JP3684921B2 - 骨粗鬆症薬剤感受性予測方法 - Google Patents
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Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、骨粗鬆症の治療において有用な情報を提供し得る新規なヒト由来試料の分析方法に関する。詳細には、本発明は、骨粗鬆症治療薬、特にビタミンＤ、エストロゲンおよびビタミンＫ2 のうちのいずれの薬剤の使用が最も有効な治療効果を示すかを予測するための、ヒト由来試料中のゲノムＤＮＡの遺伝子多型の分析方法に関する。また、本発明はヒト由来試料中のゲノムＤＮＡの遺伝子多型の組み合わせから、該試料が前記薬剤に対する感受性において特定の優先性を示す個人由来のものであると予測する方法に関する。さらに、本発明は上記の方法において使用し得る遺伝子多型分析用キットに関する。
【０００２】
【従来の技術】
骨粗鬆症は骨量（骨に含まれるカルシウムを中心としたミネラルの量）が減少し、かつ骨組織の微細構造が変化し、そのために骨が脆くなり骨折しやすくなった病態である。閉経後の女性や高齢の男性に多く、我が国の患者数は推定１，０００万人といわれている。人口の高齢化に伴い、今後も患者数は不可避的に増加するものと予測される。
【０００３】
現在、骨粗鬆症の治療薬として、カルシウム製剤、ビタミンＤ等の骨活性化薬、エストロゲン等の骨吸収抑制薬、ビタミンＫ等の骨形成促進薬など、種々の薬剤が用いられているが、その治療効果は患者によってまちまちであり、それらをどのように使い分けるかについての検討はほとんどなされていない。これらの治療薬は単剤投与が原則とされているので、どの治療薬が最も効果的であるかを調べるには、実際に１つの薬剤を数年間患者に投与して、その結果を見て判断するしかないのが現状であり、極めて非効率的である。
【０００４】
一方、近年の遺伝子研究から、いくつかの遺伝子の多型と患者の骨粗鬆症治療薬に対する感受性との関連が提唱されている。例えば、ビタミンＤ受容体（以下、ＶＤＲという）遺伝子の第８エクソンと第９エクソンの間のイントロン領域内でApa I により切断されない遺伝子型Ａは、同制限酵素によって切断される遺伝子型ａに比べてビタミンＤに対して高感受性であるとの報告がある〔例えば、特開平8-126497号公報および特開平8-126500号公報参照〕。
【０００５】
また、白木ら〔１９９７年骨代謝学会要旨集第５２頁〕には、ＶＤＲ遺伝子の多型とビタミンＤ感受性、エストロゲン受容体（以下、ＥＲという）遺伝子の多型とエストロゲン感受性およびアポリポ蛋白Ｅ（以下、ＡｐｏＥ）遺伝子の多型とビタミンＫ2 感受性について調べた結果、ＶＤＲ遺伝子型ＡＡＢ（Ｂは第８エクソンと第９エクソンの間のイントロン領域内でBsm I により切断されない遺伝子型）はａａｂｂに比べてビタミンＤ3 に対する感受性が有意に低く、またＥＲ遺伝子型ＰｐＸｘ（ＰおよびＸはそれぞれPvu IIおよびXba I で切断されない遺伝子型）は他の遺伝子型群に比べてエストロゲンに対する感受性が有意に高く、さらに、ＡｐｏＥ4 (+) 群はＡｐｏＥ4 (-) 群に比べてビタミンＫ2 に対する感受性が有意に低かったと記載されている。
【０００６】
さらに、ビタミンＤ結合蛋白（ＤＢＰ）遺伝子をHae III およびSty I で切断して得られるＲＦＬＰパターンがＧＣ２−２型のものは、他の群に比べてビタミンＤ類に対する感受性が高いと記載されている［特開平８−２０１３７３号公報］。
【０００７】
しかしながら、これらはいずれも１遺伝子の多型から１つの薬剤に対する感受性を予測するものであり、１つの薬剤について他の遺伝子型よりも感受性が高いか否かを予測するものでしかない。すなわち、ＶＤＲ遺伝子型がａａｂｂで且つＡｐｏＥ遺伝子型がＡｐｏＥ4 (-) である人は、他のＶＤＲ遺伝子型およびＡｐｏＥ遺伝子型を有する人に比べてビタミンＤおよびビタミンＫ2 に対する感受性が高いと予測されるが、それでは、このような遺伝子型を有する患者に対してビタミンＤを投与するのとビタミンＫ2 を投与するのとでは、どちらがより高い治療効果が得られるのかについては、依然として予測することができない。したがって、結局のところ、異なる薬剤のいずれに対して患者がより感受性が高いかを知るには、上述のように、実際に各薬剤を、１つの薬剤について数年間のスパンで順次患者に投与して結果を見るしかなかった。特に、エストロゲンは、治療効果は大きいが副作用も大きいため、感受性の低い患者への長期投与は患者のＱＯＬ（Quality of Life ）を著しく損なうおそれがあった。
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】
したがって、本発明の目的は、骨粗鬆症患者もしくは将来骨粗鬆症を発症する可能性のある人が、複数の骨粗鬆症治療薬のいずれに対してより高い感受性を有するかを予測する手段を提供することであり、それによって治療効果の低い薬剤の長期投与による病状の進行を回避し、患者のＱＯＬを向上させることである。
