KR102622309B1 - 염색체 상호작용의 검출 - Google Patents

염색체 상호작용의 검출 Download PDF

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이완 헌터
아로울 라마다스
알렉상드르 아코울릿체브
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옥스포드 바이오다이나믹스 피엘씨
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Abstract

동반 진단과 관련된 후성적 염색체 상호작용을 결정하는 방법.
[대표도]
도 1C

Description

염색체 상호작용의 검출
본 발명은 염색체 상호작용을 검출하는 것에 관한 것이다.
건강 관리 비용은 급증하고 있으므로 기존 약물을 사용하여 사람들을 보다 효과적으로 치료할 필요가 있다.
본 발명자들은 동반 진단의 기초로서 또는 동반 진단과 함께 사용하기 위한, 특히 요법(예컨대, 약제학적 요법)에 대한 반응성, 질환/병태에 걸리기 쉬운 소인, 및/또는 잔존 질환의 모니터링을 결정하기 위한 후성적 상태의 검출에서, 후성적 염색체 상호작용의 용도를 조사하였다. 본 발명자들의 연구는 다양한 병태에서의 후성적 상호작용의 역할을 보여주며 관련된 염색체 상호작용을 확인하는 방법을 제공한다. 본 발명은 개체의 하위그룹에 존재하는 염색체 상호작용을 관찰하는 것에 기초하여 관련된 염색체 상호작용을 확인하는 방법을 포함한다. 본 발명은 또한 확인된 염색체 상호작용을 동반 진단 시험을 위한 기초로서 사용하는 것을 포함한다.
따라서, 본 발명의 제1 양태는 하위그룹으로부터의 핵산의 제1 세트를 염색체 상호작용의 지표(index) 집단을 나타내는 핵산의 제2 세트와 접촉시키는 단계, 및 상보적인 서열을 혼성화시키는 단계를 포함하는, 하위그룹 간을 구별하는 동반 진단과 관련된 후성적 염색체 상호작용을 결정하는 방법을 제공하며, 핵산의 제1 및 제2 세트 내의 핵산은 후성적 염색체 상호작용에 함께 모인 두 염색체 영역으로부터의 서열을 포함하는 라이게이션된 생성물을 나타내고, 핵산의 제1 및 제2 세트 사이의 혼성화의 패턴은 어느 후성적 염색체 상호작용이 집단 내의 하위그룹에 특이적인지를 결정할 수 있게 해주며, 하위그룹은 동반 진단과 관련된 특징이 상이하다.
바람직하게는, 본 발명의 제1 양태(및/또는 임의의 다른 양태)에서:
- 하위그룹은 동물(예컨대, 포유동물 또는 선충) 집단에서의 하위그룹, 가장 바람직하게는 인간 집단에서의 하위그룹이고/이거나;
- 핵산의 제1 세트는 적어도 8개의 개체로부터 유래되고/되거나;
- 핵산의 제1 세트는 제1 하위그룹으로부터의 적어도 4개의 개체 및 바람직하게는 제1 하위그룹과 중복되지 않는 제2 하위그룹으로부터의 적어도 4개의 개체로부터 유래되고/되거나,
- 핵산의 제2 세트는 염색체 상호작용의 선택되지 않은 그룹을 나타내고/내거나;
- 핵산의 제2 세트는 정해진 위치에서 어레이에 결합하고/하거나;
- 핵산의 제2 세트는 적어도 100개의 상이한 유전자 또는 유전자좌에서의 염색체 상호작용을 나타내고/내거나;
- 핵산의 제2 세트는 적어도 1000개의 상이한 후성적 염색체 상호작용을 나타내는 적어도 1000개의 상이한 핵산을 포함하고/하거나;
- 핵산의 제1 세트 및 핵산의 제2 세트는 길이 10 내지 100개의 뉴클레오타이드 염기의 핵산 서열을 포함하고/하거나;
- 방법은 어떤 유전자좌 또는 유전자가 동반 진단과 관련된 상기 특징과 관련되는지 결정하기 위해 수행되고/되거나;
- 하위그룹은
(i) 특정 치료 및/또는 예방(특히, 특정 약제학적 치료 및/또는 예방)에 반응하는 것, 및/또는
(ii) 특정 병태에 걸리기 쉬운 소인, 및/또는
(iii) 재발로 이어질 수 있는 잔존 질환의 존재
와 관련하여 상이하고/하거나;
- 핵산의 제1 세트는
(i) 염색체 상호작용에 함께 모인 염색체 영역을 시험관내에서 교차결합시키는 단계;
(ii) 상기 교차결합된 DNA를 효소로 제한 소화 절단시키는 단계; 및
(iii) 상기 교차결합된 절단된 DNA 말단을 라이게이션하여 핵산의 제1 세트(특히, 라이게이션된 DNA 포함)를 형성하는 단계
를 포함하는 방법에서 생성되고/되거나;
- 동반 진단과 관련된 상기 특징은
(i) 류마티스성 관절염 환자에서 메토트렉세이트(또는 또 다른 류마티스성 관절염 약물)에 대한 반응성 및/또는
(ii) 급성 골수성 백혈병을 위한 요법에 대한 반응성, 및/또는
(iii) 흑색종의 재발 가능성이다.
바람직하게는, 본 발명의 제1 및/또는 다른 양태에서, 특징 "....핵산의 제1 및 제2 세트 내의 핵산은 후성적 염색체 상호작용에 함께 모인 두 염색체 영역으로부터의 서열을 포함하는 라이게이션된 생성물을 나타낸다..."는 하기를 포함하거나 하기일 수 있다: "...핵산의 제1 및 제2 세트 내의 핵산은 후성적 염색체 상호작용에 함께 모인 두 염색체 영역으로부터의 서열을 포함하는 라이게이션된 생성물(들)(바람직하게는 라이게이션된 핵산(들), 더욱 바람직하게는 라이게이션된 DNA)의 형태이다".
본 발명의 제2 양태는 치료 및/또는 예방(특히 약제학적 치료 및/또는 예방)과 관련된 특징을 갖는 하위그룹을 선택하는 동반 진단 분석 방법을 제공하며, 이 방법은
(a) 상기 방법에 의해 확인된 유전자좌를 하위그룹에 특징적인 후성적 상호작용을 갖는 것으로서 타이핑(typing)하는 단계, 및/또는
(b) i. 특정 치료 및/또는 예방(특히, 특정 약제학적 치료 및/또는 예방)에 대해 반응, 및/또는
ii. 특정 병태에 걸리기 쉬운 소인, 및/또는
iii. 재발로 이어질 수 있는 잔존 질환의 존재
에 대해 특징적인, 바람직하게는 적어도 5개의 상이한 유전자좌에서, 적어도 5개의 후성적 염색체 상호작용의 존재 또는 부존재를 검출하는 단계를 포함한다.
바람직하게는, 본 발명의 제2 양태(및/또는 임의의 다른 양태)에서:
- 방법은 본 발명의 제2 양태에서 정의된 바와 같은 단계 (a)를 포함하고,
(1) 상기 유전자좌는 유전자이고/이거나,
(2) 단일 뉴클레오타이드 다형성(SNP)은 타이핑되고/되거나,
(3) 마이크로RNA(miRNA)는 유전자좌로부터 발현되고/되거나,
(4) 비코딩 RNA(ncRNA)는 유전자좌로부터 발현되고/되거나,
(5) 유전자좌는 적어도 10개의 인접한 아미노산 잔기를 코딩하는 핵산 서열을 발현하고/하거나,
(6) 유전자좌는 조절 요소를 발현하고/하거나,
(7) 상기 타이핑은 유전자좌로부터의 발현 수준의 결정 또는 시퀀싱을 포함하고/하거나;
- 방법은 본 발명의 제2 양태에서 정의된 바와 같은 단계 (b)를 포함하고,
- 5 내지 500개, 바람직하게는 20 내지 300개, 더욱 바람직하게는 50 내지 100개의 후성적 염색체 상호작용이, 바람직하게는 적어도 5개의 상이한 유전자좌에서 타이핑되고/되거나;
- 바람직하게는 적어도 5개의 상이한 유전자좌에서, 5 내지 500개, 바람직하게는 20 내지 300개, 더욱 바람직하게는 50 내지 100개의 후성적 염색체 상호작용의 존재 또는 부존재가 검출된다.
본 발명의 제2 양태(및/또는 임의의 다른 양태)의 다른 바람직하거나 특별한 특징은 하기를 포함한다:
본 발명의 제2 양태의 동반 진단 분석 방법은 특히 본원에 언급된 특정 병태 또는 특징 중 어느 것의 존재를 검출하는데 사용될 수 있다.
바람직하게는, 본 발명의 제2 양태의 동반 진단 분석 방법은
- 류마티스성 관절염 환자에서 메토트렉세이트(또는 또 다른 류마티스성 관절염 약물)에 대한 반응성,
- 급성 골수성 백혈병(AML) 환자를 위한 요법에 대한 반응성,
- 흑색종의 재발 가능성,
- 전립선암 및/또는 공격성 전립선암의 발병 가능성, 및/또는
- 신경퇴행성 질환 또는 병태, 바람직하게는 치매, 예컨대 알츠하이머병, 경도 인지 장애, 혈관성 치매, 루이소체 치매, 전측두엽 치매, 또는 더욱 바람직하게는 알츠하이머병, 가장 바람직하게는 베타-아밀로이드 응집체 유도 알츠하이머병의 발병 가능성 및/또는 이에 걸리기 쉬운 소인, 및/또는
- 특히 기억 및/또는 인지에 대하여, 치매 환자(바람직하게는 알츠하이머병 환자, 더욱 바람직하게는 베타-아밀로이드 응집체를 갖는 알츠하이머병 환자) 및 알츠하이머병이 없는 인지 장애 환자 사이의 비교(들)
를 검출하는데 사용되며;
모든 경우에, 바람직하게는 인간에서 사용된다.
바람직하게는, 본 발명의 제2 양태 및 모든 다른 양태에서, 질환 또는 병태(특히 인간에서)는
- 특히 인간에서; 염증성 질환, 바람직하게는 류마티스성 관절염;
- 특히 인간에서; 혈액암, 바람직하게는 급성 골수성 백혈병(AML);
- 특히 인간에서; 고형 암/고형 종양, 바람직하게는 흑색종, 전립선암 및/또는 공격성 전립선암; 및/또는
- 특히 인간에서; 신경퇴행성 질환 또는 병태, 바람직하게는 치매, 예컨대 알츠하이머병, 경도 인지 장애, 혈관성 치매, 루이소체 치매, 전측두엽 치매, 또는 더욱 바람직하게는 알츠하이머병, 예컨대 베타-아밀로이드 응집체 유도 알츠하이머병; 및/또는
- 면역요법, 예컨대 항체 요법, 바람직하게는 항-PD1 요법에 대한 반응성을 포함한다.
일 구현예에서, 요법, 바람직하게는 항-PD1 요법에 대한 반응성은, 하기 암, 바람직하게는 표시된 단계 또는 부류의 하기 암 및/또는 바람직하게는 바이러스 감염과 같은 다른 표시된 특징을 갖는 하기 암 중 어느 것에서 검출된다:
- DLBCL_ABC: 미만성 거대 B-세포 림프종 하위유형 활성화된 B-세포
- DLBCL_GBC: 미만성 거대 B-세포 림프종 하위유형 배중심 B-세포
- HCC: 간세포 암종
- HCC_HEPB: B형 간염 바이러스를 갖는 간세포 암종
- HCC_HEPC: C형 간염 바이러스를 갖는 간세포 암종
- HEPB+R: 차도 중인 B형 간염
- Pca_Class3: 전립선암 3기
- Pca_Class2: 전립선암 2기
- Pca_Class1: 전립선암 1기
- BrCa_Stg4: 유방암 4기
- BrCa_Stg3B: 유방암 3B기
- BrCa_Stg2A: 유방암 2A기
- BrCa_Stg2B: 유방암 2B기
- BrCa_Stg1A: 유방암 1A기
- BrCa_Stg1: 유방암 1기.
병태 또는 특징은
- 다발성 경화증 환자에서 IFN-B(IFN-베타) 치료에 대한 반응성, 및/또는
- 재발 완화형 다발성 경화증에 걸리기 쉬운 소인, 및/또는
- 일차(원발성) 진행성 다발성 경화증의 가능성, 및/또는
- 근위축성 측삭 경화증(ALS) 질환 상태에 걸리기 쉬운 소인(특히 인간에서), 및/또는
- 빠른 진행성 근위축성 측삭 경화증(ALS) 질환 상태에 걸리기 쉬운 소인, 및/또는
- 공격성 2형 당뇨병 질환 상태에 걸리기 쉬운 소인, 및/또는
- 2형 당뇨병 질환 상태에 걸리기 쉬운 소인, 및/또는
- 전-2형 당뇨병 상태에 걸리기 쉬운 소인, 및/또는
- 1형 당뇨병 질환 상태에 걸리기 쉬운 소인, 및/또는
- 전신성 홍반성 낭창(SLE) 질환 상태에 걸리기 쉬운 소인, 및/또는
- 궤양성 대장염 질환 상태에 걸리기 쉬운 소인, 및/또는
- 궤양성 대장염 환자의 대장암의 재발 가능성, 및/또는
- 신경섬유종증 환자의 악성 말초 신경초 종양의 가능성, 및/또는
- 전립선암 및/또는 공격성 전립선암의 발병 가능성일 수 있다.
본 발명의 제3 양태는 개체에서(특히 인간 개체에서) 병태의 치료 및/또는 예방에서의 사용을 위한 치료제(특히 약제학적 치료제)를 제공하며, 상기 개체는 본 발명의 제2 양태의 방법에 의해 상기 치료제를 필요로 하는 것으로 확인되었다. 본 발명의 제3 양태는 또한 개체에서(특히, 인간 개체에서) 병태의 치료 및/또는 예방에서 사용하기 위한 약제(특히, 치료제를 포함하는 약제학적 조성물)의 제조에서의 치료제(예컨대, 약제학적 치료제)의 용도를 제공하며, 상기 개체는 본 발명의 제2 양태의 방법에 의해 상기 치료제를 필요로 하는 것으로 확인되었다. 본 발명의 제3 양태는 또한 치료제(예컨대, 약제학적 치료제 및/또는 유효량의 치료제)를 개체에게 투여하는 단계를 포함하는, 개체에서의(특히, 인간 개체 및/또는 이를 필요로 하는 개체에서의) 병태의 치료 및/또는 예방 방법을 제공하며, 상기 개체는 본 발명의 제2 양태의 방법에 의해 상기 치료제를 필요로 하는 것으로 확인되었다.
바람직하게는, 본 발명의 제3 양태(및/또는 다른 양태)에서, 치료제(특히, 약제학적 치료제)는
- 특히, 인간에서; 염증성 질환의 치료 및/또는 예방에서의 용도에 적합한 약제학적 활성제(예컨대, 화합물 또는 생물/생물학적 작용제, 예컨대 단백질 또는 항체);
- 특히, 인간에서; 바람직하게는 류마티스성 관절염(RA)의 치료 및/또는 예방에서의 용도에 적합한 약제학적 활성제(예컨대, 화합물 또는 생물/생물학적 작용제, 예컨대 단백질 또는 항체); 바람직하게는 약제학적 활성제는 메토트렉세이트; 하이드록시클로로퀸; 설파살라진; 레플루노미드; TNF-알파(종양 괴사 인자 알파) 억제제, 특히 단클론 항체 TNF-알파 억제제, 예컨대 인플릭시맙, 아달리무맙, 세르톨리주맙 페골 또는 골리무맙, 또는 순환 수용체 융합 단백질 TNF-알파 억제제, 예컨대 에타네르셉트; 또는 T 세포 공동자극 억제제, 예컨대 아바타셉트; 또는 인터루킨 1(IL-1) 억제제, 예컨대 아나킨라; 또는 B 세포에 대한 단클론 항체, 예컨대 리툭시맙 또는 토실리주맙; 또는
- 특히, 인간에서; 혈액암, 바람직하게는 급성 골수성 백혈병(AML)의 치료 및/또는 예방에서의 용도에 적합한 약제학적 활성제(예컨대, 화합물 또는 생물/생물학적 작용제, 예컨대 단백질 또는 항체); 또는
- 특히, 인간에서; 고형 암/고형 종양, 바람직하게는 흑색종, 전립선암 및/또는 공격성 전립선암의 치료 및/또는 예방에서의 용도에 적합한 약제학적 활성제(예컨대, 화합물 또는 생물/생물학적 작용제, 예컨대 단백질 또는 항체); 또는
- 특히, 인간에서; 신경퇴행성 질환 또는 병태, 바람직하게는 치매, 예컨대 알츠하이머병, 경도 인지 장애, 혈관성 치매, 루이소체 치매, 전측두엽 치매, 또는 더욱 바람직하게는 알츠하이머병, 예컨대 베타-아밀로이드 응집체 유도 알츠하이머병의 치료 및/또는 예방에서의 용도에 적합한 약제학적 활성제(예컨대, 화합물 또는 생물/생물학적 작용제, 예컨대 단백질 또는 항체)를 포함한다.
본 발명의 제4 양태는 후보 작용제가 염색체 상호작용을 제1 상태에 상응하는 것으로부터 제2 상태에 상응하는 염색체 상호작용으로 변화시킬 수 있는지 결정하는 것을 포함하는, 개체의 질환 상태를 제1 상태로부터 제2 상태로 변화시킬 수 있는 작용제를 확인하는 방법을 제공하며, 바람직하게는 제1 및 제2 상태는
(i) 특정 치료 및/또는 예방(특히, 특정 약제학적 치료 및/또는 예방)에 대한 반응성, 및/또는
(ii) 특정 병태에 걸리기 쉬운 소인, 및/또는
(iii) 재발로 이어질 수 있는 잔존 질환
의 존재 또는 부존재에 상응한다.
본 발명의 제5 양태는 약물에 의해 야기되는 후성적 염색체 상호작용의 변화를 검출하는 단계를 포함하는 약물의 효과를 결정하는 방법을 제공하며, 상기 효과는 바람직하게는 약물의 작용 기전이거나 약물의 약력학 특성이며, 상기 염색체 상호작용은 바람직하게는
(i) 특정 치료 및/또는 예방(특히, 특정 약제학적 치료 및/또는 예방)에 대한 반응성, 및/또는
(ii) 특정 병태에 걸리기 쉬운 소인, 및/또는
(iii) 재발로 이어질 수 있는 잔존 질환
에 특이적이다.
부가적으로 또는 대안적으로, 본 발명의 모든 양태의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명은 5개 이상(특히 7개 이상, 또는 10개 이상, 또는 15개 이상, 또는 20개 이상)의 염색체 상호작용의 존재 또는 부존재를 검출하는 것을 포함하는, 대상(예컨대, 인간 대상과 같은 포유동물)에서 류마티스성 관절염을 위한 특정 요법(특히, 특정 약제학적 요법)에 대한 반응성을 결정하는 방법으로서; 상기 염색체 상호작용은 특히 5개 이상(예를 들어 5개)의 상이한 유전자좌에서 일어나고/나거나; 상기 검출은 특히 상호작용의 부분인 염색체의 영역이 모였는지 여부를 각 상호작용에 대해 결정하는 것을 포함하는 방법에 관한 것은 아니다 .
도 1은 염색체 형태 시그너처(Chromosome Conformation Signature) EpiSwitchTM 마커가 MTX 반응자(R)와 비반응자(NR)를 구별한다는 것과 관련된 원 도표 및 그래프를 포함하는 도면이다. 반응자(R) 및 비반응자(NR) RA 환자의 발견 코호트는 DAS28(28개 관절의 질환 활성 점수) EULAR(류머티즘에 대한 유럽 연맹) 반응 기준(방법 참조)에 기초하여 선택되었다. (A) 원 도표는 기저선 및 6개월에 R 및 NR 환자 모두에 대한 CDAI 점수의 임상적 해석을 보여준다. (B) 기저선 및 6개월에 R 및 NR 환자에 대한 CDAI 점수. (C) R 및 NR, 및 건강한 대조군(HC)으로부터의 진단에서 수행된 말초 혈액 단핵 세포의 EpiSwitchTM 어레이 분석은 922개의 통계학적으로 유의한 계층화 마커 후보를 확인하였다. 추가 분석은 420개가 NR에 대해 특이적이고, 210개가 R에 대해 특이적이며, 159개가 HC에 대해 특이적임을 밝혀내었다. 원 도표는 스크리닝된 13,322개의 병태적 염색체 형태에 대한 비율을 나타낸다. 모든 마커는 조절된 p<0.2를 나타내었다. (D) 완전한 결합 군집화(complete linkage agglomeration)와 함께 맨해튼 거리 측정을 사용한 계층적 군집분석이 열지도에 의해 나타나 있다. 3개의 그룹(R, NR 및 HC)에 대해 이진 패턴화를 사용한 마커 선택은 처음에는 922개의 EpiSwitch™ 마커를 65개로 줄이고, 그 다음 상위 30개 마커로 줄였다.
도 2는 염색체 형태 시그너처 EpiSwitchTM 마커의 정제 및 검증과 관련된 원 도표 및 그래프를 포함하는 도면이다. 반응자(R) 및 비반응자(NR) RA 환자의 검증 코호트는 DAS28(28개 관절의 질환 활성 점수) EULAR(류머티즘에 대한 유럽 연맹) 반응 기준(방법 참고)에 기초하여 선택되었다. (A) 원 도표는 기준선 및 6개월에 R 및 NR 환자 모두에 대한 CDAI 점수의 임상적 해석을 나타낸다. (B) 기준선 및 6개월에 R 및 NR 환자의 CDAI 점수. **** 던(Dunn)의 다중 비교 사후 검정을 이용한 크루스칼-왈리스(Kruskal-Wallis) 검정에 의해 P<0.0001 (C) 분류화 5개의 EpiSwitchTM 마커의 상관관계 플롯. 적색 박스는 NR을 정의하는 마커를 나타내는 반면 오렌지 박스는 R을 정의하는 마커를 나타낸다. (D) 분류화 5개 EpiSwitchTM 마커에 대한 이진 점수에 기초한 60명의 환자 코호트의 주성분 분석(PCA) .
도 3은 메토트렉세이트(MTX) 치료에 대한 반응의 예후적 계층화 및 모델 검증과 관련된 그래프를 포함하는 도면이다. (A) 5개의 CCS 마커 로지스틱 회귀 분류기를 사용하여 데이터의 150개의 무작위 추출로부터 5개의 선택된 수신자 조작 특징(ROC) 곡선의 대표적인 예. (B) MTX 비반응자로부터 MTX 반응자를 식별하기 위해 선택된 EpiSwitch™ CCS 마커를 사용한 반응자(R) 및 비반응자(NR) RA 환자 대 건강한 대조군(HC)의 요인 분석.
도 4는 3C 추출 공정의 개략도이다. 3C는 염색질 형태 포획, 또는 염색체 형태 포획을 의미한다.
도 5는 MTX 치료 6개월 이내에 반응자(N) 또는 비반응자(NR)로서 확인된 DMARDS 순수한 ERA 환자에 대한 후성적 계층화 바이오마커 시그너처의 발견 및 검증을 위한 설계를 예시하는 도식이다. 후성적 계층화는 EpiSwitchTM 어레이 및 PCR(중합효소 연쇄 반응) 플랫폼에 의해 스크리닝되고 모니터링된 병태적 염색체 확인에 기초하였다. 확인된 바이오마커의 질환 특이적 후성적 성질은 건강한 대조군(HC)에 대한 계층화에 의해 확인되었다. 검증은 60명의 RA 환자(30명의 반응자 및 30명의 비반응자) 및 30명의 HC에 대해 수행되었다.
본 발명은 몇 가지 상이한 양태를 갖는다:
- 특히 하위그룹 간을 구별하는 동반 진단과 관련된 염색체 상호작용(특히 후성적)을 확인하는 방법;
- 동반 진단 방법;
- 개체의 치료 및/또는 예방(예컨대, 개체, 예컨대, 인간 개체에서 병태의 치료 및/또는 예방)에서의 사용을 위한 치료제, 상기 개체는 특히 본 발명의 동반 진단 방법에 의해 치료제를 필요로 하는 것으로 확인되었음;
- 후보 작용제가 염색체 상호작용, 특히 질환 상태와 관련되거나 연관된 염색체 상호작용을 변화시킬 수 있는지 결정하는 단계를 포함하는, 개체에서 또는 개체의 질환 상태를 변화시킬 수 있는 작용제, 특히 치료제를 스크리닝하는(확인하는) 방법;
- 약물에 의해 야기되는 후성적 염색체 상호작용의 변화를 검출하는 단계를 포함하는 약물의 효과를 결정하는 방법.
후성적 상호작용
본원에 사용된 바와 같이, 용어 '후성적' 상호작용은 전형적으로 염색체 상의 유전자좌의 원위 영역 사이의 상호작용을 지칭하며, 상기 상호작용은 역동적이며, 염색체의 영역의 상태에 따라 변경하거나, 형성하거나 파괴한다.
본 발명의 특정 방법에서, 염색체 상호작용은 염색체 상호작용의 부분인 염색체의 두 영역으로부터의 서열(들)을 포함하는 라이게이션된 핵산을 먼저 생성함으로써 검출된다. 이러한 방법에서, 영역들은 임의의 적합한 수단에 의해 교차결합될 수 있다. 바람직한 구현예에서, 상호작용은 포름알데하이드를 사용하여 교차결합되지만, 임의의 알데하이드, 또는 D-바이오티노일-e-아미노카프로산-N-하이드록시석신이미드 에스테르 또는 디곡시게닌-3-O-메틸카르보닐-e-아미노카프로산-N-하이드록시석신이미드 에스테르에 의해서도 교차결합될 수 있다. 파라-포름알데하이드는 4 옹스트롬 떨어진 DNA 사슬을 교차결합시킬 수 있다.
염색체 상호작용은, 예를 들어, 생리 조건의 변화에 반응하여 전사되거나 억압되고 있는 경우, 염색체의 영역의 상태를 반영할 수 있다. 본원에 정의된 바와 같이 하위그룹에 특이적인 염색체 상호작용은 안정한 것으로 나타났으며, 따라서 두 하위그룹 간의 차이를 측정하는 신뢰할만한 수단을 제공한다.
