JP2003135072A - 薬物代謝酵素ｃｙｐ３ａ５遺伝子上の一塩基多型の判定方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 （修正有） 【課題】 薬物代謝酵素ＣＹＰ３Ａ５遺伝子上の一塩基
多型の簡便で信頼性の高い判定方法を提供する。 【解決手段】 本判定方法は、薬物代謝酵素ＣＹＰ３
Ａ５遺伝子上の＊３アレル（または＊６アレル）に関す
る多型部位を含む領域を特異的に増幅し得るように設計
されたプライマーを用いて、被検体由来のＤＮＡをＰＣ
Ｒ法により増幅し、得られた増幅ＤＮＡ断片を制限酵
素Ｄｄｅ１によって消化し、得られた断片をゲル電気
泳動し、その泳動パターンからＣＹＰ３Ａ５遺伝子上の
一塩基多型を判定する方法であり、＊３アレルに関する
一塩基多型の検出には対応する特定の各塩基配列からな
るプライマーセットを用い、＊６アレルに関する一塩基
多型の検出には別の対応する特定の各塩基配列からなる
プライマーセットを用いるものである。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、薬物代謝酵素ＣＹ
Ｐ３Ａ５遺伝子上の一塩基多型（single nucleotide po
lymorphism：以下、略して「ＳＮＰ」という場合があ
る）の判定方法に関するものである。

【０００２】

【従来の技術】薬物を含む外来化学物質は、人体におい
て、シトクロムＰ４５０による触媒作用によって無毒化
される。このうち、シトクロムＰ４５０のＣＹＰ３Ａサ
ブファミリーは、既存薬物の約半数以上の代謝に関与す
るといわれる重要な酵素である。ＣＹＰ３Ａサブファミ
リーには、互いに相同性が高い３つのタンパク質（ＣＹ
Ｐ３Ａ４、ＣＹＰ３Ａ５、ＣＹＰ３Ａ７）の存在が知ら
れており、これらのタンパク質は互いに異なった遺伝子
にコードされている。

【０００３】成人肝臓に存在するＣＹＰ３Ａ４は、主要
なＣＹＰ３Ａ酵素の一つであり、これまで検査された殆
どすべての成人肝臓で検出されている。一方、ＣＹＰ３
Ａ５は、成人肝臓の１０〜３０％のみで発現していると
の報告があり、その発現には多様性が認められる。ＣＹ
Ｐ３Ａ４とＣＹＰ３Ａ５とは、約８５％のアミノ酸配列
が一致しており、基質となる薬物（化学物質）も一部オ
ーバーラップするが、同じ基質に対する触媒能力などの
点において相違が認められる。

【０００４】上記ＣＹＰ３Ａ酵素の活性は、個体間、民
族間での多様性が顕著であり、つまり、上記ＣＹＰ３Ａ
酵素の薬物代謝能には著しい個体差が認められる。この
ことは、上記ＣＹＰ３Ａ酵素により代謝される薬物の有
効性および安全性に少なからず影響を及ぼす。最近の研
究では、上記ＣＹＰ３Ａの活性が個体間で多様性を有す
る理由は、遺伝的要因が全体の８０％を超えると報告さ
れている。とはいえ、その遺伝的要因については未だよ
くわかっていない。

【０００５】さらに最近、上記ＣＹＰ３Ａ５酵素の遺伝
子上の２つの一塩基多型（ＳＮＰ）が報告された(Kuehl
et al., Nat. Genet. 2001;27:383-391参照)。第１の
ＳＮＰは、GenBank アクセッション番号AC005020の塩基
配列（即ち、上記ＣＹＰ３Ａ５のゲノムＤＮＡ配列）上
の22,893番目に存在する一塩基多型である。この22,893
番目の多型部位は、遺伝子のイントロン３上に位置し、
この位置の塩基がＡ（アデニン）のアレルと、Ｇ（グア
ニン）のアレルとが存在する。このうち、上記22,893番
目の多型部位の塩基がＡであるアレルはＣＹＰ３Ａ５＊
１と命名され、ＧであるアレルはＣＹＰ３Ａ５＊３と命
名されている。第２のＳＮＰは、同アクセッション番号
の塩基配列上の30,597番目に存在する一塩基多型であ
る。この30,597番目の多型部位は、遺伝子のエクソン７
上に位置し、この位置の塩基がＧ（グアニン）のアレル
と、Ａ（アデニン）のアレルとが存在する。このうち、
上記30,597番目の多型部位の塩基がＧであるアレルはＣ
ＹＰ３Ａ５＊１と命名され、ＡであるアレルはＣＹＰ３
Ａ５＊６と命名されている。

【０００６】上記ＣＹＰ３Ａ５＊３およびＣＹＰ３Ａ５
＊６のアレルは、いずれも、スプライシング異常を引き
起こし、フレームシフトによって途中ストップコドンが
現れ、正常なＣＹＰ３Ａ５タンパク質をつくることがで
きない。従って、例えばＣＹＰ３Ａ５＊３アレルのホモ
接合体では、正常なＣＹＰ３Ａ５タンパク質は発現しな
い。正常なＣＹＰ３Ａ５タンパク質の発現には、少なく
とも１つのＣＹＰ３Ａ５＊１アレルが必要である。

【０００７】

【発明が解決しようとする課題】上記Kuehl et al.の論
文によれば、上記ＣＹＰ３Ａ５タンパク質の肝臓および
小腸における発現量は、以前の報告よりも遥かに高く、
全ＣＹＰ３Ａ発現量の約５０％と報告されている。この
ように、ＣＹＰ３Ａ５の発現量が従来考えられていたよ
りも高いとすると、ＣＹＰ３Ａ５の上記２つの一塩基多
型は、ＣＹＰ３Ａが関与する薬物代謝における個体間、
民族間での多様性を生む主要な要因の一つになっている
可能性がある。

【０００８】つまり、ＣＹＰ３Ａ５の上記２つの一塩基
多型が、ＣＹＰ３Ａ酵素の薬物代謝能の個体差を生み、
これまで知られていたＣＹＰ３Ａ４が代謝酵素とされる
薬物の血中濃度がばらつく要因の一つとなっている可能
性がある。だとすれば、ＣＹＰ３Ａ５の上記２つの一塩
基多型は、ＣＹＰ３Ａによる薬物代謝の多様性を解明す
る上で非常に重要な意義を持っている。

【０００９】いずれにせよ、ＣＹＰ３Ａ酵素による薬物
代謝は臨床薬理学の分野において非常に重要な位置を占
めることから、ＣＹＰ３Ａ５の上記２つの一塩基多型を
検出する判定方法は重要である。ＣＹＰ３Ａ５遺伝子上
の上記２つの一塩基多型を検出するための簡便で信頼性
の高い判定方法があれば、例えば、１）新薬開発段階に
おける臨床試験での利用、２）薬物代謝異常の原因を調
べる検査・診断での利用、３）投与する薬の種類や薬の
投与量を決定するための治療段階での利用、といった幅
広い利用が期待できる。

【００１０】本発明は、上記の課題に鑑みなされたもの
であり、その目的は、薬物代謝酵素ＣＹＰ３Ａ５遺伝子
上の一塩基多型の簡便で信頼性の高い判定方法を提供す
ることにある。

【００１１】

【課題を解決するための手段】本発明の第１のプライマ
ーセットは、上記の課題を解決するために、薬物代謝酵
素ＣＹＰ３Ａ５遺伝子上の一塩基多型のうち、＊３アレ
ルに関する多型部位を含む領域を増幅し得るように設計
された一対のプライマーセットであって、前記多型部位
の塩基に応じて選択的に制限酵素認識部位が生ずるよう
に、一方のプライマーにおける１または２以上の塩基を
遺伝子配列上またはその相補配列上の本来の塩基とは異
なる塩基に改変したことを特徴としている。

