CN117965734A - 一种用于检测硬纤维瘤的基因标志物、试剂盒、检测方法及应用 - Google Patents
一种用于检测硬纤维瘤的基因标志物、试剂盒、检测方法及应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明提供一种用于检测硬纤维瘤的基因标志物、试剂盒、检测方法及其应用，所述基因标志物包括CTNNB1、CENPF、SPIN3、MARVELD2中的一个或多个的组合，运用选择性富集全转录本区域和关键热点变异区域的方法，针对目的基因建立探针库，获取目标DNA片段构建形成所述高通量测序文库；本发明提供的用于构建所述基于硬纤维瘤基因检测的高通量测序文库的试剂盒，将所述试剂盒用于硬纤维瘤基因的高通量测序方法，针对测序文库进行测序及生物信息学分析。与现有技术相比，本发明方案在高通量测序过程中具有低起始、高通量、检测范围广、灵敏度高、淮确性高和检测成本低等优点，不仅适用于4个基因组合的靶向高通量测序，而且适用于全外显子测序来鉴定4个基因所有突变特征。
Description
本发明属于分子生物医学技术领域，具体涉及一种用于检测硬纤维瘤的基因标志物、试剂盒、检测方法及应用。
背景技术
硬纤维瘤(Desmoid Tumors，DTs)是一种罕见且局部侵袭性强的肿瘤，发生在结缔组织中。世界卫生组织(World Health Organization,WHO)将其定义为中间性软组织肿瘤，不具有转移潜力，但其自然病史多变且不可预测。治疗方式包括手术、辐射疗法、非甾体抗炎药物、激素阻断、细胞毒化疗和酪氨酸激酶抑制剂。手术是主要治疗方法，但复发风险高。最近的研究表明，基因表达分析(如全外显子组测序和RNA测序)对于预测复发风险和选择治疗方案极为重要。高通量检测在理解硬纤维瘤生物学、确定患者预后以及指导治疗决策中具有重要作用。
传统的淋巴瘤检测方法主要基于聚合酶链式反应(PCR)及其衍生技术，在一定程度上有助于临床上对硬纤维瘤进行诊断和治疗进行判断，但它们存在明显局限性，比如检测的位点数量有限，无法覆盖所有检测位点。高通量测序技术，因其单次检测通量高、覆盖面广、检测灵敏度高等特点，已被广泛应用于科研和临床领域。此外，随着高通量测序监管体系的加强和完善，其在临床应用的意义愈发显著。高通量测序结合杂交捕获技术，相较于传统的FISH和PCR技术，不仅显著提高了检测的覆盖范围，还将检测成本有效均摊到每个基因或位点上，降低了单个检测的成本，增强了检测的经济性。因此，二代测序在临床诊断中的应用，特别是对于硬纤维瘤基因突变位点检测，具有重大的临床意义。
发明内容
为了解决上述问题，本发明提供一种用于检测硬纤维瘤的基因标志物、试剂盒、检测方法及应用。本发明通过高通量测序检测，同时检测一个样本的多个硬纤维瘤致病基因突变，具有低起始，高通量、检测范围广、灵敏度高、淮确性高和检测成本低等优点，不仅适用于4个基因组合的靶向高通量测序，而且适用于全外显子测序来鉴定4个基因所有突变特征。
本发明的技术方案为：
一种用于检测硬纤维瘤的基因标志物，包括一个或两个以上如下基因的组合：CTNNB1、CENPF、SPIN3、MARVELD2。
所述的用于检测硬纤维瘤的基因标志物在制备诊断硬纤维瘤的药物或检测试剂中的应用。
一种检测硬纤维瘤基因特征的试剂盒，所述试剂盒包括针对所述基因标志物的检测试剂。
所述检测试剂包括用于检测所述基因标志物中各个目标区域的探针组合物。
一种检测硬纤维瘤基因特征的方法，包括如下步骤：
(1)提取检测对象的基因组DNA；
(2)将基因组DNA依次进行片段化、纯化和Pre-PCR扩增反应，得到目标区域的DNA文库；
(3)通过芯片技术对所述目标区域的DNA文库进行处理，捕获并富集目标基因的编码区域以及其相邻的剪接位点区域的DNA，构建得到特定的目标区域文库；
(4)用高通量测序平台对目标区域文库进行基因检测，得到测序数据；
(5)将所得测序数据与所述基因组DNA的参考序列进行对比，发现存在的基因突变并进行数据分析，得到与硬纤维瘤致病相关的基因突变信息。
本发明可以兼容多种I11umina测序仪，包括从Miseq、Hiseq到Novaseq等机型；可以兼容多种华大智造测序仪，包括MGISEQ和DNBSEQ均在本发明方案的适用机型范围内。
所述基因组DNA选自以下基因形成的组：CTNNB1、CENPF、SPIN3、MARVELD2。
所述基因组DNA的来源为新鲜组织样本或经石蜡包埋后的石蜡样本。
步骤(5)中，先对所述测序数据进行预处理，去除测序数据中的接头序列。
所述去除测序数据中的接头序列的步骤具体为：