또한, 질환 병태에 특이적인 염색체 상호작용은 일반적으로, 예를 들어 메틸화 또는 히스톤 단백질의 결합에 대한 변화와 같은 다른 후성적 마커와 비교하여, 질환 진행 초기에 발생한다. 따라서, 본 발명의 동반 진단 방법은 질환 상태의 초기 단계를 검출할 수 있다. 이것은 조기 치료를 가능하게 하여 결과적으로 더 효과적일 수 있다. 본 발명의 또 다른 이점은 어떤 유전자좌가 관련된 염색체 상호작용의 확인과 관련이 있는지에 대한 사전 지식이 필요하지 않다는 점이다. 또한, 동일한 하위그룹 내의 개체 사이에는 관련된 염색체 상호작용의 변화가 거의 없다. 염색체 상호작용을 검출하는 것은 유전자당 최대 50개의 상이한 가능한 상호작용으로 매우 유익하므로, 본 발명의 방법은 500,000개의 상이한 상호작용을 조사할 수 있다.
후성적 상호작용의 위치 및 원인
후성적 염색체 상호작용은 중복될 수 있고 관련되거나 기술되지 않은 유전자를 코딩하는 것으로 나타난 염색체의 영역을 포함할 수 있지만, 동일하게 유전자간 영역 내에 있을 수 있다. 또한, 모든 영역에서의 후성적 상호작용이 염색체 유전자좌의 상태를 결정하는데 동등하게 중요하다는 것을 본 발명자들이 발견하였다는 점에 유의한다. 이러한 상호작용은 반드시 유전자좌에 위치한 특정 유전자의 코딩 영역에 있을 필요는 없으며 유전자간 영역에 있을 수 있다.
본 발명에서 검출되는 염색체 상호작용은 근본적인 DNA 서열의 변화, 환경적 요인, DNA 메틸화, 비코딩 안티센스 RNA 전사체, 비돌연변이유발 발암물질, 히스톤 변형, 염색질 재형성 및 특정 국소 DNA 상호작용에 의해 유발될 수 있다. 염색체 상호작용을 야기하는 변화는, 이 자체로는 유전자 생성물 또는 유전자 발현 방식에 직접적으로 영향을 미치지 않는, 근본적인 핵산 서열의 변화에 의해 유발될 수 있다. 이러한 변화는 예를 들어, 유전자의 내부 및/또는 외부의 SNP, 유전자 융합 및/또는 유전자간 DNA, 마이크로RNA, 및 비코딩 RNA의 결실일 수 있다. 예를 들어, 약 20% SNP가 비코딩 영역에 있는 것으로 알려져 있으므로, 기술된 방법은 비코딩 상황에서도 유익하다. 일 구현예에서, 상호작용을 형성하기 위해 모인 염색체의 영역은 5 kb, 3 kb, 1 kb, 500개 염기쌍 또는 200개 염기쌍 미만으로 떨어져 있다.
동반 진단 방법에서 검출되는 염색체 상호작용은 바람직하게는 본원의 표에 언급된 임의의 유전자 내에 있는 것이다. 그러나, 그것은 또한 유전자의 상류 또는 하류에 있을 수 있으며, 예를 들어 유전자 또는 코딩 서열로부터 최대 50,000, 30,000, 20,000, 10,000 또는 5000개 염기 상류 또는 하류에 있을 수 있다.
검출되는 염색체 상호작용은 유전자(코딩 서열 포함) 및 그의 조절 영역, 예컨대 프로모터 사이에서 발생하는 것일 수 있거나 아닐 수도 있다. 타이핑되는 염색체 상호작용은 유전된 것, 예를 들어 유전자 영역의 유전된 각인된 특징이거나 아닐 수도 있다.
임상학적 상황의 유형
RA(류마티스성 관절염)의 특정 사례는 일반 원리를 예시한다. 환자가 처음 약물을 투여받을 때 환자가 메토트렉세이트(MTX)에 반응할지 여부를 결정하기 위해 임상의가 선험적으로 시험할 수 있는 시험은 현재 없다. 상당수(약 30%)의 환자가 MTX에 반응하지 않으므로, 환자가 반응자 또는 비반응자인지 여부를 예측할 수 있으면 RA를 성공적으로 치료할 기회를 증가시킬 수 있을 뿐만 아니라 시간과 비용을 절약할 수 있을 것이다.
이것은 본 발명자가 사용되는 본 발명을 어떻게 시각화하는지에 관한 한 가지 예이다. 더 광범위하게 말하면, 본 발명의 목적은 질환을 검출하고 모니터링할 수 있도록 하기 위한 것이다. 보다 상세하게, 이 기술은 의학적 병태와 관련된 특이적 표현형에 대한 바이오마커에 기초하여, 즉, 특정 염색체 확인 시그너처 및/또는 상기 특정 시그너처의 변화를 인식함으로써, 계층화를 가능하게 한다.
본 발명의 방법은 바람직하게는 질환과 관련된 특이적 특징, 예컨대 치료 및/또는 예방에 대한 반응성, 가장 효과적인 요법/약물의 확인, 질환의 과정의 모니터링, 질환에 걸리기 쉬운 소인의 확인, 및/또는 잔존 질환 및/또는 재발 가능성의 의 존재의 확인의 맥락에서 사용된다. 따라서, 본 방법은 특정 병태의 존재의 진단에 사용되거나 사용되지 않을 수 있다. 본 발명의 방법은 질환의 기전이 알려져 있지 않거나, 불명확하거나 또는 복잡한 경우 유전자좌를 타이핑하는데 사용될 수 있다. 염색체 상호작용의 검출은 상이한 조절 수준에서의 변화를 이해하는 효율적인 방법을 제공하며, 그 중 일부는 복잡하다. 예를 들어, 일부 경우, 약 37,000개의 비코딩 RNA가 단일 충격에 의해 활성화될 수 있다.
하위그룹 및 개인화된 치료
본원에 사용된 바와 같이, "하위그룹"은 바람직하게는 집단 하위그룹(집단 내의 하위그룹), 더욱 바람직하게는 특정 포유동물(예컨대, 인간, 비인간 영장류, 또는 설치류, 예컨대, 마우스 또는 랫트) 또는 특정 선충(예컨대, C. elegans)과 같은 특정 동물의 집단 내의 하위그룹을 지칭한다. 가장 바람직하게는, "하위그룹"은 인간 집단 내의 하위그룹을 지칭한다.
관심있는 특정 집단, 예컨대, 인간 집단은 전체 인간 집단, 특정 병태/질환(특히 염증성 질환, 예컨대, RA, 혈액암, 예컨대 AML, 고형 암, 예컨대 흑색종 또는 전립선암(PC), 또는 신경퇴행성 질환/병태, 예컨대, 알츠하이머병(AD))으로 고통받는 인간 집단, 인간의 건강한 집단(건강한 대조군), 관심있거나 연구 중인 특정 병태/질환(예컨대, RA, AML, 흑색종, PC 또는 AD)로 고통받고 있지 않다는 의미에서 건강한 인간 집단, 특정 약물/요법에 대한 반응자인 인간 집단(예컨대, 건강하고/하거나 특정 병태/질환, 예컨대, RA, AML, 흑색종, PC 또는 AD를 가짐), 또는 특정 약물/요법에 대한 비반응자인 인간 집단(예컨대, 건강하고/하거나 특정 병태/질환, 예컨대, RA, AML, 흑색종, PC 또는 AD를 가짐)을 포함한다.
본 발명은 집단 내의, 바람직하게는 인간 집단 내의 특정 하위그룹을 검출하고 치료하는 것에 관한 것이다. 이러한 하위그룹 내에서, 본원에 논의된 특징(예컨대, 치료 및/또는 예방에 대한 반응성; 특히 하나 이상의 병태 또는 질환의 특정 치료 및/또는 예방에 대한 반응성, 및/또는 특히 하나 이상의 병태 또는 질환의 치료 및/또는 예방에서 특정 약물 또는 치료적 활성 물질/치료제에 대한 반응성)은 존재하거나 부존재할 것이다. 염색체 상의 후성적 상호작용 차이는, 일반적으로 말하면, 게놈 수준에서 존재하는 구조적 차이이다. 본 발명자들은 이들이 주어진 집단 내의 하위집합(예를 들어, 2, 또는 2 이상의 하위집합) 사이에서 상이하다는 것을 발견하였다. 이러한 차이의 확인은 의사가 그들의 환자를 방법에 기술된 바와 같이 집단의 하나의 하위집합의 일부로서 분류할 수 있게 할 것이다. 따라서, 본 발명은 의사에게 이들의 후성적 염색체 상호작용에 기초하여 환자를 위한 약물을 개인화하는 방법을 제공하고, 대안적인 보다 효과적인 치료 및/또는 예방 요법을 제공한다.
또 다른 구현예에서, 어느 정도까지 대상이 하나의 하위그룹에 속하고 집단의 다른 하위그룹에는 속하지 않는 것으로 정의되는지 결정하기 위한 역치 수준이 적용된다. 하위그룹이 특정 질환의 치료 및/또는 예방을 위한 요법의 반응자 대 비반응자를 포함하는 일 바람직한 구현예에서, 상기 역치는 특히 류마티스성 관절염에 대한 DAS28(28개 관절의 질환 활성 점수) 점수의 변화에 의해 측정될 수 있다. 일 구현예에서, 1.2 단위를 초과하는 점수는 대상이 반응자 하위그룹에 속한다는 것을 나타내는 반면, 1.2 단위 미만의 점수는 대상이 비반응자로서 정의된다는 것을 나타낸다.
전형적으로 하위그룹은 일반 집단의 적어도 10%, 적어도 30%, 적어도 50% 또는 적어도 80%일 것이다.
라이게이션된 핵산 생성
본 발명의 특정 구현예는 라이게이션된 핵산, 특히 라이게이션된 DNA를 사용한다. 이들은 염색체 상호작용에 함께 모인 두 영역으로부터의 서열을 포함하며, 따라서 상호작용에 관한 정보를 제공한다. 본원에 기재된 EpiSwitchTM 방법은 염색체 상호작용을 검출하기 위해 이러한 라이게이션된 핵산의 생성을 이용한다.
이러한 한 가지 방법, 특히 염색체 상호작용을 검출하는 하나의 특정한 방법 및/또는 후성적 염색체 상호작용을 결정하는 하나의 특정한 방법 및/또는 라이게이션된 핵산(예컨대, DNA)을 생성하는 하나의 특정한 방법은
(i) 염색체 유전자좌에 존재하는 상기 후성적 염색체 상호작용을 시험관내에서 교차결합시키는 단계;
(ii) 선택적으로 상기 염색체 유전자좌로부터 교차결합된 DNA를 단리시키는 단계;
(iii) 상기 교차결합된 DNA를 이를 적어도 1회 절단하는 효소(특히 상기 염색체 유전자좌 내에서 적어도 1회 절단하는 효소)를 이용하여 제한 소화시키는 단계;
(iv) 상기 교차결합된 절단된 DNA 말단을 라이게이션하는 단계(특히 DNA 루프를 형성하기 위해); 및
(v) 특이적 염색체 상호작용의 존재를 확인하기 위해, 특히 PCR(중합효소 연쇄 반응)과 같은 기술을 사용하여, 상기 라이게이션된 DNA 및/또는 상기 DNA 루프의 존재를 확인하는 단계
를 포함한다.
특히 상기 언급된 교차결합, 제한 소화, 라이게이션, 및 확인 단계를 포함하는, 염색체 상호작용 및/또는 후성적 변화를 검출하고, 결정하고/하거나 모니터링하는 하나의 특히 바람직한 방법은 WO 제2009/147386호 A1(Oxford Biodynamics Ltd)에 개시되어 있으며, 이의 전체 개시내용(특히 이의 청구항 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 또는 21)은 완전히 제시된 것처럼 참고로 본원에 통합되어 있다. 라이게이션된 생성물(들) 및/또는 라이게이션된 핵산(들)을 포함하는 본 발명의 방법에서 사용될 수 있는 WO 제2009/147386호 A1의 청구항 1은 적어도 하나의 염색체 유전자좌에서의 병태적 장거리 염색체 상호작용의 변화를 모니터링하는 단계를 포함하는 후성적 변화를 모니터링하는 방법을 개시하며, 여기서 장거리 상호작용의 범위는 특정 생리학적 병태와 관련되며, 상기 방법은
(i) 적어도 하나의 염색체 유전자좌에 존재하는 상기 장거리 염색체 상호작용을 시험관내에서 교차결합시키는 단계;
(ii) 상기 염색체 유전자좌로부터 교차결합된 DNA를 단리시키는 단계;
(iii) 상기 교차결합된 DNA를 적어도 하나의 염색체 유전자좌 내에서 적어도 1회 절단하는 효소를 이용하여 제한 소화시키는 단계;
(iv) 상기 교차결합된 절단된 DNA 말단을 라이게이션하여 DNA 루프를 형성하는 단계; 및
(v) 상기 DNA 루프의 존재를 확인하는 단계
를 포함하고;
DNA 루프의 존재는 특정 장거리 염색체 상호작용의 존재를 나타낸다.
PCR(중합효소 연쇄 반응)은 라이게이션된 핵산을 검출하거나 확인하는데 사용될 수 있고, 예를 들어 생성된 PCR 생성물의 크기는 존재하는 특정 염색체 상호작용을 나타낼 수 있으며, 따라서 유전자좌의 상태를 확인하는데 사용될 수 있다. 당업자는 관심있는 염색체 유전자좌 내의 DNA를 절단하는데 사용될 수 있는 수많은 제한 효소를 알 것이다. 사용된 특정 효소는 연구된 유전자좌 및 내부에 위치한 DNA의 서열에 좌우될 것임이 명백할 것이다. 본 발명에 기재된 바와 같이 DNA를 절단하는데 사용될 수 있는 제한 효소의 비제한적인 예는 Taq I 중합효소이다.
EpiSwitch TM 기술과 같은 구현예
EpiSwitchTM 기술은 표현형에 특이적인 후성적 염색체 형태 시그너처의 검출에서 마이크로어레이 EpiSwitchTM 마커 데이터의 용도와 관련된다. 본 발명자들은 어떻게 EpiSwitchTM 어레이 플랫폼이 특정한 불리한 표현형 하위그룹 대 건강한 대조군에 특이적인 잠재적인 바이오마커의 염색체 시그너처 풀(pool)의 발견에 사용되어 왔는지 본원에서 설명한다. 본 발명자들은 또한 어레이 상에서 시험된 코호트로부터의 하위그룹 사이에 특이적인 몇 가지 마커의 예와 함께 마이크로어레이로부터의 염색체 형태 시그너처의 PCR 플랫폼으로의 검증된 용도 및 번역의 예를 제공한다.
본원에 기술된 방식으로(관련된 염색체 상호작용을 확인하기 위해 그리고 동반 진단 방법에서) 라이게이션된 핵산을 이용하는 EpiSwitchTM과 같은 구현예는 몇 가지 이점을 갖는다. 이들은 확률적 노이즈 수준이 낮은데, 예를 들어 본 발명의 핵산의 제1 세트로부터의 핵산 서열은 핵산의 제2 세트와 혼성화되거나 혼성화되지 못하기 때문이다. 이것은 후성적 수준에서 복잡한 기전을 측정하는 상대적으로 간단한 방식을 허용하는 이진 결과를 제공한다. EpiSwitchTM 기술은 또한 처리 시간이 빠르고 비용이 저렴하다. 일 구현예에서, 처리 시간은 3시간 내지 6시간이다.
샘플 및 샘플 처리
샘플은 개체의 DNA를 함유할 것이다. 샘플은 일반적으로 세포를 함유할 것이다. 일 구현예에서, 샘플은 최소 침습 수단에 의해 얻어지며, 예를 들어 혈액일 수 있다. DNA는 추출되고 표준 제한 효소로 절단될 수 있다. 이것은 염색체 형태가 유지되는지 미리 결정할 수 있고, EpiSwitchTM 플랫폼으로 검출될 것이다. 샘플이 환자로부터 이전에 얻어진 혈액 샘플인 일 구현예에서, 설명된 방법은 절차가 최소 침습적이기 때문에 유리하다. 수평 이동을 포함하는 조직과 혈액 사이의 염색체 상호작용의 동기화로 인해, 혈액 샘플은 조직, 예컨대 질환과 관련된 조직에서 염색체 상호작용을 검출하는데 사용될 수 있다. 암과 같은 특정 병태의 경우, 돌연변이로 인한 유전적 노이즈는 관련된 조직에서 염색체 상호작용 '신호'에 영향을 미칠 수 있으므로, 혈액을 사용하는 것이 유리하다.
본 발명의 핵산의 특성
본원의 개시내용은 제1 및 제2 핵산을 언급한다. 또한, 핵산은 동반 진단 방법 및 다른 구현예에서 염색체 상호작용의 존재 또는 부존재를 검출하는데(예를 들어, 샘플로부터 생성된 라이게이션된 핵산에 결합함으로써) 사용된다. 본 발명의 핵산은 전형적으로 2개의 부분을 포함하며, 이들 각각은 염색체 상호작용에 함께 모인 염색체의 두 영역 중 하나로부터의 서열을 포함한다. 전형적으로 각 부분은 적어도 8, 10, 15, 20, 30 또는 40개 뉴클레오타이드 길이이다. 바람직한 핵산은, 특히 핵산이 표와 관련된 병태와 관련된 구현예에서 사용되는 경우, 상기 표에서 언급된 유전자 중 어느 것으로부터의 서열을 포함한다. 바람직한 핵산은 특정 병태에 대해 표에서 언급된 특정 프로브 서열 또는 이러한 서열의 단편 또는 동족체를 포함한다. 바람직하게는 핵산은 DNA이다. 특정 서열이 제공되는 경우, 본 발명은 특정 구현예에서 요구되는 바와 같은 상보성을 사용할 수 있음을 이해한다.
핵산의 제2 세트 - '지표' 서열
핵산 서열의 제2 세트는 지표인 기능을 가지며, 본질적으로 하위그룹 특이적 서열을 확인하는데 적합한 핵산 서열의 세트이다. 이들은 '배경' 염색체 상호작용을 나타낼 수 있고 일부 방식으로 선택될 수 있거나 선택되지 않을 수 있다. 이들은 일반적으로 모든 가능한 염색체 상호작용의 하위집합이다.
핵산의 제2 세트는 임의의 적합한 방법에 의해 도출될 수 있다. 이들은 계산적으로 도출될 수 있거나 이들은 개체 내의 염색체 상호작용에 기초할 수 있다. 이들은 핵산의 제1 세트보다 더 큰 집단 그룹을 나타낸다. 일 특정 구현예에서, 핵산의 제2 세트는 유전자의 특정 세트에서 모든 가능한 후성적 염색체 상호작용을 나타낸다. 또 다른 특정 구현예에서, 핵산의 제2 세트는 본원에 기재된 집단에 존재하는 모든 가능한 후성적 염색체 상호작용의 큰 부분을 나타낸다. 일 특정 구현예에서, 핵산의 제2 세트는 적어도 20, 50, 100 또는 500개 유전자에서의 후성적 염색체 상호작용의 적어도 50% 또는 적어도 80%를 나타낸다.
핵산의 제2 세트는 전형적으로 집단에서 질환 상태/표현형을 변형, 조절 또는 임의의 방식으로 매개하는 적어도 100개의 가능한 후성적 염색체 상호작용을 나타낸다. 핵산의 제2 세트는, 예를 들어 임의의 질환 상태, 질환에 걸리기 쉬운 소인 또는 질환 표현형과 관련된 사이토카인, 키나아제, 또는 조절자를 코딩하는 핵산 서열을 포함하는, 종에서의 질환 상태에 영향을 미치는 염색체 상호작용을 나타낼 수 있다. 핵산의 제2 세트는 동반 진단 방법과 관련되고 관련되지 않은 후성적 상호작용을 나타내는 서열을 포함한다.
일 특정 구현예에서, 핵산의 제2 세트는 집단에서 자연발생 서열로부터 적어도 부분적으로 도출되며, 전형적으로 인실리코(in silico) 방법에 의해 수득된다. 상기 핵산은 자연발생 핵산에 존재하는 핵산의 상응하는 부분과 비교하여 단일 또는 다중 돌연변이를 추가로 포함할 수 있다. 돌연변이는 하나 이상의 뉴클레오타이드 염기쌍의 결실, 치환 및/또는 부가를 포함한다. 일 특정 구현예에서, 핵산의 제2 세트는 자연발생 종에 존재하는 핵산의 상응하는 부분과 적어도 70% 서열 동일성을 갖는 동족체 및/또는 오소로그(orthologue)를 나타내는 서열을 포함할 수 있다. 또 다른 특정 구현예에서, 자연발생 종에 존재하는 핵산의 상응하는 부분에 대한 적어도 80% 서열 동일성 또는 적어도 90% 서열 동일성이 제공된다.
핵산의 제2 세트의 특성
일 특정 구현예에서, 핵산의 제2 세트에는 적어도 100개의 상이한 핵산 서열, 바람직하게는 적어도 1000, 2000 또는 5000개의 상이한 핵산 서열, 최대 100,000, 1,000,000 또는 10,000,000개의 상이한 핵산 서열이 존재한다. 전형적인 개수는 100 내지 1,000,000개, 예컨대 1,000 내지 100,000개의 상이한 핵산 서열일 것이다. 모두 또는 적어도 90% 또는 적어도 50% 또는 이들은 상이한 염색체 상호작용에 상응할 것이다.
일 특정 구현예에서, 핵산의 제2 세트는 적어도 20개의 상이한 유전자좌 또는 유전자, 바람직하게는 적어도 40개의 상이한 유전자좌 또는 유전자, 및 더욱 바람직하게는 적어도 100개, 적어도 500개, 적어도 1000개 또는 적어도 5000개의 상이한 유전자좌 또는 유전자, 예컨대 100 내지 10,000개의 상이한 유전자좌 또는 유전자에서의 염색체 상호작용을 나타낸다.
핵산의 제2 세트의 길이는 이들을 왓슨 크릭 염기쌍에 따라 핵산의 제1 세트에 특이적으로 혼성화시켜 하위그룹에 특이적인 염색체 상호작용을 확인하는데 적합하다. 전형적으로 핵산의 제2 세트는 염색체 상호작용에 함께 모인 두 염색체 영역에 서열이 상응하는 2개의 부분을 포함할 것이다. 핵산의 제2 세트는 전형적으로 적어도 10개, 바람직하게는 20개, 및 바람직하게는 30개 염기(뉴클레오타이드) 길이의 핵산 서열을 포함한다. 또 다른 구현예에서, 핵산 서열은 최대 500개, 바람직하게는 최대 100개, 및 바람직하게는 최대 50개 염기쌍 길이일 수 있다. 바람직한 구현예에서, 핵산의 제2 세트는 17 내지 25개 염기쌍의 핵산 서열을 포함한다. 일 구현예에서, 핵산 서열의 제2 세트 중 적어도 100, 80% 또는 50%는 상기 기재된 바와 같은 길이를 갖는다. 바람직하게는, 상이한 핵산은 임의의 중복 서열을 갖지 않으며, 예를 들어 핵산의 적어도 100%, 90%, 80% 또는 50%는 적어도 5개의 인접한 뉴클레오타이드에 걸쳐 동일한 서열을 갖지 않는다.
핵산의 제2 세트가 '지표'로서 작용한다는 것을 고려할 때, 제2 핵산의 동일한 세트는 상이한 특징의 하위그룹을 나타내는 제1 핵산의 상이한 세트와 함께 사용될 수 있으며, 즉, 핵산의 제2 세트는 상이한 질환 특징과 관련된 염색체 상호작용을 확인하는데 사용될 수 있는 핵산의 '보편적인' 수집을 나타낼 수 있다.
핵산의 제1 세트
핵산의 제1 세트는 본원에 언급된 임의의 이러한 특징과 같은, 동반 진단과 관련된 특징의 존재 또는 부존재에 의해 정의된 둘 이상의 별개의 하위그룹에서 존재하는 것으로 알려진 개체로부터 일반적으로 유래된다. 제1 핵산은 본원에 언급된 핵산의 제2 세트의 특징 및 특성 중 어느 것을 가질 수 있다. 핵산의 제1 세트는 일반적으로 본원에 기재된 바와 같은 처리 및 가공, 특히 EpiSwitchTM 교차결합 및 절단 단계를 겪은 개체로부터의 샘플로부터 유래된다. 전형적으로, 핵산의 제1 세트는 개체로부터 취한 샘플에 존재하는 염색체 상호작용의 모두 또는 적어도 80% 또는 50%를 나타낸다.
전형적으로, 핵산의 제1 세트는 핵산의 제2 세트에 의해 나타난 염색체 상호작용과 비교하여 핵산의 제2 세트에 의해 나타난 유전자좌 또는 유전자에 대한 염색체 상호작용의 더 작은 집단을 나타내고, 즉, 핵산의 제2 세트는 유전자좌 또는 유전자의 정의된 세트에서의 상호작용의 배경 또는 지표 세트를 나타내고 있다.
핵산의 라이브러리
본원에 기재된 핵산은 핵산의 제2 세트로부터의 적어도 200개, 적어도 500개, 적어도 1000개, 적어도 5000개 또는 적어도 10000개의 상이한 핵산을 포함하는 라이브러리 형태일 수 있다. 본 발명은 적어도 200개의 상이한 핵산을 포함하는 핵산의 특정 라이브러리를 제공한다. 핵산의 라이브러리는 본원에 언급된 핵산의 제2 세트의 특징 또는 특성 중 어느 것을 가질 수 있다. 라이브러리는 어레이에 결합된 핵산의 형태일 수 있다.
혼성화
본 발명은 핵산의 제1 세트 및 핵산의 제2 세트로부터의 전체적으로 또는 부분적으로 상보적인 핵산 서열을 혼성화시키는 수단을 필요로 한다. 일 구현예에서, 핵산의 제1 세트 모두는 단일 분석에서, 즉, 단일 혼성화 단계에서, 핵산의 제2 세트 모두와 접촉된다. 그러나, 임의의 적합한 분석이 사용될 수 있다.
표지된 핵산 및 혼성화의 패턴
본원에 언급된 핵산은, 바람직하게는 성공적인 혼성화의 검출을 돕는 형광단(형광 분자) 또는 방사성 표지와 같은 독립적인 표지를 사용하여, 표지될 수 있다. 특정 표지는 UV 광 하에서 검출될 수 있다.
