JPH05211897A - ヌクレオチド配列 - Google Patents
ヌクレオチド配列Info
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- JPH05211897A JPH05211897A JP4155462A JP15546292A JPH05211897A JP H05211897 A JPH05211897 A JP H05211897A JP 4155462 A JP4155462 A JP 4155462A JP 15546292 A JP15546292 A JP 15546292A JP H05211897 A JPH05211897 A JP H05211897A
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- JP
- Japan
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- yac
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- nucleic acid
- dna
- gene
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
- C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
- A61P25/28—Drugs for disorders of the nervous system for treating neurodegenerative disorders of the central nervous system, e.g. nootropic agents, cognition enhancers, drugs for treating Alzheimer's disease or other forms of dementia
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
- C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
- C07K14/4701—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals not used
- C07K14/4711—Alzheimer's disease; Amyloid plaque core protein
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
- C12Q2600/156—Polymorphic or mutational markers
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Abstract
(57)【要約】
【構成】 酵母人工染色体（ＹＡＣｓ）並びにそれらか
ら得られるヌクレオチド配列及びポリペプチド。アルツ
ハイマー病の検出、診断及び治療のためのそれらの使
用。トランスフェクトされた細胞及びトランスゲニック
動物の作成におけるそれらの使用。 【効果】 上記ＹＡＣｓに含まれるヌクレオチド配列
は、遺伝的若しくは後天的疾病の対立遺伝子、特にアル
ツハイマー病の診断において利用することができる。
ら得られるヌクレオチド配列及びポリペプチド。アルツ
ハイマー病の検出、診断及び治療のためのそれらの使
用。トランスフェクトされた細胞及びトランスゲニック
動物の作成におけるそれらの使用。 【効果】 上記ＹＡＣｓに含まれるヌクレオチド配列
は、遺伝的若しくは後天的疾病の対立遺伝子、特にアル
ツハイマー病の診断において利用することができる。
Description
【０００１】本発明は酵母人工染色体（ＹＡＣ）、ヌク
レオチド塩基配列及びそれから誘導されるポリヌクレオ
チド；アルツハイマー病の検出方法、診断方法及び治療
方法へのそれらの使用に関する。本発明の特別の態様は
例えばアルツハイマー病のような遺伝性疾患関連遺伝子
をコードするヌクレオチド塩基配列、例えばｍＲＮＡの
ようなＲＮＡ、及び全てが診断と治療法とに用いるため
の蛋白質のようなポリヌクレオチドとそれから誘導され
る抗体を含む。本発明は又、トランスフェクテッド細胞
及びトランスジェニック動物とに関する。本発明の診断
方法に用いるための診断キットも提供する。アルツハイ
マー病は臨床レベルでは他の原因に起因できない進行性
痴呆を特徴とし、組織病理学的レベルでは神経炎性プラ
ーク（ｎｅｕｒｉｔｉｃ ｐｌａｑｕｅ）及び神経細繊
維もつれ（ｔａｎｇｌｅ）の発現を限定的に特徴とす
る、原因不明の致命的神経変性障害である。アルツハイ
マー病の神経病理学的特徴はしばしば、患者の３０歳台
と４０歳台にダウン（Ｄｏｗｎ）症候群（ＤＳ）を有す
る患者に発現する。後者は染色体２１の部分的又は完全
なトリソミーによって生ずる遺伝性障害である。少数の
症例では、アルツハイマー病は家族性アルツハイマー病
（ＦＡＤ）と呼ばれる常染色体優勢形質として遺伝され
るように思われる。
レオチド塩基配列及びそれから誘導されるポリヌクレオ
チド；アルツハイマー病の検出方法、診断方法及び治療
方法へのそれらの使用に関する。本発明の特別の態様は
例えばアルツハイマー病のような遺伝性疾患関連遺伝子
をコードするヌクレオチド塩基配列、例えばｍＲＮＡの
ようなＲＮＡ、及び全てが診断と治療法とに用いるため
の蛋白質のようなポリヌクレオチドとそれから誘導され
る抗体を含む。本発明は又、トランスフェクテッド細胞
及びトランスジェニック動物とに関する。本発明の診断
方法に用いるための診断キットも提供する。アルツハイ
マー病は臨床レベルでは他の原因に起因できない進行性
痴呆を特徴とし、組織病理学的レベルでは神経炎性プラ
ーク（ｎｅｕｒｉｔｉｃ ｐｌａｑｕｅ）及び神経細繊
維もつれ（ｔａｎｇｌｅ）の発現を限定的に特徴とす
る、原因不明の致命的神経変性障害である。アルツハイ
マー病の神経病理学的特徴はしばしば、患者の３０歳台
と４０歳台にダウン（Ｄｏｗｎ）症候群（ＤＳ）を有す
る患者に発現する。後者は染色体２１の部分的又は完全
なトリソミーによって生ずる遺伝性障害である。少数の
症例では、アルツハイマー病は家族性アルツハイマー病
（ＦＡＤ）と呼ばれる常染色体優勢形質として遺伝され
るように思われる。
【０００２】１９８７年には、４ファミリーのＦＡＤ遺
伝子と部位Ｄ２１Ｓ１／Ｄ２１Ｓ１１及びＤ２１Ｓ１６
の最大ロッドスコア（ｌｏｄ ｓｃｏｒｅ）を有する染
色体２１マーカーとの間の遺伝的結合が検出された［ピ
ー．エッチ．セント ジョージーヒスロップ（Ｐ．Ｈ．
Ｓｔ Ｇｅｏｒｇｅ−Ｈｙｓｌｏｐ）等、サイエンス
（Ｓｃｉｅｎｃｅ）、１９８７、２３５、８８５−８９
０］。ＤＳとアルツハイマー病の両方に検出される神経
炎プラークの最大構成要素はＡ４プロテイン又はβアミ
ロイドプロテイン、染色体２１上のアミロイド先駆体プ
ロテイン（ＡＰＰ）遺伝子によってコードされるより大
きいポリペプチドから誘導される４２ｋｄペプチドであ
る。これらの研究結果を説明する最も簡単な仮説は、遺
伝子量又は他の突然変異によるＡＰＰ代謝の破壊がＤＳ
又はＦＡＤにそれぞれ見られる痴呆を生ずるというもの
である。これは後者に対してはオリジナルＦＡＤ系統
［アール．イー．タンジ（Ｒ．Ｅ．Ｔａｎｚｉ）等、ネ
イチャー（Ｎａｔｕｒｅ）、１９８７、３２９、１５６
−１５７］と追加のＦＡＤ系統［シー．ファン ブレッ
クホーヴェン（Ｃ．Ｖａｎ Ｂｒｏｅｃｋｈｏｖｅｎ）
等、ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）、１９８７、３２９、
１５３−１５５］との両方におけるＦＡＤ遺伝子とＡＰ
Ｐとの間の組み換えの２報告によって反駁された。この
後の幾つかの研究は染色体２１に対するＦＡＤの結合を
排除し［エム．エイ．ペリカクーヴァンス（Ｍ．Ａ．Ｐ
ｅｒｉｃａｋ−Ｖａｎｃｅ）等、イクス．ノイロル．
（Ｅｘｐ．Ｎｅｕｒｏｌ．）、１９８８、１０２、２７
１−２７９；ジー．ディ．シェレンベルグ（Ｇ．Ｄ．Ｓ
ｃｈｅｌｌｅｎｂｅｒｇ）等、アム．ジェイ．フム．ジ
ェネト．（Ａｍ．Ｊ．Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ．）、１９９
１、４８、５６３−５８３］、遺伝子異種性（ｇｅｎｅ
ｔｉｃ ｈｅｔｅｒｏｇｅｎｅｉｔｙ）を示唆している
が、もう一つの研究は近位マーカー２１Ｓ１６への最も
強い結合を示唆している［エイ．エム．ゴート（Ａ．
Ｍ．Ｇｏａｔｅ）等、ランセット（Ｌａｎｃｅｔ）ｉ、
１９８９、３５２−３５５］。ＦＡＤにおける遺伝子異
種性の研究は４８系統の大きい協同研究に述べられてい
る［ピー．エッチ．セント ジョージーヒスロップ等、
ネイチャー、１９９０、３４７、１９４−１９７］。Ｆ
ＡＤが単一の均一な障害ではないことが結論された。痴
呆を前老年期発現（＜６５歳）したファミリーは２１ｑ
マーカーへの結合の最も強い徴候を示すが、マーカーＤ
２１Ｓ１／Ｄ２１Ｓ１１及びＤ２１Ｓ１３／Ｄ２１Ｓ１
６に対するＦＡＤ遺伝子の位置はゴート等の上記研究に
おけるよりも充分には画定されていなかった。このデー
タ体を考慮すると、前老年期ＦＡＤを有する無関係な２
ファミリーに、通常の人口に見られないような、同じＣ
〜Ｔヌクレオチド置換が発見されたことは意外であった
［エイ．エム．ゴート等、ネイチャー、１９９１、３４
９、７０４−７０６］。この突然変異はＡ４又はβアミ
ロイドペプチドのカルボキシ末端近くでＶａｌアミノ酸
によるＩｌｅアミノ酸置換を生ずる。最も注目すべき結
論は、このむしろ控えめな突然変異が、いずれもＡＰＰ
遺伝子との組み換えを示さない、これらのファミリーに
おけるＦＡＤ発現の原因であるということである。現在
までに、ＡＰＰにおけるこの位置又は他の位置における
他の幾つかの突然変異が報告されているが、これらは染
色体２１結合ＦＡＤファミリーでは殆ど生じていない
［ルコッテ（Ｌｕｃｏｔｔｅ）等、ネイチャー、１９９
１、３５１、５３０；ムレル（Ｍｕｒｒｅｌｌ）等、サ
イエンス、１９９１、２５４、９７−９９］。
伝子と部位Ｄ２１Ｓ１／Ｄ２１Ｓ１１及びＤ２１Ｓ１６
の最大ロッドスコア（ｌｏｄ ｓｃｏｒｅ）を有する染
色体２１マーカーとの間の遺伝的結合が検出された［ピ
ー．エッチ．セント ジョージーヒスロップ（Ｐ．Ｈ．
Ｓｔ Ｇｅｏｒｇｅ−Ｈｙｓｌｏｐ）等、サイエンス
（Ｓｃｉｅｎｃｅ）、１９８７、２３５、８８５−８９
０］。ＤＳとアルツハイマー病の両方に検出される神経
炎プラークの最大構成要素はＡ４プロテイン又はβアミ
ロイドプロテイン、染色体２１上のアミロイド先駆体プ
ロテイン（ＡＰＰ）遺伝子によってコードされるより大
きいポリペプチドから誘導される４２ｋｄペプチドであ
る。これらの研究結果を説明する最も簡単な仮説は、遺
伝子量又は他の突然変異によるＡＰＰ代謝の破壊がＤＳ
又はＦＡＤにそれぞれ見られる痴呆を生ずるというもの
である。これは後者に対してはオリジナルＦＡＤ系統
［アール．イー．タンジ（Ｒ．Ｅ．Ｔａｎｚｉ）等、ネ
イチャー（Ｎａｔｕｒｅ）、１９８７、３２９、１５６
−１５７］と追加のＦＡＤ系統［シー．ファン ブレッ
クホーヴェン（Ｃ．Ｖａｎ Ｂｒｏｅｃｋｈｏｖｅｎ）
等、ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）、１９８７、３２９、
１５３−１５５］との両方におけるＦＡＤ遺伝子とＡＰ
Ｐとの間の組み換えの２報告によって反駁された。この
後の幾つかの研究は染色体２１に対するＦＡＤの結合を
排除し［エム．エイ．ペリカクーヴァンス（Ｍ．Ａ．Ｐ
ｅｒｉｃａｋ−Ｖａｎｃｅ）等、イクス．ノイロル．
（Ｅｘｐ．Ｎｅｕｒｏｌ．）、１９８８、１０２、２７
１−２７９；ジー．ディ．シェレンベルグ（Ｇ．Ｄ．Ｓ
ｃｈｅｌｌｅｎｂｅｒｇ）等、アム．ジェイ．フム．ジ
ェネト．（Ａｍ．Ｊ．Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ．）、１９９
１、４８、５６３−５８３］、遺伝子異種性（ｇｅｎｅ
ｔｉｃ ｈｅｔｅｒｏｇｅｎｅｉｔｙ）を示唆している
が、もう一つの研究は近位マーカー２１Ｓ１６への最も
強い結合を示唆している［エイ．エム．ゴート（Ａ．
Ｍ．Ｇｏａｔｅ）等、ランセット（Ｌａｎｃｅｔ）ｉ、
１９８９、３５２−３５５］。ＦＡＤにおける遺伝子異
種性の研究は４８系統の大きい協同研究に述べられてい
る［ピー．エッチ．セント ジョージーヒスロップ等、
ネイチャー、１９９０、３４７、１９４−１９７］。Ｆ
ＡＤが単一の均一な障害ではないことが結論された。痴
呆を前老年期発現（＜６５歳）したファミリーは２１ｑ
マーカーへの結合の最も強い徴候を示すが、マーカーＤ
２１Ｓ１／Ｄ２１Ｓ１１及びＤ２１Ｓ１３／Ｄ２１Ｓ１
６に対するＦＡＤ遺伝子の位置はゴート等の上記研究に
おけるよりも充分には画定されていなかった。このデー
タ体を考慮すると、前老年期ＦＡＤを有する無関係な２
ファミリーに、通常の人口に見られないような、同じＣ
〜Ｔヌクレオチド置換が発見されたことは意外であった
［エイ．エム．ゴート等、ネイチャー、１９９１、３４
９、７０４−７０６］。この突然変異はＡ４又はβアミ
ロイドペプチドのカルボキシ末端近くでＶａｌアミノ酸
によるＩｌｅアミノ酸置換を生ずる。最も注目すべき結
論は、このむしろ控えめな突然変異が、いずれもＡＰＰ
遺伝子との組み換えを示さない、これらのファミリーに
おけるＦＡＤ発現の原因であるということである。現在
までに、ＡＰＰにおけるこの位置又は他の位置における
他の幾つかの突然変異が報告されているが、これらは染
色体２１結合ＦＡＤファミリーでは殆ど生じていない
［ルコッテ（Ｌｕｃｏｔｔｅ）等、ネイチャー、１９９
１、３５１、５３０；ムレル（Ｍｕｒｒｅｌｌ）等、サ
イエンス、１９９１、２５４、９７−９９］。
【０００３】それ故、アルツハイマー病の診断と治療の
ための他の方法が必要である。
ための他の方法が必要である。
【０００４】本発明はアルツハイマー病の遺伝子塩基配
列を含む酵母人工染色体（ｙｅａｓｔ ａｒｔｉｆｉｃ
ｉａｌ ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ）（ＹＡＣ）を今回提供
する。これらのＹＡＣに含まれるヌクレオチド配列は特
にアルツハイマー病の診断と治療における遺伝性又は後
天性疾患対立遺伝子の検出に用いられる。
列を含む酵母人工染色体（ｙｅａｓｔ ａｒｔｉｆｉｃ
ｉａｌ ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ）（ＹＡＣ）を今回提供
する。これらのＹＡＣに含まれるヌクレオチド配列は特
にアルツハイマー病の診断と治療における遺伝性又は後
天性疾患対立遺伝子の検出に用いられる。
【０００５】本発明の酵母人工染色体を以下ではＹＡＣ
２３ＣＢ１０、２８ＣＡ１２及び２６ＦＦ３と呼ぶこ
とにする。これらは、本出願が優先権を主張する特許出
願の出願前にナショナル コレクション オブ インダ
ストリアル アンド マリンバクテリア（Ｎａｔｉｏｎ
ａｌ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｉｎｄｕｓｔｒｉ
ａｌ ａｎｄ Ｍａｒｉｎｅ Ｂａｃｔｅｒｉａ）（Ｎ
ＣＩＭＢ）（スコットランド、アバーディーンＡＢ９
８ＤＧ、１３５アベイ ロード、私書箱３１）によって
寄託されている。ＹＡＣクローンＳＣ／２３ＣＢ１０の
ＮＣＩＭＢ受け入れ番号は４０２５５であり、その挿入
サイズは４２５キロベースである。ＹＡＣクローンＳＣ
／２８ＣＡ１２のＮＣＩＭＢ受け入れ番号は４０４１６
であり、その挿入サイズは２７０キロベースである。Ｙ
ＡＣクローンＳＣ／２６ＦＦ３のＮＣＩＭＢ受け入れ番
号は４０４１５であり、その挿入サイズは２２０キロベ
ースである。上記ＹＡＣの各々とその用途は、ＹＡＣの
単独の場合又は他のＹＡＣのいずれかもしくは両方と組
み合わせた場合のいずれにしても、本発明の独立した特
定の態様である。
２３ＣＢ１０、２８ＣＡ１２及び２６ＦＦ３と呼ぶこ
とにする。これらは、本出願が優先権を主張する特許出
願の出願前にナショナル コレクション オブ インダ
ストリアル アンド マリンバクテリア（Ｎａｔｉｏｎ
ａｌ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｉｎｄｕｓｔｒｉ
ａｌ ａｎｄ Ｍａｒｉｎｅ Ｂａｃｔｅｒｉａ）（Ｎ
ＣＩＭＢ）（スコットランド、アバーディーンＡＢ９
８ＤＧ、１３５アベイ ロード、私書箱３１）によって
寄託されている。ＹＡＣクローンＳＣ／２３ＣＢ１０の
ＮＣＩＭＢ受け入れ番号は４０２５５であり、その挿入
サイズは４２５キロベースである。ＹＡＣクローンＳＣ
／２８ＣＡ１２のＮＣＩＭＢ受け入れ番号は４０４１６
であり、その挿入サイズは２７０キロベースである。Ｙ
ＡＣクローンＳＣ／２６ＦＦ３のＮＣＩＭＢ受け入れ番
号は４０４１５であり、その挿入サイズは２２０キロベ
ースである。上記ＹＡＣの各々とその用途は、ＹＡＣの
単独の場合又は他のＹＡＣのいずれかもしくは両方と組
み合わせた場合のいずれにしても、本発明の独立した特
定の態様である。
【０００６】本発明の第１態様では、個体からの核酸サ
ンプル中の１種以上の遺伝性又は後天性疾患対立遺伝子
の検出方法であって、ＹＡＣ ２３ＣＢ１０、２８ＣＡ
１２及び２６ＦＦ３のいずれかに含まれる遺伝子中の変
異ヌクレオチド配列の有無を検査する方法を提供する。
ンプル中の１種以上の遺伝性又は後天性疾患対立遺伝子
の検出方法であって、ＹＡＣ ２３ＣＢ１０、２８ＣＡ
１２及び２６ＦＦ３のいずれかに含まれる遺伝子中の変
異ヌクレオチド配列の有無を検査する方法を提供する。
【０００７】遺伝性又は後天性疾患は便宜的にはアルツ
ハイマー病又はこのような疾患の発現を生ずる状態であ
る。
ハイマー病又はこのような疾患の発現を生ずる状態であ
る。
【０００８】それ故、本発明の他の態様では、個体から
の核酸サンプル中の１種以上のアルツハイマー病対立遺
伝子の検出方法であって、ＹＡＣ ２３ＣＢ１０、２８
ＣＡ１２及び２６ＦＦ３のいずれかに含まれる遺伝子中
の変異ヌクレオチド配列の有無を検査する方法を提供す
る。
の核酸サンプル中の１種以上のアルツハイマー病対立遺
伝子の検出方法であって、ＹＡＣ ２３ＣＢ１０、２８
ＣＡ１２及び２６ＦＦ３のいずれかに含まれる遺伝子中
の変異ヌクレオチド配列の有無を検査する方法を提供す
る。
【０００９】本発明の方法を用いて検出されるアルツハ
イマー病の特定の形態は前老年期（＜６５歳）アルツハ
イマー病である。
イマー病の特定の形態は前老年期（＜６５歳）アルツハ
イマー病である。
【００１０】本発明の方法は個体からの核酸サンプル中
の１種以上の老年期発現アルツハイマー病対立遺伝子の
検出にも有用である。
の１種以上の老年期発現アルツハイマー病対立遺伝子の
検出にも有用である。
【００１１】対立遺伝子は遺伝子座の変異体として定義
され、遺伝子分離の通常の原理に従って遺伝される。遺
伝子座の対立遺伝子はそのサイズもしくは組成によって
又はサイズと組成との両方によって特徴づけられる。遺
伝子座の対立遺伝子変化は例えば数キロベースの核酸の
挿入、欠失又は転位に起因する、又は変化は単一塩基対
程度の変化に起因する。遺伝子座におけるこのような変
化は技術上公知の方法を用いて容易に検出可能である。
理論的な考察に縛られるのを望む訳ではないが、アルツ
ハイマー病はＹＡＣ ２３ＣＢ１０、２８ＣＡ１２及び
２６ＦＦ３のいずれかに含まれる遺伝子中、又はＹＡＣ
２３ＣＢ１０、２８ＣＡ１２及び２６ＦＦ３のいずれ
かに含まれる遺伝子内のもしくはこの遺伝子に隣接する
遺伝子制御要素中の欠失、挿入、転位及び点突然変異イ
ベントに起因すると考えられる。「ＹＡＣ ２３ＣＢ１
０、２８ＣＡ１２及び２６ＦＦ３のいずれかに含まれ
る」なる表現は、少なくともその一部がＹＡＣ ２３Ｃ
Ｂ１０、２８ＣＡ１２及び２６ＦＦ３のいずれかに含ま
れる遺伝子のコーディングもしくは非コーディング領
域、並びに１００キロベースまで、７５キロベースま
で、５０キロベースまで、２５キロベースまで、２０キ
ロベースまで、１５キロベースまで、１０キロベースま
で及び５キロベースまでのフランキング領域を含む。
され、遺伝子分離の通常の原理に従って遺伝される。遺
伝子座の対立遺伝子はそのサイズもしくは組成によって
又はサイズと組成との両方によって特徴づけられる。遺
伝子座の対立遺伝子変化は例えば数キロベースの核酸の
挿入、欠失又は転位に起因する、又は変化は単一塩基対
程度の変化に起因する。遺伝子座におけるこのような変
化は技術上公知の方法を用いて容易に検出可能である。
理論的な考察に縛られるのを望む訳ではないが、アルツ
ハイマー病はＹＡＣ ２３ＣＢ１０、２８ＣＡ１２及び
２６ＦＦ３のいずれかに含まれる遺伝子中、又はＹＡＣ
２３ＣＢ１０、２８ＣＡ１２及び２６ＦＦ３のいずれ
かに含まれる遺伝子内のもしくはこの遺伝子に隣接する
遺伝子制御要素中の欠失、挿入、転位及び点突然変異イ
ベントに起因すると考えられる。「ＹＡＣ ２３ＣＢ１
０、２８ＣＡ１２及び２６ＦＦ３のいずれかに含まれ
る」なる表現は、少なくともその一部がＹＡＣ ２３Ｃ
Ｂ１０、２８ＣＡ１２及び２６ＦＦ３のいずれかに含ま
れる遺伝子のコーディングもしくは非コーディング領
域、並びに１００キロベースまで、７５キロベースま
で、５０キロベースまで、２５キロベースまで、２０キ
ロベースまで、１５キロベースまで、１０キロベースま
で及び５キロベースまでのフランキング領域を含む。
【００１２】遺伝子座内の情報変化は疾患関連遺伝子自
体内もしくは疾患関連遺伝子から離れているが遺伝的に
結合したヌクレオチド配列内の変化に起因する。一般
に、疾患関連遺伝子自体内の変化の診断は、これによっ
て結合遺伝子マーカーの有用性を低下させるような遺伝
子組み換えイベントが生ずる可能性が排除されるので、
好ましい。同様に、多くの後天性変化はサイズ及び位置
が可変である欠失イベントであるので、疾患関連遺伝子
自体内の変化はこのような後天的変化が検出される確率
を高める。結合遺伝子マーカーにおける情報変化は便宜
的にヌクレオチド配列の可変なタンデム反復数の存在に
起因する。このような領域の例には、例えば５０、４
０、３０、２０もしくは１０塩基までのヌクレオチド配
列が反復されるミニサテライト領域［例えば、ナカムラ
（Ｎａｔａｍｕｒａ）等によるアム．ジェイ．フム．ジ
ェネト．４３、８５４−８５９頁（１９８８）に記
載］、又は５、４、３、２又は１塩基までのヌクレオチ
ド配列が反復されるミニサテライト領域、例えば（Ｃ
Ａ）ｎ反復のようなジヌクレオチド反復もしくはこれに
相補的な領域［リット（Ｌｉｔｔ）等によるアム．ジェ
イ．フム．ジェネト．４４、３９７−４０１頁（１９８
９）及びウェーバー（Ｗｅｂｅｒ）等によるアム．ジェ
イ．フム．ジェネト．４４、３８８−３９６頁（１９８
９）に記載］がある。或いは、情報変化は例えば制限酵
素によって認識されるヌクレオチド配列の変化のよう
な、サンプル核酸開裂に影響を与える変化に起因すると
考えられる。このような変化は便宜的に、制限フラグメ
ント長多型（ＲＦＬＰ）として検出される、又は塩基配
列変化の他の検出方法を用いて確認される。
体内もしくは疾患関連遺伝子から離れているが遺伝的に
結合したヌクレオチド配列内の変化に起因する。一般
に、疾患関連遺伝子自体内の変化の診断は、これによっ
て結合遺伝子マーカーの有用性を低下させるような遺伝
子組み換えイベントが生ずる可能性が排除されるので、
好ましい。同様に、多くの後天性変化はサイズ及び位置
が可変である欠失イベントであるので、疾患関連遺伝子
自体内の変化はこのような後天的変化が検出される確率
を高める。結合遺伝子マーカーにおける情報変化は便宜
的にヌクレオチド配列の可変なタンデム反復数の存在に
起因する。このような領域の例には、例えば５０、４
０、３０、２０もしくは１０塩基までのヌクレオチド配
列が反復されるミニサテライト領域［例えば、ナカムラ
（Ｎａｔａｍｕｒａ）等によるアム．ジェイ．フム．ジ
ェネト．４３、８５４−８５９頁（１９８８）に記
載］、又は５、４、３、２又は１塩基までのヌクレオチ
ド配列が反復されるミニサテライト領域、例えば（Ｃ
Ａ）ｎ反復のようなジヌクレオチド反復もしくはこれに
相補的な領域［リット（Ｌｉｔｔ）等によるアム．ジェ
イ．フム．ジェネト．４４、３９７−４０１頁（１９８
９）及びウェーバー（Ｗｅｂｅｒ）等によるアム．ジェ
イ．フム．ジェネト．４４、３８８−３９６頁（１９８
９）に記載］がある。或いは、情報変化は例えば制限酵
素によって認識されるヌクレオチド配列の変化のよう
な、サンプル核酸開裂に影響を与える変化に起因すると
考えられる。このような変化は便宜的に、制限フラグメ
ント長多型（ＲＦＬＰ）として検出される、又は塩基配
列変化の他の検出方法を用いて確認される。
【００１３】本発明の便宜的な態様では、個体からの核
酸サンプル中の１種以上の遺伝性又は後天性疾患対立遺
伝子の検出方法であって、個体ファミリーのメンバーか
らの核酸サンプル中のＹＡＣ ２３ＣＢ１０、２８ＣＡ
１２及び２６ＦＦ３のいずれかに含まれる対立遺伝子が
被検個体からの核酸サンプル中の遺伝性又は後天性疾患
の対立遺伝子の存在と一致したやり方で遺伝されたか否
かを検査することを含む方法を提供する。
酸サンプル中の１種以上の遺伝性又は後天性疾患対立遺
伝子の検出方法であって、個体ファミリーのメンバーか
らの核酸サンプル中のＹＡＣ ２３ＣＢ１０、２８ＣＡ
１２及び２６ＦＦ３のいずれかに含まれる対立遺伝子が
被検個体からの核酸サンプル中の遺伝性又は後天性疾患
の対立遺伝子の存在と一致したやり方で遺伝されたか否
かを検査することを含む方法を提供する。
【００１４】後天性疾患対立遺伝子は、個体からの核酸
サンプル中のＹＡＣ ２３ＣＢ１０、２８ＣＡ１２及び
２６ＦＦ３のいずれかに含まれる遺伝子の対立遺伝子が
個体のファミリーのメンバーからの対立遺伝子と一致し
ないやり方で得られたのか否か又は体内の細胞の幾つか
の核のみに得られたのか否かを検査することによって便
宜的に検出することができる。前者は個体及び個体のフ
ァミリーのメンバー、好ましくは個体の両親からの核酸
を分析し、個体のファミリーの両親又は他のメンバーの
いずれにも存在しない個体の対立遺伝子を観察すること
によって便宜的に行われる。後者は個体の異なる細胞か
らの、例えば異なる細胞種類（組織）からの核酸の分析
によって便宜的に行われる。次に、個体の体の異なる領
域からの核酸の比較によって、核酸サンプル中のＹＡＣ
２３ＣＢ１０、２８ＣＡ１２及び２６ＦＦ３のいずれ
かに含まれる遺伝子の対立遺伝子が異なる領域、組織又
は細胞種類では、個体の一部の後天性疾患対立遺伝子の
存在と一致して、異なるか否かを検査する。
サンプル中のＹＡＣ ２３ＣＢ１０、２８ＣＡ１２及び
２６ＦＦ３のいずれかに含まれる遺伝子の対立遺伝子が
個体のファミリーのメンバーからの対立遺伝子と一致し
ないやり方で得られたのか否か又は体内の細胞の幾つか
の核のみに得られたのか否かを検査することによって便
宜的に検出することができる。前者は個体及び個体のフ
ァミリーのメンバー、好ましくは個体の両親からの核酸
を分析し、個体のファミリーの両親又は他のメンバーの
いずれにも存在しない個体の対立遺伝子を観察すること
によって便宜的に行われる。後者は個体の異なる細胞か
らの、例えば異なる細胞種類（組織）からの核酸の分析
によって便宜的に行われる。次に、個体の体の異なる領
域からの核酸の比較によって、核酸サンプル中のＹＡＣ
２３ＣＢ１０、２８ＣＡ１２及び２６ＦＦ３のいずれ
かに含まれる遺伝子の対立遺伝子が異なる領域、組織又
は細胞種類では、個体の一部の後天性疾患対立遺伝子の
存在と一致して、異なるか否かを検査する。
【００１５】本発明の方法は下記要素：２３ＣＢ１０Ｌ
【化１１】 ２３ＣＢ１０Ｒ
【化１２】 １７ＢＦ９Ｒ
【化１３】 ２８ＣＡ１２Ｒ
【化１４】 ２６ＦＦ３Ｌ
【化１５】 ２６ＦＦ３Ｒ
【化１６】 のいずれかから独立的に選択されたポリヌクレオチドも
しくはその補体が選択的にハイブリッド化する核酸フラ
グメント中に含まれる遺伝子座における変異ヌクレオチ
ド配列の有無を検査することによって便宜的に行われ
る。
しくはその補体が選択的にハイブリッド化する核酸フラ
グメント中に含まれる遺伝子座における変異ヌクレオチ
ド配列の有無を検査することによって便宜的に行われ
る。
【００１６】上記ヌクレオチド塩基配列の各々と、それ
が選択的にハイブリド化する核酸フラグメントは本発明
の独立した特定の態様を表す。
が選択的にハイブリド化する核酸フラグメントは本発明
の独立した特定の態様を表す。
【００１７】上記遺伝子座にヌクレオチド塩基配列を製
造するための便利なプライマーは下記表１に示す。
造するための便利なプライマーは下記表１に示す。
【００１８】ＹＡＣ ２８ＣＡ１２が広がる領域内の３
ＨＴＦ島を確認し、塩基配列決定した。それ故、特定の
態様では、本発明の方法は下記要素：３ＥＨ１２Ａ１
ＨＴＦ島を確認し、塩基配列決定した。それ故、特定の
態様では、本発明の方法は下記要素：３ＥＨ１２Ａ１
【化１７】 ３ＥＨ１２Ａ７
【化１８】 ３ＥＨ１２Ａ７Ｒ
【化１９】 又は３ＥＨ１２Ｃ６
