KR101383593B1 - 염색체 입체형태 칩-상-포착(4ｃ) 에세이 - Google Patents

염색체 입체형태 칩-상-포착(4ｃ) 에세이 Download PDF

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Abstract

본 발명은 (a) 교차-결합된 DNA 표본을 제공하는 단계; (b) 교차-결합된 DNA를 1차 제한 효소로 분해하는 단계; (c) 교차-결합된 뉴클레오타이드 서열을 라이게이트하는 단계; (d) 교차 결합을 역전시키는 단계; (e) 상기 뉴클레오타이드 서열을 2차 제한 효소로 분해하는 단계; (f) 알려진 뉴클레오타이드 조성물의 하나 이상의 DNA 분자를 하나 이상의 목적 뉴클레오타이드 서열의 측면에 위치한 유용한 2차 제한 효소 분해 사이트(들)에 라이게이트하는 단계; (g) 목적 뉴클레오타이드 서열의 측면에 위치한 DNA 서열에 혼성화는 적어도 2 이상의 올리고뉴클레오타이드 프라이머를 이용하여 하나 이상의 목적 뉴클레오타이드 서열을 증폭하는 단계; (h) 증폭된 서열(들)을 어레이에 혼성화하는 단계; 및 (i) DNA 서열 사이의 상호작용 빈도를 측정하는 단계를 포함한 타겟 뉴클레오타이드 서열과 하나 이상의 목적 뉴클레오타이드 서열(즉 하나 이상의 게놈 좌위)간의 상호작용 빈도의 분석 방법에 관한 것이다.
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교차-결합, 제한 효소, 라이게이트, 뉴클레오타이드, 상호작용 빈도

Description

염색체 입체형태 칩-상-포착(4Ｃ) 에세이{Chromosome conformation capture-on-chip(4C) assay}
본 발명은 세포핵 공간 내 2 이상의 뉴클레오타이드 서열의 상호작용 빈도의 분석에 관한 것이다.
포유류 세포핵 구조에 관한 연구는 어떻게 2 미터의 DNA가 10 ㎛ 지름의 세포핵으로 접혀 세포-형태를 상술하는 정확한 유전자 발현을 가능하게 하고, 어떻게 이것이 각 세포 주기 동안 정확하게 증식되는지를 이해하는 것을 목적으로 한다. 예를 들어 조밀하게 채워진 이질염색질은 세포핵 공간 내에서 별개의 영역을 확보하는 더욱 개방된 진정염색질 및 염색체와 구분된다. 복잡한 상관관계가 세포핵 위치와 전사 활성 사이에 존재한다. 전사는 세포핵 내부에서 발생하나 염색체 상에 밀집된 활성 유전자는 염색체 영역의 가장자리 또는 외부에 우선적으로 위치한다. 염색체 영역, 동원체 또는 세포핵 주변부와 같은 매우 큰 세포핵 기준점에 대해 측정시 개별 유전자는 그의 전사 상태가 변화하면 이주한다. 더욱이 최근 β-글로빈 좌위 및 일부 선택된 다른 유전자에 대한 원위치 혼성화(FISH) 내 형광에 의해 입증된 바와 같이 염색체와 떨어진 메가염기(megabase)의 활성적으로 전사되는 유전자가 세포핵 내에서 회합할 수 있다. 전사 이외에 게놈 조직화는 복제, 재조합 및 좌위의 전위 가능성(악성을 유도할 수 있는)의 공동작용 및 개체신생 프로그램의 세팅과 리세팅과 관련된다. 이들 관찰을 기반으로 세포핵 내 DNA의 건축적 구조화는 게놈 기능에 중요한 공헌자인 것으로 판단된다.
생체 내 게놈 좌위의 공간 구조에 대한 인식을 가능하게 하는 다른 분석이 개발되었다. 홍당무 과산화효소(HRP)를 초기 RNA 전사체에 타겟시킨 후 가까운 염색질 상의 HRP-촉매된 비오틴 침전의 정량화를 포함한 RNA-TRAP로 명명된 하나의 분석이 개발되었다(Carter et al. (2002) Nat. Genet. 32, 623).
게놈 영역의 구조적 구조화를 연구하는 수단을 제공하는 염색체 입체형태 포획(3C)으로 명명된 또다른 분석이 개발되었다. 3C 기술은 세포핵 공간 내 그의 근접성을 측정하는 제공된 2개의 DNA 제한 단편 사이의 교차-결합 빈도의 정량적 PCR-분석을 포함한다(도 1 참조). 본래 효모 내 염색체의 입체형태를 분석하기 위해 개발되었고(Dekker et al., 2002) 이러한 기술은 복잡한 포유류 유전자군에서 유전자 발현과 염색질 폴딩 사이의 상관관계를 조사하도록 개조되었다(예를 들어 Tolhuis et al., 2002; Palstra et al., 2003; and Drissen et al., 2004 참조). 간단하게는 3C 기술은 생체 내 세포의 포름알데하이드 교차-결합 및 제한 효소로의 염색질 세포핵 분해후 하나의 복합체 내로 교차-결합된 DNA 단편의 라이게이션을 포함한다. 이후 라이게이션 생성물은 PCR에 의해 정량화된다. PCR 증폭 단계는 증폭되는 각각의 DNA 단편에 대한 서열 정보 지식을 요구한다. 따라서 3C 기술은 선택된 DNA 단편 사이의 상호작용 빈도의 치수를 제공한다.
세포핵 공간 내에서 서로 접촉하는 DNA 좌위에 대해 공평한 방식으로 전체 게놈을 체계적으로 선별할 수 있는 고효율 기술에 대한 요구가 존재한다.
본 발명은 3C 기술의 개선을 제공하고자 한다.
발명의 요약
현재 적용되는 3C 기술은 분석되는 각각의 단편에 대한 특정 서열 정보 지식을 요구하는 PCR 증폭 단계의 한계로 인해 제한된 수의 선택된 DNA-DNA 상호작용의 분석만을 가능하게 한다. 더욱이 광범위한 DNA 상호작용에 대한 후보로서 제한 단편을 선택하는 것은 일반적으로 유용하지 않은 목적 좌위의 실질적인 양의 사전 지식을 필요로 한다. 지금까지 기술된 많은 광범위한 DNA-DNA 상호작용의 기능적 관련성 가정시 목적 서열 - 유전자 프로모터, 인핸서, 절연서열, 침묵서열, 복제 기원 또는 MAR/SAR과 같은 - 또는 목적 게놈 영역 - 유전자-밀집 또는 유전자-결핍 영역 또는 반복 요소와 같은 -에 고리를 형성하는 DNA 요소를 무작위로 선별하는 능력이 조절 네트워크와 관련된 서열의 지도화를 크게 촉진시킬 수 있다.
본 발명은 세포핵 공간 내 2 이상의 뉴클레오타이드 서열의 상호작용 빈도의 고효율 분석을 제공하는 4C 기술(즉, 동시-위치화된 염색질의 포획 및 특성화(capture and characterise co-localised chromatin))에 관한 것이다.
4C(동시-위치화된 염색질의 포획 및 특성화) 기술은 선택 좌위와 상호작용하는 DNA 단편에 대한 공평한 게놈-광범위 검색을 가능하게 하는 3C 기술의 변형된 버전이다. 간단하게는 PCR 단계가 생략된 것을 제외하고는 3C 분석이 통상적으로 수행된다. 3C 주형은 많은 다른 목적 뉴클레오타이드 서열에 라이게이트된 미끼(즉 목적 유전자를 포함하는 선택 제한 단편)를 포함한다. 주형은 또다른 2차 제한 효소로 분할되고 라이게이트된다. 유리하게는 타겟 뉴클레오타이드 서열에 라이게이트된 하나 이상의 목적 뉴클레오타이드 서열이 각각의 프라이머가 목적 뉴클레오타이드 서열의 측면에 위치한 DNA 서열에 혼성화하는 적어도 하나 이상의(바람직하게는 적어도 2 이상의) 올리고뉴클레오타이드 프라이머를 이용하여 증폭된다. 일반적으로 이는 독립적 증폭 반응 사이에 높게 재생 가능하고 제공된 조직에 대해 특이적인 PCR 단편 패턴을 산출한다. 하나의 실시태양에서 HindⅢ 및 DpnⅡ이 1차 및 2차 제한 효소로 사용된다. 이후 증폭된 단편은 표지되고 일반적으로 대조군 표본에 대해 동일한 조합의 제한 효소로 분해된 게놈 DNA를 포함한 어레이에 선택적으로 혼성화된다.
본 발명의 하나의 바람직한 실시태양에서 2차 제한 효소에 의해 분할되는 라이게이트된 단편은 이후 리라이게이트되어 작은 DNA 고리를 형성한다.
따라서 3C 기술은 타겟 뉴클레오타이드 서열과 상호작용하는 모든 목적 뉴클레오타이드 서열이 증폭되도록 변형되었다. 실질적으로 이는 분석하고자 하는 단편에 특이적인 프라이머와의 증폭 반응을 수행하는 대신 증폭은 목적 뉴클레오타이드 서열의 측면에 위치한 DNA 서열에 혼성화하는 올리고뉴클레오타이드 프라이머(들)을 이용하여 수행됨을 의미한다. 유리하게는 4C는 PCR 증폭 단계에 포함된 PCR 프라이머 디자인에 편향되지 않고 따라서 DNA 요소와 상호작용하는 완전한 게놈을 검색하는데 이용될 수 있다.
본 발명의 관점 요약
본 발명의 관점은 수반된 청구항에 제공된다.
첫 번째 관점에 있어서, (a) 교차-결합된 DNA 표본을 제공하는 단계; (b) 교차-결합된 DNA를 1차 제한 효소로 분해하는 단계; (c) 교차-결합된 뉴클레오타이드 서열을 라이게이트하는 단계; (d) 교차 결합을 역전시키는 단계; (e) 상기 뉴클레오타이드 서열을 2차 제한 효소로 분해하는 단계; (f) 알려진 뉴클레오타이드 조성 물의 하나 이상의 DNA 분자를 하나 이상의 목적 뉴클레오타이드 서열의 측면에 위치한 유용한 2차 제한 효소 분해 사이트(들)에 라이게이트하는 단계; (g) 목적 뉴클레오타이드 서열의 측면에 위치한 DNA 서열에 혼성화는 적어도 2 이상의 올리고뉴클레오타이드 프라이머를 이용하여 하나 이상의 목적 뉴클레오타이드 서열을 증폭하는 단계; (h) 증폭된 서열(들)을 어레이에 혼성화하는 단계; 및 (i) DNA 서열 사이의 상호작용 빈도를 측정하는 단계를 포함한 타겟 뉴클레오타이드 서열과 하나 이상의 목적 뉴클레오타이드 서열(즉 하나 이상의 게놈 좌위)간의 상호작용 빈도의 분석 방법이 제공된다.
두 번째 관점에 있어서, (a) 교차-결합된 DNA 표본을 제공하는 단계; (b) 교차-결합된 DNA를 1차 제한 효소로 분해하는 단계; (c) 교차-결합된 뉴클레오타이드 서열을 라이게이트하는 단계; (d) 교차 결합을 역전시키는 단계; (e) 상기 뉴클레오타이드 서열을 2차 제한 효소로 분해하는 단계; (f) 상기 뉴클레오타이드 서열을 원형화시키는 단계; (g) 타겟 뉴클레오타이드 서열에 라이게이트된 하나 이상의 뉴클레오타이드 서열을 증폭시키는 단계; (h) 증폭된 서열을 어레이에 선택적으로 혼성화하는 단계; 및 (i) DNA 서열 사이의 상호작용 빈도를 측정하는 단계를 포함한 타겟 뉴클레오타이드 서열과 하나 이상의 목적 뉴클레오타이드 서열(즉 하나 이상의 게놈 좌위)간의 상호작용 빈도의 분석 방법이 제공된다.
세 번째 관점에 있어서, 첫 번째 및 두 번째 뉴클레오타이드 서열을 포함한 원형화 뉴클레오타이드 서열이 제공되고, 상기 첫 번째 및 두 번째 뉴클레오타이드 서열의 각각의 말단은 다른 제한 효소 인식 사이트에 의해 구별되고 상기 첫 번째 뉴클레오타이드 서열은 타겟 뉴클레오타이드 서열이고 상기 두 번째 뉴클레오타이드 서열은 게놈 DNA를 교차-결합시킴으로서 수득 가능함을 특징으로 한다.
네 번째 관점에 있어서, (a) 교차-결합된 DNA 표본을 제공하는 단계; (b) 교차-결합된 DNA를 1차 제한 효소로 분해하는 단계; (c) 교차-결합된 뉴클레오타이드 서열을 라이게이트하는 단계; (d) 교차 결합을 역전시키는 단계; (e) 상기 뉴클레오타이드 서열을 2차 제한 효소로 분해하는 단계; 및 (f) 상기 뉴클레오타이드 서열을 원형화시키는 단계를 포함한 원형화 뉴클레오타이드 서열의 제조 방법이 제공된다.
다섯 번째 관점에 있어서, 원형화 뉴클레오타이드 서열의 이용을 포함한 타겟 뉴클레오타이드 서열과 하나 이상의 뉴클레오타이드 서열(즉 하나 이상의 게놈 좌위)과의 상호작용 빈도의 분석 방법이 제공된다.
여섯 번째 관점에 있어서, 원형화 뉴클레오타이드 서열에 혼성화하거나 이에 혼성화하는 것이 가능한 하나 이상의 프로브를 포함한 지지체 상에 고정된 프로브 어레이가 제공된다.
일곱 번째 관점에 있어서, 게노 DNA 내 1차 제한 효소의 1차 제한 효소 인식 사이트 각각에 인접한 세포핵 서열에 대해 상보적인 프로브 세트가 제공된다.
여덟 번째 관점에 있어서, (a) 게놈 DNA 내 1차 제한 효소에 대한 1차 제한 효소 인식 사이트 각각을 확인하는 단계; (b) 게놈 DNA 내 1차 제한 제한 효소 인식 사이트 각각에 인접한 서열에 혼성화하는 것이 가능한 프로브를 디자인하는 단계; (c) 상기 프로브를 합성하는 단계; 및 (d) 상기 프로브를 함께 결합시켜 프로브 세트 또는 실질적인 프로브 세트를 형성하는 단계를 포함한 프로브 세트의 제조 방법이 제공된다.
아홉 번째 관점에 있어서, 여기서 기술된 방법에 의해 수득되거나 수득 가능한 프로브 세트 또는 실질적인 프로브 세트가 제공된다.
열 번째 관점에 있어서, 여기서 기술된 프로브 어레이 또는 실질적인 프로브 세트를 포함한 어레이가 제공된다.
열한 번째 관점에 있어서, 여기서 기술된 프로브 세트를 포함한 어레이가 제공된다.
열두 번째 관점에 있어서, 여기서 기술된 프로브 어레이 또는 실질적인 프로 브 세트를 고형 지지체 상에 고정시키는 단계를 포함한 어레이 제조 방법이 제공된다.
열세 번째 관점에 있어서, 여기서 기술된 프로브 어레이 또는 프로브 세트를 고형 지지체 상에 고정시키는 단계를 포함한 어레이 제조 방법이 제공된다.
열네 번째 관점에 있어서, 여기서 기술된 방법에 의해 수득되거나 수득 가능한 어레이가 제공된다.
열다섯 번째 관점에 있어서, 본 발명의 첫 번째 및 두 번째 관점의 (a)∼(i) 단계를 수행하는 단계를 포함하고, 상기 (a) 단계에서 교차-결합된 DNA 표본이 질병에 걸린 세포 및 질병에 걸리지 않은 세포에서 제공되고, 질병에 걸린 세포 및 질병에 걸리지 않은 세포 유래 DNA 서열 사이의 상호작용 빈도간의 차이가 DNA-DNA 상호작용이 특정 질병 상태를 표시함을 특징으로 하는 특정 질병 상태를 표시하는 하나 이상의 DNA-DNA 상호작용의 확인 방법이 제공된다.
열여섯 번째 관점에 있어서, 본 발명의 첫 번째 및 두 번째 관점의 (a)∼(i) 단계를 수행하는 단계를 포함하고, 상기 (a) 단계는 피험체 유래 교차-결합된 DNA 표본을 제공하는 단계를 포함하고, 상기 단계 (i)는 상기 DNA 서열과 영향 받지 않은 대조군간의 상호작용 빈도를 비교하는 단계를 포함하고, 대조군으로부터 수득된 수치와 피험체로부터 수득된 수치간의 차이는 피험체가 질병 또는 증후군에 걸려 있거나 피험자가 질병 또는 증후군에 걸릴 것임을 표시함을 특징으로 하는 DNA-DNA 상호작용 내 변화에 의해 유발되거나 그와 관련된 질병 또는 증후군의 진단 또는 예측 방법이 제공된다.
열일곱 번째 관점에 있어서, 본 발명의 첫 번째 및 두 번째 관점의 (a)∼(i) 단계를 수행하는 단계를 포함하고, 상기 (a) 단계는 피험체 유래 교차-결합된 DNA 표본을 제공하는 단계를 포함하고, 상기 방법은 (j) 질병과 관련된 게놈 재배열을 수행하는 하나 이상의 좌위를 확인하는 추가 단계를 포함함을 특징으로 하는 DNA-DNA 상호작용 내 변화에 의해 유발되거나 그와 관련된 질병 또는 증후군의 진단 또는 예측 방법이 제공된다.
열여덟 번째 관점에 있어서, (a) 표본을 하나 이상의 작용제와 접촉시키는 단계; 및 (b) 본 발명의 첫 번째 및 두 번째 관점의 (a)∼(i) 단계를 수행하는 단계를 포함하고, 상기 (a) 단계는 피험체 유래 교차-결합된 DNA 표본을 제공하는 단계를 포함하고, (i) 작용제 내에 존재하는 DNA 서열간의 상호작용 빈도와 작용제 내에 부재하는 DNA 서열간의 상효작용 빈도 사이의 차이는 DNA-DNA 상호작용을 조절하는 작용제를 표시함을 특징으로 하는 DNA-DNA 상호작용을 조절하는 하나 이상의 작용제의 확인 분석 방법이 제공된다.
열아홉 번째 관점에 있어서, (a) 본 발명의 첫 번째 및 두 번째 관점의 (a)∼(i) 단계를 수행하는 단계; 및 상기 DNA 서열과 대조군간의 상호작용 빈도를 비교하는 단계를 포함하고, 대조군과 비교시 표본 내 낮은 DNA-DNA 상호작용 빈도에서 높은 것으로의 변화는 구분점(breakpoint) 위치를 표시함을 특징으로 하는 균형 및/또는 불균형 구분점(즉 전위) 위치의 검출 방법이 제공된다.
스무 번째 관점에 있어서, (a) 본 발명의 첫 번째 및 두 번째 관점의 (a)∼(i) 단계를 수행하는 단계; 및 상기 DNA 서열과 대조군간의 상호작용 빈도를 비교하는 단계를 포함하고, 대조군과 비교시 표본에 대한 DNA-DNA 상호작용 빈도의 연전된 패턴은 역위를 표시함을 특징으로 하는 균형 및/또는 불균형 역위 위치의 검출 방법이 제공된다.
스물 한 번째 관점에 있어서, (a) 본 발명의 첫 번째 및 두 번째 관점의 (a)∼(i) 단계를 수행하는 단계; 및 상기 DNA 서열과 대조군간의 상호작용 빈도를 비교하는 단계를 포함하고, 대조군과 비교시 표본에 대한 DNA-DNA 상호작용 빈도의 축소는 결실을 표시함을 특징으로 하는 결실 위치의 검출 방법이 제공된다.
스물 두 번째 관점에 있어서, (a) 본 발명의 첫 번째 및 두 번째 관점의 (a)∼(i) 단계를 수행하는 단계; 및 상기 DNA 서열과 대조군간의 상호작용 빈도를 비교하는 단계를 포함하고, 대조군과 비교시 표본에 대한 DNA-DNA 상호작용 빈도의 증가 또는 감소는 중복 또는 삽임을 표시함을 특징으로 하는 중복 위치의 검출 방법이 제공된다.
스물 세 번째 관점에 있어서, 여기서 기술된 분석 방법에 의해 수득되거나 수득 가능한 작용제가 제공된다.
스물 네 번째 관점에 있어서, 표본 내 하나 이상의 DNA-DNA 상호작용을 확인하기 위한 원형화 뉴클레오타이드 서열의 이용이 제공된다.
스물 다섯 번째 관점에 있어서, DNA-DNA 상호작용 내 변화에 의해 유발되거나 그와 관련된 질병 또는 증후군의 진단 또는 예측을 위한 원형화 뉴클레오타이드 서열의 이용이 제공된다.
스물 여섯 번째 관점에 있어서, 표본 내 하나 이상의 DNA-DNA 상호작용을 확인하기 위한 여기서 기술된 프로브 어레이 또는 프로브 세트의 이용이 제공된다.
스물 일곱 번째 관점에 있어서, DNA-DNA 상호작용 내 변화에 의해 유발되거나 그와 관련된 질병 또는 증후군의 진단 또는 예측을 위한 프로브 어레이 또는 프로브 세트의 이용이 제공된다.
스물 여덟 번째 관점에 있어서, 표본 내 하나 이상의 DNA-DNA 상호작용을 확인하기 위한 여기서 기술된 어레이의 이용이 제공된다.
스물 아홉 번째 관점에 있어서, DNA-DNA 상호작용 내 변화에 의해 유발되거나 그와 관련된 질병 또는 증후군의 진단 또는 예측을 위한 어레이의 이용이 제공된다.
서른 번째 관점에 있어서, 실시예 또는 도면을 참고로 여기서 기술된 방법, 프로브 어레이, 프로브 세트, 방법, 어레이, 분석 방법, 작용제 또는 이용이 제공된다.
바람직한 실시태양
바람직하게는 단계 (f)에서의 라이게이션 반응은 DNA 고리 형성을 유발한다.
바람직하게는 타겟 뉴클레오타이드 서열은 게놈 재배열, 프로모터, 인핸서, 침묵서열, 절연서열, 매트릭스 부착 영역, 좌위 조절 영역, 전사 단위, 복제 기원, 재조합 핫스팟(hotspot), 전위 구분점, 동원체, 종말체, 유전자-밀집 영역, 유전자-결핍 영역, 반복 요소 및 (바이러스성) 도입 사이트로 구성된 군으로부터 선택된다.
바람직하게는 타겟 뉴클레오타이드 서열은 질병과 관련되거나 이를 유발시키거나 질병과 관련되거나 이를 유발하는 좌위 유래 선형 DNA 주형 상의 15 Mb까지 또는 그 이상으로 위치하는 뉴클레오타이드 서열이다.
바람직하게는 타겟 뉴클레오타이드 서열은 AMLl, MLL, MYC, BCL, BCR, ABLl, IGH, LYLl, TALI, TAL2, LM02, TCRα/δ, TCRβ 및 HOX 또는 "Catalogue of Unbalanced Chromosome Aberrations in Man" 2nd edition. Albert Schinzel. Berlin: Walter de Gxuyter, 2001. ISBN.3-11-011607-3에 기술된 질병과 관련된 다른 좌위로 구성된 군에서 선택된다.
바람직하게는 1차 제한 효소는 6∼8 bp 인식 사이트를 인식하는 제한 효소이다.
바람직하게는 1차 제한 효소는 BgIH, HindⅢ, EcoRI, BamHL, SpeI, PstI 및 NdeI로 구성된 군에서 선택된다.
바람직하게는 2차 제한 효소는 4 또는 5 bp 뉴클레오타이드 서열 인식 사이트를 인식하는 제한 효소이다.
바람직하게는 2차 제한 효소 인식 사이트는 타겟 뉴클레오타이드 서열내 1차 제한 사이트 유래의 약 350 bp보다 더 크게 위치한다.
바람직하게는 뉴클레오타이드 서열은 표지된다.
바람직하게는 프로브는 게놈 DNA 내 1차 제한 효소의 1차 제한 효소 인식 사이트 각각의 측면에 인접한 핵산 서열에 상보적이다.
바람직하게는 프로브는 게놈 DNA 내 1차 제한 효소의 1차 제한 효소 인식 사이트 각각으로부터의 300 염기쌍보다 더 작은 핵산 서열에 상보적이다.
바람직하게는 프로브는 게놈 DNA 내 1차 제한 효소의 1차 제한 효소 인식 사이트 각각으로부터의 300 bp보다 더 작은 서열에 상보적이다.
바람직하게는 프로브는 게놈 DNA 내 1차 제한 효소의 1차 제한 효소 인식 사이트 각각으로부터의 200∼300 bp인 서열에 상보적이다.
바람직하게는 프로브는 게놈 DNA 내 1차 제한 효소의 1차 제한 효소 인식 사이트 각각으로부터의 100∼200 bp 또는 0∼100 bp인 서열에 상보적이다.
바람직하게는 2 이상의 프로브는 게놈 DNA 내 1차 제한 효소의 차 제한 효소 인식 사이트 각각에 인접한 서열에 혼성화하는 것이 가능하다.
바람직하게는 프로브는 증복되거나 부분적으로 중복된다.
바람직하게는 중복은 10개 뉴클레오타이드 이하이다.
바람직하게는 프로브 서열은 1차 제한 효소의 1차 제한 효소 인식 사이트 각각과 2차 제한 효소의 첫 번째로 인접한 2차 제한 효소 인식 사이트 각각 사이의 서열 모두 또는 일부에 대응된다.
바람직하게는 각각의 프로브는 적어도 25 mer 이상이다.
바람직하게는 각각의 프로브는 25∼60 mer이다.
바람직하게는 프로브는 PCR 증폭 생성물이다.
바람직하게는 어레이는 약 300,000∼400,000개 프로브를 포함한다.
바람직하게는 어레이는 약 385,000개 이상의 프로브, 바람직하게는 약 750,000개 프로브, 더욱 바람직하게는 6 × 750,000개 프로브를 포함한다.
바람직하게는 선형 염색체 주형 상에 순서대로 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개의 모든 프로브 중의 하나가 어레이 내에 포함된다.
바람직하게는 낮은 상호작용 빈도에서 높은 것으로의 변환은 균형 및/또는 불균형 구분점의 위치를 표시한다.
바람직하게는 대조군과 비교시 피험체 표본에 대한 DNA-DNA 상호작용 빈도의 역전 패턴은 균형 및/또는 불균형 역위를 표시한다.
바람직하게는 대조군과 비교시 더욱 먼 영역에 대한 DNA-DNA 상호작용 빈도 내 증가와 결합하여 피험체 표본에 대한 DNA-DNA 상호작용 빈도의 축소는 균형 및/또는 불균형 결실을 표시한다.
바람직하게는 대조군과 비교시 피험체 표본에 대한 DNA-DNA 상호작용 빈도의 증가 또는 감소는 균형 및/또는 불균형 중복 또는 삽입을 표시한다.
바람직하게는 스펙트럼 핵형분석 및/또는 FISH가 상기 방법 수행 전에 이용된다.
바람직하게는 질병은 유전 질환이다.
바람직하게는 질병은 암이다.
바람직하게는 2 이상의 증폭 서열은 차별적으로 표지된다.
바람직하게는 2 이상의 증폭 서열은 서열이 다른 염색체 상에 존재시 동일하게 표지된다.
바람직하게는 2 이상의 증폭 서열은 서열이 DNA-DNA 상호작용 신호 사이의 최소 중복에 충분히 멀리에 동일한 염색체 상에 존재시 동일하게 표지된다.
바람직하게는 진단 또는 예측은 산전 진단 또는 예측이다.
장점
본 발명은 많은 장점을 지닌다. 이들 장점은 하기 설명에서 명백할 것이다.
예로서 본 발명은 특히 상업적으로 유용한 뉴클레오타이드 서열, 방법, 프로브 및 어레이를 제공하기 때문에 유리하다.
또다른 예로서 본 발명은 세포핵 공간 내 2 이상의 뉴클레오타이드 서열의 상호작용 빈도의 고효율 분석을 제공하기 때문에 유리하다.
또다른 예로서 본 발명은 통상의 3C 기술을 이용하는 경우 각각의 단일 DNA-DNA 상호작용이 특정 프라이머쌍을 포함한 특정 PCR 반응에 의해 분석되어야 하기 때문에 유리하다. 따라서 고효율 분석은 PCR이 자동화되어야 가능하나 많은 프라이머의 비용은 높아질 것이다. 따라서 DNA-DNA 상호작용의 고효율(게놈-광범위) 분석은 통상의 3C 기술로는 가능하지 않다. 이와 대조적으로 본 발명은 수천개의 DNA-DNA 상호작용의 동시 선별을 가능하게 한다. 본 발명에 따른 DNA-DNA 상호작용의 고효율 분석은 분석 규모 및 분석능을 크게 증가시킬 것이다.
또다른 예로서 본 발명은 통상의 3C 기술을 이용하는 경우 분석시 올리고뉴클레오타이드 프라이머가 디자인되고 정렬되고 포함되는 DNA 서열에 편향되기 때문에 유리하다. 일반적으로 이러한 올리고뉴클레오타이드 프라이머의 선택은 예를 들어 조사되는 뉴클레오타이드 서열과 교차-결합할 것으로 판단되는 (별개의) 인핸서 및/또는 달느 조절 요소/과민성 사이트의 위치에 관한 지식에 기반한다. 따라서 통상의 3C는 PCR 증폭 단계에 포함된 PCR 프라이머 디자인에 편향되는 반면 4C 는 편향되지 않고 상호작용 DNA 요소에 대한 완전한 게놈을 검색하는데 이용될 수 있다. 이는 4C의 교차-결합된 서열의 증폭이 조사되는 뉴클레오타이드 서열과 교차-결합하는 서열의 예측 지식에 기반하지 않기 때문이다. 오히려 4C의 하나의 실시태양에서 첫 번째(타겟) 뉴클레오타이드 서열에 교차 결합하는 서열은 뉴클레오타이드 서열에 혼성화하는 PCR 프라이머를 이용하여 증폭될 수 있다. 따라서 본 발명은 DNA-DNA 상호작용에 대한 편향되지 않은 게놈-광범위 선별을 가능하게 한다.
또다른 예로서 본 발명은 통상의 3C 기술의 이용이 단일 DNA-DNA 상호작용의 선택적 증폭만을 가능하게 하기 때문에 유리하다. 이는 어레이에 혼성화시 정보를 제공하지 않는다. 상기 기술은 첫 번째(타겟) 뉴클레오타이드 서열과 상호작용하는 모든 단편이 현재 증폭 즉 선택적으로 증폭되도록 개선되었다.
또다른 예로서 본 발명은 4C 기술이 핵산 예를 들어 염색체 내 균형 또는 불균형 유전자 이상 - 모든 형태의 전위, 결실, 역위, 중복 및 다른 유전자 재배열 -을 검출하는데 이용될 수 있기 때문에 유리하다. 4C 기술(DNA 단편의 근접성을 측정하는)은 특정 전위, 결실, 역위, 중복 및 다른 유전자 재배열(즉 균형 또는 불균형 전위, 결실, 역위, 중복 또는 다른 유전자 재배열)을 획득하는 피험체 소질을 측정할 수도 있다. 현재 전략에 대한 장점은 '4C-미끼'(분석되는 1차 및 2차 제한 효소 인식 사이트에 의해 한정되는)가 변화로부터 멀리(즉 메가염기 이상까지) 위치하여도 재배열을 검출할 수 있는 4C 기술의 분석능으로 인해 변화의 정확한 위치를 알 필요가 없다는 점이다. 또다른 장점은 4C 기술이 변화가 발생되는 2개의(1차) 인식 사이트를 한정하는데 이용될 수 있기 때문에 변화의 정확한 지도화를 가능하게 한다는 점이다. 또다른 장점은 세포가 고정 전 배양될 필요가 없다는 점이다. 따라서 예를 들어 고형 종양도 유전자 재배열에 대해 분석될 수 있다.
또다른 예로서 본 발명은 4C 기술이 전-악성 상태 즉 모든 세포가 이들 변화를 포함하기 전에 변화(즉 재배열)도 검출할 수 있기 때문에 유리하다. 따라서 본 기술은 질병의 진단뿐만 아니라 질병의 예측에도 이용될 수 있다.
또다른 예로서 본 발명에 따른 어레이 디자인은 단일 어레이 당 더 많은 부분의 게놈의 표시를 가능하게 하기 때문에 현존하는 게놈 타일링(tiling) 어레이 - Nimblegen 게놈 타일링 어리에와 같은 - 와 비교시 특히 유리하다. 예로서 헥사-뉴클레오타이드 서열을 인식하는 제한 효소의 경우 약 385,000개 프로브 각각을 지닌 약 3개 어레이는 예를 들어 완전한 인간 또는 마우스 게놈을 포함하는데 충분할 것이다. 6 bp 이상을 인식하는 제한 효소의 경우 약 385,000개 프로브의 단일 프로브는 예를 들어 완전한 인간 또는 마우스 게놈을 포함하는데 이용될 수 있다. 어레이 디자인의 장점은: (1) 각각의 프로브가 독립적인 라이게이션 이벤트를 분석하여 결과 해석을 크기 촉진시키기 때문에 유익하고; (2) 게놈의 큰 표시가 비용 효율이 높은 단일 어레이 상에서 반점으로 찍힐 수 있다는 점이다.
4C 기술은 세포유전학 접근(광학 현미경, FISH, SKY 등)에 의해 검출된 불충분하게 특성화된 재배열의 미세-지도화에 유리하게 이용될 수 있다.
4C 기술은 발생한 재배열의 조합에 대해 단일 어레이 상에서 세포핵 다수 좌위를 동시 선별하는데 유리하게 이용될 수 있다.
3C 기술
3C 방법은 Dekker et al.(2002), Tolhuis et al.(2002), Palstra et al.(2003), Splinter et al.(2004) 및 Drissen et al.(2004)에 기술되어 있다. 간단하게는 3C는 1차 제한 효소로 교차-결합된 DNA를 분해한 후 매우 낮은 DNA 농도로 라이게이션함으로서 수행된다. 이러한 조건 하에서 분자 내의 교차-결합된 단편의 라이게이션은 분자 간의 무작위 단편의 라이게이션에 대해 매우 우선적이다. 이후 교차-결합은 역전되고 개별적인 라이게이션 생성물이 검출되고 좌위-특이적 프라이머를 이용한 중합효소 연쇄 반응(PCR)에 의해 정량화된다. 2개의 특정 좌위의 교차 결합 빈도(X)는 대조군 및 교차-결합된 주형을 이용한 정량적 PCR 반응에 의해 결정되고, X는 교차-결합된 주형 및 대조군 주형으로 수득된 생성물 함량 비율로 표기된다.
본 발명에 따라 3C 주형은 Splinter et al,(2004) Methods Enzymol. 375, 493-507에 기술된 방법을 이용하여 제조된다(즉, 포름알데하이드 고정, 교차-결합된 DNA 단편의 (1차) 제한 효소 분해, 리-라이게이션 및 DNA 정제). 간단하게는 표본 - 세포, 조직 또는 세포핵과 같은 -은 교차-결합제 - 포름알데하이드와 같은 -를 이용하여 고정된다. 이후 1차 제한 효소 분해가 수행되어 DNA가 교차-결합된 세포핵 내에서 분해된다. 이후 분자 내 라이게이션이 낮은 DNA 농도(예를 들어 약 3.7 ng/㎕)에서 수행되고, 이는 비-교차-결합 DNA 단편 간의 라이게이션(즉, 분자 간 또는 무작위 라이게이션)보다 교차-결합된 DNA 단편(즉, 분자 내 라이게이션)을 선호한다. 다음으로 교차 결합이 역전되고 DNA는 정제될 수 있다. 생성되는 3C 주형은 세포핵 공간에 본래 근접하기 때문에 라이게이트되는 제한 단편을 포함한다.
1차 제한 효소가 분자 내 라이게이션 단계 이전에 DNA를 분해하는데 사용되기 때문에 1차 제한 효소에 대한 효소 인식 사이트는 첫 번째(타겟) 뉴클레오타이드 서열과 라이게이트된 뉴클레오타이드 서열을 분리할 것이다. 따라서 1차 인식 사이트는 첫 번째(타겟) 뉴클레오타이드 서열과 라이게이트된 뉴클레오타이드 서열(즉, 라이게이트된 두 번째 서열) 사이에 위치한다.
