JP2003533991A

JP2003533991A - 新生児インスリン依存性糖尿病及び多発性骨端異形成症（ウオルコット−ラリソン症候群）の患者における変異した真核生物の翻訳開始因子２アルファキナーゼ３，ｅｉｆ２ａｋ３

Info

Publication number: JP2003533991A
Application number: JP2001586567A
Authority: JP
Inventors: ジュリエール、セシル; デルピンヌ、マルク; ニコリノ、マルク
Original assignee: Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale INSERM
Current assignee: Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale INSERM
Priority date: 2000-05-23
Filing date: 2001-05-23
Publication date: 2003-11-18
Also published as: WO2001090371A1; CA2410520A1; US20040180338A1; EP1283889A1

Abstract

(57)【要約】本発明は、ウオルコット−ラリソン症候群（ＷＲＳ）を誘導し得る、糖尿病及び／又はＷＲＳに関連する他の病変を発症する危険性に影響を及ぼしうる翻訳開始因子２アルファキナーゼ３（ＥＩＦ２ＡＫ３）をコードするゲノム配列の単離された変異型核酸配列、並びにこれらの配列によってコードされるポリペプチドに関する。本発明は、また、これらの配列を含むベクター又は形質転換細胞に関する。本発明は更に、被験者における、糖尿病及び／又はＷＲＳに関連する他の病変を発症する危険性を決定する為のための方法及びキット、並びにこれらの病変の予防及び／又は治療のための医薬として使用できる化合物の選択方法に関する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】本発明は、ウオルコット−ラリソン症候群（ＷＲＳ）を誘導し得るか、あるい
は糖尿病及び／又はＷＲＳに関連する他の病変を発症する危険性に影響を及ぼし
得る翻訳開始因子２アルファキナーゼ３（ＥＩＦ２ＡＫ３）をコードするゲノム
配列の単離された変異型核酸配列(nucleic sequence)、並びにこれらの配列によ
ってコードされるポリペプチドに関する。本発明はまた、これらの配列を含むベ
クター又は形質転換細胞に関する。本発明は更に、被験者における糖尿病及び／
又はＷＲＳに関連する他の病変を発症する危険性を決定する為の方法及びキット
、並びにこれらの病変の予防及び／又は治療のための医薬として使用できる化合
物の選択方法に関する。

【０００２】ウオルコット−ラリソン症候群（ＷＲＳ）は、新生児発症又は乳児期出現のイ
ンスリン依存性糖尿病によって特徴付けられ、後年出現する多発性骨端異形成症
及び骨粗鬆症を伴う。ＷＲＳと関連しうる他の状態には、肝腎不全、精神遅滞、
皮膚異常（外胚葉異形成症）及び歯変色並びに心臓血管異常が挙げられる(Wolco
tt, C. D., ら, J. Pediatr., 80,292-297,1972; Goumy, P., ら, Arch Fr Pedi
atr., 37,323-328,1980; Stoss, H., ら, Eur J Pediatr., 138,120-129, 1982;
Al-Gazali, L. I., ら, Clinical Dysmorphology, 4,227-233,1995; Thornton,
C. M., ら, Pediatr. Pathol. Lab. Med., 17,487-96,1997)。インスリン補充
療法は糖尿病の発症から必要であるけれども、抗−膵島細胞自己抗体や他の糖尿
病関連自己抗体がＷＲＳ患者に存在しないので、病因は自己免疫であるとは思わ
れない。膵臓のオートプシー検査によって、膵臓β細胞の重大な減少が示されて
いる(Nicolino, P. M., ら, Hormone Research, 50, A215,1998)。

【０００３】本症候群は、３人の罹患した子孫のいる単一ファミリーにおいてWolcottとRal
lisonによって1972年に初めて記載された(Wolcott, C. D.ら)。次いで、文献で
約１０ケースが報告された。本症候群のまれさに係わらず、入手可能なデータは
、該症候群が、常染色体劣性形質として遺伝する：該疾患はＷＲＳ患者の親には
存在しない；その発症率は性別とは関係がないようである；該疾患は子孫で繰り
返される；及び、それは、血族結婚で生まれた子供に主に見出される、ことを強
く論証している。完全な症候群が出現する前に、糖尿病又は他の病理学的兆候か
ら、患者は非常に若い年齢で死に得るし、次いで、新生児の、又は初期発症のイ
ンスリン依存性糖尿病（ＩＤＤＭ）と誤診され得るが故にＷＲＳの発症率は実際
より少なく見積もられる。まれにあるメンデリアンサブタイプの多因子疾患は、
新規な疾患経路を同定する為の、及び他のより普通の疾患形態における罹病性の
研究のための、洞察を与え得る。例えば、ＷＲＳの原因遺伝子のよりマイルドな
変異体はまた、ＩＤＤＭの通常の形態や他の関連兆候に対する罹病性に関連し得
、このようにして、この症候群の研究に特別の関心を与え得る。ウオルフラン症
候群⁷、若年発症成人型糖尿病（ＭＯＤＹ）等の糖尿病の他のまれな形態（最近
の総説として、Inoue, H. ら, Nat. Genet., 20,143-8,1998; Hattersley, A. T
., Diabet. Med. 15,15-24,1998; Winter, W. E., ら, Endocrinol Metab. Clin
. North. Am., 28,765-85,1999; Froguel, P., ら, Trends in Endocrinology a
nd Metabolism, 10,142-146,1999参照）、並びに糖尿病と高血圧を伴ったインス
リン抵抗性の代謝性症候群（Barroso, I., ら, Nature, 402,880-3 1999)の研究
は全て、生物学的に興味のある新規疾患機構を示した。

【０００４】ＷＲＳに関与する病原経路は不明であるが、上記理由により、該疾患は、多形
質発現の原因の単一遺伝子によることが大いにあり得る。自己免疫プロセスの証
拠は無く、膵臓β−細胞が完全に欠如しているので、この遺伝子は、内分泌腺の
膵臓の発達に関与しているのかも知れないということが提唱されてきた。最近、
以前から膵臓β細胞の分化に重要であると示されてきたペアド−ボックス転写因
子ＰＡＸ４遺伝子(Sosa Pineda, ら, Nature, 386,399-402,1997)の詳細な研究
から、この遺伝子が原因遺伝子であるという見込みは無くなった(Bonthron, D.
T., ら, J. Med. Genet., 35,288-92,1998)。染色体１５ｑ１１−１２のモザイ
ク欠失の患者においてＷＲＳ症候群が存在する唯一のケースの報告は、遺伝子が
この染色体領域に位置するという可能性を提起した(Stewart, F. J. ら, Clin.
Genet. 49,152-5,1996)。しかし、この局在化の可能性の確認は報告されていな
かった。

【０００５】ヒトにおける糖尿病の原因の分子機構は複雑で、遺伝的要因及び環境要因を含
む。これらの病変を発症する危険性を予測でき、及び／又はより良く標的化され
た医薬を開発できるように、糖尿病にかかわる遺伝的機構を規定することは重要
である。

【０００６】本発明者らは、異なる種族的出身の２つの血縁家族（一方はチュニジア人家系
でもう一方はパキスタン家系）でＷＲＳを試験した。３人の罹患子供と１人の非
罹患子供を有する第１のファミリーで、ゲノム−ワイドな連鎖研究を行い、染色
体２の１７ｃＭ領域に、該疾患に関与する遺伝子の可能性のある局在化の同定が
できた。局在化は第２のファミリーで確認され、データをあわせることにより、
我々は遠位及び近位境界での組換え事象によって規定される２−３ｃＭの間隔に
遺伝子をマッピングすることができた。その間隔にマッピングされた遺伝子の中
で、膵島での高レベルの発現故に、ＷＲＳの主要な候補遺伝子として、本発明者
らは、真核生物の翻訳開始因子２アルファキナーゼ（ＥＩＦ２ＡＫ３）（膵臓真
核性開始因子２α−サブユニットキナーゼ（ＰＥＫ）としても知られる）を同定
した。この遺伝子は、胎盤でも高度に発現されている（母親からの正常な発現は
、誕生時のＷＲＳ患者の健康な状態、次いで糖尿病の急速な発症を説明し得る）
。

【０００７】それ故、本発明は、翻訳開始因子２アルファキナーゼ３（ＥＩＦ２ＡＫ３）を
コードする遺伝子の哺乳動物ゲノム配列の単離された変異型核酸配列であって（
該ＥＩＦ２ＡＫ３タンパク質は配列番号２の配列を有する）、哺乳動物における
該変異型配列の存在によって、ウオルコット−ラリソン症候群（ＷＲＳ）を誘導
し得るか、又は糖尿病及び／又はＷＲＳ関連病変の発症若しくは進行の危険性に
影響を与え得ることを特徴とする変異型核酸配列に関する。

【０００８】本発明は、天然形態の核酸配列又はポリペプチドに関するものではなく、即ち
、それらは、天然環境でとられるのではなくて、天然源からの精製によって、あ
るいは遺伝子組換えによって、又は化学合成によってそれらが得られることが可
能であったかもしれないことを理解すべきである。

【０００９】核酸配列又は核酸は、修飾されているか、若しくはされていないヌクレオチド
の明確な連続を指定する非天然のヌクレオチドを含むか若しくは含まない、核酸
のフラグメント、セグメント若しくは領域が定義付けされるのを可能とする、単
離された天然の若しくは合成のＤＮＡ及び／又はＲＮＡフラグメントを意味する
よう理解される。

【００１０】変異型核酸配列（又はタンパク質、ポリペプチド若しくはペプチド変異体）は
、天然に存在し得る、特にヒトにおいて存在し得る、特にヌクレオチド（又はア
ミノ酸残基）の欠失、置換及び／又は付加に対応する全ての代替(alternative)
核酸配列（又は代替ポリペプチド）を意味するように理解されよう。本ケースに
おいて、変異型核酸配列（又は変異型ポリペプチド）は、特に部分的に、糖尿病
及び／又はＷＲＳ関連病変の発症又は進行の危険性に関連しよう。このように、
それらは、体質、又は糖尿病及び／又はＷＲＳ関連病変の発症及び／又は進行に
対する抵抗性若しくは防御性、好ましくは糖尿病及び／又はＷＲＳ関連病変を発
症しやすい、及び／又は進行しやすい病的素因（危険性増大）と関連しうる。

【００１１】本明細書において、「糖尿病及び／又はＷＲＳ関連病変」は、１型糖尿病、２
型糖尿病、並びに他の型の糖尿病、及び／又はＷＲＳ罹患患者で報告されている
他の病変、特に例えば、骨粗鬆症及び関節炎等の骨疾患、肝不全、ネフロパシー
若しくは他の腎不全、精神遅滞、皮膚異常、歯変色、及び心臓血管異常を意味す
るように理解されよう。

【００１２】ＷＲＳ関連骨疾患では、軟骨無形成症、骨端異形成症、軟骨形成不全症、低軟
骨形成症も特に記載することができる。

【００１３】正常の核酸配列又は正常の変異型核酸配列（又は正常の変異型ポリペプチド）
は、哺乳動物、特にヒトにおいて、糖尿病及び／又はＷＲＳ関連病変の発症及び
／又は進行の危険性に影響しない核酸配列又は変異型核酸配列(variant nucleic
)（又は正常の変異型ポリペプチド）を意味するように理解されよう。

【００１４】「糖尿病及び／又はＷＲＳ関連病変の発症及び／又は進行の危険性に影響する
」とは、哺乳動物、特にヒトにおいて、被験者が、糖尿病及び／又はＷＲＳ関連
病変にかかる（発症又は進行する）可能性の増大（病的素因）又は減少（抵抗性
若しくは防御性）を意味するように理解されよう。

【００１５】アレル又はアレル変異体は、ヒトにおいて存在する多型、特に、ＷＲＳを有す
る危険性、又は糖尿病及び／又はＷＲＳ関連病変（特に、１型若しくは２型糖尿
病レベル、又はそれ以外の型の糖尿病のレベル、好ましくは１型糖尿病レベルで
）の発症及び／又は進行の危険性に影響を与えうる多型に対応する天然の代替配
列を意味するように理解されよう。

【００１６】代替核酸配列は、正常配列と比較して少なくとも１つの点変異、好ましくは、
正常配列と比較して点変異を最大１０％、好ましくは５％、２．５％、２％、１
．５％、及び１％を含む核酸配列を好ましくは意味するように理解される。好ましくは、本発明は、点変異がサイレントではない、即ち、正常配列につい
て、コードされたアミノ酸の修飾をもたらす代替核酸配列に関する。更により好
ましくは、これらの点変異は、正常タンパク質の触媒位置に位置するアミノ酸に
影響を与える。

【００１７】核酸(acid nucleic)フラグメント（又はポリペプチドフラグメント）は、最小
１２ヌクレオチド又は塩基、好ましくは、１５、２０、２５、３０、４０又は５
０塩基を含む核酸フラグメント（又はコードされるポリペプチド若しくはペプチ
ド）を意味するように理解される。これらのフラグメントは、哺乳動物、特にヒ
トにおいて、糖尿病及び／又はＷＲＳ関連病変の発症の危険性に影響を与えない
核酸配列（正常な変異型核酸）と比較して特に１つの点変異を含み得る。

【００１８】好適な実施態様において、本発明のこの単離された変異型核酸配列は、糖尿病
及び／又はＷＲＳ関連病変が、１型糖尿病、２型糖尿病、それ以外の型の糖尿病
、骨粗鬆症、関節炎、肝不全、ネフロパシー及び他の腎不全並びに精神遅滞から
なる群から選択されることを特徴とする。別の好適な実施態様では、この単離された変異型核酸配列は、糖尿病及び／又
はＷＲＳ関連病変が、１型糖尿病、２型糖尿病、及び他の型の糖尿病からなる群
から選択されることを特徴とする。より好適な実施態様では、この単離された変異型核酸配列は、糖尿病及び／又
はＷＲＳ関連病変が、１型糖尿病及び２型糖尿病からなる群から選択されること
を特徴とする。特により好適な実施態様において、この単離された変異型核酸配列は、糖尿病
及び／又はＷＲＳ関連病変が、１型糖尿病であることを特徴とする。