【００１２】ここで、上記「＊３アレルに関する多型部
位」とは、上述のように、GenBankアクセッション番号A
C005020の塩基配列（即ち、上記ＣＹＰ３Ａ５のゲノム
ＤＮＡ配列）上の22,893番目に存在する多型部位を意味
する。尚、配列番号５には、同アクセッション番号の塩
基配列の22,801番目から31,000番目までの配列が示され
る。従って，上記「＊３アレルに関する多型部位」と
は、配列番号５に示される塩基配列においては、93番目
の部位を意味する。本明細書においては、この多型部位
における一塩基多型（ＳＮＰ）を、「＊３アレルに関す
る一塩基多型（ＳＮＰ）」と称する。

【００１３】また、上記「遺伝子配列上またはその相補
配列上の本来の塩基」とは、上記アクセッション番号に
示される遺伝子配列上の塩基またはその相補配列上の塩
基を意味する。

【００１４】上記本発明の第１のプライマーセットによ
れば、多型部位の塩基に応じて選択的に制限酵素認識部
位が生ずるように一方のプライマーを設計しているの
で、本発明のプライマーセットを用いて被検体由来のＤ
ＮＡを増幅し、得られた増幅ＤＮＡ断片を制限酵素を用
いて消化し、生じた断片の長さを調べることにより、＊
３アレルに関する一塩基多型を簡便かつ信頼性高く検出
することができる。

【００１５】プライマー内の２以上の塩基を改変する場
合、前記多型部位を含む領域の特異的な増幅を確保する
ためには、改変する塩基数は２〜４が好ましく、２〜３
がより好ましく、２がさらに好ましい。

【００１６】上記本発明の第１のプライマーセットとし
ては、好ましくは、配列番号１に示される塩基配列を有
するプライマーまたは当該プライマーよりも１〜１０塩
基分短いプライマーと、配列番号２に示される塩基配列
を有するプライマーまたは当該プライマーよりも１〜１
０塩基分短いプライマーとからなるプライマーセット、
を挙げることができる。

【００１７】ここで、上記「配列番号１（または２）に
示される塩基配列を有するプライマー」とは、配列番号
１（または２）に示される塩基配列からなるプライマー
のみならず、当該プライマーよりも１〜１０塩基分長い
プライマーが含まれる。このように１〜１０塩基分長い
プライマーを設計する場合、付加部分の塩基配列は、上
記アクセッション番号に示される遺伝子配列またはその
相補配列にしたがって設計すればよい。尚、配列番号１
（または２）に示される塩基配列よりも１〜１０塩基分
長いプライマー、あるいは、１〜１０塩基分短いプライ
マーを設計する場合は、５'側を長く（または短く）し
てもよいし、３'側を長く（または短く）してもよい
し、５'側および３'側の両方を長く（または短く）して
もよい。ただし、配列番号１に示される塩基配列よりも
１〜１０塩基分長いプライマーを設計する場合はその
５'側を長くする。また、配列番号１に示される塩基配
列よりも１〜１０塩基分短いプライマーを設計する場合
は、下記２２番目の塩基がプライマーに含まれるように
設計する。

【００１８】配列番号１に示される塩基配列からなるプ
ライマーは、多型部位の塩基に応じて選択的に制限酵素
認識部位が生ずるように、その２２番目の塩基が遺伝子
配列上の本来の塩基Ｔ（チミン）とは異なる塩基Ｃ（シ
トシン）に改変されている。これにより、上記プライマ
ーを用いて増幅すると、＊３アレルの場合は多型部位近
傍で制限酵素Ｄｄｅ１により切断される認識部位が生ず
ることとなるが、＊１アレルの場合は当該認識部位が生
じない。従って、制限酵素Ｄｄｅ１により消化した後、
ＤＮＡ断片をゲル電気泳動すれば、＊１アレルである
か、＊３アレルであるかに応じて互いに異なるバンドの
パターンが得られるから、これにより、＊３アレルに関
する一塩基多型を簡便かつ信頼性高く検出することがで
きる。尚、ここで、＊１アレルとは、＊３アレルに関す
る多型部位がＧ（グアニン）以外の塩基であるアレルを
意味するものとする。

【００１９】配列番号１に示される塩基配列は、配列番
号５に示される塩基配列における６８〜９２番目の配列
（上記アクセッション番号の22,868〜22,892番目の配
列）に相当する。ただし、８９番目の塩基は、配列番号
５においてはＴ（チミン）であるが、配列番号１の２２
番目の塩基は、上記のように、Ｃ（シトシン）に改変さ
れている。

【００２０】配列番号２に示される塩基配列は、配列番
号５に示される塩基配列における２４８〜２６７番目の
配列（上記アクセッション番号の23,048〜23,067番目の
配列）の相補配列に相当する。ただし、本発明のリバー
スプライマーは、この領域以外の配列をもとに設計して
もよい。

【００２１】本発明の第１の判定方法は、薬物代謝酵素
ＣＹＰ３Ａ５遺伝子上の一塩基多型の判定方法であっ
て、上記本発明の第１のプライマーセットを用いて増幅
したＤＮＡ断片を制限酵素を用いて消化し、生じた断片
の長さを調べることにより、一塩基多型の判定を行うこ
とを特徴としており、好ましくは、制限酵素にＤｄｅ１
を用いる判定方法である。

【００２２】上記本発明の第１の判定方法によれば、上
記と同様に、＊３アレルに関する一塩基多型を簡便かつ
信頼性高く検出することができる。尚、本発明のプライ
マーセットを用いた増幅方法としては、通常のＰＣＲ
（Polymerase Chain Reaction）法を用いることができ
るが、その一部を改変した増幅方法であってもよい。

【００２３】増幅ＤＮＡ断片を制限酵素によって消化し
た後、生じた断片の長さを調べる方法としては、ゲル電
気泳動を用いることができる。例えば、アガロースゲル
電気泳動により、アレルに応じて異なるバンドのパター
ンが得られ、これにより、＊３アレルに関する一塩基多
型を簡便かつ信頼性高く検出することができる。

【００２４】一方のプライマーに、上述した配列番号１
に示される塩基配列を有するプライマーまたは当該プラ
イマーよりも１〜１０塩基分短いプライマーを用いた場
合には、制限酵素にＤｄｅ１を用いることにより、アレ
ルに応じて異なるバンドのパターンが得られ、これによ
り、＊３アレルに関する一塩基多型を簡便かつ信頼性高
く検出することができる。

【００２５】さらに、本発明の第１の判定セットは、薬
物代謝酵素ＣＹＰ３Ａ５遺伝子上の一塩基多型の判定セ
ットであって、上記本発明の第１のプライマーセット、
あるいは、上記本発明の第１の判定方法を用いることを
特徴としている。

【００２６】上記本発明の第１の判定セットによれば、
上記と同様に、＊３アレルに関する一塩基多型を簡便か
つ信頼性高く検出することができる。尚、本発明の第１
の判定セットとしては、本発明の第１のプライマーセッ
トを含むものであればよく、さらに、ＰＣＲ法に用い
る酵素や試薬、制限酵素消化反応に用いる酵素や試
薬、ゲル電気泳動に用いる酵素や試薬、などを含むも
のであってもよい。

【００２７】次に、本発明の第２のプライマーセット
は、薬物代謝酵素ＣＹＰ３Ａ５遺伝子上の一塩基多型の
うち、＊６アレルに関する多型部位を含む領域を増幅し
得るように設計された一対のプライマーセットであっ
て、配列番号３に示される塩基配列を有するプライマー
または当該プライマーよりも１〜１０塩基分短いプライ
マーと、配列番号４に示される塩基配列を有するプライ
マーまたは当該プライマーよりも１〜１０塩基分短いプ
ライマーとからなることを特徴としている。