뉴클레오타이드 서열
본 발명은 데이터베이스에서 이용 가능한 뉴클레오타이드 서열(즉, 3C 주형, 4C 주형, DNA 주형, 증폭 주형, DNA 단편 및 게놈 DNA)의 이용에 관한 것이다.
뉴클레오타이드 서열은 게놈 DNA 또는 RNA, 합성 또는 재조합 기원 즉 cDNA이다. 예를 들어 재조합 뉴클레오타이드 서열은 PCR 클로닝 기술을 이용하여 제조된다. 이는 바람직한 클론 서열의 측면에 위치한 프라이머 쌍을 제조하고, 상기 프라이머를 예를 들어 포유류(즉 동물 도는 인간 세포) 또는 비-포유류 세포에서 수득된 mRNA 또는 cDNA와 접촉시키고, 바람직한 영역의 증폭을 유발하는 조건 하에서 중합효소 연쇄 반응(PCR)을 수행하고 증폭된 단편을 분리하고(즉, 아가로스 겔 상에서 반응 혼합물을 정제함으로서) 증폭된 DNA를 회수하는 것을 포함할 것이다. 증폭된 DNA가 적당한 클로닝 벡터 내로 클론될 수 있도록 프라이머는 적당한 제한 효소 인식 사이트를 포함하도록 디자인된다.
뉴클레오타이드 서열은 센스 또는 안티센스 나선 또는 그의 결합을 나타내는 이중-나선 또는 단일-나선이다.
일부 관점에 있어서 뉴클레오타이드 서열은 단일 나선 프라이머 또는 프로브와 같은 단일-나선 DNA인 것이 바람직하다.
일부 관점에 있어서 뉴클레오타이드 서열은 이중 나선 3C 및 4C 주형과 같은 이중-나선 DNA인 것이 바람직하다.
일부 관점에 있어서 뉴클레오타이드 서열은 염색체 DNA인 것이 바람직하다.
뉴클레오타이드 서열은 첫 번째(타겟) 뉴클레오타이드 서열 및/또는 두 번째 뉴클레오타이드 서열을 포함한다.
1차 및 2차 제한 효소 인식 사이트는 서로 상이할 것이고 일반적으로 뉴클레오타이드 서열 내에서 단 한번 발생할 것이다.
하나의 관점에서 첫 번째 뉴클레오타이드 서열 및 1차 및 2차 제한 효소 인식 사이트에 의해 분리되는(즉 분열되거나 분할되는) 두 번째 뉴클레오타이드 서열(즉, 라이케이트되는)을 포함한 원형화 뉴클레오타이드 서열이 제공되고, 상기 첫 번째 뉴클레오타이드 서열은 타겟 뉴클레오타이드 서열이고, 상기 두 번째 뉴클레오타이드 서열은 게놈 DNA를 교차-결합시킴으로서(즉 생체 내 또는 시험관 내) 수득 가능하다. 1차 및 2차 제한 효소 인식 사이트는 서로 상이할 것이고 일반적으로 뉴클레오타이드 서열 내엣 단 한번 발생할 것이다.
또다른 관점에서 첫 번째 뉴클레오타이드 서열 및 1차 및 2차 제한 효소 인식 사이트에 의해 분리되는(즉 분열되거나 분할되는) 두 번째 뉴클레오타이드 서열(즉, 라이케이트되는)을 포함한 원형화 뉴클레오타이드 서열이 제공되고, 상기 첫 번째 뉴클레오타이드 서열은 타겟 뉴클레오타이드 서열이고, 상기 첫 번째 및 두 번째 뉴클레오타이드 서열은 (a) 게놈 DNA를 교차-결합시키는 단계(즉 생체 내 또는 시험관 내); (b) 1차 제한 효소로 상기 교차-결합된 DNA를 분해하는 단계; (c) 교차-결합된 뉴클레오타이드 서열을 라이게이트하는 단계; (d) 교차 결합을 역전시키는 단계; 및 (d) 뉴클레오타이드 서열을 원형화시키기 위해 2차 제한 효소로 상기 뉴클레오타이드 서열을 분해하는 단계를 포함한 과정에 의해 수득 가능하다.
바람직하게는 두 번째 뉴클레오타이드 서열은 첫 번째(타겟) 뉴클레오타이드 서열을 교차시킨다(즉, 이등분함). 따라서 뉴클레오타이드 서열은 첫 번째(타겟) 뉴클레오타이드 서열을 2개의 부분 또는 단편 - 2개의 거의 동등한 크기의 부분 또는 단편과 같은 -으로 분리시키는 2번째 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 일반적으로 부분 또는 단편은 적어도 16개 이상의 뉴클레오타이드 길이일 것이다.
첫 번째 뉴클레오타이드 서열
첫 번째 뉴클레오타이드 서열은 타겟 뉴클레오타이드 서열이다.
여기서 사용된 "타겟 뉴클레오타이드 서열"이라는 용어는 교차-결합되는 하나 이상의 서열(즉, 하나 이상의 교차 뉴클레오타이드 서열 또는 하나 이상의 알려지지 않은 뉴클레오타이드 서열 조성물 서열)을 확인하기 위해 미끼 서열로 사용되는 서열을 나타낸다.
타겟 뉴클레오타이드 서열은 알려진 서열이다.
교차-결합은 타겟 뉴클레오타이드 서열 및 그에 교차-결합된 서열이 세포핵 공간에 본래 근접함을 나타낸다. 서열이 서로 근접하게 되는 빈도를 측정함으로서 예를 들어 세포핵 공간 내 염색체 구조 또는 염색체 영역을 이해하는 것이 가능하다(즉 생체 내 또는 시험관 내). 더욱이 예를 들어 인핸서 또는 다른 인사 조절 요소가 시스 또는 트랜스로 위치한 원거리의 프로모터와 교통하는 경우 게놈 내 복잡한 구조 조직화를 이해하는 것이 가능하다. 더욱이 다른 염색체 상의(트랜스) 뉴클레오타이드 서열뿐만 아니라 동일한 염색체 상에 존재하는(시스) 뉴클레오타이드 서열에 대한 제공된 게놈 영역의 위치화를 이해하는 것이 가능하다. 따라서 세포핵 공간 내에서 빈번하게 사이트를 공유하는 다른 염색체 상의 뉴클레오타이드 서열을 지도화하는 것이 가능하다. 더욱이 균형 및/또는 불균형 유전자 변형 - 균형 및/또는 불균형 전위, 결실, 전도, 중복 및 다른 게놈 재배열(즉 하나 이상의 염색체 내 결실 또는 전위)과 같은 -을 검출하는 것이 가능하다. 이에 대해 유전자 변형은 검출될 수 있는 변화가 발생된 위치에서의 DNA-DNA 상호작용 내 변화를 유발한다.
본 발명에 따른 첫 번째(타겟) 뉴클레오타이드 서열은 세포핵 공간 내 하나 이상의 다른 서열과의 상호작용 빈도를 측정하는데 바람직한 어떠한 서열도 될 수 있다.
하나의 실시태양에서 두 번째 제한 효소가 1차 제한 사이트로부터 약 350 bp 이상에서 첫 번째(타게) 뉴클레오타이드 서열을 절단하도록 선택되기 때문에 첫 번째(타겟) 뉴클레오타이드 서열은 약 359 bp 길이 이상일 것이다.
이는 국소해부학적 제약으로 인해 원형 형태 내 편향을 최소화한다(Rippe et al.(2001) Trends in Biochem. Sciences 26, 733-40).
적당하게는 증폭 후 첫 번째(타겟) 뉴클레오타이드 서열은 두 번째 뉴클레오타이드 서열을 증폭시키는데 사용된 적어도 2 이상의 증폭 프라이머의 최소 길이가 각각 약 16개 염기라는 사실에 의해 약 32개 bp를 포함한다.
바람직한 실시태양에서 첫 번째(타겟) 뉴클레오타이드 서열은 프로모터, 인핸서, 침묵제(silencer), 절연제, 매트릭스 부착 영역, 좌위 조절 영역, 전사 단위, 복제 기원, 재조합 핫스팟(hotspot), 전좌 구분점, 동원체, 종말체, 유전자-밀집 영역, 유전자-부족 영역, 반복 요소, (바이러스성) 도입 사이트, 결실 및/또는 돌연변이가 영향(즉, 질병, 생리적, 기능적 또는 구조적 영향 - SNP(단일 뉴클레오타이드 다형증)와 같은)에 관련된 뉴클레오타이드 서열 또는 이러한 결실 및/또는 돌연변이를 포함한 뉴클레오타이드 서열(들) 또는 세포핵 공간 내에서 다른 서열과의 상호작용 빈도를 측정하기에 바람직한 서열을 완전하게 또는 부분적으로(즉, 단편) 포함하거나 이에 근접한다(즉 부근에 존재).
상기 기술된 바와 같이 첫 번째(타겟) 뉴클레오타이드 서열은 유전자 변형 - 결실 및/또는 돌연변이와 같은 -이 영향(즉, 질병)에 관련된 뉴클레오타이드 서열을 완전하게 또는 부분적으로(즉, 단편) 포함하거나 이에 근접한다(즉, 부근에 존재). 따라서 본 발명의 이러한 실시태양에 따라 첫 번째(타겟 뉴클레오타이드 서열)는 변화가 질병 - 유전성 질환 또는 선천성 질환과 같은 -과 관련되거나 연관된 유전자 영역에 인접하거나(물리적인 DNA 주형 상에 존재) 그 영역 내에 존재하는 뉴클레오타이드 서열(즉 유전자 또는 좌위)이다. 즉, 첫 번째(타겟) 뉴클레오타이드 서열은 임상적 표현형과 연관성을 기반으로 선택된다. 바람직한 실시태양에서 변화는 하나 이상의 염색체 내의 변화이고 질병은 예를 들어 하니 이상의 결실, 하나 이상의 전좌, 하나 이상의 중복 및/또는 하나 이상의 전도 등의 결과이다.
이러한 유전자/좌위의 비-한정적 예는 AMLl, MLL, MYC, BCL, BCR, ABLl, 면역글로불린 좌위인 LYLl, TAL1, TAL2, LMO2, TCRα/δ, TCRβ, HOX 및 다양한 림프모구백혈병의 다른 좌위이다.
다른 예는 하기와 같은 전자 데이터베이스 내에 기술되어 있다:
http://www.ncbi.nkn.nih.gov/entrez/query.fcgi?db==cancerchromosomes
http://cgap.nci.nih.gov/Chromosomes/Miteknan
http://www.progenetix.net/progenetix/P14603437/ideogram.html
http://www.changbioscience.com/cytogenetics/cytol.pl?query=47,xy
http://www.possum.net.au/
http://www.lmdatabases.com/
http://www.wiley.com/legacy/products/subject/life/borgaonkar/index.html
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=OMIM
http://www.sanger.ac.uk/PostGenomics/decipher/
http://agserverOl.azn.nl:8O8O/ecaruca/ecaruca.jsp
다른 예는 "Catalogue of Unbalanced Chromosome Aberrations in Man" 2nd edition. Albert Schinzel. Berlin: Walter de Grayter, 2001. ISBN 3-11- 011607-3에 기술되어 있다.
하나의 실시태양에서 "인접한"이라는 용어는 2개의 인접한 서열간에 중재 뉴클레오타이드가 존재하지 않는 "직접적으로 인접한"을 의미한다.
또다른 실시태양에서 핵산 서열 및 1차 제한 효소 인식 사이트 내에서의 "인접한"이라는 용어는 핵산 서열과 1차 제한 효소 인식 사이트간에 중재 뉴클레오타이드가 존재하지 않는 "직접적으로 인접한"을 의미한다.
두 번째 뉴클레오타이드 서열은 교차-결합 게놈 DNA에 의해 수득 가능하거나 수득되거나 확인되거나 확인 가능하다(예를 들면 생체 내 또는 시험관 내).
두 번째 뉴클레오타이드 서열(예를 들면 목적 뉴클레오타이드 서열)은 표본을 교차-결합제로 처리하고 교차-결합된 DNA 단편을 분해/라이게이트한 후 첫 번째(타겟) 뉴클레오타이드 서열에 라이게이트된다. 이러한 서열은 세포핵 공간에 본래 근접하기 때문에 첫 번째(타겟) 뉴클레오타이드 서열에 교차-결합되고 라이게이션 조건이 무작위 라이게이션 이벤트보다 교차-결합된 DNA 단편(분자내)간의 라이게이션을 선호하기 때문에 첫 번째(타겟) 뉴클레오타이드 서열에 라이게이트된다.
변경 - 전좌, 결실, 전도, 중복 및 다른 게놈 재배열과 같은 -에 기반한 질병은 일반적으로 이상 DNA-DNA 상호작용에 의해 유발된다. 4C 기술은 주로 게놈 사이트 분리의 기능인 DNA-DNA 상호작용 빈도를 측정하고 즉 DNA-DNA 상호작용 빈도는 동일한 물리적 DNA 주형 상에 존재하는 2개의 DNA 좌위 사이의 선형 거리(킬로염기 내)에 반비례하다(Dekker et al., 2002). 따라서 신규 및/E호는 물리적으로 다른 DNA 주형을 생성하는 변경(들)은 변경된 DNA-DNA 상호작용에 의해 달성되고 이는 4C 기술에 의해 측정될 수 있다.
적당하게는 두 번째 뉴클레오타이드 서열은 적어도 40개 이상의 염기쌍이다.
교차-결합제 - 포름알데하이드와 같은 -는 다른 이웃한 단백질 및 핵산에 단백질을 교차 결합시키는데 사용될 수 있다. 따라서 2 이상의 뉴클레오타이드 서열은 이들 뉴클레오타이드 서열(중의 하나)에 결합된 단백질을 통해서만 교차-결합될 수 있다. 뉴클레오타이드 서열을 직접 교차 결합시키는 교차-결합제를 포함한 포름알데하이드 이외의 교차-결합제도 본 발명에 따라 사용될 수 있다. DNA를 교차-결합시키는 작용제의 예는 UV광, 미토마이신 C, 질소 머스타드, 멜팔란, 1,3-부타디엔디에폭사이드, 시스 디아민디클로로플래티눔(Ⅱ) 및 시클로포스파미드를 포함하나 이에 한정적인 것은 아니다.
적당하게는 교차-결합제는 매우 짧은 거리 - 약 2 Å와 같은 -를 중개하여 역전될 수 있는 상세한 상호작용을 선택하는 교차-결합을 형성할 것이다.
교차-결합은 예를 들어 실온에서 2% 포름알데하이드 내에 세포를 인큐베이트시킴으로서 - 실온에서 10분간 2% 포름알데하이드로 보충된 10 ml의 DMEM-10% FCS 내에 1×107 세포를 인큐베이트시키는 것과 같이 - 수행된다.
1차 제한 효소
여기서 사용된 "1차 제한 효소"라는 용어는 교차-결합된 DNA를 분해하는데 사용되는 첫 번째 제한 효소를 나타낸다.
1차 제한 효소는 분석되는 타겟 서열(예를 들면 좌위)의 형태에 따라 선택될 것이다. 분해 조건을 최적화하기 위해 예비 실험이 수행되는 것이 바람직하다.
1차 제한 효소는 적어도 6 bp 서열 이상의 DNA를 인식하는 제한 효소에서 선택된다.
6 bp 서열의 DNA를 인식하는 제한 효소는 AclI, HindⅢ, SspI, BspLUllI, Agel, MluI, SpeI, BgiⅡ, Eco47Ⅲ, StuI, ScaI, ClaI, AvaⅢ, VspI, MfeI, PmaCI, PvuⅡ, NdeI, NcoI, SmaI, SacⅡ, AvrⅡ, PvuI, XmaⅢ, SpII, XhoI, PstI, AflⅡ, EcoRI, AatⅡ, SacI, EcoRV, SphI, NaeI, BsePI, NheI, BamHI, NarI, ApaI, KpnI, SnaI, SalI, ApaLI, HpaI, SnaBI, BspHI, BspMⅡ, NruI, XbaI, BclI, MstI, BalI, Bsp1407I, PsiI, AsuⅡ 및 AhaⅢ를 포함하나 이에 한정적인 것은 아니다.
6 bp 서열 이상의 DNA를 인식하는 제한 효소는 BbvC I, AscI, AsiS I, Fse I, Not I, Pac I, Pme I, Sbf I, SgrA I, Swa I, Sap I, Cci NI, FspA I, Mss I, Sgf I, Smi I, Srf I 및 Sse8387 I를 포함하나 이에 한정적인 것은 아니다.
본 발명의 일부 관점에 있어서 제한 효소가 6 bp 서열을 인식하는 경우 BglⅡ, HindⅢ 또는 EcoRI가 바람직하다.
"1차 제한 효소 인식 사이트"라는 용어는 1차 제한 효소에 의해 인식되고 분할되는 뉴클레오타이드 서열 내 사이트를 나타낸다.
2차 제한 효소
여기서 사용된 "2차 제한 효소"라는 용어는 1차 제한 효소 분해, 교차-결합된 DNA의 라이게이션, 탈-교차-결합 및 (선택적인) DNA 정제 후 사용되는 두 번째 제한 효소를 나타낸다. 하나의 실시태양에서 2차 제한 효소는 목적 뉴클레오타이드 서열에 한정된 DNA 말단을 제공하는데 사용되고, 이는 목적 뉴클레오타이드 서열의 측면에 위치한 2차 제한 효소 인식 사이트로의 알려진 뉴클레오타이드 조성물 서열의 라이게이션을 가능하게 한다.
하나의 실시태양에서 목적 뉴클레오타이드 서열의 측면에 위치한(예를 들어 각각의 측면 또는 말단에 존재) 2차 제한 효소 인식 사이트로의 알려진 뉴클레오타이드 조성물 서열의 라이게이션은 타겟 뉴클레오타이드 서열의 측면에 위치한 2차 제한 효소 인식 사이트와 결합된 목적 뉴클레오타이드 서열 사이의 분자 내 라이게이션을 선호하는 희석된 조건 하에서의 라이게이션을 포함한다.
또다른 실시태양에서 목적 뉴클레오타이드 서열의 측면에 위치한(예를 들어 각각의 측면 또는 말단에 존재) 2차 제한 효소 인식 사이트로의 알려진 뉴클레오타이드 조성물 서열의 라이게이션은 알려진 뉴클레오타이드 조성물의 특정 DNA 서열을 첨가한 후 타겟 뉴클레오타이드 서열의 측면에 위치한 2차 제한 효소 인식 사이트와 도입된 알려진 뉴클레오타이드 조성물의 특정 DNA 서열 사이의 분자 간 라이게이션을 선호하는 조건 하에서의 라이게이션을 포함한다.
또다른 실시태양에서 2차 제한 효소는 1차 제한 사이트의 약 350 bp(예를 들어 350∼400 bp) 이내에 2차 제한 효소 사이트가 존재하지 않도록 선택된다.
또다른 실시태양에서 2차 제한 효소는 동일한 2차 제한 효소 사이트가 라이게이트된 뉴클레오타이드 서열(예를 들어 라이게이트된 교차-결합 서열) 내에 위치하기 적당하도록 선택된다. 첫 번째(타겟) 뉴클레오타이드 서열 및 라이게이트된 뉴클레오타이드 서열의 말단이 양립 가능한 점착성(또는 블런트(blunt)) 말단이기 때문에 DNA를 원형화하기 위해 서열은 라이게이트된다. 따라서 분해 단계는 분자 내 상호작용 및 양립 가능한 말단을 통한 DNA의 선택적 원형화를 선호하는 희석 조건 하에서의 라이게이션이 뒤따른다.
바람직하게는 2차 제한 효소 인식 사이트는 4 또는 5 bp 뉴클레오타이드 서열 인식 사이트이다. 4 또는 5 bp 서열의 DNA를 인식하는 효소는 TspEI, MaeⅡ, AluI, NlaⅢ, HpaⅡ, FnuDⅡ, MaeI, DpnI, MboI, HhaI, HaeⅢ, RsaI, TaqI, CviRI, MseI, Sthl32I, AciI, DpnⅡ, Sau3AI 및 MnⅡ를 포함하나 이에 한정적인 것은 아니다.
바람직한 실시태양에서 2차 제한 효소는 NIaⅢ 및/또는 DpnⅡ이다.
"2차 제한 효소 인식 사이트"라는 용어는 2차 제한 효소에 의해 인식되고 분할되는 뉴클레오타이드 서열 내 사이트를 나타낸다.
2차 제한 효소로의 분해 후 추가 라이게이션 반응이 수행된다. 하나의 실시태양에서 이러한 라이게이션 반응은 알려진 뉴클레오타이드 서열 조성물의 DNA 서열을 타겟 뉴클레오타이드 서열에 라이게이트된 하나 이상의 서열의 2차 제한 효소 분해 사이트에 결합시킨다.
3차 제한 효소
여기서 사용된 "3차 제한 효소"라는 용어는 증폭 전 원형화된 DNA를 선형화하기 위해 2차 제한 효소 단계 후 선택적으로 사용될 수 있는 세 번째 제한 효소를 나타낸다.
바람직하게는 3차 제한 효소는 6 bp 이상의 뉴클레오타이드 인식 사이트를 인식하는 효소이다.
바람직하게는 3차 제한 효소는 1차와 2차 제한 효소 인식 사이트 사이에서 첫 번째(타겟) 뉴클레오타이드 서열을 분해한다. 당업자에 의해 인식되는 바와 같이 3차 제한 효소는 증폭 프라이머가 더 이상 혼성화될 수 없도록 1차 및 2차 제한 효소 인식 사이트에 너무 근접하여 첫 번째(타겟) 뉴클레오타이드 서열을 분해하지 못하는 것이 바람직하다. 따라서 3차 제한 효소 인식 사이트는 증폭 프라이머(들)이 혼성화될 수 있도록 사용되는 프라이머 길이와 적어도 동일한 거리로 1차 및 2차 제한 효소 인식 사이트에서 떨어져서 위치하는 것이 바람직하다.
바람직한 실시태양에서 3차 제한 효소는 6-bp 서열의 DNA를 인식하는 것이다.
"3차 제한 효소 인식 사이트"라는 용어는 3차 제한 효소에 의해 인식되고 분할되는 뉴클레오타이드 서열 내 사이트를 나타낸다.
인식 사이트
제한 엔도뉴클레아제는 DNA의 당-인산염 골격을 분할하는 효소이다. 가장 실질적인 환경에서 제공된 제한 효소는 단지 수개의 염기 범위 내에서 이중가닥 DNA의 양 나선을 절단한다. 제한 효소에 대한 기질은 인식 사이트/서열로 명명되는 이중-나선 DNA의 서열이다.
제한 인식 사이트의 길이는 사용되는 제한 효소에 따라 달라진다. 인식 서열의 길이는 얼마나 자주 효소가 DNA 서열을 절단할 것인지를 나타낸다.
예로서 많은 제한 효소는 4 bp 서열의 DNA를 인식한다. 서열 및 4 bp 서열의 DNA를 인식하는 효소는 AATT(TspEI), ACGT MaeⅡ), AGCT(AluI), CATG(NlaⅢ), CCGG(HpaⅡ), CGCG(FnuDⅡ), CTAG(MaeI), GATC(DpnI, DpnⅡ, Sau3AI & MboI), GCGC(HhaI), GGCC(HaeⅢ), GTAC(RsaI), TCGA(TaqI), TGCA(CviRI), TTAA(MseI), CCCG(Sthl32I), CCGC(AciI) 및 CCTC(MnlI)를 포함하나 이에 한정적인 것은 아니다.
또다른 예로서 많은 제한 효소는 6 bp 서열의 DNA를 인식한다. 서열 및 6 염기쌍 bp 서열의 DNA를 인식하는 효소는 AACGTT(AcII), AAGCTT(HindⅢ), AATATT(SspI), ACATGT(BspLUl1I), ACCGGT(AgeI), ACGCGT(MluI), ACTAGT(SpeI), AGATCT(BglⅡ), AGCGCT(Eco47Ⅲ), AGGCCT(StuI), AGTACT(ScaI), ATCGAT(ClaI), ATGCAT(AvaⅢ), ATTAAT(VspI), CAATTG(MfeI), CACGTG(PmaCI), CAGCTG(PvuⅡ), CATATG(NdeI), CCATGG(NcoI), CCCGGG(SmaI), CCGCGG(SacⅡ), CCTAGG(AvrⅡ), CGATCG(PvuI), CGGCCG(XmaⅢ), CGTACG(SplI), CTCGAG(XhoI), CTGCAG(PstI), CTTAAG(AflⅡ), GAATTC(EcoRI), GACGTC(AatⅡ), GAGCTC(SacI), GATATC(EcoRV), GCATGC(SphI), GCCGGC(NaeI), GCGCGC(BsePI), GCTAGC(NheI), GGATCC(BamHI), GGCGCC(NarI), GGGCCC(ApaI), GGTACC(KpnI), GTATAC(SnaI), GTCGAC(SalI), GTGCAC(ApaLI), GTTAAC(HpaI), TACGTA(SnaBI), TCATGA(BspHI), TCCGGA(BspMⅡ), TCGCGA(NruI), TCTAGA(XbaI), TGATCA(BclI), TGCGCA(MstI), TGGCCA(BalI), TGTACA(Bspl407I), TTATAA(PsiI), TTCGAA(AsuⅡ) 및 TTTAAA(AhaⅢ)를 포함하나 이에 한정적인 것은 아니다.
또다른 예로서 많은 제한 효소는 7 bp 서열의 DNA를 인식한다. 서열 및 6 bp 서열의 DNA를 인식하는 효소는 CCTNAGG(SauI), GCTNAGC(EspI), GGTNACC(BstEⅡ) 및 TCCNGGA(PfoI)를 포함하나 이에 한정적인 것은 아니다.
또다른 예로서 많은 제한 효소는 8 bp 서열의 DNA를 인식한다. 서열 및 8 bp 서열의 DNA를 인식하는 효소는 ATTTAAAT(SwaI), CCTGCAGG(Sse8387I), CGCCGGCG(Sse232I), CGTCGACG(SgrDI), GCCCGGGC(SrfI), GCGATCGC(SgfI), GCGGCCGC(NotI), GGCCGGCC(FseI), GGCGCGCC(AscI), GTTTAAAC(PmeI) 및 TTAATTAA(PacI)를 포함하나 이에 한정적인 것은 아니다.
많은 이들 효소는 생체 내에서 메틸화되는 CG 서열을 포함한다. 많은 제한 효소는 이러한 메틸화에 민감하고 메틸화된 서열을 분할하지 않게되고 예를 들어 HpaⅡ는 CCmGG 서열을 분할하지 않는 반면 그의 이소스키조머(isoschizomer) MspI는 이러한 변형에 둔감하여 메틸화된 서열을 분할할 것이다. 따라서 일부의 경우 진핵성 메틸화 민감성 효소는 사용되지 않는다.
하나의 실시태양에서 인식 사이트는 분해 사이트이다.
하나의 실시태양에서 제한 효소 인식 사이트는 제한 효소 분해 사이트이다.
원형화
본 발명의 하나의 실시태양에 따라 4C의 재료는 2차 제한 효소로 3C 주형을 분해시킨 후 라이게이트함으로서 DNA 원을 생성함으로서 제조된다.
바람직하게는 2차 제한 효소는 1차 제한 사이트로부터 약 350 bp 이상(예를 들어 350∼400 bp)에서 첫 번째(타겟) 뉴클레오타이드 서열을 절단하도록 선택된다. 유리하게는 이는 국소해부학적 제약으로 인해 원 형성의 편향을 최소화시킨다(Rippe et al.(2001) Trends in Biochem. Sciences 26, 733-40).
바람직하게는 2차 제한 효소는 4 또는 5 bp 제한 효소 인식 사이트를 인식하는 빈번한 절단기이다. 따라서 증폭 동안 모든 라이게이트된 단편의 동일한 증폭 효율을 위해 최소의 제한 단편을 수득하는 것이 가능하다.
2차 제한 효소 분해 및 라이게이션에 앞서 DNA 주형은 1차 제한 사이트로부터 약 350∼400 bp 이상에 위치한 첫 번째(타겟) 뉴클레오타이드 서열 내 2차 효소 인식 사이트 및 라이게이트된 뉴클레오타이드 서열 내(즉 두 번째 뉴클레오타이드 서열 내)에 위치한 또다른 2차 효소 인식 사이트를 포함할 것이다.
바람직하게는 2차 제한 효소 분해 단계는 1시간 이상에서 밤새까지 수행된 후 효소의 가열-불활성화가 수행된다.
바람직하게는 이러한 반응 혼합물 내 DNA는 당분야에 알려진 통상의 방법/키트를 이용하여 정제된다.
2차 제한 효소 분해 단계 후 2차 제한 효소 사이트는 첫 번째(타겟) 뉴클레오타이드 서열 내 1차 제한 사이트로부터 약 350∼400 bp 이상에 위치할 것이고, 또다른 2차 제한 효소 사이트는 라이게이트된 뉴클레오타이드 서열(즉 두 번째 뉴클레오타이드 서열) 내에 위치할 것이다. 첫 번째(타겟) 뉴클레오타이드 서열 및 라이게이트된 뉴클레오타이드 서열의 말단이 양립 가능한 말단을 지니기 때문에 DNA를 원형화하기 위해 서열은 라이게이트될 수 있다.
이후 분해 단계는 분자 내 상호작용 및 양립 가능한 말단을 통한 DNA 원형화를 선호하는 희석 조건 하에서의 라이게이션이 뒤따른다.
바람직하게는 라이게이션 반응은 약 1∼5 ng/㎕의 DNA 농도에서 수행된다.
바람직하게는 라이게이션 반응은 약 16∼25℃에서 1시간 이상 동안(예를 들어 2, 3, 4시간 이상) 수행된다.
따라서 라이게이션 반응 후 원형화된 DNA가 제조된다. 원형화된 DNA는 적어도 2차 제한 효소 또는 1차 및 2차 제한 효소에 대한 인식 사이트를 포함할 것이다. 첫 번째(타겟) 뉴클레오타이드 서열을 포함한 원형화된 DNA 내에서 1차 제한 효소 인식 사이트 및 2차 제한 효소 인식 사이트는 첫 번째(타겟) 뉴클레오타이드 서열 및 라이게이트된 뉴클레오타이드 서열(즉 두 번째 뉴클레오타이드 서열)의 말단을 한정할 것이다. 따라서 첫 번째(타겟) 뉴클레오타이드 서열 및 라이게이트된 뉴클레오타이드 서열은 1차 제한 효소 인식 사이트 및 2차 제한 효소 인식 시아트에 의해 분리된다(즉 분배된다).
증폭
4C DNA 주형을 증폭시키기 위해 하나 이상의 증폭 반응이 수행된다.
DNA 증폭은 당분야에 알려진 많은 다른 방법을 이용하여 수행된다. 예를 들면 DNA는 중합효소 연쇄 반응(Saiki et al., 1988); 라이게이션-매개 PCR, Qb 복제효소 증폭(Cahill, Foster and Mahan, 1991; Chetverin and Spirin, 1995; Katanaev, Kurnasov and Spirin, 1995); 리가제 연쇄 반응(LCR)(Landegren et al., 1988; Barany, 1991); 자가-지속 서열 복제 시스템(Fahy, Kwoh and Gingeras, 1991) 및 나선 전치 증폭(Walker et al., 1992)을 이용하여 증폭될 수 있다.
바람직하게는 DNA는 PCR을 이용하여 증폭된다. "PCR"은 클로닝 또는 정제 단계 없이 게놈 DNA 혼합물 내 뉴클레오타이드 서열 분절 농도를 증가시키는 방법을 기술한 K. B. Mullis 미국 특허등록 제4,683,195호, 제4,683,202호 및 제4,965,188호의 방법을 나타낸다.
하나의 실시태양에서 역 PCR이 이용된다. 역 PCR(IPCR)(Ochman et al (1988) Genetics 120(3), 621-3에 기술됨)은 알려진 서열 영역의 측면에 위치한 DNA 서열의 신속한 시험관 내 증폭에 대한 방법이다. 상기 방법은 중합효소 연쇄 반응(PCR)을 이용하나 일반적인 방향의 역방향의 프라이머를 지닌다. 역방 프라이머에 대한 주형은 원을 형성하도록 그 자체에 라이게이트된 제한 단편이다. 역 PCR은 예를 들어 전치 요소의 측면에 위치한 서열의 증폭 및 확인과 같은 분자 유전학에서의 많은 적용을 지닌다. 증폭의 효율 및 재현성을 증가시키기 위해 DNA 원은 3차 제한 효소를 이용하여 증폭 전에 선형화되는 것이 바람직하다. 바람직하게는 6 bp 이상의 절단기인 3차 제한 효소가 사용된다. 바람직하게는 3차 제한 효소는 1차와 2차 제한 효소 사이트 사이에서 첫 번째(타겟) 뉴클레오타이드 서열을 절단한다.
2차 제한 효소로의 3C 주형의 분해, 선택적인 원형화, 라이게이션(예를 들어 희석 조건 하에서의 라이게이션) 및 첫 번째(타겟) 뉴클레오타이드 서열-포함 원의 선택적 선형화는 증폭용 DNA 주형("4C DNA 주형")을 생성한다.
증폭 단계를 위해 각각의 프라이머가 목적 뉴클레오타이드 서열의 측면에 위치한 DNA 서열에 혼성화하는 적어도 2 이상의 올리고뉴클레오타이드 프라이머가 사용된다. 바람직한 실시태양에서 각각의 프라이머가 목적 뉴클레오타이드 서열의 측면에 위치한 타겟 서열에 혼성화하는 적어도 2 이상의 올리고뉴클레오타이드 프라이머가 사용된다.
하나의 실시태양에서 프라이머 혼성화시 "측면에 위치한"이라는 용어는 적어도 하나 이상의 프라이머가 목적 뉴클레오타이드 서열의 하나의 말단(예를 들어 5' 말단)에 인접한 DNA 서열에 혼성화하고, 적어도 하나 이상의 프라이머가 목적 뉴클레오타이드 서열의 또다른 말단(예를 들어 3' 말단)에서 DNA 서열에 혼성화함을 의미한다. 바람직하게는 적어도 하나 이상의 전방 프라이머는 목적 뉴클레오타이드 서열의 하나의 말단(예를 들어 5' 말단)에 인접한 DNA 서열에 혼성화하고 적어도 하나 이상의 역방 프라이머는 목적 뉴클레오타이드 서열의 또다른 말단(예를 들어 3' 말단)에서 DNA 서열에 혼성화한다.
바람직한 실시태양에서 프라이머 혼성화시 "측면에 위치한"이라는 용어는 적어도 하나 이상의 프라이머가 목적 뉴클레오타이드 서열의 하나의 말단(예를 들어 5' 말단)에 인접한 타겟 서열에 혼성화하고, 적어도 하나 이상의 프라이머가 목적 뉴클레오타이드 서열의 또다른 말단(예를 들어 3' 말단)에서 타겟 서열에 혼성화함을 의미한다. 바람직하게는 적어도 하나 이상의 전방 프라이머는 목적 뉴클레오타이드 서열의 하나의 말단(예를 들어 5' 말단)에 인접한 타겟 서열에 혼성화하고 적어도 하나 이상의 역방 프라이머는 목적 뉴클레오타이드 서열의 또다른 말단(예를 들어 3' 말단)에서 타겟 서열에 혼성화한다.
여기서 사용된 "프라이머"라는 용어는 정제된 제한 분해시 자연발생적이거나 합성적으로 생성된 것에 관계없이 핵산 나선에 상보적인 프라이머 연장 생성물의 합성이 유도되는 조건 하에 위치하는 경우(예를 들어 뉴클레오타이드 및 DNA 중합효소와 같은 유도제의 존재 시 적당한 온도 및 pH 하에서) 합성의 개시 시점으로 작용하는 것이 가능한 올리고뉴클레오타이드를 나타낸다. 프라이머는 바람직하게는 증폭 시 최대 효율을 위해 단일 나선이나 이중 나선도 된다. 이중 나선인 경우 프라이머는 연장 생성물을 제조하는데 사용되기 전 먼저 그의 나선을 분리하도록 처리된다. 바람직하게는 프라이머는 올리고데옥시리보뉴클레오타이드이다. 프라이머는 유도제의 존재시 연장 생성물의 합성을 촉진시키기에 충분히 길어야 한다. 프라이머의 정확한 길이는 온도, 프라이머의 공급원 및 방법의 이용을 포함한 많은 인자에 따라 달라진다.
