JP2003533991A - 新生児インスリン依存性糖尿病及び多発性骨端異形成症(ウオルコット−ラリソン症候群)の患者における変異した真核生物の翻訳開始因子2アルファキナーゼ3,eif2ak3 - Google Patents
新生児インスリン依存性糖尿病及び多発性骨端異形成症(ウオルコット−ラリソン症候群)の患者における変異した真核生物の翻訳開始因子2アルファキナーゼ3,eif2ak3Info
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Abstract
(57)【要約】
本発明は、ウオルコット−ラリソン症候群(WRS)を誘導し得る、糖尿病及び/又はWRSに関連する他の病変を発症する危険性に影響を及ぼしうる翻訳開始因子2アルファキナーゼ3(EIF2AK3)をコードするゲノム配列の単離された変異型核酸配列、並びにこれらの配列によってコードされるポリペプチドに関する。本発明は、また、これらの配列を含むベクター又は形質転換細胞に関する。本発明は更に、被験者における、糖尿病及び/又はWRSに関連する他の病変を発症する危険性を決定する為のための方法及びキット、並びにこれらの病変の予防及び/又は治療のための医薬として使用できる化合物の選択方法に関する。
Description
【0001】
本発明は、ウオルコット−ラリソン症候群(WRS)を誘導し得るか、あるい
は糖尿病及び/又はWRSに関連する他の病変を発症する危険性に影響を及ぼし
得る翻訳開始因子2アルファキナーゼ3(EIF2AK3)をコードするゲノム
配列の単離された変異型核酸配列(nucleic sequence)、並びにこれらの配列によ
ってコードされるポリペプチドに関する。本発明はまた、これらの配列を含むベ
クター又は形質転換細胞に関する。本発明は更に、被験者における糖尿病及び/
又はWRSに関連する他の病変を発症する危険性を決定する為の方法及びキット
、並びにこれらの病変の予防及び/又は治療のための医薬として使用できる化合
物の選択方法に関する。
は糖尿病及び/又はWRSに関連する他の病変を発症する危険性に影響を及ぼし
得る翻訳開始因子2アルファキナーゼ3(EIF2AK3)をコードするゲノム
配列の単離された変異型核酸配列(nucleic sequence)、並びにこれらの配列によ
ってコードされるポリペプチドに関する。本発明はまた、これらの配列を含むベ
クター又は形質転換細胞に関する。本発明は更に、被験者における糖尿病及び/
又はWRSに関連する他の病変を発症する危険性を決定する為の方法及びキット
、並びにこれらの病変の予防及び/又は治療のための医薬として使用できる化合
物の選択方法に関する。
【0002】
ウオルコット−ラリソン症候群(WRS)は、新生児発症又は乳児期出現のイ
ンスリン依存性糖尿病によって特徴付けられ、後年出現する多発性骨端異形成症
及び骨粗鬆症を伴う。WRSと関連しうる他の状態には、肝腎不全、精神遅滞、
皮膚異常(外胚葉異形成症)及び歯変色並びに心臓血管異常が挙げられる(Wolco
tt, C. D., ら, J. Pediatr., 80,292-297,1972; Goumy, P., ら, Arch Fr Pedi
atr., 37,323-328,1980; Stoss, H., ら, Eur J Pediatr., 138,120-129, 1982;
Al-Gazali, L. I., ら, Clinical Dysmorphology, 4,227-233,1995; Thornton,
C. M., ら, Pediatr. Pathol. Lab. Med., 17,487-96,1997)。インスリン補充
療法は糖尿病の発症から必要であるけれども、抗−膵島細胞自己抗体や他の糖尿
病関連自己抗体がWRS患者に存在しないので、病因は自己免疫であるとは思わ
れない。膵臓のオートプシー検査によって、膵臓β細胞の重大な減少が示されて
いる(Nicolino, P. M., ら, Hormone Research, 50, A215,1998)。
ンスリン依存性糖尿病によって特徴付けられ、後年出現する多発性骨端異形成症
及び骨粗鬆症を伴う。WRSと関連しうる他の状態には、肝腎不全、精神遅滞、
皮膚異常(外胚葉異形成症)及び歯変色並びに心臓血管異常が挙げられる(Wolco
tt, C. D., ら, J. Pediatr., 80,292-297,1972; Goumy, P., ら, Arch Fr Pedi
atr., 37,323-328,1980; Stoss, H., ら, Eur J Pediatr., 138,120-129, 1982;
Al-Gazali, L. I., ら, Clinical Dysmorphology, 4,227-233,1995; Thornton,
C. M., ら, Pediatr. Pathol. Lab. Med., 17,487-96,1997)。インスリン補充
療法は糖尿病の発症から必要であるけれども、抗−膵島細胞自己抗体や他の糖尿
病関連自己抗体がWRS患者に存在しないので、病因は自己免疫であるとは思わ
れない。膵臓のオートプシー検査によって、膵臓β細胞の重大な減少が示されて
いる(Nicolino, P. M., ら, Hormone Research, 50, A215,1998)。
【0003】
本症候群は、3人の罹患した子孫のいる単一ファミリーにおいてWolcottとRal
lisonによって1972年に初めて記載された(Wolcott, C. D.ら)。次いで、文献で
約10ケースが報告された。本症候群のまれさに係わらず、入手可能なデータは
、該症候群が、常染色体劣性形質として遺伝する:該疾患はWRS患者の親には
存在しない;その発症率は性別とは関係がないようである;該疾患は子孫で繰り
返される;及び、それは、血族結婚で生まれた子供に主に見出される、ことを強
く論証している。完全な症候群が出現する前に、糖尿病又は他の病理学的兆候か
ら、患者は非常に若い年齢で死に得るし、次いで、新生児の、又は初期発症のイ
ンスリン依存性糖尿病(IDDM)と誤診され得るが故にWRSの発症率は実際
より少なく見積もられる。まれにあるメンデリアンサブタイプの多因子疾患は、
新規な疾患経路を同定する為の、及び他のより普通の疾患形態における罹病性の
研究のための、洞察を与え得る。例えば、WRSの原因遺伝子のよりマイルドな
変異体はまた、IDDMの通常の形態や他の関連兆候に対する罹病性に関連し得
、このようにして、この症候群の研究に特別の関心を与え得る。ウオルフラン症
候群7、若年発症成人型糖尿病(MODY)等の糖尿病の他のまれな形態(最近
の総説として、Inoue, H. ら, Nat. Genet., 20,143-8,1998; Hattersley, A. T
., Diabet. Med. 15,15-24,1998; Winter, W. E., ら, Endocrinol Metab. Clin
. North. Am., 28,765-85,1999; Froguel, P., ら, Trends in Endocrinology a
nd Metabolism, 10,142-146,1999参照)、並びに糖尿病と高血圧を伴ったインス
リン抵抗性の代謝性症候群(Barroso, I., ら, Nature, 402,880-3 1999)の研究
は全て、生物学的に興味のある新規疾患機構を示した。
lisonによって1972年に初めて記載された(Wolcott, C. D.ら)。次いで、文献で
約10ケースが報告された。本症候群のまれさに係わらず、入手可能なデータは
、該症候群が、常染色体劣性形質として遺伝する:該疾患はWRS患者の親には
存在しない;その発症率は性別とは関係がないようである;該疾患は子孫で繰り
返される;及び、それは、血族結婚で生まれた子供に主に見出される、ことを強
く論証している。完全な症候群が出現する前に、糖尿病又は他の病理学的兆候か
ら、患者は非常に若い年齢で死に得るし、次いで、新生児の、又は初期発症のイ
ンスリン依存性糖尿病(IDDM)と誤診され得るが故にWRSの発症率は実際
より少なく見積もられる。まれにあるメンデリアンサブタイプの多因子疾患は、
新規な疾患経路を同定する為の、及び他のより普通の疾患形態における罹病性の
研究のための、洞察を与え得る。例えば、WRSの原因遺伝子のよりマイルドな
変異体はまた、IDDMの通常の形態や他の関連兆候に対する罹病性に関連し得
、このようにして、この症候群の研究に特別の関心を与え得る。ウオルフラン症
候群7、若年発症成人型糖尿病(MODY)等の糖尿病の他のまれな形態(最近
の総説として、Inoue, H. ら, Nat. Genet., 20,143-8,1998; Hattersley, A. T
., Diabet. Med. 15,15-24,1998; Winter, W. E., ら, Endocrinol Metab. Clin
. North. Am., 28,765-85,1999; Froguel, P., ら, Trends in Endocrinology a
nd Metabolism, 10,142-146,1999参照)、並びに糖尿病と高血圧を伴ったインス
リン抵抗性の代謝性症候群(Barroso, I., ら, Nature, 402,880-3 1999)の研究
は全て、生物学的に興味のある新規疾患機構を示した。
【0004】
WRSに関与する病原経路は不明であるが、上記理由により、該疾患は、多形
質発現の原因の単一遺伝子によることが大いにあり得る。自己免疫プロセスの証
拠は無く、膵臓β−細胞が完全に欠如しているので、この遺伝子は、内分泌腺の
膵臓の発達に関与しているのかも知れないということが提唱されてきた。最近、
以前から膵臓β細胞の分化に重要であると示されてきたペアド−ボックス転写因
子PAX4遺伝子(Sosa Pineda, ら, Nature, 386,399-402,1997)の詳細な研究
から、この遺伝子が原因遺伝子であるという見込みは無くなった(Bonthron, D.
T., ら, J. Med. Genet., 35,288-92,1998)。染色体15q11−12のモザイ
ク欠失の患者においてWRS症候群が存在する唯一のケースの報告は、遺伝子が
この染色体領域に位置するという可能性を提起した(Stewart, F. J. ら, Clin.
Genet. 49,152-5,1996)。しかし、この局在化の可能性の確認は報告されていな
かった。
質発現の原因の単一遺伝子によることが大いにあり得る。自己免疫プロセスの証
拠は無く、膵臓β−細胞が完全に欠如しているので、この遺伝子は、内分泌腺の
膵臓の発達に関与しているのかも知れないということが提唱されてきた。最近、
以前から膵臓β細胞の分化に重要であると示されてきたペアド−ボックス転写因
子PAX4遺伝子(Sosa Pineda, ら, Nature, 386,399-402,1997)の詳細な研究
から、この遺伝子が原因遺伝子であるという見込みは無くなった(Bonthron, D.
T., ら, J. Med. Genet., 35,288-92,1998)。染色体15q11−12のモザイ
ク欠失の患者においてWRS症候群が存在する唯一のケースの報告は、遺伝子が
この染色体領域に位置するという可能性を提起した(Stewart, F. J. ら, Clin.
Genet. 49,152-5,1996)。しかし、この局在化の可能性の確認は報告されていな
かった。
【0005】
ヒトにおける糖尿病の原因の分子機構は複雑で、遺伝的要因及び環境要因を含
む。これらの病変を発症する危険性を予測でき、及び/又はより良く標的化され
た医薬を開発できるように、糖尿病にかかわる遺伝的機構を規定することは重要
である。
む。これらの病変を発症する危険性を予測でき、及び/又はより良く標的化され
た医薬を開発できるように、糖尿病にかかわる遺伝的機構を規定することは重要
である。
【0006】
本発明者らは、異なる種族的出身の2つの血縁家族(一方はチュニジア人家系
でもう一方はパキスタン家系)でWRSを試験した。3人の罹患子供と1人の非
罹患子供を有する第1のファミリーで、ゲノム−ワイドな連鎖研究を行い、染色
体2の17cM領域に、該疾患に関与する遺伝子の可能性のある局在化の同定が
できた。局在化は第2のファミリーで確認され、データをあわせることにより、
我々は遠位及び近位境界での組換え事象によって規定される2−3cMの間隔に
遺伝子をマッピングすることができた。その間隔にマッピングされた遺伝子の中
で、膵島での高レベルの発現故に、WRSの主要な候補遺伝子として、本発明者
らは、真核生物の翻訳開始因子2アルファキナーゼ(EIF2AK3)(膵臓真
核性開始因子2α−サブユニットキナーゼ(PEK)としても知られる)を同定
した。この遺伝子は、胎盤でも高度に発現されている(母親からの正常な発現は
、誕生時のWRS患者の健康な状態、次いで糖尿病の急速な発症を説明し得る)
。
でもう一方はパキスタン家系)でWRSを試験した。3人の罹患子供と1人の非
罹患子供を有する第1のファミリーで、ゲノム−ワイドな連鎖研究を行い、染色
体2の17cM領域に、該疾患に関与する遺伝子の可能性のある局在化の同定が
できた。局在化は第2のファミリーで確認され、データをあわせることにより、
我々は遠位及び近位境界での組換え事象によって規定される2−3cMの間隔に
遺伝子をマッピングすることができた。その間隔にマッピングされた遺伝子の中
で、膵島での高レベルの発現故に、WRSの主要な候補遺伝子として、本発明者
らは、真核生物の翻訳開始因子2アルファキナーゼ(EIF2AK3)(膵臓真
核性開始因子2α−サブユニットキナーゼ(PEK)としても知られる)を同定
した。この遺伝子は、胎盤でも高度に発現されている(母親からの正常な発現は
、誕生時のWRS患者の健康な状態、次いで糖尿病の急速な発症を説明し得る)
。
【0007】
それ故、本発明は、翻訳開始因子2アルファキナーゼ3(EIF2AK3)を
コードする遺伝子の哺乳動物ゲノム配列の単離された変異型核酸配列であって(
該EIF2AK3タンパク質は配列番号2の配列を有する)、哺乳動物における
該変異型配列の存在によって、ウオルコット−ラリソン症候群(WRS)を誘導
し得るか、又は糖尿病及び/又はWRS関連病変の発症若しくは進行の危険性に
影響を与え得ることを特徴とする変異型核酸配列に関する。
コードする遺伝子の哺乳動物ゲノム配列の単離された変異型核酸配列であって(
該EIF2AK3タンパク質は配列番号2の配列を有する)、哺乳動物における
該変異型配列の存在によって、ウオルコット−ラリソン症候群(WRS)を誘導
し得るか、又は糖尿病及び/又はWRS関連病変の発症若しくは進行の危険性に
影響を与え得ることを特徴とする変異型核酸配列に関する。
【0008】
本発明は、天然形態の核酸配列又はポリペプチドに関するものではなく、即ち
、それらは、天然環境でとられるのではなくて、天然源からの精製によって、あ
るいは遺伝子組換えによって、又は化学合成によってそれらが得られることが可
能であったかもしれないことを理解すべきである。
、それらは、天然環境でとられるのではなくて、天然源からの精製によって、あ
るいは遺伝子組換えによって、又は化学合成によってそれらが得られることが可
能であったかもしれないことを理解すべきである。
【0009】
核酸配列又は核酸は、修飾されているか、若しくはされていないヌクレオチド
の明確な連続を指定する非天然のヌクレオチドを含むか若しくは含まない、核酸
のフラグメント、セグメント若しくは領域が定義付けされるのを可能とする、単
離された天然の若しくは合成のDNA及び/又はRNAフラグメントを意味する
よう理解される。
の明確な連続を指定する非天然のヌクレオチドを含むか若しくは含まない、核酸
のフラグメント、セグメント若しくは領域が定義付けされるのを可能とする、単
離された天然の若しくは合成のDNA及び/又はRNAフラグメントを意味する
よう理解される。
【0010】
変異型核酸配列(又はタンパク質、ポリペプチド若しくはペプチド変異体)は
、天然に存在し得る、特にヒトにおいて存在し得る、特にヌクレオチド(又はア
ミノ酸残基)の欠失、置換及び/又は付加に対応する全ての代替(alternative)
核酸配列(又は代替ポリペプチド)を意味するように理解されよう。本ケースに
おいて、変異型核酸配列(又は変異型ポリペプチド)は、特に部分的に、糖尿病
及び/又はWRS関連病変の発症又は進行の危険性に関連しよう。このように、
それらは、体質、又は糖尿病及び/又はWRS関連病変の発症及び/又は進行に
対する抵抗性若しくは防御性、好ましくは糖尿病及び/又はWRS関連病変を発
症しやすい、及び/又は進行しやすい病的素因(危険性増大)と関連しうる。
、天然に存在し得る、特にヒトにおいて存在し得る、特にヌクレオチド(又はア
ミノ酸残基)の欠失、置換及び/又は付加に対応する全ての代替(alternative)
核酸配列(又は代替ポリペプチド)を意味するように理解されよう。本ケースに
おいて、変異型核酸配列(又は変異型ポリペプチド)は、特に部分的に、糖尿病
及び/又はWRS関連病変の発症又は進行の危険性に関連しよう。このように、
それらは、体質、又は糖尿病及び/又はWRS関連病変の発症及び/又は進行に
対する抵抗性若しくは防御性、好ましくは糖尿病及び/又はWRS関連病変を発
症しやすい、及び/又は進行しやすい病的素因(危険性増大)と関連しうる。
【0011】
本明細書において、「糖尿病及び/又はWRS関連病変」は、1型糖尿病、2
型糖尿病、並びに他の型の糖尿病、及び/又はWRS罹患患者で報告されている
他の病変、特に例えば、骨粗鬆症及び関節炎等の骨疾患、肝不全、ネフロパシー
若しくは他の腎不全、精神遅滞、皮膚異常、歯変色、及び心臓血管異常を意味す
るように理解されよう。
型糖尿病、並びに他の型の糖尿病、及び/又はWRS罹患患者で報告されている
他の病変、特に例えば、骨粗鬆症及び関節炎等の骨疾患、肝不全、ネフロパシー
若しくは他の腎不全、精神遅滞、皮膚異常、歯変色、及び心臓血管異常を意味す
るように理解されよう。
【0012】
WRS関連骨疾患では、軟骨無形成症、骨端異形成症、軟骨形成不全症、低軟
骨形成症も特に記載することができる。
骨形成症も特に記載することができる。
【0013】
正常の核酸配列又は正常の変異型核酸配列(又は正常の変異型ポリペプチド)
は、哺乳動物、特にヒトにおいて、糖尿病及び/又はWRS関連病変の発症及び
/又は進行の危険性に影響しない核酸配列又は変異型核酸配列(variant nucleic
)(又は正常の変異型ポリペプチド)を意味するように理解されよう。
は、哺乳動物、特にヒトにおいて、糖尿病及び/又はWRS関連病変の発症及び
/又は進行の危険性に影響しない核酸配列又は変異型核酸配列(variant nucleic
)(又は正常の変異型ポリペプチド)を意味するように理解されよう。
【0014】
「糖尿病及び/又はWRS関連病変の発症及び/又は進行の危険性に影響する
」とは、哺乳動物、特にヒトにおいて、被験者が、糖尿病及び/又はWRS関連
病変にかかる(発症又は進行する)可能性の増大(病的素因)又は減少(抵抗性
若しくは防御性)を意味するように理解されよう。
」とは、哺乳動物、特にヒトにおいて、被験者が、糖尿病及び/又はWRS関連
病変にかかる(発症又は進行する)可能性の増大(病的素因)又は減少(抵抗性
若しくは防御性)を意味するように理解されよう。
【0015】
アレル又はアレル変異体は、ヒトにおいて存在する多型、特に、WRSを有す
る危険性、又は糖尿病及び/又はWRS関連病変(特に、1型若しくは2型糖尿
病レベル、又はそれ以外の型の糖尿病のレベル、好ましくは1型糖尿病レベルで
)の発症及び/又は進行の危険性に影響を与えうる多型に対応する天然の代替配
列を意味するように理解されよう。
る危険性、又は糖尿病及び/又はWRS関連病変(特に、1型若しくは2型糖尿
病レベル、又はそれ以外の型の糖尿病のレベル、好ましくは1型糖尿病レベルで
)の発症及び/又は進行の危険性に影響を与えうる多型に対応する天然の代替配
列を意味するように理解されよう。
【0016】
代替核酸配列は、正常配列と比較して少なくとも1つの点変異、好ましくは、
正常配列と比較して点変異を最大10%、好ましくは5%、2.5%、2%、1
.5%、及び1%を含む核酸配列を好ましくは意味するように理解される。 好ましくは、本発明は、点変異がサイレントではない、即ち、正常配列につい
て、コードされたアミノ酸の修飾をもたらす代替核酸配列に関する。更により好
ましくは、これらの点変異は、正常タンパク質の触媒位置に位置するアミノ酸に
影響を与える。
正常配列と比較して点変異を最大10%、好ましくは5%、2.5%、2%、1
.5%、及び1%を含む核酸配列を好ましくは意味するように理解される。 好ましくは、本発明は、点変異がサイレントではない、即ち、正常配列につい
て、コードされたアミノ酸の修飾をもたらす代替核酸配列に関する。更により好
ましくは、これらの点変異は、正常タンパク質の触媒位置に位置するアミノ酸に
影響を与える。
【0017】
核酸(acid nucleic)フラグメント(又はポリペプチドフラグメント)は、最小
12ヌクレオチド又は塩基、好ましくは、15、20、25、30、40又は5
0塩基を含む核酸フラグメント(又はコードされるポリペプチド若しくはペプチ
ド)を意味するように理解される。これらのフラグメントは、哺乳動物、特にヒ
トにおいて、糖尿病及び/又はWRS関連病変の発症の危険性に影響を与えない
核酸配列(正常な変異型核酸)と比較して特に1つの点変異を含み得る。
12ヌクレオチド又は塩基、好ましくは、15、20、25、30、40又は5
0塩基を含む核酸フラグメント(又はコードされるポリペプチド若しくはペプチ
ド)を意味するように理解される。これらのフラグメントは、哺乳動物、特にヒ
トにおいて、糖尿病及び/又はWRS関連病変の発症の危険性に影響を与えない
核酸配列(正常な変異型核酸)と比較して特に1つの点変異を含み得る。
【0018】
好適な実施態様において、本発明のこの単離された変異型核酸配列は、糖尿病
及び/又はWRS関連病変が、1型糖尿病、2型糖尿病、それ以外の型の糖尿病
、骨粗鬆症、関節炎、肝不全、ネフロパシー及び他の腎不全並びに精神遅滞から
