CN106957907B - 用于狗中的肝铜积累的遗传检测 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了检测狗以确定狗对肝铜积累的易感性的方法，包含检测样品中狗的基因组中一种或多种选自以下的多态性的存在或缺失：(a)SEQ ID NO:144,145,146,147,148,149,150,151,152,153,154,155，和位于染色体位置22:3135287的CGCCCC重复；(b)一种或多种与所述多态性(a)处于连锁不平衡的多态性；和/或(c)SEQ ID NO:156,157和158。

Description

用于狗中的肝铜积累的遗传检测
本申请是申请日为2012年12月06日，申请号为201280060211.3，发明名称为“用于狗中的肝铜积累的遗传检测”的发明专利申请的分案申请。
技术领域
本发明涉及确定狗对肝铜积累和铜相关肝脏疾病的易感性或狗受保护免于肝铜积累和铜相关肝脏疾病的可能性的方法。
背景技术
铜是对于体内的许多代谢过程重要的微量矿物质，并且因此是膳食中的重要部分。一旦通过肠道吸收，铜主要存储于肝脏，虽然其也可见于其他组织诸如骨髓、肌肉和脾脏。肝脏既储存铜又在协调分别通过血浆铜蓝蛋白和胆盐的铜运输和排泄中发挥核心作用。一般来说，铜缺乏是比毒性更为常见的问题。然而毒性确实发生并且可能对受到影响的动物造成严重影响。
尽管肝疾病在狗中不常见，但其最常见的形式之一是慢性肝炎(CH)。CH是组织学的诊断，其特征在于纤维化、炎症和肝细胞凋亡和坏死的存在。此疾病的最终阶段可导致肝硬化。CH的病因之一是肝铜积累。
肝铜积累可由于提高的铜摄入、肝铜代谢的原发性代谢缺陷或改变的铜胆汁排泄导致。在后一种情况中，铜毒性对于肝脏炎症、纤维化和胆汁淤积是继发性的，尽管不清楚这在狗中发生到何种程度。在继发性铜贮积病中，铜积累主要限于门脉周实质并且肝铜浓度低于家族贮积病中的积累。虽然起始因子和敏化抗原的性质未知，但是原发性胆汁性肝硬变中观察到的免疫学异常和形态学特征与免疫调节机制并存。
小肠被认为是哺乳动物中饮食铜吸收的主要部位。从肠腔向肠粘膜的运输是载体介导的过程，涉及可饱和的运输组分。一旦在粘膜细胞中，大约80%的新吸收的铜在细胞质中，其主要与金属硫蛋白(MT)结合。这些是低分子量的可诱导的蛋白具有许多功能，包括金属的动态平衡、储存、运输和解毒。在通过肠上皮细胞后，铜进入门脉循环，在那里铜结合载体蛋白肽和氨基酸并被运输至肝，且较少量进入肾。在大多数哺乳动物中，铜被容易地排泄，且铜主要排泄途径是胆汁。
肝铜积累过多的狗通常用D-青霉胺，一种强力的铜螯合剂来治疗。然而最终，能够用于患有CH的狗的最成功疗法为肝移植。
肝铜积累的遗传基础未知。其困难之处在于铜参与大量不同的生物学途径，各途径都高度复杂并涉及大量基因的事实。
WO 2009/044152 A2公开了确定狗对肝铜积累的易感性的方法，其包括检测(a)在狗的GOLGA5、ATP7a或UBL5基因中的指示对肝铜积累的易感性的多态性和/或(b)与所述多态性(a)处于连锁不平衡的多态性的存在或缺失，以及从而确定狗对肝铜积累的易感性。
WO 2010/038032 A1和WO 2010/116137 A1公开了另外的多态性用于确定狗对肝铜积累的易感性的方法。它们还公开了多态性用于确定狗受到保护免于肝铜积累的可能性的方法。
发明内容
本发明人发现在狗基因组中的许多多态性与对肝铜积累的易感性相关。他们还发现在狗基因组中的多态性与免于肝铜积累的保护相关。这些多态性的发现为通过筛选多态性来预测狗对肝铜积累的易感性或狗受保护免于肝铜积累的可能性的检测提供了基础。检测的预测能力可以使用涉及将一种或多种所定义多态性的检测结果组合的模型而放大。将一种或多种指示狗受保护免于肝铜积累的多态性的检测结果和一种或多种指示狗对肝铜积累易感性的多态性的检测结果组合的遗传学检测将提供关于狗有肝铜积累风险的可能性方面的信息。
在狗肝中的铜积累可导致一种或多种由高肝铜引起的肝疾病或病症。例如，高肝铜可导致慢性肝炎、肝硬化和最终的肝功能衰竭。本发明因此能够鉴定有风险患有或不被保护免于这些与高铜相关的肝疾病或病症的狗。一旦鉴定了狗对肝铜积累的易感性，或者一旦狗被鉴定为不具有一个或更多个指示免于肝铜积累的保护的突变，则有可能确定对该狗合适的预防措施以将肝铜水平维持在低或正常水平，例如通过施用低铜食物(例如，WO2009/044152 A2中所公开的食物)。此外，被鉴定为不具有对肝铜积累易感性相关突变的狗，或者被鉴定为具有与免于肝铜积累保护相关突变的狗可理想地用于以产生不太可能患与高铜相关的肝疾病或其它病症的狗为目标的育种程序。
本发明因此提供了测试狗以确定狗对肝铜积累的易感性的方法，包含检测样品中狗的基因组中选自以下的一种或多种多态性的存在或缺失：
Figure 330107DEST_PATH_IMAGE001
和在染色体位置22:3135287的CGCCCC重复；
(b)一种或多种与所述多态性(a)处于连锁不平衡的多态性；和/或
(c)Chr32_38904515 (SEQ ID NO: 156)、Chr8_4892743 (SEQ ID NO: 157)和Chr8_4880518 (SEQ ID NO: 158)。
本发明还提供：
- 包含关于一种或多种如本文所定义多态性和它们与狗对肝铜积累易感性的关联的信息的数据库；
- 确定狗对肝铜积累易感性的方法，包含：
(a)将关于狗基因组中存在或缺失如本文定义的一种或多种多态性的数据输入计算机系统；
(b)将数据与计算机数据库比较，所述数据库包含涉及如本文定义的一种或多种多态性及它们狗对肝铜积累易感性的关联的信息；和
(c)基于所述比较确定狗对肝铜积累的易感性；
- 计算机程序，其包含当在计算机系统上执行时，指示计算机系统执行本发明的方法的程序编码装置(program code means)；
- 计算机存储介质，其包含本发明计算机程序和本发明数据库；
- 安排以执行本发明方法的计算机系统，包含：
(a)接收关于狗基因组中存在或缺失如本文定义的多态性的数据的装置；
(b)包含涉及如本文定义的一种或多种多态性及它们与狗对肝铜积累的易感性的关联的信息的数据库；
(c)用于比较数据与数据库的模块；和
(d)基于所述比较确定狗对肝铜积累的易感性的装置；
- 确定狗对肝铜积累的易感性的方法，包含检测狗基因组中选自本文定义的多态性的一种或多种多态性的存在或缺失；
- 选自本文定义的多态性的一种或多种多态性用于确定狗对肝铜积累的易感性的用途；和
- 选择用于产生可能受保护免于肝铜积累的后代的狗的方法，包含：
- 根据本发明的方法确定候选的第一只狗的基因组是否包含指示对肝铜积累的易感性的一种或多种多态性和由此确定候选的第一只狗是否适合产生可能受保护免于肝铜积累的后代；
- 任选地，根据本发明的方法确定与第一只狗性别相反的第二只狗的基因组中是否包含指示对肝铜积累的易感性的一种或多种多态性；和
- 任选地，将第一只狗和第二只狗交配以产生可能受到保护免于肝铜积累的后代。
本发明人已发现与保护狗免于肝铜积累相关的多态性。因此，本发明提供了测试狗以确定狗受保护免于肝铜积累的可能性的方法，包含检测样品中狗的基因组中选自以下的一种或多种多态性的存在或缺失：(a) Chr22_3135144 (SEQ ID NO: 145)和(b) 与所述多态性(a)处于连锁不平衡的一种或多种多态性。
本发明还提供：
- 包含关于一种或多种如本文所定义多态性和它们与保护狗免于肝铜积累，或狗对肝铜积累易感性的关联的信息的数据库；
- 确定狗受保护免于肝铜积累的可能性的方法，包含：
(a)将关于狗基因组中存在或缺失如本文定义的一种或多种多态性的数据输入计算机系统；
(b)将数据与计算机数据库比较，所述数据库包含涉及本文定义的一种或多种多态性及它们与狗受保护免于肝铜积累，或狗对肝铜积累易感性的关联的信息；和
(c)基于所述比较确定狗受保护免于肝铜积累的可能性；
- 计算机程序，其包含当在计算机系统上执行时，指示计算机系统执行本发明的方法的程序编码装置；
- 计算机存储介质，其包含本发明计算机程序和本发明数据库；
- 安排以执行本发明方法的计算机系统，包含：
(a)接收关于狗基因组中存在或缺失如本文定义的多态性的数据的装置；
(b)包含涉及所述多态性及它们与狗受保护免于肝铜积累，或狗对肝铜积累易感性的信息的数据库；
(c)用于比较数据与数据库的模块；和
(d)基于所述比较确定狗受保护免于肝铜积累的可能性的装置；
- 确定狗受保护免于肝铜积累的可能性的方法，包含检测狗基因组中选自以下的一种或多种多态性的存在或缺失：(a) Chr22_3135144 (SEQ ID NO: 145)和(b) 与(a)处于连锁不平衡的一种或多种多态性；
- 如本文定义的多态性之于确定狗受保护免于肝铜积累的可能性的用途；和
- 选择用于产生可能受保护免于肝铜积累的后代的狗的方法，包含：
- 根据本发明的方法确定候选的第一只狗的基因组中是否包含一种或多种指示保护免于肝铜积累的多态性和由此确定候选的第一只狗是否适合产生可能受保护免于肝铜积累的后代；
- 任选地，根据本发明确定与第一只狗性别相反的第二只狗的基因组中是否包含一种或多种指示保护免于肝铜积累的多态性；和
- 任选地，将第一只狗和第二只狗交配以产生可能受到保护免于肝铜积累的后代。
附图说明
图1描绘了在拉布拉多寻回犬中根据性别和ATP7A基因型的平均铜水平(表9的数据)。y-轴为肝铜干重(mg/kg)。x-轴为ATP7A基因型：从左到右，前3个柱形为研究中的雌性狗并且最后2个柱形为研究中的雄性狗。误差线为标准误差。
图2为在拉布拉多寻回犬中根据性别和ATP7A基因型的铜组织学得分的箱形图(表9的数据)。y-轴为铜组织学得分值。x-轴为ATP7A基因型：从左到右，前3个为研究中的雌性狗并且最后2个为研究中的雄性狗。kruskal-walis p值为0.000396。
图3显示了ATP7B中编码重复的可变长度。上部：碱基及其对应的氨基酸 (AA)。加框C的染色体位置为3135287。底部：Ensembl、NCBI和比格犬和一组拉布拉多犬的测序揭示了不同数目的CGCCCC重复。因此，或多或少地产生加框的氨基酸丙氨酸(A)和脯氨酸(P)。SEQ ID NOs: 236、23和238为分别含有2、3和4个重复的多核苷酸序列。
图4显示了在重金属相关结构域域3和4之间的ATP7B CGCCCC重复的位置。
图5显示了ATP7B 4145G>A SNP (Chr22_3167534)。最右边的垂直线表示突变的大致位置。G>A 取代产生谷氨酰胺氨基酸(AA)。
图6显示了chr 22的前15 Mb中的LD结构。三角形顶部的箭头指示编码突变的位置。箭头所指的线描绘了编码突变与该区域几个SNP的高LD。
图7显示了风险等位基因的数目对肝铜定量水平的影响。x-轴为为风险等位基因的数目并且y-轴为以mg/kg计的肝铜。水平线指示400 mg/kg的正常肝铜水平。
图8显示了铜组织学得分的分步建模。X1至X17为表21中的因子。
图9显示了log-定量铜得分的分步建模。X1至X17为表21中的因子。
图10图解说明了安排执行本发明的功能性组件的实施方式。
序列简述
SEQ ID NOs: 1至5显示了多核苷酸序列，其包含实施例2的3个区域模型中所用的SNP和表4中的SNP。
SEQ ID NOs: 6至141显示了多核苷酸序列，其包含可用于确定狗对肝铜积累的易感性的其他SNP。这些序列也在表5和6中。
SEQ ID NO: 142是与狗受保护免于肝铜积累相关的ATP7A编码区SNP (ChrX_63338063)的多核苷酸序列。该序列也显示于表8中。
SEQ ID NO: 143是与SNP ChrX_63338063处于连锁不平衡的SNP (ChrX_63397393ATP7a_Reg16_F_42)的多核苷酸序列。该序列也显示于表8中。
SEQ ID NOs: 144至158显示了包含本发明中SNP的多核苷酸序列。这些序列也显示于表18中。
SEQ ID NOs: 159至226显示了包含与表18中的SNP处于连锁不平衡的SNP的多核苷酸序列。这些序列也显示于表20中。
SEQ ID NOs: 227至235为引物序列。
SEQ ID NOs: 236、237和238为对于基因组位置22:3135287的重复序列，分别包含2个、3个或4个CGCCCC重复的多核苷酸。这些序列也显示于表12中。
具体实施方式
鉴定对肝铜积累的易感性或免于肝铜积累的保护
在肝中的铜积累在许多狗品种中导致肝疾病，所述狗品种包括拉布拉多寻回犬、杜宾犬、德国牧羊犬、荷兰狮毛犬、可卡犬、西部高地白梗、贝灵顿梗和斯凯梗。任意品种的正常狗的肝内平均铜浓度为以干重计200至400 mg/kg，尽管新生狗通常具有较高的肝铜浓度。狗的肝内铜的量可通过活检测量。
对肝铜积累敏感的狗具有积累铜的倾向，以致其肝铜浓度在达到高于以干重计400 mg/kg的水平。根据本发明确定狗对肝铜积累的易感性涉及确定狗积累肝铜达到高于400 mg/kg的水平的风险或可能性，例如高于600 mg/kg、高于800 mg/kg、高于1000 mg/kg、高于1500 mg/kg、高于2000 mg/kg、高于5000 mg/kg或高于10000 mg/kg。
受到保护免于肝铜积累的狗具有积累肝铜的低风险或可能性，以致其肝铜浓度不太可能达到高于以干重计400mg/kg的水平。受到免于肝铜积累的保护的狗的肝铜浓度将低于600 mg/kg，例如低于500 mg/kg、低于400 mg/kg或低于300 mg/kg。根据本发明确定狗受到保护免于肝铜积累的可能性涉及确定狗将积累肝铜至低于600mg/kg的水平的可能性，例如低于500 mg/kg、低于400 mg/kg或低于300 mg/kg。
肝铜积累可通过组织化学评估。例如，肝铜浓度可通过组织化学半定量地评估，使用如前所述的红氨酸染色技术用于评估铜的分布(Van den Ingh等人, (1988) Vet Q 10:84–89)。浓度可如下分级为0-5的等级：0 = 无铜存在；1 = 含有一些铜阳性颗粒的孤立肝细胞和/或网状组织(RHS)细胞；2 = 含有少量至中等量的铜阳性颗粒的小群肝细胞和/或RHS细胞；3 = 含有中等量的铜阳性颗粒的较大群或面积的肝细胞和/或RHS细胞; 4 =具有许多铜阳性颗粒的大面积的肝细胞和/或RHS细胞；和5 = 具有许多铜阳性颗粒的弥散存在的肝细胞和/或RHS细胞。根据该评分系统，超过2的铜得分为异常的。
因此，根据本发明确定狗受到保护免于肝铜积累的可能性可涉及使用Van denIngh等人中所述的分级系统进行确定狗获得少于或等于3的得分的可能性，例如小于或等于2.5、2、1.5，或小于或等于1。根据本发明确定狗对肝铜积累的易感性可涉及使用Van denIngh等人中所述的分级系统确定狗获得大于或等于2的得分的风险或可能性，例如大于或等于2.5、3、3.5，或大于或等于4。
可将保护或易感性的可能性表示为例如风险因子、百分比或概率。有可能确定狗是否会积累铜至上述水平。例如，确定狗对肝铜积累的易感性或受到保护免于肝铜积累的可能性的方法可包含确定狗是否会积累铜至高于400 mg/kg的水平。
高于400mg/kg的肝铜积累水平与肝疾病相关，并可最终导致肝功能衰竭。因此确定狗基因组是否包含指示受到保护免于肝铜积累的一种或多种多态性指示了所述狗不太可能发生肝铜积累导致的疾病或病症例如慢性肝炎、肝硬化和肝功能衰竭。相反地，确定狗基因组是否包含指示对肝铜积累易感性的一种或多种多态性指示了所述狗对所述疾病或病症的易感性。因此，本发明提供了检测狗对肝铜积累相关疾病例如慢性肝炎、肝硬化和肝功能衰竭的易感性或保护狗免于所述疾病的可能性的方法。
对铜积累的易感性或免于铜积累的保护的多态性和指示
本发明人发现狗基因组中许多与对肝铜积累易感性相关的多态性。因此本发明涉及使用在这些基因组位置的一种或多种多态性标记确定狗对肝铜积累易感性的方法。
本发明因此提供了检测狗以确定狗对肝铜积累的易感性的方法，包含检测样品中在狗的基因组中一种或多种选自以下的多态性的存在或缺失：
Figure 529007DEST_PATH_IMAGE002
和染色体位置22:3135287的CGCCCC重复；
(b)与所述多态性(a)处于连锁不平衡的一种或多种多态性；和/或
(c)Chr32_38904515 (SEQ ID NO: 156)、Chr8_4892743 (SEQ ID NO: 157)和Chr8_4880518 (SEQ ID NO: 158)。
本发明人还发现狗基因组中与免于肝铜积累保护相关的多态性。本发明因此涉及使用在这些基因组位置的一种或多种多态性标记，确定狗受到保护免于肝铜积累的可能性的方法。
本发明因此还提供了检测狗以确定狗受到保护免于肝铜积累的可能性的方法，包含确定样品中狗基因组中选自以下的一种或多种多态性的存在或缺失：(a) Chr22_3135144 (SEQ ID NO: 145)和(b) 一种或多种与(a)处于连锁不平衡的多态性。
短语“检测多态性的存在或缺失”通常意指确定狗基因组中是否存在多态性。多态性包括单核苷酸多态性(SNP)、微卫星或重复多态性、插入多态性和缺失多态性。优选地，多态性为SNP。检测SNP的存在或缺失意指将SNP进行基因型分型，或将狗基因组中存在的核苷酸针对SNP分型。通常地，将确定2条同源染色体相同位置上存在的核苷酸。换言之，将一个或两个等位基因进行基因型分型并且根据基因分型确定一个或两个等位基因的同一性。狗可被确定为在SNP的第一个等位基因上是纯合的，在SNP的第二个等位基因上是杂合的或纯合的。当多态性为微卫星或重复序列时，通常方法将涉及确定重复的数目。
确定个体的表型，例如个体对疾病或病症的易感性或保护个体免于疾病或病症，不限于检测导致疾病或病症的多态性。在遗传作图研究中，检测个体样品中一组标记基因座的遗传变异与给定表型的关联。如果在特定标记基因座和表型之间发现这样的关联，则表明在该标记基因座的变异影响目的表型，或在该标记基因座的变异与未被基因分型的真正表型相关基因座处于连锁不平衡中。在一组彼此处于连锁不平衡的多态性的情况下，在特定个体中存在所有这些多态性的认知通常提供冗余信息。因此，当确定狗基因组中是否包含一种或多种指示对肝铜积累或铜相关肝疾病的易感性或免于肝铜积累或铜相关肝疾病的保护的多态性时，有必要检测这样一组多态性中的仅一种多态性。
由于连锁不平衡，并非功能易感性/保护性多态性而是与功能多态性处于连锁不平衡的多态性可作为指示功能多态性存在的标记。与本发明的多态性处于连锁不平衡的多态性指示对肝铜积累的易感性，或免于肝铜积累的保护。
相应地，如本文定义的任意一种多态位置可被直接分型，换言之即通过确定在该位置存在的核苷酸，或被间接分型，例如通过确定与所述多态性位置处于连锁不平衡的另一个多态位置存在的核苷酸。
连锁不平衡是种群中不同基因座上的等位基因的非随机配子关联。具有共同遗传而不是通过随机分配独立遗传倾向的多态性是处于连锁不平衡的。如果2种多态性共同存在的频率是2种多态性各自存在的频率的乘积，则多态性是随机分配的或彼此独立遗传的。例如，如果在不同多态位点的2种多态性在种群的50%染色体中存在，那么，如果这2个等位基因在种群的25%染色体中共同存在，就可以说它们是随机分配的。更高的百分比将意味着这2个等位基因是连锁的。如果在种群中2种多态性共同存在的频率高于2种多态性独立存在的频率的乘积，则因而断定第一种多态性与第二种多态性处于连锁不平衡。优选地，如果2种多态性共同存在的频率比2种多态性独立存在的频率的乘积高10%，例如高于30%，高于50%或高于70%，则第一种多态性与第二种多态性处于连锁不平衡。
研究显示连锁不平衡在狗中是广泛存在的(Extensive and breed-specificlinkage disequilibrium in Canis familiaris, Sutter 等人, Genome Research 14:2388-2396)。处于连锁不平衡的多态性经常在物理上非常接近，这就是它们共遗传的原因。与本文提及的多态性处于连锁不平衡的多态性位于相同的染色体上。在狗中处于连锁不平衡的多态性通常位于多态性的5mb以内，优选2mb以内、1mb以内、700kb以内、600kb以内、500kb以内、400kb以内、200kb以内、100kb以内、50kb以内、10kb以内、5kb以内、1kb以内、500bp以内、100bp以内、50bp以内或10bp以内。
使用常规技术鉴定与本文定义的任意一种多肽位置处于连锁不平衡的多态性是技术人员能力范围内的。一旦选择了潜在的多态性，技术人员可容易地确定此多态性是否以及所述多态性的哪种版本或等位基因与本文定义的任意一种多态性显著相关。
更详细地，为确定多态性是否与如本文定义的任意一种多态性处于连锁不平衡，技术人员应当在一组狗中对候选多态性和一种或多种如本文定义的多态性进行基因分型。组的大小应当足够大以得到有统计学意义的结果。通常应当对来自至少100，优选至少150或至少200只不同狗的样品进行基因分型。组中的狗可为任意品种，但通常具有相同或相似的遗传品种背景。一旦在一组狗中对多态性进行了基因分型，则可使用多种可容易得到的统计软件包中的任意一种测量一对或多对多态性之间的连锁不平衡。免费软件包的实例为Haploview (Haploview: analysis and visualisation of LD and haplotype maps,Barrett 等人, 2005, Bioinformatics, 21(2): 263-265)，可在http:// www.broadinstitute.org/haploview/haploview下载。另一个可以使用的软件实例为PLINK (http://pngu.mgh.harvard.edu/purcell/plink/)。
连锁不平衡的量度为D'。0.5至1范围的D'指示一对多态性处于连锁不平衡，1指示最显著的连锁不平衡。因此如果发现候选多态性和本文定义的特定多态性的D'处于0.5至1，优选0.6至1、0.7至1、0.8至1、0.85至1、0.9至1、0.95至1或最优选为1，则可以说候选多态性预测本文定义的多态性，并且会因此指示对肝铜积累的易感性或免于肝铜积累的保护。在本发明优选的方法中，与本文定义的多态性处于连锁不平衡的多态性与本文定义的多态性在680 kb以内并处于相同的染色体上，并且多态性对之间的连锁不平衡的计算量度D'大于或等于0.9。
连锁不平衡的另一种量度是R平方，其中R为相关系数。R平方又称“决定系数”是第一种多态性基因型中的变异占第二种多态性基因型的变异的分数。因此对候选多态性和本文定义的特定多态性来说，0.5的R平方意味着候选多态性占特定多态性变异的50%。通过标准统计学软件包(例如Haploview)可产生R平方。通常地，认为0.25或更高(R>0.5或<-0.5)的R平方是高相关性。因此对候选多态性和本文定义的特定多态性来说，如果发现R平方为0.5或更高，优选0.75或更高、0.8或更高、0.85或更高、0.9或更高或0.95或更高，则可以说候选多态性预测本文定义的多态性，并且会因此指示对肝铜积累的易感性或免于肝铜积累的保护。在本发明优选的方法中，与本文定义的多态性处于连锁不平衡的多态性与本文定义的多态性在680 kb以内并处于相同的染色体上，并且多态性对之间的连锁不平衡的计算量度R平方大于或等于0.5。
也可建立与本发明多态性处于LD的多态性单体型。即便一种或多种多态性仅仅分别与本发明多态性处于微弱的LD中，如果组合使用它们也可处于强LD中。例如，任何一种多态性可具有低于0.25的R平方值。然而，两种或多种各自具有低于0.25的R平方的突变组合起来可具有大于0.5的R平方。因此，这些多态性可组合使用以确定狗对肝铜积累的易感性或狗受到保护免于肝铜积累的可能性。
因此，本发明的方法可包含检测与如本文所定义多态性处于连锁不平衡的两种或多种多态性的存在或缺失，其中所述两种或多种多态性中每一个各自的R平方可少于或等于0.25，但是所述两种或多种多态性组合的R平方大于或等于0.5。
一旦鉴定了多态性与本文定义的多态性处于连锁不平衡并因此与其相关，技术人员可容易地确定多态性的哪种版本，即哪个等位基因与对肝铜积累的易感性或免于肝铜积累的保护相关。这可通过确定一组狗的肝铜积累表型并根据肝铜积累的水平将狗分类而实现。然后将这组狗针对目的多态性进行基因分型。然后将基因型与肝铜水平相对照以确定基因型和肝铜水平的关联，由此确定哪个等位基因与对肝铜积累的易感性或免于肝铜积累的保护相关。
表17和18中标识出了被发现指示狗对肝铜积累易感性的本发明的多态性。具体地，它们为：
Figure 119258DEST_PATH_IMAGE003
Figure 378201DEST_PATH_IMAGE004
。
此外，在ATP7B基因中的微卫星重复被发现与对肝铜积累的易感性相关。这是在染色体22上起始于基因组位置3135287 (22:3135287)的CGCCCC重复。重复序列的图解说明在图3中(SEQ ID NOs: 236至238)。可有2个(SEQ ID NO: 236)、3个(SEQ ID NO: 237)、4个(SEQ ID NO: 238)及潜在更多个的重复。因此本发明的方法可包含确定狗基因组中CGCCCC重复的数目。
确定狗对肝铜积累易感性的方法包含确定样品中狗基因组中一种或多种选自以下的多态性的存在或缺失：
Figure 132530DEST_PATH_IMAGE005
和染色体位置22:3135287的CGCCCC重复；
(b)与所述多态性(a)处于连锁不平衡的一种或多种多态性；和/或
(c)Chr32_38904515 (SEQ ID NO: 156)、Chr8_4892743 (SEQ ID NO: 157)和Chr8_4880518 (SEQ ID NO: 158)。
可检测任意数目和任意组合的多态性来实施本发明。优选地检测至少2种多态性。优选地检测2至5、3至8或5至10或8至15种多态性。
可对狗DNA在以下各个位置进行分型：
(i)一种或多种多态性(a)；
(ii)一种或多种多态性(b)；
(iii)一种或多种多态性(c)；
(iv)一种或多种多态性(a)和一种或多种多态性(b)；
(v)一种或多种多态性(a)和一种或多种多态性(c)；或
(vi)一种或多种多态性(b)和一种或多种多态性(c)。
优选地确定狗对肝铜积累易感性的方法包含确定样品中狗基因组中以下的存在或缺失：
Figure 807225DEST_PATH_IMAGE006
Figure 330610DEST_PATH_IMAGE007
Figure 448870DEST_PATH_IMAGE008
。
表18提供了与高铜相关的突变的等位基因。因此，本发明确定狗对肝铜积累易感性的方法包含确定Chr22_3167534 (SEQ ID NO: 144)的A等位基因、Chr20_55461150 (SEQID NO: 146)的A等位基因、ChrX_120879711 (SEQ ID NO: 147)的C等位基因、Chr32_38904515 (SEQ ID NO: 156)的C等位基因、Chr19_6078084 (SEQ ID NO: 148)的T等位基因、Chr15_62625262 (SEQ ID NO: 149)的A等位基因、Chr14_39437543 (SEQ ID NO: 150)的G等位基因、Chr15_62625024 (SEQ ID NO: 151)的A等位基因、Chr3_86838677 (SEQ IDNO: 152)的C等位基因、Chr8_4892743 (SEQ ID NO: 157)的T等位基因、Chr24_4011833(SEQ ID NO: 153)的G等位基因、Chr18_60812198 (SEQ ID NO: 154)的A等位基因、Chr8_4880518 (SEQ ID NO: 158)的A等位基因、Chr10_65209946 (SEQ ID NO: 155)的T等位基因和/或Chr22_3135144 (SEQ ID NO: 145)的G等位基因的存在或缺失，以及由此确定狗基因组中是否具有指示对铜积累易感性的多态性。
发现在染色体位置22:3135287的每个多余拷贝的CGCCCC重复都增加铜积累的风险。因此，确定狗对肝铜积累易感性的方法可包含确定染色体位置22:3135287上CGCCCC重复的数目。存在2个或多个重复，例如3或4个重复指示对肝铜积累的易感性。
在本发明的优选方法中，与多态性(a)处于连锁不平衡的多态性为SNP。由于处于连锁不平衡，该多态性会指示对肝铜积累的易感性。与多态性(a)处于连锁不平衡的SNP实例在表19中给出并且在SNP周边的序列在表20中给出。这些SNP可独立地使用，或与一种或多种多态性(a)和/或(c)组合使用，以确定狗对肝铜积累的易感性。本发明的方法因此可包含确定样品中狗基因组中一种或多种选自表19和20的多态性的存在或缺失。
发明人之前发现ATP7A基因中指示免于肝铜积累的保护的多态性，例如(ChrX_63338063; SNP ATP7a_Reg3_F_6; SEQ ID NO: 142)。因此，确定狗对肝铜积累的易感性的方法可进一步包含确定样品中狗基因组中一种或多种选自以下的多态性的存在或缺失：
(d)ChrX_63338063 (SNP ATP7a_Reg3_F_6; SEQ ID NO: 142)；和/或
(e)一种或多种与所述多态性(d)处于连锁不平衡的多态性。
Chr22_3135144的A等位基因和ChrX_63338063的T等位基因与低铜或免于肝铜积累的保护相关。相反地，Chr22_3135144的G等位基因和ChrX_63338063的C等位基因与高铜或对肝铜积累的易感性相关。因此，确定狗对肝铜积累易感性的方法可包含确定Chr22_3135144的A或G等位基因和/或ChrX_63338063的T或C等位基因的存在或缺失。存在Chr22_3135144的A等位基因和/或ChrX_63338063的T等位基因指示狗有可能受到保护免于肝铜积累并且存在Chr22_3135144的G等位基因和/或ChrX_63338063的C等位基因指示狗有可能对肝铜积累易感。
