KR20180039631A - 염색체 상호작용 부위를 이용하는 검출 방법 - Google Patents

염색체 상호작용 부위를 이용하는 검출 방법 Download PDF

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이완 헌터
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Abstract

본원은 게놈의 후성유전적 활성 영역을 분석하는 방법을 제공한다.

Description

염색체 상호작용 부위를 이용하는 검출 방법
본 발명은 게놈의 후성유전적 활성 영역에서 염색체 상호작용을 검출하는 것에 관한 것이다.
염색체 상호작용은 점점 더 게놈의 조절에 있어서 중요하고 질환 원인과 관련된 것으로 여겨지고 있다.
본 발명자들은 염색체 상호작용이 질환과 관련되어 있는 게놈의 영역을 확인하였다. 이 핵심 영역은 신체 및 세포 과정에서 중요한 역할을 수행한다. 본 발명에 의해 제공된 신규 방법과 함께 본 발명자들에 의해 확인된 영역은 영역에서의 염색체 상태를 기초로 개체들을, 상이한 특징을 갖는 서브그룹들로 형별(typing)할 수 있게 한다. 본 발명자들은 질환과 연관된 염색체 상호작용이 서브그룹들 사이의 많은 상이한 질환 및 비질환 특징들을 정의하는 데 있어서 핵심 역할을 수행하다고 생각한다.
본 발명은 서브그룹들을 구별하는 동반 후성유전자 검사와 관련된 후성유전적 염색체 상호작용을 확인하는 방법으로서, 상기 서브그룹들로부터의 제1 세트의 핵산을, 염색체 상호작용의 지표 집단을 나타내는 제2 세트의 핵산과 접촉시키는 단계, 및 상보성 서열들이 하이브리드화할 수 있게 하는 단계를 포함하는 방법을 제공하고, 이 때 제1 및 제2 핵산 세트의 핵산은 후성유전적 염색체 상호작용에 있어서 회합하는 양 염색체 영역들로부터의 서열들을 포함하는 결찰된 생성물을 나타내고, 제1 세트의 핵산과 제2 세트의 핵산 사이의 하이브리드화 패턴은, 어느 후성유전적 염색체 상호작용이 집단 내의 서브그룹에 특이적인지를 확인할 수 있게 하며, 서브그룹은 동반 후성유전자 검사와 관련된 특징에 있어서 상이하고, 경우에 따라, 상기 염색체 상호작용은 게놈의 소정의 질환과 연관된 영역 내에 존재한다.
본 발명은 개인이 어느 서브그룹 내에 있는지를 확인하는 동반 후성유전자 검사를 수행하는 방법으로서,
(a) 상기 방법에 의해 확인된 좌위를, 서브그룹에 특징적인 후성유전적 상호작용을 갖는 것으로서 형별하는 단계, 및/또는
(b) 상기 방법에 의해 확인된 염색체 상호작용을 서브그룹과 관련되어 있거나, 서브그룹과 연관되어 있거나 서브그룹의 특징인 것으로서 형별하는 단계, 및/또는
(c) (i) 특정 치료 및/또는 예방(특히 특정 의약 치료 및/또는 예방)에 대한 반응, 및/또는
(ii) 특정 병태에 대한 소인, 및/또는
(iii) 재발로 이어질 수 있는 잔존 질환의 존재, 및/또는
(iv) 환경적 변화에 대한 반응성, 및/또는
(v) 유전적 변화에 대한 반응, 및/또는
(vi) 대사계, 면역계, 내분비계, 소화기계, 피부계, 골격계, 근육계, 림프계, 호흡기계, 신경계 또는 생식기계의 상태에 있어서의 변화 또는 차이
에 대한 특징인 적어도 5개의 후성유전적 염색체 상호작용의 존재 또는 부재를 바람직하게는 적어도 5개의 상이한 좌위에서 검출하는 단계
를 포함하는 방법도 제공하고, 경우에 따라 상기 방법은 서브그룹을 정의하는 특징과 관련된 의학적 또는 비의학적 치료를 위해 개체를 선택하기 위해 수행되고, 상기 치료는 경우에 따라 영역과 연관되어 있는 질환과 무관하다.
바람직한 실시양태에서, 본 발명은 집단 내의 상이한 서브그룹을 나타내는 염색체 상태를 검출하는 방법으로서, 염색체 상호작용이 게놈의 소정의 질환과 연관된 영역 내에 존재하거나 부재하는지를 확인하는 단계를 포함하는 방법을 제공하고, 이 때 상기 질환은 대사계, 면역계, 내분비계, 소화기계, 피부계, 골격계, 근육계, 림프계, 호흡계, 신경계 또는 생식기계의 질환이고, 상기 염색체 상호작용은 상이한 상태의 염색체를 갖는 서브그룹으로부터의 제1 세트의 핵산을 제2 세트의 지표 핵산과 접촉시키는 단계, 및 상보성 서열들이 하이브리드화할 수 있게 하는 단계를 포함하는, 어느 염색체 상호작용이 집단의 상이한 서브그룹에 상응하는 염색체 상태와 관련되어 있는지를 확인하는 방법에 의해 경우에 따라 확인되고, 제1 세트의 핵산 및 제2 세트의 핵산에서 핵산은 염색체 상호작용에 있어서 회합하는 양 염색체 영역들로부터의 서열들을 포함하는 결찰된 생성물을 나타내고, 제1 세트의 핵산과 제2 세트의 핵산 사이의 하이브리드화 패턴은 어느 염색체 상호작용이 특정 염색체 상태에 대해 집단 내의 특정 서브그룹에 특이적인지를 확인할 수 있게 한다.
도 1은 3C 추출 방법의 개략도이다. 3C는 염색질 입체구조 포획, 또는 염색체 입체구조 포획을 의미한다.
도 2는 EpiSwitch™ 분석, 및 후성유전적 계층화 바이오마커 시그너처의 탐색 및 검증을 위한 디자인을 보여주는 도면이다[특정 질환/병태에 대한 특정 약물 치료에 대한 반응자(R) 또는 비반응자(NR)인 환자]. 후성유전적 계층화는 EpiSwitch™ 어레이 및 PCR(중합효소 연쇄 반응) 플랫폼에 의해 스크리닝되고 모니터링된 조건부 염색체 확인에 기초한다. 확인된 바이오마커의 질환 특이적 후성유전적 성질은 건강한 대조군(HC)에 대한 계층화에 의해 확인될 수 있다. 추가 환자 및 추가 HC에 대한 검증을 수행할 수 있다.
도 3 내지 18은 하나 초과의 병태에 공통된 유전자 및 마커에 대한 벤(Venn) 도표를 보여준다.
본 발명은 특히
- 집단의 상이한 서브그룹과 관련된 염색체 상호작용을 확인하는 방법;
- 특정 특징을 갖는 서브그룹을 선택하는 방법, 및/또는 개체의 서브그룹을 확인하는 방법;
- 약물(예를 들면, 의약 치료제)의 효과를 확인하는 방법으로서, 상기 약물에 의해 유발된 후성유전적 염색체 상호작용의 변화를 검출하는 단계를 포함하는 방법; 및/또는
- 한 좌위에서의 유전자 변형이 다른 좌위에서의 염색체 상호작용에 미치는 효과를 확인하는 방법; 및/또는
- 다른 핵산과 라이브러리의 형태로 존재할 수 있는 핵산
을 포함하는 여러 상이한 양태들을 갖는다.
질환과 연관된 영역
본 발명은 질환과 연관된 영역 또는 후성유전적 활성 영역에서의 염색체 상호작용의 형별에 관한 것이다. 이러한 영역에서 질환, 예컨대, 본원에서 언급된 질환 상태들 중 임의의 질환 상태의 양태에 영향을 미치는 염색체 상호작용이 일어날 것이다. 염색체 상호작용은 질환에 대한 감수성, 요법에 대한 반응성 또는 재발 가능성에 영향을 미칠 수 있다. 특정 염색체 상호작용, 유전자 및 영역은 특정 질환 특징의 언급과 함께 본 명세서의 표에 개시되어 있다. 한 실시양태에서, 그 표에 대해 본원에서 제공된 질환 특징과 상이한 특징, 예컨대, 비질환 특징, 또는 상이한 질환 또는 동일한 질환의 상이한 양상의 특징을 검출하기 위해 염색체 상호작용, 또는 유전자 및 영역 내에서의 염색체 상호작용을 형별할 수 있다.
형별되는 염색체 상호작용은 (코딩 서열을 포함하는) 유전자와 이의 조절 영역, 예컨대, 프로모터 사이에 일어나는 염색체 상호작용일 수 있거나 이러한 염색체 상호작용이 아닐 수 있다. 형별되는 염색체 상호작용은 유전자 영역의 유전된, 예를 들면, 유전된 각인된 특징인 염색체 상호작용일 수 있거나 이러한 염색체 상호작용이 아닐 수 있다.
후성유전적 상호작용
본원에서 사용될 때, 용어 '후성유전적' 상호작용은 전형적으로 염색체 상의 좌위의 원위 영역들 사이의 상호작용을 지칭하고, 상기 상호작용은 동적이고 염색체의 영역의 상태에 따라 변경되거나, 형성되거나 파괴된다.
본 발명의 특정 방법에서, 염색체 상호작용은 먼저 상호작용의 부분인 염색체의 양 영역들로부터의 서열을 포함하는 결찰된 핵산을 생성함으로써 검출된다. 이러한 방법에서, 상기 영역들은 임의의 적합한 수단에 의해 가교결합될 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 상호작용은 포름알데하이드를 사용함으로써 가교결합되나, 임의의 알데하이드, 또는 D-바이오티노일-e-아미노카프로산-N-하이드록시석신이미드 에스테르 또는 디곡시게닌-3-O-메틸카보닐-e-아미노카프로산-N-하이드록시석신이미드 에스테르에 의해 가교결합될 수도 있다. 파라-포름알데하이드는 4 옹스트롬만큼 떨어진 DNA 쇄들을 가교결합시킬 수 있다.
염색체 상호작용은 예를 들면, 염색체 영역이 생리학적 조건의 변화에 반응하여 전사되거나 저해되는 경우 이러한 염색체 영역의 상태를 반영할 수 있다. 본원에서 정의된 서브그룹에 특이적인 염색체 상호작용은 안정하므로, 2개의 서브그룹들 사이의 차이를 측정하는 신뢰할만한 수단을 제공하는 것으로 발견되었다.
추가로, 특징(예컨대, 질환 상태)에 특이적인 염색체 상호작용은 예를 들면, 다른 후성유전적 마커, 예컨대, 메틸화 또는 히스톤 단백질의 결합의 변화에 비해 통상적으로 생물학적 과정에서 초기에 일어날 것이다. 따라서, 본 발명의 방법은 생물학적 과정의 초기 단계를 검출할 수 있다. 이것은 결과적으로 보다 더 효과적일 수 있는 초기 중재술(예를 들면, 치료)을 가능하게 한다. 더욱이, 동일한 서브그룹 내의 개체들 사이의 관련된 염색체 상호작용에 있어서 변동이 거의 없다. 염색체 상호작용의 검출은 유전자당 최대 50개의 상이한 가능한 상호작용으로 매우 유익하므로, 본 발명의 방법은 500,000개의 상이한 상호작용을 조사할 수 있다.
후성유전적 상호작용의 위치 및 원인
후성유전적 염색체 상호작용은 중첩될 수 있고 관련된 유전자 또는 기재되지 않은 유전자를 코딩하는 것으로 밝혀진 염색체의 영역을 포함할 수 있으나, 동등하게 유전자간 영역에 존재할 수 있다. 본 발명자들은 모든 영역들에서의 후성유전적 상호작용이 염색체 좌위의 상태를 확인하는 데 있어서 동등하게 중요하다는 것을 발견하였다는 것도 인지되어야 한다. 이들 상호작용은 반드시 상기 좌위에 위치한 특정 유전자의 코딩 영역에 있지는 않고 유전자간 영역에 존재할 수 있다.
본 발명에서 검출되는 염색체 상호작용은 기저 DNA 서열의 변화, 환경적 용인, DNA 메틸화, 비코딩 안티센스 RNA 전사체, 비돌연변이유발성 발암물질, 히스톤 변형, 염색질 리모델링 및 특정 국소 DNA 상호작용에 의해 야기될 수 있다. 염색체 상호작용을 유발하는 변화는 그 자체가 유전자 생성물 또는 유전자 발현 방식에 직접적으로 영향을 미치지 않는, 기저 핵산 서열의 변화에 의해 야기될 수 있다. 이러한 변화는 예를 들면, 유전자의 내부 및/또는 외부의 SNP, 유전자 융합 및/또는 유전자간 DNA, 마이크로RNA 및 비코딩 RNA의 결실일 수 있다. 예를 들면, 대략 20%의 SNP들이 비코딩 영역에 있는 것으로 공지되어 있으므로, 기재된 방법은 비코딩 상황에서도 유익한다. 한 실시양태에서, 회합하여 상호작용을 형성하는 염색체의 영역들은 동일한 염색체 상에서 5 kb, 3 kb, 1 kb, 500개 염기쌍 또는 200개 염기쌍 미만만큼 떨어져 있다.
검출되는 염색체 상호작용은 바람직하게는 본 명세서의 표에서 언급된 유전자들 중 임의의 유전자 내에 있다. 그러나, 염색체 상호작용은 유전자의 업스트림 또는 다운스트림, 예를 들면, 유전자 또는 코딩 서열로부터 최대 50,000개, 최대 30,000개, 최대 20,000개, 최대 10,000개 또는 최대 5000개 염기만큼 업스트림 또는 다운스트림에 있을 수도 있다.
임상 상황의 유형
본 발명의 목적은 집단 내의 서브그룹을 정의하는 특징과 관련된 염색체 상호작용의 검출을 가능하게 하는 것이다. 예를 들면, 이 기술은 (예를 들면, 의학적 병태와 관련된) 특정 표현형에 대한 바이오마커를 기초로, 즉 특정 염색체 확인 시그너처 및/또는 그 특정 시그너처의 변화를 인식함으로써 계층화를 가능하게 한다.
본 발명의 방법은 질환과 관련된 특정 특징, 예컨대, 치료에 대한 반응성, 가장 효과적인 요법/약물의 확인, 질환의 경과의 모니터링, 질환에 대한 소인의 확인, 잔존 질환의 존재의 확인 및/또는 재발의 가능성과 관련하여 이용될 수 있다. 따라서, 상기 방법은 특정 질환의 존재의 진단을 위해 이용될 수 있거나 이용될 수 없다. 본 발명의 방법은 질환의 기작이 공지되어 있지 않거나 불분명하거나 복잡한 경우 좌위를 형별하는 데 이용될 수 있다. 염색체 상호작용의 검출은 상이한 조절 수준에서 변화(이들 중 일부는 복잡함)를 추적하는 효율적인 방식을 제공한다. 예를 들면, 일부 경우, 약 37,000개의 비코딩 RNA들이 단일 충격에 의해 활성화될 수 있다.
서브그룹 및 맞춤형 치료
본원에서 사용될 때, "서브그룹"은 바람직하게는 집단 서브그룹(집단 내의 서브그룹), 보다 바람직하게는 특정 동물, 예컨대, 특정 진핵생물, 또는 포유동물(예를 들면, 인간, 비인간, 비인간 영장류, 또는 설치류, 예를 들면, 마우스 또는 래트) 또는 특정 선충 벌레(예를 들면, 씨. 엘레간스(C. elegans))의 집단 내의 서브그룹을 지칭한다. 가장 바람직하게는, "서브그룹"은 인간 집단 내의 서브그룹을 지칭한다.
본 발명은 집단 내의 특정 서브그룹을 검출하고 치료하는 것을 포함한다. 이러한 서브그룹 내에는 본원에서 논의된 특징(예컨대, 치료에 대한 반응성)이 존재할 것이거나 부재할 것이다. 일반적으로 말하면, 염색체 상의 후성유전적 상호작용 차이는 게놈 수준에서 존재하는 구조적 차이이다. 본 발명자들은 이들이 주어진 집단 내의 서브세트들(예를 들면, 2개 또는 적어도 2개의 서브세트들) 사이에 상이하다는 것을 발견하였다. 이들 차이의 확인은 의사가 그의 환자를 본 방법에서 기재된 집단의 한 서브세트의 부분으로서 범주화할 수 있게 할 것이다. 따라서, 본 발명은 환자의 후성유전적 염색체 상호작용을 기초로 환자를 위한 의약을 맞춤화하는 방법을 의사에게 제공하고, 보다 더 효과적인 대안적 치료 섭생법을 제공한다.
또 다른 실시양태에서, 어느 정도까지 대상체가 한 서브그룹으로서 정의되고 집단의 다른 서브그룹으로서 정의되지 않는지를 확인하기 위한 역치 수준이 적용된다. 서브그룹이 특정 질환의 치료를 위한 요법의 반응자 대 비반응자를 포함하는 한 실시양태에서, 상기 역치는 DAS28 점수의 변화에 의해 측정될 수 있다. 한 실시양태에서, 1.2 유닛 초과의 점수는 대상체가 반응자 서브그룹에 속한다는 것을 표시하는 반면, 1.2 유닛 미만의 점수는 대상체가 비반응자로서 정의된다는 것을 표시한다. 전형적으로, 서브그룹은 일반적인 집단의 적어도 10%, 30%, 50% 또는 80%일 것이다.
결찰된 핵산의 생성
본 발명의 일부 실시양태는 결찰된 핵산, 특히 결찰된 DNA를 사용한다. 이 핵산은 염색체 상호작용에 있어서 회합하는 양 영역들로부터의 서열을 포함하므로, 상호작용에 대한 정보를 제공한다. 본원에 기재된 EpiSwitch™ 방법은 이러한 결찰된 핵산의 생성을 이용하여 염색체 상호작용을 검출한다.
따라서, 본 발명의 방법은
(i) 염색체 좌위에 존재하는 후성유전적 염색체 상호작용을 시험관내에서 가교결합시키고;
(ii) 경우에 따라 상기 염색체 좌위로부터 가교결합된 DNA를 단리하고;
(iii) 예를 들면, 적어도 1회 절단하는 효소(특히, 상기 염색체 좌위 내에서 적어도 1회 절단하는 효소)를 사용한 제한 분해로 상기 가교결합된 DNA를 절단하고;
(iv) (특히, DNA 루프를 형성하기 위해) 상기 가교결합된 절단된 DNA 말단을 결찰시키고;
(v) 특정 염색체 상호작용의 존재를 확인하기 위해, 특히 기법, 예컨대, PCR(중합효소 연쇄 반응)을 이용하여 상기 결찰된 DNA 및/또는 상기 DNA 루프의 존재를 확인함으로써
결찰된 핵산(예를 들면, DNA)을 생성하는 단계를 포함할 수 있다.
PCR(중합효소 연쇄 반응)은 결찰된 핵산을 검출하거나 확인하는 데 이용될 수 있고, 예를 들면, 생성된 PCR 생성물의 크기는 존재하는 특정 염색체 상호작용을 표시할 수 있으므로, 좌위의 상태를 확인하는 데 이용될 수 있다. 숙련된 자는 관심있는 염색체 좌위 내에서 DNA를 절단하는 데 사용될 수 있는 다수의 제한 효소들을 알고 있을 것이다. 사용되는 구체적인 효소가 연구되는 좌위 및 이 좌위 내에 위치하는 DNA의 서열에 의해 좌우될 것임은 분명할 것이다. 본 발명에 기재된 바와 같이 DNA를 절단하는 데 사용될 수 있는 제한 효소의 비한정적 예는 Taq I 중합효소이다.
실시양태, 예컨대, EpiSwitch™ 기술
EpiSwitch™ 기술은 표현형에 특이적인 후성유전적 염색체 입체구조 시그너처의 검출에 있어서 마이크로어레이 EpiSwitch™ 마커 데이터의 사용과 관련되어 있다. 본 발명자들은 EpiSwitch™ 어레이 플랫폼이 건강한 대조군에 비해 특정 불리한 표현형 서브그룹에 특이적인 바이오마커들의 염색체 시그너처 풀의 탐색을 위해 어떻게 사용되고 있는지를 본원에서 기술한다. 본 발명자들은 어레이 상에서 검사된 코호트로부터의 서브그룹들 사이에 특이적인 여러 마커들의 예와 함께, 마이크로어레이부터 PCR 플랫폼까지 염색체 입체구조 시그너처의 검증된 사용 및 해석의 예도 제공한다.
결찰된 핵산을 본원에 기재된 방식으로 사용하는 실시양태, 예컨대, EpiSwitch™는 여러 장점들을 가진다. 이들은 예를 들면, 본 발명의 제1 세트의 핵산으로부터의 핵산 서열이 제2 세트의 핵산과 하이브리드화하거나 하이브리드화하지 못하기 때문에 낮은 수준의 확률적 노이즈(noise)를 가진다. 이것은 후성유전자 수준에서 복잡한 기작을 측정하는 상대적으로 단순한 방식을 가능하게 하는 이진법 결과를 제공한다. EpiSwitch™ 기술은 빠른 프로세싱 시간 및 낮은 비용도 가진다. 한 실시양태에서, 프로세싱 시간은 3시간 내지 6시간이다.
샘플 및 샘플 처리
샘플은 개체로부터의 DNA를 함유할 것이다. 샘플은 통상적으로 세포를 함유할 것이다. 한 실시양태에서, 샘플은 최소한으로 침습적인 수단에 의해 수득되고, 예를 들면, 혈액일 수 있다. DNA를 추출하고 표준 제한 효소로 절단할 수 있다. 이것은 어느 염색체 입체구조가 보유되고 EpiSwitch™ 플랫폼으로 검출될 것인지를 미리 확인할 수 있다. 샘플이 환자로부터 미리 수득된 혈액 샘플인 한 실시양태에서, 기재된 방법은 절차가 최소한으로 침습적이기 때문에 유리하다. 수평 전달을 포함하는, 조직과 혈액 사이의 염색체 상호작용의 동시화로 인해, 혈액 샘플은 조직, 예컨대, 질환과 관련된 조직에서 염색체 상호작용을 검출하는 데 사용될 수 있다. 일부 병태들, 예컨대, 암의 경우, 돌연변이로 인한 유전적 노이즈가 관련된 조직에서 염색체 상호작용 '신호'에 영향을 미칠 수 있으므로, 혈액의 사용이 유리하다.
본 발명의 핵산의 특성
본 발명은 핵산을 제공한다. 이 핵산은 본원에서 언급된 제1 핵산 및 제2 핵산과 동일할 수 있거나 이들 핵산들의 특성들 중 임의의 특성을 가질 수 있다. 본 발명의 핵산은 전형적으로 염색체 상호작용에 있어서 회합하는 2개의 염색체 영역들 중 하나로부터의 서열을 각각 포함하는 2개의 부분들을 포함한다. 전형적으로, 각각의 부분은 길이가 적어도 8개, 10개, 15개, 20개, 30개 또는 40개 뉴클레오티드, 예를 들면, 길이가 10개 내지 40개 뉴클레오티드이다. 바람직한 핵산은 표 중 임의의 표에서 언급된 유전자들 중 임의의 유전자로부터의 서열을 포함하고, 특히 이 때 핵산은 그 표에 대한 관련 질환과 관련된 실시양태에서 사용된다. 바람직한 핵산은 특정 병태에 대해 표 중 임의의 표에서 언급된 특정 프로브 서열; 또는 이러한 서열의 단편 및/또는 상동체를 포함한다. 바람직하게는, 핵산은 DNA이다. 특정 서열이 제공되는 경우, 본 발명은 특정 실시양태에서 요구될 때 상보성 서열을 사용할 수 있다는 것이 이해된다.
제2 세트의 핵산 - '지표' 서열
제2 세트의 핵산 서열은 한 세트의 지표 서열이라는 기능을 갖고, 본질적으로 서브그룹 특이적 서열을 확인하는 데 적합한 한 세트의 핵산 서열이다. 이들은 '배경' 염색체 상호작용을 나타낼 수 있고 일부 방식으로 선택될 것이거나 선택되지 않을 것이다. 이들은 일반적으로 모든 가능한 염색체 상호작용의 서브세트이다.
제2 세트의 핵산은 임의의 적합한 방법에 의해 유도될 수 있다. 이들은 컴퓨터에 의해 유도될 수 있거나 개체에서의 염색체 상호작용에 기초할 수 있다. 이들은 전형적으로 제1 세트의 핵산보다 더 큰 집단 군을 나타낸다. 한 특정 실시양태에서, 제2 세트의 핵산은 한 특정 세트의 유전자에서의 모든 가능한 후성유전적 염색체 상호작용을 나타낸다. 또 다른 특정 실시양태에서, 제2 세트의 핵산은 본원에 기재된 집단에 존재하는 모든 가능한 후성유전적 염색체 상호작용의 대부분을 나타낸다. 한 특정 실시양태에서, 제2 세트의 핵산은 적어도 20개, 50개, 100개 또는 500개의 유전자, 예를 들면, 20개 내지 100개 또는 50개 내지 500개의 유전자에서의 후성유전적 염색체 상호작용 중 적어도 50% 또는 적어도 80%를 나타낸다.
제2 세트의 핵산은 전형적으로 집단에서 질환 상태/표현형을 변형시키거나, 조절하거나 임의의 방식으로 매개하는 적어도 100개의 가능한 후성유전적 염색체 상호작용을 나타낸다. 제2 세트의 핵산은 예를 들면, 임의의 질환 상태, 질환에 대한 소인 또는 질환 표현형과 연관된 사이토카인, 키나제 또는 조절제를 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 종에서 질환 상태에 영향을 미치는 염색체 상호작용을 나타낼 수 있다. 제2 세트의 핵산은 전형적으로 서브그룹을 정의하는 특징과 관련된 후성유전적 상호작용 및 이러한 특징과 관련되지 않은 후성유전적 상호작용을 나타내는 서열을 포함한다.
