JP5424519B2 - パーキン遺伝子の突然変異、組成物、方法及び使用 - Google Patents
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Description
a)組み合わせるか又は組み合わせない1個以上のエキソンの欠失、
b)エキソンの重複(例えば二重、三重)、
c)点突然変異、
d)読み枠シフトを誘導する1隣接塩基対以上の欠失、及び
e)1隣接塩基対以上の挿入から選択される1個以上の遺伝子変異を含むことを特徴とするヒトパーキンをコードする核酸に関する。
−エキソン4におけるヌクレオチド584のA→T突然変異(Lys161Asp)、
−エキソン6におけるヌクレオチド734のA→T突然変異(Lys211Asn)、
−エキソン7におけるヌクレオチド867のC→T突然変異(Arg256Cys)、
−エキソン7におけるヌクレオチド924のC→T突然変異(Arg275Trp)、
−エキソン7におけるヌクレオチド939のG→A突然変異(Asp280Asn)、
−エキソン9におけるヌクレオチド1084のG→A突然変異(Gly328Glu)、
−エキソン9におけるヌクレオチド1101のC→T突然変異(Arg334Cys)、及び/又は
−エキソン12におけるヌクレオチド1390のG→A突然変異(Gly430Asp)。
−エキソン7におけるヌクレオチド966のT→G突然変異(Cys289Gly)。
−エキソン11におけるヌクレオチド1345のC→A突然変異(Thr415Asn)。
−202及び203位のヌクレオチドAGの欠失。この欠失はアミノ酸残基34(Gln→Arg)のレベルから開始し、停止コドン(37)で終結する読み枠の変異を導入する。従って、このタンパク質は切断されており、元の4アミノ酸のC末端領域を含む。
−255位のヌクレオチドAの欠失。この欠失はアミノ酸残基52(Asn→Met)のレベルから開始し、停止コドン(81)で終結する読み枠の変異を導入する。従って、このタンパク質は切断されており、元の30アミノ酸のC末端領域を含む。
−エキソン9に対して−21〜−17位のイントロン8の5塩基対TCTGCの欠失。この欠失はスプライシング部位の非認識を生じ得る。
−Arg348をGluに変異させる1142−1143delGA位のエキソン9における2塩基対の欠失。この欠失は読み枠の変異を導入し、エキソン10の368位に停止コドンを生成する。
−エキソン9の1101位のC→Tミスセンス突然変異(Arg334Cys)とエキソン9に対して−21〜−17位のイントロン8の5塩基対の欠失。
−エキソン7の924位のC→Tミスセンス突然変異(Arg275Trp)とエキソン12の1390位のG→Aミスセンス突然変異(Gly430Asp)。
−エキソン4のヌクレオチド601のG→A突然変異(Ser167Asn)、−エキソン10のヌクレオチド1239のG→C突然変異(Val380Leu)、
−エキソン11のヌクレオチド1281のG→A突然変異(Asp394Asn)。
−遺伝子変異の5’に配置されたパーキン遺伝子領域に相補的な第1のプライマーと、
−前記遺伝子変異の3’に配置されたパーキン遺伝子領域に相補的な第2のプライマーを含むことを特徴とする上記核酸の全部又は一部の増幅用プライマー対にも関する。
i)パーキン遺伝子を含む試料を準備する段階と、
ii)上記遺伝子変異を含む前記遺伝子の少なくとも一部を(半定量的に)増幅する段階と、
iii)遺伝子変異の存在を検出する段階を含む。
For:5'-(Hex)AATTGTGACCTGGATCAGC-3'(配列番号2)、及び
Rev:5'-CTGGACTTCCAGCTGGTGGTGAG-3'(配列番号3)
Asp280Asn:5'-GGCAGGGAGTAGCCAAGTTGAGGAT-3'(配列番号4)
野生型 G
Arg334Cys:5'-AGCCCCGCTCCACAGCCAGCGC-3'(配列番号5)
野生型 G
A−図面の説明
図1:ヒトパーキンをコードするcDNAの配列。エキソン間の境界を表示する。開始コドン(atg)と停止コドン(tag)を太字で示す。768位のC→T変異を太字と下線で示す。
1.家族及び患者
第1系列の実験では、下記基準に従って38家族を選択した。i)レボドパ反応性パーキンソン病、ii)罹患メンバーの少なくとも1人の発病年齢が45歳まで、iii)常染色体劣性遺伝に適合可能な伝達。