被发现与免于肝铜积累的保护相关的多态性可用于确定狗受保护免于肝铜积累的可能性的方法中。因此，本发明提供了检测狗以确定狗受到保护免于肝铜积累的可能性的方法，包含确定样品中狗基因组中选自(a) Chr22_3135144 (SEQ ID NO: 145)和(b)一种或多种与(a)处于连锁不平衡的多态性的一种或多种多态性的存在或缺失。
可检测任意数目和任意组合的多态性来实施本发明。优选地检测至少2种多态性。优选地检测2至5、3至8、5至10或8至15种多态性。
因此，可对狗DNA在以下各个位置进行分型：
(i)多态性(a)；和/或
(ii)一种或多种多态性(b)。
确定狗受到保护免于肝铜积累的可能性的方法可进一步包含确定样品中狗基因组中(c) ChrX_63338063 (SNP ATP7a_Reg3_F_6; SEQ ID NO:142)和/或(d) 一种或多种与多态性(c)处于连锁不平衡的多态性的存在或缺失。与ChrX_63338063 (SNP ATP7a_Reg3_F_6; SEQ ID NO: 142)处于连锁不平衡的多态性的实例为ChrX_63397393 (SNPATP7a_Reg16_F_42; SEQ ID NO: 143)。其他实例在表19和20中给出。因此确定狗受到保护免于肝铜积累的可能性的方法可进一步包含确定样品中狗的基因组中(c) ChrX_63338063(SNP ATP7a_Reg3_F_6; SEQ ID NO:142)和/或(d) ChrX_63397393 (SNP ATP7a_Reg16_F_42; SEQ ID NO: 143)的存在或缺失。
优选地确定狗受到保护免于肝铜积累的可能性的方法包含检测样品中狗的基因组中以下的存在或缺失：Chr22_3167534 (SEQ ID NO: 144)、Chr22_3135144 (SEQ ID NO:145)、Chr20_55461150 (SEQ ID NO: 146)、Chr19_6078084 (SEQ ID NO: 148)、Chr3_86838677 (SEQ ID NO: 152)、Chr10_65209946 (SEQ ID NO: 155)和ChrX_63338063(SEQID NO: 142)。
如上所示，Chr22_3135144的A等位基因和ChrX_63338063的T等位基因与低铜或免于肝铜积累的保护相关。相反地，Chr22_3135144的G等位基因和ChrX_63338063的C等位基因与高铜或对肝铜积累的易感性相关。因此，确定狗受到保护免于肝铜积累的可能性的方法可包含确定Chr22_3135144的A或G等位基因和/或ChrX_63338063的T或C等位基因的存在或缺失。存在Chr22_3135144的A等位基因和/或ChrX_63338063的T等位基因指示狗有可能受到保护免于肝铜积累并且存在Chr22_3135144的G等位基因和ChrX_63338063的C等位基因指示狗不大可能受到保护免于肝铜积累。
本文所述的被发现与高肝铜或对肝铜积累易感性相关的多态性还可用于确定狗受保护免于肝铜积累的可能性的方法中。确定与高肝铜相关的等位基因的缺失可有助于确定狗受到保护免于肝铜积累的可能性。确定狗受到保护免于肝铜积累的可能性的方法因此可包含检测样品中狗基因组中一种或多种选自以下的多态性的存在或缺失：
Figure 424916DEST_PATH_IMAGE009
和位于染色体位置22:3135287的CGCCCC重复；
(f)与所述多态性(e)处于连锁不平衡的一种或多种多态性；和/或
(g)Chr32_38904515 (SEQ ID NO: 156)、Chr8_4892743 (SEQ ID NO: 157)和Chr8_4880518 (SEQ ID NO: 158)。
本发明人之前发现在犬GOLGA5、ATP7A和UBL5基因中或基因区域中的多态性指示了对肝铜积累的易感性(实施例1和2)。因此这些多态性可用于与本发明的多态性组合以提供确定狗对肝铜积累易感或受到保护免于肝铜积累的风险或可能性的强化遗传检测。本发明中确定狗对肝铜积累的易感性或狗受到免于肝铜积累的保护的方法可因此进一步包含检测(I) 狗的GOLGA5、ATP7A和UBL5基因中指示对肝铜积累易感性的多态性和/或(II)与所述多态性(I)处于连锁不平衡的多态性的存在或缺失。除本发明的多态性以外可检测任意数目和任意组合的这些多态性。优选地检测这些进一步多态性的至少2种。优选地进一步检测2至5、3至8或5至10种多态性。
因此，可对狗DNA在(i) 多态性(I)，和/或(ii) 一种或多种多态性(II)的各个位置进行进一步分型。此外，可对狗DNA在以下各个位置进行分型：
(i)两种或更多种多态性(I)；
(ii)两种或更多种多态性(II)；或
(iii)一种或多种多态性(I)和一种或多种多态性(II)。
当有2种多态性(I)时，每种多态性可在GOLGA5、ATP7A和UBL5基因的单独一个中或只在这些基因的一个中。当为3种或更多多态性(I)时，例如3至10种这样的多态性，多态性可在同一个基因中，在2个基因中或在全部3个基因中。
类似地，当有2种多态性(II)时，每种多态性可与GOLGA5、ATP7A和UBL5基因的单独一个或只在这些基因的一个中的多态性处于连锁不平衡。当有3种或更多多态性(II)时，例如3至10种这样的多态性，多态性可与在同一个基因中，在2个基因中或在全部3个基因中的多态性处于连锁不平衡。
本发明优选的方法进一步包含检测在狗GOLGA5、ATP7A或UBL5基因中至少一种指示对肝铜积累易感性的多态性(I)和与所述多态性(I)处于连锁不平衡的至少一种多态性(II)的存在或缺失。
在本发明优选的方法中，多态性(I)和/或(II)为SNP。SNP可为狗GOLGA5、ATP7A或UBL5基因中或基因区域中指示对肝铜积累的易感性的任意SNP和/或其处于连锁不平衡的SNP。
本发明的方法因此可进一步包含确定狗基因组是否包含选自表4、表5和表6中所标识的SNP，指示对肝铜积累的易感性的一种或多种多态性。在表4和5中，每个SNP在序列中位于第61位。给出了位于该位置的每个SNP的第一和第二等位基因([第一/第二])。在表6中，也指示了每个SNP的第一和第二等位基因。可使用来自表4、5和6的任意数目的SNP并且可以任意组合使用。SNP可与不同类型的多态性组合。
优选地，确定狗对肝铜积累的易感性或狗受到保护免于肝铜积累的可能性的方法进一步包含检测选自表4和表6中的SNP的一种或多种SNP和/或与其处于连锁不平衡的一种或多种SNP的存在与缺失。因此优选地一种或多种SNP选自BICF2P506595 (SEQ ID NO:1的第61位)、BICF2P772765 (SEQ ID NO:2的第61位)、BICF2S2333187 (SEQ ID NO:3的第61位)、BICF2P1324008 (SEQ ID NO:4的第61位)、BICF2P591872 (SEQ ID NO:5的第61位)、ATP7a_Reg4_F_9 (SEQ ID NO: 131的第164位)、UBL5_Reg1F_16 (SEQ ID NO: 132的第97位)、golga5_Reg1_24 (SEQ ID NO: 133的第70位)、golga5_26 (SEQ ID NO: 134的第88位)、golga5_27 (SEQ ID NO: 135的第104位)、golga5_28 (SEQ ID NO: 136的第139位)、golga5_29 (SEQ ID NO: 137的第128位)、golga5_30 (SEQ ID NO: 138的第95位)、golga5_31 (SEQ ID NO: 139的第106位)、atp7areg17_32 (SEQ ID NO: 140的第95位)、atp7areg17_33 (SEQ ID NO: 141的第90位)和与其处于连锁不平衡的一种或多种SNP。相应地，可对这16种SNP中的任一种或与这16种SNP中的任一种处于连锁不平衡的任意SNP进行分型。优选地，对这16种SNP或与其处于连锁不平衡的SNP中的至少2种进行分型。
更优选地，本发明的方法进一步包含检测选自表4中SNP的一种或多种SNP的存在或缺失。相应地，可对这5种SNP中的任一种或与这5种SNP中的任一种处于连锁不平衡的任意SNP进行分型。优选地，对这5种SNP或与其处于连锁不平衡的SNP中的至少2种进行分型。更优选地，对所有5个位置进行分型。因此优选地，被分型的核苷酸选自与下述等同的位置：
-SEQ ID NO: 1的第61位(BICF2P506595, SNP1)；
-SEQ ID NO: 2的第61位(BICF2P772765, SNP 2)；
-SEQ ID NO: 3的第61位(BICF2S2333187, SNP 3)；
-SEQ ID NO: 4的第61位(BICF2P1324008, SNP 4)；
-SEQ ID NO: 5的第61位(BICF2P591872, SNP 5)；或与这些位置中的任一个处于连锁不平衡的任意位置。优选地，所述方法包括检测SNP BICF2P506595 (SEQ ID NO:1)、BICF2P772765 (SEQ ID NO:2)、BICF2S2333187 (SEQ ID NO:3)、BICF2P1324008 (SEQ IDNO:4)和BICF2P591872 (SEQ ID NO:5)的存在或缺失。
SNP1位于GOLGA5基因的内含子中。SNP2、3和4位于UBL5基因区域中。SNP5位于ATP7A基因区域中。本发明的检测方法因此涉及在一个或多个这些基因内或在基因的区域中(在编码区或其它区域中)存在的任意SNP，或处于连锁不平衡的任意其它SNP。
实施例2证实了SNP1至5在建立对铜积累的易感性的Boolean模型中的用途。表3表示在3个基因组位置上的等位基因的二元条件。二元值指示具有指示对铜积累的易感性的等位基因(“坏”等位基因)的狗。例如000表示不具有3种坏等位基因中的任一种。111表示具有所有3种坏等位基因。
本发明人已确定SNP BICF2P506595 (SNP 1)的A等位基因、SNP BICF2P772765(SNP 2)的G等位基因、SNP BICF2S2333187 (SNP 3)的C等位基因、SNP BICF2P1324008(SNP 4)的G等位基因和SNP BICF2P591872 (SNP 5)的A等位基因指示对肝铜积累的易感性。这些等位基因纯合的狗对肝铜积累易感。因此，本发明优选的方法进一步包含确定SNPBICF2P506595的A等位基因、SNP BICF2P772765 (SNP 2)的G等位基因、SNP BICF2S2333187(SNP 3)的C等位基因、SNP BICF2P1324008 (SNP 4)的G等位基因和/或SNP BICF2P591872(SNP 5)的A等位基因的存在或缺失并由此确定狗基因组是否包含指示对肝铜积累的易感性的多态性。更优选的方法包含检测SNP BICF2P506595的AA基因型、SNP BICF2P772765的GG基因型、SNP BICF2S2333187的CC基因型、SNP BICF2P1324008的GG基因型和/或SNPBICF2P591872的AA或AG基因型的存在或缺失。
因此，确定狗对肝铜积累易感性或狗受到保护免于肝铜积累的可能性的优选方法进一步包含检测以下的存在或缺失：
(i)SNP BICF2P506595 (SNP 1)的AA基因型；
(ii)SNP BICF2P772765 (SNP 2)的GG基因型；
(iii)SNP BICF2S2333187 (SNP 3)的CC基因型
(iv)SNP BICF2P1324008 (SNP 4)的GG基因型；和/或
(v)SNP BICF2P591872 (SNP 5) AA或AG基因型；
并由此确定狗的基因组是否包含一种或多种指示免于肝铜积累保护和/或对肝铜积累易感性的多态性。更优选的方法包含检测基因型(i)；基因型(ii)、(iii)和(iv)；或基因型(v)的存在或缺失。甚至更优选的方法包含检测(i)至(v)所有5个基因型的存在或缺失。
对狗基因组中在表4、5、6、8、18和20的任一个表中标识的位置处存在的核苷酸分型可能意味着对在与表4、5、6、8、18和20中标识的序列精确对应的序列中在此位置存在的核苷酸分型。然而，应当理解的是在表4中标识的SEQ ID NO: 1至5、表5中标识的SEQ IDNO:6至130、表6中标识的SEQ ID NO: 131至141、表8中标识的的SEQ ID NO: 142和SEQ IDNO: 143、表18中标识的SEQ ID NOs: 144至158和表20中标识的SEQ ID NOs: 159至226提供的精确序列不一定在待检测的狗中存在。对存在的核苷酸分型可因此在表4、5、6、8、18和20中标识的位置或在序列中等同或对应的位置。因此如本文使用的术语等同的意思是在表4、5、6、8、18和20中标识的位置或其对应位置。SNP的序列并从而其位置可例如由于狗基因组中核苷酸的缺失或插入而发生变化。本领域技术人员能够确定与SEQ ID NOs: 1至226的每一条中的相关位置对应或等同的位置，使用例如计算机程序如GAP、BESTFIT、COMPARE、ALIGN、PILEUP或BLAST。UWGCG软件包提供了可用于计算同源性或排列序列的程序(例如使用它们的默认设置)，包括GAP、BESTFIT、COMPARE、ALIGN和PILEUP。BLAST算法也可用于比较或排列2个序列，通常使用其默认设置。用于进行2个序列的BLAST比较的软件可从国家生物技术信息中心(National Center for Biotechnology Information)(http:// www.ncbi.nlm.nih.gov/)公开获得。此算法在下面进一步描述。用于序列比对和比较的类似可公开获得的工具可在欧洲生物信息研究所(European Bioinformatics Institute)网站(http://www.ebi.ac.uk)找到，例如ALIGN和CLUSTALW程序。
有许多不同的方法可用于确定多态性是否指示对肝铜积累的易感性或免于肝铜积累的保护。通常将候选多态性与多态性及其与对肝铜积累的易感性或免于肝铜积累的保护的关联的数据库相比较。这样的数据库通过对一组狗以肝铜积累进行表型分型，例如通过肝活组织检查，并根据铜积累的水平将狗分类而生成。所述组中的狗也进行一组多态性的基因分型。然后，有可能确定各基因型和肝铜水平的关联。因此，通过在数据库中定位多态性而实现确定多态性是否指示对肝铜的易感性或免于肝铜的保护。
如果目的多态性不在上述数据库中，仍然有可能确定所述多态性是否指示对肝铜积累的易感性或免于肝铜积累的保护。这可通过对一组狗以肝铜积累进行表型分型和根据肝铜积累的水平将狗分类而实现。然后将所述组的狗进行目的多态性的基因分型。然后将基因型和肝铜水平相关联以确定基因型和肝铜水平的关联。
一旦在狗基因组中检测了到一种或多种本发明多态性的存在或缺失，就由此确定了狗是否受到保护免于肝铜积累或对肝铜积累易感。各单独的多态性或与其它多态性组合的多态性的基因型指示狗受到保护免于肝铜积累或对肝铜积累易感。
为确定狗对肝铜积累的易感性或狗受到保护免于肝铜积累的可能性，可对如本文所定义的一种或多种多态性进行基因分型。存在一个或多个与高铜相关的等位基因指示狗对肝铜积累易感。相反地，存在一个或多个与低铜相关的等位基因指示狗有可能受到保护免于肝铜积累。例如为确定狗是否受到保护免于肝铜积累，可使用来自狗的DNA样品对狗基因组中位于Chr22_3135144的SNP进行基因分型。该功能性突变位于ATP7B (在X 染色体上)并且A等位基因具有保护性。一旦确定了SNP的基因型，则有可能确定狗是否受到保护免于肝铜积累。A等位基因的存在指示了免于肝铜积累的保护。针对该等位基因纯合的狗(AA)最有可能受到保护免于肝铜积累。因此本发明优选的方法包含确定狗基因组中ATP7B SNP的A等位基因的存在或缺失。所述方法可包含确定狗对ATP7B SNP的A等位基因为纯合还是杂合。
如果方法包含检测多种指示对肝铜积累的易感性或免于肝铜积累的保护的多态性的存在或缺失，则可使用组合这些结果的模型，针对狗对肝铜积累易感性的风险或狗受到保护免于肝铜积累的可能性给出总体评估。实施例6解释了如何使用多种多态性来产生模型。优选地，使用分段建模技术。实施例2描述了模型产生的简化实例。表3给出了GOLGA5、UBL5和ATP7A基因区域中5个SNP组合的不同可能的基因型和具有那些基因型的狗具有高铜(高于600 mg/kg的肝水平)的百分比。在这个实施例中，为确定狗对肝铜积累的易感性，可使用来自狗的DNA样品对狗基因组中的5个SNP进行基因分型。一旦确定了SNP的基因型，可以基于实施例2中提供的译码，即基于基因型与高铜的关联的程度，将它们转化为二元值。然后，用表3基于具有该基因型模式和高铜的狗的百分比将二元值转化为风险因子。
通过本发明的方法可检测在任意年龄的狗，例如从0至12、0至6、0至5、0至4、0至3、0至2或0至1岁。优选地，在尽可能小的年龄检测狗，例如在其生命的头1年、头6个月或3个月以内。优选地在铜积累发生前检测狗。可能知道或可能不知道狗的历史。例如，狗可能为父母已知的小狗并且可能已知关于其父母铜积累的历史。或者，狗可能为具有的未知出身和历史的走失或被救助的狗。
通过本发明的任何方法检测的狗可为任何品种。本发明提供了确定混种或杂交狗，或杂种或远交狗的基因组是否包含指示免于肝铜积累的保护或对肝铜积累的易感性的一种或多种多态性的方法。
在本发明的方法中，狗可为疑为对肝铜积累易感的狗。或者狗可被疑为受到保护免于肝铜积累。
通常狗具有选自拉布拉多寻回犬、杜宾犬、德国牧羊犬、荷兰狮毛犬、可卡犬、西部高地白梗、贝灵顿梗和斯凯梗的品种的遗传特征。狗可为混种或杂交狗，或杂种或远交狗。狗可具有至少25%、至少50%或至少100%遗传自任何纯种的基因组或更优选地遗传自任何本文所述品种的基因组。狗可为纯种的。在本发明的一个实施方式中，待检测狗的父母一方或双方为纯种狗。在另一个实施方式中，一个或多个祖父母为纯种狗。待检测狗的1、2、3或所有4个祖父母可为纯种狗。
优选地，狗具有拉布拉多寻回犬的遗传品种特征。狗可为纯种拉布拉多寻回犬。或者，狗可为混种或杂交狗，或远交狗(杂种)。狗父母的一方或双方可为纯种拉布拉多寻回犬。狗的1、2、3或4个祖父母可为纯种拉布拉多寻回犬。狗在其遗传背景中可具有至少50%或至少75%的拉布拉多寻回犬品种。因此，狗基因组的至少50%或至少75%可来源于拉布拉多寻回犬品种。
通过评估遗传标记例如SNP或微卫星的等位基因频率可确定狗的遗传品种背景。在狗中不同SNP或微卫星的等位基因频率的组合提供了允许确定狗品种或构成混种狗的品种的识别标志。这样的遗传检测可为市售的检测。或者，不需要检测狗的特定品种遗传特征，因为例如狗主人或兽医怀疑其具有特定品种特征。这可能是由于例如已知狗的祖先或由于其外观。
本发明的预测检测可与一种或多种其它预测或诊断检测共同实施，例如确定狗的遗传品种背景/特征或对一种或多种其它疾病的易感性。
多态性的检测
根据本发明的多态性检测可包含将来自狗的样品中的多核苷酸或蛋白质与多态性的特异性结合试剂接触并确定所述试剂是否与所述多核苷酸或蛋白质结合，其中试剂的结合指示所述多态性的存在，而没有试剂的结合指示所述多态性的缺失。
所述方法通常用来自狗的样品体外实施，其中所述样品包含来自狗的DNA。样品通常包含狗的体液和/或细胞，例如使用拭子获得，例如口腔拭子。样品可为血液、尿、唾液、皮肤、颊细胞或发根样品。通常在实施方法前处理样品，例如可进行DNA提取。样品中的多核苷酸或蛋白质可被物理或化学切割，例如使用合适的酶。在一个实施方式中，在检测多态性前，将样品中的部分多核苷酸拷贝或扩增，例如通过克隆或使用基于PCR的方法。
在本发明中，任意一种或多种方法可包含确定狗中一种或多种多态性的存在或缺失。通常通过直接确定狗中多核苷酸或蛋白质中多态序列的存在来检测多态性。这样的多核苷酸通常为基因组DNA、mRNA或cDNA。可通过任意合适的方法例如下面提及的那些检测多态性。
特异性结合试剂是优先或以高亲和力与具有多态性的蛋白质或多肽结合但不与或仅以低亲和力与其它多肽或蛋白质结合的试剂。特异性结合试剂可为探针或引物。探针可为蛋白质(例如抗体)或寡核苷酸。探针可被间接标记或能够被间接标记。探针与多核苷酸或蛋白质的结合可用于固定探针或多核苷酸或蛋白质。
一般来说在方法中，可通过确定试剂与狗的多态多核苷酸或蛋白质的结合检测多态性。然而，在一个实施方式中，试剂也能够结合对应的野生型序列，例如结合在变异位置侧翼的核苷酸或氨基酸，虽然与野生型序列的结合和与含有多态性的多核苷酸或蛋白质的结合的方式具有可检测到的不同。
所述方法可基于寡核苷酸连接试验，其中使用2种寡核苷酸探针。这些探针结合至含有多态性的多核苷酸的相邻区域，在结合后允许2种探针通过合适的连接酶连接在一起。然而在一种探针中存在单个错配将破坏结合和连接。因此仅在含有多态性的多核苷酸中出现连接的探针，并因此连接产物的检测可用于确定多态性的存在。
在一个实施方式中，探针用于基于异源双链体分析的系统。在这样的系统中，当探针与含有多态性的多核苷酸序列结合时，其在存在多态性的位点形成异源双链体并因此不形成双链结构。这样的异源双链体结构可通过使用单链或双链特异酶检测。探针通常为RNA探针，使用RNA酶H切割异源双链体并通过检测切割产物检测多态性。
所述方法可基于荧光化学切割错配分析，其描述在例如PCR Methods andApplications 3, 268-71 (1994)和Proc. Natl. Acad. Sci. 85, 4397-4401 (1998)中。
在一个实施方式中，使用PCR引物，只有当其与含有多态性的多核苷酸结合时才引发PCR反应，例如序列特异性PCR系统并通过检测PCR产物可确定多态性的存在。优选地与多态性互补的引物区域位于或靠近引物的3'端。多态性的存在可使用基于荧光染料和猝灭剂的PCR试验例如Taqman PCR检测系统来确定。
特异性结合试剂可能能够特异地结合由多态序列编码的氨基酸序列。例如，所述试剂可为抗体或抗体片段。检测方法可基于ELISA系统。所述方法可为基于RFLP的系统。这可以在多核苷酸中的多态性的存在产生或破坏了被限制性内切酶识别的限制性内切位点的情况下使用。
可基于多态性的存在造成的多核苷酸或蛋白质在凝胶电泳中迁移率的改变来确定多态性的存在。在多核苷酸的情况下，可使用单链构象多态性(SSCP)或变性梯度凝胶电泳(DDGE)分析。在另一个检测多态性的方法中，对包含多态区域的多核苷酸在跨越含有多态性的区域测序以确定多态性的存在。
可通过荧光共振能量转移(FRET)的方式检测多态性的存在。具体来说，可通过双杂交探针系统检测多态性。此方法涉及使用2种彼此位置接近且与靶目的多核苷酸的内部区段互补的寡核苷酸探针，其中2种探针中的每一种用荧光团标记。任意适宜的荧光标记物或染料可用作荧光团，从而使一种探针(供体)上的荧光团的发射波长与第二种探针(受体)上的荧光团的激发波长部分重叠。通常的供体荧光团为荧光素(FAM)并且通常的受体荧光团包括德克萨斯红、罗丹明、LC-640、LC-705和青色素5 (Cy5)。
为了发生荧光共振能量转移，2种荧光团需在2种探针与靶杂交后相距很近。当供体荧光团被合适波长的光激发时，发射谱能量被转移至受体探针上的荧光团导致其发出荧光。因此，在合适波长下激发供体荧光团时检测此波长的光指示杂交和2种探针上荧光团的紧密关联。每种探针可用荧光团在一端标记，从而使位于上游(5')的探针在其3'端被标记，且位于下游(3')的探针在其5'端被标记。当与靶序列结合时2种探针之间的间隔可为1至20个核苷酸，优选1至17个核苷酸，更优选1至10个核苷酸，例如1、2、4、6、8或10个核苷酸的间隔。
可将2种探针中的第一种设计为与多态性相邻基因的保守序列结合并可将第二种探针设计为与包括一种或多种多态性的区域结合。在第二种探针靶向的基因序列中的多态性可通过测量由产生的碱基错配引起的解链温度的改变而检测。解链温度改变的程度将取决于核苷酸多态性涉及的数目和碱基类型。
也可使用引物延伸技术进行多态性分型。在此技术中，例如使用PCR拷贝或扩增多态性位点周围的靶区域。而后使用在距离多态性位点一个碱基的位置退火的引物进行单碱基测序反应(等位基因特异性核苷酸并入)。然后检测引物延伸产物以确定在多态位点存在的核苷酸。有几种方法可检测延伸产物。例如在一种检测方法中，使用荧光标记的双脱氧核苷酸终止子在多态位点处终止延伸反应。或者，使用质量修饰的双脱氧核苷酸终止子并使用质谱检测引物延伸产物。通过特异性标记一种或多种终止子，可推断出延伸的引物的序列和因此推断出在多态位点存在的核苷酸。每个反应可分析多于一种反应产物并且因此如果多于一种的终止子被特异性标记，则可确定在2条同源染色体上存在的核苷酸。
本发明还提供了可用于检测如本文定义的任何多态性的引物或探针以用于预测对肝铜积累的易感性或免于肝铜积累的保护。本发明的多核苷酸还可作为引物用于引物延伸反应以检测本文定义的SNP。
这样的引物、探针和其它多核苷酸片段的长度优选地可为至少10个，优选地至少15或至少20个，例如至少25个，至少30个或至少40个核苷酸。它们的长度通常多至40、50、60、70、100或150个核苷酸。探针和片段长度可超过150个核苷酸，例如长度多至200、300、400、500、600、700个核苷酸，或甚至达到比本发明的全长多核苷酸序列短几个核苷酸，例如5或10个核苷酸。
可使用本领域已知的任意合适的设计软件，使用表4、5、6、8、18和20中的序列设计对本发明多态性基因分型的引物和探针。这些多核苷酸序列的同源物也适于设计引物和探针。这样的同源物通常具有至少70%的同源性，优选至少80、90%、95%、97%或99%的同源性，例如覆盖至少15、20、30、100或更多连续核苷酸的区域。可基于核苷酸同一性(有时被称为“硬同源性”)计算同源性。
例如UWGCG软件包提供了可用于计算同源性的BESTFIT程序(例如在其默认设置下使用)(Devereux 等人 (1984) Nucleic Acids Research 12, p387-395)。PILEUP和BLAST算法可用于计算同源性或排列序列，例如鉴定等同或对应序列(通常使用其默认设置)，例如在Altschul S. F. (1993) J Mol Evol 36:290-300；Altschul, S, F 等人(1990) JMol Biol 215:403-10中所描述的。
进行BLAST分析的软件可通过国家生物技术信息中心(http:// www.ncbi.nlm.nih.gov/)公开地获得。此算法涉及通过鉴定当与数据库序列中相同长度的字串比对时匹配或满足一定正值阈值得分T的查询序列中的长度为W的短字串而首先鉴定高得分序列对(HSP)。T被称为邻近字串得分阈值(Altschul等人，见上文)。这些最初的相邻字串命中(hits)充当种子用于起始检索以寻找含有它们的HSP。字串命中沿着每条序列的2个方向延伸，只要可增加累积的比对得分。当累积比对得分从其最大获得值下降X的量；由于一个或多个负得分残基比对的累积，累积得分到达0或更低；或达到任一序列的末端时，在各自方向上的字串命中延伸终止。BLAST算法参数W、T和X决定了比对的敏感度和速度。BLAST程序使用11的字串长度(W)、BLOSUM62得分矩阵(见Henikoff和Henikoff (1992)Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 10915-10919)、50的比对(B)、10的期望(E)、M=5、N=4和2条链的比较作为默认设置。
BLAST算法对2条序列之间的相似性进行统计学分析；参见例如Karlin和Altschul(1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 5873-5787。BLAST算法提供的一种相似性的量度为最小和概率(P(N))，其提供了2条多核苷酸序列间会偶然发生匹配的概率的指示。例如，如果比较第一条序列与第二条序列的最小和概率低于约1、优选地低于约0.1、更优选地低于约0.01和最优选地低于约0.001，则认为一条序列与另一条序列相似。
同源序列通常具有至少1、2、5、10、20或更多个突变的差异，其可为核苷酸的取代、缺失或插入。
本发明的多核苷酸例如引物或探针可以分离的或基本上纯化的形式存在。它们可与不干扰其预期用途的载体或稀释剂混合并仍被视为是基本上分离的。它们也可为基本上纯化的形式，在这种情况下它们将通常包含至少90%，例如至少95%、98%或99%的制品的多核苷酸。
检测抗体
检测抗体为一种特异针对一种多态性但不与如本文所述的任意其它多态性结合的抗体。检测抗体在例如涉及免疫沉淀技术的纯化、分离或筛选方法中有用。
抗体可针对本发明多肽的特定表位产生。当抗体或其它化合物与其特异性针对的蛋白质优先或高亲和力结合但与其它多肽基本上不结合或仅以低亲和力结合时，抗体或其它化合物“特异性结合”多肽。各种确定抗体的特异性结合能力的竞争性结合或免疫放射测定的方案是本领域所熟知的(见例如Maddox 等人, J. Exp. Med. 158, 1211-1226,1993)。这样的免疫测定通常涉及特定蛋白质和其抗体间的复合物的形成以及测量复合物的形成。
对于本发明的目的，除非有相反的规定，术语“抗体”包括结合本发明多肽的片段。这样的片段包括Fv, F(ab')和F(ab')2片段，以及单链抗体。此外，抗体和其片段可为嵌合抗体、CDR-移植的抗体或人源化抗体。
抗体可用于检测生物样品中(例如本文提及的任何这样的样品)的本发明多肽的方法中，所述方法包含：
I提供本发明的抗体；
II将生物样品与所述抗体在允许形成抗体-抗原复合物的条件下孵育；和
III确定包含所述抗体的抗体-抗原复合物是否形成。
本发明的抗体可通过任意适宜方法生成。制备和表征抗体的方法是本领域所熟知的，参见例如Harlow 和Lane (1988) “Antibody: A Laboratory Manual”, Cold SpringHarbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY。例如，可通过在宿主动物中产生针对完整多肽或其片段例如其抗原表位(下文中所述的“免疫原”)的抗体而产生抗体。所述片段可为本文提及的任意片段(通常长度至少10或至少15个氨基酸)。
