KR102622307B1 - 후성유전적 염색체 상호작용 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 류마티스 관절염의 치료법에 대한 반응성의 확인 방법에 관한 것이다.

Description

후성유전적 염색체 상호작용
본 발명은 염색체 상호작용 및 류마티스 관절염의 검출에 관한 것이다.
보다 특히, 본 발명은 피험자에서 류마티스 관절염에 특이적인 치료법에 대한 반응성의 확인 방법; 동반 진단 방법; 개체(특히 인간 개체)에서 류마티스 관절염의 치료 및/또는 예방에 사용하기 위한 치료제; 류마티스 관절염 치료법에 대한 (특히 개체, 예를 들어 인간 개체의) 반응성을 변화시킬 수 있는 제제, 특히 치료제의 (확인을 위한) 스크리닝 방법; 약물(예를 들어 치료제)에 의해 유발되는 후성유전적(epigenetic) 염색체 상호작용의 변화를 검출하는 단계를 포함하는, 이러한 약물의 효과의 확인 방법; 및/또는 핵산 라이브러리 및/또는 핵산에 관한 것이다.
의료비는 급증하고 있으며, 따라서, 기존의 약물을 사용하여 보다 효과적으로 사람을 치료할 필요가 있다. 일부 환자들은 특정한 약제학적 치료에 비반응성이다. 일 실시예는 메토트렉세이트(MTX)에 의한 류마티스 관절염의 치료이다.
류마티스 관절염(RA)은 전세계 인구 중 1%까지 영향을 미치는 만성 자가면역 질병이다. 발병은 다인자적(multifactorial)이고, 주로 환경 인자, 특히 흡연 및 기타 폐 자극과 면역 숙주 유전자좌의 상호작용을 특징으로 한다1,2,3. 이러한 환경 인자에 유전적으로 취약한 개체의 노출은 질병의 발병 및 진행에 대한 후성유전적 상황을 제시한다. 염색질 마커(예를 들어 게놈의 메틸화 상태)의 최근의 연구는 RA와 연관된 후성유전적 차이의 최초의 증거를 제공하고 있다4,5,6,7. 그러나, 현재까지, 유전적 연관 또는 후성유전적 변화 중 어느 것도 주어진 치료법에의 반응에 대한 타당한 예측 마커를 제공하지 못하였다. 더욱이, 임상적 제시는 기존의 질병 조정 항류마티스 약물(DMARD; disease modifying anti-rheumatic drug), 예컨대 메토트렉세이트(MTX)의 효능 및 독성을 미약하게만 예측할 뿐이다.
MTX8는 EULAR 및 ACR 관리 가이드라인에 의해 권고된 가장 보편적인 첫번째 선택된 약제로서, 6개월간의 치료 후 50% 내지 65% 범위의 임상적으로 의미 있는 반응률을 전달한다11. 이러한 반응, 및 특히 높은 허들(hurdle) 반응을 나타내는 보다 더 작은 비율의 반응은, 현재 개별 환자에서는 예측될 수 없다. 이는, 치료 섭생 선택(모노 또는 조합 치료)에 대한 '시행착오'를 기반으로 한 접근법을 야기한다.
제1선 치료에 대한 반응이 장기간 결과의 가장 유의미한 예측인자임을 고려하면, 개별 환자에서 MTX 및/또는 다른 RA 약물에 대한 반응성을 예측하는 능력은 매우 중요한 임상적 툴이 될 것이다9,10.
본 발명자들은, 류마티스 관절염(RA)에 대한 동반 진단법을 기반으로 하거나 이와 함께 사용하기 위한 후성유전적 염색체 상호작용의 용도, 및 특히 RA 치료법, 특히 RA의 약제학적 치료법, 예컨대 메토트렉세이트에 대한 반응성을 확인하기 위한 후성유전적 상태의 검출에서 후성유전적 염색체 상호작용의 용도를 조사하였다. 본 발명자들의 연구는 후성유전적 상호작용에 의해 작용한 역할을 보여주고, 관련 염색체 상호작용의 확인 방법을 제공한다. 본 발명은 동반 진단 시험에 대한 기반으로서 염색체 상호작용의 사용에 관한 것이다.
이에, 본 발명의 제1 양태는 피험자(바람직하게는 포유류, 예컨대 인간 피험자)에서 류마티스 관절염에 특이적인 치료법(특히 특이적인 약제학적 치료법)에 대한 반응성의 확인 방법을 제공하며, 상기 방법은 5개 이상(특히 7개 이상, 10개 이상, 15개 이상 또는 20개 이상) 염색체 상호작용의 존재 또는 부재를 검출하는 단계를 포함하고, 여기서, 상기 염색체 상호작용은 바람직하게는 5개 이상(예를 들어 5개)의 상이한 유전자좌에 존재한다.
바람직하게는, 본 발명의 모든 양태들에서, 상기 검출 단계는, 상호작용 부분인 염색체의 영역들이 함께 회합되는지 아닌지의 여부를 각각의 상호작용에 대해 확인하는 단계를 포함한다.
보다 바람직하게는, 본 발명의 모든 양태들에서, 상기 검출 단계는, 피험자의 시료에서 염색체 상호작용을 가교시키고, 함께 회합되는 양 염색체 영역들 유래의 서열이 가교된 생성물에 존재하는지 검출함으로써, 상호작용 부분인 염색체의 영역들이 함께 회합되는지 아닌지의 여부를 각각의 상호작용에 대해 확인하는 단계를 포함한다.
바람직하게는, 본 발명의 모든 양태들에서, 염색체 상호작용이, 서브그룹과 관련된 염색체 상호작용을 확인하는 검정법에서 확인되거나 확인되어 있으며, 상기 검정법은, 서브그룹의 제1 핵산 세트를 염색체 상호작용의 인덱스 집단(index population)을 나타내는 제2 핵산 세트와 접촉시키는 단계, 및 상보적인 서열들을 하이브리드화시키는 단계를 포함하고, 여기서, 제1 핵산 세트 및 제2 핵산 세트 내 핵산들은 후성유전적 염색체 상호작용에서 함께 회합된 양 염색체 영역들 유래의 서열들을 포함하는 결찰된 생성물을 나타내고(특히 결찰된 생성물 형태로 존재하고), 제1 핵산 세트와 제2 핵산 세트 사이의 하이브리드화 패턴은 어떤 후성유전적 염색체 상호작용이 상기 집단에서 서브그룹에 특이적인지 확인할 수 있게 하고, 서브그룹들이 류마티스 관절염에 특이적인 치료법에 대한 반응성에 있어서 차이가 있다.
바람직하게는, 본 발명의 모든 양태들에서, 특징 "...제1 핵산 세트 및 제2 핵산 세트 내 핵산들은 후성유전적 염색체 상호작용에서 함께 회합된 양 염색체 영역들 모두로부터의 서열을 포함하는 결찰된 생성물을 나타낸다..."는:
"...제1 핵산 세트 및 제2 핵산 세트 내 핵산들이 후성유전적 염색체 상호작용에서 함께 회합된 양 염색체 영역들 모두로부터의 서열을 포함하는 결찰된 생성물(들)(바람직하게는 결찰된 핵산(들), 보다 바람직하게는 결찰된 DNA) 형태이다..."이거나 이를 포함한다.
보다 바람직하게는, 본 발명의 모든 양태들에서:
- 제1 핵산 세트는 적어도 8명의 개체로부터 유래된 것이고/거나
- 제1 핵산 세트는 제1 서브그룹의 적어도 4명, 및 바람직하게는 제1 서브그룹과 중복되지 않는 제2 서브그룹의 적어도 4명의 개체로부터 유래된 것이고/거나
- 제2 핵산 세트는 염색체 상호작용의 비선택된 그룹을 나타내고/거나
- 제2 핵산 세트는 한정된 위치에서 어레이에 결합되고/거나
- 제2 핵산 세트는 적어도 100개의 상이한 유전자 또는 유전자좌에서의 염색체 상호작용을 나타내고/거나
- 제2 핵산 세트는 적어도 1,000개의 후성유전적 염색체 상호작용을 나타내는 적어도 1,000개의 상이한 핵산을 포함하고/거나
- 제1 핵산 세트 및 제2 핵산 세트는 길이 10개 내지 100개의 뉴클레오타이드 염기의 핵산 서열을 포함하고/거나
- 제1 핵산 세트는
(i) 염색체 상호작용에서 함께 회합된 염색체 영역들을 시험관내 가교시키는 단계;
(ii) 상기 가교된 DNA를, 효소를 이용하여 제한 분해 절단하는 단계; 및
(iii) 상기 가교되고 절단된 DNA 말단들을 결찰하여, 제1 핵산 세트(특히 결찰된 DNA를 포함함)를 형성하는 단계
를 포함하는 방법에서 발생된 것이다.
바람직하게는, 본 발명의 모든 양태들에서, 피험자는 인간이고/거나 서브그룹은 인간 집단에서의 서브그룹이다.
바람직하게는, 본 발명의 모든 양태들에서:
a. 상기 유전자좌는 유전자이고/거나
b. 마이크로RNA(miRNA)는 유전자좌에서 발현되고/거나
c. 비-코딩 RNA(ncRNA)는 유전자좌에서 발현되고/거나
d. 유전자좌는 적어도 10개의 연속(contiguous) 아미노산 잔기를 코딩하는 핵산 서열을 발현하고/거나
e. 유전자좌는 조절 성분을 발현한다.
바람직하게는, 본 발명의 모든 양태들에서, 5개 이상(특히 5 내지 20, 5 내지 100, 5 내지 300, 또는 5 내지 500), 7개 이상(예를 들어 7 내지 500, 또는 7 내지 100), 보다 바람직하게는 10 이상 또는 15 이상(예를 들어 10 내지 500, 10 내지 100, 15 내지 500, 또는 15 내지 100), 보다 더 바람직하게는 20개 이상(예를 들어 20 내지 500, 20 내지 300, 또는 20 내지 100), 더욱 더 바람직하게는 50개 이상, 예를 들어 50 내지 100개의 후성유전적 염색체 상호작용이 유형화된다.
바람직하게는, 본 발명의 제1 양태(및/또는 모든 다른 양태)에서, 류마티스 관절염에 특이적인 치료법(특히 특이적인 약제학적 치료법), 및/또는 치료제(특히 약제학적 치료제)는, 특히 포유류, 보다 특히 인간에서, 류마티스 관절염(RA)의 치료 및/또는 예방에 사용(특히 인간에 사용)하기에 적합한 약제학적으로 활성인 제제(예를 들어 화합물 또는 생물학/생물학적 제제, 예컨대 단백질 또는 항체), 바람직하게는 질병 조정 항류마티스 약물(DMARD)을 포함한다.
보다 바람직하게는, 본 발명의 모든 양태들에서, 약제학적으로 활성인 제제는
- 합성 질병 조정 항류마티스 약물(sDMARD)을 포함하며, 이러한 sDMARD는 바람직하게는,
- 엽산의 대사 및/또는 작용을 저해하는 sDMARD(바람직하게는 sDMARD는 포유류 다이하이드로폴레이트 리덕타제(DHFR)의 저해제, 가장 바람직하게는 메토트렉세이트, 또는 덜 바람직하게는 페메트렉세드(pemetrexed)임),
- 설파살라진, 또는 설파살라진의 활성 대사산물인 5-아미노살리실산(5-ASA, 메살라진),
- 피리미딘 합성 저해제인 sDMARD(특히 다이하이드로오로테이트 데하이드로게나제(DHODH) 저해제), 가장 바람직하게는 레플루노마이드(leflunomide) 또는 이의 활성 대사산물인 테리플루노마이드(teriflunomide),
- 퀴놀론-부류의 항말라리아 약물 및 sDMARD, 가장 바람직하게는 하이드록시클로로퀸,
- 야누스 키나제(JAK) 저해제 sDMARD, 바람직하게는 JAK-1 및/또는 JAK-3 저해제 sDMARD, 가장 바람직하게는 토파시티닙(tofacitinib),
- 또는 본원에서 열거된 sDMARD 중 2, 3 또는 그 이상의 조합(예컨대 조합은 특히, 메토트렉세이트 + 설파살라진, 메토트렉세이트 + 레플루노마이드, 메토트렉세이트 + 하이드록시클로로퀸, 설파살라진 + 레플루노마이드, 메토트렉세이트 + 설파살라진 + 하이드록시클로로퀸, [설파살라진 및/또는 레플루노마이드] + 하이드록시클로로퀸, 또는 토파시티닙 + [메토트렉세이트, 설파살라진, 레플루노마이드, 및/또는 하이드록시클로로퀸]이거나 이를 포함할 수 있음)
을 포함하며,
상기 언급된 각각의 sDMARD 화합물은 독립적으로, 이의 유리 화합물 및/또는 약제학적으로 허용 가능한 염 형태일 수 있으며; 및/또는
- TNF-알파(종양 괴사 인자 알파) 저해제, 특히: 모노클로날 항체 TNF-알파 저해제, 예컨대 인플릭시맙(infliximab), 아달리무맙(adalimumab), 세르톨리주맙 페골(certolizumab pegol), 골리무맙(golimumab) 또는 이들 중 임의의 바이오시밀러(특히 USA-(예를 들어 FDA-) 및/또는 유럽-(예를 들어 EMEA-) 승인된 바이오시밀러)(특히 인플릭시맙의 바이오시밀러, 예컨대 CT-P13); 및/또는 순환 수용체 융합 단백질 TNF-알파 저해제, 예컨대 에타네르셉트(etanercept) 또는 이의 바이오시밀러(특히, 이의 USA-(예를 들어 FDA-) 및/또는 유럽-(예를 들어 EMEA-) 승인된 바이오시밀러); 및/또는
- T 세포 공동자극 저해제, 예컨대 아바타셉트(abatacept); 및/또는
- 인터루킨 1(IL-1) 저해제, 예컨대 아나킨라(anakinra); 및/또는
- B 세포에 대한 모노클로날 항체, 예컨대 리툭시맙(rituximab) 또는 이의 바이오시밀러(특히, 이의 USA-(예를 들어 FDA-) 및/또는 유럽-(예를 들어 EMEA-) 승인된 바이오시밀러); 및/또는
- 인터루킨-6(IL-6) 수용체 저해제 모노클로날 항체, 예컨대 토실리주맙(tocilizumab) 또는 이의 바이오시밀러(특히, 이의 USA-(예를 들어 FDA-) 및/또는 유럽-(예를 들어 EMEA-) 승인된 바이오시밀러); 및/또는
- 류마티스 관절염의 치료 및/또는 예방에 사용하기에 적합한 글루코코티코이드 약물, 예컨대 프레드니손, 프레드니솔론 또는 덱사메타손(특히, 예를 들어 상기 열거된 바와 같이 sDMARD와 조합된 글루코코티코이드 약물)
을 포함한다.
보다 더 바람직하게는, 본 발명의 모든 양태들에서, 약제학적으로 활성인 제제는
- 합성 질병 조정 항류마티스 약물(sDMARD)을 포함하며, 이러한 sDMARD는 바람직하게는,
- 엽산의 대사 및/또는 작용을 저해하는 sDMARD(바람직하게는 sDMARD는 포유류 다이하이드로폴레이트 리덕타제(DHFR)의 저해제, 가장 바람직하게는 메토트렉세이트, 또는 덜 바람직하게는 페메트렉세드임),
- 설파살라진, 또는 설파살라진의 활성 대사산물인 5-아미노살리실산(5-ASA, 메살라진),
- 피리미딘 합성 저해제인 sDMARD(특히 다이하이드로오로테이트 데하이드로게나제(DHODH) 저해제, 가장 바람직하게는 레플루노마이드 또는 이의 활성 대사산물인 대사산물 테리플루노마이드),
- 퀴놀론-부류의 항말라리아 약물 및 sDMARD, 가장 바람직하게는 하이드록시클로로퀸,
- 야누스 키나제(JAK) 저해제 sDMARD, 바람직하게는 JAK-1 및/또는 JAK-3 저해제 sDMARD, 가장 바람직하게는 토파시티닙,
- 또는 본원에서 열거된 sDMARD 중 2, 3 또는 그 이상의 조합(예컨대 조합은 특히, 메토트렉세이트 + 설파살라진, 메토트렉세이트 + 레플루노마이드, 메토트렉세이트 + 하이드록시클로로퀸, 설파살라진 + 레플루노마이드, 메토트렉세이트 + 설파살라진 + 하이드록시클로로퀸, [설파살라진 및/또는 레플루노마이드] + 하이드록시클로로퀸, 또는 토파시티닙 + [메토트렉세이트, 설파살라진, 레플루노마이드, 및/또는 하이드록시클로로퀸]이거나 이를 포함할 수 있음)
을 포함하며,
상기 언급된 각각의 sDMARD 화합물은 독립적으로, 이의 유리 화합물 및/또는 약제학적으로 허용 가능한 염 형태일 수 있다.
가장 바람직하게는, 본 발명의 모든 양태들에서, 약제학적으로 활성인 제제는
- 엽산의 대사 및/또는 작용을 저해하는 합성 질병 조정 항류마티스 약물(sDMARD)(바람직하게는 sDMARD는 포유류 다이하이드로폴레이트 리덕타제(DHFR)의 저해제, 가장 바람직하게는 메토트렉세이트, 또는 덜 바람직하게는 페메트렉세드임); 또는
- 메토트렉세이트 또는 페메트렉세드(바람직하게는 메토트렉세이트)와 하기 sDMARD: 설파살라진, 레플루노마이드, 하이드록시클로로퀸, 및/또는 토파시티닙 중 하나 이상의 조합
을 포함하며;
상기 언급된 각각의 sDMARD 화합물은 독립적으로, 이의 유리 화합물 및/또는 약제학적으로 허용 가능한 염 형태일 수 있다.
가장 바람직하게는, 본 발명의 모든 양태들에서, 류마티스 관절염에 특이적인 치료법은 특히 류마티스 관절염의 치료 및/또는 예방에 사용하기 위한, 메토트렉세이트 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염을 포함한다.
