KR100565698B1 - 급성골수성백혈병(aml), b-세포형 급성임파구성백혈병(b-all), t 세포형 급성임파구성백혈병(t-all) 진단용 마커 - Google Patents

급성골수성백혈병(aml), b-세포형 급성임파구성백혈병(b-all), t 세포형 급성임파구성백혈병(t-all) 진단용 마커 Download PDF

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Abstract

본 발명은 급성골수성백혈병(Acute Myeloid Leukemia; AML), B 세포형 임파구성백혈병(B-cell lineage Acute Lymphoblastic Leukemia; B-ALL), T 세포형 임파구성백혈병(T-cell lineage Acute Lymphoblastic Leukemia: T-ALL)에 특이적인 진단 마커에 관한 것이다. 또한, 상기 마커의 존재를 측정하는 제제를 포함하는 조성물, 키트, 및 이를 사용하여 AML, B-ALL 및 T-ALL을 진단하는 방법에 관한 것이다.
백혈병, 마커, AML, T-ALL, B-ALL

Description

급성골수성백혈병(AML), B-세포형 급성임파구성백혈병(B-ALL), T 세포형 급성임파구성백혈병(T-ALL) 진단용 마커{Markers for the diagnosis of AML, B-ALL and T-ALL}
도 1은 4개의 ALL(Acute Lymphoblastic Leukaemia) 샘플과 4개의 AML(Acute Myeloid Leukemia) 샘플에서 표 1, 표 2, 표 3에 포함된 유전자 중, B 세포형 ALL(B-cell Acute Lymphoblastic Leukaemia: B-ALL), T 세포형 ALL(T-cell Acute Lymphoblastic Leukaemia: T-ALL), AML 각각에서 특이적으로 발현되는 2개씩의 유전자와 모든 세포에서 일정 수준으로 발현되는 2개의 유전자의 RT-PCR 결과이다.
도 2는 정상 염색체를 가진 AML 환자에서 8개의 진단 마커 유전자의 발현을 RT-PCR로 조사한 결과이다. 환자 21을 제외하고 모든 환자가 AML 마커 유전자와 대조군 유전자만을 발현한다.
도 3은 t(15;17) 염색체 변이를 갖는 AML 환자에서 8개의 진단 마커 유전자의 발현을 RT-PCR로 조사한 결과이다. 모든 환자가 AML 마커 유전자와 대조군 유전자만을 발현한다.
도 4는 t(8;21) 염색체 변이를 갖는 AML 환자에서 8개의 진단 마커 유전자의 발현을 RT-PCR로 조사한 결과이다. 모든 환자가 AML 마커 유전자와 대조군 유전자 만을 발현한다.
도 5는 정상 염색체를 가진 B-ALL 환자에서 8개의 진단 마커 유전자의 발현을 RT-PCR로 조사한 결과이다. 모든 환자가 B-ALL 마커 유전자와 대조군 유전자만을 발현한다.
도 6은 t(9;22) 염색체 변이를 갖는 B-ALL 환자에서 8개의 진단 마커 유전자의 발현을 RT-PCR로 조사한 결과이다. 환자 51을 제외한 모든 환자가 B-ALL 마커 유전자와 대조군 유전자만을 발현한다.
도 7은 T-ALL 환자에서 8개의 진단 마커 유전자의 발현을 RT-PCR로 조사한 결과이다. 모든 환자가 T-ALL 마커 유전자와 대조군 유전자만을 발현한다.
본 발명은 급성골수성백혈병(AML), B 세포형 임파구성백혈병(B-ALL), T 세포형 임파구성백혈병(T-ALL)에 특이적인 진단용 마커에 관한 것이다. 구체적으로, 상기 마커의 존재를 측정하는 제제를 포함하는 조성물, 키트 및, 이를 사용하여 AML, B-ALL 및 T-ALL을 진단하는 방법에 관한 것이다.
백혈병(leukemia)은 백혈구가 종양성으로 증식하는 질환을 총칭하는데, 백혈병 종류는 백혈병이 기원하는 백혈구에 따라 골수성백혈병과 림프구성백혈병으로 나누고, 진행속도에 따라 급성백혈병과 만성백혈병으로 나뉜다. 백혈병의 임상양상은 질환의 유형과 침범된 세포의 성질에 따라 다양하다. 임파구성 백혈병은 임파계 혈액세포가, 골수성 백혈병은 골수계 혈액세포가, 그리고 만성 골수성 백혈병은 성숙기에 있는 세포가 변이해서 발생하며, 급성 골수성 백혈병은 비교적 초기단계의 조혈과정에서 분화를 시작하는 골수계 모세포의 장애로 초래된다.
상기 종류의 급성 백혈병은 서로 다른 메커니즘에 의해 발병되고 종류에 따라 치료제나 치료 방법 등이 차이가 나므로, 정확한 타입의 진단이 매우 중요하다. 현재까지 급성 백혈병의 분류는 일차적으로 골수 세포를 현미경으로 관찰하여 비정상적인 암세포의 형태와 염색 양상을 관찰하는 과정을 통해 이루어지며, 진단에 도움이 되는 단백질에 대한 단클론 항체를 이용한 면역학적 방법도 병용되고 있지만 아직까지 병리학적 혹은 조직학적으로 급성 백혈병의 종류를 구분할 수 있는 기준이 명확하지 않은 실정이다.
최근 들어 한번에 수천에서 수만 개의 유전자 발현을 검색할 수 있는 마이크로어레이 기술이 개발되었고, Golub 등은 50개의 유전자 발현을 이용하여 AML과 ALL을 구분할 수 있다는 것을 보고하였다 (Golub et al., Science 1998, 286:531-537). 이 보고는 유전자 발현을 이용하여 AML과 ALL을 진단할 수 있다는 가능성을 보여주었지만, 실제 적용가능성을 살펴보지 않아서 실제로 진단에 적용되기에는 한계가 있다.
따라서, 보다 신속하고 정확하게 AML과 ALL을 구분하기 위하여 현재까지 유의성이 높은 마커의 개발이 여전히 요구되고 있다.
본 발명에서는 AML, B-ALL 및 T-ALL을 간단하고 정확하게 구분하는 생물학적 마커를 개발하기 위하여, DNA 칩을 이용하여 각 타입별 백혈병에서만 과다 발현을 보이는 유전자를 일차 스크리닝하고, RT-PCR을 실시하여 유의성이 높은 마커를 확인하였다. 그 결과, 본 발명자는 AML 마커로 사용가능한 유전자인 CITED2, MGST1, BIN2, RAB32, ICAM-3, PXN, PPGB 및 TAF15; B-ALL 마커로 사용가능한 유전자인 TCL1A, CD19, INSR, OFD1, AKR1B1, CD79B 및 UHRF1; T-ALL로 사용가능한 유전자인 TCF7, TRB, TRGC2, NK4 및 CHC1L을 발굴하고, 실제 백혈병 시료를 통하여 적용하였을 때, 각 타입별 백혈병을 신속, 간편, 정확하게 진단하는 것을 확인하고 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 하나의 목적은 백혈병 의심 환자의 생물학적 시료로부터 CITED2와 MGST1, BIN2, RAB32, ICAM-3, PXN, PPGB 및 TAF15 중에서 선택되는 0 내지 3개의 유전자의 mRNA 또는 이의 단백질의 수준을 측정하여, 급성골수성백혈병(AML)을 진단하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 백혈병 의심 환자의 생물학적 시료로부터 TCL1A와 CD19, INSR, OFD1, AKR1B1, CD79B 및 UHRF1 중에서 선택되는 0 내지 3개의 유전자의 mRNA 또는 이의 단백질의 수준을 측정하여, B-세포형 급성임파구성백혈병(B-ALL)을 진단하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 백혈병 의심 환자의 생물학적 시료로부터 TCF7와 TRB, TRGC2, NK4 및 CHC1L 중에서 선택되는 0 내지 3개의 유전자의 mRNA 또는 이의 단백질의 수준을 측정하여, T 세포형 급성임파구성백혈병(T-ALL)을 진단하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 백혈병 의심 환자의 생물학적 시료로부터 CITED2와 MGST1, BIN2, RAB32, ICAM-3, PXN, PPGB 및 TAF15 중에서 선택되는 0 내지 3개의 유전자의 mRNA 또는 이의 단백질; TCL1A와 CD19, INSR, OFD1, AKR1B1, CD79B 및 UHRF1 중에서 선택되는 0 내지 3개의 유전자의 mRNA 또는 이의 단백질 ; 및 TCF7와 TRB, TRGC2, NK4 및 CHC1L 중에서 선택되는 0 내지 3개의 유전자의 mRNA 또는 이의 단백질의 수준을 측정하여, AML, B-ALL, 및 T-ALL을 구별하여 진단하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 CITED2와 MGST1, BIN2, RAB32, ICAM-3, PXN, PPGB 및 TAF15 중에서 선택되는 0 내지 3개의 유전자의 mRNA 또는 이의 단백질의 수준을 측정하는 제제를 포함하는, AML 진단 마커 검출용 키트를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 TCL1A와 CD19, INSR, OFD1, AKR1B1, CD79B 및 UHRF1 중에서 선택되는 0 내지 3개의 유전자의 mRNA 또는 이의 단백질의 수준을 측정하는 제제를 포함하는, B-ALL 진단 마커 검출용 키트를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 TCF7와 TRB, TRGC2, NK4 및 CHC1L 중에서 선택되는 0 내지 3개의 유전자의 mRNA 또는 이의 단백질의 수준을 측정하는 제제를 포함하는, T-ALL 진단 마커 검출용 키트를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 CITED2와 MGST1, BIN2, RAB32, ICAM-3, PXN, PPGB 및 TAF15 중에서 선택되는 0 내지 3개의 유전자의 mRNA 또는 단백질; TCL1A와 CD19, INSR, OFD1, AKR1B1, CD79B 및 UHRF1 중에서 선택되는 0 내지 3개의 유전자의 mRNA 또는 이의 단백질; 및 TCF7과 TRB, TRGC2, NK4 및 CHC1L 중에서 선택되는 0 내지 3개의 유전자의 mRNA 또는 이의 단백질의 수준을 측정하는 제제를 포함하는, AML, B-ALL, 및 T-ALL을 구별하기 위한 진단 마커 검출용 키트를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 CITED2와 MGST1, BIN2, RAB32, ICAM-3, PXN, PPGB 및 TAF15 중에서 선택되는 0 내지 3개의 유전자에 대해 특이적인 프라이머 쌍 또는 항체를 포함하는, AML 진단 마커 검출용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 TCL1A와 CD19, INSR, OFD1, AKR1B1, CD79B 및 UHRF1 중에서 선택되는 0 내지 3개의 유전자에 특이적인 프라이머 쌍 또는 항체를 포함하는, B-ALL 진단 마커 검출용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 TCF7와 TRB, TRGC2, NK4 및 CHC1L 중에서 선택되는 0 내지 3개의 유전자에 특이적인 프라이머 쌍 또는 항체를 포함하는, T-ALL 진단 마커 검출용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 CITED2와 MGST1, BIN2, RAB32, ICAM-3, PXN, PPGB 및 TAF15 중에서 선택되는 0 내지 3개의 유전자; TCL1A와 CD19, INSR, OFD1, AKR1B1, CD79B 및 UHRF1 중에서 선택되는 0 내지 3개의 유전자; 및 TCF7와 TRB, TRGC2, NK4 및 CHC1L 중에서 선택되는 0 내지 3개의 유전자에 특이적인 프라이머 쌍 또는 항체를 포함하는, AML, B-ALL 및 T-ALL 진단 마커의 구별 검출용 조성물에 관한 것이다.