【００１９】本発明の主題はまた、糖尿病及び／又はＷＲＳ関連病変が、膵臓β−細胞又は
その完全性(integrity)全体の喪失、特に重大な減少に関連することを特徴とす
る本発明の単離された変異型核酸配列である。本発明は、膵臓及び／又は軟骨細胞に由来する特定のタンパク質に対するＥＩ
Ｆ２ＡＫ３によって発揮される制御（もし正常に発揮されるのならば、該制御は
、これらの器官の十分な発育と機能を保証する）の変化から、糖尿病及び／又は
ＷＲＳ関連病変が生じるということを特徴とする本発明の単離された変異型核酸
配列に関する。

【００２０】本発明の単離された変異型核酸配列の中で、配列番号３〜１５の配列又はその
フラグメントからなる群から選択される核酸配列を含む、又はそれらからなる単
離された変異型核酸配列も好適である（但し、該単離された変異型核酸配列は、
配列番号１の配列ではない）。好適な実施態様において、本発明は、本発明の単離された変異型核酸配列に関
し、該変異型配列によってコードされるタンパク質ＥＩＦ２ＡＫ３が、配列番号
２のＥＩＦ２ＡＫ３の配列と比較して少なくとも１つの変異を示すことを特徴と
する。また好適な実施態様において、本発明は、本発明の単離された変異型核酸配列
によってコードされるタンパク質ＥＩＦ２ＡＫ３が、配列番号２の配列を有する
タンパク質ＥＩＦ２ＡＫ３の未熟終結又は触媒ドメインａａ５７６−ａａ１１１
５内の少なくとも１つの変異を示すことを特徴とする、核酸配列に関する。配列番号１の配列において位置１１０３でのＴの挿入、又は位置１８３２での
ＧからＡへのトランジションを含むことを特徴とする、本発明の単離された変異
型核酸配列もまた、本発明の一部を形成する。

【００２１】更に好適な実施態様において、本発明は、表４Ａ及びＢ並びに表５のカラム「
ｃＤＮＡ位置」及び／又は「ゲノムＤＮＡ位置」において規定される核酸配列多
型を少なくとも１つ該配列中に含むことを特徴とする、本発明の単離された変異
型核酸配列に関する。より好適な実施態様において、本発明は、ヒト核酸配列から選択されることを
特徴とする、本発明の単離された変異型核酸配列に関する。本発明の変異型核酸配列の相補的配列も、本発明に含まれる。

【００２２】別の目的で、本発明は、本発明の単離された変異型核酸配列によってコードさ
れるポリペプチドであって、そのアミノ酸配列が、配列番号２のＥＩＦ２ＡＫ３
の配列と比較して、少なくとも１つの点変異を示すことを特徴とするポリペプチ
ドに関する。好適な実施態様では、本発明は、表４Ａ及び５のカラム「アミノ酸」に列挙し
たアミノ酸変異の少なくとも１つを含むことを特徴とする、本発明のポリペプチ
ドに関する。本発明のポリペプチドをコードすることを特徴とする単離された核酸配列はま
た、本発明の一部を形成する。

【００２３】本発明は更に、単離された核酸配列であって、ａ）本発明の核酸配列のフラグメントであり且つ、少なくとも１２、１５、２０
、２５、３０、４０又は５０塩基を含むフラグメント；ｂ）ａ）で規定された核酸配列と特異的にハイブリダイズでき、そして少なくと
も１２、１５、２０、２５、３０、４０又は５０塩基を含む核酸配列；からなる群から選択されることを特徴とする単離された核酸配列を含む。

【００２４】レファレンス核酸配列と「特異的にハイブリダイズできる核酸配列」は、スト
リンジェントな条件下（当業者に周知で、例えば、Sambrook ら (Molecular Clo
ning, A Laboratory Manual, Sec. Edition, Cold Spring Harbor Laboratory P
ress, pages 11.50 and 11.51,1989)に見出すことができる条件）、該レファレ
ンス配列とハイブリダイズできる核酸配列を意味するものと理解されよう。好ましくは、レファレンス核酸配列と特異的にハイブリダイズできる核酸配列
は、レファレンス配列の相補配列と最適アラインメント後、少なくとも８０％、
８５％、９０％、９５％又は９９％同一度を有する。「同一度」という用語は、本明細書では、本出願で以下に定義される最適アラ
インメント後の、２つの配列間での同一性の程度又はパーセンテージを指す。

【００２５】最大限に一致するようにアラインされたとき、２つの配列のアミノ酸又はヌク
レオチド残基が同一ならば、２つのアミノ酸又はヌクレオチド配列は「同一」と
言われる。２つ（又はそれより多くの）ペプチド又はポリヌクレオチド間の配列
比較は典型的には、配列類似性の局所領域の同定と比較のためのセグメント又は
「比較ウインドウ」上で、２つの最適にアラインされた配列の配列を比較するこ
とによって行う。比較のための配列の最適アラインメントは、Smith and Waterm
an, Ad. App. Math 2: 482 (1981)の局所相同性アルゴリズムによって、Neddlem
an and Wunsch, J. Mol. Biol. 48 : 443 (1970)の相同性アラインメントアルゴ
リズムによって、Pearson and Lipman, Proc. Natl. Acad. Sci. (U. S. A.) 85
: 2444 (1988)の類似性法の検索によって、これらのアルゴリズムのコンピュー
タによる履行(the Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer
Group (GCG), 575 Science Dr., Madison, WI中のGAP, BESTFIT, FASTA, and TF
ASTA)によって、又は可視検査によって、行うことができる。

【００２６】「同一度」は、比較ウインドウ上で２つの最適にアラインされた配列を比較す
ることによって決定する。そこでは、比較ウインドウ中のペプチド又はポリヌク
レオチド配列の部分は、２つの配列の最適アラインメントのために、レファレン
ス配列（付加又は欠失を含まない）と比べて、付加又は欠失を含み得る。両方の
配列で同一のアミノ酸残基又は核酸塩基が存在する位置の数を測定し、マッチし
た位置の数を得、そのマッチした位置の数を、比較ウインドウ中の位置の全数で
割り、結果を１００倍して、配列同一性のパーセンテージを得ることによって、
パーセンテージは計算される。上記配列同一性の定義は、当業者が使用するであろう定義である。定義はそれ
自身は、如何なるアルゴリズムの助けを必要としない。アルゴリズムは、配列同
一性の計算よりも、配列の最適アラインメントを達成するためにのみ助けとなる
。上記定義から、２つの比較した配列間で配列同一性のための良く規定された、
唯一の値（その値は、最良又は最適のアラインメントで得られた値に対応する）
が存在するということが導かれる。

【００２７】ＢＬＡＳＴＮ又はＢＬＡＳＴＰにおける、「ＢＬＡＳＴ２配列」（Tatu
sova ら,“Ｂｌａｓｔ２配列−タンパク質及びヌクレオチド配列を比較する為
の新規道具”, FEMS Microbiol. Lett. 174: 247-250）ソフトウエア、これはウ
エブサイトhttp://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/bl2.htmlで利用でき、２つの配
列間の同一性を比較し、決定するために、本発明者らによって、そして一般的に
当業者によって慣習的に使用される。比較されるべき配列の性質と長さに関し選
択された置換マトリックスに依存する「オープン・ギャップ・ペナルティ」及び
「エクステンション・ギャップ・ペナルティ」は、該ソフトウエアによって直接
的に選択される（即ち、置換マトリックスＢＬＯＳＵＭ−６２の場合にそれぞれ
「５」及び「２」）。比較されるべき２つの配列間の同一性パーセンテージは、
該ソフトウエアによって直接的に計算される。

【００２８】本発明によれば、核酸配列のフラグメントは、核酸配列の検出、同定又は増幅
の方法においてプローブ又はプライマーとして使用できる。これらのフラグメン
トは、最小サイズ１０塩基を有し、少なくとも２０塩基、好ましくは２５や３０
塩基のフラグメントが好適であろう。プライマー又はプローブとして使用できる核酸配列であって、本発明の配列で
あることを特徴とする核酸配列はまた、本発明の一部を形成する。本発明は、本発明のヌクレオチド配列から演繹でき、特に、ＰＣＲ法等の増幅
方法、あるいは関連の方法を用いて、本発明のヌクレオチド配列、特に代替配列
を検出するのを可能としうる全てのプライマーに関する。

【００２９】本発明は、本発明のヌクレオチド配列、特にそれらとハイブリダイズできる配
列から演繹でき、本発明のヌクレオチド配列を検出するのを、特に正常配列と代
替配列間を識別することを可能としうる全てのプローブに関する。本発明の全てのプローブ及びプライマーは、検出可能な、及び／又は定量可能
なシグナルを得るために、当業者周知の方法によって標識されていてもよい。

【００３０】本発明は、勿論、ＤＮＡ配列とＲＮＡ配列の両方、並びにそれらとハイブリダ
イズする配列に関する。それ故、本発明は、プライマー又はプローブとして、本発明の単離された核酸
配列に関する。好適な実施態様では、本発明は、配列番号１６〜１０５の配列からなる群から
選択されることを特徴とする、本発明の単離された核酸配列に関する。別の局面では、本発明は、センス又はアンチ−センスオリゴヌクレオチドとし
て使用できる核酸配列であって、その配列は、本発明の配列から選択されること
を特徴とする核酸配列を含む。

【００３１】所定の核酸フラグメントのうち、特に、アンチ−センスオリゴヌクレオチド（
即ち、その構造が、標的配列とのハイブリダイゼーションによって、対応する産
物の発現の阻害を確実にする）を記載すべきである。対応する産物の発現の制御
にかかわるタンパク質との相互作用によって、この発現の阻害又は活性化を誘導
するであろうセンスオリゴヌクレオチドも言及すべきである。

【００３２】本発明の核酸配列から得られ得ることを特徴とする、ＥＩＦ２ＡＫ３遺伝子の
プロモーター及び／又はレギュレーターの核酸配列、又はそれらのアレル変異体
の１つ、又はそれらのフラグメントの１つも、本発明に含まれる。ＥＩＦ２ＡＫ３遺伝子のプロモーター及び／又は制御配列に関与し得る、対応
するタンパク質の発現、特に、それらの発現レベルに影響し得る変異を有する配
列もまた、本発明の先行する配列の一部を形成する。

【００３３】ＥＩＦ２ＡＫ３遺伝子のゲノム配列を用いて、ヒト被験者の集団、より詳細に
は、上記病変に罹患しているか、又はその危険性のある患者の集団中で、それら
のプロモーター及び／又はレギュレーター中に存在する多型を同定することが実
際に可能である。これらの配列番号３〜１５の配列中、非コードドメインに対応する配列番号３
の配列は、ＥＩＦ２ＡＫ３遺伝子のプロモーター及び／またはレギュレーター配
列をコードする配列を含む。該配列又はその活性フラグメントは、それらのプロ
モーター及び／又はレギュレーター、並びにその多型を同定するために特に興味
深い。該プロモーター及び／又はレギュレーターはまた、膵臓β−細胞等の、Ｅ
ＩＦ２ＡＫ３遺伝子が天然に発現されている細胞で、ＥＩＦ２ＡＫ３ポリペプチ
ド、又はその変異体、又は異種タンパク質の発現をターゲッティングするために
使用できる。

【００３４】特に診断のためには、目的とし得る核酸フラグメントのうち、例えば、ＥＩＦ
２ＡＫ３遺伝子のゲノムイントロン配列、例えば、特に正常な代替配列あるいは
ＷＲＳを有する危険性又は糖尿病及び／又はＷＲＳ関連病変（の発症及び／又は
進行）を有する危険性に影響を与える代替配列の、イントロンとエキソンとの間
の結合配列を言及すべきである。

【００３５】本発明はまた、本発明の核酸配列を含むクローニング及び／又は発現ベクター
を含む。宿主細胞で該配列の発現及び／又は分泌を可能とする要素を含むことを特徴と
する、本発明のベクターはまた、本発明の一部を形成する。該ベクターは好ましくは、プロモーター、翻訳開始シグナル及び翻訳終結シグ
ナル、並びに転写制御のための適当な領域を含むであろう。それらは、細胞内で
安定に維持されなければならないし、それらは、場合によっては、翻訳タンパク
質の分泌を特定化する特別のシグナルを有し得る。これらの異なる制御シグナルは、使用する細胞宿主に基づき選択される。この
目的のために、本発明の核酸配列は、選択された宿主内の自律複製ベクター、又
は選択された宿主のインテグレイティブベクターに挿入され得る。

【００３６】自律複製系のうち、好ましくは宿主細胞に応じて、プラスミド又はウイルスタ
イプの系が用いられるであろう。ウイルスベクターは、特に、アデノウイルス、
レトロウイルス、ポックスウイルス又はヘルペスウイルスであり得る。当業者は
、これらの系の各々を使用できる技術を知っている。宿主細胞の染色体への配列の組み込みが所望される場合には、例えば、プラス
ミド又はウイルスタイプの系が使用できるであろう。このようなウイルスは、例
えば、レトロウイルスであろう。このようなベクターは、当業者によって通常使用される方法に基づき、製造さ
れよう。それから生じるクローンは、例えば、リポフェクション、エレクトロポ
レーション又は熱ショック等の標準的な方法によって適当な宿主に導入され得る
。

【００３７】本発明は更に、宿主細胞、特に、本発明のベクターによって形質転換された真
核細胞及び原核細胞、並びに、本発明の形質転換細胞の１つを含む、ヒトを除く
哺乳動物を含む。これらの目的のために使用できる細胞のうち、勿論、細菌細胞だけでなく、酵
母細胞、動物細胞、特に、哺乳動物細胞培養物、そして特にチャイニーズハムス
ター卵巣細胞（ＣＨＯ）、更に、昆虫細胞（バキュロウイルスを用いる方法を用
いることが可能、例えば、Ｓｆ９細胞）を言及することができる。

【００３８】本発明の哺乳動物のうち、本発明のポリペプチド、正常若しくは変異型ＥＩＦ
２ＡＫ３、特にヒト起源の代替物に対応する表現型を発現するマウス、ラット又
はウサギ等の動物が好適であろう。