예를 들어 본원에 기재된 어레이 상의 혼성화의 패턴은 2개의 하위그룹 사이의 후성적 염색체 상호작용의 차이를 나타내며, 따라서 후성적 염색체 상호작용을 비교하는 방법 및 후성적 염색체 상호작용이 본 발명의 집단 내의 하위그룹에 특이적인지 결정하는 방법을 제공한다.
용어 '혼성화의 패턴'은 광범위하게는 핵산의 제1 및 제2 세트 사이의 혼성화의 존재 및 부존재, 즉, 제1 세트로부터의 어떤 특정 핵산이 제2 세트로부터의 어떤 특정 핵산에 혼성화하는지를 포함하며, 따라서 그것은 임의의 특정 분석 또는 기술 또는 '패턴'이 검출될 수 있는 표면 또는 어레이를 가질 필요에 제한되지 않는다.
동반 진단 방법
본 발명은 염색체 상호작용에 의해 제공되는 정보에 기초한 동반 진단 방법을 제공한다. 개체가 동반 진단과 관련된 특정 특징을 갖는지 여부를 확인하는 2개의 별개의 동반 진단 방법이 제공된다. 한 가지 방법은 임의의 적합한 방식으로 유전자좌를 타이핑하는 것에 기초하고, 다른 방법은 염색체 상호작용의 존재 또는 부존재를 검출하는 것에 기초한다. 특징은 병태와 관련하여 본원에 언급된 특징 중 어느 하나일 수 있다. 동반 진단 방법은, 예를 들어 개체의 모니터링이 필요한 경우, 하나를 초과하는 시점에 수행될 수 있다.
유전자좌를 타이핑하는 것에 기초한 동반 진단 방법
하위그룹에 특이적인 염색체 상호작용을 확인한 본 발명의 방법은 동반 진단 시험의 기초로서 타이핑될 수 있는 유전자일 수 있는 유전자좌를 확인하는데 사용될 수 있다. 많은 상이한 유전자 관련 효과는 동일한 염색체 상호작용을 발생시킬 수 있다. 이 구현예에서, 유전자좌 또는 발현된 핵산 또는 단백질에서의 다형성의 존재, 유전자좌로부터의 발현 수준, 유전자좌의 물리적 구조 또는 유전자좌에 존재하는 염색체 상호작용과 같은, 유전자좌의 임의의 특징이 타이핑될 수 있다. 일 특정 구현예에서, 유전자좌는 표에서, 특히 표 1, 3, 5, 6c, 6E, 18a, 18b, 18c, 18d, 18e, 18f, 22, 23, 24 또는 25(특히 표 1, 3 및/또는 5)에서 본원에 언급된 유전자 중 어느 것일 수 있거나, 또는 관련된 병태와 관련된 것으로 확인된 염색체 상호작용의 부근의 유전자좌의 임의의 특성일 수 있다.
염색체 상호작용의 검출에 기초한 동반 진단 방법
본 발명은 개체에서 특징의 존재 또는 부존재를 결정하기 위해, 염색체 상호작용, 전형적으로 5 내지 20개 또는 5 내지 500개의 이러한 상호작용, 바람직하게는 20 내지 300개 또는 50 내지 100개의 상호작용의 존재 또는 부존재를 검출하는 단계를 포함하는 동반 진단 방법을 제공한다. 바람직하게는, 염색체 상호작용은 본원에 언급된 임의의 유전자에서의 염색체 상호작용이다. 일 특정 구현예에서, 타이핑되는 염색체 상호작용은, 예를 들어 방법이 표에서 정의된 특징의 존재 또는 부존재를 결정하기 위한 것일 때, 본원의 표에, 특히 본원의 표 6b, 6D, 18b, 18e, 18f, 22, 23, 24 또는 25에 개시된 핵산에 의해 나타나는 염색체 상호작용이다.
특정 병태
동반 진단 방법은 본원에 언급된 특정 병태 또는 특징 중 어느 것의 존재를 검출하는데 사용될 수 있다. 동반 진단 방법은 류마티스성 관절염 환자에서 메토트렉세이트(또는 또 다른 류마티스성 관절염 약물)에 대한 반응성, 급성 골수성 백혈병(AML) 환자를 위한 요법에 대한 반응성, 흑색종의 재발 가능성, 전립선암 및/또는 공격성 전립선암의 발병 가능성, 및/또는 베타-아밀로이드 응집체 유도 알츠하이머병의 발병 가능성을 검출하는데 사용될 수 있다.
일 구현예에서, 본 발명의 방법은 면역요법, 예컨대 항체 요법에 대한 반응성을 검출한다. 바람직하게는 암의 항체 요법에 대한 반응성은, 예를 들어 항-PD-1 또는 항-PD-L1 또는 조합된 항-PD-1/항-PD-L1 요법을 사용한 면역요법에서 검출된다. 바람직하게는 암은 흑색종, 유방암, 전립선암, 급성 골수성 백혈병(AML), 미만성 거대 B-세포 림프종(DLBCL), 췌장암, 갑상선암, 비강암, 간암 또는 폐암이다. 이러한 구현예에서, 실시예에 기재된 바와 같이, STAT5B 및/또는 IL15에서의 염색체 상호작용의 검출이 바람직하다. 실시예에서의 연구는 면역요법에 대한 반응이 암 신원보다는 면역계 후성적 설정의 특징이라는 사실과 일치한다. ['항-PD-1'은 PD-1(프로그램화된 세포 사멸 단백질 1)에 특이적으로 결합하는 항체 또는 항체 유도체 또는 단편이다. '항-PD-L1'은 PD-1의 리간드인 PD-L1 단백질에 특이적으로 결합하는 항체 또는 항체 유도체 또는 단편이다.]
본 발명의 방법(들) 및/또는 동반 진단 방법은
- 다발성 경화증 환자에서(특히 인간에서) IFN-B(IFN-베타) 치료에 대한 반응성, 및/또는
- 재발 완화형 다발성 경화증(특히 인간에서)에 걸리기 쉬운 소인, 및/또는
- 일차 진행성 다발성 경화증(특히 인간에서)의 가능성, 및/또는
- 근위축성 측삭 경화증(ALS) 질환 상태(특히 인간에서)에 걸리기 쉬운 소인, 및/또는,
- 빠른 진행성 근위축성 측삭 경화증(ALS) 질환 상태(특히 인간에서)에 걸리기 쉬운 소인, 및/또는
- 공격성 2형 당뇨병 질환 상태(특히 인간에서)에 걸리기 쉬운 소인, 및/또는
- 2형 당뇨병 질환 상태(특히 인간에서)에 걸리기 쉬운 소인, 및/또는
- 전-2형 당뇨병 상태(특히 인간에서)에 걸리기 쉬운 소인, 및/또는
- 1형 당뇨병 질환 상태(특히 인간에서)에 걸리기 쉬운 소인, 및/또는
- 전신성 홍반성 낭창(SLE) 질환 상태(특히 인간에서)에 걸리기 쉬운 소인, 및/또는
- 궤양성 대장염 질환 상태(특히 인간에서)에 걸리기 쉬운 소인, 및/또는
- 궤양성 대장염 환자(특히 인간에서)의 대장암의 재발 가능성, 및/또는
- 신경섬유종증 환자(특히 인간에서)의 악성 말초 신경초 종양 가능성, 및/또는
- 전립선암 및/또는 공격성 전립선암(특히 인간에서)의 발병 가능성, 및/또는
- 특히 인간에서; 신경퇴행성 질환 또는 병태, 바람직하게는 치매, 예컨대 알츠하이머병, 경도 인지 장애, 혈관성 치매, 루이소체 치매, 전측두엽 치매, 또는 더욱 바람직하게는 알츠하이머병, 가장 바람직하게는 베타-아밀로이드 응집체 유도 알츠하이머병의 발병 가능성 및/또는 이들에 걸리기 쉬운 소인; 및/또는
- 특히 인간에서; 특히 기억 및/또는 인지에 대하여 치매 환자(바람직하게는 알츠하이머병 환자, 더욱 바람직하게는 베타-아밀로이드 응집체를 갖는 알츠하이머병 환자) 및 알츠하이머병이 없는 인지 장애 환자 사이의 비교
에 사용될 수 있다.
바람직하게는 표에 언급된 관련된 임의의 유전자 내에서의 임의의 염색체 상호작용의 존재 또는 부존재가 검출된다. 예를 들어, 표 중 어느 것에 언급된 유전자 중 적어도 1, 3, 10, 20, 50개에서. 바람직하게는 표에서 프로브 서열에 의해 표시되는 염색체 상호작용의 존재 또는 부존재가 방법에서 결정된다. 예를 들어 표 중 어느 것으로부터의 관련된 염색체 상호작용 중 적어도 1, 3, 10, 20, 50, 또는 100개. 이러한 수의 유전자 또는 염색체 상호작용은 본원에 언급된 임의의 상이한 구현예에서 사용될 수 있다.
동반 진단 방법을 사용하여 시험된 개체
시험될 개체는 본원에 언급된 임의의 질환 병태 또는 특징의 임의의 증상을 가지거나 가지지 않을 수 있다. 개체는 임의의 이러한 병태 또는 특징의 위험성에 있을 수 있다. 개체는 병태 또는 특징으로부터 회복되었거나 회복되는 과정 중일 수 있다. 개체는 바람직하게는 포유동물, 예컨대 비인간 영장류, 인간 또는 설치류이다. 개체는 수컷 또는 암컷일 수 있다. 개체는 30세 이상일 수 있다. 개체는 29세 이하일 수 있다.
스크리닝 방법
본 발명은 후보 작용제가 염색체 상호작용을 제1 상태에 상응하는 것으로부터 제2 상태에 상응하는 염색체 상호작용으로 변화시킬 수 있는지 결정하는 단계를 포함하는, 개체의 질환 상태를 제1 상태에서 제2 상태로 변화시킬 수 있는 작용제를 확인하는 방법을 제공하며, 바람직하게는 제1 및 제2 상태는
- 특정 치료 및/또는 예방에 대한 반응성, 및/또는
- 특정 병태에 걸리기 쉬운 소인, 및/또는
- 재발로 이어질 수 있는 잔존 질환
의 존재 또는 부존재에 상응한다.
일 구현예에서, 방법은 후보 작용제가 본원에 언급된 임의의 염색체 상호작용을 변화시킬 수 있는지 결정한다.
방법은 시험관내에서(세포내에서 또는 세포외에서) 또는 생체내에서(비인간 유기체 상에서) 수행될 수 있다. 일 구현예에서, 방법은 관련된 염색체 상호작용(들)을 포함하는 것과 같은, 세포, 세포 배양물, 세포 추출물, 조직, 기관 또는 유기체 상에서 수행된다. 방법은 전형적으로 후보 작용제를 유전자, 세포, 세포 배양물, 세포 추출물, 조직, 기관 또는 유기체와 접촉시킴으로써(또는 투여함으로써) 수행된다.
상기 스크리닝 방법에서 시험되는 적합한 후보 물질은 항체 제제(예를 들어, 단클론 및 다클론 항체, 단쇄 항체, 키메라 항체 및 CDR-이식된 항체)를 포함한다. 또한, 조합 라이브러리, 정의된 화학물질(chemical identity), 펩타이드 및 펩타이드 모방체, 올리고뉴클레오타이드 및 천연 제제 라이브러리, 예컨대 디스플레이 라이브러리(예컨대, 파아지 디스플레이 라이브러리)가 또한 시험될 수 있다. 후보 물질은 화학적 화합물일 수 있고, 이는 본원에 언급된 제제의 임의의 특성을 가질 수 있는 소분자 주위의 합성으로부터 전형적으로 유래된다.
바람직한 유전자좌 , 유전자 및 염색체 상호작용
본 발명의 모든 양태를 위해, 바람직한 유전자좌, 유전자 및 염색체 상호작용이 표에 언급되어 있다. 본 발명의 모든 양태를 위해, 바람직한 유전자좌, 유전자 및 염색체 상호작용이 표에 제공되어 있다. 전형적으로 방법 염색체 상호작용은 표에 열거된 관련된 유전자 중 적어도 1, 3, 10, 20, 30 또는 50개로부터 검출된다. 바람직하게는 임의의 하나의 표에서의 프로브 서열에 의해 나타난 관련된 특정 염색체 상호작용 중 적어도 1, 3, 10, 20, 30 또는 50개의 존재 또는 부존재가 검출된다.
유전자좌는 본원에 언급된 유전자 중 어느 것의 상류 또는 하류에 있을 수 있으며, 예를 들어 50 kb 상류 또는 20 kb 하류에 있을 수 있다.
각 병태에 대한 일 구현예에서, 표 48에 나타난 p 값 또는 조절된 p 값의 상위 범위에 의해 나타난 관련된 특정 염색체 상호작용 중 적어도 1, 3, 5, 10, 20개의 존재 또는 부존재가 검출된다. 각 병태에 대한 또 다른 구현예에서, 표 48에 나타난 p 값 또는 조절된 p 값의 중위 범위에 의해 나타난 관련된 특정 염색체 상호작용 중 적어도 1, 3, 5, 10, 20, 30 또는 50개의 존재 또는 부존재가 검출된다. 각 병태에 대한 또 다른 구현예에서, 표 48에 나타난 p 값 또는 조절된 p 값의 하위 범위에 의해 나타난 관련된 특정 염색체 상호작용 중 적어도 1, 3, 5, 10, 20, 30 또는 50개의 존재 또는 부존재가 검출된다. 각 병태에 대한 또 다른 구현예에서, 표 48에 나타난 p 값 또는 조절된 p 값의 상위, 중위 및 하위 범위 각각에 의해 나타난 관련된 특정 염색체 상호작용 중 적어도 1, 2, 3, 5 또는 10개의 존재 또는 부존재가 검출되며, 즉 총 적어도 3, 6, 9, 18 또는 30개가 검출된다.
염색체 상호작용의 특정 조합이 검출될 수 있으며(즉, 이의 존재 또는 부존재를 검출하는 것), 이는 전형적으로 본원의 표에 개시된 모든 상호작용 또는 표로부터의 선택을 나타낸다. 본원에 언급된 바와 같이, 특정 수의 상호작용이 개별 표로부터 선택될 수 있다. 일 구현예에서, 임의의 표에 개시되거나, 또는 임의의 병태와 관련하여 개시된 상호작용 중 적어도 10%, 20%, 30%, 50%, 70% 또는 90%가 검출된다.
검출되는 상호작용은, 예를 들어 본원에서의 임의의 표에서와 같이 본원에 정의된 바와 같이, 특정 특징의 존재 또는 부존재에 상응할 수 있다. 상호작용의 조합이 검출되면, 이들은 모두 특징의 존재에 상응할 수 있거나 또는 이들은 모두 특징의 부존재에 상응할 수 있다. 일 구현예에서, 검출되는 상호작용의 조합은 특징의 존재와 관련된 적어도 2, 5 또는 10개의 상호작용 및 특징의 부존재와 관련된 적어도 2, 5 또는 10개의 다른 상호작용에 상응한다.
표 49에 나타낸 프로브는, 특히 암과 관련된 병태 및 요법, 예컨대 항-PD1 요법에 대한 반응성에 대해, 본원에 언급된 선택의 일부이거나 선택의 어느 것과 조합될 수 있다.
유전자 변형에 관한 구현예
특정 구현예에서, 본 발명의 방법은 유전자 변형과 관련되거나 이에 의해 영향을 받는 염색체 상호작용을 검출하기 위해 수행될 수 있고, 즉, 하위그룹은 유전자 변형에 대해 상이할 수 있다. 분명히, 변형은 전체(비인간) 유기체 또는 유기체의 일부, 예컨대 세포의 변형일 수 있다. 어떤 염색체 상호작용이 생물학적 시스템 상태와 관련되는지 결정하는 방법에서, 핵산의 제1 세트는 적어도 2개의 하위그룹으로부터 유래될 수 있으며, 이들 중 하나는 정의된 유전자 변형을 갖고 이들 중 하나는 유전자 변형을 갖지 않으며, 방법은 어떤 염색체 상호작용이 유전자 변형과 관련되고/되거나 이에 의해 영향을 받는지 결정할 수 있다. 변형은 CRISPR 기술을 포함하는 임의의 적합한 수단에 의해 달성될 수 있다.
본 발명은 유전자 변형이 이뤄진 후 하나 이상의 다른 유전자좌에서 염색체 시그너처를 검출하는 단계를 포함하는, 게놈의 제1 유전자좌에서의 서열에 대한 유전자 변형이 게놈의 다른 유전자좌에 영향을 미치는지 결정하는 방법을 포함하며, 바람직하게는 유전자 변형은 시스템 특징을 변화시키고, 상기 시스템은 바람직하게는 대사계, 면역계, 내분비계, 소화계, 피부계, 골격계, 근육계, 림프계, 호흡기계, 신경계, 또는 생식계이다. 상기 염색체 시그너처를 검출하는 것은, 바람직하게는 표 중 어느 것에서 정의된 바와 같이, 바람직하게는 5개 이상(예컨대, 5개)의 상이한 유전자좌에서, 5개 이상(예컨대, 5개)의 상이한 염색체 상호작용의 존재 또는 부존재를 검출하는 단계를 선택적으로 포함한다. 바람직하게는 염색체 시그너처 또는 상호작용은 본원에 언급된 임의의 적합한 방법에 의해 확인된다.
일 구현예에서, 유전자 변형은 (a) 둘 이상의 RNA-가이드 엔도뉴클레아제 또는 둘 이상의 RNA-가이드 엔도뉴클레아제를 코딩하는 핵산 및 (b) 둘 이상의 가이딩 RNA 또는 둘 이상의 가이딩 RNA를 코딩하는 DNA를 세포 내로 도입하는 단계를 포함하는 방법에 의해 달성되며, 각각의 가이딩 RNA는 RNA-가이드 엔도뉴클레아제 중 하나를 염색체 서열 내의 표적화 서열로 가이드하고 RNA-가이드 엔도뉴클레아제는 표적화 부위에서 염색체 서열 중 적어도 하나의 가닥을 절단한다.
또 다른 구현예에서, 변형은 표적 서열을 갖고 유전자 생성물을 코딩하는 DNA 분자를 함유하고 발현하는 진핵 세포 내로
a) 표적 서열과 혼성화하는 CRISPR-Cas 시스템 가이드 RNA를 코딩하는 적어도 하나의 뉴클레오타이드 서열에 작동가능하게 연결된 진핵 세포에서 작동가능한 제1 조절 요소, 및
b) II형 Cas9 단백질을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열에 작동가능하게 연결된 진핵 세포에서 작동가능한 제2 조절 요소
를 포함하는 하나 이상의 벡터를 포함하는 조작된 비자연발생의 CRISPR(Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats; 군집화된 주기적으로 간격을 두고 분포하는 짧은 회문 반복 서열)-CRISPR 관련(Cas)(CRISPR-Cas) 시스템을 도입하는 단계를 포함하는, 적어도 하나의 유전자 생성물의 발현을 변경시키는 방법에 의해 달성되며,
구성요소 (a) 및 (b)는 시스템의 동일하거나 상이한 벡터 상에 위치하며, 이에 의해 가이드 RNA는 표적 서열을 표적화하고 Cas9 단백질은 DNA 분자를 절단하며, 이에 의해 적어도 하나의 유전자 생성물의 발현이 변경되고; Cas9 단백질 및 가이드 RNA는 함께 자연적으로 발생하지 않으며, 바람직하게는 각각의 RNA-가이드 엔도뉴클레아제는 Cas9 단백질로부터 유래되고 적어도 2개의 뉴클레아제 도메인을 포함하며, 선택적으로 2개의 RNA-가이드 엔도뉴클레아제 각각의 뉴클레아제 도메인 중 하나는 각각의 RNA-가이드 엔도뉴클레아제가 이중 가닥 서열의 하나의 가닥을 절단하도록 변형되고, 2개의 RNA-가이드 엔도뉴클레아제는 함께, 염색체 서열이 변형되도록 DNA 복구(수복) 공정에 의해 복구되는 염색체 서열 내에 이중 가닥 절단을 도입한다.
전형적으로, 변형은 적어도 5, 20, 50, 100 또는 1000개 염기, 바람직하게는 최대 10,000개 또는 1000,000개 염기의 결실, 삽입 또는 치환을 포함한다.
변형은 본원에 언급된 유전자좌 중 어느 것에서, 예를 들어 표 중 어느 것에 언급된 영역 또는 유전자의 어느 것에서 일어날 수 있다. 다른(비변형된) 유전자좌에서 검출되는 염색체 상호작용은 또한 본원에 언급된 유전자좌 중 어느 것에서, 예를 들어 표 중 어느 것에 언급된 영역 또는 유전자의 어느 것에서 일어날 수 있다.
유전자 변형과 관련된 구현예는 진핵생물, 척색동물(chordate), 포유동물, 식물, 농업 동물 및 식물, 및 비인간 유기체를 포함하는 임의의 유기체 상에서 수행될 수 있다.
본 발명의 방법 및 용도
본 발명의 방법은 상이한 방식으로 기술될 수 있다. 그것은 (i) 염색체 상호작용에 함께 모인 염색체 영역을 시험관내에서 교차결합시키는 단계; (ii) 상기 교차결합된 DNA를 절단 또는 제한 소화 절단시키는 단계; 및 (iii) 상기 교차결합된 절단된 DNA 말단을 라이게이션하여 라이게이션된 핵산을 형성하는 단계를 포함하는, 라이게이션된 핵산을 제조하는 방법으로서 기술될 수 있고, 라이게이션된 핵산의 검출은 유전자좌에서 염색체 상태를 결정하는데 사용될 수 있으며, 바람직하게는
- 유전자좌는 본원에 언급된 유전자좌, 영역 또는 유전자 중 어느 것일 수 있고,
- 및/또는 염색체 상호작용은 본원에 언급된 염색체 상호작용 또는 표에 개시된 프로브 중 어느 것에 상응하는 염색체 상호작용 중 어느 것일 수 있고/있거나
- 라이게이션된 생성물은 (i) 본원에 개시된 프로브 서열 중 어느 것과 동일하거나 상동인 서열;　또는 (ii)(ii)에 상보적인 서열을 갖거나 포함할 수 있다.
본 발명의 방법은 염색체 상호작용이 게놈의 정의된 영역에 존재하거나 부존재하는지 결정하는 단계를 포함하는, 집단에서의 상이한 하위그룹을 나타내는 염색체 상태를 검출하는 방법으로서 기술될 수 있고, 바람직하게는:
- 하위그룹은 본원에 언급된 특징의 존재 또는 부존재에 의해 정의되고/되거나
- 염색체 상태는 본원에 언급된 임의의 유전자좌, 영역 또는 유전자에 있을 수 있고/있거나;
- 염색체 상호작용은 본원에 언급된 것 또는 본원에 개시된 프로브 또는 프라이머 쌍 중 어느 것에 상응하는 것 중 어느 것일 수 있다.
본 발명은 본원에 언급된 임의의 유전자좌, 유전자 또는 영역에서 염색체 상호작용을 검출하는 것을 포함한다. 본 발명은 염색체 상호작용을 검출하기 위한 본원에 언급된 핵산 및 프로브 (또는 프라이머)의 용도, 예를 들어 적어도 10, 20, 100 또는 500개의 상이한 유전자좌 또는 유전자에서 염색체 상호작용을 검출하기 위한 적어도 10, 50, 100 또는 500개의 이러한 핵산 또는 프로브의 용도를 포함한다.
본원에 제공된 표
본원의 표는 병태(첫 번째 언급된 그룹)에 존재하고 대조군(전형적으로 그러나 반드시 건강한 개체는 아님; 두 번째 언급된 그룹)에 부존재하는 염색체 상호작용을 나타내는 프로브(EpiswitchTM 마커) 데이터 또는 유전자 데이터를 나타낸다. 프로브 서열은 염색체 상호작용에 함께 모인 유전자 영역의 두 부위로부터 생성된 라이게이션된 생성물을 검출하는데 사용될 수 있는 서열을 나타내며, 즉, 프로브는 라이게이션된 생성물에서의 서열에 상보적인 서열을 포함할 것이다. 시작-끝 위치의 첫 번째 2개의 세트는 프로브 위치를 나타내고, 시작-끝 위치의 두 번째 2개의 세트는 관련된 4kb 영역을 나타낸다. 하기 정보가 프로브 데이터 표에 제공되어 있다:
- HyperG_Stats: 초기하 농축(hypergeometric enrichment)의 매개변수에 기초한 유전자좌에서 상기 수의 유의한 EpiSwitch™ 마커를 찾을 확률에 대한 p-값
- Probe Count Total: 유전자좌에서 시험된 EpiSwitch™ 형태의 총 수
- Probe Count Sig: 유전자좌에서 통계학적으로 유의한 것으로 확인된 EpiSwitch™ 형태의 수
- FDR HyperG: 다중-시험(오류 발견율) 보정된 초기하 p 값
- Percent Sig: 유전자좌에서 시험된 마커 수 대비 유의한 EpiSwitch™ 마커의 백분율
- logFC: 후성적 비율(FC)의 로그 밑(base) 2
- AveExpr: 모든 어레이 및 채널에서 프로브에 대한 평균 log2-표현
- T: 중재된(moderated) t-통계
- p 값: 원시 p 값
- adj. p 값: 조절된 p 값 또는 q-값
- B - 　B-통계(lods 또는 B)는 유전자가 차별적으로 발현되는 로그 오즈(log-odds)이다.
- FC - 　비로그 배수 변화
- FC_1 - 0에 집중된 비로그 배수 변화
- LS - 이진 값 이것은 FC_1 값과 관련된다. -1.1 미만의 FC_1 값 그것은 -1로 설정되고 FC_1 값이 1.1보다 크면, 그것은 1로 설정된다. 이 값 사이의 값은 0이다
유전자 표 데이터는 관련된 염색체 상호작용이 발생하는 것으로 나타난 유전자를 보여준다. 유전자좌 표에서의 p 값은 HyperG_Stats(초기하 농축의 매개변수에 기초한 유전자좌 내의 상기 수의 유의한 EpiSwitch™ 마커를 찾을 확률에 대한 p 값)와 동일하다.
프로브는 Taq1 부위로부터 30bp 떨어지도록 설계된다. PCR의 경우, PCR 프라이머 역시 라이게이션된 생성물을 검출하도록 설계되지만 이들의 Taq1 부위로부터의 이들의 위치는 달라진다.
