CN105624796A - 芯片及其在检测耳聋相关基因中的用途 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种芯片，一种包含所述芯片的试剂盒、所述试剂盒在检测遗传性耳聋基因中的用途，一种检测耳聋相关基因的方法以及一种检测耳聋相关基因的装置。利用本发明的芯片、试剂盒、方法和/或装置，能够一次性的全面的捕获耳聋相关基因区域，检测耳聋相关基因的变异情况。

Description

芯片及其在检测耳聋相关基因中的用途

技术领域

本发明涉及生物医学领域，具体地，涉及一种芯片及其在检测耳聋相关基因中的用途，更具体地，涉及一种芯片，一种包含所述芯片的试剂盒、所述试剂盒在检测遗传性耳聋基因中的用途，一种检测耳聋相关基因的方法以及一种检测耳聋相关基因的装置。

背景技术

耳聋是一种临床上常见的疾病，发生率为1‰～3‰，遗传性因素引起的耳聋约占占先天性耳聋总人数的60％左右(Schimmenti,L.A.,etal.,Evaluationofnewbornscreeningbloodspot-basedgenetictestingassecondtierscreenforbedsidenewbornhearingscreening.GeneticsinMedicine,2011.13(12):p.1006-1010)。2006年第二次残疾人抽样调查显示，我国残疾人总数为8000万，其中听力残疾者为2670万，1-7岁听障儿童约有80万。遗传性耳聋可通过常染色体隐性遗传、常染色体显性遗传或线粒体遗传等方式传给下一代，无论父母的单方或者双方是耳聋患者还是健康携带者，耳聋基因都会通过父母向子女遗传，子代都有一定的可能会罹患耳聋疾病。目前已知的非综合征型耳聋相关基因有70多个，与耳聋相关的遗传性综合征疾病有400多种。

国内外耳聋基因的筛查诊断主要集中在少数几个最常见的致聋基因及其热点突变，包括导致DFNB1的GJB2基因、导致大前庭水管综合征的SLC26A4基因以及药物性耳聋相关的线粒体基因的1555位点等。主要采用的方法包括基因测序、变性高效液相色谱分析、高分辨率熔解曲线分析、基因突变检测芯片和限制性酶切等方法。基因测序技术是目前应用最多的遗传性耳聋检测方法，也是迄今为止分子诊断学中基因突变检测的金标准。目前国内大多数采用的是以Sanger法为基础的第一代测序技术，这种传统的测序技术有着费用高、通量低、检测范围小、难以实现自动化等多方面的不足。基因芯片检测是另外一种在国外使用较多的突变检测技术，其原理是以人类基因组DNA为模板，对某些已知的基因位点进行特异性扩增和荧光标记，然后与带有特异性核苷酸序列的芯片进行杂交，通过对荧光进行检测以获得某些特定基因位点的突变情况。但是，这种技术检测位点单一，只能对一些特定基因的特定位点进行突变检测。