从序列的末端算起去除质量低于Q20的碱基；之后以4个碱基长度的单位，从序列一端滑向另一端，去除碱基平均质量低于Q15的划窗内碱基；最后去除长度小于50个碱基的序列；利用比对软件将清洗后的测序数据比对到人源hg19参考序列上；利用生物信息软件处理比对后的数据，分析得到目的基因的SNV以及indel信息；利用所述目的基因的SNV以及indel信息，通过软件及数据库进行突变解读。
采用试剂盒进行所述与硬纤维瘤致病相关的基因突变检测。
所述基因突变为点突变或20bp以内的缺失插入突变。
检测区域为所述基因标志物的全转录本区域和热点变异区域的组合，具体地，所述检测区域为选自表1中所示的目标区域的组合。优选地，所述检测区域为表1所示的基因，转录本号，外显子号，染色体编号、染色体起始位置、染色体终止位置，碱基改变，参考基因组版本共同限定。
表1-目标基因覆盖的检测区域及具体位置
本发明的有益效果为：
本发明提供一种用于检测硬纤维瘤的基因标志物，包括CTNNB1、CENPF、SPIN3、MARVELD2中的一个或多个的组合，运用选择性富集全转录本区域和关键热点变异区域的方法，针对目的基因建立探针库，获取目标DNA片段构建形成所述高通量测序文库；进一步还提供一种用于构建上述的基于硬纤维瘤基因检测的高通量测序文库的试剂盒，将所述试剂盒用于硬纤维瘤基因的高通量测序方法，针对测序文库进行测序及生物信息学分析。与现有技术相比，本发明方案在高通量测序过程中具有低起始、高通量、检测范围广、灵敏度高、淮确性高和检测成本低等优点，不仅适用于4个基因组合的靶向高通量测序，而且适用于全外显子测序来鉴定4个基因所有突变特征。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1显示本发明检测硬纤维瘤基因特征的操作步骤示意图；
图2显示为利用本发明的高通量测序文库对硬纤维瘤的组织标本进行检测和分析获得的CTNNB1基因突变位点氨基酸改变图；
图3显示为利用本发明的高通量测序文库对硬纤维瘤的组织标本进行检测和分析获得的CENPF基因突变位点氨基酸改变图；
图4显示为利用本发明的高通量测序文库对硬纤维瘤的组织标本进行检测和分析获得的SPIN3基因突变位点氨基酸改变图；
图5显示为利用本发明的高通量测序文库对硬纤维瘤的组织标本进行检测和分析获得的MARVELD2基因突变位点氨基酸改变图；
图6显示为利用本发明的高通量测序文库对第DT-12例硬纤维瘤的组织标本进行检测和分析获得的CTNNB1基因T41A突变位点的检测数据图；
图7显示为利用本发明的高通量测序文库对第DT-04例硬纤维瘤的组织标本进行检测和分析获得的CTNNB1基因S45F突变位点的检测数据图；
图8显示为利用本发明的高通量测序文库对第DT-04例硬纤维瘤的组织标本进行检测和分析获得的SPIN3基因M150V突变位点的检测数据图。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明的技术方案进行详细的描述。显然，所描述的实施例仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所得到的所有其它实施方式，都属于本发明所保护的范围。
以下结合具体实施例，对上述技术方案详细说明。
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1
本实施例提供一种与硬纤维瘤致病相关的基因突变的检测方法，如图1所示包括基因组DNA提取、DNA片段化、测序文库制备、高通量测序和分析步骤，具体操作如下：
(1)使用天根生化科技(北京)有限公司“磁珠法通用型基因组DNA提取试剂盒”货号DP705，提取肿瘤组织样本中的基因组DNA，肿瘤组织来源可以是经石蜡包埋后的石蜡样本，也可以是新鲜组织样本；
(2)将肿瘤组织基因组DNA经Covaris破碎仪随机打断成长度为180-280bp左右的基因组DNA片段，随后进行末端修复，加单个腺苷酸A尾和Illumina接头。带有接头的基因组DNA片段经过PCR扩增，使用Qubit3.0精确测定每个文库浓度。于加上接头的文库，应用Agencourt SPRIselect(Beckman Coulter,USA,Catalog#:2358413)核酸片段筛选试剂盒在纯化文库的同时，进行片段大小筛选。经过纯化后的文库，去掉了体系中过量的测序接头和接头自连产物，避免PCR过程的无效扩增，消除对上机测序的影响；