【００２８】ここで、上記「＊６アレルに関する多型部
位」とは、上述のように、GenBankアクセッション番号A
C005020の塩基配列（即ち、上記ＣＹＰ３Ａ５のゲノム
ＤＮＡ配列）上の30,597番目に存在する多型部位を意味
し、配列番号５に示される塩基配列においては、7797番
目の部位を意味する。本明細書においては、この多型部
位における一塩基多型（ＳＮＰ）を、「＊６アレルに関
する一塩基多型（ＳＮＰ）」と称する。

【００２９】また、上記「配列番号３（または４）に示
される塩基配列を有するプライマー」とは、配列番号３
（または４）に示される塩基配列からなるプライマーの
みならず、当該プライマーよりも１〜１０塩基分長いプ
ライマーが含まれる。このように１〜１０塩基分長いプ
ライマーを設計する場合、付加部分の塩基配列は、上記
アクセッション番号に示される遺伝子配列またはその相
補配列にしたがって設計すればよい。尚、配列番号３
（または４）に示される塩基配列よりも１〜１０塩基分
長いプライマー、あるいは、１〜１０塩基分短いプライ
マーを設計する場合は、５'側を長く（または短く）し
てもよいし、３'側を長く（または短く）してもよい
し、５'側および３'側の両方を長く（または短く）して
もよい。

【００３０】上記本発明の第２のプライマーセットを用
いて被検体由来のＤＮＡを増幅し、得られた増幅ＤＮＡ
断片を制限酵素Ｄｄｅ１により消化した後、ＤＮＡ断片
をゲル電気泳動すれば、＊１アレルであるか、＊６アレ
ルであるかに応じて互いに異なるバンドのパターンが得
られるから、これにより、＊６アレルに関する一塩基多
型を簡便かつ信頼性高く検出することができる。尚、こ
こで、＊１アレルとは、＊６アレルに関する多型部位が
Ａ（アデニン）以外の塩基であるアレルを意味するもの
とする。

【００３１】配列番号３に示される塩基配列は、配列番
号５に示される塩基配列における7617〜7636番目の配列
（上記アクセッション番号の30,417〜30,436番目の配
列）に相当する。また、配列番号４に示される塩基配列
は、配列番号５に示される塩基配列における7834〜7853
番目の配列（上記アクセッション番号の30,634〜30,653
番目の配列）の相補配列に相当する。

【００３２】本発明の第２の判定方法は、薬物代謝酵素
ＣＹＰ３Ａ５遺伝子上の一塩基多型の判定方法であっ
て、上記本発明の第２のプライマーセットを用いて増幅
したＤＮＡ断片を制限酵素Ｄｄｅ１を用いて消化し、生
じた断片の長さを調べることにより、一塩基多型の判定
を行うことを特徴としている。

【００３３】上記本発明の第２の判定方法によれば、上
記と同様に、＊６アレルに関する一塩基多型を簡便かつ
信頼性高く検出することができる。尚、本発明の第２の
プライマーセットを用いた増幅方法としては、通常のＰ
ＣＲ法を用いることができるが、その一部を改変した増
幅方法であってもよい。

【００３４】増幅ＤＮＡ断片を制限酵素Ｄｄｅ１によっ
て消化した後、生じた断片の長さを調べる方法として
は、ゲル電気泳動を用いることができる。例えば、アガ
ロースゲル電気泳動により、アレルに応じて異なるバン
ドのパターンが得られ、これにより、＊６アレルに関す
る一塩基多型を簡便かつ信頼性高く検出することができ
る。

【００３５】本発明の第２の判定セットは、薬物代謝酵
素ＣＹＰ３Ａ５遺伝子上の一塩基多型の判定セットであ
って、上記本発明の第２のプライマーセット、あるい
は、上記本発明の第２の判定方法を用いることを特徴と
している。

【００３６】上記本発明の第２の判定セットによれば、
上記と同様に、＊６アレルに関する一塩基多型を簡便か
つ信頼性高く検出することができる。尚、本発明の第２
の判定セットとしては、本発明の第２のプライマーセッ
トを含むものであればよく、さらに、ＰＣＲ法に用い
る酵素や試薬、制限酵素消化反応に用いる酵素や試
薬、ゲル電気泳動に用いる酵素や試薬、などを含むも
のであってもよい。

【００３７】

【発明の実施の形態】本発明の実施の一形態は、以下に
説明するＰＣＲ−ＲＦＬＰ（restriction fragment len
gth polymorphism）法を用いたＣＹＰ３Ａ５遺伝子上の
一塩基多型の判定方法である。

【００３８】（１）ＰＣＲ−ＲＦＬＰ法を用いた判定方
法の概要 本実施形態の判定方法は、概略的に、 Ａ．薬物代謝酵素ＣＹＰ３Ａ５遺伝子上の＊３アレル
（または＊６アレル）に関する多型部位を含む領域を特
異的に増幅し得るように設計されたプライマーを用い
て、被検体由来のＤＮＡをＰＣＲ法により増幅し、 Ｂ．得られた増幅ＤＮＡ断片を制限酵素Ｄｄｅ１によっ
て消化し、 Ｃ．得られた断片をゲル電気泳動し、その泳動パターン
から一塩基多型（ＳＮＰ）を判定する、という判定方法
である。

【００３９】上記ＰＣＲ法において、＊３アレルに関す
る多型部位を含む領域を増幅するプライマーセットとし
ては、好ましくは、下記イ）およびロ）のプライマーセ
ットを用いることができる。 イ）5'ctttaaagagctcttttgtctctca 3' ロ）5'ccaggaagccagactttgat 3' 上記イ）およびロ）のプライマーの塩基配列は、それぞ
れ配列番号１および配列番号２に示される塩基配列であ
り、図１（ａ）にも、両プライマーの塩基配列が示され
る。尚、上記イ）の塩基配列において、下線を施した２
２番目の位置が改変部位にあたり、遺伝子配列上の本来
の塩基Ｔ（チミン）をＣ（シトシン）に改変したものに
なっている。

【００４０】また、上記ＰＣＲ法において、＊６アレル
に関する多型部位を含む領域を増幅するプライマーセッ
トとしては、好ましくは、下記ハ）およびニ）のプライ
マーセットを用いることができる。 ハ）5'gtgggtttcttgctgcatgt 3' ニ）5'gcccacatacttattgagag 3' 上記ハ）およびニ）のプライマーの塩基配列は、それぞ
れ配列番号３および配列番号４に示される塩基配列であ
り、図１（ｂ）にも、両プライマーの塩基配列が示され
る。

【００４１】（２）＊３アレルに関する一塩基多型の検
出 上記イ）およびロ）のプライマーセットを用い、被検体
由来のＤＮＡをＰＣＲ法により増幅すると、２００ｂｐ
のＤＮＡ断片が得られる。このＤＮＡ断片を制限酵素Ｄ
ｄｅ１により消化すると、ＤＮＡ断片は多型部位の塩基
に応じて異なるパターンで切断される。詳細には、図２
（ａ）に示すように、＊３アレルの場合、同図の矢印で
示す位置２か所で切断される結果、２２ｂｐ、１０７ｂ
ｐ、７１ｂｐの３つのＤＮＡ断片が生ずる（尚、同図で
は、上記イ）のプライマーを「3A5 6956Fm」と記載し，
上記ロ）のプライマーを「3A5 7155R」と記載してい
る）。従って、被検体の遺伝子型が＊３アレルのホモ接
合体（＊３／＊３型）の場合、ゲル電気泳動を行うと、
その泳動パターンは、理論的には、図３（ａ）の＊３／
＊３のレーンに示されるパターンになる。