적당하게는 프라이머는 적어도 15 이상, 바람직하게는 적어도 20 이상, 예를 들어 적어도 25, 30 또는 40 이상의 뉴클레오타이드 길이일 것이다. 바람직하게는 증폭 프라이머는 16∼30 뉴클레오타이드 길이이다.
바람직하게는 프라이머는 첫 번째(타겟) 뉴클레오타이드 서열과 두 번째 뉴클레오타이드 서열을 분리시키는 1차 및 2차 제한 효소 인식 사이트에 가능한 근접하도록 디자인된다. 프라이머는 약 100개 뉴클레오타이드 이내 - 1차 및 2차 제한 효소 인식 사이트로부터 약 90, 80, 70, 60, 50, 40, 30, 20, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 또는 1개 뉴클레오타이드(들) 떨어진 것과 같은 -에 존재하도록 디자인된다.
적당하게는 증폭 프라이머는 그의 3' 말단이 1차 및 2차 제한 효소 인식 사이트의 밖으로 향하여 연장이 두 번째 뉴클레오타이드 서열 내로 제한 사이트를 교차하여 즉시 진행되도록 디자인된다.
사용된 증폭 방법이 역 PCR인 경우 증폭 반응이 100∼400 ng의 4C 주형 DNA(약 50 ㎕의 PCR 증폭 혼합물 당) 또는 복제 PCR 반응이 재현 가능한 결과(도 1 참조)를 제공하고 PCR 반응 당 최대 수의 라이게이션 이벤트를 포함하는 함량의 DNA 상에서 수행되는 것이 바람직하다.
바람직하게는 역 PCR 증폭 반응은 제조사의 지침에 따라 Buffer 1을 사용한 Expand Long Template PCR System(Roche)을 이용하여 수행된다.
표본
여기서 사용된 "표본"이라는 용어는 그의 본래 의미를 지닌다. 표본은 교차-결합되거나 가능한 DNA를 포함한 어떠한 물리적 실재도 된다. 표본은 생물 재로이거나 이로부터 유래된다.
표본은 하나 이상의 실재 - 하나 이상의 세포, 하나 이상의 세포핵 또는 하나 이상의 조직 표본과 같은 -이거나 그로부터 유래된다. 실재는 DNA - 염색질과 같은 -가 존재하는 어떠한 실재도 되거나 이로부터 유래된다. 표본은 하나 이상의 분리된 세포 또는 하나 이상의 분리된 조직 표본 또는 하나 이상의 분리된 세포핵이거나 이로부터 유래된다.
표본은 생체 세포 및/또는 사멸 세포 및/또는 세포핵 용해질 및/또는 분리된 염색질이거나 이로부터 유래된다.
표본은 질환 및/또는 비-질환 피험체이거나 이로부터 유래된다.
표본은 질환이 의심되는 피험체이거나 이로부터 유래된다.
표본은 미래에 질환에 걸릴 가능성에 대해 시험되는 피험체이거나 이로부터 유래된다.
표본은 바이러스성 또는 비-바이러스성 환자 물질이거나 이로부터 유래된다.
3C 주형을 제조하기 위해 사용되는 세포 및 조적의 고정은 Splinter et al, (2004) Methods Enzymol. 375, 493-507에 기술되어 있다.
표지
바람직하게는 뉴클레오타이드 서열(예를 들어 증폭된 4C DNA 주형, 프라이머 또는 프로브 등)은 그의 다운스트림 적용 - 어레이 혼성화와 같은 -에 도움을 주기 위해 표지된다. 예로서 4C DNA 주형은 무작위 프라이밍 또는 니크(nick) 번역을 이용하여 표지된다.
다양한 표지(예를 들어 리포터)가 특히 증폭 단계 동안 여기서 기술된 뉴클레오타이드 서열을 표지하는데 사용된다. 적당한 표지는 기질, 보조인자, 저해제, 자기 입자 등뿐만 아니라 방사핵, 효소, 형광제, 화학발광제 또는 착색제를 포함한다. 적당한 표지의 이용을 기술한 특허는 US-A-3817837; US-A-3850752; US-A-3939350; US-A- 3996345; US-A-4277437; US-A-4275149 및 US-A-4366241을 포함한다.
추가적 표지는 β-갈락토시다제, 역전효소, 녹색 형광 단백질, 루시페라제, 클로람페니콜, 아세틸전이효소, β-글루쿠로니다제, 엑소-글루카나제 및 글루코아밀라제를 포함하나 이에 한정적인 것은 아니다. 형광 표지뿐만 아니라 특정 화학 목적으로 특이적으로 합성된 형광 시약도 사용된다. 형광제를 측정하는 다양한 방법이 이용 가능하다. 예를 들어 일부 형광 표지는 여기 또는 방사 스펙트럼의 변화를 나타내고, 일부는 두 번째가 형광을 획득하는 동안 하나의 형광 리포터가 형광을 소실하여 공명 에너지 전이를 나타내고, 일부는 일부가 회전 이동을 나타내는 동안 형광의 소실(저지) 또는 출현을 나타낸다.
표지를 위한 충분한 물질을 수득하기 위해 반응 당 증폭 사이클 수를 증가시키는 대신 다중 증폭이 합동된다. 대안으로 표지된 뉴클레오타이드는 증폭 반응의 최종 사이클 내에 도입될 수 있다(예를 들어 PCR의 30 사이크(표지 없음) + PCR의 10 사이클(표지 추가)).
어레이
특히 유리한 실시태양에서 여기서 기술된 방법에 따라 제조되는 4C DNA 주형은 어레이에 혼성화될 수 있다. 따라서 어레이(예를 들어 마이크로-어레이) 기술은 첫 번째(타겟) 뉴클레오타이드 서열과 세포핵 사이트를 빈번하게 공유하는 뉴클레오타이드 서열 - 게놈 단편과 같은 -을 확인하는데 이용될 수 있다.
현존하는 어레이 - 발현 및 게놈 어레이와 같은 -가 본 발명에 따라 사용될 수 있다. 그러나 또한 본 발명은 여기서 기술된 신규한 어레이(예를 들어 DNA 어레이)를 제공하고자 한다.
"어레이"는 합성적으로 또는 생합성적으로 제조되고 다양한 다른 포맷 내 생물학적 활성에 대해 선별될 수 있는 의도적으로 생성된 핵산 집합이다(예를 들어 용해성 분자의 라이브러리; 및 수지 비드, 실리카 칩 또는 다른 고형 지지체에 고착된 올리고의 라이브러리). 또한 "어레이"라는 용어는 기재 상에 본질적인 어떠한 길이(예를 들어 1∼1000 뉴클레오타이드 모노머 길이)의 핵산 점을 찍음으로서 제조될 수 있는 핵산 라이브러리를 포함한다.
어레이 기술 및 관련된 다양한 기술 및 적용은 일반적으로 많은 교본 및 문헌에 기술되어 있다. 이들은 Lemieux et al., 1998, Molecular Breeding 4, 277-289, Schena and Davis. Parallel Analysis with Biological Chips, in PCR Methods Manual (eds. M. Innis, D. Gelfand, J. Sninsky), Schena and Davis, 1999, Genes, Genomes and Chips. In DNA Microarrays: A Practical Approach (ed. M. Schena), Oxford University Press, Oxford, UK, 1999), The Chipping Forecast (Nature Genetics special issue; January 1999 Supplement), Mark Schena (Ed.), Microarray Biochip Technology, (Eaton Publishing Company), Cortes, 2000, The Scientist 14[17]:25, Gwynne and Page, Microarray analysis: the next revolution in molecular biology, Science, 1999 August 6; and Eakins and Chu, 1999, Trends in Biotechnology, 17, 217-218을 포함한다.
어레이 기술은 일반적으로 "하나의 실험시 하나의 유전자" 상에서 작업하여 낮은 처리량 및 유전자 기능의 "전체 상황"을 평가할 수 없는 무능성을 초래하는 분자생물학의 통상적인 방법의 단점을 극복시킨다. 현재 어레이 기술의 주요 적용은 서열(유전자/유전자 돌연변이)의 확인 및 유전자의 발현 수치(수량)의 측정을 포함한다. 유전자 발현 프로파일링은 선택적으로 단백질체학 기술과 결합되어 어레이 기술을 이용한다(Celis et al, 2000, FEBS Lett, 480(1 ):2- 16; Lockhart and Winzeler, 2000, Nature 405(6788):827-836; Khan et al., 1999, 20(2):223-9). 어레이 기술의 다른 적용도 당분야에 알려져 있다; 예를 들어 유전자 발견, 암 연구(Marx, 2000, Science 289: 1670-1672; Scherf, et al, 2000, Nat Genet;24(3):236-44; Ross et al, 2000, Nat Genet. 2000 Mar;24(3):227-35), SNP 분석(Wang et al, 1998, Science, 280(5366): 1077-82), 약물 발견, 약물유전체학, 질병 진단(예를 들어, 미세유체공학 장치를 이용: Chemical & Engineering News, February 22, 1999, 77(8):27- 36), 독성학(Rockett and Dix (2000), Xenobiotica, 30(2): 155-77; Afshari et al., 1999, Cancer Resl;59(19):4759-60) 및 독성유전체학(기능적 유전체학과 분자 독성학의 하이브리드).
일반적으로 어떠한 라이브러리도 라이브러리 멤버를 공간적으로 분리시킴으로서 어레이 내에 규칙적인 형태로 배열된다. 어레이에 적당한 라이브러리의 예는 핵산 라이브러리(DNA, cDNA, 올리고뉴클레오타이드 등의 라이브러리 포함), 펩타이드, 폴리펩타이드 및 단백질 라이브러리뿐만 아니라 리간드 라이브러리와 같은 어떠한 분자도 포함한 라이브러리도 포함한다.
표본의 확산 및 혼합을 제한하기 위해 표본(예를 들어 라이브러리의 멤버)은 일반적으로 고형상, 바람직하게는 고형 기재 상에 고착되거나 고정된다. 바람직한 실시태양에서 DNA 결합 리간드의 라이브러리가 제조된다. 특히 라이브러리는 멤브레인 및 플라스틱 및 유리와 같은 비-다공성 기재를 포함한 실질적인 평면 고형상에 고정된다. 더욱이 표본은 바람직하게는 인덱싱이(예를 들어 특정 표본에 대한 참조 또는 접근)이 촉진되는 방법으로 배열된다. 일반적으로 표본은 격자 형태의 점으로 적용된다. 일반적인 어레이 시스템은 이러한 목적으로 개조된다. 예를 들어 어레이는 웰 내 다수의 표본을 지니거나 각각의 웰 내에 단일 표본을 지닌 마이크로플레이트 표면 상에 고정된다. 더욱이 고형 기재는 니트로셀룰로스 또는 나일론 멤브레인(예를 들어 블럿팅 실험에 사용되는 멤브레인)과 같은 멤브레인도 된다. 대안적 기재는 유리, 실리카 기반 기재를 포함한다. 따라서 표본은 예를 들어 전하 상호작용 또는 웰 또는 웰 하단 또는 멤브레인 표면으로의 화학물질 커플링과 같은 당분야에 알려진 적당한 방법에 의해 고정된다. 예를 들어 피펫팅, 드롭-터치, 압전기 방법, 잉크-제트 및 버블제트 기술, 정전기 적용과 같은 다른 배열 또는 고정 방법도 이용된다. 실리콘-기반 칩의 경우 사진평판이 칩 상에 표본을 배열하고 고정시키는데 이용된다.
표본은 고형 기재 상에 "점 찍힘으로서" 배열된다; 이는 표본을 침적시키기 위해 수작업으로 또는 로봇 공학을 이용하여 수행된다. 일반적으로 어레이는 마크로어레이 또는 마이크로어레이로 기술되고, 차이점은 표본 점의 크기이다. 일반적으로 마크로어레이는 약 300 마이크론 이상의 표본 점 크기를 포함하고 현존하는 겔 및 블럿 스캐너에 의해 용이하게 형상화된다. 마이크로어레이 내 표본 점 크기는 일반적으로 200 마이크론 이하의 지름이고 이들 어레이는 일반적으로 수 천개의 점을 포함한다. 따라서 마이크로어레이는 상세화된 로봇 공학 및 형상화 장비를 요구하고, 이는 주문제작될 필요가 있다. 기기조작은 Cortese, 2000, The Scientist 14[11]:26에 기술되어 있다.
DNA 분자의 고정된 라이브러리를 생성하는 기술은 당분야에 기술되어 있다. 일반적으로 대부분의 종전 방법은 예를 들어 고형 기재 상의 다양한 분리된 위치에서 서열의 다양한 순열을 구축하는 제조 기술을 이용하여 단일-나선 핵산 분자 라이브러리를 어떻게 합성하는지에 대해 기술하였다. 미국 특허등록 제5,837,832호는 매우 큰 규모의 통합 기술을 기반으로 실리콘 기재에 고정된 DNA 어레이의 개선된 제조 방법을 기술한다. 특히 미국 특허등록 제5,837,832호는 본 발명의 고정된 DNA 라이브러리를 생성하는데 사용되는 기재 상의 공간적으로-한정된 위치에서 특정 프로브 세트를 합성하기 위한 "틸팅(tilting)"으로 명명되는 전략을 기술한다. 또한 미국 특허등록 제5,837,832호는 사용되는 종전 기술에 대한 참조도 제공한다.
또한 어레이는 광 침적 화학을 이용하여 구축된다.
또한 펩타이드 어레이(또는 펩타이드 모방체)가 어레이 내에 분리된 미리 한정된 위치에서 각각의 별개의 라이브러리 멤버(예를 들어 특정 펩타이드 서열)를 위치시키는 방식으로 표면 상에 합성된다. 각각의 라이브러리 멤버의 식별은 어레이 내 공간적 위치에 의해 결정된다. 미리결정된 분자(예를 들어 타겟 또는 프로브)와 반응 라이브러리 멤버 사이의 결합 상호작용이 발생하는 어레이 내 위치가 결정되어 공간적 위치를 기반으로 반응 라이브러리 멤버의 서열을 확인시킨다. 이들 방법은 미국 특허등록 제5,143,854호; WO90/15070 및 WO92/10092; Fodor et al. (1991) Science, 251: 767; Dower andFodor (1991) Ann. Rep. Med. Chem., 26: 271에 기술되어 있다.
검출을 촉진시키기 위해 표지 - 예를 들어 형광제, 생물발광제, 인광제, 방사능 등 리포터와 같은 용이하게 검출 가능한 리포터와 같은 -가 일반적으로 사용된다(상기 기술된 바와 같은). 이러한 리포터, 그의 검출, 타겟/프로브로의 커플링 등은 상기 문헌에 기술되어 있다. 또한 프로브 및 타겟의 표지는 Shalon et al, 1996, Genome Res 6(7):639-45에 개시되어 있다.
DNA 어레이의 특정한 예는 하기와 같다:
포맷 Ⅰ: 프로브 cDNA(500∼5,000 염기 길이)가 로봇 스팟팅을 이용하여 유리와 같은 고형 표면에 고정되고 개별적으로 또는 혼합물 내에서 타겟 세트에 노출된다. 이러한 방법은 Stanford University(Ekins and Chu, 1999, Trends in Biotechnology, 1999, 17, 217-218)에서 개발된 것으로 널리 판단된다.
포맷 Ⅱ: 올리고뉴클레오타이드 (20∼25-mer 올리고, 바람직하게는 40∼60 mer 올리고) 또는 펩타이드 핵산(PNA) 프로브의 어레이는 원위치(온-칩) 또는 통상적인 합성 후 온-칩 고정에 의해 합성된다. 어레이는 표지된 표본 DNA에 노출되고 혼상화되고, 상보적 서열의 식별/수량이 측정되었다. 이러한 DNA 칩은 상표GeneChip으로 Affymetrix, Inc.에서 판매하고 있다. Agilent and Nimblegen도 적당한 어레이(예를 들어 게놈 틸팅 어레이)를 제공한다.
일부 통상적으로 이용 가능한 마이크로어레이 포맷의 예는 하기 표 1에 나타나 있다(Marshall and Hodgson, 1998, Nature Biotechnology, 16(1), 27-31 참조).
현재 이용 가능한 혼성화 마이크로어레이 포맷의 예
회사 상품명 배열 방법 혼성화 단계 판독
Affymetrix,
Inc.,
Santa Clara,
California		 GeneChip 1.25 ㎠ 또는 5.25 ㎠ 내로 입방체로 분할된 실리콘 웨이퍼 상에서의 ∼20∼25-mer 올리고의 원위치(온-칩) 사진 석판 합성 표본 cDNA 또는 안티센스 RNA의 표지된 30∼40 뉴클레오타이드 단편으로 프로브된 10,000∼260,000 올리고 형상 형광
Brax,
Cambridge,
UK		 짧은 합성 올리고,
합성된 오프-칩		 태그된 핵산으로 프로브된 "보편적 칩" 상의 1000 올리고 질량 분광법
Gene Logic,
Inc.,
Columbia,
Maryland		 READSTM
GENSET
Paris, France
Hyseq Inc.,
Sunnyvale,
California		 HyChipTM 0.6 ㎠(HyGnostics) 또는 ∼18 ㎠(Gene Discovery) 상에 프린트된 500∼2000 nt DNA 표본



유리(HyChip) 상의 1.15 ㎠ 어레이로 프린트된 제작된 5-mer 올리고
8,000 7-mer 올리고로 프로브된 64개 표본 cDNA 점(HyGnostics) 또는 300 7-mer 올리고(Gene Discovery)로 프로브된 <=55,000 표본 cDNA 점

보편적인 1024 올리고 점으로 프로브된 10 kb 표본 cDNA, 표지된 5-mer 올리고 및 리가제

방사성동위원소




형광
Incyte
Pharmaceuticals,
Inc., Palo Alto,
California		 GEM PCR 단편을 점찍기 위한 압전기 프린팅 및 올리고의 온-칩 합성 표지된 RNA로 프로브된 <=1000(실제로 10,000) 올리고/PCR 단편 점 형광 및
방사능동위원소
Molecular
Dynamics, Inc.,
Sunnyvale,
California		 Storm
FluorImager		 유리 슬라이드 상의 ∼10 ㎠ 상에 펜으로 프리트된 500∼5000 nt cDNA 200∼400 nt 표지된 표본 cDNA로 프로브된 ∼10,000 cDNA 점 형광
Nanogen,
San Diego,
California		 Semiconductor
Microchip		 <=1 ㎠ 칩 내로 입방체로 분할된 실리콘 웨이퍼 상의 전기활성 점 상에 포획된 미리 제작된 ∼20-mer 올리고 200∼400 nt 표지된 표본 cDNA에 대한 혼성화를 증진시키기 위해 극성화된 25, 64, 400(및 실제로 10,000) 올리고 점 형광
Protogene
Laboratories,
Palo Alto,
California		 표면장력 어레이로의 프린팅을 통한 9 ㎠ 유리 칩 상의 40∼50-mer 올리로의 온-칩 합성 200∼400 nt 표지된 표본 핵산으로 프로브된<=8,000 올리고 점 형광
Sequenom,
Hamburg,
Germany, and
San Diego,
California		 MassArray
SpectroChip		 어레이의 오프-셋 프린팅; 약 20∼25-mer 올리고 레이저 탈착 및 질량분광법에 의해 신호전달된 SpectroChip 당 250 위치 질량 분광법
Synteni, Inc.,
Fremont,
California		 UniGEMTM ∼4 ㎠ 유리 칩 상에 팁에 의해 프린트된 500∼5,000 nt cDNA 20∼400 nt 표지된 표본 cDNA로 프로브된 <=10,000 cDNA 점 형광
Nimblegen
Systems Inc.,
Madison		 Homo
sapiens
Whole-
Genome
60mer
Mircroarray		 유전자 17.4 ㎜×13 ㎜ 당 5개 프로브를 지닌 38,000 전사체 5-마이크론 스캐닝 플랫폼
The German
Cancer
Institute,
Heidelberg,
Germany		 f-moc 또는 t-moc 화학을 이용한 프로브의 온-칩 합성을 지닌 원형 PNA 마이크로칩 8×12 cm 칩 상의 약 1,000 점 형광/질량 분광법
어레이-기반 분석으로부터 데이터를 생성하기 위해 프로브와 뉴클레오타이드 서열간의 혼성화의 존재 및 부재를 의미하는 신호가 검출된다. 또한 본 발명은 직접 및 간접 표지 기술을 기술한다. 예를 들어 직접 표지 기술은 어레이 결합된 프로브에 혼성화하는 뉴클레오타이드 서열 내로 형광 염료를 직접 결합시킨다(예를 들어 염료는 표지된 뉴클레오타이드 또는 PCR 프라이머의 존재시 효소적 합성에 의해 뉴클레오타이드 서열 내로 결합됨). 직접 표지 기구는 일반적으로 유사한 화학 구조 및 특성을 지닌 형광 염료 패밀리를 이용하여 강한 혼성화 신호를 생성하고 실행이 간단하다. 핵산의 직접 표지를 포함한 바람직한 실시태양에서 시아닌 또는 알렉사(alexa) 유사체가 다중-형광 비교 어레이 분석에 사용된다. 또다른 실시태양에서 간접 표지 기구는 마이크로어레이 프로브에 대한 혼성화 전 또는 후에 핵산 내로 항원결정인자를 도입시키는데 이용될 수 있다. 하나 이상의 염색 절차 및 시약이 혼성화 복합체를 표지시키는데 이용된다(예를 들어 항원결정인자에 결합되어 혼성화 종의 항원결정인자로의 염료 분자의 결합에 의한 형관 신호를 제공하는 형광 분자).
또한 데이터 분석은 어레이 관련 실험의 중요한 부분이다. 어레이 실험 유래의 비처리 데이터는 일반적으로 행렬 - 열은 예를 들어 유전자를 나타내고 행은 예를 들어 조직 또는 실험 조건과 같은 다양한 표본을 나타내고, 각각의 셀 내의 번호는 예를 들어 특정 표본 내 특정 서열(바람직하게는 첫 번째(타겟) 뉴클레오타이드 서열에 라이게이트된 두 번째 서열)의 발현을 특성화하는 표- 내로 변형될 필요가 있는 이미지이다. 근원적인 생물학적 처리에 관한 지식이 추출되는 경우 이들 행렬은 더욱 분석되어야 한다. 데이터 분석 방법(통제 및 비통제 데이터 분석뿐만 아니라 생물정보학 접근을 포함)은 Brazma and Vilo J(2000) FEBS Lett 480(1):17-24에 개시되어 있다.
여기서 기술된 바와 같이 표지된 후 어레이에 혼성화되는 하나 이상의 뉴클레오타이드 서열(예를 들어 DNA 주형)은 별개의 시그네쳐를 지닌 작은 범위의 서열로 풍부화된 즉 3C 절차 동안 첫 번째(타겟) 뉴클레오타이드 서열에 라이게이트된 1차 제한 효소 인식 사이트와 그의 각각의 인접한 2차 제한 효소 인식 사이트 사이에 뉴클레오타이드 서열을 연결시키는 뉴클레오타이드 서열을 포함한다.
단일 어레이는 다수의(예를 들어 2 이상) 미끼 서열을 포함한다.
프로브
여기서 사용된 "프로브"라는 용어는 또다른 목적 분자(예를 들어 또다른 올리고뉴클레오타이드)에 혼성화하는 것이 가능한 분자(예를 들어 정제된 제한 분해시 자연발생적으로 생성되거나 합성, 재조합 또는 PCR 증폭에 의해 생성된 올리고뉴클레오타이드)를 나타낸다. 프로브가 올리고뉴클레오타이드인 경우 이들은 단일-나선 또는 이중-나선이다. 프로브는 특정 타겟(예를 들어 유전자 서열)의 검출, 확인 및 분리에 유용하다. 여기서 기술된 바와 같이 본 발명에 사용된 프로브는 효소(예를 들어 ELISA뿐만 아니라 효소-기반 조직화학 에세이), 형광, 방사능 및 발광 시스템을 포함하나 이에 한정적인 것은 아닌 어떠한 검출 시스템으로도 검출 가능하도록 라벨로 표지된다.
어레이 및 마이크로어레이에 있어서 "프로브"라는 용어는 프로브에 혼성화된 뉴클레오타이드 서열을 검출하기 위한 목적으로 어레이에 부착된 혼성화 가능한 어떠한 물질을 나타내는데 사용된다.
프로브 디자인 전략은 WO95/11995, EP 717,113 및 WO9/29212에 기술되어 있다.
4C가 상호작용에 대한 편향되지 않은 게놈-광범위 검색을 가능하게 하기 때문에 게놈 내 모든 가능한(예를 들어 특정/비-반복성) 1차 제한 효소 인식 사이트에 신호를 전달하는 프로브를 지닌 어레이를 제조하는 것이 유리하다. 따라서 어레이 디자인은 실제로 첫 번째 또는 두 번째 뉴클레오타이드 서열이 아닌 1차 제한 효소의 선택에 따라서만 달라진다.
현존하는 어레이가 본 발명에 따라 이용될 수 있으나 대안적 형상을 이용하는 것이 바람직하다.
하나의 형상에서 어레이 상의 하나 이상의 프로브는 1차 제한 효소에 의해 분해되는 사이트에 가까이 혼성화될 수 있도록 디자인된다. 더욱 바람직하게는 프로브(들)는 1차 제한 효소 인식 사이트의 약 20 bp 이내에 존재한다. 더욱 바람직하게는 프로브(들)는 1차 제한 효소 인식 사이트의 약 50 bp 이내에 존재한다.
적당하게는 프로브(들)는 1차 제한 효소 인식 사이트의 약 100 bp(예를 들어 약 0∼100 bp, 약 20∼100 bp) 이내에 존재한다.
바람직한 형상에서 단일의 특정 프로브는 1차 제한 효소에 의해 분해되는 사이트의 각 측면에서 100 bp 이내에 디자인된다.
또다른 바람직한 형상에서 1차 제한 사이트에 의해 분해되는 사이트 위치에 대한 2차 제한 효소에 의해 분해되는 사이트 위치가 고려된다. 이러한 형상에서 단일의 특정 프로브는 제공된 길이의 프로브가 1차와 2차 제한 효소 인식 사이트 사이에 디자인되기에 충분히 긴 거리에서 가장 근접한 2차 제한 효소 인식 사이트를 지닌 1차 제한 효소에 의해 분해되는 사이트의 각 측면에서만 디자인된다. 이러한 형상에서 예를 들어 프로브는 동일한 측면에서 100 bp 이내에 2차 제한 효소 인식 사이트를 지닌 특정한 1차 제한 효소 인식 사이트의 측면에 디자인되지 않는다.
또다른 형상에서 어레이 상의 프로브는 1차 제한 효소에 의해 분해되는 사이트의 측면에 혼성화될 수 있도록 디자인된다. 적당하게는 1차 제한 효소 인식 사이트의 각 측면에서의 단일 프로브가 사용될 수 있다.
또다른 형상에서 2 이상의 프로브(예를 들어 3, 4, 5, 6, 7 또는 8 이상)가 1차 제한 횬소 인식 사이트의 각 측면에 디자인될 수 있고, 이후 이는 동일한 라이게이션 이벤트를 조사하는데 이용될 수 있다. 각각의 1차 제한 효소 인식 사이트에 대한 수 및 위치에 있어서 그의 인접한 2차 제한 효소 인식 사이트의 정확한 게놈 위치가 고려될 수 있다.
또다른 형상에서 2 이상의 프로브(예를 들어 3, 4, 5, 6, 7 또는 8 이상)가 가장 근접한 2차 제한 효소 인식 사이트에 관계없이 각각의 1차 제한 효소 인식 사이트 가까이에 디자인될 수 있다. 이러한 형상에서 모든 프로브는 1차 제한 효소 인식 사이트에 여전히 근접하여야 한다(바람직하게는 제한 사이트의 300 bp 이내).
유리하게는 후자의 디자인 및 1차 제한 효소 인식 사이트(의 측면) 당 1 프로브를 이용하는 디자인은 제공된 1차 제한 효소와 결합하여 다른 2차 제한 효소의 이용을 가능하게 한다.
유리하게는 1차 제한 효소 인식 사이트 당 다수의(예를 들어 2, 3, 4, 5, 6, 7 또는 8 이상) 프로브의 이용은 개별적 프로브의 불충분한 성능으로 인해 잘못된 음성 결과를 수득하게 되는 문제점을 최소화할 수 있다. 더욱이 이는 단일 칩 실험으로 수득되는 데이터의 신뢰도를 증가시키고 음향 결과를 통계적으로 작성하는 것이 요구되는 어레이 수를 감소시킬 수 있다.
어레이에 사용되는 프로브는 40 뉴클레오타이드 길이 이상이고 등온성이다.
바람직하게는 반복성 DNA 서열을 포함한 프로브는 배제된다.
첫 번째 뉴클레오타이드 서열의 측면에 위치하거나 이에 근접한 제한 사이트에 대한 프로브 진단법은 매우 강한 혼성화 신호를 제공할 것으로 예측되고 프로브 디자인에서 배제된다.
어레이는 포유류(예를 들어 인간, 마우스(예를 들어 염색체 7)), 척추동물(예를 들어 지브라피쉬(zebrafish)) 또는 무척추동물(예를 들어 박테리아, 효모, 진균 또는 곤충(예를 들어 초파리) 게놈을 포함한 어떠한 게놈도 포함한다.
또다른 바람직한 실시태양에서 어레이는 특정 1차 제한 사이트 주변에 제한 효소 분해 사이트에 가능한한 근접한 2∼6 프로브를 포함한다.
바람직하게는 제한 효소 분해 사이트로부터의 최대 거리는 약 300 bp이다.
또다른 바람직한 실시태양에서 포유류 및 비-포유류 게놈을 포함한 제한 효소에 대한 어레이 - HindⅢ, EcoRI, BglⅡ 및 NotI와 같은 -가 제공된다. 유리하게는 여기서 기술된 어레이 디자인은 분석이 동일한 종에서 수행되는 경우 모든 타겟 서열에 대한 재-디자인 어레이에 대한 필요성을 회피한다.
프로브 세트
여기서 사용된 "프로브 세트"라는 용어는 게놈 내 1차 제한 효소에 대한 1차 제한 효소 인식 사이트 각각에 혼성화하는 프로브 한 벌 또는 집합을 나타낸다.
따라서 첫 번째 관점에서 게놈 DNA 내 1차 제한 효소에 대한 1차 제한 효소 인식 사이트 각각에 인접한 핵산 서열에 상보적인 프로브 세트가 제공된다.
적당하게는 프로브 세트는 게놈 DNA 내 1차 제한 효소 인식 사이트의 각각에 인접한 첫 번째 25∼60(예를 들어 35∼60, 45∼60 또는 50∼60) 이상의 뉴클레오타이드에 상보적이다. 프로브 세트는 1차 제한 효소 인식 사이트의 하나의 측면 또는 양 측면에 상보적인 서열이다. 따라서 프로브는 게놈 DNA 내 1차 제한 효소 인식 사이트 각 측면에 인접한 핵산 서열에 상보적인 서열이다.
또한 세트를 위한 하나 이상의 프로브가 디자인될 수 있는 윈도우(예를 들어 300 bp 이하 - 250 bp, 200 bp, 150 bp 또는 100 bp와 같은 - 1차 제한 효소 인식 사이트로부터)를 한정하는 것이 가능하다. 프로브가 디자인되는 윈도우를 한정하는데 중요한 이러한 인자는 예를 들어 GC-함량, 헤어핀 구조를 형성할 수 있는 팔린드롬 서열의 부재, 단일 형태의 뉴클레오타이드 범위의 최대 크기이다. 따라서 프로브 세트는 게놈 DNA 내 1차 제한 효소 인식 사이트 각각으로부터 300 bp 이하인 핵산 서열에 상보적인 서열이 될 수 있다.
또한 각각의 제한 사이트에 근접한 최적 프로브를 확인하기 위해 1차 제한 효소 인식 사이트로부터 약 100 bp의 윈도우를 한정하는 것이 가능하다.
본 발명의 또다른 실시태양에서 프로브 세트는 게놈 DNA 내 1차 제한 효소 인식 사이트의 각각으로부터 300 bp 이하인 서열에 상보적이거나 게놈 DNA 내 1차 제한 효소 인식 사이트의 각각으로부터 200∼300 bp 사이인 서열에 상보적이거나 게놈 DNA 내 1차 제한 효소 인식 사이트의 각각으로부터 100∼200 bp 사이인 서열에 상보적이다.
본 발명의 또다른 실시태양에서 프로브 세트는 게놈 DNA 내 1차 제한 효소 인식 사이트의 각각으로부터 0∼300 bp인 서열에 상보적이거나 게놈 DNA 내 1차 제한 효소 인식 사이트의 각각으로부터 0∼200 bp인 서열에 상보적이거나 게놈 DNA 내 1차 제한 효소 인식 사이트의 각각으로부터 0∼100 bp인 서열에 상보적이다(예를 들어 게놈 DNA 내 1차 제한 효소 인식 사이트 각각으로부터 약 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80 또는 90 bp).
2 이상의 프로브도 게놈 DNA 내 1차 제한 효소 인식 사이트 각각에 인접한 서열에 혼성화하는 것이 가능하도록 디자인된다.
프로브는 중복되거나 부분적으로 중복된다. 프로브가 중복되는 경우 중복은 바람직하게는 10 뉴클레오타이드 이하이다.
또한 1차 제한 효소 인식 사이트 각각의 측면에 위치한 첫 번째 1∼300 뉴클레오타이드(예를 들어 1∼20, 1∼40, 1∼60, 1∼80, 1∼100, 1∼120, 1∼140, 1∼160, 1∼180, 1∼200, 1∼220, 1∼240, 1∼260 또는 1∼280 뉴클레오타이드)를 나타내는 PCR 단편이 사용될 수 있다.
또한 PCR 단편은 1차 제한 효소 인식 사이트 및 첫 번째 인접한 두 번째 제한 효소 인식 사이트의 측면에 위치한 각각의 게놈 사이트에 정확하게 대응되는 프로브로 사용된다. 따라서 프로브 서열은 1차 제한 효소 인식 사이트 각각과 첫 번째 인접한 2차 제한 효소 인식 사이트 각각 사이의 전부 또는 일부에 대응된다.
일반적으로 프로브, 프로브 어레이 또는 프로브 세트는 지지체 상에 고정될 것이다. 지지체(예를 들어 고형 지지체)는 다양한 물질 - 유리, 실리카, 플라스틱, 나일론 또는 니트로셀룰로스와 같은 -로 제조될 수 있다. 지지체는 바람직하게는 견고하고 평면 표면을 지닌다. 지지체는 일반적으로 약 1∼10,000,000 별개의 공간에서 어드레스로 호출 가능한 영역 또는 셀을 지닌다. 약 10∼1,000,000 또는 약 100∼100,000 또는 약 1000∼100,000 셀을 지닌 지지체가 일반적이다. 셀의 밀도는 일반적으로 제곱 센티미터 내에 적어도 약 1000, 10,000, 100,000 또는 1,000,000 이상의 셀이다. 일부 지지체에서 모든 셀은 합동된 프로브 혼합물 또는 프로브 세트에 의해 점유된다. 또다른 지지체에서 일부 세포는 합동된 프로브 혼합물 또는 프로브 세트에 의해 점유되고 일부 세포는 단일 형태의 올리고뉴클레오타이드에 의해 합성 방법으로 수득 가능한 순도 정도로 점유된다.
바람직하게는 여기서 기술된 어레이는 6 bp 절단 제한 효소의 경우 예를 들어 인간 또는 마우스 게놈 당 약 750,000배를 발생시키는 1차 제한 효소 인식 사이트 당 하나 이상의 프로브를 포함한다.
>6 bp 인식 서열을 인식하는 제한 효소의 경우 약 2×750,000 프로브의 단일 어레이는 예를 들어 각 제한 사이트의 각 측면에서 1 프로브로 완전한 인간 또는 마우스 게놈을 포함하는데 이용될 수 있다.
바람직한 어레이 디자인에 있어서 어레이 상에 존재하는 제공된 뉴클레오타이드 서열의 프로브 분자의 총 수는 이러한 어레이에 혼성화되는 4C 표본 내에 존재하는 상동성 단편을 크게 초과한다. 4C 기술의 특성 제공시 선형 염색질 주형 상의 분석되는 뉴클레오타이드 서열에 근접한 게놈 영역을 나타내는 단편은 4C 혼성화 표본을 크게 초과할 것이다(도 2에 기술됨). 이러한 다량의 단편의 혼성화 효율에 관한 정량적 정보를 수득하기 위해 혼성화되는 표본의 함량을 감소시키거나 어레이 상의 제공된 올리고뉴클레오타이드 서열의 분자 수를 증가시키는 것이 필요하다.