【化２０】 のいずれかから独立的に選択されたポリヌクレオチド又
はその補体が選択的にハイブリッド化する核酸フラグメ
ントに含まれる遺伝子座における変異ヌクレオチド配列
の有無を検査することによって行われる。
はその補体が選択的にハイブリッド化する核酸フラグメ
ントに含まれる遺伝子座における変異ヌクレオチド配列
の有無を検査することによって行われる。
【００１９】上記ヌクレオチド配列の各々と、それが選
択的にハイブリッド化する核酸補体は本発明の独立した
特定の態様を表す。
択的にハイブリッド化する核酸補体は本発明の独立した
特定の態様を表す。
【００２０】「選択的にハイブリッド化する」なる表現
は、例えば本発明のＹＡＣに対する１種以上の制限酵素
の作用によって、適当なハイブリッド化条件下で製造さ
れる核酸フラグメントの混合物中で、ポリヌクレオチド
が核酸フラグメントにハイブリッド化し、核酸フラグメ
ントを確認することを意味する。
は、例えば本発明のＹＡＣに対する１種以上の制限酵素
の作用によって、適当なハイブリッド化条件下で製造さ
れる核酸フラグメントの混合物中で、ポリヌクレオチド
が核酸フラグメントにハイブリッド化し、核酸フラグメ
ントを確認することを意味する。
【００２１】便利な核酸フラグメントには、本発明のＹ
ＡＣに対する例えばＢｓｓＨII、ＳａｃII、ＥａｇI、
ＮａｅI、ＳｆｉI又はＸｈｏIのような制限酵素の作用
によって製造されるフラグメントを含む。他の便利なフ
ラグメントには、Ｓａｕ３ＡＩ、ＴａｑI、ＡｌｕI、Ｈ
ｉｎｆI、ＲｓａI、ＥｃｏＲＶ、ＳｓｐI、ＨｉｎｃII
及びＳｔｕI並びにＥｃｏＲＩ、ＰｓｔＩ、ＢａｍＨ
Ｉ、ＨｉｎｄIII、ＰｖｕII又はＫｐｎＩによって製造
されるフラグメントがある。ＮａｅＩの作用によっては
特定の核酸フラグメントが製造される。ＸｈｏＩの作用
によっては他の特定の核酸フラグメントが製造される。
ＡＣに対する例えばＢｓｓＨII、ＳａｃII、ＥａｇI、
ＮａｅI、ＳｆｉI又はＸｈｏIのような制限酵素の作用
によって製造されるフラグメントを含む。他の便利なフ
ラグメントには、Ｓａｕ３ＡＩ、ＴａｑI、ＡｌｕI、Ｈ
ｉｎｆI、ＲｓａI、ＥｃｏＲＶ、ＳｓｐI、ＨｉｎｃII
及びＳｔｕI並びにＥｃｏＲＩ、ＰｓｔＩ、ＢａｍＨ
Ｉ、ＨｉｎｄIII、ＰｖｕII又はＫｐｎＩによって製造
されるフラグメントがある。ＮａｅＩの作用によっては
特定の核酸フラグメントが製造される。ＸｈｏＩの作用
によっては他の特定の核酸フラグメントが製造される。
【００２２】特に上述したヌクレオチド配列の１つが選
択的にハイブリッド化する単一核酸フラグメントによっ
て本発明の独立した特定の態様が形成され、この単一核
酸フラグメントは上記のような単一制限酵素の作用によ
って製造される。
択的にハイブリッド化する単一核酸フラグメントによっ
て本発明の独立した特定の態様が形成され、この単一核
酸フラグメントは上記のような単一制限酵素の作用によ
って製造される。
【００２３】上記で定義したような単一核酸フラグメン
トに含まれる遺伝子座における変異ヌクレオチド配列の
有無を検査することを含む、本発明の他の独立した特定
の態様が形成される。
トに含まれる遺伝子座における変異ヌクレオチド配列の
有無を検査することを含む、本発明の他の独立した特定
の態様が形成される。
【００２４】上記方法のいずれも核酸サンプルを、遺伝
性又は後天性に拘わらず、ＹＡＣ２３ＣＢ１０、２８Ｃ
Ａ１２及び２６ＦＦ３のいずれかに含まれる遺伝子の疾
患対立遺伝子を識別しうるポリヌクレオチドと接触させ
ることによって便宜的に行われる。ポリヌクレオチドは
例えば前述した本発明の方法の如何なる態様の実施にも
選択される。
性又は後天性に拘わらず、ＹＡＣ２３ＣＢ１０、２８Ｃ
Ａ１２及び２６ＦＦ３のいずれかに含まれる遺伝子の疾
患対立遺伝子を識別しうるポリヌクレオチドと接触させ
ることによって便宜的に行われる。ポリヌクレオチドは
例えば前述した本発明の方法の如何なる態様の実施にも
選択される。
【００２５】ポリヌクレオチドは、遺伝子中に含まれる
遺伝子座の対立遺伝子を、例えばポリヌクレオチドプロ
ーブとして又は可能な伸長のためのプライマーとして識
別することができる。ポリヌクレオチドはＤＮＡ、ＲＮ
Ａ又は、ＤＮＡにハイブリッド化可能な他の種類であり
うる。ポリヌクレオチドは便利にはＤＮＡでありうる。
核酸は二本鎖又は一本鎖形のいずれでもよいが、便利に
は一本鎖形であり、例えばヒポキサンチンのような修飾
塩基又は例えば７−デアザグァニンのようなデグァニン
を含む。
遺伝子座の対立遺伝子を、例えばポリヌクレオチドプロ
ーブとして又は可能な伸長のためのプライマーとして識
別することができる。ポリヌクレオチドはＤＮＡ、ＲＮ
Ａ又は、ＤＮＡにハイブリッド化可能な他の種類であり
うる。ポリヌクレオチドは便利にはＤＮＡでありうる。
核酸は二本鎖又は一本鎖形のいずれでもよいが、便利に
は一本鎖形であり、例えばヒポキサンチンのような修飾
塩基又は例えば７−デアザグァニンのようなデグァニン
を含む。
【００２６】ポリヌクレオチドプローブはクローン化物
質の微生物学的リプロダクション又は直接合成によって
製造することができる。プローブはラベル又はマーカー
成分を含むことができ、便利には通常の方法で32Ｐ放射
能標識することができるが、代替え的に例えば35Ｓ又は
33Ｐ放射能標識プローブを形成するようにハイブリッド
化分野で周知の他の手段によって放射能標識することが
できる。ヌクレオチドはディ．シー．ウァード（Ｄ．
Ｃ．Ｗａｒｄ）等の方法［１９８１年３月１５−２０日
にコロラド州キーストーンで開催の「精製遺伝子を用い
た発生生物学に関する１９８１年ＩＣＮ−ＵＣＬＡシン
ポジウム」要約集、ＸＸIII巻、６４７−６５８頁、ア
カデミック プレス（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓ
ｓ）；編集者ドナルド ディ．ブラウン（Ｄｏｎａｌｄ
Ｄ．Ｂｒｏｗｎ）等］によって例えばビオチン等の種
のような非放射性種で標識する、又はエイ．ディ．ビ
ー．マルコム（Ａ．Ｄ．Ｂ．Ｍａｌｃｏｍ）等の方法
［６０４回生化学会会議、１９８３年７月１日、イング
ランド、ケンブリッチの要約集］によって酵素標識する
ことができる。他の特に便利な非同位体標識方法は我々
のヨーロッパ特許出願公開第０２０７７５８号に述べら
れている。
質の微生物学的リプロダクション又は直接合成によって
製造することができる。プローブはラベル又はマーカー
成分を含むことができ、便利には通常の方法で32Ｐ放射
能標識することができるが、代替え的に例えば35Ｓ又は
33Ｐ放射能標識プローブを形成するようにハイブリッド
化分野で周知の他の手段によって放射能標識することが
できる。ヌクレオチドはディ．シー．ウァード（Ｄ．
Ｃ．Ｗａｒｄ）等の方法［１９８１年３月１５−２０日
にコロラド州キーストーンで開催の「精製遺伝子を用い
た発生生物学に関する１９８１年ＩＣＮ−ＵＣＬＡシン
ポジウム」要約集、ＸＸIII巻、６４７−６５８頁、ア
カデミック プレス（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓ
ｓ）；編集者ドナルド ディ．ブラウン（Ｄｏｎａｌｄ
Ｄ．Ｂｒｏｗｎ）等］によって例えばビオチン等の種
のような非放射性種で標識する、又はエイ．ディ．ビ
ー．マルコム（Ａ．Ｄ．Ｂ．Ｍａｌｃｏｍ）等の方法
［６０４回生化学会会議、１９８３年７月１日、イング
ランド、ケンブリッチの要約集］によって酵素標識する
ことができる。他の特に便利な非同位体標識方法は我々
のヨーロッパ特許出願公開第０２０７７５８号に述べら
れている。
【００２７】ポリヌクレオチドプローブは適当な条件下
で遺伝子座の種々な対立遺伝子にハイブリッド化する。
適切なハイブリッド化条件は関係するヌクレオチド塩基
配列に依存するが、熟練者は例えば適当なルーチン実験
後に容易に決定される。従って、例えば、ポリヌクレオ
チド塩基配列は１個以上のアルツハイマー病対立遺伝子
を示す変異体ヌクレオチド塩基配列又は通常の対立遺伝
子を示すヌクレオチド塩基配列のいずれかに相補的であ
る。ドット ブロット ハイブリッド化（Ｄｏｔ Ｂｌ
ｏｔ ｈｙｂｒｉｄｉｓａｔｉｏｎ）はハイブリッド化
生成物の有無の便利な検出方法を提供する。
で遺伝子座の種々な対立遺伝子にハイブリッド化する。
適切なハイブリッド化条件は関係するヌクレオチド塩基
配列に依存するが、熟練者は例えば適当なルーチン実験
後に容易に決定される。従って、例えば、ポリヌクレオ
チド塩基配列は１個以上のアルツハイマー病対立遺伝子
を示す変異体ヌクレオチド塩基配列又は通常の対立遺伝
子を示すヌクレオチド塩基配列のいずれかに相補的であ
る。ドット ブロット ハイブリッド化（Ｄｏｔ Ｂｌ
ｏｔ ｈｙｂｒｉｄｉｓａｔｉｏｎ）はハイブリッド化
生成物の有無の便利な検出方法を提供する。
【００２８】上記のポリヌクレオチドプローブは本発明
の他の態様を提供する。これらのヌクレオチド配列は例
えば５０、４０、３０又は２０ヌクレオチドのような便
利な長さの配列であり、例えば少なくとも６、８、１
０、１２、１４、１５、１６又は１８ヌクレオチドを含
む。便宜的に、これらのヌクレオチド配列は１０−２
５、１５−２０、１７−１９又は１８ヌクレオチドを含
む。長いヌクレオチド配列は不安定なヌクレオチドの封
入を必要とすると考えられる。適当な配列はルーチン実
験によって決定することができる。
の他の態様を提供する。これらのヌクレオチド配列は例
えば５０、４０、３０又は２０ヌクレオチドのような便
利な長さの配列であり、例えば少なくとも６、８、１
０、１２、１４、１５、１６又は１８ヌクレオチドを含
む。便宜的に、これらのヌクレオチド配列は１０−２
５、１５−２０、１７−１９又は１８ヌクレオチドを含
む。長いヌクレオチド配列は不安定なヌクレオチドの封
入を必要とすると考えられる。適当な配列はルーチン実
験によって決定することができる。
【００２９】サンプルのゲノムＤＮＡを、プローブによ
るハイブリッド化の前に、例えば制限酵素のような酵素
を用いてフラグメント化することができる。次に、核酸
を分子量によって、便利には例えば個体サポート上での
ゲル電気泳動を用いて、分離することができる。次に、
プローブとのハイブリッド化を例えばサザン ブロット
ハイブリッド化を用いて実施する［イー．エム．サザ
ン（Ｅ．Ｍ．Ｓｏｕｔｈｅｒｎ）、ジェイ．モル．バイ
オル．（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．）、１９７５、９８、
５０３−５１７］。使用プローブが放射能標識されてい
る場合には、オートラジオグラフィーが便利な検出方法
である。或いは、便利な非放射性検出系を用いることが
できる。
るハイブリッド化の前に、例えば制限酵素のような酵素
を用いてフラグメント化することができる。次に、核酸
を分子量によって、便利には例えば個体サポート上での
ゲル電気泳動を用いて、分離することができる。次に、
プローブとのハイブリッド化を例えばサザン ブロット
ハイブリッド化を用いて実施する［イー．エム．サザ
ン（Ｅ．Ｍ．Ｓｏｕｔｈｅｒｎ）、ジェイ．モル．バイ
オル．（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．）、１９７５、９８、
５０３−５１７］。使用プローブが放射能標識されてい
る場合には、オートラジオグラフィーが便利な検出方法
である。或いは、便利な非放射性検出系を用いることが
できる。
【００３０】必要な場合には、サンプルのゲノムＤＮＡ
を増幅することができる。ＤＮＡ又はＲＮＡ鋳型での核
酸プライマーの伸長は関連ＤＮＡのヌクレオチド配列に
相補的なヌクレオチド配列を含む伸長生成物を形成す
る。便利な増幅方法には、ケイ．クレッペ（Ｋ．Ｋｌｅ
ｐｐｅ）等によりジェイ．モル．バイオル．１９７１、
５６、３４１−３６１及び米国特許第４６８３１９５号
と第４６８３２０２号に開示されているようなポリメラ
ーゼ仲介連鎖反応がある、又はＰＣＴ特許出願公開第Ｗ
Ｏ−８７／０６２７０号及びバイオテクノロジー（Ｂｉ
ｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、６巻、１９８８年１０月に
述べられているＱ−β レプリカーゼを用いることがで
きる。さらに、ＰＣＴ特許出願公開第ＷＯ−８８／１０
３１５号［シスカ コーポレーション（Ｓｉｓｋａ Ｃ
ｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）に述べられている転写に基づく
核酸増幅を用いることができる。他の増幅方法には、熱
安定性ＤＮＡリガーゼの使用がある。或いは、例えばポ
リメラーゼ連鎖反応によって得られるような指数関数的
増幅とは対照的な線状増幅が使用可能である。線状増幅
では、ポリヌクレオチドプライマーをサンプルＤＮＡ鋳
型にアニールさせ、適当な条件下で、プライマーを必要
なだけ伸長させ、次に伸長生成物を鋳型から取り出す。
プライマー アニーリング、伸長及び分離の上記方法を
必要な回数繰り返す。プライマー伸長は常にサンプルＤ
ＮＡ鋳型で生ずるので、不正確なコピーが形成される可
能性が減ずることは理解されよう。線状増幅に関して必
要なサイクル数は一般に指数関数的増幅に関するサイク
ル数よりも多い。一般に、プライマーは少なくとも７ヌ
クレオチドを含み、例えば少なくとも１０、１５もしく
は２０ヌクレオチド、例えば１５−４０もしくは２０−
３０ヌクレオチドを含む。プライマーの最大長さは決定
的であるとは考えられず、実際の考察によってのみ限定
される。
を増幅することができる。ＤＮＡ又はＲＮＡ鋳型での核
酸プライマーの伸長は関連ＤＮＡのヌクレオチド配列に
相補的なヌクレオチド配列を含む伸長生成物を形成す
る。便利な増幅方法には、ケイ．クレッペ（Ｋ．Ｋｌｅ
ｐｐｅ）等によりジェイ．モル．バイオル．１９７１、
５６、３４１−３６１及び米国特許第４６８３１９５号
と第４６８３２０２号に開示されているようなポリメラ
ーゼ仲介連鎖反応がある、又はＰＣＴ特許出願公開第Ｗ
Ｏ−８７／０６２７０号及びバイオテクノロジー（Ｂｉ
ｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、６巻、１９８８年１０月に
述べられているＱ−β レプリカーゼを用いることがで
きる。さらに、ＰＣＴ特許出願公開第ＷＯ−８８／１０
３１５号［シスカ コーポレーション（Ｓｉｓｋａ Ｃ
ｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）に述べられている転写に基づく
核酸増幅を用いることができる。他の増幅方法には、熱
安定性ＤＮＡリガーゼの使用がある。或いは、例えばポ
リメラーゼ連鎖反応によって得られるような指数関数的
増幅とは対照的な線状増幅が使用可能である。線状増幅
では、ポリヌクレオチドプライマーをサンプルＤＮＡ鋳
型にアニールさせ、適当な条件下で、プライマーを必要
なだけ伸長させ、次に伸長生成物を鋳型から取り出す。
プライマー アニーリング、伸長及び分離の上記方法を
必要な回数繰り返す。プライマー伸長は常にサンプルＤ
ＮＡ鋳型で生ずるので、不正確なコピーが形成される可
能性が減ずることは理解されよう。線状増幅に関して必
要なサイクル数は一般に指数関数的増幅に関するサイク
ル数よりも多い。一般に、プライマーは少なくとも７ヌ
クレオチドを含み、例えば少なくとも１０、１５もしく
は２０ヌクレオチド、例えば１５−４０もしくは２０−
３０ヌクレオチドを含む。プライマーの最大長さは決定
的であるとは考えられず、実際の考察によってのみ限定
される。
【００３１】前述したように、ポリヌクレオチドは可能
な伸長のためのプライマーとして作用する場合に遺伝子
座の対立遺伝子を認識することができる。適当なプライ
マーは上述のサンプルＤＮＡ増幅と同様に製造される。
な伸長のためのプライマーとして作用する場合に遺伝子
座の対立遺伝子を認識することができる。適当なプライ
マーは上述のサンプルＤＮＡ増幅と同様に製造される。
【００３２】遺伝子座の対立遺伝子はニュートン（Ｎｅ
ｗｔｏｎ）等がニュークレイックアシドス リサーチ
（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）、
１７、７、１９８９、２５０３−２５１６頁に述べ、我
々のヨーロッパ特許出願公開第０３３２４３５号で特許
請求されているような、増幅困難な突然変異系（ＡＲＭ
Ｓ）によって便利に検出される。ＡＲＭＳは診断領域に
対して実質的に相補的な診断プライマーを用いるので、
適当な条件下で正常もしくは変異ヌクレオチドである末
端ヌクレオチドのアイデンティティを伸長生成物の形成
又は非形成に関して検出することができる。「診断部分
（ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ ｐｏｒｔｉｏｎ）」なる表現
は、その末端ヌクレオチドとして、その有無を検出すべ
き可能な変異ヌクレオチドを含む標的塩基配列を意味す
る。
ｗｔｏｎ）等がニュークレイックアシドス リサーチ
（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）、
１７、７、１９８９、２５０３−２５１６頁に述べ、我
々のヨーロッパ特許出願公開第０３３２４３５号で特許
請求されているような、増幅困難な突然変異系（ＡＲＭ
Ｓ）によって便利に検出される。ＡＲＭＳは診断領域に
対して実質的に相補的な診断プライマーを用いるので、
適当な条件下で正常もしくは変異ヌクレオチドである末
端ヌクレオチドのアイデンティティを伸長生成物の形成
又は非形成に関して検出することができる。「診断部分
（ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ ｐｏｒｔｉｏｎ）」なる表現
は、その末端ヌクレオチドとして、その有無を検出すべ
き可能な変異ヌクレオチドを含む標的塩基配列を意味す
る。
【００３３】伸長プライマーは適当なプライマーを用い
て検出されるだけでなく、プローブの使用を必要としな
い直接方法によっても検出され、例えば一定サイズの生
成物は直接目視化することができる、又は目視化による
検出の前に最初に例えばゲル電気泳動を用いて、生成物
を分子量によって分離することができる。
て検出されるだけでなく、プローブの使用を必要としな
い直接方法によっても検出され、例えば一定サイズの生
成物は直接目視化することができる、又は目視化による
検出の前に最初に例えばゲル電気泳動を用いて、生成物
を分子量によって分離することができる。
【００３４】本発明の適当な態様では、診断プライマー
を用いることができる。さらに、各診断プライマーに対
応する増幅プライマーを形成するのが好ましく、増幅プ
ライマーのヌクレオチド配列は対応診断プライマーの伸
長生成物が、その補体からの分離後に、増幅プライマー
の伸長生成物の合成の鋳型として役立つような配列であ
る。
を用いることができる。さらに、各診断プライマーに対
応する増幅プライマーを形成するのが好ましく、増幅プ
ライマーのヌクレオチド配列は対応診断プライマーの伸
長生成物が、その補体からの分離後に、増幅プライマー
の伸長生成物の合成の鋳型として役立つような配列であ
る。
【００３５】上記で製造した伸長生成物は次に、サンプ
ルＤＮＡ増幅に関して上述した方法のような便利な方法
を用いて増幅することができる。
ルＤＮＡ増幅に関して上述した方法のような便利な方法
を用いて増幅することができる。
【００３６】異なる遺伝子座を同時に又は連続的に検出
することができることは理解されよう。適当なプローブ
及び／又はプライマーは各被分析遺伝子座に関して用い
られる。例えば、多重ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）
を同一反応器内で実施することができる。遺伝子の全て
のコーディング領域又はキー コーディング領域に広が
るプライマーが使用可能である。デューシェーヌ筋ジス
トロフィーに関連した、このような突然変異検出方法の
利用例は公知である［ジェイ．エス．チャンバーライン
（Ｊ．Ｓ．Ｃｈａｍｂｅｒｌａｉｎ）等、１９８８、ヌ
クル．アシドス．レス．（Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅ
ｓ．）、１６、１１１４１−１１１５６］。増幅生成物
中の突然変異は例えば、特にゲル電気泳動分離後の生成
物のパターン、配列又は強度を観察することによって検
出することができる。例えばＤＮＡ又はＲＮＡのような
便利な核酸鋳型で増幅が実施される。
することができることは理解されよう。適当なプローブ
及び／又はプライマーは各被分析遺伝子座に関して用い
られる。例えば、多重ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）
を同一反応器内で実施することができる。遺伝子の全て
のコーディング領域又はキー コーディング領域に広が
るプライマーが使用可能である。デューシェーヌ筋ジス
トロフィーに関連した、このような突然変異検出方法の
利用例は公知である［ジェイ．エス．チャンバーライン
（Ｊ．Ｓ．Ｃｈａｍｂｅｒｌａｉｎ）等、１９８８、ヌ
クル．アシドス．レス．（Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅ
ｓ．）、１６、１１１４１−１１１５６］。増幅生成物
中の突然変異は例えば、特にゲル電気泳動分離後の生成
物のパターン、配列又は強度を観察することによって検
出することができる。例えばＤＮＡ又はＲＮＡのような
便利な核酸鋳型で増幅が実施される。
【００３７】便利には、ニュートン等がニュークレイッ
ク アシドス リサーチ（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ
Ｒｅｓｅａｒｃｈ）、１７、７、１９８９、２５０３
−２５１６頁に述べ、我々のヨーロッパ特許出願公開第
０３３２４３５号で特許請求されているような、増幅困
難な突然変異系（ＡＲＭＳ）を問題の各遺伝子座の対立
遺伝子の識別に用いることができる。
ク アシドス リサーチ（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ
Ｒｅｓｅａｒｃｈ）、１７、７、１９８９、２５０３
−２５１６頁に述べ、我々のヨーロッパ特許出願公開第
０３３２４３５号で特許請求されているような、増幅困
難な突然変異系（ＡＲＭＳ）を問題の各遺伝子座の対立
遺伝子の識別に用いることができる。
【００３８】本発明のポリヌクレオチドプローブ又は診
断プライマーは適当な説明書及び／又は挿入物と共に、
便利には供試もしくは対照ＤＮＡと共にキットとして供
給することができる。これらは本発明の他の態様を構成
する。
断プライマーは適当な説明書及び／又は挿入物と共に、
便利には供試もしくは対照ＤＮＡと共にキットとして供
給することができる。これらは本発明の他の態様を構成
する。
【００３９】診断プライマーに関して、このキットは４
種のデオキシヌクレオシドトリホスフェートの各々；及
びデオキシヌクレオシドトリホスフェートの重合剤と共
に標的ゲノムＤＮＡ配列の各診断部分に対する診断プラ
イマーを含む。本発明のキットは好ましくはさらに、各
診断プライマーに対応する増幅プライマーを含み、増幅
プライマーのヌクレオチド配列は対応診断プライマーの
伸長生成物が、その補体からの分離後に、増幅プライマ
ーの伸長生成物合成の鋳型として役立つような配列であ
る。上記で詳述した物質の各々及び／又は増幅プライマ
ーは便宜的に別の容器に包装されるが、好ましくは全て
を単一容器内で一緒にして、これに被分析物質を加える
ことができる。この単一容器がさらにバッファーを含む
ことが有利である。
種のデオキシヌクレオシドトリホスフェートの各々；及
びデオキシヌクレオシドトリホスフェートの重合剤と共
に標的ゲノムＤＮＡ配列の各診断部分に対する診断プラ
イマーを含む。本発明のキットは好ましくはさらに、各
診断プライマーに対応する増幅プライマーを含み、増幅
プライマーのヌクレオチド配列は対応診断プライマーの
伸長生成物が、その補体からの分離後に、増幅プライマ
ーの伸長生成物合成の鋳型として役立つような配列であ
る。上記で詳述した物質の各々及び／又は増幅プライマ
ーは便宜的に別の容器に包装されるが、好ましくは全て
を単一容器内で一緒にして、これに被分析物質を加える
ことができる。この単一容器がさらにバッファーを含む
ことが有利である。
【００４０】或いは、遺伝子座の対立遺伝子は例えばＰ
ＣＲ生成物の直接ヌクレオチド配列決定によって検出す
ることができる。前述したように、ヌクレオチド配列決
定を実施するための方法と材料は通常に熟練した分子生
物学者に直ちに明らかであり、例えば、ニュートン等の
ニュークレイック アシドス リサーチ、１６、８２３
３−８２４３頁、１９８８及びヒグチ（Ｈｉｇｕｔｉ）
等のネイチャー、１９８８、３３２、５４３−５４６頁
に述べられている方法と同様な方法が用いられる。
ＣＲ生成物の直接ヌクレオチド配列決定によって検出す
ることができる。前述したように、ヌクレオチド配列決
定を実施するための方法と材料は通常に熟練した分子生
物学者に直ちに明らかであり、例えば、ニュートン等の
ニュークレイック アシドス リサーチ、１６、８２３
３−８２４３頁、１９８８及びヒグチ（Ｈｉｇｕｔｉ）
等のネイチャー、１９８８、３３２、５４３−５４６頁
に述べられている方法と同様な方法が用いられる。
【００４１】上述したように、本発明の１つの重要な用
途は、今までに確認されていない遺伝子型、例えば遺伝
病もしくは障害のような表現型の原因となる遺伝子欠陥
の確認、又は或る表現型、例えば疾患の原因となるもし
くはこのような表現型の素因である遺伝性欠陥の確認で
ある。
途は、今までに確認されていない遺伝子型、例えば遺伝
病もしくは障害のような表現型の原因となる遺伝子欠陥
の確認、又は或る表現型、例えば疾患の原因となるもし
くはこのような表現型の素因である遺伝性欠陥の確認で
ある。
【００４２】従って、例えば遺伝病もしくは障害のよう
な表現型に関して、本発明の方法は遺伝子型（例えば、
遺伝性欠陥）を含まない核酸及び遺伝子型（例えば、被
検遺伝性欠陥）を含む核酸に適用することができ、遺伝
子型（例えば、被検遺伝性欠陥）の確認は２種類の核酸
サンプルの塩基配列の決定によって得られる情報の比較
によって行われる。このような比較は、例えば塩基配列
決定用ゲル（ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｇｅｌ）の比較に
よって、便利には自動スキャンニングによって行うこと
ができる。これに関して、標的核酸サンプル間の差異の
検出及び確認を可能にするために充分なデータが得られ
るならば、特定の塩基配列自体を決定する必要がないこ
とは理解されよう、従って、「塩基配列決定（ｓｅｑｕ
ｅｎｃｉｎｇ）」及び「塩基配列決定した（ｓｅｑｕｅ
ｎｃｅｄ）」なる用語は特定のヌクレオチド配列決定の
みを含むのではなく、特定のヌクレオチド配列決定をし
ない塩基配列の差異の検出及び確認をも含むものとして
ここでは用いる。例えば被検遺伝病又は障害の絶対的な
ヘテロ接合体の標的核酸に本発明の方法を適用すること
が便利である。このような個体には必然的に問題の遺伝
子座の正常と突然変異との両方の遺伝子型が存在し、２
種以上の単一ヌクレオチドが塩基配列決定時に存在する
ような、本発明の方法を用いて確認される部位が突然変
異をもたらす例えば疾患もしくは障害のような表現型に
なると思われる。
な表現型に関して、本発明の方法は遺伝子型（例えば、
遺伝性欠陥）を含まない核酸及び遺伝子型（例えば、被
検遺伝性欠陥）を含む核酸に適用することができ、遺伝
子型（例えば、被検遺伝性欠陥）の確認は２種類の核酸
サンプルの塩基配列の決定によって得られる情報の比較
によって行われる。このような比較は、例えば塩基配列
決定用ゲル（ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｇｅｌ）の比較に
よって、便利には自動スキャンニングによって行うこと
ができる。これに関して、標的核酸サンプル間の差異の
検出及び確認を可能にするために充分なデータが得られ
るならば、特定の塩基配列自体を決定する必要がないこ
とは理解されよう、従って、「塩基配列決定（ｓｅｑｕ
ｅｎｃｉｎｇ）」及び「塩基配列決定した（ｓｅｑｕｅ
ｎｃｅｄ）」なる用語は特定のヌクレオチド配列決定の
みを含むのではなく、特定のヌクレオチド配列決定をし
ない塩基配列の差異の検出及び確認をも含むものとして
ここでは用いる。例えば被検遺伝病又は障害の絶対的な
ヘテロ接合体の標的核酸に本発明の方法を適用すること
が便利である。このような個体には必然的に問題の遺伝
子座の正常と突然変異との両方の遺伝子型が存在し、２
種以上の単一ヌクレオチドが塩基配列決定時に存在する
ような、本発明の方法を用いて確認される部位が突然変
異をもたらす例えば疾患もしくは障害のような表現型に
なると思われる。
【００４３】さらに、遺伝子型、例えば遺伝性欠陥を含
む核酸がヘテロ二本鎖分子の分析によって検出されるこ
とは理解されよう。例えば、好ましくは増幅と次の分析