【００４２】一方、＊１アレルの場合は、図２（ａ）の
右側の矢印で示す１か所で切断される結果、１２９ｂ
ｐ、７１ｂｐの２つのＤＮＡ断片が生ずる。従って、被
検体の遺伝子型が＊１アレルのホモ接合体（＊１／＊１
型）の場合，ゲル電気泳動を行うと、その泳動パターン
は、理論的には、図３（ａ）の＊１／＊１のレーンに示
されるパターンになる。

【００４３】さらに、＊１アレルおよび＊３アレルのヘ
テロ接合体（＊１／＊３型）の場合は、＊１アレルの場
合に生ずる上記２つのＤＮＡ断片、および＊３アレルの
場合に生ずる上記３つのＤＮＡ断片の両方が生ずるか
ら、ゲル電気泳動を行うと、その泳動パターンは、理論
的には、図３（ａ）の＊１／＊３のレーンに示されるよ
うな４つのバンド（１２９、１０７、７１、２２ｂｐ）
から構成されるパターンになる。

【００４４】図４（ａ）は、実際に、＊１／＊１型、＊
１／＊３型、＊３／＊３型の各遺伝子型について、本実
施形態のＰＣＲ−ＲＦＬＰ法を用いた判定方法を行い、
ゲル電気泳動した結果を示す写真である。図中、レーン
２・３は、＊１／＊１型のサンプル、レーン４・５は、
＊１／＊３型のサンプル、レーン６・７は、＊３／＊３
型のサンプルであり、レーン１は、ＰＣＲ法により増幅
したＤＮＡ断片を制限酵素により消化せずに、そのまま
ゲル電気泳動したサンプルである。同図に示すように、
＊１／＊１型、＊１／＊３型、＊３／＊３型の実際の各
泳動パターンでは、２２ｂｐのバンドを可視化すること
はできなかったが、２２ｂｐのバンドが見えなくても、
１２９ｂｐおよび１０７ｂｐのバンドの有無で各遺伝子
型を容易に判別できるので、特に不都合はないと考えら
れる。

【００４５】このように、本実施形態の判定方法によれ
ば、被検体の遺伝子型が＊１／＊１型であるか、＊１／
＊３型であるか、＊３／＊３型であるかに応じて、互い
に異なる泳動パターンが得られるため、被検体の遺伝子
型が＊３アレルのホモ接合体であるか、ヘテロ接合体で
あるか、あるいは、＊３アレルを持っていないかを容易
に判別できる。

【００４６】（３）＊６アレルに関する一塩基多型の検
出 上記ハ）およびニ）のプライマーセットを用い、被検体
由来のＤＮＡをＰＣＲ法により増幅すると、２３７ｂｐ
のＤＮＡ断片が得られる。このＤＮＡ断片を制限酵素Ｄ
ｄｅ１により消化すると、ＤＮＡ断片は多型部位の塩基
に応じて異なるパターンで切断される。詳細には、図２
（ｂ）に示すように、＊６アレルの場合、同図の両側の
矢印で示す位置２か所で切断される結果、７４ｂｐ、１
２８ｂｐ、３５ｂｐの３つのＤＮＡ断片が生ずる（尚、
同図では、上記ハ）のプライマーを「3A5 14505F」と記
載し，上記ニ）のプライマーを「3A5 14741R」と記載し
ている）。従って、被検体の遺伝子型が＊６アレルのホ
モ接合体（＊６／＊６型）の場合、ゲル電気泳動を行う
と、その泳動パターンは、理論的には、図３（ｂ）の＊
６／＊６のレーンに示されるパターンになる。

【００４７】一方、＊１アレルの場合は、図２（ｂ）の
矢印で示す３か所で切断される結果、７４ｂｐ、１０３
ｂｐ、２５ｂｐ、３５ｂｐの４つのＤＮＡ断片が生ず
る。従って、被検体の遺伝子型が＊１アレルのホモ接合
体（＊１／＊１型）の場合，ゲル電気泳動を行うと、そ
の泳動パターンは、理論的には、図３（ｂ）の＊１／＊
１のレーンに示されるパターンになる。

【００４８】さらに、＊１アレルおよび＊６アレルのヘ
テロ接合体（＊１／＊６型）の場合は、＊１アレルの場
合に生ずる上記４つのＤＮＡ断片、および＊６アレルの
場合に生ずる上記３つのＤＮＡ断片の両方が生ずるか
ら、ゲル電気泳動を行うと、その泳動パターンは、理論
的には、図３（ｂ）の＊１／＊６のレーンに示されるよ
うな５つのバンド（１２８、１０３、７４、３５、２５
ｂｐ）から構成されるパターンになる。

【００４９】このように、本実施形態の判定方法によれ
ば、被検体の遺伝子型が＊１／＊１型であるか、＊１／
＊６型であるか、＊６／＊６型であるかに応じて、互い
に異なる泳動パターンが得られるため、被検体の遺伝子
型が＊６アレルのホモ接合体であるか、ヘテロ接合体で
あるか、あるいは、＊６アレルを持っていないかを容易
に判別できる。

【００５０】尚、図４（ｂ）は、実際に、得られたサン
プルについて、本実施形態のＰＣＲ−ＲＦＬＰ法を用い
た判定方法を行い、ゲル電気泳動した結果を示す写真で
ある。図中、レーン２〜４は、＊１／＊１型のサンプル
であり、今回得られたサンプルには、＊６アレルのホモ
接合体およびヘテロ接合体は存在しなかった。レーン１
は、ＰＣＲ法により増幅したＤＮＡ断片を制限酵素によ
り消化せずに、そのままゲル電気泳動したサンプルであ
る。同図に示すように、＊１／＊１型の実際の泳動パタ
ーンでは、２５ｂｐのバンドを可視化することはできな
かったが、これらのバンドが見えなくても、１２８ｂｐ
および１０３ｂｐのバンドの有無で各遺伝子型を容易に
判別できると考えられる。

【００５１】（４）本実施形態の判定方法の利点 本実施形態の判定方法は、以下の利点・特徴を有してお
り、ＣＹＰ３Ａ５遺伝子上の上記２つの一塩基多型の簡
便で信頼性の高い判定方法を提供するものである。 １．上記＊３アレルに関する一塩基多型の検出において
は、多型部位の塩基に応じて異なるパターンで切断され
る有用な制限酵素認識部位が存在しないため、一方のプ
ライマーにおける１つの塩基を本来の塩基とは異なる塩
基に改変し、ミスマッチプライマーを作製している。こ
れにより、有用な制限酵素認識部位を導入することがで
き、上記ＰＣＲ-ＲＦＬＰ法を用いて＊３アレルに関す
る一塩基多型を容易に検出することができる。 ２．上記ＰＣＲ-ＲＦＬＰ法を用いた判定方法によれ
ば、ＣＹＰ３Ａ５遺伝子上の上記２つの一塩基多型を含
む領域を特異的に増幅できる。尚、ＣＹＰ３Ａ５以外の
ＣＹＰ３Ａ酵素であるＣＹＰ３Ａ４およびＣＹＰ３Ａ７
も、ＣＹＰ３Ａ５とは相同性が高いタンパク質である
が、上記ＣＹＰ３Ａ４遺伝子およびＣＹＰ３Ａ７遺伝子
については、上記ＰＣＲ-ＲＦＬＰ法によって仮に増幅
ＤＮＡ断片が得られたとしても、図３（ａ）（ｂ）に示
すように、理論的には、ＣＹＰ３Ａ５の遺伝子型のいず
れの泳動パターンとも異なる泳動パターンが得られる。
従って、上記ＰＣＲ-ＲＦＬＰ法を用いた判定方法によ
れば、ＣＹＰ３Ａ５遺伝子上の上記２つの一塩基多型の
みを正確に検出することができる。 ３．制限酵素にＤｄｅ１を用いることで、＊３アレルに
関する一塩基多型の検出の場合は、＊１アレルおよび＊
３アレルのいずれのアレルでも切断される共通の制限酵
素認識部位が存在することになり、＊６アレルに関する
一塩基多型の検出の場合も、＊１アレルおよび＊６アレ
ルのいずれのアレルでも切断される共通の制限酵素認識
部位が存在することになる。従って、上記ＰＣＲ-ＲＦ
ＬＰ法を用いた判定方法によれば、制限酵素による消化
反応の信頼性を確保でき、その反応効率の調節も容易で
ある。 ４．上記ＰＣＲ-ＲＦＬＰ法を用いた判定方法によれ
ば、特殊装置として、ＰＣＲ装置（遺伝子増幅装置）を
必要とするだけなので、容易に本判定方法を実施でき
る。