본 발명의 제2 양태는 본 발명의 제1 양태에 따른 방법에 의해 상기 제제가 필요한 것으로 확인된 개체(바람직하게는 인간 개체)에서 류마티스 관절염의 치료 및/또는 예방에 사용하기 위한 류마티스 관절염용 치료제인 제제(특히 약제학적으로 활성인 제제, 바람직하게는 메토트렉세이트 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염)를 제공한다. 본 발명의 제2 양태는 또한, 본 발명의 제1 양태에 따른 방법에 의해 상기 제제가 필요한 것으로 확인된 개체(바람직하게는 인간 개체)에서 류마티스 관절염의 치료 및/또는 예방에 사용하기 위한 약제(예를 들어 약제학적으로 활성인 제제를 포함하는 약제학적 조성물)의 제조에서, 류마티스 관절염용 치료제인 제제(특히 약제학적으로 활성인 제제, 바람직하게는 메토트렉세이트 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염)의 용도를 제공한다. 본 발명의 제2 양태는 또한, 개체(바람직하게는 인간 개체)에서 류마티스 관절염의 치료 및/또는 예방 방법을 제공하며, 상기 방법은 개체에게 제제(특히 약제학적으로 활성인 제제, 바람직하게는 메토트렉세이트 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염)를 투여하는 단계를 포함하고, 여기서, 이러한 개체는 본 발명의 제1 양태에 따른 방법에 의해 상기 제제가 필요한 것으로 확인되었다.
본 발명의 제3 양태는 류마티스 관절염용 치료제에 대한 개체의 반응성의 측면에서, 개체(바람직하게는 인간 개체)에서 비반응성 상태를 반응성 상태로 변화시킬 수 있는 물질의 확인 방법으로서, 상기 방법은 후보 제제가 비반응성 상태에 상응하는 염색체 상호작용으로부터 반응성 상태에 상응하는 염색체 상호작용으로 염색체 상호작용을 변화시킬 수 있는지 아닌지의 여부를 확인하는 단계를 포함한다.
본 발명의 제4 양태는 후보 물질(특히 약제학적으로 활성인 제제)이 류마티스 관절염의 치료 및/또는 예방에 적합한지 아닌지의 여부의 확인 방법으로서, 상기 방법은 약물(즉, 후보 물질, 특히 약제학적으로 활성인 제제)에 의해 유발된 후성유전적 염색체 상호작용에서 변화를 검출하는 단계를 포함하고, 여기서, 상기 상호작용은 약물의 작용 메커니즘 또는 약물의 약력학적 특성과 관련이 있다.
본 발명의 제5 양태는 본원에 정의된 바와 같이, 선택적으로 어레이에 결합된, 적어도 200개의 상이한 제2 핵산(예를 들어 DNA 및/또는 단리된 핵산)을 포함하는 핵산 라이브러리(예를 들어 DNA 및/또는 단리된 핵산)를 제공한다.
바람직하게는, 본 발명의 제5 양태에서, 라이브러리는 5개 이상, 7개 이상, 10개 이상, 15개 이상, 20개 이상, 25개 이상, 30개 이상, 40개 이상 또는 50개 이상의 핵산(예를 들어 DNA 및/또는 단리된 핵산)을 포함하며, 이들은 각각
(i) 표 7a 및/또는 표 8a 및/또는 표 9(바람직하게는 표 7a 및/또는 표 8a, 가장 바람직하게는 표 7a)에 열거된 핵산(예를 들어 DNA) 서열; 및
(ii) 표 7a 및/또는 표 8a 및/또는 표 9(바람직하게는 표 7a 및/또는 표 8a, 가장 바람직하게는 표 7a)에 열거된 하나 이상의 서열과 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99%의 동일성을 갖는 핵산(예를 들어 DNA) 서열
로 이루어진 군으로부터 선택되는 핵산 서열(예를 들어 DNA 서열)을 포함한다(예를 들어 이들은 각각 이들로 본질적으로 구성되며, 예를 들어 구성됨).
본 발명의 제6 양태는 5개 이상, 7개 이상, 10개 이상, 15개 이상, 20개 이상, 25개 이상, 30개 이상, 40개 이상, 50개 이상 또는 70개 이상의 핵산(예를 들어 DNA 및/또는 단리된 핵산)을 포함하는 핵산 라이브러리(예를 들어 DNA 및/또는 단리된 핵산)를 제공하며, 이들은 각각
(i) 표 7a 및/또는 표 8a 및/또는 표 9(바람직하게는 표 7a 및/또는 표 8a, 가장 바람직하게는 표 7a)에 열거된 핵산(예를 들어 DNA) 서열; 및
(ii) 표 7a 및/또는 표 8a 및/또는 표 9(바람직하게는 표 7a 및/또는 표 8a, 가장 바람직하게는 표 7a)에 열거된 하나 이상의 서열과 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99%의 동일성을 갖는 핵산(예를 들어 DNA) 서열
로 이루어진 군으로부터 선택되는 핵산 서열(예를 들어 DNA 서열)을 포함한다(예를 들어 이들은 각각 이들로 본질적으로 구성되며, 예를 들어 구성됨).
본 발명의 제7 양태는
(i) 표 7a 및/또는 표 8a 및/또는 표 9(바람직하게는 표 7a 및/또는 표 8, 가장 바람직하게는 표 7a)에 열거된 핵산(예를 들어 DNA) 서열; 및
(ii) 표 7a 및/또는 표 8a 및/또는 표 9(바람직하게는 표 7a 및/또는 표 8a, 가장 바람직하게는 표 7a)에 열거된 하나 이상의 서열과 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99%의 동일성을 갖는 핵산(예를 들어 DNA) 서열
로 이루어진 군으로부터 선택되는 핵산 서열(예를 들어 DNA 서열)을 포함하는(예를 들어 본질적으로 구성되는, 예를 들어 구성되는) 핵산(예를 들어 DNA 및/또는 단리된 핵산)을 제공한다.
본 발명은 또한, 표 7a 및/또는 표 8a 및/또는 표 9(바람직하게는 표 7a 및/또는 표 8a, 가장 바람직하게는 표 7a)에 열거된 핵산(예를 들어 DNA) 서열로부터 선택되는 핵산 서열(예를 들어 DNA 서열)을 포함하는(예를 들어 본질적으로 구성되는, 예를 들어 구성되는) 핵산(예를 들어 DNA 및/또는 단리된 핵산)을 제공한다.
명확히 하기 위해, 서열 동일성은 2개의 서열들 사이에서 정확하게 일치하는 뉴클레오타이드 부호의 양이고, 이들 값은 전형적으로 BLAST 및/또는 BLAT와 같은 보편적인 알고리즘에 의해 추정된다. 이하, 더 많은 정보에 대해서는 "호모로그" 하의 내용을 참조한다.
도 1은 MTX 반응자(R)를 비-반응자(NR)로부터 구별하는 염색체 구조 시그너처 EpiSwitchTM 마커에 관한 파이 차트(pie-chart) 및 그래프를 포함하는 도면이다. 반응자(R) 및 비-반응자(NR) RA 환자의 발견 코호트는 DAS28(28개 관절의 질병 활성 점수) EULAR(유럽 류마티스 학회) 반응 기준(방법 참조)을 기반으로 선택되었다. (a) 파이 차트는 기준선 및 6개월째에 R 및 NR 환자 둘 다에 대한 CDAI 점수의 임상적 해석을 보여준다. (b) 기준선 및 6개월째에 R 및 NR 환자의 CDAI 점수이다. (c) 진단 시 R 및 NR, 및 건강한 대조군(HC)으로부터 채혈된 말초 혈액 단핵 세포의 EpiSwitchTM 어레이 분석은 922개의 통계학적으로 유의한 계층화 마커 후보를 확인시켜 주었다. 추가의 분석은, 420개가 NR에 특이적이었으며, 210개가 R에 특이적이었고, 159개는 HC에 특이적이었음을 보여주었다. 파이 차트는, 스크리닝된 13,322개의 조건부 염색체 구조에 관한 비율을 보여준다. 모든 마커들은 조정된 p<0.2를 보여주었다. (d) 완전한 관련성 집합체(linkage agglomeration)를 이용한 맨해튼 거리를 사용한 계층적 클러스터링이 히트맵(heatmap)에 의해 나타나 있다. 3개의 그룹(R, NR 및 HC)에 걸친 바이너리 패터링(binary pattering)을 사용한 마커 선별은 처음에, 922개의 EpiSwitch™ 마커를 65개까지 감소시켰으며, 그런 다음 상부 30개 마커까지 감소시켰다.
도 2는 염색체 구조 시그너처 EpiSwitchTM 마커의 개량 및 타당성에 관한 파이 차트 및 그래프를 포함하는 도면이다. 반응자(R) 및 비-반응자(NR) RA 환자의 타당성 코호트는 DAS28(28개 관절의 질병 활성 점수) EULAR(유럽 류마티스 학회) 반응 기준(방법 참조)을 기반으로 선택되었다. (a) 파이 차트는 기준선 및 6개월째에 R 및 NR 환자 둘 다에 대한 CDAI 점수의 임상적 해석을 보여준다. (b) 기준선 및 6개월째에 R 및 NR 환자의 CDAI 점수이다. ****던즈 다중 비교 포스트(Dunn's multiple comparison post) 시험과 함께 크러스칼 왈리스(Kruskal-Wallis) 시험에 의해 P<0.0001. (c) 분류화 5개 EpiSwitchTM 마커들의 상관관계 플롯이다. 적색 상자는 NR을 정의하는 마커를 가리키는 한편, 오렌지색 상자는 R을 정의하는 마커를 가리켰다. (d) 분류화 5개 EpiSwitchTM 마커들에 대한 바이너리 점수를 기반으로 한, 60명의 환자 코호트에 대한 주성분 분석(PCA; Principle Component Analysis)이다.
도 3은 메토트렉세이트(MTX) 치료에 대한 반응에 대한 예후 계층화 및 모델 타당성에 관한 그래프를 포함하는 도면이다. (a) 5개의 CCS 마커 로지스틱 회귀 분류자(classifier)를 사용하여 데이터의 150개 무작위화로부터 5개의 선택된 수신 조작 특징(ROC; Receiver Operating Characteristics) 곡선의 대표적인 예이다. (b) MTX 비-반응자로부터 MTX 반응자를 구별하기 위해 선택된 EpiSwitch™ CCS 마커를 사용한, 반응자(R) 및 비-반응자(NR) RA 환자 vs 건강한 대조군(HC)에 대한 인자 분석이다.
도 4는 3C 추출 공정의 도식도이다. 3C는 염색질 구조 포착, 또는 염색체 구조 포착을 의미한다.
도 5는 DMARDS 네이브 ERA 환자에 대한 후성유전자 계층화 바이오마커 시그너처의 발견 및 타당성에 대한 설계를 예시하는 도식이며, 상기 환자는 6개월간의 MTX 치료 내에 반응자(N) 또는 비-반응자(NR)로서 확인되었다. 후성유전자 계층화는 EpiSwitchTM 어레이 및 PCR(중합효소 연쇄 반응)에 의해 스크리닝되고 모니터링된 조건부 염색체 구조를 기반으로 하였다. 확인된 바이오마커의 질병 특이적 후성유전자는 건강한 대조군(HC)에 대한 계층화에 의해 확인되었다. 타당성은 60명의 RA 환자(30명의 반응자 및 30명의 비-반응자) 및 30명의 HC 상에서 수행되었다.
본 발명은 몇몇 상이한 양태들:
- 피험자에서 류마티스 관절염에 특이적인 치료법에 대한 반응성의 확인 방법;
- 동반 진단 방법;
- 개체의 치료 및/또는 예방(구체적으로는, 개체, 특히 인간 개체의 류마티스 관절염의 치료 및/또는 예방)에 사용하기 위한 치료제로서, 여기서, 상기 개체는 특히 본 발명의 반응성 확인 방법 및/또는 동반 진단 방법에 의해 치료제가 필요한 것으로 확인되었음;
- 류마티스 관절염 치료에 대한 (특히 개체, 예를 들어 인간 개체의) 반응성을 변화시킬 수 있는 제제, 특히 치료제의 (확인을 위한) 스크리닝 방법;
- 약물에 의해 유발된 후성유전적 염색체 상호작용의 변화를 검출하는 단계를 포함하는, 약물(예를 들어 치료제)의 효과의 확인 방법
을 가진다.
후성유전자 상호작용
본원에 사용된 바와 같이, 용어 '후성유전자' 상호작용은 전형적으로, 염색체 상의 유전자좌의 원거리 영역들 사이에서의 상호작용을 지칭하며, 상기 상호작용은 염색체의 영역의 상태에 따라 동적이고 변경적이며, 형성하거나 절단된다.
특히 본 발명의 방법에서 염색체 상호작용은, 우선 염색체 상호작용 부분인 염색체의 2개 영역들 모두로부터의 서열(들)을 포함하는 결찰된 핵산을 발생시킴으로써 검출된다. 이러한 방법에서, 이러한 영역들은 임의의 적합한 수단에 의해 가교될 수 있다. 바람직한 실시형태에서, 상호작용은 포름알데하이드를 사용하여 가교되지만, 임의의 알데하이드, 또는 D-비오티노일-e-아미노카프로산-N-하이드록시숙신이미드 에스테르 또는 디곡시게닌-3-O-메틸카르보닐-e-아미노카프로산-N-하이드록시숙신이미드 에스테르에 의해 가교될 수도 있다. 파라-포름알데하이드는 4 옹스트롬 거리의 DNA 사슬들을 가교시킬 수 있다.
염색체 상호작용은, 예를 들어 염색체가 생리학적 조건의 변화에 반응하여 전사되거나 억제되는 경우, 이러한 염색체의 영역의 상태를 반영할 수 있다. 본원에 정의된 바와 같은 서브그룹에 특이적인 염색체 상호작용은 안정한 것으로 발견되었으며, 따라서 2개의 서브그룹들 사이의 차이를 측정하는 신뢰할만한 수단을 제공한다.
또한, 질환에 특이적인 염색체 상호작용은 정상적으로는, 예를 들어 다른 후성유전자 마커, 예컨대 메틸화 또는 히스톤 단백질의 결합의 변화와 비교하여, 질병 진행 중 초기에 발생할 것이다. 따라서, 본 발명의 동반 진단 방법은 질환의 초기 상태를 검출할 수 있다. 이는 조기 치료를 가능하게 하여, 그 결과 더욱 효과적일 수 있다. 본 발명의 또 다른 이점은, 관련 염색체 상호작용의 확인에 어떤 유전자좌가 관련이 있는지에 대한 사전 지식이 필요없다는 점이다. 더욱이, 동일한 서브그룹 내의 개체들 사이에서 관련 염색체 상호작용에서 타당성은 거의 존재하지 않는다. 염색체 상호작용의 검출은 1개 유전자 당 50개까지의 상이한 가능성 있는 상호작용을 이용하여 고도로 유익하고, 따라서 본 발명의 방법은 500,000개의 상이한 상호작용에 대한 정보를 얻을 수 있다.
후성유전자 상호작용의 위치 및 원인
후성유전적 염색체 상호작용은 관련 유전자 또는 기재되지 않은 유전자를 코딩하는 것으로 나타난 염색체의 영역들을 중복하고 포함할 수 있으나, 동등하게는 유전자간(intergenic) 영역 내에 존재할 수 있다. 나아가, 본 발명자들이, 모든 영역들에서 후성유전자 상호작용이 염색체 유전자좌의 상태를 확인하는 데 동등하게 중요함을 발견하였음을 주지해야 한다. 이들 상호작용은 본질적으로, 유전자좌에 위치한 특정 유전자좌의 코딩 영역에 존재하지 않고, 유전자간 영역에 존재할 수 있다.
본 발명에서 검출되는 염색체 상호작용은 기저(underlying) DNA 서열에의 변화, 환경 인자, DNA 메틸화, 비-코딩 안티센스 RNA 전사체, 비돌연변이원성 발암원, 히스톤 변형, 염색질 리모델링 및 특정한 국소 DNA 상호작용에 의해 유발될 수 있었다. 염색체 상호작용을 초래하는 변화는 기저 핵산 서열에의 변화에 의해 유발될 수 있으며, 이러한 기저 핵산 서열은 그 자체가 유전자 생성물 또는 유전자 발현의 방식에 직접 영향을 미치지 않는다. 이러한 변화는 예를 들어, 유전자의 내부 및/또는 외부에서의 SNP, 유전자 융합 및/또는 유전자간 DNA, 마이크로RNA 및 비-코딩 RNA의 결실일 수 있다. 예를 들어, 대략 20%의 SNP가 비-코딩 영역에 존재하는 것으로 알려져 있으며, 따라서 기재된 바와 같은 방법은 또한, 비-코딩 상황에 유익하다. 일 실시형태에서, 함께 회합하여 상호작용을 형성하는 염색체의 영역들은 5 kb, 3 kb, 1 kb, 500개 염기쌍 또는 200개 염기쌍만큼 떨어져 있다.
동반 진단 방법에서 검출되는 염색체 상호작용은 바람직하게는, 본원의 표에 언급된 유전자들 중 임의의 유전자 내에 있다. 그러나, 이러한 염색체 상호작용은 유전자의 업스트림 또는 다운스트림, 유전자 또는 코딩 서열로부터 최대 50,000, 30,000, 20,000, 10,000 또는 5000개 염기만큼 업스트림 또는 다운스트림에 존재할 수 있다.
검출되는 염색체 상호작용은 유전자(코딩 서열 포함)와 이의 조절 영역, 예컨대 프로모터 사이에 발생하는 상호작용일 수 있거나 아닐 수 있다. 검출되는 염색체 상호작용은 유전되는 상호작용, 예를 들어 유전자 영역의 유전된 각인된 특징일 수 있거나 아닐 수 있다. 개체는 남성 또는 여성일 수 있다. 개체는 30세 이상일 수 있다. 개체는 29세 이하일 수 있다.
임상적 상황의 유형
RA(류마티스 관절염)를 치료하기 위한 메토트렉세이트(MTX)의 사용의 구체적인 사례는 일반적인 원칙을 예시한다. 현재로서는, 환자가 우선 MTX을 받을 때, 환자가 이 약물에 반응할 것인지 연역적으로 확인하기 위해 임상의가 사용할 수 있는 시험이 존재하지 않는다. 상당한 수(약 30%)의 환자가 MTX에 반응하지 않기 때문에, 환자가 반응자 또는 비-반응자인지 여부를 예측할 수 있는 것은 RA를 성공적으로 치료할 뿐만 아니라 시간 및 돈을 절약하는 기회를 증가시킬 것이다.
본 발명은 즉, 특정한 염색체 구조 시그너처 및/또는 해당 특정한 시그너처의 변화를 인지함으로써, 류마티스 관절염과 관련된 특이적인 표현형에 대한 바이오마커를 기반으로 한 계층화를 허용한다.