との後にヘテロ二本鎖分子を形成することによって、好
ましく調和したヘテロ二本鎖分子から不調和分子を識別
する方法によって遺伝性変化を検出することができる。
このような方法には、例えばエム．マイヤー（Ｍ．Ｍｙ
ｅｒ）等、１９８５、サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）、
２３０、１２４２によって述べられている例えばＲＮＡ
ｓｅ−Ａのような酵素の使用；例えばヒドロキシルアミ
ンもしくは四酸化オスミウムの使用によるような不調和
の化学的認識［エイ．ジェイ．モンタニロン（Ｍ．Ｊ．
Ｍｏｎｔａｎｉｌｏｎ）等、１９８９、ヌクル．アシド
ス．レス．１７、３３４７−３３５８］又は変性グラジ
エント（ｄｅｎａｔｕｒｉｎｇｇｒａｄｉｅｎｔ）ゲル
電気泳動の使用によるような物理的性質の変化の検出
［アール．エム．マイヤー等、１９８５、ヌクル．アシ
ドス．レス．、１３、３１３１］がある。これらの方法
は、予備知識なしに又は特定の塩基配列決定なしに、塩
基配列の差異が検出されるような補助手段を提供する。
む核酸がヘテロ二本鎖分子の分析によって検出されるこ
とは理解されよう。例えば、好ましくは増幅と次の分析
との後にヘテロ二本鎖分子を形成することによって、好
ましく調和したヘテロ二本鎖分子から不調和分子を識別
する方法によって遺伝性変化を検出することができる。
このような方法には、例えばエム．マイヤー（Ｍ．Ｍｙ
ｅｒ）等、１９８５、サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）、
２３０、１２４２によって述べられている例えばＲＮＡ
ｓｅ−Ａのような酵素の使用；例えばヒドロキシルアミ
ンもしくは四酸化オスミウムの使用によるような不調和
の化学的認識［エイ．ジェイ．モンタニロン（Ｍ．Ｊ．
Ｍｏｎｔａｎｉｌｏｎ）等、１９８９、ヌクル．アシド
ス．レス．１７、３３４７−３３５８］又は変性グラジ
エント（ｄｅｎａｔｕｒｉｎｇｇｒａｄｉｅｎｔ）ゲル
電気泳動の使用によるような物理的性質の変化の検出
［アール．エム．マイヤー等、１９８５、ヌクル．アシ
ドス．レス．、１３、３１３１］がある。これらの方法
は、予備知識なしに又は特定の塩基配列決定なしに、塩
基配列の差異が検出されるような補助手段を提供する。
【００４４】上記の他に、或る種の遺伝子型例えば遺伝
子欠陥が、局部的もしくは全身的のいずれであっても、
個体に表現型への素因を与えると考えられる。例えば、
このような遺伝子欠陥が確認される場合には、このよう
な「リスク」と定義された患者を監視して、疾患の発現
又は進行を早期に治療することができる。このような素
因性（ｐｒｅｄｉｓｐｏｓｉｎｇ）遺伝子型の確認に本
発明の方法を適用可能である。異なる患者及び細胞種類
の分類間の塩基配列の差異の比較によって、素因性遺伝
子型の存在又は遺伝子型／表現型の相関関係を確認する
ことができる。罹患した個体及び罹患しない個体からの
アルツハイマー病遺伝子のヌクレオチド配列の比較はア
ルツハイマー病の原因となる種々の突然変異の全ての特
性化を可能にする。
子欠陥が、局部的もしくは全身的のいずれであっても、
個体に表現型への素因を与えると考えられる。例えば、
このような遺伝子欠陥が確認される場合には、このよう
な「リスク」と定義された患者を監視して、疾患の発現
又は進行を早期に治療することができる。このような素
因性（ｐｒｅｄｉｓｐｏｓｉｎｇ）遺伝子型の確認に本
発明の方法を適用可能である。異なる患者及び細胞種類
の分類間の塩基配列の差異の比較によって、素因性遺伝
子型の存在又は遺伝子型／表現型の相関関係を確認する
ことができる。罹患した個体及び罹患しない個体からの
アルツハイマー病遺伝子のヌクレオチド配列の比較はア
ルツハイマー病の原因となる種々の突然変異の全ての特
性化を可能にする。
【００４５】本発明の他の態様は、例えば遺伝性又は後
天性疾患対立遺伝子の検出への例えばハイブリッド化プ
ローブとしての本発明の酵母人工染色体の使用を含む。
選択したＹＡＣヌクレオチド配列からの反復配列の除去
によってプローブを形成することができる。反復配列の
除去は便利には、例えば過剰なヒトＤＮＡの存在下での
再結合によって実施される［シーレイ（Ｓｅａｌｅｙ）
等、ニュークレイックアシドス リサーチ、１９８５、
１３、１９０５−１９２２］。従って、例えばＹＡＣに
含まれるヌクレオチド配列をハイブリッド化プローブと
して用いて、例えばゲルから製造されたサザン ブロッ
ト上で、ＤＮＡサンプル中の遺伝性又は後天性疾患対立
遺伝子を検出することができる。
天性疾患対立遺伝子の検出への例えばハイブリッド化プ
ローブとしての本発明の酵母人工染色体の使用を含む。
選択したＹＡＣヌクレオチド配列からの反復配列の除去
によってプローブを形成することができる。反復配列の
除去は便利には、例えば過剰なヒトＤＮＡの存在下での
再結合によって実施される［シーレイ（Ｓｅａｌｅｙ）
等、ニュークレイックアシドス リサーチ、１９８５、
１３、１９０５−１９２２］。従って、例えばＹＡＣに
含まれるヌクレオチド配列をハイブリッド化プローブと
して用いて、例えばゲルから製造されたサザン ブロッ
ト上で、ＤＮＡサンプル中の遺伝性又は後天性疾患対立
遺伝子を検出することができる。
【００４６】それ故、本発明の他の態様によると、ハイ
ブリッド化プローブとして使用するためにＹＡＣ ２３
ＣＢ１０、２８ＣＡ１２及び２６ＦＦ３のいずれかに含
まれる少なくとも１キロベース、３キロベース、５キロ
ベース、７キロベース、特に１０キロベース、５０キロ
ベース、１００キロベース、２００キロベース、２５０
キロベース、３００キロベース、３５０キロベース、４
００キロベース又は４２５キロベースまでのヌクレオチ
ド配列を提供する。このプローブは便利には、前述した
ような制限酵素又はその都合のよい組合せによって製造
される。ヌクレオチド配列は、ハイブリッド化プローブ
として用いる場合に、任意のラベル又はマーカー成分を
含むことができる。
ブリッド化プローブとして使用するためにＹＡＣ ２３
ＣＢ１０、２８ＣＡ１２及び２６ＦＦ３のいずれかに含
まれる少なくとも１キロベース、３キロベース、５キロ
ベース、７キロベース、特に１０キロベース、５０キロ
ベース、１００キロベース、２００キロベース、２５０
キロベース、３００キロベース、３５０キロベース、４
００キロベース又は４２５キロベースまでのヌクレオチ
ド配列を提供する。このプローブは便利には、前述した
ような制限酵素又はその都合のよい組合せによって製造
される。ヌクレオチド配列は、ハイブリッド化プローブ
として用いる場合に、任意のラベル又はマーカー成分を
含むことができる。
【００４７】診断的及び治療的に重要な領域を確認する
ための本発明のＹＡＣの特性化は下記方法の都合のよい
組合せのいずれかによって実施することができる。
ための本発明のＹＡＣの特性化は下記方法の都合のよい
組合せのいずれかによって実施することができる。
【００４８】重要なアプローチは我々のヨーロッパ特許
出願第３５６０２１号（参考文献としてここに関係）に
述べられている発明を用いて、本発明のＹＡＣ ２３Ｃ
Ｂ１０、２８ＣＡ１２及び２６ＦＦ３のいずれかのヌク
レオチド配列を特性化することである。ヨーロッパ特許
出願第３５６０２１号で特許請求する発明を以下では化
学遺伝学と呼ぶことにするが、これはヌクレオチド配列
の増幅方法に関する。このような方法は一部のみが知ら
れた塩基配列の増幅に関して特に重要であり、長いヌク
レオチド配列の迅速でかつ効果的な配列決定を可能にす
る。この方法は未知ヌクレオチド配列の決定のために今
まで必要であった組み換えＤＮＡクローニング方法を避
けることができる。このようにすることによって、この
方法は遺伝子座の種々の対立遺伝子のヌクレオチド配列
の多形性の検出を可能にし、異なる個体の特定遺伝子座
における対立遺伝子の同時分析を可能にする。「染色体
歩行」の先行技術方法は、遺伝性障害のマーカーの発見
からこの障害の原因である特定の遺伝子異常（ｇｅｎｅ
ｔｉｃ ｌｅｓｉｏｎ）の発見までに要する時間によっ
て例証されるような多くの可能な困難を含む。従って、
例えば、ハンティングトン舞踏病（Ｄ４Ｓ１０）の結合
遺伝子マーカーは１９８３年に発見されたが、この障害
の原因となる特定の遺伝子異常は今日でもまだ不明であ
る。同様な考察が他の多くの疾患にも該当する。「染色
体歩行」方法はゲノムＤＮＡのクローニングが必要条件
であるという欠点を有する。多くの状況下で、クローニ
ングは不可能又は少なくとも非常に困難であると実証さ
れており、このような状況下で「染色体歩行」は早期に
終了することになる；エイ．アール．ウイマン（Ａ．
Ｒ．Ｗｙｍａｎ）とケイ．エフ．ヴェルトマン（Ｋ．
Ｆ．Ｗｅｒｔｍａｎ）のメソドス イン エンザイモロ
ジー（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇ
ｙ）、１５２巻、エス．エヅ．バージャー（Ｓ．Ｌ．Ｂ
ｅｒｇｅｒ）とエイ．アール．クメル（Ａ．Ｒ．Ｋｕｍ
ｍｅｌ）編集、アカデミック プレス、サンジエゴ、１
９８７、１７３−１８０。さらに、オーバーラップクロ
ーンを表すとみなされるフラグメントの分析は、特にゲ
ノムライブラリーのいずれかのスクリーニングに存在す
るこのようなフラグメントの数と、 オーバーラップ配
列が５’又は３’の意味で存在するという事実とを考慮
すると複雑である。
出願第３５６０２１号（参考文献としてここに関係）に
述べられている発明を用いて、本発明のＹＡＣ ２３Ｃ
Ｂ１０、２８ＣＡ１２及び２６ＦＦ３のいずれかのヌク
レオチド配列を特性化することである。ヨーロッパ特許
出願第３５６０２１号で特許請求する発明を以下では化
学遺伝学と呼ぶことにするが、これはヌクレオチド配列
の増幅方法に関する。このような方法は一部のみが知ら
れた塩基配列の増幅に関して特に重要であり、長いヌク
レオチド配列の迅速でかつ効果的な配列決定を可能にす
る。この方法は未知ヌクレオチド配列の決定のために今
まで必要であった組み換えＤＮＡクローニング方法を避
けることができる。このようにすることによって、この
方法は遺伝子座の種々の対立遺伝子のヌクレオチド配列
の多形性の検出を可能にし、異なる個体の特定遺伝子座
における対立遺伝子の同時分析を可能にする。「染色体
歩行」の先行技術方法は、遺伝性障害のマーカーの発見
からこの障害の原因である特定の遺伝子異常（ｇｅｎｅ
ｔｉｃ ｌｅｓｉｏｎ）の発見までに要する時間によっ
て例証されるような多くの可能な困難を含む。従って、
例えば、ハンティングトン舞踏病（Ｄ４Ｓ１０）の結合
遺伝子マーカーは１９８３年に発見されたが、この障害
の原因となる特定の遺伝子異常は今日でもまだ不明であ
る。同様な考察が他の多くの疾患にも該当する。「染色
体歩行」方法はゲノムＤＮＡのクローニングが必要条件
であるという欠点を有する。多くの状況下で、クローニ
ングは不可能又は少なくとも非常に困難であると実証さ
れており、このような状況下で「染色体歩行」は早期に
終了することになる；エイ．アール．ウイマン（Ａ．
Ｒ．Ｗｙｍａｎ）とケイ．エフ．ヴェルトマン（Ｋ．
Ｆ．Ｗｅｒｔｍａｎ）のメソドス イン エンザイモロ
ジー（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇ
ｙ）、１５２巻、エス．エヅ．バージャー（Ｓ．Ｌ．Ｂ
ｅｒｇｅｒ）とエイ．アール．クメル（Ａ．Ｒ．Ｋｕｍ
ｍｅｌ）編集、アカデミック プレス、サンジエゴ、１
９８７、１７３−１８０。さらに、オーバーラップクロ
ーンを表すとみなされるフラグメントの分析は、特にゲ
ノムライブラリーのいずれかのスクリーニングに存在す
るこのようなフラグメントの数と、 オーバーラップ配
列が５’又は３’の意味で存在するという事実とを考慮
すると複雑である。
【００４９】化学的遺伝学は未知塩基配列を含む核酸フ
ラグメントのプライマー伸長による増幅方法を提供す
る、この方法は、標的核酸を開裂して標的核酸フラグメ
ントを得る工程、前記フラグメントの一つは開始プライ
マーとハイブリッド化する既知ヌクレオチド配列の開始
プライミング（ｐｒｉｍｉｎｇ）領域を含む；標的核酸
フラグメントからベクトレットプライマーとハイブリッ
ド化する既知配列のベクトレットプライミング領域を有
する各単位の結合によって標的核酸フラグメント／ベク
トレット単位を製造する工程、及び標的核酸フラグメン
ト／ベクトレット単位を適当な（デオキシ）ヌクレオシ
ドトリホスフェートとヌクレオシドトリホスフェートの
重合剤とによってハイブリッド化条件下で、一緒に又は
連続的に処理する工程を含み、開始プライマーの伸長生
成物は開始プライミング領域に実質的に相補的であるよ
うに選択された開始プライマーがハイブリッド化する開
始プライミング領域を有する一本鎖標的核酸／ベクトレ
ット単位に相補的であるように合成されるが、このよう
な開始プライミング領域を有さない一本鎖標的核酸／ベ
クトレット単位に相補的なこのような伸長生成物は合成
されない。
ラグメントのプライマー伸長による増幅方法を提供す
る、この方法は、標的核酸を開裂して標的核酸フラグメ
ントを得る工程、前記フラグメントの一つは開始プライ
マーとハイブリッド化する既知ヌクレオチド配列の開始
プライミング（ｐｒｉｍｉｎｇ）領域を含む；標的核酸
フラグメントからベクトレットプライマーとハイブリッ
ド化する既知配列のベクトレットプライミング領域を有
する各単位の結合によって標的核酸フラグメント／ベク
トレット単位を製造する工程、及び標的核酸フラグメン
ト／ベクトレット単位を適当な（デオキシ）ヌクレオシ
ドトリホスフェートとヌクレオシドトリホスフェートの
重合剤とによってハイブリッド化条件下で、一緒に又は
連続的に処理する工程を含み、開始プライマーの伸長生
成物は開始プライミング領域に実質的に相補的であるよ
うに選択された開始プライマーがハイブリッド化する開
始プライミング領域を有する一本鎖標的核酸／ベクトレ
ット単位に相補的であるように合成されるが、このよう
な開始プライミング領域を有さない一本鎖標的核酸／ベ
クトレット単位に相補的なこのような伸長生成物は合成
されない。
【００５０】望ましい場合には、前記伸長生成物に対し
てベクトレットプライミング領域に対して実質的に相補
的であるように選択されるベクトレットプライマーの存
在下での増幅を実施することができる。標的核酸フラグ
メント／ベクトレット単位を開始プライマーで処理し、
開始プライマー伸長生成物を増幅すべき場合には、例え
ばアール．ケイ．サイキ（Ｒ．Ｋ．Ｓａｉｋｉ）等がサ
イエンス、２３９、４８７−４９１に述べているよう
に、ベクトレットプライマーによってさらに処理する。
ベクトレットプライマーを用いない場合には、開始プラ
イミング領域への開始プライマーのハイブリッド化、次
にハイブリッド条件下、適当な（デオキシ）ヌクレオシ
ドトリホスフェートとヌクレオシドトリホスフェートの
重合剤との存在下でのプライマー伸長と変性によって算
術的又は線状増幅（以下では、線状増幅と呼ぶ）が実施
される。プライミング、プライマー伸長及び変性から成
るこの方法を適当なだけ数回繰り返して、好ましいレベ
ルの増幅を達成することができる。しかし、好ましく
は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）方法を用いて、開
始プライマーとベクトレットプライマーとの両方の存在
下で実施する。化学的遺伝学の増幅生成物を次にさらに
特性化するために配列決定することができる。
てベクトレットプライミング領域に対して実質的に相補
的であるように選択されるベクトレットプライマーの存
在下での増幅を実施することができる。標的核酸フラグ
メント／ベクトレット単位を開始プライマーで処理し、
開始プライマー伸長生成物を増幅すべき場合には、例え
ばアール．ケイ．サイキ（Ｒ．Ｋ．Ｓａｉｋｉ）等がサ
イエンス、２３９、４８７−４９１に述べているよう
に、ベクトレットプライマーによってさらに処理する。
ベクトレットプライマーを用いない場合には、開始プラ
イミング領域への開始プライマーのハイブリッド化、次
にハイブリッド条件下、適当な（デオキシ）ヌクレオシ
ドトリホスフェートとヌクレオシドトリホスフェートの
重合剤との存在下でのプライマー伸長と変性によって算
術的又は線状増幅（以下では、線状増幅と呼ぶ）が実施
される。プライミング、プライマー伸長及び変性から成
るこの方法を適当なだけ数回繰り返して、好ましいレベ
ルの増幅を達成することができる。しかし、好ましく
は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）方法を用いて、開
始プライマーとベクトレットプライマーとの両方の存在
下で実施する。化学的遺伝学の増幅生成物を次にさらに
特性化するために配列決定することができる。
【００５１】化学的遺伝学方法を用いて、ＹＡＣ ２３
ＣＢ１０、２８ＣＡ１２及び２６ＦＦ３の端部から配列
情報を我々は既に得ている。関連する配列情報は下記表
１と２に記載する。
ＣＢ１０、２８ＣＡ１２及び２６ＦＦ３の端部から配列
情報を我々は既に得ている。関連する配列情報は下記表
１と２に記載する。
【００５２】本発明の酵母人工染色体を用いてコスミ
ド、ファージ又はプラスミドＤＮＡライブラリーを製造
することもできる。例えば、便利には低融点アガロース
ゲルから精製された、ゲル精製ＹＡＣ ２３ＣＢ１０、
２８ＣＡ１２又は２６ＦＦ３を例えば６ｂｐ認識配列制
限酵素によって制限して、適当なサイズのＤＮＡフラグ
メントを得て、次にこれをプラスミド、コスミド又はバ
クテリオファージベクターにクローン化して、ＹＡＣか
らのＤＮＡに相当するクローンを得ることができる。こ
れらのクローンを次にそれ自体公知の方法を用いて塩基
配列決定して、ＹＡＣ内に付加的情報を与えることがで
きる。或いは、ＹＡＣ ２３ＣＢ１０、２８ＣＡ１２又
は２６ＦＦ３のいずれかをサブクローン化し、ＹＡＣサ
ブクローンを例えばＡｌｕ又は精製ＹＡＣ ＤＮＡのよ
うな分散ヒト反復物（ｄｉｓｐｅｒｓｅｄ ｈｕｍａｎ
ｒｅｐｅａｔ）によるハイブリッド化によって確認す
ることができる。さらに、ＹＡＣ内に得られた塩基配列
を利用して、部分的もしくは完全なゲノムＤＮＡから構
成された又はｃＤＮＡから構成することができる。例え
ば、ベクトレット分析から得られた塩基配列データを用
いて、プラスミド、ファージ、コスミド又はＹＡＣベク
ター中に製造された塩基配列ライブラリーのスクリーニ
ングに適したオリゴヌクレオチド又は増幅生成物を得る
ことができる。他のアプローチでは、上記コスミド、フ
ァージ又はプラスミドライブラリーを例えば上記のよう
なヌクレオチド配列の可変数のタンデム反復物を確認す
るためのプローブによって、特に例えば１キロベースま
で、２キロベースまで、３キロベースまで、４キロベー
スまで又は５キロベースまでのような、５キロベースま
での１０塩基対の（ＡＣ）ｎオリゴヌクレオチドのよう
なジヌクレオチドプローブによってスクリーニングする
ことができる。これは本発明の方法に利用可能な多形性
を表す。技術上周知の方法によって便利なオリゴヌクレ
オチドプローブを製造することができる。それ故、本発
明は上記のような多形性を検出することのできるポリヌ
クレオチド及びポリヌクレオチドプローブにも関する。
ド、ファージ又はプラスミドＤＮＡライブラリーを製造
することもできる。例えば、便利には低融点アガロース
ゲルから精製された、ゲル精製ＹＡＣ ２３ＣＢ１０、
２８ＣＡ１２又は２６ＦＦ３を例えば６ｂｐ認識配列制
限酵素によって制限して、適当なサイズのＤＮＡフラグ
メントを得て、次にこれをプラスミド、コスミド又はバ
クテリオファージベクターにクローン化して、ＹＡＣか
らのＤＮＡに相当するクローンを得ることができる。こ
れらのクローンを次にそれ自体公知の方法を用いて塩基
配列決定して、ＹＡＣ内に付加的情報を与えることがで
きる。或いは、ＹＡＣ ２３ＣＢ１０、２８ＣＡ１２又
は２６ＦＦ３のいずれかをサブクローン化し、ＹＡＣサ
ブクローンを例えばＡｌｕ又は精製ＹＡＣ ＤＮＡのよ
うな分散ヒト反復物（ｄｉｓｐｅｒｓｅｄ ｈｕｍａｎ
ｒｅｐｅａｔ）によるハイブリッド化によって確認す
ることができる。さらに、ＹＡＣ内に得られた塩基配列
を利用して、部分的もしくは完全なゲノムＤＮＡから構
成された又はｃＤＮＡから構成することができる。例え
ば、ベクトレット分析から得られた塩基配列データを用
いて、プラスミド、ファージ、コスミド又はＹＡＣベク
ター中に製造された塩基配列ライブラリーのスクリーニ
ングに適したオリゴヌクレオチド又は増幅生成物を得る
ことができる。他のアプローチでは、上記コスミド、フ
ァージ又はプラスミドライブラリーを例えば上記のよう
なヌクレオチド配列の可変数のタンデム反復物を確認す
るためのプローブによって、特に例えば１キロベースま
で、２キロベースまで、３キロベースまで、４キロベー
スまで又は５キロベースまでのような、５キロベースま
での１０塩基対の（ＡＣ）ｎオリゴヌクレオチドのよう
なジヌクレオチドプローブによってスクリーニングする
ことができる。これは本発明の方法に利用可能な多形性
を表す。技術上周知の方法によって便利なオリゴヌクレ
オチドプローブを製造することができる。それ故、本発
明は上記のような多形性を検出することのできるポリヌ
クレオチド及びポリヌクレオチドプローブにも関する。
【００５３】それ故、上記方法は、ＹＡＣ ２３ＣＢ１
０、２８ＣＡ１２及び２６ＦＦ３のいずれかに適用した
場合に、アルツハイマー病遺伝子及びそのフランキング
領域の全て又は少なくとも一部の直接、明白な確認を当
業者に可能にする。アルツハイマー病遺伝子を含むゲノ
ムクローン及びｃＤＮＡクローンは技術上周知の方法に
よって得られる。
０、２８ＣＡ１２及び２６ＦＦ３のいずれかに適用した
場合に、アルツハイマー病遺伝子及びそのフランキング
領域の全て又は少なくとも一部の直接、明白な確認を当
業者に可能にする。アルツハイマー病遺伝子を含むゲノ
ムクローン及びｃＤＮＡクローンは技術上周知の方法に
よって得られる。
【００５４】上記方法の都合のよい組合せを用いること
によって、ＹＡＣ ２３ＣＢ１０、２８ＣＡ１２及び２
６ＦＦ３のいずれかに含まれる遺伝子塩基配列を確認
し、特性化することができる。例を挙げると、ＹＡＣ中
に含まれる核酸塩基配列をプローブとして用いて、全Ｙ
ＡＣを用いて全体的に又はＹＡＣフラグメントを用いて
部分的に、ｃＤＮＡクローンを確認することができる
［ピー．エルビン（Ｐ．Ｅｌｖｉｎ）等、ニュークレイ
ック アシドス リサーチ、１８、３９１３−３９１
７、１９９０］。
によって、ＹＡＣ ２３ＣＢ１０、２８ＣＡ１２及び２
６ＦＦ３のいずれかに含まれる遺伝子塩基配列を確認
し、特性化することができる。例を挙げると、ＹＡＣ中
に含まれる核酸塩基配列をプローブとして用いて、全Ｙ
ＡＣを用いて全体的に又はＹＡＣフラグメントを用いて
部分的に、ｃＤＮＡクローンを確認することができる
［ピー．エルビン（Ｐ．Ｅｌｖｉｎ）等、ニュークレイ
ック アシドス リサーチ、１８、３９１３−３９１
７、１９９０］。
【００５５】ｃＤＮＡクローンの確認への利用と同様
に、ＹＡＣ内に含まれる塩基配列の一部又は全てから成
るプローブは、このプローブを哺乳動物、脊椎動物又は
他の動物の異なる種からの核酸との低緊縮性ハイブリッ
ド化条件下で用いることによって、種間相同性に基づい
て、遺伝子塩基配列の検出に用いることができる。例え
ば、１種以上の動物種からのＤＮＡを制限エンドヌクレ
アーゼによって消化させ、ゲル電気泳動を受けさせ、ナ
イロンフィルター上にブロットする。ヒトＤＮＡの特定
領域からの塩基配列と相同の動物ＤＮＡ中の塩基配列の
存在は、ヒトＤＮＡのフラグメントを低緊縮性条件下で
ハイブリッド化プローブとして用いることによって実証
される。これらの実験では、非関連種の間に広く保存さ
れる塩基配列ブロックの存在は、遺伝子塩基配列の存在
の強い徴候である。このようなアプローチは例えば腫瘍
サプレッサー遺伝子ＤＣＣのような数種の遺伝子の単離
に上首尾に用いられている［イー．アール．フェアロン
（Ｅ．Ｒ．Ｆｅａｒｏｎ）等、１９９０、サイエンス、
２４７、４９−５６］。遺伝子塩基配列は上述のように
ＩＲＰ遺伝子の確認の場合と同様にＨＴＦ島を求めるこ
とによっても確認することができる［エックス．エステ
ィビル（Ｘ．Ｅｓｔｉｖｉｌｌ）等、１９８７、ネイチ
ャー、３２６、８４０−８４５］。嚢胞性線維腫遺伝子
の確認の場合のように、上記方法の組合せも使用可能で
ある［ジェイ．エム．ロメンス（Ｊ．Ｍ．Ｒｏｍｍｅｎ
ｓ）等、１９８９、サイエンス、２４５、１０５９−１
０６５］。好ましくは、ひと度ゲノム塩基配列が、例え
ばペプチドもしくは蛋白質をコードする、問題の領域と
確認されたならば、適当なｃＤＮＡライブラリーから標
準方法によってｃＤＮＡクローンを単離する。これらの
方法の中でノーザン ブロット法、プライマー伸長法及
びＳｌマッピング分析法が全長又は全長に近いｍＲＮＡ
塩基配列を得るために使用可能な、技術上周知の方法で
ある。この場合にこれは読み取り枠（ｏｐｅｎ ｒｅａ
ｄｉｎｇ ｆｒａｍｅ）及び可能なコーディング塩基配
列として求められる。ひと度遺伝子が確認されたなら
ば、疾患状態にこのような遺伝子が関係するか否かを評
価することができる。これは、疾患を有する個体から又
は個体の一部からの、正常もしくは非罹患個体からでは
ない、核酸もしくは蛋白質中の遺伝子もしくは遺伝子産
物の突然変異形もしくは変化形を確認することによって
便利に行われる、このことは嚢胞性線維腫のような多く
の遺伝性障害とＣＦＴＲ遺伝子との研究［ジェイ．アー
ル．リオルダン（Ｊ．Ｒ．Ｒｉｏｒｄａｎ）等、１９９
０、サイエンス、２４５、１０６６−１０７３］及び結
腸直腸癌のような後天性疾患とｐ５３遺伝子との研究
［ジェイ．ジェイ．ベイカー（Ｊ．Ｊ．Ｂａｋｅｒ）
等、１９８９、サイエンス、２４４、２１７−２２１］
において実証されている。予測アミノ酸配列をｍＲＮＡ
塩基配列から誘導し、技術上周知の方法によって実証す
ることができる。次に、問題の遺伝子産物をコードする
ヌクレオチド配列を容易に利用して、イン ビトロ又は
イン ビボ表現系によって被コード（ｅｎｃｏｄｅｄ）
遺伝子産物を誘導することができる。例えば、蛋白質又
はペプチドをコードするＤＮＡを適当な表現ベクターに
結合させ、細胞中に挿入し、選択したベクター中の表現
対照塩基配列に適当な条件下で遺伝子産物を表現するこ
とができる。好ましくは、真核遺伝子を例えば酵母、昆
虫、植物もしくは哺乳動物の細胞中で、又はイン ビト
ロで、真核細胞誘導抽出物と選択した系に適当な表現制
御要素とを用いて表現する。例えば大腸菌（Ｅ．ｃｏｌ
ｉ）のような真核細胞をペプチド及び蛋白質の表現に用
いることができ、これは高収率の遺伝子産物を形成し、
例えば抗体をライズするためのペプチドもしくは蛋白質
の産生に有利な特徴である。本発明の他の態様はＹＡＣ
２３ＣＢ１０、２８ＣＡ１２及び２６ＦＦ３のいずれ
か又はいずれかの対応ＲＮＡに含まれる遺伝子、好まし
くはアルツハイマー病遺伝子から誘導される蛋白質、そ
の変異形又はフラグメントに関する。
に、ＹＡＣ内に含まれる塩基配列の一部又は全てから成
るプローブは、このプローブを哺乳動物、脊椎動物又は
他の動物の異なる種からの核酸との低緊縮性ハイブリッ
ド化条件下で用いることによって、種間相同性に基づい
て、遺伝子塩基配列の検出に用いることができる。例え
ば、１種以上の動物種からのＤＮＡを制限エンドヌクレ
アーゼによって消化させ、ゲル電気泳動を受けさせ、ナ
イロンフィルター上にブロットする。ヒトＤＮＡの特定
領域からの塩基配列と相同の動物ＤＮＡ中の塩基配列の
存在は、ヒトＤＮＡのフラグメントを低緊縮性条件下で
ハイブリッド化プローブとして用いることによって実証
される。これらの実験では、非関連種の間に広く保存さ
れる塩基配列ブロックの存在は、遺伝子塩基配列の存在
の強い徴候である。このようなアプローチは例えば腫瘍
サプレッサー遺伝子ＤＣＣのような数種の遺伝子の単離
に上首尾に用いられている［イー．アール．フェアロン
（Ｅ．Ｒ．Ｆｅａｒｏｎ）等、１９９０、サイエンス、
２４７、４９−５６］。遺伝子塩基配列は上述のように
ＩＲＰ遺伝子の確認の場合と同様にＨＴＦ島を求めるこ
とによっても確認することができる［エックス．エステ
ィビル（Ｘ．Ｅｓｔｉｖｉｌｌ）等、１９８７、ネイチ
ャー、３２６、８４０−８４５］。嚢胞性線維腫遺伝子
の確認の場合のように、上記方法の組合せも使用可能で
ある［ジェイ．エム．ロメンス（Ｊ．Ｍ．Ｒｏｍｍｅｎ
ｓ）等、１９８９、サイエンス、２４５、１０５９−１
０６５］。好ましくは、ひと度ゲノム塩基配列が、例え
ばペプチドもしくは蛋白質をコードする、問題の領域と
確認されたならば、適当なｃＤＮＡライブラリーから標
準方法によってｃＤＮＡクローンを単離する。これらの
方法の中でノーザン ブロット法、プライマー伸長法及
びＳｌマッピング分析法が全長又は全長に近いｍＲＮＡ
塩基配列を得るために使用可能な、技術上周知の方法で
ある。この場合にこれは読み取り枠（ｏｐｅｎ ｒｅａ
ｄｉｎｇ ｆｒａｍｅ）及び可能なコーディング塩基配
列として求められる。ひと度遺伝子が確認されたなら
ば、疾患状態にこのような遺伝子が関係するか否かを評
価することができる。これは、疾患を有する個体から又