【００５２】（５）本実施形態の判定方法の利用 前述のように、ＣＹＰ３Ａ５の上記２つの一塩基多型
が、ＣＹＰ３Ａ酵素の薬物代謝能の個体差を生み、これ
まで知られていたＣＹＰ３Ａ４が代謝酵素とされる薬物
の血中濃度がばらつく要因の一つとなっている可能性が
ある。いずれにせよ、ＣＹＰ３Ａ酵素による薬物代謝は
臨床薬理学の分野で非常に重要な位置を占めることか
ら、本実施形態の判定方法は、例えば、１）新薬開発段
階における臨床試験での利用、２）薬物代謝異常の原因
を調べる検査・診断での利用、３）投与する薬の種類や
薬の投与量を決定するための治療段階での利用、といっ
た幅広い利用が期待できる。

【００５３】より具体的には、開発段階の薬物、既存薬
物、あるいはその他の化学物質がＣＹＰ３Ａ５の代謝薬
物かどうかの判定に、本判定方法を利用できる。例え
ば、ヒトに対象薬物を投与したとき、薬物動態のばらつ
きと本判定の結果とを照合して関連性が認められた場
合、ＣＹＰ３Ａ５の代謝薬物である可能性が高いと判定
できる。このような本判定方法により、これまでＣＹＰ
３Ａ４の代謝薬物とされていた薬物も、ＣＹＰ３Ａ５の
代謝薬物であることが明らかにされるかもしれない。ま
た、米企業Gentest社が公表する、ＣＹＰ３Ａ５の基質
等とされる薬物および化学物質（図５参照）について
も、本判定方法を利用してＣＹＰ３Ａ５の代謝薬物かど
うか確認することができる。

【００５４】また、薬物代謝異常などの患者に対してＣ
ＹＰ３Ａ５の遺伝子型を検査する際にも本判定方法を利
用できるし、さらには、ＣＹＰ３Ａ５の代謝薬物を投与
する際にも、本判定方法を利用して患者のＣＹＰ３Ａ５
の遺伝子型を調べ、薬の種類や薬の投与量を決定するこ
とができる。

【００５５】また、後述のように、ＣＹＰ３Ａ５遺伝子
上の上記２つの一塩基多型について、各集団・各民族に
おける、あるいは民族間での大規模な頻度分布の調査
に、本判定方法を利用することができる。

【００５６】

【実施例】以下、本発明の実施例について説明する。

【００５７】（ａ）被検体由来のＤＮＡの調製 ＰＣＲ法の鋳型となる被検体由来のＤＮＡを調製するた
め、健康な日本人男性２００名の末梢血白血球から通常
のフェノール・クロロホルム法を用いてゲノムＤＮＡを
単離した。尚、被検体由来のＤＮＡを調製する際、その
由来組織、細胞は特に限定されるものではない。また、
被検体由来のＤＮＡは、単離したゲノムＤＮＡのほか、
そのゲノムＤＮＡを二次的に処理して得られたＤＮＡで
あってもよい。

【００５８】（ｂ）＊３アレルに関するＳＮＰを含む領
域のＰＣＲ法による増幅 配列番号１および２に示されるプライマーセットを作成
し、これを用いて＊３アレルに関するＳＮＰを含む領域
をＰＣＲ法により増幅した。

【００５９】上記ＰＣＲ法の反応溶液の組成は、下記表
１に示すとおりである。尚、表１において、Primer-For
wardとは、配列番号１に示されるプライマーを、Primer
-Reverseとは、配列番号２に示されるプライマーを、Ta
qGとは、AmpliTaq Gold(Perkin-Elmer,Branchbrug,NJ)
を、Templateとは、鋳型に用いた上記ゲノムＤＮＡをそ
れぞれ意味する。尚、本実施例では、反応溶液の全体量
は２５μｌとしたが、これより少量、例えば全体量を５
〜２０μｌ程度で行ってもよく、このように少量にする
ことで、費用を節約し、時間を短縮できる。

【００６０】

【表１】

【００６１】また、上記ＰＣＲ法の反応条件は、下記表
２に示すように、まず９５℃で１０分間変性させた後、
９４℃で３０秒、５６℃で３０秒、７２℃で３０秒のサ
イクルを３７回行って、＊３アレルに関するＳＮＰを含
む領域を増幅し、７２℃で５分最後の伸長を行った。

【００６２】

【表２】

【００６３】尚、ＰＣＲ法に使用するＤＮＡポリメラー
ゼやバッファーの種類・量などは特に限定されるもので
はない。また、ＰＣＲ法の反応条件についても上記の条
件に限定されるものではなく、所望の条件で行えばよ
い。

【００６４】次に、上記ＰＣＲ法により得られたＰＣＲ
産物５μｌを、下記表３に示すように、５ユニットのＤ
ｄｅ１により３７℃で２〜３時間消化させた後、３％の
アガロースゲルにて電気泳動を行った。尚、制限酵素に
よる消化反応において、反応溶液の組成、全体量、反応
温度、反応時間などは特に限定されるものではない。

【００６５】

【表３】

【００６６】図４（ａ）は、上記ゲル電気泳動を行った
結果を示す写真である。上述のように、同図に示される
実際の泳動パターンでは、被検体の遺伝子型が＊１／＊
１型であるか、＊１／＊３型であるか、＊３／＊３型で
あるかに応じて、互いに泳動パターンが異なる。従っ
て、被検体の遺伝子型が＊３アレルのホモ接合体である
か、ヘテロ接合体であるか、あるいは、＊３アレルを持
っていないかを容易に判定できる。

【００６７】尚、上記判定方法の有効性を確かめるた
め、上記ＰＣＲ法により得られたＰＣＲ産物についてシ
ークエンス解析を行い、その遺伝子型を確認した。シー
クエンス解析には、ABI PRISM BigDyeTerminator Cycle
Sequencing Ready Reaction kit(PE Biosystems社製)お
よびABI PRISM 310 DNAシークエンサー(PE Biosystems
社製)を用いた。シークエンス解析の結果は、上記判定
方法の結果と一致し、本判定方法の有効性が確かめられ
た。

【００６８】（ｃ）＊６アレルに関するＳＮＰを含む領
域のＰＣＲ法による増幅 配列番号３および４に示されるプライマーセットを作成
し、これを用いて＊６アレルに関するＳＮＰを含む領域
をＰＣＲ法により増幅した。

