CN109837340B

CN109837340B - 用于肺癌无创诊断的外周血基因标记物

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Publication number: CN109837340B
Application number: CN201711195177.1A
Authority: CN
Inventors: 顾万君; 殷晓峰
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2017-11-24
Filing date: 2017-11-24
Publication date: 2023-01-10
Anticipated expiration: 2037-11-24
Also published as: CN109837340A

Abstract

本发明涉及肿瘤基因检测领域，公开了一组识别肺癌个体的外周血生物标记物及其应用。该组外周血生物标记物为由30个基因组成的组合。该组外周血生物标志物可以用于制备诊断肺癌、跟踪肺癌疗效和筛查肺癌复发的试剂盒。与其它相关标志物相比，本组标志物具有稳定性高、易检测、无创、高准确性和高特异性的优势。

Description

用于肺癌无创诊断的外周血基因标记物

技术领域

本发明属于肿瘤基因检测领域，尤其是涉及识别肺癌个体的外周血生物标记物，及其在肺癌诊断、风险预测、复发监测、治疗效果辅助判断中的应用，以及用于检测所述生物标记物的诊断试剂盒。

背景技术

肺癌是发病率和死亡率增长最快，对人群健康和生命威胁最大的恶性肿瘤之一。我国的癌症调查表明，男性肺癌发病率和死亡率均占所有恶性肿瘤的第一位，女性发病率占第二位，死亡率占第二位。随着环境、吸烟等相关因素的进一步影响，肺癌的发病率还将会进一步提高。尽管肺癌具有较高的发病率和致死率，但肺癌的诊治仍然是世界性难题。尽管过去十年肺癌治疗的新靶点和新作用机制的抗肿瘤药物不断涌现，但这些抗肿瘤药物对肺癌患者仍只能起到缓解病情的作用。目前，早期发现并手术治疗仍然是唯一有可能治愈肺癌的最有效手段。

由于肺癌在早期没有明显的临床特征，肺癌的发现非常困难。目前常见的肺癌筛查办法是基于影像学技术(比如低剂量螺旋CT)进行肺部筛查。但是，很多早期肺癌患者并没有发生影像学技术能够分辨的表型变化，这使得基于影像学技术的肺癌早期发现很难实现。同时，发现的疑似患者很难与具有类似影像学特征的其他肺部疾病患者区分。这一部分病人大多需要进行组织病理检测来进行确诊，但是肺部组织的获取在临床上通常难以实现。因此，目前临床上迫切需要在影像学技术之外开发一种无创检测技术，能够在临床上区分早期肺癌患者和正常人群以及患有其他肺部疾病的疑似患者。

对外周循环血中的核酸或者蛋白质的检测为临床提供了一种很好的无创检测技术。目前，通过外周循环血进行无创肿瘤检测的技术主要分为三种。第一种是利用微流体技术和其它相关技术从外周循环血中筛选出循环肿瘤细胞(Circulating Tumor Cell，CTC)，然后通过对CTC中的核糖核酸(DNA或者RNA)鉴定肿瘤的分型等信息。这种方法的有效性依赖于是否能够在外周循环血中筛选出CTC。目前，CTC分离技术本身的限制以及肿瘤细胞出现在外周循环血中的时间使得这种方法对于早期肿瘤诊断的敏感性并不高。第二种方法是利用高通量DNA检测技术检测外周循环血中存在的游离肿瘤DNA(Cell free Tumor DNA，ctDNA)。这种方法能够早期发现肿瘤细胞释放到循环血中的游离DNA，但是由于循环血中存在的DNA主要是正常血细胞中的DNA以及其它组织和细胞游离在循环血中的DNA，要从很强的背景DNA信息中准确区分ctDNA的信号需要很高的测序深度。同时，这种方法由于背景信号非常强，使得检测所得结果的可靠性并不高。第三种办法就是对外周循环血中表达的核酸或者蛋白质进行测定，通过个体不同表型状态下外周循环血中所表达出的差异核酸或者蛋白质的鉴定来实现无创检测的目的。最近的一些研究表明，基于外周循环血中基因表达量的检测技术能够实现临床样本的无创检测。肿瘤发病早期，机体免疫系统可特异性识别肿瘤细胞内异常表达基因产物。因此，在肿瘤发生初期就可以在外周循环血中检测到机体对肿瘤细胞进行免疫作用的信号。这种方法具有易操作、检测成本低和所检测信号背景噪声小等优势，具有很好的应用前景。

发明内容

基于临床需求和肿瘤检测技术的特征，本发明通过采集和分析肺癌患者、其他肺部疾病患者和正常人群外周循环血中的基因表达水平数据，筛选出一组肺癌患者外周循环血中具有特异表达量的基因，并基于所述基因建立了肺癌诊断的打分模型，应用于肺癌的无创检测，而完成了本发明。

在对肺癌的诊断中，本发明具有显著进步。本发明诊断试验依赖于外周血中的基因表达谱，而非肿瘤细胞自身中的基因表达谱，可供进行性肺癌早期阶段的筛查、肺癌的辅助诊断、肺癌治疗中效果监测、肺癌复发监测等。

本发明的第一个方面是提供，用于肺癌筛查或诊断、肺癌疗效判断、肺癌复发监测的外周血生物标记物组。

根据本发明，所述的外周血生物标记物组，包括选自以下30个基因的至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30个基因，或所述基因的mRNA，或所述基因编码的蛋白质，所述30个基因为：APP基因、CaMK2G基因、CD93基因；GABARAPL1基因、MAK基因；MANSC1基因、MAP3K2基因、NBPF20基因、NBPF8基因、OSBPL1A基因、PRKDC基因、RPS6KA3基因、SLC37A3基因、SLCO3A1基因、TIAM2基因、TMX4基因、UBR4基因、UBTD1基因、ADA基因、C2CD2基因、CDKN1C基因、PRR5L基因、HLA-DOA基因、HLA-DPA1基因、HLA-DRB3基因、IDO1基因、OXTR基因、RARRES3基因、SSBP3基因和UBIAD1基因。

根据本发明，优选所述的外周血生物标记物组包含上述30个基因。

根据本发明，优选所述的外周血生物标记物组包含上述30个基因的mRNA。

根据本发明，优选所述的外周血生物标记物组包含上述30个基因编码的蛋白质。

根据本发明，优选所述的外周血生物标志物组由上述30个基因组成。

根据本发明，优选所述的外周血生物标志物组由上述30个基因的mRNA组成。

根据本发明，优选所述的外周血生物标志物组由上述30个基因编码的蛋白质组成。

所述30个基因、权重、名称、DNA、mRNA和蛋白质的说明如下表1所述。

根据本发明，相对于非肺癌人群(包括健康人群或其他肺病患者)，肺癌患者外周血中上述30个基因中的至少一种过表达或低表达(包括不表达)，通过检测受检个体中所述30个基因中的至少一种的表达量，与给定人群的相应基因表达水平进行比较，得到是否可能患有肺癌、或者肺癌治疗后是否有效或复发等的鉴定或检测结果。

术语“表达”和“基因表达”含义相同，是指细胞在生命过程中，把储存在DNA顺序中的遗传信息经过转录和翻译，转变成具有生物活性的蛋白质分子。

术语“表达增高”和“高表达”、“过表达”含义相同，是指与正常水平相比，基因转录的拷贝数增高，和/或翻译增高。

术语“表达降低”和“低表达”含义相同，是指与正常水平相比，基因转录的拷贝数降低，和/或翻译降低。

根据本发明，上述30个基因在肺癌患者中的表达水平基本上高于或低于给定人群(例如非肺癌人群)。“基本上高于”指肺癌患者外周血中基因平均表达水平超过给定人群(例如非肺癌人群)外周血中基因平均表达水平至少1.5倍，例如，至少2、3、4、5、10、20或更多倍。“基本上低于”指肺癌患者外周血中基因平均表达水平不超过给定人群(例如非肺癌人群)外周血中基因平均表达水平的0.67倍，例如，不超过0.5、0.33、0.25、0.1或更少倍。