한 특정 실시양태에서, 제2 세트의 핵산은 적어도 부분적으로 집단 내의 자연 발생 서열로부터 유래하고, 전형적으로 인 실리코(in silico) 방법에 의해 수득된다. 상기 핵산은 자연 발생 핵산에 존재하는 핵산의 상응하는 부분에 비해 단일 또는 다수의 돌연변이를 추가로 포함할 수 있다. 돌연변이는 하나 이상의 뉴클레오티드 염기쌍의 결실, 치환 및/또는 추가를 포함한다. 한 특정 실시양태에서, 제2 세트의 핵산은 자연 발생 종에 존재하는 핵산의 상응하는 부분에 대한 적어도 70%의 서열 동일성을 갖는 상동체 및/또는 오르톨로그(orthologue)를 나타내는 서열을 포함할 수 있다. 또 다른 특정 실시양태에서, 자연 발생 종에 존재하는 핵산의 상응하는 부분에 대한 적어도 80%의 서열 동일성 또는 적어도 90%의 서열 동일성이 제공된다.
제2 세트의 핵산의 특성
한 특정 실시양태에서, 제2 세트의 핵산에 적어도 100개의 상이한 핵산 서열들, 바람직하게는 적어도 1000개, 2000개 또는 5000개의 상이한 핵산 서열들, 최대 100,000개, 1,000,000개 또는 10,000,000개의 상이한 핵산 서열들이 존재한다. 전형적인 수는 100개 내지 1,000,000개, 예컨대, 1,000개 내지 100,000개의 상이한 핵산 서열들일 것이다. 이들 전부, 또는 이들 중 적어도 90% 또는 적어도 50%는 상이한 염색체 상호작용에 상응할 것이다.
한 특정 실시양태에서, 제2 세트의 핵산은 적어도 20개의 상이한 좌위 또는 유전자, 바람직하게는 적어도 40개의 상이한 좌위 또는 유전자, 보다 바람직하게는 적어도 100개, 적어도 500개, 적어도 1000개 또는 적어도 5000개의 상이한 좌위 또는 유전자, 예컨대, 100개 내지 10,000개의 상이한 좌위 또는 유전자에서의 염색체 상호작용을 나타낸다. 제2 세트의 핵산의 길이는 이들 핵산이 왓슨 크릭(Watson Crick) 염기 페어링에 따라 제1 세트의 핵산에 특이적으로 하이브리드화하여, 서브그룹에 특이적인 염색체 상호작용을 확인할 수 있게 하는 데 적합하다. 전형적으로, 제2 세트의 핵산은 염색체 상호작용에 있어서 회합하는 2개의 염색체 영역들에 상응하는 서열을 갖는 2개의 부분들을 포함할 것이다. 제2 세트의 핵산은 전형적으로 길이가 적어도 10개, 바람직하게는 20개, 훨씬 바람직하게는 30개 염기(뉴클레오티드)인 핵산 서열을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 핵산 서열은 길이가 최대 500개, 바람직하게는 최대 100개, 훨씬 바람직하게는 최대 50개 염기쌍일 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 제2 세트의 핵산은 17개 내지 25개 염기쌍의 핵산 서열을 포함한다. 한 실시양태에서, 제2 세트의 핵산 서열들 중 적어도 100%, 80% 또는 50%는 전술된 바와 같은 길이를 가진다. 바람직하게는, 상이한 핵산들은 임의의 중첩되는 서열을 갖지 않고, 예를 들면, 상기 핵산들 중 적어도 100%, 90%, 80% 또는 50%는 적어도 5개의 인접 뉴클레오티드들에 걸쳐 동일한 서열을 갖지 않는다.
제2 세트의 핵산이 '지표'로서 작용한다는 점을 고려하면, 상이한 특징에 대한 서브그룹을 나타내는 상이한 세트의 제1 핵산과 함께 동일한 세트의 제2 핵산을 사용할 수 있고, 즉 제2 세트의 핵산은 상이한 특징과 관련된 염색체 상호작용을 확인하는 데 사용될 수 있는 핵산의 '보편적인' 집합체를 나타낼 수 있다.
제1 세트의 핵산
제1 세트의 핵산은 통상적으로 동반 진단과 관련된 특징, 예컨대, 본원에서 언급된 임의의 이러한 특징의 존재 또는 부재에 의해 정의된 2개 이상의 상이한 서브그룹들 내에 있는 것으로 공지된 개체로부터 유래한다. 제1 핵산은 본원에서 언급된 제2 세트의 핵산의 특징들 및 성질들 중 임의의 특징 및 성질을 가질 수 있다. 제1 세트의 핵산은 본원에 기재된 바와 같은 치료 및 프로세싱, 특히 EpiSwitch™ 가교결합 및 절단 단계를 겪은 개체로부터의 샘플로부터 유래한다. 전형적으로, 제1 세트의 핵산은 상기 개체로부터 채취된 샘플에 존재하는 염색체 상호작용 전부, 또는 이러한 염색체 상호작용 중 적어도 80% 또는 50%를 나타낸다.
전형적으로, 제1 세트의 핵산은 제2 세트의 핵산이 나타내는 염색체 상호작용과 비교될 때 제2 세트의 핵산이 나타내는, 좌위 또는 유전자에 걸친 보다 더 작은 집단의 염색체 상호작용을 나타내고, 즉 제2 세트의 핵산은 소정의 세트의 좌위 또는 유전자에서의 배경 또는 지표 세트의 상호작용을 나타낸다.
핵산의 라이브러리
본 발명은 적어도 200개, 적어도 500개, 적어도 1000개, 적어도 5000개 또는 적어도 10000개의 상이한 본 발명의 핵산, 예컨대, '제2' 핵산을 포함하는 핵산의 라이브러리를 제공한다. 본 발명은 전형적으로 적어도 200개의 상이한 핵산을 포함하는 핵산의 특정 라이브러리를 제공한다. 라이브러리는 어레이에 결합된 핵산의 형태로 존재할 수 있다.
하이브리드화
본 발명은 제1 세트의 핵산 및 제2 세트의 핵산으로부터의 전체적 또는 부분적 상보성 핵산 서열들이 하이브리드화할 수 있게 하기 위한 수단을 요구한다. 한 실시양태에서, 모든 제1 세트의 핵산들은 단일 어세이, 즉 단일 하이브리드화 단계에서 모든 제2 세트의 핵산들과 접촉된다. 그러나, 임의의 적합한 어세이가 이용될 수 있다.
표지된 핵산 및 하이브리드화 패턴
본원에서 언급된 핵산은 바람직하게는 성공적인 하이브리드화의 검출을 돕는 독립적인 표지, 예컨대, 형광단(형광 분자) 또는 방사성 표지를 사용함으로써 표지될 수 있다. 일부 표지들은 UV 광 하에서 검출될 수 있다. 예를 들면, 본원에 기재된 어레이 상의 하이브리드화 패턴은 2개의 서브그룹들 사이의 후성유전적 염색체 상호작용의 차이를 나타내므로, 후성유전적 염색체 상호작용을 비교하고 어느 후성유전적 염색체 상호작용이 본 발명의 집단 내의 서브그룹에 특이적인지를 확인하는 방법을 제공한다.
용어 '하이브리드화 패턴'은 넓게는 제1 세트의 핵산과 제2 세트의 핵산 사이의 혼성화의 존재 및 부재, 즉 제1 세트로부터의 어느 특정 핵산이 제2 세트로부터의 어느 특정 핵산에 하이브리드화하는지를 커버하므로, 임의의 특정 어세이 또는 기법, 또는 '패턴'이 검출될 수 있는 표면 또는 어레이를 가질 필요성으로 한정되지 않는다.
특정 시스템 특징을 갖는 서브그룹의 선택
본 발명은 개체에서 특징의 존재 또는 부재를 확인하기 위해 염색체 상호작용, 전형적으로 5개 내지 20개 또는 5개 내지 500개의 이러한 상호작용, 바람직하게는 20개 내지 300개 또는 50개 내지 100개의 상호작용의 존재 또는 부재를 검출하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다. 바람직하게는, 염색체 상호작용은 본원에서 언급된 유전자들 중 임의의 유전자에서의 염색체 상호작용이다. 한 실시양태에서, 형별되는 염색체 상호작용은 예를 들면, 상기 방법이 본원에 개시된 관련된 표 중 어느 하나 이상의 표에서 정의된 특징의 존재 또는 부재를 확인하기 위한 것일 때 이러한 표 내의 핵산이 나타내는 염색체 상호작용이다.
특정 병태
본 발명의 방법은 본원에서 언급된 특정 병태들 또는 특징들 중 임의의 특정 병태 또는 특징의 존재를 검출하는 데 이용될 수 있고, 바람직하게는
- 다발성 경화증 환자(특히 인간)에서의 IFN-B(IFN-베타) 치료에 대한 반응성, 및/또는
- (특히 인간에서) 재발 완화형 다발성 경화증에 대한 소인, 및/또는
- (특히 인간에서) 원발성 진행성 다발성 경화증의 가능성, 및/또는
- (특히 인간에서) 근위축성 측삭 경화증(ALS) 질환 상태에 대한 소인, 및/또는
- (특히 인간에서) 빠른 진행성 근위축성 측삭 경화증(ALS) 질환 상태에 대한 소인, 및/또는 (특히 인간에서) 공격성 2형 당뇨병 질환 상태에 대한 소인, 및/또는
- (특히 인간에서) 2형 당뇨병 질환 상태에 대한 소인, 및/또는
- (특히 인간에서) 2형 당뇨병 전증 상태에 대한 소인, 및/또는
- (특히 인간에서) 1형 당뇨병 질환 상태에 대한 소인, 및/또는
- (특히 인간에서) 전신 홍반성 루푸스(SLE) 질환 상태에 대한 소인, 및/또는
- (특히 인간에서) 궤양성 대장염 질환 상태에 대한 소인, 및/또는
- (특히 인간에서) 궤양성 대장염 환자에 대한 대장암의 재발 가능성, 및/또는
- (특히 인간에서) 신경섬유종증 환자에 대한 악성 말초 신경초 종양의 가능성, 및/또는
- (특히 인간에서) 전립선암 및/또는 공격성 전립선암의 발생 가능성, 및/또는
- 특히 인간에서 신경변성 질환 또는 병태, 바람직하게는 치매, 예컨대, 알츠하이머병, 경도 인지 장애, 혈관 치매, 루이 소체를 갖는 치매, 전두측두엽 치매, 또는 보다 바람직하게는 알츠하이머병, 가장 바람직하게는 베타-아밀로이드 응집체에 의해 유도된 알츠하이머병에 대한 발생 가능성 및/또는 소인, 및/또는
- 특히 기억력 및/또는 인지력 면에서 치매 환자(바람직하게는 알츠하이머병 환자, 보다 바람직하게는 베타-아밀로이드 응집체를 갖는 알츠하이머병 환자)와 알츠하이머병을 갖지 않는 인지 장애 환자 간의 비교, 및/또는
- 류마티스성 관절염 환자에서 메토트렉세이트에 대한 반응성, 및/또는
- 급성 골수성 백혈병에 대한 요법에 대한 반응성, 및/또는
- 흑색종의 재발 가능성, 및/또는
- 흑색종에서의 항-PD-1 치료에 대한 반응성
을 검출하는 데 이용된다.
한 실시양태에서, 본 발명의 방법은 면역요법, 예컨대, 항체 요법에 대한 반응성을 검출한다. 바람직하게는, 암의 항체 요법에 대한 반응성은 예를 들면, 항-PD-1 또는 항-PD-L1, 또는 조합된 항-PD-1/항-PD-L1 요법을 이용한 면역요법에서 검출된다. 바람직하게는, 암은 흑색종, 유방암, 전립선암, 급성 골수성 백혈병(AML), 미만성 B 대세포 림프종(DLBCL), 췌장암, 갑상선암, 비암, 간암 또는 폐암이다. 이러한 실시양태에서, 예컨대, 실시예에 기재된 바와 같이, STAT5B 및/또는 IL15에서의 염색체 상호작용의 검출이 바람직하다. 실시예의 결과는 면역요법에 대한 반응이 암 본질보다 오히려 면역계 후성유전적 상황의 특징이라는 사실과 일치한다. ['항-PD-1'은 PD-1(프로그래밍된 세포 사멸 단백질 1)에 특이적으로 결합하는 항체, 또는 항체 유도체 또는 단편이다. '항-PD-L1'은 PD-1의 리간드인 PD-L1 단백질에 특이적으로 결합하는 항체, 또는 항체 유도체 또는 단편이다.]
한 실시양태에서, 요법, 바람직하게는 항-PD1 요법에 대한 반응성은 바람직하게는 병기 또는 클래스가 표시된 바와 같고/같거나 바람직하게는 다른 표시된 특징, 예컨대, 바이러스 감염을 갖는 하기 암들 중 임의의 암에서 검출된다.
DLBCL_ABC: 미만성 B 대세포 림프종 서브타입 활성화된 B 세포
DLBCL_GBC: 미만성 B 대세포 림프종 서브타입 배중심 B 세포
HCC: 간세포 암종
HCC_HEPB: B형 간염 바이러스를 갖는 간세포 암종
HCC_HEPC: C형 간염 바이러스를 갖는 간세포 암종
HEPB+R: 차도를 보이는 B형 간염
Pca_Class3: 전립선암 3 기
Pca_Class2: 전립선암 2 기
Pca_Class1: 전립선암 1 기
BrCa_Stg4: 유방암 4 기
BrCa_Stg3B: 유방암 3B 기
BrCa_Stg2A: 유방암 2A 기
BrCa_Stg2B: 유방암 2B 기
BrCa_Stg1A: 유방암 1A 기
BrCa_Stg1: 유방암 1 기
바람직하게는, 표에서 언급된 관련된 유전자들 중 임의의 관련된 유전자 내에서의 염색체 상호작용 중 임의의 염색체 상호작용의 존재 또는 부재가 검출된다. 예를 들면, 표들 중 어느 하나에서 언급된 유전자들 중 적어도 1개, 3개, 10개, 20개 또는 50개의 유전자들. 바람직하게는, 표 내의 프로브 서열이 나타내는 염색체 상호작용의 존재 또는 부재가 본 방법에서 확인된다. 이들 수의 유전자 또는 염색체 상호작용은 본원에서 언급된 상이한 실시양태들 중 임의의 실시양태에서 사용될 수 있다.
검사되는 개체
검사되는 개체는 본원에서 언급된 임의의 질환 상태 또는 특징의 임의의 증상을 가질 수 있거나 갖지 않을 수 있다. 개체는 임의의 이러한 병태 또는 특징의 위험에 있을 수 있다. 개체는 상기 병태 또는 특징으로부터 회복되었을 수 있거나 회복하는 중일 수 있다. 개체는 바람직하게는 포유동물, 예컨대, 영장류, 인간, 비인간 포유동물 또는 설치류이다. 개체는 수컷 또는 암컷일 수 있다. 개체는 30세 이상일 수 있다. 개체는 29세 이하일 수 있다.
유전자 변형에 관한 실시양태
일부 실시양태에서, 본 발명의 방법은 유전자 변형과 관련되어 있거나 유전자 변형에 의해 영향을 받는 염색체 상호작용을 검출하기 위해 수행될 수 있고, 즉 서브그룹은 유전자 변형에 있어서 상이할 수 있다. 분명하게는, 상기 변형은 전체 (비인간) 유기체 또는 유기체의 부분, 예컨대, 세포의 변형일 것이다. 제1 세트의 핵산은 적어도 2개의 서브그룹들, 즉 소정의 유전자 변형을 갖는 서브그룹 및 유전자 변형을 갖지 않는 서브그룹으로부터의 핵산일 수 있고, 상기 방법은 어느 염색체 상호작용이 유전자 변형과 관련되어 있고/있거나 유전자 변형에 의해 영향을 받는지를 확인할 수 있다. 상기 변형은 CRISPR 기술을 포함하는 임의의 적합한 수단에 의해 달성될 수 있다.
본 발명은 게놈의 제1 좌위에서의 서열에 대한 유전자 변형이 게놈의 다른 좌위에 영향을 미치는지를 확인하는 방법으로서, 유전자 변형이 만들어진 후 하나 이상의 다른 좌위에서 염색체 시그너처를 검출하는 단계를 포함하는 방법을 포함하고, 이 때 바람직하게는 상기 유전자 변형은 계 특징을 바꾸고, 상기 계는 바람직하게는 대사계, 면역계, 내분비계, 소화기계, 피부계, 골격계, 근육계, 림프계, 호흡계, 신경계 또는 생식기계이다. 염색체 시그너처의 상기 검출은 경우에 따라 바람직하게는 표 중 임의의 표에서 정의된 바와 같이 바람직하게는 5개 이상(예를 들면, 5개)의 상이한 좌위에서 5개 이상(예를 들면, 5개)의 상이한 염색체 상호작용의 존재 또는 부재를 검출하는 단계를 포함한다. 바람직하게는, 염색체 시그너처 또는 상호작용은 본원에서 언급된 임의의 적합한 방법에 의해 확인된다.
한 실시양태에서, 유전자 변형은 (a) 2개 이상의 RNA 안내 엔도뉴클레아제, 또는 2개 이상의 RNA 안내 엔도뉴클레아제를 코딩하는 핵산, 및 (b) 2개 이상의 안내 RNA, 또는 2개 이상의 안내 RNA를 코딩하는 DNA를 세포 내로 도입하는 단계를 포함하는 방법에 의해 달성되고, 이 때 각각의 안내 RNA는 RNA 안내 엔도뉴클레아제 중 하나를 염색체 서열 내의 표적화된 부위로 안내하고, RNA 안내 엔도뉴클레아제는 표적화된 부위에서 염색체 서열의 적어도 하나의 가닥을 절단한다.
또 다른 실시양태에서, 변형은
a) 표적 서열과 하이브리드화하는, 일정한 간격을 두고 주기적으로 분포하는 짧은 회문 반복서열(CRISPR)-CRISPR 관련 단백질(Cas)(CRISPR-Cas) 시스템 안내 RNA를 코딩하는 적어도 하나의 뉴클레오티드 서열에 작동 가능하게 연결된, 진핵 세포에서 작동 가능한 제1 조절 요소, 및
b) II형 Cas9 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열에 작동 가능하게 연결된, 진핵 세포에서 작동 가능한 제2 조절 요소
를 포함하는 하나 이상의 벡터를 포함하는 조작된 비자연 발생 CRISPR-Cas 시스템을, 표적 서열을 갖고 유전자 생성물을 코딩하는 DNA 분자를 포함하고 발현하는 진핵 세포 내로 도입하는 단계를 포함하는, 적어도 하나의 유전자 생성물의 발현을 변경시키는 방법에 의해 이루어지고,
이 때, 성분 (a)와 (b)는 상기 시스템의 동일한 또는 상이한 벡터 상에 위치하고, 상기 안내 RNA는 표적 서열을 표적화하고 Cas9 단백질은 DNA 분자를 절단하며, 이에 의해 적어도 하나의 유전자 생성물의 발현은 변경되고; Cas9 단백질 및 안내 RNA는 자연적으로 함께 존재하지 않고, 바람직하게는 각각의 RNA 안내 엔도뉴클레아제는 Cas9 단백질로부터 유래하고 적어도 2개의 뉴클레아제 도메인들을 포함하며, 경우에 따라 2개의 RNA 안내 엔도뉴클레아제 각각의 뉴클레아제 도메인들 중 하나는, 각각의 RNA 안내 엔도뉴클레아제가 이중 가닥 서열의 한 가닥을 절단하도록 변형되고, 2개의 RNA 안내 엔도뉴클레아제는 염색체 서열이 변형되도록 DNA 복구 방법에 의해 복구되는 이중 가닥 절단을 염색체 서열에 함께 도입한다.
전형적으로, 변형은 적어도 5개, 20개, 50개, 100개 또는 1000개의 염기, 바람직하게는 10,000개 또는 1000,000개의 염기의 결실, 삽입 또는 치환을 포함하였다.
변형은 본원에서 언급된 좌위 중 임의의 좌위, 예를 들면, 표 중 임의의 표에서 언급된 영역들 또는 유전자들 중 임의의 영역 또는 유전자에 존재할 수 있다. 다른 (비변형된) 좌위에서 검출되는 염색체 상호작용도 본원에서 언급된 좌위 중 임의의 좌위, 예를 들면, 표 중 임의의 표에서 언급된 영역들 또는 유전자들 중 임의의 영역 또는 유전자에 존재할 수 있다.
유전자 변형에 대한 실시양태는 진핵생물, 척색동물, 포유동물, 식물, 농업 동물 및 식물, 및 비인간 유기체를 포함하는 임의의 유기체에 대해 수행될 수 있다.
바람직한 유전자 영역, 좌위, 유전자 및 염색체 상호작용
본 발명의 모든 양태들에 대한 바람직한 유전자 영역, 좌위, 유전자 및 염색체 상호작용은 표, 예를 들면, 표 1 내지 18, 22, 24, 26, 39 내지 41, 43 내지 46, 48, 49 및 52에 언급되어 있다. 전형적으로, 본 발명의 방법에서 염색체 상호작용은 표에 나열된 적어도 1개, 3개, 10개, 20개, 30개 또는 50개의 관련된 유전자로부터 검출된다. 바람직하게는, 본 명세서의 표들 중 어느 하나에 기재된 프로브 서열에 의해 나타내어지는 적어도 1개, 3개, 10개, 20개, 30개 또는 50개의 관련된 특정 염색체 상호작용의 존재 또는 부재가 검출된다. 바람직하게는, 표 중 임의의 표, 예를 들면, 표 44, 45, 47 또는 52의 프라이머 서열이 나타내는 적어도 1개, 3개, 10개, 20개, 30개 또는 50개의 관련된 특정 염색체 상호작용의 존재 또는 부재가 검출된다.
영역은 본원에서 언급된 유전자들 중 임의의 유전자의 업스트림 또는 다운스트림, 예를 들면, 코딩 서열로부터 50 kb 업스트림 또는 20 kb 다운스트림에 존재할 수 있다.
한 실시양태에서, (염색체 상호작용이 검출되는 유전자 및/또는 위치를 포함하는) 좌위는 CTCF 결합 부위를 포함할 수 있다. 이것은 전사 저해제 CTCF에 결합할 수 있는 임의의 서열이다. 그 서열은 좌위에서 1개, 2개 또는 3개 카피로 존재할 수 있는 서열 CCCTC로 구성될 수 있거나 이러한 서열을 포함할 수 있다. CTCF 결합 부위 서열은 (IUPAC 표기법에서) 서열 CCGCGNGGNGGCAG를 포함할 수 있다. CTCF 결합 부위는 염색체 상호작용의 적어도 100개, 500개, 1000개 또는 4000개 염기 내에 존재할 수 있거나, 본 명세서의 표에 표시된 염색체 영역들 중 임의의 염색체 영역 내에 존재할 수 있다.
한 실시양태에서, 검출되는 염색체 상호작용은 표에 표시된 위치들 중 임의의 위치 또는 (4 kb 영역을 포함하는) 영역들 중 임의의 영역에 존재한다. 결찰된 생성물이 방법에서 검출되는 경우, 표 중 임의의 표의 프로브 서열들 중 임의의 프로브 서열로 표시된 서열이 검출될 수 있다. 따라서, 전형적으로 (염색체 상호작용의 양 부위들로부터의) 프로브의 양 영역들로부터의 서열이 검출될 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 임의의 표에 제시된 프로브와 동일한 또는 상보성 서열을 포함하거나 이러한 서열로 구성된 프로브가 방법에서 사용된다. 일부 실시양태에서, 표에 제시된 프로브 서열들 중 임의의 프로브 서열과 상동한 서열을 포함하는 프로브가 사용된다.
각각의 병태에 대한 실시양태에서, 표 51에 제시된 p-값 또는 조절된 p-값의 상위 범위로 표시된 적어도 1개, 3개, 5개, 10개 또는 20개의 관련된 특정 염색체 상호작용의 존재 또는 부재가 검출된다. 각각의 병태에 대한 또 다른 실시양태에서, 표 51에 제시된 p-값 또는 조절된 p-값의 중간 범위로 표시된 적어도 1개, 3개, 5개, 10개, 20개, 30개 또는 50개의 관련된 특정 염색체 상호작용의 존재 또는 부재가 검출된다. 각각의 병태에 대한 또 다른 실시양태에서, 표 51에 제시된 p-값 또는 조절된 p-값의 하위 범위로 표시된 적어도 1개, 3개, 5개, 10개, 20개, 30개 또는 50개의 관련된 특정 염색체 상호작용의 존재 또는 부재가 검출된다. 각각의 병태에 대한 또 다른 실시양태에서, 표 51에 제시된 p-값 또는 조절된 p-값의 상위 범위, 중간 범위 및 하위 범위 각각으로부터 적어도 1개, 2개, 3개, 5개 또는 10개, 즉 적어도 총 3개, 6개, 9개, 18개 또는 30개의 관련된 특정 염색체 상호작용의 존재 또는 부재가 검출된다.
전형적으로 본 명세서의 표에 개시된 모든 상호작용 또는 표로부터의 선택을 나타내는, 염색체 상호작용의 특정 조합이 검출될 수 있다(즉, 존재 또는 부재의 확인). 본원에서 언급된 바와 같이, 특정 수의 상호작용이 개별 표로부터 선택될 수 있다. 한 실시양태에서, 임의의 표에 개시되어 있거나 임의의 병태와 관련하여 개시되어 있는 상호작용 중 적어도 10%, 20%, 30%, 50%, 70% 또는 90%가 검출된다. 또 다른 실시양태에서, 실시예의 목록들 중 임의의 목록에서 하나 초과의 병태에 '공통된' 것으로서 개시되어 있는 상호작용 중 적어도 10%, 20%, 30%, 50%, 70%, 90% 또는 100%가 검출된다.