프로브 위치:
Start 1 - 단편 1 상의 TaqI 부위의 30개 염기 상류
End 1 - 단편 1 상의 TaqI 제한 부위
Start 2 - 단편 2 상의 TaqI 제한 부위
End 2 - 단편 2 상의 TaqI 부위의 30개 염기 하류
4kb 서열 위치:
Start 1 - 단편 1 상의 TaqI 부위의 4000개 염기 상류
End 1 -　 단편 1 상의 TaqI 제한 부위
Start 2 - 단편 2 상의 TaqI 제한 부위
End 2 -　단편 2 상의 TaqI 부위의 4000개 염기 하류
하기 정보가 또한 표에 제공된다:
- GLMNET - 전체 올가미(lasso) 또는 탄성네트(elastic-net) 정규화를 피팅하기 위한 절차. 람다가 0.5(탄성네트)로 설정됨
- GLMNET_1 - 람다가 1로 설정됨(lasso)
- Fishers p 값 - 정확한 피셔 검정 p 값
- Coef - 로지스틱 회귀 계수, e(e^X)를 계수의 제곱으로 올리면, 변수에 대한 교차비(odds ratio)을 얻음
- S.E. - 표준 오차
- Wald - 왈드 방정식 통계(Wald Equation Statistic). 왈드 통계는 모델 계수의 최대 가능도 추정이 0인 왈드 검정의 일부이다. 상기 검정은 최대 가능도 추정 및 0 사이의 차이가 점근적으로 정상적으로 분포한다고 가정한다
- Pr(>|Z|) - 로지스틱 모델 내의 마커의 p 값. <0.05 미만의 값은 통계학적으로 유의하며 로지스틱 모델에서 사용되어야 한다.
샘플 제조 및 염색체 상호작용 검출을 위한 바람직한 구현예
샘플을 제조하고 염색체 형태를 검출하는 방법이 본원에 기재되어 있다. 예를 들어, 본 섹션에 기재된 바와 같이, 이러한 방법의 최적화된(비통상적인) 형태가 사용될 수 있다.
전형적으로 샘플은 적어도 2 x105 세포를 함유할 것이다. 샘플은 최대 5 x105 세포를 함유할 수 있다. 일 구현예에서, 샘플은 2 x105 내지 5.5 x105 세포를 함유할 것이다.
염색체 유전자좌에 존재하는 후성적 염색체 상호작용의 교차결합이 본원에 기재되어 있다. 이것은 세포 용해가 일어나기 전에 수행될 수 있다. 세포 용해는 3 내지 7분, 예컨대 4 내지 6 또는 약 5분 동안 수행될 수 있다. 일부 구현예에서, 세포 용해는 적어도 5분 이상 내지 10분 미만 동안 수행된다.
제한 효소를 이용한 DNA의 소화가 본원에 기재되어 있다. 전형적으로, DNA 제한은 약 55℃ 내지 약 70℃, 예컨대 약 65℃에서, 약 10 내지 30분, 예컨대 약 20분 동안 수행된다.
바람직하게는 흔한 절단 제한 효소가 사용되어, 최대 4000개 염기쌍의 평균 단편 크기를 갖는 라이게이션된 DNA의 단편을 생성한다. 선택적으로, 제한 효소는 약 200 내지 300개의 염기쌍, 예컨대 약 256개의 염기쌍의 평균 단편 크기를 갖는 라이게이션된 DNA의 단편을 생성한다. 일 구현예에서, 전형적인 단편 크기는 200 염기쌍 내지 4,000개 염기쌍, 예컨대 400 내지 2,000개 또는 500 내지 1,000개 염기쌍이다.
EpiSwitch 방법의 일 구현예에서, DNA 침전 단계는 DNA 제한 소화 단계 및 DNA 라이게이션 단계 사이에서 수행되지 않는다.
DNA 라이게이션은 본원에 기재되어 있다. 전형적으로, DNA 라이게이션은 5 내지 30분, 예컨대 약 10분 동안 수행된다.
샘플 내의 단백질은 효소적으로, 예를 들어 단백질분해효소, 선택적으로 단백질분해효소 K를 사용하여 소화될 수 있다. 단백질은 약 30분 내지 1시간의 기간 동안, 예를 들어 약 45분 동안 효소적으로 소화될 수 있다. 일 구현예에서, 단백질의 소화, 예를 들어 단백질분해효소 K 소화 후, 교차결합 역전 또는 페놀 DNA 추출 단계가 없다.
일 구현예에서, PCR 검출은, 바람직하게는 라이게이션된 핵산의 존재/부존재에 대한 이진 판독으로 라이게이션된 핵산의 단일 카피를 검출할 수 있다.
동족체
폴리뉴클레오타이드/핵산(예컨대, DNA) 서열의 동족체가 본원에 언급된다. 동족체는 전형적으로, 예를 들어 적어도 10, 15, 20, 30, 100개 이상의 인접한 뉴클레오타이드의 영역에 대해, 또는 염색체 상호작용에 관여하는 염색체의 영역으로부터 유래된 핵산의 부분에 걸쳐, 적어도 70% 상동성, 바람직하게는 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99% 상동성을 갖는다. 상동성은 뉴클레오타이드 동일성에 기초하여 계산될 수 있다(때로는 "견고한 상동성"으로 지칭됨).
따라서, 특정 구현예에서, 폴리뉴클레오타이드/핵산(예컨대, DNA) 서열의 동족체는 % 서열 동일성과 관련하여 본원에 언급된다. 전형적으로, 이러한 동족체는, 예를 들어 적어도 10, 15, 20, 30, 100개 이상의 인접한 뉴클레오타이드의 영역에 대해, 또는 염색체 상호작용에 관여하는 염색체의 영역으로부터 유래된 핵산의 부분에 걸쳐, 적어도 70% 서열 동일성, 바람직하게는 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99% 서열 동일성을 갖는다.
예를 들어, UWGCG 패키지는 상동성 및/또는 % 서열 동일성을 계산하는데 사용될 수 있는 BESTFIT 프로그램을 제공한다(예를 들어 그의 기본 설정에서 사용됨) (Devereux et al (1984) Nucleic Acids Research 12, p387-395). PILEUP 및 BLAST 알고리즘은, 문헌[Altschul S. F. (1993) J MoI Evol 36:290-300; Altschul, S, F et al (1990) J MoI Biol 215:403-10]에 기재된 바와 같이, 상동성 및/또는 % 서열 동일성을 계산하고/하거나 서열을 정렬하는데(예컨대 동등하거나 상응하는 서열을 확인하는 것) 사용될 수 있다(전형적으로 그의 기본 설정에서).
BLAST 분석을 수행하기 위한 소프트웨어는 미국 국립생물공학정보센터를 통해 공개적으로 이용가능하다. 이 알고리즘은 데이터베이스 서열에서 동일한 길이의 단어와 정렬될 때 일부 양수의 역치 점수와 일치하거나 만족하는 쿼리 서열에서 길이 W인 짧은 단어를 확인함으로써 높은 점수의 서열쌍(HSP)을 확인하는 것을 먼저 포함한다. T는 인접 단어 점수 역치로 불린다(Altschul et al, 상기). 이러한 초기 인접 단어 히트는 이를 함유하는 HSP를 찾는 검색을 시작하기 위한 시드(seed)로서 작용한다. 단어 히트는 누적 정렬 점수가 증가될 수 있는 한 각 서열을 따라 양 방향으로 확장된다. 각 방향에서 단어 히트의 연장은 누적 정렬 점수가 그의 최대 달성 값으로부터 X 양만큼 떨어질 때; 누적 점수가 하나 이상의 음수 채점 잔기 정렬의 축적으로 인해 0 이하로 갈 때; 어느 하나의 서열의 말단에 도달할 때 중지된다. BLAST 알고리즘 매개변수 W5 T 및 X는 민감성 및 정렬의 속도를 결정한다. BLAST 프로그램은 디폴트로서 11의 단어 길이(W), 50의 BLOSUM62 채점 매트릭스(Henikoff and Henikoff (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 10915-10919) 정렬(B), 10의 기대값(E), M=5, N=4, 및 두 가닥의 비교를 사용한다.
BLAST 알고리즘은 2개의 서열 사이의 유사성의 통계학적 분석을 수행하며; 예컨대, 문헌[Karlin and Altschul (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 5873-5787]을 참고한다. BLAST 알고리즘에 의해 제공되는 유사성의 한 가지 척도는 2개의 폴리뉴클레오타이드 서열 사이의 매치가 우연히 일어날 가능성의 표시를 제공하는, 최소합 확률(P(N))이다. 예를 들어, 제1 서열 대 제2 서열의 비교에서 최소합 확률이 약 1 미만, 바람직하게는 약 0.1 미만, 더욱 바람직하게는 약 0.01 미만, 및 가장 바람직하게는 약 0.001 미만인 경우, 서열은 또 다른 서열과 유사한 것으로 간주된다.
상동 서열은 전형적으로 1, 2, 3, 4개 이상의 염기, 예컨대 10, 15 또는 20개 염기 미만(이는 뉴클레오타이드의 치환, 결실 또는 삽입일 수 있음)이 상이하다. 이러한 변화는 상동성 및/또는 % 서열 동일성의 계산과 관련하여 상기 언급된 영역 중 어느 것에 대해 측정될 수 있다.
어레이
핵산의 제2 세트는 어레이에 결합될 수 있고, 일 구현예에서, 어레이에 결합된 적어도 15,000개, 45,000개, 100,000개 또는 250,000개의 상이한 제2 핵산이 존재하며, 이는 바람직하게는 적어도 300개, 900개, 2000개 또는 5000개 유전자좌를 나타낸다. 일 구현예에서, 제2 핵산의 상이한 집단 중 하나 이상, 또는 모두는 어레이의 하나를 초과하는 별개의 영역에 결합하여, 사실상 어레이 상에서 반복되어, 오차 검출을 허용한다. 어레이는 Agilent SurePrint G3 Custom CGH 마이크로어레이 플랫폼에 기초한다. 제1 핵산과 어레이와의 결합의 검출은 이중 색상 시스템에 의해 수행될 수 있다.
치료제
치료제가 본원에 언급되어 있다. 본 발명은 관련된 병태를 예방하거나 치료하는데 사용하기 위한 상기 제제(작용제)를 제공한다. 이것은 필요로 하는 개체에게 제제의 치료적 유효량을 투여하는 단계를 포함할 수 있다. 본 발명은 질환을 예방하거나 치료하기 위한 약제의 제조에서의 제제의 용도를 제공한다. 본 발명의 방법은 치료를 위한 개체를 선택하는데 사용될 수 있다. 본 발명의 방법, 및 특히 동반 진단 분석 방법은 방법에 의해 확인된 사람에게 관련된 병태를 예방하거나 치료하는 제제를 이후에 투여할 수 있는 치료 단계를 포함할 수 있다.
제제의 제형은 제제의 특성에 좌우될 것이다. 제제는 제제 및 약제학적으로 허용가능한 담체 또는 희석제를 함유하는 약제학적 조성물의 형태로 제공될 것이다. 적합한 담체 및 희석제는 등장성 식염수 용액, 예를 들어 인산 완충 식염수를 포함한다. 전형적인 경구 투여 조성물은 정제, 캡슐, 액체 용액 및 액체 현탁액을 포함한다. 제제는 비경구, 정맥내, 근육내, 피하, 경피 또는 경구 투여용으로 제제화될 수 있다.
제제의 용량은 다양한 매개변수에 따라, 특히 사용된 물질; 치료될 개체의 연령, 체중 및 병태; 투여 경로; 및 필요한 요법에 따라 결정될 수 있다. 의사는 필요한 투여 경로 및 임의의 특정 제제를 위한 투여량을 결정할 수 있을 것이다. 그러나, 적합한 용량은, 예를 들어 매일 1 내지 3회 투여되는, 0.1 내지 100 mg/kg 체중, 예컨대 1 내지 40 mg/kg 체중일 수 있다.
본원에 언급된 물질의 형태
본원에 언급된 물질, 예컨대 핵산 또는 치료제 중 어느 것은 정제되거나 단리된 형태일 수 있다. 이들은 자연에서 발견되는 것과 상이한 형태일 수 있고, 예를 들어 이들은 자연에서 발생하지 않는 다른 물질과 조합되어 존재할 수 있다. 핵산(본원에 정의된 서열의 일부를 포함)은 자연에서 발견되는 것과 상이한 서열을 가질 수 있고, 예를 들어 상동성에 대한 섹션에서 기술된 바와 같이 서열 내에 적어도 1, 2, 3, 4개 이상의 뉴클레오타이드 변화를 가질 수 있다. 핵산은 5' 또는 3' 말단에 이종 서열을 가질 수 있다. 핵산은 자연에서 발견되는 것과 화학적으로 상이할 수 있고, 예를 들어 이들은 몇 가지 방식으로 변형될 수 있지만, 바람직하게는 여전히 왓슨 크릭 염기 쌍을 형성할 수 있다. 적절한 경우, 핵산은 이중 가닥 또는 단일 가닥 형태로 제공될 것이다. 본 발명은 단일 또는 이중 가닥 형태의 본원에 언급된 특정 핵산 서열 모두를 제공하며, 따라서 개시된 임의의 서열에 상보적인 가닥을 포함한다.
본 발명은 또한 특정 하위그룹과 관련된 염색체 상호작용의 검출을 포함하는, 본 발명의 임의의 방법을 수행하기 위한 키트를 제공한다. 이러한 키트는 관련된 염색체 상호작용을 검출할 수 있는 특정 결합제, 예컨대 본 발명의 공정에 의해 생성된 라이게이션된 핵산을 검출할 수 있는 제제를 포함할 수 있다. 키트에 존재하는 바람직한 제제는 PCR 반응에서 라이게이션된 핵산을 증폭시킬 수 있는, 예를 들어 본원에 기재된 바와 같은, 라이게이션된 핵산 또는 프라이머 쌍에 혼성화할 수 있는 프로브를 포함한다.
본 발명은 또한 관련된 염색체 상호작용을 검출할 수 있는 장치를 제공한다. 장치는 바람직하게는 염색체 상호작용을 검출할 수 있는 임의의 특정 결합제, 프로브 또는 프라이머 쌍, 예컨대 본원에 기재된 임의의 이러한 제제, 프로브 또는 프라이머 쌍을 포함한다.
특정 언급된 병태를 위해 본 발명에서 사용하기 위한 바람직한 치료제
A. 재발 완화형 다발성 경화증( RRMS )에 걸리기 쉬운 소인
■ 병태를 치료하는데 사용된 약물:
o 질환 변형 요법( DMT ):
● 주사가능한 약물
o 아보넥스(인터페론 베타-1a)
o 베타세론(인터페론 베타-1b)
o 코팍손(글라티라머 아세테이트)
o 엑스타비아(인터페론 베타-1b)
o 글라토파(글라티라머 아세테이트)
o 플레그리디(페그인터페론 베타-1a)
o 레비프(인터페론 베타-1a)
● 경구 약물
o 아우바지오(테리플루노미드)
o 길렌야(핀골리모드)
o 텍피데라(디메틸 푸마레이트)
● 주입된 약물
o 렘트라다(알렘투주맙)
o 노반트론(미톡산트론)
o 티사브리(나탈리주맙)
o 재발 관리:
● 고용량 정맥내 솔루-메드롤®(메틸프레드니솔론)
● 고용량 경구 델타손®(프레드니손)
● H.P. 악타 겔(ACTH)
o 스테로이드:
● 메틸프레드니솔론
B. 일차 진행성 다발성 경화증( PPMS )의 가능성
■ 병태를 치료하는데 사용된 약물:
o 스테로이드
o 면역억제 요법, 예컨대 총 림프성 방사선, 사이클로스포린, 메토트렉세이트, 2-클로로데옥시아데노신, 사이클로포스파미드, 미톡산트론, 아자티오프린, 인터페론, 스테로이드, 및 면역 글로불린.
o 코팍손
o 오크렐리주맙(Genetech).
C. 빠른 진행성 근위축성 측삭 경화증( ALS ) 질환 상태에 걸리기 쉬운 소인
■ 병태를 치료하는데 사용된 약물:
o 릴루졸
o 바클로펜.
D. 2형 당뇨병 질환 상태에 걸리기 쉬운 소인
■ 병태를 치료하는데 사용된 약물:
o 메트포르민
o 설포닐우레아, 예컨대:
■ 글리벤클라미드
■ 글리클라지드
■ 글리메피리드
■ 글리피지드
■ 글리퀴돈
o 글리타존(티아졸리딘디온, TZD)
o 글립틴(DPP-4 억제제), 예컨대:
■ 리나글립틴
■ 삭사글립틴
■ 시타글립틴
■ 빌다글립틴
o GLP-1 작용제, 예컨대:
■ 엑세나티드
■ 리라글루티드
o 아카르보스
o 나테글리니드 및 레파글리니드
o 인슐린 치료.
E. 1형 당뇨병 질환 상태에 걸리기 쉬운 소인
■ 병태를 치료하는데 사용된 약물:
o 란투스 피하
o 란투스 솔로스타르 피하
o 레베미르 피하
o 노보로그 플렉스펜 피하
o 노보로그 피하
o 후마로그 피하
o 노보로그 믹스 70-30 플렉스펜 피하
o 심린펜 60 피하
o 후마로그 퀵펜 피하
o 심린펜 120 피하
o 노볼린 R 주사
o 토우제오 솔로스타르 피하
o 아피드라 피하
o 후마로그 믹스 75-25 피하
o 후물린 70/30 피하
o 후마로그 믹스 75-25 퀵펜 피하
o 노볼린 N 피하
o 후물린 R 주사
o 노볼린 70/30 피하
o 인슐린 데테미르 피하
o 레베미르 플렉스터치 피하
o 후물린 N 피하
o 인슐린 글라르긴 피하
o 아피드라 솔로스타르 피하
o 인슐린 리스프로 피하
o 인슐린 정기적 인간 주사
o 인슐린 정기적 인간 흡입
o 후마로그 믹스 50-50 퀵펜 피하
o 인슐린 아스파르트 피하
o 노보로그 믹스 70-30 피하
o 후마로그 믹스 50-50 피하
o 아프레자 흡입
o 인슐린 NPH 인간 레콤 피하
o 인슐린 NPH 및 정기적 인간 피하
o 인슐린 아스파르트 프로타민-인슐린 아스파르트 피하
o 후물린 70/30 퀵펜 피하
o 후물린 N 퀵펜 피하
o 트레시바 플렉스터치 U-100 피하
o 트레시바 플렉스터치 U-200 피하
o 인슐린 리스프로 프로타민 및 리스프로 피하
o 프람린티드 피하
o 인슐린 글루리신 피하
o 노보로그 펜필 피하
o 인슐린 데글루덱 피하
F. 전신성 홍반성 낭창( SLE ) 질환 상태에 걸리기 쉬운 소인
■ 병태를 치료하는데 사용된 약물:
o 비스테로이드성 항염증성 약물(NSAIDS): 이부프로펜, 나프록센 및 디클로페낙.
o 하이드록시클로로퀸
o 코르티코스테로이드
o 면역억제제: 아자티오프린, 메토트렉세이트, 미코페놀레이트 모페틸 및 사이클로포스파미드.
o 리툭시맙
o 벨리무맙.
o 코르티코스테로이드: 프레드니손, 코르티손 및 하이드로코르티손
o NSAID: 인도메타신(인도신), 나부메톤(렐라펜), 및 셀레콕십(셀레브렉스)
o 항염증제: 아스피린 및 아세타미노펜(타이레놀)
o 질환 변형 항류마티스성 약물(DMARD): 하이드록시클로로퀸(플라퀘닐), 사이클로스포린(젠그라프, 네오랄, 산디뮨), 및 아자티오프린(아자산, 이뮤란).
o 항말라리아제: 클로로퀸(아랄렌) 및 하이드록시클로로퀸(플라퀘닐).
o BLyS-특이적 억제제 또는 단클론 항체(MAbS): 벨리무맙(벤리스타).
o 면역억제제/면역조절제: 아자티오프린(이뮤란), 메토트렉세이트(류마트렉스), 및 사이클로포스파미드(사이톡산).
o 항응고제: 저용량 아스피린, 헤파린(칼시파린, 리쿠애민), 및 와르파린(쿠마딘)
G. 궤양성 대장염 질환 상태에 걸리기 쉬운 소인
■ 병태를 치료하는데 사용된 약물:
o 항염증성 약물: 아미노살리실레이트 - 설파살라진(아줄피딘), 뿐만 아니라 특정 5-아미노살리실레이트, 예컨대 메살라민(아사콜, 리알다, 로와사, 카나사 등), 발살라지드(콜라잘) 및 올살라진(디펜툼) 및 코르티코스테로이드 - 프레드니손 및 하이드로코르티손.
o 면역계 억제제: 아자티오프린(아자산, 이뮤란), 머캅토퓨린(푸리네톨, 푸릭삼), 사이클로스포린(젠그라프, 네오랄, 산디뮨), 인플릭시맙(레미카데), 아달리무맙(후미라), 골리무맙(심포니) 및 베돌리주맙(엔티비오).
o 궤양성 대장염의 특정 증상을 관리하는 다른 약물:
■ 항생제
■ 지사 약물
■ 진통제
■ 철 보충제.
H. 궤양성 대장염 환자의 대장암의 재발 가능성
■ 병태를 치료하는데 사용된 약물:
아미노살리실레이트
UC 스테로이드
아자티오프린
I. 신경섬유종증 환자의 악성 말초 신경초 종양 가능성
■ 치료
MPNST 치료는 수술, 방사선요법 및 화학요법을 포함한다.
J. 전립선암 및/또는 공격성 전립선암의 발병 가능성
■ 병태를 치료하는데 사용된 약물:
■ 황체형성 호르몬 방출 호르몬(LHRH) 작용제
■ 항안드로겐 치료
■ 조합된 LHRH 및 항안드로겐 치료
o 스테로이드
o 다른 의학적 치료:
■ 아비라테론
■ 엔잘루타미드
■ 도세탁셀(탁소테레®)
■ 카르보플라틴 또는 시스플라틴 화학요법
K. 알츠하이머병:
■ 병태를 치료하는데 사용된 약물:
o 도네페질
o 리바스티그민
o 갈란타민
o 메만틴
간행물
본원에 언급된 모든 간행물의 내용은 본 명세서 내에 참고로 포함되어 있으며, 본 발명과 관련된 특징을 더 정의하는데 사용될 수 있다.
특정 구현예
EpiSwitch™ 플랫폼 기술은 유전자좌에서의 정상 및 비정상적 상태 사이의 조절 변화의 후성적 조절 시그너처를 검출한다. EpiSwitch™ 플랫폼은 염색체 형태 시그너처로도 공지된 인간 염색체의 조절성 고차 구조와 관련된 유전자 조절의 근본적인 후성적 수준을 확인하고 모니터링한다. 염색체 시그너처는 유전자 조절완화의 캐스캐이드에서 구별되는 주요 단계이다. 이들은 DNA 메틸화 및 RNA 프로파일링과 같은 후기 후성적 및 유전자 발현 바이오마커를 이용하는 바이오마커 플랫폼에 대해 고유한 장점을 갖는 고차 바이오마커이다.
EpiSwitch ™ 어레이 분석
맞춤형 EpiSwitch™ 어레이-스크리닝 플랫폼은 15K, 45K, 100K, 및 250K 고유의 염색체 형태의 4개의 밀도로 제공되며, 각각의 키메라 단편은 어레이 상에서 4회 반복되어, 각각 유효 밀도 60K, 180K, 400K 및 1백만을 만든다.
맞춤 설계된 EpiSwitch ™ 어레이
15K EpiSwitch™ 어레이는 EpiSwitch™ 바이오마커 발견 기술로 조사된 약 300개 유전자좌를 포함하는 전체 게놈을 스크리닝할 수 있다. EpiSwitch™ 어레이는 Agilent SurePrint G3 Custom CGH 마이크로어레이 플랫폼 상에서 만들어지며; 이 기술은 4개의 밀도 60K, 180K, 400K 및 1백만 프로브를 제공한다. 어레이당 밀도는 각각의 EpiSwitch™ 프로브가 4개로 제공되므로 15K, 45K, 100K 및 250K로 감소하며, 따라서 재현성의 통계학적 평가가 가능하다. 유전적 유전자좌당 조사된 잠재적인 EpiSwitch™ 마커의 평균 수는 50이며; 이와 같이 조사될 수 있는 유전자좌의 수는 300, 900, 2000, 및 5000이다.
EpiSwitch ™ 맞춤형 어레이 파이프라인
EpiSwitch™ 어레이는 EpiSwitch™ 라이브러리 생성 후 Cy5에서 표지된 샘플의 하나의 세트 및 Cy3에서 표지된 비교될/분석될 샘플의 다른 세트(대조군)를 갖는 이중 색상 시스템이다. 어레이는 Agilent SureScan 스캐너를 사용하여 스캔되며, 얻어진 특징은 Agilent 특징 추출 소프트웨어를 사용하여 추출된다. 이후, 상기 데이터는 R에서의 EpiSwitch™ 어레이 처리 스크립트를 사용하여 처리된다. 어레이는 R: Limma *에서 바이오컨덕터(Bioconductor)에서의 표준 이중 색상 패키지를 사용하여 처리된다. 어레이는 Limma *에서의 어레이 함수 내에서 표준화된 것을 사용하여 표준화되고, 이는 온칩(on chip) Agilent 양성 대조군 및 EpiSwitch™ 양성 대조군에 대해 수행된다. 데이터는 Agilent Flag 호출을 기반으로 필터링되고, Agilent 대조군 프로브가 제거되고, 이들을 Limma *를 사용하여 분석하기 위해 기술적 복제물 프로브의 평균을 낸다. 프로브는 비교되는 2개의 시나리오 사이의 차이에 기반하여 모델화되 다음 오차 발견율(False Discovery Rate)을 사용하여 보정된다. <=-1.1 또는 =>1.1이고 p<=0.1 FDR p 값을 통과하는 <=30%의 변이 계수(CV)를 갖는 프로브가 추가 스크리닝에 사용된다. 프로브 세트를 감소시키기 위해, R에서의 FactorMineR 패키지를 사용하여 추가 다중 인자 분석을 수행한다.
* 주석: LIMMA는 마이크로어레이 실험에서 차등 발현을 평가하기 위한 선형 모델 및 경험적 베이즈(Bayes) 방법이다. Limma는 마이크로어레이 또는 RNA-Seq에서 발생하는 유전자 발현 데이터의 분석을 위한 R 패키지이다.