(3)利用本发明试剂盒中的探针，对步骤(2)所得DNA片段进行特异性捕获。本发明目标基因组区域的组合探针通过碱基互补配对原理进行杂交。成功杂交的基因组DNA片段通过磁珠吸附后进行特异性洗脱，而未杂交的片段则在此过程中被移除，探针被消化，捕获的文库以PCR进行富集扩增，获得以目标基因片段为主要组成的DNA片段文库。文库构建完成后，使用Agilent5400system(AATI)对文库的insert size进行检测，insert size符合预期后，使用qPCR方法对文库的有效浓度(1.5nM)进行准确定量，以保证文库质量；
(4)构建测序文库后进行高通量测序，可以选择I11 umina测序仪和华大智造测序仪任意机型，选择PE150即Pair-end 150bp高通量测序；
(5)对所得测序结果进行分析，使用FastQC(v 0.12.1)对数据质量进行评估，判断其是否达到标准，若符合标准，则对样本进行预处理，包括使用Trimmomatic v0.39去除测序序列中的接头序列；从序列的末端算起去除质量低于Q20的碱基；之后以4个碱基长度的单位，从序列一端滑向另一端，去除碱基平均质量低于Q15的划窗内碱基；最后去除长度小于50个碱基的序列；利用比对软件BWA-MEN v0.7.17将清洗后的测序数据比对到人源(hg19版本)参考序列上；利用生物信息软件(GATK v 4.4.0.0)处理比对后的数据，进一步分析得到目的基因的SNV以及indel信息；利用上述目的基因的SNV以及indel信息，通过软件ANNOVAR及数据库进行突变生物信息学注释和解读。
实验例1
利用本发明的突变基因检测方法，对63例硬纤维瘤病人进行检测和分析，检测基因突变丰度见表2-表5。
表2-目标基因CTNNB1的突变丰度
从表2可以看出，对于CTNNB1基因，在多个样本中检测到了p.T41A和p.S45F两种突变类型。例如，样本DT-02中的CTNNB1基因突变类型为p.T41A，突变丰度为42.55％。另外，样本DT-03、DT-04和DT-05中均检测到了p.S45F类型的突变，突变丰度分别为20.44％、39.45％和60.54％。
表3-目标基因CENPF的突变丰度
从表3可以看出，对于CENPF基因，在不同样本中发现了多种突变类型，如p.A2096T、p.C2001Y、p.A1626T、p.A3021A和p.Q2045R等。例如，样本DT-01的CENPF基因突变类型为p.A2096T，突变丰度仅为0.65％。
表4-目标基因SPIN3的突变丰度
| 样本名称 | 基因名称 | 突变类型 | 突变丰度 |
| DT-04 | SPIN3 | p.M150V | 0.55％ |
| DT-12 | SPIN3 | p.M150V | 0.71％ |
| DT-43 | SPIN3 | p.M150V | 0.62％ |
| DT-63 | SPIN3 | p.M150V | 0.89％ |
| DT-80 | SPIN3 | p.M150V | 0.90％ |
从表4可以看出，对于SPIN3基因，所有检测到的突变类型均为p.M150V，但在不同样本中突变丰度有所不同。如样本DT-04中的突变丰度为0.55％，而样本DT-63中为0.89％。
表5-目标基因MARVELD2的突变丰度
| 样本名称 | 基因名称 | 突变类型 | 突变丰度 |
| DT-08 | MARVELD2 | p.K95R | 0.76％ |
| DT-25 | MARVELD2 | p.A72A | 0.96％ |
| DT-39 | MARVELD2 | p.K95R | 0.81％ |
| DT-40 | MARVELD2 | p.K95R | 0.77％ |
| DT-56 | MARVELD2 | p.K95R | 0.75％ |
| DT-59 | MARVELD2 | p.D547G | 2.42％ |
从表5可以看出，对于MARVELD2基因，检测到的突变类型包括p.K95R和p.A72A。这些突变在不同样本中的丰度相对较低，如样本DT-08中p.K95R的突变丰度为0.76％，样本DT-25中p.A72A的突变丰度为0.96％。
实验例2
本发明进一步检测63例硬纤维瘤病人中的4个目标基因突变类型即氨基酸改变情况。
如图2所示为利用本发明的高通量测序文库对硬纤维瘤的组织标本进行检测和分析获得的CTNNB1基因突变位点氨基酸改变图，从图2可以看出CTNNB1基因的突变情况，基因的编码长度为781个氨基酸，突变率为82.54％。具体的突变类型，包括D32V、H36P、T41A、S45F/del/P、A146V和R528C等，其中T41A位于第41个氨基酸位点，而R528C位于第528个氨基酸位点。