根据本发明，表1中权重为1的基因在肺癌患者中的表达水平基本上高于给定人群(例如非肺癌人群)。表1中权重为-1的基因在肺癌患者中的表达水平基本上低于给定人群(例如非肺癌人群)。

根据本发明，所述外周血可以是全血或包含富集的外周血单个核细胞(PBMC)的血样。

在本发明的一个实施方式中，外周血中所述基因的表达量可通过评估外周血中所述基因的mRNA水平得到测定。

根据本发明，可使用本领域已知的各种定量分析方法检测所述基因的mRNA水平，包括但不限于：定量RT-PCR、RNA印迹、原位杂交、DNA印迹、狭线印迹、核酸阵列等。

根据本发明的一个优选实施方式，所述的外周血生物标记物组，包括选自以上所述30个基因的至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30个基因的mRNA。

根据本发明，优选所述的外周血生物标记物组包含以上所述30个基因的mRNA。

进一步优选，所述的外周血生物标记物组由以上所述30个基因的mRNA组成。

在本发明的一个实施方式中，外周血中所述基因的表达量可通过评估外周血中所述基因编码的蛋白质水平得到测定。

根据本发明，可使用本领域已知的各种定量分析方法检测所述基因编码的蛋白质水平，包括但不限于：ELISA、放射性免疫测定、FACS、蛋白质印迹、二维SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳、高通量蛋白质测序等。

根据本发明的一个优选实施方式，所述的外周血生物标记物组，包括选自以上所述30个基因的至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30个基因所编码的蛋白质。

根据本发明，优选所述的外周血生物标记物组包含以上所述30个基因所编码的蛋白质。

进一步优选，所述的外周血生物标记物组由以上所述30个基因所编码的蛋白质组成。

APP基因，β淀粉样蛋白(A4)前体蛋白基因，该基因编码一种细胞表面受体和跨膜前体蛋白。该前体蛋白被分泌酶切割成多种肽，其中一些分泌肽可结合到乙酰转移酶复合物APBB1/TIP60上，促进转录激活，另一些肽则成为阿尔茨海默病患者大脑中淀粉样斑块的蛋白质基础。此外，还发现其中的两种肽是抗菌肽，具有抗细菌和真菌的活性。目前已知该基因突变与常染色体显性遗传性阿尔茨海默病和脑动脉淀粉样变性有关。

CAMK2G基因，γ钙/钙调蛋白依赖性蛋白激酶(钙调蛋白激酶)II基因，该基因编码丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶家族，Ca²⁺/钙调蛋白依赖性蛋白激酶亚家族中的一种酶的四个亚基之一。钙信号对于谷氨酸突触可塑性至关重要。在哺乳动物细胞中，所述酶由四个不同的链组成：α、β、γ和δ。该基因的产物是γ链。

CD93基因，该基因编码的蛋白是一种细胞表面糖蛋白和I型膜蛋白。现在认为该蛋白参与细胞间黏附和凋亡细胞的清除。该蛋白的胞质尾与膜突蛋白相互作用。

GABARAPL1，该基因编码一泛素样调节剂，其通过促进受体的顺行性细胞内运输来增加κ-类阿片受体的细胞表面表达。

MAK基因，男性生殖细胞相关激酶基因，该基因编码一种参与细胞周期调控的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶。

MANSC1，含MANSC域1基因，该基因编码含MANSC域的基因1蛋白，功能未知。

MAP3K2，丝裂原活化蛋白激酶2基因，该基因编码的蛋白质是一种丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶。该激酶优先激活参与MAP激酶信号通路的其他激酶；可直接磷酸化并激活IκB激酶，在NF-κB信号通路中发挥作用。该激酶还可以结合并激活蛋白激酶C相关的激酶2，参与调控的信号转导。

NBPF20，神经母细胞瘤断点家族，成员20基因，该基因是神经母细胞瘤断点家族(NBPF)成员之一，NBPF由几十个主要位于人类1号染色体的节段重复区中的基因构成。

NBPF8，神经母细胞瘤断点家族，成员8基因，该基因是神经母细胞瘤断点家族(NBPF)成员之一，NBPF由几十个主要位于人类1号染色体的节段重复区中的基因构成。

OSBPL1A，氧固醇结合样蛋白1A基因，该基因编码的蛋白属于氧化固醇结合蛋白家族成员(OSBP)，是一组细胞内脂质受体。

PRKDC，DNA活化的催化多肽的蛋白激酶基因，该基因编码DNA依赖性蛋白激酶(DNA-PK)的催化亚基。它和Ku70/Ku80异二聚体蛋白在DNA双链断裂修复和重组中其作用。编码的蛋白是PI3/PI4激酶家族中的一员。

RPS6KA3，核糖体蛋白S6激酶A3基因，该基因编码丝氨酸/苏氨酸激酶中RSK(核糖体S6激酶)家族中的一种蛋白，其包含2个不相同的激酶催化结构域，能磷酸化不同的底物，包括丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)信号通路中的分子。该蛋白质的活性与细胞生长和分化的控制有关。

SLC37A3，溶质载体家族37(甘油-3-磷酸转运)，成员3基因，该基因编码一种溶质载体家族37(甘油-3-磷酸转运)蛋白，具有跨膜转运蛋白活性。

SLCO3A1，溶质载体有机阴离子转运蛋白家族，成员3A1基因，该基因编码一种溶质载体有机阴离子转运蛋白家族成员，具有介导有机阴离子独立运输功能。

TIAM2，T细胞淋巴瘤侵袭和转移蛋白2基因，该基因编码鸟嘌呤核苷酸交换因子，该因子可能在神经细胞发育中起作用。

TMX4，硫氧蛋白相关跨膜蛋白4基因，该基因编码内质网蛋白中二硫键异构酶家族的成员之一，该蛋白家族催化蛋白质折叠和巯基二硫键的转换。所编码蛋白质具有N-末端的ER信号序列、催化活性的硫氧还蛋白域、一个跨膜结构域和C-末端富含ASP/GLU的钙结合域，缺少C-末端的ER保留序列。

UBR4，泛素连接酶蛋白E3组成成分4基因，该基因编码的蛋白质是一个E3泛素蛋白连接酶，在细胞核内与视网膜母细胞瘤相关蛋白相互作用，与胞浆内与钙结合钙调素相互作用。该蛋白似乎是胞质中的细胞骨架成分和细胞核中染色质支架成分。此外，该蛋白还是人乳头瘤病毒16型E7肿瘤蛋白的一个靶点。

UBTD1，含1泛域基因。许多蛋白质的降解是通过泛素途径完成的，多肽和泛素共价结合实现降解。该基因编码的是泛素蛋白家族中的一种蛋白质，能够调节E2泛素结合酶。

ADA，腺苷脱氨酶基因，该基因编码催化腺苷水解为肌苷的一种酶。该酶的缺乏会导致严重的联合免疫缺陷(SCID)，B淋巴细胞和T淋巴细胞失能，细胞免疫受损，免疫球蛋白产生下降。而该酶的升高与先天性溶血性贫血相关。

C2CD2，C2钙依赖性域蛋白2基因，该基因编码一种含C2钙依赖性域的蛋白，具体功能未知。

CDKN1C，细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂1C基因，其编码的蛋白质对几种G1周期蛋白/Cdk复合物具有强结合力和强抑制性，是细胞增殖的负性调节剂。该基因的突变与散发性肿瘤和Beckwith Wiedemann综合征有关，提示该基因是一个候选的抑癌基因。