【０００９】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは上記目的を達成するために鋭意検討を重ねた結果、ゲノムＤＮＡを含有するヒト由来試料を、ＶＤＲ遺伝子、ＥＲ遺伝子およびＡｐｏＥ遺伝子の多型について分析することにより、得られる多型の組み合わせに基づいて、ビタミンＤ、エストロゲンおよびビタミンＫ2 のうちのいずれかの薬剤に対する感受性が、他の２つの薬剤に対する感受性に比べて高いことが予測可能であることを見出した。すなわち、他の遺伝子型に比べてビタミンＤに高感受性のＶＤＲ遺伝子型および他の遺伝子型に比べてエストロゲンに高感受性のＥＲ遺伝子型を有する場合、ビタミンＤよりもエストロゲンに対してより感受性が高く、他の遺伝子型に比べてエストロゲンに高感受性のＥＲ遺伝子型および他の遺伝子型に比べてビタミンＫ2 に高感受性のＡｐｏＥ遺伝子型を有する場合、ビタミンＫ2 よりもエストロゲンに対してより感受性が高く、他の遺伝子型に比べてビタミンＤに高感受性のＶＤＲ遺伝子型および他の遺伝子型に比べてビタミンＫ2 に高感受性のＡｐｏＥ遺伝子型を有する場合、ビタミンＤよりもビタミンＫ2 に対してより感受性が高い傾向を示すことを見出して、本発明に到達した。
【００１０】
すなわち、本発明は以下の通りである。
１．ヒトから採取した試料中に含まれるゲノムＤＮＡから、ビタミンＤ受容体遺伝子、エストロゲン受容体遺伝子およびアポリポ蛋白Ｅ遺伝子のそれぞれの遺伝子多型を分析し、これらの遺伝子多型の組み合わせに基づいて、該試料が複数の骨粗鬆症治療薬に対する感受性において特定の優先性を示す個人由来のものであると予測することを特徴とする骨粗鬆症薬剤感受性予測方法。
２．ビタミンＤ受容体遺伝子、エストロゲン受容体遺伝子およびアポリポ蛋白Ｅ遺伝子の遺伝子多型の組み合わせが、[B(-) X(-) 4(-)], [B(-) X(-) 4(+)], [B(-) X(+) 4(-)], [B(-) X(+) 4(+)], [B(+) X(-) 4(-)], [B(+) X(-) 4(+)], [B(+) X(+) 4(-)]および[B(+) X(+) 4(+)]からなる群より選択されるいずれかである上記１の方法（ここで、B は第８エクソンと第９エクソンの間のイントロン領域内でBsm I により切断されないビタミンＤ受容体対立遺伝子を、X は第１エクソンと第２エクソンの間のイントロン領域内でXba I により切断されないエストロゲン受容体対立遺伝子を、4 はＡｐｏＥ4 型アポリポ蛋白Ｅ対立遺伝子をそれぞれ表し、(+) および(-) はその対立遺伝子を有するおよび有しないことをそれぞれ表している）。
３．複数の骨粗鬆症治療薬がビタミンＤ、エストロゲンおよびビタミンＫ2 である上記１または２の方法。
４．ビタミンＤ受容体遺伝子、エストロゲン受容体遺伝子およびアポリポ蛋白Ｅ遺伝子の遺伝子多型の組み合わせが[B(-) X(-) 4(-)]および[B(+) X(-) 4(-)]の場合、ビタミンＫ2 に対する感受性が、ビタミンＤに対する感受性およびエストロゲンに対する感受性に比べて高い個人由来の試料であると予測することを特徴とする上記３の方法。
５．ビタミンＤ受容体遺伝子、エストロゲン受容体遺伝子およびアポリポ蛋白Ｅ遺伝子の遺伝子多型の組み合わせが[B(-) X(-) 4(+)]の場合、ビタミンＤに対する感受性が、ビタミンＫ2 に対する感受性およびエストロゲンに対する感受性に比べて高い個人由来の試料であると予測することを特徴とする上記３の方法。
６．ビタミンＤ受容体遺伝子、エストロゲン受容体遺伝子およびアポリポ蛋白Ｅ遺伝子の遺伝子多型の組み合わせが[B(-) X(+) 4(-)], [B(-) X(+) 4(+)]および[B(+) X(+) 4(-)]の場合、エストロゲンに対する感受性が、ビタミンＤに対する感受性およびビタミンＫ2 に対する感受性に比べて高い個人由来の試料であると予測することを特徴とする上記３の方法。
７．ビタミンＤ受容体遺伝子を特異的に増幅し得るプライマー対、エストロゲン受容体遺伝子を特異的に増幅し得るプライマー対およびアポリポ蛋白Ｅ遺伝子を特異的に増幅し得るプライマー対、および／またはビタミンＤ受容体遺伝子と特異的にハイブリダイズし得る核酸プローブ、エストロゲン受容体遺伝子と特異的にハイブリダイズし得る核酸プローブおよびアポリポ蛋白Ｅ遺伝子と特異的にハイブリダイズし得る核酸プローブを含むことを特徴とするヒトゲノムＤＮＡ含有試料の遺伝子多型分析用キット。
【００１１】
【発明の実施の形態】