产生多克隆抗体的方法包括用免疫原免疫合适的宿主动物，例如实验动物，并从动物的血清中分离免疫球蛋白。因此，可用免疫原接种动物，之后从动物中取出血液并纯化IgG部分。产生单克隆抗体的方法包含使产生期望抗体的细胞永生化。通过将来自接种的实验动物的脾细胞和肿瘤细胞融合，可产生杂交瘤细胞(Kohler 和Milstein (1975)Nature256, 495-497)。
可通过常规步骤选择产生期望抗体的永生细胞。杂交瘤细胞可经培养生长或经腹腔注射以形成腹水或注射至同种异体宿主或免疫功能不全的宿主的血流中。人抗体可通过人淋巴细胞的体外免疫和之后使用Epstein-Barr病毒转化淋巴细胞来制备。
为产生单克隆和多克隆抗体二者，实验动物适宜地为山羊、兔、大鼠、小鼠、豚鼠、鸡、绵羊或马。如果需要，免疫原可以作为缀合物施用，其中免疫原，例如通过氨基酸残基之一的侧链，与合适的载体偶联。载体分子通常为生理上可接受的载体。得到的抗体可为分离的并且，如果需要，可为纯化的。
检测试剂盒
本发明也提供试剂盒，其包含对本文定义的一种或多种多态性分型的装置。具体来说，这样的装置可包括特异性的结合剂、探针、引物、引物对或引物组合、或如本文定义的能够检测或辅助检测本文定义的多态性的抗体，包括抗体片段。引物或引物对或引物组合可为只引起包含如本文讨论的待检测的多态性的多核苷酸序列的PCR扩增的序列特异性引物。引物或引物对或者可不特异针对多态核苷酸，而可特异针对上游(5')区和/或下游(3')区。这些引物允许包含多态核苷酸的区域被拷贝。适用于引物延伸技术的试剂盒可特别地包括标记的双脱氧核苷酸三磷酸(ddNTP)。它们可为例如荧光标记的或质量修饰的以便能够检测延伸产物并因此确定在多态位置存在的核苷酸。
所述试剂盒还可包含特异性结合试剂、探针、引物、引物对或引物组合或能够检测多态性缺失的抗体。所述试剂盒可进一步包含缓冲液或水溶液。
所述试剂盒可额外包含一种或多种其它能够使上述方法的任意实施方式得到实施的试剂或设备。这样的试剂或设备可包括以下的一种或多种：检测试剂与多态性结合的装置、可检测的标记例如荧光标记、能够作用于多核苷酸的酶，通常为聚合酶、限制性酶、连接酶、RNA酶H或可将标记连接至多核苷酸的酶、酶试剂的合适缓冲液或水溶液，与本文讨论的多态性侧翼的区域结合的PCR引物、阳性和/或阴性对照、凝胶电泳设备、从样品中分离DNA的装置、从个体中取得样品的装置，例如拭子或包含针的设备、或包含在上面可进行检测反应的孔的支持物。所述试剂盒可为或包含阵列例如包含本发明的特异性结合试剂(优选探针)的多核苷酸阵列。所述试剂盒通常包含一套使用所述试剂盒的说明书。
生物信息学
多态性序列可以电子格式储存，例如在计算机的数据库中。相应地，本发明提供了包含涉及选自以下的一种或多种多态性的数据库：
Figure 965619DEST_PATH_IMAGE010
和位于染色体位置 22:3135287的CGCCCC重复；
(b)一种或多种与所述多态性(a)处于连锁不平衡的多态性；和/或
(c)Chr32_38904515 (SEQ ID NO: 156)、Chr8_4892743 (SEQ ID NO: 157)和Chr8_4880518 (SEQ ID NO: 158)；
以及它们与狗对肝铜积累易感性的关联。数据库还可包含涉及本文所述任意其它多态性的信息。所述数据库可包括关于多态性的其它信息，例如多态性与狗对肝铜积累易感性的关联的程度。
本发明还提供了包含涉及选自以下的一种或多种多态性的信息的数据库：
(a)Chr22_3135144 (SEQ ID NO: 145)；和
(b)一种或多种与(a)处于连锁不平衡的多态性；
以及它们与狗受到的免于肝铜积累的保护的关联。
所述数据库还可包含涉及本文所述任意其它多态性的信息。所述数据库可包括其它关于多态性的信息，例如多态性与狗受到的免于肝铜积累的保护的关联程度。
本文描述的数据库可用于确定狗基因组是否包含一种或多种指示免于肝铜积累的保护或对肝铜积累的易感性的多态性。这样的确定可通过电子装置实施，例如通过使用计算机系统(例如PC)。
通常地，确定狗基因组是否包含一种或多种指示对肝铜积累的易感性或免于肝铜积累的保护的多态性将通过将来自狗的遗传数据输入计算机系统；将所述遗传数据与本文定义的数据库进行比较；以及基于此比较确定狗基因组是否包含一种或多种指示对肝铜积累的易感性或免于肝铜积累的保护的多态性来进行。该信息然后可用于指导狗肝铜水平的管理或可用于知情育种的目的。
本发明还提供了包含的程序编码装置计算机程序，其用于当所述程序在计算机上运行时实施所有本发明方法的所有步骤。还提供了包含储存在计算机可读介质上的程序编码装置的计算机程序产品，用于当所述程序在计算机上运行时实施本发明的方法。另外提供了包含在载波上的程序编码装置的计算机程序产品，当在计算机上运行时其命令计算机系统实施本发明的方法。
如图10中的说明，本发明还提供了安排实施根据本发明的方法的设备。所述设备通常包含计算机系统，例如PC。在一个实施方式中，所述计算机系统包含：用于接收来自狗的遗传数据的装置20；用于将所述数据和包含涉及多态性的信息的数据库10进行比较的模块30；和用于基于所述比较确定狗基因组是否包含一种或多种指示免于肝铜积累的保护或对肝铜积累的易感性的多态性的装置40。
育种工具
育种值被定义为个体作为亲本的值并且通常在农业生产中用于改善牲畜的期望性状。为了改善狗的总体铜处理能力并降低铜相关疾病例如慢性肝炎的发生率，选择受到保护免于肝铜积累的或对肝铜积累不易感的狗用于育种是有利的。此问题通过使用可用于确定狗是否受到保护免于肝铜积累或对肝铜积累不易感的多态性而解决以便知情育种。
例如，父母在ATP7B基因座的基因型可影响2只狗的后代的铜处理能力。在此基因座的特定变体的转移对后代将是有益的。通过确定在此基因座的基因型，有可能评估预期亲本的育种值并因此作出特定育种对是否合适的决定。
相应地，本发明提供了选择用于产生受到保护免于肝铜积累的后代的狗的方法，包含通过本发明的方法在候选第一只狗中确定狗的基因组中是否包含一种或多种指示免于肝铜积累的保护的多态性；并由此确定候选第一只狗是否适于产生受到保护免于肝铜积累的后代。所述方法可进一步包含通过本发明的方法在与第一只狗性别相反的第二只狗中确定狗的基因组中是否包含一种或多种指示免于肝铜积累的保护的多态性。如果结果是第一只和/或第二只狗具有指示免于肝铜积累的保护的基因型，则可让第一只狗和第二只狗交配以产生受到保护免于肝铜积累的后代。
例如，所述方法可包含确定选自Chr22_3135144 (SEQ ID NO:145)和与其处于连锁不平衡的一种或多种多态性的一种或多种多态性在候选第一只狗的基因组中的存在或缺失。更优选地，所述方法进一步包含确定SNP ChrX_63338063 (ATP7a_Reg3_F_6 SNP;SEQ ID NO: 142)或一种或多种与所述SNP处于连锁不平衡的多态性，例如ChrX_63397393(ATP7a_Reg16_F_42 SNP; SEQ ID NO:143)的存在或缺失。本发明的方法可包含确定Chr22_3135144 (SEQ ID NO: 145)的A等位基因和/或ChrX_63338063 (SEQ ID NO:142)的T等位基因的存在或缺失。存在这些SNP中的一种或多种指示第一只狗受到保护免于肝铜积累并因此是与第二只狗交配的良好候选者。在第一只和/或第二只狗中的纯合性是最优选的，因为这增加了后代是纯合的和由此受到保护免于肝铜积累的可能性。
本发明还提供了通过使用本发明的指示对铜积累的易感性的多态性而选择用于产生受到保护免于肝铜积累的后代的狗的方法。在狗基因组中缺失这些多态性指示所述狗是用于交配的良好候选者。本发明的方法可因此包含确定候选第一只狗的基因组是否包含一种或多种指示对肝铜积累的易感性的多态性；并由此确定候选第一只狗是否适于产生受到保护免于肝铜积累的后代。
所述方法可包含确定候选第一只狗的基因组中选自以下的一种或多种多态性的存在或缺失：
Figure 546773DEST_PATH_IMAGE011
和位于染色体位置22:3135287的CGCCCC重复；
(b)一种或多种与所述多态性(a)处于连锁不平衡的多态性；和/或
(c)Chr32_38904515 (SEQ ID NO: 156)、Chr8_4892743 (SEQ ID NO: 157)和Chr8_4880518 (SEQ ID NO: 158)。
所述方法还可包含确定与第一只狗性别相反的第二只狗的基因组是否包含一种或多种指示对肝铜积累易感性的多态性。所述方法因此可包含检测第二只狗的基因组中一种或多种选自以下的多态性的存在或缺失：
Figure 881940DEST_PATH_IMAGE012
和位于染色体位置22:3135287的CGCCCC重复；
(b)一种或多种与所述多态性(a)处于连锁不平衡的多态性；和/或
(c)Chr32_38904515 (SEQ ID NO: 156)、Chr8_4892743 (SEQ ID NO: 157)和Chr8_4880518 (SEQ ID NO: 158)。
如果结果为第一只和/或第二只狗的基因组不具有指示对肝铜积累易感性的基因型，之后可让第一只狗和第二只狗交配以产生对肝铜积累不易感的后代。
所述方法可进一步包含检测候选第一只狗基因组中(I) 在GOLGA5、ATP7A或UBL5基因中指示对肝铜积累易感性的多态性和/或(II) 与所述多态性(I)处于连锁不平衡的多态性的存在或缺失。优选地，所述方法包含确定在候选第一只狗的基因组中一种或多种选自表4至6中所标识的SNP的多态性和与其一种或多种处于连锁不平衡的多态性的存在或缺失。一种或多种这些多态性的存在指示第一只狗对肝铜积累易感并因此不是与第二只狗交配以产生受到免于肝铜积累的保护的后代的良好候选者。
候选第一只狗和/或第二只狗可为任意品种。优选地，候选第一只狗和/或第二只狗具有选自拉布拉多寻回犬、杜宾犬、德国牧羊犬、荷兰狮毛犬、可卡犬、西部高地白梗、贝灵顿梗和斯凯梗的品种的遗传品种特征。更优选地，候选第一只狗和/或第二只狗具有拉布拉多寻回犬品种的遗传特征。所述狗可为纯种拉布拉多寻回犬。或者，所述狗可为混种或杂交狗，或远交狗(杂种)。所述狗的父母的一方或双方可为纯种拉布拉多寻回犬。所述狗的1、2、3或4个祖父母可为纯种拉布拉多寻回犬。所述狗在其遗传背景中可具有至少50%或至少75%的拉布拉多寻回犬品种。因此，所述狗基因组的至少50%或至少75%可来源于拉布拉多寻回犬品种。
通过评估遗传标记(例如SNP或微卫星)的等位基因频率可确定狗的遗传品种特征。在狗中不同SNP或微卫星的等位基因频率的组合提供了允许确定狗品种或构成混种狗的品种的识别标志。这样的遗传检测可为市售的检测。或者，对于特定品种特征不需要对狗进行检测，因为例如狗主人或兽医怀疑其具有特定品种遗传特征。这可能是由于例如已知狗的祖先或由于其外观。
大多数被所有品种俱乐部(all breed club)登记认可的品种的纯种狗通过“封闭的血统证书”来控制。血统证书通常是由例如品种协会或养犬俱乐部保存的被认可的特定品种狗的官方登记。如果只有其父母均被登记的情况下狗才可加入，它一般被称为“封闭的”血统证书。大多数品种具有封闭的血统证书，导致了近交，因为不能从现有种群以外引入遗传多样性。在由养犬俱乐部认可的多个品种中，这已导致遗传疾病或失调的高发率和其它问题例如降低的产仔数，降低的寿命和不能自然怀孕。
为了避免与近交相关的问题，在特定品种中选择彼此关系较远的狗比起关系较近的狗进行育种是有利的。因此在本发明的一个方面，确定候选第一只狗和候选第二只狗的遗传品种特征以确定2只狗的相关度。在本发明的此方面，术语“遗传品种特征”是指在特定品种中狗的遗传血统。可如本文所述确定狗的遗传品种特征。通过确定狗的遗传特征，有可能分辨在单一品种的2只狗以确定它们的关系有多近。
因此，在本发明的一个方面确定候选第一只狗和候选第二只狗的相关度，其包含比较候选第一只狗和相同品种的候选第二只狗的遗传品种特征。优选地，所述狗为纯种狗。每只狗的遗传品种特征可通过例如鉴定在所述狗中的一种或多种品种特异多态性的存在或缺失而确定。
可通过狗共有的品种特异性多态性的数目确定所述相关度。例如，相同品种的2只狗可共有从0至100%的检测的品种特异多态性，例如从10至90%、从20至80%、从30至70%或从40至60%。因此2只狗可共有至少10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%或90%检测的品种特异多态性。可使用2只狗之间共有的检测的品种特异多态性的百分比作为它们相关度的量度。在本发明的此方面，只有当2只狗在遗传上足够地不相关时才可将其交配在一起。例如，只有当它们共有的检测的品种特异多态性低于60%、50%、40%、30%或低于20%时才可将其交配在一起。
本发明还提供了选择用于与对象狗育种的一只或多只狗的方法，所述方法包含：
(a)确定在对象狗和与对象狗性别相反的2只或多只狗的实验组中的每只狗的基因组中是否包含一种或多种指示免于肝铜积累的保护的多态性和/或一种或多种指示对肝铜积累的易感性的多态性；和
(b)从实验组中选择1只或多只狗用于与对象狗育种。
实验组可由至少2、3、4、5、10、15、20、25、30、50、75、100或200只不同的狗组成，例如从2至100，从5至70或从10至50只狗。通常基于受到保护免于肝铜积累从实验组中选择狗。从实验组中选择的一只或多只狗可与对象狗具有相同或相似的遗传品种特征。
对象狗和实验组中的每只狗可为任意品种。优选地，对象狗和/或实验组中的每只狗具有选自拉布拉多寻回犬、杜宾犬、德国牧羊犬、荷兰狮毛犬、可卡犬、西部高地白梗、贝灵顿梗和斯凯梗的品种的遗传品种特征。更优选地，所述狗具有拉布拉多寻回犬品种的遗传品种特征。所述狗可为纯种拉布拉多寻回犬。可选地，所述狗可为混种或杂交狗，或远交狗(杂种)。所述狗的父母的一方或双方可为纯种拉布拉多寻回犬。所述狗的1、2、3或4个祖父母可为纯种拉布拉多寻回犬。所述狗在其遗传背景中可具有至少50%或至少75%的拉布拉多寻回犬品种。因此，所述狗基因组的至少50%或至少75%可来源于拉布拉多寻回犬品种。
可基于与免于肝铜积累的保护或对肝铜积累的易感性相关的多态性的存在或缺失，选择最有可能受到保护免于肝铜积累的测试组中的狗与对象狗育种。或者，选择可能受到保护免于肝铜积累的测试组中的多只狗与对象狗育种。例如，可选择测试组中的至少2、3、4、5、10、15或20只狗。可基于其它因素例如地理位置、年龄、育种状态、病史、疾病易感性或身体特征从选择的狗的组中进行进一步的选择。
如上面解释的，交配相同品种中遗传最不相关的狗是理想的。这是为了提高或维持品种中的遗传多样性和降低在子代中涉及近交相关问题的可能性。因此从测试组中进一步选择狗可基于狗与对象狗的遗传相关性。相应地，所述方法可进一步包含：
(a)将对象狗的遗传品种特征和与对象狗品种相同且性别相反的2只或多只狗的测试组中的每只狗的遗传品种特征进行比较；
(b)根据比较确定对象狗和测试组中每只狗的相关度；和
(c)从测试组中选择用于与对象狗育种的1只或多只狗。
可基于其与对象狗(即待育种的狗)的相关性从测试组中选择狗。优选地，从测试组中选择的一只或多只狗是在狗实验组中相关性最远的(即具有最低的相关度)。对象狗和测试组中的狗的遗传品种特征可为已知的或可通过例如市售的品种检测法确定。
本发明因此提供了推荐用于与对象狗育种的1只或多只合适的狗的方法。推荐可对对象狗的主人或看护者、兽医、狗育种家、养犬俱乐部或品种登记作出。
本发明还涉及育种狗的方法，其中任选地在相同的品种中，在将其在一起育种前，确定性别相反的至少2只狗受到免于肝铜积累的保护或对肝铜积累的易感性。
可以将狗受到免于肝铜积累的保护或对肝铜积累的易感性以电子格式存储，例如在计算机的数据库中。相应地，本发明提供了包含涉及1只或多只狗对肝铜积累的易感性或受到免于肝铜积累的保护和性别的信息的数据库。所述数据库可包括有关狗的进一步信息，例如狗的遗传品种特征、育种状态、年龄、地理位置、病史、疾病易感性或身体特征。所述数据库通常还包含每只狗的唯一标识符，例如狗的登记名。所述数据库可被远程访问，例如使用互联网。
本发明通过以下实施例进行说明：
实施例1
全基因组关联研究并鉴定潜在含有信息基因的区域
该实施例说明了为开发铜积累遗传预测检测而采用的一般方法。它还详述了用于全基因组关联研究和鉴定潜在含有信息基因的基因组区域的方法。
用于开发铜积累遗传预测检测的一般方法如下。首先，将从诊断为肝铜积累“受影响”或“不受影响”的狗收集的样品在有大量标记的基因分型微阵列上运行。这被称为“全基因组关联研究”。分析该数据给出关于潜在含有信息基因区域的指示。然后将含有目的基因区域中的信息SNP用于模型产生。同时，对目的基因进行测序以寻找更好说明对疾病的遗传影响的编码突变或其它突变。然后将这些突变用于进一步的模型产生。实际上，由于科技的不断进步，这个过程涉及环路和并行途径。
病患招募
数据收集自254只拉布拉多寻回犬。狗以2种方式招募。临床上受影响的狗通过转介兽医住进乌得勒支大学(Utrecht University)兽医医学院肝脏学系。通过荷兰拉布拉多寻回犬育种俱乐部的登记档案积极招募受影响狗的一线亲属。
诊断
每只狗经过体检并且收集血液用于凝血检测、肝脏酶(碱性磷酸酶和丙氨酸转氨酶)、胆酸和白蛋白的测定，EDTA血液样品用于分离DNA。
肝脏活检组织通过Menghini技术，由超声波引导用Trucut 14 号针头装置获得自239只狗，收集于腹腔镜检查或剖腹手术时或取自安乐死后(Teske等人, 1992, Vet. Rec.131:30-32)。肝脏活检组织用4%福尔马林缓冲液固定3个小时、转移至70%乙醇中并在石蜡中包埋。将5微米的切片封装在载玻片上并用苏木精和曙红(常规评价)、von Giesson (网硬蛋白染色)和红氨酸(铜染色)进行染色。
诊断基于我司经认证的病理医生(TSGAMvdI)对肝脏活体组织的组织学评价。铜积累的严重性如以前描述的按照分级从0至5打分(Teske等人, 1992, Vet. Rec. 131:30-32)。另外的肝脏活体组织收集于无铜容器、冻干并且用仪器中子活化分析(INAA)以肝脏干重定量确定铜(Bode等人, 2008, Anal. Bioanal. Chem. 390:1653-1658)。
组织学得分说明如下：
0级-无铜。
1级-含有一些铜阳性颗粒的孤立肝细胞。
2级-含有少量至中等量的铜阳性颗粒的小群或小面积的肝细胞。
3级-含有中等量的铜阳性颗粒的较大群或面积的肝细胞，有时与含铜的巨噬细胞相关联。
4级-具有许多铜阳性颗粒的大面积的肝细胞，常常与含铜的巨噬细胞相关联。
5级-全小叶弥散存在具有许多铜阳性颗粒的的肝细胞，常常与含铜的巨噬细胞相关联。
样品表型分析
铜相关慢性肝炎之前已被表型表征(Hoffmann等人, 2006, J. Vet. Intern.Med. 20: 856-861)。根据肝脏活组织的评价定义了4种表型。
为了22k芯片数据(参见以下)的目的，本发明人将高于600 mg/kg干重的肝铜浓度指定为“受影响”并且低于400 mg/kg干重的为“不受影响”(quantaff)。
对于最明确的铜中毒病例和对照也应用了二元表型(cutox)。病例定义为具有>1200 mg/kg的肝铜水平或铜染色> 3并且具有肝炎组织学迹象。对照定义为具有< 400 mg/kg的肝铜水平并且染色< 2并且组织学无异常。用更为分开的表型提高遗传作图的分辨率。
病理医生根据红氨酸染色打出的半定量分数被用作定量表型(ra) (分数 0-5)并且可从所有经过肝脏活检的狗获得。
肝脏组织中的定量铜水平被用作定量表型(cuq)并且范围从65至3870 mg/kg。
基因分型(Illumina 22K芯片)
使用第一代Illumina犬类基因分型阵列进行基因组范围的基因分型，其目的在于测量大约22,000个SNP基因座(22K芯片)。本发明人在该阵列上运行251份狗DNA样品。
卡方分析
用一套卡方检验分析数据。使用2度自由度检验。而后按照p-值将基因座分等级以按优先顺序进行进一步研究。
成对分析
通常遗传作图通过按遍布整个基因组的标记对选择的样品进行基因分型来完成。针对特征例如疾病对样品进行表型分析。样品通常选自于单一亚种群并且选择使其在该种群内尽可能地不相关。这样做是为了降低从种群结构中得到假阳性命中的风险。
由于狗始终处于大量的变化遗传选择中，在之前的犬类遗传研究中难以满足这些严格的标准。这就在数据组中跨越品种亚型、地理、时间和社会集团产生了种群结构。须开发新方法以在种群结构和密切相关的样品存在时分析犬类遗传数据。成对作图是针对此目的所开发的最成功的方法。
开发了确定与一组个体中遗传特征相关的多态性的方法，即“分区映射”(又称为“2D作图”)。该方法现阶段局限于二元情况(病例/对照研究)。具有遗传关联的复杂疾病一般由多于一个基因驱动。这些基因可以非线性方式相互作用，使得更加难以用传统方法对其进行作图。通过在成对个体的层面上工作，有可能分解出多个基因的影响，因为一个基因座会或者不会在那对个体上促成表型。该过程的全部操作描述如下。运行此分析后，有可能提取出每个区域的风险等位基因并使用其他方法建立模型预测表型。
“分区映射”算法从头到尾扫描基因组，每50千碱基停顿。在这些点的每一个，分析每一对个体。对于每一对，分析整个染色体的基因型，比较三种可能情况下基因型的可能性。第一种情况为在这对个体中有驱动表型的隐性突变。第二种情况为在这对个体中有驱动表型的显性突变。第三种情况为在该对狗中在此位置没有对于表型的重要突变。使用隐马尔可夫模型计算可能性，如下所述。通过比较这些可能性，有可能针对这对个体得出贝叶斯因子倾向或者反对该位点存在隐性或显性的表型驱动突变。取这些数值的对数；则正值代表更多权重倾向隐性或显性突变，负值代表更多证据倾向此处没有重要突变。
成对个体按照该基因座贝叶斯因子对数的顺序分类。而后成对的贝叶斯因子对数依降序加和，在数据的每个百分位记录证据的累计权重。在大多数情况下一些贝叶斯因子为正值并且一些为负值。这将会给出所记录数值的影响由于数据的百分比而上升并而后下降。该数值的最大值给出了偏向隐性或显性模型证据权重的量度。这被称为“峰值”。
在一些情况下算法特别偏向基因组的纯合区域或具有高密度多态性的区域。通过对在4种可能的病例/对照状态(病例-病例、病例-对照、对照-病例、对照-对照)之间排列的每一对运行该程序来定量此作用。对于任意基因座，从正常峰值中减去排列模型的峰值，并且这样产生修正的峰值。而后有可比较跨基因组的修正峰值，给出目的区域。
此方法已被用于绘制多个与肝脏铜载量相关的位置。这些位置由指示特征相联基因的单体模式标记。而后研究这些位置寻找可能的基因。
区域基因分析
而后分析在全基因组关联研究中鉴定的区域寻找可能的基因。该过程涉及识别信息区域界限；在Ensembl中鉴定该区域的所有基因；寻找与铜或肝脏功能有关的相关蛋白结构域；寻找与铜关联途径的成员全体；并寻找在相关组织中表达的基因。基于该信息，而后按照与疾病牵连的可能性为基因分先后次序。
通过这个程序鉴定了多个与铜积累或肝脏疾病相关的候选基因。
基因分型(Illumina 170K芯片)
比上述22K芯片更新的SNP芯片成为了可能，其具有来自更多样来源的172,115个标记(170K芯片)。该芯片平均每Mb含有多于70个标记。本发明人像在22K芯片上运行那样在该阵列上运行同样的和其它的DNA样品。
分析
使用来自170K芯片的结果，用GenABEL软件(Aulchenko等人, 2007,Bioinformatics, 23: 1294-1296)进行基因组范围的关联分析。分析中保留在98%的个体中成功分型的SNP和具有98%被成功基因分型的SNP的个体。当存在至少20个携带者时将SNP保留在分析中。分析后检查显著相关SNP的哈迪温伯格平衡(HWE)。
基于常染色体基因型信息估计遗传亲属关系。3种特征(铜中毒、红氨酸染色得分和以mg/kg计定量肝铜)的遗传力由多基因模型(Aulchenko等人, 2007, Genetics, 177:577-585)估计，其中通过计算遗传亲属关系矩阵来说明种群亚构建。年龄和性别被作为协变量建模。种群分层用多维标度图检查。通过对多基因模型和基因组对照的估算的残差进行得分检测而进行分层修正。使用方程grammas (Amin等人, 2007, PloS One, 2: e1274)和fasta (Chen等人, 2007, Am. J. Hum. Genetics, 81: 913-926)修正种群分层。在grammas分析中使用1000个排列以获得基因组范围的修正后的p-值。对于雄性和雌性X-染色体被分开分析。
上述成对方法也应用于此处。
一共有109496个标记和253只狗通过了质量控制。表型和针对每一特征计算出的遗传力(H2)的总结描述于表1中。
Figure 610861DEST_PATH_IMAGE013
基因组范围关联分析产生的命中接近基因组范围显著结果。对于所有3种分析的前5个显著SNP的结果描述于表2中。
Figure 876626DEST_PATH_IMAGE014
鉴定出在染色体22上具有ra基因型的接近基因组范围显著单独区域(在grammas中1000次排列后的p-值为0.11)。发现相关区域跨越该染色体开端的15 Mb的区域。候选基因ATP7B位于该区域的3.12-3.16 Mb。该基因的分析描述于实施例5中。
实施例2
3区域模型产生
该实施例描述了确定对肝铜积累易感性的3区域模型的产生。该工作还描述于WO2009/044152 A2、WO 2010/038032 A1和WO 2010/116137 A1中。
从数据库中提取实施例1中所述的区域分析中按优先次序排列的基因内或周围的SNP。这些被分别地且按单体型分析以寻找与肝铜水平相关的信息等位基因模式。
这些模式中最显著(按自由度1度的卡方检验)的被用于模型中。3个基因(ATP7A、UBL5-直接等位基因和GOLGA5)附近的SNP被选择用于模型中。而后生成布尔模型，并且每一个基因模式由0或1代表(1为较高风险基因型或模式)并且3种模式的组合由3个数字的模式代表(例如0-0-0或0-1-1)。因此1-1-1代表高肝铜的最高风险。
表3显示了3区域模型预测铜积累的结果。每个区域使用单一SNP或一组SNP。该模型显示了使用在3个基因组区域中的SNP的这个简单模型，取决于狗的基因型的疾病风险的明确差异。
表3：使用在基因组的三个区域中的基因突变的铜累积预测模型
Figure 374604DEST_PATH_IMAGE015
表3中二元值的译码给出如下。
基因组位置染色体8 (CFA8)、GOLGA5基因区域：
1 = 如果在SNP BICF2P506595具有AA基因型
0 = 如果在SNP BICF2P506595具有任何其他基因型
基因组位置染色体32 (CFA32)，UBL5 基因区域：
1 = 如果在BICF2P772765具有GG基因型、在BICF2S2333187具有CC基因型并且在BICF2P1324008具有GG基因型
0 =如果那些SNP中的任一个显示不同基因型
基因组位置染色体X (CFAX)，ATP7A基因区域：
1 = 如果在BICF2P591872具有AA或AG基因型
0 = 如果在BICF2P591872具有GG基因型。
表3表示了在3个基因组位置的等位基因的二元条件。在基因组位置CFA8使用1个SNP (SNP 1)。在基因组位置CFA32，使用3个SNP (SNP 2、3和4)。在基因组位置CFAX使用1个SNP (SNP 5)。二元值指示狗具有指示对铜积累易感性的等位基因(“坏”基因)。例如000代表不具有3个坏等位基因中的任一个。111代表具有所有3个坏等位基因。
表4显示了用于表3中结果的SNP的位置和序列。
结果涉及3个与对铜积累易感性相关的基因组位置(在GOLGA5、UBL5和ATP7A基因内或周围)。这些区域其它指示对铜积累易感性的SNP在表5中给出。
Figure 880671DEST_PATH_IMAGE016
Figure 34572DEST_PATH_IMAGE017
Figure 917078DEST_PATH_IMAGE018
Figure 955047DEST_PATH_IMAGE019
Figure 897596DEST_PATH_IMAGE020
Figure 335530DEST_PATH_IMAGE021
Figure 693830DEST_PATH_IMAGE022
Figure 166400DEST_PATH_IMAGE023
Figure 14270DEST_PATH_IMAGE024
Figure 126452DEST_PATH_IMAGE025
Figure 350760DEST_PATH_IMAGE026
Figure 677836DEST_PATH_IMAGE027
Figure 899870DEST_PATH_IMAGE028
Figure 312396DEST_PATH_IMAGE029
Figure 74816DEST_PATH_IMAGE030
Figure 944814DEST_PATH_IMAGE031
Figure 400066DEST_PATH_IMAGE032
实施例3
鉴定其它与对肝铜积累易感性相关的SNP和保护性SNP
该实施例说明了对ATP7A基因中与对肝铜积累易感性相关的其它SNP以及还有一些保护性SNP的鉴定。此工作也描述于WO 2010/038032 A1和WO 2010/116137 A1中。
研究实施例2中标识的3个基因以进一步鉴定与对肝铜积累易感性相关的其它SNP。选择覆盖3个被标识基因内每一个外显子的33个扩增子。这些在来自拉布拉多寻回犬品种的狗的基因组的72份DNA样品中进行扩增。样品取自具有高铜(肝脏铜水平高于600mg/kg)或正常肝铜水平(低于400 mg/kg)的狗。扩增产物用Sanger法向两个方向测序。使用DNASTAR提供的软件“Seqman 4.0”组装每个扩增子中的序列。而后检查组装物以找到单碱基变异(SNP)。而后这些变异通过双向检查序列中SNP处的碱基强度进行基因分型。如果来自两个方向的SNP的基因型在超过10个样品中不一致，则该SNP被归类为假象并被忽略。被鉴定的易感性SNP在表6中给出。