본 발명은 상기 백혈병 중에서도 백혈구가 정상적인 분화과정을 거치지 않고 증식하여 골수와 말초 혈액에 미성숙(immature), 비정상적(abnormal)인 백혈구가 존재하는 특징을 보이는, 급성 백혈병, 바람직하게는 급성골수성백혈병(AML), B-세포형 급성임파구성백혈병(B-ALL) 및 T 세포형 급성임파구성백혈병(T-ALL)를 진단하는 마커에 관한 것이다. 본 발명은 생물학적 시료로부터 각 타입 급성 백혈병에 특이적인 진단 마커를 검출하여, 각 타입별 급성백혈병을 쉽고 간단하게 진단하는 방법을 제공한다.
본 발명에서 용어, “진단용 마커, 진단하기 위한 마커 또는 진단 마커(diagnosis marker)”란 백혈병 세포를 정상세포와 구분하여 진단할 수 있는 물질로, 정상 세포에 비하여 백혈병을 가진 세포에서 증가 또는 감소를 보이는 폴리펩타이드 또는 핵산(예: mRNA 등), 지질 , 당지질, 당단백질, 당(단당류, 이당류, 올리고당류 등) 등과 같은 유기 생체 분자 등을 포함하며, 특정 조건, 표현형 또는 세포형과 관련이 있는 이들은 분석에 의하여 검출될 수 있다. 본 발명의 목적상, 백혈병 진단 마커는 AML, B-ALL, 및 T-ALL을 진단할 수 있는 핵산 및 폴리펩타이드 마커이며, 마커들은 각 타입별 AML, B-ALL, 및 T-ALL 세포에서만 발현이 증가하는 특징을 가진다.
유의성 있는 진단 마커의 선택과 적용은 진단 결과의 신뢰도를 결정짓는 결정적 요소이다. 유의성 있는 진단 마커란, 진단하여 얻은 결과가 정확하여 타당도(validity)가 높고 반복 측정시에도 일관된 결과를 나타내도록 신뢰도가(reliability)가 높은 마커를 의미한다. 본 발명의 백혈병 진단 마커는, 특정 타입의 백혈병의 발병과 함께 직접적 또는 간접적 요인으로 발현이 항상 증가하는 유전자들로 반복된 실험에도 동일한 결과를 나타내며, 발현 수준의 차이가 대조군과 다른 타입의 백혈병에서와 비교할 때 매우 커서 잘못된 결과를 내린 확률이 거의 없는 신뢰도가 높은 마커들이다. 그러므로 본 발명의 유의성 있는 진단 마커의 발현 정도를 측정하여 얻은 결과를 토대로 진단된 백혈병의 타입을 타당하게 신뢰할 수 있다.
본 발명에서, “생물학적 시료”란 백혈병 발병에 의하여 백혈병 진단 마커로 사용되는 유전자 또는 단백질 수준의 차이를 검출할 수 있는 조직, 세포 등으로, 골수(bone marrow), 림프절(lymph node), 비장(spleen), 말초 혈액(peripheral blood), 림프액(lymph fluid), 장액(serous fluid), 뇨(urine), 타액(saliva) 등을 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에서 "진단"은 병리 상태의 존재 또는 특징을 확인하는 것을 의미한다. 본 발명의 목적상, 진단은 급성백혈병 발병 여부를 확인하는 것으로, AML, B-ALL, T-ALL으로 구분되는 급성백혈병의 정확한 타입까지 확인할 수 있는 것을 특징으로 한다.
하나의 양태로서, 본 발명은 백혈병 의심 환자의 생물학적 시료로부터 CITED2와 MGST1, BIN2, RAB32, ICAM-3, PXN, PPGB 및 TAF15 중에서 선택되는 0 내지 3개의 유전자의 mRNA 또는 이의 단백질의 수준을 측정하는 단계; 및 이를 정상 대조군 시료의 mRNA 또는 단백질 수준과 비교하여 mRNA 또는 단백질의 수준의 증가를 확인하는 단계를 포함하여, 급성골수성백혈병(AML)을 진단하는 방법에 관한 것이다.
본 발명에서 용어, “급성골수성백혈병(AML: Acute Myeloid Leukemia)”은 골수계 세포가 골수 내에서 증식하여 말초 혈액이나 기타 장기를 침습하는 악성 혈액 질환으로, 성인에서 발병 빈도가 높은 질환이다.
본 발명의 CITED2(Cbp/p300-interacting transactivator with Glu/Asp-rich carboxy-terminal domain, 2), MGST1(microsomal glutathione S-transferase 1), RAB32(RAB32, member RAS oncogene family), BIN2(bridging integrator 2), ICAM-3(Intercellular Adhesion Molecule-3), PXN(Paxillin), PPGB(protective protein for beta-galactosidase) 및 TAF15(TAF15 RNA polymerase II, TATA box binding protein (TBP)-associated factor, 68kDa) 유전자는 정상세포 및 다른 타입의 급성백혈병 세포에 비하여, AML 세포에서 특이적으로 높은 수준의 발현을 보이므로, AML 진단 마커로 제공된다.
이 때, 모든 급성 백혈병에서 거의 동일한 양으로 발현되는 유전자RRAGB(GTP-binding protein ragB) 및/또는 DCK(deoxycytidine kinase)를 정량 대조군으로 사용할 수 있다.
상기 유전자 모두는 AML 마커로 유용하나, 본 발명의 신속, 간편, 정확한 마커를 제공하고자 하는 본 발명의 목적상, 의학적 판단을 내리기에 충분한 정도의 과다하지 않는 수의 마커를 검출하는 것이 바람직하다. 이는 시간 및 자원의 낭비를 방지할 수 있다는 점에서도 경제적이다. 본 발명은 CITED2와 MGST1, BIN2, RAB32, ICAM-3, PXN, PPGB 및 TAF15 중에서 선택되는 0 내지 3개의 유전자를 마커로 검출하였다. 이는 실제 진단이 정확할 가능성을 극대화하고자 하는 조건과 부합하는 적절한 수의 유전자 세트이다.
CITED2는 B-ALL 및 T-ALL에서는 거의 발현되지 않고, AML에서만 특이적으로 발현되므로, 단독으로도 민감, 정확, 정밀하게 AML을 진단할 수 있는 신뢰도가 매우 높은 마커이다. 그러므로 CITED2 마커를 단독으로 검출하여 AML을 진단하거나, 또는 CITED2를 필수적으로 포함하고, MGST1, BIN2, RAB32, ICAM-3, PXN, PPGB 및 TAF15 중에서 선택되는 유전자를 마커로 검출하여 AML을 진단하도록 한다. 이 때, MGST1를 선택하여 CITED2와 함께 AML 진단 마커로 사용하는 것이 바람직하다.
생물학적 시료 중의 유전자의 발현 수준은 mRNA 또는 단백질의 양을 확인함으로써 알 수 있으며, 생물학적 시료에서 mRNA와 단백질을 분리하는 과정은 공지의 공정을 이용하여 수행할 수 있으며(Chomczynski and Sacchi Anal. Biochemistry. 1987, 162: 156-159), mRNA와 단백질의 양은 다양한 방법으로 측정할 수 있다.
본 발명에서 “mRNA 발현수준 측정”이란 AML을 진단하기 위하여 생물학적 시료에서 AML 마커 유전자들의 mRNA 존재 여부와 발현 정도를 확인하는 과정으로 mRNA의 양을 측정한다. 이를 위한 분석 방법으로는 RT-PCR, 경쟁적 RT- PCR(Competitive RT-PCR), 실시간 RT-PCR(Real-time RT-PCR), RNase 보호 분석법(RPA; RNase protection assay), 노던 블랏팅(Northern blotting), DNA 칩 등이 있으나 이로 제한되는 것은 아니다.