본 발명의 방법은 류마티스 관절염의 존재를 진단하는 데 사용될 수 있거나 사용되지 않을 수 있다. 본 발명의 방법은, 질병의 메커니즘이 미공지되어 있거나, 불분명하거나 복잡한 유전자좌의 유형화에 사용될 수 있다. 염색체 상호작용의 검출은 상이한 수준의 조절에서 하기 변화의 효율적인 방식을 제공하며, 이들 중 일부는 복잡하다. 예를 들어, 일부 경우, 약 37,000개의 비-코딩 RNA들이 단일 자극에 의해 활성화될 수 있다.
서브그룹 및 개인화된 치료
본원에 사용된 바와 같이, "서브그룹"은 바람직하게는 집단(population) 서브그룹(집단의 서브그룹), 더욱 바람직하게는 특정 동물, 예컨대 특정 포유류(예를 들어 인간, 비-인간 영장류, 또는 설치류, 예를 들어 마우스 또는 래트) 또는 특정 선충(nematode worm)(예를 들어 씨. 엘레간스(C. elegans))의 집단의 서브그룹을 지칭한다. 가장 바람직하게는, "서브그룹"은 인간 집단 내 서브그룹을 지칭한다.
관심 특정 집단, 예를 들어 인간 집단은, 인간 집단 전체, 인간 RA 집단(즉 RA를 앓고 있는 인간), 건강한 인간 집단(건강한 대조군), RA를 앓고 있지 않다는 의미에서 건강한 인간 집단, 특정 약물/치료법에 반응자인 인간(건강한 및/또는 RA) 집단, 또는 특정 약물/치료법에 비-반응자인 인간(건강한 및/또는 RA) 집단을 포함한다.
본 발명은 집단, 바람직하게는 인간 집단에서 특정 서브그룹을 검출하고 치료하는 것에 관한 것이다. 이러한 서브그룹 내에서, 본원에 고찰된 특징들(예컨대 치료 및/또는 예방에 대한 반응성; 특히 특이적인, 예를 들어 약제학적 치료 및/또는 예방, 예를 들어 치료적으로 활성인 물질/치료제, 예를 들어 약제학적 치료제에 대한 반응성)은 존재하거나 부재할 것이다. 염색체 상에서 후성유전자 상호작용 차이는 일반적으로 말해서, 게놈 수준에서 존재하는 구조적 차이이다. 본 발명자들은, 이들이 주어진 집단 내 하위세트들(예를 들어 2개, 또는 2개 이상의 하위세트들) 사이에서 상이함을 발견하였다. 이들 차이의 확인은 의사들이 그들의 환자를 본 방법에 기재된 바와 같은 집단의 하나의 하위세트의 일부로서 범주화할 수 있게 할 것이다. 따라서, 본 발명자들은 의사들에게 이들의 후성유전적 염색체 상호작용을 기반으로 환자에 대한 의약을 개인화하는 방법을 제공하며, 대안적인 보다 효과적인 치료 및/또는 예방 섭생을 제공한다.
또 다른 실시형태에서, 피험자가 집단(예를 들어 인간 집단, 예를 들어 인간 RA 집단) 중 하나의 서브그룹에 속하고 다른 서브그룹에는 속하지 않는 것으로 정의되는 정도를 확인하기 위한 역치 수준이 적용된다. 서브그룹이 특정 질병(예를 들어 또는 즉 RA)의 치료를 위한 치료법의 반응자 대 비-반응자를 포함하는 바람직한 일 실시형태에서, 상기 역치는 DAS28 점수(28개 관절의 질병 활성 점수)의 변화에 의해 측정될 수 있다. 일 실시형태에서, 1.2 단위보다 높은 점수는 피험자가 반응자 서브그룹에 속함을 가리키는 한편, 1.2 단위보다 낮은 점수는 피험자가 비-반응자로서 정의됨을 가리킨다.
전형적으로, 서브그룹은 일반적인 집단의 적어도 10%, 적어도 30%, 적어도 50%, 적어도 70% 또는 적어도 80%일 것이다.
결찰된 핵산의 생성
본 발명의 소정의 실시형태는 결찰된 핵산, 특히 결찰된 DNA를 이용한다. 이들은 염색체 상호작용에서 함께 회합되는 2개의 영역들 모두로부터의 서열을 포함하고, 따라서 상호작용에 대한 정보를 제공한다. 본원에 기재된 EpiSwitchTM 방법은 염색체 상호작용을 검출하기 위해 이러한 결찰된 핵산의 생성을 사용한다.
이러한 하나의 방법, 특히 염색체 상호작용을 검출하는 하나의 특정한 방법 및/또는 후성유전적 염색체 상호작용을 확인하는 하나의 특정한 방법 및/또는 결찰된 핵산(예를 들어 DNA)을 생성시키는 하나의 특정한 방법은
(i) 염색체 유전자좌에 존재하는 상기 후성유전적 염색체 상호작용을 시험관내 가교시키는 단계;
(ii) 가교된 DNA를 상기 염색체 유전자좌로부터 선택적으로 단리시키는 단계;
(iii) 상기 가교된 DNA를, 이를 적어도 1회 절단하는 효소(특히 상기 염색체 유전자좌 내에서 적어도 1회 절단하는 효소)를 이용하여 제한효소 분해시키는 단계;
(iv) (특히 DNA 루프를 형성하기 위해) 상기 가교 절단된 DNA 말단들을 결찰하는 단계; 및
(v) 상기 결찰된 DNA 및/또는 상기 DNA 루프의 존재를, 특히 PCR(중합효소 연쇄 반응)과 같은 기술을 사용하여 확인하여, 특이적인 염색체 상호작용의 존재를 확인하는 단계
를 포함한다.
염색체 상호작용 및/또는 후성유전적 변화를 검출하며, 확인하고/거나 모니터링하는, 특히 상기 언급된 가교, 제한효소 분해, 결찰 및 확인 단계를 포함하는 하나의 특히 바람직한 방법은 WO 2009/147386 A1(Oxford Biodynamics Ltd)에 개시되어 있으며, 이의 전체 내용(특히 이의 청구항 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 또는 21)은 그 전체가 원용에 의해 본 명세서에 포함되어 있다. 결찰된 생성물(들) 및/또는 결찰된 핵산(들)을 수반하는 본 발명의 방법에 사용될 수 있는 WO 2009/147386 A1의 청구항 1은 적어도 하나의 염색체 유전자좌에서 조건부 긴 범위의 염색체 상호작용의 변화를 모니터링하는 단계를 포함하는 후성유전적 변화의 모니터링 방법을 개시하고 있으며, 여기서, 긴 범위의 상호작용의 스펙트럼은 특이적인 생리학적 조건과 연관이 있고, 상기 방법은
(i) 적어도 하나의 염색체 유전자좌에 존재하는 상기 긴 범위의 염색체 상호작용을 시험관내 가교시키는 단계;
(ii) 가교된 DNA를 상기 염색체 유전자좌로부터 단리시키는 단계;
(iii) 상기 가교된 DNA를, 적어도 하나의 염색체 유전자좌 내에서 적어도 1회 절단하는 효소를 이용하여 제한효소 분해시키는 단계;
(iv) 상기 가교 절단된 DNA 말단들을 결찰하여, DNA 루프를 형성하는 단계; 및
(v) 상기 DNA 루프의 존재를 확인하는 단계
를 포함하며,
여기서, DNA 루프의 존재는 특이적인 긴 범위의 염색체 상호작용의 존재를 가리킨다.
PCR(중합효소 연쇄 반응)은 결찰된 핵산의 검출 또는 확인에 사용될 수 있으며, 예를 들어 생성된 PCR 생성물의 크기는 존재하는 특이적인 염색체 상호작용을 가리킬 수 있고, 따라서, 유전자좌의 상태를 확인하는 데 사용될 수 있다. 당업자는, 관심 염색체 유전자좌 내에서 DNA를 절단하는 데 사용될 수 있는 수많은 제한효소를 알 것이다. 사용되는 특정 효소는 연구되는 유전자좌 및 이러한 유전자좌 안에 위치한 DNA의 서열에 따라 다를 것임이 명백할 것이다. 본 발명에 기재된 바와 같이 DNA를 절단하는 데 사용될 수 있는 제한효소의 비제한적인 예로는, TakaRa LA Taq 폴리머라제가 있다.
EpiSwitch TM 기술과 같은 실시형태
EpiSwitchTM 기술은 표현형에 특이적인 후성유전적 염색체 구조 시그너처의 검출에서 마이크로어레이 EpiSwitchTM 마커 데이터의 사용에 관한 것이다. 본 발명자들은 본원에서, EpiSwitchTM 어레이 플랫폼이, 특정한 불리한 표현형 서브그룹 대 건강한 대조군에 특이적인 잠재적인 바이오마커의 염색체 시그너처 풀의 발견에 어떻게 사용되어 왔는지 기재하고 있다. 본 발명자들은 또한, 어레이 상에서 시험된 코호트 유래의 서브그룹들 사이에서 특이적인 몇몇 마커들의 예를 이용하여, 마이크로어레이 유래의 염색체 구조 시그너처의 PCR 플랫폼으로의 타당한 사용 및 번역의 예를 제공한다.
결찰된 핵산을 (관련 염색체 상호작용을 확인하기 위해, 및 동반 진단 방법에서) 본원에 기재된 방식으로 이용하는 실시형태들, 예컨대 EpiSwitchTM는 몇몇 이점들을 갖는다. 이들은 확률적 노이즈(stochastic noise)를 낮은 수준으로 가지며, 예를 들어 본 발명의 제1 핵산 세트 유래의 핵산 서열이 제2 핵산 세트와 하이브리드화하거나 하이브리드화에 실패하기 때문이다. 이는, 복잡한 메커니즘을 후성유전자 수준에서 측정하는 상대적으로 간단한 방식을 허용하는 바이너리 결과를 제공한다. EpiSwitchTM 기술은 또한, 신속한 처리 시간 및 낮은 비용을 가진다. 일 실시형태에서, 처리 시간은 3시간 내지 6시간이다.
시료 및 시료 처리
시료는 개체 유래의 DNA를 함유할 것이다. 시료는 통상 세포를 함유할 것이다. 일 실시형태에서, 시료는 최소로 침습적인 수단에 의해 수득되고, 예를 들어 혈액일 수 있다. DNA는 추출되고 표준 제한효소를 이용하여 절단될 수 있다. 이는, 어떤 염색체 구조가 EpiSwitchTM 플랫폼을 이용하여 보유되고 검출될 것인지 미리 확인시켜줄 수 있다. 시료가 환자로부터 이전에 수득된 혈액 시료인 일 실시형태에서, 기재된 방법은, 절차가 최소 침습적이기 때문에 유리하다. 수평적 이동(horizontal transfer)을 포함한 조직과 혈액 사이의 염색체 상호작용의 동기화(synchronisation)로 인해, 혈액 시료는 조직, 예컨대 질병과 관련된 조직 내에서 염색체 상호작용을 검출하는 데 사용될 수 있다. 소정의 질환, 예컨대 암의 경우, 돌연변이로 인한 유전적 노이즈는 관련 조직에서 염색체 상호작용 '신호'에 영향을 미칠 수 있고, 따라서 혈액의 사용이 유리하다.
본 발명의 핵산의 특성
본원의 개시내용은 제1 핵산 및 제2 핵산을 언급하고 있다. 또한, 핵산은 동반 진단 방법, 및 (예를 들어 시료로부터 생성된 결찰된 핵산에 결합함으로써) 염색체 상호작용의 존재 또는 부재를 검출하기 위한 다른 실시형태에 사용된다. 본 발명의 핵산은 전형적으로, 각각의 부분이, 염색체 상호작용에서 함께 회합되는 염색체의 2개의 영역들 중 하나로부터 유래된 서열을 포함하는 2개의 부분들을 포함한다. 전형적으로, 각각의 부분은 길이가 적어도 8, 10, 15, 20, 30 또는 40개 뉴클레오타이드이다. 바람직한 핵산은 표에 언급된 유전자들 중 임의의 유전자로부터 유래된 서열을 포함하고, 특히 핵산은 해당 표와 관련된 조건과 관련된 실시형태에 사용된다. 바람직한 핵산은 특이적인 조건에 대한 표에서 언급된 특이적인 프로브 서열, 또는 이러한 서열의 단편 또는 호모로그를 포함한다. 바람직하게는, 핵산은 DNA이다. 특이적인 서열이 제공되는 곳에서, 본 발명은 특정 실시형태에서 필요한 바와 같이 상보성을 사용할 수 있는 것으로 이해된다.
제2 핵산 세트 - '인덱스(Index)' 서열
제2 핵산 세트 서열은 인덱스의 기능을 가지며, 필수적으로 서브그룹 특이적인 서열을 확인하기에 적합한 핵산 서열 세트이다. 제2 핵산 세트 서열은 '백그라운드' 염색체 상호작용을 나타내고, 일부 방식으로 선택되거나 선택되지 않을 것이다. 상기 서열들은 모든 가능한 염색체 상호작용의 하위세트이다.
제2 핵산 세트는 임의의 적합한 방법에 의해 유래될 수 있다. 이러한 세트는 계산에 의해(computationally) 유래될 수 있거나, 이러한 세트는 개체에서 염색체 상호작용을 기반으로 할 수 있다. 상기 세트는 전형적으로, 제1 핵산 세트보다 더 큰 집단 그룹을 나타낸다. 일 실시형태에서, 제2 핵산 세트는 특이적인 유전자 세트에서 모든 가능한 후성유전적 염색체 상호작용들을 나타낸다. 또 다른 실시형태에서, 제2 핵산 세트는 본원에 기재된 집단에 존재하는 큰 비율의 모든 가능한 후성유전적 염색체 상호작용들을 나타낸다. 일 실시형태에서, 제2 핵산 세트는 적어도 20, 50, 100 또는 500개의 유전자에서 적어도 50% 또는 적어도 80%의 후성유전적 염색체 상호작용을 나타낸다.
제2 핵산 세트는 전형적으로, 집단에서 질환/표현형을 변형하거나, 조절하거나 임의의 방식으로 매개하는 적어도 100개의 가능한 후성유전적 염색체 상호작용을 나타낸다. 제2 핵산 세트는, 예를 들어 임의의 질환, 질병에의 소인 또는 질병 표현형과 연관된 사이토카인, 키나제 또는 조절자를 코딩하는 핵산 서열을 포함하는, 종에서 질환에 영향을 미치는 염색체 상호작용을 나타낼 수 있다. 제2 핵산 세트는 동반 진단 방법과 관련이 있고 관련이 없는 후성유전자 상호작용을 나타내는 서열을 포함한다.
일 실시형태에서, 제2 핵산 세트는 집단 내의 자연 발생 서열로부터 적어도 부분적으로 유래하고, 전형적으로 인 실리코(in silico) 방법에 의해 수득된다. 상기 핵산은 자연 발생 핵산에 존재하는 핵산의 상응하는 부분과 비교하여 단일 또는 다중 돌연변이를 추가로 포함할 수 있다. 돌연변이로는, 하나 이상의 뉴클레오타이드 염기쌍의 결실, 치환 및/또는 첨가가 있다. 일 실시형태에서, 제2 핵산 세트는 자연 발생 종에 존재하는 핵산의 상응하는 부분과 적어도 70%의 서열 동일성을 갖는 호모로그 및/또는 오르토로그를 나타내는 서열을 포함할 수 있다. 또 다른 실시형태에서, 자연 발생 종에 존재하는 핵산의 상응하는 부분과 적어도 80%의 서열 동일성 또는 적어도 90%의 서열 동일성이 제공된다.
제2 핵산 세트의 특성
일 실시형태에서, 제2 핵산 세트에 적어도 100개의 상이한 핵산 서열, 바람직하게는 적어도 1000, 2000 또는 5000개의 상이한 핵산 서열, 100,000, 1,000,000 또는 10,000,000개까지의 상이한 핵산 서열이 존재한다. 전형적인 수는 100개 내지 1,000,000개, 예컨대 1,000개 내지 100,000개의 상이한 핵산 서열일 것이다. 이들 중 모두 또는 적어도 90% 또는 적어도 50%는 상이한 염색체 상호작용에 상응할 것이다.
일 실시형태에서, 제2 핵산 세트는 적어도 20개의 상이한 유전자좌 또는 유전자, 바람직하게는 적어도 40개의 상이한 유전자좌 또는 유전자, 보다 바람직하게는 적어도 100개, 적어도 500개, 적어도 1000개 또는 적어도 5,000개의 상이한 유전자좌 또는 유전자, 예컨대 100개 내지 10,000개의 상이한 유전자좌 또는 유전자에서 염색체 상호작용을 나타낸다.
제2 핵산 세트의 길이는, 이러한 제2 핵산 세트가 왓슨 크릭 염기쌍에 따라 제1 핵산 세트에 특이적으로 하이브리드화하여, 서브그룹에 특이적인 염색체 상호작용의 확인을 가능하게 하는 데 적합하다. 전형적으로, 제2 핵산 세트는 염색체 상호작용에서 함께 회합되는 양 염색체 영역들에 대해 서열이 상응하는 2개의 부분들을 포함할 것이다. 제2 핵산 세트는 전형적으로, 길이가 적어도 10개, 바람직하게는 20개, 보다 바람직하게는 30개 염기(뉴클레오타이드)인 핵산 서열을 포함한다. 또 다른 실시형태에서, 핵산 서열은 길이가 최대 500개, 바람직하게는 최대 100개, 보다 바람직하게는 최대 50개 염기쌍일 수 있다. 바람직한 실시형태에서, 제2 핵산 세트는 17 내지 25개 염기쌍의 핵산 서열을 포함한다. 일 실시형태에서, 적어도 100, 80% 또는 50%의 제2 핵산 세트 서열이 상기 기재된 바와 같은 길이를 갖는다. 바람직하게는, 상이한 핵산은 임의의 중복 서열을 갖지 않으며, 예를 들어 적어도 100%, 90%, 80% 또는 50%의 핵산이 적어도 5개의 연속 뉴클레오타이드에 걸쳐 동일한 서열을 갖지 않는다.
제2 핵산 세트가 '인덱스'로서 작용하는 점을 고려하면, 동일한 제2 핵산 세트가, 상이한 특징에 대한 서브그룹을 나타내는 상이한 제1 핵산 세트와 함께 사용될 수 있으며, 즉, 제2 핵산 세트는, 상이한 질병 특징들과 관련된 염색체 상호작용을 확인하는 데 사용될 수 있는 핵산의 '범용' 컬렉션을 나타낼 수 있다.