PRR5L，富含脯氨酸的蛋白5基因，该基因编码编码富含脯氨酸的蛋白5，与mTORC2复合物关联共同调节细胞骨架的存活和组织等细胞过程。

HLA-DOA，II类主要组织相容性复合物，Doα基因，其属于HLA II类分子的α链基因。HLA-DOA和HLA-DOB形成异二聚体HLA-DO，存在于B细胞的溶酶体中，调节HLA-DM介导的多肽加载到MHC II类分子上的过程。与经典的HLAⅡ类分子相比，该基因的序列变异很小，特别是在蛋白质水平上。

HLA-DPA1，II类主要组织相容性复合物，DPα1基因，其属于HLA II类分子的α链基因。

HLA-DRB3，II类主要组织相容性复合物，DRβ3基因，其属于HLA II类分子的β链基因。

IDO1，吲哚胺2,3-双加氧酶1基因，该基因编码吲哚胺2,3-双加氧酶(IDO)，该酶催化色氨酸代谢为N-甲酰-犬尿氨酸的第一步也是限速步骤。该酶可作用于多种色氨酸底物，如D-色氨酸，L-色氨酸，5-羟色胺等。该酶在各种病生理过程中起作用，例如抗菌、抗肿瘤、神经病变、免疫调节、抗氧化。它在树突状细胞、单核细胞和巨噬细胞中表达，通过代谢细胞周围的色氨酸代谢调控T细胞。

OXTR，催产素受体基因，该基因编码的蛋白属于G蛋白偶联受体家族，作为催产素受体。催产素-受体系统在分娩过程中起重要作用。

RARRES3，视黄酸受体响应者(他佐罗汀诱导的)3基因，类维生素A物质有多种生物活性，如抑制生长、促进细胞分化、治疗增生性皮肤病。所述效应由特定的核受体蛋白介导的，此类蛋白是类固醇激素和甲状腺激素受体超家族的转录调控因子。RARRES1、RARRES2、RARRES3的基因表达能被他佐罗汀上调。RARRES3可能是一种肿瘤抑制基因或生长调节剂。

SSBP3，单链DNA结合蛋白3基因，该基因编码一种单链DNA结合蛋白，可能通过结合启动子区域中的单链多聚嘧啶序列参与α2(I)胶原基因的转录调控。

UBIAD1，UbiA异戊烯转移域，包含1基因，该基因编码的蛋白质可能参与胆固醇和磷脂代谢。其基因突变与Schnyder结晶状角膜营养不良相关。

上述基因的基本信息如下(基因名称以HGNC为准，NG、NM和NP编号以RefSeq数据库为准)：

表1 30个基因的权重、全称、DNA、mRNA和蛋白质信息

在本发明的具体实施方式中，采用基因表达差异显著性分析方法(significanceanalysis of microarray,SAM)进行了基因差异表达分析。SAM算法是一种用于在基因芯片数据中分析显著差异基因的方法，是以t检验为基础的统计推断分析方法。本发明利用SAM算法实现两个人群中的基因表达差异分析，并利用q值方法控制所找到差异表达基因的假阳性率(False Discovery Rate，FDR)。比较过程中，本发明选取表达水平倍数的变化大于1.5倍同时FDR小于0.05作为筛选差异表达基因的标准。本发明通过对比肺癌患者，其他肺病患者和正常人群的外周循环血的全基因表达数据发现，相比较于正常人群，肺癌患者的外周循环血中有978个基因的表达上调，同时有702个基因的表达下调；相比较于肺结节病患者，肺癌患者中有485个基因的表达出现上调，同时有185个基因的表达出现下调；相比较于肺结核患者，肺癌患者的外周循环血中有38个基因的表达出现上调，另外有203个基因的表达出现下调。根据肺癌患者和其它人群外周循环血的基因表达水平的两两比较结果，发现表1中的30个基因在肺癌患者与其他肺病患者和正常人群的比较中同时出现了差异表达。

对外周循环血中30个基因的表达量进行主成分分析，结果显示第一维主成分(PC1)能够很好的区分肺癌病人与正常人群以及肺结节病患者和肺结核病患者。结果表明，本发明所鉴定出的肺癌诊断生物标志物能够很好的区分肺癌患者和具有类似表型的其他肺部疾病个体以及正常人群。

与从人类基因组中1000次随机选取的其他30个基因对比，本发明所述的30个基因的AUC(Area Under ROC Curve)值，显著大于1000次随机选取的其他30个基因的AUC值，说明本发明的30个基因作为肺癌诊断标志物具有很好的特异性。

通过基因本体(Gene Ontology，GO)分析显示，本发明所筛选出的标志物主要包含与免疫应答相关的功能基因，这些功能基因的差异表达可能与机体对肺癌的免疫应答相关。

本发明的第二个方面是提供，一组外周血生物标志物组在制备诊断试剂中的应用，所述生物标志物组包括选自以下30个基因的至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30个基因，或所述基因的mRNA，或所述基因编码的蛋白质，所述30个基因为：APP基因、CaMK2G基因、CD93基因；GABARAPL1基因、MAK基因；MANSC1基因、MAP3K2基因、NBPF20基因、NBPF8基因、、OSBPL1A基因、PRKDC基因、RPS6KA3基因、SLC37A3基因、SLCO3A1基因、TIAM2基因、TMX4基因、UBR4基因、UBTD1基因、ADA基因、C2CD2基因、CDKN1C基因、PRR5L基因、HLA-DOA基因、HLA-DPA1基因、HLA-DRB3基因、IDO1基因、OXTR基因、RARRES3基因、SSBP3基因和UBIAD1基因。

根据本发明，所述诊断试剂用于肺癌早期阶段的筛查、肺癌的辅助诊断、肺癌治疗中效果监测、肺癌复发监测等。

优选，所述生物标记物组包含上述30个基因。

优选，所述生物标记物组包含上述30个基因的mRNA。

优选，所述生物标记物组包含上述30个基因编码的蛋白质。

优选，所述生物标志物组由上述30个基因组成。

优选，所述生物标志物组由上述30个基因的mRNA组成。

优选，所述生物标志物组由上述30个基因编码的蛋白质组成。

本发明的第三个方面是提供，用于检测所述30个基因的探针或引物。

本发明所述的探针为本领域常规的探针，所述探针较佳地为带有示踪物或标记物的寡核苷酸片段，只要该探针能与所述基因或其mRNA杂交即可。

本发明所述的引物为本领域常规的引物，能够用于扩增所述基因或所述基因的mRNA。

可采用本领域公知的方法，从所述30个基因的基因序列制备获得所述30个基因的扩增引物或者杂交探针。例如，利用所述基因的外显子、内含子或非翻译区3’或5’、或它们的任意组合，采用Oligo、PrimerPremier、DNA man、Blast等软件进行设计。在一个实施方案中，所述探针或引物基于所述基因3’蛋白编码区序列进行设计。

在一个实施方案中，每个探针/引物包含至少15个核苷酸。例如每个探针能包含至少20、25、50、75、100或更多个核苷酸。优选，每个探针/引物具有相对高的序列复杂性，且不具有任何不明确的残基。

在一个实施方案中，本发明使用CLC Main Workbench下载了所述30个基因的mRNA序列，并利用默认参数设计了30个基因的标准PCR扩增所需的引物。所述30个基因的每个基因的mRNA的引物序列如表2所述。

表2：30个基因的mRNA的检测引物

在本发明的一个优选实施方式中，采用定量RT-PCR检测和比较外周血中所述30个基因的mRNA水平。将RNA逆转录成cDNA，接着进行定量PCR。

本发明的第四个方面是提供一种诊断试剂盒。

根据本发明，所述诊断试剂盒用于肺癌早期阶段的筛查、肺癌的辅助诊断、肺癌治疗中效果监测、肺癌复发监测等。

根据本发明，所述诊断试剂盒用于检测外周血中所述30个基因中的至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30个基因的表达水平。