本発明の分析方法に供され得るヒト由来試料は、ヒトゲノムＤＮＡを含有するものであれば特に限定されない。好ましくは、各種ヒト細胞から単離されたゲノムＤＮＡが例示される。ゲノムＤＮＡの抽出は、ＳＤＳ／フェノール法、グアニジンチオシアネート法、ＣＴＡＢ法等の慣用の方法で行えばよい。また、全血、分画された血球細胞、擦過診材料として使用される表皮細胞や粘膜細胞、あるいは毛髪などの、入手が容易で且つＰＣＲ法の鋳型ＤＮＡ試料として従来より使用されている細胞・組織も好ましく用いられる。この場合、例えば細胞・組織を水中で煮沸したり、あるいはアルカリ溶液中で加熱することにより、細胞を破砕してゲノムＤＮＡ試料とする。
【００１２】
本発明の分析方法は、ＶＤＲ遺伝子、ＥＲ遺伝子およびＡｐｏＥ遺伝子についての遺伝子多型を調べることを特徴とする。
ＶＤＲ遺伝子は第１２番染色体上にある。ＶＤＲ遺伝子の多型の１つは、第８エクソンと第９エクソンの間のイントロン領域内での制限酵素Bsm I による切断の可否によって検出される。Bsm I で切断されない対立遺伝子をＢ、同酵素により切断される対立遺伝子をｂで表すと、ＢＢ、Ｂｂおよびｂｂの３つの遺伝子型をとり得るが、本発明においては、ＶＤＲ遺伝子多型は、対立遺伝子Ｂを有する遺伝子型B(+)（すなわち、ＢＢおよびＢｂ）と対立遺伝子Ｂを有しない遺伝子型B(-)（すなわち、ｂｂ）とに類別される。また、ＶＤＲ遺伝子の多型部位とは、対立遺伝子ｂの第８エクソンと第９エクソンの間のイントロン領域内のBsm I 制限部位（ＧＡＡＴＧＣ）および対立遺伝子Ｂのそれに対応する部位（ＧＡＡＴＧＴ）をいうものとする。
【００１３】
ＥＲ遺伝子は第６番染色体上にある。ＥＲ遺伝子の多型の１つは、第１エクソンと第２エクソンの間のイントロン領域内での制限酵素Xba I による切断の可否によって検出される。Xba I で切断されない対立遺伝子をＸ、同酵素で切断される対立遺伝子をｘで表すと、ＸＸ、Ｘｘおよびｘｘの３つの遺伝子型をとり得るが、本発明においては、ＥＲ遺伝子多型は、対立遺伝子Ｘを有する遺伝子型X(+)（すなわち、ＸＸおよびＸｘ）と対立遺伝子Ｘを有しない遺伝子型X(-)（すなわち、ｘｘ）とに類別される。また、ＥＲ遺伝子の多型部位とは、対立遺伝子ｘの第１エクソンと第２エクソンの間のイントロン領域内のXba I 制限部位（ＴＣＴＡＧＡ）および対立遺伝子Ｘのそれに対応する部位（ＴＣＣＡＧＡ）をいうものとする。
【００１４】
ＡｐｏＥ遺伝子は第１９番染色体上にあり、４つのエクソンと３つのイントロンからなり、２９９個のアミノ酸からなる蛋白質をコードする。ＡｐｏＥ蛋白はリポ蛋白によるトリグリセリドやコレステロールの輸送に関与し、ビタミンＫ2 の転送蛋白でもある。ＡｐｏＥ蛋白には３つのアイソフォーム（Ｅ2 、Ｅ3 およびＥ4 ）が知られており、このうちＥ3 が野生型であると考えられている。Ｅ4 は第１１２番目のシステイン（コドン：ＴＧＣ）がアルギニン（コドン：ＣＧＣ）に置換されたものである。また、Ｅ2 は第１５８番目のアルギニンがシステインに置換されたものである。したがって、ＡｐｏＥ4 対立遺伝子は変異部位において制限酵素Hha I により切断されるが、ＡｐｏＥ2 およびＡｐｏＥ3 対立遺伝子は同部位において同酵素により切断されない。ＡｐｏＥ2 、ＡｐｏＥ3 およびＡｐｏＥ4 対立遺伝子をそれぞれ２、３および４で表すと、2/2 、2/3 、2/4 、3/3 、3/4 および4/4 の遺伝子型をとり得るが、本発明においては、ＡｐｏＥ遺伝子多型は、対立遺伝子４を有する遺伝子型4(+)（すなわち、2/4 、3/4 および4/4 ）と、対立遺伝子４を有しない遺伝子型4(-)（すなわち、2/2 、2/3 および3/3 ）とに類別される。また、ＡｐｏＥ遺伝子の多型部位とは、対立遺伝子４の第１１２コドンにおけるHha I 制限部位（ＧＣＧＣ）および対立遺伝子２および３のそれに対応する部位（ＧＴＧＣ）をいうものとする。
【００１５】
本発明の遺伝子多型の測定方法は、ＶＤＲ遺伝子の多型B(+)とB(-)、ＥＲ遺伝子の多型X(+)とX(-)およびＡｐｏＥ遺伝子の多型4(+)と4(-)をそれぞれ区別し得る方法であれば特に制限されず、サザンハイブリダイゼーション法、シーケンス法、ＰＣＲ法等の通常のゲノムＤＮＡの検出・分析法を適宜組み合わせた種々の方法が利用できる。
【００１６】
これらの遺伝子多型の測定方法は、その原理に基づいて３つに大別される。すなわち、（１）多型部位を含む遺伝子断片を単離して当該部位の塩基配列を決定するかあるいは特異的なプローブまたはプライマーを用いて多型部位を直接検出する方法、（２）多型部位を含む遺伝子断片の高次構造の差を利用して、電気泳動度により多型を判別する方法および（３）多型部位での制限酵素による切断の可否を利用して、電気泳動度により多型を判別する方法である。（１）の具体的な方法として、例えば、シーケンス法、配列特異的オリゴプローブ（sequence-specific oligonucleotide probe;ＳＳＯＰ）法、アレル特異的増幅（mutant allele specific amplification; ＭＡＳＡ）法などが挙げられる。
【００１７】