パーキン遺伝子をコードする12個のエキソンのDNAをKitadaらに記載されている条件に従って各指針症例の末梢血白血球からPCR増幅した。要約すると、各dNTP350μM、各プライマー350μM及びTaqポリメラーゼの存在下にDNA100ngで増幅を行った。増幅条件は94℃30秒間、55〜61℃30秒間、次いで68℃30秒間を35サイクルとした。エキソン4及び7についてはイントロンプライマー対のみを使用した。PCR増幅に使用したプライマーとシーケンシングキット“Big Dye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction”(ABI PRISM)を使用して12個のエキソンの配列を2本鎖で作製し、電気泳動後に“Sequence Analysis 3.0”(ABI PRISM)ソフトウェアを使用してABI377シーケンサーで分析した。
Ex3iFor:
5'-AATTGTGACCTGGATCAGC-3'(配列番号6)
Ex3iRev:
5'-CTGGACTTCCAGCTGGTGGTGAG-3'(配列番号7)
a)原理
パーキン遺伝子におけるエキソンのヘテロ接合欠失又は重複の検出は非定量的PCRにより実施することができない。そこで、1個以上のエキソンに鋳型DNAの50%が不足しているか、又は逆にヘテロ接合もしくはホモ接合重複の場合には例えば1個以上のエキソンに過剰の例えば50%(ヘテロ接合二重)、100%(ホモ接合二重又はヘテロ接合三重)又は200%(ホモ接合三重)のDNAが存在しているかを知るためには、鋳型DNAの相対率を比較する半定量的PCRを実施すればよい。この比較を実施するためには、同一個体の数個のエキソンをPCR反応で同時に増幅し(多重PCR)、同時増幅したエキソンを量の内部標準として使用する。蛍光プライマーを使用してPCRを実施すると、例えばApplied BiosystemsのLOH Assay(Loss of Heterozygosity)で適用されるように、自動シーケンサー(ABI Prism 377)でピーク高によりPCR産物の量を測定することができる。利用可能な支持体による制限のない指数期にPCRを実施するならば、PCR産物の量(ピーク高)は鋳型DNAの量に直接関連する。多重PCR毎にエキソンの所与組み合わせについて対照個体のピーク高の代表分布と各ピーク間で決定される比が得られる。
予備実験の間に、最良に増幅するエキソンは効率が良くない他のエキソンの増幅に負の効果があることが認められた。そこで、増幅効率が同等のエキソンを再編成した。更に、PCR産物の寸法も増幅効率に影響を与え得る(短い配列は一般に長い配列よりも良好に増幅される)ので、多重反応で同等寸法のPCR産物を再編成した。こうして、3種のエキソン組み合わせを選択した。
組み合わせ2:Ex5(227bp)+6(268bp)+8(206bp)+10(165bp)及び
組み合わせ3:Ex2(308bp)+3i(243bp)+9(278bp)+12(255bp)+C328(328塩基対の外部対照)。
For:5'-(Hex)AATTGTGACCTGGATCAGC-3'(配列番号8)及び
Rev:5'-CTGGACTTCCAGCTGGTGGTGAG-3'(配列番号9)
TTRForHex:5'-(Hex)ACGTTCCTGATAATGGGATC-3'(配列番号10)及び
TTR328Rev:5'-CCTCTCTCTACCAAGTGAGG-3'(配列番号11)。
一般に、個体毎に少なくとも2回の平行反応で多重PCRを実施した。患者系列毎に(既知エキソンヘテロ接合欠失をもつ)少なくとも1個の陽性対照と少なくとも1個の陰性対照(対照個体)を平行処理し、プレミックスに存在し得る差(ピペッティング変動)に起因する過誤結果を避けるように反応プレミックス毎に正常値と病理値を得た。鋳型DNAを含まない2個の付加対照も加えた。PCR産物1.5〜2.5μlを(サイズマーカーとしてApplied BiosystemsのTAMRA 500XL 0.3μlを含む)ローディング緩衝液4μlと混合した。自動シーケンサーABI377で96ウェルを含む4%変性ポリアクリルアミドゲルにこの混合物1.5μlをロードした。ゲルをGeneScan 3.1及びGenotyper 1.1.1ソフトウェア(Applied Biosystems)により分析した。Genotyperに指示されるようにピーク高を測定した。(Taqポリメラーゼが各末端にAを不定期に加える結果として生じる)1塩基対差の二重ピークについては、2個のピーク高を加算した。Excel 5.0ソフトウェアを使用して各反応の各ピーク組み合わせの比を計算し(表5)、2回の反応の平均値を計算する。