검출되는 상호작용은 예를 들면, 본원, 예컨대, 본원의 임의의 표에서 정의된 특정 특징의 존재 또는 부재에 상응할 수 있다. 상호작용의 조합이 검출되는 경우, 이들은 모두 특징의 존재에 상응할 수 있거나, 이들은 모두 특징의 부재에 상응할 수 있다. 한 실시양태에서, 검출되는 상호작용의 조합은 특징의 존재와 관련된 적어도 2개, 5개 또는 10개의 상호작용, 및 특징의 부재와 관련된 적어도 2개, 5개 또는 10개의 다른 상호작용에 상응한다.
표 52에 제시된 프로브는 특히 암과 관련된 병태, 및 요법, 예컨대, 항-PD1 요법에 대한 반응성에 대해 본원에서 언급된 선택들 중 임의의 선택의 부분일 수 있거나 이러한 선택과 조합될 수 있다.
본원에서 제공된 표
본 명세서의 표는 병태(제1 언급된 군)에 존재하고 대조군(그러나, 전형적으로 반드시 건강한 개체는 아님)(제2 언급된 군)에 부재하는 염색체 상호작용을 나타내는 프로브(EpiSwitch™ 마커) 데이터 또는 유전자 데이터를 보여준다. 프로브 서열은 염색체 상호작용에 있어서 회합하는 유전자 영역의 양 부위들로부터 생성된 결찰된 생성물을 검출하는 데 사용될 수 있는 서열을 보여주고, 즉 프로브는 결찰된 생성물의 서열과 상보적인 서열을 포함할 것이다. 2개의 제1 세트의 시작-종결(Start-End) 위치는 프로브 위치를 보이고, 2개의 제2 세트의 시작-종결 위치는 관련된 4 kb 영역을 보여준다. 하기 정보는 프로브 데이터 표에 제공되어 있다:
- HyperG_Stats: 초기하 풍부화의 파라미터를 기초로 좌위에서 그 수의 유의한 EpiSwitch™ 마커를 발견할 확률에 대한 p-값
- 프로브 카운트 총계: 좌위에서 검사된 EpiSwitch™ 입체구조의 총 수
- 프로브 카운트 Sig: 좌위에서 통계학적으로 유의한 것으로서 발견된 EpiSwitch™ 입체구조의 수
- FDR HyperG: 다중-검정(가짜 발견율) 보정된 초기하 p-값
- 퍼센트 Sig: 좌위에서 검사된 마커의 수에 비해 유의한 EpiSwitch™ 마커의 백분율
- logFC: 후성유전적 비(FC)의 로그 밑수 2
- AveExpr: 모든 어레이들 및 채널들에 걸쳐 프로브에 대한 평균 log2-표현
- T: 조정된 t-통계자료
- p-값: 원 p-값
- adj. p-값: 조절된 p-값 또는 q-값
- B - B-통계자료(lods 또는 B)는 유전자가 차등적으로 발현되는 로그-승산(log-odds)이다.
- FC - 비-로그 배수 변화
- FC_1 - 0 주변에서 모여진 비-로그 배수 변화
- LS - 이진법 값. 이것은 FC_1 값과 관련된다. FC_1 값이 -1.1 미만인 경우, 이것은 -1로 설정되고, FC_1 값이 -1.1 초과인 경우, 이것은 1로 설정된다. 이 값들 사이의 값은 0이다.
유전자 표 데이터는 관련된 염색체 상호작용이 일어나는 것으로 확인된 유전자를 보여준다. 좌위 표의 p-값은 HyperG_Stats(초기하 풍부화의 파라미터를 기초로 좌위에서 그 수의 유의한 EpiSwitch™ 마커를 발견할 확률에 대한 p-값)와 동일하다.
프로브는 Taq1 부위로부터 30 bp만큼 떨어져 있도록 디자인된다. PCR의 경우, PCR 프라이머들도 결찰된 생성물을 검출하도록 디자인되나, Taq1 부위로부터의 이들의 위치는 상이하다.
프로브 위치:
시작 1 - 단편 1 상의 TaqI 부위의 30개 염기 업스트림
종결 1 - 단편 1 상의 TaqI 제한 부위
시작 2 - 단편 2 상의 TaqI 제한 부위
종결 2 - 단편 2 상의 TaqI 부위의 30개 염기 다운스트림
4 kb 서열 위치:
시작 1 - 단편 1 상의 TaqI 부위의 4000개 염기 업스트림
종결 1 -단편 1 상의 TaqI 제한 부위
시작 2 -단편 2 상의 TaqI 제한 부위
종결 2 - 단편 2 상의 TaqI 부위의 4000개 염기 다운스트림
상위 ALS PCR 마커들 각각에 대한 하기 정보는 표에 제공되어 있다:
- GLMNET - 전체 라소(lasso) 또는 엘라스틱-네트(elastic-net) 정규화를 피팅하기 위한 절차. 0.5로 설정된 람다(엘라스틱-네트)
- GLMNET_1 - 1로 설정된 람다(라소)
- FP - 정확 피셔 검정 P-값
- Coef - 로지스틱 회귀 계수, e(e^X)를 계수의 거듭제곱에 제곱하면 변수에 대한 승산 비를 얻는다.
- S.E. - 표준 오차
- Wald - Wald 방정식 통계자료. Wald 통계자료는 모델 계수의 최대 확률 추정치가 0과 동일한 Wald 검정의 부분이다. 상기 검정은 최대 확률 추정치와 0 사이의 차이가 점근적으로 정규 분포된다고 가정한다.
- Pr(>|Z|) - 로지스틱 모델 내의 마커에 대한 P-값. 0.05 미만의 값은 통계학적으로 유의하고 로지스틱 모델에서 사용되어야 한다.
샘플 준비 및 염색체 상호작용 검출에 대한 바람직한 실시양태
샘플을 준비하고 염색체 입체구조를 검출하는 방법들이 본원에 기재되어 있다. 이들 방법들의 최적화된 (비통상적인) 버전은 예를 들면, 이 단락에 기재된 바와 같이 이용될 수 있다.
전형적으로, 샘플은 적어도 2 x 105개의 세포를 함유할 것이다. 샘플은 최대 5 x 105개의 세포를 함유할 수 있다. 한 실시양태에서, 샘플은 2 x 105개 내지 5.5 x 105개의 세포를 함유할 것이다.
염색체 좌위에 존재하는 후성유전적 염색체 상호작용의 가교결합이 본원에 기재되어 있다. 이것은 세포 용해가 일어나기 전에 수행될 수 있다. 세포 용해는 3분 내지 7분, 예컨대, 4분 내지 6분 또는 약 5분 동안 수행될 수 있다. 일부 실시양태에서, 세포 용해는 적어도 5분 및 10분 미만 동안 수행된다.
제한 효소를 사용한 DNA의 분해가 본원에 기재되어 있다. 전형적으로, DNA 제한은 약 10분 내지 30분, 예컨대, 약 20분의 시간 동안 약 55℃ 내지 약 70℃, 예컨대, 약 65℃에서 수행된다.
바람직하게는, 최대 4000개 염기쌍의 평균 단편 크기를 갖는 결찰된 DNA의 단편을 생성하는 빈번한 절단제 제한 효소가 사용된다. 경우에 따라, 제한 효소는 약 200개 내지 300개 염기쌍, 예컨대, 약 256개 염기쌍의 평균 단편 크기를 갖는 결찰된 DNA의 단편을 생성한다. 한 실시양태에서, 전형적인 단편 크기는 200개 염기쌍 내지 4,000개 염기쌍, 예컨대, 400개 내지 2,000개 또는 500개 내지 1,000개 염기쌍이다.
EpiSwitch 방법의 한 실시양태에서, DNA 제한 분해 단계와 DNA 결찰 단계 사이에 DNA 침전 단계를 수행하지 않는다.
DNA 결찰은 본원에 기재되어 있다. 전형적으로, DNA 결찰은 5분 내지 30분, 예컨대, 약 10분 동안 수행된다.
샘플 내의 단백질은 효소를 사용함으로써, 예를 들면, 단백질분해효소, 경우에 따라 단백질분해효소 K를 사용함으로써 분해될 수 있다. 단백질은 약 30분 내지 1시간의 시간 동안, 예를 들면, 약 45분 동안 효소에 의해 분해될 수 있다. 한 실시양태에서, 단백질의 분해, 예를 들면, 단백질분해효소 K 분해 후, 가교결합 역전 또는 페놀 DNA 추출 단계가 없다.
한 실시양태에서, PCR 검출은 바람직하게는 결찰된 핵산의 존재/부재에 대한 이진법 판독으로 결찰된 핵산의 단일 카피를 검출할 수 있다.
본 발명의 방법 및 용도
본 발명의 방법은 상이한 방식으로 기재될 수 있다. 이 방법은 (i) 염색체 상호작용에 있어서 회합하는 염색체 영역들을 시험관내에서 가교결합시키는 단계; (ii) 상기 가교결합된 DNA를 자르거나 제한 분해 절단하는 단계; 및 (iii) 상기 가교결합된 절단된 DNA 말단을 결찰시켜 결찰된 핵산을 형성하는 단계를 포함하는, 결찰된 핵산을 제조하는 방법으로서 기재될 수 있고, 이 때 결찰된 핵산의 검출은 좌위에서 염색체 상태를 확인하는 데 이용될 수 있고, 바람직하게는
- 좌위는 본원에서 언급된 좌위, 영역 또는 유전자 중 임의의 좌위, 영역 또는 유전자일 수 있고/있거나,
- 염색체 상호작용은 본원에서 언급된 염색체 상호작용 중 임의의 염색체 상호작용 또는 표에 개시된 프로브들 중 임의의 프로브에 상응하는 염색체 상호작용일 수 있고/있거나,
- 결찰된 생성물은 (i) 본원에 개시된 프로브 서열들 중 임의의 프로브 서열과 동일하거나 상동한 서열, 또는 (ii) (ii)에 상보적인 서열을 가질 수 있거나 포함할 수 있다.
본 발명의 방법은 염색체 상호작용이 게놈의 소정의 후성유전적 활성(질환과 연관된) 영역 내에 존재하는지 아니면 부재하는지를 확인하는 단계를 포함하는, 집단 내의 상이한 서브그룹을 나타내는 염색체 상태를 검출하는 방법으로서 기재될 수 있고, 이 때 바람직하게는
- 서브그룹은 본원에서 언급된 특징의 존재 또는 부재로 정의되고/되거나,
- 염색체 상태는 본원에 언급된 임의의 좌위, 영역 또는 유전자에 존재할 수 있고/있거나,
- 염색체 상호작용은 본원에서 언급된 염색체 상호작용 중 임의의 염색체 상호작용 또는 본원에 개시된 프로브들 중 임의의 프로브에 상응하는 염색체 상호작용일 수 있다.
본 발명은 본원에서 언급된 임의의 좌위, 유전자 또는 영역에서 염색체 상호작용을 검출하는 것을 포함한다. 본 발명은 염색체 상호작용을 검출하기 위한 본원에서 언급된 핵산 및 프로브의 용도, 예를 들면, 적어도 10개, 20개, 100개 또는 500개의 상이한 좌위 또는 유전자에서 염색체 상호작용을 검출하기 위한 적어도 10개, 50개, 100개 또는 500개의 이러한 핵산 또는 프로브의 용도를 포함한다.
신규 치료를 확인하기 위한 본 발명의 방법의 용도
상이한 질환 상태들 사이에 공유된 염색체 상호작용의 지식은 병태에 대한 신규 치료를 확인하는 데 사용될 수 있다. 따라서, 공유된 염색체 상호작용이 일어나는 좌위에 작용하는, 특정 병태에 대한 공지된 요법은 염색체 상호작용과 관련된 다른 병태를 치료하는 데 사용될 수 있다. 따라서, 한 실시양태에서, 본 발명은 제1 병태를 치료하기 위한 요법을 선택하는 방법으로서, 그 병태와 연관된 염색체 상호작용이 제2 병태와도 연관되어 있는지를 확인하는 단계, 및 제1 병태의 치료를 위해 제2 병태를 치료하고 상기 염색체 상호작용이 일어나는 좌위에 작용하는 약물을 선택하는 단계를 포함하는 방법을 포함하고, 이 때 경우에 따라
- 염색체 상호작용은 본 명세서의 표들 중 어느 하나에서 정의된 바와 같고/같거나,
- 염색체 상호작용은 본원에서 언급된 방법에 의해 확인되고/되거나,
- 상기 좌위는 본 명세서의 표에서 언급된 임의의 영역 또는 유전자이고/이거나,
- 상기 제1 병태 및/또는 제2 병태는 본원에서 언급된 상이한 병태이다.
벤 도표 및 실시예는 유전자 및 염색체 상호작용을 공유하는 병태들을 언급한다. 제1 병태 및 제2 병태는 개별 벤 도표 또는 실시예의 개별 목록에 개시되어 있는 병태들의 조합으로부터 선택될 수 있다.
병태들의 공통 특징과 관련된 본 발명의 방법
상이한 병태들과 관련된 염색체 상호작용의 분석은 일부 상호작용이 이들 둘 다에서 일어나고 기저 공통 특징, 예컨대, 공통 기작 또는 원인을 나타낸다는 것을 보여주었다. 이러한 염색체 상호작용은 동일한 공통 특징을 갖는 병태를 검출하기 위한 '일반' 진단 검사의 기초로서 사용될 수 있다. 따라서, 본 발명은 방법이 복수의 병태(예컨대, 2개, 3개, 4개 또는 5개 이상의 병태)의 공통 특징에 대한 일반 진단 검사로서 수행되는 실시양태를 제공하고, 이 때 하나 초과의 병태에 공통된 염색체 상호작용의 존재가 확인되고, 경우에 따라
- 염색체 상호작용은 상이한 병태들에 대해 본원의 하나 초과의 표에서 언급되어 있고/있거나,
- 공통 특징은 자가면역 질환 및/또는 신경학적 병태라는 것이다.
벤 도표 및 실시예는 유전자 및 염색체 상호작용을 공유하는 병태들을 언급한다. 따라서, 이들은 공통 유전자 및 염색체 상호작용에 의해 확인된 기저 공통 특징을 갖는 병태를 개시한다. 바람직한 실시양태에서, 공통 유전자의 목록에 존재하는 적어도 1개, 3개, 5개 또는 10개의 염색체 상호작용 또는 상기 목록에서 공통된 것으로 확인된 염색체 상호작용이 검출된다.
상동체
폴리뉴클레오티드/핵산(예를 들면, DNA) 서열의 상동체가 본원에서 언급되어 있다. 이러한 상동체는 전형적으로 예를 들면, 적어도 10개, 15개, 20개, 30개 또는 100개 이상의 인접 뉴클레오티드들의 영역에 걸쳐, 또는 염색체 상호작용에 관여하는 염색체의 영역으로부터 유래한 핵산의 부분에 걸쳐 적어도 70%의 상동성, 바람직하게는 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99%의 상동성을 가진다. 상동성은 (종종 "엄격한 상동성"으로서 언급되는) 뉴클레오티드 동일성에 기초하여 계산될 수 있다.
따라서, 특정 실시양태에서, 폴리뉴클레오티드/핵산(예를 들면, DNA) 서열의 상동체는 본원에서 % 서열 동일성의 언급에 의해 언급된다. 전형적으로, 이러한 상동체는 예를 들면, 적어도 10개, 15개, 20개, 30개 또는 100개 이상의 인접 뉴클레오티드들의 영역에 걸쳐, 또는 염색체 상호작용에 관여하는 염색체의 영역으로부터 유래한 핵산의 부분에 걸쳐 적어도 70%의 서열 동일성, 바람직하게는 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99%의 서열 동일을 가진다.
예를 들면, UWGCG 팩키지는 (예를 들면, 그의 디폴트 설정에서 사용되는) 상동성 및/또는 % 서열 동일성을 계산하는 데 사용될 수 있는 BESTFIT 프로그램을 제공한다(Devereux et al (1984) Nucleic Acids Research 12, p387-395). PILEUP 및 BLAST 알고리즘은 예를 들면, 문헌(Altschul S.F. (1993) J Mol Evol 36:290-300; Altschul, S, F et al (1990) J Mol Biol 215:403-10)에 기재된 바와 같이 (전형적으로 그들의 디폴트 설정에서) 상동성 및/또는 % 서열 동일성을 계산하거나 서열을 일렬로 세우는(예컨대, 동등한 또는 상응하는 서열을 확인하는) 데 사용될 수 있다.
BLAST 분석을 수행하기 위한 소프트웨어는 국립 생명공학 정보 센터를 통해 공개적으로 입수될 수 있다. 이 알고리즘은 먼저 데이터베이스 서열에서 동일한 길이의 단어와 정렬될 때 일부 양의 값을 갖는 역치 점수 T와 일치하거나 이를 충족시키는 길이 W의 짧은 단어를 질의 서열에서 확인함으로써 고득점 서열 쌍(HSP)을 확인하는 단계를 포함한다. T는 이웃 단어 점수 역치로서 지칭된다(Altschul et al, supra). 이 초기 이웃 단어 히트(hit)는 이를 함유하는 HSP를 찾기 위해 검색을 시작하기 위한 시드(seed)로서 작용한다. 누적 정렬 점수가 증가될 수 있는 한, 단어 히트는 각각의 서열을 따라 양 방향으로 연장된다. 각각의 방향에서 단어 히트에 대한 연장은 누적 정렬 점수가 그의 최대 달성된 값으로부터 양 X만큼 떨어지거나; 누적 점수가 하나 이상의 음의 점수화 잔기 정렬의 축적으로 인해 0 이하까지 이르거나; 어느 한 서열의 말단에 도달된 때 중단된다. BLAST 알고리즘 파라미터 W5 T 및 X는 정렬의 민감성 및 속도를 결정한다. BLAST 프로그램은 11의 단어 길이(W), 50의 BLOSUM62 점수화 매트릭스(문헌(Henikoff and Henikoff (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 10915-10919) 참조) 정렬(B), 10의 기대치(E), M=5, N=4, 및 양 가닥들의 비교를 사용한다.
BLAST 알고리즘은 2개의 서열들 사이의 유사성의 통계학적 분석을 수행한다(예를 들면, 문헌(Karlin and Altschul (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-5787) 참조). BLAST 알고리즘에 의해 제공된 유사성의 한 척도는 2개의 폴리뉴클레오티드 서열들 사이의 일치가 우연히 일어날 확률의 표시를 제공하는 최소 합계 확률(P(N))이다. 예를 들면, 제1 서열과 제2 서열의 비교 시 최소 합계 확률이 약 1 미만, 바람직하게는 약 0.1 미만, 보다 바람직하게는 약 0.01 미만, 가장 바람직하게는 약 0.001 미만인 경우 서열은 또 다른 서열과 유사한 것으로 간주된다.
상동성 서열은 전형적으로 (뉴클레오티드의 치환, 결실 또는 삽입일 수 있는) 1개, 2개, 3개 또는 4개 이상의 염기, 예컨대, 10개, 15개 또는 20개 미만의 염기에 의해 상이하다. 이들 변화는 상동성 및/또는 % 서열 동일성의 계산과 관련하여 상기 언급된 영역들 중 임의의 영역에 걸쳐 측정될 수 있다.
어레이
제2 세트의 핵산은 어레이에 결합될 수 있고, 한 실시양태에서 바람직하게는 적어도 300개, 900개, 2000개 또는 5000개의 좌위를 나타내는, 어레이에 결합된 적어도 15,000개, 45,000개, 100,000개 또는 250,000개의 상이한 제2 핵산들이 존재한다. 한 실시양태에서, 하나 이상 또는 모든 상이한 집단의 제2 핵산은 오류 검출을 허용하도록 어레이 상에서 사실상 반복된, 어레이의 하나 초과의 상이한 영역에 결합된다. 어레이는 아질런트 슈어프린트(Agilent SurePrint) G3 주문제작 CGH 마이크로어레이 플랫폼에 기초할 수 있다. 제1 핵산과 어레이의 결합의 검출은 이중 색채 시스템에 의해 수행될 수 있다.
치료제
치료제가 본원에 언급되어 있다. 본 발명은 관련된 병태를 예방하거나 치료하는 데 사용하기 위한 작용제(agent)를 제공한다. 이것은 치료 유효량의 상기 작용제를, 필요로 하는 개체에게 투여하는 단계를 포함할 수 있다. 본 발명은 질환을 예방하거나 치료하기 위한 의약의 제조에 있어서의 상기 작용제의 용도를 제공한다. 본 발명의 방법은 치료를 위한 개체를 선택하는 데 이용될 수 있다. 본 발명의 방법, 특히 동반 후성유전자 검사를 수행하는 방법은 치료 단계를 포함할 수 있고, 이 때 상기 방법에 의해 확인된 사람은 관련된 병태를 예방하거나 치료하는 작용제를 투여받을 수 있다.
작용의 제제화는 작용제의 특성에 의해 좌우될 것이다. 작용제는 이 작용제 및 약학적으로 허용가능한 담체 또는 희석제를 함유하는 약학 조성물의 형태로 제공될 것이다. 적합한 담체 및 희석제는 등장성 식염수 용액, 예를 들면, 인산염 완충 식염수를 포함한다. 전형적인 경구 투약 조성물은 정제, 캡슐제, 액체 용액 및 액체 현탁액을 포함한다. 작용제는 비경구, 정맥내, 근육내, 피하, 경피 또는 경구 투여용으로 제제화될 수 있다.
작용제의 용량은 다양한 파라미터들, 특히 사용된 작용제; 치료되는 개체의 나이, 체중 및 병태; 투여 경로; 및 요구된 섭생법에 따라 결정될 수 있다. 의사는 임의의 특정 작용제를 위한 요구된 투여 경로 및 용량을 결정할 수 있을 것이다. 그러나, 적합한 용량은 예를 들면, 매일 1회 내지 3회 복용될 0.1 내지 100 mg/체중 kg, 예컨대, 1 내지 40 mg/체중 kg일 수 있다.
본원에서 언급된 물질의 형태
본원에서 언급된 물질들 중 임의의 물질, 예컨대, 핵산 또는 치료제는 정제된 또는 단리된 형태로 존재할 수 있다. 이 물질은 자연에서 발견되는 형태와 상이한 형태로 존재할 수 있고, 예를 들면, 이 물질은 자연에서 그 자신과 함께 존재하지 않는 다른 물질과 함께 존재할 수 있다. (본원에서 정의된 서열의 부분을 포함하는) 핵산은 자연에서 발견된 핵산과 상이한 서열, 예를 들면, 상동성에 대한 단락에 기재된 바와 같이 적어도 1개, 2개, 3개 또는 4개 이상의 뉴클레오티드 서열 변화를 갖는 서열을 가질 수 있다. 핵산은 5' 또는 3' 말단에서 이종 서열을 가질 수 있다. 핵산은 자연에서 발견되는 핵산과 화학적으로 상이할 수 있고, 예를 들면, 핵산은 일부 방식으로 변형될 수 있으나, 바람직하게는 여전히 왓슨-크릭 염기 페어링할 수 있다. 적절한 경우, 핵산은 이중 가닥 또는 단일 가닥 형태로 제공될 것이다. 본 발명은 단일 또는 이중 가닥 형태로 본원에서 언급된 특정 핵산 서열들 전부를 제공하므로, 개시된 임의의 서열에 대한 상보성 가닥을 포함한다.
본 발명은 특정 서브그룹과 연관된 염색체 상호작용의 검출을 포함하는, 본 발명의 임의의 방법을 수행하기 위한 키트도 제공한다. 이러한 키트는 관련된 염색체 상호작용을 검출할 수 있는 특이적 결합제, 예컨대, 본 발명의 방법에 의해 생성된 결찰된 핵산을 검출할 수 있는 물질을 포함할 수 있다. 키트에 존재하는 바람직한 물질은 예를 들면, 본원에 기재된 바와 같이, 결찰된 핵산에 하이브리드화할 수 있는 프로브 또는 PCR 반응에서 결찰된 핵산을 증폭할 수 있는 프라이머 쌍을 포함한다.
본 발명은 관련된 염색체 상호작용을 검출할 수 있는 장치도 제공한다. 상기 장치는 바람직하게는 염색체 상호작용을 검출할 수 있는 임의의 특이적 결합제, 프로브 또는 프라이머 쌍, 예컨대, 본원에 기재된 임의의 이러한 물질, 프로브 또는 프라이머 쌍을 포함한다.
특정 언급된 병태를 위해 본 발명에서 사용될 바람직한 치료제
A. 재발 완화형 다발성 경화증(RRMS)에 대한 소인
Figure pct00001
병태를 치료하기 위해 사용되는 약물 :
o 질환 변형 요법(DMT):
Figure pct00002
주사가능한 약물
o 아보넥스(Avonex)(인터페론 베타-1a)
o 베타세론(Betaseron)(인터페론 베타-1b)
o 코팍손(Copaxone)(글라티라머(glatiramer) 아세테이트)
o 엑스타비아(Extavia)(인터페론 베타-1b)
o 글라토파(Glatopa)(글라티라머 아세테이트)
o 플레그리디(Plegridy)(페그인터페론 베타-1a)
o 레비프(Rebif)(인터페론 베타-1a)
Figure pct00003
경구 약물
o 오바지오(Aubagio)(테리플루노마이드(teriflunomide))
o 길레니아(Gilenya)(핑골리모드(fingolimod))
o 텍피데라(Tecfidera)(디메틸 푸마레이트)
Figure pct00004
주입 약물
o 렘트라다(Lemtrada)(알렘투주맙(alemtuzumab))
o 노반트론(Novantrone)(미톡산트론(mitoxantrone))
o 티사브리(Tysabri)(나탈리주맙(natalizumab))
o 재발의 관리:
Figure pct00005
고용량 정맥내 Solu-Medrol®(메틸프레드니솔론(methylprednisolone))
Figure pct00006
고용량 경구 Deltasone®(프레드니손(prednisone))
Figure pct00007
H.P. 악타 겔(Acthar Gel)(ACTH)
o 스테로이드:
Figure pct00008
메틸프레드니솔론
B. 원발성 진행성 다발성 경화증(PPMS)의 가능성
Figure pct00009
병태를 치료하기 위해 사용되는 약물 :
o 스테로이드
o 면역억제 요법, 예컨대, 총 림프 방사선요법, 사이클로스포린, 메토트렉세이트, 2-클로로데옥시아데노신, 사이클로포스프아미드, 미톡산트론, 아자티오프린, 인터페론, 스테로이드 및 면역 글로빈
o 코팍손
o 오크렐리주맙(Ocrelizumab)(Genetech).