なる群から選択されることを特徴とする。 別の好適な実施態様では、この単離された変異型核酸配列は、糖尿病及び/又
はWRS関連病変が、1型糖尿病、2型糖尿病、及び他の型の糖尿病からなる群
から選択されることを特徴とする。 より好適な実施態様では、この単離された変異型核酸配列は、糖尿病及び/又
はWRS関連病変が、1型糖尿病及び2型糖尿病からなる群から選択されること
を特徴とする。 特により好適な実施態様において、この単離された変異型核酸配列は、糖尿病
及び/又はWRS関連病変が、1型糖尿病であることを特徴とする。
及び/又はWRS関連病変が、1型糖尿病、2型糖尿病、それ以外の型の糖尿病
、骨粗鬆症、関節炎、肝不全、ネフロパシー及び他の腎不全並びに精神遅滞から
なる群から選択されることを特徴とする。 別の好適な実施態様では、この単離された変異型核酸配列は、糖尿病及び/又
はWRS関連病変が、1型糖尿病、2型糖尿病、及び他の型の糖尿病からなる群
から選択されることを特徴とする。 より好適な実施態様では、この単離された変異型核酸配列は、糖尿病及び/又
はWRS関連病変が、1型糖尿病及び2型糖尿病からなる群から選択されること
を特徴とする。 特により好適な実施態様において、この単離された変異型核酸配列は、糖尿病
及び/又はWRS関連病変が、1型糖尿病であることを特徴とする。
【0019】
本発明の主題はまた、糖尿病及び/又はWRS関連病変が、膵臓β−細胞又は
その完全性(integrity)全体の喪失、特に重大な減少に関連することを特徴とす
る本発明の単離された変異型核酸配列である。 本発明は、膵臓及び/又は軟骨細胞に由来する特定のタンパク質に対するEI
F2AK3によって発揮される制御(もし正常に発揮されるのならば、該制御は
、これらの器官の十分な発育と機能を保証する)の変化から、糖尿病及び/又は
WRS関連病変が生じるということを特徴とする本発明の単離された変異型核酸
配列に関する。
その完全性(integrity)全体の喪失、特に重大な減少に関連することを特徴とす
る本発明の単離された変異型核酸配列である。 本発明は、膵臓及び/又は軟骨細胞に由来する特定のタンパク質に対するEI
F2AK3によって発揮される制御(もし正常に発揮されるのならば、該制御は
、これらの器官の十分な発育と機能を保証する)の変化から、糖尿病及び/又は
WRS関連病変が生じるということを特徴とする本発明の単離された変異型核酸
配列に関する。
【0020】
本発明の単離された変異型核酸配列の中で、配列番号3〜15の配列又はその
フラグメントからなる群から選択される核酸配列を含む、又はそれらからなる単
離された変異型核酸配列も好適である(但し、該単離された変異型核酸配列は、
配列番号1の配列ではない)。 好適な実施態様において、本発明は、本発明の単離された変異型核酸配列に関
し、該変異型配列によってコードされるタンパク質EIF2AK3が、配列番号
2のEIF2AK3の配列と比較して少なくとも1つの変異を示すことを特徴と
する。 また好適な実施態様において、本発明は、本発明の単離された変異型核酸配列
によってコードされるタンパク質EIF2AK3が、配列番号2の配列を有する
タンパク質EIF2AK3の未熟終結又は触媒ドメインaa576−aa111
5内の少なくとも1つの変異を示すことを特徴とする、核酸配列に関する。 配列番号1の配列において位置1103でのTの挿入、又は位置1832での
GからAへのトランジションを含むことを特徴とする、本発明の単離された変異
型核酸配列もまた、本発明の一部を形成する。
フラグメントからなる群から選択される核酸配列を含む、又はそれらからなる単
離された変異型核酸配列も好適である(但し、該単離された変異型核酸配列は、
配列番号1の配列ではない)。 好適な実施態様において、本発明は、本発明の単離された変異型核酸配列に関
し、該変異型配列によってコードされるタンパク質EIF2AK3が、配列番号
2のEIF2AK3の配列と比較して少なくとも1つの変異を示すことを特徴と
する。 また好適な実施態様において、本発明は、本発明の単離された変異型核酸配列
によってコードされるタンパク質EIF2AK3が、配列番号2の配列を有する
タンパク質EIF2AK3の未熟終結又は触媒ドメインaa576−aa111
5内の少なくとも1つの変異を示すことを特徴とする、核酸配列に関する。 配列番号1の配列において位置1103でのTの挿入、又は位置1832での
GからAへのトランジションを含むことを特徴とする、本発明の単離された変異
型核酸配列もまた、本発明の一部を形成する。
【0021】
更に好適な実施態様において、本発明は、表4A及びB並びに表5のカラム「
cDNA位置」及び/又は「ゲノムDNA位置」において規定される核酸配列多
型を少なくとも1つ該配列中に含むことを特徴とする、本発明の単離された変異
型核酸配列に関する。 より好適な実施態様において、本発明は、ヒト核酸配列から選択されることを
特徴とする、本発明の単離された変異型核酸配列に関する。 本発明の変異型核酸配列の相補的配列も、本発明に含まれる。
cDNA位置」及び/又は「ゲノムDNA位置」において規定される核酸配列多
型を少なくとも1つ該配列中に含むことを特徴とする、本発明の単離された変異
型核酸配列に関する。 より好適な実施態様において、本発明は、ヒト核酸配列から選択されることを
特徴とする、本発明の単離された変異型核酸配列に関する。 本発明の変異型核酸配列の相補的配列も、本発明に含まれる。
【0022】
別の目的で、本発明は、本発明の単離された変異型核酸配列によってコードさ
れるポリペプチドであって、そのアミノ酸配列が、配列番号2のEIF2AK3
の配列と比較して、少なくとも1つの点変異を示すことを特徴とするポリペプチ
ドに関する。 好適な実施態様では、本発明は、表4A及び5のカラム「アミノ酸」に列挙し
たアミノ酸変異の少なくとも1つを含むことを特徴とする、本発明のポリペプチ
ドに関する。 本発明のポリペプチドをコードすることを特徴とする単離された核酸配列はま
た、本発明の一部を形成する。
れるポリペプチドであって、そのアミノ酸配列が、配列番号2のEIF2AK3
の配列と比較して、少なくとも1つの点変異を示すことを特徴とするポリペプチ
ドに関する。 好適な実施態様では、本発明は、表4A及び5のカラム「アミノ酸」に列挙し
たアミノ酸変異の少なくとも1つを含むことを特徴とする、本発明のポリペプチ
ドに関する。 本発明のポリペプチドをコードすることを特徴とする単離された核酸配列はま
た、本発明の一部を形成する。
【0023】
本発明は更に、単離された核酸配列であって、
a)本発明の核酸配列のフラグメントであり且つ、少なくとも12、15、20
、25、30、40又は50塩基を含むフラグメント; b)a)で規定された核酸配列と特異的にハイブリダイズでき、そして少なくと
も12、15、20、25、30、40又は50塩基を含む核酸配列; からなる群から選択されることを特徴とする単離された核酸配列を含む。
、25、30、40又は50塩基を含むフラグメント; b)a)で規定された核酸配列と特異的にハイブリダイズでき、そして少なくと
も12、15、20、25、30、40又は50塩基を含む核酸配列; からなる群から選択されることを特徴とする単離された核酸配列を含む。
【0024】
レファレンス核酸配列と「特異的にハイブリダイズできる核酸配列」は、スト
リンジェントな条件下(当業者に周知で、例えば、Sambrook ら (Molecular Clo
ning, A Laboratory Manual, Sec. Edition, Cold Spring Harbor Laboratory P
ress, pages 11.50 and 11.51,1989)に見出すことができる条件)、該レファレ
ンス配列とハイブリダイズできる核酸配列を意味するものと理解されよう。 好ましくは、レファレンス核酸配列と特異的にハイブリダイズできる核酸配列
は、レファレンス配列の相補配列と最適アラインメント後、少なくとも80%、
85%、90%、95%又は99%同一度を有する。 「同一度」という用語は、本明細書では、本出願で以下に定義される最適アラ
インメント後の、2つの配列間での同一性の程度又はパーセンテージを指す。
リンジェントな条件下(当業者に周知で、例えば、Sambrook ら (Molecular Clo
ning, A Laboratory Manual, Sec. Edition, Cold Spring Harbor Laboratory P
ress, pages 11.50 and 11.51,1989)に見出すことができる条件)、該レファレ
ンス配列とハイブリダイズできる核酸配列を意味するものと理解されよう。 好ましくは、レファレンス核酸配列と特異的にハイブリダイズできる核酸配列
は、レファレンス配列の相補配列と最適アラインメント後、少なくとも80%、
85%、90%、95%又は99%同一度を有する。 「同一度」という用語は、本明細書では、本出願で以下に定義される最適アラ
インメント後の、2つの配列間での同一性の程度又はパーセンテージを指す。
【0025】
最大限に一致するようにアラインされたとき、2つの配列のアミノ酸又はヌク
レオチド残基が同一ならば、2つのアミノ酸又はヌクレオチド配列は「同一」と
言われる。2つ(又はそれより多くの)ペプチド又はポリヌクレオチド間の配列
比較は典型的には、配列類似性の局所領域の同定と比較のためのセグメント又は
「比較ウインドウ」上で、2つの最適にアラインされた配列の配列を比較するこ
とによって行う。比較のための配列の最適アラインメントは、Smith and Waterm
an, Ad. App. Math 2: 482 (1981)の局所相同性アルゴリズムによって、Neddlem
an and Wunsch, J. Mol. Biol. 48 : 443 (1970)の相同性アラインメントアルゴ
リズムによって、Pearson and Lipman, Proc. Natl. Acad. Sci. (U. S. A.) 85
: 2444 (1988)の類似性法の検索によって、これらのアルゴリズムのコンピュー
タによる履行(the Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer
Group (GCG), 575 Science Dr., Madison, WI中のGAP, BESTFIT, FASTA, and TF
ASTA)によって、又は可視検査によって、行うことができる。
レオチド残基が同一ならば、2つのアミノ酸又はヌクレオチド配列は「同一」と
言われる。2つ(又はそれより多くの)ペプチド又はポリヌクレオチド間の配列
比較は典型的には、配列類似性の局所領域の同定と比較のためのセグメント又は
「比較ウインドウ」上で、2つの最適にアラインされた配列の配列を比較するこ
とによって行う。比較のための配列の最適アラインメントは、Smith and Waterm
an, Ad. App. Math 2: 482 (1981)の局所相同性アルゴリズムによって、Neddlem
an and Wunsch, J. Mol. Biol. 48 : 443 (1970)の相同性アラインメントアルゴ
リズムによって、Pearson and Lipman, Proc. Natl. Acad. Sci. (U. S. A.) 85
: 2444 (1988)の類似性法の検索によって、これらのアルゴリズムのコンピュー
タによる履行(the Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer
Group (GCG), 575 Science Dr., Madison, WI中のGAP, BESTFIT, FASTA, and TF
ASTA)によって、又は可視検査によって、行うことができる。
【0026】
「同一度」は、比較ウインドウ上で2つの最適にアラインされた配列を比較す
ることによって決定する。そこでは、比較ウインドウ中のペプチド又はポリヌク
レオチド配列の部分は、2つの配列の最適アラインメントのために、レファレン
ス配列(付加又は欠失を含まない)と比べて、付加又は欠失を含み得る。両方の
配列で同一のアミノ酸残基又は核酸塩基が存在する位置の数を測定し、マッチし
た位置の数を得、そのマッチした位置の数を、比較ウインドウ中の位置の全数で
割り、結果を100倍して、配列同一性のパーセンテージを得ることによって、
パーセンテージは計算される。 上記配列同一性の定義は、当業者が使用するであろう定義である。定義はそれ
自身は、如何なるアルゴリズムの助けを必要としない。アルゴリズムは、配列同
一性の計算よりも、配列の最適アラインメントを達成するためにのみ助けとなる
。 上記定義から、2つの比較した配列間で配列同一性のための良く規定された、
唯一の値(その値は、最良又は最適のアラインメントで得られた値に対応する)
が存在するということが導かれる。
ることによって決定する。そこでは、比較ウインドウ中のペプチド又はポリヌク
レオチド配列の部分は、2つの配列の最適アラインメントのために、レファレン
ス配列(付加又は欠失を含まない)と比べて、付加又は欠失を含み得る。両方の
配列で同一のアミノ酸残基又は核酸塩基が存在する位置の数を測定し、マッチし
た位置の数を得、そのマッチした位置の数を、比較ウインドウ中の位置の全数で
割り、結果を100倍して、配列同一性のパーセンテージを得ることによって、
パーセンテージは計算される。 上記配列同一性の定義は、当業者が使用するであろう定義である。定義はそれ
自身は、如何なるアルゴリズムの助けを必要としない。アルゴリズムは、配列同
一性の計算よりも、配列の最適アラインメントを達成するためにのみ助けとなる
。 上記定義から、2つの比較した配列間で配列同一性のための良く規定された、
唯一の値(その値は、最良又は最適のアラインメントで得られた値に対応する)
が存在するということが導かれる。
【0027】
BLAST N又はBLAST Pにおける、「BLAST 2配列」(Tatu
sova ら,“Blast 2配列−タンパク質及びヌクレオチド配列を比較する為
の新規道具”, FEMS Microbiol. Lett. 174: 247-250)ソフトウエア、これはウ
エブサイトhttp://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/bl2.htmlで利用でき、2つの配
列間の同一性を比較し、決定するために、本発明者らによって、そして一般的に
当業者によって慣習的に使用される。比較されるべき配列の性質と長さに関し選
択された置換マトリックスに依存する「オープン・ギャップ・ペナルティ」及び
「エクステンション・ギャップ・ペナルティ」は、該ソフトウエアによって直接
的に選択される(即ち、置換マトリックスBLOSUM−62の場合にそれぞれ
「5」及び「2」)。比較されるべき2つの配列間の同一性パーセンテージは、
該ソフトウエアによって直接的に計算される。
sova ら,“Blast 2配列−タンパク質及びヌクレオチド配列を比較する為
の新規道具”, FEMS Microbiol. Lett. 174: 247-250)ソフトウエア、これはウ
エブサイトhttp://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/bl2.htmlで利用でき、2つの配
列間の同一性を比較し、決定するために、本発明者らによって、そして一般的に
当業者によって慣習的に使用される。比較されるべき配列の性質と長さに関し選
択された置換マトリックスに依存する「オープン・ギャップ・ペナルティ」及び
「エクステンション・ギャップ・ペナルティ」は、該ソフトウエアによって直接
的に選択される(即ち、置換マトリックスBLOSUM−62の場合にそれぞれ
「5」及び「2」)。比較されるべき2つの配列間の同一性パーセンテージは、
該ソフトウエアによって直接的に計算される。
【0028】
本発明によれば、核酸配列のフラグメントは、核酸配列の検出、同定又は増幅
の方法においてプローブ又はプライマーとして使用できる。これらのフラグメン
トは、最小サイズ10塩基を有し、少なくとも20塩基、好ましくは25や30
塩基のフラグメントが好適であろう。 プライマー又はプローブとして使用できる核酸配列であって、本発明の配列で
あることを特徴とする核酸配列はまた、本発明の一部を形成する。 本発明は、本発明のヌクレオチド配列から演繹でき、特に、PCR法等の増幅
方法、あるいは関連の方法を用いて、本発明のヌクレオチド配列、特に代替配列
を検出するのを可能としうる全てのプライマーに関する。
の方法においてプローブ又はプライマーとして使用できる。これらのフラグメン
トは、最小サイズ10塩基を有し、少なくとも20塩基、好ましくは25や30
塩基のフラグメントが好適であろう。 プライマー又はプローブとして使用できる核酸配列であって、本発明の配列で
あることを特徴とする核酸配列はまた、本発明の一部を形成する。 本発明は、本発明のヌクレオチド配列から演繹でき、特に、PCR法等の増幅
方法、あるいは関連の方法を用いて、本発明のヌクレオチド配列、特に代替配列
を検出するのを可能としうる全てのプライマーに関する。
【0029】
本発明は、本発明のヌクレオチド配列、特にそれらとハイブリダイズできる配
列から演繹でき、本発明のヌクレオチド配列を検出するのを、特に正常配列と代
替配列間を識別することを可能としうる全てのプローブに関する。 本発明の全てのプローブ及びプライマーは、検出可能な、及び/又は定量可能
なシグナルを得るために、当業者周知の方法によって標識されていてもよい。
列から演繹でき、本発明のヌクレオチド配列を検出するのを、特に正常配列と代
替配列間を識別することを可能としうる全てのプローブに関する。 本発明の全てのプローブ及びプライマーは、検出可能な、及び/又は定量可能
なシグナルを得るために、当業者周知の方法によって標識されていてもよい。
【0030】
本発明は、勿論、DNA配列とRNA配列の両方、並びにそれらとハイブリダ
イズする配列に関する。 それ故、本発明は、プライマー又はプローブとして、本発明の単離された核酸
配列に関する。 好適な実施態様では、本発明は、配列番号16〜105の配列からなる群から
選択されることを特徴とする、本発明の単離された核酸配列に関する。 別の局面では、本発明は、センス又はアンチ−センスオリゴヌクレオチドとし
て使用できる核酸配列であって、その配列は、本発明の配列から選択されること
を特徴とする核酸配列を含む。
イズする配列に関する。 それ故、本発明は、プライマー又はプローブとして、本発明の単離された核酸
配列に関する。 好適な実施態様では、本発明は、配列番号16〜105の配列からなる群から
選択されることを特徴とする、本発明の単離された核酸配列に関する。 別の局面では、本発明は、センス又はアンチ−センスオリゴヌクレオチドとし
て使用できる核酸配列であって、その配列は、本発明の配列から選択されること
を特徴とする核酸配列を含む。
【0031】
所定の核酸フラグメントのうち、特に、アンチ−センスオリゴヌクレオチド(
即ち、その構造が、標的配列とのハイブリダイゼーションによって、対応する産
物の発現の阻害を確実にする)を記載すべきである。対応する産物の発現の制御
にかかわるタンパク質との相互作用によって、この発現の阻害又は活性化を誘導
するであろうセンスオリゴヌクレオチドも言及すべきである。
即ち、その構造が、標的配列とのハイブリダイゼーションによって、対応する産
物の発現の阻害を確実にする)を記載すべきである。対応する産物の発現の制御
にかかわるタンパク質との相互作用によって、この発現の阻害又は活性化を誘導
するであろうセンスオリゴヌクレオチドも言及すべきである。
【0032】
本発明の核酸配列から得られ得ることを特徴とする、EIF2AK3遺伝子の
プロモーター及び/又はレギュレーターの核酸配列、又はそれらのアレル変異体
の1つ、又はそれらのフラグメントの1つも、本発明に含まれる。 EIF2AK3遺伝子のプロモーター及び/又は制御配列に関与し得る、対応
するタンパク質の発現、特に、それらの発現レベルに影響し得る変異を有する配
列もまた、本発明の先行する配列の一部を形成する。
プロモーター及び/又はレギュレーターの核酸配列、又はそれらのアレル変異体
の1つ、又はそれらのフラグメントの1つも、本発明に含まれる。 EIF2AK3遺伝子のプロモーター及び/又は制御配列に関与し得る、対応
するタンパク質の発現、特に、それらの発現レベルに影響し得る変異を有する配
列もまた、本発明の先行する配列の一部を形成する。
【0033】
EIF2AK3遺伝子のゲノム配列を用いて、ヒト被験者の集団、より詳細に
は、上記病変に罹患しているか、又はその危険性のある患者の集団中で、それら
のプロモーター及び/又はレギュレーター中に存在する多型を同定することが実
際に可能である。 これらの配列番号3〜15の配列中、非コードドメインに対応する配列番号3
の配列は、EIF2AK3遺伝子のプロモーター及び/またはレギュレーター配
列をコードする配列を含む。該配列又はその活性フラグメントは、それらのプロ
モーター及び/又はレギュレーター、並びにその多型を同定するために特に興味
深い。該プロモーター及び/又はレギュレーターはまた、膵臓β−細胞等の、E
IF2AK3遺伝子が天然に発現されている細胞で、EIF2AK3ポリペプチ
ド、又はその変異体、又は異種タンパク質の発現をターゲッティングするために
使用できる。
は、上記病変に罹患しているか、又はその危険性のある患者の集団中で、それら
のプロモーター及び/又はレギュレーター中に存在する多型を同定することが実
際に可能である。 これらの配列番号3〜15の配列中、非コードドメインに対応する配列番号3
の配列は、EIF2AK3遺伝子のプロモーター及び/またはレギュレーター配
列をコードする配列を含む。該配列又はその活性フラグメントは、それらのプロ
モーター及び/又はレギュレーター、並びにその多型を同定するために特に興味
深い。該プロモーター及び/又はレギュレーターはまた、膵臓β−細胞等の、E
IF2AK3遺伝子が天然に発現されている細胞で、EIF2AK3ポリペプチ
ド、又はその変異体、又は異種タンパク質の発現をターゲッティングするために
使用できる。
【0034】
特に診断のためには、目的とし得る核酸フラグメントのうち、例えば、EIF