根据本发明的一种实施方式，所述诊断试剂盒，其包含：一种或多种核苷酸，所述一种或多种核苷酸作为引物或探针，能与所述基因、所述基因的mRNA、或其互补物杂交；或者一种或多种抗体，所述一种或多种抗体能结合所述基因编码的蛋白质。

所述基因选自表1的30个基因中的至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30个基因。

根据本发明，所述核苷酸可以进一步结合可用于荧光、放射性或其他可检测的标记物。

根据本发明，所述抗体包括但不限于，多克隆抗体、单克隆抗体、嵌合抗体、人源化抗体、单链抗体、Fab片段和Fab表达文库产生的片段。

优选，根据本发明，所述诊断试剂盒用于检测外周血中所述30个基因中的至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30个基因的mRNA水平。

在本发明的一种实施方式中，所述诊断试剂盒含有所述30个基因中的至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30个基因的mRNA的检测引物序列。

优选，根据本发明，所述30个基因的mRNA的检测引物序列如表2所述。

在本发明的具体实施方式中，所述诊断试剂盒含有用于扩增表1中30个基因的引物对，所述引物对包括以下30个引物对中的至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30个引物对：SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2的引物对，SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4的引物对，SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6的引物对，SEQ IDNO：7和SEQ ID NO：8的引物对，SEQ ID NO：9和SEQ ID NO：10的引物对，SEQ ID NO：11和SEQ ID NO：12的引物对，SEQ ID NO：13和SEQ ID NO：14的引物对，SEQ ID NO：15和SEQID NO：16的引物对，SEQ ID NO：17和SEQID NO：18的引物对，SEQ ID NO：19和SEQ ID NO：20的引物对，SEQ ID NO：21和SEQ ID NO：22的引物对，SEQ ID NO：23和SEQ ID NO：24的引物对，SEQID NO：25和SEQ ID NO：26的引物对，SEQ ID NO：27和SEQ ID NO：28的引物对，SEQID NO：29和SEQ ID NO：30的引物对，SEQ ID NO：31和SEQ ID NO：32的引物对，SEQ ID NO：33和SEQ ID NO：34的引物对，SEQ ID NO：35和SEQID NO：36的引物对，SEQ ID NO：37和SEQID NO：38的引物对，SEQ ID NO：39和SEQ ID NO：40的引物对，SEQ ID NO：41和SEQ ID NO：42的引物对，SEQID NO：43和SEQ ID NO：44的引物对，SEQ ID NO：45和SEQ ID NO：46的引物对，SEQ ID NO：47和SEQ ID NO：48的引物对，SEQ ID NO：49和SEQ ID NO：50的引物对，SEQID NO：51和SEQ ID NO：52的引物对，SEQ ID NO：53和SEQID NO：54的引物对，SEQ ID NO：55和SEQ ID NO：56的引物对，SEQ ID NO：57和SEQ ID NO：58的引物对，SEQ ID NO：59和SEQID NO：60的引物对。

根据本发明，所述诊断试剂盒进一步含有用于定量RT-PCR的试剂。

根据本发明，所述定量RT-PCR试剂包括：逆转录酶，热稳定性DNA聚合酶，dNTPs，缓冲液，MgCl₂。

在一个具体实施方式中，所述热稳定性DNA聚合酶为Taq酶。

根据本发明，所述诊断试剂盒还包括作为基因表达量测定的内参的标准品和/或对照品。

根据本发明，优选所述的标准品和/或对照品是GAPDH。

优选，根据本发明，所述诊断试剂盒用于检测外周血中所述30个基因中的至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30个基因所编码的蛋白质的含量。

在本发明的一种实施方式中，所述诊断试剂盒含有与所述30个基因中的至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30个基因所编码的蛋白质特异性结合的抗体。

根据本发明，所述抗体是单克隆抗体或多克隆抗体。

本发明的第五个方面是提供，能够检测所述30个基因的检测试剂在制备诊断试剂或诊断试剂盒中的用途。

根据本发明，所述诊断试剂或诊断试剂盒用于肺癌早期阶段的筛查、肺癌的辅助诊断、肺癌治疗中效果监测、肺癌复发监测等。

根据本发明，所述检测试剂可以包含能够检测所述30个基因的核酸探针，或者能够扩增所述30个基因的引物，或者能够结合所述30个基因所编码的蛋白质的抗体等。

在本发明的一个实施方式中，所述检测试剂包含能够扩增所述30个基因的引物，进一步优选，所述引物序列如表2所述。

优选，所述诊断试剂盒进一步含有用于定量RT-PCR的试剂。

优选，所述定量RT-PCR试剂包括：逆转录酶，热稳定性DNA聚合酶，dNTPs，缓冲液，MgCl₂。

优选，所述热稳定性DNA聚合酶为Taq酶。

优选，所述诊断试剂盒还包括作为基因表达量测定的内参的标准品和/或对照品。

优选，所述的标准品和/或对照品是GAPDH。

本发明的第六个方面是提供，一种基于待诊断个体外周血中30个基因的表达水平判断个体肺癌风险值的方法。

根据本发明，所述方法采用公式1所示的计算公式：

公式1中，S是最终得到的个体患肺癌的风险值；n是所检测的30个基因标志物中的基因个数，为1-30的整数；W_i是基因i的权重值；e_i代表基因i在所测个体中的表达量；μ_i和τ_i代表基因i在给定人群中的表达量的均值和标准差。

根据本发明，每个基因i的权重值如表1中所述。

根据本发明，所述给定人群可以是健康人群，或者非肺癌的肺部疾病患者人群，或者是包括健康人和非肺癌的肺部疾病患者在内的人群，或者是包括健康人、非肺癌的肺部疾病患者和肺癌患者在内的人群。优选，所述给定人群中健康人和/或非肺癌的肺部疾病患者的总人数为大于等于20的整数。

根据本发明，个体的高肺癌风险值代表该检测个体具有较高的患有肺癌的可能性。

根据本发明，在30个基因中被检测的基因越多，由所述公式计算获得的风险值越具有参考价值。优选n为30。

根据本发明，所述基因的表达量可以是mRNA的表达量，也可以是基因所编码蛋白的表达量。在本发明的一个实施方式中，所述基因表达量为相应基因在外周血中的mRNA的表达量。

本发明的第七个方面是提供，一种肺癌早期筛查或肺癌诊断、肺癌疗效判断或肺癌复发监测的方法。

根据本发明，所述方法包括如下步骤：

(1)取待测个体的外周血；

(2)检测步骤(1)获取的待测个体外周血样本中所述30个基因中至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30个基因的基因表达量。

(3)根据步骤(2)中得到的待测个体外周血中所述30个基因中至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30个基因的基因表达量，根据前述公式1，计算待测个体的肺癌风险值。

根据本发明，所述基因的表达量可以是mRNA的表达量，也可以是基因所编码蛋白的表达量。在本发明的一个实施方式中，所述基因表达量为mRNA的表达量，可以采用本领域已知的实验方法，通过提取待测个体的外周血的全血RNA检测获得。