프로브의 풀은 최종 피킹(final picking)을 위해 조정된 p 값, FC 및 CV <30%(임의의 컷오프 포인트) 매개변수에 기초하여 초기에 선택된다. 추가 분석 및 최종 목록은 처음 2개 매개변수(조정된 p 값; FC)에만 기초하여 작성된다.
실시예
본 발명은 하기 비제한적인 실시예에 의해 예시된다.
통계학적 파이프라인
EpiSwitch™ 스크리닝 어레이는 EpiSwitch™ PCR 플랫폼으로의 번역을 위한 높은 가치의 EpiSwitch™ 마커를 선택하기 위해 R에서의 EpiSwitch™ 분석 패키지를 사용하여 처리된다.
1단계
프로브는 변형된 선형 회귀 모델의 생성물인 보정된 p 값(오차 발견율, FDR)에 기초하여 선택된다. p 값 <= 0.1 미만의 프로브가 선택된 다음 이들의 후성적 비율(ER)에 의해 더 감소되고, 프로브 ER은 추가 분석에 선택되기 위해 <=-1.1 또는 =>1.1이어야 한다. 마지막 필터는 변동 계수(CV)이며, 프로브는 <=0.3 미만이어야 한다.
2단계
통계학적 목록의 상위 40개 마커는 PCR 번역을 위한 마커로서 선택하기 위해 이들의 ER을 기초로 선택된다. 목록으로부터 가장 높은 음의 ER 부하를 갖는 상위 20개의 마커 및 가장 높은 양성 ER 부하를 갖는 상위 20개의 마커.
3단계
1단계로부터의 생성된 마커인 통계학적으로 유의한 프로브는 초기하 농축(HE)을 사용한 농축 분석의 기초를 형성한다. 이 분석은 유의한 프로브 목록으로부터 마커를 감소시키며, 2단계로부터의 마커와 함께 EpiSwitch™ PCR 플랫폼으로 번역된 프로브의 목록을 형성한다.
통계학적 프로브는 어떤 유전적 위치가 통계학적으로 유의한 프로브의 농축을 갖는지 결정하기 위해 HE로 처리되며, 이는 어떤 유전적 위치가 후성적 차이의 중심인지 나타낸다.
보정된 p 값에 기초한 가장 유의한 농축된 유전자좌는 프로브 목록 생성을 위해 선택된다. 0.3 또는 0.2의 p 값 미만의 유전적 위치가 선택된다. 2단계로부터의 마커와 함께, 이러한 유전적 위치에 맵핑되는 통계학적 프로브는 EpiSwitch™ PCR 번역을 위한 높은 가치의 마커를 형성한다.
어레이 설계 및 처리
어레이 설계
1. 유전적 유전자좌는 SII 소프트웨어(현재 v3.2)를 사용하여 다음과 같이 처리된다:
a. 이러한 특정 유전적 유전자좌(50kb 상류 및 20kb 하류를 갖는 유전자 서열)에서 게놈의 서열을 빼낸다
b. 이 영역 내의 서열이 CC에 포함될 확률을 정의한다
c. 특정 RE를 사용하여 서열을 절단한다
d. 어떤 제한 단편이 특정 방향에서 상호작용할 가능성이 있는지 결정한다
e. 상이한 CC가 함께 상호작용할 가능성을 순위 매긴다.
2. 어레이 크기 및 이에 따라 이용가능한 프로브 위치의 수(x)를 결정한다
3. x/4 상호작용을 빼낸다.
4. 각 상호작용에 대해, 파트 1로부터의 제한 부위에 대해 30bp의 서열 및 파트 2의 제한 부위에 대해 30bp의 서열을 정의한다. 상기 영역이 반복이 아닌지 확인하며, 그렇다면 제외하고 목록 아래에서 다음 상호작용을 취한다. 두 개의 30bp를 연결하여 프로브를 정의한다.
5. x/4 프로브 및 정의된 대조군 프로브의 리스트를 만들고 4회 복제하여 어레이 상에 생성될 목록을 만든다.
6. 맞춤형 CGH 어레이를 위한 Agilent Sure 설계 웹사이트에 프로브 목록을 업로드한다.
7. 프로브 그룹을 사용하여 Agilent 맞춤형 CGH 어레이를 설계한다.
어레이 처리
1. 템플레이트 생산을 위해 EpiSwitch™ SOP를 사용하여 샘플을 처리한다.
2. 어레이 처리 실험실에 의해 에탄올 침전으로 세척한다.
3. Agilent SureTag complete DNA 표지 키트에 따라 샘플을 처리한다 - 혈액, 세포 또는 조직에 대한 게놈 DNA 분석 효소 표지화를 위한 CGH에 기초한 Agilent 올리고뉴클레오타이드 어레이
4. Agilent 특징 추출 소프트웨어를 사용한 Agilent C 스캐너를 사용하여 스캔한다.
실시예 1: 류마티스성 관절염의 치료를 위해 메토트렉세이트의 비반응자 및 반응자를 구별하는 동반 진단과 관련된 염색체 상호작용을 결정하는 방법
출처: 글래스고 스코틀랜드 교육 연구 협회(SERA) 코호트.
실시예 1의 소개 및 간단한 요약
개별 환자의 안정한 후성적 프로파일은 신호전달 경로의 민감성을 조절하고, 유전자 발현을 조절하며, 질환 발달의 경로에 영향을 미치고, 약물의 효과적인 작용 및 치료에 대한 반응을 담당하는 조절 통제를 비효과적이게 할 수 있다. 여기에, 본 발명자들은 메토트렉세이트(MTX) 치료에 대한 비반응자를 정의하는 역할을 평가하기 위해 류마티스성 관절염(RA) 환자의 후성적 프로파일을 분석하였다.
류마티스성 관절염에서 1차(first-line) 질환을 변형시키는 항류마티스성 약물(DMARD, 일반적으로 메토트렉세이트(MTX))에 대한 반응의 신뢰성있는 임상 예측은 현재 가능하지 않다. 현재 1차 DMARD(특히, 메토트렉세이트(MTX))에 대한 반응을 결정하는 능력은 요법 후 경험적 임상 측정에 의존한다.
초기 류마티스성 관절염(ERA)에서, 1차 DMARD(특히, 메토트렉세이트(MTX))에 반응을 예측할 수 없었고, 이와 같이 치료 결정은 주로 임상적 알고리즘에 의존한다. 약물에 순수한 환자를 1차 DMARD에 반응하지 않을 환자로 분류하는 능력은 환자 계층화를 위한 귀중한 도구일 것이다. 여기에서, 본 발명자들은 초기 RA 환자의 혈액 백혈구에서의 염색체 형태 시그너처(이전에 RA에서 기술되지 않았던 매우 유익하고 안정한 후성적 변형)가 MTX 치료에 대한 비반응성을 예측할 수 있다고 보고한다.
방법:
말초 혈액 단핵 세포(PBMC)를 스코틀랜드 초기 류마티스성 관절염(SERA) 인셉션 코호트에서 모집된 DMARD 순수한 ERA 환자로부터 얻었다. 이 연구에서의 포함은 중간 내지 높은 질환 활성(DAS28 ≥ 3.2)을 갖는 RA의 진단(2010 ACR/EULAR 기준 충족) 및 메토트렉세이트(MTX)를 사용한 후속 단일 요법에 기초하였다. DAS28 = 28개 관절의 질환 활성 점수. EULAR = 류머티즘에 대한 유럽 연맹. ACR = 미국 류머티스학 대학. MTX 반응성은 하기 기준을 사용하여 6개월에 정의되었다: 반응자 - DAS28 완화(DAS28 <2.6) 또는 양호한 반응(>1.2의 DAS 28 개선 및 DAS28 3.2). 비반응자 - DAS28에서 개선 없음(≤0.6). 4명의 MTX 반응자, 4명의 MTX 비반응자 및 4명의 건강한 대조군에서의 염색체 형태 시그너처(CCS)의 초기 분석을 309개의 RA 관련 유전적 유전자좌를 포괄하는 13,322개의 고유한 프로브를 함유하는 EpiSwitchTM 어레이를 사용하여 수행하였다. 차별화 CCS를 LIMMA * 선형 모델링, 후속 이진 필터링 및 클러스터 분석에 의해 정의하였다. 30명의 MTX 반응자 및 30명의 비반응자의 검증 코호트를 EpiSwitchTM PCR 플랫폼을 사용하여 차별화 CCS에 대해 스크리닝하였다. 차별화 시그너처를 이진 점수 및 로지스틱 회귀 모델링을 사용하여 더 정제하고, 모델의 정확성 및 견고성을 ROC 분석에 의해 결정하였다 **.
* 주석: LIMMA는 마이크로어레이 실험에서 차등 발현을 평가하기 위한 선형 모델 및 경험적 베이즈(Bayes) 방법이다. Limma는 마이크로어레이 또는 RNA-Seq에서 발생하는 유전자 발현 데이터의 분석을 위한 R 패키지이다.
** 주석: ROC는 수신자 조작 특징을 의미하며 ROC 곡선을 나타낸다.　ROC 곡선은 그의 차별 역치가 달라짐에 따라 이진 분류기 시스템의 성능을 예시하는 그래프 플롯이다. 곡선은 다양한 역치 설정에서 위양성 비율에 대한 진정한 양성 비율을 플롯팅함으로써 생성된다.
CCS EpiSwitchTM 어레이 분석은 반응자 및 비반응자 ERA 환자를 구별하는 30개 마커 계층화 프로파일을 확인하였다. 검증 코호트에서 이 시그너처의 후속 평가는 이를 반응자 및 비반응자를 구별할 수 있는 5개 마커 CCS 시그너처로 정제하였다. 예측 모델링은 0.0098 내지 0.99(0 = 반응자, 1 = 비반응자) 범위의 반응자 및 비반응자에 대한 확률 점수를 제공하였다. 반응자에 대해 92%(95% 신뢰 구간 [95% CI] 75-99%)의 진양성 비율 및 비반응자에 대해 93%(95% CI 76-99%)의 진음성 비율이 있었다. 중요하게도, 이 계층화 모델을 검증하기 위한 ROC 분석은 시그너처가 MTX에 대한 NR의 92%의 민감성 예측력이 있었음을 입증하였다.
본 발명자들은 진단시 환자를 계층화하는 능력을 가진 DMARD 순수한 ERA 환자의 말초 혈액에서 매우 유익한 전신 후성적 상태를 확인하였다. 혈액 기반의 임상 시험을 사용하여, 환자를 선험적으로 비반응자로 구별하는 능력은 매우 귀중한 임상적 도구일 것이며; 계층화된 약물을 위한 길을 열고 ERA 병원에서 보다 적극적인 요법을 정당화할 것이다.
실시예 1의 상세한 형태
환자를 선험적으로 반응자(R) 및 비반응자(NR)로 구별하는 능력은 환자 계층화를 위한 귀중한 도구일 것이며, 이는 효과적인 치료의 더 빠른 도입으로 이어질 것이다. 본 발명자들은 질환 상태 및 MTX 반응성을 나타내는 혈액 유래의 백혈구에서 염색체 형태 시그너처(CCS)를 확인하기 위해 EpiSwitchTM 바이오마커 발견 플랫폼을 사용하였다. 이에 의해, 본 발명자들은 치료에 순수한 초기 RA(ERA) 환자를 MTX R 및 NR로 계층화할 수 있는 최초의 예후적 분자 시그너처를 제공하는 CXCL13, IFNAR1, IL-17A, IL-21R 및 IL-23 유전자좌에 함유된 후성적 시그너처를 확인하였다. 중요하게도, 이 계층화 모델은 MTX에 대한 NR의 92%의 민감성 예측력이 있었다. 이 후성적 RA 바이오마커 시그너처는 ERA 및 건강한 대조군(HC)을 구별할 수 있다. 이 조합적이고 예측적인 말초 혈액 시그너처는 병원에서 보다 적극적인 치료제의 더 빠른 도입을 지원하여, RA에서 개인화된 약물을 위한 길을 열 수 있다.
RA는 전세계 인구의 1%까지 영향을 미치는 만성 자가면역 질환이다. 발병은 다요인적이며 환경적인 인자, 특히 흡연 및 기타 폐 자극과 상호작용하는 주로 면역 숙주 유전자 유전자좌를 특징으로 한다. 유전적으로 민감한 개체가 이러한 환경적인 인자에 노출되는 것은 질환 발병 및 진행에 대한 후성적 맥락을 제시한다. 염색질 마커의 최근 연구(예컨대, 게놈의 메틸화 상태)는 RA와 관련된 후성적 차이의 첫 번째 증거를 제공한다. 그러나, 지금까지 유전적 관련성이나 후성적 변화는 주어진 요법에 대한 반응을 위한 검증된 예측 마커를 제공하지 못하였다. 더욱이, 임상 결과는 종래 DMARD의 효능 및 독성만을 약하게 예측한다. EULAR(류머티즘에 대한 유럽 연맹) 및 ACR(미국 류머티스학 대학) 관리 지침에 의해 권고되는 가장 일반적인 첫 번째 선택되는 약물인 MTX는 6개월 치료 후 50 내지 65% 범위의 임상적으로 의미있는 반응률을 낸다. 이러한 반응, 및 특히 높은 장애물 반응을 나타내는 다소 작은 비율은 현재 개별 환자에서 예측될 수 없다. 이것은 치료 요법 선택(단일 또는 조합 치료)에 대한 '시행 착오' 기반의 접근법을 낳는다. 개체 환자에서 약물 반응성을 예측하는 능력은 1차 치료에 대한 반응이 장기간 결과의 가장 유의한 예측인자인 점을 고려할 때, 귀중한 임상적 도구일 것이다.
본원에서, 본 발명자들은 MTX 치료에 대해 NR을 나타내고 이러한 환자의 대안적인 치료제에 대한 선험적인 확인 및 계층화를 가능하게 하는 안정한 혈액 기반의 후성적 프로파일이 있는지 확인하기 위해 스코틀랜드 초기 류마티스성 관절염(SERA) 인셉션 코호트로부터의 DMARD-순수한 ERA 환자의 후성적 프로파일링에 초점을 맞추었다. 출처 후성적 조절은 세포 활성화 및 전사 프로파일에 강하게 영향을 미칠 수 있다. 생각건대, 약물에 대한 작용 방식은 후성적으로 변형된 유전자좌에 의해 영향을 받을 수 있다. 본 발명자들은 장거리 염색질 상호작용으로도 알려진 CCS에 초점을 맞추었는데, 이들이 전사 조절에 유의한 영향을 미치는 매우 유익하고 안정한 고차 후성적 상태를 반영하기 때문이다. 이들은 또한 유의한 이점과 표현형 차이에의 초기의 기능적 연관성을 제공하며, 종양학 및 다른 질환 분야에서 유익한 바이오마커 후보로서 보고되었다.
본 발명자들은 스코틀랜드 초기 류마티스성 관절염(SERA) 인셉션 코호트에 의해 제공된 초기 RA(ERA) 환자를 사용하였다. 인구학적, 임상적 및 면역학적 인자를 진단시와 6개월에 얻었다. 이 연구에서의 포함은 중간 내지 높은 질환 활성(DAS28 ≥ 3.2)을 갖는 RA의 진단(2010 ACR/EULAR 기준 충족) 및 메토트렉세이트(MTX)를 사용한 후속 단일 요법에 기초하였다. 반응자는 MTX 투여시 6개월에 DAS28 완화(DAS28 <2.6) 또는 양호한 반응(>1.2의 DAS 28 개선 및 DAS28 3.2)을 달성한 환자로서 정의되었다. 비반응자는 MTX 투여시 6개월에 DAS28이 개선되지 않은(≤0.6) 환자로서 정의되었다. 후성적 분석을 위한 혈액 샘플을 진단시에 수집하였다. (DAS28 = 28개 관절의 질환 활성 점수.)
본 발명자들은 RA와 기능적으로 연관된 309개 유전적 유전자좌에 걸쳐 13,322개의 염색체 형태 시그너처(CCS)(13,322개의 고유의 프로브)를 분석함으로써 이진 후성적 바이오마커 프로파일링을 사용하였다. 초기 흑색종(2)을 갖는 메이요(Mayo) 병원의 혈액 기반 계층화에서 이미 성공적으로 활용되었고 현재 PD-1/PD-L1을 이용한 면역요법에 대한 반응의 예측 계층화에 사용되는 EpiSwitchTM 플랫폼 상에서, 후성적 바이오마커의 매우 유익한 계열인 CCS(1)를 판독, 모니터링 및 평가하였다.
순수한 RA 환자의 확인된 후성적 프로파일을 그래프패드 프리즘, WEKA 및 R 통계 언어를 사용하여 통계학적으로 분석하였다. EpiSwitchTM 플랫폼 및 90개의 임상적 샘플의 연장된 코호트를 사용하여, 반응자, 비반응자, RA 환자 및 건강한 대조군에 대해 통계학적으로 유의한 922개 이상의 후성적 선도 바이오마커의 풀을 확인하였다.
ERA 환자에서 치료전 순환 CCS 상태를 확인하기 위해, RA 발병과 관련된 123개의 유전적 유전자좌(표 1)를 선택하고 EpiSwitchTM 인실리코 예측 패키지를 사용하여 예측된 염색체 형태 상호작용으로 주석을 달았다. EpiSwitchTM 인실리코 예측은 13,322개의 고신뢰도 CCS 마커 후보를 생성하였다(표 1). 6개월 요법 후 임상적으로 정의된 4명의 MTX 반응자(R) 및 4명의 MTX NR(도 1A, B 및 표 2), 및 4명의 건강한 대조군(HC)으로부터 진단시에(DMARD-순수한) 단리된 말초 혈액 단핵 세포를 스크리닝하기 위해 이러한 후보를 맞춤형 발견 EpiSwitchTM 어레이(도 5)를 생성하는데 사용하였다. R, NR 및 HC를 구별한 CCS를 확인하기 위해, 표준화된 후성적 부하의 LIMMA * 선형 모델을 사용하였다. 총 922개의 통계학적으로 유의한 계층화 마커(조절된 p 값 및 EpiSwitchTM 비율에 근거하여 평가된 유의성)가 확인되었다. 922개의 선도 마커 중, 420개는 NR과 관련되었고, 210개는 R과 관련되었으며 159개는 HC와 관련되었다(도 1C). 이진 필터링 및 클러스터 분석을 EpiSwitch™ 마커에 적용하여 확인된 CCS의 유의성을 평가하였다. 계단식 계층적 군집분석 접근법(완전한 연결 응집과 함께 맨해튼 거리 측정을 사용하고 R 대 NR, HC 대 R & HC 대 NR을 고려함)은 유의한 마커의 수를 922개에서 65개로 줄였고 최종적으로 30개 마커 계층화 프로파일을 생성하였다(도 1D 및 표 3).
* 참고: LIMMA는 마이크로어레이 실험에서 차등 발현을 평가하기 위한 선형 모델 및 경험적 베이즈(Bayes) 방법이다. Limma는 마이크로어레이 또는 RNA-Seq에서 발생하는 유전자 발현 데이터의 분석을 위한 R 패키지이다.
CCS 시그너처를 정제하고 검증하기 위해, 30개의 확인된 마커를 EpiSwitch™ PCR 플랫폼(도 5)을 사용하여 계단식 접근법으로 R 및 NR의 두 번째 ERA 환자 코호트(도 2A, B 및 표 4)에서 스크리닝하였다. 첫 번째 경우, 전체 30개 CCS 마커를 12명의 ERA 환자(6명의 R 및 6명의 NR)에서 실행시켰다. 가장 우수한 차별화 CCS 마커는 이진 점수에 대한 예이트(Yate)의 연속성 보정과 함께 독립성에 대한 카이 제곱 검정을 적용함으로써 확인되었고, 이는 12개 마커 CCS 프로파일을 나타내었다(표 5). 이러한 12개 CCS 마커를 추가의 12명의 ERA 환자(6명의 R 및 6명의 NR) 및 이전 12명의 ERA와 조합된 데이터에서 실행하였다. 24명의 환자 샘플(12명의 R 및 12명의 NR)을 조합하여 WEKA 분류 플랫폼에의 로지스틱 회귀 모델(각 마커의 식별력을 채점하기 위한 5배 교차 검증을 사용하여)을 생성하였고, 이를 초기 데이터 세트의 무작위 데이터 재샘플링에 의해 10회 실행하여 모델 생성을 위한 10개의 상아힌 시작점을 생성하였다. 가장 높은 평균 점수를 갖는 마커를 선택하여 프로파일을 10개의 가장 우수한 식별 CCS 마커로 감소시켰다(표 5). 10개의 CCS 마커를 사용하여 36개의 ERA 샘플(18명의 R 및 18명의 NR)을 추가로 탐침하였다. 모든 데이터(30명의 R 및 30명의 NR)의 조합하고, 동일한 로지스틱 회귀 및 점수 계산 분석을 사용하여 MTX R을 NR과 구별한 5개의 CCS 마커 시그너처(IFNAR1, IL-21R, IL-23, IL-17A 및 CXCL13)를 밝혀내었다(도 2C, 표 5). CXCL13 및 IL-17A 유전자좌에서의 CCS는 비반응자와 관련된 반면 IFNAR1, IL-23 및 IL-21R 유전자좌에서의 CCS는 반응자와 관련되었다. 이것은 인간 자가면역에서 IL-17 축에 대해 상정된 중추적인 역할을 고려할 때 흥미로운 프로파일이었다.
중요하게도, 계층화 시그너처의 조성은 MTX 반응을 결정하기 위한 주된 중요한 유전적 위치를 잠재적으로 제어하는 염색체의 형태의 위치를 확인한다. 분류화 5개의 EpiSwitch™ CCS 마커에 대한 이진 점수의 주 성분 분석(PCA)은 이들의 MTX 반응에 기초하여 ERA 환자를 명확히 분리하였다(도 2D). 모델은 0.0098 내지 0.99(0 = 반응자, 1 = 비반응자) 범위의 반응자 및 비반응자에 대한 예측 확률 점수를 제공하였다. 컷오프 값은 반응자에 대해 ≤0.30 및 비반응자에 대해 ≥0.70으로 설정되었다. ≤0.30의 점수는 92%(95% 신뢰 구간 [95% CI] 75-99%)의 진양성 비율을 가진 반면 ≥0.70의 점수는 93%(95% CI 76-99%)의 진음성 반응률을 가지고 있었다. 반응 카테고리당 관찰되고 예측된 환자의 수(MTX에 대한 R 또는 NR)가 표 6에 나타나 있다. EpiSwitch™ CCS 마커 모델의 경우, 53명의 환자(88%)가 반응자 또는 비반응자로 분류되었다.
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표 6에 대한 주석: 컷오프 수준은 NR에 대해 (약) >0.70 및 R에 대해 <0.3의 MTX에 대한 반응의 확률에 기초하여 선택되었다. NR 및 R은 방법에 기재된 바와 같이 정의되었다.
5개의 EpiSwitch™ CSS 마커를 결정한 로지스틱 분류 모델의 '정확성' 및 '성능의 견고성'을 시험하기 위해, 150개의 ROC ** 곡선(고유의 시작점을 가짐)을 R 및 NR 데이터의 무작위 데이터 재샘플링에 의해 생성하였다(도 3A). 이것은 데이터를 훈련(66%, 6000개의 알려진 클래스 샘플에 해당) 및 시험(34%, 3000개의 미지의 클래스 샘플에 해당) 그룹으로 분리시켰고; 중요하게도 교차 검증을 위한 데이터에서 동일한 분할이 관찰되지 않는다. 모델의 평균 구별 능력(AUC)은 89.9%(95% CI 87-100%)였고, 92%의 NR에 대한 평균 민감성(반응 유병률에 대해 조절됨) 및 84%의 R에 대한 평균 특이성을 가지고 있었다. 모델의 예측 능력을 결정하기 위해, 평균 모델 정확성 통계를 베이즈 유병률 정리를 사용하여 MTX에 대한 집단 R/NR에 대해 조절하였다. 55% MTX 반응률을 사용시, 양성 예측값(PPV)은 90.3%인 반면 음성 예측값(NPV)은 86.5%였다. 반응률이 60%로 조정되면, 이것은 PPV를 87%로 감소시킨 ㅂ반면 NPV를 89%로 증가시켰다.
** 주석: ROC는 수신자 조작 특징을 의미하며 ROC 곡선을 나타낸다.　ROC 곡선은 그의 차별 역치가 달라짐에 따라 이진 분류기 시스템의 성능을 예시하는 그래프 플롯이다. 곡선은 다양한 역치 설정에서 위양성 비율에 대한 진양성 비율을 플롯팅함으로써 생성된다.
선택된 5개의 EpiSwitchTM CCS 마커의 식별력의 독립적인 평가로서, 30명의 HC를 포함한 혼합 데이터의 인자 분석(FAMD)을 수행하였다. 이것은 시그너처가 MTX R 및 NR을 구별하는 능력을 가질 뿐만 아니라 건강한 개체 및 RA 환자를 구별하는 충분한 질환 특이적 특징을 보유한다는 것을 예시하였다(도 3B).
실시예 1 - 표 6D 및 6E - RA-MTX 반응자 및 비반응자 사이의 계층화
실시예 1A로부터 표 6b+6c 이후에 제시된 표 6D 및 계속된 표 6E는 특히 약 54개의 DNA 프로브(60머) 및 이들의 DNA 서열의 목록을 나타낸다. 이러한 프로브는 실시예 1에서 사용된 프로브의 일부를 대표한다. 얽매이지 않고, 표 6D+6E에 예시된 대부분의 프로브는 RA-MTX 반응자 및 RA-MTX 비반응자 사이를 계층화하는데 유의하고/유익할 것으로 생각된다. 표시된 프로브를 PCR에 의해 추가로 조사하였다. P 값 = 확률 값; adj. = 조절된.