2AK3遺伝子のゲノムイントロン配列、例えば、特に正常な代替配列あるいは
WRSを有する危険性又は糖尿病及び/又はWRS関連病変(の発症及び/又は
進行)を有する危険性に影響を与える代替配列の、イントロンとエキソンとの間
の結合配列を言及すべきである。
2AK3遺伝子のゲノムイントロン配列、例えば、特に正常な代替配列あるいは
WRSを有する危険性又は糖尿病及び/又はWRS関連病変(の発症及び/又は
進行)を有する危険性に影響を与える代替配列の、イントロンとエキソンとの間
の結合配列を言及すべきである。
【0035】
本発明はまた、本発明の核酸配列を含むクローニング及び/又は発現ベクター
を含む。 宿主細胞で該配列の発現及び/又は分泌を可能とする要素を含むことを特徴と
する、本発明のベクターはまた、本発明の一部を形成する。 該ベクターは好ましくは、プロモーター、翻訳開始シグナル及び翻訳終結シグ
ナル、並びに転写制御のための適当な領域を含むであろう。それらは、細胞内で
安定に維持されなければならないし、それらは、場合によっては、翻訳タンパク
質の分泌を特定化する特別のシグナルを有し得る。 これらの異なる制御シグナルは、使用する細胞宿主に基づき選択される。この
目的のために、本発明の核酸配列は、選択された宿主内の自律複製ベクター、又
は選択された宿主のインテグレイティブベクターに挿入され得る。
を含む。 宿主細胞で該配列の発現及び/又は分泌を可能とする要素を含むことを特徴と
する、本発明のベクターはまた、本発明の一部を形成する。 該ベクターは好ましくは、プロモーター、翻訳開始シグナル及び翻訳終結シグ
ナル、並びに転写制御のための適当な領域を含むであろう。それらは、細胞内で
安定に維持されなければならないし、それらは、場合によっては、翻訳タンパク
質の分泌を特定化する特別のシグナルを有し得る。 これらの異なる制御シグナルは、使用する細胞宿主に基づき選択される。この
目的のために、本発明の核酸配列は、選択された宿主内の自律複製ベクター、又
は選択された宿主のインテグレイティブベクターに挿入され得る。
【0036】
自律複製系のうち、好ましくは宿主細胞に応じて、プラスミド又はウイルスタ
イプの系が用いられるであろう。ウイルスベクターは、特に、アデノウイルス、
レトロウイルス、ポックスウイルス又はヘルペスウイルスであり得る。当業者は
、これらの系の各々を使用できる技術を知っている。 宿主細胞の染色体への配列の組み込みが所望される場合には、例えば、プラス
ミド又はウイルスタイプの系が使用できるであろう。このようなウイルスは、例
えば、レトロウイルスであろう。 このようなベクターは、当業者によって通常使用される方法に基づき、製造さ
れよう。それから生じるクローンは、例えば、リポフェクション、エレクトロポ
レーション又は熱ショック等の標準的な方法によって適当な宿主に導入され得る
。
イプの系が用いられるであろう。ウイルスベクターは、特に、アデノウイルス、
レトロウイルス、ポックスウイルス又はヘルペスウイルスであり得る。当業者は
、これらの系の各々を使用できる技術を知っている。 宿主細胞の染色体への配列の組み込みが所望される場合には、例えば、プラス
ミド又はウイルスタイプの系が使用できるであろう。このようなウイルスは、例
えば、レトロウイルスであろう。 このようなベクターは、当業者によって通常使用される方法に基づき、製造さ
れよう。それから生じるクローンは、例えば、リポフェクション、エレクトロポ
レーション又は熱ショック等の標準的な方法によって適当な宿主に導入され得る
。
【0037】
本発明は更に、宿主細胞、特に、本発明のベクターによって形質転換された真
核細胞及び原核細胞、並びに、本発明の形質転換細胞の1つを含む、ヒトを除く
哺乳動物を含む。 これらの目的のために使用できる細胞のうち、勿論、細菌細胞だけでなく、酵
母細胞、動物細胞、特に、哺乳動物細胞培養物、そして特にチャイニーズハムス
ター卵巣細胞(CHO)、更に、昆虫細胞(バキュロウイルスを用いる方法を用
いることが可能、例えば、Sf9細胞)を言及することができる。
核細胞及び原核細胞、並びに、本発明の形質転換細胞の1つを含む、ヒトを除く
哺乳動物を含む。 これらの目的のために使用できる細胞のうち、勿論、細菌細胞だけでなく、酵
母細胞、動物細胞、特に、哺乳動物細胞培養物、そして特にチャイニーズハムス
ター卵巣細胞(CHO)、更に、昆虫細胞(バキュロウイルスを用いる方法を用
いることが可能、例えば、Sf9細胞)を言及することができる。
【0038】
本発明の哺乳動物のうち、本発明のポリペプチド、正常若しくは変異型EIF
2AK3、特にヒト起源の代替物に対応する表現型を発現するマウス、ラット又
はウサギ等の動物が好適であろう。
2AK3、特にヒト起源の代替物に対応する表現型を発現するマウス、ラット又
はウサギ等の動物が好適であろう。
【0039】
より特別に関心のある動物モデルには、特に、
−EIF2AK3遺伝子の発現に欠損を示すトランスジェニック動物。それらは
、胚性幹細胞における相同組換え、これらの幹細胞の胚への移入、生殖系のレベ
ルで影響を受けたキメラの選択、及び該キメラの生育によって得られる; −マウス及び/又はヒト起源のEIF2AK3遺伝子アレル変異体の1つ以上を
過剰発現するトランスジェニックマウス。該マウスは、普遍的性質、又は組織の
タイプ、好ましくは膵臓器官、に選択的な強いプロモーターの制御下に、EIF
2AK3遺伝子アレル変異体の複数コピーのトランスフェクションによって得ら
れる; −LOXP/CREリコンビナーゼ系、又は動物の正確な年齢で遺伝子の発現を
不活化する任意の他の系を用いて不活化することによって、EIF2AK3遺伝
子部分が欠損したトランスジェニック動物; −ウイルス転写又は遺伝子治療後、EIF2AK3遺伝子を過剰発現する動物(
好ましくは、ラット、ウサギ、マウス); がある。
、胚性幹細胞における相同組換え、これらの幹細胞の胚への移入、生殖系のレベ
ルで影響を受けたキメラの選択、及び該キメラの生育によって得られる; −マウス及び/又はヒト起源のEIF2AK3遺伝子アレル変異体の1つ以上を
過剰発現するトランスジェニックマウス。該マウスは、普遍的性質、又は組織の
タイプ、好ましくは膵臓器官、に選択的な強いプロモーターの制御下に、EIF
2AK3遺伝子アレル変異体の複数コピーのトランスフェクションによって得ら
れる; −LOXP/CREリコンビナーゼ系、又は動物の正確な年齢で遺伝子の発現を
不活化する任意の他の系を用いて不活化することによって、EIF2AK3遺伝
子部分が欠損したトランスジェニック動物; −ウイルス転写又は遺伝子治療後、EIF2AK3遺伝子を過剰発現する動物(
好ましくは、ラット、ウサギ、マウス); がある。
【0040】
本発明はまた、組換え又は合成ポリペプチドの製造のための本発明の核酸配列
の使用に関する。 化学合成によって得られ、組換えポリペプチドに対応する非天然アミノ酸を含
み得るポリペプチドもまた、本発明に含まれる。 これらのポリペプチドは、当業者公知の組換えポリペプチドの製造のための技
術に従い、上記核酸配列から製造できる。この場合、使用する核酸配列は、細胞
宿主でその発現を可能とするシグナルの制御下に置かれる。 組換えポリペプチドの製造の有効な系は、本発明のベクターと本発明の宿主細
胞とを有することを必要とする。 これらの細胞は、上記ベクターに挿入された核酸配列を宿主細胞に導入し、次
いで、トランスフェクトされたヌクレオチド配列の複製及び/又は発現を可能と
する条件下で該細胞を培養することによって得られ得る。
の使用に関する。 化学合成によって得られ、組換えポリペプチドに対応する非天然アミノ酸を含
み得るポリペプチドもまた、本発明に含まれる。 これらのポリペプチドは、当業者公知の組換えポリペプチドの製造のための技
術に従い、上記核酸配列から製造できる。この場合、使用する核酸配列は、細胞
宿主でその発現を可能とするシグナルの制御下に置かれる。 組換えポリペプチドの製造の有効な系は、本発明のベクターと本発明の宿主細
胞とを有することを必要とする。 これらの細胞は、上記ベクターに挿入された核酸配列を宿主細胞に導入し、次
いで、トランスフェクトされたヌクレオチド配列の複製及び/又は発現を可能と
する条件下で該細胞を培養することによって得られ得る。
【0041】
これらの細胞は、本発明の組換えポリペプチドの製造方法で使用でき、また、
分析とスクリーニングのためのモデルとして役立ち得る。 組換え形態の本発明のポリペプチドの製造方法はそれ自体本発明に含まれるが
、本発明の核酸配列の組換えポリペプチドの発現を可能とする条件下、形質転換
細胞を培養し、該組換えポリペプチドを回収することを特徴とする。
分析とスクリーニングのためのモデルとして役立ち得る。 組換え形態の本発明のポリペプチドの製造方法はそれ自体本発明に含まれるが
、本発明の核酸配列の組換えポリペプチドの発現を可能とする条件下、形質転換
細胞を培養し、該組換えポリペプチドを回収することを特徴とする。
【0042】
本発明のポリペプチドを特異的に認識し得ることを特徴とする、モノ−若しく
はポリクローナル抗体若しくはそのフラグメント、キメラ抗体、又はイムノコン
ジュゲート抗体もまた、本発明の一部を形成する。 特異的ポリクローナル抗体は、本発明の変異型ポリペプチド、特に、正常アミ
ノ酸配列と比較して代替的である本発明の変異型ポリペプチド(該変異型ポリペ
プチドは、通常の方法に従い遺伝子組換え又はペプチド合成によって、本発明の
核酸配列から製造できる)に対し免疫化した動物の血清から得られる。 本発明の、特に関心のある、ある種の変異型ポリペプチド又はそのフラグメン
トを特異的に認識する抗体の有利性は、特に注目しうる。 特定のモノクローナル抗体は、通常のハイブリドーマ培養方法によって得られ
れ得る。 本発明の抗体は、例えば、キメラ抗体、ヒト化抗体、Fab又はF(ab´)
2フラグメントである。それらはまた、検出可能な、及び/又は定量可能なシグ
ナルを得るように、イムノコンジュゲート又は標識化された抗体の形態であり得
る。
はポリクローナル抗体若しくはそのフラグメント、キメラ抗体、又はイムノコン
ジュゲート抗体もまた、本発明の一部を形成する。 特異的ポリクローナル抗体は、本発明の変異型ポリペプチド、特に、正常アミ
ノ酸配列と比較して代替的である本発明の変異型ポリペプチド(該変異型ポリペ
プチドは、通常の方法に従い遺伝子組換え又はペプチド合成によって、本発明の
核酸配列から製造できる)に対し免疫化した動物の血清から得られる。 本発明の、特に関心のある、ある種の変異型ポリペプチド又はそのフラグメン
トを特異的に認識する抗体の有利性は、特に注目しうる。 特定のモノクローナル抗体は、通常のハイブリドーマ培養方法によって得られ
れ得る。 本発明の抗体は、例えば、キメラ抗体、ヒト化抗体、Fab又はF(ab´)
2フラグメントである。それらはまた、検出可能な、及び/又は定量可能なシグ
ナルを得るように、イムノコンジュゲート又は標識化された抗体の形態であり得
る。
【0043】
本発明はまた、本発明の変異型ポリペプチドの検出及び/又は精製の方法であ
って、本発明の抗体を用いることを特徴とする方法に関する。 更に、本発明の抗体、特にモノクローナル抗体はまた、生体試料中のこれらの
ポリペプチドの検出のために使用できる。 このように、それらは、例えば、免疫蛍光法、金標識、酵素的イムノコンジュ
ゲートによって、特定の組織切片上で該変異型EIF2AK3ポリペプチドの発
現の免疫細胞化学的又は免疫組織化学的分析のための手段を構成する。 それらは、特に、生物組織若しくはサンプル中でこれらのポリペプチドの異常
な発現を検出することを可能にし、そのことは、EIF2AK3ポリペプチドの
異常発現の検出のために、又は糖尿病及び/又はWRS関連病変の予防方法若し
くは治療方法の進歩をモニターするために、それらを有用なものとする。
って、本発明の抗体を用いることを特徴とする方法に関する。 更に、本発明の抗体、特にモノクローナル抗体はまた、生体試料中のこれらの
ポリペプチドの検出のために使用できる。 このように、それらは、例えば、免疫蛍光法、金標識、酵素的イムノコンジュ
ゲートによって、特定の組織切片上で該変異型EIF2AK3ポリペプチドの発
現の免疫細胞化学的又は免疫組織化学的分析のための手段を構成する。 それらは、特に、生物組織若しくはサンプル中でこれらのポリペプチドの異常
な発現を検出することを可能にし、そのことは、EIF2AK3ポリペプチドの
異常発現の検出のために、又は糖尿病及び/又はWRS関連病変の予防方法若し
くは治療方法の進歩をモニターするために、それらを有用なものとする。
【0044】
アレル変異性(例えば、ヌクレオチドの欠失、置換、及び/又は付加といった
EIF2AK3遺伝子変異の存在)、ヘテロ接合性の喪失、あるいは遺伝子異常
の決定方法であって、本発明の核酸配列を使用することを特徴とする方法もまた
本発明の一部を形成する。
EIF2AK3遺伝子変異の存在)、ヘテロ接合性の喪失、あるいは遺伝子異常
の決定方法であって、本発明の核酸配列を使用することを特徴とする方法もまた
本発明の一部を形成する。
【0045】
本発明の方法による、試験する被験対象でのアレル変異性、ヘテロ接合性の喪
失又は遺伝子異常の決定により、例えば、被験対象の配列を、糖尿病及び/又は
WRS関連病変の発症若しくは進行の危険性の減少若しくは増大を示さない被験
者のEIF2AK3遺伝子配列と比較することによって、あるいは、被験対象が
、WRSを有することが知られている被験者、又は糖尿病及び/又はWRS関連
病変を有する危険性が減少若しくは増大していることが知られている被験者との
アレル同一性を示すか、示さないかを決定することにより、糖尿病及び/又はW
RS関連病変の病的素因と関連した、又は糖尿病及び/又はWRS関連病変の発
症若しくは進行の危険性に対する抵抗性若しくは防御性と関連した、1つのアレ
ル若しくは各々のアレルに存在するEIF2AK3遺伝子の代替配列を示す被験
者の同定が可能となるであろう。
失又は遺伝子異常の決定により、例えば、被験対象の配列を、糖尿病及び/又は
WRS関連病変の発症若しくは進行の危険性の減少若しくは増大を示さない被験
者のEIF2AK3遺伝子配列と比較することによって、あるいは、被験対象が
、WRSを有することが知られている被験者、又は糖尿病及び/又はWRS関連
病変を有する危険性が減少若しくは増大していることが知られている被験者との
アレル同一性を示すか、示さないかを決定することにより、糖尿病及び/又はW
RS関連病変の病的素因と関連した、又は糖尿病及び/又はWRS関連病変の発
症若しくは進行の危険性に対する抵抗性若しくは防御性と関連した、1つのアレ
ル若しくは各々のアレルに存在するEIF2AK3遺伝子の代替配列を示す被験
者の同定が可能となるであろう。
【0046】
これらの診断方法は、例えば、患者からの生体試料中に、上記配列の1つにお
ける変異の存在を測定することによって、WRSを有する危険性の出生前若しく
は産後診断の方法、あるいは例えば、EIF2AF3タンパク質の発現における
異常と関連した、糖尿病及び/又はWRS関連病変の病的素因の診断方法、又は
糖尿病及び/又はWRS関連病変に対する抵抗性若しくは防御性の診断方法に関
する。分析される核酸配列は、ゲノムDNA、cDNA又はmRNAのいずれか
であり得る。
ける変異の存在を測定することによって、WRSを有する危険性の出生前若しく
は産後診断の方法、あるいは例えば、EIF2AF3タンパク質の発現における
異常と関連した、糖尿病及び/又はWRS関連病変の病的素因の診断方法、又は
糖尿病及び/又はWRS関連病変に対する抵抗性若しくは防御性の診断方法に関
する。分析される核酸配列は、ゲノムDNA、cDNA又はmRNAのいずれか
であり得る。
【0047】
本発明に基づく核酸ツールはまた、隔離された患者における陽性診断及び鑑別
診断を可能とし得る。ツールは好ましくは、危険性のある被験者、特に家族歴の
ある被験者における兆候前診断のために使用されよう。出生前診断又は新生児診
断に対処することも可能である。
診断を可能とし得る。ツールは好ましくは、危険性のある被験者、特に家族歴の
ある被験者における兆候前診断のために使用されよう。出生前診断又は新生児診
断に対処することも可能である。
【0048】
更に、特異的変異の検出は、発展的な診断(evolutive diagnosis)、特に、病
変の強さ又はその出現の可能性ある期間に関する発展診断を可能とし得る。
変の強さ又はその出現の可能性ある期間に関する発展診断を可能とし得る。
【0049】
天然遺伝子と比較して遺伝子における変異の検出を可能とする方法は、勿論、
非常に多数ある。それらは、基本的に2つの大きなカテゴリーに分類され得る。
第1のタイプの方法は、変異の存在が、代替配列を、対応する正常な配列と比較
することによって検出されるものであり、第2のタイプは、変異が存在すること
によるミスマッチという証拠によって、間接的に検出されるというものである。
非常に多数ある。それらは、基本的に2つの大きなカテゴリーに分類され得る。
第1のタイプの方法は、変異の存在が、代替配列を、対応する正常な配列と比較
することによって検出されるものであり、第2のタイプは、変異が存在すること
によるミスマッチという証拠によって、間接的に検出されるというものである。
【0050】
アレル変異性、ヘテロ接合性の喪失、又は遺伝子異常(例えば変異)を決定す
る方法のうち、本発明のヌクレオチド配列の1対のプライマーを用いて、異常を
示しそうである、本発明の標的配列の、いわゆるPCR(ポリメラーゼ・チェー
ン・リアクション)又はPCR様増幅の少なくとも1ステージを含む方法が好適
である。標的産物の検出又はアッセイを行う前に、適当な制限酵素を用いて、増
幅産物を処理してもよい。
る方法のうち、本発明のヌクレオチド配列の1対のプライマーを用いて、異常を
示しそうである、本発明の標的配列の、いわゆるPCR(ポリメラーゼ・チェー
ン・リアクション)又はPCR様増幅の少なくとも1ステージを含む方法が好適
である。標的産物の検出又はアッセイを行う前に、適当な制限酵素を用いて、増
幅産物を処理してもよい。
【0051】
PCR様とは、核酸配列の直接的若しくは間接的再生を用いる全ての方法、又
は代替的に標識化システムが増幅された全ての方法を意味するように理解されよ
う。これらの方法は勿論、公知であり、一般的に、ポリメラーゼによるDNAの
増幅を含む;もとの試料がRNAのとき、前もって逆転写を行うことが勧められ
る。現在、この増幅を可能とする多数の方法、例えば、いわゆるNASBA“核
酸配列に基礎をおいた増幅(Nucleic Acid Sequence Based Amplification)”、
TAS“転写に基礎をおいた増幅システム(Transcription based Amplification
System)”、LCR“リガーゼ・チェーン・リアクション”、“エンド・ラン・
増幅”(ERA)、“サイクリング・プローブ・リアクション”(CPR)、及
びSDA“ストランド・置換増幅(Strand Displacement Amplification”が存在
し、方法は当業者周知である。
は代替的に標識化システムが増幅された全ての方法を意味するように理解されよ
う。これらの方法は勿論、公知であり、一般的に、ポリメラーゼによるDNAの
増幅を含む;もとの試料がRNAのとき、前もって逆転写を行うことが勧められ
る。現在、この増幅を可能とする多数の方法、例えば、いわゆるNASBA“核
酸配列に基礎をおいた増幅(Nucleic Acid Sequence Based Amplification)”、
TAS“転写に基礎をおいた増幅システム(Transcription based Amplification
System)”、LCR“リガーゼ・チェーン・リアクション”、“エンド・ラン・
増幅”(ERA)、“サイクリング・プローブ・リアクション”(CPR)、及
びSDA“ストランド・置換増幅(Strand Displacement Amplification”が存在
し、方法は当業者周知である。
【0052】
EIF2AK3遺伝子の変異は、それらの産物の種々の修飾の原因でありうる
。修飾は、診断アプローチのために使用できる。実際、抗原性の修飾は、特異的
抗体の開発を可能としうる。異なる産物間の識別は、これらの方法によって達成
できる。例えば、RIA若しくはELISAを用いて、EIF2AK3ポリペプ
チド変異体を特異的に認識できるモノ−若しくはポリクローナル抗体の使用に基
づく幾つかの周知の方法による診断アプローチで、これらの全ての修飾は用いる
ことができる。
。修飾は、診断アプローチのために使用できる。実際、抗原性の修飾は、特異的
抗体の開発を可能としうる。異なる産物間の識別は、これらの方法によって達成
できる。例えば、RIA若しくはELISAを用いて、EIF2AK3ポリペプ
チド変異体を特異的に認識できるモノ−若しくはポリクローナル抗体の使用に基
づく幾つかの周知の方法による診断アプローチで、これらの全ての修飾は用いる
ことができる。
【0053】
このように、本発明は、糖尿病及び/又はWRS関連病変、又は配列番号2の
配列を有するポリペプチドの異常発現と関連した病変の診断方法であって、本発
明の1つ以上の抗体を、試験する生物材料とを、該ポリペプチドと抗体の特異的
免疫複合体の可能性ある形成を可能とする条件下で接触させ、形成される可能性
のある免疫複合体を検出することを特徴とする方法に関する。
配列を有するポリペプチドの異常発現と関連した病変の診断方法であって、本発
明の1つ以上の抗体を、試験する生物材料とを、該ポリペプチドと抗体の特異的
免疫複合体の可能性ある形成を可能とする条件下で接触させ、形成される可能性
のある免疫複合体を検出することを特徴とする方法に関する。
【0054】
本発明は更に、被験者が、糖尿病及び/又はWRS関連病変を有する危険性の
減少若しくは増大にあるかどうかの決定方法であって、 a)被験者からゲノムDNA又はRNAを含む生体試料を集めること; b)タンパク質EIF2AK3をコードする少なくとも1つの遺伝子アレル又は
RNAで、糖尿病及び/又はWRS関連病変を有する危険性の減少又は増大に関
連した多型を含む可能性のあるDNA又はRNAのフラグメントの配列、又はそ
の長さを決定すること(ここで、フラグメントは、本発明の1セットのプライマ