제1 핵산 세트
제1 핵산 세트는 통상, 동반 진단법과 관련된 특징, 예컨대 본원에서 언급된 임의의 이러한 특징의 존재 또는 부재에 의해 한정되는 2개 이상의 개별 서브그룹들에 존재하는 것으로 공지된 개체로부터 유래된다. 제1 핵산은 본원에 언급된 제2 핵산의 특징 및 특성 중 임의의 것을 가질 수 있다. 제1 핵산 세트는 통상, 본원에 기재된 바와 같은 치료 및 가공, 특히 EpiSwitchTM 가교 및 절단 단계를 받은 개체의 시료로부터 유래된다. 전형적으로, 제1 핵산 세트는 개체로부터 취한 시료에 존재하는 염색체 상호작용 중 모두 또는 적어도 80% 또는 50%를 나타낸다.
전형적으로, 제1 핵산 세트는, 제2 핵산 세트로 표시된 염색체 상호작용과 비교하여 제2 핵산 세트로 표시된 유전자좌 또는 유전자에 걸친 염색체 상호작용의 더 작은 집단을 나타내며, 즉, 제2 핵산 세트는 한정된 유전자좌 또는 유전자 세트에서 상호작용의 백그라운드 또는 인덱스 세트를 나타내고 있다.
핵산 라이브러리
본 발명은 제2 핵산 세트로부터 적어도 200개, 500개, 1000개, 5000개 또는 적어도 10,000개의 상이한 핵산을 포함하는 핵산 라이브러리를 제공한다. 본 발명은, 전형적으로 적어도 200개의 상이한 핵산들을 포함하는 특정 핵산 라이브러리를 제공한다. 핵산 라이브러리는 본원에 언급된 제2 핵산 세트의 특징 또는 특성 중 임의의 것을 가질 수 있다. 라이브러리는 어레이에 결합된 핵산 형태로 존재할 수 있다.
하이브리드화
본 발명은 제1 핵산 세트 및 제2 핵산 세트 유래의 전체적으로 또는 부분적으로 상보적인 핵산 서열들을 하이브리드화시킬 수 있는 수단을 필요로 한다. 일 실시형태에서, 모든 제1 핵산 세트는 모든 제2 핵산 세트와 단일 검정법, 즉 단일 하이브리드화 단계에서 접촉된다. 그러나, 임의의 적합한 검정법이 사용될 수 있다.
표지된 핵산 및 하이브리드화 패턴
본원에 언급된 핵산은 바람직하게는, 성공적인 하이브리드화의 검출을 돕는 독립적인 표지, 예컨대 형광단(형광 분자) 또는 방사성 표지를 사용하여 표지될 수 있다. 소정의 표지들은 UV 광 하에 검출될 수 있다.
예를 들어 본원에 기재된 어레이 상에서의 하이브리드화 패턴은 2개의 서브그룹들 사이에서 후성유전적 염색체 상호작용의 차이를 나타내고, 따라서, 후성유전적 염색체 상호작용을 비교하고, 어떤 후성유전적 염색체 상호작용이 본 발명의 집단 내 서브그룹에 특이적인지 확인하는 방법을 제공한다.
용어 '하이브리드화 패턴'은 광범위하게는, 제1 핵산 세트와 제2 핵산 세트 사이에서의 하이브리드화의 존재 및 부재를 망라하며, 즉, 제1 세트 유래의 어떤 특이적인 핵산이 제2 세트 유래의 어떤 특이적인 핵산에 하이브리드화하는지를 망라하고, 따라서, 하이브리드화 패턴은 임의의 특정 검정법 또는 기술로 한정되지 않거나, '패턴'이 검출될 수 있는 표면 또는 어레이를 가질 필요성으로 한정되지 않는다.
동반 진단 방법
본 발명은 염색체 상호작용에 의해 제공된 정보를 기반으로 하는 동반 진단 방법을 제공한다. 개체가 동반 진단법과 관련된 특정한 특징을 갖고 있는지를 확인하는 2개의 별개의 동반 진단 방법들이 제공된다. 일 방법은 유전자좌를 임의의 적합한 방식으로 유형화(typing)하는 것을 기반으로 하고, 나머지 방법은 염색체 상호작용의 존재 또는 부재를 검출하는 것을 기반으로 한다. 특징은 질환과 관련된 것으로 본원에서 언급된 특징들 중 임의의 하나일 수 있다. 동반 진단 방법은 하나 초과의 시점에서, 예를 들어 개체의 모니터링이 필요할 때 수행될 수 있다.
유전자좌의 유형화를 기반으로 한 동반 진단 방법
서브그룹에 특이적인 염색체 상호작용을 확인한 본 발명의 방법은, 동반 진단 시험을 기반으로 유형화될 수 있는 유전자일 수 있는 유전자좌를 확인하는 데 사용될 수 있다. 많은 상이한 유전자-관련 효과들이 동일한 염색체 상호작용의 생성을 초래할 수 있다. 이 실시형태에서, 유전자좌의 임의의 특징, 예컨대 유전자좌 또는 발현된 핵산 또는 단백질에서의 다형성의 존재, 유전자좌로부터의 발현 수준, 유전자좌의 물리적 구조 또는 유전자좌에 존재하는 염색체 상효작용이 유형화될 수 있다. 특정한 일 실시형태에서, 유전자좌는 본원에서 표, 특히 표 1, 3, 7, 8 및/또는 9(특히 표 1 및/또는 3)에 언급된 유전자들 중 임의의 유전자, 또는 관련 질환과 연관된 것으로 발견된 염색체 상호작용의 부근에 존재하는 유전자좌의 임의의 특성일 수 있다.
염색체 상호작용의 검출을 기반으로 한 동반 진단 방법
본 발명은 염색체 상호작용, 전형적으로 5 내지 20개 또는 5 내지 500개의 이러한 상호작용, 바람직하게는 20 내지 300개 또는 50 내지 100개의 상호작용의 존재 또는 부재를 검출하여, 개체에서 특징의 존재 또는 부재를 확인하는 단계를 포함하는 동반 진단 방법을 제공한다. 바람직하게는, 염색체 상호작용은 본원에서 언급된 유전자들 중 임의의 유전자에 존재하는 상호작용이다. 특정한 일 실시형태에서, 유형화되는 염색체 상호작용은, 예를 들어 이러한 방법이 표에서 정의된 특징의 존재 또는 부재를 확인하는 것을 목적으로 하는 경우, 본원의 표, 특히 표 7a, 8a 및/또는 9에서 개시된 핵산에 의해 나타나는 상호작용이다.
특정한 질환
동반 진단 방법은 본원에 언급된 특정한 질환 또는 특징 중 임의의 것의 존재를 검출하는 데 사용될 수 있다. 동반 진단 방법은 류마티스 관절염 환자에서 메토트렉세이트에 대한 반응성을 검출하는 데 사용될 수 있다.
바람직하게는, 표에서 언급된 관련 유전자들 중 임의의 유전자 내에서 임의의 염색체 상호작용의 존재 또는 부재가 검출된다. 예를 들어, 임의의 하나의 표에서 언급된 유전자들 중 적어도 1, 3, 10, 20, 50개에서 검출된다. 바람직하게는, 표에서 프로브 서열로 표시되는 염색체 상호작용의 존재 또는 부재가 이러한 방법에서 확인된다. 예를 들어, 임의의 하나의 표에서 관련 염색체 상호작용들 중 적어도 1, 3, 10, 20, 50 또는 100개에서 확인된다. 이들 유전자 또는 염색체 상호작용의 수는 본원에서 언급된 상이한 실시형태들 중 임의의 실시형태에서 사용될 수 있다.
동반 진단 방법을 사용하여 시험된 개체
시험되는 개체는 본원에서 언급된 임의의 질환 또는 특징의 임의의 증상을 가질 수 있거나 갖지 않을 수 없다. 개체는 이러한 임의의 질환 또는 특징의 위험에 있을 수 있다. 개체는 질환 또는 특징으로부터 회복되었을 수 있거나 회복되는 과정에 있을 수 있다. 개체는 바람직하게는, 포유류, 예컨대 영장류, 인간 또는 설치류이다.
스크리닝 방법
후보 제제가 비반응성 상태에 상응하는 염색체 상호작용으로부터 반응성 상태에 상응하는 염색체 상호작용으로 염색체 상호작용을 변화시킬 수 있는 제제인지 확인하는 단계를 포함하는, 개체에서 류마티스 관절염용 치료제에 대한 비반응성 상태로부터 반응성 상태로 변화시킬 수 있는 물질의 확인 방법이 제공된다.
특정한 일 실시형태에서, 본 방법은 후보 제제가 본원에 언급된 임의의 염색체 상호작용을 변화시킬 수 있는지의 여부를 확인한다.
이러한 방법은 시험관내(세포의 내부 또는 외부에서) 또는 생체내에서(비-인간 유기체의 경우) 수행될 수 있다. 특정한 일 실시형태에서, 이러한 방법은 세포, 세포 배양물, 세포 추출물, 조직, 기관 또는 유기체, 예컨대 관련 염색체 상호작용(들)을 포함하는 것에서 수행된다. 상기 방법은 전형적으로, 후보 제제를 유전자, 세포, 세포 배양물, 세포 추출물, 조직, 기관 또는 유기체와 접촉시킴으로써(또는 투여함으로써) 수행된다.
상기 스크리닝 방법에서 시험되는 적합한 후보 물질은 항체 제제(예를 들어, 모노클로날 항체, 폴리클로날 항체, 단일 사슬 항체, 키메라 항체 및 CDR-그래프팅된 항체)를 포함한다. 더욱이, 조합 라이브러리, 한정된 화학적 아이덴터티, 펩타이드 및 펩타이드 모방체, 올리고뉴클레오타이드 및 천연 제제 라이브러리, 예컨대 디스플레이 라이브러리(예를 들어 파지 디스플레이 라이브러리)가 또한, 시험될 수 있다. 후보 물질은 화학적 화합물일 수 있으며, 이러한 화합물은 전형적으로, 본원에 언급된 제제의 특성들 중 임의의 특성을 가질 수 있는 저분자(small molecule) 부근의 합성으로부터 유래된다.
바람직한 유전자좌, 유전자 및 염색체 상호작용
본 발명의 모든 양태들에 대해, 바람직한 유전자좌, 유전자 및 염색체 상호작용은 표에 언급되어 있다. 본 발명의 모든 양태들에 대해, 바람직한 유전자좌, 유전자 및 염색체 상호작용은 표에 제공되어 있다. 전형적으로, 방법에서, 염색체 상호작용은 표에 열거된 관련 유전자들 중 적어도 1, 3, 10, 20, 30 또는 50개로부터 검출된다. 바람직하게는, 임의의 하나의 표에서 프로브 서열로 표시된 관련된 특정 염색체 상호작용 중 적어도 1, 3, 10, 20, 30 또는 50개의 존재 또는 부재가 검출된다.
유전자좌는 본원에 언급된 유전자들 중 임의의 유전자의 업스트림 또는 다운스트림, 예를 들어 50 kb 업스트림 또는 20 kb 다운스트림에 존재할 수 있다.
시료 제조 및 염색체 상호작용 검출에 대한 바람직한 실시형태
시료의 제조 방법 및 염색체 구조의 검출 방법은 본원에 기재되어 있다. 이들 방법의 최적화된(비-통상적인) 버전이 예를 들어 본 단락에 기재된 바와 같이 사용될 수 있다.
전형적으로, 시료는 적어도 2x105개의 세포를 함유할 것이다. 시료는 5x105개까지의 세포를 함유할 수 있다. 일 실시형태에서, 시료는 2x105 내지 5.5x105개의 세포를 함유할 것이다.
염색체 유전자좌에 존재하는 후성유전적 염색체 상호작용의 가교가 본원에 기재되어 있다. 이러한 가교는 세포 용해가 생성되기 전에 수행될 수 있다. 세포 용해는 3분 내지 7분, 예컨대 4분 내지 6분, 또는 약 5분 동안 수행될 수 있다. 일부 실시형태에서, 세포 용해는 적어도 5분 동안 및 10분 미만 동안 수행된다.
제한효소를 이용한 DNA 분해가 본원에 기재되어 있다. 전형적으로, DNA 제한은 약 55℃ 내지 약 70℃, 예컨대 약 65℃에서, 약 10분 내지 30분, 예컨대 약 20분의 기간 동안 수행된다.
바람직하게는, 빈번한 커터(cutter) 제한효소가 사용되며, 그 결과 평균 단편 크기가 4,000개 이하의 염기쌍인 결찰된 DNA의 단편들이 형성된다. 선택적으로, 제한효소는 평균 단편 크기가 약 200개 내지 300개 염기쌍, 예컨대 약 256개 염기쌍인 결찰된 DNA의 단편을 초래한다. 일 실시형태에서, 전형적인 단편 크기는 200개 염기쌍 내지 4,000개 염기쌍, 예컨대 400개 내지 2,000개, 또는 500개 내지 1,000개 염기쌍이다.
EpiSwitch 방법의 일 실시형태에서, DNA 침전 단계는 DNA 제한효소 분해 단계와 DNA 결찰 단계 사이에 수행되지 않는다.
DNA 결찰은 본원에 기재되어 있다. 전형적으로, DNA 결찰은 5분 내지 30분, 예컨대 약 10분 동안 수행된다.
시료 내 단백질은 예를 들어, 프로테이나제, 선택적으로 프로테이나제 K를 사용하여 효소에 의해 분해될 수 있다. 단백질은 약 30분 내지 1시간, 예를 들어 약 45분의 기간 동안 효소에 의해 분해될 수 있다. 일 실시형태에서, 단백질의 분해, 예를 들어 프로테이나제 K 분해 후, 가교 반전(reversal) 또는 페놀 DNA 추출 단계가 존재하지 않는다.
일 실시형태에서, PCR 검출은, 바람직하게는 결찰된 핵산의 존재/부재에 대한 바이너리 판독을 이용하여, 결찰된 핵산의 단일 복사체를 검출할 수 있다.
호모로그
폴리뉴클레오타이드/핵산(예를 들어 DNA) 서열의 호모로그가 본원에 지칭된다. 이러한 호모로그는 전형적으로, 예를 들어 적어도 10개, 15개, 20개, 30개, 100개 이상의 연속 뉴클레오타이드의 영역에 걸쳐, 또는 염색체 상호작용에 관여하는 염색체의 영역 유래의 핵산의 일부에 걸쳐 적어도 70% 상동성, 바람직하게는 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99%의 상동성을 가진다. 상동성은 뉴클레오타이드 동일성(이따금 "단단한(hard) 상동성"으로 지칭됨)을 기반으로 계산될 수 있다.
따라서, 특정 실시형태에서, 폴리뉴클레오타이드/핵산(예를 들어 DNA) 서열의 호모로그는 본원에서 % 서열 동일성로 지칭된다. 전형적으로, 이러한 호모로그는 예를 들어 적어도 10개, 15개, 20개, 30개, 100개 이상의 연속 뉴클레오타이드의 영역에 걸쳐, 또는 염색체 상호작용에 관여하는 염색체의 영역 유래의 핵산의 일부에 걸쳐 적어도 70%의 서열 동일성, 바람직하게는 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99%의 서열 동일성을 가진다.
예를 들어, UWGCG 패키지는 상동성 및/또는 % 서열 동일성을 계산하는 데 사용될 수 있는 BESTFIT 프로그램(예를 들어 이의 디폴트 세팅에 사용됨)을 제공한다(문헌[Devereux et al(1984) Nucleic Acids Research 12, p387-395]). PILEUP 및 BLAST 알고리즘은 상동성 및/또는 % 서열 동일성을 계산하고/거나 서열을 나열(line up)하는 데 사용될 수 있다(예를 들어 문헌[Altschul S. F. (1993) J Mol Evol 36:290-300]; [Altschul, S, F et al (1990) J Mol Biol 215:403-10]에 기재된 바와 같이 예컨대 동등한 또는 상응하는 서열의 확인(전형적으로 이들의 디폴트 세팅을 기반으로 함)).
BLAST 분석을 수행하기 위한 소프트웨어는 미국 국립 생물 정보 센터를 통해 공개적으로 입수 가능하다. 이러한 알고리즘은, 우선, 데이터베이스 서열에서 동일한 길이의 워드(word)로 정렬될 때, 일부 양의 역치 점수값 T와 일치하거나 충족시키는 쿼리 서열에서 길이 W의 짧은 워드를 확인함으로써, 하이 스코어링 서열쌍(HSP; high scoring sequence pair)을 확인하는 단계를 수반한다. T는 이웃 워드 점수 역치로 지칭된다(상기 Altschul 등). 이들 초기 이웃 워드 히트(hit)들은 이들을 함유하는 HSP를 찾으려는 검색을 개시하기 위한 시드(seed)로서 작용한다. 워드 히트는, 누적 정렬 점수가 증가될 수 있는 한, 각각의 서열을 따라 양 방향에서 연장된다. 각각의 방향에서 워드 히트에 대한 연장은: 누적 정렬 점수가 이의 최대 달성된 값으로부터 X 양만큼 하락할 때; 누적 점수가 하나 이상의 음성-스코어링 잔기 정렬의 누적으로 인해, 0 또는 그보다 낮게 될 때; 또는 둘 중 어느 서열이 종료될 때, 중단된다. BLAST 알고리즘 파라미터 W5 T 및 X는 정렬의 민감성 및 속도를 결정한다. BLAST 프로그램은 11의 워드 길이(W), BLOSUM62 스코어링 매트릭스(문헌[Henikoff and Henikoff (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 10915-10919] 참조), 50의 정렬(B), 10의 예상값(E), M=5, N=4 및 양쪽 가닥의 비교를 디폴트로서 사용한다.
BLAST 알고리즘은 2개의 서열들 사이에서 유사성의 통계학적 분석을 수행한다; 예를 들어, 문헌[Karlin and Altschul (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 5873-5787]을 참조한다. BLAST 알고리즘에 의해 제공되는 유사성의 일 측정은 최소 합 확률(P(N); smallest sum probability)로서, 이는 2개의 폴리뉴클레오타이드 서열들 사이에서 일치가 우연히 발생할 확률의 지표를 제공한다. 예를 들어, 서열은, 제1 서열을 제2 서열과 비교 시 최소 합 확률이 약 1 미만, 바람직하게는 약 0.1 미만, 보다 바람직하게는 약 0.01 미만, 가장 바람직하게는 약 0.001 미만인 경우, 유사한 것으로 간주된다.