シーケンス法では、まず、ＶＤＲ遺伝子、ＥＲ遺伝子およびＡｐｏＥ遺伝子のそれぞれの多型部位を内部に含む適当な長さの各遺伝子断片を増幅し得るような特異的プライマー対を合成する。該プライマー対は約１５〜約４０塩基で、通常のＰＣＲプライマーに要求される好適な条件を満たすものであれば特に制限されない。次いで、該プライマー対を用い、ヒト由来試料を鋳型としてＰＣＲを行い、目的の各遺伝子断片を増幅させる。ＰＣＲの反応条件は通常使用される範囲で適宜選択することができる。各遺伝子断片の増幅は別個に行っても同時に行ってもよい。得られた増幅断片を適当なベクターにそれぞれサブクローニングし、マキサム・ギルバート法やジデオキシ法を用いた通常のシーケンスにより各多型部位の塩基配列を決定することができる。また、サブクローニングすることなく直接サイクルシーケンス法により配列決定することもできる。
【００１８】
ＳＳＯＰ法は、多型部位を含む約１５〜約１００塩基の、一方の対立遺伝子配列に完全相補的なプローブを作製し、ハイブリダイゼーション温度を厳密に制御しながらヒト由来試料から抽出したゲノムＤＮＡとサザンハイブリダイゼーションを行い、ハイブリッド形成の有無により遺伝子多型を判別する方法である。ハイブリダイゼーションは各遺伝子について別個に行っても、あるいは同時に行ってもよい。但し、本発明において測定される３つの遺伝子の多型はいずれも１塩基置換であるのでミスマッチを含むプローブとの交叉反応を防ぐためにはハイブリダイゼーション条件を高度に制御する必要がある。また、ミスマッチによる不安定化効果を最大限にするために、プローブの中央付近に多型部位が存在するようにプローブを設計することが望ましい。好ましい変法として、ハイブリダイゼーションに先立って多型部位を含む断片をＰＣＲで増幅しておくＰＣＲ−ＳＳＯＰ法が挙げられる。また、両方の対立遺伝子に完全相補的な２つのプローブを作製し、その一方のみを標識して両者共存下にハイブリダイゼーションを行う競合的ハイブリダイゼーション法は、ハイブリダイゼーション条件を厳密に制御することなく１塩基置換を判別することができる。
【００１９】
ＭＡＳＡ法は、多型部位を含む約１５〜約４０塩基の、一方の対立遺伝子配列に完全相同的（または完全相補的）なオリゴＤＮＡを一方のプライマーとして合成し、アニーリング温度を厳密に制御しながらヒト由来試料を鋳型としてＰＣＲを行い、増幅産物の存在の有無により遺伝子多型を判別する方法である。該方法も上記と同様、交叉反応を防ぐためにＰＣＲの条件を高度に制御する必要があるが、自動サーマルサイクラー中で反応を行えば、比較的に容易に正確な判別が可能である。
【００２０】
上記（２）の方法としては、以下のＰＣＲ−ＳＳＣＰ（single-strand conformation polymorphism ）法、ＰＣＲ−ＤＧＧＥ（denaturing gradient gel electrophoresis ）法、ＰＣＲ−ＣＦＬＰ（cleavase fragment length polymorphism ）法等が挙げられる。これらの方法は、いずれも（１）のシーケンス法と同様にして、多型部位を内部に含む適当な長さの各遺伝子断片を増幅することを第一の工程として含む。
【００２１】
ＰＣＲ−ＳＳＣＰ法では、増幅産物を加熱またはアルカリ処理等により一本鎖に変性する。一本鎖に解離したＤＮＡ断片はその塩基配列に依存した独自の高次構造を形成するので、これをポリアクリルアミドゲル等の非変性ゲル上で電気泳動することにより、１塩基置換の多型を移動度の差として検出することができる。
【００２２】
ＰＣＲ−ＤＧＧＥ法では、増幅産物を変性・再会合させた後、変性剤（ＳＤＳ、尿素、ホルムアミドなど）の濃度勾配をつけた変性ゲル上で電気泳動する。１塩基置換の多型は、それを含むドメインの融解温度（Ｔm ）を変化させるので、異なる変性剤濃度の位置で部分解離し、その結果異なる移動度を示す。特に、ヘテロ接合体のＤＮＡの場合、変性・再会合により、野生型および変異型のホモデュプレックスと、ミスマッチを有する２種のヘテロデュプレックスとが生成されるので、４本のバンドが検出される。但し、最もＴm の高いドメイン中に変異を有する場合は移動度に差が生じない。その場合は、ＧＣクランプと呼ばれる約２０〜約５０ｂｐのＧＣリッチな配列を５’側に付加すれば、その部分が最もＴm の高いドメインになるので、多型を移動度の差として検出することができる。
【００２３】
ＰＣＲ−ＣＦＬＰ法は、増幅産物を加熱またはアルカリ処理等により一本鎖に変性し、さらにcleavaseと呼ばれるヘアピン構造を認識して切断する酵素で処理した後、ゲル電気泳動を行う方法であり、多型によるヘアピン構造の有無またはヘアピン形成部位の相違をバンドの数および／または移動度の差として検出することができる。
【００２４】
上記（３）の方法も、迅速且つ簡便に遺伝子多型を測定できるので好ましい。このような方法としては、ＲＦＬＰ法、ＰＣＲ−ＲＦＬＰ法等が挙げられる。
【００２５】