C. 빠른 진행성 근위축성 측삭 경화증(ALS) 질환 상태에 대한 소인
Figure pct00010
병태를 치료하기 위해 사용되는 약물 :
o 릴루졸(Riluzole)
o 바클로펜(Baclofen)
D. 2형 당뇨병 질환 상태에 대한 소인
Figure pct00011
병태를 치료하기 위해 사용되는 약물 :
o 메트포민(Metformin)
o 설포닐우레아, 예컨대,
Figure pct00012
글리벤클라마이드(glibenclamide)
Figure pct00013
글리클라자이드(gliclazide)
Figure pct00014
글리메피라이드(glimepiride)
Figure pct00015
글리피자이드(glipizide)
Figure pct00016
글리퀴돈(gliquidone)
o 글리타존(Glitazones)(티아졸리딘디온, TZD)
o 글립틴(Gliptins)(DPP-4 억제제), 예컨대,
Figure pct00017
리나글립틴(Linagliptin)
Figure pct00018
삭사글립틴(Saxagliptin)
Figure pct00019
시타글립틴(Sitagliptin)
Figure pct00020
빌다글립틴(Vildagliptin)
o GLP-1 아고니스트, 예컨대,
Figure pct00021
엑세나타이드(Exenatide)
Figure pct00022
리라글루타이드(Liraglutide)
o 아카보스(Acarbose)
o 나테글리나이드(Nateglinide) 및 레파글리나이드(Repaglinide)
o 인슐린 치료
E. 1형 당뇨병 질환 상태에 대한 소인
Figure pct00023
병태를 치료하기 위해 사용되는 약물 :
o 란투스(Lantus) 피하
o 란투스 솔로스타(Lantus Solostar) 피하
o 레베미어(Levemir) 피하
o 노보로그 플렉스펜(Novolog Flexpen) 피하
o 노보로그 피하
o 휴마로그(Humalog) 피하
o 노보로그 혼합물 70-30 플렉스펜 피하
o 시믈린펜(SymlinPen) 60 피하
o 휴마로그 퀵펜(KwikPen) 피하
o 시믈린펜 120 피하
o 노보린(Novolin) R 주사
o 투제오 솔로스타(Toujeo SoloStar) 피하
o 아피드라(Apidra) 피하
o 휴마로그 혼합물 75-25 피하
o 휴뮬린(Humulin) 70/30 피하
o 휴마로그 혼합물 75-25 퀵펜 피하
o 노보린 N 피하
o 휴뮬린 R 주사
o 노보린 70/30 피하
o 인슐린 디테미어(detemir) 피하
o 레베미어 플렉스터치(FlexTouch) 피하
o 휴뮬린 N 피하
o 인슐린 글라진(glargine) 피하
o 아피드라 솔로스타(Apidra SoloStar) 피하
o 인슐린 리스프로(lispro) 피하
o 인슐린 규칙적 인간 주사
o 인슐린 규칙적 인간 흡입
o 휴마로그 혼합물 50-50 퀵펜 피하
o 인슐린 아스파르트(aspart) 피하
o 노보로그 혼합물 70-30 피하
o 휴마로그 혼합물 50-50 피하
o 아프레자(Afrezza) 흡입
o 인슐린 NPH 인간 레콤브(recomb) 피하
o 인슐린 NPH 및 규칙적 인간 피하
o 인슐린 아스파르트 프로타민-인슐린 아스파르트 피하
o 휴뮬린 70/30 퀵펜 피하
o 휴뮬린 N 퀵펜 피하
o 트레시바(Tresiba) 플렉스터치 U-100 피하
o 트레시바 플렉스터치 U-200 피하
o 인슐린 리스프로 프로타민 및 리스프로 피하
o 프람린타이드(pramlintide) 피하
o 인슐린 글루리신(glulisine) 피하
o 노보로그 펜필(PenFill) 피하
o 인슐린 데글루덱(degludec) 피하
F. 전신 홍반성 루푸스(SLE) 질환 상태에 대한 소인
Figure pct00024
병태를 치료하기 위해 사용되는 약물 :
o 비스테로이드성 소염성 약물(NSAIDS): 이부프로펜(ibuprofen), 나프록센(naproxen) 및 디클로페낙(diclofenac).
o 하이드록시클로로퀸(Hydroxychloroquine)
o 코르티코스테리오드(Corticosteriods)
o 면역억제제: 아자티오프린, 메토트렉세이트, 마이코페놀레이트 모페틸 및 사이클로포스프아미드
o 리툭시맙(Rituximab)
o 벨리무맙(Belimumab)
o 코르티코스테로이드(Corticosteroids): 프레드니손, 코르티손 및 하이드로코르티손
o NSAID: 인도메타신(인도신(Indocin)), 나부메톤(렐라펜(Relafen)) 및 셀레콕십(셀레브렉스(Celebrex))
o 소염제: 아스피린 및 아세트아미노펜(타이레놀(Tylenol))
o 질환 변형 항-류마티스성 약물(DMARD): 하이드록시클로로퀸(플라케닐(Plaqenil)), 사이클로스포린(젠그라프(Gengraf), 네오랄(Neoral), 산디뮨(Sandimmune)), 및 아자티오프린(아자산(Azasan), 이뮤란(Imuran)).
o 항말라리아제: 클로로퀸(아랄렌(Aralen)) 및 하이드록시클로로퀸(플라쿠에닐(Plaquenil)).
o BLyS 특이적 억제제 또는 단일클론 항체(MAbS): 벨리무맙(벤라이스타(Benlysta)).
o 면역억제제/면역 조절제: 아자티오프린(이뮤란), 메토트렉세이트(류마트렉스(Rheumatrex)) 및 사이클로포스프아미드(사이톡산(Cytoxan)).
o 항응고제: 저용량 아스피린, 헤파린(칼시파린(Calciparine), 리쿠애민(Liquaemin)) 및 와파린(쿠마딘(Coumadin)).
G. 궤양성 대장염 질환 상태에 대한 소인
Figure pct00025
병태를 치료하기 위해 사용되는 약물 :
o 소염성 약물: 아미노살리실레이트 - 설파살라진(아줄피딘(Azulfidine))뿐만 아니라, 메살라민(아사콜(Asacol), 리알다(Lialda), 로와사(Rowasa), 카나사(Canasa) 등), 발살라자이드(콜라잘(Colazal)) 및 올살라진(디펜툼(Dipentum)) 및 코르티코스테로이드(프레드니손 및 하이드로코르티손)를 포함하는 일부 5-아미노살리실레이트
o 면역 시스템 억제제: 아자티오프린(아자산, 이뮤란), 머캡토푸린(푸린에톨(Purinethol), 푸릭삼(Purixam)), 사이클로스포린(젠그라프, 네오랄, 산디뮨), 인플릭시맙(레미케이드(Remicade)), 아달리무맙(휴미라(Humira)), 골리무맙(심포니(Simponi)) 및 벤돌리주맙(엔티비오(Entyvio)).
o 궤양성 대장염의 특정 증상을 관리하기 위한 다른 약물:
Figure pct00026
항생제
Figure pct00027
지사 약물
Figure pct00028
통증 경감제
Figure pct00029
철 보충제
H. 궤양성 대장염 환자에 대한 대장암 재발의 가능성
Figure pct00030
병태를 치료하기 위해 사용되는 약물 :
아미노살리실레이트
UC 스테로이드
아자티오프린
I. 신경섬유종증 환자에 대한 악성 말초 신경초 종양의 가능성
Figure pct00031
치료
MPNST에 대한 치료는 수술, 방사선요법 및 화학요법을 포함한다.
J. 전립선암 및/또는 공격성 전립선암의 발생 가능성
Figure pct00032
병태를 치료하기 위해 사용되는 약물 :
Figure pct00033
황체형성 호르몬 방출 호르몬(LHRH) 아고니스트
Figure pct00034
항-안드로겐 치료
Figure pct00035
조합된 LHRH 및 항-안드로겐 치료
o 스테로이드
o 다른 의학적 치료:
Figure pct00036
아비라테론(Abiraterone)
Figure pct00037
엔잘루타마이드(Enzalutamide)
Figure pct00038
도세탁셀(Taxotere®)
Figure pct00039
카보플라틴 또는 시스플라틴 화학요법
K. 알츠하이머병:
Figure pct00040
병태를 치료하기 위해 사용되는 약물 :
Figure pct00041
도네페질(Donepezil)
Figure pct00042
리바스티그민(Rivastigmine)
Figure pct00043
갈란타민(Galantamine)
Figure pct00044
메만틴(Memantine)
공개문헌
본원에서 언급된 모든 공개문헌들의 내용은 본 명세서 내로 참고로 도입되고 본 발명과 관련된 특징을 더 정의하는 데 이용될 수 있다.
특정 실시양태
EpiSwitch™ 플랫폼 기술은 좌위에서 정상 상태와 비정상 상태 사이의 조절 변화의 후성유전적 조절 시그너처를 검출한다. EpiSwitch™ 플랫폼은 염색체 입체구조 시그너처로서도 공지된 인간 염색체의 조절 고차 구조와 연관된 유전자 조절의 기본 후성유전적 수준을 확인하고 모니터링한다. 염색체 시그너처는 유전자 탈조절의 캐스케이드에서 구별되는 일차 단계이다. 이들은 후기 후성유전적 바이오마커 및 유전자 발현 바이오마커, 예컨대, DNA 메틸화 및 RNA 프로파일링을 이용하는 바이오마커 플랫폼에 비해 독특한 세트의 장점을 갖는 고차 바이오마커이다.
EpiSwitch™ 어레이 어세이
주문제작 EpiSwitch™ 어레이 스크리닝 플랫폼은 4종의 밀도인 15K, 45K, 100K 및 250K 독특한 염색체 입체구조로 입고되고, 각각의 키메라 단편은 어레이 상에서 4회 반복되어, 각각 유효 밀도 60K, 180K, 400K 및 1 백만을 만든다.
주문제작 디자인된 EpiSwitch™ 어레이
15K EpiSwitch™ 어레이는 EpiSwitch™ 바이오마커 탐색 기술에 의해 조사되는 약 300개의 좌위를 포함하는 전체 게놈을 스크리닝할 수 있다. EpiSwitch™ 어레이는 아질런트 슈어프린트 G3 주문제작 CGH 마이크로어레이 플랫폼 상에서 구축되고; 이 기술은 4종의 밀도인 60K, 180K, 400K 및 1 백만 프로브를 제공한다. 각각의 EpiSwitch™ 프로브가 사중체로서 제공됨으로써, 재현가능성의 통계학적 평가를 가능하게 하기 때문에 어레이당 밀도는 15K, 45K, 100K 및 250K까지 감소된다. 유전자 좌위당 조사되는 잠재적 EpiSwitch™ 마커의 평균 수는 50이고; 따라서, 조사될 수 있는 좌위의 수는 300, 900, 2000 및 5000이다.
EpiSwitch™ 주문제작 어레이 파이프라인
EpiSwitch™ 어레이는 EpiSwitch™ 라이브러리 생성 후 Cy5로 표지된 한 세트의 샘플, 및 Cy3으로 표지된, 비교/분석될 다른 세트의 샘플(대조군)을 갖는 이중 색채 시스템이다. 아질런트 슈어스캔 스캐너(Agilent SureScan Scanner)를 이용하여 상기 어레이를 스캐닝하고 아질런트 특징 추출 소프트웨어를 이용하여 생성된 특징을 추출한다. 그 다음, R에서 EpiSwitch™ 어레이 프로세싱 스크립트를 사용하여 데이터를 프로세싱한다. R 내의 바이오컨덕트에서 표준 이중 색채 팩키지를 사용하여 어레이를 프로세싱한다: Limma*. Limma*에서 어레이 기능 내에서의 표준화를 이용하여 상기 어레이의 표준화를 수행하고, 이것을 온 칩(on chip) 아질런트 양성 대조군 및 EpiSwitch™ 양성 대조군에 대해 수행한다. Limma*를 이용하여 데이터를 분석하기 위해 아질런트 플래그(Flag) 판정을 기초로 데이터를 여과하고, 아질런트 대조군 프로브를 제거하고, 기술적 복제물 프로브의 평균을 산출한다. 비교된 후 가짜 발견율의 이용에 의해 보정되는 2개의 시나리오들 사이의 프로브의 차이를 기초로 프로브를 모델링한다. <=-1.1 또는 =>1.1이고 p<=0.1 FDR p-값을 통과한 변동 계수(CV) <=30%를 갖는 프로브를, 추가 스크리닝을 위해 사용한다. 프로브 세트를 감소시키기 위해, R에서 FactorMineR 팩키지를 사용하여 추가 다중 요인 분석을 수행한다.
*주석: LIMMA는 마이크로어레이 실험에서 차등 발현을 평가하기 위한 선형 모델 및 실험적 베이즈(Bayes) 과정이다. Limma는 마이크로어레이 또는 RNA-Seq로부터 발생된 유전자 발현 데이터의 분석을 위한 R 팩키지이다.
최종 선발을 위해 p-값, FC 및 CV <30%(임의 컷 오프 점) 파라미터를 기초로 프로브의 풀을 먼저 선택한다. 처음 2개의 파라미터(조절된 p-값; FC)만을 기초로 추가 분석 및 최종 목록을 작성한다.
실시예
본 발명은 하기 비한정적 실시예에 의해 예증된다.
실시예 - 통계학적 파이프라인
EpiSwitch™ PCR 플랫폼 상으로의 이전을 위해 높은 값의 EpiSwitch™ 마커를 선택하기 위해 R에서 EpiSwitch™ 분석 팩키지를 사용하여 EpiSwitch™ 스크리닝 어레이를 프로세싱한다.
단계 1
변형된 선형 회귀 모델의 결과물인 프로브의 보정된 p-값(가짜 발견율, FDR)을 기초로 프로브를 선택한다. p-값 <= 0.1 미만의 프로브를 선택한 후 그의 후성유전적 비(ER)로 더 감소시키고, 프로브 ER은 추가 분석을 위해 선택되기 위해 <=-1.1 또는 =>1.1이어야 한다. 마지막 필터는 변동 계수(CV)이고, 프로브는 <=0.3 미만이어야 한다.
단계 2
PCR 이전을 위한 마커로서 선택하기 위해 마커들의 ER을 기초로 통계학적 목록으로부터 상위 40개의 마커들을 선택한다. 가장 높은 음성 ER 로드(load)를 갖는 상위 20개의 마커들 및 가장 높은 양성 ER 로드를 갖는 상위 20개의 마커들이 목록을 형성한다.
단계 3
단계 1로부터의 생성된 마커인 통계학적으로 유의한 프로브는 초기하 풍부화(HE)를 이용한 풍부화 분석의 기초를 형성한다. 이 분석은 유의한 프로브 목록으로부터의 마커 감소를 가능하게 하고, 단계 2로부터의 마커와 함께 EpiSwitch™ PCR 플랫폼 상으로 이전되는 프로브의 목록을 형성한다.
통계학적 프로브를 HE로 프로세싱하여, 어느 유전자 위치가 통계학적으로 유의한 프로브를 풍부하게 갖는지를 확인하는데, 이것은 어느 유전자 위치가 후성유전적 차이의 중심지인지를 표시한다.
프로브 목록 생성을 위해, 보정된 p-값을 기초로 가장 유의한 풍부해진 좌위를 선택한다. 0.3 또는 0.2의 p-값 미만의 유전자 위치를 선택한다. 단계 2로부터의 마커와 함께, 이들 유전자 위치에 맵핑하는 통계학적 프로브는 EpiSwitch™ PCR 이전을 위한 높은 값의 마커를 형성한다.
어레이 디자인 및 프로세싱
어레이 디자인
1. SII 소프트웨어(현재 v3.2)를 이용하여 유전자 좌위를 프로세싱한다:
a. 이들 특정 유전자 좌위에서 게놈의 서열을 뽑아낸다(50 kb 업스트림 및 20 kb 다운스트림을 갖는 유전자 서열)
b. 이 영역 내의 서열이 CC에 관여될 확률을 정의한다.
c. 특정 RE를 이용하여 서열을 절단한다.
d. 어느 제한 단편이 특정 배향으로 상호작용할 가능성이 있는지를 확인한다.
e. 상이한 CC가 함께 상호작용할 가능성의 순위를 매긴다.
2. 어레이 크기를 결정하여, 이용가능한 프로브 위치의 수(x)를 결정한다.
3. x/4 상호작용을 뽑아낸다.
4. 각각의 상호작용에 대해 부분 1로부터의 제한 부위까지 30 bp의 서열 및 부분 2의 제한 부위까지 30 bp의 서열을 정의한다. 이들 영역들이 반복부가 아닌지를 확인하고, 만약 그렇다면 배제하고 다음 상호작용을 목록에 적는다. 30 bp의 양 서열들을 연결하여 프로브를 정의한다.
5. x/4 프로브와 소정의 대조군 프로브의 목록을 생성하고 4회 반복하여 어레이 상에서 생성될 목록을 생성한다.
6. 주문제작 CGH 어레이를 위해 프로브의 목록을 아질런트 슈어 디자인 웹사이트 상에 업로드한다.
7. 프로브 군을 사용하여 아질런트 주문제작 CGH 어레이를 디자인한다.
어레이 프로세싱
1. 주형 생성을 위해 EpiSwitch™ SOP를 사용하여 샘플을 프로세싱한다.
2. 어레이 프로세싱 실험실에 의한 에탄올 침전으로 세정한다.
3. 아질런트 슈어태그(SureTag) 완전 DNA 표지부착 키트 - 혈액, 세포 또는 조직에 대한 게놈 DNA 분석 효소 표지부착을 위한 아질런트 올리고뉴클레오티드 어레이 기초 CGH에 따라 샘플을 프로세싱한다.
4. 아질런트 특징 추출 소프트웨어를 사용한 아질런트 C 스캐너를 사용하여 스캔한다.
적응증 실시예
실시예 1 - 근위축성 측삭 경화증(ALS)
운동 신경 질환인 근위축성 측삭 경화증(ALS 또는 루게릭병)은 중추신경계에서의 일차 운동 신경의 진행성 사멸을 특징으로 하는 치명적인 신경변성 질환이다. 증상은 근육 약화 및 근육 소모, 삼키는 것 및 일상적인 일의 착수에 있어서 어려움을 포함한다. 상기 질환이 진행함에 따라, 호흡을 담당하는 근육은 점진적으로 작동하지 못하여, 호흡에 있어서 어려움 및 최종적으로 사망을 야기한다. ALS는 100,000명당 2명의 평균 유병률을 갖지만 영국 및 미국에서는 100,000명당 최대 5명으로 더 높다. 이러한 병태를 갖는 환자들이 미국에는 50,000명 이상 존재하고 영국에는 5,000명 이상 존재하는 것으로 추정된다. ALS 환자에 대한 사망률은 높다: ALS로 진단받은 때부터 중간 생존(즉, 50%의 환자들이 사망한 시간)은 연구마다 다르지만, 가장 신뢰할만한(비편향된) 집단 연구에서 상기 중간 생존은 18개월 내지 30개월의 범위 내에서 약 22개월이다. 공지된 치유법은 없지만, ALS의 치료는 지지 케어에 초점을 맞춘다. 치료용으로 현재 승인된 유일한 약물, 즉 ALS 환자에게 수명의 적당한 증가를 제공하되 증상의 최소 개선을 제공하는 릴루졸이 존재한다. ALS의 생물학적 기초에 대한 집중적인 연구에도 불구하고, 진단 및 치료 방법뿐만 아니라 질환 진행의 모니터링도 도전과제로 남아있다. 이러한 예후 검사는 임상 불균질성의 생물학적 매개자에 따른 환자의 서브계층화를 가능하게 하여, 잠재적으로 빠른 진행자 및 느린 진행자를 확인하여 보다 더 정확한 예후 및 케어 계획을 가능하게 함으로써 ALS 환자에게 크게 유익할 것이다. OBD는 ALS에 대한 진단, 예후 및 예측 EpiSwitch™ 바이오마커를 개발하고 검증하기 위해 건강한 대조군에 대해 ALS를 계층화하고 느린 진행성 ALS에 대해 빠른 진행성 ALS를 계층화하기 위한 EpiSwitch™ 마커를 발견하였다.
공급원: 북동부 근위축성 측삭 경화증 컨소시엄(NEALS) - 미국
ALS 프로브 - 건강한 대조군에 대해 ALS를 계층화하기 위한 EpiSwitch™ 마커에 대해서는 이하 표 1a, 1b, 1c 및 1d를 참조한다. 표 10은 이 적응증에 대한 유전자 데이터를 보여준다.
상위 ALS 어레이 마커를 검증하고 상호작용을 연구할 수 있는 프라이머를 확인하기 위한 추가 작업을 수행하였다. 어레이 마커의 통계학적 분석은 PCR 기초 어세이 개발을 위한 최종후보자명단 선택을 알려주었다. 가장 우수한 계층화 ALS 어레이 프로브의 목록으로부터 99개의 마커들을 PCR 단계로 넘겼다.
통합된 DNA 기술(IDT) 소프트웨어(및 요구된 경우 Primer3web 버전 4.0.0 소프트웨어)를 이용하여 마이크로어레이로부터 확인된 마커로부터 프라이머를 디자인하였다. 각각의 프라이머 세트에 대한 프라이머 검사를 수행하였고; 적절한 프라이머가 잠재적 상호작용을 연구할 수 있다는 것을 보장하기 위해 샘플의 풀링된 서브세트에 대해 각각의 세트를 검사하였다. PCR로부터의 증폭된 생성물의 존재는 특정 염색체 상호작용이 일어났다는 것을 표시하는, 결찰된 생성물의 존재를 표시하는 것으로 간주되었다. 프라이머 검사가 성공적인 경우, 프라이머 세트를 스크리닝에 넘겼다.
일변량(LIMMA 팩키지, R 언어) 통계자료와 다변량(GLMNET 팩키지, R 언어) 통계자료의 조합을 이용하여 시그너처 세트를 단리하였고 WEKA(머신 러닝 알고리즘 팩키지) 내의 로지스틱 모델링을 이용하여 검증하였다. 북동부 근위축성 측삭 경화증 컨소시엄(NEALS)으로부터의 데이터를 사용하여 58명의 개체들(29 x ALS; 29 x 건강한 대조군 - HC)에 대한 검증을 위해 가장 우수한 10개의 계층화 PCR 마커들을 선택하였다. 이들은 그들의 정확 피셔의 P-값에 기초하여 선택되었다. 모든 3회의 검사들로부터 일관되게 우수한 마커는 CD36 내의 EpiSwitch 마커이었다. 표 44에 제시된 처음 9개의 PCR 마커들은 90% 순위 구별 지표로 ALS와 HC 사이를 계층화하였다. 옥스퍼드 대학에 의해 제공된 샘플들의 작은 독립적인 코호트에 대해 ALS 데이터를 분석하였다. 심지어 샘플의 작은 서브세트에서도 샘플들의 계층화는 바이오마커에 기초하는 것으로 밝혀졌다. 4개의 마커들은 0.3 미만의 p-값으로 32개의 샘플들(16개의 ALS, 16개의 건강한 대조군)의 서브세트를 계층화한다. 이들 마커들은 각각 유전자 EGFR, DNM3, CD36 및 GLYCAM1 내의 ALS.21.23_2, DNM3.5.7_8, ALS.61.63_4 및 NEALS.101.103_32이다. 피셔-정확 검정, GLMNET 및 베이지안(Bayesian) 로지스틱 모델링은 상기 4종의 핵심 마커들 이외에 CLIC4를 귀중한 마커로서 표시하였다.
실시예 2 - II형 진성 당뇨병(DM)(T2DM)
2형 당뇨병(T2DM으로서도 공지됨)은 가장 흔한 형태의 당뇨병이다. 당뇨병은 췌장이 혈당 수준을 조절하는 충분한 호르몬 인슐린을 생성하지 않거나, 신체가 감소된 인슐린 민감성으로 인해 그 자신이 생성하는 호르몬을 효과적으로 사용할 수 없을 때 일어날 수 있다. 최근까지, T2DM은 성인에서만 진단되었으나, 현재 소아 및 청년에서도 발생한다. 세계보건기구(WHO)에 따르면, 당뇨병은 전 세계적으로 346백만 명의 환자들에 의해 대유행 수준에 도달하였고, 그의 발병률은 2030년까지 2배가 될 것으로 예측된다. 2004년에만, 대략 3백 4십만 명의 사람들이 당뇨병 및 이의 합병증의 결과로서 사망하였고, 사망의 대부분은 저소득 국가 및 중소득 국가에서 발생하였다. T2DM의 발병률은 노령 인구, 생활스타일의 변화, 예컨대, 운동의 부족 및 흡연뿐만 아니라, 식습관 및 비만으로 인해 증가하고 있다. T2DM은 인슐린에 의존하지 않고 생활스타일, 예컨대, 식습관, 운동의 변화에 의해 조절될 수 있고, 약물에 의해서도 도움을 받을 수 있다. 인슐린으로 치료된 개체는 중증 저혈당증(낮은 혈당 수준)을 발생시킬 보다 더 높은 위험에 있으므로, 그의 약물 및 혈당 수준은 정기적인 모니터링을 요구한다. 일반적으로, 확립된 T2DM을 갖는 노인은 심혈관 질환(CVD) 및 다른 합병증의 보다 더 높은 위험에 있으므로, 통상적으로 최근 인식된 질환을 갖는 젊은 성인보다 더 많은 치료를 요구한다. 영국에서 7백만 명의 사람들이 T2DM으로 진행할 위험을 증가시키는 당뇨병 전증 병태에 의해 영향을 받은 것으로 추정되었다. 이러한 개체들은 상승된 혈당 수준을 특징으로 하나, 통상적으로 증상을 보이지 않으므로, 그들의 건강에 점진적인 영향을 미치는 수년 동안 간과될 수 있다. 본 발명자들은 당뇨병 전증 상태 및 T2DM에 대한 예후 계층화를 개발한다. 본원은 건강한 대조군에 대해 당뇨병 전증 상태(pre-T2DM)를 계층화하기 위한 EpiSwitch™ 마커뿐만 아니라, 건강한 대조군에 대해 T2DM을 계층화하기 위한 EpiSwitch™ 마커, 및 느린 T2DM에 대해 공격성 T2DM을 계층화하기 위한 예후 마커의 발견도 제공한다.