따라서 예를 들어 유전자 프로모터에 빈번하게 접촉하는 조절 DNA 요소의 검출을 위해 선택된 게놈 영역(예를 들어 약 0.5∼10 Mb)을 나타내는 프로브를 지닐뿐만 아니라 어레이 상에 다수의(예를 들어 100, 200, 1000) 위치에 존재하는 각각의 특정 프로브를 지닌 어레이를 이용하는 것이 필요하다. 또한 이러한 디자인은 사이트(예를 들어 목적 유전자) 주변의 국부적인(예를 들어 약 10 Mb 이내) 게놈 재배열 - 결실, 전도, 중복 등 - 을 검출하기 위한 진단 목적에 바람직하다.
어레이는 약 3×750,000개 프로브, 4×750,000개 프로브, 5×750,000개 프로브, 바람직하게는 6×750,000개 프로브를 포함한다. 더욱 바람직하게는 어레이는 각각의 제한 사이트의 각 측면에 3개 프로브를 지닌 6×750,000개 프로브를 포함한다.
프로브 어레이 또는 프로브 세트는 지지체 상에서 단계적인 방식으로 합성되거나 미리 합성된 형태로 부착될 수 있다. 하나의 합성 방법은 고-밀도의 소형화 어레이 내에 올리고뉴클레오타이드의 합성을 지시하도록 광의 이용을 수반하는 VLSIPS.TM.이다(미국 특허등록 제5,143,854호 및 EP 476,014호에 기술됨). 합성 사이클 수를 감소시키는 마스크 디자인에 대한 알고리즘은 미국 특허등록 제5,571,639호 및 미국 특허등록 제5,593,839호에 기술되어 있다. 또한 어레이는 EP 624,059호에 기술된 바와 같이 기계적으로 속박된 플로우패쓰(flowpath)에 의해 지지체 셀에 모노머를 전달함으로서 연합적 방식으로 합성될 수 있다. 또한 어레이는 잉크 제트 프린터를 이용하여 지지체 상에 시약을 점찍음으로서 합성될 수 있다(예를 들어 EP 728,520호 참조).
본 발명에서 "실질적인 프로브 세트", "실질적인 프로브 어레이"라는 용어는 프로브 세트 또는 어레이가 프로브의 전체 또는 완전한 세트 또는 어레이의 적어도 약 50, 60, 70, 80, 90, 95, 96, 97, 98 또는 99%를 포함함을 의미한다. 바람직하게는 프로브 세트 또는 어레이는 프로브의 전체 또는 완전한 세트이다(즉 100%).
바람직한 실시태양에서 어레이는 제공된 게놈 내에 존재하는 1차 제한 효소 인식 사이트 각 측면 당 단일의 특정 프로브를 포함한다. 이러한 프로브 수가 단일 어레이에 의해 포함될 수 있는 프로브 수를 초과하는 경우 어레이는 바람직하게는 제공된 종의 완전한 게놈의 묘사를 여전히 포함하나 어레이 상에 존재하는 선형 염색체 주형 상에 정렬시 예를 들어 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 102 또는 104 중의 하나의 낮은 분석능을 지닌다. 부분-최적 분석능의 완전한 인간 또는 다른 게놈을 포함한 이러한 어레이는 예를 들어 전좌 파트너가 발견되어야 하는 경우 동일한 게놈의 일부를 포함한 고-분석능보다 바람직하다.
바람직하게는 낮은 분석능의 제공된 종의 완전한 게놈의 묘사는 각각이 1차 제한 효소로의 분해 후 수득되는 단일 제한 단편을 나타내는 어레이 상의 프로브에 의해 수득된다. 바람직하게는 이는 동일한 제한 단편에 혼성화하는 모든 두 번째, 세 번째, 네 번째, 다섯 번째, 여섯 번째, 일곱 번째, 여덟 번째, 아홉 번째, 열 번째, 스무 번째, 서른 번째, 마흔 번째, 쉰 번째, 예순 번째, 일흔 번째, 여든 번째, 아흔 번째 또는 백 번째 프로브를 무시함으로서 수득된다.
바람직하게는 낮은 분석능의 제공된 종의 완전한 게놈의 묘사는 선형 염색체 주형을 따라 동일하게 분포되는 프로브를 포함한다. 바람직하게는 이는 최대의 프로브 밀도를 나타내는 게놈 영역 내에서 하나 이상의 프로브를 무시함으로서 수득된다.
혼성화
여기서 사용된 "혼성화"라는 용어는 예를 들어 중합효소 연쇄 반응(PCR) 기술 수행시 증폭 과정뿐만 아니라 "핵산의 나선이 염기쌍 형성을 통해 상보적 나선과 결합하는 과정"을 포함한다.
선택적 혼성화가 가능한 뉴클레오타이드 서열은 일반적으로 적어도 20 이상, 바람직하게는 적어도 25 또는 30 이상, 예를 들어 적어도 40, 60 또는 100 이상의 인접 뉴클레오타이드의 영역에 대해 대응되는 상보적 뉴클레오타이드 서열에 적어도 75% 이상, 바람직하게는 적어도 85% 또는 90% 이상, 더욱 바람직하게는 적어도 95% 또는 98% 이상 상동적일 것이다.
"특이적 혼성화"는 분자의 스트린전트 조건(예를 들어 65℃ 및 0.1×SSC {1×SSC = 0.15 M NaCl, 0.015 M Na-구연산 pH 7.0}) 하에서 특정 뉴클레오타이드 서열에만 결합하거나 이중화하거나 혼성화함을 나타낸다. 스트린전트 조건은 프로브가 다른 서열이 아닌 그의 타게 서열에 혼성화하는 조건이다. 스트린전트 조건은 서열-의존적이고 다른 환경에서는 상이하다. 서열이 길수록 더 높은 온도에서 특이적으로 혼성화한다. 일반적으로 스트린전트 조건은 한정된 이온 강도 및 pH에서 특정 서열에 대한 약 5℃ 이하의 용융점(Tm)이 되도록 선택된다. Tm은 타겟 서열에 상보적인 프로브의 50%가 타겟 서열에 평형으로 혼성화하는 온도이다(한정된 이온 강도, pH 및 핵산 농도 하에서)(타겟 서열이 일반적으로 과량 존재시 Tm에서 50%의 프로브가 평형으로 점유된다). 일반적으로 스트린전트 조건은 pH 7.0 내지 8.3에서 적어도 약 0.01 내지 1.0 M Na 이온 농도의 염 농도(또는 다른 염)를 포함하고 온도는 짧은 프로브의 경우 적어도 약 30℃이다. 또한 스트린전트 조건은 탈안정화제 - 포름아마이드 또는 테트라알킬 암모늄염과 같은 -의 첨가로 달성된다.
당업자에게 이해되는 바와 같이 최대 스트린전시 혼성화는 동일한 뉴클레오타이드 서열을 확인하거나 검출하는데 이용될 수 있고 중간(또는 낮은) 스트린전시 혼성화는 유사하거나 관련된 폴리뉴클레오타이드 서열을 확인하거나 검출하는데 이용될 수 있다.
또한 표지 또는 비표지 뉴클레오타이드 서열로의 프로브 어레이의 혼성화에 대한 방법이 기술되어 있다. 특정 혼성화 반응 조건은 혼성화를 변경시키도록(예를 들어 프로브/타겟 결합 스트린전시를 증가시키거나 감소시키는) 조절될 수 있다. 예를 들어 반응 온도, 음이온 또는 양이온 농도, 세정제 첨가 등은 프로브 어레이 및 타겟 분자의 혼성화 특성을 변경시킬 수 있다.
상호작용 빈도
제한 단편의 라이게이션 빈도의 정량화는 그의 교차-결합 빈도의 수치를 제공한다. 적당하게는 이는 Splinter et al.(2004)(상동)에 기술된 바와 같은 통상적인 3C 기술에 사용된 PCR을 이용하여 달성될 수 있다. 간단하게는 PCR 생성물의 형성은 Typhoon 9200 imager(Molecular Dynamics, Sunnyvale, CA)을 이용하여 에티듐 브로마이드 염색된 아라로스 겔 상의 분리 후 신호 강도를 스캔함으로서 측정될 수 있다. 적당하게는 일부 대조군은 Splinter et al.(2004)(상동)에 기술된 바와 같이 데이터를 교정하는데 이용된다.
여기서 기술된 4C 기술이 세포핵 공간 내 2 이상의 뉴클레오타이드 서열의 상호작용 빈도의 고-효율 분석을 제공하기 때문에 제한 단편의 라이게이션 빈도는 여기서 기술된 어레이를 이용하여 정량화되는 것이 바람직하다.
정량화를 위해 4C 표본에 대해 수득된 신호는 대조군 표본에 대해 수득된 신호로 표준화될 수 있다. 4C 표본 및 대조군 표본(들)은 상이하고 식별 가능한 표지(예를 들어 염료)로 표지될 것이고 어레이에 동시에 혼성화될 것이다. 대조군 표본(들)은 일반적으로 동일 몰 함량 내에 모든 DNA 단편(즉 첫 번째(타겟) 뉴클레오타이드 서열에 라이게이트된 모든 잠재적인 두 번째 뉴클레오타이드 서열)을 포함할 것이고, 혼성호 효율 내 편향을 배제하기 위해 두 번째 뉴클레오타이드 서열(들)이 유사하 크기여야 한다. 따라서 대조군 주형은 일반적으로 4C 주형으로서 1차 및 2차 제한 효소 모두로 분해되고 동일한 방법(예를 들어 무작위 프라이밍)으로 표지된 게놈 DNA(4C 주형을 수득하는데 사용되는 동일한 유전적 배경의)를 포함할 것이다. 이러한 대조군 주형은 혼성화 효율의 프로브-대-프로브 차이를 교정하는 것을 가능하게 한다. 4C 어레이 신호의 대조군 어레이 신호로의 표준화는 무작위 이벤트에 대한 풍부화의 측면에서 결과를 표현하는 것을 가능하게 한다.
표지된 4C 주형은 차별적으로 표지된 대조군 표본이 존재 또는 부재하고 하나 이상의 차별적으로 표지된 다른 4C 주형이 존재 또는 부재한 어레이에 혼성화된다. 다른 4C 주형은 이러한 4C 주형과 관련되지 않을 수 있고, 예를 들어 이는 다른 조직에서 수득되거나 역 PCR 프라이머의 다른 세트로 수득된다. 예를 들어 첫 번째 4C 주형은 환자 물질이고 두 번째 4C 주형은 건강한 피험체 또는 대조군 표본에서 수득된다.
유전자 재배열이 예측되는 현저한 혼성화 패턴을 가정시 질환 피험체와 건강한 피험체를 항상 비교할 필요는 없을 것이다. 따라서 각각 동일한 환자 또는 피험체 유래의 다른 좌위의 신호를 전달하는 다수의(예를 들어 2 이상의) 4C 주형이 하나의(또는 하나 이상의) 어레이에 혼성화된다.
4C 주형은 차별적으로 표지되거나(예를 들어 2 이상의 다중-색상 혼성화로) 이러한 좌위가 일반적으로 DNA-DNA 상호작용 신호 사이를 최소한으로 중복하기에 충분히 멀리 떨어져서 다른 염색체 또는 동일한 염색체 상에 존재하는 경우 동일하게 표지된다. 예로서 T-세포 백혈병을 지닌 피험체 유래 물질은 TCRα/δ(전좌를 검출하기 위해 하나의 색상으로 표지됨) 및 MLL, TAL1, HOX1l 및 LM02(다른 유전자 재배열을 검출하기 위해 각각 동일한 두 번째 색상으로 표지됨)에 대해 4C 주형을 수득하도록 처리된다. 이들 5개 4C 주형은 하나의 어레이로 혼성화되고 이는 질병과 관련된 게놈 재벼열에 대한 다수의 좌위에서 동시 분석을 가능하게 한다.
상호작용 빈도의 정량화를 위해 절대 신호 강도 또는 대조군 표본에 대한 비율도 고려된다. 더욱이 선형 염색체 주형 상에 인접한 프로브 신호는 상호작용하는 염색체 영역을 확인하기 위해 사용된다. 이러한 위치 정보는 바람직하게는 예를 들어 연속 평균 또는 연속 평균 접근을 이용하여 윈도우 접근을 활주시킴으로서 선형 염색체 주형 상에서 프로브를 정렬시키고 절대 신호 강도 또는 대조군 주형 신호에 대한 비율을 분석함으로서 분석된다.
에세이 방법
본 발명의 또다른 측면에서 DNA-DNA 상호작용을 조절하는 하나 이상의 작용제를 확인하는 에세이 방법이 제공된다.
여기서 사용된 "조절하는"이라는 용어는 DNA-DNA 상호작용을 방지하거나 감소시키거나 억제하거나 복구하거나 향상시키거나 증가시키거나 영향을 미침을 나타낸다.
일부의 경우 DNA-DNA 상호작용을 조절하는데 사용되는 2 이상의 작용제를 함께 평가하는 것이 바람직하다. 이러한 경우 에세이는 첫 번째 작용제와 동시에 또는 순차적으로 이러한 추가 작용제(들)을 첨가함으로서 용이하게 변형된다.
또한 본 발명의 방법은 많은 작용제가 DNA-DNA 상호작용의 활성을 조절하는데 시험됨으로서 선별된다.
본 발명의 에세이 방법은 정량적 에세이뿐만 아니라 작용제의 소규모 또는 대규모 선별에 적당함이 예측된다.
약물 개발 프로그램 및 이러한 작용제를 포함한 조성물로서의 이러한 치료제의 의학적 이용은 본 발명의 범위 내에 존재한다. 예를 들어 약물 개발 프로그램은 여기서 기술된 방법에 의해 확인되거나 확인 가능한 작용제를 취하고 선택적으로는 이를 변형시키고(예를 들어 그의 구조를 변형시키거나 상기 모이어티를 포함한 신규한 조성물을 제공함) 또다른 연구를 수행(예를 들어 독성 연구 및/또는 활성, 구조 또는 기능에 관한 연구)하는 것을 포함한다. 이러한 시도는 비-인간 동물에서 수행되고 결국 인간에서 tngodehlse. 이러한 시도는 일반적으로 다른 용량 수치의 효과(들)를 측정하는 것을 포함한다. 약물 개발 프로그램은 선별함으로서(예를 들어 구조 및/또는 기능을 예측하고, 가능한 작용제 또는 길항제를 확인하고, 유사한 구조 또는 기능을 지닌 다른 모이어티를 검색하기 위해) 확인된 모이어티를 분석하는 컴퓨터를 이용한다.
진단 시험
현재 다양한 게놈 재배열은 이용 가능한 분자-세포유전학 기술에 의해 검출되기 어렵다. 어레이 비교 게놈 혼성화 기술(어레이-CGH)이 35∼300 Kb의 분석능으로 염색체 증폭 및/또는 결실의 검출을 위해 신규하게 개발되었으나 이러한 기술은 균형 전좌 및 염색체 전도를 검출하기에 적당하지 않다. 한편 스펙트럼 핵형분석(SKY) 또는 통상의 핵형분석이 수적 변화뿐만 아니라 염색체 전화의 검출을 위해 환자 물질 상에서 종종 수행되나 전좌 구분점을 한정하는 분석능은 일반적으로 각각 10∼50 Mb 및 5∼10 Mb로 낮다. 결론적으로 두가지 방법 특히 SKY에 의해 수득된 결과는 원위치 혼성화(FISH) 및 분자 구분점 클로닝 전략과 유사하게 시간-소비적이고 노동-집약적인 검증 실험을 유도할 것이다.
4C 주형은 물리적으로 결합된 DNA 서열간의 변화된 상호작용 빈도에 기반하여 염색체 재배열을 검출할 수 있는 절차를 포함한다. 따라서 4C 기술은 대부분의 인간 악성/다수의 선천성 기형 또는 정신지체에 대한 (재발성) 염색체 재배열의 확인에 유용하다. 4C 기술의 중요한 장점은 수천개만의 염기쌍의 영역으로 구분점의 매우 정확한 지도화가 가능하다는 점이다. 4C 기술의 또다른 장점은 4C-미끼 서열이 구분점으로부터 1∼5 Mb 떨어져서 위치하더라도 구분점이 검출 가능할 것이기 때문에 구분점의 정확한 위치에 대한 사전 지식이 필요 없다는 점이다. 또한 이는 동일한 미끼 서열이 큰 구분점 영역을 포함한 특정 염색체 재배열의 검출에 사용될 수 있다는 장점도 지닌다. 4C 기술에 의한 게놈 재배열의 정확한 지도화는 이상적으로 발현된 유전자(들)에 기반한 질병 또는 유전자 장애의 확인을 크게 촉진시킬 것이고, 이는 유전형-표현형 상관관계의 더 우수한 이해에 중요하게 기여하고 치료 결정을 돕고 중요한 예후 정보를 추가시킬 것이다.
본 발명의 하나의 실시태양에서 질병의 진단 또는 예측에 대한 근거를 제공하기 위해 피험체 유래의 정상 또는 표준 수치가 수립된다. 이는 정상 피험체 - 동물 또는 인간과 같은 -로부터 채취된 표본을 시험함으로서 달성된다. DNA-DNA 상호작용 빈도는 이를 양성 대조군의 희석 시리즈와 비교함으로서 정량화된다. 이후 정상 피험체로부터 수득된 표준 수치가 질병 또는 장애에 의해 영향 받거나 잠재적으로 영향 받는 피험체 유래의 표본으로부터 수득된 수치와 비교된다. 표준 수치와 피험체 수치간의 편차는 질병 상태의 존재를 수립한다.
이러한 진단 에세이는 특정 치료 관리의 효율을 평가하도록 제작되고 동물 연구 또는 임상적 시도 또는 환자 개인의 치료를 모니터하는데 이용된다. 질병의 진단에 대한 근거를 제공하기 위해 DNA-DNA 상호작용에 대한 정상 또는 표준 프로파일이 수립된다. 정상 표본으로부터 수득된 표준 수치는 장애 또는 질병에 의해 잠재적으로 영향 받는 피험체 유래 표본으로부터 수득된 수치와 비교된다. 표준 수치와 피험체 수치간의 편차는 질병 상태의 존재를 수립한다. 질병이 수립되면 현존하는 치료제가 투여되고 치료 프로파일 또는 수치가 생성된다. 최종적으로 수치가 진행되는지 또는 정상 또는 표준 패턴으로 복귀하는지 여부를 평가하기 위해 규칙적 근거 상에서 본 방법이 반복된다. 성공적인 치료 프로파일은 수일 또는 수개월 기간 동안 치료 효율을 나타내는데 이용된다.
4C 기술은 분석되는 뉴클레오타이드 서열에 시스로 결합된 적어도 5 Mb 이상의 게놈 DNA를 정확하게 검출한다(도 2∼3 및 5 참조). 유리하게는 4C 기술은 재배열 서열과 선택된 4C 서열(미끼)간의 게놈 사이트 분리 변화에 의해 수반되는 게놈 변형을 검출하는데 이용된다. 이러한 변화는 예를 들어 게놈 사이트 분리의 증가 또는 감소이거나 4C 서열(미끼)에 인접한 서열(예를 들어 15 Mb 이상까지)의 하향-표현(결실) 또는 과-표현(중복)이다. 일반적으로 이러한 게놈 변형 또는 재배열은 질병 - 암(예를 들어 백혈병) 및 여기서 기술된 다른 유전성 또는 선천성 질병과 같은 -에 의하거나 그와 관련된다.
유전자 변형(예를 들어 게놈 또는 염색체 변형 - 균형 및/또는 불균형 게놈 또는 염색체 변형과 같은)은 핵산의 재배열, 전좌, 전도, 삽입, 결실 및 다른 돌연변이 및 염색체 전부 또는 일부의 손실 또는 획들을 포함하나 이에 한정적인 것은 아니다. 이들은 선천성 장애 및 후천성 질병 - 악성종양과 같은 -의 주된 원인이다. 많은 재배열에서 2개의 다른 염색체가 관련된다. 이러한 방법으로 유전자(또는 유전자 단편)가 특정 염색체의 정상적인 생리적 환경에서 제거되고 비-관련 유전자 또는 유전자 단편(종종 종양유전자 또는 원발암유전자)에 인접한 수용 염색체에 위치한다.
악성종양은 급성 백혈병, 악성 림프종 및 고형 종양을 포함할 수 있다. 변경의 비-제한적 예는 NHL에서 빈번하게 발생하는 t(14;18); 소아 전구체-B-ALL에서 빈번하게 발견되는 t(12;21); 및 급성 백혈병에서의 llq23(MLL(골수-림프구 백혈병 또는 혼합성 백혈병) 유전자) 변형의 존재이다.
염색체 영역 llq23 내의 MLL 유전자는 ALL 및 급성 골수 백혈병(AML) 모두에서 일부 전좌에 관련된다. 현재 적어도 10개 이상의 파트너 유전자가 확인되었다. 이들 전좌 일부 - t(4; 11)(q21;q23), t(ll;19)(q23;pl3) 및 t(l;ll)(p32;q23)와 같은 -는 ALL에서 우선적으로 발생하고, t(l;ll)(q21;q23), t(2;ll)(p21;q23), t(6;ll)(q27;q23) 및 t(9;ll)(p22;q23)은 AML에서 빈번하게 관찰된다. llq23 영역과 관련된 재배열은 유아 급성 백혈병에서 매우 빈번하게 발생하고(약 60∼70%) 소아 및 성인 백혈병에서는 훨씬 더 적은 정도로 발생한다(각각 약 5%).
림프구 악성종양의 재배열은 Ig 또는 TCR 유전자와 관련된다. 예는 MYC 유전자가 각각 Ig 중쇄(IGH), Ig 카파(IGK) 또는 Ig 람다(IGL) 유전자 분절에 커플되는 3가지 형태의 전좌(Burkitt 림프종에서 발견되는 t(8;14), t(2;8) 및 t(8;22))를 포함한다. 이러한 카테고리 내 또다른 일반적인 형태의 전좌는 주요 NHL 형태 중의 하나인 소포 림프종의 약 90%에서 관찰되는 t(14;18)(q32;q21)이다. 이러한 전좌에서 BCL2 유전자가 JH 유전자 분절 내 또는 그에 인접한 IGH 좌위 내 영역으로 재배열된다. 이러한 염색체 변형의 결과는 프로그램된 세포 사멸을 저해함으로서 성장 조절 내 생존 인자로서 중요한 역할을 하는 BCL2 단백질의 과발현이다.
BCL2 유전자는 3개의 엑손으로 구성되나 이들은 큰 영역에 걸쳐 산포된다. 이들 중 최종 엑손은 큰 3' 비번역 영역(3' UTR)을 암호화한다. 이러한 3' UTR은 많은 t(14;18) 구분점이 군집하고 "주요 구분점 영역"으로 명명되는 2개 영역 중 하나이고; t(14;18) 전좌와 관련된 다른 구분점 영역은 BCL2 좌위의 20∼30 kb 다운스트림에 위치하고 "소군집 영역"으로 명명된다. 세 번째 BCL2 구분점 영역인 VCR(변이 군집 영역)은 BCL2의 5' 측면에 위치하고 특히 IGK 및 IGL 유전자 분절이 파트너 유전자인 변이 전좌 즉 t(2;18) 및 t(18;22)와 관련된다.
따라서 예로서 4C 기술은 제공된 임상적 표현형과의 그의 빈번한 결합에 기반하여 선택된 좌위 내 또는 그에 근접한 유전자 변형에 대한 피험체 물질의 선별에 적용될 수 있다. 이러한 좌위의 또다른 비-제한적 예는 AMLl, MLL, MYC, BCL, BCR, ABLl, 면역글로불린 좌위, LYLl, TALI, TAL2, LMO2, TCRa/δ, TCRβ, HOX 및 다양한 림프모구 백혈병 내 다른 좌위이다.
유리하게 유전자 변형이 의심되는 경우 4C 기술은 여기서 설명된 바와 같이 변형의 존재를 검증하고 지도화하도록 선별하는데 적용될 수 있다.
게놈 재배열의 검출
본 발명의 특히 바람직한 실시태양에서 여기서 기술된 방법은 게놈 재배열의 검출에 이용될 수 있다.
현재 게놈 재배열 - 전좌 구분점과 같은 -은 매우 검출하기 어렵다. 예를 들어 비교 게놈 혼성화(CGH) 마이크로어레이는 여러 형태의 재배열을 검출할 수 있으나 전좌를 검출할 수 없다. 전좌가 환자에서 의심되나 염색체 파트너가 알려져 있지 않는 경우 스펙트럼 핵형분석(SKY)이 전좌 파트너를 발견하고 구분점 위치의 대략적 수치를 수득하기 위해 수행된다. 그러나 분석능이 매우 불충분하고(일반적으로 ∼500 Mb 이하) 추가적인 미세-지도화(시간 소비적이고 고비용인)가 일반적으로 요구된다. 이는 일반적으로 제한된 분석능을 제공하는 형광 원위치 혼성화(FISH)를 이용하여 수행된다. FISH를 이용하여 구분점은 최대 분석능으로 +/- 50 kb 영역에 위치할 수 있다.
DNA-DNA 상호작용 빈도는 주로 게놈 사이트 분리의 기능이고, 즉 DNA-DNA 상호작용 빈도가 동일한 물리적 DNA 주형 상에 존재하는 2개의 DNA 사이에서 선형 거리(킬리염기)에 반비례한다(Dekker et al., 2002). 따라서 하나 이상의 새로운 물리적 DNA 주형을 생성하는 전좌는 구분점에 근접한 변경된 DNA-DNA 상호작용에 의해 수반되고 이는 4C 기술에 의해 측정될 수 있다. 전좌가 파손된 염색체(DNA) 팔의 물리적 결합(상호작용)의 결과이기 때문에 전좌에 기반한 질병은 일반적으로 변형된 DNA-DNA 상호작용에 의해 유발된다.
따라서 전좌의 검출을 위해 4C 기술은 질환 및 비질환 피험체간에 상이한 DNA-DNA 상호작용을 확인하는데 이용된다.
예로서 4C 기술은 여기서 기술된 제공된 임상적 표현형과의 빈번한 결합에 기반하여 선택된 좌의에 근접한 전좌에 대해 환자 물질의 선별에 적용될 수 있다.
전좌는 환자에서 의심되나 염색체 파트너가 알려지지 않은 경우 초기 지도화가 스펙트럼 핵형분석(SKY)과 같은 현재 이용 가능한 방법을 이용하여 수행된다. 이는 전좌 파트너를 확인시키고 구분점 위치의 매우 개략적인 수치를 제공한다(일반적으로 ∼50 Mb 이하의 분석능). 이후 4C 기술은 구분점을 미세하게 지도화하고 예를 들어 전좌의 결과로서 이상-발현된 유전자(들)를 확인하기 위해 예를 들어 2 Mb, 5Mb, 10Mb, 20Mb 마다(또는 여기서 기술된 다른 간격) 이들 영역 내에서 '미끼'-서열을 이용하여 적용될 수 있다.
일반적으로 전좌는 4C-미끼 서열을 포함한 것 이외의 염색체 또는 동일한 염색체 상에의 다른 곳의 낮은 상호작용 빈도에서 높은 상호작용 빈도로의 급겨한 변환에 의해 확인될 것이다.
바람직한 실시태양에서 피험체 유래의 표본은 전-악성 상태이다.
바람직한 실시태양에서 피험체 유래 표본은 태아 진단을 위한 양수 천자에 의해 수득되는 배양되거나 배양되지 않은 앰니오사이트(amniocyte)로 구성된다.
바람직한 어레이 디자인에서 단일 어레이 상에 존재하는 프로브는 최대 분석능으로 제공된 종의 완전한 게놈을 나타낸다. 따라서 4C 기술에 의해 전좌를 검출하는 어레이는 제공된 종(예를 들어 인간)의 게놈 내 모든 1차 제한 효소 인식 사이트의 모든 측면에 상보적인 여기서 기술된 프로브를 포함한다.
또다른 바람직하게는 디자인에서 단일 어레이 상에 존재하는 프로브는 제공된 종의 완전한 게놈을 나타내나 최대 분석능은 아니다. 따라서 4C 기술에 의해 전좌를 검출하는 어레이는 제공된 종(예를 들어 인간)의 게놈 내 모든 1차 제한 효소 인식 사이트의 하나의 측면에 상보적인 여기서 기술된 프로브를 포함한다.
또다른 바람직한 디자인에서 단일 어레이 상에 존재하는 프로브는 제공된 종의 완전한 게놈을 나타내나 최대 분석능은 아니다. 따라서 4C 기술에 의해 전좌, 결실, 전도, 중복 및 다른 게놈 재배열을 검출하는 어레이는 제공된 종(예를 들어 인간)의 게놈의 선형 주형에 따라 정렬시 모든 다른 1차 제한 효소 인식 사이트의 하나의 측면에 상보적인 여기서 기술된 프로브를 포함한다.
따라서 4C 기술에 의해 전좌, 결실, 전도, 중복 및 다른 게놈 재배열을 검출하는 어레이는 각각 1차 제한 효소로 분해 후 수득시 단일 제한 단편을 나타내는 여기서 기술된 프로브를 포함한다. 바람직하게는 이는 동일한 제한 단편에 혼성화하는 모든 두 번째, 세 번째, 네 번째, 다섯 번째, 여섯 번째, 일곱 번째, 여덟 번째, 아홉 번째, 열 번째, 스무 번째, 서른 번째, 마흔 번째, 쉰 번째, 예순 번째, 일흔 번째, 여든 번째, 아흔 번째 또는 백 번째 프로브를 무시함으로서 수득된다. 4C 기술에 의해 전좌, 결실, 전도, 중복 및 다른 게놈 재배열을 검출하는 어레이는 선형 염색체 주형을 따라 동일하게 분포되는 여기서 기술된 프로브를 포함한다. 바람직하게는 이는 최대 프로브 밀도를 나타내는 게놈 영역 내 하나 이상의 프로브를 무시함으로서 수득된다.
또다른 바람직한 디자인에서 단일 어레이 상에 존재하는 프로브는 제공된 종의 완전한 게놈을 나타내나 최대 분석능은 아니다. 따라서 4C 기술에 의해 전좌, 결실, 전도, 중복 및 다른 게놈 재배열을 검출하는 어레이는 제공된 종(예를 들어 인간)의 선형 주형을 따라 정렬시 모든 두 번째, 세 번째, 네 번째, 다섯 번째, 여섯 번째, 일곱 번째, 여덟 번째, 아홉 번째, 열 번째, 스무 번째, 서른 번째, 마흔 번째, 쉰 번째, 예순 번째, 일흔 번째, 여든 번째, 아흔 번째 또는 백 번째 프로브 1차 제한 효소 인식 사이트의 하나의 측면에 상보적인 여기서 기술된 프로브를 포함한다. 4C 기술에 의해 전좌, 결실, 전도, 중복 및 다른 게놈 재배열을 검출하는 어레이는 완전한 게놈을 나타내나 100 킬로염기 마다 단일 프로브로 여기서 기술된 프로브를 포함한다. 4C 기술에 의해 전좌, 결실, 전도, 중복 및 다른 게놈 재배열을 검출하는 어레이는 특정 프로브 서열에 의해 나타날 수 있는 게놈 내 모든 단일 1차 제한 효소 인식 사이트를 나타내는 여기서 기술된 프로브를 포함한다.
또다른 바람직한 어레이 디자인에서 단일 어레이 상의 여기서 기술된 프로브는 전좌, 결실, 전도, 중복 및 다른 게놈 재배열과 관련된 모든 좌위 주변에 제공된 크기 - 약 50 kb, 100 kb, 200 kb, 300 kb, 400 kb, 500 kb, 1 Mb, 2 Mb, 3 Mb, 4 Mb, 5 Mb, 6 Mb, 7 Mb, 8 Mb, 9 Mb 또는 10 Mb와 같은 -(예를 들어 약 50 kB∼10 Mb)의 게놈 영역을 나타낸다.
또다른 바람직한 어레이 디자인에서 단일 어레이 상의 여기서 기술된 프로브는 전좌, 결실, 전도, 중복 및 다른 게놈 재배열과 관련된 것으로 알려진 선택된 좌위 주변에 제공된 크기 - 약 50 kb, 100 kb, 200 kb, 300 kb, 400 kb, 500 kb, 1 Mb, 2 Mb, 3 Mb, 4 Mb, 5 Mb, 6 Mb, 7 Mb, 8 Mb, 9 Mb 또는 10 Mb와 같은 -(예를 들어 약 50 kB∼10 Mb)의 게놈 영역을 나타낸다. 선택은 교육된 표준을 근거로 이루어질 수 있고 예를 들어 이들은 제공된 형태의 질병과 관련된 좌위만을 나타낼 수 있다.
또다른 바람직한 어레이 디자인에서 단일 어레이 상의 여기서 기술된 프로브는 각 프로브 서열에서 혼성화 신호 강도의 정량적 측정을 가능하기 위해 각각 프로브가 몇 배(예를 들어 10, 100, 1000)로 나타남으로서 예를 들어 염색체 또는 다수의 염색체의 100 kb, 200 kb, 300 kb, 400 kb, 500 kb, 600 kb, 700 kb, 800 kb, 900 kb, 1 Mb, 2 Mb, 3 Mb, 4 Mb, 5 Mb, 6 Mb, 7 Mb, 8 Mb, 9 Mb, 10 Mb, 20 Mb, 30 Mb, 40 Mb, 50 Mb, 60 Mb, 70 Mb, 80 Mb, 90 Mb 또는 100 Mb(예를 들어. 100 kb∼10 Mb)(부분)의 목적 게놈 영역을 나타낸다.
바람직한 실험 디자인에서 4C 서열(미끼)은 실질적인 재배열 서열(즉 전좌의 경우 구분점)로부터 약 O kb, 10 kb, 20 kb, 30 kb, 40 kb, 50 kb, 100 kb, 200 kb, 300 kb, 400 kb, 500 kb, 1 Mb, 2 Mb, 3 Mb, 4 Mb, 5 Mb, 6 Mb, 7 Mb, 8 Mb, 9 Mb 10 Mb, 11 Mb, 12 Mb, 13 Mb, 14 Mb 또는 15 Mb(예를 들어 약 0∼15 Mb) 이상에 위치한다.
바람직한 혼성화에서 질환 및 비질환 피험체 유래 하나의 서열(4C 미끼)로 수득되는 2개의 차별적으로 표지된 4C 주형은 동일한 어레이에 동시에 혼성화된다. DNA-DNA 상호작용 상의 차이는 시스(4C-미끼와 동일한 염색체 상의) 및 트랜스(전좌 파트너 상의)의 구분점의 검출을 가능하게 한다.
바람직한 혼성화에서 질환 및 비질환 피험체 유래 하나의 서열(4C 미끼)로 수득되는 다수의 차별적으로 표지된 4C 주형은 동일한 어레이에 동시에 혼성화된다. DNA-DNA 상호작용 상의 차이는 시스(4C-미끼와 동일한 염색체 상의) 및 트랜스(전좌 파트너 상의)의 구분점의 검출을 가능하게 한다.
유리하게는 마이크로-어레이 상의 이중 색상 분석 대신 다중-색상이 이용되어 단일 어레이로의 2 이상의 표본의 동시 혼성화를 가능하게 한다. 따라서 다중-색상 혼성화는 4C 기술에 이용될 수 있다.
바람직한 혼성화에서 질환 피험체 유래 하나의 서열(4C 미끼)로 수득되는 다수의 차별적으로 표지된 4C 주형 및 비질환 피험체 유래의 하나의 차별적으로 표지된 4C 주형은 동일한 어레이에 동시에 혼성화된다. DNA-DNA 상호작용 상의 차이는 시스(4C-미끼와 동일한 염색체 상의) 및 트랜스(전좌 파트너 상의)의 구분점의 검출을 가능하게 한다.
또다른 바람직한 혼성화에서 각각 또다른 가능한 전좌 파트너를 나타내는 2개의 다른 서열(4C-미끼)로 수득되는 동일한 비질환 피험체 유래의 2개의 차별적으로 표지된 4C 주형은 동일한 어레이에 동시에 혼성화된다. 목적 서열(4C-미끼)을 전달하는 염색체와 관련되지 않은 염색체의 선형 주형 상에서 관찰되는 강한 혼성화 신호 집단은 전좌 파트너 염색체 및 전좌 파트너 상의 구분점을 확인시킬 것이다.