欠失については、比の差が対照と症例の夫々の全比(患者の比/対照の比、図4に関する表5参照)で少なくとも1.6の逆数即ち≦0.625(=1/1.6)であるならば、結果は疾病であると解釈する。(例えばPCRのある回の増幅率が低いために)平行反応間の比の差が不一致の場合には、十分な増幅で得られた比が正常であるならばこれらの比を採用する。
a)点突然変異
パーキン配列変異体を(他の試料の利用可能性による)家族内の同時分離と、パーキンソン病をもたない対照集団(61〜73個体)におけるその存在について試験した。1142−1143delGA突然変異は明らかに病原性であるため、この突然変異については対照を試験しなかった。使用した方法はPCRと、適当な制限酵素による消化又はポリアクリルアミドゲル電気泳動(PAGE=polyacrylamide gel electrophoresis)であった(表2参照)。変異体がそのままでは制限部位変化を生じなかった場合には、ミスマッチをもつプライマーを使用して部位を人工的に生成した。配列変異体の位置の近傍に1塩基の変異を導入し、この変異体を含む制限部位を生成するようにプライマーを設計した。プライマーを下表に示す。
家族内のエキソン欠失又は重複の同時分離を従来記載されている方法により分析した。これらの突然変異は読み枠シフトを伴うか又は伴わずにタンパク質の内部欠失を誘導する病原性である可能性が非常に高いので、対照集団を試験しなかった。
PARK2遺伝子座との関係を分析するために、Tassinら(1998)に記載されているようにこの遺伝子座の近傍に位置する4種のマイクロサテライト型マーカー(D6S1579、D6S411、D6S1550及びD6S305)を試験した。
a)第1系列の実験では87人の患者を含むAR−JPをもつ38家族の指針症例でパーキン遺伝子の分析を行った。
エキソン増幅の結果、3家族でホモ接合状態の欠失の存在が判明し、その内訳はフランス人1家族(SAL−024)とポルトガル人1家族(SAL−711)でエキソン3が欠失しており、アルジェリア人1家族(DEL−001)でエキソン8及び9が欠失していた。これらの欠失はホモ接合状態の各家族では全患者で検出されるが、関連健常サンプルでは検出されないので、疾病と共に伝達される(図2)。
欠失のない家族で配列を分析した結果、エキソン12個とイントロン4個(表2及び3、図3)の16個の核酸配列変異体の存在が判明した。3個の変異体は読み枠シフトと切断タンパク質合成を誘導する。これらの変異体はエキソン2の202−203delAG(Gln34Arg(Stop37))及び255delA(Asn52Met(Stop81))とエキソン3の321−322insGT(Trp74Cys(Stop81))の突然変異であり、夫々IT−020及びUK−086、TOU−096、LYO−119家族に検出された。これらの突然変異は202−203delAG以外はホモ接合状態である。IT−006家族にはエキソン12にナンセンス突然変異1459G→A(Trp453Stop)がホモ接合状態で存在している。変異体の8個はミスセンス型である。エキソン4には584A→T(Lys161Asp)及び601G→A(Ser167Asn)が夫々IT−020及びSAL−730家族の患者にヘテロ接合状態で存在している。エキソン7には、867C→T(Arg256Cys)及び924C→T(Arg275Trp)変異体が夫々DE−012及びIT−015家族にヘテロ接合状態で検出される。エキソン10には、1239G→C(Val380Leu)変異体が11家族(IT−014、IT−020、IT−058、SAL−017、GRE−029、SAL−038、TOU−096、SAL−431、UK−006、UK−086、DE−022)にヘテロ接合及びホモ接合状態で検出される。エキソン11には1281G→A(Asp394Asn)変異体がUK−046家族にヘテロ接合状態で検出され、1345C→A(Thr415Asn)変異体がIT−014家族にホモ接合状態で検出される。最後に、768C→T(Pro223Ser)変異体は配列決定した全個体にホモ接合状態で検出されるので非病原性であり、パーキン配列のミスプリントであると思われる[Kitadaら,1998]。対照集団でこれらの変異体を調査した処、Ser167Asn、Val380Leu及びAsp394Asnの3種が多型性を示すことが判明した(表2)。他の変異体は切断パーキン合成又は非保存置換又はリン酸化可能なアミノ酸の1個の置換を誘導したので、病原突然変異である可能性が非常に大きい。更に、これらの変異体は家族内で疾病と共に分離し、90個の対照染色体では検出されない。