优选，步骤(2)中检测所述30个基因的基因表达量。进一步优选，检测所述30个基因的mRNA的表达量。

优选，步骤(3)中根据所述30个基因的基因表达量计算肺癌风险值。进一步优选，根据所述30个基因的mRNA的表达量计算肺癌风险值。

根据本发明，所述方法如在人群健康筛查时使用，被测个体的高肺癌风险值代表该检测个体具有较高的患有肺癌的可能性，因此可用于肺癌的早期筛查。所述方法如在疾病诊断过程中使用，例如影像学检查后结合使用，被测个体的高肺癌风险值代表该检测个体具有较高的患有肺癌的可能性，因此可用于肺癌的辅助诊断。所述方法如在肺癌治疗后使用，被测个体的高肺癌风险值或者相比治疗前风险值升高，代表其治疗效果可能不佳，因此可用于治疗效果评估。所述方法如在肺癌治疗后复查时使用，被测个体的高肺癌风险值或者相比治疗后风险值升高，代表其肺癌可能复发，因此可用于肺癌复发监测。

本发明的第八个方面是提供，一种用于肺癌早期筛查或肺癌诊断、肺癌疗效判断或肺癌复发监测的系统。

根据本发明，所述系统包括一种存储给定人群外周血样中所述30个基因中的至少一个基因的对照表达谱的存储器。

所述系统任选进一步包括能将被检个体的所述30个基因中的至少一个基因的表达谱与所述对照表达谱进行比较和计算的程序，以及一种能执行该程序的处理器。

在一个实施方式中，所述程序使用前述公式1进行肺癌风险值的计算。

根据本发明，所述给定人群可以是健康人群，或者非肺癌的肺部疾病患者人群，或者是包括健康人和非肺癌的肺部疾病患者在内的人群，或者是包括健康人、非肺癌的肺部疾病患者和肺癌患者在内的人群。例如，对照表达谱可以是健康人群外周血所述30个基因中的至少一个基因的表达谱，可以是非肺癌的肺部疾病患者的外周血所述30个基因中的至少一个基因的表达谱。

根据本发明，所述基因的表达谱可以是基因的mRNA的表达谱，也可以是基因所编码蛋白质的表达谱。在本发明的一个实施方式中，所述基因的表达谱为外周血中相应基因的mRNA的表达谱。

附图说明

图1：30个基因诊断标志物中每一个基因在正常人、肺结节病患者、肺结核患者和肺癌患者的循环外周血中的基因表达。图中，HC代表正常人群，SA代表肺结节病患者，TB代表肺结核病患者，LC代表肺癌患者。

图2：30个基因的基因本体富集(GO enrichment)分析中最显著相关的前10个基因功能分类。

图3：30个基因表达在发现人群中的主成分分析(PCA)。PC1和PC2分别代表第一个主成分和第二个主成分。图中，HC代表正常人群，SA代表肺结节病患者，TB代表肺结核病患者，LC代表肺癌患者。

图4：30个基因表达在验证人群中的主成分分析(PCA)。PC1和PC2分别代表第一个主成分和第二个主成分。图中，HC代表正常人群，SA代表肺结节病患者，TB代表肺结核病患者，LC代表肺癌患者。

图5：30个基因组成的肺癌标记物计算出的肺癌风险值在验证数据集的不同群体中具有显著差异。图中，HC代表正常人群，SA代表肺结节病患者，TB代表肺结核病患者，LC代表肺癌患者。

图6：30个基因组成的肺癌标记物计算出的肺癌风险值在验证数据集中预测肺癌的ROC曲线图。

图7：已有文献报道的两组外周血肺癌诊断标记物组计算出的肺癌风险值在验证数据集中预测肺癌的ROC曲线图。

图8：在验证数据集中，本发明鉴定的30个基因组成的肺癌标记物比1000次随机挑选的其他30个基因具有显著的肺癌预测能力。黑色三角代表本发明鉴定的30个基因组成的肺癌标记物预测的AUC值。

具体实施方式

以下结合实施例对本发明做进一步描述。需要说明的是，实施例不能作为对本发明保护范围的限制，本领域的技术人员理解，任何在本发明基础上所作的改进和变化都在本发明的保护范围之内。

以下实施例所用化学试剂都是常规试剂，均可商购获得。

实施例1本发明30个基因诊断标志物的筛选

为了筛选肺癌诊断标记物，本实施例对用于发现肺癌诊断标志物的人群的外周循环血的全基因表达数据进行分析。

1、人群样本来源

用来发现基因标志物的人群包括38个健康人、25个患有肺结节病的患者、16个患有肺结核病的患者和8个患有肺癌的患者。

上述87个样本的基因表达数据来自NCBI的GEO基因表达综合数据库(GEOAccession编号：GSE42830)，以下为所述数据库中该87个样本的信息列表：

从该数据库共得到该87个样本列的47323基因行的表达矩阵(参见文献Bloom etal.,PLoS ONE,2013,8:e70630)。

所述肺结核病患者来源于英国伦敦皇家自由医院(Royal Free HospitalNHSFoundation Trust,London)。所述肺结节病患者来源于英国伦敦皇家自由医院(RoyalFree Hospital NHS Foundation Trust,London)，帝国学院圣玛丽医院(StMary’sHospital Imperial College NHS Trust)，伦敦巴内特和恰似农场医院(Barnetand ChaseFarm NHS Trust in London)，牛津结节病专科(the Oxford SarcoidosisClinic)，牛津丘吉尔医院(Churchill Hospital in Oxford)和巴黎Avicenne医院(the AvicenneHospital in Paris)。所述肺癌患者来源于法国里昂合作网络(theLyon CollaborativeNetwork,France)。

2、数据对比分析

利用SAM算法实现两个人群中的基因表达差异分析，并利用q值方法控制所找到差异表达基因的假阳性率(False Discovery Rate，FDR)。比较过程中，选取表达水平倍数的变化大于1.5倍同时FDR小于0.05作为筛选差异表达基因的标准。

首先，比较肺癌患者和正常人群的外周血的全基因表达，筛选出肺癌患者和正常人群的外周血中出现差异表达的基因。通过比较，发现相比较于正常人群，肺癌患者的外周循环血中有978个基因的表达上调，同时有702个基因的表达下调。

其次，比较了肺癌患者和肺结节病患者外周循环血的全基因表达水平，发现肺癌患者中有485个基因的表达出现上调，同时有185个基因的表达出现下调。

再次，比较了肺癌患者和肺结核患者外周循环血中的基因表达水平，发现肺癌患者的外周循环血中有38个基因的表达出现上调，另外有203个基因的表达出现下调。

根据上述肺癌患者和其它人群外周循环血的基因表达水平的两两比较结果，进一步筛选在上述肺癌人群和其他三种人群间比较中同时出现的差异表达基因。通过筛选，发现30个基因在上述三组不同人群的比较中同时出现了差异表达。所述30个基因见表1。

这些基因在上述四类不同人群外周循环血中的基因表达量见图1。

对87个样本外周循环血中30个基因的表达量进行主成分分析(PrincipalComponent Analysis，PCA)，结果显示第一维主成分(PC1)能够很好的区分肺癌病人与正常人群以及肺结节病患者和肺结核病患者(图3)。

基于外周循环血中30个基因的表达量进行聚类分析(Cluster Analysis，CA)，结果显示肺癌病人聚在一个独立的类中，而其他肺部疾病患者和健康个体则聚在另外一类中。这些结果表明，所鉴定出的肺癌诊断基因标志物能够很好的区分肺癌患者和其他个体。

实施例2 30个基因肺癌诊断标志物在独立人群中的验证

为了验证所述包含30个基因的外周循环血肺癌诊断标志物的有效性，本实施例用与用于标志物发现的人群完全独立的人群，获取其外周血中所述30个基因标志物的基因表达数据，验证所述标志物的诊断效用。