【００３９】より特別に関心のある動物モデルには、特に、 −ＥＩＦ２ＡＫ３遺伝子の発現に欠損を示すトランスジェニック動物。それらは
、胚性幹細胞における相同組換え、これらの幹細胞の胚への移入、生殖系のレベ
ルで影響を受けたキメラの選択、及び該キメラの生育によって得られる； −マウス及び／又はヒト起源のＥＩＦ２ＡＫ３遺伝子アレル変異体の１つ以上を
過剰発現するトランスジェニックマウス。該マウスは、普遍的性質、又は組織の
タイプ、好ましくは膵臓器官、に選択的な強いプロモーターの制御下に、ＥＩＦ
２ＡＫ３遺伝子アレル変異体の複数コピーのトランスフェクションによって得ら
れる； −ＬＯＸＰ／ＣＲＥリコンビナーゼ系、又は動物の正確な年齢で遺伝子の発現を
不活化する任意の他の系を用いて不活化することによって、ＥＩＦ２ＡＫ３遺伝
子部分が欠損したトランスジェニック動物； −ウイルス転写又は遺伝子治療後、ＥＩＦ２ＡＫ３遺伝子を過剰発現する動物（
好ましくは、ラット、ウサギ、マウス）；がある。

【００４０】本発明はまた、組換え又は合成ポリペプチドの製造のための本発明の核酸配列
の使用に関する。化学合成によって得られ、組換えポリペプチドに対応する非天然アミノ酸を含
み得るポリペプチドもまた、本発明に含まれる。これらのポリペプチドは、当業者公知の組換えポリペプチドの製造のための技
術に従い、上記核酸配列から製造できる。この場合、使用する核酸配列は、細胞
宿主でその発現を可能とするシグナルの制御下に置かれる。組換えポリペプチドの製造の有効な系は、本発明のベクターと本発明の宿主細
胞とを有することを必要とする。これらの細胞は、上記ベクターに挿入された核酸配列を宿主細胞に導入し、次
いで、トランスフェクトされたヌクレオチド配列の複製及び／又は発現を可能と
する条件下で該細胞を培養することによって得られ得る。

【００４１】これらの細胞は、本発明の組換えポリペプチドの製造方法で使用でき、また、
分析とスクリーニングのためのモデルとして役立ち得る。組換え形態の本発明のポリペプチドの製造方法はそれ自体本発明に含まれるが
、本発明の核酸配列の組換えポリペプチドの発現を可能とする条件下、形質転換
細胞を培養し、該組換えポリペプチドを回収することを特徴とする。

【００４２】本発明のポリペプチドを特異的に認識し得ることを特徴とする、モノ−若しく
はポリクローナル抗体若しくはそのフラグメント、キメラ抗体、又はイムノコン
ジュゲート抗体もまた、本発明の一部を形成する。特異的ポリクローナル抗体は、本発明の変異型ポリペプチド、特に、正常アミ
ノ酸配列と比較して代替的である本発明の変異型ポリペプチド（該変異型ポリペ
プチドは、通常の方法に従い遺伝子組換え又はペプチド合成によって、本発明の
核酸配列から製造できる）に対し免疫化した動物の血清から得られる。本発明の、特に関心のある、ある種の変異型ポリペプチド又はそのフラグメン
トを特異的に認識する抗体の有利性は、特に注目しうる。特定のモノクローナル抗体は、通常のハイブリドーマ培養方法によって得られ
れ得る。本発明の抗体は、例えば、キメラ抗体、ヒト化抗体、Ｆａｂ又はＦ（ａｂ´）
２フラグメントである。それらはまた、検出可能な、及び／又は定量可能なシグ
ナルを得るように、イムノコンジュゲート又は標識化された抗体の形態であり得
る。

【００４３】本発明はまた、本発明の変異型ポリペプチドの検出及び／又は精製の方法であ
って、本発明の抗体を用いることを特徴とする方法に関する。更に、本発明の抗体、特にモノクローナル抗体はまた、生体試料中のこれらの
ポリペプチドの検出のために使用できる。このように、それらは、例えば、免疫蛍光法、金標識、酵素的イムノコンジュ
ゲートによって、特定の組織切片上で該変異型ＥＩＦ２ＡＫ３ポリペプチドの発
現の免疫細胞化学的又は免疫組織化学的分析のための手段を構成する。それらは、特に、生物組織若しくはサンプル中でこれらのポリペプチドの異常
な発現を検出することを可能にし、そのことは、ＥＩＦ２ＡＫ３ポリペプチドの
異常発現の検出のために、又は糖尿病及び／又はＷＲＳ関連病変の予防方法若し
くは治療方法の進歩をモニターするために、それらを有用なものとする。

【００４４】アレル変異性（例えば、ヌクレオチドの欠失、置換、及び／又は付加といった
ＥＩＦ２ＡＫ３遺伝子変異の存在）、ヘテロ接合性の喪失、あるいは遺伝子異常
の決定方法であって、本発明の核酸配列を使用することを特徴とする方法もまた
本発明の一部を形成する。

【００４５】本発明の方法による、試験する被験対象でのアレル変異性、ヘテロ接合性の喪
失又は遺伝子異常の決定により、例えば、被験対象の配列を、糖尿病及び／又は
ＷＲＳ関連病変の発症若しくは進行の危険性の減少若しくは増大を示さない被験
者のＥＩＦ２ＡＫ３遺伝子配列と比較することによって、あるいは、被験対象が
、ＷＲＳを有することが知られている被験者、又は糖尿病及び／又はＷＲＳ関連
病変を有する危険性が減少若しくは増大していることが知られている被験者との
アレル同一性を示すか、示さないかを決定することにより、糖尿病及び／又はＷ
ＲＳ関連病変の病的素因と関連した、又は糖尿病及び／又はＷＲＳ関連病変の発
症若しくは進行の危険性に対する抵抗性若しくは防御性と関連した、１つのアレ
ル若しくは各々のアレルに存在するＥＩＦ２ＡＫ３遺伝子の代替配列を示す被験
者の同定が可能となるであろう。

【００４６】これらの診断方法は、例えば、患者からの生体試料中に、上記配列の１つにお
ける変異の存在を測定することによって、ＷＲＳを有する危険性の出生前若しく
は産後診断の方法、あるいは例えば、ＥＩＦ２ＡＦ３タンパク質の発現における
異常と関連した、糖尿病及び／又はＷＲＳ関連病変の病的素因の診断方法、又は
糖尿病及び／又はＷＲＳ関連病変に対する抵抗性若しくは防御性の診断方法に関
する。分析される核酸配列は、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ又はｍＲＮＡのいずれか
であり得る。

【００４７】本発明に基づく核酸ツールはまた、隔離された患者における陽性診断及び鑑別
診断を可能とし得る。ツールは好ましくは、危険性のある被験者、特に家族歴の
ある被験者における兆候前診断のために使用されよう。出生前診断又は新生児診
断に対処することも可能である。

【００４８】更に、特異的変異の検出は、発展的な診断(evolutive diagnosis)、特に、病
変の強さ又はその出現の可能性ある期間に関する発展診断を可能とし得る。

【００４９】天然遺伝子と比較して遺伝子における変異の検出を可能とする方法は、勿論、
非常に多数ある。それらは、基本的に２つの大きなカテゴリーに分類され得る。
第１のタイプの方法は、変異の存在が、代替配列を、対応する正常な配列と比較
することによって検出されるものであり、第２のタイプは、変異が存在すること
によるミスマッチという証拠によって、間接的に検出されるというものである。

【００５０】アレル変異性、ヘテロ接合性の喪失、又は遺伝子異常（例えば変異）を決定す
る方法のうち、本発明のヌクレオチド配列の１対のプライマーを用いて、異常を
示しそうである、本発明の標的配列の、いわゆるＰＣＲ（ポリメラーゼ・チェー
ン・リアクション）又はＰＣＲ様増幅の少なくとも１ステージを含む方法が好適
である。標的産物の検出又はアッセイを行う前に、適当な制限酵素を用いて、増
幅産物を処理してもよい。

【００５１】ＰＣＲ様とは、核酸配列の直接的若しくは間接的再生を用いる全ての方法、又
は代替的に標識化システムが増幅された全ての方法を意味するように理解されよ
う。これらの方法は勿論、公知であり、一般的に、ポリメラーゼによるＤＮＡの
増幅を含む；もとの試料がＲＮＡのとき、前もって逆転写を行うことが勧められ
る。現在、この増幅を可能とする多数の方法、例えば、いわゆるＮＡＳＢＡ“核
酸配列に基礎をおいた増幅(Nucleic Acid Sequence Based Amplification)”、
ＴＡＳ“転写に基礎をおいた増幅システム(Transcription based Amplification
System)”、ＬＣＲ“リガーゼ・チェーン・リアクション”、“エンド・ラン・
増幅”（ＥＲＡ）、“サイクリング・プローブ・リアクション”（ＣＰＲ）、及
びＳＤＡ“ストランド・置換増幅(Strand Displacement Amplification”が存在
し、方法は当業者周知である。

【００５２】ＥＩＦ２ＡＫ３遺伝子の変異は、それらの産物の種々の修飾の原因でありうる
。修飾は、診断アプローチのために使用できる。実際、抗原性の修飾は、特異的
抗体の開発を可能としうる。異なる産物間の識別は、これらの方法によって達成
できる。例えば、ＲＩＡ若しくはＥＬＩＳＡを用いて、ＥＩＦ２ＡＫ３ポリペプ
チド変異体を特異的に認識できるモノ−若しくはポリクローナル抗体の使用に基
づく幾つかの周知の方法による診断アプローチで、これらの全ての修飾は用いる
ことができる。

【００５３】このように、本発明は、糖尿病及び／又はＷＲＳ関連病変、又は配列番号２の
配列を有するポリペプチドの異常発現と関連した病変の診断方法であって、本発
明の１つ以上の抗体を、試験する生物材料とを、該ポリペプチドと抗体の特異的
免疫複合体の可能性ある形成を可能とする条件下で接触させ、形成される可能性
のある免疫複合体を検出することを特徴とする方法に関する。

【００５４】本発明は更に、被験者が、糖尿病及び／又はＷＲＳ関連病変を有する危険性の
減少若しくは増大にあるかどうかの決定方法であって、ａ）被験者からゲノムＤＮＡ又はＲＮＡを含む生体試料を集めること；ｂ）タンパク質ＥＩＦ２ＡＫ３をコードする少なくとも１つの遺伝子アレル又は
ＲＮＡで、糖尿病及び／又はＷＲＳ関連病変を有する危険性の減少又は増大に関
連した多型を含む可能性のあるＤＮＡ又はＲＮＡのフラグメントの配列、又はそ
の長さを決定すること（ここで、フラグメントは、本発明の１セットのプライマ
ーを用いるポリメラーゼ・チェーン・リアクションで増幅できる）：ｃ）ＤＮＡ又はＲＮＡのフラグメントの配列が、糖尿病及び／又はＷＲＳ関連病
変を有する危険性の減少又は増大に関連した多型を含むかどうかを観察すること
によって、被験者が、糖尿病及び／又はＷＲＳ関連病変を有する危険性の減少又
は増大にあるかどうかを観察すること（ここで、該多型の存在は、被験者が糖尿
病及び／又はＷＲＳ関連病変を有する危険性の減少又は増大にあることを示す）
；のステップを含む方法に関する。

【００５５】好適な実施態様において、本発明の方法は、被験者が、糖尿病及び／又はＷＲ
Ｓ関連病変を有する危険性の増大にあるかどうかの決定方法に関する。

【００５６】本発明は更に、そのファミリーの１員がＷＲＳに罹患している被験者がＷＲＳ
を有する危険性があるかどうかを決定する為のインビトロ方法（好ましくは、出
生前又は新生児において）であって、ａ）被験者からゲノムＤＮＡ又はＲＮＡを含む生体試料を集めること；ｂ）ＥＩＦ２ＡＫ３遺伝子の両方のアレルの配列で、ＷＲＳを有する危険性に関
連した多型を含む可能性のあるＤＮＡ又はＲＮＡのフラグメントの配列、又はそ
の長さを決定すること（ここで、フラグメントは、本発明の１セットのプライマ
ーを用いるポリメラーゼ・チェーン・リアクションで増幅できる）；ｃ）両方のアレルで、ＤＮＡ又はＲＮＡのフラグメントの配列がＷＲＳを有する
危険性に関連した変異を持っているかどうかを観察することによって、被験者が
ＷＲＳを有する危険性があるかどうかを観察すること（ここで、該多型の存在は
、被験者がＷＲＳを有する危険性があることを示す）；のステップを含む方法に関する。

【００５７】本発明は更に、ＷＲＳを有する危険性の診断（好ましくは、出生前又は新生児
において）のための本発明に従うインビトロ方法であって、ステップｂ）でＷＲＳを有する危険性に関連した多型が、配列番号１の配列中、
位置１１０３でのＴの挿入又は位置１８３２でのＧからＡへのトランジッション
に対応する変異の存在であること（ここで、被験者のＥＩＦ２ＡＫ３遺伝子アレ
ルの各々での変異の存在は、被験者がＷＲＳを有する危険性があることを示す）
を特徴とする方法に関する。

【００５８】本発明は更に、そのファミリーの１員がＷＲＳに罹患している被験者がＷＲＳ
を有する危険性があるかどうかを決定する為のインビトロ方法（好ましくは、出
生前又は新生児において）であって、ａ）ＷＲＳに罹患しているファミリーの１員及び被験者からゲノムＤＮＡ又はＲ
ＮＡを含む生体試料を集めること；ｂ）ＷＲＳに罹患しているファミリーの１員及び被験者が、ＥＩＦ２ＡＫ３遺伝
子の近く、又はその中に位置する多型マーカー（マイクロサテライトマーカー又
は単一ヌクレオチド多型（ＳＮＰ））を比較することによってアレル同一性を示
すかどうかを決定すること（ここで、ＷＲＳに罹患しているファミリーの１員及
び被験者の間の遺伝子型同一性は、被験者がＷＲＳを有する危険性があることを
示す）；のステップを含む方法に関する。

【００５９】本発明は更に、そのファミリーの１員がＷＲＳに罹患している被験者がＷＲＳ
を有する危険性があるかどうかの決定のインビトロ方法（好ましくは、出生前又
は新生児において）であって、ａ）ＷＲＳに罹患しているファミリーの１員及び被験者からゲノムＤＮＡ又はＲ
ＮＡを含む生体試料を集めること；ｂ）ファミリーの１員の両方のＥＩＦ２ＡＫ３遺伝子アレル上で、ＷＲＳを有す
る危険性に関連する多型を含む可能性のあるＤＮＡ又はＲＮＡのフラグメントの
配列を決定すること（ここで、フラグメントは、本発明の１セットのプライマー
を用いるポリメラーゼ・チェーン・リアクションで増幅できる）；ｃ）ステップｂ）で同定したＷＲＳ罹患の原因であるフラグメントの配列の変異
が、被験者の両方のＥＩＦ２ＡＫ３遺伝子アレルの同一のフラグメントに存在す
るかどうかを決定すること（ここで、フラグメントは、本発明の１セットのプラ
イマーを用いるポリメラーゼ・チェーン・リアクションで増幅できる）；ｄ）被験者の両方のＥＩＦ２ＡＫ３遺伝子アレル上のフラグメントの配列が、ス
テップｂ）で同定されたのと同一の変異を含むかどうかを観察すること（ここで
、両方のアレル上での変異の存在は、被験者がＷＲＳを有する危険性があること
を示す）；のステップを含む方法に関する。