发明内容

依据本发明的一方面，提供一种芯片，该芯片包含探针，探针固定于固相基质上，所述探针能够特异性识别以下342个基因中的至少100个基因的外显子区域：ABR、CLRN1、FABP4、IGF1、MYH14、PHEX、SNAI2、ACAN、COCH、FAS、ILDR1、MYH2、PLDN、SOBP、ACTG1、COL11A1、FBXO2、ITGA8、MYH3、PMP22、SOD1、AIFM1、COL11A2、FGF20、JAG1、MYH4、PNOC、SORBS1、AKAP12、COL2A1、FGF3、JAG2、MYH8、POU1F1、SOX10、ALDH1A2、COL4A3、FGFR1、KCNE1、MYH9、POU3F4、SOX2、ALMS1、COL4A4、FGFR2、KCNJ10、MYO15A、POU4F3、SOX9、AP3D1、COL4A5、FGFR3、KCNMA1、MYO1A、PROP1、SPRY2、APAF1、COL9A1、FIGN、KCNQ1、MYO3A、PRPS1、ST3GAL5、APOA1、COL9A2、FOXG1、KCNQ4、MYO6、PRRX1、STRC、AQP4、CPLX1、FOXI1、KIT、MYO7A、PRRX2、TAF10、ATF2、CRYM、FXN、KITLG、NAV2、PTK7、TBX1、ATOH1、DBH、FZD3、LAMA2、NAV3、PTPRQ、TBX10、ATP2B2、DDR1、FZD6、LARGE、NDP、RARA、TCOF1、ATP8B1、DFNA5、GAS7、LFNG、NDRG1、RARB、TECTA、AXIN1、DFNB31、GATA3、LHFPL5、NEFL、RARG、TGFA、BARHL1、DFNB59、GBX2、LMO4、NEU1、RASA1、TGFB2、BBS1、DIABLO、GFI1、LMX1A、NEURL、RDX、THRA、BBS4、DIAPH1、GIPC3、LOXHD1、NEUROD1、S1PR2、THRB、BCR、DIAPH3、GJA1、LRIG3、NEUROG1、SCARB2、TIMM8A、BDNF、DIO2、GJB1、LRP2、NF1、SCO1、TJP2、BMP4、DIO3、GJB2、LRTOMT、NOTCH1、SCRIB、TMC1、BSN、DLX2、GJB3、MAFB、NOX3、SEMA3E、TMEM126A、BSND、DLX5、GJB6、MAP1A、NOXO1、SERAC1、TMEM220、C17orf48、DMD、GLI3、MARVELD2、NR4A3、SERPINB6、TMIE、C1orf125、DNAH7、GOT1L1、MCOLN3、NTF3、SFTPC、TMPRSS13、CACNA1D、DNAH9、GPR98、MGAT4B、NTN1、SIX1、TMPRSS3、CACNB2、DPYS、GPSM2、MIR182、NTRK2、SIX5、TNC、CACNG2、DSPP、GPX1、MIR183、NTRK3、SLC12A2、TNFRSF11B、CASP3、DVL1、GRHL2、MIR96、OC90、SLC12A6、TPRN、CCDC50、DVL2、GRID1、MITF、OPA1、SLC12A7、TRIOBP、CD36、DVL3、GRXCR1、MKKS、OR2T4、SLC17A8、TRPV4、CDH23、EDN3、GUSB、MON2、OTOA、SLC19A2、TSHR、CDKN1B、EDNRB、HAL、MOS、OTOF、SLC1A3、TUB、CDKN2D、EGFLAM、HES1、MPV17、OTOG、SLC26A4、TYRP1、CEACAM16、EPHB1、HES5、MPZ、OTOP1、SLC26A5、UCN、CELSR1、EPHB2、HGF、MSRB3、OTX1、SLC30A4、USH1C、CHD7、EPHB3、HMX2、MSX2、OTX2、SLC4A11、USH1G、CHRNA9、ERBB4、HMX3、MTAP、PAX2、SLC4A7、USH2A、CKB、ESPN、HOXA1、MUC4、PAX3、SLC9A1、USP15、CLDN11、ESR2、HOXA2、MUC6、PCDH15、SLCO2B1、VANGL2、CLDN14、ESRRB、HOXB1、MUTED、PDE8B、SMAD4、WFS1、CLDN9、EYA1、HS6ST2、MYH1、PDSS1、SMPX、YME1L1、CLIC5、EYA4、IFT88、MYH13、PDZD7、SMS、SALL1、ORC4、P2RX2、DNMT1、TFAP2A、ORC6、NLRP3、CLPP、GDF6、CDT1、MASP1、CIB2、ORC1、CDC6、LARS2、CDKN1C、POMT1、TSHZ1、KIAA1199、CABP2、WNT7A、TSPEAR、KARS、ATP6V1B1、ZIC3、TRMU、HSD17B4、ANKH、EFTUD2、POLR1C、HARS、ABHD12、COG1、POLR1D和HARS2。在本发明的一个实施例中，所述探针能够特异性识别所述342个基因中的至少200个基因的外显子区域。在本发明的一个实施例中，所述探针能够特异性识别所述342个基因中的至少300个基因的外显子区域。在本发明的另一个实施例中，所述探针能够特异性识别所述342个基因的外显子区域。在本发明的一个实施例中，所述探针还能够特异性识别其能特异性识别的各个基因的外显子区域的上下游各至少30bp的内含子区域。在本发明的一个实施例中，所述探针还能够特异性识别线粒体基因组chrM。这些基因或区域是发明人经过收集、多次筛选和组合试验获得的，能够全面展现或代表耳聋和外耳畸形遗传相关基因。对于耳聋相关的几百个基因的全部外显子都有可能发生致病突变的情况，利用本发明这一方面或各个实施方式中的芯片，能够一次性全面检测耳聋所有相关基因以及这些基因的变异情况。