ＲＦＬＰ法は、ヒト由来試料から単離したゲノムＤＮＡを、一方の遺伝子多型を多型部位で切断し得る制限酵素（さらに必要に応じて、該多型部位の上流および下流の適当な部位でゲノムＤＮＡを切断し得る他の制限酵素）で消化し、当該遺伝子の部分配列または全配列をプローブとしてサザンハイブリダイゼーションを行い、バンドの長さおよび数に基づいて多型を判別する方法である。本発明においては、ＶＤＲ遺伝子の分析にはBsm I が、ＥＲ遺伝子の分析にはXba I が、ＡｐｏＥ遺伝子の分析にはHha I がそれぞれ使用される。
【００２６】
ＰＣＲ−ＲＦＬＰ法は、ＶＤＲ遺伝子、ＥＲ遺伝子およびＡｐｏＥ遺伝子のそれぞれの多型部位を内部に含む適当な長さの各遺伝子断片を増幅し得るような特異的プライマー対を合成し、該プライマー対を用い、ヒト由来試料を鋳型としてＰＣＲを行い、目的の各遺伝子断片を増幅させた後、増幅産物について上記のＲＦＬＰ法と同様の制限酵素処理を行い、ゲル電気泳動してバンドの長さおよび数から多型を判別する方法である。また、ＰＣＲに先立って制限酵素処理を行えば、制限酵素で切断されるＤＮＡは遺伝子増幅されないので、バンドの有無により多型を判別することができる。
【００２７】
上記のような本発明の多型分析により、ヒト由来試料は、ＶＤＲ遺伝子、ＥＲ遺伝子およびＡｐｏＥ遺伝子の遺伝子多型の組み合わせに基づいて、[B(-) X(-) 4(-)], [B(-) X(-) 4(+)], [B(-) X(+) 4(-)], [B(-) X(+) 4(+)], [B(+) X(-) 4(-)], [B(+) X(-) 4(+)], [B(+) X(+) 4(-)]および[B(+) X(+) 4(+)]に類別される。
【００２８】
本発明は、上記の遺伝子多型の組み合わせに基づいて、該ヒト由来試料が、複数の骨粗鬆症治療薬に対する感受性において特定の優先性を示す個人由来のものであると予測することを特徴とする。本発明において、複数の骨粗鬆症治療薬とは、好ましくはビタミンＤ、エストロゲンおよびビタミンＫ2 である。また、ここで骨粗鬆症治療薬に対する感受性とは、治療薬の骨粗鬆症治療効果の度合いの大きさを意味する。すなわち、ある患者において薬剤Ａが薬剤Ｂよりも治療効果が高い場合には、「その患者の薬剤Ａに対する感受性は薬剤Ｂに対する感受性に比べて高い」。本発明においては、薬剤投与前後での骨塩量の変化率を感受性の指標とし、［骨塩量変化率］−［期待骨塩量変化率］の値が大きい程、その薬剤に対する感受性が高いと定義する。
【００２９】
本発明の分析方法では、ＶＤＲ遺伝子、ＥＲ遺伝子およびＡｐｏＥ遺伝子の遺伝子多型の組み合わせが[B(-) X(-) 4(-)]および[B(+) X(-) 4(-)]の場合、ビタミンＫ2 に対する感受性が、ビタミンＤに対する感受性およびエストロゲンに対する感受性に比べて高い個人由来の試料であると予測し、遺伝子多型の組み合わせが[B(-) X(-) 4(+)]の場合、ビタミンＤに対する感受性が、ビタミンＫ2 に対する感受性およびエストロゲンに対する感受性に比べて高い個人由来の試料であると予測し、遺伝子多型の組み合わせが[B(-) X(+) 4(-)], [B(-) X(+) 4(+)]および[B(+) X(+) 4(-)]の場合、エストロゲンに対する感受性が、ビタミンＤに対する感受性およびビタミンＫ2 に対する感受性に比べて高い個人由来の試料であると予測することを特徴とする。
【００３０】
本発明はまた、上記の分析方法を実施するのに有用なヒトゲノムＤＮＡ含有試料の遺伝子多型分析用キットを提供する。本発明のキットは、ＶＤＲ遺伝子を特異的に増幅し得るプライマー対、ＥＲ遺伝子を特異的に増幅し得るプライマー対およびＡｐｏＥ遺伝子を特異的に増幅し得るプライマー対、および／またはＶＤＲ遺伝子と特異的にハイブリダイズし得る核酸プローブ、ＥＲ遺伝子と特異的にハイブリダイズし得る核酸プローブおよびＡｐｏＥ遺伝子と特異的にハイブリダイズし得る核酸プローブを含む。
【００３１】
多型分析にシーケンス法、ＰＣＲ−ＳＳＯＰ法、ＰＣＲ−ＳＳＣＰ法、ＰＣＲ−ＤＧＧＥ法、ＰＣＲ−ＣＦＬＰ法等を用いる場合、各プライマー対は、多型部位を内部に含む各遺伝子断片を増幅し得るように、各遺伝子の多型部位よりも上流の配列と、多型部位よりも下流の配列と同一の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドが使用される。一方、ＭＡＳＡ法を用いる場合は、一方のプライマーは、各遺伝子の多型部位を含む領域に完全相同的（＝センス）または完全相補的（＝アンチセンス）な塩基配列を有するものである。
【００３２】
また、多型分析にＲＦＬＰ法を用いる場合、核酸プローブは各遺伝子の一部または全部の配列を含むものであれば特に制限されず、多型部位の配列を必ずしも含む必要はない。一方、多型分析にＳＳＯＰ法またはＰＣＲ−ＳＳＯＰ法を用いる場合、核酸プローブは、各遺伝子の多型部位を含む領域の配列に完全相補的な塩基配列を有するものである。
【００３３】
本発明のキットは、本発明の分析方法を実施するのに好適な各種試薬および／または器具等をさらに含んでいてもよい。
【００３４】