【００６０】本発明は更に、ポリメラーゼ・チェーン・リアクション後、最終的に、逆転写
のステップの後に得られた増幅産物のサイズの決定及び／又は配列決定によって
、多型を含む可能性のあるＤＮＡ又はＲＮＡのフラグメントの配列又はその長さ
がステップｂ）で得られる、本発明の方法に関する。

【００６１】本発明は更に、糖尿病及び／又はＷＲＳ関連病変を有する危険性の減少又は増
大に関連した少なくとも１つの付加マーカーのレベルについて、被験者からの生
体試料をアッセイする第２の方法を更に含むこと（ここで、少なくとも１つのマ
ーカーの有意なレベルの存在は、被験者が、糖尿病及び／又はＷＲＳ関連病変を
有する危険性の減少又は増大にあるかどうかを確認することを可能とする）を特
徴とする本発明の方法に関する。

【００６２】好適な実施態様において、関連する該付加マーカーは、糖尿病及び／又はＷＲ
Ｓ関連病変を有する危険性の増大と関連した付加マーカーである。

【００６３】別の目的で、本発明は、被験者がＷＲＳを有する危険性があるかどうかをイン
ビトロで決定する（好ましくは、出生前又は新生児において）為のキットであっ
て、ＥＩＦ２ＡＫ３遺伝子の近く、又はその中に位置する多型マーカー（マイクロサ
テライトマーカー又は単一ヌクレオチド多型（ＳＮＰ））を含むゲノムＤＮＡの
フラグメントを増幅できる少なくとも１対のプライマー、及び／又は該多型マー
カーを検出できる少なくとも１つのプローブを含む（ここで、好ましくは、少な
くとも１対のプライマー又は少なくとも１つのプローブは、本発明のプライマー
及びプローブから選択される）キットを含む。

【００６４】本発明は更に、被験者がＷＲＳを有する危険性があるかどうかをインビトロで
決定する（好ましくは、出生前又は新生児において）為のキットであって、配列番号１の配列中の位置１１０３でＴの挿入又は位置１８３２でＧからＡへの
トランジッションを含む可能性のあるＥＩＦ２ＡＫ３ゲノムＤＮＡのフラグメン
トを増幅できる少なくとも１対のプライマーを含む（ここで、該プライマーは、
本発明のプライマーから選択される）キットに関する。

【００６５】本発明は更に、被験者が、糖尿病及び／又はＷＲＳ関連病変を有する危険性の
減少又は増大にあるかどうかを決定する為のキットであって、タンパク質ＥＩＦ２ＡＫ３をコードし、糖尿病及び／又はＷＲＳ関連病変を有す
る危険性の減少又は増大と関連した多型を含む可能性のあるゲノムＤＮＡ又はＲ
ＮＡのフラグメントを増幅できる少なくとも１対のプライマーを含む（ここで、
該プライマーは、本発明のプライマーから選択される）キットに関する。

【００６６】好ましくは、該関連多型は、糖尿病及び／又はＷＲＳ関連病変を有する危険性
の減少又は増大と関連した多型である。

【００６７】本発明は更に、糖尿病及び／又はＷＲＳ関連病変を有する危険性の減少又は増
大と関連した少なくとも１つの付加マーカーのレベルについて、被験者からの生
体試料をアッセイする手段を更に含む（ここで、関連する付加マーカーは、糖尿
病及び／又はＷＲＳ関連病変を有する危険性の増大と関連する付加マーカーであ
る）ことを特徴とする本発明のキットに関する。

【００６８】好適な実施態様で、本発明の、被験者が、糖尿病及び／又はＷＲＳ関連病変を
有する危険性の減少又は増大にあるかどうかを決定する為の、上記方法又はキッ
トは、糖尿病及び／又はＷＲＳ関連病変が、１型糖尿病、２型糖尿病、それ以外
の型の糖尿病、骨粗鬆症、関節炎、肝不全、ネフロパシー及び他の腎不全並びに
精神遅滞からなる群から選択されることを特徴とする。

【００６９】より好適な実施態様で、本発明の方法又はキットは、糖尿病及び／又はＷＲＳ
関連病変が、１型糖尿病、２型糖尿病、及びそれ以外の型の糖尿病からなる群か
ら選択されることを特徴とする。

【００７０】特により好適な実施態様では、本発明の方法又はキットは、該糖尿病及び／又
はＷＲＳ関連病変が、１型糖尿病であることを特徴とする。

【００７１】本発明はまた、ＥＩＦ２ＡＫ３タンパク質の発現と活性を研究する為の、並び
にＥＩＦ２ＡＫ３遺伝子若しくはそれらの発現産物と、ＥＩＦ２ＡＫ３遺伝子若
しくはそれらの発現産物の活性に関与しうる化学的若しくは生化学的化合物との
直接的又は間接的相互作用を研究する為の、本発明の細胞、哺乳動物又はポリペ
プチドの使用に関する。

【００７２】本発明はまた、ＥＩＦ２ＡＫ３タンパク質と直接的又は間接的に相互作用でき
、及び／又はＥＩＦ２ＡＫ３タンパク質の発現又は活性を調節できる化学的若し
くは生化学的化合物のスクリーニングのための、本発明の細胞、哺乳動物又はポ
リペプチドの使用に関する。

【００７３】ＥＩＦ２ＡＫ３タンパク質と直接的又は間接的に相互作用でき、及び／又はＥ
ＩＦ２ＡＫ３タンパク質の発現又は活性を調節することを可能とすることができ
る化学的又は生化学的化合物の選択方法であって、本発明の細胞、哺乳動物又は
ポリペプチドを使用することを特徴とする方法も本発明に含まれる。

【００７４】ＥＩＦ２ＡＫ３タンパク質と直接的又は間接的に相互作用でき、及び／又はＥ
ＩＦ２ＡＫ３タンパク質の発現又は活性を調節することを可能とすることができ
ることを特徴とする化学的又は生化学的化合物も、本発明の一部を形成する。本発明の方法によって選択されることを特徴とする化合物も、本発明の一部を
形成する。

【００７５】好適な実施態様では、本発明は、 −ＥＩＦ２ＡＫ３タンパク質発現のレベルの調節；及び／又は −膵臓β−細胞又はその完全性の増大；及び／又は −糖尿病及び／又はＷＲＳ関連病変の予防又は治療；を可能とすることを特徴とする本発明の化合物を含む。

【００７６】好適な実施態様では、本発明は、本発明の抗体、ポリペプチド、ベクター、又
はセンス若しくはアンチ−センス核酸配列から選択されることを特徴とする本発
明の化合物を含む。

【００７７】本発明は更に、特に、糖尿病及び／又はＷＲＳ関連病変の予防及び／又は治療
のための医薬としての本発明の化合物に関する。

【００７８】好適な実施態様では、本発明は更に、糖尿病及び／又はＷＲＳ関連病変の予防
及び／又は治療のための医薬としての本発明の化合物であって、糖尿病及び／又
はＷＲＳ関連病変が、１型糖尿病、２型糖尿病、それ以外の型の糖尿病、骨粗鬆
症、関節炎、肝不全、ネフロパシー及び他の腎不全並びに精神遅滞からなる群か
ら選択されることを特徴とする化合物に関する。より好適な実施態様では、本発明の化合物は、糖尿病及び／又はＷＲＳ関連病
変が、１型糖尿病、２型糖尿病、及びそれ以外の型の糖尿病からなる群から選択
されることを特徴とする。特により好適な実施態様では、本発明の化合物は、糖尿病及び／又はＷＲＳ関
連病変が、１型糖尿病であることを特徴とする。

【００７９】実施例１：方法臨床診断及びファミリー２つのファミリーを研究した。ＷＲＳ１はチュニジア人起源であり、以前³⁹に
報告されている。一方、ＷＲＳ２はパキスタン人起源であった。全ての患者で糖
尿病を初期発症した（寿命の２ヶ月〜６ヶ月）、一方、骨端異形成症及び／又は
成長遅延は、ＷＲＳ１の２人の生存患者とＷＲＳ２のより年長の患者で、寿命の
最初の２年で診断されたが、早期に死亡したため（ＷＲＳ１で、齢５ヶ月）ある
いは患者が幼い（ＷＲＳ２の最後の子供、齢６ヶ月）ため、他の罹患患者では診
断されなかった。全ての生体試料収集と検査は、家族からのインフォームド・コ
ンセントを伴ってなされた。ファミリーの全てのメンバー（ファミリーＷＲＳ１
の最初の子供は除いて）について、ＤＮＡ抽出のために静脈血をＥＤＴＡ上に収
集した（ＤＮＡサンプルは、オートプシー肝臓サンプルから抽出した）。ＷＲＳ
１ファミリーの親と１人の子供の新鮮血液サンプルもまた、ＲＮＡ抽出のために
ＥＤＴＡ上に収集した。

【００８０】遺伝子型キャラクタリゼーション記載されたように（Dib, C. ら, Nature, 380,152-154,1996）ＡＢＩ３７７シ
ークエンサーで蛍光標識プライマーを用いて、マイクロサテライト多型の遺伝子
型キャラクタリゼーションを行った。

【００８１】連鎖解析ＬＩＮＫＡＧＥパッケージからのプログラムＬＯＤＳＣＯＲＥ（Lathrop, G.
M., ら, Proc. Natl. Acad. Sci., U. S. A, 81, 3443-6,1984）を用いて、２点
連鎖解析を行い、ＬＩＮＫＭＡＰプログラムを用いて、多点解析を行った。我々
は、疾患遺伝子頻度０．００００１の、十分に浸透度のある(penetrant)劣性疾
患であると仮定した。ＣＥＰＨ親からアレル頻度（ftp ://ftp.genethon.fr/pub
/Gmap/Nature-1995/alleles/）又は公共データベースで利用できる情報から演繹
されるアレル頻度が、解析のために推定された。ゲノムスクリーニングのために
、本発明者らは、ＧＤＢウェブサイト（http://www.gdb.org）上で利用できるMa
rshfieldマップ上で見積もられるKosambi ｃＭでの遺伝子距離を推定した。ＷＲ
Ｓ遺伝子の微細マッピングにおいて、マーカー順序は公共データベースから得、
組換え事象がＷＲＳファミリーで観察された。十分に情報が与えられるマーカー
遺伝子座を有する連鎖の最大限の証拠を得る確立の計算は、プログラムＳＬＩＮ
Ｋでなされた。

【００８２】ＥＩＦ２ＡＫ３遺伝子のゲノム構造ＥＩＦ２ＡＫ３に対応する完全長ヒトｃＤＮＡは以前にクローニングされた（
Genbank: AF110146） (Shi, Y., ら, J. Biol. Chem. 274,5723-30,1999)。遺伝
子の３’ＵＴＲに位置するプライマー（STS3'F : GGGGCATAACCTAATTTGAGC 及びS
TS3'R: GGGGACTTTCCTTCTTCTGC）を用いてCaltech ＢＡＣライブラリーをスクリ
ーニングすることによって、ＥＩＦ２ＡＫ３(CIT978SK-121D7)の３’末端をカバ
ーするＢＡＣクローンを同定した。ＥＩＦ２ＡＫ３ｃＤＮＡを用いるブラスト
検索によって、配列決定されたＢＡＣ末端(Genbank: AQ543111)を用いて、該遺
伝子の５’領域をカバーするオーバーラップするＢＡＣであるＲＣＰＩ−１１−
３４９Ｃ１６を同定した。インター−エキソン(inter-exons)ＰＣＲによって得
られた長いＰＣＲフラグメントを配列決定し、レファレンスｃＤＮＡ配列（ＡＦ
１１０１４６）と比較することによって、並びにエキソンプライマーを用いて、
ＢＡＣクローンＤＮＡ上での相補的直接配列決定によって、遺伝子のイントロン
／エキソン構造（表１）を確立した。

【００８３】

【表１】

【００８４】表１の説明：レファレンスとして用いたｃＤＮＡ：Genbank AF110146。イントロ
ン配列は、小文字活字であり、エキソン配列は、大文字活字である。ＡＧ及びＧ
Ｔスプライスコンセンサス配列には、下線を引いてある。

【００８５】変異／多型スクリーニング及びハプロタイプ推定ＲＴ−ＰＣＲ増幅産物でのｃＤＮＡのコード領域の直接的配列決定によって、
対照として正常コーカソイド人を用いて、ＷＲＳ１インデックス患者と彼の２人
の親について、並びに、ＰＣＲ増幅ゲノムＤＮＡでの遺伝子のコード領域の配列
決定により、対照として正常コーカソイド人を用いて、ＷＲＳ２インデックス患
者と彼の父親について、変異スクリーニングを行った。ＷＲＳを有するＷＲＳ１
ファミリーで同定された変異の共分離(cosegregation)を、プライマーPEK1 : CT
GACTGGAAAGTTATGG 及び PEK2: AAAAGACTGATGGGAATGACを用い、次にＡｆｌＩＩに
よる制限酵素消化を行うＰＣＲ−ＲＦＬＰ法によって、ゲノムＤＮＡで確認した
。消化後、正常アレルは、３０２及び３５ｂｐフラグメントを与え（制限酵素部
位の存在）、一方、変異アレルは、３３７ｂｐフラグメントを与える（部位無し
）。それらは、アガロースゲル電気泳動によって分離された。９５人の無関係の
健康なコーカソイド人でＰＣＲ増幅したゲノムＤＮＡ上で遺伝子の全エキソンを
配列決定することによって、多型のスクリーニングを行った。ＱＩＡｍｐＲＮ
Ａ血液ミニ−キット（Qiagen）を用いて、新鮮血液でのＲＮＡ抽出を行い、Ｐｒ
ｏＳＴＡＲシングル−チューブＲＴ−ＰＣＲシステム(Stratagene)を用いて、Ｒ
Ｔ−ＰＣＲを行った。ビッグ−ダイ・ターミネーターケミストリー(Rosenblum,
B. B., ら, Nucleic Acids Research, 25,4500-4 1997; Heiner, C. R., ら, Ge
nome Research, 8,557-61, 1998)を用い、配列決定プライマーとして鋳型プライ
マーの１つを用い、ＡＢＩ３７００シークエンサーで配列決定反応を行った。