は個体の一部からの、正常もしくは非罹患個体からでは
ない、核酸もしくは蛋白質中の遺伝子もしくは遺伝子産
物の突然変異形もしくは変化形を確認することによって
便利に行われる、このことは嚢胞性線維腫のような多く
の遺伝性障害とＣＦＴＲ遺伝子との研究［ジェイ．アー
ル．リオルダン（Ｊ．Ｒ．Ｒｉｏｒｄａｎ）等、１９９
０、サイエンス、２４５、１０６６−１０７３］及び結
腸直腸癌のような後天性疾患とｐ５３遺伝子との研究
［ジェイ．ジェイ．ベイカー（Ｊ．Ｊ．Ｂａｋｅｒ）
等、１９８９、サイエンス、２４４、２１７−２２１］
において実証されている。予測アミノ酸配列をｍＲＮＡ
塩基配列から誘導し、技術上周知の方法によって実証す
ることができる。次に、問題の遺伝子産物をコードする
ヌクレオチド配列を容易に利用して、イン ビトロ又は
イン ビボ表現系によって被コード（ｅｎｃｏｄｅｄ）
遺伝子産物を誘導することができる。例えば、蛋白質又
はペプチドをコードするＤＮＡを適当な表現ベクターに
結合させ、細胞中に挿入し、選択したベクター中の表現
対照塩基配列に適当な条件下で遺伝子産物を表現するこ
とができる。好ましくは、真核遺伝子を例えば酵母、昆
虫、植物もしくは哺乳動物の細胞中で、又はイン ビト
ロで、真核細胞誘導抽出物と選択した系に適当な表現制
御要素とを用いて表現する。例えば大腸菌（Ｅ．ｃｏｌ
ｉ）のような真核細胞をペプチド及び蛋白質の表現に用
いることができ、これは高収率の遺伝子産物を形成し、
例えば抗体をライズするためのペプチドもしくは蛋白質
の産生に有利な特徴である。本発明の他の態様はＹＡＣ
２３ＣＢ１０、２８ＣＡ１２及び２６ＦＦ３のいずれ
か又はいずれかの対応ＲＮＡに含まれる遺伝子、好まし
くはアルツハイマー病遺伝子から誘導される蛋白質、そ
の変異形又はフラグメントに関する。
【００５６】本発明のさらに他の態様は、例えばＣＮＳ
障害、特にアルツハイマー病のような遺伝性又は後天性
疾患の診断及び／又は治療へのＹＡＣ ２３ＣＢ１０、
２８ＣＡ１２及び２６ＦＦ３のいずれか又はいずれかの
対応ＲＮＡに含まれる遺伝子、好ましくはアルツハイマ
ー病遺伝子から誘導される蛋白質、その変異形又はフラ
グメントの使用に関する。
障害、特にアルツハイマー病のような遺伝性又は後天性
疾患の診断及び／又は治療へのＹＡＣ ２３ＣＢ１０、
２８ＣＡ１２及び２６ＦＦ３のいずれか又はいずれかの
対応ＲＮＡに含まれる遺伝子、好ましくはアルツハイマ
ー病遺伝子から誘導される蛋白質、その変異形又はフラ
グメントの使用に関する。
【００５７】診断用途に関して、個体からのサンプル中
の遺伝性又は後天性疾患の対立遺伝子の有無は特定蛋白
質もしくはそのフラグメントに関連して、又は特定蛋白
質の表現、非表現もしくは示差（ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉ
ａｌ）表現に関連して評価することができる。
の遺伝性又は後天性疾患の対立遺伝子の有無は特定蛋白
質もしくはそのフラグメントに関連して、又は特定蛋白
質の表現、非表現もしくは示差（ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉ
ａｌ）表現に関連して評価することができる。
【００５８】蛋白質及び／又はその表現レベルの検出は
抗体を用いて便利に行うことができる。このような抗体
は本発明のＹＡＣ中に含まれる遺伝子の少なくとも一部
によって又は対応ＲＮＡ塩基配列によってコードされる
ポリペプチド塩基配列にライズされる便利にはポリクロ
ーナル抗体、さらに便利にはモノクローナル抗体であ
る。このようにして、抗体は遺伝子もしくは対応ＲＮＡ
塩基配列によってコードされる蛋白質に結合する、又は
蛋白質のフラグメント又は突然変異形に結合する。例え
ばアルツハイマー病に罹患したヒトのようなヒトに一般
的な蛋白質の変異形を用いて、アルツハイマー病患者の
脳脊髄液中に検出されるペアード ヘリカル フィラメ
ント（ＰＨＦ）コア蛋白質に結合する診断抗体の場合に
実証されているように、変異形に特異的な抗体を得るこ
とができる［国際特許第８９／０３９９３号、メディカ
ル リサーチ カウンシル（Ｍｅｄｉｃａｌ Ｒｅｓｅ
ａｒｃｈ ｃｏｕｎｃｉｌ）］。
抗体を用いて便利に行うことができる。このような抗体
は本発明のＹＡＣ中に含まれる遺伝子の少なくとも一部
によって又は対応ＲＮＡ塩基配列によってコードされる
ポリペプチド塩基配列にライズされる便利にはポリクロ
ーナル抗体、さらに便利にはモノクローナル抗体であ
る。このようにして、抗体は遺伝子もしくは対応ＲＮＡ
塩基配列によってコードされる蛋白質に結合する、又は
蛋白質のフラグメント又は突然変異形に結合する。例え
ばアルツハイマー病に罹患したヒトのようなヒトに一般
的な蛋白質の変異形を用いて、アルツハイマー病患者の
脳脊髄液中に検出されるペアード ヘリカル フィラメ
ント（ＰＨＦ）コア蛋白質に結合する診断抗体の場合に
実証されているように、変異形に特異的な抗体を得るこ
とができる［国際特許第８９／０３９９３号、メディカ
ル リサーチ カウンシル（Ｍｅｄｉｃａｌ Ｒｅｓｅ
ａｒｃｈ ｃｏｕｎｃｉｌ）］。
【００５９】ここで用いる「抗体」なる用語は本発明の
ペプチドの抗原決定基の認識部位を含むあらゆる免疫グ
ロブリンとそのフラグメントとを含む。
ペプチドの抗原決定基の認識部位を含むあらゆる免疫グ
ロブリンとそのフラグメントとを含む。
【００６０】突然変異体、野生型又はペプチド フラグ
メントのいずれであっても、アルツハイマー病遺伝子産
物を検出する抗体は、診断剤又は予後作用剤（ｐｒｏｇ
ｎｏｓｔｉｃ ａｇｅｎｔ）として有意な価値を有する
と考えられる。例えば、このような抗体を用いて、分子
規模の障害を決定するための組織抽出物もしくは組織切
片中の完全な、野生型もしくは全アルツハイマー病の遺
伝子産物のレベルを検出することができ、このような抗
体は、特にアルツハイマー病遺伝子又はその遺伝子産物
を含むならば、治療剤の設計に有用である。
メントのいずれであっても、アルツハイマー病遺伝子産
物を検出する抗体は、診断剤又は予後作用剤（ｐｒｏｇ
ｎｏｓｔｉｃ ａｇｅｎｔ）として有意な価値を有する
と考えられる。例えば、このような抗体を用いて、分子
規模の障害を決定するための組織抽出物もしくは組織切
片中の完全な、野生型もしくは全アルツハイマー病の遺
伝子産物のレベルを検出することができ、このような抗
体は、特にアルツハイマー病遺伝子又はその遺伝子産物
を含むならば、治療剤の設計に有用である。
【００６１】それ故、本発明の第１態様によると、例え
ばアルツハイマー病のような遺伝性もしくは後天性疾患
の診断及び／又は治療へのＹＡＣ ２３ＣＢ１０、２８
ＣＡ１２及び２６ＦＦ３のいずれかに含まれる遺伝子か
ら誘導される蛋白質又はそのフラグメントを確認する抗
体の使用を提供する。
ばアルツハイマー病のような遺伝性もしくは後天性疾患
の診断及び／又は治療へのＹＡＣ ２３ＣＢ１０、２８
ＣＡ１２及び２６ＦＦ３のいずれかに含まれる遺伝子か
ら誘導される蛋白質又はそのフラグメントを確認する抗
体の使用を提供する。
【００６２】本発明のさらに他の態様によると、ＹＡＣ
２３ＣＢ１０、２８ＣＡ１２及び２６ＦＦ３のいずれ
かに含まれる遺伝子から誘導される蛋白質又はそのフラ
グメントを確認する抗体の使用を提供する。生物学的に
重要な塩基配列、例えば蛋白質をコードする塩基配列が
一般に、それらが低緊縮性条件下で交差ハイブリッド化
する程度に高レベルの進化保存（ｅｖｏｌｕｔｉｏｎａ
ｒｙ ｃｏｎｓｅｒｖａｔｉｏｎ）を示すことは理解さ
れよう。この特徴は適当なハイブリッド化条件下で１つ
の種からの同等遺伝子を第２種からヌクレオチドを用い
て単離することを可能にする。この方法は例えばブタ第
VIII因子から誘導される塩基配列を用いたヒト第VIII因
子の単離のような多くの場合に既に用いられている［ジ
ェイ．ギツィエール（Ｊ．Ｇｉｔｓｃｈｉｅｒ）等、１
９８４、ネイチャー、３１２、３２６−３３０；ジェ
イ．ジェイ．ツール（Ｊ．Ｊ．Ｔｏｏｌｅ）等、１９８
４、ネイチャー、３１２、３４２−３４７］。ＰＣＲ増
幅テクノロジーの出現は１つの種からの遺伝子からのオ
リゴヌクレオチドプライマーの第２種における塩基配列
の増幅への使用を可能にする。このアプローチはラット
のアルドース レダクターゼ遺伝子から採取された塩基
配列を用いたヒト アルドース レダクターゼ遺伝子の
単離に上首尾に用いられている。［エイ．グラハム
（Ａ．Ｇｒａｈａｍ）等、ジェイ．バイオル．ケム．１
９９０、２６６、６８７２−６８７７］。従って、例え
ば、ＹＡＣ ２３ＣＢ１０、２８ＣＡ１２及び２６ＦＦ
３のいずれかに含まれるアルツハイマー病遺伝子のよう
なヒト遺伝子に同等の非ヒト動物、例えばマウス又はラ
ットの遺伝子の確認が可能になる。
２３ＣＢ１０、２８ＣＡ１２及び２６ＦＦ３のいずれ
かに含まれる遺伝子から誘導される蛋白質又はそのフラ
グメントを確認する抗体の使用を提供する。生物学的に
重要な塩基配列、例えば蛋白質をコードする塩基配列が
一般に、それらが低緊縮性条件下で交差ハイブリッド化
する程度に高レベルの進化保存（ｅｖｏｌｕｔｉｏｎａ
ｒｙ ｃｏｎｓｅｒｖａｔｉｏｎ）を示すことは理解さ
れよう。この特徴は適当なハイブリッド化条件下で１つ
の種からの同等遺伝子を第２種からヌクレオチドを用い
て単離することを可能にする。この方法は例えばブタ第
VIII因子から誘導される塩基配列を用いたヒト第VIII因
子の単離のような多くの場合に既に用いられている［ジ
ェイ．ギツィエール（Ｊ．Ｇｉｔｓｃｈｉｅｒ）等、１
９８４、ネイチャー、３１２、３２６−３３０；ジェ
イ．ジェイ．ツール（Ｊ．Ｊ．Ｔｏｏｌｅ）等、１９８
４、ネイチャー、３１２、３４２−３４７］。ＰＣＲ増
幅テクノロジーの出現は１つの種からの遺伝子からのオ
リゴヌクレオチドプライマーの第２種における塩基配列
の増幅への使用を可能にする。このアプローチはラット
のアルドース レダクターゼ遺伝子から採取された塩基
配列を用いたヒト アルドース レダクターゼ遺伝子の
単離に上首尾に用いられている。［エイ．グラハム
（Ａ．Ｇｒａｈａｍ）等、ジェイ．バイオル．ケム．１
９９０、２６６、６８７２−６８７７］。従って、例え
ば、ＹＡＣ ２３ＣＢ１０、２８ＣＡ１２及び２６ＦＦ
３のいずれかに含まれるアルツハイマー病遺伝子のよう
なヒト遺伝子に同等の非ヒト動物、例えばマウス又はラ
ットの遺伝子の確認が可能になる。
【００６３】さらに他のアプローチでは、本発明のＹＡ
Ｃを用いて、例えば動物及び／又はヒトのようなトラン
スジェニック種の形成並びにヒト及び／又は動物細胞ラ
インをも形成することができる。例えば、齧歯類又はヒ
ト遺伝子をトランスフェクションもしくはトランスジェ
ネシスに用いて、遺伝子、便利にはアルツハイマー病遺
伝子の全てもしくは一部を細胞中に挿入して、自主的に
複製するようにする、又は通常はアルツハイマー病遺伝
子によって占められている部位以外の部位においてゲノ
ム中に統合するようにする。或いは、トランスフェクシ
ョンもしくはトランスジェニック実験を実施して、例え
ば齧歯類又はヒト細胞ラインにおけるアルツハイマー病
遺伝子の一部もしくは全てをクローン化遺伝子が不活化
又は複製する（１コピー又は２コピー）ようにする。
Ｃを用いて、例えば動物及び／又はヒトのようなトラン
スジェニック種の形成並びにヒト及び／又は動物細胞ラ
インをも形成することができる。例えば、齧歯類又はヒ
ト遺伝子をトランスフェクションもしくはトランスジェ
ネシスに用いて、遺伝子、便利にはアルツハイマー病遺
伝子の全てもしくは一部を細胞中に挿入して、自主的に
複製するようにする、又は通常はアルツハイマー病遺伝
子によって占められている部位以外の部位においてゲノ
ム中に統合するようにする。或いは、トランスフェクシ
ョンもしくはトランスジェニック実験を実施して、例え
ば齧歯類又はヒト細胞ラインにおけるアルツハイマー病
遺伝子の一部もしくは全てをクローン化遺伝子が不活化
又は複製する（１コピー又は２コピー）ようにする。
【００６４】例えばネオマイシン耐性「ネオ（ｎｅ
ｏ）」のような選択的マーカーをＹＡＣＳＣ／２３ＣＢ
１０中に導入するためには酵母での相同的組み換えが便
利に利用される。これは例えばＹＡＣのヒトＤＮＡ部分
における「アル（ａｌｕ）」反復配列要素又はベクター
アームのいずれかに関する［パヴァン（Ｐａｖａｎ）、
１９９０、モル．セル．バイオル．（Ｍｏｌ．Ｃｅｌ
ｌ．Ｂｉｏｌ．）１０、４１６３−４１６９］。或い
は、例えば「ネオ」標的のような標的（ｔａｒｇｅｔｉ
ｎｇ）はクローン化ＤＮＡの特異性領域（ｓｐｅｃｉｆ
ｉｃ ｒｅｇｉｏｎ）に対してである［パチニス（Ｐａ
ｃｈｎｉｓ）等、プロク．ナトル．アカド．サイ．（Ｐ
ｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．）、１９９０、
８７、５１０９−５１１３］。相同的組み換えはＹＡＣ
のヒトＤＮＡ部分の塩基配列を操作及び変更するために
も使用可能である。選択性マーカーの操作及び挿入後
に、例えばポリエチレングリコール仲介スフェロブラス
ト融合によって［パバン等、１９９０、モル．セル．バ
イオル．１０、４１６３−４１６９；パクニス（Ｐａｃ
ｈｎｉｓ）等、１９９０、プロク．ナトル．アカド．サ
イ．８７、５１０９−５１１３］、リン酸カルシウム共
沈殿によって［ディ’ウルソ（Ｄ’Ｕｒｓｏ）等、ゲノ
ミクス（Ｇｅｎｏｍｉｃｓ）、７、５３１−５３４；ウ
ィグラー（Ｗｉｇｌｅｒ）等、１９７９、プロク．ナト
ル．アカド．サイ．７６、１３７３−１３７６］、エレ
クトロポレーション（ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏ
ｎ）によって［ティ．ディ．エトシュマン（Ｔ．Ｄ．Ｏ
ｅｔｓｃｈｍａｎ）等、１９８８、Ｐ．Ｎ．Ａ．Ｓ．Ｕ
ＳＡ、８５、８５８３−８５８７；エス．シー．ボッグ
ス（Ｓ．Ｃ．Ｂｏｇｇｓ）等、１９８６、イクスプ．ヘ
マトル．（Ｅｘｐ．Ｈｅｍａｔｏｌ．）、１４９、９８
８−９４４］、ＹＡＣを哺乳動物細胞ライン又は胚幹
（ｅｍｂｒｙｏ ｓｔｅｍ）（ＥＳ）細胞中に移入させ
る、又は精製ＹＡＣ ＤＮＡを直接ＥＳ細胞にミクロ注
入する。ＥＳ細胞における相同的組み換えは例えば、便
利にはポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を用いたスクリ
ーニングによって、確認される。次に、トランスジェニ
ック動物の発生のために、好ましい細胞を例えばマウス
もしくはラットのような適当な動物又は同様な胚細胞中
に直接注入される。選択性マーカーを含む又は含まない
精製ＹＡＣも、トランスジェニック動物の発生のため
に、例えばマウスもしくはラット又は同様な動物のよう
な適当な動物の受精卵中に直接注入することもできる。
ＹＡＣは上記方法によってトランスジェニック細胞ライ
ンの発生のために用いることもできる。
ｏ）」のような選択的マーカーをＹＡＣＳＣ／２３ＣＢ
１０中に導入するためには酵母での相同的組み換えが便
利に利用される。これは例えばＹＡＣのヒトＤＮＡ部分
における「アル（ａｌｕ）」反復配列要素又はベクター
アームのいずれかに関する［パヴァン（Ｐａｖａｎ）、
１９９０、モル．セル．バイオル．（Ｍｏｌ．Ｃｅｌ
ｌ．Ｂｉｏｌ．）１０、４１６３−４１６９］。或い
は、例えば「ネオ」標的のような標的（ｔａｒｇｅｔｉ
ｎｇ）はクローン化ＤＮＡの特異性領域（ｓｐｅｃｉｆ
ｉｃ ｒｅｇｉｏｎ）に対してである［パチニス（Ｐａ
ｃｈｎｉｓ）等、プロク．ナトル．アカド．サイ．（Ｐ
ｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．）、１９９０、
８７、５１０９−５１１３］。相同的組み換えはＹＡＣ
のヒトＤＮＡ部分の塩基配列を操作及び変更するために
も使用可能である。選択性マーカーの操作及び挿入後
に、例えばポリエチレングリコール仲介スフェロブラス
ト融合によって［パバン等、１９９０、モル．セル．バ
イオル．１０、４１６３−４１６９；パクニス（Ｐａｃ
ｈｎｉｓ）等、１９９０、プロク．ナトル．アカド．サ
イ．８７、５１０９−５１１３］、リン酸カルシウム共
沈殿によって［ディ’ウルソ（Ｄ’Ｕｒｓｏ）等、ゲノ
ミクス（Ｇｅｎｏｍｉｃｓ）、７、５３１−５３４；ウ
ィグラー（Ｗｉｇｌｅｒ）等、１９７９、プロク．ナト
ル．アカド．サイ．７６、１３７３−１３７６］、エレ
クトロポレーション（ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏ
ｎ）によって［ティ．ディ．エトシュマン（Ｔ．Ｄ．Ｏ
ｅｔｓｃｈｍａｎ）等、１９８８、Ｐ．Ｎ．Ａ．Ｓ．Ｕ
ＳＡ、８５、８５８３−８５８７；エス．シー．ボッグ
ス（Ｓ．Ｃ．Ｂｏｇｇｓ）等、１９８６、イクスプ．ヘ
マトル．（Ｅｘｐ．Ｈｅｍａｔｏｌ．）、１４９、９８
８−９４４］、ＹＡＣを哺乳動物細胞ライン又は胚幹
（ｅｍｂｒｙｏ ｓｔｅｍ）（ＥＳ）細胞中に移入させ
る、又は精製ＹＡＣ ＤＮＡを直接ＥＳ細胞にミクロ注
入する。ＥＳ細胞における相同的組み換えは例えば、便
利にはポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を用いたスクリ
ーニングによって、確認される。次に、トランスジェニ
ック動物の発生のために、好ましい細胞を例えばマウス
もしくはラットのような適当な動物又は同様な胚細胞中
に直接注入される。選択性マーカーを含む又は含まない
精製ＹＡＣも、トランスジェニック動物の発生のため
に、例えばマウスもしくはラット又は同様な動物のよう
な適当な動物の受精卵中に直接注入することもできる。
ＹＡＣは上記方法によってトランスジェニック細胞ライ
ンの発生のために用いることもできる。
【００６５】表現制御要素は、ヌクレオチド配列、好ま
しくはコーディング配列を野生型もしくは変異アルツハ
イマー病遺伝子の表現に影響を与える因子の少なくとも
部分的な制御下に置くために、トランスフェクション又
はトランスジェネシスにも用いられる。例えばトランス
ジェネシスでは、アルツハイマー病遺伝子のプロモータ
ーの制御下で表現される問題の遺伝子を有し、突然変異
体又は野生型のアルツハイマー病遺伝子によって通常示
される発生及び／又は組織特異性パターンで遺伝子を表
現する、新規なマウス又はラット子孫（ｐｒｏｇｅｎ
ｙ）が発生される。
しくはコーディング配列を野生型もしくは変異アルツハ
イマー病遺伝子の表現に影響を与える因子の少なくとも
部分的な制御下に置くために、トランスフェクション又
はトランスジェネシスにも用いられる。例えばトランス
ジェネシスでは、アルツハイマー病遺伝子のプロモータ
ーの制御下で表現される問題の遺伝子を有し、突然変異
体又は野生型のアルツハイマー病遺伝子によって通常示
される発生及び／又は組織特異性パターンで遺伝子を表
現する、新規なマウス又はラット子孫（ｐｒｏｇｅｎ
ｙ）が発生される。
【００６６】それ故、本発明の他の態様によると、ＹＡ
Ｃ ２３ＣＢ１０、２８ＣＡ１２及び２６ＦＦ３のいず
れか又はそのフラグメントの、例えば以下で述べるよう
な、トランスジェニック種の製造への使用を提供する。
ＹＡＣは細胞中に便利にミクロ注入される。
Ｃ ２３ＣＢ１０、２８ＣＡ１２及び２６ＦＦ３のいず
れか又はそのフラグメントの、例えば以下で述べるよう
な、トランスジェニック種の製造への使用を提供する。
ＹＡＣは細胞中に便利にミクロ注入される。
【００６７】本発明のさらに他の態様によると、ＹＡＣ
２３ＣＢ１０、２８ＣＡ１２及び２６ＦＦ３のいずれ
かに含まれる遺伝子及び／又はその制御要素から得られ
る遺伝子塩基配列を含むトランスジェニック種を提供す
る。便利なトランスジェニック種は動物及び／又はヒト
並びにヒト及び／又は動物細胞ラインを含む。
２３ＣＢ１０、２８ＣＡ１２及び２６ＦＦ３のいずれ
かに含まれる遺伝子及び／又はその制御要素から得られ
る遺伝子塩基配列を含むトランスジェニック種を提供す
る。便利なトランスジェニック種は動物及び／又はヒト
並びにヒト及び／又は動物細胞ラインを含む。
【００６８】他の態様では、本発明はＹＡＣ ２３ＣＢ
１０、２８ＣＡ１２及び２６ＦＦ３のいずれかに含まれ
る遺伝子から誘導される治療剤を提供する。便利な治療
剤はレトロウイルスと蛋白質、例えば抗体とそのフラグ
メントを含む。治療剤は必要量で投与するために適当な
配合成分を含む。
１０、２８ＣＡ１２及び２６ＦＦ３のいずれかに含まれ
る遺伝子から誘導される治療剤を提供する。便利な治療
剤はレトロウイルスと蛋白質、例えば抗体とそのフラグ
メントを含む。治療剤は必要量で投与するために適当な
配合成分を含む。
【００６９】本発明はまた、「アンチセンス（ａｎｔｉ
ｓｅｎｓｅ）」原理によって製造される治療剤をも提供
する［ウールマン（Ｕｈｌｍａｎ）とペイマン（Ｐｅｙ
ｍａｎ）、ケミカル レヴュース（Ｃｈｅｍｉｃａｌ
Ｒｅｖｉｅｗｓ）、１９９０、９０、５４３］。ＹＡＣ
２３ＣＢ１０、２８ＣＡ１２及び２６ＦＦ３のいずれ
かに含まれる遺伝子塩基配列、好ましくはアルツハイマ
ー病遺伝子をコードする遺伝子塩基配列は、「オリゴデ
オキシヌクレオチド：遺伝子表現のアンチセンス抑制剤
（Ｏｌｉｇｏｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ：Ａｎ
ｔｉｓｅｎｓｅＩｎｈｉｂｉｔｏｒｓ）」ジェイ．エ
ス．コーヘン（Ｊ．Ｓ．Ｃｏｈｅｎ）編集、ＣＲＣ出版
社、１９８９におけるように、技術上公知の便利なアン
チセンス方法を用いて、アンチセンス オリゴヌクレオ
チドによる治療法の高度に選択的な標的を形成すること
ができる。アルツハイマー病遺伝子内に多くの種々なア
ンチセンス オリゴヌクレオチドが設計され、これらの
全てがＹＡＣ ２３ＣＢ１０、２８ＣＡ１２及び２６Ｆ
Ｆ３のいずれかに含まれるヌクレオチド配列から誘導さ
れることは理解されよう。
ｓｅｎｓｅ）」原理によって製造される治療剤をも提供
する［ウールマン（Ｕｈｌｍａｎ）とペイマン（Ｐｅｙ
ｍａｎ）、ケミカル レヴュース（Ｃｈｅｍｉｃａｌ
Ｒｅｖｉｅｗｓ）、１９９０、９０、５４３］。ＹＡＣ
２３ＣＢ１０、２８ＣＡ１２及び２６ＦＦ３のいずれ
かに含まれる遺伝子塩基配列、好ましくはアルツハイマ
ー病遺伝子をコードする遺伝子塩基配列は、「オリゴデ
オキシヌクレオチド：遺伝子表現のアンチセンス抑制剤
（Ｏｌｉｇｏｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ：Ａｎ
ｔｉｓｅｎｓｅＩｎｈｉｂｉｔｏｒｓ）」ジェイ．エ
ス．コーヘン（Ｊ．Ｓ．Ｃｏｈｅｎ）編集、ＣＲＣ出版
社、１９８９におけるように、技術上公知の便利なアン
チセンス方法を用いて、アンチセンス オリゴヌクレオ
チドによる治療法の高度に選択的な標的を形成すること
ができる。アルツハイマー病遺伝子内に多くの種々なア
ンチセンス オリゴヌクレオチドが設計され、これらの
全てがＹＡＣ ２３ＣＢ１０、２８ＣＡ１２及び２６Ｆ
Ｆ３のいずれかに含まれるヌクレオチド配列から誘導さ
れることは理解されよう。
【００７０】次に、本発明を下記図面、表及び実施例に
関連して、非限定的に、説明する。図１では、 （ａ）染色体２１のＤ２１Ｓ１６及びフランキング領域
のゲノム及び制限マップ。図示する制限部位は：Ｂ＝Ｂ
ｓｓＨII、Ｆ＝ＳｆｉI、Ｌ＝ＳａｌI、Ｎ＝ＮｏｔI、
Ｓ＝ＳａｃII。ボックスは次のようにプローブのゲノム
位置を示す：Ｃ＝Ｄ２１Ｓ１６、Ｄ＝２８ＣＡ１２Ｒ、
Ｅ＝２６ＦＦ３Ｒ。
関連して、非限定的に、説明する。図１では、 （ａ）染色体２１のＤ２１Ｓ１６及びフランキング領域
のゲノム及び制限マップ。図示する制限部位は：Ｂ＝Ｂ
ｓｓＨII、Ｆ＝ＳｆｉI、Ｌ＝ＳａｌI、Ｎ＝ＮｏｔI、
Ｓ＝ＳａｃII。ボックスは次のようにプローブのゲノム
位置を示す：Ｃ＝Ｄ２１Ｓ１６、Ｄ＝２８ＣＡ１２Ｒ、
Ｅ＝２６ＦＦ３Ｒ。
【００７１】（ｂ）各ＹＡＣの位置と配向とを示すＤ２
１Ｓ１６における本発明のＹＡＣ包含（ｃｏｎｔｉｇ）
並びにＢｓｓＨII、ＳａｃII、ＥａｇI、ＮａｅI、Ｓｆ
ｉI及びＸｈｏIの複合制限マップ。Ｄ２１Ｓ１６遺伝子
座の位置を示す。ＣｐＧ含有制限部位のクラスターはボ
ックスで表示する；黒色で陰影をつけた部位もゲノム制
限マップの一方又は他方に示す。
１Ｓ１６における本発明のＹＡＣ包含（ｃｏｎｔｉｇ）
並びにＢｓｓＨII、ＳａｃII、ＥａｇI、ＮａｅI、Ｓｆ
ｉI及びＸｈｏIの複合制限マップ。Ｄ２１Ｓ１６遺伝子
座の位置を示す。ＣｐＧ含有制限部位のクラスターはボ
ックスで表示する；黒色で陰影をつけた部位もゲノム制
限マップの一方又は他方に示す。
【００７２】図２はＹＡＣクローンの端部を増幅する化
学遺伝学ベクトレット方法の概略図を示す。Ｙ／ＶはＹ
ＡＣベクターを表す。工程（i）では、これを酵素Ｘで
切断する。工程（ii）では、ＶＥとして示すベクトレッ
トを工程（i）の生成物に結合させる。工程（iii）で
は、ＰＣＲプライマーａとａ’を用いて、ＹＡＣベクタ
ーとベクトレットとの間の領域を増幅する。工程（iv）
では、工程（iii）の操作をプライマーｂとｂ’によっ
て繰り返し、この工程の生成物を次にプライマーｃと
ｃ’によって塩基配列決定する。
学遺伝学ベクトレット方法の概略図を示す。Ｙ／ＶはＹ
ＡＣベクターを表す。工程（i）では、これを酵素Ｘで
切断する。工程（ii）では、ＶＥとして示すベクトレッ
トを工程（i）の生成物に結合させる。工程（iii）で
は、ＰＣＲプライマーａとａ’を用いて、ＹＡＣベクタ
ーとベクトレットとの間の領域を増幅する。工程（iv）
では、工程（iii）の操作をプライマーｂとｂ’によっ
て繰り返し、この工程の生成物を次にプライマーｃと
ｃ’によって塩基配列決定する。
【００７３】表１はライブラリー スクリーニングとＹ
ＡＣ特性化とに用いたＰＣＲプライマーを示す。Ｎはこ
の位置に４ヌクレオチドの全てが表されることを示す。
大体のＰＣＲ生成物サイズも記載する。プライマー設計
のための塩基配列はＹＡＣ挿入−末端ＰＣＲ生成物の直
接の塩基配列決定から得た、但しＤ１２Ｓ１３［ピー．
スチニッセン（Ｐ．Ｓｔｉｎｉｓｓｅｎ）等、ニューク
レイック アシドスリサーチ、１９９０、１８、３６７
２］とＡＰＰエキソン（ｅｘｏｎ）１４［エス．ヨシカ
イ（Ｓ．Ｙｏｓｈｉｋａｉ）等、ジーン（Ｇｅｎｅ）、
１９９０、８７、２５７−２６３］とを除く。
ＡＣ特性化とに用いたＰＣＲプライマーを示す。Ｎはこ
の位置に４ヌクレオチドの全てが表されることを示す。
大体のＰＣＲ生成物サイズも記載する。プライマー設計
のための塩基配列はＹＡＣ挿入−末端ＰＣＲ生成物の直
接の塩基配列決定から得た、但しＤ１２Ｓ１３［ピー．
スチニッセン（Ｐ．Ｓｔｉｎｉｓｓｅｎ）等、ニューク
レイック アシドスリサーチ、１９９０、１８、３６７
２］とＡＰＰエキソン（ｅｘｏｎ）１４［エス．ヨシカ
イ（Ｓ．Ｙｏｓｈｉｋａｉ）等、ジーン（Ｇｅｎｅ）、
１９９０、８７、２５７−２６３］とを除く。
【００７４】表２は化学遺伝学方法を用いてＹＡＣの端
部において決定されたヌクレオチド配列を示す。
部において決定されたヌクレオチド配列を示す。
【００７５】表３はＨＴＦ島に隣接して確認されたヌク
レオチド配列を示す。
レオチド配列を示す。
【００７６】表１
【化２１】 表２
【化２２】 表３
【化２３】 酵母人工染色体（ＹＡＣ）ライブラリーの構成 アガロース プラグ中の高分子量ＤＮＡを１．５ｘ１０
7細胞／ｍｌの濃度のヒト リンフォブラストイド（ｌ
ｙｍｐｈｏｂｌａｓｔｏｉｄ）細胞ラインＧＭ１４１６
（４８，ＸＸＸＸ）［ナショナル インスティチュート
オブ ジェネラル メディカル サイエンシス ヒュ
ーマン ジェネティック ムタント セル レポジトリ
ー（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｇ
ｅｎｅｒａｌ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｈ
ｕｍａｎ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｍｕｔａｎｔ Ｃｅｌｌ
Ｒｅｐｏｓｉｔｏｒｙ）、ニュージャシー州、カムデ
ン］から、シュバルツ（Ｓｃｈｗａｒｔｚ）とカンター
（Ｃａｎｔｏｒ）の方法［１９８４、セル（Ｃｅｌ
ｌ），３７、６７−７５］の原理に従って製造した。細
胞ラインＤＮＡからのプラグ製造の詳細は既述したとお
りであった［アナンド（Ａｎａｎｄ）とサザン（Ｓｏｕ
ｔｈｅｒｎ）、核酸のゲル電気泳動（Ｇｅｌ Ｅｌｅｃ
ｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ ｏｆ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃ
ｉｄｓ）、１０１−１２３頁、ディ．リックウッド
（Ｄ．Ｒｉｃｋｗｏｏｄ）とビー．ディ．ヘイムス
（Ｂ．Ｄ．Ｈａｍｅｓ）編集、ＩＲＬプレス、英国、オ
ックスフォード］。個々のプラグは〜１．５ｘ１０6細
胞を含み、約１０μｇのＤＮＡ含量を有した。分取分画
のために、完全なプラグ１０個（〜１００μｇ）を２０
倍過剰な１ｘＴＥ（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ
７．５、２ｍＭ ＥＤＴＡ）中で４℃において１６時間
平衡させ、次に１ｘＴＥ中で２回３０分間洗浄し、次に