ーを用いるポリメラーゼ・チェーン・リアクションで増幅できる): c)DNA又はRNAのフラグメントの配列が、糖尿病及び/又はWRS関連病
変を有する危険性の減少又は増大に関連した多型を含むかどうかを観察すること
によって、被験者が、糖尿病及び/又はWRS関連病変を有する危険性の減少又
は増大にあるかどうかを観察すること(ここで、該多型の存在は、被験者が糖尿
病及び/又はWRS関連病変を有する危険性の減少又は増大にあることを示す)
; のステップを含む方法に関する。
減少若しくは増大にあるかどうかの決定方法であって、 a)被験者からゲノムDNA又はRNAを含む生体試料を集めること; b)タンパク質EIF2AK3をコードする少なくとも1つの遺伝子アレル又は
RNAで、糖尿病及び/又はWRS関連病変を有する危険性の減少又は増大に関
連した多型を含む可能性のあるDNA又はRNAのフラグメントの配列、又はそ
の長さを決定すること(ここで、フラグメントは、本発明の1セットのプライマ
ーを用いるポリメラーゼ・チェーン・リアクションで増幅できる): c)DNA又はRNAのフラグメントの配列が、糖尿病及び/又はWRS関連病
変を有する危険性の減少又は増大に関連した多型を含むかどうかを観察すること
によって、被験者が、糖尿病及び/又はWRS関連病変を有する危険性の減少又
は増大にあるかどうかを観察すること(ここで、該多型の存在は、被験者が糖尿
病及び/又はWRS関連病変を有する危険性の減少又は増大にあることを示す)
; のステップを含む方法に関する。
【0055】
好適な実施態様において、本発明の方法は、被験者が、糖尿病及び/又はWR
S関連病変を有する危険性の増大にあるかどうかの決定方法に関する。
S関連病変を有する危険性の増大にあるかどうかの決定方法に関する。
【0056】
本発明は更に、そのファミリーの1員がWRSに罹患している被験者がWRS
を有する危険性があるかどうかを決定する為のインビトロ方法(好ましくは、出
生前又は新生児において)であって、 a)被験者からゲノムDNA又はRNAを含む生体試料を集めること; b)EIF2AK3遺伝子の両方のアレルの配列で、WRSを有する危険性に関
連した多型を含む可能性のあるDNA又はRNAのフラグメントの配列、又はそ
の長さを決定すること(ここで、フラグメントは、本発明の1セットのプライマ
ーを用いるポリメラーゼ・チェーン・リアクションで増幅できる); c)両方のアレルで、DNA又はRNAのフラグメントの配列がWRSを有する
危険性に関連した変異を持っているかどうかを観察することによって、被験者が
WRSを有する危険性があるかどうかを観察すること(ここで、該多型の存在は
、被験者がWRSを有する危険性があることを示す); のステップを含む方法に関する。
を有する危険性があるかどうかを決定する為のインビトロ方法(好ましくは、出
生前又は新生児において)であって、 a)被験者からゲノムDNA又はRNAを含む生体試料を集めること; b)EIF2AK3遺伝子の両方のアレルの配列で、WRSを有する危険性に関
連した多型を含む可能性のあるDNA又はRNAのフラグメントの配列、又はそ
の長さを決定すること(ここで、フラグメントは、本発明の1セットのプライマ
ーを用いるポリメラーゼ・チェーン・リアクションで増幅できる); c)両方のアレルで、DNA又はRNAのフラグメントの配列がWRSを有する
危険性に関連した変異を持っているかどうかを観察することによって、被験者が
WRSを有する危険性があるかどうかを観察すること(ここで、該多型の存在は
、被験者がWRSを有する危険性があることを示す); のステップを含む方法に関する。
【0057】
本発明は更に、WRSを有する危険性の診断(好ましくは、出生前又は新生児
において)のための本発明に従うインビトロ方法であって、 ステップb)でWRSを有する危険性に関連した多型が、配列番号1の配列中、
位置1103でのTの挿入又は位置1832でのGからAへのトランジッション
に対応する変異の存在であること(ここで、被験者のEIF2AK3遺伝子アレ
ルの各々での変異の存在は、被験者がWRSを有する危険性があることを示す)
を特徴とする方法に関する。
において)のための本発明に従うインビトロ方法であって、 ステップb)でWRSを有する危険性に関連した多型が、配列番号1の配列中、
位置1103でのTの挿入又は位置1832でのGからAへのトランジッション
に対応する変異の存在であること(ここで、被験者のEIF2AK3遺伝子アレ
ルの各々での変異の存在は、被験者がWRSを有する危険性があることを示す)
を特徴とする方法に関する。
【0058】
本発明は更に、そのファミリーの1員がWRSに罹患している被験者がWRS
を有する危険性があるかどうかを決定する為のインビトロ方法(好ましくは、出
生前又は新生児において)であって、 a)WRSに罹患しているファミリーの1員及び被験者からゲノムDNA又はR
NAを含む生体試料を集めること; b)WRSに罹患しているファミリーの1員及び被験者が、EIF2AK3遺伝
子の近く、又はその中に位置する多型マーカー(マイクロサテライトマーカー又
は単一ヌクレオチド多型(SNP))を比較することによってアレル同一性を示
すかどうかを決定すること(ここで、WRSに罹患しているファミリーの1員及
び被験者の間の遺伝子型同一性は、被験者がWRSを有する危険性があることを
示す); のステップを含む方法に関する。
を有する危険性があるかどうかを決定する為のインビトロ方法(好ましくは、出
生前又は新生児において)であって、 a)WRSに罹患しているファミリーの1員及び被験者からゲノムDNA又はR
NAを含む生体試料を集めること; b)WRSに罹患しているファミリーの1員及び被験者が、EIF2AK3遺伝
子の近く、又はその中に位置する多型マーカー(マイクロサテライトマーカー又
は単一ヌクレオチド多型(SNP))を比較することによってアレル同一性を示
すかどうかを決定すること(ここで、WRSに罹患しているファミリーの1員及
び被験者の間の遺伝子型同一性は、被験者がWRSを有する危険性があることを
示す); のステップを含む方法に関する。
【0059】
本発明は更に、そのファミリーの1員がWRSに罹患している被験者がWRS
を有する危険性があるかどうかの決定のインビトロ方法(好ましくは、出生前又
は新生児において)であって、 a)WRSに罹患しているファミリーの1員及び被験者からゲノムDNA又はR
NAを含む生体試料を集めること; b)ファミリーの1員の両方のEIF2AK3遺伝子アレル上で、WRSを有す
る危険性に関連する多型を含む可能性のあるDNA又はRNAのフラグメントの
配列を決定すること(ここで、フラグメントは、本発明の1セットのプライマー
を用いるポリメラーゼ・チェーン・リアクションで増幅できる); c)ステップb)で同定したWRS罹患の原因であるフラグメントの配列の変異
が、被験者の両方のEIF2AK3遺伝子アレルの同一のフラグメントに存在す
るかどうかを決定すること(ここで、フラグメントは、本発明の1セットのプラ
イマーを用いるポリメラーゼ・チェーン・リアクションで増幅できる); d)被験者の両方のEIF2AK3遺伝子アレル上のフラグメントの配列が、ス
テップb)で同定されたのと同一の変異を含むかどうかを観察すること(ここで
、両方のアレル上での変異の存在は、被験者がWRSを有する危険性があること
を示す); のステップを含む方法に関する。
を有する危険性があるかどうかの決定のインビトロ方法(好ましくは、出生前又
は新生児において)であって、 a)WRSに罹患しているファミリーの1員及び被験者からゲノムDNA又はR
NAを含む生体試料を集めること; b)ファミリーの1員の両方のEIF2AK3遺伝子アレル上で、WRSを有す
る危険性に関連する多型を含む可能性のあるDNA又はRNAのフラグメントの
配列を決定すること(ここで、フラグメントは、本発明の1セットのプライマー
を用いるポリメラーゼ・チェーン・リアクションで増幅できる); c)ステップb)で同定したWRS罹患の原因であるフラグメントの配列の変異
が、被験者の両方のEIF2AK3遺伝子アレルの同一のフラグメントに存在す
るかどうかを決定すること(ここで、フラグメントは、本発明の1セットのプラ
イマーを用いるポリメラーゼ・チェーン・リアクションで増幅できる); d)被験者の両方のEIF2AK3遺伝子アレル上のフラグメントの配列が、ス
テップb)で同定されたのと同一の変異を含むかどうかを観察すること(ここで
、両方のアレル上での変異の存在は、被験者がWRSを有する危険性があること
を示す); のステップを含む方法に関する。
【0060】
本発明は更に、ポリメラーゼ・チェーン・リアクション後、最終的に、逆転写
のステップの後に得られた増幅産物のサイズの決定及び/又は配列決定によって
、多型を含む可能性のあるDNA又はRNAのフラグメントの配列又はその長さ
がステップb)で得られる、本発明の方法に関する。
のステップの後に得られた増幅産物のサイズの決定及び/又は配列決定によって
、多型を含む可能性のあるDNA又はRNAのフラグメントの配列又はその長さ
がステップb)で得られる、本発明の方法に関する。
【0061】
本発明は更に、糖尿病及び/又はWRS関連病変を有する危険性の減少又は増
大に関連した少なくとも1つの付加マーカーのレベルについて、被験者からの生
体試料をアッセイする第2の方法を更に含むこと(ここで、少なくとも1つのマ
ーカーの有意なレベルの存在は、被験者が、糖尿病及び/又はWRS関連病変を
有する危険性の減少又は増大にあるかどうかを確認することを可能とする)を特
徴とする本発明の方法に関する。
大に関連した少なくとも1つの付加マーカーのレベルについて、被験者からの生
体試料をアッセイする第2の方法を更に含むこと(ここで、少なくとも1つのマ
ーカーの有意なレベルの存在は、被験者が、糖尿病及び/又はWRS関連病変を
有する危険性の減少又は増大にあるかどうかを確認することを可能とする)を特
徴とする本発明の方法に関する。
【0062】
好適な実施態様において、関連する該付加マーカーは、糖尿病及び/又はWR
S関連病変を有する危険性の増大と関連した付加マーカーである。
S関連病変を有する危険性の増大と関連した付加マーカーである。
【0063】
別の目的で、本発明は、被験者がWRSを有する危険性があるかどうかをイン
ビトロで決定する(好ましくは、出生前又は新生児において)為のキットであっ
て、 EIF2AK3遺伝子の近く、又はその中に位置する多型マーカー(マイクロサ
テライトマーカー又は単一ヌクレオチド多型(SNP))を含むゲノムDNAの
フラグメントを増幅できる少なくとも1対のプライマー、及び/又は該多型マー
カーを検出できる少なくとも1つのプローブを含む(ここで、好ましくは、少な
くとも1対のプライマー又は少なくとも1つのプローブは、本発明のプライマー
及びプローブから選択される)キットを含む。
ビトロで決定する(好ましくは、出生前又は新生児において)為のキットであっ
て、 EIF2AK3遺伝子の近く、又はその中に位置する多型マーカー(マイクロサ
テライトマーカー又は単一ヌクレオチド多型(SNP))を含むゲノムDNAの
フラグメントを増幅できる少なくとも1対のプライマー、及び/又は該多型マー
カーを検出できる少なくとも1つのプローブを含む(ここで、好ましくは、少な
くとも1対のプライマー又は少なくとも1つのプローブは、本発明のプライマー
及びプローブから選択される)キットを含む。
【0064】
本発明は更に、被験者がWRSを有する危険性があるかどうかをインビトロで
決定する(好ましくは、出生前又は新生児において)為のキットであって、 配列番号1の配列中の位置1103でTの挿入又は位置1832でGからAへの
トランジッションを含む可能性のあるEIF2AK3ゲノムDNAのフラグメン
トを増幅できる少なくとも1対のプライマーを含む(ここで、該プライマーは、
本発明のプライマーから選択される)キットに関する。
決定する(好ましくは、出生前又は新生児において)為のキットであって、 配列番号1の配列中の位置1103でTの挿入又は位置1832でGからAへの
トランジッションを含む可能性のあるEIF2AK3ゲノムDNAのフラグメン
トを増幅できる少なくとも1対のプライマーを含む(ここで、該プライマーは、
本発明のプライマーから選択される)キットに関する。
【0065】
本発明は更に、被験者が、糖尿病及び/又はWRS関連病変を有する危険性の
減少又は増大にあるかどうかを決定する為のキットであって、 タンパク質EIF2AK3をコードし、糖尿病及び/又はWRS関連病変を有す
る危険性の減少又は増大と関連した多型を含む可能性のあるゲノムDNA又はR
NAのフラグメントを増幅できる少なくとも1対のプライマーを含む(ここで、
該プライマーは、本発明のプライマーから選択される)キットに関する。
減少又は増大にあるかどうかを決定する為のキットであって、 タンパク質EIF2AK3をコードし、糖尿病及び/又はWRS関連病変を有す
る危険性の減少又は増大と関連した多型を含む可能性のあるゲノムDNA又はR
NAのフラグメントを増幅できる少なくとも1対のプライマーを含む(ここで、
該プライマーは、本発明のプライマーから選択される)キットに関する。
【0066】
好ましくは、該関連多型は、糖尿病及び/又はWRS関連病変を有する危険性
の減少又は増大と関連した多型である。
の減少又は増大と関連した多型である。
【0067】
本発明は更に、糖尿病及び/又はWRS関連病変を有する危険性の減少又は増
大と関連した少なくとも1つの付加マーカーのレベルについて、被験者からの生
体試料をアッセイする手段を更に含む(ここで、関連する付加マーカーは、糖尿
病及び/又はWRS関連病変を有する危険性の増大と関連する付加マーカーであ
る)ことを特徴とする本発明のキットに関する。
大と関連した少なくとも1つの付加マーカーのレベルについて、被験者からの生
体試料をアッセイする手段を更に含む(ここで、関連する付加マーカーは、糖尿
病及び/又はWRS関連病変を有する危険性の増大と関連する付加マーカーであ
る)ことを特徴とする本発明のキットに関する。
【0068】
好適な実施態様で、本発明の、被験者が、糖尿病及び/又はWRS関連病変を
有する危険性の減少又は増大にあるかどうかを決定する為の、上記方法又はキッ
トは、糖尿病及び/又はWRS関連病変が、1型糖尿病、2型糖尿病、それ以外
の型の糖尿病、骨粗鬆症、関節炎、肝不全、ネフロパシー及び他の腎不全並びに
精神遅滞からなる群から選択されることを特徴とする。
有する危険性の減少又は増大にあるかどうかを決定する為の、上記方法又はキッ
トは、糖尿病及び/又はWRS関連病変が、1型糖尿病、2型糖尿病、それ以外
の型の糖尿病、骨粗鬆症、関節炎、肝不全、ネフロパシー及び他の腎不全並びに
精神遅滞からなる群から選択されることを特徴とする。
【0069】
より好適な実施態様で、本発明の方法又はキットは、糖尿病及び/又はWRS
関連病変が、1型糖尿病、2型糖尿病、及びそれ以外の型の糖尿病からなる群か
ら選択されることを特徴とする。
関連病変が、1型糖尿病、2型糖尿病、及びそれ以外の型の糖尿病からなる群か
ら選択されることを特徴とする。
【0070】
特により好適な実施態様では、本発明の方法又はキットは、該糖尿病及び/又
はWRS関連病変が、1型糖尿病であることを特徴とする。
はWRS関連病変が、1型糖尿病であることを特徴とする。
【0071】
本発明はまた、EIF2AK3タンパク質の発現と活性を研究する為の、並び
にEIF2AK3遺伝子若しくはそれらの発現産物と、EIF2AK3遺伝子若
しくはそれらの発現産物の活性に関与しうる化学的若しくは生化学的化合物との
直接的又は間接的相互作用を研究する為の、本発明の細胞、哺乳動物又はポリペ
プチドの使用に関する。
にEIF2AK3遺伝子若しくはそれらの発現産物と、EIF2AK3遺伝子若
しくはそれらの発現産物の活性に関与しうる化学的若しくは生化学的化合物との
直接的又は間接的相互作用を研究する為の、本発明の細胞、哺乳動物又はポリペ
プチドの使用に関する。
【0072】
本発明はまた、EIF2AK3タンパク質と直接的又は間接的に相互作用でき
、及び/又はEIF2AK3タンパク質の発現又は活性を調節できる化学的若し
くは生化学的化合物のスクリーニングのための、本発明の細胞、哺乳動物又はポ
リペプチドの使用に関する。
、及び/又はEIF2AK3タンパク質の発現又は活性を調節できる化学的若し
くは生化学的化合物のスクリーニングのための、本発明の細胞、哺乳動物又はポ
リペプチドの使用に関する。
【0073】
EIF2AK3タンパク質と直接的又は間接的に相互作用でき、及び/又はE
IF2AK3タンパク質の発現又は活性を調節することを可能とすることができ
る化学的又は生化学的化合物の選択方法であって、本発明の細胞、哺乳動物又は
ポリペプチドを使用することを特徴とする方法も本発明に含まれる。
IF2AK3タンパク質の発現又は活性を調節することを可能とすることができ
る化学的又は生化学的化合物の選択方法であって、本発明の細胞、哺乳動物又は
ポリペプチドを使用することを特徴とする方法も本発明に含まれる。
【0074】
EIF2AK3タンパク質と直接的又は間接的に相互作用でき、及び/又はE
IF2AK3タンパク質の発現又は活性を調節することを可能とすることができ
ることを特徴とする化学的又は生化学的化合物も、本発明の一部を形成する。 本発明の方法によって選択されることを特徴とする化合物も、本発明の一部を
形成する。
IF2AK3タンパク質の発現又は活性を調節することを可能とすることができ
ることを特徴とする化学的又は生化学的化合物も、本発明の一部を形成する。 本発明の方法によって選択されることを特徴とする化合物も、本発明の一部を
形成する。
【0075】
好適な実施態様では、本発明は、
−EIF2AK3タンパク質発現のレベルの調節;及び/又は
−膵臓β−細胞又はその完全性の増大;及び/又は
−糖尿病及び/又はWRS関連病変の予防又は治療;
を可能とすることを特徴とする本発明の化合物を含む。
【0076】
好適な実施態様では、本発明は、本発明の抗体、ポリペプチド、ベクター、又
はセンス若しくはアンチ−センス核酸配列から選択されることを特徴とする本発
明の化合物を含む。
はセンス若しくはアンチ−センス核酸配列から選択されることを特徴とする本発
明の化合物を含む。
【0077】
本発明は更に、特に、糖尿病及び/又はWRS関連病変の予防及び/又は治療
のための医薬としての本発明の化合物に関する。
のための医薬としての本発明の化合物に関する。
【0078】
好適な実施態様では、本発明は更に、糖尿病及び/又はWRS関連病変の予防
及び/又は治療のための医薬としての本発明の化合物であって、糖尿病及び/又
はWRS関連病変が、1型糖尿病、2型糖尿病、それ以外の型の糖尿病、骨粗鬆
症、関節炎、肝不全、ネフロパシー及び他の腎不全並びに精神遅滞からなる群か
ら選択されることを特徴とする化合物に関する。 より好適な実施態様では、本発明の化合物は、糖尿病及び/又はWRS関連病
変が、1型糖尿病、2型糖尿病、及びそれ以外の型の糖尿病からなる群から選択
されることを特徴とする。 特により好適な実施態様では、本発明の化合物は、糖尿病及び/又はWRS関
連病変が、1型糖尿病であることを特徴とする。
及び/又は治療のための医薬としての本発明の化合物であって、糖尿病及び/又
はWRS関連病変が、1型糖尿病、2型糖尿病、それ以外の型の糖尿病、骨粗鬆
症、関節炎、肝不全、ネフロパシー及び他の腎不全並びに精神遅滞からなる群か
ら選択されることを特徴とする化合物に関する。 より好適な実施態様では、本発明の化合物は、糖尿病及び/又はWRS関連病
変が、1型糖尿病、2型糖尿病、及びそれ以外の型の糖尿病からなる群から選択
されることを特徴とする。 特により好適な実施態様では、本発明の化合物は、糖尿病及び/又はWRS関
連病変が、1型糖尿病であることを特徴とする。
【0079】
実施例1:方法臨床診断及びファミリー
2つのファミリーを研究した。WRS1はチュニジア人起源であり、以前39に
報告されている。一方、WRS2はパキスタン人起源であった。全ての患者で糖
尿病を初期発症した(寿命の2ヶ月〜6ヶ月)、一方、骨端異形成症及び/又は
成長遅延は、WRS1の2人の生存患者とWRS2のより年長の患者で、寿命の
最初の2年で診断されたが、早期に死亡したため(WRS1で、齢5ヶ月)ある
いは患者が幼い(WRS2の最後の子供、齢6ヶ月)ため、他の罹患患者では診
断されなかった。全ての生体試料収集と検査は、家族からのインフォームド・コ
ンセントを伴ってなされた。ファミリーの全てのメンバー(ファミリーWRS1
の最初の子供は除いて)について、DNA抽出のために静脈血をEDTA上に収
集した(DNAサンプルは、オートプシー肝臓サンプルから抽出した)。WRS
1ファミリーの親と1人の子供の新鮮血液サンプルもまた、RNA抽出のために
EDTA上に収集した。
報告されている。一方、WRS2はパキスタン人起源であった。全ての患者で糖
尿病を初期発症した(寿命の2ヶ月〜6ヶ月)、一方、骨端異形成症及び/又は
成長遅延は、WRS1の2人の生存患者とWRS2のより年長の患者で、寿命の
最初の2年で診断されたが、早期に死亡したため(WRS1で、齢5ヶ月)ある
いは患者が幼い(WRS2の最後の子供、齢6ヶ月)ため、他の罹患患者では診
断されなかった。全ての生体試料収集と検査は、家族からのインフォームド・コ
ンセントを伴ってなされた。ファミリーの全てのメンバー(ファミリーWRS1
の最初の子供は除いて)について、DNA抽出のために静脈血をEDTA上に収
集した(DNAサンプルは、オートプシー肝臓サンプルから抽出した)。WRS
1ファミリーの親と1人の子供の新鮮血液サンプルもまた、RNA抽出のために
EDTA上に収集した。
【0080】遺伝子型キャラクタリゼーション
記載されたように(Dib, C. ら, Nature, 380,152-154,1996)ABI377シ
ークエンサーで蛍光標識プライマーを用いて、マイクロサテライト多型の遺伝子
型キャラクタリゼーションを行った。
ークエンサーで蛍光標識プライマーを用いて、マイクロサテライト多型の遺伝子
型キャラクタリゼーションを行った。
【0081】連鎖解析
LINKAGEパッケージからのプログラムLODSCORE(Lathrop, G.