依据本发明的另一方面，提供一种试剂盒，其包含前面所述的任一芯片。依据本发明的再一方面，提供了前述试剂盒在检测耳聋相关基因中的用途。前述关于本发明一方面的芯片的优点及技术特征，同样适用本发明的试剂盒及其用途。

依据本发明的又一方面，提供一种检测耳聋相关基因的方法，该方法包括：(1)获取受检者的核酸，所述核酸为基因组核酸和/或游离核酸片段；(2)捕获所述核酸获得耳聋相关基因区域；(3)对所述耳聋相关基因区域进行序列测定，获得序列信息；(4)基于所述序列信息检测所述耳聋相关基因；其中，(2)是利用前述的本发明一方面的芯片或者包含芯片的试剂盒进行的。前述关于本发明一方面的芯片或试剂盒的优点及技术特征的描述，同样适用于本发明这一方面的方法。在本发明的一个实施例中，(4)还包括基于所述序列信息同时检测所述耳聋相关基因中的SNP和INDEL变异。在一个示例中，同时检测所述耳聋相关基因的SNP和INDEL变异，包括：将所述序列信息与参考序列进行第一比对，获得第一比对结果；将所述第一比对结果与所述参考序列的一部分进行第二比对，获得第二比对结果；基于所述第一比对结果和所述第二比对结果，同时检测所述SNP和INDEL变异。所说的第二比对为局部比对，第一比对为常规全局比对，可利用但不限于SOAP或BWA等软件依照其默认设置进行，获得第一比对结果，第一比对结果包括序列信息在参考序列上的匹配位置及匹配情况信息，在本发明的一个实施例中，所说的参考序列为hg19，第二比对中所说的参考序列的一部分包括与所捕获的耳聋相关基因区域对应的参考序列中的每个已知INDEL位点及其上下游各1000bp的参考序列，进行第二比对即基于第一比对结果，对与所捕获的耳聋相关基因区域对应的参考序列中的所有已知INDEL附近的所有序列信息(reads)进行局部重新比对，能够消除第一比对中的错误，提高后续变异检测的准确率，第二比对可利用GATK重比对软件(https://www.broadinstitute.org/gatk/)进行。在本发明的一个实施例中，同时检测所述SNP和INDEL变异，是通过GATKUnifiedGenotyper软件进行的。本发明的这一方面的方法是基于目标区域捕获结合超高通量测序技术平台开发的，该方法能够一次性对342个与遗传性耳聋相关的致病核基因及线粒体基因进行检测分析，对遗传性耳聋致病基因突变进行评估。通过对耳聋致病基因进行检测，可以确定遗传方式，计算耳聋再发风险，对患者及其家庭成员的患病风险、携带者风险、子代的再发风险做出准确评估与解释。结合利用前述本发明的方法，通过简单方便的采样，采集外周血，进行超高深度DNA测序，能够一次性对多种与耳聋相关的遗传性致病因素进行全面分析，为患者治疗提供科学依据及生育指导，具有高效准确、低成本、易操作的特点。本发明的方法提供了一种高通量、覆盖全面、高准确度的遗传性耳聋基因检测方法，能够对遗传性耳聋患者临床治疗提供科学依据及生育指导。

相应于前述的方法，本发明一方面还提供一种检测耳聋相关基因的装置，利用该装置能够完成前述的本发明的方法的全部或部分步骤，该装置包括：A.核酸获取单元，用于获取受检者的核酸，所述核酸为基因组核酸和/或游离核酸片段；B.捕获单元，与A单元相连，用于捕获来自A单元中的核酸，以获得耳聋相关基因区域；C.序列测定单元，与B单元相连，用于对来自B单元的耳聋相关基因区域进行序列测定，以获得序列信息；D.检测单元，与C单元相连，用于基于来自C单元的序列信息检测所述耳聋相关基因；其中，B单元中的捕获是利用本发明一方面的或者各个实施方式中的芯片进行的。图1是本发明的一个实施例中的装置结构示意图。对本发明的方法的优点及技术特征的描述，同样适用本发明的装置，而且，本领域人员可以理解，本发明的装置中的全部或部分单元，可选择的、可拆卸的包含一个或多个子单元以执行或实现前述本发明方法的各个具体实施方式。