【００６９】上記ＰＣＲ法の反応溶液の組成は、上記表
１に示すとおりである。ただし、表１において、Primer
-Forwardとは、この場合配列番号３に示されるプライマ
ーを、Primer-Reverseとは、この場合配列番号４に示さ
れるプライマーをそれぞれ意味する。尚、本実施例で
は、反応溶液の全体量は２５μｌとしたが、これより少
量、例えば全体量を５〜２０μｌ程度で行ってもよく、
このように少量にすることで、費用を節約し、時間を短
縮できる。

【００７０】また、上記ＰＣＲ法の反応条件は、概ね上
記表２に示すとおりであるが、５６℃で３０秒のステッ
プについては、５６℃ではなく、５８℃で３０秒とし
た。他の反応条件は、上記表２の条件と同じである。

【００７１】尚、ＰＣＲ法に使用するＤＮＡポリメラー
ゼやバッファーの種類・量などは特に限定されるもので
はない。また、ＰＣＲ法の反応条件についても上記の条
件に限定されるものではなく、所望の条件で行えばよ
い。

【００７２】次に、上記ＰＣＲ法により得られたＰＣＲ
産物５μｌを、上記表３に示すように、５ユニットのＤ
ｄｅ１により３７℃で２〜３時間消化させた後、３％の
アガロースゲルにて電気泳動を行った。尚、制限酵素に
よる消化反応において、反応溶液の組成、全体量、反応
温度、反応時間などは特に限定されるものではない。

【００７３】図４（ｂ）は、上記ゲル電気泳動を行った
結果を示す写真である。上述のように、図中、レーン２
〜４は、＊１／＊１型のサンプルであり、今回得られた
サンプルには、＊６アレルのホモ接合体およびヘテロ接
合体は存在しなかった。しかしながら、図３（ｂ）に示
すように、被検体の遺伝子型が＊１／＊１型であるか、
＊１／＊６型であるか、＊６／＊６型であるかに応じ
て、理論的には互いに泳動パターンが異なる。従って、
被検体の遺伝子型が＊６アレルのホモ接合体であるか、
ヘテロ接合体であるか、あるいは、＊６アレルを持って
いないかの判定を容易に行うことができると考えられ
る。

【００７４】尚、上記判定方法の有効性を確かめるた
め、上記ＰＣＲ法により得られたＰＣＲ産物についてシ
ークエンス解析を行い、その遺伝子型を確認した。シー
クエンス解析には、ABI PRISM BigDyeTerminator Cycle
Sequencing Ready Reaction kit(PE Biosystems社製)お
よびABI PRISM 310 DNAシークエンサー(PE Biosystems
社製)を用いた。シークエンス解析の結果は、上記判定
方法の結果と一致し、本判定方法の有効性が確かめられ
た。

【００７５】（ｄ）本判定方法による日本人のＣＹＰ３
Ａ５の遺伝子型の頻度解析 本判定方法を利用して、健康な日本人成人男性２００名
において、ＣＹＰ３Ａ５遺伝子に関する遺伝子型の頻度
解析の調査を行った。その結果を下記表４に示す。

【００７６】

【表４】

【００７７】このように、＊３アレルの頻度は、７６.
７５％（４００のうち３０７）であり、＊１アレルの頻
度は、２３.２５％（４００のうち９３）であった。＊
６アレルは検出されなかった。＊３アレルに関する一塩
基多型について、＊１アレルを野生型、＊３アレルを変
異型とすると、野生型のホモ接合体（＊１／＊１）頻度
は７.０％（１４／２００）、ヘテロ接合体（＊１／＊
３）頻度は３２．５％（６５／２００）、変異型のホモ
接合体（＊３／＊３）頻度は６０.５％（１２１／２０
０）であった。これらの結果は、Hardy-Weinberg equil
ibriumに従った値を示しており、本判定方法の有効性を
裏付けるものである。

【００７８】

【発明の効果】本発明によれば、以上のように、薬物代
謝酵素ＣＹＰ３Ａ５遺伝子上の一塩基多型の簡便で信頼
性の高い判定方法を提供することができる。

【００７９】それゆえ、本発明は、１）新薬開発段階に
おける臨床試験での利用、２）薬物代謝異常の原因を調
べる検査・診断での利用、３）投与する薬の種類や薬の
投与量を決定するための治療段階での利用、といった幅
広い利用が期待できる。