配列の分析と比較によりパーキンの機能的ドメインを試験した。この試験の結果、アミノ酸保存置換Thr415AsnはcAMP及びcGMP依存性タンパク質キナーゼのコンセンサス配列(KKTT)とタンパク質キナーゼCのリン酸化部位(TTK)に位置することが判明した。この試験の結果、ナンセンス突然変異Trp435Stopはミリストイル化N末端部位(GCEWNR)に位置することも判明した。
ホモ接合欠失と点突然変異は患者26人を含む12家族で検出された。平均発病年齢は36.7歳であり、その範囲は7〜56歳であった(表3)。突然変異の機能的結果(ホモ接合欠失、切断突然変異及びミスセンス突然変異)により家族間を比較した処、振戦はホモ接合欠失をもつ家族のほうが切断突然変異をもつ家族に比較して有意に低頻度であるが、発病年齢、重篤度又は関連徴候頻度に有意差は認められない(表3)。
エキソンに8個の新規点突然変異が同定され、そのうち6個はミスセンス突然変異であり、1個が切断、1個がナンセンスであり、即ちエキソン6の734A→T(Lys211Asn)、エキソン7の905T→A(Cys268Stop)、939G→A(Asp280Asn)及び966T→G(Cys289Gly)、エキソン9の1084G→A(Gly328Glu)、1142−1143delGA及び1101C→T(Arg334Cys)、エキソン12の1390G→A(Gly430Asp)であった。ミスセンス突然変異のうちの5個は非保存アミノ酸置換を誘導し、1個は保存置換(Cys289Gly)を誘導する。更に、エキソン9に対して−21〜−17位に位置するイントロン8に5塩基対の欠失も検出された。これらの全配列変異体は61〜73人の対照個体では検出されなかったので(1142−1143delGA突然変異は試験しない)、多型性ではない。結果を表2に詳細に示す。
Hattoriら(1998a)とLuckingら(1998)によりエキソン3、Hattoriら(1998a)によりエキソン3+4について既に報告されている欠失以外に、エキソンのホモ接合欠失が3家族で検出された。これらの欠失はエキソン3(FDP−ANG−GEO−141)、3+4(IT−064)及び5+6(SPD−LIB−HAG−076)である。読み枠に及ぼすエキソン欠失の結果と試料におけるその相対頻度を表4に示す。
5種の新規エキソン二重、即ちホモ接合状態のエキソン3の二重(SPD−NIC−AIT−091)と、ヘテロ接合状態のエキソン3の二重(SAL 399 213)が検出された。更に、エキソン6(FPD−LIL−CHA−171)、エキソン7(DE4001)及びエキソン11(SAL 399 213)の二重も検出された。2種の三重即ちホモ接合状態(RM347)とヘテロ接合状態(RM330)のエキソン2の三重も検出された。
13種の異なるエキソンヘテロ接合欠失組み合わせが21家族で検出された。検出された欠失はエキソン2、2+3、2+3+4、3、3+4、3−6、3−9、4、5、6、6+7、7+8+9及び8であった。エキソン2、2+3、2+3+4、3−6、3−9、6、6+7、7+8+9及び8の欠失は新規である。
2家族以上で5個の点突然変異が検出された。これらの突然変異は202−203delAG(5家族でヘテロ接合又はホモ接合状態)、255delA(6家族でホモ接合又はヘテロ接合状態)、Lys211Asn(2家族でヘテロ接合状態)及びArg275Trp(5家族でヘテロ接合状態)である。
パーキン突然変異をもつ家族のうち、8家族でエキソンのホモ接合欠失、10家族でホモ接合状態の点突然変異、1家族でホモ接合エキソン二重、1家族でエキソン三重が検出された。21家族の患者は2種の異なる突然変異の複合ヘテロ接合であった(異なる点突然変異3回、点突然変異とエキソン欠失6回、点突然変異と二重2回、三重とエキソン欠失1回、異なる2種のエキソン二重1回及び異なる2種のエキソン欠失6回、表4参照)。2症例では、数個の隣接エキソンの複合欠失がヘテロ接合であるか否かを判定することができず、13症例(点突然変異6例とエキソン突然変異7例)ではヘテロ接合状態の突然変異しか検出されなかった。