상동성 서열은 전형적으로, 1, 2, 3, 4개 이상의 염기, 예컨대 10, 15 또는 20개 미만의 염기(뉴클레오타이드의 치환, 결실 또는 삽입일 수 있음)가 상이하다. 이들 변화는 상동성 및/또는 % 서열 동일성의 계산과 관련하여, 상기 언급된 영역들 중 임의의 영역에 걸쳐 측정될 수 있다.
어레이
제2 핵산 세트는 어레이에 결합될 수 있고, 일 실시형태에서, 어레이에 결합된 적어도 15,000, 45,000, 100,000 또는 250,000개의 상이한 제2 핵산들이 존재하고, 이들은 바람직하게는 적어도 300, 900, 2000 또는 5000개의 유전자좌를 나타낸다. 일 실시형태에서, 제2 핵산의 상이한 집단들 중 하나 이상 또는 모두는 어레이의 1개 초과의 개별 영역들에 결합되어, 오차 검출을 허용하는 어레이 상에서 반복 시행된다. 어레이는 Agilent SurePrint G3 Custom CGH 마이크로어레이 플랫폼을 기반으로 할 수 있다. 어레이에 대한 제1 핵산의 결합의 검출은 이중 색상 시스템에 의해 수행될 수 있다.
치료제
치료제는 본원에 언급되어 있다. 본 발명은 관련 질환의 예방 또는 치료에 사용하기 위한 이러한 제제를 제공한다. 이는, 필요한 개체에게 치료적 유효량의 제제를 투여하는 단계를 포함할 수 있다. 본 발명은 질병의 예방 또는 치료를 위한 약제의 제조에서 제제의 용도를 제공한다. 본 발명의 방법은 치료를 받을 개체를 선택하는 데 사용될 수 있다. 본 발명의 방법, 특히 동반 진단 시험을 수행하기 위한 방법은 치료 단계를 포함할 수 있으며, 이러한 치료 단계에서, 본 방법에 의해 확인된 사람은 관련 질환을 예방하거나 치료하는 제제를 투여받을 수 있다.
제제의 제형은 제제의 성질에 따라 다를 것이다. 제제는 이러한 제제 및 약제학적으로 허용 가능한 담체 또는 희석제를 함유하는 약제학적 조성물 형태로 제공될 것이다. 적합한 담체 및 희석제는 등장성 식염수 용액, 예컨대 인산염-완충된 식염수를 포함한다. 전형적인 경구 투약 조성물은 정제, 캡슐, 액체 용액 및 액체 현탁액을 포함한다. 제제는 비경구, 정맥내, 근육내, 피하, 경피 또는 경구 투여를 위해 제형화될 수 있다.
제제의 용량은 다양한 파라미터들에 따라, 특히 사용된 물질; 치료를 받는 개체의 연령, 체중 및 상태; 투여 경로; 및 필요한 섭생에 따라 결정될 수 있다. 의사는 임의의 특정 제제에 필요한 투여 경로 및 투약량을 결정할 수 있을 것이다. 더욱이, 적합한 용량은 예를 들어 1일 1 내지 3회 투여되는 0.1 내지 100 mg/kg 체중, 예컨대 1 내지 40 mg/kg 체중일 수 있다.
본원에서 언급된 물질의 형태
본원에 언급된 임의의 물질, 예컨대 핵산 또는 치료제는 정제된 형태 또는 단리된 형태일 수 있다. 이들 물질은 자연상에서 발견되는 것과 상이한 형태일 수 있으며, 예를 들어 이들 물질은 자연상에서 발생하지 않는 다른 물질과 조합하여 존재할 수 있다. (본원에 정의된 서열의 일부를 포함하는) 핵산은 자연상에서 발견되는 것과 상이한 서열, 예를 들어 상동성 문맥에서 기재된 바와 같은 서열에 적어도 1, 2, 3, 4개 이상의 뉴클레오타이드 변화를 갖는 서열을 가질 수 있다. 핵산은 5' 말단 또는 3' 말단에 이종성 서열을 가질 수 있다. 핵산은 자연상에서 발견되는 것과 화학적으로 상이할 수 있으며, 예를 들어 핵산은 일부 방식으로 변형될 수 있으나, 바람직하게는 여전히 왓슨 크릭 염기쌍을 형성할 수 있다. 적절하다면, 핵산은 이중 가닥 또는 단일 가닥 형태로 제공될 것이다. 본 발명은 본원에 언급된 모든 특이적인 핵산 서열들을 단일 가닥 형태 또는 이중 가닥 형태로 제공하고, 따라서 개시된 임의의 서열에 상보적인 가닥을 포함한다.
본 발명은 또한, 특정 서브그룹과 연관된 염색체 상호작용을 검출하는 단계를 포함하는, 본 발명의 임의의 방법을 수행하기 위한 키트를 제공한다. 이러한 키트는 관련 염색체 상호작용을 검출할 수 있는 특이적인 결합 제제, 예컨대 본 발명의 방법에 의해 생성된 결찰된 핵산을 검출할 수 있는 제제를 포함할 수 있다. 키트에 존재하는 바람직한 제제는, PCR 반응에서 결찰된 핵산을 증폭시킬 수 있는 예를 들어 본원에 기재된 바와 같은 결찰된 핵산 또는 프라이머 쌍에 하이브리드화할 수 있는 프로브를 포함한다.
본 발명은 또한, 관련 염색체 상호작용을 검출할 수 있는 장치를 제공한다. 이러한 장치는 바람직하게는, 염색체 상호작용을 검출할 수 있는 임의의 특이적인 결합 제제, 프로브 또는 프라이머 쌍, 예컨대 본원에 기재된 이러한 임의의 제제, 프로브 또는 프라이머 쌍을 포함한다.
공개문헌
본원에서 언급된 모든 공개문헌들의 내용은 원용에 의해 본 명세서에 포함되어 있고, 본 발명과 관련된 특징들을 추가로 정의하는 데 사용될 수 있다.
구체적인 실시형태
EpiSwitch™ 플랫폼 기술은 유전자좌에서 정상적인 상태와 비정상적인 상태 사이에서 조절 변화의 후성유전자 조절 시그너처를 검출한다. EpiSwitchTM 플랫폼은 염색체 구조 시그너처로도 공지된 인간 염색체의 조절 고차(high order) 구조와 연관된 유전자 조절의 기본적인 후성유전자 수준을 확인하고, 모니터링한다. 염색체 시그너처는 유전자 탈조절(deregulation)의 캐스케이드에서 별개의 일차 단계이다. 이들 시그너처는, 후기(late) 후성유전자 및 유전자 발현 바이오마커를 이용하는 바이오마커 플랫폼, 예컨대 DNA 메틸화 및 RNA 프로파일링에 대해 독특한 세트의 이점들을 가진 고차 바이오마커이다.
EpiSwitch™ 어레이 검정법
주문 EpiSwitch™ 어레이-스크리닝 플랫폼은 4개 밀도인 15K, 45K, 100K 및 250K의 독특한 염색체 구조로 제공되며, 각각의 키메라 단편은 어레이 상에서 4회 반복되어, 각각 60K, 180K, 400K 및 1백만의 유효 밀도를 만든다.
주문 설계된 EpiSwitch™ 어레이
15K EpiSwitch™ 어레이는 EpiSwitch™ 바이오마커 발견 기술을 이용하여 조사된 약 300개의 유전자좌들을 포함하는 전체 게놈을 스크리닝할 수 있다. EpiSwitch™ 어레이는 Agilent SurePrint G3 Custom CGH 마이크로어레이 플랫폼 상에서 구축되며; 이러한 기술은 4개의 밀도인 60K, 180K, 400K 및 1백만 프로브를 제공한다. 각각의 EpiSwitch™ 프로브가 4벌(quadruplicate)로 제시됨에 따라 1개 어레이 당 밀도는 15K, 45K, 100K 및 250K까지 감소되며, 따라서 재현 가능성을 통계학적으로 평가할 수 있다. 1개 유전적 유전자좌 당 조사된 잠재적인 EpiSwitch™ 마커의 평균 수는 50이며; 이와 같이, 조사될 수 있는 유전자좌의 수는 300, 900, 2000 및 5000이다.
EpiSwitch™ 주문 어레이 파이프라인
EpiSwitch™ 어레이는, EpiSwitch™ 라이브러리 발생 후 Cy5로 표지되고, Cy3로 표지된 다른 시료(대조군)와 비교/분석되는 이중 색상 시스템이다. 이러한 어레이는 Agilent SureScan 스캐너를 사용하여 스캐닝되고, 결과적인 특징은 Agilent Feature 추출 소프트웨어를 사용하여 추출된다. 그런 다음, 데이터는 R에서 EpiSwitch™ 어레이 프로세싱 스크립트를 사용하여 처리된다. 이러한 어레이는 R에서 바이오컨덕터에서 표준 이중 색상 패키지를 사용하여 처리된다: Limma*. 어레이의 정상화는, Limma*에서 어레이 기능 내에서 정상화된 어레이를 사용하여 수행되고, 이는 온 칩 Agilent 양성 대조군 및 EpiSwitch™ 양성 대조군에 대해서 수행된다. 데이터는 Agilent Flag 콜을 기반으로 여과되고, Agilent 대조군 프로브는 제거되며, 기술적인 복제 프로브가 평균화되어, Limma*를 사용하여 분석된다. 프로브는 비교되는 2개의 시나리오들 사이에서 프로브의 차이를 기반으로 모델링되고, 그런 다음, 오류 발견률(False Discover rate)을 사용함으로써 보정(correct)된다. <1 또는 >1이며 p=0.01 FDR p-값을 통과한 변동 계수(CV; Coefficient of Variation)가 30% 미만인 프로브가 추가의 스크리닝에 사용된다. 프로브 세트를 감소시키기 위해, 추가의 다중 인자 분석이 R에서 FactorMineR 패키지를 사용하여 수행된다.
*주: LIMMA는 마이크로어레이 실험에서 차별적인 발현을 평가하기 위한 선형 모델 및 경험적 베이스 방법(Empirical Bayes Method)이다. Limma는 마이크로어레이 또는 RNA-Seq로부터 발생하는 유전자 발현 데이터의 분석을 위한 R 패키지이다.
프로브의 풀은 처음에, 최종적인 피킹(final picking)을 위해 조정된 p-값, FC 및 CV <30%(임의의 컷 오프 포인트) 파라미터를 기반으로 선택된다. 추가의 분석 및 최종적인 리스트는 처음 2개의 파라미터들(adj p-값; FC)을 기반으로 해서만 나타난다.
공개문헌
본원에서 언급된 모든 공개문헌들의 내용은 원용에 의해 본 명세서에 포함되어 있고, 본 발명과 관련된 특징들을 추가로 정의하는 데 사용될 수 있다.
구체적인 실시형태
EpiSwitch™ 플랫폼 기술은 유전자좌에서 정상적인 상태와 비정상적인 상태 사이에서 조절 변화의 후성유전자 조절 시그너처를 검출한다. EpiSwitchTM 플랫폼은 염색체 구조 시그너처로도 공지된 인간 염색체의 조절 고차 구조와 연관된 유전자 조절의 기본적인 후성유전자 수준을 확인하고, 모니터링한다. 염색체 시그너처는 유전자 탈조절의 캐스케이드에서 별개의 일차 단계이다. 이들 시그너처는, 후기 후성유전자 및 유전자 발현 바이오마커를 이용하는 바이오마커 플랫폼, 예컨대 DNA 메틸화 및 RNA 프로파일링에 대해 독특한 세트의 이점들을 가진 고차 바이오마커이다.
EpiSwitch™ 어레이 검정법
주문 EpiSwitch™ 어레이-스크리닝 플랫폼은 4개 밀도인 15K, 45K, 100K 및 250K의 독특한 염색체 구조로 제공되며, 각각의 키메라 단편은 어레이 상에서 4회 반복되어, 각각 60K, 180K, 400K 및 1백만의 유효 밀도를 만든다.
주문 설계된 EpiSwitch™ 어레이
15K EpiSwitch™ 어레이는 EpiSwitch™ 바이오마커 발견 기술을 이용하여 조사된 약 300개의 유전자좌들을 포함하는 전체 게놈을 스크리닝할 수 있다. EpiSwitch™ 어레이는 Agilent SurePrint G3 Custom CGH 마이크로어레이 플랫폼 상에서 구축되며; 이러한 기술은 4개의 밀도인 60K, 180K, 400K 및 1백만 프로브를 제공한다. 각각의 EpiSwitch™ 프로브가 4벌로 제시됨에 따라 1개 어레이 당 밀도는 15K, 45K, 100K 및 250K까지 감소되며, 따라서 재현 가능성을 통계학적으로 평가할 수 있다. 1개 유전적 유전자좌 당 조사된 잠재적인 EpiSwitch™ 마커의 평균 수는 50이며; 이와 같이, 조사될 수 있는 유전자좌의 수는 300, 900, 2000 및 5000이다.
EpiSwitch™ 주문 어레이 파이프라인
EpiSwitch™ 어레이는, EpiSwitch™ 라이브러리 발생 후 Cy5로 표지되고, Cy3로 표지된 다른 시료(대조군)와 비교/분석되는 이중 색상 시스템이다. 이러한 어레이는 Agilent SureScan 스캐너를 사용하여 스캐닝되고, 결과적인 특징은 Agilent Feature 추출 소프트웨어를 사용하여 추출된다. 그런 다음, 데이터는 R에서 EpiSwitch™ 어레이 프로세싱 스크립트를 사용하여 처리된다. 이러한 어레이는 R에서 바이오컨덕터에서 표준 이중 색상 패키지를 사용하여 처리된다: Limma*. 어레이의 정상화는, Limma*에서 어레이 기능 내에서 정상화된 어레이를 사용하여 수행되고, 이는 온 칩 Agilent 양성 대조군 및 EpiSwitch™ 양성 대조군에 대해서 수행된다. 데이터는 Agilent Flag 콜을 기반으로 여과되고, Agilent 대조군 프로브는 제거되며, 기술적인 복제 프로브가 평균화되어, Limma*를 사용하여 분석된다. 프로브는 비교되는 2개의 시나리오들 사이에서 프로브의 차이를 기반으로 모델링되고, 그런 다음, 오류 발견률을 사용함으로써 보정된다. ≤1 또는 ≥1이며 p≤0.01 FDR p-값을 통과한 변동 계수(CV)가 30% 이하인 프로브가 추가의 스크리닝에 사용된다. 프로브 세트를 감소시키기 위해, 추가의 다중 인자 분석이 R에서 FactorMineR 패키지를 사용하여 수행된다.
*주: LIMMA는 마이크로어레이 실험에서 차별적인 발현을 평가하기 위한 선형 모델 및 경험적 베이스 방법(Empirical Bayes Method)이다. Limma는 마이크로어레이 또는 RNA-Seq로부터 발생하는 유전자 발현 데이터의 분석을 위한 R 패키지이다.
프로브의 풀은 처음에, 최종적인 피킹(final picking)을 위해 조정된 p-값, FC 및 CV <30%(임의의 컷 오프 포인트) 파라미터를 기반으로 선택된다. 추가의 분석 및 최종적인 리스트는 처음 2개의 파라미터들(adj p-값; FC)을 기반으로 해서만 나타난다.
실시예
본 발명은 하기 비제한적인 실시예에 의해 예시된다.
통계학적 파이프라인
EpiSwitch™ 스크리닝 어레이를 R에서 EpiSwitch™ Analytical 패키지를 사용하여 처리하여, EpiSwitch™ PCR 플랫폼 상으로 번역될 중요한 EpiSwitch™ 마커를 선택한다.
단계 1
프로브들을 이들의 보정된 p-값(오차 발견률, FDR)을 기반으로 선택하고, 이는 변형된 선형 회귀 모델의 생성물이다. p-값 ≤ 0.1보다 낮은 프로브들을 선택한 다음, 이들의 후성유전자 비율(ER)만큼 더 감소시키며, 프로브 ER은 추가의 분석에 선택되기 위해서는 ≤ -1.1 또는 ≥ 1.0이어야 한다. 마지막 필터는 변동 계수(CV)이며, 프로브는 ≤ 0.3보다 낮아야 한다.
단계 2
통계학적 리스트로부터의 상부 40개의 마커들을, PCR 번역용 마커로서 선택되기 위해 이들의 ER을 기반으로 선택한다. 최고 음성 ER 로드(laod)를 가진 상부 20개의 마커 및 최고 양성 ER 로드를 가진 상부 20개의 마커가 상기 리스트를 형성한다.
단계 3
단계 1로부터의 결과적인 마커, 통계학적으로 유의한 프로브는 초기하 농화(HE; hypergeometric enrichment)를 사용하는 농화 분석의 염기를 형성한다. 이 분석은 유의한 프로브 리스트로부터 마커를 감소시킬 수 있고, 단계 2의 마커와 함께, EpiSwitch™ PCR 플랫폼 상으로 번역되는 프로브의 리스트를 형성한다.
통계학적 프로브를 HE에 의해 처리하여, 어떤 유전적 위치가 통계학적으로 유의한 프로브의 농화를 갖는지 확인하며, 이는 어떤 유전적 위치가 후성유전자 차이의 허브인지 가리킨다.
보정된 p-값을 기반으로 가장 유의하게 농화된 유전자좌를 프로브 리스트 생성을 위해 선택한다. 0.3 또는 0.2의 p-값보다 낮은 유전적 위치를 선택한다. 단계 2의 마커와 함께 이들 유전적 위치에 대한 통계학적 프로브 맵핑은 EpiSwitch™ PCR 번역에 대한 중요한 마커를 형성한다.
실시예 1: 류마티스 관절염의 치료를 위한 메토트렉세이트의 비-반응자와 반응자 사이를 구별하는 동반 진단법과 관련된 염색체 상호작용의 확인 방법
소스: 글래스고 스코티쉬 교육 연구 학회(SERA) 코호트.
실시예 1에 대한 도입 및 간략한 요약
개별 환자의 안정한 후성유전자 프로파일은 신호전달 경로의 민감성을 조정하며, 유전자 발현을 조절하고, 질병 발달의 경로에 영향을 미치고, 약물의 유효 작용 및 치료에 대한 반응을 책임지는 조절 제어를 무효화시킬 수 있다. 본원에서, 본 발명자들은 류마티스 관절염(RA) 환자의 후성유전자 프로파일을 분석하여, 메토트렉세이트(MTX) 치료에 대한 비-반응자를 한정하는 데 있어서 이의 역할을 평가하였다.