M., ら, Proc. Natl. Acad. Sci., U. S. A, 81, 3443-6,1984)を用いて、2点
連鎖解析を行い、LINKMAPプログラムを用いて、多点解析を行った。我々
は、疾患遺伝子頻度0.00001の、十分に浸透度のある(penetrant)劣性疾
患であると仮定した。CEPH親からアレル頻度(ftp ://ftp.genethon.fr/pub
/Gmap/Nature-1995/alleles/)又は公共データベースで利用できる情報から演繹
されるアレル頻度が、解析のために推定された。ゲノムスクリーニングのために
、本発明者らは、GDBウェブサイト(http://www.gdb.org)上で利用できるMa
rshfieldマップ上で見積もられるKosambi cMでの遺伝子距離を推定した。WR
S遺伝子の微細マッピングにおいて、マーカー順序は公共データベースから得、
組換え事象がWRSファミリーで観察された。十分に情報が与えられるマーカー
遺伝子座を有する連鎖の最大限の証拠を得る確立の計算は、プログラムSLIN
Kでなされた。
M., ら, Proc. Natl. Acad. Sci., U. S. A, 81, 3443-6,1984)を用いて、2点
連鎖解析を行い、LINKMAPプログラムを用いて、多点解析を行った。我々
は、疾患遺伝子頻度0.00001の、十分に浸透度のある(penetrant)劣性疾
患であると仮定した。CEPH親からアレル頻度(ftp ://ftp.genethon.fr/pub
/Gmap/Nature-1995/alleles/)又は公共データベースで利用できる情報から演繹
されるアレル頻度が、解析のために推定された。ゲノムスクリーニングのために
、本発明者らは、GDBウェブサイト(http://www.gdb.org)上で利用できるMa
rshfieldマップ上で見積もられるKosambi cMでの遺伝子距離を推定した。WR
S遺伝子の微細マッピングにおいて、マーカー順序は公共データベースから得、
組換え事象がWRSファミリーで観察された。十分に情報が与えられるマーカー
遺伝子座を有する連鎖の最大限の証拠を得る確立の計算は、プログラムSLIN
Kでなされた。
【0082】EIF2AK3遺伝子のゲノム構造
EIF2AK3に対応する完全長ヒトcDNAは以前にクローニングされた(
Genbank: AF110146) (Shi, Y., ら, J. Biol. Chem. 274,5723-30,1999)。遺伝
子の3’UTRに位置するプライマー(STS3'F : GGGGCATAACCTAATTTGAGC 及びS
TS3'R: GGGGACTTTCCTTCTTCTGC)を用いてCaltech BACライブラリーをスクリ
ーニングすることによって、EIF2AK3(CIT978SK-121D7)の3’末端をカバ
ーするBACクローンを同定した。EIF2AK3 cDNAを用いるブラスト
検索によって、配列決定されたBAC末端(Genbank: AQ543111)を用いて、該遺
伝子の5’領域をカバーするオーバーラップするBACであるRCPI−11−
349C16を同定した。インター−エキソン(inter-exons)PCRによって得
られた長いPCRフラグメントを配列決定し、レファレンスcDNA配列(AF
110146)と比較することによって、並びにエキソンプライマーを用いて、
BACクローンDNA上での相補的直接配列決定によって、遺伝子のイントロン
/エキソン構造(表1)を確立した。
Genbank: AF110146) (Shi, Y., ら, J. Biol. Chem. 274,5723-30,1999)。遺伝
子の3’UTRに位置するプライマー(STS3'F : GGGGCATAACCTAATTTGAGC 及びS
TS3'R: GGGGACTTTCCTTCTTCTGC)を用いてCaltech BACライブラリーをスクリ
ーニングすることによって、EIF2AK3(CIT978SK-121D7)の3’末端をカバ
ーするBACクローンを同定した。EIF2AK3 cDNAを用いるブラスト
検索によって、配列決定されたBAC末端(Genbank: AQ543111)を用いて、該遺
伝子の5’領域をカバーするオーバーラップするBACであるRCPI−11−
349C16を同定した。インター−エキソン(inter-exons)PCRによって得
られた長いPCRフラグメントを配列決定し、レファレンスcDNA配列(AF
110146)と比較することによって、並びにエキソンプライマーを用いて、
BACクローンDNA上での相補的直接配列決定によって、遺伝子のイントロン
/エキソン構造(表1)を確立した。
【0083】
【表1】
【0084】表1の説明
:レファレンスとして用いたcDNA:Genbank AF110146。イントロ
ン配列は、小文字活字であり、エキソン配列は、大文字活字である。AG及びG
Tスプライスコンセンサス配列には、下線を引いてある。
ン配列は、小文字活字であり、エキソン配列は、大文字活字である。AG及びG
Tスプライスコンセンサス配列には、下線を引いてある。
【0085】変異/多型スクリーニング及びハプロタイプ推定
RT−PCR増幅産物でのcDNAのコード領域の直接的配列決定によって、
対照として正常コーカソイド人を用いて、WRS1インデックス患者と彼の2人
の親について、並びに、PCR増幅ゲノムDNAでの遺伝子のコード領域の配列
決定により、対照として正常コーカソイド人を用いて、WRS2インデックス患
者と彼の父親について、変異スクリーニングを行った。WRSを有するWRS1
ファミリーで同定された変異の共分離(cosegregation)を、プライマーPEK1 : CT
GACTGGAAAGTTATGG 及び PEK2: AAAAGACTGATGGGAATGACを用い、次にAflIIに
よる制限酵素消化を行うPCR−RFLP法によって、ゲノムDNAで確認した
。消化後、正常アレルは、302及び35bpフラグメントを与え(制限酵素部
位の存在)、一方、変異アレルは、337bpフラグメントを与える(部位無し
)。それらは、アガロースゲル電気泳動によって分離された。95人の無関係の
健康なコーカソイド人でPCR増幅したゲノムDNA上で遺伝子の全エキソンを
配列決定することによって、多型のスクリーニングを行った。QIAmp RN
A血液ミニ−キット(Qiagen)を用いて、新鮮血液でのRNA抽出を行い、Pr
oSTARシングル−チューブRT−PCRシステム(Stratagene)を用いて、R
T−PCRを行った。ビッグ−ダイ・ターミネーターケミストリー(Rosenblum,
B. B., ら, Nucleic Acids Research, 25,4500-4 1997; Heiner, C. R., ら, Ge
nome Research, 8,557-61, 1998)を用い、配列決定プライマーとして鋳型プライ
マーの1つを用い、ABI3700シークエンサーで配列決定反応を行った。
対照として正常コーカソイド人を用いて、WRS1インデックス患者と彼の2人
の親について、並びに、PCR増幅ゲノムDNAでの遺伝子のコード領域の配列
決定により、対照として正常コーカソイド人を用いて、WRS2インデックス患
者と彼の父親について、変異スクリーニングを行った。WRSを有するWRS1
ファミリーで同定された変異の共分離(cosegregation)を、プライマーPEK1 : CT
GACTGGAAAGTTATGG 及び PEK2: AAAAGACTGATGGGAATGACを用い、次にAflIIに
よる制限酵素消化を行うPCR−RFLP法によって、ゲノムDNAで確認した
。消化後、正常アレルは、302及び35bpフラグメントを与え(制限酵素部
位の存在)、一方、変異アレルは、337bpフラグメントを与える(部位無し
)。それらは、アガロースゲル電気泳動によって分離された。95人の無関係の
健康なコーカソイド人でPCR増幅したゲノムDNA上で遺伝子の全エキソンを
配列決定することによって、多型のスクリーニングを行った。QIAmp RN
A血液ミニ−キット(Qiagen)を用いて、新鮮血液でのRNA抽出を行い、Pr
oSTARシングル−チューブRT−PCRシステム(Stratagene)を用いて、R
T−PCRを行った。ビッグ−ダイ・ターミネーターケミストリー(Rosenblum,
B. B., ら, Nucleic Acids Research, 25,4500-4 1997; Heiner, C. R., ら, Ge
nome Research, 8,557-61, 1998)を用い、配列決定プライマーとして鋳型プライ
マーの1つを用い、ABI3700シークエンサーで配列決定反応を行った。
【0086】
95人の無関係なコーカソイド人対照での遺伝子型データからアレル頻度>0
.05で、8つの多型部位について、ハプロタイプ頻度を推定した。考慮する必
要のあるハプロタイプ組合せの数を減らすために、これは、ステップ−ワイズ法
によってなされた。第1ステップで、2つの部位を任意に選び、Hardy-Weinberg
平衡を仮定して、ハプロタイプ頻度の最大公算推定値を得た。連鎖不平衡の仮定
の下に計算された最初の頻度から出発するEMアルゴリズムを用い、推定値を見
出した。次いで、別の部位を任意に選択し、最初の2つの部位についての先のハ
プロタイプ頻度推定値に基づく最初の値、並びに新規部位での連鎖平衡の仮定か
ら出発して、3つの部位全てについて対応するハプロタイプ頻度を同じように推
定した。全ての部位が推定値に含まれるまで、この方法を続けた。このように、
1ステップで0の頻度推定値をハプロタイプを持つときはいつでも、アレルの同
一の組合せを含む全てのハプロタイプは、後のステージで0頻度を有した。
.05で、8つの多型部位について、ハプロタイプ頻度を推定した。考慮する必
要のあるハプロタイプ組合せの数を減らすために、これは、ステップ−ワイズ法
によってなされた。第1ステップで、2つの部位を任意に選び、Hardy-Weinberg
平衡を仮定して、ハプロタイプ頻度の最大公算推定値を得た。連鎖不平衡の仮定
の下に計算された最初の頻度から出発するEMアルゴリズムを用い、推定値を見
出した。次いで、別の部位を任意に選択し、最初の2つの部位についての先のハ
プロタイプ頻度推定値に基づく最初の値、並びに新規部位での連鎖平衡の仮定か
ら出発して、3つの部位全てについて対応するハプロタイプ頻度を同じように推
定した。全ての部位が推定値に含まれるまで、この方法を続けた。このように、
1ステップで0の頻度推定値をハプロタイプを持つときはいつでも、アレルの同
一の組合せを含む全てのハプロタイプは、後のステージで0頻度を有した。
【0087】Genbankアクセッション番号
ヒト EIF2AK3 cDNA配列: AF110146 ; EIF2AK3タンパク質配列: AAD19961 (ヒト)
, AAD03337 (マウス), AAC83801 (ラット)。GCN2及び関連キナーゼタンパク質配
列: P15442 (酵母), CAB58363 (マウス), CAA92117 (C. elegans), AAC13490 (D
. melanogaster), CAB60699 及びCAB11253 (S. pombe) ; HRIタンパク質配列: A
AF18391 (ヒト), Q9Z2R9 (マウス), Q63185 (ラット), P33279 (ウサギ); WEE1
タンパク質配列: AAB60401 (ヒト), (P47810)マウス, (BAA06624)ラット, (AAD5
2983) Z. mais, (AAF02869) A. thaliana, (AAC46913) D. melanogaster, (P478
17) X. laevis ; PKRタンパク質配列: AAC50768 (ヒト), Q03963 (マウス), AAA
61926 (ラット);本研究で産生された EIF2AK3 ゲノムDNA 配列: 割り当てられた
Genbank 番号。
, AAD03337 (マウス), AAC83801 (ラット)。GCN2及び関連キナーゼタンパク質配
列: P15442 (酵母), CAB58363 (マウス), CAA92117 (C. elegans), AAC13490 (D
. melanogaster), CAB60699 及びCAB11253 (S. pombe) ; HRIタンパク質配列: A
AF18391 (ヒト), Q9Z2R9 (マウス), Q63185 (ラット), P33279 (ウサギ); WEE1
タンパク質配列: AAB60401 (ヒト), (P47810)マウス, (BAA06624)ラット, (AAD5
2983) Z. mais, (AAF02869) A. thaliana, (AAC46913) D. melanogaster, (P478
17) X. laevis ; PKRタンパク質配列: AAC50768 (ヒト), Q03963 (マウス), AAA
61926 (ラット);本研究で産生された EIF2AK3 ゲノムDNA 配列: 割り当てられた
Genbank 番号。
【0088】
実施例2:WRSファミリーでのゲノムスクリーニング
最初に、4人の子供を有するチュニジア人系統の血縁家族(WRS1)を研究
した。子供のうち3人がWRSを罹患しており、1人は健康であった。親はいと
こ同士であり、両方とも罹患していなかった。いったんその家系に入り、そして
祖父母の1人から両方の親によって遺伝したまれな劣性変異を仮定するモデルの
下で、家系による同一性(identical-by-descent)についての完全な情報によって
、最大ロッドスコア2.53を得ることができたと計算された。家系による同一
性についての完全な情報を与えるマーカーによって、遺伝形質に関係していない
領域内で偶然に最大ロッドスコアを観察する頻度は、約0.6%(即ち、それは
、公称p−値0.006を有することである)であろうことをシミュレーション
研究が示した。下記のように、1つのそのような可能性ある連鎖領域が、ゲノム
−ワイドな連鎖研究で、WRS1ファミリーについて同定された。次いで、この
領域への連鎖が、本研究中に集めた第2のファミリーで確認された。
した。子供のうち3人がWRSを罹患しており、1人は健康であった。親はいと
こ同士であり、両方とも罹患していなかった。いったんその家系に入り、そして
祖父母の1人から両方の親によって遺伝したまれな劣性変異を仮定するモデルの
下で、家系による同一性(identical-by-descent)についての完全な情報によって
、最大ロッドスコア2.53を得ることができたと計算された。家系による同一
性についての完全な情報を与えるマーカーによって、遺伝形質に関係していない
領域内で偶然に最大ロッドスコアを観察する頻度は、約0.6%(即ち、それは
、公称p−値0.006を有することである)であろうことをシミュレーション
研究が示した。下記のように、1つのそのような可能性ある連鎖領域が、ゲノム
−ワイドな連鎖研究で、WRS1ファミリーについて同定された。次いで、この
領域への連鎖が、本研究中に集めた第2のファミリーで確認された。
【0089】
Genethonスクリーニングセット(http://www.genethon.fr)から289のマイク
ロサテライトマーカーで、ゲノム−ワイド連鎖を行った。マーカー18は染色体
15にあり(平均間隔:6.3cM)、残りは、他の常染色体にわたって分布し
た(平均間隔:13.1cM)。最初のスクリーンでは情報が不十分であったマ
ーカーへの補足として、後のステージで24の付加的なマイクロサテライトを加
えた。これらは、両方の親でホモ接合性であるか、又は1人の親からの減数分裂
でWRSへ完全に連鎖するという証拠をもったその親でヘテロ接合性であるマー
カーであった。該遺伝形質は、完全な浸透度を持ち、表現型を持たないまれな劣
性変異によるとの仮定の下に、連鎖解析を行った。マーカーアレル頻度は、CE
PHファミリーから推定した。 4つのマーカーは十分な情報を与え、該遺伝形質への完全な連鎖と一致するト
ランスミッションのパターンを有していた(表2参照)。
ロサテライトマーカーで、ゲノム−ワイド連鎖を行った。マーカー18は染色体
15にあり(平均間隔:6.3cM)、残りは、他の常染色体にわたって分布し
た(平均間隔:13.1cM)。最初のスクリーンでは情報が不十分であったマ
ーカーへの補足として、後のステージで24の付加的なマイクロサテライトを加
えた。これらは、両方の親でホモ接合性であるか、又は1人の親からの減数分裂
でWRSへ完全に連鎖するという証拠をもったその親でヘテロ接合性であるマー
カーであった。該遺伝形質は、完全な浸透度を持ち、表現型を持たないまれな劣
性変異によるとの仮定の下に、連鎖解析を行った。マーカーアレル頻度は、CE
PHファミリーから推定した。 4つのマーカーは十分な情報を与え、該遺伝形質への完全な連鎖と一致するト
ランスミッションのパターンを有していた(表2参照)。
【0090】
【表2】
【0091】表2の説明
:3つの染色体領域(染色体2の2つの領域及び染色体9の1つの領
域)についての結果を示す(その最初のデータで、WRSとの完全な連鎖と合致
した)。太字で示したマーカーは、連鎖に関し十分な情報を与え、WRSとの組
換えが無いという仮説と一致した。d:次のマーカーまでの距離(cM)。θ:
WRS遺伝子座との推定組換えフラクション。
域)についての結果を示す(その最初のデータで、WRSとの完全な連鎖と合致
した)。太字で示したマーカーは、連鎖に関し十分な情報を与え、WRSとの組
換えが無いという仮説と一致した。d:次のマーカーまでの距離(cM)。θ:
WRS遺伝子座との推定組換えフラクション。
【0092】
マーカーの2つは、染色体2の単一領域で隣接していた(12cM距離);別
のマーカーも染色体2にあったが、距離にして63cM最初の2つとは隔てられ
ている;第4のマーカーは染色体9にあった。染色体2の隣接している2つのマ
ーカー、D2S113とD2S160、はその遺伝形質と完全に連関し、θ=0
でそれぞれロッドスコア2.48と1.85を与えた。これら2つに近い別のマ
ーカー、D2S286はある程度は情報を与え、θ=0でロッドスコア0.88
4を与えた。この領域からの3つのマーカーの多遺伝子座ロッドスコアは、家系
から可能な最大であった(2.53)。
のマーカーも染色体2にあったが、距離にして63cM最初の2つとは隔てられ
ている;第4のマーカーは染色体9にあった。染色体2の隣接している2つのマ
ーカー、D2S113とD2S160、はその遺伝形質と完全に連関し、θ=0
でそれぞれロッドスコア2.48と1.85を与えた。これら2つに近い別のマ
ーカー、D2S286はある程度は情報を与え、θ=0でロッドスコア0.88
4を与えた。この領域からの3つのマーカーの多遺伝子座ロッドスコアは、家系
から可能な最大であった(2.53)。
【0093】
染色体2の第2領域で、マーカーD2S364はθ=0でロッドスコア1.1
9を与えた。染色体9で、D9S168は、θ=0でロッドスコア1.92での
連鎖と一致するパターンを示した。このマーカーは、D9S269(1人(osne)
の親からの減数分裂の為に情報を与え、θ=0でロッドスコア1.17を与えた
)からの連鎖情報を補足するために最初のゲノム−ワイドセットに加えられた。
これら3つの領域からの他のマーカーが、これらの領域で可能なハプロタイプ同
一性に関するより完全な情報を与えるために、このファミリーでの遺伝子型判定
のために選択された。この目的で、D2S380とD2S112の間に40の更
なるマーカー(領域1)、D2S382とD2S116の間に10の更なるマー
カー(領域2)、及びD9S288とD9S1846の間に3つの更なるマーカ
ー(領域3)がキャラクタライズされた。遺伝子型の調査と更なる統計的解析は
、領域1での連鎖を確認する為の証拠を提供し、罹患した子供に遺伝したハプロ
タイプは、CD8AとD2S363の間の17cM間隔での同一のマイクロサテ
ライトアレルを担持している(図1A)。他の領域は、興味がありそうではない
としてこの段階で拒絶された。WRS患者に遺伝した親のハプロタイプは、全体
にわたって同一ではなかった(図1B及び1C)。
9を与えた。染色体9で、D9S168は、θ=0でロッドスコア1.92での
連鎖と一致するパターンを示した。このマーカーは、D9S269(1人(osne)
の親からの減数分裂の為に情報を与え、θ=0でロッドスコア1.17を与えた
)からの連鎖情報を補足するために最初のゲノム−ワイドセットに加えられた。
これら3つの領域からの他のマーカーが、これらの領域で可能なハプロタイプ同
一性に関するより完全な情報を与えるために、このファミリーでの遺伝子型判定
のために選択された。この目的で、D2S380とD2S112の間に40の更
なるマーカー(領域1)、D2S382とD2S116の間に10の更なるマー
カー(領域2)、及びD9S288とD9S1846の間に3つの更なるマーカ
ー(領域3)がキャラクタライズされた。遺伝子型の調査と更なる統計的解析は
、領域1での連鎖を確認する為の証拠を提供し、罹患した子供に遺伝したハプロ
タイプは、CD8AとD2S363の間の17cM間隔での同一のマイクロサテ
ライトアレルを担持している(図1A)。他の領域は、興味がありそうではない
としてこの段階で拒絶された。WRS患者に遺伝した親のハプロタイプは、全体
にわたって同一ではなかった(図1B及び1C)。
【0094】
実施例3:WRS遺伝子の微細マッピング
連鎖研究の過程で、異なる種族的出身の第2のWRSファミリー(WRS2)
が得られた。このファミリーは、2人の罹患した子供と両親から構成されていた
。両親は非罹患でいとこ同士であった。染色体2の領域1からのマイクロサテラ
イトマーカー(D2S380−D2S112)の選択は、このファミリーに特徴
的であった。ファミリーパネルを併せての2点連鎖解析は、θ=0で3.41ま