在ATP7A编码区域中保护性SNP的发现
发现了保护性SNP (ATP7A Reg3_F_6; ChrX_63338063)。这提供于表7中并且SNP周围的序列提供于表8中。此SNP在ATP7A基因(X染色体连锁的基因)的编码区并导致编码序列的改变。进行了根据性别和ATP7A基因型的平均肝铜水平的研究(表9)。图1用图表说明了表9的数据。图2以铜-组织学得分的形式说明了相同的数据。通过秩和检验检测对以性别-基因型为分组的组织学得分而确定了p-值(0.000396)。数据明确地说明T等位基因的存在指示了狗受到免于高肝铜的保护。
结果可能解释了慢性肝炎对雌性的偏向。雄性狗仅具有一个拷贝的X染色体并因此在ATP7A基因座上为半合的。由于雄性X染色体的半合状态，在雄性中见到X染色体连锁的隐性基因效应的可能性大于在雌性中。此处的保护性作用是隐性的，因此我们在雌性群体中观察到更多的案例。
保护性SNP造成ATP7A的第328位氨基酸从苏氨酸变化至异亮氨酸，导致潜在的氢键数从3减少至0和疏水性的增加，潜在地改变了蛋白质的形状。在此位置的苏氨酸在许多哺乳动物中(包括马、人、黑猩猩和海豚)是保守的，指示此氨基酸在蛋白质功能中的重要性。
ATP7A中其它保护性但不编码的SNP的发现
对ATP7A基因测序揭示了几乎与编码SNP ATP7a_Reg3_F_6 (ChrX_63338063)处于完全连锁不平衡的内含子SNP。就像编码SNP，内含子SNP (ATP7a_Reg 16_F42)与免于肝铜积累的保护显著相关(表7)。二者的显著性使用在基因型和疾病状态的独立性上的具有2度自由度的卡方测量。疾病状态对于>600 mg/kg肝脏干重的铜定量和>=2.5的组织学得分为阳性；对于<400 mg/kg肝脏干重的铜定量和<2.5的组织学得分为阴性。预期的表基于假定基因型频率和疾病频率独立，样品中两个变量的贝叶斯估计。
非编码SNP和编码SNP之间连锁不平衡的计算度量值为：D' = 0.93并且R平方 =0.86。因此SNP几乎处于完全不平衡。
在ATP7a_Reg 16_F42周围的序列显示于表8中。
实施例4
ATP7A保护性SNP品种和地理多样性的研究
该实施例描述了对ATP7A保护性编码区域SNP的品种和地理多样性的研究。
在来自除拉布拉多寻回犬以外的其它品种的狗的DNA样品中对ATP7A编码区域SNP(ATP7A Reg3_F_6; ChrX_63338063)基因分型以确定该SNP是否存在于其它品种中。表10显示了结果，以及每种基因型的狗数目。“T”列指纯合子雌性(TT)和半合子雄性(T)。结果表明此SNP在多种狗品种中存在并因此可在多种不同品种、混种狗和杂种中用作免于铜积累的保护的指示物。在美国和日本拉布拉多犬种群中也发现了此SNP的T等位基因，证明狗的地理位置不妨碍此SNP的使用。
Figure 299889DEST_PATH_IMAGE033
Figure 803683DEST_PATH_IMAGE034
Figure 839772DEST_PATH_IMAGE035
Figure 465925DEST_PATH_IMAGE036
Figure 39995DEST_PATH_IMAGE037
Figure 144217DEST_PATH_IMAGE038
实施例5
ATP7B测序
该实施例描述了ATP7B (cDNA和gDNA)的测序和对与铜积累相关的突变的阐明。
ATP7B测序 - cDNA
扩增子的选择和引物序列
用Perl Primer开发引物并用NCBI引物Blast检查特异性。引物需要设计为对活性ATP7B而不是对ATP7B的假基因(位于基因组位置4:38596510- 38597615的1106 bp的片断)特异。引物(表11)通过开发与ATP7B的假基因错配的引物而得以保证。根据NCBI数据库，主要焦点的片断位于ATP7B的外显子2中。然而，Ensemble描述该片断既为外显子2(ENSCAFE00000046065)又为外显子3 (ENSCAFE00000046071)，且二者之间有33个碱基对的内含子。
Figure 300392DEST_PATH_IMAGE039
测序
聚合酶链式反应(PCR)使用Pfx聚合酶(Invitrogen, Carlsbad, USA)进行。测序结果使用SeqMan (DNAstar8.1)分析。将结果与NCBI (Build2.1)和Ensembl (CanFam 2.0，2005年５月，数据库版本62.2r)进行比较。检查拉布拉多谱系寻找孟德尔不一致。
结果
测序制备自肝脏RNA用于引物优化的比格犬cDNA揭示了一段有趣的片断并且由于ATP7B的同步gDNA测序，在我们的拉布拉多子集中只有这部分DNA最终得到了测序。测序结果揭示了2个有趣的编码非同义突变：1个SNP和1段重复。此外我们能够解决2个基因组浏览器NCBI和Ensembl之间差异中的一个。因为ATP7B的外显子1的序列还未得到阐明，外显子的编号以外显子2开始。
ATP7B编码重复(Chr22_3135287)
2个在线基因组数据库(NCBI和Ensembl)之间在预测ATP7B基因的外显子结构方面存在差异。根据NCBI，外显子2长度为1237个碱基对(bp)。然而，Ensembl描述这1237bp为2个外显子，即外显子2 (971bp)、内含子2-3 (33bp)和外显子3 (233bp)。我们的测序结果表明外显子2确实长1237个碱基对并且没有内含子序列。
另一个值得注意的发现为该33bp编码片断长度可变(图3)。Ensemble显示4个重复，而NCBI显示杂合性(3和4个重复)。我们测序的比格犬也为杂合的但是有2和3个重复。在我们的拉布拉多子集中我们发现了纯合的(3个重复)、杂合的(3和4个重复)和纯合的(4个重复)的狗。重复中第一个C的染色体位置为22:3135287。该重复位于ATP7B的第三和第四重金属相关结构域之间(图4)。真兽亚纲哺乳动物之间的多物种序列比对显示了该特定区域没有良好地保守。狗是唯一其中在该位置发现CGCCCC重复的物种。
来源于NCBI的重复周围序列显示于表12中。
Figure 97447DEST_PATH_IMAGE040
ATP7B 790G>A (Chr22_3135144)
我们在该重复上游大约144bp处发现了非同义突变(ATP7B 790 G>A)。该SNP位于染色体位置3135144上的外显子2中。其为G>A取代并且因此氨基酸丙氨酸由苏氨酸取代。该SNP位于第三个重金属相关结构域内。
ATP7B测序-基因组的
在可获得完整的表型数据的98只狗中用Beckmann Coulter进行ATP7B重测序(Sanger)。外显子和外显子-内含子界限也被测序。
测序结果用SeqMan (DNAstar8.1)分析。将结果与NCBI (Build2.1)和Ensembl(CanFam 2.0，2005年５月，数据库版本62.2r)进行比较。检查拉布拉多谱系寻找孟德尔不一致。
结果
在98只拉布拉多中ATP7B的全gDNA测序分析揭示了2个外显子非同义突变(包SNPATP7B 790 G>A; Chr22_3135144)和4个外显子同义突变。检测到9个内含子内单个碱基对取代。另外，在内含子区域检测到3个单个碱基对插入或缺失(indels)和1个7 bp的删除。还发现了6个碱基对的编码重复(上述)。进行了与表型关系的统计学分析。在这组98只拉布拉多中只有该重复和2个非同义SNP与表型有显著关联。在扩展的狗组中研究这3个突变并且寻找功能性影响的证据。
ATP7B 4145G>A
ATP7B 4145G>ASNP位于ATP7B的末端，在终止密码子上游大约154 bp (外显子21，染色体位置3167534)。它是非同义突变，其中G>A取代导致了氨基酸谷氨酰胺代替精氨酸(图5)。
在拉布拉多的扩展组中的分型突变和影响预测
在更大的拉布拉多寻回犬小组中进一步分析发现于ATP7B中的2个有趣SNP(SNP790G>A和SNP4145G>A)和1段重复。对于SNP790G>A，对267只拉布拉多和1只比格犬(对照)通过SNaPshot进行分型并且对于SNP4145G>A，对总共242只拉布拉多通过SNaPshot进行分型。对于重复，216只狗通过基因扫描(Genescan)分型。用于突变分型的方法更加详细说明如下。
基因扫描
进行基因扫描以使用3-引物方法将ATP7B中的DNA片断长度多态性分型。Pfx聚合酶用于扩增子的PCR扩增，因为Platinum Taq聚合酶不能够检测到短串GC-重复。如用于测序同样的引物还用于基因扫描，但在正向引物中加入了M13-尾。引物序列列于表13中。
Figure 643966DEST_PATH_IMAGE041
基因扫描结果用Applied Biosystems GeneMapper软件版本4.0分析。关注点在于微卫星的长度和长度的差异，以及个体在此基因座对该微卫星为纯合的还是杂合的。将峰值彼此进行比较并且与大小标准进行比较以确定峰的可靠度。
SNaPshot
为了在扩展组的拉布拉多寻回犬中准确的SNP分析进行SNaPshot。
对于790G>A，用于测序的引物(功能性ATP7B特异的)还用于SNaPshot方法的PCR反应。用于SNP 4145G>A的PCR引物用Perl Primer开发并用NCBI引物Blast检查。因为还引入了内含子序列，这些引物对于功能性ATP7B基因是特异的。此外，对于两个SNP，还设计了SNaPshot引物。引物序列在表14中给出。
Figure 817458DEST_PATH_IMAGE042
SNaPshot方法对于两个SNP是相同的，除了PCR步骤以外。SNP 4145G>A的模板使用标准Platinum Taq聚合酶生成。相比之下，SNP 790G>A的模板使用Pfx聚合酶生成，其能够更准确地扩增富含GC的段落。
结果用Applied Biosystems GeneMapper软件版本4.0分析。关注点在于不同的颜色，每种颜色代表另一个碱基，并且在于个体的杂合性或纯合性。将峰值彼此进行比较并且与大小标准进行比较以确定峰的可靠度。
多物种比对
为了检查在其它物种中突变区域的保守性，使用Ensemble多物种比对工具进行多物种比对。两个单个碱基在不同物种中都高度保守，而编码重复则不是。狗是唯一在该位置有重复的物种。
突变影响预测
用几种预测程序评估两种SNP对蛋白质功能可能预测的有害影响：
●Align-GVGD (http://agvgd.iarc.fr/index.php)。
将氨基酸生物物理性质和蛋白质多序列比对组合，以预测目的基因中错义取代落入从加倍有害到加倍中性的范围的何处的工具。
●PolyPhen (http://genetics.bwh.harvard.edu/pph/index.html)。
使用直接的物理的和比较的考量预测氨基酸取代对人蛋白质的结构和功能的可能的影响。
●PhD-SNP (http://gpcr.biocomp.unibo.it/cgi/predictors/PhD-SNP/PhD- SNP. cgi)。
该工具被用作人有害单个核苷酸多态性的预测器。
●SNAP (http://rostlab.org/services/snap/)。
这是评估单个氨基酸取代对蛋白质功能影响的方法。
由于预测程序主要基于人数据输入，不是所有程序都可以预测犬类氨基酸取代的影响。根据所用预测程序，怀疑ATP7B 790 G>A对蛋白质功能具有最有害的影响。
LD计算
对于ATP7B的编码突变和ATP7B第一部分内的672个SNP，使用程序Haploview计算LD的2个量度(D'及置信区间和R平方)。来自GWAS的前3个最相关SNP的结果描述于表15中。高D'和低R平方指示了所测量突变任意组合的等位基因频率的不同。区域(Chr22的前15Mb)中LD的结构描述于图6中。此区域的突变和几个SNP之间存在高LD，产生在GWAS分析中相关的大面积区域。
Figure 513625DEST_PATH_IMAGE043
编码突变与表型的统计学关联
ATP7B中的编码突变在扩展组的拉布拉多中被分型并且使用线性模型确定突变影响的强度和方向(贝塔系数)以及单个突变关联和与同一个模型中所有突变关联的显著性(p-值)。对于211只拉布拉多，ATP7B中所有3个突变和ATP7A中的突变被分型。在这组中，确定了每只狗风险等位基因的数目并且计算了基于RA染色的风险等位基因数量对肝铜的影响。
以年龄、性别和突变作为协变量对ATP7B编码突变进行以铜ra-得分作为结果变量的线性建模。计算单个等位基因影响以及为另外2个突变修正的每个突变的影响，并且结果总结于表16中。突变被以附加的形式建模，所以针对每一个额外拷贝的等位基因估计影响。
790 G/A (Chr22_3135144)被发现为保护性的，而每个额外拷贝的重复(Chr22_3135287)和在位置4145 (Chr22_3167534)的每个额外的A造成了显著更高的肝铜RA得分。
Figure 481581DEST_PATH_IMAGE044
为了研究所有已知促成疾病表型的编码突变的影响，在其中ATP7B的3个突变以及之前发现的ATP7A编码突变被成功分型的211只拉布拉多中进行线性建模。对每狗个体的风险等位基因的数目进行计数。风险等位基因是：对于ATP7A编码突变为C、对于ATP7B 790为G、G/A (Chr22_3135144)、对于在染色体位置22:3135287的ATP7B重复为3个重复和对于ATP7B 4145 G/A (Chr22_3167534)为A。结果变量为基于RA铜染色(0-5级)的肝铜水平并且风险等位基因的数目作为协变量被建模。每个额外的风险等位基因导致了RA染色得分显著升高了0.33和3.5 e-08的非常显著的p-值。图7显示了风险等位基因的数目对定量肝铜水平的影响。
实施例6
SNP基因分型和模型的产生
该实施例说明了SNP的基因分型和模型的产生。
通过对经CACH-表型分析的DNA样品进行SOLID测序(使用SOLID 3测序平台)鉴定SNP。此外，来自之前工作的SNP和ATP7A、COMMD1、ATOX1和ATP7B基因的测序包括在分析中。
对所有可获得的经过表型分析的DNA样品通过GeneSeek将SNP基因分型。用一套卡方检验分析SNP。使用2度自由度检验，和表型和基因型之间独立性的无效假设。所用的表型为：
●组织学得分>=2.5对比组织学得分<2.5
●定量铜>600对比定量铜< 400。
针对定量铜和组织学得分应用相关系数检验以及卡方检验。在MATLAB中使用corrcoef函数进行检验，产生p-值和相关系数。
而后按照p-值将基因座分级，以按照优选顺序进行进一步研究。研究显著性超出0.001的基因组区域寻找如在实施例1中标题为“区域基因分析”部分所述的潜在候选基因。
而后针对所选SNP检查基因型。由于corrcoef函数有时可在组成员数少的有序数据(如基因型)中提供假阳性，只针对那些具有表型差异的在至少两个组中含有10个或更多样品的组过滤SNP。其余SNP用于产生模型。
最终数据由对260个样品被基因分型的386个SNP组成。分析鉴定了许多与对肝铜积累的易感性或免于肝铜积累的保护显著相关的SNP。该分析显示于表17中。SNP的进一步信息，包括周围序列在表18中给出。
与SNP处于连锁不平衡的和因此也与对肝铜积累的易感性或免于肝铜积累的保护相关的SNP实例在表19和20中给出。
Figure 577713DEST_PATH_IMAGE045
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Figure 577755DEST_PATH_IMAGE069
Figure 518029DEST_PATH_IMAGE070
模型生成
表17至20中标识的突变可独自用于确定对肝铜积累的易感性或免于肝铜积累的保护。然而，评价对肝铜积累的易感性或免于肝铜积累的保护的更为准确的方法可以通过使用涉及突变组合的模型而实现。表17和18中的突变被用于模型生成，如下所述。
变量
选择的变量为在Geneseek基因分型中所鉴定的所有突变，而且雄性性别代码为0雌性为1。基因型被以有序的形式编码为0、1或2 (第二等位基因计数)。
使用了2个报告变量，log10-定量铜和组织学得分。这二者看起来都对遗传线性应答并且近似地对彼此应答，并且因此成为此类型线性建模的良好候选者。
方法
由于变量的数目和可获得的样品大小，并非所有遗传影响能够被建模在一起。为了解决这点使用了分步建模技术。该技术通过插入和清除因子同时观察模型中系数估计值的显著性，确定哪些因子应该被用于模型中。所使用的确切方法描述如下：
1. 将数据为平均斑块化(mean-patched)以允许缺失数据。
2. 使用MATLAB分步指令，对平均斑块化的数据进行分步回归。这使用了0.9的系数周边置信区间。
3. 而后将所选的变量和系数记录下来并且检查剩余误差(residuals)的合适方差分布。
4. 为了探究诊断的截断值，针对所有潜在截断值生成优势比、患病率修正的阳性预测值和患病率修正的阴性预测值以产生显示PPV和NPV之间在不同截断值时的权衡的图表。出于这些目的，阳性为在组织学标度上>2.5并且在定量铜标度上铜>600 mg/kg。
模型测定中所用的因子译码显示于表21中：
表21
因子 名称
X1 Chr32_38904515 (UBL5直接同源基因)
X2 Chr20_55461150 (STXB2)
X3 Chr19_6078084 (微粒体谷胱甘肽S-转移酶2 (GST))
X4 Chr3_86838677 (KRT18 (印度小儿肝硬化)
X5 Chr14_39437543 (白介素-6前体(IL-6))
X6 Chr8_4880518
X7 Chr8_4892743
X8 性别
X9 Chr24_4011833
X10 Chr10_65209946 (COMMD1)
X11 Chr22_3167534 (ATP7B)
X12 Chr22_3135144 (ATP7B)
X13 ChrX_63338063 (ATP7A)
X14 Chr18_60812198 (ATOX1)
X15 Chr15_62625024 (未知基因)
X16 Chr15_62625262 (未知基因)
X17 ChrX_120879711 (MTMR1)
结果
使用分步工具建模产生了图8和9中所示的预测函数。图8说明了组织学铜得分的分步建模。图9说明了定量铜得分对数的分步建模。
序列表
<110> Mars, Incorporated
<120> 用于狗中的肝铜积累的遗传检测
<130> N.114784A
<150> GB 1120989.7
<151> 2011-12-06
<160> 238
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 121
<212> DNA
<213> 家犬
<400> 1
ctcagaacta gataggctaa taagtgatag gccttgtgtt ttcctagagt gtgctttaaa 60
rgtttcttaa gctaaaaaat tacattcgtg agaaaattga aataaaagga aaacagtcat 120
g 121
<210> 2
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<212> DNA
<213> 家犬
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raatgatatt acatctcgta tggtgaatgt gacacagccg tcagttgcgt tagctctgct 120
t 121
<210> 3
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<212> DNA
<213> 家犬
<400> 3
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<212> DNA
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catctttgct tggggcctgg ggtttttatt gaggattgtg atctggtgta tgtgtctcct 60
yaggcatcca gaaaccattc agaacaagaa caagcgtcca ggtatcctct gtaagtcact 120
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acaaaccctc agacccagat acacagtatc atgtggacac agacatgtaa caccaaaatg 60
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ytgtagggta gttaggatgg acttaatgga gatgagtcct agggagccac actcagagtt 120
a 121
<210> 30
<211> 121
<212> DNA
<213> 家犬
<400> 30
taaacacccc caatcactac catcctcaca cctaaggata cacaatgtgt ctactttatg 60
rtatgtcttt actattcgtt gcttatgaaa ttttattcat tawctaaaac agggaaaaaa 120
g 121
<210> 31
<211> 121
<212> DNA
<213> 家犬
<400> 31
tatagytggs caattaaatc tcctattctt ttgtctcaaa ggatatttga aattacatag 60
ytcttttctc atataaaacc taccatacaa tcattagatg atccttctta gttaattttt 120
t 121
<210> 32
<211> 121
<212> DNA
<213> 家犬
<400> 32
gatgctgtgg gccagtccag aacccacctg agagaaacaa acaggcctct ttgccagcag 60
rgcagcgtca gtgtcacccc tgtgacatgt cagaacctcc ctgaaagttc atctaacctc 120
t 121
<210> 33
<211> 121
<212> DNA
<213> 家犬
<400> 33
ggctcagaag aaaaatcagc ccagttcaca tccaatgttt ccacacatct aatcgtcttg 60
rgttcagagg tagatgtggt atcacttaya tggacacata taacagctgg cccccacctc 120
t 121
<210> 34
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<212> DNA
<213> 家犬
<400> 34
gtttcagtta attatagtcc ttactggatc cgattgctgt ggcgctaaaa tgaaagaagg 60
yagggtacct gggtggctca ggggttgaga atctgctttt gactcaggtc atgatcccag 120
g 121
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<212> DNA
<213> 家犬
<400> 35
cagagtagca ttattttctg ctgtatgagg acacttttgt tatatccaca gtggacagaa 60
ractgggttt tagaacatgc tcaattgaaa caagactgag ggctcacaaa ttcctgctcc 120
a 121
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<212> DNA
<213> 家犬
<400> 36
ttacttattc atctgagacc aaggccactg tggtgaacct acaaagcctt acaaagcagg 60
rccagaaggg cacataaatc acttgactaa catttggtca aaatagctct tgggctcttt 120
t 121
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<212> DNA
<213> 家犬
<400> 37
ataaaaataa aagagctatt aataagaact cataaaatct acataaatat agtaacaggt 60
yaatattccc agcatatttt tacaaatcat ctataaagag catgagagca tatagggatt 120
a 121
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<212> DNA
<213> 家犬
<400> 38
gcaacaacct ggtttgtgtg tgggaagcta atgcctcccc aaatgcagca aactctcctc 60
ytgattttag aaaagcagtt tagttacagg caaatgcata catgcatgat aaatactact 120
c 121
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<212> DNA
<213> 家犬
<400> 39
gattttataa aacatgatga ccttggcatt tatatagtag atattactac tctgaaattc 60
saggaagtat gatcataaac tcacacttaa tctggtagaa gtatggacaa tgtatcaaag 120
g 121
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<212> DNA
<213> 家犬
<400> 40
cttggttgag ttaaaacatt tgcccatgca atttaatgca tgtccctgtg gggttggaac 60
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c 121
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<212> DNA
<213> 家犬
<400> 41
ccttccacac gctcaggttg gcacggaggg ggtgtccttg cctgaggggt cctggcacag 60
ycatcagggc acacagctga taacccaagg gagcagtagg caagacctca tgggcgccgg 120
g 121
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<212> DNA
<213> 家犬
<400> 42
attctctttg ctgtctcctg tatacagaga taaaagcaag agttttcccc ttcaggtttc 60
ygaaacccag cttcctttag attttaaggg gtattctgtg tacccatttc ccaccttctg 120
c 121
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<212> DNA
<213> 家犬
<400> 43
gcgggttggg accccccctt ctgctgctcc cacttcagag ttgtggcgtc actaagatga 60
sacctcatgt cgggaacctg agagtccctc gggagttgtg cagggactgt agccgaccta 120
t 121
<210> 44
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<212> DNA
<213> 家犬
<400> 44
acatatgcac agtgaatcgt ggattgttgt gtttgatttc ttacatgata caataaaagg 60
raagtagttg aagcaaaact ttagtttaaa ggaaacaatt tctctatcat aatgttcagt 120
g 121
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<212> DNA
<213> 家犬
<400> 45
cccacagacc ccaggtgctg accacagcag ccacttgggc ccccaatgca ggagacacct 60
ygggaatgaa ggggacaagg ccagctcagg cacatcgtca gtgcacctga tgggaaggcc 120
g 121
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<212> DNA
<213> 家犬
<400> 46
atctgatcct agccaatgga aagcaatttg agataggaat catatcttgt tttggtttat 60
rtgctttctt tggagttttg cacatcatag ataactgtaa atttgtagaa taaatgtttg 120
a 121
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<212> DNA
<213> 家犬