실시예 1 - 결론
결론적으로, R/NR에 대한 장래의 임상적 평가에 기초한 DMARD 순수한 ERA 환자의 후성적 프로파일 분류의 연구는 MTX 반응에 도움이 되고 도움이 되지 않는 후성적 상태를 구별하는 일관된 후성적 시그너처를 확인하였다. 이것은, 우리의 지식으로는, 질환과 관련된 것으로 보이고(건강한 대조군 대비) 1차 MTX 요법에 대한 비반응성을 예측할 수 있는, 초기 RA 환자에서의 안정적이고 선택적으로 구별하는 혈액 기반의 후성적 바이오마커의 첫 번째 예이다. 이 모델은 5개의 병태적 CCS에 기초한 검증된 분류기 및 산업적 ISO-13485 EpiSwitch™ 플랫폼에 의한 이들의 검출의 직접적이고 실용적인 이점을 제공하는데, 이는 가까운 미래에 임상 실습에서 일상적으로 이용될 가능성이 있다. 중요하게도, 이 예측 시그너처를 채택함으로써, MTX 순수한 ERA 환자를 R 및 NR 코호트로 계층화할 수 있어야 한다. 이것은 효과적인 치료제의 조기 사용을 시도하는 ERA에 대해 현재 승인된 치료 전략을 통해 환자 진행을 가속화할 잠재성을 제공하며, 따라서 '개인화된' 치료 요법으로 이어질 수 있다. 또한, 병원에서 신속한 생물학적 치료 요법을 정당화하는데 사용될 수 있는 대안적인 CCS 시그너처가 RA 환자(및 다른 자가면역 질환을 갖는 환자)에 존재한다고 생각할 수 있다. 이것은 사회 경제적으로 큰 영향을 미쳐 보다 비용 효과적이며 견고한 치료 접근법을 제공할 것이다.
실시예 1 - 재료 및 방법
실시예 1 - RA 환자 집단
이 연구에서 ERA 환자는 스코틀랜드 초기 류마티스성 관절염(SERA) 인셉션 코호트의 일부이다. 인구학적, 임상적 및 면역학적 인자를 진단시와 6개월에 얻었다(표 1). 인셉션 코호트에의 포함은 스코틀랜드에서 이차 의료 류마티스과에서 미분화 다발성관절염 또는 RA(≥1 팽윤된 관절)의 임상 진단에 기초하였다. 제외 기준은 이전 또는 현재 DMARD/생물학적 요법 및/또는 확립된 대안적인 진단(즉, 건선 관절염, 반응성 관절염)이었다. 이 연구에서의 포함은 중간 내지 높은 질환 활성(DAS28 ≥ 3.2)을 갖는 RA의 진단(RA에 대해 2010 ACR/EULAR 기준을 충족함) 및 MTX를 이용한 후속 단일요법에 기초하였다. [DAS28 = 28개 관절의 질환 활성 점수. EULAR = 류머티즘에 대한 유럽 연맹. ACR = 류머티스학의 미국 대학.] 반응자는 MTX 투여시 6개월에 DAS28 완화(DAS28 <2.6) 또는 우수한 반응(>1.2의 DAS28 개선 및 DAS28 ≤3.2)을 달성한 환자로서 정의되었다. 비반응자는 MTX 투여시 6개월에 DAS28(≤0.6)의 개선이 없는 환자로서 정의되었다. 혈액 샘플을 진단시에 EDTA 튜브에 수집하고(기저선) 원심분리하여 PBMC를 함유하는 버피 층(buffy layer)을 생성하였고, 이는 채취하여 -80℃에서 보관하였다. 지역 윤리 위원회는 연구 프로토콜을 승인하였고 모든 환자는 연구 등록 전에 사전동의를 받았다.
실시예 1 - EpiSwitch TM 처리, 어레이 및 PCR 검출. EpiSwitch TM 분석을 위한 프로브 설계 및 위치
패턴 인식 방법을 사용하여 인간 게놈 내의 전사 단위와 관련된 인간 게놈 데이터를 분석하였다. 독점적 EpiSwitchTM 패턴 인식 소프트웨어는 염색질 상호작용에 관여하는 확률 점수를 제공한다. 123개 유전자좌로부터의 서열을 다운로드받아 처리하여 13,322개의 가장 가능성 있는 염색체 상호작용의 목록을 생성하였다. 60머 프로브를 설계하여 이러한 잠재적인 상호작용을 조사하고 맞춤형 어레이로서 Agilent SureDesign 웹사이트에 업로드하였다. 네스티드 PCR에 의해 잠재적인 마커를 스크리닝하기 위해 선택된 위치에서, 프라이머3을 사용하여 서열 특이적 올리고뉴클레오타이드를 설계하였다. 올리고뉴클레오타이드를 올리고뉴클레오타이드 특이적 BLAST를 사용하여 특이성에 대해 시험하였다.
실시예 1 - 환자 PBMC로부터의 염색질 형태 시그너처 분석
템플레이트 제조: 50 μl의 각 PBMC 샘플로부터의 염색질을 제조사의 지침(Oxford BioDynamics Ltd)에 따라 EpiSwitchTM 분석을 사용하여 추출하였다. 간략히, 고차 구조를 포름알데하이드로 고정시키고, 염색질을 추출하고, TaqI으로 소화시키고, 분자내 라이게이션을 최대화하기 위한 조건에서 희석 및 라이게이션하고, 이어서 단백질분해효소 K로 처리하였다. EpiSwitch TM 마이크로어레이 : EpiSwitchTM 마이크로어레이 혼성화를 제조사의 지침(Agilent)에 따라 Agilent 시스템을 사용한 맞춤형 Agilent 8x60k 어레이를 사용하여 수행하였다. 각각의 어레이는 55088개의 프로브 스팟을 함유하며, 이는 4 반복된 EpiSwitchTM 패턴 인식 소프트웨어에 의해 예측된 13,322개의 잠재적인 염색체 상호작용, 및 EpiSwitchTM 및 Agilent 대조군을 나타낸다. 간략히, 1 μg의 EpiSwitchTM 템플레이트를 Agilent SureTag 표지화 키트를 사용하여 표지하였다. 표지된 DNA의 처리를 수행하였다. 어레이 분석을 Agilent 스캐너 및 소프트웨어를 사용하여 세척 직후에 수행하였다. 모든 실험을 비교하기 위해, 데이터를 배경 보정하고 표준화하였다. 어레이의 각 스팟이 4개씩 존재하므로, 어레이 내의 각 프로브의 4개의 스팟의 중앙값을 계산하고 그의 로그2 변환 값을 추가 분석에 사용하였다. 변동 계수 및 p 값을 각 프로브 복제물에 대해 계산하였다. EpiSwitch TM PCR 검출: 각 프라이머 세트가 정확하게 작동하고 있는지 확인하기 위해 올리고뉴클레오타이드를 템플레이트 상에서 시험하였다. 기술적 및 복제물 차이를 수용하기 위해, 각 샘플을 4회 처리하였다. 이러한 4개의 복제물로부터의 모든 추출물을 모으고 각 샘플에 대해 최종 네스티드 PCR을 수행하였다. 이 과정은 제한된 복제수의 템플레이트를 더 높은 정확도로 검출할 수 있게 해주었다. 모든 PCR 증폭된 샘플을 LabChip DNA 1K Version2 키트(Perkin Elmer)를 사용하여 Perkin Elmer로부터의 LabChip® GX에서의 전기영동에 의해 시각화하고 내부 DNA 마커를 형광 염료를 사용하여 제조사의 프로토콜에 따라 DNA 칩에 로딩하였다. 형광을 레이저에 의해 검출하고, 전기영동도 판독값을 장비 소프트웨어를 사용하여 겔 그림 상의 시뮬레이트된 밴드로 번역하였다. 밴드를 양성으로 간주하기 위해 설정된 역치는 30 형광 단위 이상이었다.
실시예 1 - 통계학적 방법 및 패키지.
그래프패드 프리즘 및 SPSS를 임상 데이터의 모든 통계학적 분석에 사용하였다. 카이 제곱 검정 및 피셔의 정확한 검정(범주형 변수의 경우), 독립적 샘플을 위한 t-검정(연속형 정규 분포 변수의 경우), 및 만-휘트니 U 검정(정규 분포를 갖지 않는 연속형 변수의 경우)을 차이를 확인하는데 사용하였다. 통계학적 유의 수준을 0.05로 설정하였고, 모든 시험은 양측(2-sided)이었다. R(및 적절한 패키지)을 EpiSwitch™ 데이터의 평가에 사용하였다. 이것은 이 제곱 검정 및 GLM(logit)을 위한 Stats 패키지, WEKA 교차 확률로부터의 ROC 곡선을 위한 ROCR 패키지, 열지도를 위한 R에서의 gplot & stats 패키지를 포함하였다. FactorMiner 패키지를 PCA 및 인자 플롯에 사용하였다. Weka를 속성 감소, 데이터 무작위화 및 재샘플링, 로지스틱 모델 분류기, AUC 계산 및 모델 정확성 계산에 사용하였다.
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피셔의 정확한 무조건부 검정은 두 그룹 간의 비율 차이를 평가하는데 사용된다. 두 그룹 간의 연속 변수의 차이를 조사하기 위해, 독립적인 샘플 t-검정 또는 만-휘트니 U-검정(데이터의 분포에 따라)이 사용된다. $n=3
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피셔의 정확한 무조건부 검정은 두 그룹 간의 비율 차이를 평가하는데 사용된다. 두 그룹 간의 연속 변수의 차이를 조사하기 위해, 독립적인 샘플 t-검정 또는 만-휘트니 U-검정(데이터의 분포에 따라)을 사용하였다.
$ 한 명의 환자 "기타" (비-백인, 비-동남아시아인, 비-인도 아대륙인, 비-아프리카계 카리브해인), 한 명의 환자는 답을 주지 않았다.
$$ BMI에 대한 반응자에서 n= 25
€기저선 - n = 29 비-R, n= 30 R; 6m - n = 30 비-R, n= 29
# 기저선 - n = 26 비-R, n= 29 R; 6m - n = 21 비-R, n= 29
§기저선 - n = 19 비-R, n= 23 R; 6m - n = 19 비-R, n= 22
c기저선 - n = 13 비-R, n= 23 R
∝기저선- n = 26 비-R, n= 29 R
기저선 - n = 29 비-R, n= 27 R; 6m - n = 28 비-R, n= 25
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표 6에 대한 주석: 컷오프 수준은 NR에 대해 (약) >0.70 및 R에 대해 <0.3의 MTX에 대한 반응의 확률에 기초하여 선택되었다. NR 및 R은 방법에 기재된 바와 같이 정의되었다.
실시예 1A - RA 분석: MTX 반응자 대 비반응자 : 실시예 1 이후의 작업
실시예 1 이후에, 실시예 1A에서, MTX 단일요법 중인 RA 환자에 대해, MTX 반응자 대 MTX 비반응자 사이를 계층화하는 더 정제된 DNA 프로브를 생성하기 위해, 본 명세서의 실시예 섹션의 시작에 있는 "통계학적 파이프라인" 방법(들)을 사용하여, 생물통계학적 초기하 분석을 수행하였다
실시예 1A 결과: 이하 표 6b(및 연속부분 표 6c)는 RA-MTX에 대한 프로브 및 유전자좌 데이터 - 반응자(R) 및 비반응자(NR) 사이를 계층화하는 DNA 프로브를 개시한다. B = B-통계(lods 또는 B), 이는 유전자가 차별적으로 발현되는 로그 오즈(log-odds)이다. FC는 비로그 배수 변화이다. FC_1은 0을 중심으로 한 비로그 배수 변화이다. 표 6b+6c는 초기하 분석으로부터 MTX 반응자(MTX-R)를 확인하기 위한 25개의 정제된 바람직한 DNA 프로브(60머), 및 MTX 반응자(MTX-NR)를 확인하기 위한 24개의 정제된 바람직한 DNA 프로브(60머)를 포함하는 것으로 보인다.
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실시예 2: AML(급성 골수성 백혈병)의 치료에서 LSD1의 억제 동안 약력학적 바이오마커로서 동반 진단과 관련된 염색체 상호작용을 결정하는 방법
출처: 영국 암 연구소.
약력학적 바이오마커
약력학적(PD) 바이오마커는 유기체 내의 표적에 대한 약물 효과의 분자 지표이다. PD 바이오마커는 약물 요법, 표적 효과, 및 생물학적 종양 반응 사이의 연관성을 조사하는데 사용될 수 있다. 새로운 약물 개발을 집중된 PD 바이오마커 측정과 결합하는 것은 정보에 입각한, 조기 계속/중단(go/no-go) 결정을 하고, 표적화된 제제의 합리적인 조합을 선택하며, 조합 약물 요법의 스케줄을 최적화하는 중요한 데이터를 제공한다. PD 종점의 사용은 또한 전임상 모델에서 선도 화합물의 선택에서부터 첫 인간 시험(국립 암 연구소)까지 약물 개발 내내 합리성과 가설 테스트 능력을 향상시킨다.
본 발명자들은 염색체 시그너처가 관찰된 표현형 변화와 일치하는 시점에 많은 약물에 대한 반응을 모니터링하는 약력학적 바이오마커로서 사용될 수 있음을 발견하였다.
EpiSwitch ™ 마커 - 이상적인 약력학적 바이오마커
MV4-11 세포주에서 BET(bromodomain and extra-terminal) 억제제에 대한 연구는 BET 억제가 주요 발암유전자 BCL2, CDK6, 및 C-MYC의 전사 억제를 일으킨다는 것을 보여주었다. LSD1 억제제와 같은 BET 억제제는 히스톤의 아세틸화 및 메틸화 상태를 표적화하는 후성적 요법이다. 유전자좌에서의 위상 변화가 임의의 조절 변화보다 선행하기 때문에, EpiSwitch™을 이용한 MYC 유전자좌에서의 발견은 LSD1 억제를 이용한 조절 변화의 증거를 보여준다. MV4-11 세포주는 MLL-AF4 및 FLT3-ITD를 발현하는 전좌를 갖는 반면 THP-1은 MLL-AF9만을 발현한다.
AML(급성 골수성 백혈병)을 위한 EpiSwitch ™ LSD1 억제 바이오마커 연구
EpiSwitchTM 플랫폼에 의해 확인된 후성적 바이오마커는 LSD1 탈메틸효소의 후성적 기전을 설명하는데 적합하고 세포주 내에서 및 세포주 사이에서 LSD1 억제제의 상이한 특이성을 계층화하는데 적합하다. 이 작업은 염색체 형태 시그너처가 LSD1 억제에서 기전 연계 예측 바이오마커로서 사용될 수 있음을 입증한다. 표준 LSD1 억제제인 트라닐시프로민(TCP)이 본 연구에서 조사된다.
EpiSwitch ™ LSD1 약력학적 바이오마커 발견
세포를 1uM의 트라닐시프로민(TCP)으로 처리하였다. 2개의 AML(급성 골수성 백혈병) 세포주 THP-1 및 MV4-11을 상기 화합물로 시험하였다. THP-1 세포에서 MYD88 유전자 부근에서 확인된 염색체 시그너처가 표 7에 나타나 있다. MV4-11 세포에서 MYD88 유전자 부근에서 확인된 염색체 시그너처가 표 8에 나타나 있다. 각 숫자 조합은 개체 염색체 상호작용을 가리킨다. 유전자에 대한 위치가 생성되었고 제한 부위 및 검출 및 프라이머 효율의 다른 특징에 기초하여 선택되었으며, 이후 상호작용에 대해 분석되었다. 표 7 및 8의 결과는 시그너처 검출이 없음을 나타낸다. 시그너처 검출은 번호 1로 표시된다. 하기는 세포주 THP-1 및 MV4-11에 대한 MyD88 유전자좌의 PCR EpiSwitch™ 마커 결과이다. FACS 분석을 사용하여 분화의 지표로서 CD11b± 세포의 발현을 분류하였다. MyD88 및 MYC 유전자좌는 72시간에 치료 변화의 주요 유전적 구동체로서, 이전에 발표된 연구에 근거하여 선택되었다.
LSD1 억제제(TCP) 실험 - 발견 확인
치료되지 않은 세포와 비교하여 이후의 시점(72시간)에서 변화하는 형태는 2개의 세포 유형 사이에 가장 일관성을 나타낸다. 이것은 THP-1 데이터에 나타난 굵은 이중선 위의 마커이며, MV4-11 데이터에서 음영된 세포에 의해 강조되어 있다.
LSD1 억제는 MYD88의 ORF의 5' 상류와의 장거리 상호작용을 제거하여, 유전자좌에 대한 조절 전망을 변화시킨다.
LSD1 억제 분석 대 유전자 발현 데이터 - MYC 유전자좌 형태와 유전자 발현(GEX)과의 시간적 및 구조적 상관관계
MYC는 AML(급성 골수성 백혈병) 병리학을 유발하는 표적 유전자이지만 72시간 치료에서는, 배수 변화가 너무 작아서 마커로 유의하지 않다. GEX 데이터에 대한 72시간에 MYC 유전자에서 표 9에 나타난 변화는 72시간에 확인된 형태 변화와 상관관계가 있다. 치료되지 않은 세포 대비 MYC에서의 음성 GEX 변화는 MYC 증식 효과를 교란시키는 요건과 일치한다. 변화는 많은 신호 캐스캐이드에 의해 이 유전자좌에서 유발된 엄격한 통제와도 일치하여 작다.
상기 GEX 데이터와 달리, EpiSwitchTM 바이오마커는 세포자멸사(표현형 변화)에 의한 세포 분화 및 이들의 사멸과 상응하는 72시간 치료에서 염색체 형태 시그너처의 변화를 명확하게 검출한다.
LSD1 억제 분석 대 유전자 발현 데이터 - MyD88 유전자좌 형태와 유전자 발현(GEX)과의 시간적 및 구조적 상관관계
GEX 데이터에 대한 72시간에 MyD88에서 나타난 변화는 72시간에 확인된 형태 변화와 상관관계가 있다. GEX 변화는 치료되지 않은 세포 대비 양성이며, 이는 LSD1 억제제로 치료한 후 이러한 AML(급성 골수성 백혈병) 세포에서 나타나는 차이와 일치한다.
GEX 및 EpiSwitchTM에 의해 확인된 MYD88 유전자좌에서 TCP로 72시간 치료시에 1.5 배수 변화만이 관찰되었다. 이러한 변화 수준은 마이크로어레이 유전자 발현 분석에서 노이즈에 의해 지나치게 영향을 받는다. 그러나, 염색체 시그너처에 대해 관찰된 후성적 변화는 깨끗하여 0 또는 1의 이진 형식을 따른다. 데이터는 뚜렷한 변화 패턴을 나타낸다. MYC 및 MYD88 모두는 GEX 데이터에서 나타난 바와 같이, 유전자 발현에서 강한 반응을 나타내지 않을 수 있지만, 염색체 시그너처를 통해 핵심적인 후성적 변화가 가시화됨에 따라 확인될 수 있는 후성적 유발자이다. 이러한 2개의 후성적 구동체는 성공적인 요법 치료에 필요한 표현형 변화를 정의한다. 72시간째 세포는 분화하여 아폽토시스를 겪는다.
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실시예 3: 치료된 환자에서 흑색종 재발의 예후를 위한 동반 진단과 관련된 염색체 상호작용을 결정하는 방법( PCR 데이터).
출처: 메이요 병원 전이성 흑색종 코호트, USA
예후적 바이오마커는 질환의 경과 또는 결과(예컨대, 말기, 안정화 또는 진행)을 예측한다. 이 연구는 재발 또는 회복의 징후에 대해, 수술 치료를 받은 모니터링된 흑색종 환자에서 명확한 후성적 염색체 형태 차이를 확인하고, 상기 바이오마커를 흑색종의 재발을 모니터링하기 위한 예후적 바이오마커일 가능성에 대해 검증하는 재발을 위한 예후적 바이오마커로서 작용할 수 있는 염색체 시그너처를 발견하고 검증한다. 여기에서, 본 발명자들은 치료 2년 내에 재발할 가능성이 있는 후보를 확인하기 위해 원래의 성장의 절제에 의한 치료를 받은 확진된 흑색종 환자에게의 적용에서 염색체 형태 시그너처의 검증된 예후적 사용의 예를 제시하고자 한다.
224명의 흑색종 환자를 수술로 치료하여 암을 제거하였다. 그리고 나서, 이들을 수술 후 >100일에 분석을 위해 혈액을 채혈하면서 2년의 기간 동안 관찰하였다.
EpiSwitch ™ 예후적 바이오마커 발견
흑색종과 관련된 44개의 유전자 및 차세대 시퀀싱 NGS에 의한 임의의 질환-특이적 장거리 상호작용에 대한 게놈의 나머지의 염색체 시그너처를 시험하였다. 딥 시퀀싱을 통한 흑색종과 관련된 염색체 시그너처의 비편향적 평가는 2500개 후보 마커의 초기 풀을 제공하였다. 흑색종 환자 및 대조군으로서 비흑색종 피부암(NMSC) 환자로부터의 혈액 샘플의 확장 세트에 대한 EpiSwitch™ 플랫폼에 의한 추가 분석은 후보 마커의 초기 풀을 150개로 감소시켰다. 표 13에 나타난 바와 같이, 샘플 수의 추가 확장으로, 그것은 32개로 감소되었다.
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재발의 예후
비흑색종 피부암으로부터 흑색종의 계층화를 위해 이전에 확인된 상위 15개의 마커는 TBx2; TYR; BRAF; MiTF; p16; BRN2; p21; TBx3의 총 8개의 유전자로부터 취한 TBx2 7/15, TYR 1/9, TYR 13/17, TYR 3/11, TYR 3/23, P16 11/19, P16 7/23, P16 9/29, MITF 35/51, MITF 43/61, MITF 49/55, BRAF 5/11, BRAF 27/31, BRAF 21/31, BRAF 13/21를 포함한다.
흑색종 환자의 후성적 프로파일의 3C 분석은 예후적 바이오마커일 가능성이 있는 150개의 염색체 시그너처(서명)를 밝혀내었고, 이는 시험 샘플 코호트의 확장 세트에서 3개로 감소하였다. 염색체 형태 시그너처의 전환을 나타내는 3개의 염색체 시그너처는 재발에 대한 치료 및 2년 결과와 상당히 일치하며, 가장 우수한 잠재적인 예후적 흑색종 마커는 BRAF 5/11, p16-11/19 및 TYR 13/17이다. 최종적으로, 3개의 염색체 시그너처를 예후적 바이오마커로서 검증 단계로 넘겼다.
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표 14는 상기 환자 사이에서 치료 후 2년 내에 재발이 관찰되었음을 보여준다. 염색체 시그너처의 완전히 비편향적 분석을 통해 이러한 질환-특이적 3개의 마커는 치료 후 재발된 대다수의 환자에서 치료 후에 계속 존재하였고 변하지 않았다.
표 15는 염색체 시그너처가 치료의 결과로서 변화하여 보다 건강한 프로파일을 반영한다는 증거를 제공한다. 염색체 시그너처의 완전히 비편향적 분석을 통해, 동일한 질환 특이적인 3개의 마커가 치료 후에 대다수의 환자에서 변화하였고 존재하지 않았으며, 2년 동안 재발의 징후가 없었다.
표 16은 동일한 3개의 예후적 바이오마커가 건강한 집단에서 존재하지 않을 경향이 강하다는 것을 보여준다. 초기 발견 단계에서 확인된 모든 흑색종 특이적 바이오마커로부터, 이들이 진단 마커와 상이하였다는 점에서, 이러한 3개의 마커만이 치료 후 이들의 변화로 인해 예후적 가치를 가지고 있었다.
이러한 결과는 3개의 확인된 염색체 시그너처가 유효하고 강력한 예후적 바이오마커로서 작용하는 염색체 시그너처에 대한 증거를 예시한다는 것을 확인시켜준다.
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재발의 예후(치료된 흑색종 환자에서 잔존 질환 모니터링 )
수술 후 혈액 시험으로부터 3개의 예후적 염색체 시그너처를 이용한 계층화에 기초하여, 재발 치료 후 2년 동안 관찰된 224명의 흑색종 환자에 대한 교차 검증. 표 17은 관련된 혼동 표를 보여준다.
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약물 반응에 대한 예측적 / 약력학적 바이오마커 : 전이성 흑색종 환자에서 항-PD-1(어레이 데이터)
흑색종
악성 흑색종은 가장 흔치 않지만, 가장 공격적인 형태의 피부암이다. 그것은 어두운 색소인 멜라닌의 합성을 담당하는 세포인 멜라닌 세포에서 발생한다. 대부분의 악성 흑색종은 태양으로부터의 강한 UV 노출에 의해 유발된다. 새로운 흑색종 사례의 대부분은 햇빛과 선베드로부터의 UV 노출에 대한 행동 변화와 관련이 있는 것으로 여겨진다. 전 세계적으로, 2012년에, 232,000명에서 흑색종이 발생하여 55,000명이 사망하였다. 발병률은 호주와 뉴질랜드에서 가장 높다. 전 세계 발병률은 임의의 다른 암 유형보다 남성들 사이에서 더 빠르게 증가하였으며, 지난 10년간 여성들 사이에서 두 번째로 빠른 발병률 증가를 나타내었다. 생존율은 1기 및 2기 흑색종 개체에게는 매우 좋다. 그러나, 암이 원위 림프절 또는 신체의 다른 부위까지 퍼진 흑색종 환자는 7-19%만이 5년 넘게 생존할 것이다. 현재, 흑색종을 정확하게 진단하는 유일한 방법은 의심되는 모반(mole)에 절제 생검을 수행하는 것이다. 치료는 종양의 수술적 제거를 포함한다. 영국에는 흑색종 스크리닝 프로그램이 없지만, 흑색종의 위험 및 증상의 인식을 높이기 위한 교육 프로그램이 만들어졌다. 호주와 같이 흑색종 발병률이 매우 높은 국가에서는 스크리닝 프로그램에 대한 수요가 높다. 이 연구는 흑색종 면역요법에 대한 진단, 예후, 잔존 질환 모니터링 및 동반 진단을 위한 바이오마커에 관한 것이다.
연구 배경
현재 암 치료에서 시험되는 모든 면역조절제의 주요 문제는 낮은 반응률이다. 후기 흑색종 사례에서, 항-PD-1 또는 항-PD-L1 단클론 항체의 경우, 객관적인 반응률은 30-40%에 불과하다. 이러한 요법은 반응자 대 비반응자를 예측하는 바이오마커를 강하게 필요로 한다. PD-1 유전자좌는 장거리 염색체 형태 시그너처의 리세팅을 통해 후성적으로 사이토카인에 의해 조절된다.
OBD 기술
EpiSwitchTM 플랫폼 기술은 면역요법 이전 및 면역요법에 대한 반응으로 PD-1 후성적 상태의 계층화에 이상적으로 적합하다. EpiSwitchTM 어레이는 흑색종 환자에서 항-PD-1 치료에 대한 반응의 제어 및 조절에 관여하는 >332개 유전자좌의 분석을 위해 설계되었다.