공급원: 노르포크(Norfolk) 및 노르위치(Norwich) 대학 병원(NNUH), NHS 재단 트러스트(Trust) - 노르위치 영국
2형 진성 당뇨병 전증 프로브 - 건강한 대조군에 대해 2형 당뇨병 전증을 계층화하기 위한 EpiSwitch™ 마커에 대해서는 이하 표 2a, 2b, 2c 및 2d를 참조한다. 표 11은 유전자 데이터를 보여준다.
2형 진성 당뇨병 프로브 - 건강한 대조군에 대해 2형 진성 당뇨병을 계층화하기 위한 EpiSwitch™ 마커에 대해서는 이하 표 3a, 3b, 3c 및 3d를 참조한다. 표 12는 유전자 데이터를 보여준다.
실시예 3 - I형 진성 당뇨병(T1DM)
1형 진성 당뇨병(DM)(T1DM으로서도 공지됨; 이전에 인슐린 의존성 당뇨병 또는 소아 당뇨병)은 췌장에서 인슐린 생성 베타 세포의 자가면역 파괴로부터 비롯된 당뇨병의 한 형태이다. 보편적인 증상은 다뇨증(빈뇨), 조갈증(증가된 갈증), 다식증(증가된 배고픔) 및 체중 손실이다. T1DM은 모든 당뇨병 사례들의 5%를 차지하지만, 소아들 사이에서 가장 흔한 내분비 및 대사 병태들 중 하나이다. 그의 원인은 공지되어 있지 않으나, 유전적 요인 및 환경적 유발자 둘 다가 관여한다고 생각된다. 전 세계적으로, 해마다 약 80,000명의 소아들이 이 질환을 발생시킨다고 추정되지만, T1DM을 갖는 사람들의 수는 공지되어 있지 않다. 신규 사례의 발생은 국가 및 지역마다 다르다. 미국 및 북유럽에서는 해마다 100,000건당 8건 내지 17건의 신규 사례가 발생한다. 당뇨병의 치료는 혈당, 및 혈관을 손상시키는 다른 공지된 위험 요인의 수준을 낮추는 단계를 포함한다. 인슐린의 투여는 생존을 위해 필수적이다. 인슐린 요법은 무한정 계속되어야 하고 통상적으로 정상적인 일상 활동을 손상시키지 않는다. 치료되지 않은 당뇨병은 많은 심각한 장기간 합병증, 예컨대, 심장 질환, 졸중, 신부전, 족부 궤양 및 눈에의 손상을 야기할 수 있다. 급성 합병증은 당뇨병성 케톤산증 및 혼수상태를 포함한다. OBD의 당뇨병 프로그램은 T1DM의 진단 및 예후 계층화를 위한 EpiSwitch™ 바이오마커의 개발에 초점이 맞추어져 있다.
본원은 건강한 대조군에 대해 T1DM을 계층화하기 위한 EpiSwitch™ 마커를 제공한다.
공급원: 글래스고우(Glasgow)에 근거지를 둔 프로큐어먼트 컴파니 티슈 솔루션스(Procurement Company Tissue Solutions)에 의해 수집된 백인 샘플(러시아에서 수집된 샘플); NEALS 컨소시엄 대조군(미국).
1형 진성 당뇨병(T1DM) 프로브 - 건강한 대조군에 대해 T1DM을 계층화하기 위한 EpiSwitch™ 마커에 대해서는 이하 표 4a, 4b, 4c 및 4d를 참조한다. 표 13은 유전자 데이터를 보여준다.
실시예 4 - 궤양성 대장염(UC)
위장관의 만성 염증성 질환인 궤양성 대장염(UC)은 해마다 100,000명당 10명의 발병률 및 100,000명당 243명의 유병률을 갖는, 가장 흔한 유형의 염증성 장 질환이다. UC는 어느 연령대에서나 발생할 수 있지만, 15세 내지 30세의 사람들 및 60세가 넘는 사람들에게서 발생할 가능성이 더 높다. 궤양성 대장염의 정확한 원인은 공지되어 있지 않다. 그러나, 과다활성 장 면역 시스템, 가족력 및 환경적 요인(예를 들면, 감정적 스트레스)이 UC를 야기하는 데 있어서 역할을 할 수 있다고 생각된다.
상기 질환은 다른 인종 및 민족 서브그룹보다 백인 및 아슈케나지 유대인 출신의 사람들에서 더 널리 퍼져있다. 이 병태의 가장 흔한 징후 및 증상은 혈액 또는 고름을 갖는 설사 및 복부 불편이다. 이 병태는 관절, 척추, 피부, 눈, 및 간 및 이의 담관에서 염증을 야기할 수도 있다. 가족력, 신체 검사, 실험실 검사 및 대장의 내시경검사를 고려함으로써 UC 진단을 수행한다. 이 평생 질환은 상당한 이환율, 및 특히 잘 조절되지 않는 경우 사회적 및 심리적 후유증에 대한 잠재력과 연관되어 있다. 궤양성 대장염을 갖는 사람들 중 어림잡아 30% 내지 60%는 해마다 적어도 1회 재발을 가질 것이다. 이들 중 약 80%는 경증 내지 중등도이고 약 20%는 중증이다. UC를 갖는 사람들 중 대략 25%는 그들의 일생 동안 급성 중증 결장염의 하나 이상의 에피소드를 가질 것이다. 이들 중 20%는 그들의 첫 번째 입원 시 결장의 전부 또는 일부의 수술적 제거(결장절제술)를 필요로 할 것이고, 40%는 그들의 다음 입원 시 이러한 수술적 제거를 필요로 할 것이다. 사망률이 지난 30년에 걸쳐 꾸준히 개선되었지만, 급성 중증 결장염은 여전히 최대 2%의 사망률을 가진다. 사망률은 의학적 요법 및 결장절제술을 포함하는 중재술의 시기에 의해 직접적으로 영향을 받는다.
궤양성 대장염은 오래 지속된 및 광범위한 질환에서 가장 큰 위험을 갖는, 대장암의 발생과 잘 확립된 연관성을 가진다. 재발의 치료는 임상 중증도, 질환의 정도 및 환자의 선호도에 의해 좌우될 수 있고 아미노살리실레이트, 코르티코스테로이드 또는 면역조절제의 사용을 포함할 수 있다. 그로 인한 물질 및 투약 섭생법의 넓은 선택은 영국 전체에 걸쳐 관리에 있어서 광범위한 불균질성을 생성하였고, 건강관리 전문가가 일관된 고품질 케어를 제공하는 데 도움을 주는 포괄적인 지침의 중요성을 강조한다.
본원은 UC에 대한 질환 특이적 시그너처의 발생을 위해 건강한 대조군에 대해 UC를 계층화하기 위한 EpiSwitch™ 마커를 제공한다.
공급원: 글래스고우에 근거지를 둔 프로큐어먼트 컴파니 티슈 솔루션스에 의해 수집된 백인 샘플(러시아에서 수집된 샘플); NEALS 컨소시엄 대조군(미국).
궤양성 대장염(UC) 프로브 - 건강한 대조군에 대해 UC를 계층화하기 위한 EpiSwitch™ 마커에 대해서는 이하 표 5a, 5b, 5c 및 5d를 참조한다. 표 14는 유전자 데이터를 보여준다.
실시예 5 - 전신 홍반성 루푸스(SLE)
원반모양 루푸스 또는 파종 홍반성 루푸스로서도 공지된 전신 홍반성 루푸스(SLE)는 피부, 관절, 신장, 뇌 및 다른 장기에 영향을 미치는 자가면역 질환이다. "루푸스"는 다수의 상이한 질환들을 포함하지만, SLE는 가장 흔한 유형의 루푸스이다. SLE는 발진, 감광성, 구강 궤양, 관절염, 폐 및 심장을 둘러싸는 내층의 염증, 신장 문제, 발작 및 정신병, 및 혈액 세포 비정상을 포함하는 넓은 어레이의 임상 징후를 갖는 질환이다. 증상은 달라질 수 있고 시간의 경과에 따라 변화할 수 있으며 질환 특이적이 아니어서, 진단하기 어렵다. 이 질환은 유년기부터 노년기까지 발생하고, 15세 내지 40세에 가장 많이 발생한다. 집단에서의 SLE의 보고된 유병률은 100,000건의 사례당 20건 내지 150건의 사례이다. 여성에서, 유병률은 100,000명당 164명(백인) 내지 406명(아프리카계 미국인)이다. 경증 질환의 개선된 검출로 인해, 발병률은 20세기의 지난 40년 동안 거의 3배가 되었다. 추정된 발병률은 북아메리카, 남아메리카, 유럽 및 아시아에서 100,000명당 1명 내지 25명이다. SLE의 정확한 원인은 공지되어 있지 않으나, 여러 요인들이 이 질환과 연관되어 있다. 루푸스를 갖는 사람들은 종종 다른 자가면역 병태를 갖는 가족 구성원을 가진다. 자외선, 일부 약물, 바이러스, 신체적 또는 감정적 스트레스 및 외상과 같은 환경적 유발제가 있을 수 있다. SLE에 대한 치유법은 없고 치료는 증상을 완화시키는 것이다. 이들은 발현된 증상에 따라 달라질 것이고 소염성 약물, 스테로이드, 코르티코스테로이드 및 항-말라리아 약물을 포함할 수 있다. 생존은 개선되고 있는데, 이것은 더 많은 또는 더 경미한 사례가 인식되고 있다는 것을 암시한다. OBD는 SLE에 대한 예후 시그너처를 개발하고 있다.
SLE 프로브 - 건강한 대조군에 대해 SLE를 계층화하기 위한 EpiSwitch™ 마커에 대해서는 표 6a, 6b, 6c 및 6d를 참조한다. 표 15는 유전자 데이터를 보여준다.
공급원: 글래스고우에 근거지를 둔 프로큐어먼트 컴파니 티슈 솔루션스에 의해 수집된 백인 샘플(러시아에서 수집된 샘플); NEALS 컨소시엄 대조군.
실시예 6 - 다발성 경화증(MS)
다발성 경화증(MS)은 뇌 및 척수 둘 다에 영향을 미치는, 중추신경계(CNS)의 후천성 만성 면역 매개 염증성 병태이다. MS의 원인은 공지되어 있지 않다. 유전적으로 취약한 사람들에서 환경적 유발제에 대한 비정상적인 면역 반응이 면역 매개 급성 및 만성 염증을 초래한다고 생각된다. 염증의 초기 다음에, 신경계 내의 영향받은 세포의 진행성 변성기가 있다. MS는 유럽, 미국, 캐나다, 뉴질랜드, 및 호주의 일부 구역에서 사람들 사이에 더 흔하고, 아시아 및 열대지방에서 덜 흔하다. 이 질환은 영국에서 대략 100,000명의 사람들에게 영향을 미친다. 미국에서, MS를 갖는 사람들의 수는 약 400,000명인 것으로 추정되고, 해마다 대략 10,000건의 새로운 사례가 진단된다. MS를 갖는 사람들은 시각 및 감각 교란, 사지 약화, 보행 문제, 및 방광 및 장 증상을 경험하면서 전형적으로 20세 내지 40세에 증상을 발생시킨다. 이들은 초기에 부분적 회복을 가질 수 있으나, 시간의 경과에 따라 진행성 장애를 발생시킬 수 있다. 비록 치유법은 없지만, MS를 치료하고 관리하기 위한 많은 방법들이 존재한다. 이들은 약물 치료, 운동 및 물리요법, 식이요법 및 대체 요법을 포함한다. MS는 상당한 개인적, 사회적 및 경제적 영향력을 갖는, 장애를 초래할 잠재력이 매우 높은 질병이다. MS를 갖는 사람들은 그들의 일하는 능력에 대한 상당한 영향뿐만 아니라, 그들의 삶의 질 및 그들 가족들의 삶의 질에 불리한 및 종종 고도로 약화시키는 효과를 가지면서 진단 후 수년 동안 생존한다. OBD의 MS 프로그램은 원발성 진행성 MS와 재발 완화형 MS 사이의 예후 계층화를 검토하는 단계를 포함한다.
질환의 가장 흔한(대략 90%) 패턴은 재발 완화형 MS(MSRR)이다. 이 유형의 MS를 갖는 대다수의 사람들은 그들의 20대 초반에 증상을 먼저 경험한다. 그 후, 주기적 발병(재발)에 이은 부분적 또는 완전한 회복(차도)가 존재한다. 영향받은 신경의 패턴, 발병의 중증도, 회복의 정도 및 재발 사이의 시간 모두가 사람마다 폭넓게 다르다. 궁극적으로, 재발 완화형 MS를 갖는 사람들 중 약 3분의 2는 MS의 이차 진행기에 들어간다. 이것은 덜 빈번하게 되거나 완전히 중단된, 재발과 무관한 장애의 점진적인 축적이 있을 때 발생한다.
본원은 IFN-Β 치료에 대한 비반응자인 MS 환자에 대해 반응자인 MS 환자를 계층화하기 위한 EpiSwitch™ 모니터링 마커, 건강한 대조군에 대해 MSRR을 계층화하기 위한 EpiSwitch™ 마커, 및 MSPP(원발성 진행성 유형의 MS)에 대해 MSRR(재발 완화형 MS)을 계층화하기 위한 EpiSwitch™ 마커를 제공한다.
공급원: 글래스고우에 근거지를 둔 프로큐어먼트 컴파니 티슈 솔루션스에 의해 수집된 백인 샘플(MS-RR: 러시아; MS IFN-B R 대 NR: 미국에서 수집된 샘플); NEALS 컨소시엄 대조군(미국).
재발 완화형 다발성 경화증(MSRR) 프로브 - 건강한 대조군에 대해 MSRR을 계층화하기 위한 EpiSwitch™ 마커에 대해서는 이하 표 7a, 7b, 7c 및 7d를 참조한다. 표 16은 유전자 데이터를 보여준다.
또한, 다발성 경화증(MS) 프로브 - (A) IFN-Β(IFN-베타) 치료에 대한 비반응자인 MS 환자에 대해 (B) 반응자인 MS 환자를 계층화하기 위한 EpiSwitch™ 모니터링 마커에 대해서는 이하 표 8a, 8b, 8c 및 8d를 참조한다. 표 17은 유전자 데이터를 보여준다.
실시예 7 - 신경섬유종증(NF)
NF1 돌연변이를 갖는 환자에서, 악성 상태로의 형질전환은 환자의 후성유전적 환경에 의해 좌우되기 때문에 예측하기 어렵다. NF2 돌연변이체에서, 질환의 예후는 매우 신뢰할만하고 유전학 그 자체에 의해 확실히 정의된다. 본원은 풍부해진 데이터에서 329개의 상위 프로브들을 보여주는, 양성 총상 신경섬유종에 대해 악성 말초 신경초 종양(MPNST)을 계층화하기 위한 EpiSwitch™ 마커를 제공한다.
공급원: 벨기에 - 루뱅 대학
신경섬유종증(NF) 프로브 - 악성 말초 신경초 종양(MPNST)에 대해 양성 총상 신경섬유종을 계층화하기 위한 EpiSwitch™ 마커에 대해서는 이하 표 9a 및 9b를 참조한다. 표 18은 유전자 데이터를 보여준다.
실시예 8: 류마티스성 관절염의 치료를 위한 메토트렉세이트의 비반응자와 반응자를 구별하는 동반 진단과 관련된 염색체 상호작용을 확인하는 방법
공급원: 글래스고우 스코틀랜드 교육 연구 협회(SERA) 코호트
실시예 8의 도입부 및 간단한 요약
개별 환자의 안정한 후성유전자 프로파일은 신호전달 경로의 민감성을 조절하고, 유전자 발현을 조절하고, 질환 발생의 경로에 영향을 미치고, 약물의 효과적인 작용 및 치료에 대한 반응을 담당하는 조절 제어를 비효과적으로 만들 수 있다. 본원에서 본 발명자들은 메토트렉세이트(MTX) 치료에 대한 비반응자를 정의하는 데 있어서 류마티스성 관절염(RA) 환자의 후성유전자 프로파일의 역할을 평가하기 위해 이 프로파일을 분석하였다.
류마티스성 관절염에서 제1선 질환 변형 항-류마티스성 약물(DMARD, 통상적으로 메토트렉세이트(MTX))에 대한 신뢰할만한 임상 예측은 현재 가능하지 않다. 현재, 제1선 DMARD(특히, 메토트렉세이트(MTX))에 대한 반응을 확인하는 능력은 요법 후 실험적인 임상 측정에 의존한다.
초기 류마티스성 관절염(ERA)에서, 제1선 DMARD(특히, 메토트렉세이트(MTX))에 대한 반응을 예측하는 것이 가능하지 않기 때문에, 치료 결정은 주로 임상 알고리즘에 의존한다. 약물 무경험 환자를, 제1선 DMARD에 반응하지 않을 환자로 분류하는 능력은 환자 계층화를 위한 귀중한 수단이 될 것이다. 본원에서 본 발명자들은 초기 RA 환자의 혈액 백혈구에서 염색체 입체구조 시그너처(RA에서 이전에 기재되지 않은, 고도로 유익하고 안정한 후성유전적 변형)가 MTX 치료에 대한 비반응성을 예측할 수 있다는 것을 보고한다.
방법:
스코틀랜드인 초기 류마티스성 관절염(SERA) 개시 코호트에서 모집된 DMARD 무경험 ERA 환자로부터 말초 혈액 단핵세포(PBMC)를 수득하였다. 이 연구에의 포함은 중간 내지 높은 질환 활성(DAS28 ≥3.2)을 갖는 RA(2010 ACR/EULAR 기준을 충족시킴)의 진단 및 메토트렉세이트(MTX)를 사용한 후속 단일요법에 기초하였다. DAS28 = 28개 관절의 질환 활성 점수. EULAR = 유럽 류마티즘 연맹. ACR = 미국 류마티스학 학회. 하기 기준을 이용하여 6개월에서 MTX 반응성을 정의하였다: 반응자 - DAS28 차도(DAS28 <2.6) 또는 우수한 반응(>1.2의 DAS28 개선 및 DAS28 3.2). 비반응자 - DAS28의 개선 없음(≤0.6). 309개의 RA 관련 유전자 좌위를 커버하는 13,322개의 독특한 프로브들을 함유하는 EpiSwitch™ 어레이를 이용하여 4명의 MTX 반응자들, 4명의 MTX 비반응자들 및 4명의 건강한 대조군들에서의 염색체 입체구조 시그너처(CCS)의 초기 분석을 착수하였다. 구별 CCS를 LIMMA* 선형 모델링, 후속 이진법 여과 및 클러스터 분석으로 정의하였다. EpiSwitch™ PCR 플랫폼을 이용하여, 구별 CCS에 대해 30명의 MTX 반응자들 및 30명의 비반응자들의 검증 코호트를 스크리닝하였다. 이진법 점수 및 로지스틱 회귀 모델링, 및 ROC 분석**에 의해 결정된 모델의 정확성 및 강건성을 이용하여, 구별 시그너처를 더 개량하였다.
*주석: LIMMA는 마이크로어레이 실험에서 차등 발현을 평가하기 위한 선형 모델 및 실험적 베이즈 방법이다. Limma는 마이크로어레이 또는 RNA-Seq로부터 생성된 유전자 발현 데이터의 분석을 위한 R 팩키지이다.
**주석: ROC는 수신기 작동 특징(Receiver Operating Characteristic)을 의미하고 ROC 곡선을 지칭한다. ROC 곡선은 이진법 분류자 시스템의 성능을, 그의 구별 역치가 달라짐에 따라 보여주는 그래프 도표이다. 다양한 역치 설정에서 가짜 양성률에 비해 진짜 양성률을 작도함으로써 상기 곡선을 생성한다.
CCS EpiSwitch™ 어레이 분석은 반응자 ERA 환자와 비반응자 ERA 환자를 구별하는 30-마커 계층화 프로파일을 확인시켜주었다. 본 발명자들의 검증 코호트에서의 이 시그너처의 후속 평가는 이것을, 반응자와 비반응자를 구별할 수 있는 5-마커 CCS 시그너처로 개량하였다. 예측 모델링은 0.0098부터 0.99(0 = 반응자, 1 = 비반응자)에 이르는, 반응자 및 비반응자에 대한 확률 점수를 제공하였다. 반응자에 대한 92%의 진짜 양성률(95% 신뢰구간[95% CI] 75-99%), 및 비반응자에 대한 93%의 진짜 음성률(95% CI 76-99%)이 존재하였다. 중요하게는, 이 계층화 모델을 검증하기 위한 ROC 분석은 시그너처가 NR의 경우 MTX에 대한 92%의 민감성이라는 예측력을 가졌다는 것을 입증하였다.
본 발명자들은 진단 시 환자들을 계층화하는 힘을 갖는 고도로 유익한 전신 후성유전적 상태를 DMARD 무경험 ERA 환자의 말초 혈액에서 확인하였다. 혈액 기초 임상 검사를 이용하여 선험적으로 환자를 비반응자로 구별하는 능력은 계층화된 의약을 준비하고 ERA 임상에서 보다 더 공격적인 치료 섭생법을 정당화하면서 귀중한 임상 수단일 것이다.
실시예 8의 상세한 버전
선험적으로 환자를 반응자(R)와 비반응자(NR)로 구별하는 능력은 효과적인 치료의 보다 더 이른 도입을 이끌어내는 환자 계층화를 위한 귀중한 수단일 것이다. 본 발명자들은 EpiSwitch™ 바이오마커 탐색 플랫폼을 사용하여, 질환 상태 및 MTX 반응성을 표시하는 염색체 입체구조 시그너처(CCS)를 혈액 유래의 백혈구에서 확인하였다. 이로써, 본 발명자들은 치료 무경험 초기 RA(ERA) 환자를 MTX R과 NR로 계층화할 수 있게 하는 제1 예후 분자 시그너처를 제공하는 CXCL13, IFNAR1, IL-17A, IL-21R 및 IL-23 좌위에 함유된 후성유전적 시그너처를 확인하였다. 중요하게는, 이 계층화 모델은 NR의 경우 MTX에 대한 92%의 민감성이라는 예측력을 가졌다. 이 후성유전적 RA 바이오마커 시그너처는 ERA와 건강한 대조군(HC)을 구별할 수 있다. 이 조합적 예측 말초 혈액 시그너처는 RA에서의 맞춤형 의약을 준비하면서 임상에서 더 공격적인 치료제의 보다 더 이른 도입을 뒷받침할 수 있다.
RA는 전 세계 인구의 1%까지 영향을 미치는 만성 자가면역 질환이다. 발병은 다원적이고 주로 환경적 요인, 특히 흡연 및 다른 폐 자극과 상호작용하는 면역 숙주 유전자 좌위를 특징으로 한다. 이러한 환경적 요인에의 유전적으로 민감한 개체의 노출은 질환 발생 및 진행에 대한 후성유전적 환경을 암시한다. 염색질 마커(예를 들면, 게놈의 메틸화 상태)의 최근 연구는 RA와 연관된 후성유전적 차이의 첫 번째 증거를 제공한다. 그러나, 최근까지 유전적 연관성 및 후성유전적 변화 중 어느 것도 주어진 요법에 대한 반응에 대한 검증된 예측 마커를 제공하지 않았다. 뿐만 아니라, 임상 소견은 통상적인 DMARD의 효능 및 독성만을 약하게 예측한다. EULAR(유럽 류마티즘 연맹) 및 ACR(미국 류마티스학 학회) 관리 지침에 의해 권장된 가장 흔한 제1 선택 약물인 MTX는 6개월의 치료 후 50% 내지 65%의 임상적으로 유의한 반응률을 전달한다. 이러한 반응, 및 특히 극복하기 어려운 반응을 나타내는 다소 더 작은 비율은 현재 개별 환자에서 예측될 수 없다. 이것은 치료 섭생법 선택(단일 또는 조합적 치료제)에 대한 '시행착오' 기초 방법을 야기한다. 제1선 치료에 대한 반응이 장기간 결과의 가장 중요한 예측자라는 점을 고려할 때, 개별 환자에서 약물 반응성을 예측하는 능력은 귀중한 임상 수단일 것이다.
본원에서 본 발명자들은 MTX 치료에 대한 NR을 표시함으로써, 대체 요법을 위해 이러한 환자를 선험적으로 확인하고 계층화할 수 있게 하는 안정한 혈액 기초 후성유전자 프로파일이 존재하는지를 확인하기 위해 스코틀랜드인 초기 류마티스성 관절염(SERA) 개시 코호트로부터의 DMARD 무경험 ERA 환자의 후성유전자 프로파일링에 초점을 맞추었다. 공급원 후성유전적 조절은 세포 활성화 및 전사 프로파일에 강하게 영향을 미칠 수 있다. 추정하건대, 약물에 대한 작용 방식은 후성유전적으로 변형된 좌위에 의해 영향을 받을 수 있다. CCS가 전사 조절과 상당히 연관되어 있는, 고도로 유익하고 안정한 고차 후성유전적 상태를 반영하기 때문에, 본 발명자들은 장범위 염색질 상호작용으로서도 공지된 CCS에 초점을 맞추었다. 이들은 상당한 장점 및 표현형 차이와의 초기 기능적 연관성도 제공하고, 종양학 및 다른 질환 영역에서 유익한 바이오마커 후보로서 보고되어 있다.