<400> 47
gtcaatgcca ttaacctggc gaagctgctc gagcatccac tgcgatctcc gcacgaacga 60
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c 121
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<212> DNA
<213> 家犬
<400> 48
actggttaat aagacttcac agattttatc catcatgttg attatctgta tatgtatttt 60
ytaccactta ggataaagtt ctgttatctg taattgattc caaccagcat gtttgctcca 120
a 121
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<212> DNA
<213> 家犬
<400> 49
cttcttcttt cccattggat tctttcatca atcgtaggta gttcttaatg aagatctgtg 60
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t 121
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<213> 家犬
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gggacacatt tctggacaga cctctgatca cactcacagg acagcaagag gaagctctgg 60
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a 121
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<213> 家犬
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gggcagatcc tcagtgagta ttggctcatg ttctccgagg gaagtagagt cccagaagaa 60
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a 121
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<213> 家犬
<400> 52
tcatctccat ttgtaataga aaccacatat atagagagat tggattatta accactaaaa 60
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t 121
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<213> 家犬
<400> 53
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a 121
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<213> 家犬
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a 121
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<213> 家犬
<400> 55
gattttattc tttactttga ttttttttaa gttttactat gatattcaat atgattgtgg 60
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t 121
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<213> 家犬
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gtggccggag ggggtgggcc ctactgtggc ccagcttcac gtcccactgg ccaaacatca 60
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g 121
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<212> DNA
<213> 家犬
<400> 57
gatgggagac ctcatacaca tgcaaagatc actattaaag actctcgagc aaagatcgaa 60
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c 121
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<212> DNA
<213> 家犬
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caacaaggtt tttaaggttc ttttcactac cttcttcttt ttgtacttgc ttaggacacc 60
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a 121
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<212> DNA
<213> 家犬
<400> 59
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a 121
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<213> 家犬
<400> 60
attccccatg tttgaggaaa tcacaggagc cactaggaaa tcaaccattt cccaaccaac 60
ytgatgattt cctgatccaa aggttctccc aggacaaata tgaggtagcc tttcacactc 120
t 121
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<213> 家犬
<400> 61
cagtcttgta ggagagtaga ttgactcaca gaactggcaa gattgggaat ctgagcattg 60
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t 121
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<212> DNA
<213> 家犬
<400> 62
gaatacattg ccagaataat ttcaagttct caaatctcaa ctaataagat tttcgttaaa 60
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c 121
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<212> DNA
<213> 家犬
<400> 63
aagttaagat attcaagaaa gagaagagag tgactgagct aaaaagaaaa tcagatctct 60
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t 121
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<213> 家犬
<400> 64
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a 121
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<212> DNA
<213> 家犬
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ttctatgaaa tagctaccat tctggttggt atcttctgtt gatttagatg atgaaggaag 60
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c 121
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<213> 家犬
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agaggagaaa acacagctaa aaactttttt acagactgga caaaggtgct tacacttttc 60
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g 121
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<213> 家犬
<400> 67
aggatgaata tttattaaca gtaaatatac atttttattg ttctatatac tctaaagaca 60
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g 121
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<213> 家犬
<400> 68
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<212> DNA
<213> 家犬
<400> 69
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c 121
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<212> DNA
<213> 家犬
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tattaccctg ctctccagcc actcctttac cttccattag cccacacctg ctctacacac 60
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a 121
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<212> DNA
<213> 家犬
<400> 71
tctcagatac ttgatagcca gcatttcccc ccattttctt ccaagagcac gaaagcatag 60
raatgatatt acatctcgta tggtgaatgt gacacagccg tcagttgcgt tagctctgct 120
t 121
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<211> 121
<212> DNA
<213> 家犬
<400> 72
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stgcattaac ttttccccaa aacagaaagc aacagagact tctgtaggtc agtcaacagt 120
g 121
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<211> 121
<212> DNA
<213> 家犬
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ttaccattac tataacccaa gttatagtat actataacca agtccttaat tgacttgatg 60
yttgtgcagc tgattttaaa tctatttaga ataatagttt acttgtgaca attcatatta 120
a 121
<210> 74
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<212> DNA
<213> 家犬
<400> 74
ttggtcgact gactgattgg ttttactgtg gaggaaagaa aagggaattt tcccaaagag 60
racagagaga aaacatggaa ttgagcaaag ggagaataga gagacagggc agccactgaa 120
g 121
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<212> DNA
<213> 家犬
<400> 75
tgccttatcc tccagctcct ccctcaccat cttggaaact agctcaaatg tcactggtac 60
ktgtctttct tttgatcttt ctgaaagaca aacatgatcc catcacctct gcctttagaa 120
c 121
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<213> 家犬
<400> 76
actcctaagt aaaagttaaa ttaacagatt tgccatcaag taccttgccc atttttccta 60
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a 121
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<212> DNA
<213> 家犬
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ctggtgggct tgtcaggggc aggatgttgt gtggtgagca cagaattaaa actaggagct 60
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g 121
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<212> DNA
<213> 家犬
<400> 78
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a 121
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<212> DNA
<213> 家犬
<400> 79
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a 121
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<212> DNA
<213> 家犬
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aatcaaacaa gtgctagaac atagaacaag tggctcatct tttccccaaa tgtctggata 60
rgaaaaaaaa aatctaaaca aatgctagat gttaagtatc tgaaatgatc agcccatgaa 120
a 121
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<212> DNA
<213> 家犬
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t 121
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<212> DNA
<213> 家犬
<400> 82
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t 121
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<212> DNA
<213> 家犬
<400> 83
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t 121
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<213> 家犬
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t 121
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<213> 家犬
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<213> 家犬
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<213> 家犬
<400> 89
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<213> 家犬
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g 121
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<213> 家犬
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<213> 家犬
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g 121
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<213> 家犬
<400> 93
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t 121
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<400> 94
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<213> 家犬
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<211> 121
<212> DNA
<213> 家犬
<400> 98
gctttgaaaa ccaacaggaa atacatccag gaaagctata caactgtggt gaaaggaaag 60
raaaatctgc tcttaaaagg ttgtgtgcag actcacttgc cccagaaacc agtgcgaaaa 120
c 121
<210> 99
<211> 121
<212> DNA
<213> 家犬
<400> 99
gagatgtgta aaatttaata gaaatgaaac ttgccaaaac agacctctgt actcgtcagc 60
rttctaagtc catctttctg tagcatgtaa gtagaataat gttctattaa tttcctctat 120
g 121
<210> 100
<211> 121
<212> DNA
<213> 家犬
<400> 100
gttctttcta ttctatcaca cataccaccc ccctgcccac agtacccctt tctgccatgt 60
ytcagactcc tacacaagag gttctctctc ctggcttcca gttagacagg caggtaaagc 120
t 121
<210> 101
<211> 121
<212> DNA
<213> 家犬
<400> 101
taaaaaaata caacagtagc attagaagac atgctaagcg gctgtattag agaaggttag 60
ygctggcctg aagtttagaa accttccctt ctcttttttt ttttccttcc cttctcttta 120
a 121
<210> 102
<211> 121
<212> DNA
<213> 家犬
<400> 102
tcaagagtac tagagcatct ataatcaatg gtaaattggg gaactagtga aacaagttta 60
yaggacaaat aacataaata aggatttttt tttaaatttg gaaaattgtg gaataatgat 120
a 121
<210> 103
<211> 121
<212> DNA
<213> 家犬
<400> 103
agaattcaat tttggggagc caggaaacca gattagtttt ccaaagggaa gtgccatttg 60
yatctatccc ggtggggctg ccaagaattc cctggggtgg gagacggcgc ttctgtggat 120
t 121
<210> 104
<211> 121
<212> DNA
<213> 家犬
<400> 104
caccagagag ccccgcaaga tcatactgca caagggctcc actggcctgg gcttcaacat 60
ygtaggagga gaggatggag aaggcatttt tgtttccttc atcctggcag gaggcccagc 120
t 121
<210> 105
<211> 121
<212> DNA
<213> 家犬
<400> 105
tggtgatgat ttatccccca tgttcaagat ttatcctccc tgtctcaaga aatcatgtca 60
ytacaggcat ccttaaagtc acaagactgg gaagtaaata ctgatgaggt ccaagacctg 120
g 121
<210> 106
<211> 121
<212> DNA
<213> 家犬
<400> 106
agcatagtgt acccacatat aaggtcacat ctgaggccag ggagtcgggg tcttgaagat 60
katgactgat catgtgcttg aggatgatga tgatcatgtg cttttcctgg ctgtgcagtt 120
g 121
<210> 107
<211> 121
<212> DNA
<213> 家犬
<400> 107
gtgtgtgtgt gtgtgtgtgt gtgtttaatt ctttgtgaga agcccctcat tttgacctaa 60
rtttggtaga ggccccaggg gatctgagag gagaacaaaa ggataaacca tttgctgttc 120
a 121
<210> 108
<211> 121
<212> DNA
<213> 家犬
<400> 108
ccaactttca ctagcatcac agcccctatc aatctctgtt cttttttctg tcagtaccat 60
rtttgctcct actacatcya atctgtgagc tcacaggatg aggaccaaca gctgccctga 120
g 121
<210> 109
<211> 121
<212> DNA
<213> 家犬
<400> 109
tgtcttacct ctctctattc ccttgtccat agtagtatta aatatatctt cctgaacaca 60
ratctgatcc agtctctttt tgtaattaaa agcctttgct agctttggtg atcacctcca 120
g 121
<210> 110
<211> 121
<212> DNA
<213> 家犬
<400> 110
gacctgacag attatgtaga ctttgttttc aaagggagca cctgctggat atacaacatg 60
rcactaaatt gtgctccaca tccttggcag aggtgggggg cggggcacaa aggaagaaac 120
c 121
<210> 111
<211> 121
<212> DNA
<213> 家犬
<400> 111
cagaggaaaa ggagaaggtc ccacttaggg gactggagag gagtggggga acatcaccag 60
mgccttcctg agccaggccc cctgtgggga gaagctctcc ccaggactgg gtgcctttga 120
a 121
<210> 112
<211> 121
<212> DNA
<213> 家犬
<400> 112
tcctccctct ccccatcccc attctcatgc aagtgtgctc tctctctaaa acaccccccc 60
mcacacacac acacagacac aaccaaattt gggtctcaat gtcttgacca aggaaaaggc 120
a 121
<210> 113
<211> 121
<212> DNA
<213> 家犬
<400> 113
gagaagaagg aggagaaaga ggaaaagtat atttgatgga atgaaaaaca agagttcaat 60
ytcactctgg tctggggtga ccactattag tccttcaaca tcttccttga aggaatttta 120
a 121
<210> 114
<211> 121
<212> DNA
<213> 家犬
<400> 114
ctggaattct gtcagatcaa cattcagagc tccatcaaat ctgagggaag cagtgataga 60
rgatacaatt tgacctttca gtctattcag gttcatgtag gttaggcatt caatatcaaa 120
g 121
<210> 115
<211> 121
<212> DNA
<213> 家犬
<400> 115
ccacatgtgg ttacaccact gtgttatcct tccacctgtc ccatcaaccc acccgcacat 60
rtcacagtgc ctctgtcctc aaagaacact gtatccaaca cctccacatc ctctcagcat 120
g 121
<210> 116
<211> 121
<212> DNA
<213> 家犬
<400> 116
attcctatgg tgggcgctgc acatttcctc ccaggggaag ggcaagggtc ctgcatttct 60
rtgctttcca gggcctccgc accaagagca attgctaggt cacgcatgcc cctgcacttc 120
c 121
<210> 117
<211> 121
<212> DNA
<213> 家犬
<400> 117
catgtcatca ctaactaatt tattaacaag agttttattc tttgaaaaac aaaatcactc 60
rcattactca gttgcttatt ccttgattca tatacaaatg actgataaca tgagataaaa 120
a 121
<210> 118
<211> 121
<212> DNA
<213> 家犬
<400> 118
gatgatttag ttgtttgaat gatctggcat ataaatcttc caaatctgtg tccattggat 60
ygcttacagt ttaatctttt tatttcttcc cagaatcaca ttttttcatt atttatcttt 120
g 121
<210> 119
<211> 121
<212> DNA
<213> 家犬
<400> 119
agttaaattc tgtgaataac tagaatccgt tatacttttt ctgaaatgaa gtctgtaggc 60
wtttcaacag caaaaggaat tctgwtttty aaaactatac ataatgcttc ttaaaagccc 120
t 121
<210> 120
<211> 121
<212> DNA
<213> 家犬
<400> 120
aatgccaact ttaaaaacgc attcaaggtt ttcctctgta aatgcattcc tcattttgga 60
ygtgatgtaa aatcttattc agtgttttgt ttttttttcc ccccacaggt ctcaacaatt 120
a 121
<210> 121
<211> 121
<212> DNA
<213> 家犬
<400> 121
ggtgggaccg gccatcagca ggcgggccag cgccccacag atgttgtcac ggacccgatc 60
rtggcgctcc cgtgccagga ggggcaacag aagccccagc agcttgggga agtatctggt 120
t 121
<210> 122
<211> 121
<212> DNA
<213> 家犬