또다른 바람직한 혼성화에서 각각 또다른 가능한 전좌 파트너를 나타내는 다수의 서열(4C-미끼)로 수득되는 동일한 비질환 피험체 유래의 다수의 차별적으로 표지된 4C 주형은 동일한 어레이에 동시에 혼성화된다. 목적 서열(4C-미끼)을 전달하는 염색체와 관련되지 않은 염색체의 선형 주형 상에서 관찰되는 강한 혼성화 신호 집단은 전좌 파트너 염색체 및 목적 서열에 대한 그의 구분점을 확인시킬 것이다.
4C 기술에 의해 전좌, 결실, 전도, 중복 및 다른 게놈 재배열의 검출에 이용되는 물질은 질환 및/또는 비질환 피험체 유래의 생체 세포 및/또는 사멸 세포 및/또는 세포핵 용해질 및/또는 분리된 염색질 등(여기서 기술된)을 교차-결합함으로서(및 여기서 기술된 바와 같이 추가 처리시킴으로서) 수득될 수 있다.
전도의 검출
전도(예를 들어 균형 전도)는 방법 - 비교 게놈 혼성화 기술과 같은 -에 의해 검출될 수 없으나 특히 (균형) 전도가 4C 서열(미끼)에 근접한 경우(예를 들어 약 1∼15 Mb 이상) 4C 기술에 의해 검출될 수 있다.
(균형) 전도의 검출은 질환 및 비-질환 피험체 간에 상이한 DNA-DNA 상호작용을 확인하는 것을 기반으로 한다. 전도는 4C 서열(미끼)로서 채취된 동일한 염색체 상에 근접한 서열에 대해 측정시 재배열 영역의 모든(대부분 중심에 위치한) 서열의 물리적인 DNA 주형 상의 상대적 위치(킬러염기 내)를 변화시킬 것이다. DNA-DNA 상호작용 빈도가 게놈 사이트 분리에 역비례하기 때문에 질환 피험체는 비질환 피험체와 비교시 재배열 게놈 영역 내에 위치한 모든 프로브에 대한 역전된 패턴의 혼성화 강도를 제공할 것이다. 따라서 4C 기술은 (균형) 전도의 위치 및 크기의 확인을 가능하게 한다.
본 발명의 이러한 관점에 다라 바람직한 특정 어레이 디자인은 전도 또는 다른 재배열이 의심되는 좌위 주변에 제공된 크기의 - 약 50 kb, 100 kb, 200 kb, 300 kb, 400 kb, 500 kb, 1 Mb, 2 Mb, 3 Mb, 4 Mb, 5 Mb, 6 Mb, 7 Mb, 8 Mb, 9 Mb 또는 10 Mb)와 같은 -(예를 들어 50 kb∼10 Mb) 게놈 영역을 나타내는 단일 어레이 상에 프로브를 포함한다.
또다른 바람직한 특정 어레이 디자인에서 단일 어레이 상의 프로브는 전도 또는 다른 재배열이 의심되는 좌위 주변에 제공된 크기(50 kb, 100 kb, 200 kb, 300 kb, 400 kb, 500 kb, 1 Mb, 2 Mb 등)의 게놈 영역을 나타낸다. 신호 강도의 신뢰할 수 있는 정량적 분석을 위해 어레이 상에 존재하는 프로브 함량은 일반적으로 어레이에 혼성화되는 동족 단편의 함량을 크게 초과한다. 따라서 어레이 상에 몇 배(10, 20, 50, 100, 1000배)로 존재하는 각각의 프로브를 지니는 것이 요구된다. 더욱이 어레이에 혼성화되는 주형의 함량을 적정할 필요가 있다.
결실의 검출
결실의 검출은 질환 및 비질환 피험체 간에 상이한 DNA-DNA 상호작용을 확인하는 것을 기반으로 한다. 결실은 결실되는 영역 가까이에(예를 들어 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 또는 15 Mb 이상) 위치한 4C 서열(미끼)와의 DNA 상호작용의 부재를 유발할 것이다. 이는 결실이 두 대립유전자 모두에 존재하는 경우(상동접합성) 재배열 영역에 위치한 모든 프로브에 대한 혼성화 신호의 완전한 부재 또는 결실이 하나의 대립유전자에 존재하는 경우(이형접합성) 비질환 피험체의 신호 강도 대비 질환 피험체 신호 강도의 감소를 유발한다. 결실은 더 많은 말단 서열을 분석되는 4C 서열(미끼)에 대해 물리적 DNA 주형 상에 더욱 인접하게 하고, 이는 결실되는 영역 바로 너머에 위치한 프로브에 대해 더 강한 혼성화 신호를 유발할 것이다.
중복(들)의 검출
중복의 검출은 일반적으로 질환 및 비질환 피험체 간에 상이한 DNA-DNA 상호작용을 확인하는 것을 기반으로 한다. 중복된 영역 내 프로브는 대조군 비질환 피험체 유래 신호와 비교시 재배열 영역 가까이에(예를 들어 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 또는 15 Mb 이상) 위치한 4C 서열(미끼)와의 증가된 혼성화 신호를 나타낼 것이다. 중복되는 영역 너머의 프로브는 4C 서열로부터 더욱 더 떨어지고 결과적으로 대조군 비질환 피험체와 비교시 감소된 혼성화 신호를 나타낼 것이다.
바람직하게는 대조군과 비교시 피험체 표본에 대한 DNA-DNA 상호작용 빈도의 증가 또는 감소는 중복 또는 삽입을 표시한다.
바람직하게는 대조군과 비교시 피험체 표본에 대한 DNA-DNA 상호작용 빈도의 증가 및/또는 더 먼 영역에 대한 DNA-DNA 상호작용 빈도의 감소는 중복 또는 삽입을 표시한다.
태아 진단
유리하게는 4C 기술은 태아 진단에도 이용될 수 있다.
핵산은 당분야에 알려진 다양한 방법을 이용하여 태아에서 수득될 수 있다. 예로서 현탁액 내 태아 세포가 추출되고 수일간 배양되는 양수를 수득하기 위해 양수 천자가 이용될 수 있다(Mercier & Bresson 1995) Ann. Gnt., 38, 151-157). 이후 상기 세포 유래 핵산이 추출될 수 있다. 융모막 융모의 수집은 배양 단계를 생략 가능하게 하고 양수의 채취를 필요 없게 한다. 이들 기술은 초기에(융모막 융모 수집을 위한 임신 기간 7주 및 양수 천자를 위한 13∼14주까지) 적용되나 다소 유산 위험이 증가된다.
또한 제대 수준에서의 태아 혈액의 직접적인 채취가 핵산을 수득하는데 이용될 수 있으나 일반적으로 이러한 기술에서 전문화된 임상 학자 팀이 필요하다(Donner et al. 1996) Fetal Diagn. Ther., 10, 192-199).
유리하게는 유전자 변형(예를 들어 게놈 또는 염색체 변형) - 재배열, 전좌, 전도, 삽입, 결실 및 염색체 및 핵산 내 다른 돌연변이와 같은 -은 이러한 단계에서 검출된다.
바람직하게는 대부분의 변형이 태아에서 발생하는 염색체이므로 유전자 변형(예를 들어 게놈 또는 염색체 변형) - 재배열, 전좌, 전도, 삽입, 결실 및 염색체 21, 18, 13, X 또는 Y 내 다른 돌연변이 및 염색체 21, 18, 13, X 또는 Y의 일부 또는 전부의 소실 또는 획득과 같은 -이 검출된다.
게놈 도입 사이트의 측정
또한 4C 기술은 다수의 카피가 게놈 내 다른 위치에 삽입되는 경우에도 바이러스 및 트랜스유전자의 게놈 도입 사이트의 측정을 가능하게 한다(도 4에 기술됨).
특정 전화를 획득하는 성향의 측정
유리하게는 4C 기술은 유전자 변형에 빈번하게 관련되는 좌위의 게놈 환경을 측정하기 위해 비질환 피험체에 적용될 수 있다.
따라서 여기서 기술된 의학적 이용 이외에 본 발명은 진단에 이용될 수 있다.
피험체
"피험체"라는 용어는 포유류 - 동물 및 인간과 같은 -를 포함한다.
작용제
작용제는 유기 화합물 또는 다른 화학물질이다. 작용제는 천연 또는 인공에 관계없이 어떠한 적당한 공급원으로부터 수득되거나 그에 의해 생성되는 화합물이다. 작용제는 아미노산 분자, 폴리펩타이드 또는 그의 화학적 유도체 또는 그의 결합이다. 작용제는 폴리뉴클레오타이드 분자이다 - 이는 센스 또는 안티센스 분자 또는 항체, 예를 들어 폴리클론 항체, 단일클론 항체 또는 단일클론 인간화 항체이다.
항체-생성 인간 세포주에 대한 요구를 우회하는 인간 특성을 지닌 단일 클론 항체를 생성하기 위한 다양한 전략이 개발되어 왔다. 예를 들어 유용한 마우스 단일클론 항체는 설차류 변이 영역과 인간 불변 영역을 연결시킴으로서 "인간화"되었다(Winter, G. and Milstein, C.(1991) Nature 349, 293-299). 이는 항체의 인간 항-마우스 면역원성을 감소시키나 잔여 면역원성은 외래 V-영역 골격에 의해 유지된다. CDR-이식 및 골격 조작(EP 0239400)이 개선되었고 인간에게 치료적 이용에 수용 가능한 인간화 마우스 항체를 생성하는 것이 가능한 지점으로 항체 조작을 개량시켰다. 인간화 항체는 당분야에 잘 알려진 다른 방버을 이용하여 수득된다(예를 들어 US-A-239400에 기술된 바와 같이).
작용제는 가수분해 가능한 이중 기능성 링커인 링커에 의해 실재(예를 들어 유기 분자)에 부착된다.
실재는 펩타이드뿐만 아니라 작은 유기 분자와 같은 다른 화합물을 포함한 화합물 라이브러리에서 디자인되거나 수득된다.
예로서 실재는 천연 물질, 생물학적 거대분자 또는 박테리아, 진균 또는 동물(특히 포유류) 세포 또는 조직와 같은 생물학적 물질에서 제조된 추출물, 유기 또는 무기 분자, 합성 작용제, 반합성 작용제, 구조적 또는 기능성 유사제, 펩타이드, 펩타이드유사제, 전체 단백질에서 분할된 펩타이드, 합성적으로 합성된 펩타이드(예로서 펩타이드 합성기 또는 재조합 기술을 이용하거나 이들의 결합에 의한), 재조합 작용제, 항체, 천연 또는 비-천연 작용제, 융합 단백질 또는 그의 동등물 및 그의 돌연변이체, 유도체 또는 그의 결합이다.
일반적으로 실재는 유기 화합물일 것이다. 일부의 경우 유기 화합물은 2 이상의 하이드로카빌기를 포함할 것이다. 여기서 "하이드로카빌기"라는 용어는 적어도 C 및 H를 포함한 기를 의미하고, 선택적으로는 하나 이상의 다른 적당한 치환기를 포함하기도 한다. 이러한 치환기의 예는 할로-, 알콕시-, 니트로-, 알킬기, 사이클릭기를 포함한다. 치환기가 사이클릭기일 가능성 이외에도 치환기의 결합은 사이클릭기를 형성한다. 하이드로카빌기가 하나 이상의 C를 포함하는 경우 이들 탄소는 서로 결합될 필요는 없다. 예를 들어 적어도 2 이상의 탄소는 적당한 요소 또는 기를 통해 결합된다. 따라서 하이드로카빌기는 이에 의해 원자를 포함한다. 적당한 원자는 당업자에게 명백할 것이고 예를 들어 황, 질소 및 산소를 포함한다. 일부 적용에 있어서 바람직하게는 실재는 적어도 하나 이상의 사이클릭기를 포함한다. 사이클릭기는 비-융합 폴리사이클릭기와 같은 폴리사이클릭기이다. 일부 적용에 있어서 실재는 또다른 하이드로카빌기에 결합된 적어도 하나 이상의 상기 사이클릭기를 포함한다.
실재는 할로기 - 플루오로기, 클로로기, 브로모기 또는 요오드기와 같은 -를 포함한다.
실재는 하나 이상의 알킬기, 알콕시기, 알케닐기, 알켄길 및 알키닐렌기 - 불균형 또는 균형-사슬인 -를 포함한다.
전구 약물
실재가 전구 약물에서 유래됨은 당업자에 의해 인식될 것이다. 전구 약물의 예는 약물학적 활성을 보유할 뿐만 아니라 특정한 경우 투여된 후(경구적 또는 비경구적으로) 약물학적으로 활성인 실재를 형성하도록 신체 내에서 대사되는 특정 보호기(들)를 포함한다.
적당한 전구 약물은 독소루비신, 마이토마이신, 페놀 머스타드, 메토트렉세이트, 안티폴레이트, 클로람페니콜, 캄토테신, 5-플루오로우라실, 시아나이드, 퀴닌, 디피리다몰 및 파클리탁셀을 포함하나 이에 한정적인 것은 아니다.
예를 들어 "Design of Prodrugs" by H. Bundgaard, Elsevier, 1985에 기술된 바와 같이 "프로-모이어티(pro-moiety)"로 알려진 특정한 모이어티가 작용제의 적당한 기능성을 대신함도 인실될 것이다.
작용제는 약제학적으로 수용 가능한 염 - 산 첨가 염 또는 염기 염과 같은 - 또는 수산화물을 포함한 그의 용매 화합물의 형태이다. 적당한 염에 대한 고찰은 Berge et al, J. Pharm. Sci., 1977, 66, 1-19 참조.
작용제는 다른 치료적 목적을 나타내는 것이 가능하다.
작용제는 하나 이상의 다른 약제학적 활성제와 결합하여 사용된다.
활성제의 결합이 투여되는 경우 활성제의 결합은 동시에, 개별적으로 또는 연속적으로 투여된다.
입체 및 기하 이성질체
실재는 입체이성질체 및/또는 기하 이성질체로서 존재한다 - 예를 들어 실재는 하나 이상의 비대칭 및/또는 기하 중심을 보유하여 2 이상의 다른 입체이성질체 및/또는 기하학적 형태로 존재한다. 본 발명은 이들 실재의 모든 개별적 입체이성질체 및 기하 이성질체 및 그의 혼합물의 이용을 기술한다.
약제학적 염
작용제는 약제학적으로 수용 가능한 염의 형태로 투여된다.
약제학적으로-수용 가능한 염은 당업에게 잘 알려져 있고 예를 들어 J.Pharm.Sci., 66, 1-19(1977)에서 기술된 것을 포함한다. 적당한 산 첨가 염은 비-독성 염을 형성하는 산으로부터 형성되고 염산염, 브롬화수소산염, 질산염, 황산염, 중황산염, 인산염, 인산수소염, 아세트산염, 트리플루오로아세트산염, 글루콘산염, 젖산염, 살리실산염, 구연산염, 주석산염, 아스코르브산염, 숙신산염, 말레이트, 푸마르산염, 벤조산염, 메탄술폰산염, 에탄술폰산염, 벤젠술폰산염 및 p-톨루엔술폰사염을 포함한다.
하나 이상의 산성 모이어티가 존재하는 경우 적당한 약제학적으로 수용 가능한 염기 첨가 염은 비-독성 염을 형성하는 염기로부터 형성될 수 있고 알루미늄염, 칼슘염, 리튬염, 마그네슘염, 칼륨염, 나트륨염, 아연염 및 이에탄올아민염과 같은 약제학적-활성 아민염을 포함한다.
작용제의 약제학적으로 수용 가능한 염은 작용제 용액과 원하는 적당한 산 또는 염기를 함께 혼합함으로서 용이하게 제조된다. 염은 용액에서 침전되고 여과에 의해 채취되거나 용매의 휘발에 의해 회수된다.
작용제는 다형성 형태로 존재한다.
작용제는 하나 이상의 비대칭 탄소 원자를 포함하고 따라서 2 이상의 입체이성질체 형태로 존재한다. 작용제가 알케닐기 또는 알케닐렌기를 포함하는 경우 시스(E) 및 트랜스(Z) 이성질체가 발생한다. 본 발명은 작용제의 개별적인 입체이성질체 및 적당한 경우 그의 개별적인 호변체 형태, 그의 혼합물을 포함한다.
부분입체이성질체 또는 시스 및 트랜스 이성질체의 분리는 통상의 기술 예를 들어 작용제 또는 그의 적당한 염 또는 유도체의 입체이성질체 혼합물의 분획 결정화, 크로마토그래피 또는 H.P.L.C.에 의해 달성된다. 또한 작용제의 개별적 거울상체는 대응하는 광학적으로 순수한 중간물로부터 또는 적당한 키랄 지지체를 이용한 대응 라세미체의 H.P.L.C.와 같은 분해에 의해 또는 적당한 광학적 활성 산 또는 염기로의 대응 라세미체의 반응에 의해 형성된 부분입체이성질체의 분획 결정화에 의해 제조된다.
또한 작용제는 작용제 또는 그의 약제적으로 수용 가능한 염의 모든 적당한 동위원소 변이를 포함한다. 작용제 또는 그의 약제적으로 수용 가능한 염의 동위원소 변이는 적어도 하나 이상의 원소가 동일한 원자수를 지니나 일반적으로 자연에서 발견되는 원자 질량과 상이한 원자 질량을 지닌 원자로 대체된 것으로 정의된다. 작용제 및 그의 약제학적으로 수용 가능한 염 내로 통합될 수 있는 동위원소의 예는 각각 2H, 3H, 13C, 14C, 15N, 170, 180, 31P, 32P, 35S, 18F 및 36Cl과 같은 수소, 탄소, 질소, 산소, 인, 황, 불소 및 염소를 포함한다. 예를 들어 3H 또는 14C와 같은 방사성 동위원소가 통합된 것과 같이 작용제 및 그의 약제학적으로 수용 가능한 염의 특정 동위원소 변이는 약물 및/또는 기질 조직 분포 연구에 유용하다. 삼중수소 즉 3H 및 탄소-14 즉 14C 동위원소는 제조의 용이성 및 검출감도에 있어서 특히 바람직하다. 또한 중수소 즉 2H와 같은 동위원소로의 치환은 더 큰 대사 안정성을 유발하는 특정 치료 장점 예를 들어 증가된 생체 내 반감기 또는 감소된 투여량 필요조건을 제공하고 따라서 일부 환경에서 바람직하다. 본 발명의 작용제 및 그의 약제학적으로 수용 가능한 염의 동위원소 변이는 일반적으로 적당한 시약의 적당한 동위원소 변이를 이용한 통상의 절차에 의해 제조된다.
약제학적 활성 염
작용제는 약제학적으로 수용 가능한 염으로 투여된다. 일반적으로 약제학적으로 수용 가능한 염은 적당한 산 또는 염기를 이용하여 용이하게 제공된다. 염은 용액에서 침전되고 여과 또는 용매의 휘발에 의해 회수된다.
화학 합성 방법
작용제는 화학 합성 기술에 의해 제조된다.
본 발명의 화합물의 합성 동안 민감성 작용기가 보호되고 탈보호될 필요가 있음은 당업자에게 이해될 것이다. 이는 예를 들어 T W Greene and P G M Wuts, John Wiley and Sons Inc. (1991) 및 PJ. Kocienski의 "Protecting Groups", Georg Thieme Verlag (1994)에 기술된 바와 같이 통상의 기술에 의해 달성된다.
반응 동안 특정 조건 하에서 염기가 염기-민감성기를 포함한 광학 중심을 지닌 기질과의 반응에 사용되는 경우 입체중심이 라세미화될 수 있음이 가능하다. 이는 구아닐화 단계 동안 가능하다. 당분야에 잘 알려진 바와 같이 반응 서열, 조건, 시약, 보호/탈보호 요법의 선택에 의해 이와 같은 잠재적인 문제점을 회피하는 것이 가능하여야 한다.
화합물 및 염은 분리되고 통상의 방법에 의해 정제된다.
부분입체이성질체의 분리는 통상의 기술 예를 들어 식 (Ⅰ)의 화합물 또는 그의 적당한 염 또는 유도체의 입체이성질체 혼합물의 분획 결정화, 크로마토그래피 또는 H.P.L.C.에 의해 달성된다. 또한 식 (Ⅰ)의 화합물의 개별적 거울상체는 대응하는 광학적으로 순수한 중간물로부터 또는 적당한 키랄 지지체를 이용한 대응 라세미체의 H.P.L.C.와 같은 분해에 의해 또는 대응 라세미체의 적당하게 광학적으로 활성인 산 또는 염기와의 반응에 의해 형성되는 부분입체이성질체의 분획 결정화에 의해 제조된다.
작용제는 전부 또는 일부의 작용제를 합성하는 화학적 방법을 이용하여 생성된다. 예를 들어 작용제가 펩타이드를 포함하는 경우 펩타이드는 고형상 기술에 의해 합성되고 수지로부터 분할되고 예비 고성능 액체 크로마토그래피에 의해 정제된다(예를 들어 Creighton (1983) Proteins Structures And Molecular Principles, WH Freeman and Co, New York NY). 합성 펩타이드 조성물은 아미노산 분석 또는 서열분석(예를 들어 Edman 분해 절차; Creighton, 상동)에 의해 확인된다.
펩타이드 저해제(또는 그의 변이체, 상동체, 유도체, 단편 또는 유사제)의 합성은 다양한 고형상 기술을 이용하여 제조될 수 있고(Roberge JY et al (1995) Science 269: 202-204) 예를 들어 제조사에서 제공된 지침에 따라 ABI 43 1 A Peptide Synthesizer(Perkin Elmer)와 같은 것을 이용하여 자동화 합성이 달성된다. 더욱이 작용제를 포함한 아미노산 서열은 직접 합성 동안 변경되거나 변이 작용제를 생성하기 위해 다른 서브유니트 또는 그의 일부 유래의 서열로 화학적 방법을 이용하여 결합된다.
화학 유도체
여기서 사용된 "유도체" 또는 "유도된"이라는 용어는 작용제의 화학적 변형을 포함한다. 이러한 화학적 변형의 예는 할로기, 알킬기, 아실기 또는 아미노기에 의한 수소의 교체이다.
화학적 변형
작용제는 변형된 작용제 - 화학적으로 변형된 작용제와 같으나 이에 한정적이지 않은 -이다.
작용제의 화학적 변형은 수소 결합 상호작용, 전하 상호작용, 소수성 상호작용, 반 데르 발스 상호작용 또는 이중극 상호작용을 증가시키거나 감소시킨다.
하나의 관점에서 작용제는 다른 화합물 개발의 모델(예를 들어 주형)로서 작용한다.
약제학적 조성물
또다른 관점에서 약제학적으로 수용 가능한 담체, 희석제, 부형제 또는 보조제 및/또는 그의 결합과 혼합된 여기서 기술된 에세이 방법에 의해 확인된 작용제를 포함한 약제학적 조성물이 제공된다.
또다른 관점에서 작용제를 포함한 백신 조성물이 제공된다.
또다른 관점에서 에세이에 의해 확인된 작용제를 약제학적으로 수용 가능한 희석제, 담체, 부형제 또는 보조제 및/또는 그의 결합과 혼합하는 것을 포함한 약제학적 조성물의 제조 방법이 제공된다.
또다른 관점에서 피험체에 작용제 또는 약제학적 조성물 또는 백신을 투여하는 것을 포함한 질병의 예방 및/또는 치료 방법이 제공된다.
약제학적 조성물은 인체용 또는 인체 내 동물 사용용 또는 수의학적 약물용이고 일반적으로 하나 이상의 약제학적으로 수용 가능한 희석제, 담체 또는 부형제를 포함한다. 치료적으로 사용하기 위한 수용 가능한 담체 또는 희석제는 약제학 분야에 잘 알려져 있고 예를 들어 Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co.(A. R. Gennaro edit. 1985)에 기술되어 있다. 약제학적 담체, 부형제 또는 희석제의 선택은 투여의 계획된 루트 및 표준 약제학적 실행에 따라 선택될 수 있다. 약제학적 조성물은 담체, 부형제 또는 희석제, 어떠한 적당한 결합제(들), 윤활제(들), 현탁제(들), 코팅제(들), 용해제(들)을 포함한다.
방부제, 안정화제, 염료 및 향미제가 약제학적 조성물 내에 제공된다. 방부제의 예는 벤조산나트륨, 소르브산 및 p-하이드록시벤조산 에스테르를 포함한다. 항산화제 및 현탁제도 사용된다.
다른 전달 시스템에 따라 다르게 다른 조성물/제형 필요조건이 존재한다. 예로서 본 발명의 약제학적 조성물은 미니-펌프를 이용하여 또는 비경 스프레이 또는 흡입용 에어로졸과 같은 점막 경로 또는 소화 가능한 용액 또는 조성물이 전달을 위해 주입 가능한 형태로 제형화된 비경구 투여 또는 정맥내, 근육내 또는 피하 경로에 의해 투여된다. 대안으로 제형은 많은 경로로 투여되도록 디자인된다.
작용제가 위장 점막을 통해 점막으로 투여되는 경우 위장관을 통과하는 동안 안정하게 유지될 수 있어야 하고, 예를 들어 단백질 분해성 분해에 저항적이고 산성 pH에 안정적이고 담즙의 세정 효과에 저항적이어야 한다.
적당한 경우 약제학적 조성물은 흡입, 좌약 또는 질좌제의 형태, 로션, 용액, 크림, 연고 또는 살포제의 형태, 피부 패취의 이용, 전분 또는 락토오스와 같은 부형제를 함유한 정제 형태, 캡슐 또는 오뷸 단독 또는 부형제와 함께 또는 향미제 또는 착색제를 포함한 엘릭시르, 용액 또는 현탁액 형태로 경구적으로 투여되거나 약제학적 조성물은 예를 들어 정맥내, 근육내 또는 피하로 주입될 수 있다. 비경구 투여의 경우 조성물은 다른 물질 예를 들어 혈액과 등장액을 이루기에 충분한 염 또는 모노사카라이드를 포함한 멸균 수용액 형태로 가장 잘 이용된다. 구강 또는 설하 투여의 경우 조성물은 통상의 방식으로 제형화될 수 있는 정제 또는 로젠지 형태로 투여된다.
작용제는 사이클로덱스트린과 결합되어 사용된다. 사이클로덱스트린은 약물 분자와 봉입 및 비-봉입 복합체를 형성하는 것으로 알려져 있다. 약물-사이클로덱스트린 복합체의 형성은 약물 분자의 용해성, 용해 속도, 생체이용률 및/또는 안정성 특성을 변형시킨다. 약물-사이클로덱스트린 복합체는 일반적으로 최대 용량 형태 및 투여 경로에 유용하다. 약물과의 직접 복합체 형성의 대안으로 사이클로덱스트린은 보조 첨가제 예를 들어 담체, 희석제 또는 안정화제로서 사용된다. 알파-, 베타- 및 감마-사이클로덱스트린은 가장 일반적으로 사용되고 적당한 예는 WO-A-91/11172, WO-A-94/02518 및 WO-A-98/55148에 기술되어 있다.
작용제가 단백질인 경우 상기 단백질은 치료되는 피험체 내 원위치에서 제조된다. 이러한 점에서 상기 단백질을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열은 상기 단백질이 상기 뉴클레오타이드 서열로부터 발현되도록 비-바이러스성 기술 (예를 들어 리포솜의 이용) 및/또는 바이러스성 기술(예를 들어 레트로바이러스 벡터의 이용)을 이용하여 전달된다.
또한 본 발명의 약제학적 조성물은 통상의 치료와 결합하여 이용된다.
투여
"투여된다"이라는 용어는 바이러스성 또는 비-바이러스성 기술에 의해 전달된다. 바이러스성 전달 메커니즘은 아데노바이러스 벡터, 아데노-결합 바이러스(AVV) 벡터, 헤르페스 바이러스 벡터, 레트로바이러스 벡터, 렌티바이러스 벡터 및 바큘로바이러스 벡터를 포함하나 이에 한정적인 것은 아니다. 비-바이러스성 전달 메커니즘은 액제 매개 트랜스펙션, 리포솜, 면역리포솜, 리포펙틴, 양이온 전면 양친매제 및 그의 결합을 포함한다.
구성성분은 단독으로 투여되나 일반적으로 약제학적 조성물로서 투여된다 - 예를 들어 구성성분이 투여의 의도된 경로 및 표준 약제학적 실행에 따라 선택된 적당한 약제학적 부형제, 희석제 또는 담체와 혼합되어 존재하는 경우 -.
예를 들어 구성성분은 중간-, 지연된-, 변형된-, 지속된-, 펄스된- 또는 제어된-방출 적용을 위한 향미제 또는 착색제를 포함한 정제, 캡슐, 오뷸, 엘릭시르, 용액 또는 현탁액의 형태로 투여될 수 있다.
약제가 정제인 경우 정제는 미정질 셀룰로스, 락토오스, 구연산나트륨, 탄산칼슘, 이염기인산칼슘 및 글리신과 같은 부형제, 전분(바람직하게는 옥수수, 감자 또는 타피오카 전분), 글리콜산나트륨 전분, 나트륨 크로스카멜로스 및 특정 규산염 복합체와 같은 붕괴제 및 폴리비닐피롤리돈, 하이드록시프로필메틸셀룰로스(HPMC), 하이드록시프로필셀룰로스(HPC), 슈크로스, 젤라틴 및 아카시아와 같은 과립 결합제를 포함한다. 더욱이 스테아르산마그네슘, 스테아르산, 벤조산글리세릴 및 활석과 같은 윤활제가 포함된다.
또한 유사 형태의 고형 조성물은 젤라틴 캡슐 내 충진제로서 이용된다. 이러한 점에서 바람직한 부형제는 락토오스, 전분, 셀룰로스, 우유당 또는 고분자 폴리에틸렌글리콜을 포함한다. 수성 현탁액 및/또는 엘릭시르의 경우 작용제는 다양한 감미제 또는 향미제, 착색제 또는 염료, 유화제 및/또는 현탁제 및 물, 에탄올, 프로필렌글리콜 및 글리세린과 같은 희석제 및 그의 결합과 결합된다.
투여(전달) 경로는 경구(예를 들어 정제, 캡슐, 소화 가능한 용액), 국부, 점막(예를 들어 비강 스프레이 또는 흡입용 에어로졸), 비강, 비경구(예를 들어 주입 가능 형태), 위장관, 척수내, 복막내, 근육내, 정맥내, 자궁내, 안내, 피부내, 두개골내, 기관내, 질내, 뇌실내, 대뇌내, 피하, 안구(유리체내 또는 전방내 포함), 경피성, 직장, 구강, 질, 경막, 설하 중 하나 이상을 포함하나 이에 한정적인 것은 아니다.
투여량 수치
일반적으로 외과의사는 개체 피험체에 가장 적당한 실질적인 투여량을 결정할 것이다. 특정 환자에 대한 특정 투여량 수치 및 투여량 빈도는 달라지고 사용되는 특정 화합물의 활성, 대사 안정성 및 화합물의 작용 기간, 연령, 체중, 일반적 건강, 성별, 식이, 투여 모드 및 시간, 배설 속도, 약물 결합, 특정 조건의 경중도 및 개별적 진행 치료를 포함한 다양한 인자에 따라 달라질 것이다.
제형
구성성분(들)은 당분야에 알려진 기술을 이용하여 하나 이상의 적당한 담체, 희석제 또는 부형제와 혼합시키는 것과 같이 약제학적 조성물로 제형화된다.
질병
본 발명의 관점은 질병의 치료 및/또는 예방 및/또는 진단 및/또는 예측 - WO-A- 98/09985에 기입된 바와 같은 -에 이용된다.
참고를 용이하게 하기 위해 리스트의 일부가 제공된다: 대식세포 저해 및/또는 T 세포 저해 활성 및 그에 따른 항염증 활성; 항-면역 활성, 예를 들어 염증과 관련되지 않은 반응을 포함한 세포 및/또는 체액 면역 반응에 대한 저해 효과; 바이러스 및/또는 다른 세포내 병원체 관련 질병; T 세포 내 상향-조절된 fas 수용체 발현뿐만 아니라 세포외 매트릭스 성분 및 섬유결합소에 대한 대식세포 T 세포의 부착능력 저해; 류마티스 관절염을 포함한 관절염, 과민성, 알레르기 반응, 천식, 전신 홍반 루푸스, 콜라겐 질병 및 다른 자가면역 질병 관련 염증, 죽상동맥경화증, 죽상경화성 심장병, 재관류 손상, 심장정지, 심근경색증, 혈관 염증 장애, 호흡 곤란 증후군 또는 다른 심폐질환 관련 염증, 소화궤양, 궤양 대장염 및 다른 위장관 질병, 간섬유증, 간경화 또는 다른 간질환, 갑상샘엽 또는 다른 과립 질환, 사구체신염 또는 다른 신장 및 비뇨기 질환, 중이염 또는 다른 이비인후과 질환, 피부염 또는 다른 피부 질환, 치주 질환 또는 다른 치과 질환, 고환염 또는 부고환-고환염, 불임증, 고환통 외상 또는 다른 면역-관련 고환 질환, 태반 기능장애, 태반 부전증, 습관성 유산, 자간증, 자간전증 및 다른 면역 및/또는 염증-관련 부인과 질환, 후방 포도막염, 중간부 포도막염, 전방 포도막염, 결막염, 맥락망막염, 포도막망막염, 시각신경염, 안내 염증, 예를 들어 망막염 또는 낭포황반부종, 교감성 안염, 공막염, 망막 색소변성, 퇴행성 폰더스 질환의 면역 및 염증 성분, 안구 외상의 염증 성분, 감염에 의해 유발된 안구 염증, 증식성 유리체-망막병증, 급성 허혈 시각 신경병증, 과도 흉터형성 예를 들어 녹내장 여과 시술 후, 안구 이식에 대한 면역 및/또는 염증 및 면역 및 염증-관련 안과 질환 관련 염증, 면역 및/또는 염증 억제가 이로운 중추신경계(CNS) 또는 다른 기관 내 자가면역 질환 또는 이상 또는 장애, 파킨슨병, 파킨슨병의 치료 유래 합병증 및/또는 부작용, AIDS-관련 치매 복합 HIV-관련 뇌병증, 데빅병, 시덴함 무도병, 알츠하이머병 및 다른 퇴행성 질환, CNS의 이상 또는 장애, 뇌졸중의 염증 성분, 경색후 증후군, 정신과 질환의 면역 및 염증 성분, 척수염, 뇌염, 아급성 경화성 범뇌염, 뇌척수염, 급성 신경병증, 아급성 신경병증, 만성 신경병증, 길랑-바레 증후군, 시덴함 무도병, 중증 근육무력증, 가성 뇌종양, 다운증후군, 헌팅톤병, 근위축성 측삭 경화증, CNS 압박증 또는 CNS 외상 또는 CNS 감염의 염증 성분, 근육위축 및 퇴행위축의 염증 성분 및 중추 및 말초 신경계의 면역 및 염증 관련 질환, 이상 또는 장애, 외상-후 염증, 패혈성 쇼크, 감염성 질환, 수술의 염증 합병증 또는 부작용, 골수 이식 또는 다른 이식 합병증 및/또는 부작용, 예를 들어 바이러스 담체로의 감염으로 인한 유전자 치료의 염증 및/또는 면역 합병증 및 부작용 또는 각막, 골수, 기관, 렌즈, 페이스메이커, 천연 또는 인공 피부 조직과 같은 천연 또는 인공 세포, 조직 및 기관의 이식시 이식 거부의 예방 및/또는 치료를 위한 단핵세포 또는 백혈구를 치료하거나 개선시키기 위해 체액 및/또는 세포 면역 반응을 억제시키거나 저해시키기 위한 AIDS 관련 염증. 특정 암 관련 장애는 하기를 포함하나 이에 한정적인 것은 아니다: 고형 종양; 백혈병과 같은 혈액 생성 종양; 종양 전이; 양성 종양 예를 들어 혈관종, 청신경종, 신경섬유종, 트라코마 및 화농성 육아종; 류마티스 관절염; 건선; 안구 혈관형성 질환, 예를 들어 당뇨 망막병증, 미숙아 망막병증, 황반변성, 각막 이식 거부, 신생혈관 녹내장, 수정체후부 섬유증식증, 피부홍조; 오슬러-웨버 증후군; 심근 혈관형성; 플라크 혈관신생; 모세혈관확장; 혈우병 관절; 혈관섬유종; 상처 과립형성; 심장 부정맥; 대뇌 부정맥; 동정맥기형; 허혈성 사지 혈관형성; 신생혈관 녹내장; 수정체후부 섬유증식증; 당뇨 혈관신생; 헬리코박터 관련 질환, 골절, 혈관생성, 조혈, 배란, 월경 및 태반형성.