1、人群样本来源

包含52个健康个体、25个肺结节病患者、11个结核病患者和8个肺癌患者。

上述96个样本的基因表达数据来自NCBI的GEO基因表达综合数据库(GEOAccession编号：GSE42826)，以下为所述数据库中该96个样本的信息列表：

从该数据库中共得到该96个样本列的所述30个基因行的表达矩阵。

2、数据分析

首先对验证人群的外周循环血中30个生物标志物的基因表达量进行了主成分分析，结果表明第一主成分能较好的风险区分肺癌患者和其他种类的检测个体(图4)。

基于公式1的肺癌风险值计算方法，

(公式1)，将96个个体外周血中30个生物标志物的基因表达量带入公式1，其中以所述96个个体的基因i的表达量为基础，计算基因i在给定人群中的表达量的均值μ_i和标准差τ_i，计算出96个个体的肺癌风险值(表3)，再基于每个个体的肺癌风险值，计算出52个健康个体、25个肺结节病患者、11个结核病患者和8个肺癌患者对应的不同群体的癌症风险值，比较不同群体的癌症风险值，发现肺癌患者的癌症风险值明显比其他三组病人的肺癌风险值高(t检验：P值<0.01；图5)。

基于肺癌风险值的预测ROC(Receiver Operating Characteristic)曲线下的面积为0.947(图6)。由此说明，采用本发明所述的30个基因作为诊断标志物，可以区分肺癌患者和非肺癌患者。

3、与已有文献报道的外周血肺癌诊断标志物的对比

为了进一步验证所述包含30个基因的外周循环血肺癌诊断标志物的肺癌诊断表现，本实施例进一步从已发表文献中获取两组用于肺癌早期诊断的外周血基因标志物：

发表于Showe et al.,Cancer Research,2009,69:9202-9210，由19个基因组成的外周血肺癌诊断标志物，为方便描述，本实施例中称之为“标志物组A”，包括以下19个基因：DYRK2、YY1、C19orf12、THEM2、MYADM、ROGDI、DNAJB14、BRE、C9orf64、FAM110A、C19orf62、C13orf27、ASCC3、SLC1A5、PTPLAD1、MRE11A、CREB1、CCDC53、USP48；

发表于Zander et al.,Clinical Cancer Research；2011,17:3360–3367，由318个基因组成的外周血肺癌诊断标志物，为方便描述，本实施例中称之为“标志物组B”，包括以下318个基因：TNFAIP6、RCC2、NUP62、SLC25A5、GALT、HIST1H4H、DDX24、CYP4F3、SRPK1、ICAM2、GIMAP5、L3MBTL2、ATIC、MYO9A、FN3KRP、IMP3、LY9、PHF19、IMP4、DFFA、ANAPC5、B4GALT5、MCM3AP、ITGAX、CUTA、CD6、HLA-DPA1、SLC36A1、GNE、HIST2H2BE、RUVBL1、GPBAR1、SLC11A1、STXBP5、LZTR1、WDR54、CREB5、CDC25B、CDK5RAP1、PHF15、COQ6、HNRPM、YIPF4、GIMAP6、MFNG、GABARAPL1、S100P、SRP68、CHMP7、LPXN、TRAP1、HMGB2、ECHS1、PPRC1、SCAMP3、SLC22A4、CCT7、ANKMY1、B4GALT7、TM6SF1、GLTSCR2、PDZD8、STK17B、PIP5K2B、HLA-DRA、FARS2、HLA-DQA1、ARIH2、EIF2B1、UBE2G2、HDAC1、GOT2、CDK4、HSP90AB1、RUVBL1.1、GEMIN4、PABPC4、LOC88523、ADCY4、PADI4、CD96、CD58、TMEM109、LCK、NOSIP、BCL11B、IRAK3、CYB5R4、DPH2、MAGED1、IL2RB、ABLIM1、EWSR1、C6orf66、COPS7B、TMCO3、AGTPBP1、NT5C3、MRPS26、CHIC2、LSM4、TRAPPC6A、XPO5、RBM4、IMPDH2、NUP205、BCL6、LOC642816、TRAF3IP3、HIST1H2AE、MAP4K1、PPBP、FAIM3、SAMM50、PLSCR1、BTBD10、AKR1A1、LOC374395、SMAD3、MLLT6、ZMYM6、SIPA1L2、OPLAH、SLC25A25、PCSK7、LY9.1、AKR1B1、KARS、MGC57346、TRIM25、RPL8、EXOSC10、SAMSN1、DIRC2、RANGAP1、SHMT2、SLC25A3、IL18RAP、ALG9、HSPA8、DCXR、TGIF2、SDCCAG3、KCNJ15、RPUSD3、MAP2K3、CRELD1、PRPF8、CCR2、C2orf25、NUP93、TXNDC14、SF3B3、RNF13、LFNG、CKAP4、PTEN、P2RY11、CKLF、LAX1、FBXL15、TLR4、ATP5G2、UBE2I、DDX39、BTN3A2、HSPC159、RBM14、VPREB3、CLEC4E、CYBASC3、LOC387841、FXYD5、DSC2、GGA2、TAF1C、RFX5、EXOC6、STK25、ADA、TMEM101、KCTD17、CA4、UBQLN4、CKAP5、NUP210、SIGIRR、AARS、LAS1L、CRY2、AHSA1、C8orf33、MUM1、DHRS9、TTC4、ALKBH5、S100A8、QPCT、PADI2、IL18R1、KBTBD7、KIF1B、FBXO21、NFE2L2、APRT、TAF15、APEX1、SAP30、LBH、HSD17B8、LRMP、MAN2A2、ECH1、RASSF7、EIF4A1、C21orf33、ILF2、NPAL3、ATP1A1、NDUFS8、C1orf151、CUGBP2、DKFZp761P0423、IDH3B、NT5C2、NME3、HLA-DRB3、C21orf2、FCRL3、IVNS1ABP、NSUN5C、SAE1、MCM7、PNPO、ABCA1、AIM2、PDLIM7、C20orf3、HIST2H2AC、TMCC3、RRM2B、CBFA2T2、CECR1、PHF10、PSMD2、HIST1H2BG、WDR6、ARHGAP17、PPP1R16B、NUP85、PMVK、NAT10、NUBPL、CCT7.1、GTF2H4、SVIL、PLCG1、S100A9、CLEC4D、E2F1、RPP21、NFATC3、ALG3、RPL18A、TYSND1、GSTP1、ZC3HC1、MME、COPZ1、PLOD2、CD55、TPM2、ILF3、APRT.1、SIVA、UNC84B、ACSS1、POMT1、DDB1、ATP5A1、APOL3、DNAJC3、PDXP、DDX56、ACOX1、MRRF、ITGAM、MAP3K4、HSPA8.1、HIF1A、MRPL11、CMTM6、ADM、HTATIP2、HBP1、UBE2Z、SPAG9、LRRK2、MIF4GD、CDK9、RARRES3、TXNDC3、HIST1H2AC、GNLY、IFRD1、GCA、MLL、BCOR、CEACAM1、EEF2、DDX28、CALM1、MGC40489、MTMR3、FBXL13、PHTF1、PPP2R5A、CDCA4。

采用前述相同的数据库，得到所述96个个体的外周血样本中标志物组A所对应的96列19个基因行的表达数据，标志物组B所对应的96列318个基因行的表达数据。

基于公式1的肺癌风险值计算方法，分别计算出基于标志物组A和标志物组B的96个个体的肺癌风险值(表3)。

表3本申请30个基因组成的标志物组、标志物组A和标志物组B的肺癌风险值

基于标志物组A得到的肺癌风险值的预测ROC曲线下的面积为0.537，基于标志物组B得到的肺癌风险值的预测ROC曲线下的面积为0.918(图7)。

与已发表的两组外周血肺癌诊断标志物相比，本发明所述的30个基因的诊断标志物的肺癌预测ROC曲线下的面积更大。结果表明，在独立样本验证数据集中，本发明所述外周血30个基因的诊断标志物比已发表文献中所述的两组外周血肺癌诊断标志物能更有效地区分肺癌患者和非肺癌患者。