<400> 122
aggggacttg tgctaatcac tgggcaaatt ttatgaactt ctgaatttta aagcaaaaga 60
raaggtgaaa gaatggaaag aaggtgtgag tgtttgagga aaacttcttc tttggggttg 120
a 121
<210> 123
<211> 121
<212> DNA
<213> 家犬
<400> 123
tacacaagca aggcagtatg ccctgtctcc ttcccttggg ccacctgcac ttagacatgg 60
yaggttccag tgatgtgtct agtctctagc aagcagggct tgcttctgct ctatccatcc 120
a 121
<210> 124
<211> 121
<212> DNA
<213> 家犬
<400> 124
ctgtccttgg tctggacctg ctgtgaagac caagtgcttc ctgagatctc tctgagtcta 60
rtttccagag cagtgagtga gaaatgaaat gagccgagga ttgccctccc tcctatggac 120
t 121
<210> 125
<211> 121
<212> DNA
<213> 家犬
<400> 125
taagccatca gcatgggctc ctaggggtct gttcaactcc cttgtggtgt cttactgctc 60
ragcaaagga acagtctggt acagtgggag caagagctga ggttggagag tggggacaca 120
g 121
<210> 126
<211> 121
<212> DNA
<213> 家犬
<400> 126
gaggaggtgg aagtgattaa gtttaaaatt tctggggtgg tttctggcga catgaagctg 60
mgagctagaa tgcctttcaa tctcataatt tctttaattt ggtgattata ccagagccac 120
a 121
<210> 127
<211> 121
<212> DNA
<213> 家犬
<400> 127
cctgacaaac actacctctg ctcttcaaaa gcaataagca tttattctgt gacacattta 60
ratacaaagt caattacaat agagtataag tacaatacta gggaaagtac aaagtcatay 120
g 121
<210> 128
<211> 121
<212> DNA
<213> 家犬
<400> 128
gcatgatgaa atcagaaaaa gtatgtaagt ttctagaaga agctagatat atggtaactt 60
wggtcaaata gaaccatgta gtgaaaagaa tatgagtttt caagttcaat aaaaaacaaa 120
a 121
<210> 129
<211> 121
<212> DNA
<213> 家犬
<400> 129
atgcataagt ttccaaaaga gttcaggatt ccaaaataaa agcttcacta aaagattcat 60
mgcaaaagag taatgaacaa ttaaagtcat aggatatcta aaatgaaaaa ctgttagact 120
g 121
<210> 130
<211> 121
<212> DNA
<213> 家犬
<400> 130
agatggctta gttgtttctc tttcctcctg aagtccacag cttagttact tggactctcc 60
raaataggat cgttggacat ttgaggaaag ctctagcatg aaagccatag actaaaaaac 120
a 121
<210> 131
<211> 283
<212> DNA
<213> 家犬
<400> 131
ctctcatttt gtgtattgat ttgaggactc tgtccttttt gttctcttag gtgttttgta 60
accatttttg tggttcttgc cacaaaaggc cttatgaagt cctgcatatg agtgatgtgc 120
aggacaactt tgactttctg acagccagtt tttgtgtttt gttmccttag ttcccaagtt 180
cctatcttgt ttacctcatg atcacatttt aatatcaatg aaatttgtag gaaaacagca 240
gaaggaaaga tataaggtta ctattctcta tggaccttgg ttg 283
<210> 132
<211> 223
<212> DNA
<213> 家犬
<400> 132
ttgcagatta tatgataaat atagttgtag cttcaaaaat gactataacg aacagaaaaa 60
aattaactta tcaaaaactt ttcaaatttc cccatayact taactaggta ggccacagag 120
tatgatagta tgcaagttat taaaatctgt tagcaaggca taacacatat atttctactt 180
aatgaggttt ctataatcaa ggcttgtcaa gtccattatg ttc 223
<210> 133
<211> 157
<212> DNA
<213> 家犬
<400> 133
tcagactgaa tctaaagcca catatatttc ctcagcagct gataacatta gaaatcagaa 60
agccactaty ttagctggca ccgcaaatgt aaaagtaggc tctaggacgc cagtggaggc 120
ttcccatcct attgaaaatg catctgttcc taggcca 157
<210> 134
<211> 179
<212> DNA
<213> 家犬
<400> 134
tcttgtgctt gttctttatc accattcatt cagtacatcc aaattttgaa atccttagag 60
ctctatagcc tctatgtagg agaatgarat ttcatcaaaa ggaaatattt tgagaattta 120
agtgattttt ttatgatatt ttagctatag cagtcacctt gagccaaaag acattctac 179
<210> 135
<211> 191
<212> DNA
<213> 家犬
<400> 135
aaaaatatac tctctttctt acagaaacct ctaataattc agattctggc catgaagttc 60
aggaggattc ttcaaaggaa aatgtatcat caagtgctgc ctcyactgac cacaacccaa 120
cacctactca tgatggcaaa tcmcmtraac tgtytawtyt csgattggrr awtmaaykgt 180
traggaatga a 191
<210> 136
<211> 244
<212> DNA
<213> 家犬
<400> 136
tttgcccaag aaaaatgaag acctatgacc atggaaagac ttgatacata atgctggagt 60
actagtagtc agacccaccc aagtcttttc acgtgttcat tcagtataga tgcggcacac 120
gttggctgag tccctccgkt gtgtcaggaa ctgttttagg tattggggat gaagtaggga 180
acactgattt agsttctgtt tattcatgtc tcactttgta ggaattycmh tamatagaar 240
aada 244
<210> 137
<211> 251
<212> DNA
<213> 家犬
<400> 137
tctcagtact cacaggtact tacaaataca acactaagag gtttcacaaa acagtactct 60
tacatagcac atgctgtact ctctgttcca ttctatttta ttactatttt aaaatatgga 120
ttgtgatytg ccaakttgat tctctggccc attaatagtt tgaaaatctc ttctgtagga 180
gtataggaat taccacagag ttttgagaaa ttgatgaatg ccacgcttta cctgtgggaa 240
cgtagattct a 251
<210> 138
<211> 191
<212> DNA
<213> 家犬
<400> 138
cagatgatga gtctggagct ggtgatctgg gctggagata atgaacctgg gagtcatcag 60
ctttggagaa agggtgtctg gcctcactct tgctwgcaca gaaagaaagt gctcattagt 120
gtcaactctc agcaacactt ggtatttgta aactttaatt tttgctgact tcatggagaa 180
ataatgtttt t 191
<210> 139
<211> 206
<212> DNA
<213> 家犬
<400> 139
taatgataca gaaatgaatt tggcaggaat gtatggaaaa gtccgaaaag ctgctagttc 60
aattgaccag tttaggtaag caagtgcagt actggtgagg aatggkgcat cggctccttc 120
tgtgctattt tccggtggct ccagtcacag ccccatcaag cagagctgat acctaaagtg 180
acatttaccc tacttcctct ctcaat 206
<210> 140
<211> 186
<212> DNA
<213> 家犬
<400> 140
catcacttaa aatcatctca gcaagtgttg ttgaagatga ttttttataa agtatattcc 60
aatcttattc tatacttcag aagcttggaa ttctyatttg ctttgctgga ttgaaaaagt 120
ctggaagtaa ttagaatgac ttctcatact cccaccttga attctcctaa tatcaaaggc 180
tgggag 186
<210> 141
<211> 171
<212> DNA
<213> 家犬
<220>
<221> misc_feature
<222> (169)..(169)
<223> n是a, c, g, 或t
<400> 141
atatggagaa atgagctctt atacactttc agtggacatg taaactgtta ttgtcttttt 60
ggagagcatt tggcaggatc tatcaaagtr cacacatcat ttgattgagc aattccactt 120
ccagccatat tctggacata atttacaagt ataaaaagat gcatgtttng a 171
<210> 142
<211> 213
<212> DNA
<213> 家犬
<400> 142
aaatattgaa agtgctttat ctacactcca atatgtaagc agcatagtag tttctttaga 60
gaatagatct gccatagtaa agtacaatgc aagcttagtc aytccagaaa ccctgagaaa 120
agcaatagag gccatatcac caggacaata cagagttagt attgctagtg aagttgagag 180
tacctcaaac tctccctcca gctcacctct tca 213
<210> 143
<211> 125
<212> DNA
<213> 家犬
<400> 143
ttaaaataac tacttgcagt gatttctttc ccccagtata aaatgtcagt tttgtctcaa 60
tccacccyct tcaccttaaa aagaaaaaga aagtattagt tttcagtgtc atttgcctta 120
aaatg 125
<210> 144
<211> 201
<212> DNA
<213> 家犬
<400> 144
gagaggtacg aggcccaggc gcagggccgc atgaagcccc tgacggcgtc ccaggtcagc 60
gtgcacattg gcatggatga ccggcggtgg gactccccgc rggccacgcc ctgggaccag 120
gtcagccgtg tcagccaggt gtctctgtcc tccctgaagt ccgacaagct gtcccgacac 180
agcgccgcgg ccgacgacgg c 201
<210> 145
<211> 201
<212> DNA
<213> 家犬
<400> 145
ggtctgcatt tggaacacct gcccagtggt tgttaaattt aacccctgct aagagaatga 60
gaggacagca cccctggaga gacagaatcc aggtgcttgc rgttctccat acgtgcactg 120
cagcaggatc cccagagttc aagcaccaag ttctgcaggg agattgcagg tcgcagcaga 180
ggtgctgttg tgctcgttct g 201
<210> 146
<211> 201
<212> DNA
<213> 家犬
<220>
<221> misc_feature
<222> (8)..(8)
<223> n是a, c, g, 或t
<220>
<221> misc_feature
<222> (65)..(65)
<223> n是a, c, g, 或t
<220>
<221> misc_feature
<222> (148)..(148)
<223> n是a, c, g, 或t
<220>
<221> misc_feature
<222> (152)..(152)
<223> n是a, c, g, 或t
<220>
<221> misc_feature
<222> (181)..(181)
<223> n是a, c, g, 或t
<400> 146
cggggctnga tctcacgacc ctgacatagt gacctgagcc aaaaccaaga gttggacgct 60
caatngactg agcctcccgg gagccccaaa gtcaagagac rctacagatg cgttgggcac 120
aatgacaggg gaggaagctg aggtctgntg gnggaggttc tgcacctccc agcaggaccc 180
ngcacacagc aggtgcctgc t 201
<210> 147
<211> 201
<212> DNA
<213> 家犬
<400> 147
ggggagtccg gcatggcccc ctgtcagccc tgtcccctca gggtgtcttg gccgggttgc 60
tccctgacaa gctctccctc ctctctcttc aggttcagcc ygaatctgac accatgcccc 120
tagggaagag cagcgagctt tggaagcagg gagaagacct ataggaggcc gagggcctgg 180
ggatgcccag ctgtctgggg c 201
<210> 148
<211> 201
<212> DNA
<213> 家犬
<400> 148
ccttcagaga gaacccagga caattactaa actaccgtgc cctggaagat gttttgtgac 60
tcctcactcc ctctgccttg cttattggcc attatttttt katccctctc tcttctacca 120
ttattaatca aacacaacaa acaaaacact tctaacaagg atattaggtt tgtatacatt 180
ttttttaaaa acagcaactt a 201
<210> 149
<211> 201
<212> DNA
<213> 家犬
<400> 149
acttcctgat tgctactgtc tggacactag gttttgcgat ttgttctccc cttccagtgt 60
ttcacagtct ggtggaactt caggaaacat ttgactccgc rttgctgagc agcaggtatt 120
tatgtgttga gtcgtggcca tctgattcgt acagaatcgc ttttactatc tctttattgc 180
tagtccagta tattcttccc t 201
<210> 150
<211> 201
<212> DNA
<213> 家犬
<400> 150
cagggaacat tttcaaagat gtagaaaatc ccaagacatg ttaacatagg gaatgcatgt 60
aaagatgcaa tcaaaagcct ttgaaatgac aaccacttat rtaagaccta gcaatgtgca 120
cttccaaaca ttaactaaaa gttctatctc ccccctctgg gttccttaaa cattacacct 180
ctctgcctat caaagcacct a 201
<210> 151
<211> 201
<212> DNA
<213> 家犬
<400> 151
ttcctcatag gaaatttggc cttctctgat attttggttg tgctgttttg ctcacctttt 60
acactgacct ctgtcctgct ggatcagtgg atgtttggca ragtcatgtg tcacattatg 120
ccttttcttc aatgtgtgtc agttctggtt tcaactttaa ttctaatatc aattgccatt 180
gtcaggtatc atatgatcaa g 201
<210> 152
<211> 201
<212> DNA
<213> 家犬
<400> 152
atccagaaga agtctgctag gggtaactat cttttcgctc tctgtttatg ccaacatttc 60
acaaaagctt gtctcccgtg acttaaatag atacacccag mgtgtatgtt ggggattttt 120
gcaagtatcc ttaggaggcc ctacgtcgta aggcacagtc ataagacctc gcgtccctat 180
tccctcatct gtaaaatggt g 201
<210> 153
<211> 201
<212> DNA
<213> 家犬
<400> 153
caaggtctgt ggatgtgctt actccgtcct caccacaaac accgatgtct cggacacact 60
cagtgagccc aggttaggaa gccaggattg cagggccaag rgtataagga ggtgtcctgg 120
gagcctcaaa agaaaaatac aaaagtatga agactcagaa taaattctta caaatcttgc 180
tgtgtcttcc cacagatggc a 201
<210> 154
<211> 201
<212> DNA
<213> 家犬
<400> 154
gaaaggccgt ttcctacctc ggccccaagt agtgagggcc tggaccctga gcccatgatg 60
gaccaaaggg agcaggtggg tgaggcccca gcccttggac rgaatatttc attagctaat 120
gcaaatcatg agttcaggga atcctcacag ccccctgaga atacgcagag cactgtgtta 180
tgtctcccag ggtccctttt a 201
<210> 155
<211> 201
<212> DNA
<213> 家犬
<220>
<221> misc_feature
<222> (56)..(56)
<223> n是a, c, g, 或t
<220>
<221> misc_feature
<222> (100)..(100)
<223> n是a, c, g, 或t
<220>
<221> misc_feature
<222> (130)..(130)
<223> n是a, c, g, 或t
<400> 155
aaagtatcag cacactgatg cagccagcct agctgaagat ggagttgttg aagcanaggt 60
gttcatgatc cctccccagt gacctgcgat tttttttttn waatcttatt cgcccatttt 120
attaaatccn caaattcaaa tctgtttgtc tcacttgctg agatttcttt tgtctttctc 180
tttcattcat tcttacagtt g 201
<210> 156
<211> 201
<212> DNA
<213> 家犬
<220>
<221> misc_feature
<222> (101)..(101)
<223> n是胞嘧啶或不存在核苷酸
<400> 156
aagaaaaaga aaaacccagc catcaagggt gtgcatgtct gtgaaagctc cagacaggat 60
gatcgaggtt gtttgcaacg acagtctaga gaagaaggtg ngcgttaagt gcaacactga 120
tgacaccatc ggggacctta agaagctgat tgcagcccag actggcacct gttggaacaa 180
gaccatcctg aagaagtggt a 201
<210> 157
<211> 201
<212> DNA
<213> 家犬
<400> 157
gcctagcatt attcctgaca tgtgttaggt cctcaacaaa tagtagctaa tatactttct 60
ggatttcttt ctttttggct aagtagaaga gctggtgctg ycatccttat agtctgtata 120
gtaggatttc ttttctttcc ttttcttttt taaagatttt acttatttac tcatgagaga 180
cacagactga gagagagagg c 201
<210> 158
<211> 201
<212> DNA
<213> 家犬
<400> 158
agagagagga gaagcaggct ctatgcagga agcccgatgt gggactcgat cccaggtctc 60
caggatcatg ccctgagcca aaggcaagac gctcaaccac wtagccaccc aggcgtccct 120
tttaccttag tttttgtcct aaagcttcat ataaatggaa tcatgtagta tgtatgtgtg 180
tacactctct tttctgactt c 201
<210> 159
<211> 237
<212> DNA
<213> 家犬
<400> 159
tgcctctcca ctactcactc ttctcttgaa agattatttc ctgcttaaac tggcccgtga 60
cttcctgctg ccagaaccat ggaatggcct cctgagggag gctccctatg ctgctcccat 120
yagcagatat tgcagcgtca cagtataact cagtggcttg aaatgatggc tatttatcat 180
tgctcagtaa tttgagtggc tcgaagagga tagaatttca tttctttctc agataat 237
<210> 160
<211> 237
<212> DNA
<213> 家犬
<400> 160
tgtacagctg actccctgag aaaggacatc ctgggtcacc tttcaagtat ttcctggcat 60
ggaaacccca tatcttcaaa cacaaaaatc agaaaatcac agtccttatc tgtttgggcc 120
yatttatagg agagtctttt tattgcctgg aattgtatat ttttacattt cttagatttc 180
tacaaaataa tatttgtgcc ttctttcaag tataatatta tttattaaag ttgcttt 237
<210> 161
<211> 237
<212> DNA
<213> 家犬
<400> 161
attaatacat tcttagtgtc ttctttaaaa atgcaacttc catgctttat aaaataccaa 60
caaatgcttt acatctttat gatggtaatt ttggatcaat actggaggat tttaaaaaaa 120
yctctgcttc ccctgcttgt gtggtctctc acgcgctctc attctcactc tgtcaaataa 180
ataaacaaaa tctttccaaa aagacaaagt ccttgtgaaa actgagaagg cctgtga 237
<210> 162
<211> 237
<212> DNA
<213> 家犬
<400> 162
atttgtactt tcttttcact tctcctgcgt ggtgcgtatc tctccagtct gtgttcttta 60
ggcatacatt gctgtatgtg ctttaaatag aatcctacct tatatactgc ttaataacct 120
rtgaccataa gatcaggttc catgtcttca aagattctcc tcatcatttt cacgggtata 180
ggcatagatt acaattgatc cattccccac tttgcacatt tagattgttt tcacttt 237
<210> 163
<211> 237
<212> DNA
<213> 家犬
<400> 163
tgcaatgact ctgtttacaa ataaggtcac aatctcaggt accagagctt agggcttcaa 60
cctgtcttgg gggagggtgg gcaggatacc attcagtcca taacagcaga agatcccggt 120
ygtcctcaca gtatggtggg cagtggccag ccctccggac tttcacctcc agggggcagg 180
cggagaagct aaaggggggt ctcatggcct cccagctcct ccctttgccc ctgcaat 237
<210> 164
<211> 237
<212> DNA
<213> 家犬
<400> 164
acccacgccc agcatctaag aggccaaccc ctccctgctg tgggctcctg ggcttctcaa 60
cccccaagga ggggactgca gtccagcgtg ccgacagctg cctccacccc aaagggggcc 120
ratggctggt gagtggagac tgagtgcatg accgactttt ttagccaaga ctttttctta 180
attgttagag atggcaaact caagcaaatg ggaaactcat ccgctcaagt aaccagc 237
<210> 165
<211> 237
<212> DNA
<213> 家犬
<400> 165
gcctcgtggg acagctttct agcactttcc cctttttaag agattgactg caatttctat 60
aataacatca cattagctag aaattaatgt cctcattaag acagcaatta ggcacattag 120
ygcggcaata aaagagaagc ttatgaaata attgctggtt ccgaaatgcc tttaatttag 180
tgttttatat tgcgccatgt tattaatttt ttccctcggc agaagataat aagagaa 237
<210> 166
<211> 237
<212> DNA
<213> 家犬
<400> 166
cataaatgcc ccccccacct ctgtgtctgt gcagaaacca aaagtcttgg gcttctatga 60
tccccagtga gtgctaggag caggaccgca atcacagcag cacatcctag aaaggactta 120
rgagccagat actaccatcc tattcactca ggtaatcctc acagtaaacc gcaatggcat 180