【実施例】
以下、参考例および実施例を用いて、本発明を詳細に説明する。
【００３５】
参考例１
無作為に選んだ閉経後の１７７人の日本人女性から血液を採取し、血球細胞を分画して、常法によりゲノムＤＮＡを抽出精製した。該ゲノムＤＮＡを鋳型とし、下記のプライマー対を用いてＶＤＲ遺伝子断片、ＥＲ遺伝子断片およびＡｐｏＥ遺伝子断片をそれぞれ別個に増幅した。
ＶＤＲ遺伝子断片増幅用プライマー：
センス： 5'-CAACCAAGACTACAAGTACCGCGTCAGTGA-3' （配列番号１）
アンチセンス：5'-AACCAGCGGGAAGAGGTCAAGGG-3' （配列番号２）
ＥＲ遺伝子断片増幅用プライマー：
センス： 5'-CTGCCACCCTATCTGTATCTTTTCCTATTCTCC-3' （配列番号３）
アンチセンス：5'-TCTTTCTCTGCCACCCTGGCGTCGATTATCTGA-3' （配列番号４）
ＡｐｏＥ遺伝子断片増幅用プライマー：
センス： 5'-TAAGCTTTGGCACGGCTGTCCAAGGA-3' （配列番号５）
アンチセンス：5'-ACAGAATTCGCCCCGGCCTGGTACAC-3' （配列番号６）
ＰＣＲ条件は、ＶＤＲ遺伝子については、変性：９４℃、６０秒；アニーリング：６２℃、６０秒；伸長：７２℃、６０秒（３０サイクル）、ＥＲ遺伝子については、変性：９４℃、３０秒；アニーリング：６５℃、３０秒；伸長：７２℃、３０秒（３０サイクル）、ＡｐｏＥ遺伝子については、変性：９４℃、３０秒；アニーリング：６１℃、４０秒；伸長：７２℃、９０秒（３０サイクル）であった。このＰＣＲ増幅により、多型部位を含む７．２ｋｂｐのＶＤＲ遺伝子断片、１．３ｋｂｐのＥＲ遺伝子断片および２４４ｂｐのＡｐｏＥ遺伝子断片がそれぞれ得られる。ＶＤＲ遺伝子増幅反応液をBsm I で、ＥＲ遺伝子増幅反応液をXba I で、ＡｐｏＥ遺伝子増幅反応液をHha I でそれぞれ処理した後、アガロースゲル電気泳動にかけた。各増幅産物が多型部位において制限酵素で切断される場合、ＶＤＲ増幅産物では４．６ｋｂｐと２．６ｋｂｐ、ＥＲ増幅産物では９００ｂｐと４００ｂｐ、ＡｐｏＥ増幅産物では７２、４８、３８、３５、１９、１７および１５ｂｐのバンドが検出される。４型を持たない（すなわち、4(-)）場合は認められない７２ｂｐのバンドが検出される。泳動終了後、エチジウムブロマイドでゲルを染色し、バンドパターンからＶＤＲ、ＥＲおよびＡｐｏＥの遺伝子多型を判別し、８つの多型群に類別した（表２）。
【００３６】
上記のように多型分析を行った日本人女性１７７人の骨塩量をそれぞれ測定した。次いで、これらの患者にビタミンＤ3 、エストロゲンまたはビタミンＫ2 のいずれかを６ヶ月間投与した。投与量はビタミンＤ3 が１μｇ／日、エストロゲンが０．３１２ｍｇ／日およびビタミンＫ2 が４５ｍｇ／日であった。６ヶ月後に再度骨塩量を測定し、薬剤投与前の骨塩量に対する変化率を求めた。各遺伝子型別の平均骨塩量変化率から各薬剤の治療効果期待値（無作為に抽出した患者に対する全平均治療効果；表１）を差し引いた値を各遺伝子型における薬剤感受性とした。その結果を表２に示す。
【００３７】
【表１】
【００３８】
【表２】
【００３９】
表２から明らかなように、遺伝子型が[B(-) X(-) 4(-)]および[B(+) X(-) 4(-)]の場合、ビタミンＫ2 に対する感受性が、ビタミンＤに対する感受性およびエストロゲンに対する感受性に比べて高く、遺伝子型が[B(-) X(-) 4(+)]の場合、ビタミンＤに対する感受性が、ビタミンＫ2 に対する感受性およびエストロゲンに対する感受性に比べて高く、遺伝子型が[B(-) X(+) 4(-)], [B(-) X(+) 4(+)]および[B(+) X(+) 4(-)]の場合、エストロゲンに対する感受性が、ビタミンＤに対する感受性およびビタミンＫ2 に対する感受性に比べて高かった。
【００４０】
実施例１
ある日本人の骨粗鬆症患者から血液を採取し、血球細胞を分画して、常法によりゲノムＤＮＡを抽出精製する。該ゲノムＤＮＡを鋳型とし、参考例１と同様の方法でＶＤＲ遺伝子、ＥＲ遺伝子およびＡｐｏＥ遺伝子の多型を分析する。得られた遺伝子型が[B(-) X(-) 4(-)]および[B(+) X(-) 4(-)]の場合、該ゲノムＤＮＡは、ビタミンＫ2 に対する感受性が、ビタミンＤに対する感受性およびエストロゲンに対する感受性に比べて高い個人由来のものであると判定し、遺伝子型が[B(-) X(-) 4(+)]の場合、該ゲノムＤＮＡは、ビタミンＤに対する感受性が、ビタミンＫ2 に対する感受性およびエストロゲンに対する感受性に比べて高い個人由来のものであると判定する。さらに、遺伝子型が[B(-) X(+) 4(-)], [B(-) X(+) 4(+)]および[B(+) X(+) 4(-)]の場合、該ゲノムＤＮＡは、エストロゲンに対する感受性が、ビタミンＤに対する感受性およびビタミンＫ2 に対する感受性に比べて高い個人由来のものであると判定する。