류마티스 관절염에서 제1선 질병 조정 항류마티스 약물(DMARD, 통상 메토트렉세이트(MTX))에 대한 반응의 신뢰할만한 임상적 예측이 현재로서는 불가능하다. 현재, 제1선 DMARD(특히, 메토트렉세이트(MTX))에 대한 반응을 확인하는 능력은 치료법 후, 경험적인 임상적 측정에 의존한다.
초기 류마티스 관절염(ERA)에서, 제1선 DMARD(특히 메토트렉세이트(MTX))에 대한 반응을 예측하는 것이 불가능했으며, 따라서 이러한 치료 결정은 주로 임상적 알고리즘에 의존한다. 약물에 네이브한 환자를 제1선 DMARD에 반응하지 않을 환자로 분류하는 능력은 환자 계층화를 위한 매우 중요한 툴일 것이다. 본원에서, 본 발명자들은, 초기 RA 환자의 혈중 백혈구에서 염색체 구조 시그너처(RA에서 이전에 기재되지 않은 고도로 유익하고 안정한 후성유전자 변형)가 MTX 치료에 대한 비반응성을 예측할 수 있다고 보고하고 있다.
방법:
말초 혈액 단핵 세포(PBMC)를, 스코틀랜드 초기 류마티스 관절염(SERA) 시작 코호트에서 보충된 DMARD 네이브 ERA 환자로부터 수득하였다. 이 연구에의 포함은, 중간 내지 높은 질병 활성(DAS28 ≥ 3.2)을 가진 RA(2010 ACR/EULAR 기준을 충족함)의 진단, 및 메토트렉세이트(MTX)를 이용한 후속적인 단독요법을 기반으로 하였다. DAS28 = 28개 관절의 질병 활성 점수. EULAR = 유럽 류마티스 학회. ACR = 미국 류마티스학 대학. MTX 반응성을 6개월째에 하기 기준을 사용하여 정의하였다: 반응자 - DAS28 경감(DAS28 <2.6) 또는 양호한 반응(>1.2의 DAS28 개선 및 DAS28 ≤3.2). 비-반응자 - DAS28에서 개선이 없음(≤0.6). 4명의 MTX 반응자, 4명의 MTX 비-반응자 및 4명의 건강한 대조군에서 염색체 구조 시그너처(CCS)의 초기 분석을, 309 RA-관련 유전적 유전자좌를 망라하는 13,322개의 독특한 프로브를 함유하는 EpiSwitchTM 어레이를 사용하여 수행하였다. 구별되는 CCS를 LIMMA* 선형 모델링, 후속적인 바이너리 필터링 및 클러스터 분석에 의해 한정하였다. 30명의 MTX 반응자 및 30명의 비-반응자의 타당성 코호트를, 구별되는 CCS에 대해 EpiSwitchTM PCR 플랫폼을 사용하여 스크리닝하였다. 구별되는 시그너처를 바이너리 점수 및 로지스틱 회귀 모델링을 사용하여 더 개량하고, 모델의 정확성 및 강건성(robustness)을 ROC** 분석에 의해 확인하였다.
*주: LIMMA는 마이크로어레이 실험에서 차별적인 발현을 평가하기 위한 선형 모델 및 경험적 베이스 방법이다. Limma는 마이크로어레이 또는 RNA-Seq로부터 발생하는 유전자 발현 데이터의 분석을 위한 R 패키지이다.
**주: ROC는 수신자 조작 특징을 의미하고, ROC 곡선을 지칭한다. ROC 곡선은 바이너리 분류 시스템의 성능을 예시하는 그래픽 플롯이며, 이의 판별 역치는 다양해진다. 이러한 곡선은, 다양한 역치 세팅에서 위양성율(false positive rate)에 대한 진양성율(true positive rate)을 플롯화함으로써 만들어진다.
CCS EpiSwitchTM 어레이 분석은 반응자 및 비-반응자 ERA 환자를 구별하는 30-마커 계층화 프로파일을 확인시켜 주었다. 본 발명자들의 타당성 코호트에서 이러한 시그너처의 후속적인 평가는, 이를, 반응자 및 비-반응자를 구별할 수 있는 5-마커 CCS 시그너처로 개량하였다. 예측 모델링은 반응자 및 비-반응자에 대한 확률 점수를 0.0098 내지 0.99(0 = 반응자, 1 = 비-반응자)의 범위로 제공하였다. 반응자에 대해 92%(95% 신뢰 구간[95% CI] 75-99%)의 진양성율이 존재하였으며, 비-반응자에 대해 93%(95% CI 76-99%)의 진음성율(true negative rate)이 존재하였다. 중요하게는, 이러한 계층화 모델을 입증하기 위한 ROC 분석은, 시그너처가 MTX에 대한 NR에 대해 92%에서 예측 가능한 민감성 파워를 가졌음을 나타내었다.
본 발명자들은, 진단 시 환자를 계층화하는 파워를 가진, DMARD 네이브 ERA 환자의 말초 혈액에서 고도로 유익한 전신 후성유전자 상태를 확인하였다. 혈액-기반 임상 시험을 사용하여 환자를 연역적으로 비-반응자로 구별하는 능력은 매우 중요한 임상적 툴일 것이며; 계층화된 의약에 대한 길을 닦고, ERA 클리닉에서 보다 공격적인 치료 섭생을 정당화한다.
실시예 1의 상세한 버전
환자를 연역적으로 반응자(R) 및 비-반응자(NR)로 구별하는 능력은 환자 계층화에 매우 중요한 툴일 것이며, 효과적인 치료의 보다 조기 도입을 초래할 것이다. 본 발명자들은, 혈액-유래 백혈구에서 질환 및 MTX 반응성의 지표인 염색체 구조 시그너처(CCS)를 확인하기 위해 EpiSwitchTM 바이오마커 발견 플랫폼을 사용하였다. 이로써, 본 발명자들은 치료 네이브 초기 RA(ERA) 환자를 MTX R 및 NR로 계층화할 수 있는 제1 예후 분자 시그너처를 제공하는 CXCL13, IFNAR1, IL-17A, IL-21R 및 IL-23 유전자좌에 함유된 후성유전자 시그너처를 확인하였다. 중요하게는, 이러한 계층화 모델은 MTX에 대한 NR에 대해 92%에서 예측 가능한 민감성 파워를 가졌다. 이러한 후성유전자 RA 바이오마커 시그너처는 ERA와 건강한 대조군(HC) 사이를 분간할 수 있다. 이러한 조합적인, 예측성 말초 혈액 시그너처는 클리닉에서 보다 공격적인 치료법을 보다 조기에 도입하는 것을 지지할 수 있고, RA에서 개인화된 의약으로의 길을 닦을 수 있다.
RA는 전세계 집단 중 1%까지 영향을 미치는 만성 자가면역 질병이다. 발병은 다인자적이고, 주로 환경 인자, 특히 흡연 및 기타 폐 자극과 면역 숙주 유전자좌의 상호작용을 특징으로 한다1 ,2,3. 이러한 환경 인자에 유전적으로 취약한 개체의 노출은 질병의 발병 및 진행에 대한 후성유전자 개념을 제시한다. 염색질 마커(예를 들어 게놈의 메틸화 상태)의 최근의 연구는 RA와 연관된 후성유전자 차이의 최초의 증거를 제공하고 있다4 ,5,6,7. 그러나, 현재까지, 유전적 연관 또는 후성유전적 변화 중 어느 것도 주어진 치료법에의 반응에 대한 타당한 예측 마커를 제공하지 못하였다. 더욱이, 임상적 제시는 단지 종래의 DMARD의 효능 및 독성을 미약하게 예측할 뿐이다. MTX8는 EULAR(유럽 류마티스 학회) 및 ACR(미국 류마티스학 대학) 관리 가이드라인에 의해 권고된 가장 보편적인 첫번째 선택된 약제로서, 6개월간의 치료 후 50% 내지 65% 범위의 임상적으로 의미 있는 반응률을 전달한다11. 이러한 반응, 및 특히 높은 허들 반응을 나타내는 보다 더 작은 비율은, 현재 개별 환자에서는 예측될 수 없다. 이는, 치료 섭생 선택(모노 또는 조합 치료)에 대한 '시행착오'를 기반으로 한 접근법을 야기한다. 제1선 치료에 대한 반응이 장기간 결과의 가장 유의미한 예측인자임을 고려하면, 개별 환자에서 약물 반응성을 예측하는 능력은 매우 중요한 임상적 툴이 될 것이다9,10.
본원에서, 본 발명자들은, MTX 치료에 대한 NR을 가리키고 따라서 대안적인 치료법에 대한 이러한 환자의 연역적인 확인 및 계층화를 가능하게 하는 안정한 혈액-기반 후성유전자 프로파일이 존재하는지 확인하기 위해, 스코틀랜드 초기 류마티스 관절염(SERA) 시작 코호트로부터 DMARD-네이브, ERA 환자의 후성유전자 프로파일링에 초점을 맞추었다. 소스 후성유전자 변형은 세포내 활성화 및 전사 프로파일에 강하게 영향을 미칠 수 있다. 생각하건대, 약물에 대한 작용 방식은 후성유전자적으로 변형된 유전자좌에 의해 영향을 받을 수 있었다. 본 발명자들은, CCS가, 전사 조절에 상당한 영향을 가진 고도로 유익하고 안정한 고차 후성유전자 상태를 반영하기 때문에, 긴 범위의 염색질 상호작용으로도 공지된 CCS에 초점을 맞추었다12,13,14. CCS들은 또한, 상당한 이점들15 및 표현형 차이에 초기의 기능적인 결찰을 제공하고16, 종양학 및 다른 질병 영역들에서 유익한 바이오마커 후보로서 기록되어 있다17,18,19.
본 발명자들은 스코틀랜드 초기 류마티스 관절염(SERA) 시작 코호트에 의해 제공된 초기 RA(ERA) 환자를 이용하였다. 인구통계학적, 임상적 및 면역학적 인자들을 진단 시 및 6개월째에 수득하였다. 이 연구에의 포함은, 중간 내지 높은 질병 활성(DAS28 ≥ 3.2)을 가진 RA(2010 ACR/EULAR 기준을 충족함)의 진단, 및 MTX를 이용한 후속적인 단독요법을 기반으로 하였다. 반응자를 MTX를 수여 받았을 때 6개월째에 DAS28 경감(DAS28 <2.6) 또는 양호한 반응(>1.2의 DAS28 개선 및 DAS28 ≤3.2)을 달성한 환자로서 정의하였다. 비-반응자는 MTX를 수여 받았을 때 6개월째에 DAS28에서 개선이 없음(≤0.6)을 달성한 환자로서 정의하였다. 후성유전자 분석용 혈액 시료를 진단 시 수합하였다(DAS28 = 28개 관절의 질병 활성 점수).
본 발명자들은, RA와 기능적으로 결찰된 309개의 유전적 유전자좌에 걸쳐 13,322개의 염색체 구조 시그너처(CCS)(13,322개의 독특한 프로브)에 걸쳐 분석함으로써, 바이너리 후성유전자 바이오마커 프로파일링을 사용하였다. 후성유전자 바이오마커(1)의 고도로 유익한 클래스로서 CCS를, 초기 흑색종(2)을 가진 메이요 클리닉 코호트의 혈액 기반 계층화에 이미 성공적으로 이용되어 왔으며 현재 PD-1/PD-L1을 이용한 면역치료법에 대한 반응의 예측 가능한 계층화에 사용되는 EpiSwitchTM 플랫폼 상에서 판독하고, 모니터링하고 평가하였다.
네이브 RA 환자의 확인된 후성유전자 프로파일을 GraphPad Prism, WEKA 및 R 통계학적 언어를 사용하여 통계학적 분석 처리하였다. EpiSwitchTM 플랫폼 및 90개의 임상 시료의 연장된 코호트를 사용함으로써, 본 발명자들은 반응자, 비-반응자, RA 환자 및 건강한 대조군에 대해 통계학적으로 유의한 922개가 넘는 후성유전자 리드(lead) 바이오마커의 풀을 확인하였다.
ERA 환자에서 예비치료 순환 CCS 상태를 확인하기 위해, RA 발병과 연관된 123 유전적 유전자좌(표 1)를 선택하고, EpiSwitchTM 인 실리코 예측 패키지20를 사용하여 예측된 염색체 구조 상호작용을 이용하여 주석을 달았다. EpiSwitchTM 인 실리코 예측은 13,322개의 고-신뢰 CCS 마커 후보를 발생시켰다(표 1). 이들 후보를 사용하여, 맞춤형(bespoke) 발견 EpiSwitchTM 어레이를 발생시켜(도 5), 6개월 치료법(도 1A, 1B 및 표 2) 후 임상적으로 정의된 4명의 MTX 반응자(R) 및 4명의 MTX NR, 및 4명의 건강한 대조군(HC)으로부터 진단(DMARD-네이브) 시 단리된 말초 혈액 단핵 세포를 스크리닝하였다. R, NR 및 HC를 구별한 CCS를 확인하기 위해, 정상화된 후성유전자 로드의 LIMMA 선형 모델을 이용하였다. 총 922개의 통계학적으로 유의한 계층화 마커들(조정된 p 값 및 EpiSwitchTM 비율을 기반으로 평가된 유의성)을 확인하였다. 922개의 리드 마커 중에서, 420개가 NR과 연관이 있었으며, 210개가 R과 연관이 있었고, 159개가 HC와 연관이 있었다(도 1C). 바이너리 필터링 및 클러스터 분석을 EpiSwitch™ 마커에 적용하여, 확인된 CCS의 유의성을 평가하였다. 단계적인 계층적 클러스터링 접근법(완전한 연관성 집합을 이용한 맨해튼 거리 측정을 사용하고 R vs NR, HC vs R & HC vs NR을 고려하여)은 유의한 마커의 수를 922에서 65로 감소시켰고, 마지막으로는 30-마커 계층화 프로파일을 초래하였다(도 1D 및 표 3).
CCS 시그너처를 개량하고 입증하기 위해, 30개의 확인된 마커를 단계적인 접근법에서 EpiSwitch™ PCR 플랫폼(도 5)을 사용하여 R 및 NR의 제2 ERA 환자 코호트(도 2A, 2B 및 표 4)에서 스크리닝하였다. 제1의 경우에서, 총 30개의 CCS 마커를 12명의 ERA 환자(6명의 R 및 6명의 NR)에서 진행시켰다. 최상의 구별하는 CCS 마커를, 바이너리 점수 상에서 예이츠(Yate) 연속성 보정과 함께 독립성에 대한 치-스퀘어드(Chi-squared) 시험을 적용하고, 12-마커 CCS 프로파일을 드러냄으로써 확인하였다. 이들 12개의 CCS 마커를 부가적인 12명의 ERA 환자(6명의 R 및 6명의 NR) 상에서 진행시켰으며, 데이터를 이전의 12명의 ERA와 조합하였다. 24명 환자(12명의 R 및 12명의 NR)의 시료를 조합하여, WEKA 분류화 플랫폼(각각의 마커의 식별력의 점수를 매기기 위해 5배 교차 타당성을 사용함)에서 로지스틱 회귀 모델을 구축하고, 초기 데이터 세트의 무작위 데이터 재시료화에 의해 10회 진행시켜, 모델 발생에 대한 10개의 상이한 출발점을 발생시켰다. 최고 평균 점수를 가진 마커를 선택하였으며, 따라서 프로파일을 10개의 최상의 식별 CCS 마커까지 감소시켰다. 10개의 CCS 마커를 사용하여, 추가의 36개의 ERA 시료(18명의 R 및 18명의 NR)를 프로브하였다. 모든 데이터(30명의 R 및 30명의 NR)를 조합하고, 동일한 로지스틱 회귀 및 점수 계산 분석을 사용하여, MTX R을 NR로부터 구별한 5개의 CCS 마커 시그너처(IFNAR1, IL-21R, IL-23, IL-17A 및 CXCL13)를 나타내었다(도 2C). CXCL13 및 IL-17A 유전자좌에서 CCS는 비-반응자와 연관이 있었던 한편, IFNAR1, IL-23 및 IL-21R 유전자좌에서 CCS는 반응자와 연관이 있었다. 이는, 인간 자가면역에서 IL-17 축에 대해 가정된 중심 역할을 고려하면, 매력적인 프로파일이었다.
중요하게는, 계층화 시그너처의 조성물은 MTX 반응을 확인하기 위한 중요한 중요성의 유전적 위치를 잠재적으로 조절하는 염색체 구조의 위치를 확인시켜 준다. 5개의 분류화 EpiSwitch™ CCS 마커들에 대한 바이너리 점수의 주성분 분석(PCA)은 ERA 환자들의 MTX 반응을 기반으로 ERA 환자들의 명확한 분리를 제공하였다(도 2D). 모델은 반응자 및 비-반응자에 대한 예측 확률 점수를 0.0098 내지 0.99(0 = 반응자, 1 = 비-반응자) 범위로 제공하였다. 컷 오프 값을 반응자에 대해 ≤0.30 및 비-반응자에 대해 ≥0.70에서 설정하였다. ≤0.30의 점수는 92% (95% 신뢰 구간 [95% CI] 75-99%)의 진양성율을 가진 한편, ≥0.70의 점수는 93% (95% CI 76-99%)의 진음성 반응율을 가졌다. 1개 반응 범주(MTX에 대한 R 또는 NR) 당 관찰된 환자 및 예측된 환자의 수는 표 6에 나타나 있다. EpiSwitch™ CCS 마커 모델을 이용하여, 53명의 환자(88%)를 반응자 또는 비-반응자로서 분류하였다.