附图说明

本发明的上述和/或附加的方面和优点，结合下面附图对实施方式的描述将变得明显和容易理解，其中：

图1是本发明的一个具体实施方式中的装置结构示意图；

图2是本发明的一个具体实施方式中的目标区域捕获测序及分析的流程图。

具体实施方式

本申请描述中的基因名称均采用NCBI-Gene里的官方命名(OfficialSymbol)。另外，为助理解，对一些科技术语进行解释说明。

同义突变：指由于某个碱基的改变使代表某种氨基酸的密码子突变为其他密码子，但是仍然编码同一个氨基酸。

错义突变：编码某种氨基酸的密码子经碱基替换以后，变成编码另一种氨基酸的密码子,从而使多肽链的氨基酸种类和序列发生改变。某些错义突变能使多肽链丧失原有功能，许多蛋白质的异常就是由错义突变引起的。

终止密码子获得突变：也被称为无义突变，指由于某个碱基的改变使代表某种氨基酸的密码子突变为终止密码子，从而使肽链合成提前终止。

终止密码子丧失突变：指由于某个碱基的改变使终止密码子突变为其他密码子，从而使肽链合成无法正常终止。

依据一般方法，实现本发明的方法主要包括遗传性耳聋基因检测芯片的设计，目标区域捕获测序技术以及分析流程的开发。

(1)遗传性耳聋基因检测芯片的设计

根据耳聋患者除听力损失外，是否合并其他器官系统异常，可以将遗传性耳聋分为非综合征型耳聋和综合征型耳聋。目前已知的非综合征型耳聋相关基因有70多个，与耳聋相关的遗传性综合征疾病有400多种。通过参考OMIM数据库，遗传性耳聋数据库及文献查询，收集TheHereditaryHearinglossHomepage数据库相关基因，OMIM数据库现已报道与遗传性耳聋及外耳畸形相关基因，以及高质量文献报道遗传性耳聋及外耳畸形相关基因，最终获取342个核基因以及全部的线粒体基因作为遗传性耳聋检测基因。具体基因列表如表1所示。