상기 검출 방법들을 통하여, 정상 대조군에서의 mRNA 발현량과 AML 의심환자에서의 mRNA 발현량을 비교할 수 있고, AML 마커 유전자에서 mRNA로의 유의한 발현량의 증가여부를 판단하여 AML 의심 환자의 실제 AML 환자 여부를 진단할 수 있다.
mRNA 발현수준 측정은 바람직하게는, AML 진단 마커로 사용되는 유전자에 특이적인 프라이머를 이용하는 RT-PCR법을 이용하는 것이다.
RT-PCR은 P. Seeburg(Cold Spring Harb Symp Quant Biol 1986, Pt 1:669-677)에 의해 RNA를 분석하는데 도입된 방법으로, mRNA를 역전사하여 얻어진 cDNA를 PCR로 증폭하여 분석한다. 이 때 증폭 단계에서 AML 진단 마커에 특이적으로 제조된 프라이머 쌍을 사용하도록 한다. RT-PCR 후 전기영동하여 밴드 패턴과 밴드의 두께를 확인함으로써 AML 진단 마커로 사용되는 유전자의 mRNA 발현 여부와 정도를 확인 가능하고 이를 대조군과 비교함으로써, AML 발생 여부를 간편하게 진단할 수 있다.
달리는, 상기 AML 마커 유전자 또는 그 단편에 해당하는 핵산이 유리 같은 기판에 고밀도로 부착되어 있는 DNA 칩을 이용하는 것이다. DNA 칩은 시료에서 mRNA를 분리하고, 그 말단 또는 내부를 형광 물질로 표지된 cDNA 프로브를 조제하고, DNA 칩에 혼성화시킨 다음 판독하여, 유전자의 존재 또는 발현 정도를 확인하여, AML 발병 여부를 진단할 수 있다.
본 발명에서 “단백질 발현수준 측정”이란 AML을 진단하기 위하여 생물학적 시료에서의 AML 마커 유전자에서 발현된 단백질의 존재 여부와 발현 정도를 확인하는 과정으로, 상기 유전자의 단백질에 대하여 특이적으로 결합하는 항체를 이용하여 단백질의 양을 확인한다.
항체를 이용하여 단백질 수준을 측정하기 위한 분석 방법으로는, 웨스턴 블랏, ELISA(enzyme linked immunosorbent assay), 방사선면역분석(RIA: Radioimmunoassay), 방사 면역 확산법(radioimmunodiffusion), 오우크테로니(Ouchterlony) 면역 확산법, 로케트(rocket) 면역전기영동, 조직면역 염색, 면역침전 분석법(Immunoprecipitation Assay), 보체 고정 분석법(Complement Fixation Assay), FACS, 단백질 칩(protein chip) 등이 있으나 이로 제한되는 것은 아니다.
상기 분석 방법들을 통하여, 정상 대조군에서의 항원-항체 복합체의 형성량과 AML 의심환자에서의 항원-항체 복합체의 형성량을 비교할 수 있고, AML 마커 유전자에서 단백질로의 유의한 발현량의 증가여부를 판단하여, AML 의심 환자의 실제 AML 환자 여부를 진단할 수 있다.
본 발명에서 사용된 용어 “항원-항체 복합체”란 AML 마커 단백질과 이에 특이적인 항체의 결합물을 의미하고, 항원-항체 복합체의 형성량은 검출 라벨(detection label)의 시그널의 크기를 통해서 정량적으로 측정 가능하다.
이러한 검출 라벨은 효소, 형광물, 리간드, 발광물, 미소입자(microparticle), 레독스 분자 및 방사선 동위원소로 이루어진 그룹중에서 선택할 수 있으며, 반드시 이로 제한되는 것은 아니다. 검출 라벨로서 효소가 사용되는 경우 이용 가능한 효소에는 β-글루쿠로니다제, β-D-글루코시다제, β-D-갈락토시다제, 우레아제, 퍼옥시다아제 또는 알칼라인 포스파타아제, 아세틸콜린에스테라제, 글루코즈 옥시다제, 헥소키나제와 GDPase, RNase, 글루코즈 옥시다제와 루시페라제, 포스포프럭토키나제, 포스포에놀피루베이트 카복실라제, 아스파르테이트 아미노트랜스페라제, 포스페놀피루베이트 데카복실라제 또는 β-라타마제 등이 있으며 이로 제한되지 않는다. 형광물에는 플루오레신, 이소티오시아네이트, 로다민, 피코에리테린, 피코시아닌, 알로피코시아닌, o-프탈데히드, 플루오레스카민 등이 있으며 이로 제한되지 않는다. 리간드에는 바이오틴 유도체 등이 있으며 이로 제한되지 않는다. 발광물에는 아크리디늄 에스테르, 루시페린, 루시퍼라아제 등이 있으며 이로 제한되지 않는다. 미소입자에는 콜로이드 금, 착색된 라텍스 등이 있으며 이로 제한되지 않는다. 레독스 분자에는 페로센, 루테늄 착화합물, 바이올로젠, 퀴논, Ti 이온, Cs 이온, 디이미드, 1,4-벤조퀴논, 하이드로퀴논, K4 W(CN) 8 , [Os(bpy) 3 ] 2+ , [RU(bpy) 3 ] 2+ 또는 [MO(CN) 8 ] 4- 등이 포함되며 이로 제한되지 않는다. 방사선동위원소에는 3H, 14C, 32P, 35S, 36Cl, 51Cr, 57Co, 58Co, 59Fe, 90Y, 125I, 131I 또는 186Re 등이 포함되며 이로 제한되지 않는다.
단백질 발현수준 측정은 바람직하게는, ELISA(enzyme-linked immunosorbent assay)법을 이용하는 것이다. ELISA는 고체 지지체에 부착된 항원을 인지하는 표지된 항체를 이용하는 직접적 ELISA, 고체 지지체에 부착된 항원을 인지하는 항체의 복합체에서 포획 항체를 인지를 하는 표지된 항체를 이용하는 간접적 ELISA, 고 체 지지체에 부착된 항체와 항원의 복합체에서 항원을 인지하는 표지된 또 다른 항체를 이용하는 직접적 샌드위치 ELISA, 고체 지지체에 부착된 항체와 항원의 복합체에서 항원을 인지하는 또다른 항체와 반응시킨 후 이 항체를 인지하는 표지된 2차 항체를 이용하는 간접적 샌드위치 ELISA 등 다양한 ELISA 방법을 포함한다. 보다 바람직하게는, 고체 지지체에 항체를 부착시키고 시료를 반응시킨 후 항원-항체 복합체의 항원을 인지하는 표지된 항체를 부착시켜 효소적으로 발색시키거나 항원-항체 복합체의 항원을 인지하는 항체에 대해 표지된 2차 항체를 부착시켜 효소적으로 발색시키는 샌드위치 ELISA 방법에 의해서 검출한다. AML 마커 단백질과 항체의 복합체 형성 정도를 확인하여, AML 발병여부를 확인할 수 있다.
또한, 바람직하게는, 상기 AML 마커에 대한 하나 이상의 항체가 기판위의 정해진 위치위에 배열되어 고밀도로 고정화되어 있는 단백질 칩을 이용하는 것이다. 단백질 칩을 이용하여 시료를 분석하는 방법은, 시료에서 단백질을 분리하고, 분리한 단백질을 단백질 칩과 혼성화시켜서 항원-항체 복합체를 형성시키고, 이를 판독하여, 단백질의 존재 또는 발현 정도를 확인하여, AML 발병여부를 확인할 수 있다.
또한, 바람직하게는, 상기 AML 마커에 대한 하나 이상의 항체를 이용한 웨스턴 블랏을 이용하는 것이다. 시료에서 전체 단백질를 분리하고, 이를 전기영동하여, 단백질을 크기에 따라 분리한 다음, 니트로셀루로즈 막으로 이동시켜 항체와 반응시킨다. 생성된 항원-항체 복합체의 양을 표지된 항체를 이용하여 확인하는 방법으로 유전자의 발현에 의해 생성된 단백질의 양을 확인하여, AML 발병여부를 확인할 수 있다.
상기 검출 방법은 백혈병이 걸리지 않은 대조군에서의 마커 유전자의 발현량과 백혈병이 발병한 세포에서의 마커 유전자의 발현량을 조사하는 방법으로 이루어진다. mRNA 또는 단백질 수준은 상기한 마커 단백질의 절대적(예: ㎍/㎖) 또는 상대적(예: 시그널의 상대 강도) 차이로 나타낼 수 있다.
또 다른 양태로서, 본 발명은 백혈병 의심 환자의 생물학적 시료로부터 TCL1A와 CD19, INSR, OFD1, AKR1B1, CD79B 및 UHRF1 중에서 선택되는 0 내지 3개의 유전자의 mRNA 또는 이의 단백질의 수준을 측정하는 단계; 및 이를 정상 대조군 시료의 mRNA 또는 단백질 수준과 비교하여 mRNA 또는 단백질의 수준의 증가를 확인하는 단계를 포함하여, B 세포형 급성임파구성백혈병(B-ALL)을 진단하는 방법에 관한 것이다.
본 발명에서 “B 세포형 임파구성백혈병(B cell Acute Lymphocytic Leukemia: B-ALL)"은 WHO 분류에 의한 것으로 t(8;14), t(8;22), t(2;8), t(9;22), t(4;11), t(1;19) 등의 염색체 변이를 포함한다.