でのロッドスコアを与え、多遺伝子座連鎖解析は、WRSへの連鎖を裏付けるマ
ーカーD2S1786/D2S2181/DS2S2216/D2S2222の
位置で最大ロッドスコア4.33に到達した。
が得られた。このファミリーは、2人の罹患した子供と両親から構成されていた
。両親は非罹患でいとこ同士であった。染色体2の領域1からのマイクロサテラ
イトマーカー(D2S380−D2S112)の選択は、このファミリーに特徴
的であった。ファミリーパネルを併せての2点連鎖解析は、θ=0で3.41ま
でのロッドスコアを与え、多遺伝子座連鎖解析は、WRSへの連鎖を裏付けるマ
ーカーD2S1786/D2S2181/DS2S2216/D2S2222の
位置で最大ロッドスコア4.33に到達した。
【0095】
次に、WRSの原因遺伝子が存在するはずであるより小さな領域を決定するた
めに、2つのファミリーの罹患した子供からの、連鎖領域で家系による同一性の
可能性のあるセグメント間でのオーバーラップを試験した。上記の4つの密接に
リンクしたマイクロサテライトマーカー(〜1cM以内)を含むCD8AとD2
S2154の間の約2−3cMのセグメントから、オーバーラップはなっていた
。これらは、罹患した子供全てでホモ接合性であり、両方のファミリーでWRS
との完全な連鎖を示した(図1A)。該遺伝子を含む決定的な領域は、2つの組
換え事象によって規定される。1つは、個々のWRS1−3での絶対組換え(obl
igate recombination)(CD8AとD2S1786の間の遠位境界を規定する)
であり、他方は、ファミリーWRS2で曾祖父母から両親に到る減数分裂の1つ
で起こったと推定される組換え(D2S2222とD2S2154の間の近位境
界を規定する)である。
めに、2つのファミリーの罹患した子供からの、連鎖領域で家系による同一性の
可能性のあるセグメント間でのオーバーラップを試験した。上記の4つの密接に
リンクしたマイクロサテライトマーカー(〜1cM以内)を含むCD8AとD2
S2154の間の約2−3cMのセグメントから、オーバーラップはなっていた
。これらは、罹患した子供全てでホモ接合性であり、両方のファミリーでWRS
との完全な連鎖を示した(図1A)。該遺伝子を含む決定的な領域は、2つの組
換え事象によって規定される。1つは、個々のWRS1−3での絶対組換え(obl
igate recombination)(CD8AとD2S1786の間の遠位境界を規定する)
であり、他方は、ファミリーWRS2で曾祖父母から両親に到る減数分裂の1つ
で起こったと推定される組換え(D2S2222とD2S2154の間の近位境
界を規定する)である。
【0096】
実施例4:連鎖の領域内での候補遺伝子の変異スクリーニング:真核細胞の翻訳
開始因子2アルファキナーゼ3(EIF2AK3) 公共データベースの情報から、決定的領域の部分的物理マップを構築した。領
域内にマッピングされる可能性のある幾つかの発現配列タグ(EST)のうち、
ホワイトヘッドYACコンティグWC2.7にマップされた1つ(D2S199
4/WI−6863)は、我々の興味を引いた。このESTは最近、遺伝子EI
F2AK3(Shi, Y.ら, 1999)、セリン/スレオニンキナーゼ、並びに膵島及
び胎盤での高レベル発現の故にWRSの主要候補遺伝子、として同定された。こ
の領域へのこの遺伝子の独立したマッピングも最近、Hayesら(Hayes, S. E.,
ら, Cytogenet Cell Genet, 86,327-328,1999)による放射線ハイブリッドマッ
ピングとin situハイブリダイゼーションによって得られた。ファミリーWRS
1とファミリーWRS2に由来するインデックス患者での変異について、EIF
2AK3をスクリーニングした。
開始因子2アルファキナーゼ3(EIF2AK3) 公共データベースの情報から、決定的領域の部分的物理マップを構築した。領
域内にマッピングされる可能性のある幾つかの発現配列タグ(EST)のうち、
ホワイトヘッドYACコンティグWC2.7にマップされた1つ(D2S199
4/WI−6863)は、我々の興味を引いた。このESTは最近、遺伝子EI
F2AK3(Shi, Y.ら, 1999)、セリン/スレオニンキナーゼ、並びに膵島及
び胎盤での高レベル発現の故にWRSの主要候補遺伝子、として同定された。こ
の領域へのこの遺伝子の独立したマッピングも最近、Hayesら(Hayes, S. E.,
ら, Cytogenet Cell Genet, 86,327-328,1999)による放射線ハイブリッドマッ
ピングとin situハイブリダイゼーションによって得られた。ファミリーWRS
1とファミリーWRS2に由来するインデックス患者での変異について、EIF
2AK3をスクリーニングした。
【0097】
EIF2AK3は低レベルで普遍的に発現しているので(Shi, Y.ら, 1999)、
新鮮全血からの全RNAから調製したRT−PCR産物の直接配列決定によって
、ファミリーWRS1からのインデックス患者で、遺伝子のコード領域を精査し
た。新鮮な血液サンプルは、WRS2ファミリーでは入手できなかったので、変
異スクリーニングのためのこの遺伝子のゲノム構成も確立した(方法参照)。明
確にされたエキソン−イントロン構造は、刊行されているコンセンサススプライ
ス配列に十分に一致した(Breathnach, R., ら, Annu. Rev. Biochem., 50,349-3
83, 1981)。cDNAで直接(ファミリーWRS1)、又は表3Aと3Bに示す
プライマーを用い、ゲノムDNAからエキソンを増幅することによって(ファミ
リーWRS2)、WRS1ファミリーとWRS2ファミリーの変異スクリーニン
グを、遺伝子のコード領域で行った。
新鮮全血からの全RNAから調製したRT−PCR産物の直接配列決定によって
、ファミリーWRS1からのインデックス患者で、遺伝子のコード領域を精査し
た。新鮮な血液サンプルは、WRS2ファミリーでは入手できなかったので、変
異スクリーニングのためのこの遺伝子のゲノム構成も確立した(方法参照)。明
確にされたエキソン−イントロン構造は、刊行されているコンセンサススプライ
ス配列に十分に一致した(Breathnach, R., ら, Annu. Rev. Biochem., 50,349-3
83, 1981)。cDNAで直接(ファミリーWRS1)、又は表3Aと3Bに示す
プライマーを用い、ゲノムDNAからエキソンを増幅することによって(ファミ
リーWRS2)、WRS1ファミリーとWRS2ファミリーの変異スクリーニン
グを、遺伝子のコード領域で行った。
【0098】表3A及び3B EIF2AK3の変異及び多型スクリーニングのために使用したプライマーの配 列
【0099】
【表3】
【0100】表3Bの説明
:星印(*)で印をつけたプライマー対は非コード配列をカバーし
、対照での多型のスクリーニングのためにのみ使用した。
、対照での多型のスクリーニングのためにのみ使用した。
【0101】
2つの異なる変異が、2つのファミリーで、WRS患者ではホモ接合性で、彼
らの両親及びファミリーWRS1の健康な兄弟ではヘテロ接合性で同定された(
図2)。ファミリーのメンバー全てからのゲノムDNAの関連領域の直接配列決
定によって(両方の変異)、並びにWRS1の変異の存在/非存在を評価するた
めに設計されたPCR−RFLPによって、変異と疾患アレルの共分離が確認さ
れた(方法参照)。更に、EIF2AK3のイントロン15で同定されたマイク
ロサテライト多型(表4A)は、WRS1では十分に情報を与えるものであり、
WRS2ではある程度は情報を与えるものであり、両方のファミリーで疾患アレ
ルと共分離した(示さず)。直接配列決定(両方の変異)及びPCR−RFLP
アッセイ(essay)(WRS1ファミリーでの変異)によって示されるように、1
90人のコーカソイド人、95人の日本人及び95人のアフリカ黒人には両方の
変異ともなかった。タンパク質レベルでの2つの変異の影響の記載は図3に示す
。WRS1変異は、位置1103でのTの挿入(1103insT)であり、それ
は、位置345でのフレームシフト及び同位置でタンパク質の未熟終結をつくる
(ins345fs/ter345)。即ち、WRS1変異は、制御ドメイン(アミノ酸1−5
76)の一部及び触媒ドメイン(アミノ酸577−1115)の全てを欠く、端
を切られたタンパク質を産生する。このことから、該タンパク質の機能の完全な
喪失が生じ得る。
らの両親及びファミリーWRS1の健康な兄弟ではヘテロ接合性で同定された(
図2)。ファミリーのメンバー全てからのゲノムDNAの関連領域の直接配列決
定によって(両方の変異)、並びにWRS1の変異の存在/非存在を評価するた
めに設計されたPCR−RFLPによって、変異と疾患アレルの共分離が確認さ
れた(方法参照)。更に、EIF2AK3のイントロン15で同定されたマイク
ロサテライト多型(表4A)は、WRS1では十分に情報を与えるものであり、
WRS2ではある程度は情報を与えるものであり、両方のファミリーで疾患アレ
ルと共分離した(示さず)。直接配列決定(両方の変異)及びPCR−RFLP
アッセイ(essay)(WRS1ファミリーでの変異)によって示されるように、1
90人のコーカソイド人、95人の日本人及び95人のアフリカ黒人には両方の
変異ともなかった。タンパク質レベルでの2つの変異の影響の記載は図3に示す
。WRS1変異は、位置1103でのTの挿入(1103insT)であり、それ
は、位置345でのフレームシフト及び同位置でタンパク質の未熟終結をつくる
(ins345fs/ter345)。即ち、WRS1変異は、制御ドメイン(アミノ酸1−5
76)の一部及び触媒ドメイン(アミノ酸577−1115)の全てを欠く、端
を切られたタンパク質を産生する。このことから、該タンパク質の機能の完全な
喪失が生じ得る。
【0102】表4A、4B及び5:EIF2AK3エキソン及び隣接イントロン領域で同定さ れた多型、並びに推定されたハプロタイプ組合せ及び頻度
【0103】
【表4】
【0104】表4Aの説明
:レファレンスcDNA(Genbank AF110146)に対し、遺伝子のイン
トロン/エキソン構造の確立の間に産生されたゲノム配列に対し、アミノ酸変化
の記載を伴って、多型を位置づける。頻度は、95人の関係のない健康なコーカ
ソイド人の集団をスクリーニングすることによって推定した。
トロン/エキソン構造の確立の間に産生されたゲノム配列に対し、アミノ酸変化
の記載を伴って、多型を位置づける。頻度は、95人の関係のない健康なコーカ
ソイド人の集団をスクリーニングすることによって推定した。
【0105】
【表5】
【0106】表4Bの説明
:《7》はエキソン多型で7−リピートアレルに対応し、《8》は
エキソン多型で8−リピートアレルに対応する。《I》及び《D》は、最後のイ
ントロン15多型で、それぞれAT挿入アレル及びAT欠失アレルに対応する。
エキソン多型で8−リピートアレルに対応する。《I》及び《D》は、最後のイ
ントロン15多型で、それぞれAT挿入アレル及びAT欠失アレルに対応する。
【0107】
【表6】
【0108】
WRS2変異は1832GからAへのトランジッションであり、タンパク質の
触媒ドメイン内に位置する位置587でアルギニンの代わりにグルタミンが生じ
る(R587Q)。この変異はタンパク質の公知の機能部位には位置しないが、
HanksとHunter(Hanks, S. K., ら, Faseb J., 9,576-96,1995)によって明確にさ
れたように、高度に保存されたキナーゼサブドメインIの隣接境界にあり、異な
る生物からのeIF−2αキナーゼ間で完全に保存されている:マウス及びラッ
トからのEIF2AK3、 S. cerevisiaeからのGCN2、及び異なる生物(S. pombe, C.
elegans, D. melanogaster 及びマウスを含む)からのそのホモローグ、 ヒト、
マウス、ラット及びウサギからのHRI (eIF-2a キナーゼヘムレギュレーテッドイ
ンヒビター)、 ヒト、マウス及びラットからのPKR (プロテインキナーゼ, イン
ターフェロン誘導性二本鎖RNA依存性)。更に、該領域はWEE1(触媒ドメ
インが、これらのser/thrキナーゼ及び異なる生物からのそのホモローグ
と相同性を共有する別のキナーゼ)で高度に保存されている(図3)。興味深い
ことに、同様に保存された位置での単一アミノ酸変化[ラットEIF2AK3で
の位置614でリジンの代わりにアラニン(図3で示されるように、ヒトEIF
2AK3で位置621に対応する)]は、キナーゼ活性の完全な喪失を生じる(S
hi, Y.ら, 1999)。
触媒ドメイン内に位置する位置587でアルギニンの代わりにグルタミンが生じ
る(R587Q)。この変異はタンパク質の公知の機能部位には位置しないが、
HanksとHunter(Hanks, S. K., ら, Faseb J., 9,576-96,1995)によって明確にさ
れたように、高度に保存されたキナーゼサブドメインIの隣接境界にあり、異な
る生物からのeIF−2αキナーゼ間で完全に保存されている:マウス及びラッ
トからのEIF2AK3、 S. cerevisiaeからのGCN2、及び異なる生物(S. pombe, C.
elegans, D. melanogaster 及びマウスを含む)からのそのホモローグ、 ヒト、
マウス、ラット及びウサギからのHRI (eIF-2a キナーゼヘムレギュレーテッドイ
ンヒビター)、 ヒト、マウス及びラットからのPKR (プロテインキナーゼ, イン
ターフェロン誘導性二本鎖RNA依存性)。更に、該領域はWEE1(触媒ドメ
インが、これらのser/thrキナーゼ及び異なる生物からのそのホモローグ
と相同性を共有する別のキナーゼ)で高度に保存されている(図3)。興味深い
ことに、同様に保存された位置での単一アミノ酸変化[ラットEIF2AK3で
の位置614でリジンの代わりにアラニン(図3で示されるように、ヒトEIF
2AK3で位置621に対応する)]は、キナーゼ活性の完全な喪失を生じる(S
hi, Y.ら, 1999)。
【0109】
実施例5:EIF2AK3の多型スクリーニング
インスリン依存性糖尿病を含む、WRSを特徴付ける複数の病理学的症状の為
に、95人の正常コーカソイド人のパネルで、多型についてエキソンの全部をス
クリーニングすることを決定した。これらの変異及び可能なハプロタイプの知識
は、糖尿病又は成長異常を含む幾つかの疾患でこの遺伝子の関与を試験する為の
価値ある資源を構成するであろう。エキソン又は近傍隣接イントロン領域に位置
する合計8つの変異体が、0.05超の稀少アレル頻度をもって同定された(表
4A)。これらの変異体のうち5つが、タンパク質のコード領域にマップされ、
それらのうち4つがアミノ酸配列に影響を与える。このデータは、11ハプロタ
イプで8つの変異体の配列と一致し、そのうち5つが、0.05超の推定頻度を
有した(表4B)。更に、更なる稀少な変異体[キャラクタライズされた190
のうち1つ又は2つのアレルに起こった(表5)]が同定された。イントロン1
5で(CA)nタンデムリピートに基づくマイクロサテライトも同定され、多型
であることが確認され(示さず)、表4Aに列挙されてもいる。この多型は、疾
患におけるEIF2AK3の役割を探索するファミリー研究のために興味深いで
あろう。
に、95人の正常コーカソイド人のパネルで、多型についてエキソンの全部をス
クリーニングすることを決定した。これらの変異及び可能なハプロタイプの知識
は、糖尿病又は成長異常を含む幾つかの疾患でこの遺伝子の関与を試験する為の
価値ある資源を構成するであろう。エキソン又は近傍隣接イントロン領域に位置
する合計8つの変異体が、0.05超の稀少アレル頻度をもって同定された(表
4A)。これらの変異体のうち5つが、タンパク質のコード領域にマップされ、
それらのうち4つがアミノ酸配列に影響を与える。このデータは、11ハプロタ
イプで8つの変異体の配列と一致し、そのうち5つが、0.05超の推定頻度を
有した(表4B)。更に、更なる稀少な変異体[キャラクタライズされた190
のうち1つ又は2つのアレルに起こった(表5)]が同定された。イントロン1
5で(CA)nタンデムリピートに基づくマイクロサテライトも同定され、多型
であることが確認され(示さず)、表4Aに列挙されてもいる。この多型は、疾
患におけるEIF2AK3の役割を探索するファミリー研究のために興味深いで
あろう。
【0110】
これらの結果は、EIF2AK3遺伝子の変異が、異なる種族的出身の2つの
血縁家族でのWRSおよびそれに関連する病変の原因であることを示している。 これらの結果は、WRSでのEIF2AK3の役割、並びにインスリン依存性
糖尿病と症候群の他の特徴の病因との関与についての強い証拠を提供する。
血縁家族でのWRSおよびそれに関連する病変の原因であることを示している。 これらの結果は、WRSでのEIF2AK3の役割、並びにインスリン依存性
糖尿病と症候群の他の特徴の病因との関与についての強い証拠を提供する。
【0111】
これは、糖尿病、骨格形成異常、及びWRSの他の兆候を説明できる分子機構
を理解する為のキーとなる知見である。EIF2AK3は、タンパク質翻訳の調
節に役割を果たし(Shi, Y., ら, Mol. Cell. Biol., 18,7499-509 1998; Hardi
ng, H. P., ら, Nature, 398 (6722): 90,1999, Mar. 4, Nature 397,271-4 199
9)、膵島細胞で高度に発現されている(Shi, Y., ら, J. Biol. Chem. 274,5723-
30,1999)。我々の研究に基づき、EIF2AK3は、膵臓β−細胞の完全性を維
持するのに重要な機能を有しているようである。
を理解する為のキーとなる知見である。EIF2AK3は、タンパク質翻訳の調
節に役割を果たし(Shi, Y., ら, Mol. Cell. Biol., 18,7499-509 1998; Hardi
ng, H. P., ら, Nature, 398 (6722): 90,1999, Mar. 4, Nature 397,271-4 199
9)、膵島細胞で高度に発現されている(Shi, Y., ら, J. Biol. Chem. 274,5723-
30,1999)。我々の研究に基づき、EIF2AK3は、膵臓β−細胞の完全性を維
持するのに重要な機能を有しているようである。
【0112】
EIF2AK3は、eIF−2αキナーゼファミリー(ヘム−レギュレーテッ
ドインヒビターキナーゼ(HRI)、二本鎖RNA依存性プロテインキナーゼ(
PKR)及び酵母GCN2(Shi, Y.ら, 1998; Harding, H. P.ら, 1999)も含む
)の最近同定されたメンバーである。興味深いことに、これらの関連遺伝子の1
つ、PKRは、細胞増殖及びアポトーシスの制御に役割を果たすことが示され(S
rivastava, S. P., ら, J. Biol. Chem., 273,2416-23 1998)、EIF2AK3
は、WRS患者に特徴的な膵臓β−細胞非存在に関連しうる同様の機能を有する
可能性を提起する。更に、膵島細胞での高レベルの発現から、EIF2AK3は
、グルコースに反応してインスリン発現(タンパク質合成のレベルで起こる急速
プロセス(Goodison, S., ら, Biochem. J., 285,563-8,1992; Gilligan, M., ら
, J. Biol. Chem., 271,212-15,1996))の微細な制御に役割を果たす良き候補で
ある。
ドインヒビターキナーゼ(HRI)、二本鎖RNA依存性プロテインキナーゼ(
PKR)及び酵母GCN2(Shi, Y.ら, 1998; Harding, H. P.ら, 1999)も含む
)の最近同定されたメンバーである。興味深いことに、これらの関連遺伝子の1
つ、PKRは、細胞増殖及びアポトーシスの制御に役割を果たすことが示され(S
rivastava, S. P., ら, J. Biol. Chem., 273,2416-23 1998)、EIF2AK3
は、WRS患者に特徴的な膵臓β−細胞非存在に関連しうる同様の機能を有する
可能性を提起する。更に、膵島細胞での高レベルの発現から、EIF2AK3は
、グルコースに反応してインスリン発現(タンパク質合成のレベルで起こる急速
プロセス(Goodison, S., ら, Biochem. J., 285,563-8,1992; Gilligan, M., ら
, J. Biol. Chem., 271,212-15,1996))の微細な制御に役割を果たす良き候補で
ある。
【0113】
糖尿病と骨疾患の両方でのEIF2AK3の役割を説明するために、様々な証
拠及び仮説が提起された。軟骨細胞で発現される遺伝子の変異は、WRS(軟骨
無形成症/骨端異形成症/軟骨形成不全症/低軟骨形成症/骨粗鬆症/関節炎)
で観察される骨疾患と同様な多くの骨疾患の原因であることが知られている。例
えば、これも膵島細胞で強く発現しているFGFR3の機能獲得型(gain-of-fun
ction)変異(Hughes, S. E., J. Histochem. Cytochem., 45,1005-19,1997)は、
軟骨形成不全症と低軟骨形成症の原因である(Rousseau, F., ら, Nature, 371,2
52-4,1994; Rousseau, F., ら, J. Med. Genet. 33,749-52,1996)。FGFR3
の変異及びこれらの疾患に関与する他の遺伝子の優性効果とは対照的に、WRS
表現型は劣性である。即ち、EIF2AK3は、膵臓及び/又は軟骨細胞からの
特定のタンパク質に対する負の制御を発揮し、正常条件下でこれらの器官の十分
な発育と機能を保証するのかもしれず、一方、WRS患者では、機能性EIF2
AK3の喪失が、この(これらの)タンパク質の過剰発現に従い、異なる器官と