【００８６】９５人の無関係なコーカソイド人対照での遺伝子型データからアレル頻度＞０
．０５で、８つの多型部位について、ハプロタイプ頻度を推定した。考慮する必
要のあるハプロタイプ組合せの数を減らすために、これは、ステップ−ワイズ法
によってなされた。第１ステップで、２つの部位を任意に選び、Hardy-Weinberg
平衡を仮定して、ハプロタイプ頻度の最大公算推定値を得た。連鎖不平衡の仮定
の下に計算された最初の頻度から出発するＥＭアルゴリズムを用い、推定値を見
出した。次いで、別の部位を任意に選択し、最初の２つの部位についての先のハ
プロタイプ頻度推定値に基づく最初の値、並びに新規部位での連鎖平衡の仮定か
ら出発して、３つの部位全てについて対応するハプロタイプ頻度を同じように推
定した。全ての部位が推定値に含まれるまで、この方法を続けた。このように、
１ステップで０の頻度推定値をハプロタイプを持つときはいつでも、アレルの同
一の組合せを含む全てのハプロタイプは、後のステージで０頻度を有した。

【００８７】Genbankアクセッション番号ヒト EIF2AK3 cDNA配列: AF110146 ; EIF2AK3タンパク質配列: AAD19961 (ヒト)
, AAD03337 (マウス), AAC83801 (ラット)。GCN2及び関連キナーゼタンパク質配
列: P15442 (酵母), CAB58363 (マウス), CAA92117 (C. elegans), AAC13490 (D
. melanogaster), CAB60699 及びCAB11253 (S. pombe) ; HRIタンパク質配列: A
AF18391 (ヒト), Q9Z2R9 (マウス), Q63185 (ラット), P33279 (ウサギ); WEE1
タンパク質配列: AAB60401 (ヒト), (P47810)マウス, (BAA06624)ラット, (AAD5
2983) Z. mais, (AAF02869) A. thaliana, (AAC46913) D. melanogaster, (P478
17) X. laevis ; PKRタンパク質配列: AAC50768 (ヒト), Q03963 (マウス), AAA
61926 (ラット);本研究で産生された EIF2AK3 ゲノムDNA 配列: 割り当てられた
Genbank 番号。

【００８８】実施例２：ＷＲＳファミリーでのゲノムスクリーニング最初に、４人の子供を有するチュニジア人系統の血縁家族（ＷＲＳ１）を研究
した。子供のうち３人がＷＲＳを罹患しており、１人は健康であった。親はいと
こ同士であり、両方とも罹患していなかった。いったんその家系に入り、そして
祖父母の１人から両方の親によって遺伝したまれな劣性変異を仮定するモデルの
下で、家系による同一性(identical-by-descent)についての完全な情報によって
、最大ロッドスコア２．５３を得ることができたと計算された。家系による同一
性についての完全な情報を与えるマーカーによって、遺伝形質に関係していない
領域内で偶然に最大ロッドスコアを観察する頻度は、約０．６％（即ち、それは
、公称ｐ−値０．００６を有することである）であろうことをシミュレーション
研究が示した。下記のように、１つのそのような可能性ある連鎖領域が、ゲノム
−ワイドな連鎖研究で、ＷＲＳ１ファミリーについて同定された。次いで、この
領域への連鎖が、本研究中に集めた第２のファミリーで確認された。

【００８９】 Genethonスクリーニングセット(http://www.genethon.fr)から２８９のマイク
ロサテライトマーカーで、ゲノム−ワイド連鎖を行った。マーカー１８は染色体
１５にあり（平均間隔：６．３ｃＭ）、残りは、他の常染色体にわたって分布し
た（平均間隔：１３．１ｃＭ）。最初のスクリーンでは情報が不十分であったマ
ーカーへの補足として、後のステージで２４の付加的なマイクロサテライトを加
えた。これらは、両方の親でホモ接合性であるか、又は１人の親からの減数分裂
でＷＲＳへ完全に連鎖するという証拠をもったその親でヘテロ接合性であるマー
カーであった。該遺伝形質は、完全な浸透度を持ち、表現型を持たないまれな劣
性変異によるとの仮定の下に、連鎖解析を行った。マーカーアレル頻度は、ＣＥ
ＰＨファミリーから推定した。４つのマーカーは十分な情報を与え、該遺伝形質への完全な連鎖と一致するト
ランスミッションのパターンを有していた（表２参照）。

【００９０】

【表２】

【００９１】表２の説明：３つの染色体領域（染色体２の２つの領域及び染色体９の１つの領
域）についての結果を示す（その最初のデータで、ＷＲＳとの完全な連鎖と合致
した）。太字で示したマーカーは、連鎖に関し十分な情報を与え、ＷＲＳとの組
換えが無いという仮説と一致した。ｄ：次のマーカーまでの距離（ｃＭ）。θ：
ＷＲＳ遺伝子座との推定組換えフラクション。

【００９２】マーカーの２つは、染色体２の単一領域で隣接していた（１２ｃＭ距離）；別
のマーカーも染色体２にあったが、距離にして６３ｃＭ最初の２つとは隔てられ
ている；第４のマーカーは染色体９にあった。染色体２の隣接している２つのマ
ーカー、Ｄ２Ｓ１１３とＤ２Ｓ１６０、はその遺伝形質と完全に連関し、θ＝０
でそれぞれロッドスコア２．４８と１．８５を与えた。これら２つに近い別のマ
ーカー、Ｄ２Ｓ２８６はある程度は情報を与え、θ＝０でロッドスコア０．８８
４を与えた。この領域からの３つのマーカーの多遺伝子座ロッドスコアは、家系
から可能な最大であった（２．５３）。

【００９３】染色体２の第２領域で、マーカーＤ２Ｓ３６４はθ＝０でロッドスコア１．１
９を与えた。染色体９で、Ｄ９Ｓ１６８は、θ＝０でロッドスコア１．９２での
連鎖と一致するパターンを示した。このマーカーは、Ｄ９Ｓ２６９（１人(osne)
の親からの減数分裂の為に情報を与え、θ＝０でロッドスコア１．１７を与えた
）からの連鎖情報を補足するために最初のゲノム−ワイドセットに加えられた。
これら３つの領域からの他のマーカーが、これらの領域で可能なハプロタイプ同
一性に関するより完全な情報を与えるために、このファミリーでの遺伝子型判定
のために選択された。この目的で、Ｄ２Ｓ３８０とＤ２Ｓ１１２の間に４０の更
なるマーカー（領域１）、Ｄ２Ｓ３８２とＤ２Ｓ１１６の間に１０の更なるマー
カー（領域２）、及びＤ９Ｓ２８８とＤ９Ｓ１８４６の間に３つの更なるマーカ
ー（領域３）がキャラクタライズされた。遺伝子型の調査と更なる統計的解析は
、領域１での連鎖を確認する為の証拠を提供し、罹患した子供に遺伝したハプロ
タイプは、ＣＤ８ＡとＤ２Ｓ３６３の間の１７ｃＭ間隔での同一のマイクロサテ
ライトアレルを担持している（図１Ａ）。他の領域は、興味がありそうではない
としてこの段階で拒絶された。ＷＲＳ患者に遺伝した親のハプロタイプは、全体
にわたって同一ではなかった（図１Ｂ及び１Ｃ）。

【００９４】実施例３：ＷＲＳ遺伝子の微細マッピング連鎖研究の過程で、異なる種族的出身の第２のＷＲＳファミリー（ＷＲＳ２）
が得られた。このファミリーは、２人の罹患した子供と両親から構成されていた
。両親は非罹患でいとこ同士であった。染色体２の領域１からのマイクロサテラ
イトマーカー（Ｄ２Ｓ３８０−Ｄ２Ｓ１１２）の選択は、このファミリーに特徴
的であった。ファミリーパネルを併せての２点連鎖解析は、θ＝０で３．４１ま
でのロッドスコアを与え、多遺伝子座連鎖解析は、ＷＲＳへの連鎖を裏付けるマ
ーカーＤ２Ｓ１７８６／Ｄ２Ｓ２１８１／ＤＳ２Ｓ２２１６／Ｄ２Ｓ２２２２の
位置で最大ロッドスコア４．３３に到達した。

【００９５】次に、ＷＲＳの原因遺伝子が存在するはずであるより小さな領域を決定するた
めに、２つのファミリーの罹患した子供からの、連鎖領域で家系による同一性の
可能性のあるセグメント間でのオーバーラップを試験した。上記の４つの密接に
リンクしたマイクロサテライトマーカー（〜１ｃＭ以内）を含むＣＤ８ＡとＤ２
Ｓ２１５４の間の約２−３ｃＭのセグメントから、オーバーラップはなっていた
。これらは、罹患した子供全てでホモ接合性であり、両方のファミリーでＷＲＳ
との完全な連鎖を示した（図１Ａ）。該遺伝子を含む決定的な領域は、２つの組
換え事象によって規定される。１つは、個々のＷＲＳ１−３での絶対組換え(obl
igate recombination)（ＣＤ８ＡとＤ２Ｓ１７８６の間の遠位境界を規定する）
であり、他方は、ファミリーＷＲＳ２で曾祖父母から両親に到る減数分裂の１つ
で起こったと推定される組換え（Ｄ２Ｓ２２２２とＤ２Ｓ２１５４の間の近位境
界を規定する）である。

【００９６】実施例４：連鎖の領域内での候補遺伝子の変異スクリーニング：真核細胞の翻訳
開始因子２アルファキナーゼ３（ＥＩＦ２ＡＫ３）公共データベースの情報から、決定的領域の部分的物理マップを構築した。領
域内にマッピングされる可能性のある幾つかの発現配列タグ（ＥＳＴ）のうち、
ホワイトヘッドＹＡＣコンティグＷＣ２．７にマップされた１つ（Ｄ２Ｓ１９９
４／ＷＩ−６８６３）は、我々の興味を引いた。このＥＳＴは最近、遺伝子ＥＩ
Ｆ２ＡＫ３（Shi, Y.ら, 1999）、セリン／スレオニンキナーゼ、並びに膵島及
び胎盤での高レベル発現の故にＷＲＳの主要候補遺伝子、として同定された。こ
の領域へのこの遺伝子の独立したマッピングも最近、Hayesら（Hayes, S. E.,
ら, Cytogenet Cell Genet, 86,327-328,1999）による放射線ハイブリッドマッ
ピングとin situハイブリダイゼーションによって得られた。ファミリーＷＲＳ
１とファミリーＷＲＳ２に由来するインデックス患者での変異について、ＥＩＦ
２ＡＫ３をスクリーニングした。

【００９７】ＥＩＦ２ＡＫ３は低レベルで普遍的に発現しているので(Shi, Y.ら, 1999)、
新鮮全血からの全ＲＮＡから調製したＲＴ−ＰＣＲ産物の直接配列決定によって
、ファミリーＷＲＳ１からのインデックス患者で、遺伝子のコード領域を精査し
た。新鮮な血液サンプルは、ＷＲＳ２ファミリーでは入手できなかったので、変
異スクリーニングのためのこの遺伝子のゲノム構成も確立した（方法参照）。明
確にされたエキソン−イントロン構造は、刊行されているコンセンサススプライ
ス配列に十分に一致した(Breathnach, R., ら, Annu. Rev. Biochem., 50,349-3
83, 1981)。ｃＤＮＡで直接（ファミリーＷＲＳ１）、又は表３Ａと３Ｂに示す
プライマーを用い、ゲノムＤＮＡからエキソンを増幅することによって（ファミ
リーＷＲＳ２）、ＷＲＳ１ファミリーとＷＲＳ２ファミリーの変異スクリーニン
グを、遺伝子のコード領域で行った。

【００９８】表３Ａ及び３ＢＥＩＦ２ＡＫ３の変異及び多型スクリーニングのために使用したプライマーの配列

【００９９】

【表３】

【０１００】表３Ｂの説明：星印（^*）で印をつけたプライマー対は非コード配列をカバーし
、対照での多型のスクリーニングのためにのみ使用した。

【０１０１】２つの異なる変異が、２つのファミリーで、ＷＲＳ患者ではホモ接合性で、彼
らの両親及びファミリーＷＲＳ１の健康な兄弟ではヘテロ接合性で同定された（
図２）。ファミリーのメンバー全てからのゲノムＤＮＡの関連領域の直接配列決
定によって（両方の変異）、並びにＷＲＳ１の変異の存在／非存在を評価するた
めに設計されたＰＣＲ−ＲＦＬＰによって、変異と疾患アレルの共分離が確認さ
れた（方法参照）。更に、ＥＩＦ２ＡＫ３のイントロン１５で同定されたマイク
ロサテライト多型（表４Ａ）は、ＷＲＳ１では十分に情報を与えるものであり、
ＷＲＳ２ではある程度は情報を与えるものであり、両方のファミリーで疾患アレ
ルと共分離した（示さず）。直接配列決定（両方の変異）及びＰＣＲ−ＲＦＬＰ
アッセイ(essay)（ＷＲＳ１ファミリーでの変異）によって示されるように、１
９０人のコーカソイド人、９５人の日本人及び９５人のアフリカ黒人には両方の
変異ともなかった。タンパク質レベルでの２つの変異の影響の記載は図３に示す
。ＷＲＳ１変異は、位置１１０３でのＴの挿入（１１０３insＴ）であり、それ
は、位置３４５でのフレームシフト及び同位置でタンパク質の未熟終結をつくる
（ins345fs/ter345）。即ち、ＷＲＳ１変異は、制御ドメイン（アミノ酸１−５
７６）の一部及び触媒ドメイン（アミノ酸５７７−１１１５）の全てを欠く、端
を切られたタンパク質を産生する。このことから、該タンパク質の機能の完全な
喪失が生じ得る。