바람직하게는 질병은 암이다 - 급성 림프구성 백혈병(ALL), 급성 골수성 백혈병(AML), 부신피질암, 항문암, 방광암, 혈암, 뇌종양, 유방암, 여성 생식기 암, 남성 생식기 암, 중추신경계 림프종, 자궁경부암, 소아 횡문근육종, 소아 육종, 만성 림프구성 백혈병(CLL), 만성 골수성 백혈병(CML), 결장 및 직장 암, 결장암, 자궁내막암, 자궁내막육종, 식도암, 안암, 쓸개암, 위암, 위장관암, 모발상 세포 백혈병, 두경부 암, 간세포 암, 호지킨병, 하인두암, 카포시 육종, 신장암, 후두암, 백혈병, 간암, 폐암, 악성 섬유 조직구종, 악성 흉선종, 흑색종, 중피종, 다발골수종, 골수종, 비강 및 부비동 암, 비인두암, 신경계암, 신경모세포종, 비-호지킨 림프종, 구강암, 구인두암, 골육종, 난소암, 췌장암, 부갑상샘암, 음경암, 인두암, 하수체 종양, 형질세포 신생물, 원발 CNS 림프종, 전립선암, 직장암, 호흡계암, 망막모세포종, 침샘암, 피부암, 소장암, 연조직 육종, 위암, 고환암, 갑상샘암, 비뇨기계암, 자궁 육종, 질암, 혈관계암, 발덴스트룀 마크로글로불린혈증 및 윌름즈 종양과 같은 -.
키트
본 발명의 방법에 사용되는 물질은 키트 제조에 적당하다.
이러한 키트는 각각 예를 들어 1차 제한 효소, 2차 제한 효소, 교차-결합제, 라이게이션 효소(예를 들어 리가제) 및 교차-결합을 역전시키는 작용제(예를 들어 프로티나제 K)를 포함한 여기서 기술된 방법에 이용되는 하나 이상의 다양한 시약(일반적으로 농축 형태)을 지닌 용기를 포함한다.
또한 동결건조되거나 용액(예를 들어 증류수 또는 완충액) 상태와 같이 어떠한 형태도 가능한 올리고뉴클레오타이드가 용기 내에 제공된다.
본 발명의 바람직한 관점에서 여기서 기술된 프로브 세트, 어레이 및 선택적으로는 하나 이상의 표지를 포함한 키트가 제공된다.
또한 일반적으로 지침 세트가 포함될 것이다.
이용
유리하게는 본 발명은 뉴클레오타이드 서열의 공간적 조직에 관한 정보 - 생체 내 또는 시험관 내 게놈 좌위와 같은 -를 수득하기 위해 이용될 수 있다.
예로서 4C 기술은 하나 이상의 유전자 좌위의 3차원 조직을 연구하는데 이용될 수 있다. 특히 본 기술은 하나 이상의 유전자 좌위의 3차원 조직 내 하나 이상의 전사 인자의 역할을 연구하는데 이용될 수 있다.
또다른 예로서 4C 기술은 트랜스-작용 인자 및 시스-조절 DNA 요소의 역할을 연구하는데 이용될 수 있다.
또다른 예로서 4C 기술은 시험관 내 또는 생체 내 광범위 유전자 조절을 연구하는데 이용될 수 있다.
또다른 예로서 4C 기술은 염색체간 근접도 및 상호작용을 연구하는데 이용될 수 있다.
또다른 예로서 4C 기술은 프로모터, 인핸서, 침묵제, 절연체, 좌위 조절 영역, 복제 기원, MAR, SAR, 동원체, 종말체 또는 조절 네트워크 내 다른 목적 서열과 기능하는 뉴클레오타이드 서열을 확인하는데 이용될 수 있다.
또다른 예로서 4C 기술은 돌연변이 및/또는 결실이 발생하여 원거리의 조절 요소에 영향을 미치고 따라서 그의 지도화가 이러한 정보 제공에 실패하는 경우 표현형(질병)에 중요한 유전자를 확인하는데 이용될 수 있다.
또다른 예로서 4C 기술은 결국 유전자 좌위, 거대 게놈 영역 또는 완전한 염색체의 공간적 입체형태를 재구축하는데 이용될 수 있다.
또다른 예로서 4C 기술은 세포핵 공간 내에 특정 염색체를 함께 유지시키는 잠재적인 고정 서열을 한정하는데 이용될 수 있다.
또다른 예로서 4C 기술은 결국 서로에 대해 염색체 위치를 높은 분석능으로 재구축하는데 이용될 수 있다.
일반적 재조합 DNA 방법론 기술
본 발명은 특별히 나타내지 않는 한 당업자의 능력 내에 있는 화학, 분자생물학, 미생물학, 재조합 DNA 및 면역학의 통상의 기술을 이용한다. 이러한 기술은 문헌 내에 설명되어 있다. J. Sambrook, E. F. Fritsch, and T. Maniatis, 1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition, Books 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory Press; Ausubel, F. M. et al. (1995) and periodic supplements; Current Protocols in Molecular Biology, ch. 9, 13, and 16, John Wiley & Sons, New York, N. Y.); B. Roe, J. Crabtree, and A. Kahn, 1996, DNA Isolation and Sequencing: Essential Techniques, John Wiley & Sons; M. J. Gait (Editor), 1984, Oligonucleotide Synthesis: A Practical Approach, M Press; and, D. M. J. Lilley and J. E. Dahlberg, 1992, Methods of Enzymology: DNA Structure Part A: Synthesis and Physical Analysis of DNA Methods in Enzymology, Academic Press 참조. 이들 문헌 각각은 여기서 참고로서 포함된다.
본 발명은 실시예에 의해 더욱 설명되고 이는 본 발명의 수행시 당업자에게 도움을 주고자 하나 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.
도 1은 3C 기술의 원리를 나타낸 것이다..
도 2(a)는 4C 기술의 하나의 실시태양의 원리를 나타낸 것이다. 3C 분석은 통상적인 방법 즉, 제한 효소로서 HindⅢ(H)로 수행된다. 교차-결합 역전 후 DNA 혼합물은 많은 다른 단편에 라이게이트된 첫 번째(타겟) 뉴클레오타이드 서열을 포함할 것이다. 이들 단편은 첫 번째(타겟) 뉴클레오타이드 서열 특이적 프라이머를 이용하여 DpnⅡ 원 상에서 증폭 방법 - 역 PCR과 같은 - 을 이용하여 증폭되고 표지될 것이다. 표지된 증폭 생성물은 여기서 기술된 바와 같이 어레이에 혼성화된다. HindⅢ 및 DpnⅡ은 예로서 제공된 것이고 다른 조합의 제한 효소 - 6 도는 8- 및 4 또는 5-절단기와 같은 - 도 이용될 수 있다. 도 2(b)는 2개의 독립적인 태아 간(L1, L2) 및 뇌(B1, B2) 표본 유래 겔 전기영동에 의해 분리된 PCR 결과를 나타낸 것이다. 도 2(c)는 마이크로어레이 프로브 위치의 개략도를 나타낸 것이다. 프로브는 100 bp의 HindⅢ 사이트 내에 디자인된다. 따라서 각 프로브는 하나의 가능한 라이게이션 파트너를 분석한다.
도 3은 4C 기술이 β-글로빈(염색체 7)의 게놈 환경을 검출함을 나타낸 것이다. 마우스 염색체 10, 11, 12, 14, 15, 7 및 8(상단부터 하단까지; 나타난 영역은 각각의 대응 동원체로부터의 동일한 거리에 존재함) 상의 ∼35 Mb 게놈 영역 내 에 위치하는 프로브에 대한 비처리된 비율(대조군 표본에 대해 수득된 신호에 의해 나누어진 β-글로빈 HS2에 대한 4C 신호)이 나타나 있다. 염색체 7(4열) 상의 (글로빈) 미끼 주변의 더 큰 무리의 강한 신호가 주지되어야 하고, 이는 4C 기술이 선형 염색체 주형 상에 근접한 게놈 단편을 검출함을 입증한다(상호작용 빈도가 게놈 사이트 분리에 역비례한다는 사실과 일치). 높은 신호 강도를 나타내는 미끼 주변에 시스(cis)로 결합된 영역이 큼(>5 Mb)이 주지되어야 하고, 이는 예를 들어 전위가 구분점에서 1 MB 이상 떨어진 미끼로도 검출될 수 있음을 의미한다.
도 4는 4C 기술이 Rad23A(염색체 8)의 게놈 환경을 검출함을 나타낸 것이다. 마우스 염색체 10, 11, 12, 14, 15, 7 및 8(상단부터 하단까지; 나타난 영역은 각각의 대응 동원체로부터의 동일한 거리에 존재함) 상의 ∼15 Mb 게놈 영역 내에 위치하는 프로브에 대한 비처리된 비율(대조군 표본에 대해 수득된 신호에 의해 나누어진 Rad23A에 대한 4C 신호)이 나타나 있다. 염색체 8(7열) 상의 (Rad23A) 미끼 주변의 더 큰 무리의 강한 신호가 주지되어야 하고, 이는 4C 기술이 선형 염색체 주형 상에 근접한 게놈 단편을 검출함을 입증한다(상호작용 빈도가 게놈 사이트 분리에 역비례한다는 사실과 일치). 높은 신호 강도를 나타내는 미끼 주변에 시스(cis)로 결합된 영역이 큼(>5 Mb)이 주지되어야 하고, 이는 예를 들어 전위가 구분점에서 1 MB 이상 떨어진 미끼로도 검출될 수 있음을 의미한다.
도 5는 전사 조직(태아 간) 및 비-전사 조직(태아 뇌)에 대한 염색체 7(∼ 135 Mb) 상의 β-글로빈의 4C 상호작용을 나타낸 것이다(이동 평균 접근에 의해 분석됨). β-글로빈과의 광범위 상호작용이 조직간에 상이함이 주지되어야 한다(유전자의 전사 상태에 의존적임). 조직과 독립적으로 강한 4C 신호는 미끼 주변의 큰 영역(>5 Mb)를 구별한다.
도 6은 태안 간세포 내 β-글로빈과 상호작용하는 Uros 및 Eraf를 나타낸다. 4C 접근은 2개 유전자인 Uros 및 Eraf가 ∼30 Mb 떨어져 위치한 β-글로빈 좌위와 함께 >30 Mb 이상으로 상호작용함을 나타낸다. 이들 2개의 상호작용은 Osborne et al., Nature Genetics 36, 1065 (2004)에 기술된 바와 같은 다른 기술에 의해 종전 발견되었다. 이러한 예는 4C 기술에 의해 검출되는 광범위 상호작용이 FISH에 의해 검증될 수 있고 실제로 세포핵 근접성을 반영함을 나타낸다.
도 7은 4C 기술이 시스로 결합된 관련되지 않은 게놈 영역간의 변환을 정확히 확인함을 나타낸 것이다. 이들 실험을 위해 마우스 염색체 8 상의 Rad23A 좌위 내로 삽입되는 인간 β-글로빈 좌위 조절 영역(LCR) 카세트(∼20 kb)를 포함하는데 형질전환 마우스가 이용되었다. 4C 기술은 이러한 삽입에 동형접합성인 형질전환 마우스의 E14.5 태아 간에서 수행되었다. 도입 카세트(HS2) 내 HindⅢ 단편이 '4C-미끼'로 사용되었다. 자료는 4C 기술이 형질전환 카세트의 양 말단을 정확하게 한정하고(하단열: ∼380 kb 인간 β-글로빈 잔여 서열 내 프로브가 아닌 인간 LCR(∼20 kb) 내 프로브만이 4C-신호를 제공하고) 마우스 염색체 8 상의 도입 위치를 나타냄(상위 패널: 염색체 8(도입 위치는 화살표 참조) 상의 신호와 6개 다른 마우스 염색체 상의 신호를 비교함)(완전한 염색체가 표시됨)을 나타낸다. 이러한 예는 4C 기술이 이소 도입 DNA 단편(바이러스, 트랜스유전자 등)의 게놈 위치를 검출하는데 이용될 수 있음을 나타낸다. 이는 시스로 결합되는 관련되지 않은 게놈 영역간의 변환이 정확히 확인될 수 있고, 게놈 구분점과 전위 파트너를 확인하는데 이용될 수 있음을 나타낸다.
도 8은 HS2 및 β-글로빈에 대한 프로파일이 매우 유사하기 때문에 4C 기술이 재현 가능한 데이터를 생성함을 나타낸 것이다. 4개의 생물학적으로 독립적인 4C 실험은 미끼로서 β-글로빈 유전자 β-메이저(major)(상위 2열) 또는 β-글로빈 HS2(하단 2열)을 이용하여 E14.5 태아 간에서 수행되었다. 이들 미끼는 선형 염색체 주형 상에서 ∼40 kb 떨어져 있으나 종전에는 세포핵 공간에 근접한 것으로 나타났다(Tolhuis et al, Molecular Cell 10, 1453 (2002)). β-글로빈 좌위에서 20∼20 Mb 떨어진 마우스 염색체 7 상의 ∼5 Mb 영역이 묘사되어 있다. 데이터는 독립적 실험간의 높은 재현성을 나타낸고 세포핵 공간에 근접한 2개 단편이 게놈 내 다른 곳에 위치한 상호작용 파트너를 공유함을 입증한다.
도 9는 4C 기술이 건강한 사람(상단)과 전위를 지닌 환자(A;B)(하단) 유래의 세포 내 서열 X(염색체 A 상의)로 DNA-DNA 상호작용 빈도를 측정하는데 적용됨을 나타낸다. DNA-DNA 상호작용 빈도(Y-축)을 나타내는 신호 강도는 선형 염색체 주 형(X-축) 상에 정렬된 프로브에 대해 플롯된다. 정상 세포에 있어서 빈번한 DNA-DNA 상호작용은 염색체 A 및 서열 X 상에서 검출된다. 환자 세포에 있어서 상호작용 빈도의 50% 축소는 구분점(BP)의 다른 면에 위치하는 염색체 A 상의 프로브에 대해 관찰된다(회색 곡선(환자)와 흑색 선(건강한 사람)을 비교). 더욱이 전위는 근접한 물리적 근접성의 염색체 B의 일부를 서열 X에 이동시키고, 빈번한 DNA-DNA 상호작용은 염색체 B 상의 이러한 영역에 대해 현재 관찰된다. 이러한 염색체 상의 낮은 상호작용 빈도에서 높은 것으로의 급격한 변환은 그의 구분점위 위치를 표시한다.
도 10은 (균형) 역위(들)이 4C 기술에 의해 검출될 수 있음을 나타낸다. DNA-DNA 상호작용 빈도의 역전된 패턴(혼성화 신호 강도로서 4C 기술에 의해 측정됨)은 비-질환 피험체(점선 곡선)와 비교시 질환 피험체(실선 곡선)에서 관찰되고 이는 역위의 존재 및 크기를 나타낸다.
도 11은 4C 기술에 의한 이형접합성 결실(들)을 나타낸 것이다. 비-질환 피험체(흑색 곡선)와 비교시 질환 피험체(회색 곡선) 내 축소된 DNA-DNA 상호작용 빈도(혼성화 신호 강도로 4C 기술에 의해 측정)를 지닌 프로브는 결실된 영역의 위치 및 크기를 나타낸다. 질환 피험체의 결실 영역 내 잔여 혼성화 신호는 무손상 대립유전자에서 유래한다(이형접합성 결실). 이들 영역이 4C 서열(미끼)에 대한 물리적 근접성에 더욱 근접하기 때문에 결실은 일반적으로 결실된 영역 바로 너머 에 위치한 프로브에 대한 신호 강도 증가에 의해 달성된다(회색 곡선이 결실의 우측에서 흑색 곡선 위에 존재함을 주지).
도 12는 4C 기술에 의해 검출되는 중복을 나타낸 것이다. 정상 피험체(점선 곡선)와 비교시 환자(실선 곡선) 내 증가된 혼성화 신호를 지닌 프로브는 중복의 위치 및 크기를 나타낸다. 4C 기술에 의해 검출되는 중복은 일반적으로 중복 영역 너머 프로브에 대한 비-질환 피험체 대비 질환 피험체 내 감소된 혼성화 신호에 의해 달성된다(중복은 4C 서열 유래 게놈 사이트 분리를 증가시킴).
도 13은 4C 기술에 의해 나타난 β-글로빈과의 광범위 상호작용을 나타낸 것이다. a, 염색체 7 및 2개의 관련되지 않은 염색체(8 및 14)와의 β-글로빈 HS2 상호작용을 나타내는 대조군 혼성화 신호에 대한 4C의 비처리 비율. b-c, 염색체 7 상의 2개의 다른 1-2 Mb 영역을 따라 플롯된 2개의 독립적인 태아 간(상단, 적색) 및 태아 뇌 표본(하단, 청색)에 대한 비처리 데이터. 상호작용의 높은 재현 가능성의 집단이 2개의 태아 간 표본(b) 또는 2개의 뇌 표본(c)에서 관찰된다. d-e, 동일한 영역에 대한 연속적 평균 데이터. f, 염색체 7 상의 활성(태아 간, 상단) 및 불활성(태아 뇌, 하단) β-글로빈과의 상호작용의 영역의 개략도.
도 14는 각각 활성 및 불활성 염색체 영역과 상호작용하는 활성 및 불활성 β-글로빈을 나타낸 것이다. a, 활성 β-글로빈이 다른 활성적으로 전사되는 유 전자와 우선적으로 상호작용함을 나타내는 태아 간 내 β-글로빈 광범위 상호작용(4C 연속 평균, 상단), 태아 간 내 마이크로어레이 발현 분석(로그 규모, 중앙) 및 유전자 Uros(β-글로빈으로부터 ∼30 Mb 떨어진)를 포함하는 4 Mb 영역을 따라 플롯된 유전자의 위치(하단) 간의 비교. b, 불활성 β-글로빈이 불활성 영역과 우선적으로 상호작용함을 나타내는 글로빈으로부터 ∼38 Mb 떨어져 위치한 OR 유전자 집단 주변의 태아 뇌 내 동일한 비교. c, 유전자 함량 및 활성의 측면에서 태아 간(좌측) 및 뇌(우측) 내 β-글로빈과 상호작용하는 영역 특성.
도 15는 태아 간 및 뇌 내 매우 유사하고, 활성적인 영역과 상호작용하는 편재하게 발현되는 Rad23A를 나타낸 것이다. a, 태아 간(상단, 적색) 및 뇌(하단, 청색) 내 활성 Rad23A와 상호작용하는 염색체 8 상의 영역의 개략도. b, 태아 간 내 Rad23A 광범위 상호작용(4C 연속 평균)과 마이크로어레이 발현 분석(로그 규모)(상단 2개 패널), 태아 뇌 내 Rad23A 광범위 상호작용(4C 연속 평균) 과 마이크로어레이 발현 분석(로그 규모)(패널 3 및 4) 및 염색체 8의 3 Mb 영역을 따라 플롯된 유전자의 위치(하단 패널) 간의 비교. c, 유전자 함량 및 활성의 측면에서 태아 간(좌측) 및 뇌(우측) 내 Rad23A와 상호작용하는 영역 특성.
도 16은 4C 기술이 상호작용 영역을 확실하게 확인시킴을 확증하는 냉동-FISH를 나타낸 것이다. a, 일부가 β-글로빈 좌위(녹색) 및/또는 Uros(적색)을 포함하는 10개 이상의 세포핵을 나타내는 (200 nm) 냉동-절편 일부의 예. 절편화 로 인해 많은 세포핵은 이들 2개의 좌위에 대한 신호를 포함하지 않는다. b-d, 모두 상호작용에 대해 양성으로 득점된 신호에 완전하게(b) 또는 부분적으로(c) 중복되고, 신호에 접촉되는(d) 예. e-g, 모두 상호작용에 대해 음성으로 득점된 비-접촉 대립유전자를 포함한 세포핵(e-f) 및 β-글로빈만을 포함한 세포핵(g)의 예. h-i, 냉동-FISH 결과의 개략도. β-글로빈(h) 및 Rad23A(i)와의 상호작용 백분율은 4C 기술에 의해 양성으로 확인된 영역(적색 화살촉) 및 음성으로 확인된 영역(청색 화살촉)에 대해 염색체 상단에 나타나 있다. 동일한 BAC가 2개 조직에 사용되었다. 태아 간 및 뇌 내 2개의 별개의 OR 유전자 집단 사이의 냉동-FISH에 의해 측정된 상호작용 빈도는 염색체 하단에 나타나 있다.
도 17은 매우 유사한 결과를 제공하는 HS2 및 β-메이저의 4C 분석을 나타낸 것이다. (a) 4개의 독립적인 E14.5 간 표본의 비처리 4C 데이터는 HS2(상단)와 β-메이저(하단)의 매우 유사한 상호작용 패턴을 나타낸다. (b) HS-2 실험시 상호작용에 대해 양성으로 득점된 프로브와 β-메이저 실험시 상호작용에 대해 양성으로 득점된 프로브 사이에 큰 중복이 존재한다.
도 18은 시스 및 트랜스 상호작용 사이의 비교를 나타낸 것이다. (a) 시스(염색체 7, 상단) 내에서 양성으로 확인된 영역 및 α-글로빈 좌위(염색체 11, 하단)을 포함한 트랜스 내 영역과의 β-글로빈 상호작용을 나타내는 2개의 독립적 실험으로부터의 비처리 4C 데이터. (b) 시스(염색체 8, 상단) 내 양성으로 확인 된 영역 및 최대 연속 평균치에 따라 정렬시 상단에 나타나는 트랜스 내 영역과의 Rad23A 상호작용을 나타내는 2개의 독립적 실험으로부터의 비처리 4C 데이터. 트랜스 내 영역은 시스 내 광범위-상호작용하는 영역의 확인을 가능하게 하는 스트린전트 조건과 부합되지 않는다.
도 19는 β-글로빈과 상호작용하는 영역이 서로 빈번하게 접촉함을 나타낸다. 활성적으로 전사되는 유전자를 포함하고 태아 간 내 β-글로빈과 상호작용하는 4C 기술에 의해 확인되는 2개의 영역(약 60 Mb 떨어짐)은 5.5%의 냉동-FISH에 의한 동시-위치화 빈도를 나타내었고, 이는 배경 동시-위치화 빈도보다 더욱 유의적인이었다.
(실시예 1)
재료 및 방법
4C 기술
3C 기술 절차의 초기 단계는 종전 기술된 바와 같이 수행되었고(Splinter et al. (2004). Methods Enzymol 375, 493-507 (2004)), HindⅢ-단편들 사이에 라이게 이션 생성물을 생성하였다. 이러한 HindⅢ-라이게이트-3C 주형(∼50 ㎍)은 50 U의 DpnⅡ(HS2, Rad23A) 또는 NlaⅢ(β-메이저)의 2차 빈번 절단 제한 효소로 100 ng/㎕에서 밤새 분해되었다. DNA 원 형성 내 속박을 방지하기 위해 목적 제한 단편(즉 '미끼')을 구별하는 HindⅢ 제한 사이트로부터 약 350∼400 bp 이내를 절단하지 않는 2차 제한 효소를 선택에 주의한다. 2차 제한 효소 분해 후 DNA는 페놀 추출되고 에탄올 침전된 후 저농도로(200 U 리가제(Roche)를 이용하여 14 ml 내 50 ㎍ 표본, 16℃에서 4시간) 라이게이트되어 DpnⅡ- 또는 DpnⅡ-원 형성을 촉진시켰다. 라이게이션 생성물은 담체(20 ㎍/ml)로서 글리코겐(Roche)을 이용하여 페놀 추출되고 에탄올 침전되었다. 목적 원은 하기 제한 효소를 이용하여 1차 및 2차 제한 효소 인식 사이트 사이에서 미끼를 절단하는 50 U의 3차 제한 효소로 밤새 분해함으로서 선형화되었다: SpeI(HS2), PstI(Rad23A) 및 PflmI(β-메이저). 이러한 선형화 단계는 PCR 증폭의 첫 번째 라운드 동안 후속 프라이머 혼성화를 촉진시키기 위해 수행되었다. 분해된 생성물은 QIAquick 뉴클레오타이드 제거(250) 컬럼(Qiagen)을 이용하여 정제되었다.
PCR 반응은 1.2 kb까지의 크기인 단편의 선형 증폭을 보증하도록 최적화된 조건을 이용하여(4C-PCR 단편의 80%는 600 bp 이하임) Expand Long Template PCR system(Roche)을 이용하여 수행되었다. PCR 조건은 하기와 같다: 94℃ 2분간, 94℃ 15초간 30 사이클, 55℃ 1분간 및 68℃ 3분간 후 68℃ 7분간의 최종 단계. 선형 범위의 증폭을 여전히 나타내는 최대 함량의 주형이 측정되었다. 이를 위해 주형의 연속적 희석이 PCR 반응에 첨가되었고 증폭된 DNA 재료는 아가로스 겔 상에서 이동되었고 PCR 생성물은 ImageQuant 소프트웨어를 이용하여 정량화되었다. 일반적으로 50 ㎕의 PCR 반응 당 100∼200 ng의 주형은 선형 범위의 증폭시 생성물을 제공하였다. 16 내지 32 PCR 반응이 수집되고 QIAquick 뉴클레오타이드 제거(250) 시스템(Qiagen)을 이요하여 이러한 4C 주형을 정제시켰다. 정제된 4C 주형은 표지되고 표준 ChIP-chip 프로토콜(Nimblegen Systems of Iceland, LLC)에 따라 어레이에 혼성화되었다. 4C 절차에 사용되는 1차 및 2차 제한 효소로 분해된 차별적으로 표지된 게놈 DNA는 혼성화 효율의 차이를 교정하는 대조군 주형으로 작용하였다. 각 실험에 있어서 2개의 독립적으로 처리된 표본이 대안적 염료 방향으로 표지되었다.
사용된 4C-프라이머 서열:
HS2: 5'-ACTTCCTACACATTAACGAGCC-3',
5'-GCTGTTATCCCTTTCTCTTCTAC-3'
Rad23A: 5'-TCACACGCGAAGTAGGCC-3',
5'- CCTTCCTCCACCATGATGA-3'
β-메이저: 5'-AACGCATTTGCTCAATCAACTACTG-3',
5'-GTTGCTCCTCACATTTGCTTCTGAC-3'
4C 어레이
어레이 및 분석은 NCBI build m34을 기반으로 하였다. 프로브(60-mer)는 100 bp 까지의 서열 및 HindⅢ 사이트 다운스트림에서 선택되었다. CG-함량은 균일한 혼성화 신호를 위해 50%로 최적화되었다. 교차-혼성화를 방지하기 위해 매우 풍부한 반복서열과의 어떠한 유사성을 지닌 프로브(RepBase 10.09)3는 프로브 세트에서 제거되었다. 더욱이 게놈 내 2 이상의 BLAST 히트(hit)를 제공하는 프로브도 프로브 세트에서 제거되었다. 서열 정렬은 표준 세팅을 이용한 MegaBLAST(Zhang et al. (2000) J Comput Biol 7, 203-14)을 이용하여 수행되었다. 히트는 30 nt 이상의 정렬로 한정되었다.
4C 데이터 분석
신호 비율 4C 표본/게놈 DNA은 각각의 프로브에 대해 계산되었고 데이터는 Nimblegen Systems에서 제공된 SignalMap 소프트웨어로 시각화되었다. 데이터는 R 팩키지(http://www.r-proiect.org), Spotfire 및 Excel을 이용하여 분석되었다. 비처리된 혼성화 비율은 염색체 주형에 따른 20∼50 양성 4C 신호의 군집을 나타내 었다. 이들 군집을 한정하기 위해 연속 평균이 적용되었다. 9∼39 프로브 범위의 다양한 윈도우 크기가 사용되었고, 이들 모두는 동일한 군비으로 확인되었다. 나타난 결과는 29개 프로브(평균 60 kb)의 윈도우 크기를 기반으로 하였고 무작위 데이터를 교차하여 수행된 연속 평균과 비교되었다. 이는 각각의 어레이에 개별적으로 수행되었다. 따라서 모든 측정은 특정 어레이의 크기 및 노이즈(noise)에 대해 고려되었다. (아님. 거짓 양성)/(아님. 거짓 양성 + 아님. 진실 양성)으로 정의되는 거짓 발견율(FDR)은 하기와 같이 측정되었다: (무작위 세트 내 양성수)/(데이터 내 양성수). 역치는 FDR<0.05인 최소 수치를 수립하도록 상단 하단 접근을 이용하여 측정되었다.
다음으로 생물학적 중복 실험이 비교되었다. 두 개의 중복 내 역치에 부합하는 윈도우는 양성으로 고려되었다. 무작위 데이터와 비교시 두 개의 중복 내 역치를 상위하는 윈도우는 존재하지 않았다. 염색체 주형 상에 직접 인접한 양성 윈도우들은 결합하여(갭은 허용되지 않음) 양성 영역을 생성하였다.
발현 분석
각 조직에 대해 3개의 독립적 마이크로어레이가 Affymetrix 프로토콜(마우스 430_2 어레이)에 따라 수행되었다. 데이터는 RMA catool을 이용하여 표준화되었고(www.bioconductor.org) 각각의 프로브-세트에 대해 3개의 마이크로어레이 측정 이 평균되었다. 더욱이 다수의 프로브-세트가 동일한 유전자를 나타내는 경우 이들도 평균되었다. Mas5calls(Affy library: www.bioconductor.org)는 "존재", "부재" 및 "최저" 콜(call)을 수립하는데 이용되었다. 3개 어레이 모두에서 "존재" 콜 및 50 이상의 발현 수치를 지닌 유전자는 발현됨이라고 명명된다. '태아 간-특이적 유전자'는 태아 간에서 발현되는 우리의 기준에 부합하고 태아 뇌와 비교시 5배 이상 더 높은 발현 수치를 지닌 유전자로 분류되었다. 각각의 유전자 주변의 전체 전사 활성의 수치를 제공하기 위해 연속 총계가 적용되었다. 이를 위해 본 발명은 로그-형질전환 발현 수치를 이용하였다. 각각의 유전자에 대해 본 발명은 유전자 자체를 포함하여 유전자 시작점의 100 kb 업스트림 및 말단의 100 kb 다운스트림 윈도우 내에서 발견되는 모든 유전자의 발현의 총계를 계산하였다. 양성 4C 영역 내에서 발견되는 활성 유전자에 대해 수득된 수치(각각 간 내 HS2, 뇌 내 Rad23A 및 간 내 Rad23A에 대해 n = 124, 123 및 208)는 양성 4C 영역 외부의 활성 유전자에 대해 수득된 수치(염색체 7의 최대 동원체 상호작용 영역과 종말체 사이에 존재하는 활성 비-상호작용 유전자수에 대응하는 각각 n= 153, 301 및 186)와 비교되었고; 2개의 그룹은 원 테일드(one tailed) Wilcoxon 등급 총계 시험을 이용하여 비교되었다.
FISH 프로브
하기 BAC 클론(BACPAC Resources Centre)이 사용되었다; Hbb-1의 경우 P23- 370E12, 80.1 Mb에서의 염색체 7의 경우 RP23-317H16(OR gene cluster), Uros의 경우 RP23-334E9, 118.3 Mb에서의 염색체 7의 경우 RP23-32C19, 130.1Mb에서의 염색체 7의 경우 RP23-143F10, 73.1 Mb에서의 염색체 7의 경우 RP23-470N5, 135.0 Mb에서의 염색체 7의 경우 RP23-247L11(OR gene cluster), Rad23A의 경우 RP23-136A15, 21.8 Mb에서의 염색체 8의 경우 RP23-307P24 및 122.4 Mb에서의 염색체 8의 경우 RP23-460F21. 염색체 7 동원체 특이적 프로브의 경우 본 발명은 DNA 분절 D7Mit21에 어닐(anneal)하는 Pl 클론 5279(Genome Systems Inc.)를 사용하였다. 무작위 프라임 표지된 프로브는 BioPrime Array CGH Genomic Labeling System(Invitrogen)을 이용하여 제조되었다. 프라이밍 전 DNA는 DpnⅡ로 분해되었고 DNA clean and concentrator-5 kit(Zymo research)로 정제되었다. 분해된 DNA(300 ng)은 SpectrumGreen dUTP(Vysis) 또는 Alexa fluor 594 dUTP(Molecular probes)로 표지되었고 GFX PCR DNA and Gel Band Purification kit(Amersham Biosciences)를 통해 정제되어 통합되지 않은 뉴클레오타이드가 제거되었다. 표지된 프로브의 특이성은 마우스 ES 세포에서 제조된 중기 스프레드 상에서 시험되었다.
냉동-FISH
냉동-FISH는 앞서 기술된 바와 같이 수행되었다. 간단하게는 E14.5 간 및 뇌가 4% 파라포름알데하이드/250 mM HEPES, pH 7.5 내에서 20분간 고정되고 작은 조직 블록으로 절단된 후 4℃에서 8% 파라포름알데하이드 내에서 2시간 동안 추가 고정 단계가 수행되었다. 고정된 조직 블록은 실온에서 20분간 2.3 M 슈크로스 내에 침지되었고 표본 홀더 상에 봉입되고 액체 질소 내에서 즉시-동결되었다. 조직 블록은 절편될 때까지 액체 질소 내에 보관되었다. 약 200 nm의 초박 냉동절편이 냉동-연결장치가 장착된 Reichert Ultramicrotome E(Leica)를 이용하여 절단되었다. 슈크로스로 충전된 루프를 이용하여 절편은 커버슬립으로 옮겨지고 -20℃에서 보관되었다. 혼성화를 위해 절편은 PBS로 세척되어 슈크로스가 제고되고, 37℃에서 1시간 동안 2xSSC 내 250 ng/ml RNase로 처리되고 0.1 M HCl 내에서 10분간 인큐베??되고 에탄올 시리즈로 탈수되고 80℃에서 70% 포름아마이드/2xSSC, pH 7.5 내에 8분간 변성되었다. 절편은 프로브 혼성화 직전에 다시 탈수되었다. 500 ng 표지된 프로브는 5 ㎍의 마우스 Cotl DNA(Invitrogen)로 동시-침전되고 하이브믹스(hybmix)(50% 포름아마이드, 10% 황산덱스트란, 2xSSC, 50 mM 인산염 완충액, pH 7.5) 내에 용해되었다. 프로브는 95℃에서 5분간 변성되고 37℃에서 30분간 리어닐(reanneal)되고 37℃에서 적어도 40시간 이상 동안 혼성화되었다. 혼성화후 세척 후 세포핵은 PBS/0.05% Tween-20 내 20 ng/ml DAPI(Sigma)로 대조염색되고 Prolong Gold 안티페이드 시약(Molecular Probes) 내에 봉입되었다.
이미지는 CCD 카메라 및 Isis FISH Imaging System 소프트웨어(Metasystems)가 장착된 Zeiss Axio Imager Zl 에피형광 현미경(xlOO 평면 수차교정, 1.4 오일 대물렌즈)으로 수집되었다. 절편에 제겅된 프로브 결합을 알지 못하는 사람에 의 해 최소의 250 β-글로빈 또는 Rad23A 대립유전자가 분석되었고 게놈 내 다른 곳에 위치하는 BAC와의 중복 또는 비-중폭으로서 득점었다. 4C 음성 영역 대비 4C-양성 영역에 대해 측정된 수치간의 차이점의 유의성을 평가하기 위해 적합-반복-양호시험(Replicated goodness-of-fit tests)(G-통계치)이 수행되었다. 결과의 개요는 표 2에 나타나 있다.