[표 6]
Figure 112018007861735-pct00001
5개의 EpiSwitch™ CSS 마커를 확인한 로지스틱 분류화 모델의 '정확성' 및 '성능의 강건성'을 시험하기 위해, 150개의 ROC** 곡선(독특한 출발점이 있음)을, R 및 NR 데이터의 무작위 데이터 재시료화에 의해 발생시켰다(도 3A). 이는 데이터를 트레이닝 그룹(66%, 6000개의 공지된 클래스 시료와 동등함) 및 시험 그룹(34%, 3000개의 미공지된 클래스 시료와 동등함)으로 분할하였으며; 중요하게는, 교차 검증용 데이터에서는 동일한 분할이 전혀 나타나지 않는다. 모델의 평균 식별력(AUC; average discriminative ability)은 89.9%(95% CI 87-100%)이었으며, NR에 대한 평균 민감성(반응 우세에 대해 조정됨)은 92%이고, R에 대한 평균 특이성은 84%이었다. 모델의 예측 능력을 확인하기 위해, 평균 모델 정확성 통계를 베이스 우세 정리(Bayes prevalence theorem)를 사용하여 MTX에 대한 집단 R/NR에 대해 조정하였다21. 55% MTX 반응률을 사용하여, 양성 예측 값(PPV)은 90.3%인 한편, 음성 예측 값(NPV)은 86.5%이었다. 반응률이 60%까지 조정된다면, 이는 PPV를 87%까지 감소시킨 한편, NPV를 89%까지 증가시켰다.
**주: ROC는 수신자 조작 특징을 의미하고, ROC 곡선을 지칭한다. ROC 곡선은 바이너리 분류 시스템의 성능을 예시하는 그래픽 플롯이며, 이의 판별 역치는 다양해진다. 이러한 곡선은, 다양한 역치 세팅에서 위양성율에 대한 진양성율을 플롯화함으로써 만들어진다.
선택된 5개의 EpiSwitchTM CCS 마커의 식별력의 독립적인 평가로서, 30 HC를 혼입하는 혼합 데이터의 인자 분석(FAMD)을 수행하였다. 이는, 시그너처가 MTX R과 NR 사이에서 구별하는 파워를 갖고 있을 뿐만 아니라, 건강한 개체와 RA 환자 사이에서 구별하는 충분한 질병-특이적인 특징을 보유한다(도 3B).
실시예 1 - 표 8a - RA-MTX 반응자와 비-반응자 사이의 계층화
이하 제시되는 표 8a, 및 연속 표 8b는 특히 약 54개의 DNA 프로브(60량체) 및 이들의 DNA 서열의 리스트를 보여준다. 이들 프로브는 실시예 1에 사용된 프로브들 중 일부를 나타낸다. 결부시키고자 하는 것은 아니지만, 표 8a+8b에 예시된 프로브들 중 대부분은 RA-MTX 반응자와 RA-MTX 비-반응자 사이에서 계층화에 유의하고/유용한 경향이 있는 것으로 생각된다. 나타낸 프로브를 PCR에 의해 더 조사하였다. P 값 = 확률 값; adj. = 조정된.
실시예 1 - 결론
결론적으로, R/NR에 대한 유망한 임상적 평가를 기반으로 한 DMARD 네이브 ERA 환자의 후성유전자 프로파일 분류에 대한 본 발명자들의 연구는 일관된 후성유전자 시그너처를 확인해 주었으며, 이러한 시그너처는 MTX 반응에 도움이 되는 후성 유전자 상태 및 도움이 되지 않는 후성유전자 상태를 식별한다. 이는 본 발명자들이 알기로는, 질병과 관련이 있으며(건강한 대조군과 비교하여) 제1선 MTX 치료법에 대한 비반응성을 예측할 수 있는 초기 RA 환자에서 안정하고 선택적으로 구별하는 혈액 기반 후성유전자 바이오마커의 최초의 예이다. 이 모델은 5개의 조건부 CCS 및 산업적인 ISO-13485 EpiSwitch™ 플랫폼에 의한 이들의 검출을 기반으로 한 타당성 있는 분류자를 이용한 직접적이고 실질적인 이득을 제공하며, 머지 않은 미래에 임상 실시 내에서 일상적으로 이용 가능할 잠재성을 가진다. 중요하게는, 이러한 예측성 시그너처를 채택함으로써, MTX 네이브 ERA 환자를 R 및 NR 코호트로 계층화하는 것이 가능해야 한다. 이는 효과적인 치료제를 보다 조기에 사용하려는 ERA에 대한 현재 승인된 치료 전략을 통해 환자의 진전을 가속화하는 잠재성을 제공하여, '개인화된' 치료 섭생을 초래한다. 더욱이, 클리닉에서 패스트-트랙 생물학적 치료 섭생을 정당화하는 데 사용될 수 있는 대안적인 CCS 시그너처가 RA 환자(및 다른 자가면역 질병을 가진 환자)에 존재한다고 생각할 수 있다. 이는 엄청나게 큰 사회 경제적인 영향을 가질 것이며, 보다 비용 효과적이고 강력한 치료적 접근을 제공할 것이다.
실시예 1 - 재료 및 방법
실시예 1 - RA 환자 집단
이 연구에서 ERA 환자는 스코틀랜드 초기 류마티스 관절염(SERA) 시작 코호트의 일부이다. 인구통계학적, 임상적 및 면역학적 인자들을 진단 시 및 6개월째에 수득하였다(표 2). 시작 코호트에의 포함은, 스코틀랜드에서 2차 류마티스 의료 기관에서 구별되지 않는 다발 관절염 또는 RA(≥1 부어오른 관절)의 임상적 진단을 기반으로 하였다. 배제 기준은 이전의 또는 현재의 DMARD/생물학적 치료법 및/또는 현재 구축된 대안적인 진단(즉, 건선성 관절염, 반응성 관절염)이었다. 이 연구에의 포함은, 중간 내지 높은 질병 활성(DAS28 ≥ 3.2)을 가진 RA(2010 ACR/EULAR 기준을 충족함)의 진단, 및 MTX를 이용한 후속적인 단독요법을 기반으로 하였다[DAS28 = 28개 관절의 질병 활성 점수. EULAR = 유럽 류마티스 학회. ACR = 미국 류마티스학 대학]. 반응자를 MTX를 수여 받았을 때 6개월째에 DAS28 경감(DAS28 <2.6) 또는 양호한 반응(>1.2의 DAS28 개선 및 DAS28 ≤3.2)을 달성한 환자로서 정의하였다. 비-반응자는 MTX를 수여 받았을 때 6개월째에 DAS28에서 개선이 없음(≤0.6)을 달성한 환자로서 정의하였다. 혈액 시료를 진단 시(기준선) EDTA 튜브에 수합하고, 원심분리하여, PBMC를 함유한 버피(buffy) 층을 수득하고, 이 층을 수합하고, -80℃에 보관하였다. 지역 윤리 위원회는 연구 프로토콜을 승인하였으며, 모든 환자는 연구 등록 전에 고지에 입각한 동의서를 제공하였다.
실시예 1 - EpiSwitch TM 프로세싱, 어레이 및 PCR 검출. EpiSwitch TM 검정법에 대한 프로브 설계 및 위치
패턴 인지 방법을 사용하여, 인간 게놈에서 전사 단위와 관련된 인간 게놈 데이터를 분석하였다. 등록 EpiSwitch TM 패턴 인지 소프트웨어18 , 20는, 영역이 염색질 상호작용에 관여하는 확률(probabilistic) 점수를 제공한다. 123개의 유전자좌 유래의 서열을 다운로드하고, 처리하여, 13,322개의 가장 가능성 있는 염색체 상호작용의 리스트를 만들었다. 이들 잠재적인 상호작용을 조사하기 위해 60량체 프로브를 설계하고, 주문 어레이로서 Agilent SureDesign 웹사이트에 업로드하였다. 서열-특이적인 올리고뉴클레오타이드를, 네스티드(nested) PCR에 의해 잠재적인 마커를 스크리닝하기 위한 선택된 부위에서 프라이머323을 사용하여 설계하였다. 올리고뉴클레오타이드를, 올리고뉴클레오타이드 특이적인 BLAST를 사용하여 특이성을 시험하였다.
실시예 1 - 환자 PBMC로부터의 염색질 구조 시그너처 분석
주형 제조: 각각의 PBMC 시료 50 ㎕로부터 염색질을 EpiSwitchTM 검정법을 제조업체(Oxford BioDynamics Ltd)의 지시에 따라 사용하여 추출하였다. 간략하게는, 고차 구조를 포름알데하이드를 이용하여 고정시키고, 염색질을 추출한 다음, TaqI을 이용하여 분해하고, 희석시킨 다음, 분자내 결찰을 최대화하는 조건에서 결찰하고, 후속적으로 프로테이나제 K를 처리하였다. EpiSwitch TM 마이크로어레이 : EpiSwitch TM 마이크로어레이 하이브리드화를, Agilent 시스템을 사용하는 주문 Agilent 8x60k 어레이를 제조업체(Agilent)의 지시에 따라 사용하여 수행하였다. 각각의 어레이는 55,088개의 프로브 스팟을 함유하였으며, 이는 EpiSwitch TM 패턴 인지 소프트웨어에 의해 4벌 중복되고, + EpiSwitch TM 및 Agilent 조절에 의해 예측된 13,322개의 잠재적인 염색체 상호작용을 나타낸다. 간략하게는, EpiSwitch TM 시료 1 ㎍을 Agilent SureTag 표지 키트를 사용하여 표지하였다. 표지된 DNA의 가공을 수행하였다. 세척 직후 Agilent 스캐너 및 소프트웨어를 사용하여 어레이 분석을 수행하였다. 모든 실험들을 비교하기 위해, 데이터를 백그라운드 보정하고, 정상화하였다. 어레이 내의 각각의 스폿이 4벌 중복되어 존재하기 때문에, 어레이 내 각각의 프로브의 4개 스팟의 중앙값을 계산하고, 이의 log2 변환 값을 추가의 분석에 사용하였다. 변동 계수 및 p-값을 각각의 프로브 복제물에 대해 계산하였다. EpiSwitch TM PCR 검출: 올리고뉴클레오타이드를 주형 상에서 시험하여, 각각의 프라이머 세트가 올바르게 작동하고 있었는지 확인하였다. 기술적 및 중복적인 변화에 맞추기 위해, 각각의 시료를 4회 처리하였다. 이들 4개의 복제물 유래의 모든 추출물들을 풀링하고, 마지막의 네스티드 PCR을 각각의 시료 상에서 수행하였다. 이 절차는 제한된 복사수의 주형을 보다 높은 정확도로 검출할 수 있게 하였다24. 모든 PCR 증폭된 시료를 LabChip DNA 1K Version2 키트(Perkin Elmer)를 사용하는 Perkin Elmer사의 LabChip® GX에서 전기영동에 의해 시각화하고, 내부 DNA 마커를, 형광 염료를 제조업체의 프로토콜에 따라 사용하여 DNA 칩 상에 로딩하였다. 형광을 레이저에 의해 검출하고, 전기영동도 판독 결과를 장비 소프트웨어를 사용하여 겔 사진 상의 시뮬레이션된 밴드로 번역하였다. 본 발명자들이 밴드에 대해 양성으로 간주할 것으로 설정한 역치는 30개 이상의 형광 단위이었다.
실시예 1 - 통계학적 방법 및 패키지
GraphPad Prism 및 SPSS를 임상 데이터의 모든 통계학적 분석에 사용하였다. 치-스퀘어 시험 및 피셔의 정확한 시험(범주의 변량에 대해), 독립적인 시료(연속적인 정상적으로 분포된 변량에 대해)에 대한 t-테스트 및 만 휘트니 U 테스트(정상 분포가 없는 연속 변량에 대해)를 사용하여, 차이를 확인하였다. 통계학적 유의성의 수준을 0.05에서 설정하였으며, 모든 시험들은 2-사이드였다. R(및 적절한 패키지)을 EpiSwitch™ 데이터의 평가에 사용하였다. 이는, 치 스웨어 테스트 및 GLM(로지트(logit))에 대한 Stats 패키지, WEKA 오즈 확률로부터의 ROC 곡선에 대한 ROCR 패키지, 히트맵에 대한 R에서 gplot & stats 패키지를 포함하였다. FactorMiner 패키지를 PCA 및 인자 플롯에 사용하였다. Weka를 속성 감소(Attribute Reduction), 데이터 무작위화 및 재시료화, 로지스틱 모델 분류기, AUC 계산 및 모델 정확성 계산에 사용하였다.
실시예 1 및 본 특허 명세서 모든 부분에 대한 참조문헌
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실시예 1A - RA 분석: MTX 반응자 vs. 비-반응자, 및 RA vs. 건강한 대조군: 실시예 1에 후속적인 작업
실시예 1 이후, 실시예 1A에서, 생물통계학적 초기하학적 분석을 본 명세서의 실시예 부문의 시작에서 "통계학적 파이프라인" 방법(들)을 사용하여 수행하여, RA 환자에 대한 MTX 단독요법에 대한 MTX 반응자 vs. MTX 비-반응자 사이의 보다 개량된 DNA 프로브 계층화를 생성하였다.
실시예 1A 결과: 이하 표 7(파트 a 및 연속 파트 b)은 RA-MTX에 대한 프로브 및 유전자좌 데이터 - 반응자(R)와 비-반응자(NR) 사이의 DNA 프로브 계층화를 개시한다. B = B-통계학적(lods 또는 B), 이는 유전자가 차별적으로 발현된 로그-오드(log-odd)이다. FC는 비-로그 배수 변화이다. FC_1은 약 0을 중심으로 한 비-로그 배수 변화이다. 표 7a는 초기하학적 분석으로부터, MTX 반응자 (MTX-R)를 확인하기 위한 25개의 개량된 바람직한 DNA 프로브(60량체) 및 MTX 비-반응자(MTX-NR)를 확인하기 위한 24개(또는 25개)의 개량된 바람직한 DNA 프로브(60량체)를 포함하는 것으로 보인다. 이하, 표 9(파트 a, b 및 c)는 RA 환자 vs. 건강한 대조군 (HC)의 초기하학적 분석으로부터 농화된 데이터를 개시하고 있으며, RA 환자에서의 MTX 반응에 관한 것은 아니다.