４℃において２０倍過剰なＥｃｏＲＩ制限バッファー中
で６０分間洗浄した。ＥｃｏＲＩバッファーは１００ｍ
Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ７．５、５０ｍＭ ＮａＣ
ｌ、５ｍＭ ＭｇＣｌ2、１００μｇ／ｍｌウシ血清ア
ルブミン、７ｍＭ ２−メルカプトエタノール又は便利
には、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ７．５、１０
０ｍＭ ＮａＣｌ、６ｍＭ ＭｇＣｌ2、１００μｇ／
ｍｌゼラチン、１〜２ｍＭ ジチオスレイトールであ
る。バッファーを新鮮な冷バッファー＋ＥｃｏＲＩと置
換して、最終プラグ＋バッファー３ｍｌ量とＥｃｏＲＩ
５単位／ｍｌ濃度とを得た。プラグを氷上に３０分
間、時々混合しながら維持して、酵素を平衡させた。こ
れらを次に室温においてインキュベートし、５分毎に３
０分間にわたってプラグ１個を取り出した。インキュベ
ーションを３７℃において続け、再び５分間毎にプラグ
１個を取り出した。追加の１０ｍＭ ＥＤＴＡを含む冷
ＴＡＥ（４０ｍＭ ＴｒｉｓアセテートｐＨ８．３、２
ｍＭ ＥＤＴＡ）中にプラグを滴下することによって消
化を停止させた。これは最終ＹＡＣライブラリー中にヒ
ト ゲノムをより良く表示するための広範囲の部分消化
物を得るために好ましい方法である。
7細胞／ｍｌの濃度のヒト リンフォブラストイド（ｌ
ｙｍｐｈｏｂｌａｓｔｏｉｄ）細胞ラインＧＭ１４１６
（４８，ＸＸＸＸ）［ナショナル インスティチュート
オブ ジェネラル メディカル サイエンシス ヒュ
ーマン ジェネティック ムタント セル レポジトリ
ー（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｇ
ｅｎｅｒａｌ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｈ
ｕｍａｎ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｍｕｔａｎｔ Ｃｅｌｌ
Ｒｅｐｏｓｉｔｏｒｙ）、ニュージャシー州、カムデ
ン］から、シュバルツ（Ｓｃｈｗａｒｔｚ）とカンター
（Ｃａｎｔｏｒ）の方法［１９８４、セル（Ｃｅｌ
ｌ），３７、６７−７５］の原理に従って製造した。細
胞ラインＤＮＡからのプラグ製造の詳細は既述したとお
りであった［アナンド（Ａｎａｎｄ）とサザン（Ｓｏｕ
ｔｈｅｒｎ）、核酸のゲル電気泳動（Ｇｅｌ Ｅｌｅｃ
ｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ ｏｆ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃ
ｉｄｓ）、１０１−１２３頁、ディ．リックウッド
（Ｄ．Ｒｉｃｋｗｏｏｄ）とビー．ディ．ヘイムス
（Ｂ．Ｄ．Ｈａｍｅｓ）編集、ＩＲＬプレス、英国、オ
ックスフォード］。個々のプラグは〜１．５ｘ１０6細
胞を含み、約１０μｇのＤＮＡ含量を有した。分取分画
のために、完全なプラグ１０個（〜１００μｇ）を２０
倍過剰な１ｘＴＥ（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ
７．５、２ｍＭ ＥＤＴＡ）中で４℃において１６時間
平衡させ、次に１ｘＴＥ中で２回３０分間洗浄し、次に
４℃において２０倍過剰なＥｃｏＲＩ制限バッファー中
で６０分間洗浄した。ＥｃｏＲＩバッファーは１００ｍ
Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ７．５、５０ｍＭ ＮａＣ
ｌ、５ｍＭ ＭｇＣｌ2、１００μｇ／ｍｌウシ血清ア
ルブミン、７ｍＭ ２−メルカプトエタノール又は便利
には、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ７．５、１０
０ｍＭ ＮａＣｌ、６ｍＭ ＭｇＣｌ2、１００μｇ／
ｍｌゼラチン、１〜２ｍＭ ジチオスレイトールであ
る。バッファーを新鮮な冷バッファー＋ＥｃｏＲＩと置
換して、最終プラグ＋バッファー３ｍｌ量とＥｃｏＲＩ
５単位／ｍｌ濃度とを得た。プラグを氷上に３０分
間、時々混合しながら維持して、酵素を平衡させた。こ
れらを次に室温においてインキュベートし、５分毎に３
０分間にわたってプラグ１個を取り出した。インキュベ
ーションを３７℃において続け、再び５分間毎にプラグ
１個を取り出した。追加の１０ｍＭ ＥＤＴＡを含む冷
ＴＡＥ（４０ｍＭ ＴｒｉｓアセテートｐＨ８．３、２
ｍＭ ＥＤＴＡ）中にプラグを滴下することによって消
化を停止させた。これは最終ＹＡＣライブラリー中にヒ
ト ゲノムをより良く表示するための広範囲の部分消化
物を得るために好ましい方法である。
【００７７】ベクター プラスミドｐＹＡＣ４を成長さ
せ、塩化セシウム／臭化エチジウムバンドを含む標準プ
ラスミド マキシープレプ プロトコールを用いて精製
した［マニアティス ティ．（Ｍａｎｉａｔｉｓ
Ｔ．）、フリシュ イー．エフ．（Ｆｒｉｔｓｈ Ｅ．
Ｆ．）及びサン．ブロック ジェイ．（Ｓａｍｂｒｏｏ
ｋＪ．）、１９８２、分子クローニング：実験室マニュ
アル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｉｎｇ：Ａ Ｌａｂ
ｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ）、コールド スプリン
グ ハーバー ラボラトリー プレス（Ｃｏｌｄ Ｓｐ
ｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒ
ｅｓｓ）］。ＤＮＡ（５００μｇ）をＢａｍＨＩ（２０
０単位）によって消化させ、消化物を完全性に関して検
査した。塩濃度を高めて、ＥｃｏＲＩ（２００単位）を
加え、消化を続けさせ、再び消化物を完全性に関して検
査した。ＤＮＡを沈殿させ、再懸濁させ、ウシ腸アルカ
リホスファターゼ（１単位）を用いて脱ホスホリル化し
た。脱ホスホリル化効率はこのベクターが自己連結する
能力を有さないがホスホリル化末端を有するＥｃｏＲＩ
切断ＤＮＡに連結する能力を保持することによってテス
トした。
せ、塩化セシウム／臭化エチジウムバンドを含む標準プ
ラスミド マキシープレプ プロトコールを用いて精製
した［マニアティス ティ．（Ｍａｎｉａｔｉｓ
Ｔ．）、フリシュ イー．エフ．（Ｆｒｉｔｓｈ Ｅ．
Ｆ．）及びサン．ブロック ジェイ．（Ｓａｍｂｒｏｏ
ｋＪ．）、１９８２、分子クローニング：実験室マニュ
アル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｉｎｇ：Ａ Ｌａｂ
ｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ）、コールド スプリン
グ ハーバー ラボラトリー プレス（Ｃｏｌｄ Ｓｐ
ｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒ
ｅｓｓ）］。ＤＮＡ（５００μｇ）をＢａｍＨＩ（２０
０単位）によって消化させ、消化物を完全性に関して検
査した。塩濃度を高めて、ＥｃｏＲＩ（２００単位）を
加え、消化を続けさせ、再び消化物を完全性に関して検
査した。ＤＮＡを沈殿させ、再懸濁させ、ウシ腸アルカ
リホスファターゼ（１単位）を用いて脱ホスホリル化し
た。脱ホスホリル化効率はこのベクターが自己連結する
能力を有さないがホスホリル化末端を有するＥｃｏＲＩ
切断ＤＮＡに連結する能力を保持することによってテス
トした。
【００７８】ＥｃｏＲＩ部分消化ゲノムＤＮＡのパルス
化フィールド（ｐｕｌｓｅｄ ｆｉｅｌｄ）ゲル電気泳
動分画は「ワルツァー（Ｗａｌｔｚｅｒ）」装置で実施
した［アナンド，アール．、１９８６、トレンドス イ
ン ジェネチックス（Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｇｅｎｅｔ
ｉｃｓ）、２、２７８−２８３；サザン等、１９８７、
ニュークレイック アシドス リサーチ、１５、５９２
５−５９４３］。ＤＮＡフラグメント＞２００ｋｂを選
択し、ＤＮＡを含むゲル スライスをアナンド等、１９
８９、ニュークレイック アシドス リサーチ、１７、
３４２５−３４３３の記載に従って処理した。
化フィールド（ｐｕｌｓｅｄ ｆｉｅｌｄ）ゲル電気泳
動分画は「ワルツァー（Ｗａｌｔｚｅｒ）」装置で実施
した［アナンド，アール．、１９８６、トレンドス イ
ン ジェネチックス（Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｇｅｎｅｔ
ｉｃｓ）、２、２７８−２８３；サザン等、１９８７、
ニュークレイック アシドス リサーチ、１５、５９２
５−５９４３］。ＤＮＡフラグメント＞２００ｋｂを選
択し、ＤＮＡを含むゲル スライスをアナンド等、１９
８９、ニュークレイック アシドス リサーチ、１７、
３４２５−３４３３の記載に従って処理した。
【００７９】分画後に回収したゲノムＤＮＡを、シュラ
イヘル（Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ）とシール（Ｓｃｈｕｅ
ｌｌ）によって提供される真空透析装置を用いてＵＨ１
００／７５ウルトラ シンブル（ｔｈｉｍｂｌｅ）（真
空透析膜）中、低い減圧（〜３００ｍｍＨｇ）下で約５
ｍｌにまで濃縮した。次に、ＤＮＡ溶液を同じウルトラ
シンブル中で冷１ｘＴＨ １リットルに対して一晩透
析した。脱ホスホリル化ベクター（１００μｇ）を加
え、ＤＮＡを２ｍｌに再び濃縮した。次に、これを〜３
ｍｍの開口を与えるようにカットされた先端を有する１
０００μｌピペットを用いて１５ｍｌ−滅菌ファルコン
管（Ｆａｌｃｏｎ ｔｕｂｅ）に移して、１０ｘ連結バ
ッファー２２０μｌを加えた。氷上で１時間平衡させた
後に、１ｘ連結バッファー８００μｌ中のＴ４ＤＮＡリ
ガーゼ（６０単位）を、分配先端を穏やかに動かしなが
ら、加えて、徐々に分散させた。氷上でさらに１時間平
衡させた後に、連結ミックスを１２℃において一晩イン
キュベートした。これは非接触インサートを減じて連結
イベントを挿入するために全ての成分をほぼ完全に混合
する好ましい手段である。上記の穏やかな方法を用い
て、連結ＤＮＡをフェノールで１回、クロロホルム／イ
ソアミルアルコールで１回抽出し、再び同じウルトラ
シンブルに移した。ＤＮＡを１．５ｍｌに濃縮し、再び
〜３ｍｍの開口を与える先端を用いて１．５ｍｌ−エッ
ペンドルフ管（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ ｔｕｂｅ）に移し
た。この状態で、ＤＮＡを４℃において数カ月貯蔵する
ことができ、転換効率の注目すべき低下は見られなかっ
た。サッカロミセス セレヴィジエ（Ｓａｃｃｈａｒｏ
ｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＡＢ１３８０（Ｍ
ＡＴａΨ+ ｕｒａ３ ｔｒｐ１ ａｄｅ２−１ ｃａ
ｎ１−１００ ｌｙｓ２−１ｈｉｓ５）細胞をリティカ
ーゼによってスフェロブラスト化し、発表プロトコール
［ピー．エム．アイ．バージャーとケイ．ジェイ．パー
シバル（Ｋ．Ｊ．Ｐｅｒｃｉｖａｌ）、１９８７、アナ
リティカル バイオケミストリー（Ａｎａｌｙｔｉｃａ
ｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）、１６３、３９４１−
３９７］に従って形質転換した、但し３０μｌ量中の２
μｇ未満の連結ＤＮＡをスフェロプラスト（酵母培養物
１７．５ｍｌから）７００μｌと共に用いた。ウラシル
を含まない２個の９ｃｍ直径プレート上の寒天中に形質
転換ミックスを入れ、３０℃において４８−７２時間イ
ンキュベートした。形質転換効率を監視するために、対
照形質転換には非カットｐＹＡＣ４ １００ｎｇを用い
た。１次形質転換プレートを用いて、既述したような完
全グリッド化ＹＡＣライブラリーを構成した［アナンド
等、１９９０、ニュークレイック アシドス リサー
チ、１８、１９５１−１９５６］。簡単に説明すると、
寒天中からコロニーを二重選択回収プレートの表面に取
り出しし、９６コロニー列を形成した。次に、プレート
を３０℃において３日間増殖させて、大きいコロニーを
形成した。次に、ＳＤ培地中に２０％グリセロールを含
む９６孔マイクロタイタープレートに接種した。各コロ
ニーのアリコートを１０ｘ１０ｃｍプレートに接種し
て、９ｘ９６列（８６４コロニー）を形成した。これら
のマスタープレートを３０℃において２４時間増殖させ
た。オリジナルの回収プレートを３０℃において２日間
再増殖させ、細胞を回収して、ＰＦＧＥ及びＰＣＲ分析
用のＤＮＡプラグを形成した。３レプリカ リフトをマ
スタープレートからハイボンド（Ｈｙｂｏｎｄ）Ｎもし
くは同様なフィルター上に取り出し、３０℃において一
晩増殖させた。マスタープレートを再増殖させ、細胞を
回収して、ＰＣＲ分析用のＤＮＡプラグを形成した。レ
プリカの中の２個を２０％グリセロールを含むＳＤ寒天
上でさらに４時間増殖させてから、−７０℃で貯蔵し
た。１２スレーブ（ｓｌａｖｅ）リフトを第３レプリカ
プレートから取り出した。スレーブリフトを３０℃にお
いて２日間増殖させてからリティカーゼによって処理し
て、細胞をスフェロプラスト化した。次に細胞を１０％
ＳＤＳによって溶解し、アルカリによって変性させ、２
ｘＳＳＣによる洗浄によって中和し、ＤＮＡを焼成（ｂ
ａｋｉｎｇ）又はＵＶ固定によってフィルターに固定し
た。全体で４０マスターフィルターの１２コピーを製造
した（４０ｘ８６４クローン）。
イヘル（Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ）とシール（Ｓｃｈｕｅ
ｌｌ）によって提供される真空透析装置を用いてＵＨ１
００／７５ウルトラ シンブル（ｔｈｉｍｂｌｅ）（真
空透析膜）中、低い減圧（〜３００ｍｍＨｇ）下で約５
ｍｌにまで濃縮した。次に、ＤＮＡ溶液を同じウルトラ
シンブル中で冷１ｘＴＨ １リットルに対して一晩透
析した。脱ホスホリル化ベクター（１００μｇ）を加
え、ＤＮＡを２ｍｌに再び濃縮した。次に、これを〜３
ｍｍの開口を与えるようにカットされた先端を有する１
０００μｌピペットを用いて１５ｍｌ−滅菌ファルコン
管（Ｆａｌｃｏｎ ｔｕｂｅ）に移して、１０ｘ連結バ
ッファー２２０μｌを加えた。氷上で１時間平衡させた
後に、１ｘ連結バッファー８００μｌ中のＴ４ＤＮＡリ
ガーゼ（６０単位）を、分配先端を穏やかに動かしなが
ら、加えて、徐々に分散させた。氷上でさらに１時間平
衡させた後に、連結ミックスを１２℃において一晩イン
キュベートした。これは非接触インサートを減じて連結
イベントを挿入するために全ての成分をほぼ完全に混合
する好ましい手段である。上記の穏やかな方法を用い
て、連結ＤＮＡをフェノールで１回、クロロホルム／イ
ソアミルアルコールで１回抽出し、再び同じウルトラ
シンブルに移した。ＤＮＡを１．５ｍｌに濃縮し、再び
〜３ｍｍの開口を与える先端を用いて１．５ｍｌ−エッ
ペンドルフ管（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ ｔｕｂｅ）に移し
た。この状態で、ＤＮＡを４℃において数カ月貯蔵する
ことができ、転換効率の注目すべき低下は見られなかっ
た。サッカロミセス セレヴィジエ（Ｓａｃｃｈａｒｏ
ｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＡＢ１３８０（Ｍ
ＡＴａΨ+ ｕｒａ３ ｔｒｐ１ ａｄｅ２−１ ｃａ
ｎ１−１００ ｌｙｓ２−１ｈｉｓ５）細胞をリティカ
ーゼによってスフェロブラスト化し、発表プロトコール
［ピー．エム．アイ．バージャーとケイ．ジェイ．パー
シバル（Ｋ．Ｊ．Ｐｅｒｃｉｖａｌ）、１９８７、アナ
リティカル バイオケミストリー（Ａｎａｌｙｔｉｃａ
ｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）、１６３、３９４１−
３９７］に従って形質転換した、但し３０μｌ量中の２
μｇ未満の連結ＤＮＡをスフェロプラスト（酵母培養物
１７．５ｍｌから）７００μｌと共に用いた。ウラシル
を含まない２個の９ｃｍ直径プレート上の寒天中に形質
転換ミックスを入れ、３０℃において４８−７２時間イ
ンキュベートした。形質転換効率を監視するために、対
照形質転換には非カットｐＹＡＣ４ １００ｎｇを用い
た。１次形質転換プレートを用いて、既述したような完
全グリッド化ＹＡＣライブラリーを構成した［アナンド
等、１９９０、ニュークレイック アシドス リサー
チ、１８、１９５１−１９５６］。簡単に説明すると、
寒天中からコロニーを二重選択回収プレートの表面に取
り出しし、９６コロニー列を形成した。次に、プレート
を３０℃において３日間増殖させて、大きいコロニーを
形成した。次に、ＳＤ培地中に２０％グリセロールを含
む９６孔マイクロタイタープレートに接種した。各コロ
ニーのアリコートを１０ｘ１０ｃｍプレートに接種し
て、９ｘ９６列（８６４コロニー）を形成した。これら
のマスタープレートを３０℃において２４時間増殖させ
た。オリジナルの回収プレートを３０℃において２日間
再増殖させ、細胞を回収して、ＰＦＧＥ及びＰＣＲ分析
用のＤＮＡプラグを形成した。３レプリカ リフトをマ
スタープレートからハイボンド（Ｈｙｂｏｎｄ）Ｎもし
くは同様なフィルター上に取り出し、３０℃において一
晩増殖させた。マスタープレートを再増殖させ、細胞を
回収して、ＰＣＲ分析用のＤＮＡプラグを形成した。レ
プリカの中の２個を２０％グリセロールを含むＳＤ寒天
上でさらに４時間増殖させてから、−７０℃で貯蔵し
た。１２スレーブ（ｓｌａｖｅ）リフトを第３レプリカ
プレートから取り出した。スレーブリフトを３０℃にお
いて２日間増殖させてからリティカーゼによって処理し
て、細胞をスフェロプラスト化した。次に細胞を１０％
ＳＤＳによって溶解し、アルカリによって変性させ、２
ｘＳＳＣによる洗浄によって中和し、ＤＮＡを焼成（ｂ
ａｋｉｎｇ）又はＵＶ固定によってフィルターに固定し
た。全体で４０マスターフィルターの１２コピーを製造
した（４０ｘ８６４クローン）。
【００８０】既述した方法［アナンド等、１９９０、ニ
ュークレイック アシドス リサーチ、１８、１９５１
−１９５６］を用いて、高分子量酵母細胞を製造した。
簡単には、グリセロール ストックのアリコートを用い
て、１０ｍｌ培地［６．７ｇ／ｌ バクト酵母窒素ベー
ス、アミノ酸を含まず、２０ｇ／ｌ グルコース、５５
ｍｇ／ｌ チロシン、１４ｇ／ｌ カサミノ酸］を接種
して、３０℃において４００ｒｐｍで一晩振とうした。
細胞を回収して、５０ｍＭ ＥＤＴＡ中で１回洗浄し、
１Ｍソルビトール、２０ｍＭ ＥＤＴＡ、１４ｍＭ ２
−メルカプトエタノール及び１ｍｇ／ｍｌ ジモラーゼ
もしくは２０単位／ｍｌ リティカーゼ中に５００μｌ
まで再懸濁させた。３７℃におけるインキュベーション
後に、スフェロプラスト形成を監視し、〜８０％まで進
行させた（〜１時間）。同じ溶液中の１％ＬＧＴアガロ
ースの等量を加え、混合物をプラグ型に注入した。次
に、ドデシル硫酸リチウムを用いるがプロテアーゼを用
いない酵母染色体サイズマーカープロトコールに従い、
ＤＮＡサンプルを「ワルツァー」ＰＦＧＥ装置で分析し
た［アナンド，アール．、１９８６、トレンドス イン
ジェネチックス、２、２７８−２８３；サザン等、１
９８７、ニュークレイック アシドス リサーチ、１
５、５９２５−５９４３］。
ュークレイック アシドス リサーチ、１８、１９５１
−１９５６］を用いて、高分子量酵母細胞を製造した。
簡単には、グリセロール ストックのアリコートを用い
て、１０ｍｌ培地［６．７ｇ／ｌ バクト酵母窒素ベー
ス、アミノ酸を含まず、２０ｇ／ｌ グルコース、５５
ｍｇ／ｌ チロシン、１４ｇ／ｌ カサミノ酸］を接種
して、３０℃において４００ｒｐｍで一晩振とうした。
細胞を回収して、５０ｍＭ ＥＤＴＡ中で１回洗浄し、
１Ｍソルビトール、２０ｍＭ ＥＤＴＡ、１４ｍＭ ２
−メルカプトエタノール及び１ｍｇ／ｍｌ ジモラーゼ
もしくは２０単位／ｍｌ リティカーゼ中に５００μｌ
まで再懸濁させた。３７℃におけるインキュベーション
後に、スフェロプラスト形成を監視し、〜８０％まで進
行させた（〜１時間）。同じ溶液中の１％ＬＧＴアガロ
ースの等量を加え、混合物をプラグ型に注入した。次
に、ドデシル硫酸リチウムを用いるがプロテアーゼを用
いない酵母染色体サイズマーカープロトコールに従い、
ＤＮＡサンプルを「ワルツァー」ＰＦＧＥ装置で分析し
た［アナンド，アール．、１９８６、トレンドス イン
ジェネチックス、２、２７８−２８３；サザン等、１
９８７、ニュークレイック アシドス リサーチ、１
５、５９２５−５９４３］。
【００８１】ゲノムＰＦＧＥ ＬＧＴアガロース プラグ中でヒト リンフォブラスト
イド細胞ライン、ＧＭ１４１６から高分子量ＤＮＡを製
造した［シュバルツとカンター、セル、１９８４、３
７、６７−７５］。細胞はＹＡＣライブラリー構成に用
いたものと同じ培養エージ（ｃｕｌｔｕｒｅ ａｇｅ）
であった。残りのプロトコールはアナンドとサザン、核
酸のゲル電気泳動、ディ．リックウッドとビー．ディ．
ヘイムス編集、ＩＲＬプレス、英国、オックスフォー
ド、１９９０、１０１−１２３頁の記載と本質的に同じ
であった。要約すると、各１００ｍｌアガロースプラグ
は〜９μｇＤＮＡを含有した。消化の前に、充分なプラ
グを室温において無菌ＴＥ（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣ
ｌ、１ｍＭ ｄｉＮａＥＤＴＡ ｐＨ８．０）と室温に
おいて１６時間、バッファーを２回交換して、平衡させ
た。次に、プラグの１／３を氷上で適当な１ｘ制限バッ
ファー（ＤＤＴ、スペルミジン及びゼラチンを含まず）
５００ｍｌと２時間平衡させた。次に、プラグの各１／
３を１ｘ制限バッファー１００ｍｌ（１ｍＭ ＤＤＴ、
２ｍＭスペルミジン及び１００ｍｇ／ｍｌゼラチンを含
む）中に移し、氷上で１５分間平衡させてから、適当な
消化温度において２−４時間インキュベートした。二重
消化の場合には、第１酵素による制限後に、プラグを第
２バッファー中で３０分間氷上で平衡させてから、平衡
及び消化のために酵素を含む完全なバッファーに移し
た。さらに１０ｍＭ ｄｉＮａＥＤＴＡを含む０．５ｘ
ＴＡＥ（１リットルはＴｒｉｓベース２．４２ｇ，氷酢
酸 ０．５７１ｍｌ、０．５Ｍ ｄｉＮａＥＤＴＡ２ｍ
ｌ、ｐＨ８．０）１ｍｌを添加して、全ての反応を停止
させ、パルス フィールド ゲル上に負荷させるまで氷
上に維持した。処理した（ｒｕｎ）各ゲルは、非特異的
ヌクレアーゼ分解を制御するために酵素を添加せずに同
じ処理を施したＤＮＡプラグをも含んだ。
イド細胞ライン、ＧＭ１４１６から高分子量ＤＮＡを製
造した［シュバルツとカンター、セル、１９８４、３
７、６７−７５］。細胞はＹＡＣライブラリー構成に用
いたものと同じ培養エージ（ｃｕｌｔｕｒｅ ａｇｅ）
であった。残りのプロトコールはアナンドとサザン、核
酸のゲル電気泳動、ディ．リックウッドとビー．ディ．
ヘイムス編集、ＩＲＬプレス、英国、オックスフォー
ド、１９９０、１０１−１２３頁の記載と本質的に同じ
であった。要約すると、各１００ｍｌアガロースプラグ
は〜９μｇＤＮＡを含有した。消化の前に、充分なプラ
グを室温において無菌ＴＥ（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣ
ｌ、１ｍＭ ｄｉＮａＥＤＴＡ ｐＨ８．０）と室温に
おいて１６時間、バッファーを２回交換して、平衡させ
た。次に、プラグの１／３を氷上で適当な１ｘ制限バッ
ファー（ＤＤＴ、スペルミジン及びゼラチンを含まず）
５００ｍｌと２時間平衡させた。次に、プラグの各１／
３を１ｘ制限バッファー１００ｍｌ（１ｍＭ ＤＤＴ、
２ｍＭスペルミジン及び１００ｍｇ／ｍｌゼラチンを含
む）中に移し、氷上で１５分間平衡させてから、適当な
消化温度において２−４時間インキュベートした。二重
消化の場合には、第１酵素による制限後に、プラグを第
２バッファー中で３０分間氷上で平衡させてから、平衡
及び消化のために酵素を含む完全なバッファーに移し
た。さらに１０ｍＭ ｄｉＮａＥＤＴＡを含む０．５ｘ
ＴＡＥ（１リットルはＴｒｉｓベース２．４２ｇ，氷酢
酸 ０．５７１ｍｌ、０．５Ｍ ｄｉＮａＥＤＴＡ２ｍ
ｌ、ｐＨ８．０）１ｍｌを添加して、全ての反応を停止
させ、パルス フィールド ゲル上に負荷させるまで氷
上に維持した。処理した（ｒｕｎ）各ゲルは、非特異的
ヌクレアーゼ分解を制御するために酵素を添加せずに同
じ処理を施したＤＮＡプラグをも含んだ。
【００８２】ＰＦＧＥは前述のワルツァー装置で実施し
た［アナンド，アール．、１９８６、トレンドス イン
ジェネチックス、２、２７８−２８３；サザン等、１
９８７、ニュークレイック アシドス リサーチ、１
５、５９２５−５９４３］。ＤＮＡを０．５ｘＴＡＥ中
の１．５％アガロース ゲル中で、１８℃、パルス時間
６５秒間によって１５０Ｖ／３００ｍＡにおいて〜３３
時間分画した。これらの条件下で、５０−１０００ｋｂ
範囲内のＤＮＡフラグメントを分析した。サイズ基準と
して、ラムダ オリゴマー（プロメガ）とＡＢ１３８０
酵母ゲノムＤＮＡを用いた。電気泳動後に、ゲルを染色
し、写真撮影し、標準方法を用いてハイバンドＮ＋によ
ってブロットした。移したＤＮＡをＵＶ架橋によってフ
ィルターに固定した。我々自身の変更方法を用いて、ハ
イブリッド化を実施した。オートラジオグラフィーの前
にフィルターを６５℃において０．５ＳＳＣまで洗浄し
た。フィルターを沸騰０．１％ＳＤＳ中への浸漬によっ
て除去し、次のプローブによるハイブリッド化の前にフ
ィルムに再暴露した。
た［アナンド，アール．、１９８６、トレンドス イン
ジェネチックス、２、２７８−２８３；サザン等、１
９８７、ニュークレイック アシドス リサーチ、１
５、５９２５−５９４３］。ＤＮＡを０．５ｘＴＡＥ中
の１．５％アガロース ゲル中で、１８℃、パルス時間
６５秒間によって１５０Ｖ／３００ｍＡにおいて〜３３
時間分画した。これらの条件下で、５０−１０００ｋｂ
範囲内のＤＮＡフラグメントを分析した。サイズ基準と
して、ラムダ オリゴマー（プロメガ）とＡＢ１３８０
酵母ゲノムＤＮＡを用いた。電気泳動後に、ゲルを染色
し、写真撮影し、標準方法を用いてハイバンドＮ＋によ
ってブロットした。移したＤＮＡをＵＶ架橋によってフ
ィルターに固定した。我々自身の変更方法を用いて、ハ
イブリッド化を実施した。オートラジオグラフィーの前
にフィルターを６５℃において０．５ＳＳＣまで洗浄し
た。フィルターを沸騰０．１％ＳＤＳ中への浸漬によっ
て除去し、次のプローブによるハイブリッド化の前にフ
ィルムに再暴露した。
【００８３】用いたハイブリッド化プローブは次のとお
りであった：ｐＧＳＥ９／Ｄ２１Ｓ１６［ジー．ディ．
ステワルト（Ｇ．Ｄ．Ｓｔｅｗａｒｔ）等、ニュークレ
イック アシドス リサーチ、１９８５、１３、４１２
５−４１３２；ＡＴＣＣ受け入れ番号５９４６８／バク
テリオファージ、５９４６９／ＤＮＡ］、２８ＣＡ１２
Ｒ及び２６ＦＦ３Ｒ（表２参照）。ＡＴＣＣは米国、メ
リーランド州２０８５２、ロックヴィル、パークローン
ドライブ１２３０１である。
りであった：ｐＧＳＥ９／Ｄ２１Ｓ１６［ジー．ディ．
ステワルト（Ｇ．Ｄ．Ｓｔｅｗａｒｔ）等、ニュークレ
イック アシドス リサーチ、１９８５、１３、４１２
５−４１３２；ＡＴＣＣ受け入れ番号５９４６８／バク
テリオファージ、５９４６９／ＤＮＡ］、２８ＣＡ１２
Ｒ及び２６ＦＦ３Ｒ（表２参照）。ＡＴＣＣは米国、メ
リーランド州２０８５２、ロックヴィル、パークローン
ドライブ１２３０１である。
【００８４】ＹＡＣの単離と初期特性化 ヒトＤＮＡの３．５ゲノム等価ＹＡＣライブラリーの構
成とスクリーニング方法、ＹＡＣクローンの初期特性
化、ＹＡＣ ＤＮＡによるポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣ
Ｒ）の使用に関するこれ以上の詳細は、アナンド等、ニ
ュークレイックアシドス リサーチ、１９８９、１７、
３４２５−３４３３；アナンド等、ニュークレイック
アシドス リサーチ、１９９０、１８、１９５１−１９
５６；アナンド等、ゲノミックス（Ｇｅｎｉｍｉｃ
ｓ）、１９９１、９、１２４−１３０に記載されてお
り、また我々のヨーロッパ特許出願公開第４１６８０１
号に記載されている。
成とスクリーニング方法、ＹＡＣクローンの初期特性
化、ＹＡＣ ＤＮＡによるポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣ
Ｒ）の使用に関するこれ以上の詳細は、アナンド等、ニ
ュークレイックアシドス リサーチ、１９８９、１７、
３４２５−３４３３；アナンド等、ニュークレイック
アシドス リサーチ、１９９０、１８、１９５１−１９
５６；アナンド等、ゲノミックス（Ｇｅｎｉｍｉｃ
ｓ）、１９９１、９、１２４−１３０に記載されてお
り、また我々のヨーロッパ特許出願公開第４１６８０１
号に記載されている。
【００８５】ＹＡＣの制限マッピング ＤＮＡプラグ（〜３μｇ）を４℃において穏やかに撹拌
しながらＴＥ５０ｍｌに対して一晩透析した。次に、プ