Figure 112008002318253-pct00001
본 발명자들은 배경(0.4∼3.9%)과 진성(5∼20.4%) 상호작용 사이의 통계적으로 유의적인 차이를 발견하였으나 냉동-FISH에 의해 측정된 빈도가 다른 FISH 프로토콜을 이용하여 다른 것에 의해 측정된 것보다 낮음이 명백하다. 절편법은 일부 상호작용 좌위를 분리시키고 따라서 냉동-FISH 측정은 진성 상호작용 빈도를 다소 과소평가할 것이다. 한편 현재 2D- 및 3D FISH 절차는 z-방향 내 제한된 분석능으로 인해 과대평가될 것이다. 향후 더욱 특이적인 FISH 프로브와 결합된 개선된 현미경 기술이 진성 상호작용 빈도를 더 우수하게 나타낼 것이다.
(실시예 2)
3C 절차(즉 포름알데하이드 고정, (1차) 제한 효소 분해, 교차-결합된 DNA의 재-라이게이션 및 DNA 정제)는 기술된 바와 같이 수행되고(Splinter et al, (2004) Methods Enzymol. 375: 493-507), 이들이 세포핵 공간에 본래 근접하기 때문에 라이게이트되는 제한 단편을 포함한 DNA 혼합물('3C 주형')을 생성한다.
제공된 제한 단편에 라이게이트되는 모든 단편을 증폭시키기 위해 역 PCR이 수행되었다("미끼"; 이는 프로모터, 인핸서, 절연체, 매트릭스 부착 영역, 복제 기원 또는 어떠한 다른 첫 번째(타겟) 뉴클레오타이드 서열을 포함하기 때문에 선택됨).
이를 위해 DNA 원은 2차 제한 효소(바람직하게는 테트라- 또는 펜타-뉴클레오타이드 서열을 인식하는 빈번 절단기)로 3C 주형을 분해한 후 분자내 상호작용이 선호되도록 희석 조간 하에서 라이게이션됨으로서 생성된다. 위상 속박으로 인한 원 형성시 편향을 최소화하기 위해(Rippe et al, (2001) Trends in Biochem. Sciences 26, 733-40) 2차 제한 효소는 바람직하게는 1차 제한 사이트로부터 >350∼400 bp의 미끼를 절단하도록 선택되어야 한다. 역 PCR 증폭 효율 및 재현성을 증가시키기 위해 원은 진단성 1차 및 2차 제한 사이트 사이에서 미끼를 절단하는 제한 효소(예를 들어 6 이상의 bp 절단기)에 의해 PCR 증폭 전에 최상으로 선형화된다.
2차 제한 효소로의 3C 주형의 분해, 희석된 조건 하에서의 라이게이션을 통한 원형화 및 미끼-포함 원의 선형화는 DNA 조작이 역 PCR 증폭용 DNA 주형('4C 주형')을 생성하는 표준 조건 하에서 수행된다.
따라서 10 ㎍의 3C 주형은 20 U의 2차 제한 효소로 100 ㎕ 내에서 분해된 후(밤새) 효소가 열-불활성화되고 DNA가 정제된다. 라이게이션은 50 U T4 리가제(16℃에서 4시간 동안, RT에서 30분간)로 10 ml 내에서 수행된 후 DNA가 정제된다. 최종적으로 목적 원의 선형화는 20 U의 제한 효소로 100 ㎕로 수행된 후(밤새) DNA가 정제된다.
역 PCR의 경우 각각 1차 및 직접 인접한 2차 제한 효소 인식 사이트에 가능한한 근접하고, 각각 연장이 미끼에 라이게이트되는 단편 내로 제한 사이트를 직접 교차하여 진행되도록 3' 말단 외부를 지닌도록 디자인된다. 이들 프라이머를 지닌 역 PCR는 PCR 반응 당 최대수의 라이게이션 이벤트를 포함시키기 위해 바람직하게는 100∼400 ng DNA의 4C 주형(50 ㎕ PCR 반응 혼합물 당) 상에서 수행된다. 본 발명은 제조사의 절차에 따라 완충액 1을 이용하여 Expand Long Template PCR System(Roche)을 적용시킨 역 PCR을 수행한다.
하기 PCR 사이클이 수행된다:
1. 2분 94℃
2. 15초 94℃
3. 1분 55℃
4. 3분 68℃
5. 단계 2∼4 29x(또는 25∼4Ox 사이의 어떤 것) 반복
6. 7분 68℃
7. 종료
개별적 PCR 반응간의 재현성을 분석하기 위해 겔 전기영동이 수행된다. 일반적으로 동일한 생성물 패턴이 수득되어야 한다.
무작위 프라이밍에 의한 표지화 및 어레이 혼성화에 충분한 재료를 수득하기 위해 다수의 PCR 반응(각각 PCR 30 사이클 후 수득됨)이 수집될 수 있다(반응 단 PCR 사이클 수를 증가시키는 대신). 무작위 프라임 표지화의 대안으로 표지된 뉴클레오타이드가 PCR의 최종 사이클(예를 들어 30 사이클(비표지) + 10 사이클(표지)) 내에 통합될 수 있다.
(실시예 3)
4C 기술을 이용한 전좌의 검출
4C 기술은 건강한 피험체 유래의 세포 및 서열 X에 근접한 구분점을 지닌 염색체 A와 B 사이의 단일의 상호간 전좌를 지닌 환자 유래의 세포 내에 존제하는 제공된 서열 X에 대한 상호작용 빈도를 측정하는데 이용된다(도 9에 나타난 바와 같이).
정상 세포에서 이러한 분석은 염색체 A 상의 0.2∼10 Mb 서열 X 내에 위치하는 (거의) 모든 프로브에 대한 증가된 혼성화 신호(즉 X와의 빈번한 상호작용)를 나타낸다(강한 교차-결합 신호를 나타내는 염색체 영역의 실질적 크기는 어레이에 혼성화된 표본의 복합도에 따로 주로 달라짐). 다른 염색체뿐만 아니라 동일한 염색체 상의 다른 곳에서 이러한 증가된 혼성화 신호를 지닌 프로브의 거대 영역(선형 DNA 주형 상의)은 관찰되지 않는다.
그러나 환자 세포에서 구분점위 다른 측면에 위치한 모든 염색체 A 프로브를 지닌 혼성화 신호는 ∼50%까지 감소되는 반면(염색체 A의 하나의 카피는 여전히 손상되지 않고 정상 신호를 생성할 것임) 특정(즉 정상 세포에 존재하지 않는) 농도의 증가된 혼성화 신호가 염색체 B 상의 구분점에 인접한 프로브에서 관찰된다. 실제로 염색체 B 상에서 강한 혼성화 신호를 나타내지 않는 프로브간의 급격한 변환은 염색체 B 상의 구분점 위치를?? 나타낸다.
(실시예 4)
4C 기술 결과의 분석
4C 기술은 그의 과민성 사이트 2(HS)를 포함한 제한 단편 상에 집중된 마우스 β-글로빈 좌위 조절 영역(LCR)의 게놈 환경을 특성화하는데 이용되었다. LCR은 높은 수치의 β-글롤빈 유전자 발현에 필요한 강한 적혈구-특이적 전사 조절 요소이다. β-글로빈 좌위는 후각 신경세포에서만 전사되는 거대한 2.9 Mb 집단의 후각 수용체 유전자 내에 존재하는 위치 97 Mb에서의 염색체 7 상에 존재한다. 상호작용은 2개의 조직에서 분석되었다: LCR이 활성적이고 β-글로빈 유전자가 높게 전사되는 E14.5 태아 간 및 LCR이 불활성이고 및 글로빈 유전자가 침묵하는 E14.5 태아 뇌. 두 조직에서 대부분의 상호작용은 염색체 7 상의 서열에서 발견되었고 극히 적은 LCR 상호작용이 6개의 관련되지 않은 염색체(8, 10, 11, 12, 13, 14)에서 검출되었다(도 13a). 상호작용 빈도가 물리적으로 결합된 DNA 서열 사이의 거리(염기쌍)에 반비례하다는 아이디어와 일치하여 염색체 7 상의 가장 강한 신호는 β-글로빈의 염색체 위치 주변에 집중된 5∼10 Mb 영역 내에서 발견되었다. 이러한 영역 내 상호작용을 정량적으로 해석하는 것은 불가능하였다. 본 발명자들은 이들 인접 서열이 너무 빈번하게 함께 존재하여 본 발명의 혼성화 표본 내 큰 과잉표현(overrepresentation))이 대응 프로브를 포화시킨 것으로 판단하였다. 이는 1:10 및 1:100으로 희석된 표본으로 혼성화 수행시 확인되었고 신호 강도가 이러한 영역 내부가 아닌 외부 및 가장자리의 프로브에서 감소됨을 발견하였다(데이터는 나타내지 않음).
4C 절차는 높게 재현 가능한 데이터를 생성하였다. 도 2b∼c는 β-글로빈 유전자로부터 광범위하게 25 Mb 및 80 Mb 떨어진 염색체 7 상의 2개의 1.5 Mb 영역에 대한 대조군 혼성화 신호 대비 4C-신호의 비처리 비율을 나타낸다. 이러한 분성능 수치에서 독립적으로 처리된 표본 유래의 결과는 거의 동일하였다. 태아 간 및 뇌 모두에서 양성 신호 집단은 종종 β-글로빈에서 10 메가염기 떨어진 염색체 위치의 염색체 7 상에서 확인되었다. 이들 집단은 일반적으로 염색체 주형 상에 나란히 놓인 증가된 신호 비율을 지닌 최소 20∼50 개 프로브로 구성된다. 어레이 상의 각각의 프로브는 독립적인 라이게이션 이벤트를 분석하였다. 더욱이 HS2 제한 단편의 2개 카피만이 세포 당 존재하고, 이들 각각은 하나의 다른 제한 단편에만 라이게이트될 수 있다. 따라서 20 이상의 이웃 제한 단편으로의 독립적 라이게이션 이벤트의 검출은 대응 좌위가 다수 세포 내 β-글로빈 LCR에 접촉함을 강하게 나타낸다.
이들 집단의 통계적 유의성을 측정하기 위해 개별적 실험의 데이터가 염색체 지도 상에 정렬되었고 약 60 kb의 윈도우 크기로 연속 평균 알고리즘을 이용하여 분석되었다. 무작위로 혼합된 데이터의 연속 평균 분포는 역치 조정하는데 이용되었고 5%의 거짓 발견 비율을 가능하게 하였다. 이러한 분석은 중복 실험에서 재현 가능하게 발견된 태아 간 내 66개 집단 및 태아 뇌 내 45개 집단을 확인시켰다(도 13d∼f). 실제로 높은 분석능의 FISH는 이러한 집단이 빈번하게 상호작용하는 좌위를 실질적으로 나타냄을 확인시켰다(하기 참조).
따라서 4C 기술은 염색체 위치에서 군집된 다수의 제한 단편으로의 독립적 라이게이션 이벤트의 검출에 의해 광범위한 상호작용 좌위를 확인시킨다.
완전하게 독립적인 4C 실험 시리즈가 HS2의 ∼50 kb 다운스트림에 위치한 β 메이저 유전자의 게놈 환경을 조사하는 다른 역 PCR 프라이머 세트로 수행되었다. 태아 간에서 β 메이저 유전자는 높게 전사되고 LCR에 의해 빈번하게 접촉된다. HS2와 거의 동일한 β 메이저와의 광범위한 상호작용 집단이 태아 간 및 태아 뇌에서 발견되었고, 이는 이들 좌위가 β-글로빈 좌위에 접촉함을 실증한다(도 17).
(실시예 5)
별개의 게놈 환경을 점유하는 활성 및 불활성 β-글로빈
2개 조직 사이의 비교는 태아 간 내에서 활성적으로 전사되는 β-글로빈 좌위가 뇌 내 그의 전사적으로 침묵인 대응물 보다는 완전하게 상이한 좌위 세트와 상호작용함을 나타내었다(τ=-0.03; Spearman's Rank 상관관계)(도 13f). 이는 결과가 프로브의 서열 조성에 의해 영향 받음을 배제시켰다. 태아 간의 경우 상호작용하는 DNA 분절은 염색체 7의 종말체를 향해 위치하는 대다수(40/66)로 β-글로빈 좌위 주변에 집중된 70 Mb 영역 내에 위치한다. 태아 뇌의 경우 태아 간과 비교시 상호작용하는 좌위는 염색체 7의 동원체를 향해 위치하는 대부분의 상호작용(43/45)으로 β-글로빈과 유사하거나 또는 그로부터 훨씬 더 멀리에서 발견되었다. 이들 데이터는 활성 및 불활성 β-글로빈 좌위가 염색체 7의 다른 부분에 접촉함을 입증하였다.
6개의 다른 염색체(8, 10, 11, 12, 13 및 14)가 마이크로어레이 상에 표시되었다. 이들 염색체 상의 강한 혼성화 신호는 거의 드물고 일반적으로 선형 DNA 주형 상에서 분리되는 것으로 나타났고 중복 실험시 부재한 것으로 나타났다. 또한 이들 염색체를 교차한 연속 평균 수치는 염색체 7에 대해 득점된 수치에 재현 가능하게 근접할 수 없다(도 19). 따라서 본 발명의 데이터는 그의 자신의 염색체 영역 내의 이러한 좌위의 바람직한 위치와 일치하여 β-글로빈 좌위가 동일한 염색체 상의 다른 곳의 좌위에 주로 접촉함을 나타내었다. 본 발명자들은 마우스 α- 및 β-글로빈이 세포핵 공간 내에서 빈번하게 만나지 않는다는 FISH에 의한 최근 증명(Brown, J. M. et al. (2006) J Cell Biol 172, 177-87)과 일치하여 α-글로빈 좌위도 어레이 상에 존재하고(염색체 11) β-글로빈과의 상호작용에 대해 양성으로 득점되지 않음을 주목한다.
관찰되는 염색체 7 상의 광범위 상호작용의 적절성을 더 잘 이해하기 위해 본 발명은 상호작용하는 좌위를 유전자의 염색체 위치와 비교하였다. 더욱이 2개의 조직 내 이들 위치에서 전사 활성을 측정하기 위해 Affymetrix 발현 어레이 분석이 수행되었다. 태아 간 및 뇌 내 상호작용 영역의 평균 크기가 비교 가능하였으나(각각 183 kb 및 159 kb) 현격한 차이는 그의 유전자 함량 및 활성에서 관찰되었다. 태아 간 내에서 80%의 β-글로빈 상호작용 좌위는 하나 이상의 활성적으로 전사되는 유전자를 포함한 반면 태아 뇌 내에서 대부분(87%)은 검출 가능한 유전자 활성을 나타내지 않았다(도 15). 따라서 β-글로빈 좌위는 2개의 조직에서 매우 상이한 게놈 환경 내에 함몰되어 있다. 좌위가 활성적이지 않은 뇌에서 이는 염색체 7의 동원체를 향해 위치하는 전사 침묵 좌위에 주로 접촉된다. 좌위가 매우 활성적인 태아 간에서 이는 염색체 7의 종말체 측면을 더욱 현저하게 향하여 위치하는 활성적으로 전사되는 영역과 우선적으로 상호작용한다. 중요하게는 4C 기술은 FISH에 의해 이루어진 종전 관찰(Osborne, C. S. et al. (2004) Nat Genet 36, 1065-71 (2004))과 일치하여 태아 간에서 활성적인 β-글로빈 좌위와 상호작용하는 유전자로서 Uro 및 Eraf 유전자(β-글로빈에서 ∼30 Mb 떨어진)를 확인시켰다. 또한 뇌에서 접촉은 β-글로빈에서 17 및 37 Mb 떨어진 각 측면에 위치한 염색체 7 상에 존재하는 2개의 다른 후각 수용체 유전자 집단에서 관찰되었다.
염색체 7 상의 전사되는 영역 모두가 태아 간 내 활성 β-글로빈 좌위와 상호작용하는 것은 아니다. 따라서 본 발명은 태아 간 내 다른 활성 영역에 의해서가 아닌 상호작용 좌위에 의해서 독점적으로 공유되는 공통요소를 검색하였다. β-글로빈 유전자, Uros 및 Eraf는 모두 동일한 전사 인자 세트에 의해 조절되는 적혈구-특이적 유전자이고, 이들 인자가 세포핵 공간 내에서 그들의 타겟 유전자 발현을 조정한다는 점은 흥미로운 의견이다. 본 발명은 태아 간에서 우선적으로(>5-배 이상) 발현되는 유전자를 확인하기 위해 E14.5 태아 간 유래의 Affymetrix 발현 어레이 데이터를 태아 뇌와 비교하였다. 이에 따라 염색체 7 상의 28%의 활성 유전자가 28%가 동시-위치 영역 내에서 발견되는 "태아 간-특이적"으로 분류되었다. 따라서 본 발명은 동시-위치 영역 내에서 풍부한 "태아 간-특이적" 유전자를 발견하지 못하였다. 더욱 중요하게는 66개 중 49개(74%) 상호작용 영역이 "태아 간-특이적"을 포함하지 않았고 따라서 본 발명의 데이터가 세포핵 공간 내 조직-특이적 유전자의 동등한 발현에 대한 증거를 나타내지 않는 것으로 결론 내려졌다. β-글로빈 유전자는 예외적인 높은 비율로 전사되고 높은 전사 활성의 다른 영역과 우선적으로 상호작용하는 좌위가 높게 발현되는 유전자인지 또는 높은 밀도의 활성 유전자를 지닌 영역인지 여부가 의문스러웠다. 유전자 활성 수치로서 Affymetrix 계산을 이용하여 본 발명은 활성적으로 전사되는 유전자 주변의 200 kb 영역 내에서 전체 전사 활성을 측정하기 위해 연속 총계 알고리즘을 수행하였다. 이러한 분석은 상호작용 유전자 주변의 전사 활성이 염색체 7 상의 비-상호작용 활성 유전자 주변보다 더 높지 않암을 나타내었다(p = 0.9867; Wilcoxon 등급 총계).
(실시예 6)
조직 간에 높게 보존되는 하우스키핑(housekeeping) 유전자의 게놈 환경
다음으로 두 조직 모두에서 유사하게 발현되는 유전자가 그의 게놈 환경도 변환시키는지 여부가 조사되었다. Rad23A는 염색체 8 상의 대부분의 하우스키핑 유전자의 유전자-밀집 집단 내에 존재하는 편재하여 발현되는 유전자이다. E14.5 태아 간 및 뇌 모두에서 이러한 유전자 및 그의 직접적인 인접 유전자 대다수는 활성적이다. 4C 분석이 수행되었고 Rad23A에서 70 Mb까지 떨어진 좌위와의 매우 광범위한 상호작용을 확인시켰다. 중요하게는 Rad23A와의 상호작용은 태아 간과 뇌 사이에 높게 연관되었다(τ=0.73; Spearman 등급 상관관계)(도 15a). 이들 좌위의 공유된 특징은 이들이 활성적으로 전사되는 유전자를 포함한다는 점이다. 따라서 두 조직 내에서 대략 70%가 적어도 하나 이상의 활성 유전자를 포함하였다(도 15b∼c). 염색체 상이 다른 곳의 활성 유전자와 비교시 상호작용 유전자 주변의 영역은 연속 총계 알고리즘에 의해 측정된 바와 같이(두 조직 모두에 대해 p < 0.001) 통계적으로 유의적인 높은 수치의 유전자 활성을 나타내었다. 따라서 β-글로빈 좌위와 달리 유전자-풍부 영역에 위치하는 Rad23A 유전자는 증가된 전사 활성의 다른 염색체 영역과 멀리에서 우선적으로 상호작용한다. Rad23A를 포함하는 염색체 영역이 주로 그의 염색체 영역의 가장자리(90%) 또는 외부(10%)에 존재함이 FISH에 의해 관찰되었다(D. Noordermeer, M. Branco, A. Pombo and W. de Laat, 간행되지 않음). 그러나 4C 분석만이 염색체 내 상호작용을 나타내었고 염색체 7, 10, 11, 12, 13 또는 14 상의 어떠한 영역도 상호작용에 대한 본 발명의 엄격한 기준에 재현 가능하게 부합되지 않는다. 따라서 Rad23A는 2개의 매우 다른 조직에서 유사한 염색체내 상호작용과 주로 관련된다. Rad23A가 관련되지 않은 염색체 상의 인접 좌위를 선호하는 경우 이들은 여기서 4C 기술에 대해 사용되는 조건 하에서 검출되기에 충분히 빈번하게 상호작용하지 않았다.
(실시예 7)
고해상 현미경에 의한 4C 기술의 검증
4C 기술에 의해 수득되는 결과를 확인하기 위해 냉동-FISH 실험이 수행되었다. 냉동-FISH는 초박 냉동-절편의 제조에 의해 z-축 내 개선된 분석능을 제공하면서 세포핵 미세구조를 더욱 우수하게 보호하는 현재 3D-FISH 프로토콜에 대해 장점을 지닌 최근 개발된 현미경 기술이다(Branco, M. R. & Pombo, A (2006). PLoS Biol 4, el38). 4C 데이터는 얼마나 빈번하게 β-글로빈 또는 Rad23A 대립유전자가(항상 n>250) E14.5 간 및 뇌로부터 제조된 200 nm 초박 절편 내 15개 이상의 선택된 염색체 영역과 동시-위치화하는지를 측정함으로서 검증되었다. 중요하게는 냉동-FISH에 의해 측정된 모든 상호작용 빈도는 4C 결과와 완벽하게 일치하였다(도 17). 예를 들어 4C 기술에 의해 β-글로빈과 상호작용하는 것으로 확인된 원거리 영역은 4C에 의해 검출되지 않은 중간 영역보다 더 빈번하게 동시-위치하였다(각각 7.4% 및 9.7% 대 3.6% 및 3.5%). 또한 4C 기술에 의해 태아 간이 아닌 태아 뇌에서 β-글로빈과 상호작용하는 것으로 확인된 2개의 원거리 후각 수용제 유전자 집단은 각각 뇌 내 12.9% 및 7% 대 간 절편 내 3.6% 및 1.9%의 동시-위치화 빈도를 득점하였다. 요약적으로 4C 기술에 의해 양성적으로 확인된 좌위에 대해 측정된 동시-위차화 빈도는 모두 배경 좌위에 대해 측정된 빈도보다 유의적으로 높았다(p<0.05; G-테스트). 본 발명은 4C 기술이 상호작용 DNA 좌위를 정확하게 확인시키는 것으로 결론 내렸다. 최종적으로 본 발명은 β-글로빈과 상호작용하는 것으로 확인된 좌위가 서로 빈번하게 접촉하는 함을 입증하기 위해 냉동-FISH를 이용하였다. 이는 뇌 내 염색체 상의 멀리 떨어진 2개의 상호작용 OR 유전자 집단(도 17)뿐만 아니라 태아 간 내 큰 염색체 거리로 분리된 2개의 활성 영역(도 19)에 대해서도 사실이었다. 또한 이들 2개의 원거리 OR 유전자 집단 사이의 빈번한 접촉은 태아 간에서도 발견된 반면 이들은 활성적으로 전사되는 β-글로빈 좌위를 포함한 OR 유전자 집단과 상호작용하지 않았다. 이들 데이터는 별개의 OR 유전자 집단 간의 세포핵 상호작용이 분석되는 태아 뇌 조직의 특성이 아님을 나타내었다. 이러한 공간적 접촉이 단일 대립유전자만이 후각 신경세포 당 전사됨을 보증하는데 필요한 많은 OR 유전자들 사이의 교통을 촉진시킴을 서술한다(Shykind, B. (2005) Hum MoI Genet 14 Spec No 1, R33-9).
(실시예 8)
활성 및 불활성 염색질 도메인의 세포핵 조직화
여기서 기술된 관찰은 활성일 뿐만 아니라 불활성인 게놈 영역이 많은 광범위한 접촉을 포함한 세포핵 공간 내 별개의 영역을 형성함을 입증하고, 이는 각각 DNA 분절이 그 자신의 바람직한 상호작용 세트를 지님을 나타낸다. 본 발명의 데이터는 β-글로빈 좌위 스위치가 켜지면 전사 침묵 게놈 환경을 이탈하여 활성 도메인의 상호작용이 선호되는 세포핵 영역으로 진입함을 나타낸다. 전사 활성화시 이러한 현격한 재위치화는 특정 발현 수치에 도달하고, 더욱 중요하게는 β-글로빈의 경우 선형 염색체 주형 상의 다른 활성 유전자에서 분리되어 존재하는 조직-특이적 유전자만의 특징이 됨이 예측된다. 불활성 게놈 좌위 사이 및 활성 게놈 좌위 사이 모두에서 확인되는 광범위한 상호작용의 넓은 네트워크가 간기 동안 역동적 이동의 결과보다 더 많이 염색체 입체형태 내 세포-대-세포 차이를 반영함이 제안된다(Chakalova et al. (2005) Nat Rev Genet 6, 669-77 (2005). 아마도 세포 분열 후 다른 정도의 탈-응축은 불활성 염색질에서 멀리 떨어진 활성 게놈 영역을 조종하고 유사한 염색질 조성물의 원거리 좌위간의 접촉은 주로 염색질-결합 단백질간의 친화성을 통해 안정화된다. 원거리 좌위간의 공간적 근접부위는 기능성이나 간단하게는 염색체의 언폴딩(unfolding) 패턴의 결과이다. 개별적 좌위가 제한된 세포핵 부피 내에서 이동될 수 있는 반면 염색체의 일반적인 입체구조는 세포 주기 동안 대부분 유지되고 재조정을 위해 세포 분열을 필요로 한다. 이러한 의견은 세포핵 내부의 태그된 DNA 좌위의 제한된 이동을 나타내는 생체 세포 이미지 연구와 일치하고(Chubb et al. (2002) Curr Biol 12, 439-45 (2002)) 세포핵 염색질 위치 정보가 세포군에서 보존되지 않고 세포 분열 동안 빈번하게 전달됨을 나타내는 연구와 일치한다(Essers, J. et al. MoI Biol Cell 16, 769-75 (2005); Gerlich, D. et al. Cell 112, 751-64 (2003)).
또다른 관점 1
본 발명의 또다른 관점은 하기 번호의 항에 나타나 있다.
1. 제공된 종(예를 들어 인간)의 게놈 내 모든 1차 제한 효소 인식 사이트의 모든 측면에 상보적인 프로브 세트
2. 제공된 종(예를 들어 인간)의 게놈 내 모든 1차 제한 효소 인식 사이트의 하나의 측면에만 상보적인 프로브 세트
3. 제공된 종(예를 들어 인간)의 게놈의 선형 주형을 따라 정렬시 모든 다른 1차 제한 효소 인식 사이트의 하나의 측면에 상보적인 프로브 세트
4. 제공된 종(예를 들어 인간)의 게놈의 선형 주형을 따라 정렬시 모든 세 번째, 네 번째, 다섯 번째, 여섯 번째, 일곱 번째, 여덟 번째, 아홉 번째, 열 번째, 스무 번째, 서른 번째, 마흔 번째, 쉰 번째, 예순 번째, 일흔 번째, 여든 번째, 아흔 번째 또는 백 번째 1차 제한 효소 인식 사이트의 하나의 측면에 상보적인 프로브 세트
5. 전좌, 결실, 전도, 중복 및 다른 게놈 재배열과 관련된 것으로 알려진 모든 좌위 주변의 제공된 크기(예를 들어 약 50 kb, 100 kb, 200 kb, 300 kb, 400 kb, 500 kb, 1 Mb, 2 Mb, 3 Mb, 4 Mb, 5 Mb, 6 Mb, 7 Mb, 8 Mb, 9 Mb 또는 10 Mb)(예를 들어 50 kb∼10 Mb)의 게놈 영역을 나타내는 프로브 세트
6. 전좌, 결실, 전도, 중복 및 다른 게놈 재배열과 관련된 것으로 알려진 선택된 좌위 주변의 제공된 크기(예를 들어 약 50 kb, 100 kb, 200 kb, 300 kb, 400 kb, 500 kb, 1 Mb, 2 Mb, 3 Mb, 4 Mb, 5 Mb, 6 Mb, 7 Mb, 8 Mb, 9 Mb 또는 10 Mb)(예를 들어 50 kb∼10 Mb)의 게놈 영역을 나타내는 프로브 세트
7. 바람직하게는 4C 서열(미끼)은 실질적인 재배열 서열(예를 들어 전좌의 경우 구분점)로부터 약 50 kb, 100 kb, 200 kb, 300 kb, 400 kb, 500 kb, 1 Mb, 2 Mb, 3 Mb, 4 Mb, 5 Mb, 6 Mb, 7 Mb, 8 Mb, 9 Mb, 10 Mb, 11 Mb, 12 Mb, 13 Mb, 14 Mb 또는 15 Mb 이상 이내에 존재한다.
8. 각각 1차 제한 효소로의 분해 후 수득되거나 수득 가능한 단일 제한 단편을 나타내는 제공된 종의 완전한 게놈을 나타내는 프로브 세트
9. 선형 염색체 주형을 따라 동일하게 분포되는 프로브를 지닌 제공된 종의 완전한 게놈을 나타내는 프로브 세트
10. 1∼10항 중 어느 한 항에 따른 프로브 세트를 포함한 어레이
11. 뉴클레오타이드 서열 또는 프로브 어레이 또는 프로브 세트 또는 여기서 기술된 어레이의 이용을 포함한 하나 이상의 뉴클레오타이드 서열(예를 들어 하나 이상의 게놈 좌위)과의 타겟 뉴클레오타이드 서열의 상호작용 빈도의 분석 방법
12. 뉴클레오타이드 서열 또는 프로브 어레이 또는 프로브 세트 또는 여기서 기술된 어레이의 이용을 포함한 특정 질병 상태를 나타내는 하나 이상의 DNA-DNA 상호작용의 확인 방법
13. 뉴클레오타이드 서열 또는 프로브 어레이 또는 프로브 세트 또는 여기서 기술된 어레이의 이용을 포함한 DNA-DNA 내 변화에 의해 유발되거나 이에 관련되는 질병 또는 증후군의 진단 또는 예측 방법
14. 뉴클레오타이드 서열 또는 프로브 어레이 또는 프로브 세트 또는 여기서 기술된 어레이의 이용을 포함한 DNA-DNA 상호작용을 조절하는 하나 이상의 작용제의 확인 방법
15. 뉴클레오타이드 서열 또는 프로브 어레이 또는 프로브 세트 또는 여기서 기술된 어레이의 이용을 포함한 구분점(예를 들어 전좌) 위치의 검출 방법
16. 뉴클레오타이드 서열 또는 프로브 어레이 또는 프로브 세트 또는 여기서 기술된 어레이의 이용을 포함한 전도 위치의 검출 방법
17. 뉴클레오타이드 서열 또는 프로브 어레이 또는 프로브 세트 또는 여기서 기술된 어레이의 이용을 포함한 결실 위치의 검출 방법
18. 뉴클레오타이드 서열 또는 프로브 어레이 또는 프로브 세트 또는 여기서 기술된 어레이의 이용을 포함한 중복 위치의 검출 방법
19. 선택된 DNA 분절에 공간적으로 근접한 (모든) DNA 분절을 확인하기 위한 4C 기술에서의 마이크로어레이의 이용
20. 분석에 포함되는(완전한 게놈이거나 게놈의 일부일 수 있음) 게놈 영역에 존재하는 1차 제한 효소 인식 사이트에 직접 인접한 DNA 서열에 상동적인 프로브를 포함한 마이크로어레이: 각각의 프로브는 특정 1차 제한 효소 인식 사이트로부터 바람직하게는 100 bp 이내 도는 최대 300 bp 이내에 위치하거나 대안으로 각각의 1차 제한 효소 인식 사이트와 그의 가장 근접한 2차 제한 효소 인식 사이트 사이에 디자인됨.
21. 제공된 종의 완전한 게놈을 나타냄을 특징으로 하는 선택된 좌위의 서열에 상보적인 프로브를 포함한 여기서 기술된 프로브
22. 21항에 있어서, 상기 좌위는 하나 이상의 질병과 관련됨을 특징으로 하는 어레이
23. 21항 또는 22항에 있어서, 상기 선택된 좌위의 서열은 상기 좌위에서 200 Mb까지 떨어진 서열을 포함함을 특징으로 하는 어레이
24. (a) 교차-결합된 DNA 표본을 제공하는 단계;
(b) 상기 교차-결합된 DNA를 1차 제한 효소로 분해하는 단계;
(c) 상기 교차-결합된 뉴클레오타이드 서열을 라이게이트하는 단계;
(d) 교차 결합을 역전시키는 단계;
(e) 상기 뉴클레오타이드 서열을 2차 제한 효소로 분해하는 단계;
(f) 상기 뉴클레오타이드 서열을 라이게이트하는 단계;
(g) 각각의 프라이머가 목적 뉴클레오타이드 서열의 측면에 위치하는 알려진 DNA 서열에 혼성화하는 적어도 2 이상의 올리고뉴클레오타이드 프라이머를 이용하여 타겟 뉴클레오타이드 서열에 라이게이트되는 하나 이상의 목적 뉴클레오타이드 서열을 증폭시키는 단계;
(h) 상기 증폭된 서열(들)을 어레이에 혼성화시키는 단계; 및
(i) DNA 서열간의 상호작용 빈도를 측정하는 단계를 포함한
하나 이상의 목적 뉴클레오타이드 서열(예를 들어 하나 이상의 게놈 좌위)과의 타겟 뉴클레오타이드 서열의 상호작용 빈도의 분석 방법
또다른 관점 2
본 발명의 또다른 관점으 하기 번호의 항에 나타나 있다.