본 발명의 TCL1A(T-cell leukemia/lymphoma 1A), CD19, INSR(insulin receptor), OFD1(oral-facial-digital syndrom 1), AKR1B1(aldo-keto reductase family 1, member B1), CD79B 및 UHRF1(ubiquitin-like, containing PHD and RING finger domains, 1) 유전자는 정상세포 및 다른 타입의 급성백혈병 세포에 비하여, B-ALL 세포에서 특이적으로 높은 수준의 발현을 보이므로, B-ALL 마커로 사용된다.
상기 유전자 모두는 B-ALL 마커로 유용하나, 본 발명의 신속, 간편, 정확한 마커를 제공하고자 하는 본 발명의 목적상, 의학적 판단을 내리기에 충분한 정도의 과다하지 않는 수의 마커를 검출하는 것이 바람직하다. 본 발명은 TCL1A와 CD19, INSR, OFD1, AKR1B1, CD79B 및 UHRF1 중에서 선택되는 0 내지 3개의 유전자를 마커로 검출하였다. 이는 실제 진단이 정확할 가능성을 극대화하고자 하는 조건과 부합하는 적절한 수의 유전자 세트이다.
이 때, 모든 급성 백혈병에서 거의 동일한 양으로 발현되는 유전자 RRAGB 및/또는 DCK를 정량 대조군으로 사용할 수 있다.
TCL1A은 AML 및 T-ALL에서는 거의 발현되지 않고, B-ALL에서만 특이적으로 발현되므로, 단독으로도 민감, 정확, 정밀하게 B-ALL을 진단할 수 있는 신뢰도가 매우 높은 마커이다. 그러므로 TCL1A 마커를 단독으로 검출하여 B-ALL을 진단하거나, 또는 CD19를 필수적으로 포함하고, INSR, OFD1, AKR1B1, CD79B 및 UHRF1 중에서 선택되는 유전자를 마커로 검출하여 B-ALL을 진단하도록 한다. 이 때, CD19를 선택하여 TCL1A와 함께 B-ALL 진단 마커로 사용하는 것이 바람직하다.
B-ALL 마커의 mRNA 수준은, RT-PCR, 경쟁적 RT-PCR(Competitive RT-PCR), 실시간 RT-PCR(Real-time RT-PCR), RNase 보호 분석법(RPA; RNase protection assay), 노던 블랏팅(Northern blotting), DNA 칩 등의 분석 방법을 통하여, 정상 대조군에서의 RNA 발현량과 B-ALL 의심 환자에서의 RNA 발현량을 비교할 수 있고, B-ALL 마커 유전자에서 mRNA로의 유의한 발현량의 증가여부를 판단하여, B-ALL 의심 환자의 실제 B-ALL 환자 여부를 진단할 수 있다.
mRNA 발현수준 측정은 바람직하게는, B-ALL 진단 마커로 사용되는 유전자에 특이적인 프라이머를 이용하는 RT-PCR 또는 DNA 칩을 이용하는 것이다.
B-ALL 마커의 단백질 수준은, 웨스턴 블랏, ELISA, RIA, 방사 면역 확산법, 오우크테로니 면역 확산법, 로케트 면역전기영동, 조직면역 염색, 면역침전 분석법, 보체 고정 분석법, FACS, 단백질 칩 등의 분석 방법을 통하여, 정상 대조군에서의 항원-항체 복합체의 형성량과 B-ALL 의심환자에서의 항원-항체 복합체의 형성량을 비교할 수 있고, B-ALL 마커 유전자에서 단백질로의 유의한 발현량의 증가여부를 판단하여, B-ALL 의심 환자의 실제 B-ALL 환자 여부를 진단할 수 있다.
단백질 발현수준 측정은 바람직하게는, ELISA, 단백질 칩 또는 웨스턴 블랏을 이용하는 것이다.
또 다른 양태로서, 본 발명은 백혈병 의심 환자의 생물학적 시료로부터 TCF7와 TRB, TRGC2, NK4 및 CHC1L 중에서 선택되는 0 내지 3개의 유전자의 mRNA 또는 이의 단백질의 수준을 측정하는 단계; 및 이를 정상 대조군 시료의 mRNA 또는 단백질 수준과 비교하여 mRNA 또는 단백질의 수준의 증가를 확인하는 단계를 포함하여, T 세포형 급성임파구성백혈병(T-ALL)을 진단하는 방법에 관한 것이다.
본 발명에서 “T-세포형 임파구성백혈병(T-cell Acute Lymphocytic Leukemia: T-ALL)"은 WHO 분류에 의한 것으로 14q11, 7q34 등의 염색체 변이를 포함한다.
본 발명의 TCF7(transcription factor 7:T-cell specific, HMG-box), TRB(T cell receptor beta locus), TRGC2(T cell receptor gamma constant 2), NK4(natural killer cell transcript 4), CHC1L(chromosome condensation 1-like) 유전자는 정상세포 및 다른 타입의 급성백혈병 세포에 비하여, T-ALL 세포에서 특이적으로 높은 수준의 발현을 보이므로, T-ALL 마커로 사용된다.
상기 유전자 모두는 T-ALL 마커로 유용하나, 본 발명의 신속, 간편, 정확한 마커를 제공하고자 하는 본 발명의 목적상, 의학적 판단을 내리기에 충분한 정도의 과다하지 않는 수의 마커를 검출하는 것이 바람직하다. 본 발명은 TCF7와 TRB, TRGC2, NK4 및 CHC1L 중에서 선택되는 0 내지 3개의 유전자를 마커로 검출하였다. 이는 실제 진단이 정확할 가능성을 극대화하고자 하는 조건과 부합하는 적절한 수의 유전자 세트이다.
이 때, 모든 급성 백혈병에서 거의 동일한 양으로 발현되는 유전자 RRAGB 및/또는 DCK를 정량 대조군으로 사용할 수 있다.
TCF7은 AML 및 B-ALL에서는 거의 발현되지 않고, T-ALL에서만 특이적으로 발현되므로, 단독으로도 민감, 정확, 정밀하게 T-ALL을 진단할 수 있는 신뢰도가 매우 높은 마커이다. 그러므로 TCF7 마커를 단독으로 검출하여 T-ALL을 진단하거나, 또는 TCF7를 필수적으로 포함하고, TRB, TRGC2, NK4 및 CHC1L 중에서 선택되는 유전자를 마커로 검출하여 T-ALL을 진단하도록 한다. 이 때, TRB를 선택하여 TCF7와 함께 T-ALL 진단 마커로 사용하는 것이 바람직하다.
T-ALL 마커의 mRNA 수준은, RT-PCR, 경쟁적 RT-PCR(Competitive RT-PCR), 실시간 RT-PCR(Real-time RT-PCR), RNase 보호 분석법(RPA; RNase protection assay), 노던 블랏팅(Northern blotting), DNA 칩 등의 분석 방법을 통하여, 정상 대조군에서의 RNA 발현량과 T-ALL 의심 환자에서의 RNA 발현량을 비교할 수 있고, T-ALL 마커 유전자에서 mRNA로의 유의한 발현량의 증가여부를 판단하여, T-ALL 의심 환자의 실제 T-ALL 환자 여부를 진단할 수 있다.
mRNA 발현수준 측정은 바람직하게는, T-ALL 진단 마커로 사용되는 유전자에 특이적인 프라이머를 이용하는 RT-PCR 또는 DNA 칩을 이용하는 것이다.
T-ALL 마커의 단백질 수준은, 웨스턴 블랏, ELISA, RIA, 방사 면역 확산법,오우크테로니 면역 확산법, 로케트 면역전기영동, 조직면역 염색, 면역침전 분석법, 보체 고정 분석법, FACS, 단백질 칩 등의 분석 방법을 통하여, 정상 대조군에서의 항원-항체 복합체의 형성량과 T-ALL 의심환자에서의 항원-항체 복합체의 형성량을 비교할 수 있고, T-ALL 마커 유전자에서 단백질로의 유의한 발현량의 증가여부를 판단하여, T-ALL 의심 환자의 실제 T-ALL 환자 여부를 진단할 수 있다.
단백질 발현수준 측정은 바람직하게는, ELISA, 단백질 칩 또는 웨스턴 블랏을 이용하는 것이다.
또 다른 양태로서, 본 발명은 백혈병 의심 환자의 생물학적 시료로부터 CITED2와 MGST1, BIN2, RAB32, ICAM-3, PXN, PPGB 및 TAF15 중에서 선택되는 0 내지 3개의 유전자; TCL1A와 CD19, INSR, OFD1, AKR1B1, CD79B 및 UHRF1 중에서 선택되는 0 내지 3개의 유전자; 및 TCF7와 TRB, TRGC2, NK4 및 CHC1L 중에서 선택되는 0 내지 3개의 유전자의 mRNA 또는 이의 단백질의 수준을 측정하는 단계; 및 이를 정상 대조군 시료의 mRNA 또는 단백질 수준과 비교하여 mRNA 또는 단백질의 수준의 증가를 확인하는 단계를 포함하여, AML, B-ALL, 및 T-ALL을 구별하여 진단하는 방법을 제공하는 것이다.
AML, B-ALL 및 T-ALL 환자 검출 마커 유전자의 발현 수준을 동시에 측정함으로써, 백혈병의 타입을 한번에 결정할 수 있는 방법의 효율성을 도모할 수 있다.
이 때, 모든 급성 백혈병에서 거의 동일한 양으로 발현되는 유전자 RRAGB 및/또는 DCK를 정량 대조군으로 사용할 수 있다.