【００４１】
【発明の効果】
本発明の分析方法によれば、投薬前に対象となる患者がどの骨粗鬆症治療薬に対してより感受性が高いかを高い確率で予測することができるので、適切な薬剤の選択が可能となる。したがって、治療効果の乏しい薬剤を長期間投与するという非効率的な治療を回避することができ、患者のＱＯＬを向上することができる点で極めて有用である
【００４２】
【配列表のフリーテキスト】
配列番号１：多型部位を含むＶＤＲ遺伝子の断片を増幅するためのプライマーとして働くべく設計されたオリゴヌクレオチド。
配列番号２：多型部位を含むＶＤＲ遺伝子の断片を増幅するためのプライマーとして働くべく設計されたオリゴヌクレオチド。
配列番号３：多型部位を含むＥＲ遺伝子の断片を増幅するためのプライマーとして働くべく設計されたオリゴヌクレオチド。
配列番号４：多型部位を含むＥＲ遺伝子の断片を増幅するためのプライマーとして働くべく設計されたオリゴヌクレオチド。
配列番号５：多型部位を含むＡｐｏＥ遺伝子の断片を増幅するためのプライマーとして働くべく設計されたオリゴヌクレオチド。
配列番号６：多型部位を含むＡｐｏＥ遺伝子の断片を増幅するためのプライマーとして働くべく設計されたオリゴヌクレオチド。
【００４３】
【配列表】
【発明の属する技術分野】
本発明は、骨粗鬆症の治療において有用な情報を提供し得る新規なヒト由来試料の分析方法に関する。詳細には、本発明は、骨粗鬆症治療薬、特にビタミンＤ、エストロゲンおよびビタミンＫ2 のうちのいずれの薬剤の使用が最も有効な治療効果を示すかを予測するための、ヒト由来試料中のゲノムＤＮＡの遺伝子多型の分析方法に関する。また、本発明はヒト由来試料中のゲノムＤＮＡの遺伝子多型の組み合わせから、該試料が前記薬剤に対する感受性において特定の優先性を示す個人由来のものであると予測する方法に関する。さらに、本発明は上記の方法において使用し得る遺伝子多型分析用キットに関する。
【０００２】
【従来の技術】
骨粗鬆症は骨量（骨に含まれるカルシウムを中心としたミネラルの量）が減少し、かつ骨組織の微細構造が変化し、そのために骨が脆くなり骨折しやすくなった病態である。閉経後の女性や高齢の男性に多く、我が国の患者数は推定１，０００万人といわれている。人口の高齢化に伴い、今後も患者数は不可避的に増加するものと予測される。
【０００３】
現在、骨粗鬆症の治療薬として、カルシウム製剤、ビタミンＤ等の骨活性化薬、エストロゲン等の骨吸収抑制薬、ビタミンＫ等の骨形成促進薬など、種々の薬剤が用いられているが、その治療効果は患者によってまちまちであり、それらをどのように使い分けるかについての検討はほとんどなされていない。これらの治療薬は単剤投与が原則とされているので、どの治療薬が最も効果的であるかを調べるには、実際に１つの薬剤を数年間患者に投与して、その結果を見て判断するしかないのが現状であり、極めて非効率的である。
【０００４】
一方、近年の遺伝子研究から、いくつかの遺伝子の多型と患者の骨粗鬆症治療薬に対する感受性との関連が提唱されている。例えば、ビタミンＤ受容体（以下、ＶＤＲという）遺伝子の第８エクソンと第９エクソンの間のイントロン領域内でApa I により切断されない遺伝子型Ａは、同制限酵素によって切断される遺伝子型ａに比べてビタミンＤに対して高感受性であるとの報告がある〔例えば、特開平8-126497号公報および特開平8-126500号公報参照〕。
【０００５】
また、白木ら〔１９９７年骨代謝学会要旨集第５２頁〕には、ＶＤＲ遺伝子の多型とビタミンＤ感受性、エストロゲン受容体（以下、ＥＲという）遺伝子の多型とエストロゲン感受性およびアポリポ蛋白Ｅ（以下、ＡｐｏＥ）遺伝子の多型とビタミンＫ2 感受性について調べた結果、ＶＤＲ遺伝子型ＡＡＢ（Ｂは第８エクソンと第９エクソンの間のイントロン領域内でBsm I により切断されない遺伝子型）はａａｂｂに比べてビタミンＤ3 に対する感受性が有意に低く、またＥＲ遺伝子型ＰｐＸｘ（ＰおよびＸはそれぞれPvu IIおよびXba I で切断されない遺伝子型）は他の遺伝子型群に比べてエストロゲンに対する感受性が有意に高く、さらに、ＡｐｏＥ4 (+) 群はＡｐｏＥ4 (-) 群に比べてビタミンＫ2 に対する感受性が有意に低かったと記載されている。
【０００６】
さらに、ビタミンＤ結合蛋白（ＤＢＰ）遺伝子をHae III およびSty I で切断して得られるＲＦＬＰパターンがＧＣ２−２型のものは、他の群に比べてビタミンＤ類に対する感受性が高いと記載されている［特開平８−２０１３７３号公報］。
【０００７】