4、与随机挑选的其他30个基因的组合对比

一些研究表明很多基因标志物对于疾病的诊断能力并不比随机挑选的一些由同样个数基因组成的标志物的区分度好。为了验证本发明所述的30个基因肺癌诊断标志物是否比其它随机挑选的30个基因诊断标志物具有更好的区分度，本实施例进一步进行了随机采样检验。

采用前述相同的数据库，从人类基因组中随机选取30个基因，得到所述96个个体的相应30个基因的表达量数据，根据公式1，计算出相应30个基因的肺癌风险值，然后比较随机选择的30个基因标志物的肺癌诊断能力。

重复上述随机选择和肺癌诊断过程共1000次，并记录每次根据肺癌风险值进行肺癌诊断的AUC(Area Under ROC Curve)值。

结果表明，本发明所述的30个基因的肺癌诊断标志物的AUC值显著大于1000次随机选择的其他30个基因的肺癌诊断标志物的AUC值(右侧P值＝0.007；图8)，进一步验证了本发明所述30个基因肺癌诊断标志物具有很好的特异性。

SEQUENCE LISTING

<110> 万君, 顾

<120> 用于肺癌无创诊断的外周血基因标记物

<130> CPCN17110903

<160> 60

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

tgatggtaat gctggcct 18

<210> 2

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

ctcttctccc cacccaaa 18

<210> 3

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

taaccacatc caccagca 18

<210> 4

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

atctacccac ctttcccc 18

<210> 5

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

aggagagaaa gaagggag 18

<210> 6

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

ttgagatgtg ggatgagg 18

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<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

ggaaaaagga aggagaaaag 20

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<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

aaggaagggg tgagataa 18

<210> 9

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 9

tcacagccac catacact 18

<210> 10

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 10

accagcatca aacaaacaca 20

<210> 11

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 11

ccctagccca tcatcaca 18

<210> 12

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 12

cccacttcat tccttctc 18

<210> 13

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 13

aggtgtgctt atttaggg 18

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<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 14

agaagtcatc aggcagaa 18

<210> 15

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 15

tccacctctt ctgccaca 18

<210> 16

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 16

gatgggctga ggttggaa 18

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<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 17

gaggaggatg agaaagtg 18

<210> 18

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 18

gttgtgtgat ttgtggtg 18

<210> 19

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 19

tttgaagagg aaggagag 18

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<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 20

ggaagatgga aggggtaa 18

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<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 21

atcgcacctt actctgtt 18

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<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 22

ccacagccac atagtctc 18

<210> 23

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 23

agtattaggg cagggatca 19

<210> 24

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 24

tggtatcttg ggcttctg 18

<210> 25

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 25

gtggtgtttg tctttggt 18

<210> 26

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 26

tccctttctg tgtttcgt 18

<210> 27

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 27

gcagaggaac aagaaaaaga 20

<210> 28

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 28

agaggaggta gagggatg 18

<210> 29

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 29

tcttacacat ctcccaac 18

<210> 30

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 30

caatttccac tttaccacc 19

<210> 31

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 31

ggaggaggaa aaagatga 18

<210> 32

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 32

agggaaagaa agatgtgg 18

<210> 33

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 33

tcaatccttc tcgtctaca 19

<210> 34

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 34

caccacacac acgagata 18

<210> 35

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 35

atcatcaacc agccccca 18

<210> 36

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 36

cctgttcgcc ttttctct 18

<210> 37

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 37

ctaactactc gctcaaca 18

<210> 38

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 38

ctccctcttt tcatcttc 18

<210> 39

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 39

gaaggagaag agagagga 18

<210> 40

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 40

cataacacac acacacact 19

<210> 41

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 41

cctctcctcc tctccttt 18

<210> 42

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 42

gcatttttcg gcctcttt 18

<210> 43

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 43

gaactatgcc tccccgataa 20

<210> 44

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 44

cccataaacc tccacatcac 20

<210> 45

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 45

cattcaacac acacacac 18

<210> 46

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 46

ttctcctcca cttccatc 18

<210> 47

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 47

ccctacaaac tccatctc 18

<210> 48

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 48

tatcctttct ctaccccac 19

<210> 49

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 49

gaacggccag gaagagaa 18

<210> 50

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 50

gcaaagggga gcacaaaa 18

<210> 51

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 51

ccttactgcc aactctcc 18

<210> 52

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 52

acccttcata caccagacc 19

<210> 53

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 53

catcaccttc cgcttctac 19

<210> 54

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 54

cccgaaaaag aaacccca 18

<210> 55

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 55

ccacaccaag agcccaaa 18

<210> 56

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 56

gcgagagagg gaaacaga 18

<210> 57

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 57

tggtggtgtg tattttgg 18

<210> 58

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 58

tagaggttga ttggggtg 18

<210> 59

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 59

ctactacctg tcccctct 18

<210> 60

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 60

ctttcttccc cttgtctct 19

Claims

1.一组用于肺癌早期筛查或诊断、肺癌疗效判断或肺癌复发监测的外周血生物标志物组，所述标志物组为如下30个基因，所述30个基因为：APP基因、CaMK2G基因、CD93基因、GABARAPL1基因、MAK基因、MANSC1基因、MAP3K2基因、NBPF20基因、NBPF8基因、OSBPL1A基因、PRKDC基因、RPS6KA3基因、SLC37A3基因、SLCO3A1基因、TIAM2基因、TMX4基因、UBR4基因、UBTD1基因、ADA基因、C2CD2基因、CDKN1C基因、PRR5L基因、HLA-DOA基因、HLA-DPA1基因、HLA-DRB3基因、IDO1基因、OXTR基因、RARRES3基因、SSBP3基因和UBIAD1基因。

2.如权利要求1所述的外周血生物标志物组，其特征在于，所述标志物组为所述30个基因的mRNA。

3.权利要求1-2任一项所述的外周血生物标志物组在制备用于肺癌早期筛查或诊断、肺癌疗效判断或肺癌复发监测的诊断试剂中的应用。

4.用于检测权利要求1-2任一项所述的外周血生物标志物组的探针或引物。

5.如权利要求4所述的探针或引物，其特征在于，所述引物为引物对，包括以下30个引物对：SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2的引物对，SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4的引物对，SEQ IDNO：5和SEQ ID NO：6的引物对，SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：8的引物对，SEQ ID NO：9和SEQID NO：10的引物对，SEQ ID NO：11和SEQ ID NO：12的引物对，SEQ ID NO：13和SEQ ID NO：14的引物对，SEQ ID NO：15和SEQ ID NO：16的引物对，SEQ ID NO：17和SEQ ID NO：18的引物对，SEQ ID NO：19和SEQ ID NO：20的引物对，SEQ ID NO：21和SEQ ID NO：22的引物对，SEQ ID NO：23和SEQ ID NO：24的引物对，SEQ ID NO：25和SEQ ID NO：26的引物对，SEQ IDNO：27和SEQ ID NO：28的引物对，SEQ ID NO：29和SEQ ID NO：30的引物对，SEQ ID NO：31和SEQ ID NO：32的引物对，SEQ ID NO：33和SEQ ID NO：34的引物对，SEQ ID NO：35和SEQ IDNO：36的引物对，SEQ ID NO：37和SEQ ID NO：38的引物对，SEQ ID NO：39和SEQ ID NO：40的引物对，SEQ ID NO：41和SEQ ID NO：42的引物对，SEQ ID NO：43和SEQ ID NO：44的引物对，SEQ ID NO：45和SEQ ID NO：46的引物对，SEQ ID NO：47和SEQ ID NO：48的引物对，SEQ IDNO：49和SEQ ID NO：50的引物对，SEQ ID NO：51和SEQ ID NO：52的引物对，SEQ ID NO：53和SEQ ID NO：54的引物对，SEQ ID NO：55和SEQ ID NO：56的引物对，SEQ ID NO：57和SEQ IDNO：58的引物对，SEQ ID NO：59和SEQ ID NO：60的引物对。