보다 바람직하게는, CITED2와 MGST1 유전자; TCL1A와 CD19의 유전자; 및 TCF7와 TRB의 유전자의 mRNA 또는 이의 단백질의 수준을 측정하는 방법을 제공한다. CITED2와 MGST1은 AML 진단을 위한 유의성이 높은 마커이다. TCL1A와 CD19는 B-ALL 진단을 위한 유의성이 높은 마커이다. TCF7와 TRB는 T-ALL 진단을 위한 유의성이 높은 마커이다. 그러므로 정렬된 6개 유전자의 발현 패턴 및 양을 비교함으로서, 백혈병의 발병 여부와 타입을 한 눈에 진단할 수 있다.
AML, B-ALL 및 T-ALL의 진단은 본 발명에서 제공하는 백혈병 진단 마커 유전자에 대한 mRNA 또는 단백질 수준을 검출할 수 있는 제제를 포함하는 키트에 의해 손쉽게 가능하다.
또 다른 양태로서, 본 발명은 CITED2와 MGST1, BIN2, RAB32, ICAM-3, PXN, PPGB 및 TAF15 중에서 선택되는 0 내지 3개의 유전자의 mRNA 또는 이의 단백질의 수준을 측정하는 제제를 포함하는, AML 진단 마커 검출용 키트에 관한 것이다.
본 발명의 검출용 키트는, 분석 방법에 적합한 한 종류 또는 그 이상의 다른 구성성분 조성물, 용액 또는 장치로 구성된다.
바람직하게는, RT-PCR을 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 포함하는 것을 특징으로 하는 진단 마커 검출용 키트에 관한 것이다. RT-PCR 키트는, 마커 유전자에 대한 특이적인 각각의 프라이머 쌍을 포함한다. 프라이머는 각 마커 유전자의 핵산서열에 특이적인 서열을 가지는 뉴클레오타이드로서, 약 7 bp 내지 50 bp의 길이, 보다 바람직하게는 약 10 bp 내지 30 bp 의 길이이다. 또한 대조군 유전자의 핵산 서열에 특이적인 프라이머를 포함할 수 있다. 그 외 RT-PCR 키트는 테스트 튜브 또는 다른 적절한 컨테이너, 반응 완충액(pH 및 마그네슘 농도는 다양), 데옥시뉴클레오타이드(dNTPs), Taq-폴리머라아제 및 역전사효소와 같은 효소, DNAse, RNAse 억제제 DEPC-수(DEPC-water), 멸균수 등을 포함할 수 있다.
또한 바람직하게는, DNA 칩을 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 포함하는 것을 특징으로 하는 진단 실험 키트에 관한 것이다. DNA 칩 키트는, 유전자 또는 그의 단편에 해당하는 cDNA 또는 올리고뉴클레오티드가 부착되어 있는 기판, 및 형광표식 프로브를 제작하기 위한 시약, 제제, 효소 등을 포함할 수 있다. 또한 기판은 대조군 유전자로 사용되는 RRAGB 및/또는 DCK 유전자 또는 그의 단편에 해당하는 cDNA를 포함할 수 있다.
또한 바람직하게는, ELISA를 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 포함하는 것을 특징으로 하는 진단 시험 키트에 관한 것이다. ELISA 키트는, 마커 단백질에 대한 특이적인 항체를 포함한다. 항체는 각 마커 단백질에 대한 특이성 및 친화성 이 높고 다른 단백질에 대한 교차 반응성이 거의 없는 항체로, 단클론 항체, 다클론 항체 또는 재조합 항체이다. 또한 ELISA 키트는 대조군 단백질에 특이적인 항체를 포함할 수 있다. 그 외 ELISA 키트는 결합된 항체를 검출할 수 있는 시약, 예를 들면, 표지된 2차 항체, 발색단(chromophores), 효소(예: 항체와 컨주게이트됨) 및 그의 기질 또는 항체와 결합할 수 있는 다른 물질 등을 포함할 수 있다.
AML 마커 검출용 RT-PCR 키트는 CITED2 및 MGST1, BIN2, RAB32, ICAM-3, PXN, PPGB 및 TAF15 중에서 선택되는 0 내지 3개의 유전자에 대하여 특이적인 각각의 프라이머 쌍을 포함한다. 또한 RRAGB 및/또는 DCK 유전자에 대하여 특이적인 프라이머 쌍을 포함할 수 있다.
AML 마커 검출용 DNA 칩 키트는 CITED2 및 MGST1, BIN2, RAB32, ICAM-3, PXN, PPGB 및 TAF15 중에서 선택되는 0 내지 3개의 유전자 또는 그의 단편에 해당하는 cDNA가 부착되어 있는 기판을 포함한다. 또한 RRAGB 및/또는 DCK 유전자 또는 그의 단편에 해당하는 cDNA를 기판에 부착 및 고정할 수 있다.
AML 마커 검출용 ELISA 키트는 CITED2 및 MGST1, BIN2, RAB32, ICAM-3, PXN, PPGB 및 TAF15 중에서 선택되는 0 내지 3개의 단백질에 대한 특이적인 항체를 포함한다. 또한 RRAGB 및/또는 DCK 단백질에 대하여 특이적인 항체를 포함할 수 있다.
또 다른 양태로서, 본 발명은 TCL1A와 CD19, INSR, OFD1, AKR1B1, CD79B 및 UHRF1 중에서 선택되는 0 내지 3개의 유전자의 mRNA 또는 이의 단백질의 수준을 측정하는 제제를 포함하는, B-ALL 진단 마커 검출용 키트에 관한 것이다.
B-ALL 마커 검출용 RT-PCR 키트는 TCL1A와 CD19, INSR, OFD1, AKR1B1, CD79B 및 UHRF1 중에서 선택되는 0 내지 3개의 유전자에 대하여 특이적인 각각의 프라이머 쌍을 포함한다. 또한 RRAGB 및/또는 DCK 유전자에 대하여 특이적인 프라이머 쌍을 포함할 수 있다.
B-ALL 마커 검출용 DNA 칩 키트는 TCL1A와 CD19, INSR, OFD1, AKR1B1, CD79B 및 UHRF1중에서 선택되는 0 내지 3개의 유전자 또는 그의 단편에 해당하는 cDNA가 있는 기판을 포함한다. 또한 RRAGB 및/또는 DCK 유전자 또는 그의 단편에 해당하는 cDNA 또는 올리고뉴클레오티드를 기판에 부착 및 고정할 수 있다.
B-ALL 마커 검출용 ELISA 키트는 TCL1A와 CD19, INSR, OFD1, AKR1B1, CD79B 및 UHRF1 중에서 선택되는 0 내지 3개의 단백질에 대한 특이적인 항체를 포함한다. 또한 RRAGB 및/또는 DCK 단백질에 대하여 특이적인 항체를 포함할 수 있다.
또 다른 양태로서 본 발명은 TCF7와 TRB, TRGC2, NK4 및 CHC1L 중에서 선택되는 0 내지 3개의 유전자의 mRNA 또는 이의 단백질의 수준을 측정하는 제제를 포함하는, T-ALL 진단 마커 검출용 키트에 관한 것이다.
T-ALL 마커 검출용 RT-PCR 키트는 TCF7와 TRB, TRGC2, NK4 및 CHC1L 중에서 선택되는 0 내지 3개의 유전자에 대하여 특이적인 각각의 프라이머 쌍을 포함한다. 또한 RRAGB 및/또는 DCK 유전자에 대하여 특이적인 프라이머 쌍을 포함할 수 있다.
T-ALL 마커 검출용 DNA 칩 키트는 TCF7와 TRB, TRGC2, NK4 및 CHC1L 중에서 선택되는 유전자 또는 그의 단편에 해당하는 cDNA가 부착되어 있는 기판을 포함한 다. 또한 RRAGB 및/또는 DCK 유전자 또는 그의 단편에 해당하는 cDNA 또는 올리고뉴클레오티드를 기판에 부착 및 고정할 수 있다.
T-ALL 마커 검출용 ELISA 키트는 TCF7와 TRB, TRGC2, NK4 및 CHC1L 중에서 선택되는 0 내지 3개의 단백질에 대한 특이적인 항체를 포함한다. 또한 RRAGB 및/또는 DCK 단백질에 대하여 특이적인 항체를 포함할 수 있다.
또 다른 양태로서, 본 발명은 CITED2와 MGST1, BIN2, RAB32, ICAM-3, PXN, PPGB 및 TAF15 중에서 선택되는 0 내지 3개의 유전자; TCL1A와 CD19, INSR, OFD1, AKR1B1, CD79B 및 UHRF1 중에서 선택되는 0 내지 3개의 유전자; 및 TCF7와 TRB, TRGC2, NK4 및 CHC1L 중에서 선택되는 0 내지 3개의 유전자의 mRNA 또는 이의 단백질의 수준을 측정하는 제제를 포함하는, AML, B-ALL, 및 T-ALL을 구별하기 위한 진단 마커 검출용 키트에 관한 것이다.
AML, B-ALL, 및 T-ALL을 구별 검출용 RT-PCR 키트는 CITED2와 MGST1, BIN2, RAB32, ICAM-3, PXN, PPGB 및 TAF15 중에서 선택되는 0 내지 3개의 유전자; TCL1A와 CD19, INSR, OFD1, AKR1B1, CD79B 및 UHRF1 중에서 선택되는 0 내지 3개의 유전자; 및 TCF7와 TRB, TRGC2, NK4 및 CHC1L 중에서 선택되는 0 내지 3개의 유전자에 대하여 특이적인 각각의 프라이머 쌍을 포함한다.