表1

ABR

CLRN1

FABP4

IGF1

MYH14

PHEX

SNAI2

ACAN

COCH

FAS

ILDR1

MYH2

PLDN

SOBP

ACTG1

COL11A1

FBXO2

ITGA8

MYH3

PMP22

SOD1

AIFM1

COL11A2

FGF20

JAG1

MYH4

PNOC

SORBS1

AKAP12

COL2A1

FGF3

JAG2

MYH8

POU1F1

SOX10

ALDH1A2

COL4A3

FGFR1

KCNE1

MYH9

POU3F4

SOX2

ALMS1

COL4A4

FGFR2

KCNJ10

MYO15A

POU4F3

SOX9

AP3D1

COL4A5

FGFR3

KCNMA1

MYO1A

PROP1

SPRY2

APAF1

COL9A1

FIGN

KCNQ1

MYO3A

PRPS1

ST3GAL5

APOA1

COL9A2

FOXG1

KCNQ4

MYO6

PRRX1

STRC

AQP4

CPLX1

FOXI1

KIT

MYO7A

PRRX2

TAF10

ATF2

CRYM

FXN

KITLG

NAV2

PTK7

TBX1

ATOH1

DBH

FZD3

LAMA2

NAV3

PTPRQ

TBX10

ATP2B2

DDR1

FZD6

LARGE

NDP

RARA

TCOF1

ATP8B1

DFNA5

GAS7

LFNG

NDRG1

RARB

TECTA

AXIN1

DFNB31

GATA3

LHFPL5

NEFL

RARG

TGFA

BARHL1

DFNB59

GBX2

LMO4

NEU1

RASA1

TGFB2

BBS1

DIABLO

GFI1

LMX1A

NEURL

RDX

THRA

BBS4

DIAPH1

GIPC3

LOXHD1

NEUROD1

S1PR2

THRB

BCR

DIAPH3

GJA1

LRIG3

NEUROG1

SCARB2

TIMM8A

BDNF

DIO2

GJB1

LRP2

NF1

SCO1

TJP2

BMP4

DIO3

GJB2

LRTOMT

NOTCH1

SCRIB

TMC1

BSN

DLX2

GJB3

MAFB

NOX3

SEMA3E

TMEM126A

BSND

DLX5

GJB6

MAP1A

NOXO1

SERAC1

TMEM220

C17orf48

DMD

GLI3

MARVELD2

NR4A3

SERPINB6

TMIE

C1orf125

DNAH7

GOT1L1

MCOLN3

NTF3

SFTPC

TMPRSS13

CACNA1D

DNAH9

GPR98

MGAT4B

NTN1

SIX1

TMPRSS3

CACNB2

DPYS

GPSM2

MIR182

NTRK2

SIX5

TNC

CACNG2

DSPP

GPX1

MIR183

NTRK3

SLC12A2

TNFRSF11B

CASP3

DVL1

GRHL2

MIR96

OC90

SLC12A6

TPRN

CCDC50

DVL2

GRID1

MITF

OPA1

SLC12A7

TRIOBP

CD36

DVL3

GRXCR1

MKKS

OR2T4

SLC17A8

TRPV4

CDH23

EDN3

GUSB

MON2

OTOA

SLC19A2

TSHR

CDKN1B

EDNRB

HAL

MOS

OTOF

SLC1A3

TUB

CDKN2D

EGFLAM

HES1

MPV17

OTOG

SLC26A4

TYRP1

CEACAM16

EPHB1

HES5

MPZ

Otop1

SLC26A5

UCN

CELSR1

EPHB2

HGF

MSRB3

OTX1

SLC30A4

USH1C

CHD7

EPHB3

HMX2

MSX2

OTX2

SLC4A11

USH1G

CHRNA9

ERBB4

HMX3

MTAP

PAX2

SLC4A7

USH2A

CKB

ESPN

HOXA1

MUC4

PAX3

SLC9A1

USP15

CLDN11

ESR2

HOXA2

MUC6

PCDH15

SLCO2B1

VANGL2

CLDN14

ESRRB

HOXB1

MUTED

PDE8B

SMAD4

WFS1

CLDN9

EYA1

HS6ST2

MYH1

PDSS1

SMPX

YME1L1

SALL1

ORC4

P2RX2

DNMT1

TFAP2A

ORC6

NLRP3

GDF6

CDT1

MASP1

CIB2

CLPP

ORC1

CDC6

POMT1

TSHZ1

KIAA1199

CABP2

LARS2

CDKN1C

WNT7A

TSPEAR

KARS

ATP6V1B1

ZIC3

TRMU

HSD17B4

ANKH

EFTUD2

POLR1C

HARS

ABHD12

COG1

POLR1D

HARS2

CLIC5

EYA4

IFT88

MYH13

PDZD7

SMS

chrM(线粒体基因组)

根据人类基因组HG19，调取上述342个核基因的外显子序列，及全部线粒体基因序列，考虑到捕获区域的大小及成本，最终芯片的核基因只涉及了其外显子区域，并对各个外显子区域前后延伸30bp，以减少重组的影响。可以这样设计获得探针序列：从hg19上获取上述342个基因的外显子序列以及侧翼±30bp区域的各段参考序列，对每一段参考序列，都从一段参考序列的一端开始，依次拷贝预定长度的参考序列获得探针序列，使得最后总的探针能够覆盖该段参考序列至少一次，相邻探针序列之间可以重叠或不重叠，这边，预定长度为探针的长度，可为50-250nt。最后获得的芯片总计1.93M。该芯片上覆盖有丰富的捕获探针，探针覆盖区域达98％，可以从复杂的基因组中富集目标DNA片段，在同一张芯片上以高特异性和高覆盖率捕获约1.93M的基因组区域。

(2)目标区域捕获测序技术及其分析流程

基本流程如图2所示，首先从全血中提取基因组DNA，并将检测合格的DNA同时进行SNP质谱检测和文库制备。文库制备是将1μg基因组DNA打断成主带为200-300bp小片段DNA，然后将打断后DNA片段进行末端补平，在3'端加碱基“A”，使得DNA片段能与3'端带有“T”碱基的特殊接头连接，经Non-CapturedPCR构建完成的文库，通过遗传性耳聋芯片将捕获富集外显子区域，再通过PCR扩增富集后产物，最后通过杂交前后PCR产物QPCR检测获得序列捕获杂交效率。QPCR检测合格后，将一定数量的文库进行Hiseq2000/Hisq2500上机测序。信息分析采用自主开发的信息分析流程进行数据处理，分析流程包含的软件、脚本等可通过深圳华大基因公开的网页或数据库来获取，或者定制深圳华大基因的服务来进行该数据处理，数据处理主要包括过滤、比对、去重复、重比对、质控、SNV(SNP)+INDEL检测、CNV检测、注释等步骤。注释结果的解读，主要基于HGMD、BGIGap以及各大耳聋致病突变数据库及文献搜索查阅进行，同时结合多个功能预测软件结果及受检者临床表征进行综合解读，基本规则参考美国医学遗传学和基因组学学院(AmericanCollegeofMedicalGeneticsandGenomics，ACMG)相关指南进行。本方法采用芯片捕获结合超高通量测序技术，一次性对遗传性耳聋相关的342个核基因编码区及全部线粒体基因进行突变检测，弥补了以Sanger法为基础的第一代测序技术的费用高、通量低、检测范围小、难以实现自动化等多方面的不足，以及基因芯片突变位点检测方法的检测位点单一、覆盖度低的不足。