ラグを新たなＴＥ５０ｍｌによってさらに１時間洗浄し
た。各制限酵素に対して、１個のプラグを１ｘ消化バッ
ファー（ＤＤＴ又はゼラチンを含まず）５ｍｌと４℃に
おいて１時間平衡させた。この間に、種々な量の制限酵
素［ＸｈｏI：０．２、４．０及び２０単位；ＳｆｉI；
０．２、２．０及び２０単位；ＢｓｓＨII：０．１６、
０．４及び４．０単位；ＮａｅＩ：０．４、２．０及び
２０単位；ＥａｇＩ：１．０、２０単位；ＮｏｔＩ：
２．０及び４０単位；ＳａｃII：２．０及び４０単位］
を、ＤＤＴ（１ｍＭ），スペルミジン（２ｍＭ）及びゼ
ラチン（１００μｇ／ｍｌ）と共に含む１ｘ反応バッフ
ァーの１００μｌを氷上の１．５ｍｌ管中に調製した。
適当な平衡化プラグ（〜１μｇＤＮＡ）の１／３を各消
化ミックスに加えた。全ての管を氷上にさらに３０分間
放置した後に、３７℃において（ＸｈｏＩ，ＮａｅＩ，
ＳａｌＩ，ＥａｇＩ，ＮｏｔＩ及びＳａｃII）又は５０
℃（ＢｓｓＨII，ＳｆｉＩ）において１時間（部分消
化）又は２時間（完全消化）インキュベートした。消化
物をワルツァーＰＦＧＥ装置上で２０℃において０．５
ｘＴＡＥ中の１．５％アガロースゲル中でのＰＦＧＥに
よって、１００ｋｂのＹＡＣ ＤＮＡにつき５秒間のパ
ルス時間＋５秒間の切り換え時間を用いて分画した。バ
クテリオファージ ラムダコンカテマーとＨｉｎｄIII
消化物をＤＮＡサイズマーカーとして用いた。ゲルを染
色し、写真撮影し、標準方法を用いてジーン スクリー
ン（Ｇｅｎｅ Ｓｃｒｅｅｎ）［デュポン（ＤｕＰｏｎ
ｔ）］又はハイバンドＮ＋［アマーシャム（Ａｍｅｒｓ
ｈａｍ）］上にブロットした。フィルターを最初に、ｐ
ＹＡＣ４アームの各々に対応するｐＢＲ３２２ ＤＮＡ
プローブとハイブリッド化させ［ブルケ（Ｂｕｒｋｅ）
等、サイエンス、１９８７、２３６、８０６−８１
２］、次に利用可能な内部プローブとハイブリッド化さ
せ、最後に３２ｐ標識ラムダＤＮＡとハイブリッド化さ
せて、サイズマーカーを目視可能にする。得られるオー
トラジオグラフは各ベクターアームと内部プローブとを
含む大抵の部分消化産物のサイズを表示する。これらの
データを用いて、ＹＡＣの共通（ｃｏｎｓｅｎｓｕｓ）
制限マップを構成した。
しながらＴＥ５０ｍｌに対して一晩透析した。次に、プ
ラグを新たなＴＥ５０ｍｌによってさらに１時間洗浄し
た。各制限酵素に対して、１個のプラグを１ｘ消化バッ
ファー（ＤＤＴ又はゼラチンを含まず）５ｍｌと４℃に
おいて１時間平衡させた。この間に、種々な量の制限酵
素［ＸｈｏI：０．２、４．０及び２０単位；ＳｆｉI；
０．２、２．０及び２０単位；ＢｓｓＨII：０．１６、
０．４及び４．０単位；ＮａｅＩ：０．４、２．０及び
２０単位；ＥａｇＩ：１．０、２０単位；ＮｏｔＩ：
２．０及び４０単位；ＳａｃII：２．０及び４０単位］
を、ＤＤＴ（１ｍＭ），スペルミジン（２ｍＭ）及びゼ
ラチン（１００μｇ／ｍｌ）と共に含む１ｘ反応バッフ
ァーの１００μｌを氷上の１．５ｍｌ管中に調製した。
適当な平衡化プラグ（〜１μｇＤＮＡ）の１／３を各消
化ミックスに加えた。全ての管を氷上にさらに３０分間
放置した後に、３７℃において（ＸｈｏＩ，ＮａｅＩ，
ＳａｌＩ，ＥａｇＩ，ＮｏｔＩ及びＳａｃII）又は５０
℃（ＢｓｓＨII，ＳｆｉＩ）において１時間（部分消
化）又は２時間（完全消化）インキュベートした。消化
物をワルツァーＰＦＧＥ装置上で２０℃において０．５
ｘＴＡＥ中の１．５％アガロースゲル中でのＰＦＧＥに
よって、１００ｋｂのＹＡＣ ＤＮＡにつき５秒間のパ
ルス時間＋５秒間の切り換え時間を用いて分画した。バ
クテリオファージ ラムダコンカテマーとＨｉｎｄIII
消化物をＤＮＡサイズマーカーとして用いた。ゲルを染
色し、写真撮影し、標準方法を用いてジーン スクリー
ン（Ｇｅｎｅ Ｓｃｒｅｅｎ）［デュポン（ＤｕＰｏｎ
ｔ）］又はハイバンドＮ＋［アマーシャム（Ａｍｅｒｓ
ｈａｍ）］上にブロットした。フィルターを最初に、ｐ
ＹＡＣ４アームの各々に対応するｐＢＲ３２２ ＤＮＡ
プローブとハイブリッド化させ［ブルケ（Ｂｕｒｋｅ）
等、サイエンス、１９８７、２３６、８０６−８１
２］、次に利用可能な内部プローブとハイブリッド化さ
せ、最後に３２ｐ標識ラムダＤＮＡとハイブリッド化さ
せて、サイズマーカーを目視可能にする。得られるオー
トラジオグラフは各ベクターアームと内部プローブとを
含む大抵の部分消化産物のサイズを表示する。これらの
データを用いて、ＹＡＣの共通（ｃｏｎｓｅｎｓｕｓ）
制限マップを構成した。
【００８６】ｐＹＡＣ４のＬ（左）とＲ（右）アームは
それぞれｔｒｐ遺伝子とｕｒａ遺伝子を含むものとして
定義される。挿入−末端産物（以下参照）はそれらがｐ
ＹＡＣアームのいずれに近いかによってＬ（左）又はＲ
（右）と名付けた。例えば、２３ＣＢ１０Ｌはクローン
ＳＣ／２３ＣＢ１０からのＹＡＣ中のｐＹＡＣ４のＬ
（左）アームに隣接する挿入−末端ＤＮＡセグメントを
表す。
それぞれｔｒｐ遺伝子とｕｒａ遺伝子を含むものとして
定義される。挿入−末端産物（以下参照）はそれらがｐ
ＹＡＣアームのいずれに近いかによってＬ（左）又はＲ
（右）と名付けた。例えば、２３ＣＢ１０Ｌはクローン
ＳＣ／２３ＣＢ１０からのＹＡＣ中のｐＹＡＣ４のＬ
（左）アームに隣接する挿入−末端ＤＮＡセグメントを
表す。
【００８７】ＹＡＣ末端の単離 化学遺伝学ベクトレットを用いた挿入−末端ＹＡＣセグ
メントの単離方法は他所で詳述されている［ジェイ．エ
ッチ．リリー（Ｊ．Ｈ．Ｒｉｌｅｙ）等、ニュークレイ
ック アシドス リサーチ、１９９０、１８、２８８７
−２８９０；我々のヨーロッパ特許出願公開第０４１６
８０１号］。要約すると、ＹＡＣ−ベクトレット系は人
工染色体の各端部（Ｌ及びＲ）の特定塩基配列を画定す
るｐＹＡＣ４ベクターと、ヒトＤＮＡインサートの末端
領域内に可能なＰＣＲプライミング部位を形成するベク
トレット、オリゴヌクレオチド カセットとの非対称性
を利用する。これは各ｐＹＡＣアームとベクトレットと
の間のＤＮＡ増幅を可能にする。ホスト（酵母）ＤＮＡ
の存在下又は不存在下で、ＹＡＣ ＤＮＡは制限され、
ベクトレットは暴露端部に連結する。
メントの単離方法は他所で詳述されている［ジェイ．エ
ッチ．リリー（Ｊ．Ｈ．Ｒｉｌｅｙ）等、ニュークレイ
ック アシドス リサーチ、１９９０、１８、２８８７
−２８９０；我々のヨーロッパ特許出願公開第０４１６
８０１号］。要約すると、ＹＡＣ−ベクトレット系は人
工染色体の各端部（Ｌ及びＲ）の特定塩基配列を画定す
るｐＹＡＣ４ベクターと、ヒトＤＮＡインサートの末端
領域内に可能なＰＣＲプライミング部位を形成するベク
トレット、オリゴヌクレオチド カセットとの非対称性
を利用する。これは各ｐＹＡＣアームとベクトレットと
の間のＤＮＡ増幅を可能にする。ホスト（酵母）ＤＮＡ
の存在下又は不存在下で、ＹＡＣ ＤＮＡは制限され、
ベクトレットは暴露端部に連結する。
【００８８】ＹＡＣクローンＤＮＡをＨｉｎｆＩ、Ａｌ
ｕＩ、ＲｓａＩ、ＰｖｕII、ＢｇｌII又はＥｃｏＲＶに
よって消化させ、適当な付着末端又は平滑末端ベクトレ
ット単位と連結させる［ジェイ．エッチ．リリー等、上
記引用文献）。これらの「ベクトレット ライブラリ
ー」ＤＮＡを次に、ｐＹＡＣ４Ｌ−、Ｒ−末端特異的及
びベクトレット特異的オリゴヌクレオチドによるＰＣＲ
に基質として用いて、挿入−末端ＤＮＡを増幅した。ベ
クトレットＰＣＲ産物はベクター又はベクトレットに相
補的な５’３２Ｐ標識プライマーを用いていずれかの末
端から直接塩基配列決定した（図３）。得られた配列は
ＹＡＣに対して可能な塩基配列タグッド（ｔａｇｇｅ
ｄ）部位（ＳＴＳ）を提供し［オルソン（Ｏｌｓｏｎ）
等、サイエンス、１９８９、２４５、１４３４−１４３
５］、ＹＡＣライブラリーの再スクリーニッグのための
ＰＣＲプライマー設計に使用可能である。ＥｃｏＲＩ−
カット（すなわち、ベクターを含まない）ベクトレット
ＰＣＲ産物もハイブリッド化プローブとして使用可能で
ある。
ｕＩ、ＲｓａＩ、ＰｖｕII、ＢｇｌII又はＥｃｏＲＶに
よって消化させ、適当な付着末端又は平滑末端ベクトレ
ット単位と連結させる［ジェイ．エッチ．リリー等、上
記引用文献）。これらの「ベクトレット ライブラリ
ー」ＤＮＡを次に、ｐＹＡＣ４Ｌ−、Ｒ−末端特異的及
びベクトレット特異的オリゴヌクレオチドによるＰＣＲ
に基質として用いて、挿入−末端ＤＮＡを増幅した。ベ
クトレットＰＣＲ産物はベクター又はベクトレットに相
補的な５’３２Ｐ標識プライマーを用いていずれかの末
端から直接塩基配列決定した（図３）。得られた配列は
ＹＡＣに対して可能な塩基配列タグッド（ｔａｇｇｅ
ｄ）部位（ＳＴＳ）を提供し［オルソン（Ｏｌｓｏｎ）
等、サイエンス、１９８９、２４５、１４３４−１４３
５］、ＹＡＣライブラリーの再スクリーニッグのための
ＰＣＲプライマー設計に使用可能である。ＥｃｏＲＩ−
カット（すなわち、ベクターを含まない）ベクトレット
ＰＣＲ産物もハイブリッド化プローブとして使用可能で
ある。
【００８９】ゲノムＰＦＧＥマップ Ｄ２１Ｓ１３−Ｄ２１Ｓ１６領域のゲノムＰＦＧＥマッ
プは利用可能であるが［エム．ジェイ．オウエン（Ｍ．
Ｊ．Ｏｗｅｎ）等、アム．ジェイ．フム．ジェネト．１
９９０、４６、３１６−３２２；ピー．スチニッセン
（Ｐ．Ｓｔｉｎｉｓｓｅｎ）等、ゲノミックス、１９９
０、７、１１９−１２２］、ＹＡＣライブラリーの構成
に用いた細胞ライン（ＧＭ１４１６）からのＤＮＡを用
いて、ＹＡＣとゲノムマップとの不一致をゲノムＤＮＡ
ソースの相違に帰することができない、我々独自のマッ
プを形成しようと決めた。ＹＡＣ歩行が進行すると、挿
入−末端単離から得られる追加のプローブが同じブロッ
トにハイブリッド化した。
プは利用可能であるが［エム．ジェイ．オウエン（Ｍ．
Ｊ．Ｏｗｅｎ）等、アム．ジェイ．フム．ジェネト．１
９９０、４６、３１６−３２２；ピー．スチニッセン
（Ｐ．Ｓｔｉｎｉｓｓｅｎ）等、ゲノミックス、１９９
０、７、１１９−１２２］、ＹＡＣライブラリーの構成
に用いた細胞ライン（ＧＭ１４１６）からのＤＮＡを用
いて、ＹＡＣとゲノムマップとの不一致をゲノムＤＮＡ
ソースの相違に帰することができない、我々独自のマッ
プを形成しようと決めた。ＹＡＣ歩行が進行すると、挿
入−末端単離から得られる追加のプローブが同じブロッ
トにハイブリッド化した。
【００９０】ＹＡＣ ｃｏｎｔｉｇ ＹＡＣライブラリーをＤ２１Ｓ１６ゲノムプローブｐＧ
ＳＥ９とのハイブリッド化によって最初にスクリーニン
グした。単一ポジティブＹＡＣクローン、２３ＣＢ１０
（４３０ｋｂ）を単離した。これを両方のＹＡＣベクタ
ーアームとｐＧＳＥ９内部プローブとを用いてマッピン
グした。Ｄ２１Ｓ１６は２３ＣＢ１０のＲ末端から〜４
０ｋｂの２０ｋｂＮａｅＩフラグメントに位置確認され
た。このＹＡＣはまたＤ２１Ｓ１６から〜１６０ｋｂの
単一ＢｓｓＨII部位を含有したが、ＳａｃII部位は含ま
なかった。Ｄ２１Ｓ１６領域の我々独自のもう一つのゲ
ノムマップの検査（エム．ジェイ．オウエン等、アム．
ジェイ．フム．ジェネト．１９９０、４６、３１６−３
２２）は染色体２１上の２３ＣＢ１０の試験的な配向を
可能にし、２３ＣＢ１０Ｒはセントロメア方向に、２３
ＣＢ１０ＬはＤ２１Ｓ１３方向に配向した。２３ＣＢ１
０にはゲノムマップ上に見られない幾つかの部位が存在
するが、別のゲノムマップに示される［ピー．スチニッ
セン（Ｐ．Ｓｔｉｎｉｓｓｅｎ）等、ゲノミックス、１
９９０、７、１１９−１２２］、Ｄ２１Ｓ１６に直接隣
接するＢｓｓＨIIとＳｆｉＩとは検出されなかった。２
３ＣＢ１０の両方の挿入ー末端を単離し、配列決定し
た。これらの配列から設計されたＰＣＲプライマーを用
いて、ＹＡＣライブラリーを再スクリーニングした。
ＳＥ９とのハイブリッド化によって最初にスクリーニン
グした。単一ポジティブＹＡＣクローン、２３ＣＢ１０
（４３０ｋｂ）を単離した。これを両方のＹＡＣベクタ
ーアームとｐＧＳＥ９内部プローブとを用いてマッピン
グした。Ｄ２１Ｓ１６は２３ＣＢ１０のＲ末端から〜４
０ｋｂの２０ｋｂＮａｅＩフラグメントに位置確認され
た。このＹＡＣはまたＤ２１Ｓ１６から〜１６０ｋｂの
単一ＢｓｓＨII部位を含有したが、ＳａｃII部位は含ま
なかった。Ｄ２１Ｓ１６領域の我々独自のもう一つのゲ
ノムマップの検査（エム．ジェイ．オウエン等、アム．
ジェイ．フム．ジェネト．１９９０、４６、３１６−３
２２）は染色体２１上の２３ＣＢ１０の試験的な配向を
可能にし、２３ＣＢ１０Ｒはセントロメア方向に、２３
ＣＢ１０ＬはＤ２１Ｓ１３方向に配向した。２３ＣＢ１
０にはゲノムマップ上に見られない幾つかの部位が存在
するが、別のゲノムマップに示される［ピー．スチニッ
セン（Ｐ．Ｓｔｉｎｉｓｓｅｎ）等、ゲノミックス、１
９９０、７、１１９−１２２］、Ｄ２１Ｓ１６に直接隣
接するＢｓｓＨIIとＳｆｉＩとは検出されなかった。２
３ＣＢ１０の両方の挿入ー末端を単離し、配列決定し
た。これらの配列から設計されたＰＣＲプライマーを用
いて、ＹＡＣライブラリーを再スクリーニングした。
【００９１】他の２クローン、１７ＢＦ９（４８０ｋ
ｂ）と５ＣＥ１１（２４０ｋｂ）とを２３ＣＢ１０Ｌを
用いて検出した。これらの両方をマッピングした。ＹＡ
Ｃ ５ＣＥは２３ＣＢ１０の左半分によって殆ど完全に
包含され、この領域のマップを確立した。ＹＡＣ １７
ＢＦ９も５ＥＣ１１の大部分によって重複されるが、Ｄ
２１Ｓ１３方向に２４０ｋｂ伸長した。右手の挿入−末
端、１７ＢＦ９ＲのみがこのＹＡＣから上首尾に単離さ
れ、１７ＢＦ９Ｒからのプライマー（表１）によるＰＣ
Ｒが５ＣＥ１１と２３ＣＢ１０とを検出した。
ｂ）と５ＣＥ１１（２４０ｋｂ）とを２３ＣＢ１０Ｌを
用いて検出した。これらの両方をマッピングした。ＹＡ
Ｃ ５ＣＥは２３ＣＢ１０の左半分によって殆ど完全に
包含され、この領域のマップを確立した。ＹＡＣ １７
ＢＦ９も５ＥＣ１１の大部分によって重複されるが、Ｄ
２１Ｓ１３方向に２４０ｋｂ伸長した。右手の挿入−末
端、１７ＢＦ９ＲのみがこのＹＡＣから上首尾に単離さ
れ、１７ＢＦ９Ｒからのプライマー（表１）によるＰＣ
Ｒが５ＣＥ１１と２３ＣＢ１０とを検出した。
【００９２】２３ＣＢ１０Ｒによるスクリーンでは３種
クローン２８ＣＡ１２（２６０ｋｂ）、３８ＦＣ５及び
３１ＥＨ２が検出された。後者の２種クローンは多重の
ＹＡＣを含むので、２８ＣＡ１２のために廃棄した。２
８ＣＡ１２の制限マップは２３ＣＢ１０との明白な重複
を示さなかったが、ＥａｇＩ、ＳａｃII及びＮａｅＩの
一致した部位を有する２グループを示し（図３）、これ
らの１つがゲノムマップの１つ上のＤ２１Ｓ１６のセン
トロメア側に検出されるＥａｇI／ＳａｃII対に相当す
ると考えられる（エム．ジェイ．オウエン等、アム．ジ
ェイ．フム．ジェネト．１９９０、４６、３１６−３２
２）。２３ＣＢ１０Ｒは反復を含むことと小サイズであ
るために、２８ＣＡ１２マッピングブロットとのハイブ
リッド化に用いることは不可能であった。それ故、２８
ＣＡ１２の両端部を単離し、２３ＣＢ１０マッピングブ
ロットにハイブリッド化した。これは２３ＣＢ１０に含
まれ、２３ＣＢ１０Ｒから２５ｋｂ離れた２８ＣＡ１２
Ｌによる２８ＣＡ１２の配向を可能にし、２８ＣＡ１２
Ｒはセントロメア方向に２３５ｋｂ伸長した。２８ＣＡ
１２Ｒの塩基配列を決定し、ＰＣＲプライマーをライブ
ラリーの再スクリーンに用いた。２種ＹＡＣ ３ＥＨ１
２（１９０ｋｂ）と２６ＦＦ３（２２０ｋｂ）とを単離
し、マッピングした。３ＥＨ１２は２８ＣＡ１２によっ
て殆ど完全に包含された。他方では、２６ＦＦ３は６０
ｋｂだけ２８ＣＡ１２に重複するにすぎず、セントロメ
ア方向に１６０ｋｂ伸長した。
クローン２８ＣＡ１２（２６０ｋｂ）、３８ＦＣ５及び
３１ＥＨ２が検出された。後者の２種クローンは多重の
ＹＡＣを含むので、２８ＣＡ１２のために廃棄した。２
８ＣＡ１２の制限マップは２３ＣＢ１０との明白な重複
を示さなかったが、ＥａｇＩ、ＳａｃII及びＮａｅＩの
一致した部位を有する２グループを示し（図３）、これ
らの１つがゲノムマップの１つ上のＤ２１Ｓ１６のセン
トロメア側に検出されるＥａｇI／ＳａｃII対に相当す
ると考えられる（エム．ジェイ．オウエン等、アム．ジ
ェイ．フム．ジェネト．１９９０、４６、３１６−３２
２）。２３ＣＢ１０Ｒは反復を含むことと小サイズであ
るために、２８ＣＡ１２マッピングブロットとのハイブ
リッド化に用いることは不可能であった。それ故、２８
ＣＡ１２の両端部を単離し、２３ＣＢ１０マッピングブ
ロットにハイブリッド化した。これは２３ＣＢ１０に含
まれ、２３ＣＢ１０Ｒから２５ｋｂ離れた２８ＣＡ１２
Ｌによる２８ＣＡ１２の配向を可能にし、２８ＣＡ１２
Ｒはセントロメア方向に２３５ｋｂ伸長した。２８ＣＡ
１２Ｒの塩基配列を決定し、ＰＣＲプライマーをライブ
ラリーの再スクリーンに用いた。２種ＹＡＣ ３ＥＨ１
２（１９０ｋｂ）と２６ＦＦ３（２２０ｋｂ）とを単離
し、マッピングした。３ＥＨ１２は２８ＣＡ１２によっ
て殆ど完全に包含された。他方では、２６ＦＦ３は６０
ｋｂだけ２８ＣＡ１２に重複するにすぎず、セントロメ
ア方向に１６０ｋｂ伸長した。
【００９３】ＨＴＦ島 ２個以上のＣｐＧ含有レアーカッター（ｒａｒｅ ｃｕ
ｔｔｅｒ）制限部位（ＢｓｓＨII，ＳａｃII，ＥａｇＩ
及びＮａｅＩ）の幾つかのクラスターがＹＡＣｃｏｎｔ
ｉｇの物理的マップに明白であった。これらの中の３種
のみがゲノムＰＦＧＥマップのいずれにも観察された。
ＹＡＣ２６ＦＦ３はこれらのクラスターを特に多く含有
した（図１）。
ｔｔｅｒ）制限部位（ＢｓｓＨII，ＳａｃII，ＥａｇＩ
及びＮａｅＩ）の幾つかのクラスターがＹＡＣｃｏｎｔ
ｉｇの物理的マップに明白であった。これらの中の３種
のみがゲノムＰＦＧＥマップのいずれにも観察された。
ＹＡＣ２６ＦＦ３はこれらのクラスターを特に多く含有
した（図１）。
【００９４】体細胞ハイブリッド（ＳＣＨ）パネル ５ＳＣＨからのＤＮＡをＹＡＣ末端と対照２１ｑマーカ
ー、Ｄ２１Ｓ１３とＡＰＰエキソン１４とから誘導され
たプライマー対によるＰＣＲに用いた（表１）。ＤＮＡ
パネルは染色体２１マーカーによって独特のパターンの
生成物を形成するように設計した。このアッセイを用い
てＹＡＣの両端がこの染色体から誘導されたことを検査
した。相互連結したＹＡＣが染色体２１からの両端を有
する先験的確率は＜２％であるので、これはこの種の人
工産物の信頼できるスクリーンとして役立った。
ー、Ｄ２１Ｓ１３とＡＰＰエキソン１４とから誘導され
たプライマー対によるＰＣＲに用いた（表１）。ＤＮＡ
パネルは染色体２１マーカーによって独特のパターンの
生成物を形成するように設計した。このアッセイを用い
てＹＡＣの両端がこの染色体から誘導されたことを検査
した。相互連結したＹＡＣが染色体２１からの両端を有
する先験的確率は＜２％であるので、これはこの種の人
工産物の信頼できるスクリーンとして役立った。
【００９５】Ａｌｕ ＰＣＲ Ａｌｕ−ＰＣＲ方法は複雑な非ヒトバックグラウンドか
らのヒトＤＮＡの単離に最近導入されて以来［ディ．エ
ル．ネルソン（Ｄ．Ｌ．Ｎｅｌｓｏｎ）等、Ｐ．Ｎ．
Ａ．Ｓ．，１９８６、８６、６６８６−６６９０］、用
いられている。Ａｌｕ−ＰＣＲは如何なるＹＡＣがＹＡ
Ｃのｃｏｎｔｉｇを制限マッピングの時間のかかる工程
に頼ることなくさらに伸長させるかを決定するのに役立
ち、非接触（ｎｏｎ−ｃｏｎｔｉｇｕｏｕｓ）連結及び
他のＹＡＣ人工産物を立証すると考えられる。上記ｃｏ
ｎｔｉｇを用いて、我々はＡｌｕ−ＰＣＲを「フィンガ
ープリンティング」オーバーラップＹＡＣの手段として
評価している。
らのヒトＤＮＡの単離に最近導入されて以来［ディ．エ
ル．ネルソン（Ｄ．Ｌ．Ｎｅｌｓｏｎ）等、Ｐ．Ｎ．
Ａ．Ｓ．，１９８６、８６、６６８６−６６９０］、用
いられている。Ａｌｕ−ＰＣＲは如何なるＹＡＣがＹＡ
Ｃのｃｏｎｔｉｇを制限マッピングの時間のかかる工程
に頼ることなくさらに伸長させるかを決定するのに役立
ち、非接触（ｎｏｎ−ｃｏｎｔｉｇｕｏｕｓ）連結及び
他のＹＡＣ人工産物を立証すると考えられる。上記ｃｏ
ｎｔｉｇを用いて、我々はＡｌｕ−ＰＣＲを「フィンガ
ープリンティング」オーバーラップＹＡＣの手段として
評価している。
【００９６】第１工程として、Ａｌｕ−ＰＣＲ条件を最
適化した。特に、Ｍｇ+2濃度の効果を試験した。［Ｍｇ
+2］を１から３ｍＭに増加させると、ＥｔＢｒ染色ゲル
中の可視帯数と一般バックグラウンドの両方が増大し
た。情報を最大化するために、全てのＡｌｕ−ＰＣＲ反
応に３ｍＭ Ｍｇ+2を用いた。各Ａｌｕプライマーの使
用は独立的に各ＹＡＣに対して独特のパターンの生成
物、又はフィンガープリントを生じた。同じ反応への両
Ａｌｕプライマーの使用は新たなフィンガープリントを
生じた。これらの生成物はプライマー単独使用によって
得られるものに比べて、一般に異なり、小さい。これは
恐らく、密接な間隔で配置されたＡｌｕ要素が同方向を
向く頻度と多様な条件下での個々のＰＣＲ反応の間の競
合とを表すと考えられる。一般に小さいＰＣＲ生成物は
単独プライマー反応で製造される大きい生成物の代わり
に形成される。Ａｌｕ−ＰＣＲフィンガープリントは一
般にＰＦＧＥマッピングによって検出されるＹＡＣオー
バーラップを表した。
適化した。特に、Ｍｇ+2濃度の効果を試験した。［Ｍｇ
+2］を１から３ｍＭに増加させると、ＥｔＢｒ染色ゲル
中の可視帯数と一般バックグラウンドの両方が増大し
た。情報を最大化するために、全てのＡｌｕ−ＰＣＲ反
応に３ｍＭ Ｍｇ+2を用いた。各Ａｌｕプライマーの使
用は独立的に各ＹＡＣに対して独特のパターンの生成
物、又はフィンガープリントを生じた。同じ反応への両
Ａｌｕプライマーの使用は新たなフィンガープリントを
生じた。これらの生成物はプライマー単独使用によって
得られるものに比べて、一般に異なり、小さい。これは
恐らく、密接な間隔で配置されたＡｌｕ要素が同方向を
向く頻度と多様な条件下での個々のＰＣＲ反応の間の競
合とを表すと考えられる。一般に小さいＰＣＲ生成物は
単独プライマー反応で製造される大きい生成物の代わり
に形成される。Ａｌｕ−ＰＣＲフィンガープリントは一
般にＰＦＧＥマッピングによって検出されるＹＡＣオー
バーラップを表した。
【００９７】Ａｌｕ−ＰＣＲは相互に離れたＰＣＲ内の
Ａｌｕ反復要素によってフランクされる領域の増幅を可
能にする［ネルソン（Ｎｅｌｓｏｎ）等、Ｐ．Ｎ．Ａ．
Ｓ．，１９８６、８６、６６８６−６６９０］。我々
は、コンセンサスＡｌｕ配列の４７−１３と２２６−２
６０位置に相当し、最も頻繁な変化を考慮した変性Ａｌ
ｕプライマーＰＤＪ３３（５’ＧＣＣＴＣＣＣＡＡＡ
ＧＴＧＣＴＧＧＧＡＴＴＡＣＡＧＧ［Ｃ／Ｔ］［Ａ／
Ｇ］ＴＧ ＡＧＣＣＡ３’）とＰＤＪ３４（５’ＴＧＡ
ＧＣ［Ｃ／Ｔ］［Ｇ／Ａ］［Ａ／Ｔ］ＧＡ Ｔ［Ｃ／
Ｔ］［Ｇ／Ａ］［Ｃ／Ｔ］［Ｇ／Ａ］ＣＣＡ［Ｃ／Ｔ］
Ｔ ＧＣＡＣＴＣＣＡＧＣＣＴＧＧＧ３’）とを用いた
［ダブリュ．アール．ジェリネク（Ｗ．Ｒ．Ｊｅｌｉｎ
ｅｋ）等、アン．レブ．バイオケム．，１９８２，５
１，８１３−８４４；ピー．ジェイ．デジョング（Ｐ．
Ｊ．ｄｅ Ｊｏｎｇ）等、アブストラクト９８、ヒュー
マンゲノムＩ，米国、サンジエゴ、１９８９年１０月２
−４日］。
Ａｌｕ反復要素によってフランクされる領域の増幅を可
能にする［ネルソン（Ｎｅｌｓｏｎ）等、Ｐ．Ｎ．Ａ．
Ｓ．，１９８６、８６、６６８６−６６９０］。我々
は、コンセンサスＡｌｕ配列の４７−１３と２２６−２
６０位置に相当し、最も頻繁な変化を考慮した変性Ａｌ
ｕプライマーＰＤＪ３３（５’ＧＣＣＴＣＣＣＡＡＡ
ＧＴＧＣＴＧＧＧＡＴＴＡＣＡＧＧ［Ｃ／Ｔ］［Ａ／
Ｇ］ＴＧ ＡＧＣＣＡ３’）とＰＤＪ３４（５’ＴＧＡ
ＧＣ［Ｃ／Ｔ］［Ｇ／Ａ］［Ａ／Ｔ］ＧＡ Ｔ［Ｃ／
Ｔ］［Ｇ／Ａ］［Ｃ／Ｔ］［Ｇ／Ａ］ＣＣＡ［Ｃ／Ｔ］
Ｔ ＧＣＡＣＴＣＣＡＧＣＣＴＧＧＧ３’）とを用いた
［ダブリュ．アール．ジェリネク（Ｗ．Ｒ．Ｊｅｌｉｎ
ｅｋ）等、アン．レブ．バイオケム．，１９８２，５
１，８１３−８４４；ピー．ジェイ．デジョング（Ｐ．
Ｊ．ｄｅ Ｊｏｎｇ）等、アブストラクト９８、ヒュー
マンゲノムＩ，米国、サンジエゴ、１９８９年１０月２
−４日］。
【００９８】ＰＣＲはテクネ ＰＨＣ−１ サーマル
サイクラー中で、〜５ｎｇのＹＡＣクローンＤＮＡ、１
０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ８．５（室温）、５０
ｍＭＫＣｌ、３．０ｍＭ ＭｇＣｌ2、０．０１％ゼラ
チン、７０ｐｍｏｌのいずれかの各Ａｌｕプライマー、
１００ｎＭｏｌの各ｄＮＴＰ及び２単位のＴａｇ ポリ
メラーゼ［パーキンーエルマー セタス］を、５０μｌ
の鉱油オーバーレイと共に含む１００μｌ反応で実施し
た。サンプルをサーマル サイクラー中で９６℃におい
て変性させ、９２℃に冷却して、２μｌの１ｘ反応バッ
ファー中２単位の酵素を添加した。次に、管に対して３
８サイクルを９２℃での２分間、６０℃での２分間、７
２℃での２分間に実施した。各ＹＡＣ ＤＮＡの他のソ
ースからのＤＮＡによる汚染を避けるために細心の注意
を払った。
サイクラー中で、〜５ｎｇのＹＡＣクローンＤＮＡ、１
０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ８．５（室温）、５０
ｍＭＫＣｌ、３．０ｍＭ ＭｇＣｌ2、０．０１％ゼラ
チン、７０ｐｍｏｌのいずれかの各Ａｌｕプライマー、
１００ｎＭｏｌの各ｄＮＴＰ及び２単位のＴａｇ ポリ
メラーゼ［パーキンーエルマー セタス］を、５０μｌ
の鉱油オーバーレイと共に含む１００μｌ反応で実施し
た。サンプルをサーマル サイクラー中で９６℃におい
て変性させ、９２℃に冷却して、２μｌの１ｘ反応バッ
ファー中２単位の酵素を添加した。次に、管に対して３
８サイクルを９２℃での２分間、６０℃での２分間、７
２℃での２分間に実施した。各ＹＡＣ ＤＮＡの他のソ
ースからのＤＮＡによる汚染を避けるために細心の注意
を払った。
【００９９】ＹＡＣｓ中の転写／コード配列の同定 可能なＨＴＦアイランドに隣接するクローニング配列 クローン化ＤＮＡを制限マッピングする最も重要な理由
の一つは、可能なＨＴＦアイランドの全部をつきとめる
ことである。これは、一つ以上のＣＧジヌクレオチドを
その認識配列として有する酵素（例えばＮｏｔI、Ｂｓ
ｓＨII、ＳａｃII（ＳｓｔII）、ＥａｇIおよびＮａｅ
I）の制限部位のクラスタリングを基礎にして行うこと
によって可能である。これらの制限部位のクラスター
は、一般に遺伝子配列に付随する（Ｂｉｒｄ Ａ．Ｐ．
Ｎａｔｕｒｅ ３２１，２０９−２１３，１９８６）。
の一つは、可能なＨＴＦアイランドの全部をつきとめる
ことである。これは、一つ以上のＣＧジヌクレオチドを
その認識配列として有する酵素（例えばＮｏｔI、Ｂｓ
ｓＨII、ＳａｃII（ＳｓｔII）、ＥａｇIおよびＮａｅ
I）の制限部位のクラスタリングを基礎にして行うこと
によって可能である。これらの制限部位のクラスター
は、一般に遺伝子配列に付随する（Ｂｉｒｄ Ａ．Ｐ．
Ｎａｔｕｒｅ ３２１，２０９−２１３，１９８６）。
【０１００】可能なＨＴＦアイランドをつきとめた後、
本発明者らは観察されたＨＴＦアイランドに隣接する配
列を特異的にクローニングする方法を検討した。この実
験には、クローン３ＥＨ１２を用いたが、その理由は、
この比較的小型のＹＡＣは、２８ＣＡ１２によってスパ
ンされる領域内に含まれる、３つの可能なＨＴＦアイラ
ンドを有し、即ち下記に対するコインシデント部位を有
していたためである： ＳａｃII／ＥａｇI／ＮａｅI ＳａｃII／ＥａｇI ＢｓｓＨII／ＥａｇI／ＮａｅI クローニングはＳａｃIIおよびＢｓｓＨII部位に向けら
れた。３ＥＨ１２ ＹＡＣ（１９０kb）を、調製用パル
スフィールドゲル電気泳動（ＰＦＧＥ）で精製し、そし
て〜１００ngのＤＮＡをＢｓｓＨIIで消化し、そして別
の１００ngをＳａｃIIで消化した。これら二つのアリコ
ートの２回目の消化はＳａｕ３Ａにより行われ、Ｂａｍ
ＨI適合末端を生じた。次にＤＮＡを低ゲル化温度のア
ガロースから、熱フェノール抽出と引き続くエタノール
沈澱により抽出した。これらのＤＮＡをＢａｍＨI／Ｂ
ｓｓＨIIおよびＢａｍＨI／ＳａｃIIで切断したＢｌｕ
ｅｓｃｒｉｐｔベクターに連結した（このベクターは先
ず稀な方の消化酵素で消化し、ゲルで精製し、そして次
にＢａｍＨIで切断して脱ホスホリル化した）。連結し
たＤＮＡを用いてＢＲＬ ＤＨ５ａｌｐｈａのコンピテ
ント細胞を形質転換した。この形質転換の結果を下記に
示す。
本発明者らは観察されたＨＴＦアイランドに隣接する配
列を特異的にクローニングする方法を検討した。この実
験には、クローン３ＥＨ１２を用いたが、その理由は、
この比較的小型のＹＡＣは、２８ＣＡ１２によってスパ
ンされる領域内に含まれる、３つの可能なＨＴＦアイラ
ンドを有し、即ち下記に対するコインシデント部位を有
していたためである： ＳａｃII／ＥａｇI／ＮａｅI ＳａｃII／ＥａｇI ＢｓｓＨII／ＥａｇI／ＮａｅI クローニングはＳａｃIIおよびＢｓｓＨII部位に向けら
れた。３ＥＨ１２ ＹＡＣ（１９０kb）を、調製用パル
スフィールドゲル電気泳動（ＰＦＧＥ）で精製し、そし
て〜１００ngのＤＮＡをＢｓｓＨIIで消化し、そして別
の１００ngをＳａｃIIで消化した。これら二つのアリコ