如图3所示为利用本发明的高通量测序文库对硬纤维瘤的组织标本进行检测和分析获得的CENPF基因突变位点氨基酸改变图；从图3可以看出CENPF基因的突变情况，其中突变率为15.87％。CENPF基因的编码长度约3000个氨基酸，CENPF蛋白质包含4个结构域，包括SMC_prok_B、Cenp-F_N、Cenp-F_leu_zip和Rb_bdg_C_Cenp-F。突变主要集中在Cenp-F_N和Cenp-F_leu_zip两个结构域内，而Rb_bdg_C_Cenp-F域则显示出较少的突变。
图4所示为利用本发明的高通量测序文库对硬纤维瘤的组织标本进行检测和分析获得的SPIN3基因突变位点氨基酸改变图；从图4可以看出SPIN3基因的突变情况，其体细胞突变率为7.94％。SPIN3基因的编码长度约250个氨基酸，大部分突变均发生在Spin-Ssty域内，表明这个域在SPIN3基因的功能中可能具有重要作用。
图5所示为利用本发明的高通量测序文库对硬纤维瘤的组织标本进行检测和分析获得的MARVELD2基因突变位点氨基酸改变图；从图中可以看出MARVELD2基因的突变情况，其突变率为7.94％。MARVELD2基因的编码长度为568个氨基酸，两个主要结构域，MARVEL和Occludin_ELL。两个主要的突变点，p.K95R和p.D547G，分别位于基因的两端，p.K95R靠近基因的起始部分，p.D547G靠近终止部分。
实施例3
本发明检测63例硬纤维瘤病人中的4个目标基因突变类型，以样本DT-04和DT-12为例，
如图6所示为利用本发明的高通量测序文库对第DT-12例硬纤维瘤的组织标本进行了检测和分析获得的CTNNB1基因T41A突变位点的检测数据图。
如图7所示为利用本发明的高通量测序文库对第DT-04例硬纤维瘤的组织标本进行了检测和分析获得的CTNNB1基因S45F突变位点的检测数据图。
如图8所示为利用本发明的高通量测序文库对第DT-04例硬纤维瘤的组织标本进行了检测和分析获得的SPIN3基因M150V突变位点的检测数据图。
以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应以所述权利要求的保护范围为准。
Claims (10)
1.一种用于检测硬纤维瘤的基因标志物，其特征在于，包括一个或两个以上如下基因的组合：CTNNB1、CENPF、SPIN3、MARVELD2。
2.根据权利要求1所述的用于检测硬纤维瘤的基因标志物在制备诊断硬纤维瘤的药物或检测试剂中的应用。
3.一种检测硬纤维瘤基因特征的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括针对所述基因标志物的检测试剂。
4.一种检测硬纤维瘤基因特征的方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)提取检测对象的基因组DNA；
(2)将基因组DNA依次进行片段化、纯化和Pre-PCR扩增反应，得到目标区域的DNA文库；
(3)通过芯片技术对所述目标区域的DNA文库进行处理，捕获并富集目标基因的编码区域以及其相邻的剪接位点区域的DNA，构建得到特定的目标区域文库；
(4)用高通量测序平台对目标区域文库进行基因检测，得到测序数据；
(5)将所得测序数据与所述基因组DNA的参考序列进行对比，发现存在的基因突变并进行数据分析，得到与硬纤维瘤致病相关的基因突变信息。
5.根据权利要求4所述的检测硬纤维瘤基因特征的方法，其特征在于，所述基因组DNA选自以下基因形成的组：CTNNB1、CENPF、SPIN3、MARVELD2。
6.根据权利要求4所述的检测硬纤维瘤基因特征的方法，其特征在于，所述基因组DNA的来源为新鲜组织样本或经石蜡包埋后的石蜡样本。
7.根据权利要求4所述的检测硬纤维瘤基因特征的方法，其特征在于，步骤(5)中，先对所述测序数据进行预处理，去除测序数据中的接头序列。
8.根据权利要求7所述的检测硬纤维瘤基因特征的方法，其特征在于，所述去除测序数据中的接头序列的步骤具体为：
从序列的末端算起去除质量低于Q20的碱基；之后以4个碱基长度的单位，从序列一端滑向另一端，去除碱基平均质量低于Q15的划窗内碱基；最后去除长度小于50个碱基的序列；利用比对软件将清洗后的测序数据比对到人源hg19参考序列上；利用生物信息软件处理比对后的数据，分析得到目的基因的SNV以及indel信息；利用所述目的基因的SNV以及indel信息，通过软件及数据库进行突变解读。
9.根据权利要求4所述的检测硬纤维瘤基因特征的方法，其特征在于，采用试剂盒进行所述与硬纤维瘤致病相关的基因突变检测。
10.根据权利要求4所述的检测硬纤维瘤基因特征的方法，其特征在于，所述基因突变为点突变或20bp以内的缺失插入突变。
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