방법
EpiSwitchTM 어레이 분석을 사용한 바이오마커 확인:
1. EpiSwitch™ 패턴 인식에 의해 결정된 332개 유전자 위치에 대한 염색체 형태.
2. PD1 스크리닝 어레이 상의 14,000개의 EpiSwitchTM 마커.
샘플
모든 환자는 이전에 화학요법 및 항-CTLA-4 요법으로 치료되었다. 2개의 시점은 치료전(기저선 샘플) 및 치료후(12주 샘플)를 고려하였다
발견 코호트
* 기저선에서 4명의 반응자 대 4명의 비반응자
* 12주에 4명의 반응자 대 4명의 반응자(일치)
초기하 분석
어레이 데이터 분석의 마지막 단계로서, 조절 허브, 즉, 잠재적인 원인이 되는 표적이자 계층화를 위한 바람직한 유전자좌로서 가장 조밀하게 조절된 유전자를 확인하기 위해 초기하 분석을 수행하였다. 데이터는 R 대 R 12W(12W_FC_1)에 대한 후성적 비율에 의해 순위가 매겨지며, BL 이진에서 1은 반응자 기저선이 12주의 반응자와 비교될 때, 반응자 대 비반응자에서 루프가 존재한다는 것을 가리킨다. 후성적 비율은 루프의 존재가 12주 반응자 환자 샘플에서 더 풍부함을 가리킨다. 이것은 이 시그너처의 확장이 있었음을 가리킨다.
요약
잠재적인 예측적 및 약력학적 바이오마커에 대한 항-PD1 요법의 이 후성적 스크리닝은 이전의 생물학적 증거와 일치하는, 많은 새로운 조절 지식을 제공한다. 연구는 검증 분석에서 사용하기 위한 예측적 및 약력학적/반응 EpiSwitch™ 마커의 풍부한 풀을 제공한다. 결과는 항-PD-1 요법을 허용하는 정의된 후성적 프로파일의 존재를 보여준다. 항-PD1 요법을 허용하는 후성적 프로파일은 기저선의 순수한 환자에 존재하며 12주 이상의 치료로 강화된다.
추가 정보
이 연구는 일반의에 의한 좋지 못한 흑색종 진단의 문제를 해결하기 위한 진단 시험의 기초로서 EpiSwitchTM에 관한 것이다. 실제 임상 환경을 대표하는 86명의 환자 샘플의 초기 세트로부터 15개의 선도 EpiSwitchTM 바이오마커를 스크리닝하고 확인하였다. 이후, 바이오마커를 2개의 독립적인 환자 코호트에서 훈련시키고 검증하였다: 호주에서 1개(395명 환자) 및 메이요 병원에서 1개(119명 환자):
● 119개의 독립적으로 그리고 소급적으로 주석이 달린 혈액 샘플
● 59개의 흑색종 샘플
● 60개의 대조군(20명의 NMSC, 20명의 양성 병태, 20명의 건강한 환자))
● 미국의 2개의 병원 수집
95% 신뢰 구간(CI)
민감성 90.0% 79.9%-95.3%
특이성 78.3% 66.4%-86.9%
PPV 88.7% 77.4%-94.7%
NPV 80.6% 69.6%-88.3%
68개의 EpiSwitch™ 마커가 통계학적 처리에 의해 항-PD-1 요법에 대한 기저선에서의 예측적 바이오마커로서 확인되었다(PD1-R 대 NR BL). R은 반응자이고, NR은 비반응자이다. 63개의 EpiSwitch™ 마커가 통계학적 처리에 의해 항-PD-1 요법에 대한 반응 바이오마커로서 확인되었다(PD1 R-BL 대 R-12W). 10개의 마커는 예측적 및 반응 마커의 우수한 후보이다.
피셔-정확한 시험 결과: 상위 8개의 예측적 EpiSwitch™ 어레이 마커가 독립적 환자 코호트에서 EpiSwitch™ PCR 플랫폼을 이용하여 검증되었다(표 37 참고). 기저선에서의 반응자 및 12주에서의 반응자 사이의 PCR 분석에 대한 피셔-정확한 분석으로부터 식별 마커에 대해 표 38을 참고한다. 1은 형태 존재이다. 0은 형태 부존재이다/어레이: R12_W는 형태가 12주의 반응자에 존재하였음을 가리킨다.
STAT5B_17_40403935_40406459_40464294_40468456_FR 프로브를 기저선에서 반응자 대 비반응자에서 측정하였고, 형태는 반응자에 존재한다. 이 비교에서, 마커는 12주의 반응자에 있으며, 이것은 사실인데, 반응자 대 비반응자에서의 형태를 검출하는데 사용된 DNA의 집중이 기저선의 반응자 대 12주의 반응자보다 더 크기 때문이며, 이는 후성적 부하(Epigenetic Load)가 항-PD-1 반응 환자에서 증가하였음을 가리킨다. 마커 STAT5B 및 IL15가 특히 흥미로우며, 항-PD1 요법에 대한 효능 반응을 담당하는 핵심적인 개인화된 의학 및 조절 사건에 관여한다(표 39 내지 40, 43 내지 47 참고).
하기 표 36a 내지 36f, 37a, 37b, 38a, 및 38b는 또한 실시예 3에 관한 것이며 하기와 같다:
표 36a. 상위 프로브 - 항-PD1(흑색종) - 반응자
표 36b. 상위 프로브 - 항-PD1(흑색종) - 반응자 - 프로브 서열
표 36c. 상위 프로브 - 항-PD1(흑색종) - 반응자 - 유전자좌
표 36d. 상위 프로브 - 항-PD1(흑색종) 비반응자
표 36e. 상위 프로브 - 항-PD1(흑색종) 비반응자
표 36f. 상위 프로브 - 항-PD1(흑색종) 비반응자 - 프로브 서열 및 유전자좌
표 37a. 항-PD1: 약력학적 반응 마커
표 37b. 항-PD1: 약력학적 반응 마커
표 38a. 항-PD1: 약력학적 반응 마커 - 기저선 반응자 및 기저선 비반응자 사이에 차이는 없으나 12주 반응자에서 유의한 변화를 나타냄
표 38b. 프로브 위치 - 항-PD1: 약력학적 반응 마커 - 기저선 반응자 및 기저선 비반응자 사이에 차이는 없으나 12주 반응자에서 유의한 변화를 나타냄
징후예
실시예 4 - 근위축성 측삭 경화증( ALS )
운동 뉴런 질환 근위축성 측삭 경화증(ALS 또는 루게릭병)은 중추 신경계에서 일차 운동 뉴런의 점진적인 사멸을 특징으로 하는 치명적인 신경퇴행성 질환이다. 증상은 근육 약화 및 근육 소모, 삼키는데 어려움 및 일상 업무를 수행하는데 어려움을 포함한다. 질환이 진행됨에 따라, 호흡을 담당하는 근육이 점점 나빠져 호흡 곤란을 일으키고 최종적으로 사망을 야기한다. ALS는 100,000명당 2명의 평균 유병률을 갖지만, 영국과 미국에서는 100,000명당 최대 5명으로 더 높다. 미국에서는 상기 병태를 갖는 환자가 50,000명이 넘고 영국에서는 환자가 5,000명이 넘는 것으로 추정된다. ALS 환자의 사망률은 높다: ALS 진단으로부터의 중간 생존(즉, 환자의 50%가 사망할 때의 시간)은 다른 연구에서 달라지지만, 가장 신뢰할만한(비편향된) 집단 연구에서 약 22개월이며 18-30개월 범위를 갖는다. 알려진 치유법이 없으므로, ALS의 치료는 지지 치료에 초점을 맞춘다. 현재 치료가 승인된 유일한 약물은 릴루졸(riluzole)이며, 이는 ALS 환자의 수명을 약간 증가시키지만 증상의 개선은 작다. ALS의 생물학적 기초에 대한 집중적인 연구에도 불구하고, 진단 및 치료 방법 뿐만 아니라 질환 진행의 모니터링은 도전으로 남아있다. 이러한 예후적 시험은 임상적 이질성의 생물학적 중재자(mediator)에 따라 환자를 하위 계층화할 수 있게 함으로써 ALS 환자에게 크게 도움이 될 것이며, 이는 잠재적으로 빠르고 느린 진행자(progressor)를 확인함으로서 보다 정확한 진단 및 관리 계획을 잠재적으로 가능하게 할 수 있다. OBD는 ALS에 대한 진단적, 예후적 및 예측적　EpiSwitch TM 　바이오마커를 개발하고 검증하기 위해, ALS 대 건강한 대조군, 및 빠른 진행성 ALS 대 느린 진행성 ALS를 계층화하는 EpiSwitchTM 마커를 개발해 왔다.
출처: 북동 근위축성 측삭 경화증 컨소시엄(NEALS) - USA.
ALS 대 건강한 대조군을 계층화하는 ALS 프로브 - EpiSwitchTM 마커에 대해 표 1, 2, 18, 및 42 및 이후를 참조한다. 표 27은 이 징후에 대한 유전자 데이터를 보여준다.
상위 ALS 어레이 마커를 검증하고 상호작용을 연구할 수 있는 프라이머를 확인하기 위해 추가 작업을 수행하였다. 어레이 마커의 통계학적 분석은 PCR 기반 분석 개발을 위한 최종 후보자 선택을 알아내었다. 최선의 계층화 ALS 어레이 프로브의 목록으로부터, 99개의 마커를 PCR 단계로 옮겼다.
마이크로어레이로부터 확인된 마커로부터 Integrated DNA Technologies(IDT) 소프트웨어(및 필요한 경우 PRimer3web version 4.0.0 소프트웨어)를 사용하여 프라이머를 설계하였다. 프라이머 시험을 각 프라이머 세트에 대해 수행하였고; 적절한 프라이머가 잠재적인 상호작용을 연구할 수 있도록 하기 위해, 샘플의 모은 하위집합에서 각 세트를 시험하였다. PCR로부터의 증폭된 생성물의 존재는 특정 염색체 상호작용이 일어나고 있음을 나타내는 라이게이션된 생성물의 존재를 나타내도록 취해졌다. 프라이머 시험이 성공적이면, 프라이머 세트를 스크리닝에 사용하였다.
시그너처 세트를 단변량(LIMMA 패키지, R 언어) 및 다변량(GLMNET 패키지, R 언어) 통계의 조합을 사용하여 단리하고 WEKA(기계 학습 알고리즘 패키지) 내의 로지스틱 모델링을 사용하여 검증하였다. 가장 우수한 10개의 계층화 PCR 마커를 복동 근위축성 측삭 경화증 컨소시엄(NEALS)으로부터의 데이터를 사용하여 58명의 개체(29 x ALS; 29 x 건강한 대조군 - HC)에 대한 검증을 위해 선택하였다. 이들은 정확한 피셔의 p 값에 기초하여 선택하였다. 3개의 모든 시험으로부터 일관성 있게 우수한 마커는 CD36에서의 EpiSwitch 마커였다. 표 41에 나타난 처음 9개 PCR 마커는 90% 순위 차별화 지수로 ALS 및 HC 사이를 계층화하였다.
ALS 마커 세트를 옥스포드 대학에 의해 제공된 샘플의 작은 독립적인 코호트에 대해 분석하였다. 샘플의 작은 하위집합에서도 샘플의 계층화가 바이오마커에 기초하여 나타났다. 4개의 마커는 p 값 < 0.3으로 32개(16개 ALS, 16개 건강한 대조군) 샘플의 하위집합을 계층화한다. 이러한 핵심 마커는 각각 유전자 EGFR, DNM3, CD36 및 GLYCAM1에서 ALS.21.23_2, DNM3.5.7_8, ALS.61.63_4 및 NEALS.101.103_32이다. 피셔-정확한 시험, GLMNET 및 베이시안 로지스틱 모델링은 4개의 핵심 마커에 대한 귀중한 부가가치로서 CLIC4를 표시하였다.
표 41에 제시된 PCR 마커에 대한 프라이머의 서열이 표 42에 제공되어 있다.
실시예 5 - 당뇨병(DM) II형( T2DM )
2형 당뇨병(T2DM으로도 알려짐)은 가장 흔한 형태의 당뇨병이다. 당뇨병은 췌장이 혈당 수준을 조절하는 호르몬 인슐린을 충분히 생산하기 않거나 신체가 인슐린 민감성 감소로 인해 생산하는 호르몬을 효과적으로 사용할 수 없을 때 발생할 수 있다. 최근까지, T2DM은 성인에서만 진단되었지만, 현재는 어린이 및 젊은이에게 발생하고 있다. 세계 보건 기구(WHO)에 따르면, 당뇨병은 전 세계적으로 3억 4600만명 환자로 유행병 수준에 도달하였고 그 발병률은 2030년에 두 배가 될 것으로 예측된다. 2004년에만, 약 340만명이 당뇨병과 그 합병증의 결과로 사망하였고 사망 대부분은 저소득 및 중소득 국가에서 발생하였다. T2DM의 발병률은 인구 고령화, 운동 부족 및 흡연과 같은 생활 스타일의 변화뿐만 아니라 식이 및 비만으로 인해 증가하고 있다. T2DM은 인슐린 의존성이 아니며 식이, 운동과 같은 생활 스타일의 변화에 의해 조절될 수 있고 추가로 약물로 보조될 수 있다. 인슐린으로 치료된 개체는 심각한 저혈당증(낮은 혈당 수준)이 발생할 위험이 더 높으므로 이들의 약물 및 혈당 수준은 정기적인 모니터링을 필요로 한다. 일반적으로, 확립된 T2DM을 갖는 고령의 개체는 심혈관 질환(CVD) 및 다른 합병증의 위험이 높으므로, 일반적으로 최근에 인식된 질환을 갖는 젊은 성인보다 더 많은 치료를 필요로 한다. 영국에서는 7백만명이 전당뇨병 병태에 의해 영향을 받고 있는 것으로 추정되며, 이는 T2DM으로 진행할 위험성을 증가시킨다. 이러한 개체는 증가된 혈당 수준을 특징으로 하지만, 일반적으로 증상이 없으므로 수년 동안 간과될 수 있어 건강에 점진적으로 영향을 미친다. 발명자들은 전당뇨병 상태 및 T2DM에 대한 예후적 계층화를 개발한다. 전당뇨병 상태(전-T2DM) 대 건강한 대조군을 계층화하기 위한 EpiSwitchTM 마커뿐만 아니라 T2DM 대 건강한 대조군을 계층화하기 위한 EpiSwitchTM 마커, 및 공격성 T2DM 대 느린 T2DM을 계층화하기 위한 예후적 마커의 발견이 본원에 제공된다.
출처: 노르포크 및 노르위치 대학 병원(NNUH), NHS 재단 신탁 - 노르위치 UK
전-2형 당뇨병 대 건강한 대조군을 계층화하기 위한 전-2형 당뇨병 프로브 - EpiSwitchTM 마커에 대해 이하 표 19a, 19b, 19c 및 19d를 참고한다. 표 28은 유전자 데이터를 나타낸다.
또한 2형 당뇨병 대 건강한 대조군을 계층화하기 위한 2형 당뇨병 프로브 - EpiSwitch™ 마커에 대해 이하 표 20a, 20b, 20c, 20d를 참고한다. 표 29는 유전자 데이터를 나타낸다.
실시예 6 - 당뇨병 I형( T1DM )
당뇨병(DM) 1형(T1DM으로도 알려짐; 이전에 인슐린 의존성 당뇨병 또는 소아 당뇨병)은 췌장에서 인슐린을 생산하는 베타 세포의 자가면역 파괴로부터 비롯되는 당뇨병의 한 형태이다. 고전적인 증상은 다뇨증(잦은 배뇨), 다갈증(갈증 증가), 다식증(배고픔 증가) 및 체중 감소이다. T1DM은 모든 당뇨병 사례의 5%를 차지하지만, 어린이 사이에서 가장 흔한 내분비 및 대사 병태 중 하나이다. 그 원인은 알려져 있지 않지만, 유전적 요인 및 환경적 유발자 모두가 관련이 있다고 여겨진다. 전 세계적으로, 매년 약 80,000명의 어린이가 질환에 걸리는 것으로 추정되지만, T1DM 환자의 수는 알려져 있지 않다. 새로운 사례의 발생은 국가와 지역에 따라 다르다. 미국 및 북유럽은 연간 100,000명당 8-17건의 신규 사례에 속한다. 당뇨병의 치료는 혈당을 낮추고 혈관을 손상시키는 다른 알려진 위험 인자의 수준을 낮추는 것을 포함한다. 인슐린의 투여는 생존에 필수적이다. 인슐린 요법은 무기한 계속되어야 하며, 일반적으로 정상적인 일상 활동에 방해하지 않는다. 치료되지 않은 당뇨병은 심장 질환, 뇌졸중, 신부전, 발 궤양 및 눈의 손상과 같은 많은 심각한 장기 합병증을 유발할 수 있다. 급성 합병증은 당뇨병성 케톤산증 및 혼수를 포함한다. OBD의 당뇨병 프로그램은 T1DM의 진단적 및 예후적 계층화를 위한 EpiSwitch TM 　바이오마커의 개발에 초점을 맞추고 있다.
T1DM 대 건강한 대조군을 계층화하기 위한 EpiSwitchTM 마커가 본원에 제공된다.
출처: 글래스고에 기반을 둔 프로큐어먼트 컴퍼니 티슈 솔루션스(Procurement Company Tissue Solutions)에 의해 수집된 백인 샘플(러시아에서 수집된 샘플); NEALS 컨소시엄 통제(USA).
T1DM 대 건강한 대조군을 계층화하기 위한 1형 당뇨병(T1DM) 프로브 - EpiSwitchTM 마커에 대해 이하 표 21a, 21b, 21c 및 21d를 참고한다. 표 30은 유전자 데이터를 나타낸다.
실시예 7 - 궤양성 대장염( UC )
위장관의 만성 염증성 질환인 궤양성 대장염(UC)은 장의 염증성 질환의 가장 흔한 유형이며 매년 100,000명당 10명의 발병률 및 100,000명당 243명의 유병률을 갖는다. UC는 모든 연령의 사람들에게 발생할 수 있지만, 15세 내지 30세 및 60세 이상의 연령의 사람들에게서 발생할 가능성이 더 높다. 궤양성 대장염의 정확한 원인은 알려져 있지 않다. 그러나, 과민성 장내 면역계, 가족력 및 환경적인 요인(예컨대, 감정적인 스트레스)이 UC를 유발하는 역할을 할 수 있다고 여겨진다.
그것은 다른 인종 및 민족 하위그룹보다 백인 및 아슈케나지 유대인(Ashkenazi Jewish) 출신의 사람에서 더 유행한다. 이 병태의 가장 흔한 징후 및 증상은 피 또는 고름이 있는 설사 및 복부 불쾌감이다. 그것은 또한 관절, 척추, 피부, 눈, 및 간과 그 담관에서 염증을 유발할 수 있다. UC 진단은 가족력 확인, 신체 검사, 실험실 검사 및 대장 내시경을 통해 수행된다. 이 평생의 질환은 특히 잘 관리되지 않으면 유의한 병적 상태 및 사회적 및 심리적 후유증의 가능성과 관련된다. 궤양성 대장염 환자의 추정상 30-60%가 매년 적어도 1회 재발할 것이다. 이들 중 약 80%는 경증 내지 보통이며 약 20%는 중증이다. UC 환자의 약 25%는 평생 급성 중증 대장염의 한 번 이상의 증상을 가질 것이다. 이들 중, 20%는 첫 입원시 그리고 40%는 그 다음 입원시 결장의 전부 또는 일부를 수술적으로 제거(결장절제술)할 필요가 있을 것이다. 사망률은 지난 30년간 꾸준히 개선되었으나, 급성 중증 대장염은 여전히 2%의 사망률을 갖는다. 사망률은 의학요법 및 결장절제술을 포함하는 개입 시기에 직접적으로 영향을 받는다.
궤양성 대장염은 대장암의 발병과 연관된다는 증거가 많으며, 오래되고 광범위한 질환에서 위험성이 가장 크다. 재발의 치료는 임상적 중증도, 질환의 정도 및 환자의 선호도에 따라 달라질 수 있고, 아미노살리실레이트, 코르티코스테로이드 또는 면역조절제의 사용을 포함할 수 있다. 결과적으로 제제 및 투여 요법의 폭넓은 선택은 영국에서 광범위한 관리 이질성을 야기하였고, 의료 전문가가 일관된 고품질 의료를 제공하도록 포괄적인 지침의 중요성을 강조한다.
UC를 위한 질환 특이적 시그너처의 개발을 위해 UC 대 건강한 대조군을 계층화하기 위한 EpiSwitchTM 마커가 본원에 제공된다.
출처: 글래스고에 기반을 둔 프로규어먼트 컴퍼니 티슈 솔루션스에 의해 수집된 백인 샘플(러시아에서 수집된 샘플); NEALS 컨소시엄 통제(USA).
UC 대 건강한 대조군을 계층화하기 위한 궤양성 대장염(UC) 프로브 - EpiSwitchTM 마커에 대해 이하 표 22a, 22b, 22c 및 22d를 참고한다. 표 31은 유전자 데이터를 나타낸다.
실시예 8 - 전신성 홍반성 낭창( SLE )
원판상 낭창(discoid lupus) 또는 파종 홍반성 낭창으로도 알려진 전신성 홍반성 낭창(SLE)은 피부, 관절, 신장, 뇌, 및 다른 장기에 영향을 미치는 자가면역 질환이다. "낭창"은 많은 상이한 질환을 포함하지만, SLE는 낭창의 가장 흔한 유형이다. SLE는 발진, 광민감성, 구강 궤양, 관절염, 폐 및 심장 주위의 내벽의 염증, 신장 문제, 발작 및 정신병, 및 혈액 세포 이상을 포함하는 다수의 임상 증상을 갖는 질환이다. 증상은 다양할 수 있고 시간이 지남에 따라 변할 수 있으며, 질환 특이적이지 않으므로 진단하기 어렵다. 그것은 유아기부터 노년까지 발생하며, 15세 내지 40세에 최대 발병률을 갖는다. 인구에서 SLE의 보고된 유병률은 100,000명당 20 내지 150건이다. 여성에서, 유병률은 100,000명당 164명(백인) 내지 406명(아프리카계 미국인)으로 달라진다. 가벼운 질환의 검출 개선으로 인해, 발병률은 20세기의 마지막 40년에 거의 3배가 되었다. 추정된 발병률은 북미, 남미, 유럽 및 아시아에서 100,000명당 1 내지 25명이다. SLE의 정확한 원인은 알려져 있지 않지만, 몇 가지 요인이 질환과 관련되었다. 낭창을 가진 사람은 다른 자가면역 병태가 있는 가족 구성원이 있다. 자외선, 특정 약물, 바이러스, 물리적 또는 감정적 스트레스, 및 외상과 같은 환경적인 유발자가 있을 수 있다. SLE를 위한 치유법은 없으며 치료는 증상을 완화시키는 것이다. 이들은 나타난 증상에 따라 달라질 것이며, 항염증성 약물, 스테로이드, 코르티코스테로이드 및 항말라리아 약물을 포함할 수 있다. 생존이 개선되어 왔으며, 이는 더 많은 또는 더 가벼운 사례가 인식되고 있음을 시사한다. OBD는 SLE에 대한 예후적 시그너처를 개발해왔다.
SLE 대 건강한 대조군을 계층화하기 위한 SLE 프로브 - EpiSwitchTM 마커에 대해 표 23a, 23b, 23c 및 23d를 참고한다. 표 32는 유전자 데이터를 나타낸다.
출처: 글래스고에 기반을 둔 프로큐어먼트 컴퍼니 티슈 솔루션스에 의해 수집된 백인 샘플(러시아에서 수집된 샘플); NEALS 컨소시엄 통제(USA).
실시예 9 - 다발성 경화증(MS)
다발성 경화증(MS)은 뇌와 척수 모두에 영향을 미치는, 중추 신경계(CNS)의 후천성 만성 면역 매개 염증성 병태이다. MS의 원인은 알려져 있지 않다. 유전적으로 취약한 사람들에게서 환경적인 유발자에 대한 비정상적인 면역 반응이 면역 매개 급성 염증, 및 이후 만성 염증을 초래하는 것으로 여겨진다. 염증의 초기 단계 이후 신경계에서 영향을 받은 세포의 점진적인 퇴화 단계가 뒤따른다. MS는 유럽, 미국, 캐나다, 뉴질랜드, 및 호주의 구역에서의 사람들 사이에서 더 흔하며, 아시아와 열대 지방에서는 덜 흔하다. 그것은 영국에서 약 100,000명에게 영향을 미친다. 미국에서, MS 환자 수는 약 400,000명으로 추정되며, 매년 약 10,000건의 새로운 사례가 진단된다. MS 환자는 전형적으로 20세 내지 40세에 증상이 발생하며, 시각 및 감각 장애, 사지 약화, 보행 문제, 및 방광 및 장 증상을 경험한다. 이들은 초기에는 부분적인 회복을 보일 수 있지만, 시간이 지남에 따라 점진적인 장애가 생긴다. 치유법은 없지만, MS를 치료 및 관리하기 위한 많은 옵션이 있다. 이들은 약물 치료, 운동 및 물리요법, 식이 및 대체 요법을 포함한다. MS는 상당한 개인적, 사회적 및 경제적 결과를 갖는 잠재적으로 매우 무능력화시키는 장애이다. MS 환자는 진단 후에 수년 동안 사는데, 이들의 일하는 능력에 심각한 영향뿐만 아니라 이들의 삶의 질 및 이들의 가족의 삶의 질에 부정적이고 종종 매우 약화시키는 효과를 갖는다. OBD의 MS 프로그램은 일차 진행성 및 재발 완화형 MS 사이의 예후적 계층화를 관찰하는 것을 포함한다.
질환의 가장 흔한(약 90%) 패턴은 재발 완화형 MS(MSRR)이다. 이러한 유형의 MS를 갖는 대부분의 사람들은 20대 초반에 증상을 처음 경험한다. 이후, 주기적인 공격(재발) 다음으로 부분적 또는 완전한 회복(완화)이 뒤따른다. 영향을 받은 신경의 패턴, 공격의 중증도, 회복의 정도, 및 재발 사이의 시간 모두는 사람마다 매우 다르다. 결국, 재발 완화형 MS를 가진 사람들의 약 3분의 2가 MS의 2차 진행 단계에 들어간다. 이것은 재발과 관련이 없는 장애의 점진적인 축적이 있을 때 발생하며, 이것은 덜 빈번하게 되거나 완전히 중단된다.