以下结合具体个体样本对依据本发明的具体检测方法的运行结果进行详细的描述。下面示例，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。在本发明的描述中，除非另有说明，“多个”的含义是两个或两个以上。

除另有交待，以下实施例中涉及的未特别交待的试剂、序列(接头、标签和引物)、软件及仪器，都是常规市售产品或者开源的，比如购自Illumina公司的hiseq2000测序平台建库相关试剂盒来进行文库构建等。

实施例

对1名先天性听力损失患者(天津残疾人联合会)进行基因检测，检测致病突变。

DNA提取：使用QIAGEN试剂盒对外周血样本进行DNA提取，并进行NanoDrop8000检测及琼脂糖凝胶电泳检测质控。

样品打断：使用Covaris打断法，将样品DNA打碎至100-700bp范围的片段。

1)文库制备

文库制备参考Illumina公司的文库构建指导手册进行，以下具体描述。

1.1末端修复

末端修复反应体系：

反应个数	1个反应(μL)
		10x Polynucleotide KinaseBuffer(B904)	10μL
dNTP Solution Set	4μL
		T4DNA Polymerase	5μL
Klenow Fragment	1μL
		T4Polynucleotide Kinase(T4PNK)	5μL
Total volume	25μL

1.2末端加“A”

末端加“A”反应体系：

反应个数	1个反应(μL)
		10x Blue buffer	3.5μL
dATP(5mM)	1.4μL
		Klenow(3’-5’exo-)	2μL
Total volume	6.9μL

配置好的mix震荡混匀后，每管加入6.9μL酶反应混合液，反应条件：37℃，30min。

1.3Adapter连接

Adapter连接反应体系：

试剂名称	1个反应(μL)
		10x Ligation buffer	1.5
Index PE Adapter(40μM)	1
		ATP(10mM)	3.5
T4DNA Ligase	3
		ddH2O	6
Total volume	15

将配置好的mix震荡混匀，每个反应加入15μL酶反应混合液。

反应条件：16℃温浴12-16h(过夜)。

1.4Non-Captured样品Pre-LM-PCR

PCR反应体系：

试剂名称	1个样品(μL)
		Index P1(10μM公用引物)	8
10×Pfx Amplification Buffer	10
		dNTP(10mM)	4
MgSO4(50mM)	4
		PCR Index primer 2.0(10pmol/μL)	4
ddH2O	34
		Total volume	62

PCR程序：

1.5芯片杂交，目标区域捕获富集

参照NimbleGen使用说明书进行杂交洗脱，获取目的基因区域并PCR富集。

2)上机测序

采用hiseq2000PE101+8+101程序进行上机测序。

3)信息分析

3.1从测序仪获取原始数据(FASTQ数据)。

3.2过滤：对原始FASTQ数据进行质量控制，去除常规所说的低质量值数据。

3.3比对：利用SOAP软件及其默认参数设置，使用Hg19参考序列进行比对，并行化处理任务。

3.4去重复：基于Picard的read去重复算法，并行化地从比对结果中找出重复read并以SAM/BAM文件的tag方式进行标记。

3.5重比对：使用基于GATK重比对模型，进行重比对。即，在上一比对结果的基础上，对INDEL附近的所有reads进行局部重新比对，以消除比对的错误，提高变异检测的准确率。

3.6检测SNVINDEL：使用在GATKUnifiedGenotyper基础上开发的基于Hadoop平台的并行化变异检测模块，同时进行SNP和Indel的检测。比对完成后利用更完备的错误模型计算基因型似然值，考虑了PCR、碱基质量(BaseQuality)和比对质量(MappingQuality)等多种因素。UnifiedGenotyper是集合多种变异检测方法而成的一种变异识别软件(VariantsCaller)，UnifiedGenotyper使用贝叶斯最大似然模型，同时估计基因型和基因频率，最后对每一个样本的每一个变异位点和基因型都会给出一个精确的后验概率。该软件能将输入bam文件中的样本进行变异检测，最后生成一个vcf文件，vcf文件中会包含所有样本的变异位点和基因型信息。从vcf文件得到的结果是最原始的、没有经过任何过滤和校正的Variants集合。这一步产生的变异位点会有很高的假阳性，尤其是indel，因此，我们在前面进行重比对以尽量减少该突变检测中的假阳性结果。