本発明はパーキン遺伝子の変異体、その診断及び/又は治療的使用、及びパーキン遺伝子の変異(特にヘテロ接合エキソン欠失とエキソン重複)を検出するための技術に関する。
第1試験ではパーキン遺伝子における欠失、突然変異及び挿入の存在を検出することができた。
まず、パーキン遺伝子におけるヘテロ接合状態のエキソン欠失とホモ接合及びヘテロ接合状態のエキソン重複(例えば、二重、三重)の検出について説明する。エキソン欠失は比較的頻度が高い(後記参照)ので、この側面は有用である。検出方法として、半定量的多重PCRプロトコールを選択し、開発した。この方法は指数期にPCR増幅を行うならば遺伝子定量、例えばPMP22遺伝子の欠失の検出(PoropatとNicholson,1998)に有効であると既に認められている。これらの全実験において、定量の標準として使用する同時増幅対照の選択は重要である(Prior,1998)。実験では、同一個体で多重PCR増幅の内部対照として非欠失エキソンを使用する。隣接する2個に欠失がある場合には対照として使用できないので、隣接する2個以上のエキソンを含まないように4又は5個のエキソンの組み合わせを選択した。別の遺伝子(Transthyretin)のエキソンを3種の組み合わせのうちの1種で同時増幅し、パーキン遺伝子全体のヘテロ接合欠失を同定した。この外部対照はTransthyretinと共に試験したエキソン9の両側のエキソンを含む他の2種の組み合わせで間接的に表した。
比較的頻度は低いが、過去にパーキン遺伝子で記載されていない4種のエキソン二重と1種のエキソン三重を同定することができた。更に、10種の新規エキソン欠失組み合わせが同定され、エキソン2の欠失を立証したのは今回が最初であった。点突然変異とエキソン欠失の相対頻度は約50%であると推定された。即ち、(ヘテロ接合又はホモ接合)エキソン欠失はパーキンの突然変異の50%までを占め、本願に記載する技術の有用性が強調される。実際に、この技術は53家族のうちの26家族で突然変異を検出することができた。即ち、試料でパーキン遺伝子における点突然変異及び欠失は同一頻度であったが、日本人ではエキソン欠失が大半を占めている(Hattoriら,1998)。記載したエキソン欠失又は重複の機能的結果(読み枠シフト又はインフレーム欠失/重複)はパーキンの公開cDNA配列(Kitadaら,1998)から推定したが、PCR産物の不在はエキソン欠失が必ずしも完全に存在することを意味しないので(上記参照)、上記結果は推測に過ぎない。しかし、検出された変異は試験することができた家族で疾病と共に伝達され、複合ヘテロ接合体で点突然変異に関連しており、欠失は点突然変異と似た頻度で同定されるので、このような変異が疾病に関与している可能性は非常に高い。更に、個別症例では、ヘテロ接合欠失と点突然変異の頻度は似通っている。エキソン3の場合には、PCR産物が存在しない場合にこのエキソンの変異を示すエキソンプライマーを使用した。更に、症例の一部では、隣接する数個のエキソンを同時に欠失させ、ゲノム欠失を大きくした。
得られた結果は、早期発病パーキンソン病をもつ77家族のうちの34家族がパーキン遺伝子の突然変異をもつことを示しており、この遺伝子がヨーロッパ人家族で重要であることを裏付けている。分析した102個別症例のうちの18症例で突然変異が検出されたが、度数が低く、症例によっては分析が不完全であるので、これを解釈するのは難しい。他方、驚くべきことに、分かっている7症例の発病年齢は特に早く(13〜22歳)、パーキン遺伝子の突然変異なしに非常に早期に発病する症例(例えば、IT−NA−JMP−3)は非常に少ないことが分かった。この結果は、年齢が低い場合、特に25歳以下の場合に個別症例でパーキン遺伝子の突然変異の頻度が増すことを示唆している。小家族では常染色体劣性病が個別症例として出現する全可能性があることを考慮するならば、個別症例でパーキン遺伝子の突然変異が観察されるのは意外ではない。発病年齢によるパーキンの突然変異の頻度を個別症例で正確に決定するためには、もっと大きい試料を分析すると有用であろう。