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SEQUENCE LISTING <110> Oxford BioDynamics Limited <120> Epigenetic Chromosome Interactions <130> P103197WO01 <140> PCT/GB2016/051894 <141> 2016-06-24 <160> 152 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 60 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 1 tgttttttgg ctgcataaat gtcttctttc gaaataatca tcaaaatatt tttcattgac 60 <210> 2 <211> 60 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 2 cacccccatc tccctttgct gactctcttc gatgaatcca tttttttgga aatagatgat 60 <210> 3 <211> 60 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 3 cacccccatc tccctttgct gactctcttc gaactgtggc aattttaact tttcaaattg 60 <210> 4 <211> 60 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 4 cacccccatc tccctttgct gactctcttc gaggcatgat ttgagtcttg acagaagttc 60 <210> 5 <211> 60 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 5 tgccagtatt ttattgagga tttttgcatc gagattgggt tgcatcatgt tggccaggct 60 <210> 6 <211> 60 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 6 tgttttttgg ctgcataaat gtcttctttc gaactcatgg gcacaagcaa tcctcccacc 60 <210> 7 <211> 60 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 7 tgccagtatt ttattgagga 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cagactgttc gaaatcggaa gcctctctga aggtccaagg 60 <210> 24 <211> 60 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 24 tgccagtatt ttattgagga tttttgcatc gaattcctgg gtttatatcc caatcattgt 60 <210> 25 <211> 60 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 25 cacccccatc tccctttgct gactctcttc gatattggtg tatattcaaa gggtacttga 60 <210> 26 <211> 60 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 26 tgatcactgt ttcctatgag gatacagctc gaggggcagg gggcggtcct gggccaggcg 60 <210> 27 <211> 60 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 27 aacttatgat tctaatcttg aatgtctgtc gatctatgag gaaatgcccc cagcctccca 60 <210> 28 <211> 60 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 28 cataatgcat gtgcatgaaa actaatcttc gatctatgag gaaatgcccc cagcctccca 60 <210> 29 <211> 60 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 29 atcagtaagc tggtcagcta cccatgaatc gatctatgag gaaatgcccc cagcctccca 60 <210> 30 <211> 60 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 30 gtgtcccaat ttctagtgca ctgtgaactc gacctcgcgg gaggggtgcc aggccgcatc 60 <210> 31 <211> 60 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 31 ccggggcttc tcgtttaaga attctttgtc gatctatgag gaaatgcccc cagcctccca 60 <210> 32 <211> 60 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 32 gtctttgaag aaggactaat gcttagtatc gagtgcagcg ccggtgggcc agcactgctg 60 <210> 33 <211> 60 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 33 gttcatttaa acattttatt atgtatattc gaggggccag gcttttatac ccccatctga 60 <210> 34 <211> 60 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 34 ttctccacag ccggccggtc cttggcagtc gaggggcagg gggcggtcct gggccaggcg 60 <210> 35 <211> 60 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 35 gcaacacata caacgactaa tcttcttttc gacgccgagg agctctgcag tgggggcgta 60 <210> 36 <211> 60 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 36 gtaggtgctg agtaagtgag cacttgcctc gaggggcagg gggcggtcct gggccaggcg 60 <210> 37 <211> 60 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 37 cagaaagacc ttgcaatcat acggtgcttc gacgccgagg agctctgcag tgggggcgta 60 <210> 38 <211> 60 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 38 tactgtgctg tgctcgtcaa agagtatgtc gatctatgag gaaatgcccc cagcctccca 60 <210> 39 <211> 60 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 39 cagaaattaa tcaaatgcaa gtgcaccctc gaccacccaa gggctgagga gtgcgggcac 60 <210> 40 <211> 60 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 40 aagggaccta gtcccctatt aagatttctc gaggggccag gcttttatac ccccatctga 60 <210> 41 <211> 60 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 41 cctgccgaga cacgggacgt gggattgctc gatctatgag gaaatgcccc cagcctccca 60 <210> 42 <211> 60 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 42 ccaaagctcg ctttcttaac cactatgctc gaggggccag gcttttatac ccccatctga 60 <210> 43 <211> 60 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 43 tgaattgtgt agcgtaagaa tttatatctc gaagtttgtg aactggcagg tggacgggga 60 <210> 44 <211> 60 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 44 acctgatctg gggaagatta ggaattgttc gaaaccaatt tcctgggatg ggggtggggg 60 <210> 45 <211> 60 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 45 gcaagaggat ctcttgaggc ccaggagttc gaggggccag gcttttatac ccccatctga 60 <210> 46 <211> 60 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 46 tatcaagtga tccaaaaggc tgccagtgtc gaggggcagg gggcggtcct gggccaggcg 60 <210> 47 <211> 60 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 47 aagggaccta gtcccctatt aagatttctc gaaaccaatt tcctgggatg ggggtggggg 60 <210> 48 <211> 60 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 48 tatggacttt gtagtctcat atcaaagctc gaaaccaatt tcctgggatg ggggtggggg 60 <210> 49 <211> 60 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 49 aaaaataatc tggctctaca cttaggattc gaaaccaatt tcctgggatg ggggtggggg 60 <210> 50 <211> 60 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 50 tgatcactgt ttcctatgag gatacagctc gaggggcagg gggcggtcct gggccaggcg 60 <210> 51 <211> 60 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 51 aacctggaga acgccaagcg cttcgccatc gaggggcagg gggcggtcct gggccaggcg 60 <210> 52 <211> 60 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 52 ctacctttgt ggcacttggt acagcaaatc gacgggcccc gtgaggcggg ggcgggaccc 60 <210> 53 <211> 60 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 53 catcaattat aactcacctt acagatcatc gacgggcccc gtgaggcggg ggcgggaccc 60 <210> 54 <211> 60 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 54 tgatcactgt ttcctatgag gatacagctc gaagattagg taaaggtggg gacgcggaga 60 <210> 55 <211> 60 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 55 gaaaggtaat tgcccccaat atttattttc gaaacagatc gggcggctcg ggttacacac 60 <210> 56 <211> 60 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 56 ttctccacag ccggccggtc cttggcagtc gaggggcagg gggcggtcct gggccaggcg 60 <210> 57 <211> 60 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 57 cgtgtcccaa tttctagtgc actgtgaact cgacctcgcg ggaggggtgc caggccgcat 60 <210> 58 <211> 60 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 58 cctctcttct aaaaggtctc aacatcactc gactggagag cccggggcct cgcgccgctt 60 <210> 59 <211> 60 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 59 gtttcccctt gatgctcaga gaaaggcctc gaaacagatc gggcggctcg ggttacacac 60 <210> 60 <211> 60 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 60 cataatgcat gtgcatgaaa actaatcttc gatctatgag gaaatgcccc cagcctccca 60 <210> 61 <211> 60 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 61 agatgtgtaa gtcaccaggg agtgcattcg cgacctcgcg ggaggggtgc caggccgcat 60 <210> 62 <211> 60 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 62 gtaatggtgc catcatagct caagctcctc gatctatgag gaaatgcccc cagcctccca 60 <210> 63 <211> 60 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 63 aatacaaagg atggtatatt ttgcatattc gatctatgag gaaatgcccc cagcctccca 60 <210> 64 <211> 60 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 64 cctctcttct aaaaggtctc aacatcactc gatggtgcgg gaggtggccg gcagggttgg 60 <210> 65 <211> 60 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 65 ataattcttc ctggcacata ataagtattc gaatcgggcg ggttccggcg tgggtttcag 60 <210> 66 <211> 60 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 66 tctaaaggga tttccactat atgtagattc gaggggcgtg tgcgcgcgtg gcggggcccg 60 <210> 67 <211> 60 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 67 aacttatgat tctaatcttg aatgtctgtc gatctatgag gaaatgcccc cagcctccca 60 <210> 68 <211> 60 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 68 gaggtgggca gatcacgggg tcagggtatc gaggcccatc actggcgggg agacgggagg 60 <210> 69 <211> 60 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 69 actgaatatg aaaaaaaatg taaaaattat cgacctcgcg ggaggggtgc caggccgcat 60 <210> 70 <211> 60 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 70 gattttatag caaatttaca aaaatgagtc gatctatgag gaaatgcccc cagcctccca 60 <210> 71 <211> 60 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 71 accaagagtt ggaccccctt tttgatgttc gatggtgcgg gaggtggccg gcagggttgg 60 <210> 72 <211> 60 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 72 tatattgcta tctactagca aaggataatc gaagaggttc agggcggtgc ccgcggcgct 60 <210> 73 <211> 60 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 73 atcagtaagc tggtcagcta cccatgaatc gatctatgag gaaatgcccc cagcctccca 60 <210> 74 <211> 60 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 74 tgaaaacagt tcatcctgag tttcagtctc gaagattagg taaaggtggg gacgcggaga 60 <210> 75 <211> 60 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 75 gtgcagagcg agagcggggc agaggcggtc gaaactggga gaattcatct gaaatgatta 60 <210> 76 <211> 60 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 76 gaggcaggca gatcatgagg tcaggagttc gagccctgga ccccaggcca gctaatgagg 60 <210> 77 <211> 60 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 77 gctcactgca acctccacct cccaggttcg cgaacctcct gataacttca gcattaacag 60 <210> 78 <211> 60 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 78 agggtcttgc tatgttgccc aggctggcct cgagatcagc ctgggcaaca cggtgaaaac 60 <210> 79 <211> 60 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 79 tgtaatataa gcatagctca ctgcagcctc gaagcatttg tacgacattc tcatcttctt 60 <210> 80 <211> 60 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 80 acagaggagc gaggcccgat ccttactttc gaactcctga cctcgtgatc tgcccacctc 60 <210> 81 <211> 60 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 81 gggtttcacc atgttagcca ggatggtctc gatctcctga cctcatgatc cgcctgcctc 60 <210> 82 <211> 60 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 82 gcatttcacc atgttggtga ggctggtctc gaagagttca cacgtgtcca aatttggtgg 60 <210> 83 <211> 60 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 83 ctgggatcac aggcatgtgc caccatgctc gacaagaata gtctccttgt ttctgaacat 60 <210> 84 <211> 60 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 84 gtatttctgg ttctagatcc ttgaggaatc gagcagaagg agtctctccc tgaggccacc 60 <210> 85 <211> 60 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 85 cgaggcgggc ggatcacgag gtcaggagat cgacccccac gttctcacca cctgtttctt 60 <210> 86 <211> 60 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 86 gtatttctgg ttctagatcc ttgaggaatc gacctcctgg gctcaaccta tcctcccacc 60 <210> 87 <211> 60 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 87 gggtttcact gtgttagcca ggatggtctc gacctccctg gctcaagtga tcttcccacc 60 <210> 88 <211> 60 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 88 tgccctagag atctgtggaa ctttgaactc gatatatgaa aatagttttt taattataaa 60 <210> 89 <211> 60 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 89 ggtgggggaa tcacttgagg tcagaagttc gagaccatcc tgggcaacat ggtaaaaccc 60 <210> 90 <211> 60 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 90 aatggcacga tcacggctca ctgcagcctc gaatgttact gacagtggac acagtaagaa 60 <210> 91 <211> 60 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 91 gagttttgcc atgttgccca ggctggtctc gagaacagcc tggccaacat ggtgaaaccc 60 <210> 92 <211> 60 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 92 aggtctcact atgttgcccg ggctggtctc gacgccgagg agctctgcag tgggggcgta 60 <210> 93 <211> 60 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 93 gggtttcacc atgttggcga ggctggtctc gaactcctga cctcaggtga tccgcctgcc 60 <210> 94 <211> 60 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 94 ggtgggtgga tcacctgagg tcaggagttc gacctaaggg tggtcataat tctgctgctg 60 <210> 95 <211> 60 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 95 gggtctcaca gccttcagag ctgagagcct aggcttcagt gagccataat cacgccacta 60 <210> 96 <211> 60 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 96 ctttgggagg ccaaggtgag tggattgctc gacatctcat ttgataggat taagtcaacg 60 <210> 97 <211> 60 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 97 aggtctcact atgttgcccg ggctggtctc gaacagcagc gtgtgcgccg acagcgcgcc 60 <210> 98 <211> 60 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 98 tctgtcgccc aggttggagt acagtggctc gaggatgtcc tattttgcca ccttatctaa 60 <210> 99 <211> 60 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 99 ttatatctcc tacctccaag cctggcagtc gattccaaag tgaagcaaaa aaaaaacttc 60 <210> 100 <211> 60 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 100 aaagaccctg tctctaaata aatagaacat cgagatcatg ccactgcact ccagcctggg 60 <210> 101 <211> 60 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 101 ggggtttttc catgttagtc aggctggtct aatggctccc ttaccttgct ggctgtgggc 60 <210> 102 <211> 60 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 102 agtggcatga tcacagctca ctgccacctc gaaaccaaac cctgtgactt caacacccaa 60 <210> 103 <211> 60 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 103 ccctccctca acatgcaggg attacaattc gaagatggtc tgaaggaagc aattgggaaa 60 <210> 104 <211> 60 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 104 tatataattt ccactttgtt tttaataatc gaaacataac tgttctaaaa tatgtcaagt 60 <210> 105 <211> 60 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 105 tgctgaaaga aaacacaatt tatttaagtc gagaccatcc tagctaacac ggtgaaaccc 60 <210> 106 <211> 60 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 106 gttttaacat ttaaagataa aatccccatc gaacccaggg aggcagaggt agcagtgagc 60 <210> 107 <211> 60 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 107 agctgattgt gtaactctca gtctgagctc gaacccaggg aggcagaggt agcagtgagc 60 <210> 108 <211> 60 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 108 gggaaataaa tattatgaag ctttagtgtc gaacccaggg aggcagaggt agcagtgagc 60 <210> 109 <211> 60 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 109 taccaggaag atattttata aatgaatgtc gaagacagtt ttgagatttg cttttcctag 60 <210> 110 <211> 60 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 110 taagtgggag aaaagacaaa gatttctctc gaggtgagcg gatcacctga ggtcaggagt 60 <210> 111 <211> 60 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 111 agatcttaaa gcaagctaaa agagctattc gaacccaggg aggcagaggt agcagtgagc 60 <210> 112 <211> 60 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 112 tctccttttg ggcacatagg acataaaatc gaacccaggg aggcagaggt agcagtgagc 60 <210> 113 <211> 60 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 113 ttcattcccg caaaagggtc atatatactc gaacccaggg aggcagaggt agcagtgagc 60 <210> 114 <211> 60 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 114 atactgacac actattccac ccacaaagtc gaacccaggg aggcagaggt agcagtgagc 60 <210> 115 <211> 60 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 115 ctaatgtgct agtttgtcca catattaatc gagcctgcag tgagccatga tcatgccact 60 <210> 116 <211> 60 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 116 ttctttcttt aagctttgct tctatcattc gagataattt agaattaaga aggaataaac 60 <210> 117 <211> 60 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 117 aggttttgcc aagttggctg ggatggtctc gagaccagcc tgaccaacat ggagaaaccc 60 <210> 118 <211> 60 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 118 ggaaccaaac tggaattcag gagacaattc gaacccaggg aggcagaggt agcagtgagc 60 <210> 119 <211> 60 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 119 cacattaaca cctgtcaata aacaggattc gaacccaggg aggcagaggt agcagtgagc 60 <210> 120 <211> 60 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 120 gtacaaagaa gtgatgtagc atgtcctgtc gaacccaggg aggcagaggt agcagtgagc 60 <210> 121 <211> 60 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 121 tatataattt ccactttgtt tttaataatc gaaggacata tgatgggtgt ggctcgcctg 60 <210> 122 <211> 60 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 122 agaaatgagt caggttcaat gaattgtctc gagaccatca tggctaacac ggtgaaaccc 60 <210> 123 <211> 60 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 123 caagtggatg ggacacccac catgtccctc gaacccaggg aggcagaggt agcagtgagc 60 <210> 124 <211> 60 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 124 aatctttcat gaggaggcaa tcaagatgtc gactgctgtg ctagcaatga gcgaggctcc 60 <210> 125 <211> 60 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 125 gaagtcaccg tcggcaggtt ctgctgcttc gaacccaggg aggcagaggt agcagtgagc 60 <210> 126 <211> 60 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 126 gtcaaacctt tgaaaactgc agctccagtc gactgctgtg ctagcaatga gcgaggctcc 60 <210> 127 <211> 60 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 127 gttgtgacaa ttttcacaga agcgttgttc gaacccaggg aggcagaggt agcagtgagc 60 <210> 128 <211> 60 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 128 aatgcttatg ttctaattcc aaaaggaatc gagcctgcag tgagccatga tcatgccact 60 <210> 129 <211> 60 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 129 gctctgtcaa gaagacagag caaggtcttc gagcctgcag tgagccatga tcatgccact 60 <210> 130 <211> 60 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 130 gggtttcacc gtgttagcca ggatggtctc gagaccatcc tggctaacat ggtgaaacca 60 <210> 131 <211> 60 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 131 atataaatta catgtcaaga agataatgtc gagaccatcc tgaccaacat ggtgaaacct 60 <210> 132 <211> 60 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 132 catgatagtt aagagatcat atctagaatc gattctctat ttcatttatt tccactgtaa 60 <210> 133 <211> 60 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 133 gggtttcacc atattggcca ggctggtctc gagaccagcc tggccaacat ggtgaaaccc 60 <210> 134 <211> 60 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 134 aggttttgcc aagttggctg ggatggtctc gagaccatcc tggccaacat ggtgaaaacc 60 <210> 135 <211> 60 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 135 ggctggcaga tcacctaagg tcaggcattc gagagcatga aataaagact tgttaaggct 60 <210> 136 <211> 60 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 136 gagtgattgt ggttccgagg tcaggaggtc gacatatttc ctgttccctt ggaataaaaa 60 <210> 137 <211> 60 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 137 tccaggtact tctcttagcc ttatggcttc gatgtgagag gcactctctt tcactaatag 60 <210> 138 <211> 60 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 138 ggttttcacc atgttggcca ggatggtctc gagaccagcc tggccaacat ggtgaaaccc 60 <210> 139 <211> 60 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 139 tttatatttt aaaaatttgg gttttttttc gaggctgcaa tgagccatga tcacaccact 60 <210> 140 <211> 60 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 140 tgctgaaaga aaacacaatt tatttaagtc gaataaatgt gtggctatct tacagtgatt 60 <210> 141 <211> 60 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 141 gggtttcacc atgttagcca ggatggtctc gagaccagcc tggccaacat ggtgaaaccc 60 <210> 142 <211> 60 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 142 gagtttcacc atgttgacca ggctggtctc gagatcagcc tgggcaacat ggtgaaaccc 60 <210> 143 <211> 60 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 143 gggaggactg gatcaggaat ctgtgtcttc gaacccaggg aggcagaggt agcagtgagc 60 <210> 144 <211> 60 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 144 tacaacaatt aagatatcac ctatattctc gagaccatcc tagctaacat ggtgaaatct 60 <210> 145 <211> 60 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 145 gagggaaaaa tactaaggcc actaaaaatc gagaccatcc tggacaacat ggagaaacac 60 <210> 146 <211> 60 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 146 gggttttaac atattggcca ggctggtctc gagaccagcc tggccaatgt ggtgaaaccc 60 <210> 147 <211> 60 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 147 ggatttcacc atgttggcca ggctggtctc gagaccagcc tggccaacat ggtgaaaccc 60 <210> 148 <211> 60 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 148 gtttattgca gcattggcct gtggagactc gagcctgcag tgagccatga tcatgccact 60 <210> 149 <211> 60 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 149 aaacgggacc agcagcgcta ctcaggcctc gactgctgtg ctagcaatga gcgaggctcc 60 <210> 150 <211> 60 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 150 ccatgttggt caggctggtc tcaaactctc gagaccagcc tggccaacat ggtgaaaccc 60 <210> 151 <211> 60 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 151 gggtttctcc atgctggtca ggctggtctc gagaccagcc tggccaacat ggtgaaaccc 60 <210> 152 <211> 60 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 152 gggtttcgcc atgttggcca ggctggtctc gagaccagcc tggccaacat ggtgaaaccc 60

Claims (20)

  1. 류마티스 관절염에 특이적인 치료법에 반응성이 있는 인간 피험체를 선택하는 방법으로서, 상기 방법은 인간 피험체로부터의 샘플에서
    -제1 염색체 상호작용의 부존재
    -제2 염색체 상호작용의 존재
    -제3 염색체 상호작용의 부존재
    -제4 염색체 상호작용의 존재 및
    -제5 염색체 상호작용의 존재를 검출하는 것을 포함하고,
    특이적인 치료법에 반응성이 있는 인간 피험체를 선택하는 것은
    -제1 염색체 상호작용의 부존재
    -제2 염색체 상호작용의 존재
    -제3 염색체 상호작용의 부존재
    -제4 염색체 상호작용의 존재 및
    -제5 염색체 상호작용의 존재의 검출에 기반한 것이고,
    -제1 염색체 상호작용은 CXCL13 유전자에 있는 것이고, 프로브 (a) TTATATCTCCTACCTCCAAGCCTGGCAGTCGATTCCAAAGTGAAGCAAAAAAAAAACTTC에 상응하는 마커 CXCL13_Site1_Site3_RR에 관한 것이고;
    - 제2 염색체 상호작용은 IFNAR1 유전자에 있는 것이고, 프로브 (b) GTGCAGAGCGAGAGCGGGGCAGAGGCGGTCGAAACTGGGAGAATTCATCTGAAATGATTA에 상응하는 마커 IFNAR1_Site2_Site4_RR에 관한 것이고;
    - 제3 염색체 상호작용은 IL-17A 유전자에 있는 것이고, 프로브 (c) CCCTCCCTCAACATGCAGGGATTACAATTCGAAGATGGTCTGAAGGAAGCAATTGGGAAA에 상응하는 마커 IL_17_Site3_Site1_RR에 관한 것이고 ;
    - 제4 염색체 상호작용은 IL21R 유전자에 있는 것이고, 프로브 (d) GAGGCAGGCAGATCATGAGGTCAGGAGTTCGAGCCCTGGACCCCAGGCCAGCTAATGAGG에 상응하는 마커 IL-21R_Site5_Site2_RR에 관한 것이고; 및
    - 제5 염색체 상호작용은 IL-23 유전자에 있는 것이고, 프로브 (e) AGTGGCATGATCACAGCTCACTGCCACCTCGAAACCAAACCCTGTGACTTCAACACCCAA에 상응하는 마커 IL23_Site4_Site5_FR에 관한 것이고;
    류마티스 관절염에 특이적인 치료법은 메토트렉세이트 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염을 포함하고,
    염색체 상호작용의 존재 또는 부존재를 검출하는 것이,
    (i) 염색체 상호작용에 함께 회합된, 샘플의 염색체 영역들을 시험관내 가교시키는 단계;
    (ii) 상기 가교된 DNA를, 효소를 이용하여 제한 분해 절단하는 단계;
    (iii) 상기 가교 절단된 DNA 말단들을 결찰하여 결찰된 핵산을 형성하는 단계; 및
    (iv) 프로브 (a), (b), (c), (d) 및 (e)를 사용하여, 염색체 상호작용에 상응하는 결찰된 핵산의 존재 또는 부존재를 검출하는 단계를 포함하는 방법에 의한 것인 방법.
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