3.7注释：使用人类基因组数据库NCBI104，频率数据库dbSNP135、1000human、ESP6500，以及BGI内部频率数据库进行注释；使用HGVS对变异进行标准命名，同时使用OMIM、HGMD疾病数据库，CGD临床基因组数据库进行突变及疾病注释。

4)结果分析

测序数据统计结果见表2，表3展现目标区域覆盖度信息，表4是检测出的候选突变的信息。

表2

表3

表4

*hom/het:hom表示此突变位点为纯合突变，het表示此突变位点为杂合突变。

GJB2基因的c.235delC突变，是GJB2基因的常见致病突变，可导致常染色体隐性遗传性听力损失1(DFNB1)。据上表可知，该样本检测到GJB2基因的c.235delC(纯合)突变，根据其隐性遗传模式规律，纯合突变可能导致疾病的发生。

Claims (13)

1.一种芯片，其包含探针，所述探针固定于固相基质上，所述探针能够特异性识别以下342个基因中的至少100个基因的外显子区域：ABR、CLRN1、FABP4、IGF1、MYH14、PHEX、SNAI2、ACAN、COCH、FAS、ILDR1、MYH2、PLDN、SOBP、ACTG1、COL11A1、FBXO2、ITGA8、MYH3、PMP22、SOD1、AIFM1、COL11A2、FGF20、JAG1、MYH4、PNOC、SORBS1、AKAP12、COL2A1、FGF3、JAG2、MYH8、POU1F1、SOX10、ALDH1A2、COL4A3、FGFR1、KCNE1、MYH9、POU3F4、SOX2、ALMS1、COL4A4、FGFR2、KCNJ10、MYO15A、POU4F3、SOX9、AP3D1、COL4A5、FGFR3、KCNMA1、MYO1A、PROP1、SPRY2、APAF1、COL9A1、FIGN、KCNQ1、MYO3A、PRPS1、ST3GAL5、APOA1、COL9A2、FOXG1、KCNQ4、MYO6、PRRX1、STRC、AQP4、CPLX1、FOXI1、KIT、MYO7A、PRRX2、TAF10、ATF2、CRYM、FXN、KITLG、NAV2、PTK7、TBX1、ATOH1、DBH、FZD3、LAMA2、NAV3、PTPRQ、TBX10、ATP2B2、DDR1、FZD6、LARGE、NDP、RARA、TCOF1、ATP8B1、DFNA5、GAS7、LFNG、NDRG1、RARB、TECTA、AXIN1、DFNB31、GATA3、LHFPL5、NEFL、RARG、TGFA、BARHL1、DFNB59、GBX2、LMO4、NEU1、RASA1、TGFB2、BBS1、DIABLO、GFI1、LMX1A、NEURL、RDX、THRA、BBS4、DIAPH1、GIPC3、LOXHD1、NEUROD1、S1PR2、THRB、BCR、DIAPH3、GJA1、LRIG3、NEUROG1、SCARB2、TIMM8A、BDNF、DIO2、GJB1、LRP2、NF1、SCO1、TJP2、BMP4、DIO3、GJB2、LRTOMT、NOTCH1、SCRIB、TMC1、BSN、DLX2、GJB3、MAFB、NOX3、SEMA3E、TMEM126A、BSND、DLX5、GJB6、MAP1A、NOXO1、SERAC1、TMEM220、C17orf48、DMD、GLI3、MARVELD2、NR4A3、SERPINB6、TMIE、C1orf125、DNAH7、GOT1L1、MCOLN3、NTF3、SFTPC、TMPRSS13、CACNA1D、DNAH9、GPR98、MGAT4B、NTN1、SIX1、TMPRSS3、CACNB2、DPYS、GPSM2、MIR182、NTRK2、SIX5、TNC、CACNG2、DSPP、GPX1、MIR183、NTRK3、SLC12A2、TNFRSF11B、CASP3、DVL1、GRHL2、MIR96、OC90、SLC12A6、TPRN、CCDC50、DVL2、GRID1、MITF、OPA1、SLC12A7、TRIOBP、CD36、DVL3、GRXCR1、MKKS、OR2T4、SLC17A8、TRPV4、CDH23、EDN3、GUSB、MON2、OTOA、SLC19A2、TSHR、CDKN1B、EDNRB、HAL、MOS、OTOF、SLC1A3、TUB、CDKN2D、EGFLAM、HES1、MPV17、OTOG、SLC26A4、TYRP1、CEACAM16、EPHB1、HES5、MPZ、OTOP1、SLC26A5、UCN、CELSR1、EPHB2、HGF、MSRB3、OTX1、SLC30A4、USH1C、CHD7、EPHB3、HMX2、MSX2、OTX2、SLC4A11、USH1G、CHRNA9、ERBB4、HMX3、MTAP、PAX2、SLC4A7、USH2A、CKB、ESPN、HOXA1、MUC4、PAX3、SLC9A1、USP15、CLDN11、ESR2、HOXA2、MUC6、PCDH15、SLCO2B1、VANGL2、CLDN14、ESRRB、HOXB1、MUTED、PDE8B、SMAD4、WFS1、CLDN9、EYA1、HS6ST2、MYH1、PDSS1、SMPX、YME1L1、CLIC5、EYA4、IFT88、MYH13、PDZD7、SALL1、ORC4、P2RX2、DNMT1、TFAP2A、ORC6、NLRP3、CLPP、GDF6、CDT1、MASP1、CIB2、ORC1、CDC6、LARS2、CDKN1C、POMT1、TSHZ1、KIAA1199、CABP2、WNT7A、TSPEAR、KARS、ATP6V1B1、ZIC3、TRMU、HSD17B4、ANKH、EFTUD2、POLR1C、HARS、ABHD12、COG1、POLR1D、HARS2和SMS；