본 발명자들은 스코틀랜드인 초기 류마티스성 관절염(SERA) 개시 코호트에 의해 제공된 초기 RA(ERA) 환자를 사용하였다. 진단 시 및 6개월에서 인구학 요인, 임상 요인 및 면역학 요인을 수득하였다. 이 연구에의 포함은 중간 내지 높은 질환 활성(DAS28 ≥3.2)을 갖는 RA(2010 ACR/EULAR 기준을 충족시킴)의 진단 및 MTX를 사용한 후속 단일요법에 기초하였다. 반응자는 MTX를 제공받았을 때 6개월에서 DAS28 차도(DAS28 <2.6) 또는 우수한 반응(>1.2의 DAS28 개선 및 DAS28 ≤3.2)을 달성한 환자로서 정의되었다. 비반응자는 MTX를 제공받았을 때 6개월에서 DAS28이 개선되지 않은(≤0.6) 환자로서 정의되었다. 후성유전자 분석을 위한 혈액 샘플을 진단 시 채취하였다. (DAS28 = 28개 관절의 질환 활성 점수).
본 발명자들은 RA와 기능적으로 연관된 309개의 유전자 좌위를 가로질러 13,322개 이상의 염색체 입체구조 시그너처(CCS)(13,322개의 독특한 프로브)를 분석함으로써 이진법 후성유전적 바이오마커 프로파일링을 사용하였다. 초기 흑색종을 갖는 마요(Mayo) 임상 코호트의 혈액 기초 계층화에서 이미 성공적으로 사용되었고 PD-1/PD-L1을 사용한 면역요법에 대한 반응의 예측 계층화를 위해 현재 사용되고 있는 EpiSwitch™ 플랫폼 상에서 후성유전적 바이오마커의 고도로 유익한 클래스로서 CCS를 판독하고 모니터링하고 평가하였다.
그래프패드 프리즘(GraphPad Prism), WEKA 및 R 통계학적 언어를 사용하여 무경험 RA 환자의 확인된 후성유전자 프로파일을 통계학적으로 분석하였다. 본 발명자들은 EpiSwitch™ 플랫폼 및 90개의 임상 샘플들의 연장된 코호트를 사용함으로써, 반응자, 비반응자, RA 환자 및 건강한 대조군에 대한 통계학적으로 유의한 922개 이상의 후성유전적 선도(lead) 바이오마커들의 풀을 확인하였다.
ERA 환자에서 치료 전 순환 CCS 상태를 확인하기 위해, RA 발병과 연관된 123개의 유전자 좌위(표 22)를 선택하였고 EpiSwitch™ 인 실리코 예측 팩키지를 사용함으로써 예측된 염색체 입체구조 상호작용으로 해석하였다. EpiSwitch™ 인 실리코 예측은 13,322개의 고신뢰 CCS 마커 후보를 생성하였다(표 22). 6개월 요법 후 모두 임상적으로 정의된 4명의 MTX 반응자(R) 및 4명의 MTS NR(표 23), 및 4명의 건강한 대조군(HC)으로부터 진단 시(DMARD 무경험) 단리된 말초 혈액 단핵세포를 스크리닝하기 위해 이들 후보들을 사용하여 맞춤생산 탐색 EpiSwitch™ 어레이를 생성하였다. R, NR 및 HC를 구별하는 CCS를 확인하기 위해, 표준화된 후성유전적 로드의 LIMMA* 선형 모델을 사용하였다. 총 922개의 통계학적으로 유의한 계층화 마커들(조절된 p 값 및 EpiSwitch™ 비에 기초하여 평가된 유의성)을 확인하였다. 922개의 선도 마커들 중 420개의 마커들은 NR과 연관되어 있었고, 210개의 마커들은 R과 연관되어 있었고, 159개의 마커들은 HC와 연관되어 있었다. 이진법 여과 및 클러스터 분석을 EpiSwitch™ 마커에 적용하여, 확인된 CCS의 유의성을 평가하였다. (완전한 연관 집합체를 사용한 맨하탄(Manhattan) 거리 측정을 이용하고 R 대 NR, HC 대 R 및 HC 대 NR을 고려하는) 단계적 계층적 밀집 방법은 유의한 마커의 수를 922에서 65까지 감소시켰고 최종적으로 30-마커 계층화 프로파일을 생성하였다(표 3).
*주석: LIMMA는 마이크로어레이 실험에서 차등 발현을 평가하기 위한 선형 모델 및 실험적 베이즈 방법이다. Limma는 마이크로어레이 또는 RNA-Seq로부터 비롯된 유전자 발현 데이터의 분석을 위한 R 팩키지이다.
CCS 시그너처를 개량하고 검증하기 위해, EpiSwitch™ PCR 플랫폼을 이용하여 단계적 방식으로 R 및 NR의 제2 ERA 환자 코호트에서 30개의 확인된 마커들을 스크리닝하였다(표 25). 첫 번째 경우, 전체 30개의 CCS 마커들을 12명의 ERA 환자들(6명의 R 및 6명의 NR)에서 검사하였다. 이진법 점수에 대한 예이츠(Yate)의 연속성 보정과 함께 독립성에 대한 카이-제곱 검정을 적용하여 12-마커 CCS 프로파일을 보여줌으로써 가장 잘 구별하는 CCS 마커들을 확인하였다(표 26). 이들 12개의 CCS 마커들을 추가 12명의 ERA 환자들(6명의 R 및 6명의 NR)에서 검사하였고 데이터를 이전 12 ERA와 조합하였다. 24개의 환자 샘플들(12개의 R 및 12개의 NR)을 조합함으로써, (각각의 마커의 구별력을 점수화하기 위해 5배 교차검증을 이용하여) WEKA 분류 플랫폼에서 로지스틱 회귀 모델을 구축하고 초기 데이터 세트의 무작위적 데이터 재샘플링으로 10회 작동시킴으로써 모델 생성을 위한 10개의 상이한 시작점을 생성하였다. 가장 높은 평균 점수를 갖는 마커를 선택함으로써, 프로파일을 10개의 가장 잘 구별하는 CCS 마커들까지 감소시켰다(표 26). 10개의 CCS 마커들을 사용하여 추가 36개의 ERA 샘플들(18개의 R 및 18개의 NR)을 프로빙하였다. 모든 데이터(30개의 R 및 30개의 NR)를 조합하고 동일한 로지스틱 회귀 및 점수 계산 분석을 이용함으로써, MTX R을 NR로부터 구별하는 5개의 CCS 마커 시그너처(IFNAR1, IL-21R, IL-23, IL-17A 및 CXCL13)를 확인하였다(표 26). CXCL13 및 IL-17A 좌위에서의 CCS는 비반응자와 연관된 반면, IFNAR1, IL-23 및 IL-21R 좌위에서의 CCS는 반응자와 연관되어 있었다. 이것은 인간 자가면역에서의 IL-17 축에 대해 추정된 중추적 역할을 고려할 때 아주 흥미로운 프로파일이었다.
중요하게는, 계층화 시그너처의 조성은 MTX 반응을 확인하는 데 일차적으로 중요한 유전자 위치를 잠재적으로 조절하는 염색체 입체구조의 위치를 확인시켜준다. 5개의 EpiSwitch™ CCS 마커들을 분류하기 위한 이진법 점수의 주성분 분석(PCA)은 환자들의 MTX 반응에 기초한 ERA 환자들의 명확한 분리를 제공하였다. 모델은 0.0098부터 0.99에 이르는(0 = 반응자, 1 = 비반응자), 반응자 및 비반응자에 대한 예측 확률 점수를 제공하였다. 컷-오프 값은 반응자의 경우 ≤0.30 및 비반응자의 경우 ≥0.70로 설정되었다. ≤0.30의 점수는 92%(95% 신뢰구간[95% CI] 75-99%)의 진짜 양성률을 갖는 반면, ≥0.70의 점수는 93%(95% CI 76-99%)의 진짜 음성 반응률을 가졌다. 반응 범주(MTX에 대한 R 또는 NR)당 관찰되고 예측된 환자의 수는 하기 표 A에 제시되어 있다. EpiSwitch™ CCS 마커 모델을 사용하였을 때, 53명의 환자들(88%)은 반응자 또는 비반응자로서 분류되었다.
[표 A]
Figure pct00045
5개의 EpiSwitch™ CSS 마커들을 확인한 로지스틱 분류 모델의 '정확성' 및 '성능의 강건성'을 검정하기 위해, R 및 NR 데이터의 무작위적 데이터 재샘플링으로 150개의 ROC** 곡선(독특한 시작점을 가짐)을 생성하였다. 이것은 데이터를 훈련 군(66%, 6000개의 공지된 클래스 샘플들과 동등함)과 검정 군(34%, 3000개의 비공지된 클래스 샘플들과 동등함)으로 분할시켰고; 중요하게는, 교차검증을 위한 데이터에서는 동일한 분할이 결코 확인되지 않는다. 모델의 평균 구별 능력(AUC)은 89.9%(95% CI 87-100%)이었고, 이 때 NR의 경우 평균 민감성(반응 우세에 대해 조절됨)은 92%이었고 R의 경우 평균 특이성은 84%이었다. 모델의 예측 능력을 확인하기 위해, 베이즈 우세 정리를 이용하여 평균 모델 정확성 통계자료를 MTX에 대한 집단 R/NR에 대해 조절하였다. 55% MTX 반응률을 이용하였을 때, 양성 예측 값(PPV)은 90.3%이었지만, 음성 예측 값(NPV)은 86.5%이었다. 반응률을 60%까지 조절한 경우, 이것은 PPV를 87%까지 감소시킨 반면, NPV를 89%까지 증가시켰다.
선택된 5개의 EpiSwitch™ CCS 마커들의 구별력의 독립적인 평가로서, 30개의 HC를 포함하는 혼합된 데이터의 요인 분석(FAMD)을 수행하였다. 이것은 시그너처가 MTX R과 NR을 구별하는 힘을 가질 뿐만 아니라 건강한 개체와 RA 환자를 구별하는 충분한 질환 특이적 특징도 보유한다는 것을 예증하였다.
실시예 8 - 표 27C 및 27D - RA-MTX 반응자와 비반응자 사이의 계층화
표 27C 및 연속 표 27D는 특히 약 54개의 DNA 프로브들(60 mer) 및 이들의 DNA 서열의 목록을 보여준다. 이들 프로브들은 실시예 9에서 사용된 프로브들 중 일부를 나타낸다. 표 27C 및 27D에 예시된 프로브들은 RA-MTX 반응자와 RA-MTX 비반응자 사이를 계층화하는 데 사용될 수 있다. 제시된 프로브들을 PCR로 더 조사하였다. P 값 = 확률 값; adj. = 조절됨.
실시예 8 - 결론
결론적으로, R/NR에 대한 기대되는 임상 평가에 기초한 DMARD 무경험 ERA 환자의 후성유전자 프로파일 분류라는 본 발명자들의 연구는 MTX 반응에 이바지하는 후성유전적 상태와 MTX 반응에 이바지하지 않는 후성유전적 상태를 구별하는 일관된 후성유전적 시그너처를 확인시켜주었다. 본 발명자들이 아는 한, 이것은 (건강한 대조군에 비해) 질환과 관련된 것으로 보이고 제1선 MTX 요법에 대한 비반응성을 예측할 수 있는 초기 RA 환자들에서 안정하고 선택적으로 구별하는 혈액 기초 후성유전적 바이오마커의 첫 번째 예이다. 이 모델은 임상 실시 내에서 가까운 장래에 상용적으로 이용될 수 있는 잠재력을 갖는, 5개의 조건부 CCS 및 산업적 ISO-13485 EpiSwitch™ 플랫폼에 의한 이들의 검출에 기초한 검증된 분류자로 직접적이고 실용적인 이점을 제공한다. 중요하게는, 이 예측 시그너처를 채택함으로써 MTX 무경험 ERA 환자를 R 코호트와 NR 코호트로 계층화할 수 있을 것이다. 이것은 효과적인 치료제의 보다 더 이른 사용을 추구함으로써 '맞춤형' 치료 섭생법으로 이어지는, ERA에 대한 현재 승인된 치료 전략을 통한 환자 진행을 가속화하는 하는 잠재력을 제공한다. 나아가, 임상에서 신속히 추적되는 생물학적 치료 섭생법을 정당화하는 데 사용될 수 있는 대안적 CCS 시그너처가 RA 환자(및 다른 자가면역 질환을 갖는 환자)에 존재할 것이다. 이것은 보다 더 비용 효과적이고 강력한 치료 방법을 제공함으로써 사회경제적으로 지대한 영향을 미칠 것이다.
실시예 8 - 재료 및 방법
RA 환자 집단
이 연구에서 ERA 환자는 스코틀랜드인 초기 류마티스성 관절염(SERA) 개시 코호트의 부분이다. 진단 시 및 6개월에서 인구학 요인, 임상 요인 및 면역학 요인을 수득하였다. 개시 코호트에의 포함은 스코틀랜드의 이차 케어 류마티스학 시설에서의 비구별된 다발관절염 또는 RA(≥1 부은 관절)의 임상 진단에 기초하였다. 배제 기준은 이전 또는 현재 DMARD/생물학적 요법 및/또는 확립된 대안적 진단(즉, 건선성 관절염, 반응성 관절염)이었다. 이 연구에의 포함은 중간 내지 높은 질환 활성(DAS28 ≥3.2)을 갖는 RA(RA에 대한 2010 ACR/EULAR 기준을 충족시킴)의 진단 및 MTX를 사용한 후속 단일요법에 기초하였다. [DAS28 = 28개 관절의 질환 활성 점수. EULAR = 유럽 류마티즘 연맹. ACR = 미국 류마티스학 학회]. 반응자는 MTX를 제공받았을 때 6개월에서 DAS28 차도(DAS28 <2.6) 또는 우수한 반응(>1.2의 DAS28 개선 및 DAS28 ≤3.2)을 달성한 환자로서 정의되었다. 비반응자는 MTX를 제공받았을 때 6개월에서 DAS28이 개선되지 않은(≤0.6) 환자로서 정의되었다. 진단 시(기준) 혈액 샘플을 EDTA 튜브 내에 채취하고 원심분리하여 PBMC를 함유하는 버피 층을 생성하였고, 이 버피 층을 수거하고 -80℃에서 저장하였다.
EpiSwitch™ 프로세싱, 어레이 및 PCR 검출. EpiSwitch™ 어세이를 위한 프로브 디자인 및 위치
패턴 인식 방법론을 이용하여 인간 게놈 내의 전사 유닛과 관련하여 인간 게놈 데이터를 분석하였다. 전매특허 EpiSwitch™ 패턴 인식 소프트웨어는 영역이 염색질 상호작용에 관여할 확률적 점수를 제공한다. 123개의 유전자 좌위로부터의 서열을 다운로딩하고 프로세싱하여 13,322개의 가장 개연성 있는 염색체 상호작용의 목록을 생성하였다. 60 mer 프로브를 디자인하여, 이들 잠재적 상호작용을 조사하고 아질런트 슈어디자인 웹사이트에 주문제작 어레이로서 업로딩하였다. 네스티드(nested) PCR에 의한 잠재적 마커의 스크리닝을 위해 선택된 부위에서 Primer3을 사용하여 서열 특이적 올리고뉴클레오티드를 디자인하였다. 올리고뉴클레오티드 특이적 BLAST를 이용하여 특이성에 대해 올리고뉴클레오티드를 검사하였다.
환자 PBMC로부터의 염색질 입체구조 시그너처 분석
주형 준비: EpiSwitch™ 어세이를 제조자의 설명서(Oxford BioDynamics Ltd)에 따라 사용하여 50 ㎕의 각각의 PBMC 샘플로부터 염색질을 추출하였다. 요약하건대, 고차 구조물을 포름알데하이드로 고정시키고 염색질을 추출하고 TaqI로 분해하고 희석하고 분자내 결찰을 최대화하는 조건에서 결찰시킨 후, 단백질분해효소 K로 처리하였다. EpiSwitch™ 마이크로어레이: 아질런트 시스템을 사용하는 주문제작 아질런트 8x60k 어레이를 제조자의 설명서(Agilent)에 따라 사용하여 EpiSwitch™ 마이크로어레이 하이브리드화를 수행하였다. 각각의 어레이는 EpiSwitch™ 패턴 인식 소프트웨어에 의해 예측된, 사중체화된 13,322개의 잠재적 염색체 상호작용, 및 EpiSwitch™ 및 아질런트 대조군을 나타내는 55088개의 프로브 점을 함유한다. 요약하건대, 아질런트 슈어태그(SureTag) 표지부착 키트를 사용하여 1 ㎍의 EpiSwitch™ 주형을 표지하였다. 표지된 DNA의 프로세싱을 수행하였다. 세척 직후 아질런트 스캐너 및 소프트웨어를 이용하여 어레이 분석을 수행하였다. 모든 실험들을 비교하기 위해, 데이터를 배경 보정하고 표준화하였다. 어레이 내의 각각의 점이 사중체로 존재하기 때문에, 어레이에서 각각의 프로브의 4개 점들의 중간값을 계산하였고 추가 분석을 위해 그의 log2 변환된 값을 사용하였다. 각각의 프로브 복제물에 대한 변동 계수 및 p-값을 계산하였다. EpiSwitch™ PCR 검출: 각각의 프라이머 세트가 정확히 작동하였다는 것을 확인하기 위해 주형에 대해 올리고뉴클레오티드를 시험하였다. 기술적 및 복제물 변동을 해결하기 위해, 각각의 샘플을 4회 프로세싱하였다. 이들 4개의 복제물들로부터의 모든 추출물을 모았고 최종 네스티드 PCR을 각각의 샘플에 대해 수행하였다. 이 절차는 보다 더 높은 정확성으로 한정된 카피 수 주형의 검출을 가능하게 하였다. LabChip DNA 1K 버전2 키트(Perkin Elmer)를 사용하여 퍼킨 엘머(Perkin Elmer)로부터의 LabChip® GX에서 전기영동으로 모든 PCR 증폭된 샘플들을 가시화하였고, 형광 염료를 사용하여 제조자의 프로토콜에 따라 내부 DNA 마커를 DNA 칩 상에 적재하였다. 형광을 레이저로 검출하였고 기계 소프트웨어를 이용하여 전기영동도 판독결과를 겔 사진 상의 시뮬레이션된 밴드로 옮겼다. 본 발명자들이 양성으로서 간주되는 밴드에 대해 설정한 역치는 30 형광 유닛 이상이었다.
통계학적 방법 및 팩키지
임상 데이터의 모든 통계학적 분석을 위해 그래프패드 프리즘 및 SPSS를 사용하였다. (범주형 변수에 대한) 카이-제곱 검정 및 피셔 정확 검정, (연속 정규 분포된 변수에 대한) 독립적인 샘플에 대한 t-검정, 및 (정규 분포를 갖지 않는 연속 변수에 대한) 만-휘트니(Mann-Whitney) U 검정을 이용하여 차이를 확인하였다. 통계학적 유의성의 수준은 0.05로 설정되었고, 모든 검정은 2-측 검정이었다. R(및 적절한 팩키지)는 EpiSwitch™ 데이터의 평가를 위해 사용되었다. 이것은 카이-제곱 검정 및 GLM을 위한 Stats 팩키지(logit), WEKA 승산 확률로부터의 ROC 곡선을 위한 ROCR 팩키지, 히트맵(Heatmaps)을 위한 R 내의 gplot & stats 팩키지를 포함하였다. FactorMiner 팩키지는 PCA 및 요인 도표를 위해 사용되었다. Weka는 속성 감소, 데이터 무작위화 및 재샘플링, 로지스틱 모델 분류자, AUC 계산 및 모델 정확성 계산을 위해 사용되었다.
실시예 8A - RA 분석: MTX 반응자 대 비반응자: 실시예 8의 후속 작업
실시예 1A에서, 본 명세서 내의 실시예 단락의 시작 부분에 기재된 "통계학적 파이프라인" 방법(들)을 이용하여 생물통계학적 초기하 분석을 수행함으로써, MTX 단일요법 시 RA 환자에 대한 MTX 반응자와 MTX 비반응자 사이를 계층화하는 더 개량된 DNA 프로브를 생성하였다.
결과: 이하, 표 27A(및 연속 부분 표 27B 및 27AB)는 반응자(R)와 비반응자(NR) 사이를 계층화하는 RA-MTX - DNA 프로브에 대한 프로브 및 좌위 데이터를 개시한다. B = 그 유전자가 차등적으로 발현되는 로그-승산인 B-통계자료(lods 또는 B). FC는 비-로그 배수 변화이다. FC_1은 0 주위에서 모여진 비-로그 배수 변화이다. 표 27A+27B는 초기하 분석으로부터 MTX 반응자(MTX-R)를 확인하기 위한 25개의 개량된 바람직한 DNA 프로브(60 mer), 및 MTX 반응자(MTX-NR)를 확인하기 위한 24개의 개량된 바람직한 DNA 프로브(60 mer)의 서열을 포함한다.
실시예 9: AML(급성 골수성 백혈병)의 치료에 있어서 LSD1의 억제 동안 약력학적 바이오마커로서 동반 진단과 관련된 염색체 상호작용을 확인하는 방법
공급원: 영국 암연구소
약력학적 바이오마커
약력학적(PD) 바이오마커는 유기체에서 표적에 대한 약물 효과의 분자 표시자이다. PD 바이오마커는 약물 섭생법, 목표 효과 및 생물학적 종양 반응 사이의 연관성을 조사하는 데 사용될 수 있다. 신규 약물 개발과 집중적인 PD 바이오마커 측정의 커플링은 정보에 근거하여 초기에 진행할지 아니면 중단할지를 결정하고 표적화된 물질의 합리적인 조합을 선택하고 조합 약물 섭생법의 스케쥴을 최적화하기 위한 임상 데이터를 제공한다. PD 종점의 사용은 임상전 모델에서의 선도 화합물의 선택부터 인간에서의 첫 번째 시험까지 약물 개발 전체에 걸쳐 합리성 및 가설 검정력도 향상시킨다(국립 암연구소).
본 발명자들은 염색체 시그너처가 관찰된 표현형 변화와 일치하는 시점에서 다수의 약물들에 대한 반응을 모니터링하기 위한 약력학적 바이오마커로서 사용될 수 있다는 것을 발견하였다.
EpiSwitch™ 마커 - 이상적인 약력학적 바이오마커
MV4-11 세포주에 대한 BET(브로모도메인 및 가외의 말단) 억제제에 대한 연구는 BET 억제가 핵심 발암유전자 BCL2, CDK6 및 C-MYC의 전사 저해를 야기한다는 것을 보여주었다. LSD1 억제제처럼 BET 억제제는 히스톤의 아세틸화 및 메틸화 상태를 표적화하는 후성유전적 요법이다. 좌위에서의 위상학적 변화는 임의의 조절 변화보다 먼저 일어나기 때문에, EpiSwitch™에 의해 MYC 좌위에서 발견된 결과는 LSD1 억제에 의한 조절 변화의 증거를 보여준다. MV4-11 세포주는 MLL-AF4 및 FLT3-ITD를 발현하는 전위를 보유하는 반면, THP-1만이 MLL-AF9를 발현한다.
AML(급성 골수성 백혈병)에 대한 EpiSwitch™ LSD1 억제 바이오마커 연구
EpiSwitch™ 플랫폼에 의해 확인된 후성유전적 바이오마커는 LSD1 데메틸라제(demethylase)의 후성유전적 기작을 묘사하고 세포주들 내에서 및 사이에서 LSD1 억제제의 상이한 특이성을 계층화하는 데 매우 적합하다. 이 연구는 염색체 입체구조 시그너처가 LSD1 억제에 있어서 기작과 연관된 예측 바이오마커로서 사용될 수 있었다는 것을 입증한다. 표준 LSD1 억제제인 트래닐사이프로민(tranylcypromine)(TCP)을 이 연구에서 조사하였다.
EpiSwitch™ LSD1 약력학적 바이오마커 탐색
세포를 1 μM의 트래닐사이프로민(TCP)으로 처리하였다. 2종의 AML(급성 골수성 백혈병) 세포주 THP-1 및 MV4-11을 상기 화합물로 시험하였다. THP-1 세포에서 MYD88 유전자의 근처에서 확인된 염색체 시그너처는 표 28에 제시되어 있다. MV4-11 세포에서 MYD88 유전자의 근처에서 확인된 염색체 시그너처는 표 29에 제시되어 있다. 각각의 숫자 조합은 개별 염색체 상호작용을 표시한다. 유전자를 가로질러 위치를 생성하였고, 제한 부위 및 검출의 다른 특징 및 프라이머 효율을 기초로 선택한 후, 상호작용에 대해 분석하였다. 표 28 및 29의 결과는 시그너처 검출을 나타내지 않는다. 시그너처 검출은 숫자 1로 표시되어 있다. 아래에는 세포주 THP-1 및 MV4-11의 경우 MyD88 좌위에 대한 PCR EpiSwitch™ 마커 결과가 있다. FACS 분석을 이용하여, 구별의 표시자로서 CD11b± 세포의 발현에 대해 분류하였다. 이전에 공개된 연구를 기초로 MyD88 및 MYC 좌위를 72시간에서의 치료 변화의 핵심 유전적 유도자로서 선택하였다.
LSD1 억제제(TCP) 실험 - 탐색 결과
비처리된 세포에 비해 더 늦은 시점(72시간)에서 변화하는 입체구조는 2종의 세포들 사이에 가장 높은 일관성을 보인다. 이들은 THP-1 데이터에 표시된 굵은 이중 선 위의 마커들이고, MV4-11 데이터에서 음영으로 표시된 세포에 의해 강조된다.