AML, B-ALL, 및 T-ALL을 구별 검출용 DNA 칩 키트는 CITED2와 MGST1, BIN2, RAB32, ICAM-3, PXN, PPGB 및 TAF15 중에서 선택되는 0 내지 3개의 유전자; TCL1A와 CD19, INSR, OFD1, AKR1B1, CD79B 및 UHRF1 중에서 선택되는 0 내지 3개의 유전 자; 및 TCF7와 TRB, TRGC2, NK4 및 CHC1L 중에서 선택되는 0 내지 3개의 유전자 또는 그의 단편에 해당하는 cDNA가 부착되어 있는 기판을 포함한다.
AML, B-ALL, 및 T-ALL을 구별 검출용 ELISA 키트는 CITED2와 MGST1, BIN2, RAB32, ICAM-3, PXN, PPGB 및 TAF15 중에서 선택되는 0 내지 3개의 단백질; TCL1A와 CD19, INSR, OFD1, AKR1B1, CD79B 및 UHRF1 중에서 선택되는 0 내지 3개의 단백질; 및 TCF7와 TRB, TRGC2, NK4 및 CHC1L 중에서 선택되는 0 내지 3개의 단백질에 대한 특이적인 항체를 포함한다.
또 다른 양태로서, 본 발명은 CITED2와 MGST1, BIN2, RAB32, ICAM-3, PXN, PPGB 및 TAF15 중에서 선택되는 0 내지 3개의 유전자에 대해 특이적인 프라이머 쌍을 포함하는, AML 진단 마커 검출용 조성물에 관한 것이다.
본 발명의 "프라이머"는 짧은 자유 3말단 수산화기(free 3' hydroxyl group)를 가지는 핵산 서열로 상보적인 템플레이트와 염기쌍(base pair)을 형성할 수 있고 템플레이트 가닥 복사를 위한 시작 지점으로 기능을 하는 짧은 핵산 서열을 의미한다. 프라이머는 적절한 완충용액 및 온도에서 중합반응(즉, DNA 폴리머레이즈 또는 역전사효소)을 위한 시약 및 상이한 4가지 뉴클레오사이드 트리포스페이트의 존재하에서 DNA 합성이 개시할 수 있다. 본 발명의 프라이머는, 각 마커 유전자 특이적인 프라이머로 7개 내지 50개의 뉴클레오타이드 서열을 가진 센스 및 안티센스 핵산이다. 프라이머는 DNA 합성의 개시점으로 작용하는 프라이머의 기본 성질을 변화시키지 않는 추가의 특징을 혼입할 수 있다.
본 발명의 프라이머는 포스포르아미다이트 고체 지지체 방법, 또는 기타 널리 공지된 방법을 사용하여 화학적으로 합성할 수 있다. 이러한 핵산 서열은 또한 당해 분야에 공지된 많은 수단을 이용하여 변형시킬 수 있다. 이러한 변형의 비-제한적인 예로는 메틸화, "캡화", 천연 뉴클레오타이드 하나 이상의 동족체로의 치환, 및 뉴클레오타이드 간의 변형, 예를 들면, 하전되지 않은 연결체(예: 메틸 포스포네이트, 포스포트리에스테르, 포스포로아미데이트, 카바메이트 등) 또는 하전된 연결체(예: 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트 등)로의 변형이 있다. 핵산은 하나 이상의 부가적인 공유 결합된 잔기, 예를 들면, 단백질(예: 뉴클레아제, 독소, 항체, 시그날 펩타이드, 폴리-L-리신 등), 삽입제(예: 아크리딘, 프소랄렌 등), 킬레이트화제(예: 금속, 방사성 금속, 철, 산화성 금속 등), 및 알킬화제를 함유할 수 있다. 본 발명의 핵산 서열은 또한 검출 가능한 시그날을 직접적으로 또는 간접적으로 제공할 수 있는 표지를 이용하여 변형시킬 수 있다. 표지의 예로는 방사성 동위원소, 형광성 분자, 바이오틴 등이 있다.
AML 진단 마커 검출용 조성물은 바람직하게는, CITED2와 MGST1 진단 마커 검출용 조성물이고, CITED2를 증폭하기 위한 서열번호 1 및 2, MGST1을 증폭하기 위한 서열번호 3 및 4에 해당하는 각각의 프라이머 쌍을 포함한다. 또한 대조군 유전자 RRAGB를 증폭하기 위한 서열번호 13 및 14, DCK를 증폭하기 위한 서열번호 15 및 16을 추가로 포함할 수 있다.
또 다른 양태로서, 본 발명은 CITED2와 MGST1, BIN2, RAB32, ICAM-3, PXN, PPGB 및 TAF15 중에서 선택되는 0 내지 3개의 단백질에 특이적인 항체를 포함하는, AML 진단 마커 검출용 조성물에 관한 것이다.
본 발명에서, “항체”란 항원성 부위에 대해서 지시되는 특이적인 단백질 분자를 의미한다. 본 발명의 목적상, 항체는 마커 단백질에 대해 특이적으로 결합하는 항체를 의미하며, 다클론 항체, 단클론 항체 및 재조합 항체를 모두 포함한다.
상기한 바와 같이 AML 마커 단백질이 규명되었으므로 이를 이용하여 항체를 생성하는 것은 당업계에 널리 공지된 기술을 이용하여 용이하게 제조할 수 있다.
다클론 항체는 상기한 AML 마커 단백질 항원을 동물에 주사하고 동물로부터 채혈하여 항체를 포함하는 혈청을 수득하는 당업계에 널리 공지된 방법에 의해 생산할 수 있다. 이러한 다클론 항체는 염소, 토끼, 양, 원숭이, 말, 돼지, 소 개 등의 임의의 동물 종 숙주로부터 제조 가능하다.
단클론 항체는 당업계에 널리 공지된 하이브리도마 방법(hybridoma method)(Kohler 및 Milstein (1976) European Jounral of Immunology 6:511-519 참조), 또는 파지 항체 라이브러리(Clackson et al, Nature, 352:624-628, 1991; Marks et al, J. Mol. Biol., 222:58, 1-597, 1991) 기술을 이용하여 제조될 수 있다.
하이브리도마 방법은 AML 진단 마커 단백질 항원을 주사한 마우스와 같은 면역학적으로 적합한 숙주 동물로부터의 세포를 이용하고, 나머지 하나의 집단으로는 암 또는 골수종 세포주를 이용한다. 이러한 두 집단의 세포들을 폴리에틸렌글리콜 과 같은 당업계에 널리 공지된 방법에 의해 융합시키고 나서 항체-생산 세포를 표준적인 조직 배양 방법에 의해 증식시킨다. 한계 희석법(limited dilution technique)에 의한 서브클로닝에 의해 균일한 세포 집단을 수득한 후, AML 진단오염 마커 단백질에 대해 특이적인 항체를 생산할 수 있는 하이브리도마를 표준 기술에 따라 시험관내에서 또는 생체내에서 대량으로 배양한다. 상기한 하이브리도마가 생산하는 단클론 항체는 정제하지 않고 사용할 수도 있으나, 최선의 결과를 얻기 위해서는 당업계에 널리 공지된 방법에 따라 고순도로 정제하여 사용하는 것이 바람직하다.
파지 항체 라이브러리 방법은 세포내에 존재하는, 다양한 AML 마커에 대한항체 유전자(Single chain fragmentvariable, scFv형태)를 획득하여 이를 파아지의 표면에 융합 단백질 형태로 발현함으로서 항체 라이브러리를 시험관 내에서 제작하고, 이 라이브러리로부터 AML 단백질과 결합하는 단클론 항체를 분리, 제작하는 방법이다.
상기 방법으로 제조된 항체는 겔 전기영동, 투석, 염 침전, 이온교환 크로마토그래피, 친화성 크로마토그래피 등의 방법을 이용하여 분리한다.
또한 본 발명의 항체는 2개의 전체 길이의 경쇄 및 2개의 전체 길이의 중쇄를 가지는 완전한 형태뿐만 아니라, 항체 분자의 기능적인 단편을 포함한다. 항체 분자의 기능적인 단편이란 적어도 항원 결합 기능을 보유하고 있는 단편을 뜻하며, Fab, F(ab'), F(ab') 2 및 Fv 등이 있다.
AML 진단 마커 검출용 조성물은 바람직하게는, CITED2와 MGST1 진단 마커 검 출용 조성물이고, CITED2 특이적 항체, MGST1 특이적 항체를 포함한다. 또한 대조군 유전자 RRAGB에 특이적 항체, DCK에 특이적 항체를 추가로 포함할 수 있다.
또 다른 양태로서, 본 발명은 TCL1A와 CD19, INSR, OFD1, AKR1B1, CD79B 및 UHRF1 중에서 선택되는 0 내지 3개의 유전자에 특이적인 프라이머 쌍을 포함하는, B-ALL 진단 마커 검출용 조성물에 관한 것이다.
B-ALL 진단 마커 검출용 조성물은 바람직하게는, TCL1A와 CD19 진단 마커 검출용 조성물이고, TCL1A를 증폭하기 위한 서열번호 5 및 6, CD19를 증폭하기 위한 서열번호 7 및 8에 해당하는 각각의 프라이머 쌍을 포함한다. 또한 대조군 유전자 RRAGB를 증폭하기 위한 서열번호 13 및 14, DCK를 증폭하기 위한 서열번호 15 및 16을 추가로 포함할 수 있다.
또 다른 양태로서, 본 발명은 TCL1A와 CD19, INSR, OFD1, AKR1B1, CD79B 및 UHRF1 중에서 선택되는 0 내지 3개의 단백질에 특이적인 항체를 포함하는, B-ALL 진단 마커 검출용 조성물에 관한 것이다.