【００８０】

【配列表】 SEQUENCE LISTING <110> The New Industry Research Organization <120> Novel detection assay for Single Nucleotide Polymorphism (SNP) on a gene encoding drug-metabolizing enzyme CYP3A5 <130> P130904 <160> 5 <170> PatentIn Ver. 2.1 <210> 1 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Artificially Synthesized Primer Sequence <400> 1 ctttaaagag ctcttttgtc tctca 25 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Artificially Synthesized Primer Sequence <400> 2 ccaggaagcc agactttgat 20 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Artificially Synthesized Primer Sequence <400> 3 gtgggtttct tgctgcatgt 20 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Artificially Synthesized Primer Sequence <400> 4 gcccacatac ttattgagag 20 <210> 5 <211> 8200 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 5 taggagatac ccacgtatgt accacccagc ttaacgaatg ctctactgtc atttctaacc 60 ataatctctt taaagagctc ttttgtcttt cagtatctct tccctgtttg gaccacatta 120 cccttcatca tatgaagcct tgggtggctc ctgtgtgaga ctcttgctgt gtgtcacacc 180 ctaatgaact agaacctaag gttgctgtgt gtcgtacaac taggggtatg gattacataa 240 cataatgatc aaagtctggc ttcctgggtg tggctccagc tgcagaatcg ggctagtgaa 300 gtttaatcag ctccgttgtc cccacacaga acgtatgaag gtcaactccc tgtgctggcc 360 atcacagatc ccgacgtgat cagaacagtg ctagtgaaag aatgttattc tgtcttcaca 420 aatcgaaggg taagcatcca ttttttgaaa tttaaataat gattgatcca ctgattaaat 480 ttttattttg aaaaaaacat atattcacag aaggttacct aaaaaatgta caggaaggtt 540 ccatgtactc ttcatcctgt cccgcccagt ggtaacatct tgcaatcttg tatattgcaa 600 tatatatcta gtatattcat attatcaggt tggcacaaaa gttaaaatgg caaactacag 660 gctgggcata atggctcatg cctgtaatcc cagcactttg ggaggccgag gcaggtggat 720 cacgaggtca ggagttcgag atcagcctga ccaacatggt gaaaccccat ctctactaaa 780 aatacaaaaa ttagctgcgt gtggtggcat gcgcctgtag tcccagctac tcagtagtct 840 gagacaggag aatcgcttga acctgggagg cggaggttgc agtgagccga gatcacgcca 900 ttatactcca gtctgggcaa cccaatgaga ctccatctca aacaacaaca acaacaacaa 960 caacaaaaac cggcaaactg caataacttt tgcaccaacc taatactata gtacaggaaa 1020 ttgactttga tatagtttac agagcttttc agatttcacc agttttacat gcccttgttt 1080 gtgtgtgttt atgtgtgtgg gtagttctaa gcaatttttc acattcgtag atttgtgcaa 1140 cgaccagcac catcaagatg cagacccatt ccgtcaccat gtggctccct cctgctgtcc 1200 tacagtcaca acatggagtt tgtctttttc tctgacaggt tctatatcag agcaaacttt 1260 tatttatttg aggaggccaa tgtattaata tttcctttta tggattgttc ttttggtgtt 1320 aagtctgaaa atcctttgct tagccctcct tcctacattg ctttttctaa gagttatata 1380 gtttaacact ttacaaaatg taactctatt acccattttg tgttaatatt tgcataagtt 1440 atgagattta gatcaaggtt cattttctgt ggactatggc tgtccaaatg ttccaacacc 1500 attttggaaa ggtaggcata ttgtcaaaac tcagctgagt atattttgtg aatctatttc 1560 ttattgttta ctcctccact aataccacac tgtggtgact ctagtagctg tacagtaact 1620 cttaacatca tatagggcaa ttctttccac tttattgatt tatattttca gaatggcttt 1680 agcttttctt gtcccttgcc tttccataaa aattcagaat aagcttgtaa gtgtctacaa 1740 acaaacctgc cataattttg ataagaatta aagcagaggt gtccaatctt ttggcttccc 1800 tgggccacag tggaagaaga agtgtcgtgg gccacacata aaatacacac acacacacac 1860 acacacacac acacacacac acacacacac aaatggtctg tgtatagttt tcattatata 1920 tctaccacca cagataagca aaaatgtcct tgcataataa tcctaattat gcactgcccc 1980 attcagaggg tctttcaaaa tcattgaaca ggttccaagt ttgcaatcac tgatacagaa 2040 aatgtacata tctagctaaa cttcactact tttttgatat tttttattat aaaagaaaag 2100 agaacaacat aaaactagtg gggtacttga cattgttttt gagaaactaa tccatcagta 2160 tctggcttga tggaagtagt tgcaattctc agtgagttct caaggtgctc atcagatatt 2220 ttggttctaa ttttactctt cgtgttcttc atccttgaaa atagtagctc acaaatgtaa 2280 gtgctgccaa aaagcaatga catgaacaag gtgtgattgt gaagcaaggg atatttgtca 2340 ttgggaagac aggtcttaca aaagtccagt aaagaggcaa aatcaaattt ttctataagt 2400 tgaacatcag attgcagctc taggcattcc atttcaaaat tgccaggtaa catatatatg 2460 tcgactgaaa atggagttgc aaatatacca aaatattgat gattttttca gaaatcttga 2520 aatacctgtt ttcaaattcc 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attttaaatt agcagtttta ctctccaaac gtctttcaat 3420 agatttccca atttctccaa ttctcctggc tatagtctgg tgagacaaac tgattttaga 3480 aatatcagtt tctcaaggca aataatatct accacatctt ccagacattg cttaataaac 3540 tcaccatcag taaatggttt tgattttttt gctattaaat ttgctaccac ataactaggt 3600 tttaccttac gattgagtcc gagttgtaac tttttaaaaa atcttttttg ttgaaaagac 3660 agactttttt tcagttctgc tattttgtcc ttacaacaca tacacaccaa atttgtcagc 3720 acgtttttgc atataatgcc tcttcaaatt gtagtctttg aaaactggca caaattccgt 3780 ggaaattaag cagagtgctt cgctatttgc ctcaacaaga aaaagtcatt tgtccacttt 3840 tcattgaaca atcttccttc atccataatt tttgtttttt agggttttct ttttaagaca 3900 ttgtggaagc cattctggaa ttaaaagcat tataatagat aagcaactat atttactttt 3960 attatggaaa ttaacagata ggaaaataga acagaaagca aggtttaata atcaaataag 4020 aatacttaca tgtcttctaa ataatattaa acacctatca tctacaaagg taggttgaaa 4080 tattattgat aattgctggg ttttacttgc caaattgcca caaacacacc taatacctga 4140 cagtgtcaat tcaactgtcc gtgattagaa gataacacac tggaagtcgc acaccaccat 4200 aaaactgaag ccacacatgc gtacaaatgg cgacagtgtc tggtgtacag cagcgctctg 4260 ccttgtccag aatacacact tgaattcttt gtcacaattc acttcacgtg gcactgcaat 4320 agcgtcctct cgctctttgt tagttaattt taatggcttt taatttcttc ttgctgaact 4380 gtttgcaatt ataatgcaaa ttatggatac tagtccatta tttgtggatg tgacatactc 4440 tgattacccc tttccattcc attgttgtct acgaagttca cacttgagaa tcacatagtc 4500 aaattacaaa attacaaaaa aaattgcaaa aaaactcaaa atgttttaag aaagtttcca 4560 catttgtatt gggatacatt caaagccatc ctggactgca tgaggcctgc aggccacaag 4620 ttggacaagc ttgaattaaa ccaatagaac aatttgggta taatctatat ctttactatg 4680 ttcagccttt catcccgtga atatagtatg cctctccatt tctttagctt ttattacttt 4740 cctcaacatt ttatagtttt cagcatagag gtcctgtaca tcttttgtta gatttacacc 4800 agaaatattt catttttgtt ggagtaactg taaatgatac tgtttttctt gtattttcag 4860 atattgatta ttgttacata gaaatgtgaa taattttgtt tgttgatctt gtatcctata 4920 gccttgcaga acttacctat tcgttctaga aatttttttg tatattcctt gacattttat 4980 acattgacaa ttatgtcacc tgaaaataga gacaattcta ttatttcctt tccaatctgt 5040 atgcctttta tttctttttc ttgtctagtg tattaagaca tcaggtatgc tctttagtaa 5100 gaatgttgag agtgggcatt ttttagttct tcttgatctt ggaaaaacca ttcagtcctt 5160 catcattaaa tgtgatttaa ctgaatgatt tttttacaga ttgtctttat caaatgaagg 5220 aactgtctct ctcttcctag tttattgaga ttttatcatg acagctggaa gtacacattt 5280 taaaacaaaa catagttgtg gaagataaga gaaagttcca agcatgctgg cttgatagtc 5340 cagccccaag ttgggaaaag taattatccc tttctttttc cttctattta tggaataaaa 5400 aattaagaga aaagaatttt caaggaaatt gcattattcc ttcaaaacag gtttctagtc 5460 tttaagtatt acctactttt caaaaaaaaa tcaccacatc atggcatccc tttttcaagt 5520 tgcccatgct gtaggtgtat taaagacaga gctggtctga ggcaacatac agtctgccca 5580 tctgtcacca atccttttct actctgcaca ctcctgggga agggctaggt cttgttcctg 5640 tctattccac tggaagaaca gttccctacc acgtggagca tttgcaatta aaaggagact 5700 gagatataga ggcaggagac cacaccagat ggctgggtct ccccactccc acccccgccc 5760 cacatacact cagaagaggc taggcatcta ggatctccat tgagcatctt gaatatggct 5820 tgccataata tcatatacag tcaataaata tttgttaaat aaggatgcct cttcaatata 5880 ttttgtgcaa ccatgaagat caccacaact aatgtgagaa aaaatgtttc tgttgaactc 5940 tagtctttag gcccagtggg atttatgaaa agtgccatct ctttagctga ggatgaagaa 6000 tggaagagaa tacggtcatt gctgtctcca accttcacca gcggaaaact caaggaggta 6060 tgaaaataag atgagtctta attagaaatg taaagaatga atctggggac aggtagaaag 6120 taagatcaca gtccgtttcc aaggggtagt ccactgagtt cgagcttcct aaaaatggtc 6180 ttttatcttt atgtacagaa aagacatcac aaaattcatt acaaaatgtc acttactgct 6240 ccatgctgga gaaagccata tccttctggg acttgagtct gcacatttaa ctacaggtac 6300 tgatctgttt tgtgcttaga tgttccccat cattgcccag tatggagatg tattggtgag 6360 aaacttgagg cgggaagcag agaaaggcaa gcctgtcacc ttgaaagagt aagtaggagc 6420 acagccatgg ggttctgagc tgtcatgagc ccttccagct gcctgccatg gagtcgacag 6480 tcgcactgtt gggttactcc agtgaccaga caaaagcagg gcagcgctgc aactccaaag 6540 agccacctaa gagggagtgg ctcccatgag gcggcaagtc agcaagggaa aagggccttc 6600 tctcctgtgc acaggagcca ggatttactt atctgttaac ttgtcaccat aaatattctg 6660 ggagattaaa tacatacttt agaaattaaa aaaacatgat tgtatcaaag ttttgagtgt 6720 agtggatatg gaactgtggg taagcaagca tttggtactt gttgccttgc attgggtaag 6780 atgggaaagt tacaatgggg aacttggaac aatttcaatc ccttcatggt ttttctgaga 6840 atatcagcaa actatgaact attaaacctt cccactactt ccttttcctc caatctcaaa 6900 aaagaaaggg tgctagaaat gctatgtgta gagcaagcct attatttgct gtctacaatg 6960 gtatgtgctt caattatgca ggaacgacag gtgtaatctg agcctgtcct gttcagactt 7020 gggacatgtg gtcactcagt tttgggttct ccaaatcaat gttggagaga tctatttttt 7080 ttaaccagaa cattcttgat tgtcacatct tacaaaaatg actctgctct cagcgcaact 7140 tcaggtcaga ggagctgggg atagtggggt tttccagagc attagcaggg agtgtagaga 7200 ataaaggatg atatttctag gaactcagaa cagggtgtta ctgttttgta aagtgttgaa 7260 gaggaattgg ctctgggcat agagtctgta gtcagacaac gccacctttc ttgaatccac 7320 taggaagagt taattattct actcttgttc tgctgaagca cagagcttac atatcttata 7380 tcatccacac tcaacacatg ctactgtagt tgtctgataa tgggtctctg tcttcctatg 7440 actgggctcc ttgacctcag aggtgagtct aactcagctt ggtgtctcca tcacccccag 7500 catagggcca gctccatcac tggcaccaga taaccacctt ctgagggagt agatggaaga 7560 tgattcagca gatagttctg aaagtctgtg gctctttatg tgtcttgact ggatatgtgg 7620 gtttcttgct gcatgtatag tggaaggacg gtaagaggtg ctgattttaa ttttccatat 7680 ctttctccac tcagcatctt tggggcctac agcatggatg tgattactgg cacatcattt 7740 ggagtgaaca tcgactctct caacaatcca caagacccct ttgtggagag cactaagaag 7800 ttcctaaaat ttggtttctt agatccatta tttctctcaa taagtatgtg ggctattatt 7860 tctttctctc tttttaaaaa taactgcttt cttgacatat aattcacata tcgtataatt 7920 catccactta aaaggtacaa ttccattgtt tttaagataa tcaaaaatat gtatgaccat 7980 tactattgta aactaaaatg tttttgtcaa tctagagccc tcacacactt tagctgtcaa 8040 caccccacca caaaccccac tgccctaagc atccaataat caactttctg cctctataga 8100 tttgcctatt ctggacactt catagaaata atatcattga tttttctctg ttgtttttta 8160 ttctctattt catgagttta ttttagtctg ttattttctt 8200