ートの２回目の消化はＳａｕ３Ａにより行われ、Ｂａｍ
ＨI適合末端を生じた。次にＤＮＡを低ゲル化温度のア
ガロースから、熱フェノール抽出と引き続くエタノール
沈澱により抽出した。これらのＤＮＡをＢａｍＨI／Ｂ
ｓｓＨIIおよびＢａｍＨI／ＳａｃIIで切断したＢｌｕ
ｅｓｃｒｉｐｔベクターに連結した（このベクターは先
ず稀な方の消化酵素で消化し、ゲルで精製し、そして次
にＢａｍＨIで切断して脱ホスホリル化した）。連結し
たＤＮＡを用いてＢＲＬ ＤＨ５ａｌｐｈａのコンピテ
ント細胞を形質転換した。この形質転換の結果を下記に
示す。
【０１０１】 ５個のＳａｃII／Ｓａｕ３Ａ組換え体をさらに分析し
た。これら５つのうち４つは正しい挿入（即ちＳａｃII
によるものでなくＸｂａIによるプラスミド消化物，お
よびプラスミドポリリンカーからの棄てられたフラグメ
ント中の部位）を示唆する制限パターンを有していた。
ゲル分析の結果は、これら４つのうち３つだけが検出可
能なフラグメント（Ａ１＝１５０bp；Ａ７＝７００bpお
よびＡ８＝２００bp）を有しており、さらにまた、ＹＡ
Ｃマッピングブロットへのハイブリダイゼーションによ
り、これら３つのうち２つだけがＹＡＣ ３ＥＨ１２に
マッピングバックされた。これら２つのフラグメントの
サイズは後に示す。
た。これら５つのうち４つは正しい挿入（即ちＳａｃII
によるものでなくＸｂａIによるプラスミド消化物，お
よびプラスミドポリリンカーからの棄てられたフラグメ
ント中の部位）を示唆する制限パターンを有していた。
ゲル分析の結果は、これら４つのうち３つだけが検出可
能なフラグメント（Ａ１＝１５０bp；Ａ７＝７００bpお
よびＡ８＝２００bp）を有しており、さらにまた、ＹＡ
Ｃマッピングブロットへのハイブリダイゼーションによ
り、これら３つのうち２つだけがＹＡＣ ３ＥＨ１２に
マッピングバックされた。これら２つのフラグメントの
サイズは後に示す。
【０１０２】７つのＢｓｓＨII／Ｓａｕ３Ａ組換え体を
さらに分析した。７つのもの全ては正しい挿入片を示唆
する制限パターンを有していたが、しかしゲル分析によ
るとこれら７つのうち５つのみが検出可能なフラグメン
トをもっていた（Ｃ２＝３５０bp；Ｃ５＝１５０bp；Ｃ
６＝５００bp；Ｃ７＝２７０bpおよびＣ１０＝２９０b
p）。ＹＡＣマッピングブロットへのハイブリダイゼー
ションにより、１つのもの（Ｃ６）のみがＹＡＣ ３Ｅ
Ｈ１２にマッピングバックされた。ハイブリダイズした
フラグメントのサイズを下に示す： 上の表は三つのクローンが、３ＥＨ１２内につきとめら
れた３つの異なる可能なＨＴＦアイランドを代表するこ
とを示す。これらのクローンを配列決定し、その配列を
表３に示す。
さらに分析した。７つのもの全ては正しい挿入片を示唆
する制限パターンを有していたが、しかしゲル分析によ
るとこれら７つのうち５つのみが検出可能なフラグメン
トをもっていた（Ｃ２＝３５０bp；Ｃ５＝１５０bp；Ｃ
６＝５００bp；Ｃ７＝２７０bpおよびＣ１０＝２９０b
p）。ＹＡＣマッピングブロットへのハイブリダイゼー
ションにより、１つのもの（Ｃ６）のみがＹＡＣ ３Ｅ
Ｈ１２にマッピングバックされた。ハイブリダイズした
フラグメントのサイズを下に示す： 上の表は三つのクローンが、３ＥＨ１２内につきとめら
れた３つの異なる可能なＨＴＦアイランドを代表するこ
とを示す。これらのクローンを配列決定し、その配列を
表３に示す。
【０１０３】稀な方の制限部位に隣接するクローンのデ
ータを使用してオリゴヌクレオチドを設計し、次にこれ
らをＹＡＣベクターライブラリーまたはヒトゲノムベク
ターライブラリーに対して用いて、クローン化フラグメ
ントから両方向の外側へ延びるＤＮＡをＰＣＲで増幅す
ることかできるであろう。次にこれらの増幅産物を、あ
る範囲の種からの制限消化ＤＮＡを含む「多種ブロット
（Ｚｏｏ ｂｌｏｔｓ）」のサザンブロット分析に用い
て配列の保存性を研究したり、あるいは転写物を検出す
るためのノーザンブロット分析に用いたり、転写された
ｃＤＮＡ配列を検出するためにｃＤＮＡライブラリーに
対して用いることができるであろう。ｃＤＮＡの分析
は、以下にＹＡＣｓによるｃＤＮＡライブラリーのスク
リーニングのセクションにおいて記載するものと同様で
ある。
ータを使用してオリゴヌクレオチドを設計し、次にこれ
らをＹＡＣベクターライブラリーまたはヒトゲノムベク
ターライブラリーに対して用いて、クローン化フラグメ
ントから両方向の外側へ延びるＤＮＡをＰＣＲで増幅す
ることかできるであろう。次にこれらの増幅産物を、あ
る範囲の種からの制限消化ＤＮＡを含む「多種ブロット
（Ｚｏｏ ｂｌｏｔｓ）」のサザンブロット分析に用い
て配列の保存性を研究したり、あるいは転写物を検出す
るためのノーザンブロット分析に用いたり、転写された
ｃＤＮＡ配列を検出するためにｃＤＮＡライブラリーに
対して用いることができるであろう。ｃＤＮＡの分析
は、以下にＹＡＣｓによるｃＤＮＡライブラリーのスク
リーニングのセクションにおいて記載するものと同様で
ある。
【０１０４】ＹＡＣｓによるｃＤＮＡライブラリーのス
クリーニング ＹＡＣｓは、ＹＡＣｓの大型ゲノム挿入片中に含まれる
ようなコード配列をつきとめるために、ｃＤＮＡライブ
ラリーをスクリーニングするためのハイブリダイゼーシ
ョンプローブとして直接用いることが可能である。本発
明者らは、以前に任意の適当なＹＡＣに適用可能な信頼
性できる方法を報告した（Ｅｌｖｉｎら，ＮＡＲ，１
８，３９１３−３９１７，１９９０，およびまた、Ｗａ
ｌｌａｃｅら，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４９，１８１−１８
６，１９９０）。
クリーニング ＹＡＣｓは、ＹＡＣｓの大型ゲノム挿入片中に含まれる
ようなコード配列をつきとめるために、ｃＤＮＡライブ
ラリーをスクリーニングするためのハイブリダイゼーシ
ョンプローブとして直接用いることが可能である。本発
明者らは、以前に任意の適当なＹＡＣに適用可能な信頼
性できる方法を報告した（Ｅｌｖｉｎら，ＮＡＲ，１
８，３９１３−３９１７，１９９０，およびまた、Ｗａ
ｌｌａｃｅら，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４９，１８１−１８
６，１９９０）。
【０１０５】ＹＡＣは最初にＹＡＣクローンから精製し
て均一にする。酵母細胞（好ましくは１０ml一夜培養の
もの）を収穫し、アガロースプラグ中にＤＮＡを調製す
るために用いる（ＡｎａｎｄおよびＳｏｕｔｈｅｒｎ，
１９９０，Ｇｅｌ Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ
ｏｆ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ． Ｒｉｃｋｗｏｏ
ｄ Ｄ， Ｈａｎｅｓ Ｂ．Ｄ．（編者），ＩＲＬプレ
ス，オックスフォード，１０１−１２３頁）。全部で１
５のプラグを、パルスフィールドゲルの一本の長いスロ
ット（１．５％アガロース支持ゲルと、１．０％のシー
プラック（Ｓｅａ Ｐｌａｑｕｅ）低ゲル化温度アガロ
ースの分画用ゲルとからなる）に負荷する。電気泳動の
後、ＹＡＣをエチジウムブロマイドで染色して可視化
し、ゲルから切り出す。ＹＡＣを含有する低ゲル化温度
アガロースを６５℃で溶解し、これに同量のヌクレアー
ゼ不含水を添加する。混合物を次にフェノール／ＴＥで
二回抽出し（ＴＥは１０mMトリスＨＣｌ，１mM ＥＤＴ
Ａ，ｐＨ８．０である）、水相をブタノールによる反復
抽出で約１００μl に濃縮する。最後にＹＡＣを水相か
ら沈澱させ、ＤＮＡを１０mM トリスＨＣｌ，ｐＨ８．
０に、終濃度１０ng／μl に再懸濁させる。
て均一にする。酵母細胞（好ましくは１０ml一夜培養の
もの）を収穫し、アガロースプラグ中にＤＮＡを調製す
るために用いる（ＡｎａｎｄおよびＳｏｕｔｈｅｒｎ，
１９９０，Ｇｅｌ Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ
ｏｆ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ． Ｒｉｃｋｗｏｏ
ｄ Ｄ， Ｈａｎｅｓ Ｂ．Ｄ．（編者），ＩＲＬプレ
ス，オックスフォード，１０１−１２３頁）。全部で１
５のプラグを、パルスフィールドゲルの一本の長いスロ
ット（１．５％アガロース支持ゲルと、１．０％のシー
プラック（Ｓｅａ Ｐｌａｑｕｅ）低ゲル化温度アガロ
ースの分画用ゲルとからなる）に負荷する。電気泳動の
後、ＹＡＣをエチジウムブロマイドで染色して可視化
し、ゲルから切り出す。ＹＡＣを含有する低ゲル化温度
アガロースを６５℃で溶解し、これに同量のヌクレアー
ゼ不含水を添加する。混合物を次にフェノール／ＴＥで
二回抽出し（ＴＥは１０mMトリスＨＣｌ，１mM ＥＤＴ
Ａ，ｐＨ８．０である）、水相をブタノールによる反復
抽出で約１００μl に濃縮する。最後にＹＡＣを水相か
ら沈澱させ、ＤＮＡを１０mM トリスＨＣｌ，ｐＨ８．
０に、終濃度１０ng／μl に再懸濁させる。
【０１０６】ＹＡＣ ＤＮＡ配列を、Ｆｅｉｎｂｅｒｇ
およびＶｏｇｅｌｓｔｅｉｎ（Ａｎａｌ Ｂｉｏｃｈｅ
ｍ，１３７，１９８４，２６６−２７６）のランダムプ
ライミング法で32Ｐ ｄＣＴＰ（３０００Ｃｉ mmol）
により標識する。典型的標識反応においては、１００ng
のＹＡＣ ＤＮＡを１５０μＣｉのｄＣＴＰと一緒に
し、標識反応を約２時間３７℃で行うと、この時間まで
に約７０％の放射標識ヌクレオチドがＹＡＣ ＤＮＡに
取り込まれる。
およびＶｏｇｅｌｓｔｅｉｎ（Ａｎａｌ Ｂｉｏｃｈｅ
ｍ，１３７，１９８４，２６６−２７６）のランダムプ
ライミング法で32Ｐ ｄＣＴＰ（３０００Ｃｉ mmol）
により標識する。典型的標識反応においては、１００ng
のＹＡＣ ＤＮＡを１５０μＣｉのｄＣＴＰと一緒に
し、標識反応を約２時間３７℃で行うと、この時間まで
に約７０％の放射標識ヌクレオチドがＹＡＣ ＤＮＡに
取り込まれる。
【０１０７】ベクターおよびヒト反復配列がフィルター
ハイブリダイゼーション反応に及ぼす影響は、標識ＹＡ
Ｃを切断したヒト胎盤ＤＮＡ（タイプＸIII，シグマ）
および切断したｐＢＲ３２２ＤＮＡの存在下に沸騰水浴
中で１０分間加熱変性させることにより、最小限に抑え
られる。次にＤＮＡを６５℃で５ＸＳＳＣ中のＣｏｔ２
５０と再会合させる（Ｓｅａｌｅｙ Ｐ．Ｇ．，Ｗｈｉ
ｔｔａｋｅｒ Ｐ．Ａ．，Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｅ．
Ｍ．，ＮＡＲ，１３，１９８５，１９０５−１９２
２）。典型的には、再会合の実施は、４００μl の最終
容積中で、０．２５μg／mlのプローブ濃度、５０μg
／mlのｐＢＲ３２２ＤＮＡ、および反応成分をＣｏｔ２
５０に運ぶために十分量のヒト胎盤（ドライバー）ＤＮ
Ａを用いて行う。再会合反応に要求されるドライバーＤ
ＮＡの量は、ＹＡＣのヒトＤＮＡ含有物のサイズ（キロ
ベース）、および再会合を生じるために許される時間に
関係していることは理解されるであろう。再会合反応の
のち、プローブ溶液を直ちにハイブリダイゼーションバ
ッファーに６５℃で添加する。本発明者らはプローブ濃
度０．３−２．０ng／mlプローブＤＮＡにおけるハイブ
リダイゼーションに続いて、同程度の感度の結果を得て
いる。
ハイブリダイゼーション反応に及ぼす影響は、標識ＹＡ
Ｃを切断したヒト胎盤ＤＮＡ（タイプＸIII，シグマ）
および切断したｐＢＲ３２２ＤＮＡの存在下に沸騰水浴
中で１０分間加熱変性させることにより、最小限に抑え
られる。次にＤＮＡを６５℃で５ＸＳＳＣ中のＣｏｔ２
５０と再会合させる（Ｓｅａｌｅｙ Ｐ．Ｇ．，Ｗｈｉ
ｔｔａｋｅｒ Ｐ．Ａ．，Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｅ．
Ｍ．，ＮＡＲ，１３，１９８５，１９０５−１９２
２）。典型的には、再会合の実施は、４００μl の最終
容積中で、０．２５μg／mlのプローブ濃度、５０μg
／mlのｐＢＲ３２２ＤＮＡ、および反応成分をＣｏｔ２
５０に運ぶために十分量のヒト胎盤（ドライバー）ＤＮ
Ａを用いて行う。再会合反応に要求されるドライバーＤ
ＮＡの量は、ＹＡＣのヒトＤＮＡ含有物のサイズ（キロ
ベース）、および再会合を生じるために許される時間に
関係していることは理解されるであろう。再会合反応の
のち、プローブ溶液を直ちにハイブリダイゼーションバ
ッファーに６５℃で添加する。本発明者らはプローブ濃
度０．３−２．０ng／mlプローブＤＮＡにおけるハイブ
リダイゼーションに続いて、同程度の感度の結果を得て
いる。
【０１０８】上記したようにして作成されたプローブ
は、当業者に周知の標準的な方法を使用してｃＤＮＡラ
イブラリーをスクリーンするために用いてもよい。簡単
に述べると、レプリカプラーク（ｒｅｐｌｉｃａ ｐｌ
ａｑｕｅ）又はコロニーリフト（ｃｏｌｏｎｙ ｌｉｆ
ｔｓ）はＨｙｂｏｎｄ−Ｎ（アマーシャム社製）ナイロ
ン膜上で作成され、５Ｘ ＳＳＣ、５Ｘ Ｄｅｎｈａｒ
ｄｔｓ、２００μｇ／ｍｌの切断されたサケ精子ＤＮＡ
（タイプＩＩＩ、シグマ社製）、０．１％ＳＤＳ及び６
％ＰＥＧを含有する緩衝液中において６５℃で少なくと
も６時間プリハイブリダイズ（ｐｒｅｈｙｂｒｉｄｉｓ
ｅ）させる。ハイブリダイゼーション反応は５Ｘ ＳＳ
Ｃ、５Ｘ Ｄｅｎｈａｒｄｔｓ、２００μｇ／ｍｌの切
断されたサケ精子ＤＮＡ（タイプＩＩＩ、シグマ社
製）、０．１％ＳＤＳ及び６％ＰＥＧ中において６５℃
で約１６時間行う。本発明者らは、他のプリハイブリダ
イゼーション溶液及びハイブリダイゼーション溶液がハ
イブリダイゼーション時間を延長したのと同様にかなり
有効に作用することをも見いだした。ハイブリダイゼー
ションの後でフィルターを２Ｘ ＳＳＣ及び０．１％Ｓ
ＤＳ中で洗い、引き続いて０．５Ｘ ＳＳＣ及び０．１
％ＳＤＳ中において６５℃で２０分間保持する。次いで
フィルターをサランラップ（Ｓａｒａｎ Ｗｒａｐ）で
包んで、−７０℃においてコダックＸ−ＡＲフィルムに
感光させる。
は、当業者に周知の標準的な方法を使用してｃＤＮＡラ
イブラリーをスクリーンするために用いてもよい。簡単
に述べると、レプリカプラーク（ｒｅｐｌｉｃａ ｐｌ
ａｑｕｅ）又はコロニーリフト（ｃｏｌｏｎｙ ｌｉｆ
ｔｓ）はＨｙｂｏｎｄ−Ｎ（アマーシャム社製）ナイロ
ン膜上で作成され、５Ｘ ＳＳＣ、５Ｘ Ｄｅｎｈａｒ
ｄｔｓ、２００μｇ／ｍｌの切断されたサケ精子ＤＮＡ
（タイプＩＩＩ、シグマ社製）、０．１％ＳＤＳ及び６
％ＰＥＧを含有する緩衝液中において６５℃で少なくと
も６時間プリハイブリダイズ（ｐｒｅｈｙｂｒｉｄｉｓ
ｅ）させる。ハイブリダイゼーション反応は５Ｘ ＳＳ
Ｃ、５Ｘ Ｄｅｎｈａｒｄｔｓ、２００μｇ／ｍｌの切
断されたサケ精子ＤＮＡ（タイプＩＩＩ、シグマ社
製）、０．１％ＳＤＳ及び６％ＰＥＧ中において６５℃
で約１６時間行う。本発明者らは、他のプリハイブリダ
イゼーション溶液及びハイブリダイゼーション溶液がハ
イブリダイゼーション時間を延長したのと同様にかなり
有効に作用することをも見いだした。ハイブリダイゼー
ションの後でフィルターを２Ｘ ＳＳＣ及び０．１％Ｓ
ＤＳ中で洗い、引き続いて０．５Ｘ ＳＳＣ及び０．１
％ＳＤＳ中において６５℃で２０分間保持する。次いで
フィルターをサランラップ（Ｓａｒａｎ Ｗｒａｐ）で
包んで、−７０℃においてコダックＸ−ＡＲフィルムに
感光させる。
【０１０９】本発明者らは上記の方法を使用して、ベク
ターλｇｔ１１におけるｃＤＮＡライブラリーのスクリ
ーニング用ＹＡＣプローブを作成した。組換えｃＤＮＡ
クローンはフィルターハイブリダイゼーションの２つの
連続した反応から同定し、単一の正組換え体の同定と同
時にその単離を可能とする。当該ｃＤＮＡクローンを更
に分析する前に、ＹＡＣヒト遺伝子配列とそれらのクロ
ーンとの相同性をハイブリダイゼーションによって確認
する。ｃＤＮＡ類は、例えば、組換えＤＮＡを適当な制
限エンドヌクレアーゼによる酵素分解によるか、若しく
はクローニンング部位の側面部に位置する（ｆｌａｎ
ｋ）ベクター配列と相同性があるオリゴヌクレオチドプ
ライマー類を用いるＰＣＲ増幅により得られる。次い
で、ｃＤＮＡ類はアガロースゲルを用いる電気泳動によ
って分画され、サザンブロット法により適当な膜に移さ
れ、最後に前記のＹＡＣプローブとハイブリダイズさせ
る。ＹＡＣとハイブリダイズしたｃＤＮＡ類のみを更に
分析する。
ターλｇｔ１１におけるｃＤＮＡライブラリーのスクリ
ーニング用ＹＡＣプローブを作成した。組換えｃＤＮＡ
クローンはフィルターハイブリダイゼーションの２つの
連続した反応から同定し、単一の正組換え体の同定と同
時にその単離を可能とする。当該ｃＤＮＡクローンを更
に分析する前に、ＹＡＣヒト遺伝子配列とそれらのクロ
ーンとの相同性をハイブリダイゼーションによって確認
する。ｃＤＮＡ類は、例えば、組換えＤＮＡを適当な制
限エンドヌクレアーゼによる酵素分解によるか、若しく
はクローニンング部位の側面部に位置する（ｆｌａｎ
ｋ）ベクター配列と相同性があるオリゴヌクレオチドプ
ライマー類を用いるＰＣＲ増幅により得られる。次い
で、ｃＤＮＡ類はアガロースゲルを用いる電気泳動によ
って分画され、サザンブロット法により適当な膜に移さ
れ、最後に前記のＹＡＣプローブとハイブリダイズさせ
る。ＹＡＣとハイブリダイズしたｃＤＮＡ類のみを更に
分析する。
【０１１０】数百キロベースの大きなＤＮＡプローブを
用いるｃＤＮＡライブラリーのスクリーニングは、単一
のＹＡＣ中でクローンされた種々のコーディング配列を
表す２種以上のｃＤＮＡ種を同定することが可能である
ことが理解されよう。加えて、ｃＤＮＡライブラリー中
における特定のｃＤＮＡを表現することは、そのライブ
ラリー由来の単一配列の複数コピーの選択を可能にす
る。したがって、ｃＤＮＡクローンの分析における更な
る段階は、ＹＡＣプローブによって検出される特有なｃ
ＤＮＡ配列の数の決定である。これは交差ハイブリダイ
ゼーションによって好適に行う事ができる。この場合、
ＹＡＣスクリーニングの２つの反応によって選択された
すべてのｃＤＮＡを表すサザンブロット（Ｓｏｕｔｈｅ
ｒｎ ｂｌｏｔｓ）とハイブリダイズさせるプローブと
して個々のＹＡＣ−ポジティブなｃＤＮＡを使用する。
用いるｃＤＮＡライブラリーのスクリーニングは、単一
のＹＡＣ中でクローンされた種々のコーディング配列を
表す２種以上のｃＤＮＡ種を同定することが可能である
ことが理解されよう。加えて、ｃＤＮＡライブラリー中
における特定のｃＤＮＡを表現することは、そのライブ
ラリー由来の単一配列の複数コピーの選択を可能にす
る。したがって、ｃＤＮＡクローンの分析における更な
る段階は、ＹＡＣプローブによって検出される特有なｃ
ＤＮＡ配列の数の決定である。これは交差ハイブリダイ
ゼーションによって好適に行う事ができる。この場合、
ＹＡＣスクリーニングの２つの反応によって選択された
すべてのｃＤＮＡを表すサザンブロット（Ｓｏｕｔｈｅ
ｒｎ ｂｌｏｔｓ）とハイブリダイズさせるプローブと
して個々のＹＡＣ−ポジティブなｃＤＮＡを使用する。
【０１１１】ＹＡＣを含むゲノミックＤＮＡ内のｃＤＮ
Ａクローンの由来を調べる最終的な試験は、クローニン
グされたゲノミックＤＮＡの特定の領域にｃＤＮＡを局
在化させることである。これは、ＹＡＣを適当な制限エ
ンドヌクレアーゼで酵素分解し、制限フラグメントをパ
ルスフィールドゲル（ｐｕｌｓｅ ｆｉｅｌｄ ｇｅ
ｌ）電気泳動とサザンブロッティングにより分画するこ
とによって容易に行うことができる。本明細書の最初の
部分に記載したスクリーニング用カスケードによって選
択された標識ｃＤＮＡクローンを用いて得られたフィル
ターをハイブリダイズさせると、ｃＤＮＡをＹＡＣの特
定の領域に局在化させるのに使用することが可能な制限
フラグメントのパターンを観察することができる。
Ａクローンの由来を調べる最終的な試験は、クローニン
グされたゲノミックＤＮＡの特定の領域にｃＤＮＡを局
在化させることである。これは、ＹＡＣを適当な制限エ
ンドヌクレアーゼで酵素分解し、制限フラグメントをパ
ルスフィールドゲル（ｐｕｌｓｅ ｆｉｅｌｄ ｇｅ
ｌ）電気泳動とサザンブロッティングにより分画するこ
とによって容易に行うことができる。本明細書の最初の
部分に記載したスクリーニング用カスケードによって選
択された標識ｃＤＮＡクローンを用いて得られたフィル
ターをハイブリダイズさせると、ｃＤＮＡをＹＡＣの特
定の領域に局在化させるのに使用することが可能な制限
フラグメントのパターンを観察することができる。
【０１１２】更に、上記スクリーニング方法によって同
定されたｃＤＮＡは染色体のイン・サイチュウ（ｉｎ
ｓｉｔｕ）ハイブリダイゼーション用の標識プローブと
して用いることができる。このハイブリダイゼーション
により公知の染色体マップ部位に対するｃＤＮＡ類の由
来が確認される。このようにして、ｃＤＮＡプローブ
は、ＹＡＣ中でクローンされた遺伝子配列の染色体上の
位置を特定若しくは確認するために使用することもでき
る。
定されたｃＤＮＡは染色体のイン・サイチュウ（ｉｎ
ｓｉｔｕ）ハイブリダイゼーション用の標識プローブと
して用いることができる。このハイブリダイゼーション
により公知の染色体マップ部位に対するｃＤＮＡ類の由
来が確認される。このようにして、ｃＤＮＡプローブ
は、ＹＡＣ中でクローンされた遺伝子配列の染色体上の
位置を特定若しくは確認するために使用することもでき
る。
【０１１３】遺伝子座と関連した特定の疾病を包含する
ことが知られているＹＡＣｓから単離されたｃＤＮＡ類
は、この疾病の病理における相同性遺伝子の相対的重要
性に関する手掛かり又はこの疾病に関係した遺伝子の正
体（ｉｄｅｎｔｉｔｙ）を提供するためのハイブリダイ
ゼーションプローブとして用いることもできる。例え
ば、多くの遺伝子はＤＮＡ配列の進化的保存（ｅｖｏｌ
ｕｔｉｏｎａｒｙ ｃｏｎｓｅｒｖａｔｉｏｎ）を示
し、これが遺伝子産物の比較生物学的な重要性の指標と
なり得る。このようにして、ｃＤＮＡ類は、ｃＤＮＡが
他の種のＤＮＡ類に交差ハイブリダイゼーションするこ
とを裏付けるためのハイブリダイゼーションプローブと
して使用することができる。これは、幾つかの種由来の
ＤＮＡを適当な制限エンドヌクレアーゼで酵素分解し、
得られたフラグメントをアガロースゲル上で分画した上
で、サザンブロッティングとｃＤＮＡを用いるハイブリ
ダイゼーションによって好適に行うことができる。
ことが知られているＹＡＣｓから単離されたｃＤＮＡ類
は、この疾病の病理における相同性遺伝子の相対的重要
性に関する手掛かり又はこの疾病に関係した遺伝子の正
体（ｉｄｅｎｔｉｔｙ）を提供するためのハイブリダイ
ゼーションプローブとして用いることもできる。例え
ば、多くの遺伝子はＤＮＡ配列の進化的保存（ｅｖｏｌ
ｕｔｉｏｎａｒｙ ｃｏｎｓｅｒｖａｔｉｏｎ）を示
し、これが遺伝子産物の比較生物学的な重要性の指標と
なり得る。このようにして、ｃＤＮＡ類は、ｃＤＮＡが
他の種のＤＮＡ類に交差ハイブリダイゼーションするこ
とを裏付けるためのハイブリダイゼーションプローブと
して使用することができる。これは、幾つかの種由来の
ＤＮＡを適当な制限エンドヌクレアーゼで酵素分解し、
得られたフラグメントをアガロースゲル上で分画した上
で、サザンブロッティングとｃＤＮＡを用いるハイブリ
ダイゼーションによって好適に行うことができる。
【０１１４】同様な方法で、ｃＤＮＡは、組織特異的な
遺伝子発現を調べるために、例えば、ノーザンブロット
分析においてハイブリダイゼーションプローブとして用
いることができる。正常組織と疾病に関連した組織とに
おける相同複製物（ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ ｔｒａｎｓ
ｃｒｉｐｔ）の数量又は大きさの相違は、その疾病の過
程における遺伝子の役割を反映していると言い得る。リ
ボヌクレアーゼ（ＲＮＡｓｅ）プロテクションアッセイ
のように当業者に公知の他の方法論が、含有度合いの低
いｍＲＮＡｓの含有量の変化を裏付けるために必要とさ
れるかもしれない。健常者と患者からの一群のＤＮＡを
スクリーニングするためのプローブとしてｃＤＮＡを使
用することは、その疾病の表現型（ｐｈｅｎｏｔｙｐ
ｅ）の原因である可能性がある遺伝子レベルでの何らか
の総体的な欠失又は転位を検知するものである。
遺伝子発現を調べるために、例えば、ノーザンブロット
分析においてハイブリダイゼーションプローブとして用
いることができる。正常組織と疾病に関連した組織とに
おける相同複製物（ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ ｔｒａｎｓ
ｃｒｉｐｔ）の数量又は大きさの相違は、その疾病の過
程における遺伝子の役割を反映していると言い得る。リ
ボヌクレアーゼ（ＲＮＡｓｅ）プロテクションアッセイ
のように当業者に公知の他の方法論が、含有度合いの低
いｍＲＮＡｓの含有量の変化を裏付けるために必要とさ
れるかもしれない。健常者と患者からの一群のＤＮＡを
スクリーニングするためのプローブとしてｃＤＮＡを使
用することは、その疾病の表現型（ｐｈｅｎｏｔｙｐ
ｅ）の原因である可能性がある遺伝子レベルでの何らか
の総体的な欠失又は転位を検知するものである。
【０１１５】ノーザンブロット分析 ノーザンブロット分析は、完全な（ｉｎｔａｃｔ）ＹＡ
Ｃｓ若しくはそれから得られる適当な制限フラグメント
となり得るハイブリダイゼーションプローブ類の使用に
より、クローン化されたゲノミックＤＮＡに関するコー
ディング配列の存在を証明するために利用することもで
きる。ノーザンブロット分析を行う場合は、相対的に未
分解の完全な（ｔｏｔａｌ）ＲＮＡの単離のための任意
の確立された方法を用いることができる。本発明者らの
研究室では、Ｃｈｉｒｇｗｉｎらの方法（Ｊ．Ｍ．Ｃｈ
ｉｒｇｗｉｎ，Ａ．Ｅ．Ｐｒｚｙｂｙｌａ，Ｒ．Ｊ．Ｍ
ａｃＤｏｎａｌｄ，Ｗ．Ｊ．Ｒｕｔｔｅｒ，Ｂｉｏｃｈ
ｅｍｉｓｔｒｙ，１９１９，１８、５２９４−５２９
９）の変法（Ｐ．Ｅｌｖｉｎ ｅｔ ａｌ，Ｂｒｉｔｉ
ｓｈ Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ，１９８８，５７，３６−４２
に記載されている）によって凍結組織標本又は細胞ペレ
ットから完全なＲＮＡが単離された。
Ｃｓ若しくはそれから得られる適当な制限フラグメント
となり得るハイブリダイゼーションプローブ類の使用に
より、クローン化されたゲノミックＤＮＡに関するコー
ディング配列の存在を証明するために利用することもで
きる。ノーザンブロット分析を行う場合は、相対的に未
分解の完全な（ｔｏｔａｌ）ＲＮＡの単離のための任意
の確立された方法を用いることができる。本発明者らの
研究室では、Ｃｈｉｒｇｗｉｎらの方法（Ｊ．Ｍ．Ｃｈ
ｉｒｇｗｉｎ，Ａ．Ｅ．Ｐｒｚｙｂｙｌａ，Ｒ．Ｊ．Ｍ
ａｃＤｏｎａｌｄ，Ｗ．Ｊ．Ｒｕｔｔｅｒ，Ｂｉｏｃｈ
ｅｍｉｓｔｒｙ，１９１９，１８、５２９４−５２９
９）の変法（Ｐ．Ｅｌｖｉｎ ｅｔ ａｌ，Ｂｒｉｔｉ
ｓｈ Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ，１９８８，５７，３６−４２
に記載されている）によって凍結組織標本又は細胞ペレ
ットから完全なＲＮＡが単離された。
【０１１６】完全なＲＮＡｓ（レーン（ｌａｎｅ）当た
り≧２−１０μｇ）を５０％ホルムアミド及び２．２Ｍ
ホルムアルデヒドを含有する緩衝液中で１０分間７０℃
まで加熱し、氷上で冷却し、１％アガロース−ホルムア
ルデヒドゲル上で電気泳動により分画した。Ｈｙｂｏｎ
ｄ・Ｎ膜（アマーシャム社製）上でのノーザンブロッテ
ィングは製造会社の指示書に従って行った。
り≧２−１０μｇ）を５０％ホルムアミド及び２．２Ｍ
ホルムアルデヒドを含有する緩衝液中で１０分間７０℃
まで加熱し、氷上で冷却し、１％アガロース−ホルムア
ルデヒドゲル上で電気泳動により分画した。Ｈｙｂｏｎ
ｄ・Ｎ膜（アマーシャム社製）上でのノーザンブロッテ
ィングは製造会社の指示書に従って行った。
【０１１７】標識ＹＡＣプローブを使用する更なるハイ
ブリダイゼーションは、ｃＤＮＡライブラリーをスクリ
ーニングするためのＹＡＣプローブの作成及び使用につ
いてすでに記載した内容と本質的に同じ方法で行った。
ブリダイゼーションは、ｃＤＮＡライブラリーをスクリ
ーニングするためのＹＡＣプローブの作成及び使用につ
いてすでに記載した内容と本質的に同じ方法で行った。
【０１１８】適当なＲＮＡサンプルの選択によって、Ｙ
ＡＣプローブを使用するノーザンブロット分析は、組織
特異的な遺伝子発現の評価、種々のＲＮＡサンプル中に
おける発現された配列類の相対的な頻度（ｒｅｌａｔｉ
ｖｅ ａｂｕｎｄａｎｃｅ）の評価及び特定の組織若し
くは疾病状態の複製物の大きさの変化の評価を可能にす
る。
ＡＣプローブを使用するノーザンブロット分析は、組織
特異的な遺伝子発現の評価、種々のＲＮＡサンプル中に
おける発現された配列類の相対的な頻度（ｒｅｌａｔｉ
ｖｅ ａｂｕｎｄａｎｃｅ）の評価及び特定の組織若し
くは疾病状態の複製物の大きさの変化の評価を可能にす
る。
【０１１９】サザンブロット分析 ハイブリダイゼーションプローブとして完全なＹＡＣｓ
の利用は、ゲノミックＤＮＡｓのサザンブロット分析に