B-ALL 진단 마커 검출용 조성물은 바람직하게는, TCL1A와 CD19 진단 마커 검출용 조성물이고, TCL1A 특이적 항체, CD19 특이적 항체를 포함한다. 또한 대조군 유전자 RRAGB에 특이적 항체, DCK에 특이적 항체를 추가로 포함할 수 있다.
또 다른 양태로서, 본 발명은 TCF7와 TRB, TRGC2, NK4 및 CHC1L 중에서 선택 되는 0 내지 3개의 유전자에 특이적인 프라이머 쌍을 포함하는, T-ALL 진단 마커 검출용 조성물에 관한 것이다.
T-ALL 진단 마커 검출용 조성물은 바람직하게는 TCF7와 TRB 진단 마커 검출용 조성물이고, TCF7를 증폭하기 위한 서열번호 9 및 10, TRB를 증폭하기 위한 서열번호 11 및 12에 해당하는 각각의 프라이머 쌍을 포함한다. 또한 대조군 유전자 RRAGB를 증폭하기 위한 서열번호 13 및 14, DCK를 증폭하기 위한 서열번호 15 및 16을 추가로 포함할 수 있다.
또 다른 양태로서, 본 발명은 TCF7와 TRB, TRGC2, NK4 및 CHC1L 중에서 선택되는 0 내지 3개의 단백질에 특이적인 항체를 포함하는, T-ALL 진단 마커 검출용 조성물에 관한 것이다.
T-ALL 진단 마커 검출용 조성물은 바람직하게는, TCF7와 TRB 진단 마커 검출용 조성물이고, TCF7 특이적 항체, TRB 특이적 항체를 포함한다. 또한 대조군 유전자 RRAGB에 특이적 항체, DCK에 특이적 항체를 추가로 포함할 수 있다.
또 다른 양태로서, 본 발명은 CITED2와 MGST1, BIN2, RAB32, ICAM-3, PXN, PPGB 및 TAF15 중에서 선택되는 0 내지 3개의 유전자; TCL1A와 CD19, INSR, OFD1, AKR1B1, CD79B 및 UHRF1 중에서 선택되는 0 내지 3개의 유전자; 및 TCF7와 TRB, TRGC2, NK4 및 CHC1L 중에서 선택되는 0 내지 3개의 유전자에 특이적인 프라이머 쌍을 포함하는, AML, B-ALL 및 T-ALL 진단 마커의 구별 검출용 조성물에 관한 것 이다.
바람직하게는, CITED2와 MGST1 유전자; TCL1A와 CD19의 유전자; 및 TCF7와 TRB의 유전자에 특이적인 프라이머 쌍을 포함하는 조성물이고, CITED2를 증폭하기 위한 프라이머쌍은, 서열번호 1 및 2; MGST1을 증폭하기 위한 프라이머쌍은, 서열번호 3 및 4; TCL1A을 증폭하기 위한 프라이머쌍은, 서열번호 5 및 6; CD19을 증폭하기 위한 프라이머쌍은, 서열번호 7 및 8; TCF7를 증폭하기 위한 프라이머쌍은, 서열번호 9 및 10; TRB를 증폭하기 위한 프라이머쌍은, 서열번호 11 및 12이다. 또한 대조군 유전자 RRAGB를 증폭하기 위한 서열번호 13 및 14, DCK를 증폭하기 위한 서열번호 15 및 16을 추가로 포함할 수 있다.
또 다른 양태로서, 본 발명은 CITED2와 MGST1, BIN2, RAB32, ICAM-3, PXN, PPGB 및 TAF15 중에서 선택되는 0 내지 3개의 단백질; TCL1A와 CD19, INSR, OFD1, AKR1B1, CD79B 및 UHRF1 중에서 선택되는 0 내지 3개의 단백질; 및 TCF7와 TRB, TRGC2, NK4 및 CHC1L 중에서 선택되는 0 내지 3개의 단백질에 특이적인 항체를 포함하는, AML, B-ALL 및 T-ALL 진단 마커의 구별 검출용 조성물에 관한 것이다.
바람직하게는 CITED2와 MGST1 단백질; TCL1A와 CD19의 단백질; 및 TCF7와 TRB의 단백질에 특이적인 항체를 포함하는 조성물이다.
이하 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예 에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1 - DNA chip 기술을 이용한 AML 및 ALL 환자의 골수 세포의 유전자 발현 조사
<1-1> 골수세포의 RNA 분리
본 발명자들은 82명의 AML 환자 및 23명의 B-ALL 및 2명의 T-ALL 환자의 골수 시료에서 RNA를 분리하여 실험에 이용하였다. 보관된 골수 시료에서 RNA를 분리하기 위하여 1 ml의 골수 시료에 5ml의 TriZol 시약 (InVitrogen, Cat. No. 15596-018)을 첨가하여 조직 호모게네이저로 1분간 세포를 파괴시켰다. 이후의 RNA 분리 과정은 TriZol 시약의 제조사에서 제공한 실험 방법에 따라 진행하였다. RNA를 분리한 후 순도를 더 높이기 위하여 RNeasy kit (Qiagen, Cat. No. 74106)을 이용하여 제조사에서 제공한 실험 방법에 따라 RNA를 추가 정제하였다.
<1-2> 분리된 RNA의 정량 분석
분리된 RNA는 스펙트로포토미터(spectrophotometer)를 이용하여 260nm의 파장에서 흡광도를 측정하여 RNA를 정량하였다.
<1-3> Reference RNA의 제조
DNA 칩과 하이브리드화 시 골수 세포에서 분리된 RNA와 함께 하이브리드화하는 참조 RNA는 혈액세포에서 기인한 세포주에서 RNA를 분리하여 사용하였다. 참조 RNA를 제조하기 위하여 HL-60, K-562, CCRF-CEM, CCRF-HSB-2, CEM-CM3, Molt-4, THP-1의 일곱 가지의 세포주(한국세포주은행 (http;//cellbank.snu.ac.kr)에서 구입)에서 <1-1>과 같은 방법으로 RNA를 분리하였다. 분리된 RNA는 <1-2>와 같은 방법으로 정량한 후 동량을 섞어서 참조 RNA로 사용하였다.
<1-4> 실험에 사용된 DNA 칩
DNA 칩은 15,972개의 cDNA 프로브를 포함하는 16K 인간 cDNA 칩(16K human cDNA chip)을 이용하였다(Vivian G. Cheung et al., Nature Genetics, Making and reading microarrays, 1999 Jan 21: 15-19; Microarray Biochip Technology, Mark Schena, 2000, Eaton Publishing). 간단히 제작 과정을 설명하면 다음과 같다. cDNA가 클로닝되어 있는 플라스미드를 포함하는 박테리아 스톡으로부터 플라스미드를 분리하고, 분리된 플라스미드를 주형으로 하여PCR을 수행하여 증폭하였다. 증폭된 cDNA는 프로브로 사용하기 위해, PCR 클린-업 키트(clean-up kit)를 이용하여 불순물을 제거하였다. 정제된 cDNA를 50% DMSO가 포함된 스폿팅 용액에 100 내지 200 ng/μl의 농도로 녹여서 GAPS II 슬라이드(Corning, Cat. No. 40006)에 스폿팅한 후, 적당량의 자외선을 조사하여 고정시켜 본 발명의 16K 인간 cDNA 칩을 제조하였다.
<1-5> DNA 칩 실험 및 유전자 발현 정량
10μg의 골수 시료에서 분리된 RNA와 참조 시료 RNA를 아미노알릴-dUTP 존재 하에 역전사하여 cDNA를 제조한 후, 각각 모노에스테르-Cy5와 모노에스테르-Cy3와 반응시켜 Cy5와 Cy3를 표지하였다. 표지된 시료는 PCR 클린-업 키트를 이용하여 정제한 후, DNA 칩에 16시간 이상 하이브리드화하였다. 하이브리드화 후 비특이적 하이브리드화를 제거하기 위하여 SSC를 포함하는 세척 용액을 이용하여 DNA 칩을 세척하였다. 세척된 DNA 칩은 공촛점(confocal) 레이저 스캐너(Perkin Elmer, Scanarray Lite)를 이용하여 스캐닝하여 각 스팟에 존재하는 형광의 데이터를 얻어서 TIFF 형태의 이미지 파일로 저장하였다. TIFF 이미지 파일을 GenePix 3.0 (Axon Instruments)으로 정량하여 각 스팟의 형광값을 정량하였다. GenePix 3.0에서 얻어진 정량 결과는 Yang 등 (Nucleic Acids Res 2002, 30:e15)이 제안한 방법에 의해, S-plus 통계 패키지 (InSightful)에서 제공하는 'lowess' 기능을 이용하여 보정하였다.
실시예 2 - DNA 칩 결과로부터 AML, B-ALL, T-ALL에서 발현이 차이나는 유전자의 선별 및 대조군 유전자의 선별
사용된 DNA 칩에 존재하는 15,972개의 프로브에 대하여, AML 시료와 B-ALL, T-ALL 시료 사이에 발현이 차이가 나는 유전자를 p<10-6의 유의 수준에서 t-test로 선별하였다. 이 경우 15,972번의 t-test를 반복하게 되므로, p<10-6의 유의수준에서는 0.02번의 거짓 양성(false postivie)이 발현될 것으로 예상되므로, 선별된 유전자는 모두 실제로 발현이 차이나는 유전자이다. t-test 결과 268개의 유전자가 AML, B-ALL, T-ALL에서 발현이 차이나는 것으로 선별되었다.