1. 1차 및 2차 제한 효소 인식 사이트에 의해 분리되는 첫 번째 및 두 번째 뉴클레오타이드 서열을 포함하고, 상기 첫 번째 뉴클레오타이드 서열은 타겟 뉴클레오타이드 서열이고 상기 뉴클레오타이드 서열은 게놈 DNA를 교차-결합시킴으로서 수득 가능함을 특징으로 하는 원형화 뉴클레오타이드 서열
2. 1항에 있어서, 상기 타겟 뉴클레오타이드 서열은 프로모터, 인핸서, 침묵제, 절연체, 매트릭스 부착 영역, 좌위 조절 영역, 전사 단위, 복제 기원, 재조합 핫스팟, 전좌 구분점, 동원체, 종말체, 유전자-밀집 영역, 유전자-부족 영역, 반복 요소 및 (바이러스성) 도입 사이트로 구성된 군에서 선택됨을 특징으로 하는 원형화 뉴클레오타이드 서열
3. 1항에 있어서, 상기 타겟 뉴클레오타이드 서열은 질병과 관련되거나 이를 유발하거나 선형 DNA 주형 상에 질병과 관련되거나 이를 유발하는 좌위로부터 15 Mb 이하로 위치함을 특징으로 하는 원형화 뉴클레오타이드 서열
4. 1∼3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 타겟 뉴클레오타이드 서열은 AMLl, MLL, MYC, BCL, BCR, ABLl, IGH, LYLl, TALI, TAL2, LM02, TCRa/δ, TCRβ 및 또는 Catalogue of Unbalanced Chromosome Aberrations in Man" 2nd edition. Albert Schinzel. Berlin: Walter de Gruyter, 2001. ISBN 3-11-011607-3에서 기술된 질병과 관련된 다른 좌위로 구성된 군에서 선택됨을 특징으로 하는 원형화 뉴클레오타이드 서열
5. 1∼4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 1차 제한 효소 인식 사이트는 6∼8 bp 제한 사이트이고, 바람직하게는 BglⅡ, HindⅢ, EcoRI, BamHI, SpeI, PstI 및 NdeI로 구성된 군에서 선택됨을 특징으로 하는 원형화 뉴클레오타이드 서열
6. 상기 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 2차 제한 효소 인식 사이트는 4 또는 5 bp 뉴클레오타이드 서열 인식 사이트임을 특징으로 하는 원형화 뉴클레오타이드 서열
7. 상기 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 2차 제한 효소 인식 사이트는 1차 제한 사이트에서 약 350 bp 이상에 위치함을 특징으로 하는 원형화 뉴클레오타이드 서열
8. 상기 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 뉴클레오타이드 서열을 표지됨을 특징으로 하는 원형화 뉴클레오타이드 서열
9. 1차 및 2차 제한 효소 인식 사이트에 의해 분리되는 첫 번째 및 두 번째 뉴클레오타이드 서열을 포함하고, 상기 첫 번째 뉴클레오타이드 서열은 타겟 서열이고 상기 두 번째 뉴클레오타이드 서열은 게놈 DNA를 교차-결합시킴으로서 수득 가능하고 상기 두 번째 뉴클레오타이드 서열은 타겟 뉴클레오타이드 서열과 상호작용함을 특징으로 하는 뉴클레오타이드 서열
10. (a) 교차-결합된 DNA 표본을 제공하는 단계;
(b) 상기 교차-결합된 DNA를 1차 제한 효소로 분해하는 단계;
(c) 상기 교차-결합된 뉴클레오타이드 서열을 라이게이트하는 단계;
(d) 교차 결합을 역전시키는 단계;
(e) 상기 뉴클레오타이드 서열을 2차 제한 효소로 분해하는 단계; 및
(f) 상기 뉴클레오타이드 서열을 원형화하는 단계를 포함한
원형화 뉴클레오타이드 서열의 제조 방법
11. (a) 교차-결합된 DNA 표본을 제공하는 단계;
(b) 상기 교차-결합된 DNA를 1차 제한 효소로 분해하는 단계;
(c) 상기 교차-결합된 뉴클레오타이드 서열을 라이게이트하는 단계;
(d) 교차 결합을 역전시키는 단계;
(e) 상기 뉴클레오타이드 서열을 2차 제한 효소로 분해하는 단계;
(f) 상기 뉴클레오타이드 서열을 원형화하는 단계; 및
(g) 타겟 뉴클레오타이드 서열에 라이게이트하는 하나 이상의 뉴클레오타이드 서열을 증복시키는 단계를 포함한
뉴클레오타이드 서열의 제조 방법
12. 11항에 있어서, 상기 원형화 타겟 뉴클레오타이드 서열은 증폭전에 선형화됨을 특징으로 하는 방법
13. 12항에 있어서, 상기 원형화 타겟 뉴클레오타이드 서열은 6 bp 이상의 인식 사이트를 인식하는 제한 효소를 이용하여 선형화됨을 특징으로 하는 방법
14. 10∼13항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 교차-결합된 뉴클레오타이드 서열은 PCR을 이용하여 증폭됨을 특징으로 하는 방법
15. 14항에 있어서, 상기 교차-결합된 뉴클레오타이드 서열은 역 PCR을 이용하여 증폭됨을 특징으로 하는 방법
16. 14항 또는 15항에 있어서, Expand Long Template PCR System (Roche)이 이용됨을 특징으로 하는 방법
17. 1∼9항 중 어느 한 항에 따른 뉴클레오타이드 서열의 이용을 포함한 하나 이상의 뉴클레오타이드 서열(예를 들어 게놈 좌위)과의 타겟 뉴클레오타이드 서열의 상호작용 빈도의 분석 방법
18. 1∼9항 중 어느 한 항에 따른 뉴클레오타이드 서열에 혼성화되거나 혼성화하는 것이 가능한 하나 이상의 프로브를 포함한 지지체 상에 고정된 프로브 어레이
19. 게놈 DNA 내 1차 제한 효소의 1차 제한 효소 인식 사이트 중 각각 하나에 인접한 뉴클레오타이드 서열에 상보적인 프로브 세트
20. 19항에 있어서, 상기 프로브는 게놈 DNA 내 1차 제한 효소의 1차 제한 효소 인식 사이트 중 각각 하나로부터 300 염기쌍 이하인 핵산 서열에 상보적임을 특징으로 하는 프로브 세트
21. 19∼21항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 프로브는 게놈 DNA 내 1차 제한 효소의 1차 제한 효소 인식 사이트 중 각각 하나로부터 300 염기쌍 이하인 서열에 상보적임을 특징으로 하는 프로브 세트
23. 19∼22항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 프로브는 게놈 DNA 내 1차 제한 효소의 1차 제한 효소 인식 사이트 중 각각 하나로부터 200∼300 염기쌍 이하인 서열에 상보적임을 특징으로 하는 프로브 세트
24. 19∼23항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 프로브는 게놈 DNA 내 1차 제한 효소의 1차 제한 효소 인식 사이트 중 각각 하나로부터 100∼200 염기쌍 이하인 서열에 상보적임을 특징으로 하는 프로브 세트
25. 19∼24항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 2 이상의 프로브는 게놈 DNA 내 1차 제한 효소의 각각의 1차 제한 효소 인식 사이트에 인접한 서열에 혼성화하는 것이 가능하도록 디자인됨을 특징으로 하는 프로브 세트
26. 25항에 있어서, 상기 프로브는 중복되거나 부분적으로 중복됨을 특징으로 하는 프로브 세트
27. 26항에 있어서, 상기 중복은 10개 뉴클레오타이드 이하임을 특징으로 하는 프로브 세트
28. 19∼27항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 프로브 서열은 1차 제한 효소의 1차 제한 효소 인식 사이트 중 각각 하나와 2차 제한 효소의 첫 번째 인접한 2차 제한 효소 인식 사이트 사이의 서열 전부 또는 일부에 대응됨을 특징으로 하는 프로브 세트
29. 19∼28항 중 어느 한 항에 있어서, 각각의 프로브는 적어도 25 mer 이상임을 특징으로 하는 프로브 세트
30. 19∼29항 중 어느 한 항에 있어서, 각각의 프로브는 25∼60 mer임을 특징으로 하는 프로브 세트
31. (a) 게놈 DNA 내 1차 제한 효소에 대한 1차 제한 효소 인식 사이트 중 각각 하나를 확인하는 단계;
(b) 게놈 DNA 내 1차 제한 효소 인식 사이트 중 각각 하나에 인접한 서열에 혼성화하는 것이 가능한 프로브를 디자인하는 단계;
(c) 상기 프로브를 합성하는 단계; 및
(d) 프로브를 함께 결합시켜 프로브 세트 또는 실질적인 프로브 세트를 형성하는 단계를 포함한
프로브 세트의 제조 방법
32. 31항에 있어서, 상기 프로브는 PCR 증폭 생성물임을 특징으로 하는 방법
33. 31항 또는 32항에 다른 방법에 의해 수득되거나 수득 가능한 프로브 세트 또는 실질적인 프로브 세트
34. 19항에 따른 프로브 어레이 또는 19∼30항 또는 33항 중 어느 한 항에 따른 프로브 세트를 포함한 어레이
35. 19∼30 또는 33항 중 어느 한 항에 따른 프로브 세트를 포함한 어레이
36. 34항 또는 35항에 있어서, 상기 어레이는 약 300,000∼400,000개 프로브를 포함함을 특징으로 하는 어레이
37. 34∼36항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 어레이는 약 385,000개 이상 프로브, 바람직하게는 약 750,000개 프로브, 더욱 바람직하게는 6 × 750,000개 프로브를 포함함을 특징으로 하는 어레이
38. 34∼37항 중 어느 한 항에 있어서, 프로브수가 단일 어레이 내에 포함될 수 있는 프로브수를 초과하는 경우 어레이는 낮은 분석능으로 제공된 종의 완전한 게놈의 표시를 포함하거나 이를 구성함을 특징으로 하는 어레이
39. 38항에 있어서, 선형 염색체 주형 상에 정렬시 모든 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개 프로브 중 하나가 어레이에 포함됨을 특징으로 하는 어레이
40. 18항에 따른 실질적인 프로브 어레이 또는 19∼30항 또는 33항 중 어느 한 항에 따른 실질적인 프로브 세트를 고형 지지체 상에 고정하는 단계를 포함한 어레이 제조 방법
41. 18항에 따른 프로브 어레이 또는 19∼30항 또는 33항 중 어느 한 항에 따른 프로브 세트를 고형 지지체 상에 고정하는 단계를 포함한 어레이 제조 방법
42. 40항 또는 41항에 따른 방법에 의해 수득되거나 수득 가능한 어레이
43. (a) 교차-결합된 DNA 표본을 제공하는 단계;
(b) 상기 교차-결합된 DNA를 1차 제한 효소로 분해하는 단계;
(c) 상기 교차-결합된 뉴클레오타이드 서열을 라이게이트하는 단계;
(d) 교차 결합을 역전시키는 단계;
(e) 상기 뉴클레오타이드 서열을 2차 제한 효소로 분해하는 단계;
(f) 상기 뉴클레오타이드 서열을 원형화하는 단계;
(g) 타겟 뉴클레오타이드 서열에 라이게이트하는 하나 이상의 뉴클레오타이드 서열을 증폭시키는 단계;
(h) 선택적으로는 상기 증폭된 서열을 어레이에 혼성화시키는 단계; 및
(i) DNA 서열간의 상호작용 빈도를 측정하는 단계를 포함한
하나 이상의 뉴클레오타이드 서열(예를 들어 하나 이상의 게놈 좌위)과의 타겟 뉴클레오타이드 서열의 상호작용 빈도의 분석 방법
44. (a) 질환 및 비질환 세포로부터 교차-결합된 DNA 표본을 제공하는 단계;
(b) 각 표본 내 상기 교차-결합된 DNA를 1차 제한 효소로 분해하는 단계;
(c) 상기 교차-결합된 뉴클레오타이드 서열을 라이게이트하는 단계;
(d) 교차 결합을 역전시키는 단계;
(e) 상기 뉴클레오타이드 서열을 2차 제한 효소로 분해하는 단계;
(f) 상기 뉴클레오타이드 서열을 원형화하는 단계;
(g) 타겟 뉴클레오타이드 서열에 라이게이트하는 하나 이상의 뉴클레오타이드 서열을 증폭시키는 단계;
(h) 선택적으로는 상기 증폭된 서열을 어레이에 혼성화시키는 단계; 및
(i) DNA 서열간의 상호작용 빈도를 측정하는 단계를 포함하고,
질환 및 비질환 세포 유래의 DNA 서열간의 상호작용 빈도 사이의 차이는 DNA-DNA 상호작용이 특정 질병 상태의 표시함을 나타냄을 특징으로 하는
특정 질병 상태를 표시하는 하나 이상의 DNA-DNA 상호작용의 확인 방법
45. (a) 피험체로부터 교차-결합된 DNA 표본을 제공하는 단계;
(b) 상기 교차-결합된 DNA를 1차 제한 효소로 분해하는 단계;
(c) 상기 교차-결합된 뉴클레오타이드 서열을 라이게이트하는 단계;
(d) 교차 결합을 역전시키는 단계;
(e) 상기 뉴클레오타이드 서열을 2차 제한 효소로 분해하는 단계;
(f) 상기 뉴클레오타이드 서열을 원형화하는 단계;
(g) 타겟 뉴클레오타이드 서열에 라이게이트하는 하나 이상의 뉴클레오타이드 서열을 증폭시키는 단계;
(h) 선택적으로는 상기 증폭된 서열을 어레이에 혼성화시키는 단계;
(i) DNA 서열간의 상호작용 빈도를 측정하는 단계; 및
(j) DNA 서열간의 상호작용 빈도를 영향받지 않은 대조군과 비교하는 단계를 포함한
DNA-DNA 상호작용 내 변화에 의해 유발되거나 그와 관련된 질병 또는 증후군의 진단 또는 예측 방법
46. 45항에 있어서, 낮은 상호작용 빈도에서 높은 상호작용 빈도로의 변환은 구분점 위치를 표시함을 특징으로 하는 방법
47. 45항에 있어서, 대조군과 비교시 피험체 표본에 대한 DNA-DNA 상호작용 빈도의 역전된 패턴은 전도를 표시함을 특징으로 하는 방법
48. 45항에 있어서, 대조군과 비교시피험체 표본에 대한 DNA-DNA 상호작용 빈도 내 축소는 더욱 원거리의 영역에 대한 DNA-DNA 상호작용 빈도 증가와 결합하여 결실을 표시함을 특징으로 하는 방법
49. 45항에 있어서, 대조군과 비교시 피험체 표본에 대한 DNA-DNA 상호작용 빈도의 증가 또는 감소는 중복 또는 삽임을 표시함을 특징으로 하는 방법
50. 45∼49항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법을 수행하기 전에 스펙트럼 핵형분석 및/또는 FISH가 이용됨을 특징으로 하는 방법
51. 45∼49항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 질병은 유전병임을 특징으로 하는 방법
52. 45∼49항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 질병은 암임을 특징으로 하는 방법
53. (a) 피험체로부터 교차-결합된 DNA 표본을 제공하는 단계;
(b) 상기 교차-결합된 DNA를 1차 제한 효소로 분해하는 단계;
(c) 상기 교차-결합된 뉴클레오타이드 서열을 라이게이트하는 단계;
(d) 교차 결합을 역전시키는 단계;
(e) 상기 뉴클레오타이드 서열을 2차 제한 효소로 분해하는 단계;
(f) 상기 뉴클레오타이드 서열을 원형화하는 단계;
(g) 타겟 뉴클레오타이드 서열(들)에 라이게이트하는 2 이상의 서열을 증폭시키는 단계;
(h) 상기 2 이상의 증폭된 서열을 표지하는 단계;
(i) 상기 뉴클레오타이드 서열을 어레이에 혼성화시키는 단계; 및
(j) 질병과 관련된 게놈 재배열을 수행한 하나 이상의 좌위를 확인하는 단계를 포함한
DNA-DNA 상호작용 내 변화에 의해 유발되거나 그와 관련된 질병 또는 증후군의 진단 또는 예측 방법
54. 53항에 있어서, 상기 2 이상의 증폭된 서열은 차별적으로 표지됨을 특징으로 하는 방법
55. 54항에 있어서, 상기 2 이상의 증폭된 서열은 서열이 다른 염색체 상에 존재하는 경우 동일하게 표지됨을 특징으로 하는 방법
56. 53항에 있어서, 상기 2 이상의 증폭된 서열은 DNA-DNA 상호작용 신호간에 최소로 중복되기에 충분히 먼 원거리에서 동일한 염색체 상에 존재하는 경우 동일하게 표지됨을 특징으로 하는 방법
57. (a) 표본을 하나 이상의 작용제와 접촉시키는 단계;
(b) 피험체로부터 교차-결합된 DNA를 제공하는 단계;
(c) 교차-결합된 DNA를 1차 제한 효소로 분해하는 단계;
(d) 상기 교차-결합된 DNA를 라이게이트하는 단계;
(e) 교차 결합을 역전시키는 단계;
(f) 상기 뉴클레오타이드 서열을 2차 제한 효소로 분해하는 단계;
(g) 상기 뉴클레오타이드 서열을 원형화하는 단계;
(h) 타겟 뉴클레오타이드 서열에 라이게이트하는 하나 이상의 뉴클레오타이드 서열을 증폭시키는 단계;
(i) 선택적으로는 상기 증폭된 서열을 어레이에 혼성화시키는 단계; 및
(j) DNA 서열간의 상호작용 빈도를 측정하는 단계를 포함하고,
(ⅰ) 작용제 존재시 DNA 서열간의 상호작용 빈도와 (ⅱ) 작용제 부재시 DNA 서열간의 상호작용 빈도 사이의 차이는 DNA-DNA 상호작용을 조절하는 작용제를 표시함을 특징으로 하는
DNA-DNA 상호작용을 조절하는 하나 이상의 작용제의 확인 분석 방법
58. (a) 교차-결합된 DNA 표본을 제공하는 단계;
(b) 상기 교차-결합된 DNA를 1차 제한 효소로 분해하는 단계;
(c) 상기 교차-결합된 뉴클레오타이드 서열을 라이게이트하는 단계;
(d) 교차 결합을 역전시키는 단계;
(e) 상기 뉴클레오타이드 서열을 2차 제한 효소로 분해하는 단계;
(f) 상기 뉴클레오타이드 서열을 원형화하는 단계;
(g) 타겟 뉴클레오타이드 서열에 라이게이트하는 하나 이상의 뉴클레오타이드 서열을 증폭시키는 단계;
(h) 선택적으로는 상기 증폭된 서열을 어레이에 혼성화시키는 단계;
(i) DNA 서열간의 상호작용 빈도를 측정하는 단계; 및
(j) DNA 서열간의 상호작용 빈도를 영향받지 않은 대조군과 비교하는 단계를 포함하고,
대조군과 비교시 표본 내 낮은 DNA-DNA 상호작용 빈도에서 높은 DNA-DNA 상호작용 빈도로의 변환은 구분점 위치를 표시함을 특징으로 하는
구분점(예를 들어 전좌) 위치의 검출 방법
59. (a) 교차-결합된 DNA 표본을 제공하는 단계;
(b) 상기 교차-결합된 DNA를 1차 제한 효소로 분해하는 단계;
(c) 상기 교차-결합된 뉴클레오타이드 서열을 라이게이트하는 단계;
(d) 교차 결합을 역전시키는 단계;
(e) 상기 뉴클레오타이드 서열을 2차 제한 효소로 분해하는 단계;
(f) 상기 뉴클레오타이드 서열을 원형화하는 단계;
(g) 타겟 뉴클레오타이드 서열에 라이게이트하는 하나 이상의 뉴클레오타이드 서열을 증폭시키는 단계;
(h) 선택적으로는 상기 증폭된 서열을 어레이에 혼성화시키는 단계;
(i) DNA 서열간의 상호작용 빈도를 측정하는 단계; 및
(j) DNA 서열간의 상호작용 빈도를 영향받지 않은 대조군과 비교하는 단계를 포함하고,
대조군과 비교시 표본에 대한 DNA-DNA 상호작용 빈도의 역전된 패턴은 전도를 표시함을 특징으로 하는
전도 위치의 검출 방법
60. (a) 교차-결합된 DNA 표본을 제공하는 단계;
(b) 상기 교차-결합된 DNA를 1차 제한 효소로 분해하는 단계;
(c) 상기 교차-결합된 뉴클레오타이드 서열을 라이게이트하는 단계;
(d) 교차 결합을 역전시키는 단계;
(e) 상기 뉴클레오타이드 서열을 2차 제한 효소로 분해하는 단계;
(f) 상기 뉴클레오타이드 서열을 원형화하는 단계;
(g) 타겟 뉴클레오타이드 서열에 라이게이트하는 하나 이상의 뉴클레오타이드 서열을 증폭시키는 단계;
(h) 선택적으로는 상기 증폭된 서열을 어레이에 혼성화시키는 단계;
(i) DNA 서열간의 상호작용 빈도를 측정하는 단계; 및
(j) DNA 서열간의 상호작용 빈도를 영향받지 않은 대조군과 비교하는 단계를 포함하고,
대조군과 비교시 표본에 대한 DNA-DNA 상호작용 빈도의 축소는 결실을 표시함을 특징으로 하는
결실 위치의 검출 방법
61. (a) 교차-결합된 DNA 표본을 제공하는 단계;
(b) 상기 교차-결합된 DNA를 1차 제한 효소로 분해하는 단계;
(c) 상기 교차-결합된 뉴클레오타이드 서열을 라이게이트하는 단계;
(d) 교차 결합을 역전시키는 단계;
(e) 상기 뉴클레오타이드 서열을 2차 제한 효소로 분해하는 단계;
(f) 상기 뉴클레오타이드 서열을 원형화하는 단계;
(g) 타겟 뉴클레오타이드 서열에 라이게이트하는 하나 이상의 뉴클레오타이드 서열을 증폭시키는 단계;
(h) 선택적으로는 상기 증폭된 서열을 어레이에 혼성화시키는 단계;
(i) DNA 서열간의 상호작용 빈도를 측정하는 단계; 및
(j) DNA 서열간의 상호작용 빈도를 영향받지 않은 대조군과 비교하는 단계를 포함하고,
대조군과 비교시 피험체 표본에 대한 DNA-DNA 상호작용 빈도의 축소는 증가 또는 감소는 중복 또는 삽입을 표시함을 특징으로 하는
중복 위치의 검출 방법
62. 57항에 따른 분석 방법에 의해 수득되거나 수득 가능한 작용제
63. 표본 내 하나 이상의 DNA-DNA 상호작용을 확인하기 위한 1∼9항 중 어느 한 항에 따른 뉴클레오타이드 서열의 이용
64. DNA-DNA 상호작용 내 변화에 의해 유발되거나 그와 관련된 질병 또는 증후군을 진단하거나 예측하기 위한 1∼9항 중 어느 한 항에 따른 뉴클레오타이드 서열의 이용
65. 표본 내 하나 이상의 DNA-DNA 상호작용을 확인하기 위한 18항에 따른 프로브 어레이 또는 19∼30항 또는 33항 중 어느 한 항에 따른 프로브 세트의 이용
66. DNA-DNA 상호작용 내 변화에 의해 유발되거나 그와 관련된 질병 또는 증후군을 진단하거나 예측하기 위한 18항에 따른 프로브 어레이 또는 19∼30항 또는 33항 중 어느 한 항에 따른 프로브 세트의 이용
67. 표본 내 하나 이상의 DNA-DNA 상호작용을 확인하기 위한 34∼39항 또는 42항 중 어느 한 항에 따른 어레이의 이용
68. DNA-DNA 상호작용 내 변화에 의해 유발되거나 그와 관련된 질병 또는 증후군을 진단하거나 예측하기 위한 34∼39항 또는 42항 중 어느 한 항에 따른 어레이의 이용
69. 64항, 66항 또는 68항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 진단 또는 예측은 태아 진단 또는 예측임을 특징으로 하는 이용
70. 실시예 또는 도면을 참고로 여기서 실질적으로 기술된 방법
71. 실시예 또는 도면을 참고로 여기서 실질적으로 기술된 프로브 어레이
72. 실시예 또는 도면을 참고로 여기서 실질적으로 기술된 프로브 세트
73. 실시예 또는 도면을 참고로 여기서 실질적으로 기술된 방법
74. 실시예 또는 도면을 참고로 여기서 실질적으로 기술된 어레이
75. 실시예 또는 도면을 참고로 여기서 실질적으로 기술된 분석 방법
76. 실시예 또는 도면을 참고로 여기서 실질적으로 기술된 작용제
77. 실시예 또는 도면을 참고로 여기서 실질적으로 기술된 이용
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상기 명세서에 언급된 모든 문헌은 참고문헌에 포함된다. 본 발명의 기술된 방법 및 시스템의 다양한 변형 및 변경이 본 발명의 범위 및 정신에 위배됨이 없이 당업자에게 명백할 것이다. 본 발명이 특정한 바람직한 실시태양과 관련하여 기술되었으나 청구된 본 발명은 이러한 특정한 실시태양에 부당하게 한정되지 않음이 이해되어야 한다. 실제로 분자생물학 및 관련 분야의 기술자에게 명백한 본 발명의 실시 수단의 다양한 변형은 하기 청구항의 범위 내에 존재한다.

Claims (66)

  1. (a) 교차-결합된 DNA 표본을 제공하는 단계;
    (b) 교차-결합된 DNA를 1차 제한 효소로 분해하는 단계;
    (c) 교차-결합된 뉴클레오타이드 서열을 라이게이션하는 단계;
    (d) 교차 결합을 역전(reverse)시키는 단계;
    (e) 뉴클레오타이드 서열을 2차 제한 효소로 분해하는 단계;
    (f) 하나 이상의 관심(interest) 뉴클레오타이드 서열에 인접한(flank) 이용 가능한 2차 제한 효소 분해 사이트에서 알려진 뉴클레오타이드 조성을 지닌 하나 이상의 DNA 서열을 라이게이션하는 단계;
    (g) 관심 뉴클레오타이드 서열에 인접한 DNA 서열과 혼성화되는 적어도 2개의 올리고뉴클레오타이드 프라이머를 사용하여 하나 이상의 관심 뉴클레오타이드 서열을 증폭시키는 단계;
    (h) 증폭된 서열을 어레이에 혼성화시키는 단계; 및
    (i) DNA 서열간의 상호작용 빈도(frequency)를 결정하는 단계;
    로 이루어진 게놈 좌위(locus)와 같은 하나 이상의 관심 뉴클레오타이드 서열과의 타겟 뉴클레오타이드 서열간의 상호작용 빈도를 분석하는 방법
  2. 제 1항에 있어서, 상기 단계 (f)의 라이게이션 반응은 DNA 서클(circle) 형성을 유발함을 특징으로 하는 방법
  3. 제 1항에 있어서, 상기 타겟 뉴클레오타이드 서열은 게놈 재배열, 프로모터, 인핸서, 사일런서(silencer), 절연체, 매트릭스 부착 영역, 로커스 조절 영역, 전사 단위, 복제 기원, 재조합 핫스팟(hotspot), 전좌 구분점(translocation breakpoint), 동원체(centromere), 종말체(telomere), 유전자-밀집 영역, 유전자-부족 영역, 반복 엘레멘트 및 바이러스 도입 사이트로 구성된 군에서 선택됨을 특징으로 하는 방법
  4. 제 1항 또는 제 3항에 있어서, 상기 타겟 뉴클레오타이드 서열은 질병에 관련되거나 원인이 되는 뉴클레오타이드 서열 또는 질병에 관련되거나 원인이 되는 좌위(locus)로부터 선형 DNA 주형 상에서 15 Mb 내외에 위치한 뉴클레오타이드 서열임을 특징으로 하는 방법
  5. 제 1항 또는 제 3항에 있어서, 상기 타겟 뉴클레오타이드 서열은 AMLl, MLL, MYC, BCL, BCR, ABLl, IGH, LYLl, TALI, TAL2, LM02, TCRα/δ, TCRβ, HOX 또는 질병에 관련된 좌위(locus)로 구성된 군에서 선택됨을 특징으로 하는 방법
  6. 제 1항에 있어서, 상기 1차 제한 효소는 6∼8 bp 크기의 뉴클레오타이드 인식 사이트를 인식하는 제한 효소임을 특징으로 하는 방법
  7. 제 6항에 있어서, 상기 1차 제한 효소는 BglⅡ, HindⅢ, EcoRI, BamHI, SpeI, PstI 및 NdeI로 구성된 군에서 선택됨을 특징으로 하는 방법
  8. 제 1항에 있어서, 상기 2차 제한 효소는 4 또는 5 bp 크기의 뉴클레오타이드 인식 사이트를 인식하는 제한 효소임을 특징으로 하는 방법
  9. 제 8항에 있어서, 상기 2차 제한 효소 인식 사이트는 타겟 뉴클레오타이드 서열 내 1차 제한 효소 사이트로부터 350 bp 이상 떨어져 위치함을 특징으로 하는 방법
  10. 제 1항에 있어서, 상기 뉴클레오타이드 서열은 표지됨을 특징으로 하는 방법
  11. (a) 교차-결합된 DNA 표본을 제공하는 단계;
    (b) 교차-결합된 DNA를 1차 제한 효소로 분해하는 단계;
    (c) 교차-결합된 뉴클레오타이드 서열을 라이게이트하는 단계;
    (d) 교차 결합을 역전(reverse)시키는 단계;
    (e) 뉴클레오타이드 서열을 2차 제한 효소로 분해하는 단계;
    (f) 뉴클레오타이드 서열을 원형화(circularize)시키는 단계;
    (g) 타겟 뉴클레오타이드 서열에 라이게이트된 하나 이상의 뉴클레오타이드 서열을 증폭시키는 단계;
    (h) 증폭된 서열을 어레이에 혼성화시키는 단계; 및
    (i) DNA 서열간의 상호작용 빈도를 결정하는 단계;
    로 이루어진 게놈 좌위와 같은 하나 이상의 뉴클레오타이드 서열과 타겟 뉴클레오타이드 서열간의 상호작용 빈도를 분석하는 방법
  12. 첫 번째 및 두 번째 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 원형 뉴클레오타이드에 있어서, 상기 첫 번째 및 두 번째 뉴클레오타이드 서열의 말단 각각은 서로 다른 제한 효소 인식 사이트에 의해 분리되고, 상기 첫 번째 뉴클레오타이드 서열은 타겟 뉴클레오타이드 서열이며 상기 두 번째 뉴클레오타이드 서열은 게놈 DNA의 교차 결합으로 수득 가능한 것임을 특징으로 하는 원형(circularized) 뉴클레오타이드
  13. (a) 교차-결합된 DNA 표본을 제공하는 단계;
    (b) 교차-결합된 DNA를 1차 제한 효소로 분해하는 단계;
    (c) 교차-결합된 뉴클레오타이드 서열을 라이게이트하는 단계;
    (d) 교차 결합을 역전(reverse)시키는 단계;
    (e) 뉴클레오타이드 서열을 2차 제한 효소로 분해하는 단계; 및
    (f) 뉴클레오타이드 서열을 원형화시키는 단계;
    로 이루어진 원형 뉴클레오타이드의 제조 방법
  14. 제 12항의 원형 뉴클레오타이드를 사용한 게놈 좌위와 같은 하나 이상의 뉴클레오타이드 서열과 타겟 뉴클레오타이드 서열간의 상호작용 빈도의 분석 방법
  15. 제 12항의 원형 뉴클레오타이드에 혼성화되거나 혼성화되는 것이 가능한 하나 이상의 프로브를 포함한 지지체 상에 고정화된 프로브 어레이
  16. 삭제
  17. 삭제
  18. 삭제
  19. 삭제
  20. 삭제
  21. 삭제
  22. 삭제
  23. 삭제
  24. 삭제
  25. 삭제
  26. 삭제
  27. 삭제
  28. 삭제
  29. 삭제
  30. 삭제
  31. 제 15항의 프로브 어레이를 포함한 어레이
  32. 삭제
  33. 제 31항에 있어서, 상기 어레이는 300,000∼400,000개 프로브를 포함함을 특징으로 하는 어레이
  34. 제 31항에 있어서, 상기 어레이는 385,000개 이상의 프로브를 포함함을 특징으로 하는 어레이
  35. 제 31항 또는 제 33항에 있어서, 상기 어레이는 제공된 종(species)의 모든 대표 게놈으로 구성되거나 포함함을 특징으로 하는 어레이
  36. 삭제
  37. 제 15항의 프로브 어레이를 고형 지지체 상에 고정화시키는 단계를 포함하는 어레이의 제조 방법
  38. 삭제
  39. 제 37항의 방법에 의해 수득되거나 수득 가능한 어레이
  40. 제 1항 또는 제 11항의 단계 (a)∼(i)를 수행하는 단계를 포함하고, 단계 (a)에서 교차-결합된 DNA 표본은 질환 및 비-질환 세포로부터 제공되고, 질환 및 비-질환 세포 유래의 DNA 서열간의 상호작용 빈도 차이는 DNA-DNA 상호작용이 특정 질병 상태를 표시함을 나타냄을 특징으로 하는 특정 질병 상태를 표시하는 하나 이상의 DNA-DNA 상호작용의 확인 방법
  41. 제 1항 또는 제 11항의 단계 (a)에서 피험체로부터 교차-결합된 DNA 표본을 제공하는 것을 포함하는 단계 (a)∼(i)를 수행하는 단계로 이루어진 시험관 내 진단 또는 예측 방법에 있어서,
    상기 단계 (i)는 DNA 서열간의 상호작용 빈도를 영향 받지 않은 대조군과 비교하는 것을 포함하고; 대조군에서 수득된 수치와 피험체에서 수득된 수치간의 차이는 피험체가 질병 또는 증후군을 앓고 있음을 표시하거나 피험체가 질병 또는 증후군을 앓게 될 것을 표시함을 특징으로 하는 DNA-DNA 상호작용 내 변화에 의해 유발되거나 그와 관련된 질병 또는 증후군의 시험관 내 진단 또는 예측 방법
  42. 제 41항에 있어서, 상기 DNA-DNA 상호작용 빈도의 상승 변환 패턴은 균형 또는 비균형 구분점(breakpoint) 위치를 통해 표시함을 특징으로 하는 시험관 내 방법
  43. 제 41항에 있어서, 대조군과 비교시 피험체 표본에 대한 DNA-DNA 상호작용 빈도의 역위(inverse)된 패턴은 균형 또는 비균형화된 역위를 표시함을 특징으로 하는 시험관 내 방법
  44. 제 41항에 있어서, 대조군과 비교시 피험체 표본에 대한 DNA-DNA 상호작용 빈도의 감소와 원거리의 영역에 대한 DNA-DNA 상호작용 빈도의 증가는 결합하여 균형 또는 비균형화된 결실을 표시함을 특징으로 하는 시험관 내 방법
  45. 제 41항에 있어서, 대조군과 비교시 피험체 표본에 대한 DNA-DNA 상호작용 빈도의 차이는 염색체 내에서 뉴클레오타이드 염기의 중복을 표시함을 특징으로 하는 시험관 내 방법
  46. 제 41항에 있어서, 스펙트럼 핵형분석 또는 FISH가 상기 방법을 수행하기 전에 이용됨을 특징으로 하는 시험관 내 방법
  47. 제 41항에 있어서, 상기 질병은 유전병임을 특징으로 하는 시험관 내 방법
  48. 제 41항에 있어서, 상기 질병은 암임을 특징으로 하는 시험관 내 방법
  49. 제 1항 또는 제 11항의 단계 (a)에서 피험체로부터 교차-결합된 DNA 표본을 제공하는 것을 포함하는 (a)∼(i)를 수행하는 단계로 이루어진 시험관 내 진단 또는 예측 방법에 있어서,
    상기 방법은 (j) 질병과 관련된 게놈 재배열을 수행하는 하나 이상의 좌위(locus)를 확인하는 추가 단계를 포함함을 특징으로 하는 DNA-DNA 상호작용 내 변화에 의해 유발되거나 그와 관련된 질병 또는 증후군의 시험관 내 진단 또는 예측 방법
  50. 제 49항에 있어서, 2 이상의 증폭 서열은 차별적으로 표지됨을 특징으로 하는 시험관 내 방법
  51. 제 49항에 있어서, 2 이상의 증폭 서열은 서열이 다른 염색체 상에 존재시 동일하게 표지됨을 특징으로 하는 시험관 내 방법
  52. 제 49항에 있어서, 2 이상의 증폭 서열은 동일한 염색체 상에 존재시에도 증폭 서열이 DNA-DNA 상호작용 신호의 중복을 피할 수 있는 위치에 존재시 동일하게 표지됨을 특징으로 하는 시험관 내 방법
  53. (a) 표본을 하나 이상의 작용제와 접촉시키는 단계; 및
    (b) 제 1항 또는 제 11항의 단계 (a)에서 표본으로부터 교차-결합된 DNA를 제공하는 것을 포함하는 단계 (a)∼(i)를 수행하는 단계로 이루어진 DNA-DNA 상호작용을 조절하는 하나 이상의 작용제를 확인하기 위한 분석 방법에 있어서,
    (i) 작용제의 존재시 DNA 서열간의 상호작용 빈도와 (ⅱ) 작용제 부재시 DNA 서열간의 상호작용 빈도 사이의 차이는 DNA-DNA 상호작용을 조절하는 작용제를 표시함을 특징으로 하는 DNA-DNA 상호작용을 조절하는 하나 이상의 작용제를 확인하기 위한 분석 방법
  54. (a) 제 1항 또는 제 11항의 단계 (a)∼(i)를 수행하는 단계; 및
    (b) DNA 서열간의 상호작용 빈도를 대조군과 비교하는 단계로 이루어진 균형 또는 비균형 구분점인 전좌(translocation) 위치의 검출 방법에 있어서,
    대조군과 비교시 표본 내 DNA-DNA 상호작용 빈도의 상승 변환 패턴은 구분점의 위치를 표시함을 특징으로 하는 균형 또는 비균형 구분점인 전좌(translocation) 위치의 검출 방법
  55. (a) 제 1항 또는 제 11항의 단계 (a)∼(i)를 수행하는 단계; 및
    (b) DNA 서열간의 상호작용 빈도를 대조군과 비교하는 단계로 이루어진 균형 또는 비균형 역위(inversion) 위치의 검출 방법에 있어서,
    대조군과 비교시 표본에 대한 DNA-DNA 상호작용의 역위된 패턴은 역위를 표시함을 특징으로 하는 균형 또는 비균형 역위(inversion) 위치의 검출 방법
  56. (a) 제 1항 또는 제 11항의 단계 (a)∼(i)를 수행하는 단계; 및
    (b) DNA 서열간의 상호작용 빈도를 대조군과 비교하는 단계로 이루어진 결실 위치의 검출 방법에 있어서,
    대조군과 비교시 표본에 대한 DNA-DNA 상호작용의 감소는 뉴클레오타이드 염기의 결실을 표시함을 특징으로 하는 결실 위치의 검출 방법
  57. (a) 제 1항 또는 제 11항의 단계 (a)∼(i)를 수행하는 단계; 및
    (b) DNA 서열간의 상호작용 빈도를 대조군과 비교하는 단계로 이루어진 중복 또는 삽입 위치의 검출 방법에 있어서,
    대조군과 비교시 표본에 대한 DNA-DNA 상호작용 빈도의 차이는 염색체 내에서 뉴클레오타이드 염기의 중복을 표시함을 특징으로 하는 중복 위치의 검출 방법
  58. 삭제
  59. 삭제
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  61. 삭제
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