LSD1 억제는 MYD88의 ORF에 대한 5' 업스트림과의 장범위 상호작용을 제거하여, 좌위에 대한 조절 랜드스케이프(landscape)를 변화시킨다.
LSD1 억제 분석 대 유전자 발현 데이터 - MYC 좌위 입체구조와 유전자 발현(GEX)의 일시적 및 구조적 상관관계
MYC는 AML(급성 골수성 백혈병) 발병을 유도하는 표적 유전자이지만, 72시간 치료에서, 마커에 대한 배수 변화는 유의하기에는 너무 작다. 표 30에서 확인된, 72시간에서 MYC 좌위에서 GEX 데이터에 대한 변화는 72시간에서 확인된 입체구조 변화와 상관관계를 가진다. 비처리된 세포에 비해 MYC에서의 음성 GEX 변화는 MYC 증식 효과를 교란시키기 위한 요건과 일치한다. 상기 변화는 다수의 신호 캐스케이드들에 의해 이 좌위에 대해 유발된 엄격한 조절과도 일치할 정도로 작다.
상기 GEX 데이터와 달리, EpiSwitch™ 바이오마커는 세포 분화 및 아폽토시스(표현형 변화)에 의한 그의 사멸에 상응하는 염색체 입체구조 시그너처의 변화를 72시간 처리에서 명확히 검출한다.
LSD1 억제 분석 대 유전자 발현 데이터 - MyD88 좌위 입체구조와 유전자 발현(GEX)의 일시적 및 구조적 상관관계
GEX 데이터에 대해 72시간에서 MyD88에서 관찰된 변화는 72시간에서 확인된 입체구조 변화와 상관관계를 갖는다. GEX 변화는 비처리된 세포에 비해 양성이고, 이것은 LSD1 억제제를 사용한 처리 후 이들 AML(급성 골수성 백혈병) 세포에서 관찰된 차이와 일치한다.
GEX 및 EpiSwitch™ 둘 다에 의해 확인된 MYD88 좌위에서 TCP로 처리하였을 때 72시간에서 단지 1.5배 변화가 관찰되었다. 이 수준의 변화는 마이크로어레이 유전자 발현 분석에서 노이즈에 의해 너무 많은 영향을 받는다. 그러나, 염색체 시그너처에 대해 관찰된 후성유전적 변화는 0 또는 1의 이진법 포맷을 따르기에 용이하다. 데이터는 변화의 상이한 패턴을 보여준다. MYC 및 MYD88 둘 다는 GEX 데이터에서 확인된 바와 같이 유전자 발현에서의 강한 반응을 제공할 수 없으나, 핵심 후성유전적 변화가 염색체 시그너처를 통해 가시화될 때 확인될 수 있는 후성유전적 유도제이다. 이들 두 유전적 유도제들은 성공적인 요법 치료를 위해 요구된 표현형 변화를 정의한다. 72시간에서, 세포는 분화하고 아폽토시스를 겪는다. [표 31 내지 33도 이 실시예와 관련되어 있다.]
실시예 10: 치료받은 환자에서 흑색종 재발의 예후를 위한 동반 진단과 관련된 염색체 상호작용을 확인하는 방법(PCR 데이터)
공급원: 마요 임상 전이성 흑색종 코호트, 미국
예후 바이오마커는 질환의 경과 또는 결과(예를 들면, 말기, 안정화 또는 진행)를 예측한다. 이 연구는 수술 치료를 받은 모니터링된 흑색종 환자들에서 재발 또는 회복의 징후에 대한 명확한 후성유전적 염색체 입체구조 차이를 확인하기 위해 재발에 대한 예후 바이오마커로서 작용할 수 있고 흑색종의 재발을 모니터링하기 위한 예후 바이오마커일 잠재력에 대해 이러한 바이오마커를 검증하는 데 사용될 수 있는 염색체 시그너처를 탐색하고 검증한다. 본원에서 본 발명자들은 2년의 치료 이내에 재발할 가능성이 높은 후보를 확인하기 위해 원래의 성장물의 절제에 의한 치료를 받은 확인된 흑색종 환자에 적용함에 있어서 염색체 입체구조 시그너처의 검증된 예후 용도의 본 발명자들의 예를 제공하고자 한다.
224명의 흑색종 환자들을, 그들의 암을 제거하기 위한 수술로 치료하였다. 그 다음, 이들을 2년의 기간 동안 관찰하였는데, 이 때 혈액은 수술한지 100일 초과의 기간 경과 후 분석을 위해 채취되었다.
EpiSwitch™ 예후 바이오마커 탐색
흑색종과 연관된 44개의 유전자 및 나머지 게놈의 염색체 시그너처를 차세대 시퀀싱 NGS로 임의의 질환 특이적 장범위 상호작용에 대해 검사하였다. 딥(deep) 시퀀싱을 통한 흑색종과 연관된 염색체 시그너처의 비편향된 평가는 2500개의 후보 마커들의 초기 풀을 제공하였다. 흑색종 환자, 및 대조군으로서 비흑색종 피부암(NMSC)을 갖는 환자로부터의 확장 세트의 혈액 샘플에 대한 EpiSwitch™ 플랫폼에 의한 추가 분석은 후보 마커의 초기 풀을 150까지 감소시켰다. 표 34에 나타낸 바와 같이, 상기 초기 풀은 샘플 수에 대한 추가 확장에 의해 32까지 감소되었다.
재발의 예후
비흑색종 피부암으로부터의 흑색종의 계층화를 위해 이전에 확인된 상위 15개의 마커들은 총 8개의 유전자, 즉 TBx2; TYR; BRAF; MiTF; p16; BRN2; p21; 및 TBx3으로부터 수득된 TBx2 7/15, TYR 1/9, TYR 13/17, TYR 3/11, TYR 3/23, P16 11/19, P16 7/23, P16 9/29, MITF 35/51, MITF 43/61, MITF 49/55, BRAF 5/11, BRAF 27/31, BRAF 21/31, 및 BRAF 13/21을 포함한다.
흑색종 환자의 후성유전자 프로파일의 3C 분석은 확장 세트의 검사 샘플 코호트에서 3까지 감소된, 예후 바이오마커가 될 잠재력을 갖는 150개의 염색체 시그너처를 보여주었다. 치료 및 재발에 대한 2년 결과와 매우 일치하는 염색체 입체구조 시그너처에서의 전환을 보이고 가장 우수한 잠재적 예후 흑색종 마커인 3개의 염색체 시그너처는 BRAF 5/11, p16-11/19 및 TYR 13/17이다. 마지막으로, 상기 3개의 염색체 시그너처를 예후 바이오마커로서의 검증 단계로 넘겼다.
표 35는 재발이 상기 환자들 중에서 치료 후 2년 이내에 관찰되었다는 것을 보여준다. 염색체 시그너처의 완전히 비편향된 분석을 통해, 이들 질환 특이적 3개 마커들은 치료 후 재발된 대다수의 환자들에서 치료 후 존재하고 변화되지 않은 상태로 남아있었다. 표 36은 염색체 시그너처가 치료의 결과로서 변화하여 보다 더 건강한 프로파일을 반영한다는 증거를 제공한다. 염색체 시그너처의 완전히 비편향된 분석을 통해, 동일한 질환 특이적 3개 마커들이 변화하였고 2년 동안 재발의 징후 없이 치료 후 대다수의 환자들에 부재하였다. 표 37은 동일한 3개 예후 바이오마커들이 건강한 집단에 부재하는 강한 경향을 보인다는 것을 보여준다. 초기 탐색 단계에서 확인된 모든 흑색종 특이적 바이오마커들로부터, 이들 3개 마커들만이 치료 후 그들의 변화로 인해 예후 값을 가졌고, 이 점에서 이들은 진단 마커와 상이하였다. 표 38도 이 실시예와 관련되어 있다.
이들 결과는 상기 3개의 확인된 염색체 시그너처들이 유효하고 강력한 예후 바이오마커로서 작용하는 염색체 시그너처에 대한 증거를 예시한다는 것을 확인시켜준다.
실시예 11: 약물 반응에 대한 예측/약력학적 바이오마커: 전이성 흑색종 환자에서의 항-PD-1(어레이 데이터)
흑색종
악성 흑색종은 가장 덜 흔하지만 가장 공격적인 형태의 피부암이다. 이것은 어두운 색소인 멜라닌의 합성을 담당하는 세포인 멜라닌세포에서 발생한다. 대다수의 악성 흑색종은 태양으로부터의 과도한 UV 노출에 의해 야기된다. 대다수의 새로운 흑색종 사례는 일광 및 선베드로부터의 UV 노출을 향한 행동 변화와 연관되어 있는 것으로 생각된다. 전 세계적으로, 2012년에 흑색종은 232,000명의 사람들에서 발생하였고 55,000명의 사망을 초래하였다. 발병률은 호주 및 뉴질랜드에서 가장 높다. 전 세계 발병률은 남성들 사이에서 임의의 다른 유형의 암보다 더 빠르게 증가하고 있고 지난 십년에 걸쳐 여성들 사이에서 두 번째로 가장 빠른 발병률 증가를 가진다. 1 기 및 2 기 흑색종을 갖는 개체들의 경우 생존율은 매우 우수하다. 그러나, 멀리 있는 림프절 또는 신체의 다른 부분으로 퍼진 암을 갖는 흑색종 환자들의 7% 내지 19%만이 5년 이상 동안 생존할 것이다. 현재, 흑색종을 정확히 진단하는 유일한 방법은 의심스러운 모반에 대한 절개 생검을 수행하는 것이다. 치료는 종양의 수술적 제거를 포함한다. 영국에는 흑색종 스크리닝 프로그램이 없지만, 흑색종의 위험 및 증상의 인식을 상승시키기 위한 교육 프로그램이 생겼다. 흑색종 발병률이 매우 높은 국가, 예를 들면, 호주에서 스크리닝 프로그램에 대한 높은 수요가 있다. 이 작업은 진단, 예후, 잔존 질환 모니터링, 및 흑색종 면역요법에 대한 동반 진단을 위한 바이오마커에 관한 것이다.
연구 배경
암의 치료에서 현재 시험된 모든 면역조절제들이 갖는 주요 문제점은 그들의 낮은 반응률이다. 후기 흑색종의 경우, 항-PD-1 또는 항-PD-L1 단일클론 항체에 대한 객관적인 반응률은 단지 30% 내지 40%이다. 이러한 요법은 반응자 대 비반응자를 예측하는 바이오마커를 절실히 필요로 한다. PD-1 좌위는 장범위 염색체 입체구조 시그너처의 재설정을 통해 후성유전적으로 사이토카인에 의해 조절된다.
OBD 기술
EpiSwitch™ 플랫폼 기술은 면역요법 전 및 면역요법에 대한 반응으로 PD-1 후성유전적 상태의 계층화에 이상적으로 적합하다. 흑색종 환자에서 항-PD-1 치료에 대한 반응의 제어 및 조절과 연관된 332개 초과의 좌위의 분석을 위해 EpiSwitch™ 어레이를 디자인하였다.
방법
EpiSwitch™ 어레이 분석을 이용한 바이오마커 확인:
1. EpiSwitch™ 패턴 인식에 의해 확인된 332개의 유전자 위치들에 대한 염색체 입체구조.
2. PD1 스크리닝 어레이 상의 14,000개 EpiSwitch™ 마커.
샘플
모든 환자들은 화학요법 및 항-CTLA-4 요법으로 이미 치료받았다. 두 시점은 치료 전(기준 샘플) 및 치료 후(12주 샘플)로서 간주되었다.
탐색 코호트
Figure pct00046
기준에서 4명의 반응자 대 4명의 비반응자
Figure pct00047
12주에서 4명의 반응자 대 4명의 반응자(일치됨)
초기하 분석
어레이 데이터 분석의 마지막 단계로서, 잠재적 원인 표적 및 계층화를 위한 바람직한 좌위로서 조절 중심지, 즉 가장 조밀하게 조절되는 유전자를 확인하기 위해 초기하 분석을 수행하였다. 데이터는 기준에서의 반응자가 12주에서의 반응자와 비교될 때 R 대 R 12W(12W_FC_1)에 대한 후성유전적 비에 의해 순위가 매겨지고, BL 이진법에서 1은 루프가 비반응자와 대조적으로 반응자에 존재한다는 것을 표시한다. 상기 후성유전적 비는 루프의 존재가 12주 반응자 환자 샘플에서 더 풍부하다는 것을 표시한다. 이것은 이 시그너처의 확장이 있다는 것을 표시한다.
요약
잠재적 예측 및 약력학적 바이오마커에 대한 항-PD1 요법의 이 후성유전적 스크린은 종래 생물학적 증거와 일치하는 풍부한 새로운 조절 지식을 제공한다. 상기 연구는 검증 분석에서 사용할 예측 및 약력학적/반응 EpiSwitch™ 마커의 풍부한 풀을 제공한다. 결과는 항-PD-1 요법을 허용하는 소정의 후성유전자 프로파일의 존재를 보여준다. 항-PD1 요법을 허용하는 후성유전자 프로파일은 기준에서 무경험 환자에 존재하고 12주 기간에 걸쳐 치료에 의해 강화된다.
표 39a. 상위 프로브 - 항-PD1(흑색종) - 반응자
표 39b. 상위 프로브 - 항-PD1(흑색종) - 반응자 - 프로브 서열
표 39c. 상위 프로브 - 항-PD1(흑색종) - 반응자 - 좌위
표 39d. 상위 프로브 - 항-PD1(흑색종) 비반응자
표 39e. 상위 프로브 - 항-PD1(흑색종) 비반응자
표 39f. 상위 프로브 - 항-PD1(흑색종) 비반응자 - 프로브 서열 및 좌위
표 40a. 항-PD1: 약력학적 반응 마커
표 40b. 항-PD1: 약력학적 반응 마커
표 41a. 항-PD1: 약력학적 반응 마커 - 기준 반응자와 기준 비반응자의 차이가 없으나, 12주 반응자에서 유의한 변화를 보인다.
표 41b. 프로브 위치 - 항-PD1: 약력학적 반응 마커 - 기준 반응자와 기준 비반응자의 차이가 없으나, 12주 반응자에서 유의한 변화를 보인다.
실시예 11 - 추가 정보
이 연구는 일반적인 의사에 의한 좋지 않은 흑색종 진단이라는 문제점을 해결하기 위한 진단 검사를 위한 기초로서 EpiSwitch™에 관한 것이다. 실제 임상 상황을 대표하는 초기 세트의 86개 환자 샘플들로부터 15개의 선도 EpiSwitch™ 바이오마커들을 스크리닝하고 확인하였다. 그 다음, 상기 바이오마커들을 2개의 독립적인 환자 코호트, 즉 호주로부터의 환자 코호트(395명의 환자들) 및 마요 병원으로부터의 환자 코호트(119명의 환자들)에서 훈련하고 검증하였다:
Figure pct00048
119개의 독립적으로 및 소급적으로 해석된 혈액 샘플
Figure pct00049
59개의 흑색종 샘플
Figure pct00050
60개의 대조군(20 NMSC, 20 양성 병태, 20 건강한 환자) )
Figure pct00051
미국 내의 2개의 임상 수집기관
Figure pct00052
통계학적 프로세싱으로 68개의 EpiSwitch™ 마커들을 기준에서 항-PD-1 요법에 대한 예측 바이오마커로서 확인하였다. (PD1-R 대 NR BL). R은 반응자이고, NR은 비반응자이다.
통계학적 프로세싱으로 63개의 EpiSwitch™ 마커들을 항-PD-1 요법에 대한 반응 바이오마커로서 확인하였다(PD1 R-BL 대 R-12W).
10개의 마커들은 예측 및 반응 마커를 위한 우수한 후보이다.
피셔-정확 검정 결과: 상위 8개의 예측 EpiSwitch™ 어레이 마커들을 독립적인 환자 코호트에 대해 EpiSwitch™ PCR 플랫폼으로 검증하였다(표 42 참조). 기준에서의 반응자와 12주에서의 반응자 사이의 PCR 분석에 대한 피셔-정확 분석으로부터의 구별 마커에 대해서는 표 43을 참조한다. 1은 존재하는 입체구조이다. 0은 부재하는 입체구조이고/어레이: R12_W는 입체구조가 12주에서 반응자에 존재하였다는 것을 표시한다.
기준에서 반응자 대 비반응자에서 STAT5B_17_40403935_40406459_40464294_40468456_FR 프로브를 측정하였고, 입체구조는 반응자에 존재한다.
이 비교에서, 마커는 12주에서 반응자에 존재하고, 이것은 반응자 대 비반응자에서 입체구조를 검출하는 데 사용된 DNA의 농도가 기준에서의 반응자 대 12주에서의 반응자에서 입체구조를 검출하는 데 사용된 DNA의 농도보다 더 높은 경우이고, 이는 후성유전적 로드가 항-PD-1 반응 환자에서 증가하였다는 것을 표시한다.
마커 STAT5B 및 IL15는 특히 흥미롭고 항-PD1 요법에 대한 효과적인 반응을 책임지는 핵심 맞춤화된 의학적 및 조절 사건에 관여한다(표 46 내지 49 참조).
실시예 12
상이한 암에서의 항-PD1 반응성과 관련된 염색체 상호작용
표 50은 특정 암을 갖는 개체에서 (달리 NR(비반응자)로 언급되지 않은 한) 항-PD1에 대한 반응자에 존재하는 염색체 상호작용의 패턴을 보여준다. 표에서 사용된 용어는 이하에 설명되어 있다.
DLBCL_ABC: 미만성 B 대세포 림프종 서브타입 활성화된 B 세포
DLBCL_GBC: 미만성 B 대세포 림프종 서브타입 배중심 B 세포
HCC: 간세포 암종
HCC_HEPB: B형 간염 바이러스를 갖는 간세포 암종
HCC_HEPC: C형 간염 바이러스를 갖는 간세포 암종
HEPB+R: 차도를 보이는 B형 간염
Pca_Class3: 전립선암 3 기
Pca_Class2: 전립선암 2 기
Pca_Class1: 전립선암 1 기
BrCa_Stg4: 유방암 4 기
BrCa_Stg3B: 유방암 3B 기
BrCa_Stg2A: 유방암 2A 기
BrCa_Stg2B: 유방암 2B 기
BrCa_Stg1A: 유방암 1A 기
BrCa_Stg1: 유방암 1 기
PD_1_R_흑색종: 흑색종 반응자
PD_1_NR_흑색종: 흑색종 비반응자
실시예 13
상위 100개 EpiSwitch™ 마커들의 MSRR, MSPP 및 ALS 중첩
하나 초과의 조건에 존재하는 마커들의 분석을 수행하였다. 결과는 도 3 내지 18 및 이하에 제공되어 있다.
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SEQUENCE LISTING <110> Oxford BioDynamics Limited <120> Detection Processes <130> P103465WO01 <140> PCT/GB2016/051910 <141> 2016-06-24 <160> 744 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 14 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> misc_feature <222> (6)..(6) <223> 'n' can be any base <220> <221> misc_feature <222> (9)..(9) <223> 'n' can be any base <400> 1 ccgcgnggng gcag 14 <210> 2 <211> 60 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 2 gcctgcaggg ggcgcccccg cgcctgcctc gaccacacat ccacatggac gcatggcagg 60 <210> 3 <211> 60 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 3 ttatcaaccc ggcgtctgga acaatcgctc gatccacacc acaccagcag tggggcacaa 60 <210> 4 <211> 60 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 4 aggacagaga cccctaattc caccaccatc gacccttctg ctttctctcc aggggatggc 60 <210> 5 <211> 60 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 5 ccgcccctgt cctctcgctt cccgctggtc gatccacacc acaccagcag tggggcacaa 60 <210> 6 <211> 60 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 6 agttctttct tgaattcttt cctgatactc gatccacacc acaccagcag tggggcacaa 60 <210> 7 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<210> 668 <211> 60 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 668 tccagtacaa taaacaatgt accaaagatc gacaaaattt taacatgtta tgcagttaca 60 <210> 669 <211> 60 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 669 taaactctga cattgcctat tagcattctc gaatgcatgg ctcactgtaa cctccaactc 60 <210> 670 <211> 60 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 670 tatcctttgg tttagaagta tttcttattc gacaactact ggcttaaaaa aggcaaaaca 60 <210> 671 <211> 60 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 671 tacctccttg ggaacatatt tgagagtttc gactcctgct tccctcccct catctttaaa 60 <210> 672 <211> 60 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 672 acacttgatt tttgctttcc aagctgactc gagacatcta agaaggtcca gccagatgtt 60 <210> 673 <211> 60 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 673 gcgccctatt tccaccttgt gccttctgtc gacacaccaa gatgtcacgg aggagtctgt 60 <210> 674 <211> 60 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 674 ccagctgaag tttcgcaggt cccctgcttc gagtaggcca atcccatttt tggcgaaaac 60 <210> 675 <211> 60 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 675 tacctccttg ggaacatatt tgagagtttc gactcctgct tccctcccct catctttaaa 60 <210> 676 <211> 60 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 676 acacttgatt tttgctttcc aagctgactc gagacatcta agaaggtcca gccagatgtt 60 <210> 677 <211> 60 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 677 gcgccctatt tccaccttgt gccttctgtc gacacaccaa gatgtcacgg aggagtctgt 60 <210> 678 <211> 60 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 678 ccagctgaag tttcgcaggt cccctgcttc gagtaggcca atcccatttt tggcgaaaac 60 <210> 679 <211> 60 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 679 actttggctc aagagtgaag atattcagtc gactcctgct tccctcccct catctttaaa 60 <210> 680 <211> 60 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 680 ttccttaggc aagtcatcca attccatgtc gacacaaggg tttgtaacaa aaaacaaaaa 60 <210> 681 <211> 60 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 681 tcttaggagg taagaatgaa tttcttggtc gaactcctga ccaggaggct gggagggggt 60 <210> 682 <211> 60 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 682 catcatttta ataggtgcaa gagttccgtc gaacgcccat acctgtggga atcaagcaat 60 <210> 683 <211> 60 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 683 aaaaacaaaa aagccaattc tgtacccctc gaaccagccc tggctctgtc cccagacctt 60 <210> 684 <211> 60 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 684 gcgccctatt tccaccttgt gccttctgtc gagacatcta agaaggtcca gccagatgtt 60 <210> 685 <211> 60 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 685 ttgattattt caggttgaca gctgtaaatc gactcctgct tccctcccct catctttaaa 60 <210> 686 <211> 21 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 686 ggaacctcgc tgtccataaa c 21 <210> 687 <211> 24 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 687 tctgtatgca agtcctgatg tttc 24 <210> 688 <211> 22 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 688 ggtaggagtg tgccttatta ac 22 <210> 689 <211> 21 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 689 gaggctgtta ggcattctaa g 21 <210> 690 <211> 22 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 690 gaaaccaacc ctatctgtaa ac 22 <210> 691 <211> 18 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 691 aaagaaagga ggctgtgg 18 <210> 692 <211> 19 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 692 gctctggact gcctttaac 19 <210> 693 <211> 22 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 693 aagtcagact cctcttctct ac 22 <210> 694 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 694 gtgaaactaa gccctcaacc 20 <210> 695 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 695 taccctcctt ccattcagac 20 <210> 696 <211> 21 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 696 gctacagagg tgaaggagat c 21 <210> 697 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 697 aagtctggag ctgggcaaag 20 <210> 698 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 698 gaaacagcat tcttgccaac 20 <210> 699 <211> 21 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 699 gcttcatgag agagtgagaa c 21 <210> 700 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 700 aaagagaaca gggtgtaacg 20 <210> 701 <211> 18 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 701 gagccgggaa taaacgac 18 <210> 702 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 702 aggtctaggg ttcagggctc 20 <210> 703 <211> 21 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 703 gggttcattt gactggactg g 21 <210> 704 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 704 gccagtgtga caagattgcc 20 <210> 705 <211> 21 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 705 gacatcagtg gagggaggaa c 21 <210> 706 <211> 19 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 706 atgcctgcaa cttaaggac 19 <210> 707 <211> 23 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 707 gaggacaaag agatagctta ctg 23 <210> 708 <211> 22 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 708 ctgtctagag tccagatctt tc 22 <210> 709 <211> 19 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 709 aaactacagg tgagggttg 19 <210> 710 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 710 tgacttgtcc accttcaccc 20 <210> 711 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 711 tacggcagtg tgggtctaac 20 <210> 712 <211> 60 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 712 aaatacaatt gaaataaaaa taatcttgtc gaagcaaggg cttccaggtc ataggtggat 60 <210> 713 <211> 60 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 713 tgttactggg ctcaccacaa gcttaaaatc gaacgctgcc agcattagaa cctatttgtt 60 <210> 714 <211> 60 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 714 aaaaaggcac tatgaaaaaa caacatgctc gaactcctga cctcagatga tccacacacc 60 <210> 715 <211> 60 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 715 caaacaagaa taaagagtag agggtgtttc gagaatcttc aactttttgt atcttctatt 60 <210> 716 <211> 60 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 716 tctctttgga atgtcagtta ttcaaatatc gaatagctcc tattgttatg gagtgtagca 60 <210> 717 <211> 60 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 717 tatctcagct tttggcctgt ctcagctttc gacatagtag gtacttggta aacatttgtt 60 <210> 718 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 718 tgagtaacac aaagcatctg 20 <210> 719 <211> 18 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 719 agtgactggc tatgttcc 18 <210> 720 <211> 21 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 720 ctggtgattt gtgtgacttt g 21 <210> 721 <211> 18 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 721 agggaagatg tggaggag 18 <210> 722 <211> 19 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 722 gtacgactcc agccaaatg 19 <210> 723 <211> 22 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 723 gctgtctgtt actagattgc ac 22 <210> 724 <211> 18 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 724 accttgcaag aagcacag 18 <210> 725 <211> 21 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 725 atgatacttc ccaactgaca c 21 <210> 726 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 726 aggagcatcc atatcaagtg 20 <210> 727 <211> 19 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 727 ctgccatgtc tgactatcc 19 <210> 728 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 728 cagtgaagaa gccatcatcg 20 <210> 729 <211> 22 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 729 gcttagagaa atacaccagc ag 22 <210> 730 <211> 18 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 730 atgggcagca tttctcac 18 <210> 731 <211> 22 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 731 agggacgatt tatatgactt gc 22 <210> 732 <211> 22 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 732 gtgctggtat gtacctgtaa tc 22 <210> 733 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 733 gagggttgag aagcatcttg 20 <210> 734 <211> 60 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 734 tgtaaactgt aatatcaaaa attcaaaatc gaagagttga tttacttatt aacattagaa 60 <210> 735 <211> 60 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 735 acttttatag tgaaaagtgc catttgagtc gactgtgatt gaatgtaaaa ggttttaaat 60 <210> 736 <211> 60 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 736 tactgtagta agttctctga ggaggatatc gaagtcttgg attaaggttc attcaacaaa 60 <210> 737 <211> 60 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 737 tccatttgaa ggatgagaaa actgaggctc gaggcttaga aagtttcatt tggttgctca 60 <210> 738 <211> 60 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 738 ttttaaaccc aggtgcacac acaagagctc gaagcaggaa tcctggttct gttcccaggc 60 <210> 739 <211> 60 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 739 ccactccccc aggcttacct gcgagccatc gaggtgggcc tgggttctcg tggagggaga 60 <210> 740 <211> 60 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 740 tcactcattc tagatccctc tgtaaagttc gaactctgga ccttgtgatc cacccacctt 60 <210> 741 <211> 60 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 741 ttccatagat tacttttcaa atcatccttc gaagctggcg gctgagggcc cggcgccaag 60 <210> 742 <211> 60 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 742 tacagtcttt gtagatgcag agtagcgttc gaagctggcg gctgagggcc cggcgccaag 60 <210> 743 <211> 21 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 743 ctgcccgtaa ataagcagaa g 21 <210> 744 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 744 gagggttgag aagcatcttg 20

Claims (25)

  1. 서브그룹들을 구별하는 동반 후성유전자 검사와 관련된 후성유전적 염색체 상호작용을 확인하는 방법으로서, 상기 서브그룹들로부터의 제1 세트의 핵산을, 염색체 상호작용의 지표 집단을 나타내는 제2 세트의 핵산과 접촉시키는 단계, 및 상보성 서열들이 하이브리드화할 수 있게 하는 단계를 포함하고, 제1 및 제2 핵산 세트의 핵산은 후성유전적 염색체 상호작용에 있어서 회합하는 양 염색체 영역으로부터의 서열을 포함하는 결찰된 생성물을 나타내고, 제1 세트의 핵산과 제2 세트의 핵산 사이의 하이브리드화 패턴은, 어느 후성유전적 염색체 상호작용이 집단 내의 서브그룹에 특이적인지를 확인할 수 있게 하며, 서브그룹들은 동반 후성유전자 검사와 관련된 특징에 있어서 상이하고, 경우에 따라, 상기 염색체 상호작용은 게놈의 소정의 질환과 연관된 영역 내에 존재하는 것인 방법.