関連する観察される表現型を作り得る。この仮説は、タンパク質翻訳のレベルに
対するEIF2AK3のダウン−レギュレーション効果と一致する。EIF2A
K3は胎盤で発現するので、母性EIF2AK3の発現のために、胚発育は正常
のままであり得、一方、これらの機構によって影響を受ける産後の成長と発育プ
ロセスは変わるだろう。この仮説を試すために、特に、このモデルで、その制御
がEIF2AK3によって直接的に影響を受け得るその標的タンパク質を同定す
るために、分子レベルでのEIF2AK3に関する更なる研究が必要である。
拠及び仮説が提起された。軟骨細胞で発現される遺伝子の変異は、WRS(軟骨
無形成症/骨端異形成症/軟骨形成不全症/低軟骨形成症/骨粗鬆症/関節炎)
で観察される骨疾患と同様な多くの骨疾患の原因であることが知られている。例
えば、これも膵島細胞で強く発現しているFGFR3の機能獲得型(gain-of-fun
ction)変異(Hughes, S. E., J. Histochem. Cytochem., 45,1005-19,1997)は、
軟骨形成不全症と低軟骨形成症の原因である(Rousseau, F., ら, Nature, 371,2
52-4,1994; Rousseau, F., ら, J. Med. Genet. 33,749-52,1996)。FGFR3
の変異及びこれらの疾患に関与する他の遺伝子の優性効果とは対照的に、WRS
表現型は劣性である。即ち、EIF2AK3は、膵臓及び/又は軟骨細胞からの
特定のタンパク質に対する負の制御を発揮し、正常条件下でこれらの器官の十分
な発育と機能を保証するのかもしれず、一方、WRS患者では、機能性EIF2
AK3の喪失が、この(これらの)タンパク質の過剰発現に従い、異なる器官と
関連する観察される表現型を作り得る。この仮説は、タンパク質翻訳のレベルに
対するEIF2AK3のダウン−レギュレーション効果と一致する。EIF2A
K3は胎盤で発現するので、母性EIF2AK3の発現のために、胚発育は正常
のままであり得、一方、これらの機構によって影響を受ける産後の成長と発育プ
ロセスは変わるだろう。この仮説を試すために、特に、このモデルで、その制御
がEIF2AK3によって直接的に影響を受け得るその標的タンパク質を同定す
るために、分子レベルでのEIF2AK3に関する更なる研究が必要である。
【0114】
WRSにおける糖尿病は自己免疫病因を有するようには思われないけれども、
患者が永久にインスリン依存性糖尿病であるという事実は、該症候群にかかわる
生物学的プロセスが、他の遺伝子因子(特にMHC及びインスリン遺伝子におい
て)と共に、典型的自己免疫インスリン依存性糖尿病(diabetes mellitus)(I
DDM)と関連しうることを示唆する。最近、新規遺伝子であるWFS1が、こ
れもまた膵臓β−細胞の喪失を特徴とする若年発症インスリン依存性糖尿病を含
む別のメンデリアン症候群(ウオルフラム症候群)の原因であることが示され、
このような遺伝子がIDDMに対する感受性を調節するのに重要でありうること
が考えられた(Inoue; H.ら, 1998)。フランスと米国からの多岐にわたるIDD
MファミリーでのマイクロサテライトマーカーとEIF2AK3変異体の予備的
な研究では、我々は、IDDM感受性への関係の有意な証拠を検出できなかった
(データは示さず)。しかし、このことは、調べたファミリーのサンプルのサイ
ズが限られていたこと、遺伝子の幾つかのリスク変異体の存在(そのうちの一部
は稀少でありうる)、又は我々の研究でカバーされなかった調節領域又はイント
ロン領域にそれらが位置していることによるものでありうる。この特定の領域へ
の連鎖の証拠は、IDDM (Hashimoto, L., ら, Nature, 371,161-164, 1994;
Davies, J. L., ら, Nature, 371,130-136,1994; Mein, C. A., ら, Nature Gen
et, 19,297-300,1998; Concannon, P., ら, Nature Genet, 19,292-296,1998)及
びインスリン非依存性糖尿病(Hanis, C. L., ら, Nature Genet, 13,161-6,1996
; Pratley, R. E., ら, J. Clin. Invest., 101,1757-64,1998)の他の研究では
報告されなかった。本明細書で記載した多型は、異なる源からの患者及びファミ
リーにおけるEIF2AK3の直接的試験によって、通常の型の糖尿病とのその
かかわりの問題を確認することを可能とするだろう。
患者が永久にインスリン依存性糖尿病であるという事実は、該症候群にかかわる
生物学的プロセスが、他の遺伝子因子(特にMHC及びインスリン遺伝子におい
て)と共に、典型的自己免疫インスリン依存性糖尿病(diabetes mellitus)(I
DDM)と関連しうることを示唆する。最近、新規遺伝子であるWFS1が、こ
れもまた膵臓β−細胞の喪失を特徴とする若年発症インスリン依存性糖尿病を含
む別のメンデリアン症候群(ウオルフラム症候群)の原因であることが示され、
このような遺伝子がIDDMに対する感受性を調節するのに重要でありうること
が考えられた(Inoue; H.ら, 1998)。フランスと米国からの多岐にわたるIDD
MファミリーでのマイクロサテライトマーカーとEIF2AK3変異体の予備的
な研究では、我々は、IDDM感受性への関係の有意な証拠を検出できなかった
(データは示さず)。しかし、このことは、調べたファミリーのサンプルのサイ
ズが限られていたこと、遺伝子の幾つかのリスク変異体の存在(そのうちの一部
は稀少でありうる)、又は我々の研究でカバーされなかった調節領域又はイント
ロン領域にそれらが位置していることによるものでありうる。この特定の領域へ
の連鎖の証拠は、IDDM (Hashimoto, L., ら, Nature, 371,161-164, 1994;
Davies, J. L., ら, Nature, 371,130-136,1994; Mein, C. A., ら, Nature Gen
et, 19,297-300,1998; Concannon, P., ら, Nature Genet, 19,292-296,1998)及
びインスリン非依存性糖尿病(Hanis, C. L., ら, Nature Genet, 13,161-6,1996
; Pratley, R. E., ら, J. Clin. Invest., 101,1757-64,1998)の他の研究では
報告されなかった。本明細書で記載した多型は、異なる源からの患者及びファミ
リーにおけるEIF2AK3の直接的試験によって、通常の型の糖尿病とのその
かかわりの問題を確認することを可能とするだろう。
【0115】
自己免疫疾患遺伝子座のクラスタリングの証拠は、現在までヒトにおいてこの
領域で報告されていないけれども(Becker, K. G., ら, Proc. Natl. Acad. Sci.
U. S. A., 95,9979-84,1998)、マウス及びラットにおいて、自己免疫疾患及び
炎症性疾患の独立した研究によって、これらの疾患に感受性のある幾つかの遺伝
子が、EIF2AK3へのシンテニィ領域にマッピングされたことは、注目すべ
きである(Kawahito, Y., ら, J. Immunol., 161,4411-9,1998)。特に、感受性の
ある遺伝子座が、インスリン依存性糖尿病について、マウスで、この領域に以前
にマッピングされ(de Gouyon, B., ら, Proc. Natl. Acad. Sci., U. S. A., 90
,1877-81,1993)、関節炎の幾つかのモデルについての遺伝子座がこの領域にマッ
ピングされた:ラット(Remmers, E. F., ら, Nature Genet, 14,82-5,1996)及び
マウス(Yang, H. T., ら, J. Immunol. 163,2916-21,1999)におけるコラーゲン
誘導型関節炎(CIA)、ラットにおけるマイコバクテリア誘導型関節炎(AI
A)(Kawahito, Y. et., 1998)及びマウスにおけるプリスタン誘導型関節炎(P
IA)(Vingsbo Lundberg, C., ら, Nature Genet, 20,401-4,1998)。しかし、
現在まで、幾つかのモデル生物でマッピングされた多数の自己免疫疾患遺伝子座
、並びに多くの場合にこれらの遺伝子座と関連する大きな信頼区間のせいで、こ
のような疾患に感受性のある遺伝子の比較マッピング結果の解釈は注意を要し、
これらの特定の疾患モデルにおけるEIF2AK3の関与を評価するためには、
更なる研究を要するであろう。
領域で報告されていないけれども(Becker, K. G., ら, Proc. Natl. Acad. Sci.
U. S. A., 95,9979-84,1998)、マウス及びラットにおいて、自己免疫疾患及び
炎症性疾患の独立した研究によって、これらの疾患に感受性のある幾つかの遺伝
子が、EIF2AK3へのシンテニィ領域にマッピングされたことは、注目すべ
きである(Kawahito, Y., ら, J. Immunol., 161,4411-9,1998)。特に、感受性の
ある遺伝子座が、インスリン依存性糖尿病について、マウスで、この領域に以前
にマッピングされ(de Gouyon, B., ら, Proc. Natl. Acad. Sci., U. S. A., 90
,1877-81,1993)、関節炎の幾つかのモデルについての遺伝子座がこの領域にマッ
ピングされた:ラット(Remmers, E. F., ら, Nature Genet, 14,82-5,1996)及び
マウス(Yang, H. T., ら, J. Immunol. 163,2916-21,1999)におけるコラーゲン
誘導型関節炎(CIA)、ラットにおけるマイコバクテリア誘導型関節炎(AI
A)(Kawahito, Y. et., 1998)及びマウスにおけるプリスタン誘導型関節炎(P
IA)(Vingsbo Lundberg, C., ら, Nature Genet, 20,401-4,1998)。しかし、
現在まで、幾つかのモデル生物でマッピングされた多数の自己免疫疾患遺伝子座
、並びに多くの場合にこれらの遺伝子座と関連する大きな信頼区間のせいで、こ
のような疾患に感受性のある遺伝子の比較マッピング結果の解釈は注意を要し、
これらの特定の疾患モデルにおけるEIF2AK3の関与を評価するためには、
更なる研究を要するであろう。
【0116】
これらの知見はまた、WRSで観察される他の病理学的兆候を理解するのに関
連しうる。特に、WRS患者は初期腎臓合併症に罹患し、ネフロパシーに至り、
それ故、この遺伝子は糖尿病性ネフロパシーの妥当な候補となる。糖尿病におけ
る骨粗鬆症(その発症は非糖尿病集団におけるよりも大きい)でのこの遺伝子の
変異体の試験も興味深いであろう。
連しうる。特に、WRS患者は初期腎臓合併症に罹患し、ネフロパシーに至り、
それ故、この遺伝子は糖尿病性ネフロパシーの妥当な候補となる。糖尿病におけ
る骨粗鬆症(その発症は非糖尿病集団におけるよりも大きい)でのこの遺伝子の
変異体の試験も興味深いであろう。
【0117】
実施例6:1型糖尿病(T1DM)におけるEIF2AK3の関与
EIF2AK3領域に位置するマイクロサテライトと、糖尿病との連鎖の証明
上記実施例で、EIF2AK3遺伝子での変異がウオルコット−ラリソン症候
群の原因である証拠が示された。この症候群は、特に、永久性新生児若しくは乳
児発症インスリン依存性糖尿病及び多発性骨端異形成症と関連し、このことは、
この遺伝子が、1型糖尿病(T1DM)及び2型糖尿病(T2DM)を含む、よ
り頻度の高い型の糖尿病に関与しうることを強く示唆する。
群の原因である証拠が示された。この症候群は、特に、永久性新生児若しくは乳
児発症インスリン依存性糖尿病及び多発性骨端異形成症と関連し、このことは、
この遺伝子が、1型糖尿病(T1DM)及び2型糖尿病(T2DM)を含む、よ
り頻度の高い型の糖尿病に関与しうることを強く示唆する。
【0118】
先に考察したように、T1DMの感受性遺伝子をマッピングするために、幾つ
かのグループが多岐にわたる1型糖尿病ファミリーのゲノム−ワイドスクリーニ
ングを行った。T1DMに関するこれらの刊行された結果において、並びに、同
様にT2DMで行われたゲノム−ワイドスクリーニングにおいて、EIF2AK
3遺伝子(染色体領域2p12)近傍に位置するマイクロサテライトマーカーの
、糖尿病との連鎖の証拠はなく、このことは糖尿病に対するこの遺伝子の遺伝子
変異の寄与が小さい可能性があり、見逃されるかもしれないことを示唆している
。遺伝的効果が検出されない幾つかのあり得る理由(例えば、サンプルサイズが
小さいことによって研究の力が限定されること、糖尿病への感受性へ寄与するマ
イナーな遺伝子的効果の多様性、並びに集団内及び集団間での遺伝学的及び環境
的不均質性)がある。
かのグループが多岐にわたる1型糖尿病ファミリーのゲノム−ワイドスクリーニ
ングを行った。T1DMに関するこれらの刊行された結果において、並びに、同
様にT2DMで行われたゲノム−ワイドスクリーニングにおいて、EIF2AK
3遺伝子(染色体領域2p12)近傍に位置するマイクロサテライトマーカーの
、糖尿病との連鎖の証拠はなく、このことは糖尿病に対するこの遺伝子の遺伝子
変異の寄与が小さい可能性があり、見逃されるかもしれないことを示唆している
。遺伝的効果が検出されない幾つかのあり得る理由(例えば、サンプルサイズが
小さいことによって研究の力が限定されること、糖尿病への感受性へ寄与するマ
イナーな遺伝子的効果の多様性、並びに集団内及び集団間での遺伝学的及び環境
的不均質性)がある。
【0119】
本実施例では、1型糖尿病におけるEIF2AK3の関与を支持する補足的情
報を提供する。 本実施例は特に、幾つかの集団群で、EIF2AK3領域に位置するマイクロ
サテライトの、糖尿病との連鎖の証拠を示す。 スカンジナビア人集団(環境と遺伝学的バックグラウンドにおいて比較的均一
であると考えられている集団群)においてゲノム−ワイドな調査をやり遂げた。
ファミリーパネルは、デンマーク、スウェーデン及びノルウェーからの426の
多様な家族と485の罹患した同胞対(sibpair)を含んでいた(ECIGSコン
ソーシアム−インスリン依存性糖尿病ゲノム精査のための欧州コンソーシアム)
。
報を提供する。 本実施例は特に、幾つかの集団群で、EIF2AK3領域に位置するマイクロ
サテライトの、糖尿病との連鎖の証拠を示す。 スカンジナビア人集団(環境と遺伝学的バックグラウンドにおいて比較的均一
であると考えられている集団群)においてゲノム−ワイドな調査をやり遂げた。
ファミリーパネルは、デンマーク、スウェーデン及びノルウェーからの426の
多様な家族と485の罹患した同胞対(sibpair)を含んでいた(ECIGSコン
ソーシアム−インスリン依存性糖尿病ゲノム精査のための欧州コンソーシアム)
。
【0120】
ゲノム全体にわたり位置する314のマイクロサテライトマーカーを用い、ゲ
ノムワイドスクリーニングを行った(平均マーカー間間隔11cM)。EIF2
AK3近傍でマーカー密度を増大させるために、補足的マイクロサテライトマー
カータイピングを行った。単一点解析のためにANALYZEプログラムを用い
(J. Terwilliger, プログラムSIBPAIR:核家族に関する同胞対解析, ftp ://link
age.cpcm.columbia.edu)、並びに多点解析のためにASPEXプログラムを用い
(E. Hauser, ら, Genet Epidemiol. 13,117-37,1996; D. Hinds and N. Risch,
The ASPEXパッケージ:罹患同胞対マッピング, ftp://lahmed.standford.edu/pub
/aspex)、連鎖解析を行った。
ノムワイドスクリーニングを行った(平均マーカー間間隔11cM)。EIF2
AK3近傍でマーカー密度を増大させるために、補足的マイクロサテライトマー
カータイピングを行った。単一点解析のためにANALYZEプログラムを用い
(J. Terwilliger, プログラムSIBPAIR:核家族に関する同胞対解析, ftp ://link
age.cpcm.columbia.edu)、並びに多点解析のためにASPEXプログラムを用い
(E. Hauser, ら, Genet Epidemiol. 13,117-37,1996; D. Hinds and N. Risch,
The ASPEXパッケージ:罹患同胞対マッピング, ftp://lahmed.standford.edu/pub
/aspex)、連鎖解析を行った。
【0121】
更に、DR3/DR4の両方のヘテロ接合性(高リスクHLA群)である糖尿
病同胞対のサブセット、並びにDR3アレルもDR4アレルも共有しない(低リ
スクHLA群)糖尿病患者で解析を行った。連鎖結果を下記の表6に示す。
病同胞対のサブセット、並びにDR3アレルもDR4アレルも共有しない(低リ
スクHLA群)糖尿病患者で解析を行った。連鎖結果を下記の表6に示す。
【0122】
【表7】
【0123】
全部:全ての糖尿病同胞対
DR3/4:HLA−DR3/4の両方の糖尿病同胞対
【0124】
連鎖の示唆的証拠が、単一点解析(ロッド−スコア2.49まで)及び多点解
析(ロッド−スコアピーク2.51、D2S388−D2S113の区間で)で
見出された。低リスクHLA群で、連鎖の証拠は見出されなかったが(示さず)
、高リスクHLA群で連鎖の増大した証拠が見出された(単一ポイント解析で、
ロッド−スコア4.26まで)。 EIF2AK3での変異又はEIF2AK3近傍に位置する別の遺伝子が、ス
カンジナビア人集団において1型糖尿病への感受性に関与するという仮説を、こ
れらの補足的な結果は支持している。EIF2AK3での変異は、インスリン依
存性糖尿病の1形態を生じ得るので、EIF2AK3は、染色体2p12のこの
領域に位置するマイクロサテライトマーカーで検出される連鎖の原因の遺伝子で
あるという仮説を我々は好む。
析(ロッド−スコアピーク2.51、D2S388−D2S113の区間で)で
見出された。低リスクHLA群で、連鎖の証拠は見出されなかったが(示さず)
、高リスクHLA群で連鎖の増大した証拠が見出された(単一ポイント解析で、
ロッド−スコア4.26まで)。 EIF2AK3での変異又はEIF2AK3近傍に位置する別の遺伝子が、ス
カンジナビア人集団において1型糖尿病への感受性に関与するという仮説を、こ
れらの補足的な結果は支持している。EIF2AK3での変異は、インスリン依
存性糖尿病の1形態を生じ得るので、EIF2AK3は、染色体2p12のこの
領域に位置するマイクロサテライトマーカーで検出される連鎖の原因の遺伝子で
あるという仮説を我々は好む。
【0125】
実施例7:第3のWRS変異
ウオルコット−ラリソン症候群のアフリカ人患者(そのDNAは、Dr. Cather
ine Diatloff (Hopital Necker,パリ)によって供給された)で、ホモ接合性で存
在する第3の変異が同定された。 この第3の変異は、エキソン12中に位置するミスセンス変異である。 −cDNAレファレンス配列で第3の変異の位置(Genbank番号:AF1101
46):2037T>A(T=正常,A=変異)
ine Diatloff (Hopital Necker,パリ)によって供給された)で、ホモ接合性で存
在する第3の変異が同定された。 この第3の変異は、エキソン12中に位置するミスセンス変異である。 −cDNAレファレンス配列で第3の変異の位置(Genbank番号:AF1101
46):2037T>A(T=正常,A=変異)
【0126】レファレンスタンパク質配列でのアミノ酸変化
655N(Asn)>K(Lys)(N=正常,K=変異)
このアミノ酸変化は、キナーゼサブドメインIV内に位置し、恐らく、機能が
劇的に変化しているタンパク質を生じる。
劇的に変化しているタンパク質を生じる。
【図1】
WRSに連鎖する可能性のある3つの領域でマイクロサテライトマーカーの拡
張されたセットのキャラクタリゼーションからの結果。 図1A:ファミリーWRS1とWRS2の領域1(染色体2) 図1B:領域2(染色体2);及び 図1C:ファミリーWRS1の領域3(染色体9)。 WRS患者へ遺伝された親のハプロタイプは全体にわたって同一ではなかった
ので、領域2及び3は、目的とするものではありそうではないとして却下された
(図1B及び1C)。 マーカー順序は、公共のデータベースから得られ、これらのファミリーで観察
された組換えに基づき、必要な場合には修正した。幾つかの密接に関連している
マーカーの場合、限られた情報又は公共で利用できるデータ間の矛盾の故に、そ
の順序は曖昧なままであった。
張されたセットのキャラクタリゼーションからの結果。 図1A:ファミリーWRS1とWRS2の領域1(染色体2) 図1B:領域2(染色体2);及び 図1C:ファミリーWRS1の領域3(染色体9)。 WRS患者へ遺伝された親のハプロタイプは全体にわたって同一ではなかった
ので、領域2及び3は、目的とするものではありそうではないとして却下された
(図1B及び1C)。 マーカー順序は、公共のデータベースから得られ、これらのファミリーで観察
された組換えに基づき、必要な場合には修正した。幾つかの密接に関連している
マーカーの場合、限られた情報又は公共で利用できるデータ間の矛盾の故に、そ
の順序は曖昧なままであった。
【図2】
WRS患者でのEIF2AK3変異。
配列クロマトグラムは、WRS1ファミリー(図2A:1103−insT)と
WRS2ファミリー(図2B:1832G>A)からのインデックス患者及び正
常対照での変異の領域について示している。ゲノムDNAの配列決定(両方のフ
ァミリー)及びPCR−RFLPアッセイ(WRS1)によって、対応する遺伝