更に適用し得る。様々な制限酵素で分解されたヒトゲノ
ミックＤＮＡｓは、アガロースゲル上で分画され、Ｓｏ
ｕｔｈｅｒｎＥ．Ｍ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ，９８，
５０３−５１７，１９７５に記載された方法の変法によ
り適当な膜に移される。ＹＡＣプローブを使用する更な
るハイブリダイゼーションは、ｃＤＮＡライブラリーの
スクリーニング及びノーザンブロット分析におけるＹＡ
Ｃプローブの使用についてすでに記載した内容と本質的
に同じ方法で行う。
の利用は、ゲノミックＤＮＡｓのサザンブロット分析に
更に適用し得る。様々な制限酵素で分解されたヒトゲノ
ミックＤＮＡｓは、アガロースゲル上で分画され、Ｓｏ
ｕｔｈｅｒｎＥ．Ｍ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ，９８，
５０３−５１７，１９７５に記載された方法の変法によ
り適当な膜に移される。ＹＡＣプローブを使用する更な
るハイブリダイゼーションは、ｃＤＮＡライブラリーの
スクリーニング及びノーザンブロット分析におけるＹＡ
Ｃプローブの使用についてすでに記載した内容と本質的
に同じ方法で行う。
【０１２０】ゲルに適用される制限酵素で分解されたＤ
ＮＡｓは単一の個体から得てもよいし、特定の表現型
（例えば、疾病の表現型）を共有する個体由来の制限酵
素分解ＤＮＡｓのプール（ｐｏｏｌ）を表してもよい。
ＹＡＣプローブで同定された制限フラグメントは、個体
又は複数の個体のプールに特異的であると言え、したが
って、特定の表現型に関連した多形態の（ｐｏｌｙｍｏ
ｒｐｈｉｃ）制限フラグメントの同定を可能にする。
ＮＡｓは単一の個体から得てもよいし、特定の表現型
（例えば、疾病の表現型）を共有する個体由来の制限酵
素分解ＤＮＡｓのプール（ｐｏｏｌ）を表してもよい。
ＹＡＣプローブで同定された制限フラグメントは、個体
又は複数の個体のプールに特異的であると言え、したが
って、特定の表現型に関連した多形態の（ｐｏｌｙｍｏ
ｒｐｈｉｃ）制限フラグメントの同定を可能にする。
【０１２１】ゲルに適用される制限酵素で分解されたＤ
ＮＡｓは無関係な種の個体から得ることもできる。得ら
れたサザンブロット（すなわち“ズー・ブロッツ（Ｚｏ
ｏｂｌｏｔｓ）”）へのＹＡＣプローブ類のハイブリダ
イゼーションは、幾つかの種における相同的な保存（ｃ
ｏｎｓｅｒｖｅｄ）ＤＮＡ配列へのＹＡＣの交差ハイブ
リダイゼーションを裏付けるものと言い得る。多くの遺
伝子は配列の進化的保存（ｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙ
ｃｏｎｓｅｒｖａｔｉｏｎ ｏｆ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）
を示すので、そのような相同的制限フラグメントの検出
は、ＹＡＣ中でクローン化されたゲノミックＤＮＡがコ
ーディング配列（単数若しくは複数）を含むという証拠
になり得る。
ＮＡｓは無関係な種の個体から得ることもできる。得ら
れたサザンブロット（すなわち“ズー・ブロッツ（Ｚｏ
ｏｂｌｏｔｓ）”）へのＹＡＣプローブ類のハイブリダ
イゼーションは、幾つかの種における相同的な保存（ｃ
ｏｎｓｅｒｖｅｄ）ＤＮＡ配列へのＹＡＣの交差ハイブ
リダイゼーションを裏付けるものと言い得る。多くの遺
伝子は配列の進化的保存（ｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙ
ｃｏｎｓｅｒｖａｔｉｏｎ ｏｆ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）
を示すので、そのような相同的制限フラグメントの検出
は、ＹＡＣ中でクローン化されたゲノミックＤＮＡがコ
ーディング配列（単数若しくは複数）を含むという証拠
になり得る。
【０１２２】
配列番号：１ 配列の長さ：２８ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列 ACCCGTTCTC GGAGCACTGT CCGACCGC 28 配列番号：２ 配列の長さ：２７ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列 AGTCCTGCTC GCTTCGCTAC TTGGAGC 27 配列番号：３ 配列の長さ：２８ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列 GTGTTATGTA GTATACTCTT TCTTCAAC 28 配列番号：４ 配列の長さ：２８ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列 CTTCAACAAT TAAATACTCT CGGTAGCC 28 配列番号：５ 配列の長さ：１８ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列 GTTGGTTTAA GGCGCAAG 18 配列番号：６ 配列の長さ：２７ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列 ATAGGCGCCA GCAACCGCAC CTGTGGC 27 配列番号：７ 配列の長さ：２７ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列 ACCTGTGGCG CCGGTGATGC CGGCCAC 27 配列番号：８ 配列の長さ：２８ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列 CTTGCAAGTC TGGGAAGTGA ATGGAGAC 28 配列番号：９ 配列の長さ：２０ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列 GTCGAACGCC CGATCTCAAG 20 配列番号：１０ 配列の長さ：３５ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列 GCCTCCCAAA GTGCTGGGAT TACAGGYRTG AGCCA 35 配列番号：１１ 配列の長さ：３５ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列 TGAGCYRWGA TYRYRCCAYT GCACTCCAGC CTGGG 35 配列番号：１２ 配列の長さ：２１ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列 CTCAGGGGAC TCTTACCTTC G 21 配列番号：１３ 配列の長さ：２１ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列 TGTTACTCAC CAAAGAGATG G 21 配列番号：１４ 配列の長さ：２０ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列 ATCCATTCAT CCATTCTCCC 20 配列番号：１５ 配列の長さ：２０ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列 CAACATCAGG TCAACCAGAG 20 配列番号：１６ 配列の長さ：２４ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列 CCATATCAGG CCCTGAATAT CAGC 24 配列番号：１７ 配列の長さ：２４ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列 CATNAATGGC CAGATGACAG ATCC 24 配列番号：１８ 配列の長さ：２４ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列 TTGGTTTCCT TNAACATCTT TGTG 24 配列番号：１９ 配列の長さ：２４ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列 GCAGAAGGAG AGAAAGACCA CTGG 24 配列番号：２０ 配列の長さ：２４ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列 CCTTATCTAT ATTTTCAAGT ACTC 24 配列番号：２１ 配列の長さ：２４ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列 CAGCTGGTAA TATTTTGCTC TGTG 24 配列番号：２２ 配列の長さ：２８ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列 GAATTCAGTT NNAAATATGT TGAGATTG 28 配列番号：２３ 配列の長さ：２３ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列 CTGGCTTCAA GGACCACCTC ATC 23 配列番号：２４ 配列の長さ：２５ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列 AATTCAGTCA AGGATGACGA TTGAC 25 配列番号：２５ 配列の長さ：２５ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列 GTACACATGA TTTTATTGTG TCTAC 25 配列番号：２６ 配列の長さ：２５ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列 AGTGAATCAT ATAACCTAGC CATTG 25 配列番号：２７ 配列の長さ：２０ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列 CAATTAACAT TTATGAACTC 20 配列番号：２８ 配列の長さ：１０４ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列 GGGATATTCA ATTCAATTGA GATTTGAGTG GGGACCAAAC CATATCAGGC CCTGAATATC 60 AGCCTCCAAA TCAGCCAACT TCTGATTATT TACAGGANGG CCTA 104 配列番号：２９ 配列の長さ：１０９ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列 AAGTCTTGGT TTCCTTNAAC ATCTTTGTGC CATCTCAAAT CTGAATATTA GGTATTGTCA 60 CCCTACTACC CATCAGGAGT CCAGTGGTCT TTCTCTCCTT CTGCCATCA 109 配列番号：３０ 配列の長さ：１５４ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列 TTANCGACAG GAGACGNNTG ACCATTATAA NNGAGACACA AAGAGACACC GTTATGCATG 60 GTGTAGAAAT CGTGTACTAT ACCGATAANT TTACTCTTAC GAAAACCTCA TGAACTTTTA 120 TANCTNTTCC TTAAGGCNTT AGANNNCTNN NNCG 154 配列番号：３１ 配列の長さ：１２２ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列 GAATTCAGTT NNAAATATGT TGAGATTGAA GTACAAAAAC ATAGACATCT CCAGGAGGTG 60 TTTCCATGAA AGAGACATGG TGGGAAAAGT AAATTTGTTG ATGAGGTGGT CCTTGAAGCC 120 AG 122 配列番号：３２ 配列の長さ：１１３ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列 GAATTCAGTC AAGGATGACG ATTGACAAAG GAGTCTTATC ATTTAAAAAA TCATTTCAAA 60 TTAAAGCTAA TATCTTTTAA GTATAGAAGT AGACACAATA AAATCATGTG TAC 113 配列番号：３３ 配列の長さ：１２６ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列 GAATTCTTAA AAGTGAATCA TATAACCTAG CCATTGTATT TCTAAGTAGT TATCCAAAAT 60 ACCTGGAAGC ATATTTCTGT ACAAAAAATG AGTTCATAAA TGTTAATTGT TTTATTTGTA 120 ATAGCT 126 配列番号：３４ 配列の長さ：１４１ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列 CGGGCCTGCT TACTACAGGC GCCCCGGCCA TGGCCAGGCC ATCGACACGG CTGCCATCGA 60 AACGGCCACC GCGTCAAGGG CAGCTACAAC CGGGCGGAAA ACGTCTTCAA GGTCAGCAAG 120 CCACGCGACG ACGTGAAGAT C 141 配列番号：３５ 配列の長さ：３４２ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列 GGTGATGCCG TGCTCCTCCA TCATGCTGGC GGCATCCACG GCCAGCGCGT CTTCGGCGAT 60 GGTGCGTGGC CCCTTGTGCA TGACATCGCC GGCCTGCAGC GCGCGCAGGT CGGTGCCGGC 120 CTCCACGCGG CGGCGCAGGT CTCCGTCGGT GAAGATGCCC TGCAGCACGC CTGCCGCATC 180 GACGATGGCC GAGCAGCCCA GGCCCTTGGC GCTCATCTCG CGCATCAGTT CGACAAAGCT 240 GGCATCNCCC GACCTTCGGC AGCTCATCGC CGCTGCGCAT GACATCACGC ACATGGGTCA 300 GCAGTTTGCG GCCCAGCGCA CCGCCCGGAT GGAGCGCGCA AA 342 配列番号：３６ 配列の長さ：２５２ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列 GATCCACGCC GGCACCAGCC TCTGAATTCC CTTAGTATTT ATTGATCTGG GCATGGTGAC 60 CGGCATCGAC CTGGTGCTGG CGCTGTCCAA CAGCGGCGAG GCNATGAGCT CGCTGCGCTG 120 CTGCCGGCCA TCAAGNCGAC CAGGGCATAC CCCTGGTGGC CATGACCGGC GGCGCGCAAT 180 CCACNCTNNC NCGCCATGCT GACTGGGTGC TGGACACCGT GTCGAGCNCG AGGCCTGCCT 240 TTGAACCTGG CA 252 配列番号：３７ 配列の長さ：３８０ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列 GATCTGTTCG CCAATGTGCG CGGCGCACGC CTGCCGGCCT GCACGCGGAA ACCGTGCTCG 60 ATGGCCGTGG GTTGGGCAAG GTGCTGAAGC GCTATCGGAT TGCGTGAACC ACTGCAGAGC 120 CGAGCATAGG CTTATGGGGA ATCCGCAGCA ACGGGGTCAG AGCCCTCTCC ACAGGAGAGG 180 AATCCGACCC CAGCGCGATG AGCCGAGCAT AGGCTCGTAC GGGGAATCCG CAGCAACGGG 240 GTCAGAGCCT CTCCACAGGA GAGGAATCCG ACCCCAGCGC GANAGGCATA GGCTCGGCTC 300 TACGGGGAAT CCGCAGCAAC GGGGTCAGAG NNCTCTCCTC AGGAGAGGCA TCCGACCCCG 360 GCGCCAGGGC TTCAGCGCGC 380
【図１】遺伝子座と各制限酵素との関係を表す図であ
る。
る。
【図２】ＹＡＣとＥｃｏＲＩとの関係を示す図である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.5 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ａ６１Ｋ 48/00 ＡＡＭ 8314−4Ｃ Ｃ１２Ｎ 5/10 15/11 15/12 ＺＮＡ (31)優先権主張番号 ９１１２７９９．３ (32)優先日 1991年６月13日 (33)優先権主張国 イギリス（ＧＢ）
Claims (16)
- 【請求項１】 個体からの核酸サンプル中の１種以上の
遺伝性又は後天性疾患対立遺伝子の検出方法であって、
ＹＡＣ ２３ＣＢ１０、２８ＣＡ１２及び２６ＦＦ３の
いずれかに含まれる遺伝子中の変異ヌクレオチド塩基配
列の有無を検査する方法。 - 【請求項２】 １種以上のアルツハイマー病対立遺伝子
を検出するための請求項１記載の方法。 - 【請求項３】 前老年期（＜６５歳）アルツハイマー病
を検査するための請求項２記載の方法。 - 【請求項４】 個体からの核酸サンプル中の１種以上の
遺伝性又は後天性疾患対立遺伝子の検出方法であって、
個体ファミリーのメンバーからの核酸サンプル中のＹＡ
Ｃ ２３ＣＢ１０、２８ＣＡ１２及び２６ＦＦ３のいず
れかに含まれる対立遺伝子が被検個体からの核酸サンプ
ル中の遺伝性又は後天性疾患の対立遺伝子の存在と一致
して遺伝されたか否かを検査することを含む方法。 - 【請求項５】 下記要素： （ａ） 【化１】 （ｂ） 【化２】 （ｃ） 【化３】 （ｄ） 【化４】 （ｅ） 【化５】 （ｆ） 【化６】 のいずれかから独立的に選択されるポリヌクレオチド又
はその補体が選択的にハイブリッド化する核酸フラグメ
ントに含まれる遺伝子座における変異ヌクレオチドの有
無を検査することを含む請求項１〜３のいずれかに記載
の方法。 - 【請求項６】 下記要素： （i） 【化７】 （ii） 【化８】 （iii） 【化９】 （iv） 【化１０】 のいずれかから独立的に選択されるポリヌクレオチド又
はその補体が選択的にハイブリッド化する核酸フラグメ
ントに含まれる遺伝子座における変異ヌクレオチドの有
無を検査することを含む請求項１〜３のいずれかに記載
の方法。 - 【請求項７】 任意のラベル又はマーカー成分を有する
少なくとも１種のポリヌクレオチドプローブ又はプライ
マーの使用を含む請求項１〜６のいずれかに記載の方
法。 - 【請求項８】 請求項７で定義したような１種以上のプ
ローブ又はプライマーを適当な使用説明書、任意のバッ
ファー、供試ＤＮＡ又は対照ＤＮＡ等と共に含む診断キ
ット。 - 【請求項９】 プローブとしてのＹＡＣ ２３ＣＢ１
０、２８ＣＡ１２及び２６ＦＦ３又はこれらのフラグメ
ントのいずれかの使用を含む請求項１〜４のいずれかに
記載の方法。 - 【請求項１０】 ＹＡＣ ２３ＣＢ１０、２８ＣＡ１２
及び２６ＦＦ３のいずれかに含まれる遺伝子の遺伝子産
物にライズされる（ｒａｉｓｅｄ）抗体の使用を含む請
求項１〜４のいずれかに記載の方法。 - 【請求項１１】 ＹＡＣ ２３ＣＢ１０、２８ＣＡ１２
及び２６ＦＦ３又はそれらのフラグメントのいずれかの
使用を含むトランスフェクテッド（ｔｒａｎｓｆｅｃｔ
ｅｄ）細胞ラインの製造方法。 - 【請求項１２】 ＹＡＣ ２３ＣＢ１０、２８ＣＡ１２
及び２６ＦＦ３又はそれらのフラグメントのいずれかの
使用を含むトランスジェニック種の製造方法。 - 【請求項１３】 アルツハイマー病治療剤の製造へのＹ
ＡＣ ２３ＣＢ１０、２８ＣＡ１２及び２６ＦＦ３のい
ずれか又はそれらのフラグメントの使用。 - 【請求項１４】 ＹＡＣ ＳＣ／２３ＣＢ１０（ＮＣＩ
ＭＢ４０２５５）。 - 【請求項１５】 ＹＡＣ ＳＣ／２８ＣＡ１２（ＮＣＩ
ＭＢ４０４１６）。 - 【請求項１６】 ＹＡＣ ＳＣ／２６ＦＦ３（ＮＣＩＭ
Ｂ４０４１５）。
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|---|---|---|---|
| GB9112801.7 | 1991-06-13 | ||
| GB9112797.7 | 1991-06-13 | ||
| GB919112795A GB9112795D0 (en) | 1991-06-13 | 1991-06-13 | Nucleotide sequence |
| GB919112797A GB9112797D0 (en) | 1991-06-13 | 1991-06-13 | Nucleotide sequences |
| GB9112799.3 | 1991-06-13 | ||
| GB9112795.1 | 1991-06-13 | ||
| GB919112801A GB9112801D0 (en) | 1991-06-13 | 1991-06-13 | Polynucleotides |
| GB919112799A GB9112799D0 (en) | 1991-06-13 | 1991-06-13 | Nucleic acid sequences |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH05211897A true JPH05211897A (ja) | 1993-08-24 |
Family
ID=27450699
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP4155462A Pending JPH05211897A (ja) | 1991-06-13 | 1992-06-15 | ヌクレオチド配列 |
Country Status (10)
| Country | Link |
|---|---|
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| EP (1) | EP0518583B1 (ja) |
| JP (1) | JPH05211897A (ja) |
| AT (1) | ATE163050T1 (ja) |
| AU (1) | AU662150B2 (ja) |
| CA (1) | CA2071105A1 (ja) |
| DE (1) | DE69224327T2 (ja) |
| GB (1) | GB2256642B (ja) |
| IE (1) | IE71923B1 (ja) |
| NZ (1) | NZ242955A (ja) |
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|---|---|---|---|---|
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| US5656427A (en) * | 1994-08-29 | 1997-08-12 | Gen-Probe Incorporated | Nucleic acid hybridization assay probes, helper probes and amplification oligonucleotides targeted to Mycoplasma pneumoniae nucleic acid |
| FR2742758A1 (fr) * | 1994-10-28 | 1997-06-27 | Ass Fr Contre Les Myopathies | Segment d'adn chromosomique associe a une des formes de la maladie d'alzheimer, sondes correspondantes et leurs applications diagnostiques |
| US6210919B1 (en) | 1995-04-28 | 2001-04-03 | Hsc Research And Development Limited Partnership | Genetic sequences and proteins related to alzheimer's disease |
| US6531586B1 (en) | 1995-04-28 | 2003-03-11 | The Hospital For Sick Children | Genetic sequences related to Alzheimer's Disease |
| US5986054A (en) | 1995-04-28 | 1999-11-16 | The Hospital For Sick Children, Hsc Research And Development Limited Partnership | Genetic sequences and proteins related to alzheimer's disease |
| EP0876483A1 (en) * | 1996-01-26 | 1998-11-11 | HSC Research and Development Limited Partnership | Nucleic acids and proteins related to alzheimer's disease, and uses therefor |
| US20030131364A1 (en) * | 1999-04-27 | 2003-07-10 | Karen Duff | Method for producing transgenic animal models with modulated phenotype and animals produced therefrom |
| WO2006032021A2 (en) | 2004-09-14 | 2006-03-23 | Yale University | Identification of gene associated with reading disability and uses therefor |
| DK2917369T3 (en) | 2012-11-07 | 2019-04-15 | Univ Yale | ASSESSMENT OF THE RISK OF READING AND LANGUAGE DISORDER |
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| GB8724412D0 (en) * | 1987-10-19 | 1987-11-25 | Medical Res Council | Protein |
| WO1989007657A1 (en) * | 1988-02-10 | 1989-08-24 | The Children's Medical Center Corporation | Amyloid protein precursors, genetic probes, antibodies, and methods of use |
| US5015570A (en) * | 1988-05-13 | 1991-05-14 | Molecular Therapeutics, Inc. | Molecular diagnosis of Alzheimer Disease |
| GB8920211D0 (en) * | 1989-09-07 | 1989-10-18 | Ici Plc | Diagnostic method |
| EP0421099A3 (en) * | 1989-09-25 | 1991-11-21 | American Cyanamid Company | Methods for modulating promoter responsible for beta amyloid precursor protein expression |
| GB8921791D0 (en) * | 1989-09-27 | 1989-11-08 | Imp Cancer Res Tech | Disease gene |
| WO1991017269A1 (en) * | 1990-05-03 | 1991-11-14 | Ig Laboratories, Inc. | A method for mapping a eukaryotic chromosome |
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-
1992
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