6.用于检测权利要求1-2任一项所述的外周血生物标志物组的检测试剂在制备用于肺癌早期筛查或诊断、肺癌疗效判断或肺癌复发监测的诊断试剂或诊断试剂盒中的应用。

7.如权利要求6所述的应用，所述检测试剂包含用于检测权利要求1-2任一项所述的外周血生物标志物组的核酸探针，或者用于扩增权利要求1-2任一项所述的外周血生物标志物组的引物。

8.如权利要求7所述的应用，其特征在于，所述检测试剂包含以下30个引物对：SEQ IDNO：1和SEQ ID NO：2的引物对，SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4的引物对，SEQ ID NO：5和SEQID NO：6的引物对，SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：8的引物对，SEQ ID NO：9和SEQ ID NO：10的引物对，SEQ ID NO：11和SEQ ID NO：12的引物对，SEQ ID NO：13和SEQ ID NO：14的引物对，SEQ ID NO：15和SEQ ID NO：16的引物对，SEQ ID NO：17和SEQ ID NO：18的引物对，SEQ IDNO：19和SEQ ID NO：20的引物对，SEQ ID NO：21和SEQ ID NO：22的引物对，SEQ ID NO：23和SEQ ID NO：24的引物对，SEQ ID NO：25和SEQ ID NO：26的引物对，SEQ ID NO：27和SEQ IDNO：28的引物对，SEQ ID NO：29和SEQ ID NO：30的引物对，SEQ ID NO：31和SEQ ID NO：32的引物对，SEQ ID NO：33和SEQ ID NO：34的引物对，SEQ ID NO：35和SEQ ID NO：36的引物对，SEQ ID NO：37和SEQ ID NO：38的引物对，SEQ ID NO：39和SEQ ID NO：40的引物对，SEQ IDNO：41和SEQ ID NO：42的引物对，SEQ ID NO：43和SEQ ID NO：44的引物对，SEQ ID NO：45和SEQ ID NO：46的引物对，SEQ ID NO：47和SEQ ID NO：48的引物对，SEQ ID NO：49和SEQ IDNO：50的引物对，SEQ ID NO：51和SEQ ID NO：52的引物对，SEQ ID NO：53和SEQ ID NO：54的引物对，SEQ ID NO：55和SEQ ID NO：56的引物对，SEQ ID NO：57和SEQ ID NO：58的引物对，SEQ ID NO：59和SEQ ID NO：60的引物对。

9.权利要求4或5所述的探针或引物在制备用于肺癌早期筛查或诊断、肺癌疗效判断或肺癌复发监测的诊断试剂或诊断试剂盒中的应用。

10.一种用于肺癌早期筛查或诊断、肺癌疗效判断或肺癌复发监测的诊断试剂盒，其含有一种或多种核苷酸，所述一种或多种核苷酸作为引物或探针，能与所述基因、所述基因的mRNA、或其互补物杂交，所述试剂盒用于检测权利要求1-2任一项所述的生物标志物组的表达水平。

11.如权利要求10所述的诊断试剂盒，其含有以下30个引物对：SEQ ID NO：1和SEQ IDNO：2的引物对，SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4的引物对，SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6的引物对，SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：8的引物对，SEQ ID NO：9和SEQ ID NO：10的引物对，SEQ IDNO：11和SEQ ID NO：12的引物对，SEQ ID NO：13和SEQ ID NO：14的引物对，SEQ ID NO：15和SEQ ID NO：16的引物对，SEQ ID NO：17和SEQ ID NO：18的引物对，SEQ ID NO：19和SEQ IDNO：20的引物对，SEQ ID NO：21和SEQ ID NO：22的引物对，SEQ ID NO：23和SEQ ID NO：24的引物对，SEQ ID NO：25和SEQ ID NO：26的引物对，SEQ ID NO：27和SEQ ID NO：28的引物对，SEQ ID NO：29和SEQ ID NO：30的引物对，SEQ ID NO：31和SEQ ID NO：32的引物对，SEQ IDNO：33和SEQ ID NO：34的引物对，SEQ ID NO：35和SEQ ID NO：36的引物对，SEQ ID NO：37和SEQ ID NO：38的引物对，SEQ ID NO：39和SEQ ID NO：40的引物对，SEQ ID NO：41和SEQ IDNO：42的引物对，SEQ ID NO：43和SEQ ID NO：44的引物对，SEQ ID NO：45和SEQ ID NO：46的引物对，SEQ ID NO：47和SEQ ID NO：48的引物对，SEQ ID NO：49和SEQ ID NO：50的引物对，SEQ ID NO：51和SEQ ID NO：52的引物对，SEQ ID NO：53和SEQ ID NO：54的引物对，SEQ IDNO：55和SEQ ID NO：56的引物对，SEQ ID NO：57和SEQ ID NO：58的引物对，SEQ ID NO：59和SEQ ID NO：60的引物对。

12.如权利要求10或11所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括定量RT-PCR的试剂。

13.如权利要求12所述的试剂盒，其特征在于，所述定量RT-PCR的试剂包括逆转录酶，热稳定性DNA聚合酶，dNTPs，缓冲液，MgCl₂。

14.如权利要求13所述的试剂盒，其特征在于，所述热稳定性DNA聚合酶为Taq酶。

15.如权利要求10或11所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括作为基因表达量测定的内参的标准品和/或对照品。

16.如权利要求15所述的试剂盒，其特征在于，所述标准品和/或对照品是GAPDH。

17.一种用于肺癌早期筛查或肺癌诊断、肺癌疗效判断或肺癌复发监测的系统，其特征在于，所述系统包括一种存储给定人群外周血样中30个基因的对照表达谱的存储器，一种能执行计算程序的处理器，所述程序是将被检个体的所述30个基因的表达谱与所述对照表达谱进行比较和计算，所述程序使用公式1进行肺癌风险值的计算，公式1：

其中，S是最终得到的个体患肺癌的风险值；n＝30；W_i是基因i的权重值；e_i代表基因i在所测个体中的表达量；μ_i和τ_i代表基因i在给定人群中的表达量的均值和标准差；

所述30个基因为APP基因、CaMK2G基因、CD93基因、GABARAPL1基因、MAK基因、MANSC1基因、MAP3K2基因、NBPF20基因、NBPF8基因、OSBPL1A基因、PRKDC基因、RPS6KA3基因、SLC37A3基因、SLCO3A1基因、TIAM2基因、TMX4基因、UBR4基因、UBTD1基因、ADA基因、C2CD2基因、CDKN1C基因、PRR5L基因、HLA-DOA基因、HLA-DPA1基因、HLA-DRB3基因、IDO1基因、OXTR基因、RARRES3基因、SSBP3基因和UBIAD1基因；

APP基因、CaMK2G基因、CD93基因、GABARAPL1基因、MAK基因、MANSC1基因、MAP3K2基因、NBPF20基因、NBPF8基因、OSBPL1A基因、PRKDC基因、RPS6KA3基因、SLC37A3基因、SLCO3A1基因、TIAM2基因、TMX4基因、UBR4基因和UBTD1基因的权重值均分别为1，ADA基因、C2CD2基因、CDKN1C基因、PRR5L基因、HLA-DOA基因、HLA-DPA1基因、HLA-DRB3基因、IDO1基因、OXTR基因、RARRES3基因、SSBP3基因和UBIAD1基因的权重值均分别为-1；

所述对照表达谱为给定人群的所述基因的mRNA表达谱。