【図面の簡単な説明】

【図１】本発明の実施の一形態に係るプライマーセット
の塩基配列を示す図であって，（ａ）は、＊３アレルに
関する一塩基多型の検出に用いたプライマーセットの塩
基配列、（ｂ）は、＊６アレルに関する一塩基多型の検
出に用いたプライマーセットの塩基配列を示す。

【図２】本実施形態のＰＣＲ法により増幅されるＤＮＡ
断片およびその制限酵素認識部位を示す図であり、
（ａ）は、＊３アレルに関する一塩基多型の検出の際に
増幅されるＤＮＡ断片、（ｂ）は、＊６アレルに関する
一塩基多型の検出の際に増幅されるＤＮＡ断片を示す。

【図３】本実施形態のＰＣＲ-ＲＦＬＰ法によりゲル電
気泳動した場合の各泳動パターンを模式的に示す図であ
り、（ａ）は、＊３アレルに関する一塩基多型の検出の
際の各泳動パターン、（ｂ）は、＊６アレルに関する一
塩基多型の検出の際の各泳動パターンを示す。

【図４】本実施形態のＰＣＲ-ＲＦＬＰ法によりゲル電
気泳動した場合の実際の各泳動パターンを示す図であ
り、（ａ）は、＊３アレルに関する一塩基多型の検出の
際の各泳動パターン、（ｂ）は、＊６アレルに関する一
塩基多型の検出の際の各泳動パターンを示す。

【図５】ＣＹＰ３Ａ５の基質等とされる薬物および化学
物質の一覧を示す図である。

フロントページの続き Ｆターム(参考） 4B024 AA11 BA80 CA02 CA20 HA11 HA19 4B063 QA01 QA13 QA17 QA19 QQ04 QQ21 QQ42 QQ43 QQ79 QR08 QR32 QR35 QR40 QR42 QR62 QS16 QS25 QS36 QX01

Claims (8)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】薬物代謝酵素ＣＹＰ３Ａ５遺伝子上の一塩
   基多型のうち、＊３アレルに関する多型部位を含む領域
   を増幅し得るように設計された一対のプライマーセット
   であって、前記多型部位の塩基に応じて選択的に制限酵
   素認識部位が生ずるように、一方のプライマーにおける
   １または２以上の塩基を遺伝子配列上またはその相補配
   列上の本来の塩基とは異なる塩基に改変したことを特徴
   とするプライマーセット。
2. 【請求項２】配列番号１に示される塩基配列を有するプ
   ライマーまたは当該プライマーよりも１〜１０塩基分短
   いプライマーと、配列番号２に示される塩基配列を有す
   るプライマーまたは当該プライマーよりも１〜１０塩基
   分短いプライマーとからなることを特徴とする請求項１
   記載のプライマーセット。
3. 【請求項３】請求項１または２記載のプライマーセット
   を用いて増幅したＤＮＡ断片を制限酵素を用いて消化
   し、生じた断片の長さを調べることにより、一塩基多型
   の判定を行うことを特徴とする薬物代謝酵素ＣＹＰ３Ａ
   ５遺伝子上の一塩基多型の判定方法。
4. 【請求項４】制限酵素にＤｄｅ１を用いることを特徴と
   する請求項３記載の判定方法。
5. 【請求項５】請求項１または２記載のプライマーセッ
   ト、あるいは、請求項３または４記載の判定方法を用い
   ることを特徴とする薬物代謝酵素ＣＹＰ３Ａ５遺伝子上
   の一塩基多型の判定セット。
6. 【請求項６】薬物代謝酵素ＣＹＰ３Ａ５遺伝子上の一塩
   基多型のうち、＊６アレルに関する多型部位を含む領域
   を増幅し得るように設計された一対のプライマーセット
   であって、配列番号３に示される塩基配列を有するプラ
   イマーまたは当該プライマーよりも１〜１０塩基分短い
   プライマーと、配列番号４に示される塩基配列を有する
   プライマーまたは当該プライマーよりも１〜１０塩基分
   短いプライマーとからなることを特徴とするプライマー
   セット。
7. 【請求項７】請求項６記載のプライマーセットを用いて
   増幅したＤＮＡ断片を制限酵素Ｄｄｅ１を用いて消化
   し、生じた断片の長さを調べることにより、一塩基多型
   の判定を行うことを特徴とする薬物代謝酵素ＣＹＰ３Ａ
   ５遺伝子上の一塩基多型の判定方法。
8. 【請求項８】請求項６記載のプライマーセット、あるい
   は、請求項７記載の判定方法を用いることを特徴とする
   薬物代謝酵素ＣＹＰ３Ａ５遺伝子上の一塩基多型の判定
   セット。