  2. 제1항에 있어서,
    - 서브그룹은 인간 집단의 서브그룹이고/이거나,
    - 제1 세트의 핵산은 적어도 8명의 개체들로부터 유래하고/하거나,
    - 제1 세트의 핵산은 제1 서브그룹으로부터의 적어도 4명의 개체와, 바람직하게는 제1 서브그룹과 중첩되지 않는 제2 서브그룹으로부터의 적어도 4명의 개체로부터 유래하고/하거나,
    - 제2 세트의 핵산은 선택되지 않은 염색체 상호작용 그룹을 나타내고/내거나,
    - 제2 세트의 핵산은 소정의 위치에서 어레이에 결합되고/되거나,
    - 제2 세트의 핵산은 적어도 100개의 상이한 유전자 또는 좌위에서 염색체 상호작용을 나타내고/내거나,
    - 제2 세트의 핵산은 적어도 1000개의 상이한 후성유전적 염색체 상호작용을 나타내는 적어도 1000개의 상이한 핵산을 포함하고/하거나,
    - 제1 세트의 핵산 및 제2 세트의 핵산은 10개 내지 100개 뉴클레오티드 염기 길이의 핵산 서열을 포함하고/하거나,
    - 제1 세트의 핵산은 적어도 2개의 서브그룹들로부터 유래하고, 이들 서브그룹들 중 하나는 소정의 유전자 변형을 갖고 이들 서브그룹들 중 하나는 유전자 변형을 갖지 않으며, 과정은 어느 염색체 상호작용이 유전자 변형과 관련되어 있고/있거나 유전자 변형에 의해 영향을 받는지를 확인하고, 경우에 따라, 다세포 유기체의 경우, 유전자 변형은 시험관내 세포에 대해서만 이루어지고 전체 유기체에 대해서는 이루어지지 않는 것인 방법.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    - 상기 방법은 어느 좌위 또는 유전자가 동반 후성유전자 검사와 관련된 상기 특징과 관련되어 있는지를 확인하기 위해 수행되고/되거나,
    - 제1 세트의 핵산 및/또는 제2 세트의 핵산은 질환과 연관되어 있거나 게놈의 질환과 연관된 영역 내에 존재하는 적어도 하나의 염색체 상호작용을 나타내는 것인 방법.
  4. 개인이 어느 서브그룹 내에 있는지를 확인하는 동반 후성유전자 검사를 수행하는 방법으로서,
    (a) 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항의 방법에 의해 확인된 좌위를, 서브그룹에 특징적인 후성유전적 상호작용을 갖는 것으로서 형별(typing)하는 단계, 및/또는
    (b) 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항의 방법에 의해 확인된 염색체 상호작용을, 서브그룹의 특징과 관련되어 있거나 연관되어 있는 것으로서 형별하는 단계, 및/또는
    (c) (i) 특정 치료 및/또는 예방(특히 특정 의약 치료 및/또는 예방)에 대한 반응, 및/또는
    (ii) 특정 병태에 대한 소인, 및/또는
    (iii) 재발로 이어질 수 있는 잔존 질환의 존재, 및/또는
    (iv) 환경적 변화에 대한 반응성, 및/또는
    (v) 유전적 변화에 대한 반응, 및/또는
    (vi) 대사계, 면역계, 내분비계, 소화기계, 피부계, 골격계, 근육계, 림프계, 호흡계, 신경계 또는 생식기계의 상태에 있어서의 변화 또는 차이
    에 대해 특징적인 적어도 5개의 후성유전적 염색체 상호작용의 존재 또는 부재를 바람직하게는 적어도 5개의 상이한 좌위에서 검출하는 단계
    를 포함하고, 경우에 따라, 상기 방법은 서브그룹을 정의하는 특징과 관련된 의학적 또는 비의학적 치료를 위해 개체를 선택하기 위해 수행되고, 상기 치료는 경우에 따라 그 영역이 연관되어 있는 질환과 무관한 것인 방법.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 질환과 연관된 영역은
    (i) 본 명세서의 표에 나열된 유전자 중 어느 하나에 상응하고/하거나,
    (ii) 본 명세서의 표에 제시된 임의의 프로브 또는 프라이머 쌍에 의해 나타내어지는 염색체 상호작용 중 어느 하나에 상응하고/하거나,
    (iii) (i) 또는 (ii)를 포함하거나 측면을 접하는 4,000개 염기 영역에 상응하고/하거나,
    (iv) 질환에 대한 감수성, 요법에 대한 반응성 또는 질환 상태로의 재발과 연관되어 있는 것인 방법.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 질환과 연관된 영역 및/또는 염색체 상호작용은
    - 환경적 변화 또는 요법에 대한 반응성, 및/또는
    - 질환 상태에 대한 소인, 및/또는
    - 잔존 질환 상태, 및/또는
    - 개체에서의 유전적 변화에 대한 반응, 및/또는
    - 치료 및/또는 예방(특히 의약 치료 및/또는 예방)과 관련된 특징
    을 결정하거나 이들과 연관되어 있는 것인 방법.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 서브그룹은
    (i) 특정 치료 및/또는 예방(특히 특정 의약 치료 및/또는 예방)에 대한 반응, 및/또는
    (ii) 특정 병태에 대한 소인, 및/또는
    (iii) 경우에 따라 재발로 이어질 수 있는 잔존 질환의 존재, 및/또는
    (iv) 소정의 유전적 변화 또는 유전적 변화에 대한 반응, 및/또는
    (iv) 대사계, 면역계, 내분비계, 소화기계, 피부계, 골격계, 근육계, 림프계, 호흡계, 신경계 또는 생식기계의 상태에 있어서의 차이, 및/또는
    (v) 비질환 특징,
    (vi) 염색체 상호작용, 경우에 따라 본 명세서의 임의의 표에 기재된 임의의 프로브 또는 프라이머 쌍에 의해 정의된 염색체 상호작용에 의해 유발된 특징,
    (vii) 항체를 포함하는 치료, 및/또는
    (viii) 면역계 또는 암과 관련된 병태
    에 있어서 상이한 것인 방법.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서,
    (i) 염색체 상호작용에 있어서 회합하는 염색체 영역들을 시험관내에서 가교결합시키는 단계;
    (ii) 상기 가교결합된 DNA를 효소로 제한 분해 절단하는 단계; 및
    (iii) 상기 가교결합된 절단된 DNA 말단을 결찰시켜 결찰된 핵산(특히 결찰된 DNA)을 형성하는 단계
    를 포함하는 방법에 의해
    - 제1 세트의 핵산을 생성하고/하거나;
    - 제4항에 기재된 염색체 상호작용의 형별을 수행하는 것인 방법.
  9. 제4항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 경우에 따라 제4항의 단계 (a)를 포함하고, 여기서
    (1) 상기 좌위는 유전자이고/이거나,
    (2) 단계 (a)에서 단일 뉴클레오티드 다형성(SNP)이 형별되고/되거나,
    (3) 상기 좌위로부터 마이크로RNA(miRNA)가 발현되고/되거나,
    (4) 상기 좌위로부터 비코딩 RNA(ncRNA)가 발현되고/되거나,
    (5) 상기 좌위는 적어도 10개의 인접 아미노산 잔기들을 코딩하는 핵산 서열을 발현하고/하거나,
    (6) 상기 좌위는 조절 요소를 발현하고/하거나,
    (7) 단계 (a)에서의 상기 형별은 좌위로부터의 발현을 시퀀싱하거나 좌위로부터의 발현 수준을 측정하는 것을 포함하는 것인 방법.
  10. 제4항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서,
    - 제4항의 단계 (b)에서, 적어도 5개 내지 500개, 바람직하게는 20개 내지 300개, 보다 바람직하게는 50개 내지 100개의 후성유전적 염색체 상호작용을, 바람직하게는 적어도 5개의 상이한 좌위에서 형별하고/하거나,
    - 상기 방법은 동일한 서브그룹과 상관관계를 갖는, 상이한 질환과 연관된 영역에서 염색체 상태를 검출하기 위해 적어도 2회, 3회, 5회 또는 10회 수행되고/되거나,
    - 상기 방법은 본 명세서의 표 중 어느 하나의 프로브 또는 프라이머 쌍 중 어느 하나에 의해 나타내어지는 염색체 상호작용의 형별을 포함하는 것인 방법.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 동반 후성유전자 검사와 관련된 상기 특징은
    - 류마티스성 관절염 환자에서의 메토트렉세이트에 대한 반응성, 및/또는
    - 급성 골수성 백혈병에 대한 요법에 대한 반응성, 및/또는
    - 흑색종의 재발 가능성, 및/또는
    - 흑색종 환자에서의 항-PD-1 요법에 대한 반응성, 및/또는
    - 바람직하게는 흑색종, 유방암, 전립선암, 급성 골수성 백혈병(AML), 미만성 B 대세포 림프종(DLBCL), 췌장암, 갑상선암, 비암, 간암 또는 폐암의 치료에 있어서 항-PD-1, 항-PD-L1 요법 또는 항-PD1-1/항-PD-L1 조합 요법에 대한 반응성, 및/또는
    - 다발성 경화증 환자에서의 IFN-B(IFN-베타) 치료에 대한 반응성, 및/또는
    - 재발 완화형 다발성 경화증에 대한 소인, 및/또는
    - 원발성 진행성 다발성 경화증의 가능성, 및/또는
    - 근위축성 측삭 경화증(ALS) 질환 상태에 대한 소인, 및/또는
    - 빠른 진행성 근위축성 측삭 경화증(ALS) 질환 상태에 대한 소인, 및/또는
    - 공격성 2형 당뇨병 질환 상태에 대한 소인, 및/또는
    - 2형 당뇨병 질환 상태에 대한 소인, 및/또는
    - 2형 당뇨병 전증 상태에 대한 소인, 및/또는
    - 1형 당뇨병 질환 상태에 대한 소인, 및/또는
    - 전신 홍반성 루푸스(SLE) 질환 상태에 대한 소인, 및/또는
    - 궤양성 대장염 질환 상태에 대한 소인, 및/또는
    - 궤양성 대장염 환자에 대한 대장암의 재발 가능성, 및/또는
    - 신경섬유종증 환자에 대한 악성 말초 신경초 종양의 가능성, 및/또는
    - 전립선암 및/또는 공격성 전립선암의 발생 가능성, 및/또는
    - 신경변성 질환 또는 병태, 바람직하게는 치매, 예컨대, 알츠하이머병, 경도 인지 장애, 혈관 치매, 루이 소체를 갖는 치매, 전두측두엽 치매, 또는 보다 바람직하게는 알츠하이머병, 가장 바람직하게는 베타-아밀로이드 응집체에 의해 유도된 알츠하이머병의 발생 가능성 및/또는 이러한 질환에 대한 소인, 및/또는
    - 치매 환자(바람직하게는 알츠하이머병 환자, 보다 바람직하게는 베타-아밀로이드 응집체를 갖는 알츠하이머병 환자)와 알츠하이머병을 갖지 않는 인지 장애 환자의, 특히 기억력 및/또는 인지력 면에서의 비교인 방법.
  12. 개체의 병태를 치료 및/또는 예방하는 데 사용하기 위한 치료제로서, 상기 개체는 제4항 내지 제11항 중 어느 한 항의 방법에 의해 상기 치료제를 필요로 하는 개체로서 확인된 것인 치료제.
  13. 개체의 질환 상태를 제1 상태로부터 제2 상태로 변화시킬 수 있는 작용제를 확인하는 방법으로서, 후보 작용제가 염색체 상호작용을 제1 상태에 상응하는 염색체 상호작용으로부터 제2 상태에 상응하는 염색체 상호작용으로 변화시킬 수 있는지를 확인하는 단계를 포함하고, 바람직하게는 제1 상태 및 제2 상태는
    (i) 특정 치료 및/또는 예방(특히 특정 의약 치료 및/또는 예방)에 대한 반응성, 및/또는
    (ii) 특정 병태에 대한 소인, 및/또는
    (iii) 재발로 이어질 수 있는 잔존 질환, 및/또는
    (iv) 동반 후성유전자 검사와 관련된 특징으로서, 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에서 정의된 특징
    의 존재 또는 부재에 상응하는 것인 방법.
  14. 약물의 효과를 확인하는 방법으로서, 상기 약물에 의해 유발된 후성유전적 염색체 상호작용의 변화를 검출하는 단계를 포함하고, 상기 효과는 바람직하게는 약물의 작용 메커니즘이거나 약물의 약력학적 특성이고, 염색체 상호작용은 바람직하게는
    (i) 특정 치료 및/또는 예방(특히 특정 의약 치료 및/또는 예방)에 대한 반응성, 및/또는
    (ii) 특정 병태에 대한 소인, 및/또는
    (iii) 재발로 이어질 수 있는 잔존 질환, 및/또는
    (iv) 동반 후성유전자 검사와 관련된 특징으로서, 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에서 정의된 특징
    에 특이적인 것인 방법.
  15. 게놈의 제1 좌위에서의 서열에 대한 유전자 변형이 게놈의 다른 좌위에 영향을 미치는지를 확인하는 방법으로서, 유전자 변형이 이루어진 후 하나 이상의 다른 좌위에서의 염색체 상호작용의 존재 또는 부재를 검출하는 단계를 포함하고, 바람직하게는 유전자 변형은 계 특징을 변화시키고, 상기 계는 바람직하게는 대사계, 면역계, 내분비계, 소화기계, 피부계, 골격계, 근육계, 림프계, 호흡계, 신경계 또는 생식기계이고,
    - 염색체 시그너처의 상기 검출은, 경우에 따라, 바람직하게는 제4항 내지 제11항 중 어느 한 항에서 정의된 바와 같이, 바람직하게는 5개 이상(예를 들면, 5개)의 상이한 좌위에서, 5개 이상(예를 들면, 5개)의 상이한 염색체 상호작용의 존재 또는 부재를 검출하는 것을 포함하고/하거나,
    - 바람직하게는 상기 염색체 시그너처 또는 상호작용은 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에서 정의된 방법에 의해 확인되고/되거나,
    - 변형되는 좌위, 및/또는 염색체 상호작용의 염색체 존재 또는 부재가 검출되는 하나 이상의 좌위는 CTCF 결합 부위를 포함하고/하거나,
    - 검출되는 염색체 상호작용은 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에서 정의된, 동반 진단과 관련된 특징에 상응하는 것인 방법.
  16. 제15항에 있어서, 상기 유전자 변형은 (a) 2개 이상의 RNA 안내 엔도뉴클레아제, 또는 2개 이상의 RNA 안내 엔도뉴클레아제를 코딩하는 핵산 및 (b) 2개 이상의 안내 RNA, 또는 2개 이상의 안내 RNA를 코딩하는 DNA를 세포 내로 도입하는 단계를 포함하는 방법에 의해 이루어지고, 각각의 안내 RNA는 RNA 안내 엔도뉴클레아제 중 하나를 염색체 서열 내의 표적화된 부위로 안내하고, RNA 안내 엔도뉴클레아제는 표적화된 부위에서 염색체 서열의 적어도 한 가닥을 절단하는 것인 방법.
  17. 제15항에 있어서, 상기 유전자 변형은
    a) 표적 서열과 하이브리드화하는, 일정한 간격을 두고 주기적으로 분포하는 짧은 회문 반복서열(Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats; CRISPR)-CRISPR 관련 단백질(Cas)(CRISPR-Cas) 시스템 안내 RNA를 코딩하는 적어도 하나의 뉴클레오티드 서열에 작동 가능하게 연결된, 진핵 세포에서 작동 가능한 제1 조절 요소, 및
    b) II형 Cas9 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열에 작동 가능하게 연결된, 진핵 세포에서 작동 가능한 제2 조절 요소
    를 포함하는 하나 이상의 벡터를 포함하는 조작된 비자연 발생 CRISPR-Cas 시스템을, 표적 서열을 가지며 유전자 생성물을 코딩하는 DNA 분자를 포함하고 발현하는 진핵 세포 내로 도입하는 단계를 포함하는, 하나 이상의 유전자 생성물의 발현을 변경시키는 방법에 의해 수행되고,
    성분 (a)와 (b)는 상기 시스템의 동일한 또는 상이한 벡터 상에 위치하고, 상기 안내 RNA는 표적 서열을 표적화하고 Cas9 단백질은 DNA 분자를 절단하고, 이에 의해 적어도 하나의 유전자 생성물의 발현이 변경되며; Cas9 단백질 및 안내 RNA는 자연적으로 함께 존재하지 않고, 바람직하게는 각각의 RNA 안내 엔도뉴클레아제는 Cas9 단백질로부터 유래하고 적어도 2개의 뉴클레아제 도메인을 포함하며, 경우에 따라, 2개의 RNA 안내 엔도뉴클레아제 각각의 뉴클레아제 도메인 중 하나는, 각각의 RNA 안내 엔도뉴클레아제가 이중 가닥 서열의 한 가닥을 절단하도록 변형되고, 2개의 RNA 안내 엔도뉴클레아제는 염색체 서열이 변형되도록 DNA 복구 과정에 의해 복구되는 이중 가닥 절단을 염색체 서열 내로 함께 도입하는 것인 방법.
  18. 제15항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 유전자 변형은 적어도 5개, 20개, 50개, 100개 또는 1000개 염기, 바람직하게는 최대 10,000개 또는 1000,000개 염기의 결실, 삽입 또는 치환을 포함하는 것인 방법.
  19. 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 질환과 연관된 영역은
    - 본 명세서의 표 중 어느 하나에서 정의된 영역에 상응하고/하거나,
    - 본 명세서의 표에 제시된 프로브 또는 프라이머 중 어느 하나에 의해 정의된 염색체 상호작용을 포함하고/하거나,
    - 본 명세서의 표 중 어느 하나에 나열된 유전자에 상응하고/하거나,
    - 상기 서브그룹들 사이에 상이한 특징은 상응하는 표에 대해 제시된 것과 동일하지 않고, 경우에 따라 상기 특징은 상이한 질환, 동일한 질환의 상이한 양상 또는 비질환 특징과 관련되어 있는 것인 방법.
  20. 제1 부분 및 제2 부분을 포함하는 DNA 분자로서, 본 명세서의 표에서 언급된 특정 프로브 서열 중 어느 하나에 대해 70% 이상의 동일성을 갖거나 그러한 서열을 포함하거나 그러한 서열과 동일하며, 바람직하게는
    - 상기 부분은 각각 염색체 상호작용에 있어서 회합하는 염색체의 영역을 나타내고/내거나,
    - DNA 분자는 제8항의 방법에 의해 얻을 수 있는 결찰된 핵산을 나타내는 것인 DNA 분자.
  21. 제20항에서 정의된 적어도 200개의 상이한 DNA 분자를 포함하는 DNA 분자의 라이브러리로서, 경우에 따라 각각의 DNA 분자는 상이한 염색체 상호작용을 나타내고, 상기 라이브러리의 DNA 분자는 경우에 따라 동일한 어레이에 결합되는 것인 DNA 분자의 라이브러리.
  22. 제20항 또는 제21항에 정의된 DNA 분자 또는 라이브러리의,
    - 경우에 따라 적어도 10개, 50개, 100개 또는 500개의 상이한 좌위에서 염색체 상호작용을 검출하고/하거나,
    - 상기 DNA 분자 또는 라이브러리를, 하기 단계들을 포함하는 방법으로 만들어진 결찰된 DNA 분자와 접촉시키는 단계를 포함하는, 적어도 1개, 10개, 50개, 100개 또는 500개의 상이한 좌위에서의 염색체 상호작용을 검출하는 방법에 있어서의 용도:
    (i) 염색체 상호작용에 있어서 회합하는 염색체 영역들을 시험관내에서 가교결합시키는 단계;
    (ii) 가교결합된 DNA를 자르거나 제한 분해 절단하는 단계; 및
    (iii) 가교결합된 잘려진 또는 절단된 DNA 말단을 결찰시켜 결찰된 DNA 분자를 형성하는 단계.
  23. 제1 병태를 치료하기 위한 요법을 선택하는 방법으로서, 그 병태와 연관된 염색체 상호작용이 제2 병태와도 연관되어 있는지를 확인하는 단계, 및 제1 병태를 치료하기 위해 제2 병태를 치료하고 상기 염색체 상호작용이 일어나는 좌위에 작용하는 약물을 선택하는 단계를 포함하고, 경우에 따라
    - 염색체 상호작용은 본 명세서의 표들 중 어느 하나에서 정의된 것이고/이거나,
    - 염색체 상호작용은 어느 염색체 상호작용이 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 따른 동반 후성유전자 검사와 관련되어 있는지를 확인하는 방법에 의해 확인되고/되거나,
    - 상기 좌위는 본 명세서의 표에서 언급된 임의의 영역 또는 유전자이고/이거나,
    - 상기 제1 병태 및/또는 상기 제2 병태는 본원에서 언급된 상이한 병태인 방법.
  24. 제4항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 복수의 병태의 공통 특징에 대한 일반 진단 검사로서 수행되는 방법으로서, 하나보다 많은 병태에 공통된 염색체 상호작용의 존재를 확인하고, 경우에 따라
    - 상기 염색체 상호작용은 상이한 병태들에 대해 본 명세서의 하나보다 많은 표에 언급되어 있고/있거나,
    - 상기 공통 특징은 병태가 자가면역 질환 및/또는 신경학적 병태라는 것인 방법.
  25. 프라이머 쌍, 경우에 따라 본 명세서에 기재된 어느 하나의 표에 정의되거나, 경우에 따라 상기 표에 정의된 임의의 프라이머 쌍에 대해 70% 이상의 동일성을 갖는 프라이머 쌍의 용도로서,
    (i) 염색체 상호작용에 있어서 회합하는 염색체 영역들을 시험관내에서 가교결합시키는 단계;
    (ii) 가교결합된 DNA를 자르거나 제한 분해 절단하는 단계; 및
    (iii) 가교결합된 잘려진 또는 절단된 DNA 말단을 결찰시켜 결찰된 DNA 분자를 형성하는 단계
    를 포함하는 방법으로 만들어진 결찰된 DNA 분자의 존재를 검출하기 위해 PCR 반응에 상기 프라이머 쌍을 이용하는 것을 포함하는 방법으로 염색체 상호작용을 검출하기 위한 용도이며,
    경우에 따라
    - 상기 염색체 상호작용은 본 명세서의 표 중 어느 하나에서 정의된 프로브, 유전자 또는 영역에 의해 나타내어지는 것이고/이거나,
    - 그 존재가 검출되는 결찰된 DNA 분자는, 제20항에서 정의된 것이고/이거나 본 명세서의 임의의 표에 기재된 특정 프로브인 용도.
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