aaaaaatatt acctccaggg cccaacggac ggactcttga tctcagggtt gtgagtt 237
<210> 167
<211> 237
<212> DNA
<213> 家犬
<400> 167
atgagatatg tctgctcagc cactgtctgg ggccttgtaa ttgaagcctt ataattagca 60
tgaagtcacc agcttggtcc tgctgaaagg gcacagggtg gggtgtgaaa ggaggatggc 120
yaagggctcg tccacaggaa acattttcta aacactagag aggaggcagc caaagagctc 180
ccttcctcat cgcccatgga ccccactgct atgctggcaa ttcccctttt ggttaat 237
<210> 168
<211> 237
<212> DNA
<213> 家犬
<400> 168
ttcctgtgca gagggacacg tgaaggccct aggtcctcct gggagaaaag atttccctcc 60
taatgatcca gggactagga tttcattctg aaatggaatg gagaatggca ggtgtggctt 120
kctggggatt gagaaccaca ggccccagga gattcaggaa aggacagtaa tgccctgctg 180
ctcaggcccc ggtggaggaa tcatatcctc agctcagcaa caccacccgc cccccta 237
<210> 169
<211> 237
<212> DNA
<213> 家犬
<400> 169
acatcggcta aacaaaaaca ggagaatccc attataagac ggttcctgta gtacagatgt 60
gtctgggtga agcctgggtt gtatcgtggc cccatgtaga gccagcctgg gcagagagct 120
rgtctaccca ctaagcaact gcaagaggca aagtgcagca ttgatgtcac gaggtccagc 180
atcaactagg accatcccca tccatgtgag caggctcaca cgtggaatcg cagtgga 237
<210> 170
<211> 237
<212> DNA
<213> 家犬
<400> 170
ccgtgcttca caggcgagaa tctgaatgac cgtgatgcca ccacatgtca ccatcccctt 60
ttccactggg aaaggggtcc ttgttgcctt ccagctccag aattgcatcc tcacaatttc 120
rgaggccctt cctcctgcta agctctgtgc ttttccagaa agtagagcat aagacaaggg 180
cttatatgca agtatatttt ttggaaaata tgatcccaga gagcaggagt gagaact 237
<210> 171
<211> 237
<212> DNA
<213> 家犬
<400> 171
actccatgaa atggtttatt ttatcctatg aatcgatgtg gagaacaaag gcaaaagaaa 60
tatagaaaaa tattaaattt ccttacaatg tacagcccat tgataatatt ttagacagtg 120
wgagtgatct tgcttatgga gctcaactgc ctcaatgtta atccttagct aaaggcaaaa 180
gacaatctta gtttgacatt agcctgaccg ccttatgcta tccctaaccc ccgtccc 237
<210> 172
<211> 237
<212> DNA
<213> 家犬
<400> 172
aatccaaata ctccatgaaa tggtttattt tatcctatga atcgatgtgg agaacaaagg 60
caaaagaaat atagaaaaat attaaatttc cttacaatgt acagcccatt gataatattt 120
kagacagtgt gagtgatctt gcttatggag ctcaactgcc tcaatgttaa tccttagcta 180
aaggcaaaag acaatcttag tttgacatta gcctgaccgc cttatgctat ccctaac 237
<210> 173
<211> 237
<212> DNA
<213> 家犬
<400> 173
aggaaaaata tgcttgcttt tgaaggaatc aatttgtggt ttcttttaat gagttatcaa 60
actattaata agcattaatt atttattgtg taaggcaaag tgcttcttaa taggtattct 120
ktccttaact tagaacattc acagattccc aatagcctct agtgcagaag aagtctgccg 180
ctcttctttc ctcctttcac tagtctctcc tatatctgtg atacctccaa tcatagc 237
<210> 174
<211> 237
<212> DNA
<213> 家犬
<400> 174
cttccatgtt ctgtctccct ttctgatatt tcctactcat tccagaaaat attcttaatg 60
aagcctctga tacggtcttg aggatcctca gagaccatat gtcagtctgt caatgaagca 120
raaatcaaga tgtttggatc cctagtagat atgtaatcaa aatgccatgg gaatacagag 180
aaggggagtc atttgtatca gttagtgtta aaaattatta tcacgctctt gatatta 237
<210> 175
<211> 237
<212> DNA
<213> 家犬
<400> 175
gagaatactg aagacgtaat gaagttgagt tccaccttta taataattcc gttttaccct 60
aaaggggaat attcaaaaat gtgacatcgc tctaccagac caccttgcga ctgctctaaa 120
mgattggcag gggcaagaac ttgtgtcact gataggcggg attttttagt cctctctgca 180
aatcattaag aaaatgttcc aacgcaacaa aacaaaatat ggtggcgatc cctgaac 237
<210> 176
<211> 237
<212> DNA
<213> 家犬
<400> 176
acctgataac accgcctcag tggagaacga gttggcactt caggacagat ttccctgcca 60
gagcctattc ctgtttgaca ctttcatttg aagaaaccca ctcatggttt cttctctcca 120
rggtttaaaa ccgagatcaa gtatatctct ttaataatgt cacattccaa agaatgactc 180
cgataagggg attgttcaag ggcttgggta ttcacataag ggctatcatg cggggag 237
<210> 177
<211> 236
<212> DNA
<213> 家犬
<400> 177
tcctctagat ctgacctaca tttcaaaaat atatgagtgg gctataacca ggaatgtctt 60
ctcttgctgc cattattcac actgcatttt ctgaagttgt tttttttttt tttttttttt 120
ycccctcggt gactttaatg gccattgagg gaactgtaga cattgggagt ctttatacag 180
ccctagtgaa atggcgagtg ttatcaatag ggtggctgaa tggtacggct ctgggc 236
<210> 178
<211> 237
<212> DNA
<213> 家犬
<400> 178
catctgtgac ccttggattc aaaccaagta ggatgcaaac ctcagaactt ctggcatttc 60
ggatgcactg atctctgcca gccccttgcc ctcttctaat gggatagaag ctgatgatgt 120
ragacaccgc gtgcaccatc tgcccaagac gtcccagttg atgccactca tcctggtttg 180
tgcaaaaaat tctctatttg ccctaattcc accgctcagc aactggaagg acctgag 237
<210> 179
<211> 237
<212> DNA
<213> 家犬
<400> 179
tcacaatggc tttttttttt ttaagattta acaggaattt tgtgatcctt tatatgatat 60
gtttcaatga agccttttgg gaaaggttct taatgtgaaa gaattttcac agagaatatc 120
rgaaataaat gtgcaaaagg gagtcgtttt aggattagag atatgcatgg aagagggaaa 180
aagcctactt atattactag aaaataattt tcaatttaga agttatactg aactatt 237
<210> 180
<211> 237
<212> DNA
<213> 家犬
<400> 180
cccatttttt taggattgat aaactgatca tctaacagat attatataca aaagtcagag 60
aagacacaat agccaaccct gtgtgtaagg aaaatgacag agttggttaa agagaaaaga 120
raaaggaggt acacagagag atgtagaggt cacattaaaa atgaacgttg tccatgtcta 180
tgaaagatgg aaggtaattc tatgcctata aggtatgtta taagttaaat taattgt 237
<210> 181
<211> 237
<212> DNA
<213> 家犬
<400> 181
aacaaaccta ccaaacagga caaaccagtc cggattatat aatatgtaaa tatgccaggg 60
agctggggag catacttgtg ggaggataag ctggagcaat ggttaaatga gctcaatcct 120
yactatactt gaaggtagta gcctcttcat tcacactcca tggctagccc tttgtaacta 180
aaatatggaa aacacaacca atgaagaagt tacatgtatc cctaaaaata ccaccta 237
<210> 182
<211> 121
<212> DNA
<213> 家犬
<400> 182
cccttggcgt tctaaagtcc agccccctct cttcgcattc tgtgctttct cctgtgtggc 60
rgtctctgtg ctttatctgc acataaacac ttcacaaatt tccgttccag cttagttctc 120
t 121
<210> 183
<211> 237
<212> DNA
<213> 家犬
<400> 183
ttaagtttag aaaaaacaaa ttcaagaaca agctttttat atttaacatc gatgaatcag 60
aagatacggg gttttttaaa ttattaaact aaaattatta aactggtcct gtttggtata 120
ragttatctt aattatgcta atctggaatc ttaaagcatt tttaaactaa tattttaaga 180
aaccaagttt tagatttatt ccaaccttgg gctagaaaag gatgaccttt gtgggcc 237
<210> 184
<211> 237
<212> DNA
<213> 家犬
<400> 184
tgagccaccc aggtgcccca aaacatgatt agtcttgaaa caaagtgtat cacaataatg 60
attcaattag atgaataaaa tgtagttttt gagaatggta aacactatgt aagagtaaag 120
ytagcctatt tgatcagtaa acctatttaa gtttagaaaa aacaaattca agaacaagct 180
ttttatattt aacatcgatg aatcagaaga tacggggttt tttaaattat taaacta 237
<210> 185
<211> 237
<212> DNA
<213> 家犬
<400> 185
agatgtcatg ctatgatata tttaaataag ttacagacat gtataatttc catggtatgt 60
tttacattca tataaaaatt aactattcat aaaatataat aaaatgtagt gtttttctta 120
ytgagcttca gtgatcataa tttgtatatt aacttaatga ccagaaataa ttaagtaaag 180
ctagttaaat tcttgggatg ttatggatta tgttatttgg ttggctgttc atgataa 237
<210> 186
<211> 120
<212> DNA
<213> 家犬
<400> 186
tgttttgaat ttaaggtgtt tttccaggct gagaagaaac gtgagctctt ggaaattatr 60
attaacgtat ctaatgcata taccctagag ggcaaggaaa tttctattca ttccctgtat 120
<210> 187
<211> 237
<212> DNA
<213> 家犬
<400> 187
cccccaggat ctgtcagtaa tccctgactg cctgcagacc acatggggag agggatccat 60
tcctatgaca gagaatttat actggcttgt gagctgaaca gatacctcag aagatgttca 120
yctgtgagac agagagacat ggtgacaaat acaagtgtca gccaacagca gcaccaagtc 180
caggaatggc tgcctgagct ggatggaacc tcactatcca gagccatcca taggccg 237
<210> 188
<211> 121
<212> DNA
<213> 家犬
<400> 188
agagccaacg ctggatctca gggagaatct agaaggccag ctgaccagaa aaccaactgg 60
rcagacagaa gctgggagca gcgcctgtgg aggcaggcac gagaggcccc ggtgcagccg 120
c 121
<210> 189
<211> 237
<212> DNA
<213> 家犬
<400> 189
ctgggtggct gttggagaga gtgtgttgtg ttgttcccag ggttagtcct aggaatggta 60
gagcctgtca agttctccct gaaagtcacg tcactcccca cttcagcagg cccagcctgt 120
sttgtatccc tgcagcactg cctcaggatc cttgctctgc agtgatcaga gtcatctgat 180
aagcctgtcc ctgtctaggc tgatattaat ttcaggttgt caccctctat gcctctt 237
<210> 190
<211> 237
<212> DNA
<213> 家犬
<400> 190
ggccttatga agacttctct gatctgttga tctgatgtac ccagattctg aatccctaat 60
tagactcaat taggacactc ctggaggtga ctactgcttt cttagacttt gtcactcaaa 120
yatctaatac attcgacttt gacccatgga tttattgagt tcctcttgca cacccagttc 180
agtagatgtg gtccactatt ttggtgcatc gactgctcta gaatttagct tttggaa 237
<210> 191
<211> 237
<212> DNA
<213> 家犬
<400> 191
atgacacatg caagtgctca ataacgttag acactgtact gttaattaaa ggtctatcgc 60
ccctttaaac aaaatgtcca gaatgttcat gttcaccaaa agtgaaaggc attcatgtct 120
mtgtttctgt tgagttcact gtcacctttg tgcctagaaa ggagaagaca cactggtttt 180
tcctcctcta gagaagtgca gatttgtata ggtgaggagt atacataggt tgtgggc 237
<210> 192
<211> 237
<212> DNA
<213> 家犬
<400> 192
ctttgggaat gaggcctgtc ccgctagcct gcttcattta ctctcatgat tcttggcaaa 60
gttcttataa gtcacgttca aattatcagg cttcattcct agtctgagca gacttgtccc 120
rtctcccagc ctgtggatgt tcaagaagcg caacttggtt ttatgtttat taatcaaaag 180
ccctttagcc tctgatgaac ctctgagggt ggctttaaag ccccgcgcct gctctga 237
<210> 193
<211> 237
<212> DNA
<213> 家犬
<400> 193
aaagaaaaaa gtaagggtca aaacactagc aaaattaaat taaaaaaata agaaaaacaa 60
gtcacacttt tttttttttt ttggtcattt gggaaaagca caatattttg cttgattact 120
yttcctcact tttcaactag taatatagat tgcatgaaaa ataaacaaaa caagtaaact 180
ttaaatgttt gctggtgtag aggtgaataa gaacaatcca tggattttgc aatcaca 237
<210> 194
<211> 237
<212> DNA
<213> 家犬
<400> 194
tctagctcca gtctccttta ttcagtgcca ccttcatttt tccattccag ccaaattagt 60
gttttcattc tctcaagcat tttcatctat gtacttcctg aaccctcttc atggaagaca 120
ycctctactc ttcagcatat tactatccca gcatccctta ccctgatagt ttaacttgat 180
tctttatcta cctgattcag taatatttct ctattcttat catattcagc aatgttc 237
<210> 195
<211> 237
<212> DNA
<213> 家犬
<400> 195
tcccctactg aaaacaaatt cccccatctt caccctacca tggggatttt acatttgtta 60
ccagatttgg ggcaaactca tcctattttc ccttcagtgt ggagaagaga ttttggaaag 120
yagaccatgc aaatctctaa gctcacaata aactgaattg gagaggcata aaacctgaca 180
ggaaaaaaag gtgtgaactt gatctttagc ttgctgttct ggtttaatag gtttctg 237
<210> 196
<211> 237
<212> DNA
<213> 家犬
<400> 196
aagggtgaac tgacttttag tcagaatgtt tatttttaac agattataaa atagccacct 60
atttagatgg ataaatgtat tgtgattatg gtgttgttta taaaaagaat tttcaggatt 120
ktccacaaaa cttaatgtta gtattagtta ttaagagtac aatggaatat cattcagcca 180
tataaaagaa tgaaatcttg ctatttgcaa tgacatagat ggagctagag agtataa 237
<210> 197
<211> 237
<212> DNA
<213> 家犬
<400> 197
atgagtttgc aattctagcc ggtgcatgag gacttctccc tttcccgagc cctcccggaa 60
agtttggcca gatccccagc ccaaatggca gcatgtgctc gggaagatga ttaatgttag 120
ygcgaggctc cagagaatct ctcagggccc ttttgtttat taaatagaaa aattcatgtt 180
taaatataat gtcaagggga tgacacggac caacatgatc caagacagac tgccggc 237
<210> 198
<211> 237
<212> DNA
<213> 家犬
<400> 198
ctcccactaa ctagcaggta tacatagtta aatttctcta acacagagca atactacctt 60
ccacaccaga aaatggcaaa ggctaaatat aaccacagat ctcaaggcta ctgaactaca 120
ygcaggtaat agattatatt taaaacatat cagatgaatc tgcactaata ctgggggcct 180
ataaaacttt ctaacataca gtagtataag caggatttcc aatcagtgag aaaagga 237
<210> 199
<211> 121
<212> DNA
<213> 家犬
<400> 199
atgtgtaatt tacaaagagt tcatatatta ctttatcagt taagcttttg taattccata 60
mtctatacta attttaaaga ggagtgattc cttcttgcaa ttagtttatt gcctccgtat 120
g 121
<210> 200
<211> 237
<212> DNA
<213> 家犬
<400> 200
atatatcatt ccacctatag taattttcac taatctgccc atttattccc tagtgcatac 60
ccttaatata aatctgcaac aagaatataa cttttctaaa aaaaaaaaaa aagtgtacat 120
rcattagtga tgtgtgtgac caactaaata ccagtgtata agcccatgcc catatttcat 180
tttcacgaat tatgtttgct gcataaataa gacttgtagc tttttaaact tacctct 237
<210> 201
<211> 237
<212> DNA
<213> 家犬
<400> 201
gtgtcagtat gttaagccac tagtgcactg ttaactgctg ccatgactaa gaaaaaacac 60
agaagctgct gctgctacta tgtcactctt gtcattttta aggtgaatcc tcatatgaat 120
ragagggagt acatgcttaa tggtcagagt gacagctttt gcttcatggc gagccatcga 180
aaccccacaa atctctttgc cccaacagat tcttcacctt tcttctccag aaatgaa 237
<210> 202
<211> 237
<212> DNA
<213> 家犬
<400> 202
ttatggatct tacaatctag tgattgaaac acaaattaga tttgggcttg tctataaaac 60
tgggatattt tctgatattg gaatgaatac tgggacagtc ccttaattat ggtttcatga 120
rtgattagtc ttatgataca tagtttatgt gtaattgcta tttctaatcc aaaataaatt 180
ggacctttcg tttagattaa acatggagtc tttgatgtaa ataccgtaga aggagtc 237
<210> 203
<211> 237
<212> DNA
<213> 家犬
<400> 203
tgctgtctaa acaggagctt gaaggatgag taggaagaga tttcagatag aacagctgtg 60
ctggagcaaa gagggtctga gggagcatgg tatatttagt ggacggcagc tagttgcctg 120
scactggagc atggcgggtg gggagtaaga ggtgggagag aaaactcaat gacaggcaga 180
agccagacca tgaagggcct cacatcctgt gcagaggagt tttgattttt atctcct 237
<210> 204
<211> 237
<212> DNA
<213> 家犬
<400> 204
tttgtccttg aaagaagttt ttctctttct ttcccatttt ctttttcttc ctatttgctt 60
aattatctgt tgccagataa ttcacaccta agttcataga ggaccaatgt cacagatatt 120
ytcttaaaca aaactggctt tgtaacaata aaatttgtct gtttaaaatg taactaatat 180
cggagatatt tacctaagga agtatttgta aatagtatct agaaatgcaa gaaaata 237
<210> 205
<211> 237
<212> DNA
<213> 家犬
<400> 205
gccaacgcta agattcatat gtctattttt actcaacacc aaataaaggt accatttcta 60
atccaagaac ttcactctgc tgtcttctag cacattggca ttttccacag gcatttcttg 120
ytttacttga tgtatttttt tccagttttt cttaatatga tatctgagaa atttttttgc 180
taagtattga ttcaaaaatt taaaattaag gttaaattgt ggctaatcag catactg 237
<210> 206
<211> 236
<212> DNA
<213> 家犬
<400> 206
ttttatcatg ccaggaaatt cttggaatgt agccactgtc tgatatttat ggttccataa 60
gcatttgact ctgaaaagtc tctaattctg gaaaacggcc actgatcagt tgttaatgca 120
yagcagtagg aaaaaagtca ccccttaaaa ggagagagag gacaaaagga acagcttgtg 180
aggctaaaag tatgacaagt atgacgtcta cctatacagg aagtgtatat gcatct 236
<210> 207
<211> 121
<212> DNA
<213> 家犬
<400> 207
gctaataaag gatcaacctc tgggctgcag aataacctaa tctattcata cctcagtgac 60
rtcctgaatt agaaccgggg gctgatgaac tccaatgcac cagccaacca accagagtta 120
g 121
<210> 208
<211> 237
<212> DNA
<213> 家犬
<400> 208
tgaatgactt tttcaacccg aattttcatg acatttttgt catgacattt ctcatataac 60
ctaccgcatg taaagcaaga tctcctattg gattctgtct tattttttgt catcttccaa 120