【０１０２】表４Ａ、４Ｂ及び５：ＥＩＦ２ＡＫ３エキソン及び隣接イントロン領域で同定された多型、並びに推定されたハプロタイプ組合せ及び頻度

【０１０３】

【表４】

【０１０４】表４Ａの説明：レファレンスｃＤＮＡ(Genbank AF110146)に対し、遺伝子のイン
トロン／エキソン構造の確立の間に産生されたゲノム配列に対し、アミノ酸変化
の記載を伴って、多型を位置づける。頻度は、９５人の関係のない健康なコーカ
ソイド人の集団をスクリーニングすることによって推定した。

【０１０５】

【表５】

【０１０６】表４Ｂの説明：《７》はエキソン多型で７−リピートアレルに対応し、《８》は
エキソン多型で８−リピートアレルに対応する。《Ｉ》及び《Ｄ》は、最後のイ
ントロン１５多型で、それぞれＡＴ挿入アレル及びＡＴ欠失アレルに対応する。

【０１０７】

【表６】

【０１０８】ＷＲＳ２変異は１８３２ＧからＡへのトランジッションであり、タンパク質の
触媒ドメイン内に位置する位置５８７でアルギニンの代わりにグルタミンが生じ
る（Ｒ５８７Ｑ）。この変異はタンパク質の公知の機能部位には位置しないが、
HanksとHunter(Hanks, S. K., ら, Faseb J., 9,576-96,1995)によって明確にさ
れたように、高度に保存されたキナーゼサブドメインＩの隣接境界にあり、異な
る生物からのｅＩＦ−２αキナーゼ間で完全に保存されている：マウス及びラッ
トからのEIF2AK3、 S. cerevisiaeからのGCN2、及び異なる生物（S. pombe, C.
elegans, D. melanogaster 及びマウスを含む）からのそのホモローグ、ヒト、
マウス、ラット及びウサギからのHRI (eIF-2a キナーゼヘムレギュレーテッドイ
ンヒビター)、ヒト、マウス及びラットからのPKR (プロテインキナーゼ, イン
ターフェロン誘導性二本鎖ＲＮＡ依存性)。更に、該領域はＷＥＥ１（触媒ドメ
インが、これらのｓｅｒ／ｔｈｒキナーゼ及び異なる生物からのそのホモローグ
と相同性を共有する別のキナーゼ）で高度に保存されている（図３）。興味深い
ことに、同様に保存された位置での単一アミノ酸変化［ラットＥＩＦ２ＡＫ３で
の位置６１４でリジンの代わりにアラニン（図３で示されるように、ヒトＥＩＦ
２ＡＫ３で位置６２１に対応する）］は、キナーゼ活性の完全な喪失を生じる(S
hi, Y.ら, 1999)。

【０１０９】実施例５：ＥＩＦ２ＡＫ３の多型スクリーニングインスリン依存性糖尿病を含む、ＷＲＳを特徴付ける複数の病理学的症状の為
に、９５人の正常コーカソイド人のパネルで、多型についてエキソンの全部をス
クリーニングすることを決定した。これらの変異及び可能なハプロタイプの知識
は、糖尿病又は成長異常を含む幾つかの疾患でこの遺伝子の関与を試験する為の
価値ある資源を構成するであろう。エキソン又は近傍隣接イントロン領域に位置
する合計８つの変異体が、０．０５超の稀少アレル頻度をもって同定された（表
４Ａ）。これらの変異体のうち５つが、タンパク質のコード領域にマップされ、
それらのうち４つがアミノ酸配列に影響を与える。このデータは、１１ハプロタ
イプで８つの変異体の配列と一致し、そのうち５つが、０．０５超の推定頻度を
有した（表４Ｂ）。更に、更なる稀少な変異体［キャラクタライズされた１９０
のうち１つ又は２つのアレルに起こった（表５）］が同定された。イントロン１
５で（ＣＡ）ｎタンデムリピートに基づくマイクロサテライトも同定され、多型
であることが確認され（示さず）、表４Ａに列挙されてもいる。この多型は、疾
患におけるＥＩＦ２ＡＫ３の役割を探索するファミリー研究のために興味深いで
あろう。

【０１１０】これらの結果は、ＥＩＦ２ＡＫ３遺伝子の変異が、異なる種族的出身の２つの
血縁家族でのＷＲＳおよびそれに関連する病変の原因であることを示している。これらの結果は、ＷＲＳでのＥＩＦ２ＡＫ３の役割、並びにインスリン依存性
糖尿病と症候群の他の特徴の病因との関与についての強い証拠を提供する。

【０１１１】これは、糖尿病、骨格形成異常、及びＷＲＳの他の兆候を説明できる分子機構
を理解する為のキーとなる知見である。ＥＩＦ２ＡＫ３は、タンパク質翻訳の調
節に役割を果たし（Shi, Y., ら, Mol. Cell. Biol., 18,7499-509 1998; Hardi
ng, H. P., ら, Nature, 398 (6722): 90,1999, Mar. 4, Nature 397,271-4 199
9)、膵島細胞で高度に発現されている(Shi, Y., ら, J. Biol. Chem. 274,5723-
30,1999)。我々の研究に基づき、ＥＩＦ２ＡＫ３は、膵臓β−細胞の完全性を維
持するのに重要な機能を有しているようである。

【０１１２】ＥＩＦ２ＡＫ３は、ｅＩＦ−２αキナーゼファミリー（ヘム−レギュレーテッ
ドインヒビターキナーゼ（ＨＲＩ）、二本鎖ＲＮＡ依存性プロテインキナーゼ（
ＰＫＲ）及び酵母ＧＣＮ２(Shi, Y.ら, 1998; Harding, H. P.ら, 1999)も含む
）の最近同定されたメンバーである。興味深いことに、これらの関連遺伝子の１
つ、ＰＫＲは、細胞増殖及びアポトーシスの制御に役割を果たすことが示され(S
rivastava, S. P., ら, J. Biol. Chem., 273,2416-23 1998)、ＥＩＦ２ＡＫ３
は、ＷＲＳ患者に特徴的な膵臓β−細胞非存在に関連しうる同様の機能を有する
可能性を提起する。更に、膵島細胞での高レベルの発現から、ＥＩＦ２ＡＫ３は
、グルコースに反応してインスリン発現（タンパク質合成のレベルで起こる急速
プロセス(Goodison, S., ら, Biochem. J., 285,563-8,1992; Gilligan, M., ら
, J. Biol. Chem., 271,212-15,1996)）の微細な制御に役割を果たす良き候補で
ある。

【０１１３】糖尿病と骨疾患の両方でのＥＩＦ２ＡＫ３の役割を説明するために、様々な証
拠及び仮説が提起された。軟骨細胞で発現される遺伝子の変異は、ＷＲＳ（軟骨
無形成症／骨端異形成症／軟骨形成不全症／低軟骨形成症／骨粗鬆症／関節炎）
で観察される骨疾患と同様な多くの骨疾患の原因であることが知られている。例
えば、これも膵島細胞で強く発現しているＦＧＦＲ３の機能獲得型(gain-of-fun
ction)変異(Hughes, S. E., J. Histochem. Cytochem., 45,1005-19,1997)は、
軟骨形成不全症と低軟骨形成症の原因である(Rousseau, F., ら, Nature, 371,2
52-4,1994; Rousseau, F., ら, J. Med. Genet. 33,749-52,1996)。ＦＧＦＲ３
の変異及びこれらの疾患に関与する他の遺伝子の優性効果とは対照的に、ＷＲＳ
表現型は劣性である。即ち、ＥＩＦ２ＡＫ３は、膵臓及び／又は軟骨細胞からの
特定のタンパク質に対する負の制御を発揮し、正常条件下でこれらの器官の十分
な発育と機能を保証するのかもしれず、一方、ＷＲＳ患者では、機能性ＥＩＦ２
ＡＫ３の喪失が、この（これらの）タンパク質の過剰発現に従い、異なる器官と
関連する観察される表現型を作り得る。この仮説は、タンパク質翻訳のレベルに
対するＥＩＦ２ＡＫ３のダウン−レギュレーション効果と一致する。ＥＩＦ２Ａ
Ｋ３は胎盤で発現するので、母性ＥＩＦ２ＡＫ３の発現のために、胚発育は正常
のままであり得、一方、これらの機構によって影響を受ける産後の成長と発育プ
ロセスは変わるだろう。この仮説を試すために、特に、このモデルで、その制御
がＥＩＦ２ＡＫ３によって直接的に影響を受け得るその標的タンパク質を同定す
るために、分子レベルでのＥＩＦ２ＡＫ３に関する更なる研究が必要である。

【０１１４】ＷＲＳにおける糖尿病は自己免疫病因を有するようには思われないけれども、
患者が永久にインスリン依存性糖尿病であるという事実は、該症候群にかかわる
生物学的プロセスが、他の遺伝子因子（特にＭＨＣ及びインスリン遺伝子におい
て）と共に、典型的自己免疫インスリン依存性糖尿病(diabetes mellitus)（Ｉ
ＤＤＭ）と関連しうることを示唆する。最近、新規遺伝子であるＷＦＳ１が、こ
れもまた膵臓β−細胞の喪失を特徴とする若年発症インスリン依存性糖尿病を含
む別のメンデリアン症候群（ウオルフラム症候群）の原因であることが示され、
このような遺伝子がＩＤＤＭに対する感受性を調節するのに重要でありうること
が考えられた(Inoue; H.ら, 1998)。フランスと米国からの多岐にわたるＩＤＤ
ＭファミリーでのマイクロサテライトマーカーとＥＩＦ２ＡＫ３変異体の予備的
な研究では、我々は、ＩＤＤＭ感受性への関係の有意な証拠を検出できなかった
（データは示さず）。しかし、このことは、調べたファミリーのサンプルのサイ
ズが限られていたこと、遺伝子の幾つかのリスク変異体の存在（そのうちの一部
は稀少でありうる）、又は我々の研究でカバーされなかった調節領域又はイント
ロン領域にそれらが位置していることによるものでありうる。この特定の領域へ
の連鎖の証拠は、ＩＤＤＭ (Hashimoto, L., ら, Nature, 371,161-164, 1994;
Davies, J. L., ら, Nature, 371,130-136,1994; Mein, C. A., ら, Nature Gen
et, 19,297-300,1998; Concannon, P., ら, Nature Genet, 19,292-296,1998)及
びインスリン非依存性糖尿病(Hanis, C. L., ら, Nature Genet, 13,161-6,1996
; Pratley, R. E., ら, J. Clin. Invest., 101,1757-64,1998)の他の研究では
報告されなかった。本明細書で記載した多型は、異なる源からの患者及びファミ
リーにおけるＥＩＦ２ＡＫ３の直接的試験によって、通常の型の糖尿病とのその
かかわりの問題を確認することを可能とするだろう。

【０１１５】自己免疫疾患遺伝子座のクラスタリングの証拠は、現在までヒトにおいてこの
領域で報告されていないけれども(Becker, K. G., ら, Proc. Natl. Acad. Sci.
U. S. A., 95,9979-84,1998)、マウス及びラットにおいて、自己免疫疾患及び
炎症性疾患の独立した研究によって、これらの疾患に感受性のある幾つかの遺伝
子が、ＥＩＦ２ＡＫ３へのシンテニィ領域にマッピングされたことは、注目すべ
きである(Kawahito, Y., ら, J. Immunol., 161,4411-9,1998)。特に、感受性の
ある遺伝子座が、インスリン依存性糖尿病について、マウスで、この領域に以前
にマッピングされ(de Gouyon, B., ら, Proc. Natl. Acad. Sci., U. S. A., 90
,1877-81,1993)、関節炎の幾つかのモデルについての遺伝子座がこの領域にマッ
ピングされた：ラット(Remmers, E. F., ら, Nature Genet, 14,82-5,1996)及び
マウス(Yang, H. T., ら, J. Immunol. 163,2916-21,1999)におけるコラーゲン
誘導型関節炎（ＣＩＡ）、ラットにおけるマイコバクテリア誘導型関節炎（ＡＩ
Ａ）(Kawahito, Y. et., 1998)及びマウスにおけるプリスタン誘導型関節炎（Ｐ
ＩＡ）(Vingsbo Lundberg, C., ら, Nature Genet, 20,401-4,1998)。しかし、
現在まで、幾つかのモデル生物でマッピングされた多数の自己免疫疾患遺伝子座
、並びに多くの場合にこれらの遺伝子座と関連する大きな信頼区間のせいで、こ
のような疾患に感受性のある遺伝子の比較マッピング結果の解釈は注意を要し、
これらの特定の疾患モデルにおけるＥＩＦ２ＡＫ３の関与を評価するためには、
更なる研究を要するであろう。

【０１１６】これらの知見はまた、ＷＲＳで観察される他の病理学的兆候を理解するのに関
連しうる。特に、ＷＲＳ患者は初期腎臓合併症に罹患し、ネフロパシーに至り、
それ故、この遺伝子は糖尿病性ネフロパシーの妥当な候補となる。糖尿病におけ
る骨粗鬆症（その発症は非糖尿病集団におけるよりも大きい）でのこの遺伝子の
変異体の試験も興味深いであろう。

【０１１７】実施例６：１型糖尿病（Ｔ１ＤＭ）におけるＥＩＦ２ＡＫ３の関与ＥＩＦ２ＡＫ３領域に位置するマイクロサテライトと、糖尿病との連鎖の証明上記実施例で、ＥＩＦ２ＡＫ３遺伝子での変異がウオルコット−ラリソン症候
群の原因である証拠が示された。この症候群は、特に、永久性新生児若しくは乳
児発症インスリン依存性糖尿病及び多発性骨端異形成症と関連し、このことは、
この遺伝子が、１型糖尿病（Ｔ１ＤＭ）及び２型糖尿病（Ｔ２ＤＭ）を含む、よ
り頻度の高い型の糖尿病に関与しうることを強く示唆する。

【０１１８】先に考察したように、Ｔ１ＤＭの感受性遺伝子をマッピングするために、幾つ
かのグループが多岐にわたる１型糖尿病ファミリーのゲノム−ワイドスクリーニ
ングを行った。Ｔ１ＤＭに関するこれらの刊行された結果において、並びに、同
様にＴ２ＤＭで行われたゲノム−ワイドスクリーニングにおいて、ＥＩＦ２ＡＫ
３遺伝子（染色体領域２ｐ１２）近傍に位置するマイクロサテライトマーカーの
、糖尿病との連鎖の証拠はなく、このことは糖尿病に対するこの遺伝子の遺伝子
変異の寄与が小さい可能性があり、見逃されるかもしれないことを示唆している
。遺伝的効果が検出されない幾つかのあり得る理由（例えば、サンプルサイズが
小さいことによって研究の力が限定されること、糖尿病への感受性へ寄与するマ
イナーな遺伝子的効果の多様性、並びに集団内及び集団間での遺伝学的及び環境
的不均質性）がある。