任选地，所述探针能够特异性识别所述342个基因中的至少200个基因的外显子区域；

任选地，所述探针能够特异性识别所述342个基因中的至少300个基因的外显子区域；

任选地，所述探针能够特异性识别所述342个基因的外显子区域。

2.权利要求1的芯片，其特征在于，所述探针还能够特异性识别其能特异性识别的各个基因的外显子区域的上下游各30bp的内含子区域。

3.权利要求1的芯片，其特征在于，所述探针还能够特异性识别线粒体基因组。

4.一种试剂盒，其包括权利要求1-3任一芯片。

5.权利要求4的试剂盒在检测耳聋相关基因中的用途。

6.一种检测耳聋相关基因的方法，其特征在于，包括：

(1)获取受检者的核酸，所述核酸为基因组核酸和/或游离核酸片段；

(2)捕获所述核酸获得耳聋相关基因区域；

(3)对所述耳聋相关基因区域进行序列测定，获得序列信息；

(4)基于所述序列信息检测所述耳聋相关基因；其中，(2)是利用权利要求4的试剂盒进行的。

7.权利要求6的方法，其特征在于，(4)包括基于所述序列信息同时检测所述耳聋相关基因的多种变异，所述变异选自SNP、INDEL和CNV的至少一种。

8.权利要求7的方法，其特征在于，同时检测所述耳聋相关基因的多种变异，包括：

将所述序列信息与参考序列进行第一比对，获得第一比对结果；

将所述第一比对结果与所述参考序列的一部分进行第二比对，获得第二比对结果；

基于所述第一比对结果和所述第二比对结果，同时检测所述耳聋相关基因的SNP和INDEL变异。

9.权利要求8的方法，其特征在于，所述第一比对为全局比对，所述第二比对为局部比对。

10.权利要求8的方法，其特征在于，所述参考序列为hg19。

11.权利要求8的方法，其特征在于，所述参考序列的一部分包括与所述耳聋相关基因区域对应的所述参考序列中的每个已知INDEL位点，以及所述每个已知INDEL位点上下游各1000bp范围的序列。

12.权利要求8的方法，其特征在于，利用GATKUnifiedGenotyper软件同时检测所述耳聋相关基因的SNP和INDEL变异。

13.一种检测耳聋相关基因的装置，其特征在于，包括：

A.核酸获取单元，用于获取受检者的核酸，所述核酸为基因组核酸和/或游离核酸片段；

B.捕获单元，与A单元相连，用于捕获来自A单元中的核酸，以获得耳聋相关基因区域；

C.序列测定单元，与B单元相连，用于对来自B单元的耳聋相关基因区域进行序列测定，以获得序列信息；

D.检测单元，与C单元相连，用于基于来自C单元的序列信息检测所述耳聋相关基因；其中，B单元中的捕获是利用权利要求4的试剂盒进行的。