yggtcttagg caaatgaagt ttaagtagta agattatatg cctcctccca ctttggtgca 180
tgcacacaga tgcaggaaca tgcttagtaa ctaatctttg tgggacatag gaatgcc 237
<210> 209
<211> 237
<212> DNA
<213> 家犬
<400> 209
gccagctcta atgagtttgt ttccaagcgg tgcttccaga aattgttagt ggttggtagt 60
tgcaatgggt tttgaaatta gaggacatca cagcagagta gaatggtttg gaacagggga 120
rtatgattag gattaatgag atgaaagaaa attctggcta gagggctaga agagccatgg 180
aagaaaatat acactaaccc tttggagtgt tcctccaagt gaagatttgc aacattt 237
<210> 210
<211> 237
<212> DNA
<213> 家犬
<400> 210
acgagaagca agattgccat accgttcctg gtaccgggcc atgacgttga ccttcaaaag 60
ccctgaaacg gctgttttcc tggctgctgt gagctgtgga actcaggagt aggtatttcc 120
ygaaaacatt taacatccca tagcaaaggt gttggaggcg tcgtctccat tgtcgtttct 180
cccgggctgt ggttggcctt tctgcgtgag tgcttctccc cgctgcgggc tggctct 237
<210> 211
<211> 237
<212> DNA
<213> 家犬
<400> 211
taggaaaaaa catctggcct ctgactcgga tccagtcatc ccagcctcat tcacacccac 60
ccatcagctc tcagagaacc ttctgagact tcgataaata gctgagccct taaaatgaca 120
rcattgattt ggcatggttt gggcaataac ttctggctgc tgtgattttt aggttttgaa 180
tatttagttt ctggaaactc tgatagaatg aataacttta tatgtttatt taattct 237
<210> 212
<211> 237
<212> DNA
<213> 家犬
<400> 212
gtctactgaa gccagacagt tggttcatta gattaattaa agtgcaaact aaccccaatc 60
tggtgttttg ataacggcca cagggctctt gaagttggaa tcggccagca tttgacagtg 120
ytctcattaa agccacagtg gaattgcctc tatggtttct cctaaacttt tgaatttacc 180
ttataacaaa gaagtggact ttgagcatcc ctgattgttt tttcagtgtt aactgct 237
<210> 213
<211> 237
<212> DNA
<213> 家犬
<400> 213
tgttgctttc ctgcacacaa gcagttgaac cagagtaggg aggaatcatt tttaggaatg 60
tgttattatt attttttagg aatgcacaaa acccatgcca aaaagcccat ccacgtctaa 120
ygtccttgaa cctctccttc actaccaatt gtattctttt atgttcccaa tcaactggct 180
ggcctgaaat agatttctcc taccaagaaa tgtagataaa aatatttatt tctggaa 237
<210> 214
<211> 237
<212> DNA
<213> 家犬
<400> 214
gtctcagccc tctattccag aaggtaggac tggccctggg cctgtctacg aggtggtggc 60
tgcgagccct caaggcctgg cattgtcaaa gttctgacaa ccttccccac ctatggcagc 120
kcagtgttag acgctccagg ctgagggttg atgcacactt tttcggcttc caaagtgtgg 180
ccttctcctc agggcttccc atggggtcca caggctggca gcaacctctt ggagaaa 237
<210> 215
<211> 237
<212> DNA
<213> 家犬
<400> 215
cagctgtgtc atggaaatgg cactttaaaa attcatatga atcttaacag taaagcacaa 60
gactttggag atatttctcc tgttgaatag ctgcttgggg atgtgccaca gatctgtaga 120
rgtcagcatt cactctaagt tcccgggaac catgagacag cagcaaccat ggccaccaca 180
gcaacacagc aggtgcccat aagcccattt tacagatgga gaaattgggt ccagaga 237
<210> 216
<211> 237
<212> DNA
<213> 家犬
<400> 216
cctctggctc cccagaacct cagagcttag gggatgtagt ggttgtaatc ctggatccct 60
ctgtggggtg gcaggtctgg agtggtgagc tactgtgagg gaactggggt aactgtgacc 120
ygagaagaaa ggagcgaggg agtgagtgtg tgtctgtgaa atatgcctct gtgtgtataa 180
acagggctgg agggctcagt gccccccact cccaaagatc cacctgttac atccccg 237
<210> 217
<211> 237
<212> DNA
<213> 家犬
<400> 217
ttcttctctt gtgactggtc actaaagaca gagatttcag gagagctgac tttggtagga 60
attctcaccc ttttctggcc taggcctata atttttatac cgacagctgg agtcccagat 120
rgaagagacc ttaaactctt tggactatga agaacctgtt ttttctctct ctctcttttt 180
tttcccctta aaacaaaaat ttattttcct caggcctcat cctgtaccca gtcttgt 237
<210> 218
<211> 237
<212> DNA
<213> 家犬
<400> 218
agctccaatt tagtcatata ctaaagaatc aggtcatact ctaggcagac tctaggcagt 60
tagcacatga aaccagttca catgctttat catcatcctt tttgttctca aaacagccaa 120
maacagttct gtataagata tttcacatgt ttaattcttt cagttcttct agcaagcagg 180
aagcttagaa caagatttta gtatttggtt tagataacaa ttgcaaatag gagcacc 237
<210> 219
<211> 237
<212> DNA
<213> 家犬
<400> 219
gacttttcta gagagaccat ggaagatgca tgtggggcct gcccaggctg ccacagggga 60
aaggagccgg gaggagggag ctgtcaggcc acttcctctg atggcccctc agcagcagga 120
rgagagcatt tcctcaccag atcccactca acactggcca cggtccccct gtggacttca 180
gaactgactc agaactaacc tgactgactg cgtatgattt gtctttttag gaggacc 237
<210> 220
<211> 237
<212> DNA
<213> 家犬
<400> 220
cccgcgccag gccggtcctc tcctcccagc tcctcctctc ccgctcgcag tcagggcagc 60
cagggagggg agaaattctc atctcaaaac tagtaagaca aggccccgca gcgggtctgc 120
rgcgcggagg cggctgcctc tcctggtcca tactggacac agctgaccac atttcaacag 180
gtaagaatca ttttaaatat tacccttaaa ccaaaaaaag ttcttctttt gcttcta 237
<210> 221
<211> 237
<212> DNA
<213> 家犬
<400> 221
cagtattccg attcttctat ttgctaattt taaagtgcag atctaagagg acaaccttat 60
tattatttcc atggtcttag agatcatctt actgttgccc cacaatgtcc atgcttcccg 120
kgaaagatgt gtgtatccag actcaaagtg aatctaatag ggaaggaaga ctgagaattc 180
tattagtaag caacccgtat ttaacaacat ggcccagttt gaagatttgc agaaaca 237
<210> 222
<211> 237
<212> DNA
<213> 家犬
<400> 222
tcaggagtga gcctgtacgt tatcctgact actgattccc ttgcaccaaa aaagcaacgg 60
gagcataagg gcaagatatg acctttagct aaagggttgc aagttatatt actagtcgtc 120
rctgctcaaa cacccagcac cagaccctgc atagaataca gaaaagagtc ctcaccatca 180
agccactacc acctgaagca tgaaggagag aacaaggaga gatcacctcc taagtgt 237
<210> 223
<211> 237
<212> DNA
<213> 家犬
<400> 223
ctgacctctg ctctagtcaa ttgctctgaa agtacagtcc tctgatccta gactcgaacc 60
ctctcaagca taacagttcc atctactatt cactaatcca tttatttaac tgggagtgtt 120
statgctttg gctctgggat atgaaggaaa ggacattgtg cccgaacata taggaaagtt 180
attgtttaag gagatataca gggaaataat tttaaaacac catggtaatc ttttcct 237
<210> 224
<211> 237
<212> DNA
<213> 家犬
<400> 224
cgttttcctt ataaattttt agaaaacaga acaggaaaaa aaaaaaaaga aagaaaacag 60
aacagagaac aaaccaacat gtcttgatgc ctccaggaac cagttttctc atagccttag 120
rggaaacaat ttacaaaata tctgaaaagc ctgcagatat cttagatcca agattccaag 180
gcataaaaat gtaagtgatc atgtactacg tattactgaa atacagaaag caaccaa 237
<210> 225
<211> 237
<212> DNA
<213> 家犬
<400> 225
agcaccttga gaatggtgta gtggaaagaa agttgacttt tagtaactat gcatttgtct 60
cgttaatgca gtttctcacc tgctttgaga taatgggaaa tggaactaac aggtagtggt 120
racacagatg atggacaata taaagatttg agatatatat aaaaaaaatt tgatcattat 180
atgtacactt tgctagtttt gctctacatt ttttatccac acaaaaagta atttgca 237
<210> 226
<211> 237
<212> DNA
<213> 家犬
<400> 226
taagtagcct ttagtgcaag gaaaagaaaa aggcagtaag gatgaacctt tgtttcaaag 60
gtattaggag tcatttaagg aatttcaaaa aaaaaaaaaa gaagtgacat gattttgaac 120
raagaagtga ctgtcagtac tataaagagc acattgcctc aaggagaaac tgaagttaga 180
gaagccaaat tggctgataa aaatctaggc cggagatgca aacacctaaa tgaaaac 237
<210> 227
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 227
gttaccctgc agctgagagt 20
<210> 228
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 228
atggcgagca tcacagtatc 20
<210> 229
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 229
gttttcccag tcacgacgtt accctgcagc tgagagt 37
<210> 230
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 230
gttttcccag tcacgac 17
<210> 231
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 231
gttaccctgc agctgagag 19
<210> 232
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 232
agggtcgtac tgtacttggg 20
<210> 233
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 233
cgtctggatg ggaagtttct c 21
<210> 234
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 234
ttgtcggact tcagggagg 19
<210> 235
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 235
ccggcggtgg gactccccgc 20
<210> 236
<211> 989
<212> DNA
<213> 家犬
<400> 236
tcagcaccca ggaggcagtc atcacttacc agccttatct tattcaaccc caggacctca 60
gggaccatgt aaacgacatg gggtttgaag ctgtcatcaa gaacagagtg gcacccgtaa 120
gcctgggacc cattgatatt gggcggttac agaggaccaa cccaaagatg cctttgactt 180
ctgataacca gaatctcaat aactctgaga ccttgggcca tcaagggagc catgtggtta 240
ccctgcagct gagagtcgac ggaatgcact gtcagtcttg tgtcctgaac attgaagaga 300
atataggcca actccccggg gttcagaatg tgcaagtgtc cttggagaac agaacggccc 360
aagtacagta cgacccttct tgtgtcaccg caggggccct gcagagggcc attgaagctc 420
tcccaccagg gaactttaaa gtttctcttc ctgccgcagc agcaggaagt gagacaggta 480
acaggttttc ggcatgtgcc gcccccgccc caagaacccc ggcaccgggc aggtgcgata 540
ctgtgatgct cgccattgtg ggcatgacct gtgcatcctg cgtccagtcg atcgaaggcc 600
tgatctccca gagggaaggg gtgcagcaaa tatctgtctc tctggctgaa gggaccgcag 660
tggttctcta tgatccctct ataattggcc cggaagaact ccgagctgcc gtcgaggaga 720
tgggatttga gacttcagtc ctctctggta tgtagtggca ccccgggtct tctcctctct 780
ccttgggcct tacggcagag tgcctgcagg gtggcacagg ggagccaccc cagctgctcg 840
cctgtcgggt tggccaagtc ccgcagcgtt tccctgtgtg ttgaatgtgt ccgggtggga 900
gaaagagaac tttctggtgt gtagattttg cctctcatgg ggctgggact acattgctaa 960
attctttgtt gttgttattt tttttaact 989
<210> 237
<211> 995
<212> DNA
<213> 家犬
<400> 237
tcagcaccca ggaggcagtc atcacttacc agccttatct tattcaaccc caggacctca 60
gggaccatgt aaacgacatg gggtttgaag ctgtcatcaa gaacagagtg gcacccgtaa 120
gcctgggacc cattgatatt gggcggttac agaggaccaa cccaaagatg cctttgactt 180
ctgataacca gaatctcaat aactctgaga ccttgggcca tcaagggagc catgtggtta 240
ccctgcagct gagagtcgac ggaatgcact gtcagtcttg tgtcctgaac attgaagaga 300
atataggcca actccccggg gttcagaatg tgcaagtgtc cttggagaac agaacggccc 360
aagtacagta cgacccttct tgtgtcaccg caggggccct gcagagggcc attgaagctc 420
tcccaccagg gaactttaaa gtttctcttc ctgccgcagc agcaggaagt gagacaggta 480
acaggttttc ggcatgtgcc gcccccgccc ccgccccaag aaccccggca ccgggcaggt 540
gcgatactgt gatgctcgcc attgtgggca tgacctgtgc atcctgcgtc cagtcgatcg 600
aaggcctgat ctcccagagg gaaggggtgc agcaaatatc tgtctctctg gctgaaggga 660
ccgcagtggt tctctatgat ccctctataa ttggcccgga agaactccga gctgccgtcg 720
aggagatggg atttgagact tcagtcctct ctggtatgta gtggcacccc gggtcttctc 780
ctctctcctt gggccttacg gcagagtgcc tgcagggtgg cacaggggag ccaccccagc 840
tgctcgcctg tcgggttggc caagtcccgc agcgtttccc tgtgtgttga atgtgtccgg 900
gtgggagaaa gagaactttc tggtgtgtag attttgcctc tcatggggct gggactacat 960
tgctaaattc tttgttgttg ttattttttt taact 995
<210> 238
<211> 1001
<212> DNA
<213> 家犬
<400> 238
tcagcaccca ggaggcagtc atcacttacc agccttatct tattcaaccc caggacctca 60
gggaccatgt aaacgacatg gggtttgaag ctgtcatcaa gaacagagtg gcacccgtaa 120
gcctgggacc cattgatatt gggcggttac agaggaccaa cccaaagatg cctttgactt 180
ctgataacca gaatctcaat aactctgaga ccttgggcca tcaagggagc catgtggtta 240
ccctgcagct gagagtcgac ggaatgcact gtcagtcttg tgtcctgaac attgaagaga 300
atataggcca actccccggg gttcagaatg tgcaagtgtc cttggagaac agaacggccc 360
aagtacagta cgacccttct tgtgtcaccg caggggccct gcagagggcc attgaagctc 420
tcccaccagg gaactttaaa gtttctcttc ctgccgcagc agcaggaagt gagacaggta 480
acaggttttc ggcatgtgcc gcccccgccc ccgcccccgc cccaagaacc ccggcaccgg 540
gcaggtgcga tactgtgatg ctcgccattg tgggcatgac ctgtgcatcc tgcgtccagt 600
cgatcgaagg cctgatctcc cagagggaag gggtgcagca aatatctgtc tctctggctg 660
aagggaccgc agtggttctc tatgatccct ctataattgg cccggaagaa ctccgagctg 720
ccgtcgagga gatgggattt gagacttcag tcctctctgg tatgtagtgg caccccgggt 780
cttctcctct ctccttgggc cttacggcag agtgcctgca gggtggcaca ggggagccac 840
cccagctgct cgcctgtcgg gttggccaag tcccgcagcg tttccctgtg tgttgaatgt 900
gtccgggtgg gagaaagaga actttctggt gtgtagattt tgcctctcat ggggctggga 960
ctacattgct aaattctttg ttgttgttat tttttttaac t 1001

Claims (7)

1.探针、引物或引物组合在制备用于检测狗以确定所述狗对肝铜积累的易感性的试剂盒中的用途，所述探针、引物或引物组合能够检测或辅助检测所述狗的基因组中由SEQ IDNO:155的第101位表示的Chr10_65209946的多态性的存在或缺失，其中所述狗具有拉布拉多寻回犬品种的遗传特征。
2.根据权利要求1的用途，进一步包含检测所述狗的基因组中一种或多种选自以下的多态性的存在或缺失:
(a)由SEQ ID NO:144的第101位表示的Chr22_3167534、由SEQ ID NO:145的第101位表示的Chr22_3135144、由SEQ ID NO:146的第101位表示的Chr20_55461150、由SEQ ID NO:147的第101位表示的ChrX_120879711、由SEQ ID NO:148的第101位表示的Chr19_6078084、由SEQ ID NO:149的第101位表示的Chr15_62625262、由SEQ ID NO:150的第101位表示的Chr14_39437543、由SEQ ID NO:151的第101位表示的Chr15_62625024、由SEQ ID NO:152的第101位表示的Chr3_86838677、由SEQ ID NO:153的第101位表示的Chr24_4011833、由SEQID NO:154的第101位表示的Chr18_60812198，和位于染色体位置22:3135287的CGCCCC重复；和/或
(b)由SEQ ID NO:156的第101位表示的Chr32_38904515、由SEQ ID NO:157的第101位表示的Chr8_4892743和由SEQ ID NO:158的第101位表示的Chr8_4880518；和/或
(c)由SEQ ID NO:142的第102位表示的ChrX_63338063。
3.根据权利要求 1 的用途，其中所述多态性为单核苷酸多态性(SNP)。
4.根据权利要求1的用途，进一步包含检测样品中所述狗的基因组中选自以下的一种或多种SNP的存在与缺失：由SEQ ID NO:1的第61位表示的BICF2P506595、由SEQ ID NO:2的第61位表示的BICF2P772765、由SEQ ID NO:3的第61位表示的BICF2S2333187、由SEQ IDNO:4的第61位表示的BICF2P1324008、由SEQ ID NO:5的第61位表示的BICF2P591872、由SEQID NO:131的第164位表示的ATP7a_Reg4_F_9、由SEQ ID NO:132的第97位表示的UBL5_Reg1F_16、由SEQ ID NO:133的第70位表示的golga5_Reg1_24、由SEQ ID NO:134的第88位表示的golga5_26、由SEQ ID NO:135的第104位表示的golga5_27、由SEQ ID NO:136的第139位表示的golga5_28、由SEQ ID NO:137的第128位表示的golga5_29、由SEQ ID NO:138的第95位表示的golga5_30、由SEQ ID NO:139的第106位表示的golga5_31、由SEQ ID NO:140的第95位表示的atp7areg17_32，和由SEQ ID NO:141的第90位表示的atp7areg17_33。
5.根据权利要求4的用途，包含检测以下SNP的存在或缺失：由SEQ ID NO:1的第61位表示的BICF2P506595、由SEQ ID NO:2的第61位表示的BICF2P772765、由SEQ ID NO:3的第61位表示的BICF2S2333187、由SEQ ID NO:4的第61位表示的BICF2P1324008和由SEQ ID NO:5的第61位表示的BICF2P591872。
6.根据权利要求1的用途，包含检测样品中所述狗的基因组中以下的存在或缺失：由SEQ ID NO:155的第101位表示的Chr10_65209946、由SEQ ID NO:144的第101位表示的Chr22_3167534、由SEQ ID NO:145的第101位表示的Chr22_3135144、由SEQ ID NO:146的第101位表示的Chr20_55461150、由SEQ ID NO:148的第101位表示的Chr19_6078084、由SEQID NO:152的第101位表示的Chr3_86838677和由SEQ ID NO:142的第102位表示的ChrX_63338063。
7.安排执行确定狗对肝铜积累的易感性的方法的计算机系统，所述方法包含：
(a)将关于所述狗基因组中如权利要求 1 所定义的和任选地如权利要求2至6中任一项所定义的多态性的存在或缺失的数据输入至计算机系统；
(b)将所述数据与计算机数据库比较，所述数据库包含关于如权利要求 1 所定义的和任选地如权利要求2至6中任一项所定义的多态性和它们与狗对肝铜积累易感性的关联的信息；
和
(c)基于所述比较确定所述狗对肝铜积累的易感性，
其中所述计算机系统包含：
(i)接收关于狗基因组中如权利要求 1 所定义的和任选地如权利要求2至6中任一项所定义的多态性的存在或缺失的数据的装置；
(ii)包含关于如权利要求 1 所定义的和任选地如权利要求2至6中任一项所定义的多态性的信息和它们与狗对肝铜积累的易感性的关联的信息的数据库；
(iii)用于比较数据与数据库的模块；和
(iv)基于所述比较确定狗对肝铜积累的易感性的装置。
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