【０１１９】本実施例では、１型糖尿病におけるＥＩＦ２ＡＫ３の関与を支持する補足的情
報を提供する。本実施例は特に、幾つかの集団群で、ＥＩＦ２ＡＫ３領域に位置するマイクロ
サテライトの、糖尿病との連鎖の証拠を示す。スカンジナビア人集団（環境と遺伝学的バックグラウンドにおいて比較的均一
であると考えられている集団群）においてゲノム−ワイドな調査をやり遂げた。
ファミリーパネルは、デンマーク、スウェーデン及びノルウェーからの４２６の
多様な家族と４８５の罹患した同胞対(sibpair)を含んでいた（ＥＣＩＧＳコン
ソーシアム−インスリン依存性糖尿病ゲノム精査のための欧州コンソーシアム）
。

【０１２０】ゲノム全体にわたり位置する３１４のマイクロサテライトマーカーを用い、ゲ
ノムワイドスクリーニングを行った（平均マーカー間間隔１１ｃＭ）。ＥＩＦ２
ＡＫ３近傍でマーカー密度を増大させるために、補足的マイクロサテライトマー
カータイピングを行った。単一点解析のためにＡＮＡＬＹＺＥプログラムを用い
(J. Terwilliger, プログラムSIBPAIR:核家族に関する同胞対解析, ftp ://link
age.cpcm.columbia.edu)、並びに多点解析のためにＡＳＰＥＸプログラムを用い
(E. Hauser, ら, Genet Epidemiol. 13,117-37,1996; D. Hinds and N. Risch,
The ASPEXパッケージ:罹患同胞対マッピング, ftp://lahmed.standford.edu/pub
/aspex)、連鎖解析を行った。

【０１２１】更に、ＤＲ３／ＤＲ４の両方のヘテロ接合性（高リスクＨＬＡ群）である糖尿
病同胞対のサブセット、並びにＤＲ３アレルもＤＲ４アレルも共有しない（低リ
スクＨＬＡ群）糖尿病患者で解析を行った。連鎖結果を下記の表６に示す。

【０１２２】

【表７】

【０１２３】全部：全ての糖尿病同胞対ＤＲ３／４：ＨＬＡ−ＤＲ３／４の両方の糖尿病同胞対

【０１２４】連鎖の示唆的証拠が、単一点解析（ロッド−スコア２．４９まで）及び多点解
析（ロッド−スコアピーク２．５１、Ｄ２Ｓ３８８−Ｄ２Ｓ１１３の区間で）で
見出された。低リスクＨＬＡ群で、連鎖の証拠は見出されなかったが（示さず）
、高リスクＨＬＡ群で連鎖の増大した証拠が見出された（単一ポイント解析で、
ロッド−スコア４．２６まで）。ＥＩＦ２ＡＫ３での変異又はＥＩＦ２ＡＫ３近傍に位置する別の遺伝子が、ス
カンジナビア人集団において１型糖尿病への感受性に関与するという仮説を、こ
れらの補足的な結果は支持している。ＥＩＦ２ＡＫ３での変異は、インスリン依
存性糖尿病の１形態を生じ得るので、ＥＩＦ２ＡＫ３は、染色体２ｐ１２のこの
領域に位置するマイクロサテライトマーカーで検出される連鎖の原因の遺伝子で
あるという仮説を我々は好む。

【０１２５】実施例７：第３のＷＲＳ変異ウオルコット−ラリソン症候群のアフリカ人患者（そのＤＮＡは、Dr. Cather
ine Diatloff (Hopital Necker,パリ)によって供給された）で、ホモ接合性で存
在する第３の変異が同定された。この第３の変異は、エキソン１２中に位置するミスセンス変異である。 −ｃＤＮＡレファレンス配列で第３の変異の位置（Genbank番号：ＡＦ１１０１
４６）：２０３７Ｔ＞Ａ（Ｔ＝正常，Ａ＝変異）

【０１２６】レファレンスタンパク質配列でのアミノ酸変化６５５Ｎ（Ａｓｎ）＞Ｋ（Ｌｙｓ）（Ｎ＝正常，Ｋ＝変異）このアミノ酸変化は、キナーゼサブドメインＩＶ内に位置し、恐らく、機能が
劇的に変化しているタンパク質を生じる。

【図面の簡単な説明】

【図１】ＷＲＳに連鎖する可能性のある３つの領域でマイクロサテライトマーカーの拡
張されたセットのキャラクタリゼーションからの結果。図１Ａ：ファミリーＷＲＳ１とＷＲＳ２の領域１（染色体２）図１Ｂ：領域２（染色体２）；及び図１Ｃ：ファミリーＷＲＳ１の領域３（染色体９）。ＷＲＳ患者へ遺伝された親のハプロタイプは全体にわたって同一ではなかった
ので、領域２及び３は、目的とするものではありそうではないとして却下された
（図１Ｂ及び１Ｃ）。マーカー順序は、公共のデータベースから得られ、これらのファミリーで観察
された組換えに基づき、必要な場合には修正した。幾つかの密接に関連している
マーカーの場合、限られた情報又は公共で利用できるデータ間の矛盾の故に、そ
の順序は曖昧なままであった。

【図２】ＷＲＳ患者でのＥＩＦ２ＡＫ３変異。配列クロマトグラムは、ＷＲＳ１ファミリー（図２Ａ：１１０３−insＴ）と
ＷＲＳ２ファミリー（図２Ｂ：１８３２Ｇ＞Ａ）からのインデックス患者及び正
常対照での変異の領域について示している。ゲノムＤＮＡの配列決定（両方のフ
ァミリー）及びＰＣＲ−ＲＦＬＰアッセイ（ＷＲＳ１）によって、対応する遺伝
子型を決定した。ＷＲＳ２ファミリーでは、配列中にイントロン１０−８１１Ａ
／Ｔでの頻度の高い多型がみられる（インデックス患者：Ｔ／Ｔ；対照：Ａ／Ａ
）。

【図３】タンパク質レベルでのＷＲＳファミリーからのＥＩＦ２ＡＫ３変異の影響。図３Ａ：ＷＲＳ１ファミリー及びＷＲＳ２ファミリーでの変異（それぞれ、in
s３４５fs／ter３４５及びＲ５８７Ｑ）を示している。シグナルペプチドは黒に
色づけており、制御ドメインはしま線(batched line)で示され、触媒ドメインは
着色されていない。図３Ｂ：異なる生物からのＥＩＦ２αキナーゼ及び関連キナーゼ（ＷＥＥ１）
について、Ｒ５８７Ｑ変異近くでの、アミノ酸配列保存を示している。配列アラ
インメントを、ＢＬＡＳＴプログラムを用いて行った。正確な保存は赤で示し、
保存的変化は黄で示し、非保存的変化には色づけしていない。キナーゼサブドメ
インＩ及びＩＩ（部分）を示す。

【配列表】

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ａ６１Ｋ 45/00 Ａ６１Ｐ 1/16 ４Ｃ０８４ 48/00 3/10 ４Ｃ０８５Ａ６１Ｐ 1/16 13/12 ４Ｈ０４５ 3/10 19/02 13/12 19/10 19/02 25/18 19/10 Ｃ０７Ｋ 16/40 25/18 Ｃ１２Ｎ 1/15 Ｃ０７Ｋ 16/40 1/19 Ｃ１２Ｎ 1/15 1/21 1/19 9/12 1/21 Ｃ１２Ｑ 1/48 Ｚ 5/10 1/68 Ａ 9/12 Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｑ 1/48 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ 1/68 5/00 Ａ // Ｃ１２Ｐ 21/08 Ａ６１Ｋ 37/52 (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ，ＴＲ)，ＣＡ，ＪＰ，ＵＳ (71)出願人サントルナシオナルドゥジェノティパージュフランス国、エフ−91000 エヴリー、リュガストンクレミユ２ (72)発明者ジュリエール、セシルフランス国、エフ−75014 パリ、リュドゥラトーンブイソワール 35 (72)発明者デルピンヌ、マルクフランス国、エフ−75011 パリ、アンパストゥルイヨ 21 (72)発明者ニコリノ、マルクフランス国、エフ−69006 リヨン、リュデュゲスクラン 105 Ｆターム(参考） 4B024 AA01 AA11 BA10 CA04 DA02 DA06 EA04 GA11 HA12 HA17 4B050 CC03 DD11 LL01 LL03 4B063 QA12 QA19 QQ08 QQ26 QQ43 QR32 QR55 QR62 QS25 QS34 4B064 AG27 CA10 CA20 CC24 DA13 4B065 AA26X AA90X AA99Y AB01 AC14 BA02 CA25 CA29 CA44 CA46 4C084 AA02 AA06 AA07 AA13 AA17 BA44 CA53 DC25 NA10 ZA152 ZA672 ZA752 ZA812 ZA892 ZA962 ZA972 ZC352 4C085 AA13 AA14 BB22 BB41 BB43 CC02 CC23 DD63 DD88 EE01 4H045 AA10 AA11 AA30 BA10 CA40 DA76 DA89 EA28 EA50 FA74