エキソンのヘテロ接合欠失又にエキソン重複の検出技術により複合ヘテロ接合症例を同定することができたが、家族の約1/4(53家族のうちの13家族)では単一突然変異しか検出されなかった。その内訳は、ヘテロ接合状態の点突然変異6症例と、ヘテロ接合状態のエキソン欠失7症例であった。これらの突然変異はアミノ酸の非保存置換又は切断タンパク質を誘導するので、病原役割をもつ可能性が非常に高い。更に、これらのミスセンス型突然変異の1種(Arg275Trp)は別のヘテロ接合点突然変異(Gly430Asp)とヘテロ接合エキソン欠失(エキソン3−6又はエキソン5+6)に関連しており、異なる3家族で他の対立遺伝子に検出される。13家族では他の対立遺伝子に突然変異が検出されなかったので、検出されない第2の突然変異が遺伝子の別の領域に存在すると考えられる。この仮説は、PARK2遺伝子座に関係すると予想される6家族で患者が領域の4種のマーカーに対してハロタイプであるために突然変異が全く検出されなかったという事実により裏付けられる。従って、プロモーター領域、非翻訳5‘及び3’領域又はイントロン配列等の遺伝子の他の領域に存在すると考えられる。
77家族のうちの5家族では、パーキン遺伝子座との遺伝子関係を除外することができた。更に、この遺伝子座を明確に排除できなかった21家族では突然変異が同定されなかった。これらの結果は、ヨーロッパでは早期発病常染色体劣性パーキンソン病をもつ家族に少なくとも1個の別の遺伝子座が存在するらしいということを示唆している。この仮説はLeroyら(1998)により提案され、2つに分岐する家族が報告され、一方はパーキン遺伝子の欠失を示すが、他方はこれらの欠失も同一ハプロタイプも示さないため、この遺伝子座との関係が除外される。
エキソンのヘテロ接合欠失又はエキソン重複の新規検出方法を報告する。特に、エキソン二重/三重とエキソン2及び他のエキソン組み合わせの欠失は新規である。エキソン配列決定と組み合わせることにより、8種の新規点突然変異と、スプライシング部位に関係すると思われるイントロン欠失を同定することができた。即ち、分析した77家族のうちの34家族(約50%)がパーキン遺伝子の突然変異を示す。更に、19個別症例でこの遺伝子の突然変異が検出された。ヨーロッパ人では、点突然変異とエキソン欠失の割合は等しいと思われる。更に、欠失に関するエキソン3〜5と3種の点突然変異(202−203delAG、255delA及びArg275Trp)に対応する2つの突然変異ホットスポットも判明した。
Claims (11)
- 試験試料中において、配列番号1を含むヒトパーキン遺伝子におけるヘテロ接合性遺伝子変異を同定する方法であって、前記遺伝子変異が、
a)次の単一エキソン又はエキソンの組合せのいずれか1個の欠失:
エキソン2−3;
エキソン2;
エキソン2−4;
エキソン3−6;
エキソン6;
エキソン6−7;
エキソン8;
エキソン7−9;もしくは
エキソン3−9;
b)エキソン3、6、7又は11のいずれか1個の重複、
c)次のアミノ酸変化のいずれか1個を生じる点突然変異:
Gln34Arg;
Lys161Asn;
Lys211Asn;
Arg256Cys;及び
Arg275Trp、
(ここにおいて、前記アミノ酸は、配列番号1によりコードされる)、
d)エキソン2の三重重複、あるいは
e)前記a)乃至d)の組合せ
を含んでなる同定方法。
- 前記パーキン遺伝子中の遺伝子変異の検出が、前記試料中の核酸を単離することを含んでなる、請求項1に記載の方法。
- 前記パーキン遺伝子中の遺伝子変異の検出が、前記試料中の核酸を増幅することを含んでなる、請求項1に記載の方法。
- 前記増幅工程が、
遺伝子変異の5’に位置するパーキン遺伝子の領域に相補的な第1のプライマー;及び
遺伝子変異の3’に位置するパーキン遺伝子の領域に相補的な第2のプライマー
を含んでなるプライマー対の手段にて行われる請求項3に記載の方法。
- 前記試料が、血液、組織、血漿及び細胞培養物からなる群から選択される生物学的試料である、請求項1に記載の方法。
- 前記試料が、前記増幅工程においてパーキン遺伝子又はその一部が利用し易くなるように前処理され、該前処理は細胞の溶解、酵素処理又は変性から選択される、請求項3に記載の方法。
- 検出工程が、配列決定、PCR/制限、ASO、PAGE又は多重PCRにより行われる請求項1に記載の方法。
- 前記検出が、エキソンの欠失、エキソンの重複、エキソンの三重重複、又はそれらの組合せを明示する、請求項7に記載の方法。
- 前記1個以上の遺伝子変異が、常染色体劣性パーキンソン症候群に伴われるものである、請求項1に記載の方法。
- 試験試料又は生物学的試料が、ヒト対象から得られるものである、請求項1に記載の方法。
- ヒト対象が、常染色体劣性パーキンソン症候群を有するヒトである、請求項10に記載の方法。
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