IFN-B 치료에 대한 반응자 대 비반응자인 MS 환자를 계층화하기 위한 EpiSwitchTM 모니터링 마커; MSRR 대 건강한 대조군을 계층화하기 위한 EpiSwitchTM 마커 및 MSRR(재발 완화형의 MS) 대 MSPP(일차 진행성 유형의 MS)를 계층화하기 위한 EpiSwitchTM 마커가 본원에 제공된다.
출처: 글래스고에 기반을 둔 프로큐어먼트 컴퍼니 티슈 솔루션스에 의해 수집된 백인 샘플(MS-RR: 러시아; MS IFN -B R 대 NR : USA에서 수집된 샘플); NEALS 컨소시엄 통제(USA).
MSRR 대 건강한 대조군을 계층화하기 위한 재발 완화형 다발성 경화증(MSRR) 프로브 - EpiSwitchTM 마커에 대해 이하 표 24a, b, c 및 d를 참고한다. 표 33은 유전자 데이터를 나타낸다.
또한 (B) IFN-B(IFN-베타) 치료에 대한 반응자 대 (A) 비반응자인 MS 환자를 계층화하기 위한 다발성 경화증(MS) 프로브 - EpiSwitchTM 모니터링 마커에 대해 이하 표 25a, 25b, 25c 및 25d를 참고한다. 표 34는 유전자 데이터를 나타낸다.
실시예 10 - 신경섬유종증 ( NF )
NF1 돌연변이를 갖는 환자에서 악성 상태로의 전환은 예측하기 어려운데 그것이 환자의 후성적 정황에 의해 결정되기 때문이다. NF2 돌연변이체에서, 질환의 예측은 매우 신뢰할만하며 유전학 자체의 의해 강하게 규정된다. 농축된 데이터에서 329개의 상위 프로브를 나타내는 악성 말초 신경초 종양(MPNST) 대 양성 얼기형(plexiform)을 계층화하기 위한 EpiSwitchTM 마커가 제공된다.
출처: 벨기에 - 루뱅 대학교
양성 얼기형 대 악성 말초 신경초 종양(MPNST)을 계층화하기 위한 신경섬유종증(NF) 프로브 - EpiSwitchTM 마커에 대해 이하 표 26a 및 26b를 참고한다. 표 35는 유전자 데이터를 나타낸다.
실시예 11 - 상이한 암에서 항-PD1 반응성과 관련된 염색체 상호작용
표 47은 특정 암을 갖는 개체에서 항-PD1에 대한 반응자(달리 NR(비반응자)로 언급되지 않는 한)에 존재하는 염색체 상호작용의 패턴을 보여준다. 표에 사용된 용어가 하기에 설명되어 있다.
DLBCL_ABC: 미만성 거대 B-세포 림프종 하위유형 활성화된 B-세포
DLBCL_GBC: 미만성 거대 B-세포 림프종 하위유형 배중심 B-세포
HCC: 간세포 암종
HCC_HEPB: B형 간염 바이러스를 갖는 간세포 암종
HCC_HEPC: C형 간염 바이러스를 갖는 간세포 암종
HEPB+R: 차도중인 B형 간염
Pca_Class3: 전립선암 3기
Pca_Class2: 전립선암 2기
Pca_Class1: 전립선암 1기
BrCa_Stg4: 유방암 4기
BrCa_Stg3B: 유방암 3B기
BrCa_Stg2A: 유방암 2A기
BrCa_Stg2B: 유방암 2B기
BrCa_Stg1A: 유방암 1A기
BrCa_Stg1: 유방암 1기
PD_1_R_흑색종: 흑색종 반응자
PD_1_NR_흑색종: 흑색종 비반응자
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SEQUENCE LISTING <110> Oxford BioDynamics Limited <120> Detection of Chromosome Interactions <130> P103136WO01 <140> PCT/GB2016/051900 <141> 2016-06-24 <160> 744 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 60 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 1 tgttttttgg ctgcataaat gtcttctttc gaaataatca tcaaaatatt tttcattgac 60 <210> 2 <211> 60 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 2 cacccccatc tccctttgct gactctcttc gatgaatcca tttttttgga aatagatgat 60 <210> 3 <211> 60 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 3 cacccccatc tccctttgct gactctcttc gaactgtggc aattttaact tttcaaattg 60 <210> 4 <211> 60 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 4 cacccccatc tccctttgct gactctcttc gaggcatgat ttgagtcttg acagaagttc 60 <210> 5 <211> 60 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 5 tgccagtatt ttattgagga tttttgcatc gagattgggt tgcatcatgt tggccaggct 60 <210> 6 <211> 60 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 6 tgttttttgg ctgcataaat gtcttctttc gaactcatgg gcacaagcaa tcctcccacc 60 <210> 7 <211> 60 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 7 tgccagtatt 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ctgtgtgtgg cagactgttc gaaatcggaa gcctctctga aggtccaagg 60 <210> 24 <211> 60 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 24 tgccagtatt ttattgagga tttttgcatc gaattcctgg gtttatatcc caatcattgt 60 <210> 25 <211> 60 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 25 cacccccatc tccctttgct gactctcttc gatattggtg tatattcaaa gggtacttga 60 <210> 26 <211> 60 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 26 tgatcactgt ttcctatgag gatacagctc gaggggcagg gggcggtcct gggccaggcg 60 <210> 27 <211> 60 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 27 aacttatgat tctaatcttg aatgtctgtc gatctatgag gaaatgcccc cagcctccca 60 <210> 28 <211> 60 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 28 cataatgcat gtgcatgaaa actaatcttc gatctatgag gaaatgcccc cagcctccca 60 <210> 29 <211> 60 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 29 atcagtaagc tggtcagcta cccatgaatc gatctatgag gaaatgcccc cagcctccca 60 <210> 30 <211> 60 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 30 gtgtcccaat ttctagtgca ctgtgaactc gacctcgcgg gaggggtgcc aggccgcatc 60 <210> 31 <211> 60 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 31 ccggggcttc 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ggaccccctt tttgatgttc gatggtgcgg gaggtggccg gcagggttgg 60 <210> 72 <211> 60 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 72 tatattgcta tctactagca aaggataatc gaagaggttc agggcggtgc ccgcggcgct 60 <210> 73 <211> 60 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 73 atcagtaagc tggtcagcta cccatgaatc gatctatgag gaaatgcccc cagcctccca 60 <210> 74 <211> 60 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 74 tgaaaacagt tcatcctgag tttcagtctc gaagattagg taaaggtggg gacgcggaga 60 <210> 75 <211> 60 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 75 gtgcagagcg agagcggggc agaggcggtc gaaactggga gaattcatct gaaatgatta 60 <210> 76 <211> 60 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 76 gaggcaggca gatcatgagg tcaggagttc gagccctgga ccccaggcca gctaatgagg 60 <210> 77 <211> 60 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 77 gctcactgca acctccacct cccaggttcg cgaacctcct gataacttca gcattaacag 60 <210> 78 <211> 60 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 78 agggtcttgc tatgttgccc aggctggcct cgagatcagc ctgggcaaca cggtgaaaac 60 <210> 79 <211> 60 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 79 tgtaatataa gcatagctca ctgcagcctc gaagcatttg tacgacattc tcatcttctt 60 <210> 80 <211> 60 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 80 acagaggagc gaggcccgat ccttactttc gaactcctga cctcgtgatc tgcccacctc 60 <210> 81 <211> 60 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 81 gggtttcacc atgttagcca ggatggtctc gatctcctga cctcatgatc cgcctgcctc 60 <210> 82 <211> 60 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 82 gcatttcacc atgttggtga ggctggtctc gaagagttca cacgtgtcca aatttggtgg 60 <210> 83 <211> 60 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 83 ctgggatcac aggcatgtgc caccatgctc gacaagaata gtctccttgt ttctgaacat 60 <210> 84 <211> 60 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 84 gtatttctgg ttctagatcc ttgaggaatc gagcagaagg agtctctccc tgaggccacc 60 <210> 85 <211> 60 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 85 cgaggcgggc ggatcacgag gtcaggagat cgacccccac gttctcacca cctgtttctt 60 <210> 86 <211> 60 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 86 gtatttctgg ttctagatcc ttgaggaatc gacctcctgg gctcaaccta tcctcccacc 60 <210> 87 <211> 60 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 87 gggtttcact gtgttagcca ggatggtctc gacctccctg gctcaagtga tcttcccacc 60 <210> 88 <211> 60 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 88 tgccctagag atctgtggaa ctttgaactc gatatatgaa aatagttttt taattataaa 60 <210> 89 <211> 60 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 89 ggtgggggaa tcacttgagg tcagaagttc gagaccatcc tgggcaacat ggtaaaaccc 60 <210> 90 <211> 60 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 90 aatggcacga tcacggctca ctgcagcctc gaatgttact gacagtggac acagtaagaa 60 <210> 91 <211> 60 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 91 gagttttgcc atgttgccca ggctggtctc gagaacagcc tggccaacat ggtgaaaccc 60 <210> 92 <211> 60 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 92 aggtctcact atgttgcccg ggctggtctc gacgccgagg agctctgcag tgggggcgta 60 <210> 93 <211> 60 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 93 gggtttcacc atgttggcga ggctggtctc gaactcctga cctcaggtga tccgcctgcc 60 <210> 94 <211> 60 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 94 ggtgggtgga tcacctgagg tcaggagttc gacctaaggg tggtcataat tctgctgctg 60 <210> 95 <211> 60 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 95 gggtctcaca 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taataacgtt gtcaagatta 60 <210> 292 <211> 60 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 292 tctttagcac ccgggcccca caattgtctc gatctgctgc ggtgggtcca tagactggca 60 <210> 293 <211> 60 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 293 ggccagagcg ccggcaagag ctcggtgctc gaaaagaaaa aaaaaatact agggggtagg 60 <210> 294 <211> 60 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 294 acccaggata aaacgcagtg ttgaccgatc gacccttctg ctttctctcc aggggatggc 60 <210> 295 <211> 60 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 295 ttcattcatt cattcattca ttcatacatc gaaaggccag taggtgtgat ctgaggaagg 60 <210> 296 <211> 60 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 296 caagataaag gaagagtgaa atcctgtctc gaccgggcga ctcccccggg gcgggggtgg 60 <210> 297 <211> 60 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 297 gcggcactcg gcctctccgc agcagttctc gaggaaagac ttactaggtc ctgcagtatt 60 <210> 298 <211> 60 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 298 tccccagcct gctctctggt agacctcttc gagggcccac atgcccgggg gagaggggag 60 <210> 299 <211> 60 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 299 tctttagcac ccgggcccca 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tccatcccca acttcaatga cttctacatc gacatagtac tgaaagtctt tgctagagta 60 <210> 308 <211> 60 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 308 acccaggata aaacgcagtg ttgaccgatc gattcttggg ccttccacct tcacattcta 60 <210> 309 <211> 60 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 309 agacccggac gtctccgcga ggcggccatc gaggaaggct cctctgagaa agagtctgct 60 <210> 310 <211> 60 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 310 ctccagaaag gacctttaaa cactcaggtc gatggccgcc tcgcggagac gtccgggtct 60 <210> 311 <211> 60 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 311 ttcctgaaaa aaaatggcta cttattagtc gatggccgcc tcgcggagac gtccgggtct 60 <210> 312 <211> 60 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 312 agacccggac gtctccgcga ggcggccatc gagtgtcaac atgatggcac ctaaagctgt 60 <210> 313 <211> 60 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 313 acccaggata aaacgcagtg ttgaccgatc gagggcgtgg acttctacac gtccatcact 60 <210> 314 <211> 60 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 314 cactttttat agaagagaaa gtgaagattc gatggccgcc tcgcggagac gtccgggtct 60 <210> 315 <211> 60 <212> DNA <213> Homo 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aagctcaata aatcccaagc acacacactc gaataaatag tatctttgcc caataatatg 60 <210> 512 <211> 60 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 512 aagctcaata aatcccaagc acacacactc gaatgtaaaa tgagagacct gatgcacagt 60 <210> 513 <211> 60 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 513 aagctcaata aatcccaagc acacacactc gaggcaaagt gggcattttc cagcaccctg 60 <210> 514 <211> 60 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 514 aagctcaata aatcccaagc acacacactc gaaatggctc cagattcctg gccgagtagg 60 <210> 515 <211> 60 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 515 acctgaatac attgagatta ttttgcaatc gagatctgag tgtgagggtg gggggctgag 60 <210> 516 <211> 60 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 516 aaggttgtga aaattttatc ttacgtgatc gatgacacaa agtgtgttta aatacagggt 60 <210> 517 <211> 60 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 517 gtatgtcagg ggtcagaggg ggcagaggtc gaggagacta cttaggaata atacaacaaa 60 <210> 518 <211> 60 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 518 gtatgtcagg ggtcagaggg ggcagaggtc gaggacctag ctacccggca aacatcaaat 60 <210> 519 <211> 60 <212> DNA <213> Homo 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cgcccgcctc 60 <210> 543 <211> 60 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 543 gaggcgggcg gatcacgagg tcaggagatc gatctcccga cctcgtgatc cgcccgcctc 60 <210> 544 <211> 60 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 544 tgacaccata cattttattt ctcccttctc gagattttgt tattaagctt ccgtctcgtt 60 <210> 545 <211> 60 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 545 agtcctttat ttctgttaca atcttaaatc gagattttgt tattaagctt ccgtctcgtt 60 <210> 546 <211> 60 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 546 taccttttta gagctatgtc atgtatgttc gaacagagtt taccacagct ttgcagcgcg 60 <210> 547 <211> 60 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 547 tgtattctgt atcacttaga ctcttctttc gaagaaggaa tcttaaacaa gagaagcaag 60 <210> 548 <211> 60 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 548 agttgttttt ccttgaaaag ggtttacctc gacggttaca atttcagtat gcacgggact 60 <210> 549 <211> 60 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 549 ttaacctagc agatctggtt cttctggttc gaggtattta tatcaccttg agtattattt 60 <210> 550 <211> 60 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 550 cctaataaag aaaaaaaaat gagtcccttc gaagcacaaa gttacaggac atggcatcca 60 <210> 551 <211> 60 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 551 tcctttggcc tggtaatctt ttcaatattc gaagcacaaa gttacaggac atggcatcca 60 <210> 552 <211> 60 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 552 ctgctccatg tctgtattcc tactttattc gaaagcatct ttgtgtcatt gtccatgctc 60 <210> 553 <211> 60 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 553 cctaaactaa gcttgggctt aagatccatc gaaaggatac ttttatagga accaggctag 60 <210> 554 <211> 60 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 554 atatatatat atcacaatgc ctaagggatc gaatagcttt ttaagaacag tgtataaaat 60 <210> 555 <211> 60 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 555 ctctctgatt tgccacataa agtaggcatc gattccaaat aaattagttg gtgatgtgga 60 <210> 556 <211> 60 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 556 acttcatgca caagttaggt atttactctc gagattataa acattttcat ttggattttg 60 <210> 557 <211> 60 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 557 agaaaatata gtattgattg ctttcaagtc gatgcgcgcc cgccggggcc cggtcggagc 60 <210> 558 <211> 60 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 558 tactgtagta 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acctcttaat 60 <210> 645 <211> 60 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 645 gttgggttga agatgaaatc ataggaagtc gagctgtaac ctctgcttgg tattctccct 60 <210> 646 <211> 60 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 646 ggtgggcaga tcacttaagg ccaggaattc gaaacaccag ctctcttaaa tcctgtgcct 60 <210> 647 <211> 60 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 647 ggtgggcaga tcacttaagg ccaggaattc gaggaaaacc tcggggcaaa atagggaaag 60 <210> 648 <211> 60 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 648 tgagaatgga atagatcaaa gggagggttc gagacaaggt ctcactttat cacccaacct 60 <210> 649 <211> 60 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 649 ggtgggcaga tcacttaagg ccaggaattc gactgtgtgc ccatgaagaa agaagatggg 60 <210> 650 <211> 60 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 650 agtgatagaa gagggacaag gtggcagttc gattttaaaa cacgctcttc aataaaaaga 60 <210> 651 <211> 60 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 651 agcaggggga tcacataagg ccaggagttc gataaaataa attagagaag atataaataa 60 <210> 652 <211> 60 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 652 ggtgggcaga tcacttaagg ccaggaattc 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Homo sapiens <400> 676 acacttgatt tttgctttcc aagctgactc gagacatcta agaaggtcca gccagatgtt 60 <210> 677 <211> 60 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 677 gcgccctatt tccaccttgt gccttctgtc gacacaccaa gatgtcacgg aggagtctgt 60 <210> 678 <211> 60 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 678 ccagctgaag tttcgcaggt cccctgcttc gagtaggcca atcccatttt tggcgaaaac 60 <210> 679 <211> 60 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 679 actttggctc aagagtgaag atattcagtc gactcctgct tccctcccct catctttaaa 60 <210> 680 <211> 60 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 680 ttccttaggc aagtcatcca attccatgtc gacacaaggg tttgtaacaa aaaacaaaaa 60 <210> 681 <211> 60 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 681 tcttaggagg taagaatgaa tttcttggtc gaactcctga ccaggaggct gggagggggt 60 <210> 682 <211> 60 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 682 catcatttta ataggtgcaa gagttccgtc gaacgcccat acctgtggga atcaagcaat 60 <210> 683 <211> 60 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 683 aaaaacaaaa aagccaattc tgtacccctc gaaccagccc tggctctgtc cccagacctt 60 <210> 684 <211> 60 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 684 gcgccctatt tccaccttgt gccttctgtc gagacatcta agaaggtcca gccagatgtt 60 <210> 685 <211> 60 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 685 ttgattattt caggttgaca gctgtaaatc gactcctgct tccctcccct catctttaaa 60 <210> 686 <211> 21 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 686 ggaacctcgc tgtccataaa c 21 <210> 687 <211> 24 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 687 tctgtatgca agtcctgatg tttc 24 <210> 688 <211> 22 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 688 ggtaggagtg tgccttatta ac 22 <210> 689 <211> 21 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 689 gaggctgtta ggcattctaa g 21 <210> 690 <211> 22 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 690 gaaaccaacc ctatctgtaa ac 22 <210> 691 <211> 18 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 691 aaagaaagga ggctgtgg 18 <210> 692 <211> 19 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 692 gctctggact gcctttaac 19 <210> 693 <211> 22 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 693 aagtcagact cctcttctct ac 22 <210> 694 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 694 gtgaaactaa gccctcaacc 20 <210> 695 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 695 taccctcctt ccattcagac 20 <210> 696 <211> 21 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 696 gctacagagg tgaaggagat c 21 <210> 697 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 697 aagtctggag ctgggcaaag 20 <210> 698 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 698 gaaacagcat tcttgccaac 20 <210> 699 <211> 21 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 699 gcttcatgag agagtgagaa c 21 <210> 700 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 700 aaagagaaca gggtgtaacg 20 <210> 701 <211> 18 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 701 gagccgggaa taaacgac 18 <210> 702 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 702 aggtctaggg ttcagggctc 20 <210> 703 <211> 21 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 703 gggttcattt gactggactg g 21 <210> 704 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 704 gccagtgtga caagattgcc 20 <210> 705 <211> 21 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 705 gacatcagtg gagggaggaa c 21 <210> 706 <211> 19 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 706 atgcctgcaa cttaaggac 19 <210> 707 <211> 23 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 707 gaggacaaag agatagctta ctg 23 <210> 708 <211> 22 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 708 ctgtctagag tccagatctt tc 22 <210> 709 <211> 19 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 709 aaactacagg tgagggttg 19 <210> 710 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 710 tgacttgtcc accttcaccc 20 <210> 711 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 711 tacggcagtg tgggtctaac 20 <210> 712 <211> 60 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 712 aaatacaatt gaaataaaaa taatcttgtc gaagcaaggg cttccaggtc ataggtggat 60 <210> 713 <211> 60 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 713 tgttactggg ctcaccacaa gcttaaaatc gaacgctgcc agcattagaa cctatttgtt 60 <210> 714 <211> 60 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 714 aaaaaggcac tatgaaaaaa caacatgctc gaactcctga cctcagatga tccacacacc 60 <210> 715 <211> 60 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 715 caaacaagaa taaagagtag agggtgtttc gagaatcttc aactttttgt atcttctatt 60 <210> 716 <211> 60 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 716 tctctttgga atgtcagtta ttcaaatatc gaatagctcc tattgttatg gagtgtagca 60 <210> 717 <211> 60 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 717 tatctcagct tttggcctgt ctcagctttc gacatagtag gtacttggta aacatttgtt 60 <210> 718 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 718 tgagtaacac aaagcatctg 20 <210> 719 <211> 18 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 719 agtgactggc tatgttcc 18 <210> 720 <211> 21 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 720 ctggtgattt gtgtgacttt g 21 <210> 721 <211> 18 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 721 agggaagatg tggaggag 18 <210> 722 <211> 19 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 722 gtacgactcc agccaaatg 19 <210> 723 <211> 22 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 723 gctgtctgtt actagattgc ac 22 <210> 724 <211> 18 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 724 accttgcaag aagcacag 18 <210> 725 <211> 21 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 725 atgatacttc ccaactgaca c 21 <210> 726 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 726 aggagcatcc atatcaagtg 20 <210> 727 <211> 19 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 727 ctgccatgtc tgactatcc 19 <210> 728 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 728 cagtgaagaa gccatcatcg 20 <210> 729 <211> 22 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 729 gcttagagaa atacaccagc ag 22 <210> 730 <211> 18 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 730 atgggcagca tttctcac 18 <210> 731 <211> 22 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 731 agggacgatt tatatgactt gc 22 <210> 732 <211> 22 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 732 gtgctggtat gtacctgtaa tc 22 <210> 733 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 733 gagggttgag aagcatcttg 20 <210> 734 <211> 60 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 734 tgtaaactgt aatatcaaaa attcaaaatc gaagagttga tttacttatt aacattagaa 60 <210> 735 <211> 60 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 735 acttttatag tgaaaagtgc catttgagtc gactgtgatt gaatgtaaaa ggttttaaat 60 <210> 736 <211> 60 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 736 tactgtagta agttctctga ggaggatatc gaagtcttgg attaaggttc attcaacaaa 60 <210> 737 <211> 60 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 737 tccatttgaa ggatgagaaa actgaggctc gaggcttaga aagtttcatt tggttgctca 60 <210> 738 <211> 60 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 738 ttttaaaccc aggtgcacac acaagagctc gaagcaggaa tcctggttct gttcccaggc 60 <210> 739 <211> 60 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 739 ccactccccc aggcttacct gcgagccatc gaggtgggcc tgggttctcg tggagggaga 60 <210> 740 <211> 60 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 740 tcactcattc tagatccctc tgtaaagttc gaactctgga ccttgtgatc cacccacctt 60 <210> 741 <211> 60 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 741 ttccatagat tacttttcaa atcatccttc gaagctggcg gctgagggcc cggcgccaag 60 <210> 742 <211> 60 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 742 tacagtcttt gtagatgcag agtagcgttc gaagctggcg gctgagggcc cggcgccaag 60 <210> 743 <211> 21 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 743 ctgcccgtaa ataagcagaa g 21 <210> 744 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 744 gagggttgag aagcatcttg 20

Claims (18)

  1. 하기 (i) 내지 (xiii)에 나타낸 프로브 중 적어도 10개를 사용하여, 하기 표 42a의 후성적 염색체 상호작용 중 적어도 10개의 존재 또는 부존재를 검출하는 것을 포함하는, 사람에서 근위축성 측삭 경화증에 대한 소인을 결정하는 방법으로서,

    후성적 염색체 상호작용의 존재 또는 부존재의 검출은
    (a) 염색체 상호작용에 함께 모인, 사람의 염색체 영역들을 시험관내에서 교차결합시키는 단계;
    (b) 상기 교차결합된 DNA를 효소로 제한 소화 절단시키는 단계;
    (c) 상기 교차결합된 절단된 DNA 말단을 라이게이션하여 라이게이션된 핵산을 형성하는 단계; 및
    (d) 상기 적어도 10개의 프로브를 사용하여, 염색체 상호작용에 상응하는 라이게이션된 핵산의 존재 또는 부존재를 검출하는 단계;
    를 포함하는 방법에 의한 것이고,
    (i) 내지 (xiii)에 나타낸 프로브들은 하기의 것인 방법:
    (i) AAATACAATTGAAATAAAAATAATCTTGTCGAAGCAAGGGCTTCCAGGTCATAGGTGGAT
    (ii) TGTTACTGGGCTCACCACAAGCTTAAAATCGAACGCTGCCAGCATTAGAACCTATTTGTT
    (iii) CCCCTAATTTAGCAAGCAGAAAGAGAACTCGATGCTTCATTTGACTCACACTCACATTTA
    (iv) AAAAAGGCACTATGAAAAAACAACATGCTCGAACTCCTGACCTCAGATGATCCACACACC
    (v) CCTCTGTCCACACCATTATTTTAAAGAGTCGACATGCCTTGCTTTACCATTGTTTAATTT
    (vi) CAAACAAGAATAAAGAGTAGAGGGTGTTTCGAGAATCTTCAACTTTTTGTATCTTCTATT
    (vii) CTCCACGTCACCCCATGTCAATTCCAAGTCGATGCCAGACACTCTTCTGGGGGTGGGGTG
    (viii) CCACCCCCGCCCCGGGGGAGTCGCCCGGTCGAGGGCCTGGCAAGAAGACAGAAGCCGACT
    (ix) TCTCTTTGGAATGTCAGTTATTCAAATATCGAATAGCTCCTATTGTTATGGAGTGTAGCA
    (x) TATCTCAGCTTTTGGCCTGTCTCAGCTTTCGACATAGTAGGTACTTGGTAAACATTTGTT
    (xi) AGGACAGAGACCCCTAATTCCACCACCATCGACCCTTCTGCTTTCTCTCCAGGGGATGGC
    (xii) TTCCACCTGTAATACTGTGCCTGTATTCTCGAGCAGGCGCTCAACAAATACAACTTCCTT
    (xiii) ACCAAACCCAAGGTCCGCTGCTCGCTGCTCGAATTCCCAACTGAGGGAGCTTTGTGGAAA.
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