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】翻訳開始因子２アルファキナーゼ３（ＥＩＦ２ＡＫ３）をコ
ードする遺伝子の哺乳動物ゲノム配列の単離された変異型核酸配列であって、該
ＥＩＦ２ＡＫ３タンパク質は配列番号２の配列を有し、哺乳動物における該変異
体配列の存在が、ウオルコット−ラリソン症候群（ＷＲＳ）を誘導し得るか、あ
るいは糖尿病及び／又はＷＲＳ関連病変の発症若しくは進行の危険性に影響を及
ぼすことを特徴とする変異型核酸配列。
【請求項２】該糖尿病及び／又はＷＲＳ関連病変が、１型糖尿病、２型糖
尿病、それ以外の型の糖尿病、骨粗鬆症、関節炎、肝不全、ネフロパシー及び他
の腎不全並びに精神遅滞からなる群から選択されることを特徴とする請求項１に
記載の単離された変異型核酸配列。
【請求項３】該糖尿病及び／又はＷＲＳ関連病変が、１型糖尿病、２型糖
尿病、及びそれ以外の型の糖尿病からなる群から選択されることを特徴とする請
求項１又は２に記載の単離された変異型核酸配列。
【請求項４】該糖尿病及び／又はＷＲＳ関連病変が、膵臓β−細胞又はそ
の完全性の重大な減少と関連していることを特徴とする請求項１〜３に記載の単
離された変異型核酸配列。
【請求項５】該糖尿病及び／又はＷＲＳ関連病変が、膵臓及び／又は軟骨
細胞に由来する特定のタンパク質に対してＥＩＦ２ＡＫ３によって発揮される制
御の変化から生じ、もし制御が正常に発揮されるのならば、該制御が、これらの
器官の十分な発育と機能を保証する、ということを特徴とする請求項１〜４に記
載の単離された変異型核酸配列。
【請求項６】該変異体配列が、配列番号３〜１５の配列又はそれらのフラ
グメントからなる群より選択される配列を含む（但し、請求項１に記載の単離さ
れた変異型核酸配列は、配列番号１の配列ではない）ことを特徴とする請求項１
〜５に記載の単離された変異型核酸配列。
【請求項７】該変異型配列によってコードされるタンパク質ＥＩＦ２ＡＫ
３が、ＥＩＦ２ＡＫ３の配列番号２の配列と比較して少なくとも１つの点変異を
示すことを特徴とする請求項１〜６に記載の単離された変異型核酸配列。
【請求項８】該変異型配列によってコードされるタンパク質ＥＩＦ２ＡＫ
３が、未熟終結、又は配列番号２の配列を有するタンパク質ＥＩＦ２ＡＫ３の触
媒ドメインａａ５７６−ａａ１１１５中に少なくとも１つの点変異を示すことを
特徴とする請求項１〜７に記載の単離された変異型核酸配列。
【請求項９】配列番号１の配列中、位置１１０３でＴの挿入又は位置１８
３２でＧからＡへのトランジッションを含むことを特徴とする請求項１〜８に記
載の単離された変異型核酸配列。
【請求項１０】表４Ａ及びＢ並びに表５のカラム「ｃＤＮＡ位置」及び／
又は「ゲノムＤＮＡ位置」において規定される核酸配列多型の少なくとも１つを
含むことを特徴とする請求項１〜８に記載の変異型核酸配列。
【請求項１１】ヒト核酸配列から選択されることを特徴とする請求項１〜
１０に記載の単離された変異型核酸配列。
【請求項１２】請求項１〜１１に記載の変異型核酸配列の相補的配列。
【請求項１３】請求項１〜１１に記載の単離された変異型核酸配列によっ
てコードされるポリペプチドであって、そのアミノ酸配列が、ＥＩＦ２ＡＫ３の
配列番号２の配列と比較して少なくとも１つの点変異を示すことを特徴とする、
ポリペプチド。
【請求項１４】表４Ａ及び５のカラム「アミノ酸」中で列挙したアミノ酸
変異の少なくとも１つを含むことを特徴とする請求項１２に記載のポリペプチド
。
【請求項１５】請求項１３及び１４のうちの１項に記載のポリペプチドを
コードすることを特徴とする単離された核酸配列。
【請求項１６】ａ）少なくとも１２塩基を含む、請求項１〜１２及び１５
のいずれか１項に記載の核酸配列のフラグメント；ｂ）ａ）で規定された核酸配列と特異的にハイブリダイズでき、且つ少なくとも
１２塩基を含む核酸配列；からなる群から選択されることを特徴とする単離された核酸配列。
【請求項１７】プライマー又はプローブとしての請求項１６に記載の単離
された核酸配列。
【請求項１８】配列番号１６〜１０５の配列からなる群から選択されるこ
とを特徴とする請求項１６及び１７に記載の単離された核酸配列。
【請求項１９】その配列が、請求項１６及び１８のうちの１項に記載の配
列から選択されることを特徴とする、センス又はアンチ−センスオリゴヌクレオ
チドとして使用できる核酸配列。
【請求項２０】請求項１６及び１９のうちの１項に記載の核酸配列を含む
クローニング及び／又は発現ベクター。
【請求項２１】宿主細胞において該配列の発現及び／分泌を可能とする要
素を含むことを特徴とする請求項２０に記載のベクター。
【請求項２２】請求項２０及び２１のうちの１項に記載のベクターによっ
て形質転換された宿主細胞。
【請求項２３】真核又は原核細胞であることを特徴とする請求項２２に記
載の細胞。
【請求項２４】請求項２２又は２３に記載の細胞を含むことを特徴とする
ヒトを除く哺乳動物。
【請求項２５】核酸配列の検出及び／又は増幅のためのプライマー又はプ
ローブとしての、請求項１６〜１８のうちの１項に記載の核酸配列の使用。
【請求項２６】組換え又は合成ポリペプチドの製造のための請求項１〜１
２及び１５のうちの１項に記載の核酸配列の使用。
【請求項２７】該組換えポリペプチドの発現を可能とする条件下、請求項
２２及び２３のうちの１項に記載の形質転換細胞を培養し、該組換えポリペプチ
ドを回収することを特徴とする、組換えポリペプチドの製造方法。
【請求項２８】請求項２６に記載の方法によって得ることができることを
特徴とする組換え又は合成ポリペプチド。
【請求項２９】請求項１３、１４及び２８のうちの１項に記載のポリペプ
チドを特異的に認識できることを特徴とする、モノ−又はポリクローナル抗体、
若しくはそのフラグネント、キメラ抗体、又はイムノコンジュゲート抗体。
【請求項３０】請求項１６〜１８のうちの１項に記載の核酸配列を使用す
ることを特徴とする、生体試料又はライブラリー中に含まれるＲＮＡ、ｃＤＮＡ
又はゲノムＤＮＡをスクリーニングする方法。
【請求項３１】請求項１〜１２及び１５〜１８のうちの１項に記載の核酸
配列を使用することを特徴とする、アレル変異、又はヘテロ接合性の喪失を決定
する方法。
【請求項３２】糖尿病及び／又はＷＲＳ関連病変、又は配列番号２の配列
を有するポリペプチドの異常発現と関連した病変の診断方法であって、請求項２
９に記載の１つ以上の抗体を、試験する生物材料と、該ポリペプチドと該抗体と
の特異的免疫複合体の可能性ある形成を可能とする条件下で接触させ、形成され
る可能性のある免疫複合体を検出することを特徴とする方法。
【請求項３３】被験者が、糖尿病及び／又はＷＲＳ関連病変を有する危険
性の減少若しくは増大にあるかどうかの決定方法であって、ａ）被験者からゲノムＤＮＡ又はＲＮＡを含む生体試料を集めること；ｂ）タンパク質ＥＩＦ２ＡＫ３をコードする少なくとも１つの遺伝子アレル又は
ＲＮＡで、糖尿病及び／又はＷＲＳ関連病変を有する危険性の減少又は増大に関
連した多型を含む可能性のあるＤＮＡ又はＲＮＡのフラグメントの配列、又はそ
の長さを決定すること（ここで、フラグメントは、請求項１６〜１８のうちの１
項に記載の１セットのプライマーを用いるポリメラーゼ・チェーン・リアクショ
ンで増幅できる）；ｃ）ＤＮＡ又はＲＮＡのフラグメントの配列が、ＷＲＳ関連病変を有する危険性
の減少又は増大に関連した多型を含むかどうかを観察することによって、被験者
が、糖尿病及び／又はＷＲＳ関連病変を有する危険性の減少又は増大にあるかど
うかを観察すること（ここで、該多型の存在は、被験者が糖尿病及び／又はＷＲ
Ｓ関連病変を有する危険性の減少又は増大にあることを示す）；のステップを含む方法。
【請求項３４】そのファミリーの１員がＷＲＳに罹患している被験者がＷ
ＲＳを有する危険性があるかどうかを決定する為のインビトロ方法であって、ａ）被験者からゲノムＤＮＡ又はＲＮＡを含む生体試料を集めること；ｂ）ＥＩＦ２ＡＫ３遺伝子の両方のアレルの配列で、ＷＲＳを有する危険性に関
連した多型を含む可能性のあるＤＮＡ又はＲＮＡのフラグメントの配列、又はそ
の長さを決定すること（ここで、フラグメントは、請求項１６〜１８のうちの１
項に記載の１セットのプライマーを用いるポリメラーゼ・チェーン・リアクショ
ンで増幅できる）；ｃ）両方のアレルで、ＤＮＡ又はＲＮＡのフラグメントの配列がＷＲＳを有する
危険性に関連した変異を担持しているかどうかを観察することによって、被験者
がＷＲＳを有する危険性があるかどうかを観察すること（ここで、該変異の存在
は、被験者がＷＲＳを有する危険性があることを示す）；のステップを含む方法。
【請求項３５】ＷＲＳを有する危険性の診断のための請求項３４に記載の
方法であって、ステップｂ）でＷＲＳを有する危険性に関連した多型が、配列番号１の配列中、
位置１１０３でのＴの挿入又は位置１８３２でのＧからＡへのトランジッション
に対応する変異の存在であること（ここで、被験者のＥＩＦ２ＡＫ３遺伝子アレ
ルの各々での変異の存在は、被験者がＷＲＳを有する危険性があることを示す）
を特徴とする方法。
【請求項３６】そのファミリーの１員がＷＲＳに罹患している被験者がＷ
ＲＳを有する危険性があるかどうかを決定する為のインビトロ方法であって、ａ）ＷＲＳに罹患しているファミリーの１員及び被験者からゲノムＤＮＡ又はＲ
ＮＡを含む生体試料を集めること；ｂ）ＷＲＳに罹患しているファミリーの１員及び被験者が、ＥＩＦ２ＡＫ３遺伝
子の近く、又はその中に位置する多型マーカーを比較することによってアレル同
一性を示すかどうかを決定すること（ここで、ＷＲＳに罹患しているファミリー
の１員及び被験者の間の遺伝子型同一性は、ＷＲＳを有する危険性があることを
示す）；のステップを含む方法。
【請求項３７】そのファミリーの１員がＷＲＳに罹患している被験者がＷ
ＲＳを有する危険性があるかどうかを決定する為の請求項３６に記載の方法であ
って、ａ）ＷＲＳに罹患しているファミリーの１員及び被験者からゲノムＤＮＡ又はＲ
ＮＡを含む生体試料を集めること；ｂ）ファミリーの１員の両方のＥＩＦ２ＡＫ３遺伝子アレル上で、ＷＲＳを有す
る危険性に関連する多型を含む可能性のあるＤＮＡ又はＲＮＡのフラグメントの
配列を決定すること（ここで、フラグメントは、請求項１６〜１８のうちの１項
に記載の１セットのプライマーを用いるポリメラーゼ・チェーン・リアクション
で増幅できる）；ｃ）ステップｂ）で同定したＷＲＳ罹患の原因であるフラグメントの配列の変異
が、被験者の両方のＥＩＦ２ＡＫ３遺伝子アレルの同一のフラグメントに存在す
るかどうかを決定すること（ここで、フラグメントは、請求項１６〜１８のうち
の１項に記載の１セットのプライマーを用いるポリメラーゼ・チェーン・リアク
ションで増幅できる）；ｄ）被験者の両方のＥＩＦ２ＡＫ３遺伝子アレル上のフラグメントの配列が、フ
ァミリーの１員についてステップｂ）で同定された同一の変異を含むかどうかを
観察すること（ここで、両方のアレル上での変異の存在は、被験者がＷＲＳを有
する危険性があることを示す）；のステップを含む方法。
【請求項３８】ポリメラーゼ・チェーン・リアクション後、結局は、逆転
写のステップ後、に得られた増幅産物のサイズの決定及び／又は配列決定によっ
て、多型を含む可能性のあるＤＮＡ又はＲＮＡのフラグメントの配列又はその長
さがステップｂ）で得られる、請求項３３〜３７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３９】糖尿病及び／又はＷＲＳ関連病変を発症する危険性の減少
又は増大に関連した少なくとも１つの付加マーカーのレベルについて、被験者か
らの生体試料をアッセイする第２の方法を更に含むこと（ここで、少なくとも１
つのマーカーの有意なレベルの存在は、被験者が、糖尿病及び／又はＷＲＳ関連
病変を発症する危険性の減少又は増大にあるかどうかを確認することを可能とす
る）を特徴とする請求項３３に記載の方法。
【請求項４０】被験者が、糖尿病及び／又はＷＲＳ関連病変を有する危険
性の減少又は増大にあるかどうかを決定する為のキットであって、タンパク質ＥＩＦ２ＡＫ３をコードし、糖尿病及び／又はＷＲＳ関連病変を有す
る危険性の減少又は増大と関連した多型を含む可能性のあるゲノムＤＮＡ又はＲ
ＮＡのフラグメントを増幅できる少なくとも１対のプライマーを含む（ここで、
該プライマーは、請求項１６〜１８のうちの１項に記載のプライマーから選択さ
れる）キット。
【請求項４１】糖尿病及び／又はＷＲＳ関連病変を有する危険性の減少又
は増大と関連した少なくとも１つの付加マーカーのレベルについて、被験者から
の生体試料をアッセイする手段を更に含むことを特徴とする請求項４０に記載の
キット。
【請求項４２】該関連付加マーカーが、糖尿病及び／又はＷＲＳ関連病変
を有する危険性の増大と関連した付加マーカーであることを特徴とする請求項４
１に記載のキット。
【請求項４３】被験者がＷＲＳを有する危険性があるかどうかを決定する
為のキットであって、ＥＩＦ２ＡＫ３遺伝子の近く、又はその中に位置する多型
マーカーを含むゲノムＤＮＡのフラグメントを増幅できる少なくとも１対のプラ
イマーを含むキット。
【請求項４４】被験者がＷＲＳを有する危険性があるかどうかを決定する
為のキットであって、配列番号１の配列中、位置１１０３でのＴの挿入又は位置１８３２でのＧからＡ
へのトランジッションを含む可能性のあるＥＩＦ２ＡＫ３ゲノムＤＮＡのフラグ
メントを増幅できる少なくとも１対のプライマーを含む（ここで、該プライマー
は、請求項１６〜１８のうちの１項に記載のプライマーから選択される）キット
。
【請求項４５】糖尿病及び／又はＷＲＳ関連病変が、１型糖尿病、２型糖
尿病、それ以外の型の糖尿病、骨粗鬆症、関節炎、肝不全、ネフロパシー及び他
の腎不全並びに精神遅滞からなる群から選択されることを特徴とする請求項３２
、３３及び３９のいずれか１項に記載の方法又は請求項４０〜４２のいずれか１
項に記載のキット。
【請求項４６】糖尿病及び／又はＷＲＳ関連病変が、１型糖尿病、２型糖
尿病、及びそれ以外の型の糖尿病からなる群から選択されることを特徴とする請
求項３２、３３及び３９のいずれか１項に記載の方法又は請求項４０〜４２のい
ずれか１項に記載のキット。
【請求項４７】糖尿病及び／又はＷＲＳ関連病変が、１型糖尿病であるこ
とを特徴とする請求項３２、３３及び３９のいずれか１項に記載の方法又は請求
項４０〜４２のいずれか１項に記載のキット。
【請求項４８】ＥＩＦ２ＡＫ３タンパク質の発現又は活性を研究する為の
、並びにＥＩＦ２ＡＫ３タンパク質と、ＥＩＦ２ＡＫ３タンパク質の活性に関与
しうる化学的若しくは生化学的化合物との直接的又は間接的相互作用を研究する
為の、請求項２２及び２３のうちの１項に記載の細胞、請求項２５に記載の哺乳
動物又は請求項１３〜１４及び２８のうちの１項に記載のポリペプチドの使用。
【請求項４９】ＥＩＦ２ＡＫ３タンパク質と直接的又は間接的に相互作用
でき、及び／又はＥＩＦ２ＡＫ３タンパク質の発現若しくは活性を調節できる化
学的若しくは生化学的化合物のスクリーニングの為の、請求項２２及び２３のう
ちの１項に記載の細胞、請求項２５に記載の哺乳動物又は請求項１３、１４及び
２８のうちの１項に記載のポリペプチドの使用。
【請求項５０】ＥＩＦ２ＡＫ３タンパク質と直接的又は間接的に相互作用
でき、及び／又はＥＩＦ２ＡＫ３タンパク質の発現又は活性を調節することを可
能とすることができる化学的又は生化学的化合物の選択方法であって、請求項２
２及び２３のうちの１項に記載の細胞、請求項２５に記載の哺乳動物又は請求項
１３、１４及び２８のうちの１項に記載のポリペプチドを使用することを特徴と
する方法。
【請求項５１】請求項５０に記載の方法によって選択されることを特徴と
する化合物。
【請求項５２】 −ＥＩＦ２ＡＫ３タンパク質発現のレベルの調節；及び／
又は −膵臓β−細胞又はその完全性の増大；及び／又は −糖尿病及び／又はＷＲＳ関連病変の予防又は治療；を可能とすることを特徴とする請求項５１に記載の化合物。
【請求項５３】ａ）請求項２９に記載の抗体；ｂ）請求項１３、１４及び２８のうちの１項に記載のポリペプチド；ｃ）請求項２０及び２１のどちらかに記載のベクター；ｄ）請求項１９に記載のセンス又はアンチ−センス核酸配列；から選択されることを特徴とする請求項５１及び５２のうちの１項に記載の化合
物。
【請求項５４】医薬としての、請求項５１〜５３のうちの１項に記載の化
合物。
【請求項５５】糖尿病及び／又はＷＲＳ関連病変の予防及び／又は治療の
ための請求項５４に記載の化合物。
【請求項５６】糖尿病及び／又はＷＲＳ関連病変が、１型糖尿病、２型糖
尿病、それ以外の型の糖尿病、骨粗鬆症、関節炎、肝不全、ネフロパシー及び他
の腎不全並びに精神遅滞からなる群から選択されることを特徴とする請求項５５
に記載の化合物。
【請求項５７】糖尿病及び／又はＷＲＳ関連病変が、１型糖尿病、２型糖
尿病、及びそれ以外の型の糖尿病からなる群から選択されることを特徴とする請
求項５５に記載の化合物。
【請求項５８】糖尿病及び／又はＷＲＳ関連病変が、１型糖尿病であるこ
とを特徴とする請求項５５に記載の化合物。