RT-PCR을 이용한 AML, B-ALL, T-ALL의 진단을 위한 유전자를 선별하기 위하여, t-test에서 얻어진 p 값과 AML, B-ALL, T-ALL 시료의 발현 수준의 차이를 함께 고려하여 AML, B-ALL, T-ALL에서 높게 발현되는 유전자 10개 이내로 선별하였다(표 1, 표 2 및 표 3).
Figure 112004062527314-pat00001
Figure 112004062527314-pat00002
Figure 112005026480863-pat00013
또한, 시료의 종류에 관계없이 일정한 수준으로 발현되는 유전자를 선별하기 위하여, 전체 시료에서 각각의 유전자 발현의 분산을 구하고, 분산이 가장 작은 7개의 유전자를 선별하였다(표 4).
Figure 112004062527314-pat00004
실시예 3 - RT-PCR을 이용한 B-ALL, T-ALL, AML 특이적 진단 마커 유전자 및 대조군 유전자의 선별
<실시예 2>에서 선별된 진단 마커 후보유전자의 발현 차이를 이용하여 실제로 AML과 ALL을 구분할 수 있는지 조사하기 위하여, 4개의 AML 시료와 2개의 T-ALL 시료, 2개의 B-ALL 시료에서 RT-PCR로 유전자 발현을 조사하였다. RT-PCR 반응은 다음과 같은 방법으로 수행하였다. 5μg의 RNA 시료를 취하여 20μl 반응부피에서 역전사시키고, 증류수를 첨가하여 100μl로 희석하였다. 희석된 역전사 산물을 2μl 취하여 주형으로 이용하고, 8개의 마커 유전자에 특이적인 프라이머 쌍 존재 하에 25μl 반응 부피에서 25회의 PCR 반응을 수행하였다. PCR 반응 산물 중 8μl를 취하여 0.5μg/ml의 에티듐 브로마이드 존재하에 2% 아가로즈 젤에서 전기영동하여 밴드를 관찰하였다. 유전자 중에서 가장 AML, B-ALL, TLL 특이적인 유전자 및 모든 시료에서 일정한 수준으로 발현되는 2개의 대조군 유전자를 선별하였다. 도 1은 선정된 8개의 유전자의 RT-PCR 결과를 나타낸 것이다.
실시예 4 - 57개의 급성 백혈병 골수 세포에서 8개의 진단 마커 유전자를 이용한 AML 및 ALL의 진단
실시예 3에서 선정된 8개의 진단용 유전자의 발현을 추가적인 41개의 AML 시료와 16개의 ALL 시료에서 조사하였다. 급성 백혈병은 특징적인 염색체 변이를 갖고 있는 것으로 알려져 있다. 예를 들면 AML은 t(8;21), t(15;17), inv(16) 등의 염색체 변이가 가장 빈번하게 나타나며, ALL은 t(9;22)의 염색체 변이를 갖는 경우 예후가 좋지 않은 것으로 알려져 있다. <실시예 4>에서 선별된 진단 마커 유전자들이 상기와 같은 여러 가지 염색체 변이를 갖는 급성 백혈병에서 적용이 가능한지 조사하기 위해 여러 가지 염색체 변이를 갖는 시료들에서 8개의 진단 마커 유전자의 발현을 조사하였다. 도 2는 정상적인 염색체를 갖는 AML 시료에서, 도 3은 t(15;17) 염색체 변이를 갖는 AML 시료에서, 도 4는 t(8;21)의 염색체 변이를 갖는 AML 시료에서, 도 5는 정상적인 염색체를 갖는 B-ALL 시료에서, 도 6은 t(9;22) 염색체 변이를 갖는 B-ALL 시료에서, 도 7은 T-ALL 시료에서 8개의 진단 마커 유전자의 발현을 조사한 것이다.
종합적으로 39개의 AML 시료 중 38개의 시료는 AML 특이적인 진단 마커 유전자를 하나 이상 발현하였으며, ALL 특이적인 마커 유전자는 발현하지 않았다. 한개의 AML 시료는 AML 마커 뿐만 아니라 ALL 마커 유전자를 발현하였다. 또한, 16개의 ALL 시료 중 15개의 시료는 ALL 특이적인 진단 마커 유전자를 하나이상 발현하였으며, AML 특이적인 마커 유전자는 발현하지 않았다. 한개의 ALL 시료는 ALL 마커 뿐만 아니라 AML 마커도 발현하였다. 55개의 급성 백혈병 시료는 모두 하나 이상의 대조군 유전자를 발현하였다. 이러한 결과는 <실시예 4>에서 발굴한 8개의 마커 유전자의 발현을 확인함으로써 AML, B-ALL, T-ALL의 구별이 가능하다는 것을 보여준다.
상기 결과에서 39개의 AML 시료 중 38개를 정확하게 진단할 수 있었으며, 16개의 ALL 시료 중 15개를 정확하게 진단할 수 있어서 본 진단의 민감도는 AML 진단에 대하여 97.4%, ALL 진단에 대하여 93.8%, 전체적으로 96.4%로 계산되었다. 또한 16개의 AML이 아닌 시료 중 15개를 AML이 아니라고 진단할 수 있었으며, 39개의 ALL이 아닌 시료 중 38개를 ALL이 아니라고 진단할 수 있어서 특이도는 AML 진단에 있어서 93.8%, ALL 진단에 있어서 96.4%, 전체적으로 96.4%로 계산되었다 (표 5).
Figure 112004062527314-pat00005
본 발명의 백혈병 진단 마커의 mRNA 또는 단백질의 발현 수준을 검출하여 AML, B-ALL 및 T-ALL을 구별하는 방법을 통하여 급성 백혈병 타입을 정확하고 간편하게 진단할 수 있다.

서열목록 전자파일 첨부

Claims (19)

  1. (i) CITED2; 또는 (ii) CITED2와 MGST1, BIN2, RAB32, ICAM-3, PXN, PPGB 및 TAF15 중에서 선택되는 1 내지 3개의 유전자에 특이적인 프라이머 쌍을 포함하는, AML 진단 마커 검출용 키트.
  2. 제1항에 있어서, CITED2와 MGST1 유전자에 특이적인 프라이머 쌍을 포함하는 키트.
  3. (i) TCL1A; 또는 (ii) TCL1A와 CD19, INSR, OFD1, AKR1B1, CD79B 및 UHRF1 중에서 선택되는 1 내지 3개의 유전자에 특이적인 프라이머 쌍을 포함하는 , B-ALL 진단 마커 검출용 키트.
  4. 제3항에 있어서, TCL1A와 CD19의 유전자에 특이적인 프라이머 쌍을 포함하는 키트.
  5. (i) CITED2; 또는 (ii) CITED2와 MGST1, BIN2, RAB32, ICAM-3, PXN, PPGB 및 TAF15 중에서 선택되는 1 내지 3개의 유전자에 특이적인 프라이머 쌍;
    (i) TCL1A; 또는 (ii) TCL1A와 CD19, INSR, OFD1, AKR1B1, CD79B 및 UHRF1 중에서 선택되는 1 내지 3개의 유전자에 특이적인 프라이머 쌍; 및
    (i) TCF7; 또는 (ii) TCF7과 TRB, TRGC2, NK4 및 CHC1L 중에서 선택되는 1 내지 3개의 유전자에 특이적인 프라이머 쌍을 포함하는, 유전자 발현양의 증가로 AML, B-ALL 및 T-ALL을 구별하기 위한 진단 마커 검출용 키트.
  6. 제5항에 있어서, CITED2와 MGST1; TCL1A와 CD19; 및 TCF7와 TRB의 유전자에 특이적인 프라이머 쌍을 포함하는 키트.
  7. 제1항, 제3항 및 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 검출용 키트는 DNA 칩 또는 RT-PCR 키트.
  8. (i) CITED2; 또는 (ii) CITED2와 MGST1, BIN2, RAB32, ICAM-3, PXN, PPGB 및 TAF15 중에서 선택되는 1 내지 3개의 유전자에 대해 특이적인 프라이머 쌍을 포함하는, AML 진단 마커 검출용 조성물.
  9. 제8항에 있어서, CITED2와 MGST1 유전자에 대해 특이적인 프라이머 쌍을 포함하는 조성물.
  10. 삭제
  11. 삭제
  12. (i) TCL1A; 또는 (ii) TCL1A와 CD19, INSR, OFD1, AKR1B1, CD79B 및 UHRF1 중에서 선택되는 1 내지 3개의 유전자에 특이적인 프라이머 쌍을 포함하는, B-ALL 진단 마커 검출용 조성물.
  13. 제12항에 있어서, TCL1A와 CD19의 유전자에 특이적인 프라이머 쌍을 포함하는 조성물.
  14. 삭제
  15. 삭제
  16. (i) CITED2; 또는 (ii) CITED2와 MGST1, BIN2, RAB32, ICAM-3, PXN, PPGB 및 TAF15 중에서 선택되는 1 내지 3개의 유전자에 특이적인 프라이머 쌍;
    (i) TCL1A와 (ii) TCL1A와 CD19, INSR, OFD1, AKR1B1, CD79B 및 UHRF1 중에서 선택되는 1 내지 3개의 유전자에 특이적인 프라이머 쌍; 및
    (i) TCF7와 (ii) TCF7과 TRB, TRGC2, NK4 및 CHC1L 중에서 선택되는 1 내지 3개의 유전자에 특이적인 프라이머 쌍을 포함하는, 유전자 발현양의 증가로 AML, B-ALL 및 T-ALL 을 구별하기 위한 진단 마커 검출용 조성물.
  17. 제16항에 있어서, CITED2와 MGST1; TCL1A와 CD19; 및 TCF7와 TRB의 유전자에 특이적인 프라이머 쌍을 포함하는 조성물.
  18. 삭제
  19. 삭제
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