子型を決定した。WRS2ファミリーでは、配列中にイントロン10−811A
/Tでの頻度の高い多型がみられる(インデックス患者:T/T;対照:A/A
)。
WRS2ファミリー(図2B:1832G>A)からのインデックス患者及び正
常対照での変異の領域について示している。ゲノムDNAの配列決定(両方のフ
ァミリー)及びPCR−RFLPアッセイ(WRS1)によって、対応する遺伝
子型を決定した。WRS2ファミリーでは、配列中にイントロン10−811A
/Tでの頻度の高い多型がみられる(インデックス患者:T/T;対照:A/A
)。
【図3】
タンパク質レベルでのWRSファミリーからのEIF2AK3変異の影響。
図3A:WRS1ファミリー及びWRS2ファミリーでの変異(それぞれ、in
s345fs/ter345及びR587Q)を示している。シグナルペプチドは黒に
色づけており、制御ドメインはしま線(batched line)で示され、触媒ドメインは
着色されていない。 図3B:異なる生物からのEIF2αキナーゼ及び関連キナーゼ(WEE1)
について、R587Q変異近くでの、アミノ酸配列保存を示している。配列アラ
インメントを、BLASTプログラムを用いて行った。正確な保存は赤で示し、
保存的変化は黄で示し、非保存的変化には色づけしていない。キナーゼサブドメ
インI及びII(部分)を示す。
s345fs/ter345及びR587Q)を示している。シグナルペプチドは黒に
色づけており、制御ドメインはしま線(batched line)で示され、触媒ドメインは
着色されていない。 図3B:異なる生物からのEIF2αキナーゼ及び関連キナーゼ(WEE1)
について、R587Q変異近くでの、アミノ酸配列保存を示している。配列アラ
インメントを、BLASTプログラムを用いて行った。正確な保存は赤で示し、
保存的変化は黄で示し、非保存的変化には色づけしていない。キナーゼサブドメ
インI及びII(部分)を示す。
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フロントページの続き
(51)Int.Cl.7 識別記号 FI テーマコート゛(参考)
A61K 45/00 A61P 1/16 4C084
48/00 3/10 4C085
A61P 1/16 13/12 4H045
3/10 19/02
13/12 19/10
19/02 25/18
19/10 C07K 16/40
25/18 C12N 1/15
C07K 16/40 1/19
C12N 1/15 1/21
1/19 9/12
1/21 C12Q 1/48 Z
5/10 1/68 A
9/12 C12P 21/08
C12Q 1/48 C12N 15/00 ZNAA
1/68 5/00 A
// C12P 21/08 A61K 37/52
(81)指定国 EP(AT,BE,CH,CY,
DE,DK,ES,FI,FR,GB,GR,IE,I
T,LU,MC,NL,PT,SE,TR),CA,J
P,US
(71)出願人 サントル ナシオナル ドゥ ジェノティ
パージュ
フランス国、エフ−91000 エヴリー、リ
ュ ガストン クレミユ 2
(72)発明者 ジュリエール、セシル
フランス国、エフ−75014 パリ、リュ
ドゥ ラ トーンブ イソワール 35
(72)発明者 デルピンヌ、マルク
フランス国、エフ−75011 パリ、アンパ
ス トゥルイヨ 21
(72)発明者 ニコリノ、マルク
フランス国、エフ−69006 リヨン、リュ
デュゲスクラン 105
Fターム(参考) 4B024 AA01 AA11 BA10 CA04 DA02
DA06 EA04 GA11 HA12 HA17
4B050 CC03 DD11 LL01 LL03
4B063 QA12 QA19 QQ08 QQ26 QQ43
QR32 QR55 QR62 QS25 QS34
4B064 AG27 CA10 CA20 CC24 DA13
4B065 AA26X AA90X AA99Y AB01
AC14 BA02 CA25 CA29 CA44
CA46
4C084 AA02 AA06 AA07 AA13 AA17
BA44 CA53 DC25 NA10 ZA152
ZA672 ZA752 ZA812 ZA892
ZA962 ZA972 ZC352
4C085 AA13 AA14 BB22 BB41 BB43
CC02 CC23 DD63 DD88 EE01
4H045 AA10 AA11 AA30 BA10 CA40
DA76 DA89 EA28 EA50 FA74
Claims (58)
- 【請求項1】 翻訳開始因子2アルファキナーゼ3(EIF2AK3)をコ
ードする遺伝子の哺乳動物ゲノム配列の単離された変異型核酸配列であって、該
EIF2AK3タンパク質は配列番号2の配列を有し、哺乳動物における該変異
体配列の存在が、ウオルコット−ラリソン症候群(WRS)を誘導し得るか、あ
るいは糖尿病及び/又はWRS関連病変の発症若しくは進行の危険性に影響を及
ぼすことを特徴とする変異型核酸配列。 - 【請求項2】 該糖尿病及び/又はWRS関連病変が、1型糖尿病、2型糖
尿病、それ以外の型の糖尿病、骨粗鬆症、関節炎、肝不全、ネフロパシー及び他
の腎不全並びに精神遅滞からなる群から選択されることを特徴とする請求項1に
記載の単離された変異型核酸配列。 - 【請求項3】 該糖尿病及び/又はWRS関連病変が、1型糖尿病、2型糖
尿病、及びそれ以外の型の糖尿病からなる群から選択されることを特徴とする請
求項1又は2に記載の単離された変異型核酸配列。 - 【請求項4】 該糖尿病及び/又はWRS関連病変が、膵臓β−細胞又はそ
の完全性の重大な減少と関連していることを特徴とする請求項1〜3に記載の単
離された変異型核酸配列。 - 【請求項5】 該糖尿病及び/又はWRS関連病変が、膵臓及び/又は軟骨
細胞に由来する特定のタンパク質に対してEIF2AK3によって発揮される制
御の変化から生じ、もし制御が正常に発揮されるのならば、該制御が、これらの
器官の十分な発育と機能を保証する、ということを特徴とする請求項1〜4に記
載の単離された変異型核酸配列。 - 【請求項6】 該変異体配列が、配列番号3〜15の配列又はそれらのフラ
グメントからなる群より選択される配列を含む(但し、請求項1に記載の単離さ
れた変異型核酸配列は、配列番号1の配列ではない)ことを特徴とする請求項1
〜5に記載の単離された変異型核酸配列。 - 【請求項7】 該変異型配列によってコードされるタンパク質EIF2AK
3が、EIF2AK3の配列番号2の配列と比較して少なくとも1つの点変異を
示すことを特徴とする請求項1〜6に記載の単離された変異型核酸配列。 - 【請求項8】 該変異型配列によってコードされるタンパク質EIF2AK
3が、未熟終結、又は配列番号2の配列を有するタンパク質EIF2AK3の触
媒ドメインaa576−aa1115中に少なくとも1つの点変異を示すことを
特徴とする請求項1〜7に記載の単離された変異型核酸配列。 - 【請求項9】 配列番号1の配列中、位置1103でTの挿入又は位置18
32でGからAへのトランジッションを含むことを特徴とする請求項1〜8に記
載の単離された変異型核酸配列。 - 【請求項10】 表4A及びB並びに表5のカラム「cDNA位置」及び/
又は「ゲノムDNA位置」において規定される核酸配列多型の少なくとも1つを
含むことを特徴とする請求項1〜8に記載の変異型核酸配列。 - 【請求項11】 ヒト核酸配列から選択されることを特徴とする請求項1〜
10に記載の単離された変異型核酸配列。 - 【請求項12】 請求項1〜11に記載の変異型核酸配列の相補的配列。
- 【請求項13】 請求項1〜11に記載の単離された変異型核酸配列によっ
てコードされるポリペプチドであって、そのアミノ酸配列が、EIF2AK3の
配列番号2の配列と比較して少なくとも1つの点変異を示すことを特徴とする、
ポリペプチド。 - 【請求項14】 表4A及び5のカラム「アミノ酸」中で列挙したアミノ酸
変異の少なくとも1つを含むことを特徴とする請求項12に記載のポリペプチド
。 - 【請求項15】 請求項13及び14のうちの1項に記載のポリペプチドを
コードすることを特徴とする単離された核酸配列。 - 【請求項16】 a)少なくとも12塩基を含む、請求項1〜12及び15
のいずれか1項に記載の核酸配列のフラグメント; b)a)で規定された核酸配列と特異的にハイブリダイズでき、且つ少なくとも
12塩基を含む核酸配列; からなる群から選択されることを特徴とする単離された核酸配列。 - 【請求項17】 プライマー又はプローブとしての請求項16に記載の単離
された核酸配列。 - 【請求項18】 配列番号16〜105の配列からなる群から選択されるこ
とを特徴とする請求項16及び17に記載の単離された核酸配列。 - 【請求項19】 その配列が、請求項16及び18のうちの1項に記載の配
列から選択されることを特徴とする、センス又はアンチ−センスオリゴヌクレオ
チドとして使用できる核酸配列。 - 【請求項20】 請求項16及び19のうちの1項に記載の核酸配列を含む
クローニング及び/又は発現ベクター。 - 【請求項21】 宿主細胞において該配列の発現及び/分泌を可能とする要
素を含むことを特徴とする請求項20に記載のベクター。 - 【請求項22】 請求項20及び21のうちの1項に記載のベクターによっ
て形質転換された宿主細胞。 - 【請求項23】 真核又は原核細胞であることを特徴とする請求項22に記
載の細胞。 - 【請求項24】 請求項22又は23に記載の細胞を含むことを特徴とする
ヒトを除く哺乳動物。 - 【請求項25】 核酸配列の検出及び/又は増幅のためのプライマー又はプ
ローブとしての、請求項16〜18のうちの1項に記載の核酸配列の使用。 - 【請求項26】 組換え又は合成ポリペプチドの製造のための請求項1〜1
2及び15のうちの1項に記載の核酸配列の使用。 - 【請求項27】 該組換えポリペプチドの発現を可能とする条件下、請求項
22及び23のうちの1項に記載の形質転換細胞を培養し、該組換えポリペプチ
ドを回収することを特徴とする、組換えポリペプチドの製造方法。 - 【請求項28】 請求項26に記載の方法によって得ることができることを
特徴とする組換え又は合成ポリペプチド。 - 【請求項29】 請求項13、14及び28のうちの1項に記載のポリペプ
チドを特異的に認識できることを特徴とする、モノ−又はポリクローナル抗体、
若しくはそのフラグネント、キメラ抗体、又はイムノコンジュゲート抗体。 - 【請求項30】 請求項16〜18のうちの1項に記載の核酸配列を使用す
ることを特徴とする、生体試料又はライブラリー中に含まれるRNA、cDNA
又はゲノムDNAをスクリーニングする方法。 - 【請求項31】 請求項1〜12及び15〜18のうちの1項に記載の核酸
配列を使用することを特徴とする、アレル変異、又はヘテロ接合性の喪失を決定
する方法。 - 【請求項32】 糖尿病及び/又はWRS関連病変、又は配列番号2の配列
を有するポリペプチドの異常発現と関連した病変の診断方法であって、請求項2
9に記載の1つ以上の抗体を、試験する生物材料と、該ポリペプチドと該抗体と
の特異的免疫複合体の可能性ある形成を可能とする条件下で接触させ、形成され
る可能性のある免疫複合体を検出することを特徴とする方法。 - 【請求項33】 被験者が、糖尿病及び/又はWRS関連病変を有する危険
性の減少若しくは増大にあるかどうかの決定方法であって、 a)被験者からゲノムDNA又はRNAを含む生体試料を集めること; b)タンパク質EIF2AK3をコードする少なくとも1つの遺伝子アレル又は
RNAで、糖尿病及び/又はWRS関連病変を有する危険性の減少又は増大に関
連した多型を含む可能性のあるDNA又はRNAのフラグメントの配列、又はそ
の長さを決定すること(ここで、フラグメントは、請求項16〜18のうちの1
項に記載の1セットのプライマーを用いるポリメラーゼ・チェーン・リアクショ
ンで増幅できる); c)DNA又はRNAのフラグメントの配列が、WRS関連病変を有する危険性
の減少又は増大に関連した多型を含むかどうかを観察することによって、被験者
が、糖尿病及び/又はWRS関連病変を有する危険性の減少又は増大にあるかど
うかを観察すること(ここで、該多型の存在は、被験者が糖尿病及び/又はWR
S関連病変を有する危険性の減少又は増大にあることを示す); のステップを含む方法。 - 【請求項34】 そのファミリーの1員がWRSに罹患している被験者がW
RSを有する危険性があるかどうかを決定する為のインビトロ方法であって、 a)被験者からゲノムDNA又はRNAを含む生体試料を集めること; b)EIF2AK3遺伝子の両方のアレルの配列で、WRSを有する危険性に関
連した多型を含む可能性のあるDNA又はRNAのフラグメントの配列、又はそ
の長さを決定すること(ここで、フラグメントは、請求項16〜18のうちの1
項に記載の1セットのプライマーを用いるポリメラーゼ・チェーン・リアクショ
ンで増幅できる); c)両方のアレルで、DNA又はRNAのフラグメントの配列がWRSを有する
危険性に関連した変異を担持しているかどうかを観察することによって、被験者
がWRSを有する危険性があるかどうかを観察すること(ここで、該変異の存在
は、被験者がWRSを有する危険性があることを示す); のステップを含む方法。 - 【請求項35】 WRSを有する危険性の診断のための請求項34に記載の
方法であって、 ステップb)でWRSを有する危険性に関連した多型が、配列番号1の配列中、
位置1103でのTの挿入又は位置1832でのGからAへのトランジッション
に対応する変異の存在であること(ここで、被験者のEIF2AK3遺伝子アレ
ルの各々での変異の存在は、被験者がWRSを有する危険性があることを示す)
を特徴とする方法。 - 【請求項36】 そのファミリーの1員がWRSに罹患している被験者がW
RSを有する危険性があるかどうかを決定する為のインビトロ方法であって、 a)WRSに罹患しているファミリーの1員及び被験者からゲノムDNA又はR
NAを含む生体試料を集めること; b)WRSに罹患しているファミリーの1員及び被験者が、EIF2AK3遺伝
子の近く、又はその中に位置する多型マーカーを比較することによってアレル同
一性を示すかどうかを決定すること(ここで、WRSに罹患しているファミリー
の1員及び被験者の間の遺伝子型同一性は、WRSを有する危険性があることを
示す); のステップを含む方法。 - 【請求項37】 そのファミリーの1員がWRSに罹患している被験者がW
RSを有する危険性があるかどうかを決定する為の請求項36に記載の方法であ
って、 a)WRSに罹患しているファミリーの1員及び被験者からゲノムDNA又はR
NAを含む生体試料を集めること; b)ファミリーの1員の両方のEIF2AK3遺伝子アレル上で、WRSを有す
る危険性に関連する多型を含む可能性のあるDNA又はRNAのフラグメントの
配列を決定すること(ここで、フラグメントは、請求項16〜18のうちの1項
に記載の1セットのプライマーを用いるポリメラーゼ・チェーン・リアクション
で増幅できる); c)ステップb)で同定したWRS罹患の原因であるフラグメントの配列の変異
が、被験者の両方のEIF2AK3遺伝子アレルの同一のフラグメントに存在す
るかどうかを決定すること(ここで、フラグメントは、請求項16〜18のうち
の1項に記載の1セットのプライマーを用いるポリメラーゼ・チェーン・リアク
ションで増幅できる); d)被験者の両方のEIF2AK3遺伝子アレル上のフラグメントの配列が、フ
ァミリーの1員についてステップb)で同定された同一の変異を含むかどうかを
観察すること(ここで、両方のアレル上での変異の存在は、被験者がWRSを有
する危険性があることを示す); のステップを含む方法。 - 【請求項38】 ポリメラーゼ・チェーン・リアクション後、結局は、逆転
写のステップ後、に得られた増幅産物のサイズの決定及び/又は配列決定によっ
て、多型を含む可能性のあるDNA又はRNAのフラグメントの配列又はその長
さがステップb)で得られる、請求項33〜37のいずれか1項に記載の方法。 - 【請求項39】 糖尿病及び/又はWRS関連病変を発症する危険性の減少
又は増大に関連した少なくとも1つの付加マーカーのレベルについて、被験者か
らの生体試料をアッセイする第2の方法を更に含むこと(ここで、少なくとも1
つのマーカーの有意なレベルの存在は、被験者が、糖尿病及び/又はWRS関連
病変を発症する危険性の減少又は増大にあるかどうかを確認することを可能とす
る)を特徴とする請求項33に記載の方法。 - 【請求項40】 被験者が、糖尿病及び/又はWRS関連病変を有する危険
性の減少又は増大にあるかどうかを決定する為のキットであって、 タンパク質EIF2AK3をコードし、糖尿病及び/又はWRS関連病変を有す
る危険性の減少又は増大と関連した多型を含む可能性のあるゲノムDNA又はR
NAのフラグメントを増幅できる少なくとも1対のプライマーを含む(ここで、
該プライマーは、請求項16〜18のうちの1項に記載のプライマーから選択さ
れる)キット。 - 【請求項41】 糖尿病及び/又はWRS関連病変を有する危険性の減少又
は増大と関連した少なくとも1つの付加マーカーのレベルについて、被験者から
の生体試料をアッセイする手段を更に含むことを特徴とする請求項40に記載の
キット。 - 【請求項42】 該関連付加マーカーが、糖尿病及び/又はWRS関連病変
を有する危険性の増大と関連した付加マーカーであることを特徴とする請求項4
1に記載のキット。 - 【請求項43】 被験者がWRSを有する危険性があるかどうかを決定する
為のキットであって、EIF2AK3遺伝子の近く、又はその中に位置する多型
マーカーを含むゲノムDNAのフラグメントを増幅できる少なくとも1対のプラ
イマーを含むキット。 - 【請求項44】 被験者がWRSを有する危険性があるかどうかを決定する
為のキットであって、 配列番号1の配列中、位置1103でのTの挿入又は位置1832でのGからA
へのトランジッションを含む可能性のあるEIF2AK3ゲノムDNAのフラグ
メントを増幅できる少なくとも1対のプライマーを含む(ここで、該プライマー
は、請求項16〜18のうちの1項に記載のプライマーから選択される)キット
。 - 【請求項45】 糖尿病及び/又はWRS関連病変が、1型糖尿病、2型糖
尿病、それ以外の型の糖尿病、骨粗鬆症、関節炎、肝不全、ネフロパシー及び他
の腎不全並びに精神遅滞からなる群から選択されることを特徴とする請求項32
、33及び39のいずれか1項に記載の方法又は請求項40〜42のいずれか1
項に記載のキット。 - 【請求項46】 糖尿病及び/又はWRS関連病変が、1型糖尿病、2型糖
尿病、及びそれ以外の型の糖尿病からなる群から選択されることを特徴とする請
求項32、33及び39のいずれか1項に記載の方法又は請求項40〜42のい
ずれか1項に記載のキット。 - 【請求項47】 糖尿病及び/又はWRS関連病変が、1型糖尿病であるこ
とを特徴とする請求項32、33及び39のいずれか1項に記載の方法又は請求
項40〜42のいずれか1項に記載のキット。 - 【請求項48】 EIF2AK3タンパク質の発現又は活性を研究する為の
、並びにEIF2AK3タンパク質と、EIF2AK3タンパク質の活性に関与
しうる化学的若しくは生化学的化合物との直接的又は間接的相互作用を研究する
為の、請求項22及び23のうちの1項に記載の細胞、請求項25に記載の哺乳
動物又は請求項13〜14及び28のうちの1項に記載のポリペプチドの使用。 - 【請求項49】 EIF2AK3タンパク質と直接的又は間接的に相互作用
でき、及び/又はEIF2AK3タンパク質の発現若しくは活性を調節できる化
学的若しくは生化学的化合物のスクリーニングの為の、請求項22及び23のう
ちの1項に記載の細胞、請求項25に記載の哺乳動物又は請求項13、14及び
28のうちの1項に記載のポリペプチドの使用。 - 【請求項50】 EIF2AK3タンパク質と直接的又は間接的に相互作用
でき、及び/又はEIF2AK3タンパク質の発現又は活性を調節することを可
能とすることができる化学的又は生化学的化合物の選択方法であって、請求項2
2及び23のうちの1項に記載の細胞、請求項25に記載の哺乳動物又は請求項
13、14及び28のうちの1項に記載のポリペプチドを使用することを特徴と
する方法。 - 【請求項51】 請求項50に記載の方法によって選択されることを特徴と
する化合物。 - 【請求項52】 −EIF2AK3タンパク質発現のレベルの調節;及び/
又は −膵臓β−細胞又はその完全性の増大;及び/又は −糖尿病及び/又はWRS関連病変の予防又は治療; を可能とすることを特徴とする請求項51に記載の化合物。 - 【請求項53】 a)請求項29に記載の抗体; b)請求項13、14及び28のうちの1項に記載のポリペプチド; c)請求項20及び21のどちらかに記載のベクター; d)請求項19に記載のセンス又はアンチ−センス核酸配列; から選択されることを特徴とする請求項51及び52のうちの1項に記載の化合
物。 - 【請求項54】 医薬としての、請求項51〜53のうちの1項に記載の化
合物。 - 【請求項55】 糖尿病及び/又はWRS関連病変の予防及び/又は治療の
ための請求項54に記載の化合物。 - 【請求項56】 糖尿病及び/又はWRS関連病変が、1型糖尿病、2型糖
尿病、それ以外の型の糖尿病、骨粗鬆症、関節炎、肝不全、ネフロパシー及び他
の腎不全並びに精神遅滞からなる群から選択されることを特徴とする請求項55
に記載の化合物。 - 【請求項57】 糖尿病及び/又はWRS関連病変が、1型糖尿病、2型糖
尿病、及びそれ以外の型の糖尿病からなる群から選択されることを特徴とする請
求項55に記載の化合物。 - 【請求項58】 糖尿病及び/又はWRS関連病変が、1型糖尿病であるこ
とを特徴とする請求項55に記載の化合物。
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