しかしながら、これらはいずれも１遺伝子の多型から１つの薬剤に対する感受性を予測するものであり、１つの薬剤について他の遺伝子型よりも感受性が高いか否かを予測するものでしかない。すなわち、ＶＤＲ遺伝子型がａａｂｂで且つＡｐｏＥ遺伝子型がＡｐｏＥ4 (-) である人は、他のＶＤＲ遺伝子型およびＡｐｏＥ遺伝子型を有する人に比べてビタミンＤおよびビタミンＫ2 に対する感受性が高いと予測されるが、それでは、このような遺伝子型を有する患者に対してビタミンＤを投与するのとビタミンＫ2 を投与するのとでは、どちらがより高い治療効果が得られるのかについては、依然として予測することができない。したがって、結局のところ、異なる薬剤のいずれに対して患者がより感受性が高いかを知るには、上述のように、実際に各薬剤を、１つの薬剤について数年間のスパンで順次患者に投与して結果を見るしかなかった。特に、エストロゲンは、治療効果は大きいが副作用も大きいため、感受性の低い患者への長期投与は患者のＱＯＬ（Quality of Life ）を著しく損なうおそれがあった。
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】
したがって、本発明の目的は、骨粗鬆症患者もしくは将来骨粗鬆症を発症する可能性のある人が、複数の骨粗鬆症治療薬のいずれに対してより高い感受性を有するかを予測する手段を提供することであり、それによって治療効果の低い薬剤の長期投与による病状の進行を回避し、患者のＱＯＬを向上させることである。
【０００９】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは上記目的を達成するために鋭意検討を重ねた結果、ゲノムＤＮＡを含有するヒト由来試料を、ＶＤＲ遺伝子、ＥＲ遺伝子およびＡｐｏＥ遺伝子の多型について分析することにより、得られる多型の組み合わせに基づいて、ビタミンＤ、エストロゲンおよびビタミンＫ2 のうちのいずれかの薬剤に対する感受性が、他の２つの薬剤に対する感受性に比べて高いことが予測可能であることを見出した。すなわち、他の遺伝子型に比べてビタミンＤに高感受性のＶＤＲ遺伝子型および他の遺伝子型に比べてエストロゲンに高感受性のＥＲ遺伝子型を有する場合、ビタミンＤよりもエストロゲンに対してより感受性が高く、他の遺伝子型に比べてエストロゲンに高感受性のＥＲ遺伝子型および他の遺伝子型に比べてビタミンＫ2 に高感受性のＡｐｏＥ遺伝子型を有する場合、ビタミンＫ2 よりもエストロゲンに対してより感受性が高く、他の遺伝子型に比べてビタミンＤに高感受性のＶＤＲ遺伝子型および他の遺伝子型に比べてビタミンＫ2 に高感受性のＡｐｏＥ遺伝子型を有する場合、ビタミンＤよりもビタミンＫ2 に対してより感受性が高い傾向を示すことを見出して、本発明に到達した。
【００１０】
すなわち、本発明は以下の通りである。
１．ヒトから採取した試料中に含まれるゲノムＤＮＡから、ビタミンＤ受容体遺伝子、エストロゲン受容体遺伝子およびアポリポ蛋白Ｅ遺伝子のそれぞれの遺伝子多型を分析し、これらの遺伝子多型の組み合わせに基づいて、該試料が複数の骨粗鬆症治療薬に対する感受性において特定の優先性を示す個人由来のものであると予測することを特徴とする骨粗鬆症薬剤感受性予測方法。
２．ビタミンＤ受容体遺伝子、エストロゲン受容体遺伝子およびアポリポ蛋白Ｅ遺伝子の遺伝子多型の組み合わせが、[B(-) X(-) 4(-)], [B(-) X(-) 4(+)], [B(-) X(+) 4(-)], [B(-) X(+) 4(+)], [B(+) X(-) 4(-)], [B(+) X(-) 4(+)], [B(+) X(+) 4(-)]および[B(+) X(+) 4(+)]からなる群より選択されるいずれかである上記１の方法（ここで、B は第８エクソンと第９エクソンの間のイントロン領域内でBsm I により切断されないビタミンＤ受容体対立遺伝子を、X は第１エクソンと第２エクソンの間のイントロン領域内でXba I により切断されないエストロゲン受容体対立遺伝子を、4 はＡｐｏＥ4 型アポリポ蛋白Ｅ対立遺伝子をそれぞれ表し、(+) および(-) はその対立遺伝子を有するおよび有しないことをそれぞれ表している）。
３．複数の骨粗鬆症治療薬がビタミンＤ、エストロゲンおよびビタミンＫ2 である上記１または２の方法。
４．ビタミンＤ受容体遺伝子、エストロゲン受容体遺伝子およびアポリポ蛋白Ｅ遺伝子の遺伝子多型の組み合わせが[B(-) X(-) 4(-)]および[B(+) X(-) 4(-)]の場合、ビタミンＫ2 に対する感受性が、ビタミンＤに対する感受性およびエストロゲンに対する感受性に比べて高い個人由来の試料であると予測することを特徴とする上記３の方法。
５．ビタミンＤ受容体遺伝子、エストロゲン受容体遺伝子およびアポリポ蛋白Ｅ遺伝子の遺伝子多型の組み合わせが[B(-) X(-) 4(+)]の場合、ビタミンＤに対する感受性が、ビタミンＫ2 に対する感受性およびエストロゲンに対する感受性に比べて高い個人由来の試料であると予測することを特徴とする上記３の方法。
６．ビタミンＤ受容体遺伝子、エストロゲン受容体遺伝子およびアポリポ蛋白Ｅ遺伝子の遺伝子多型の組み合わせが[B(-) X(+) 4(-)], [B(-) X(+) 4(+)]および[B(+) X(+) 4(-)]の場合、エストロゲンに対する感受性が、ビタミンＤに対する感受性およびビタミンＫ2 に対する感受性に比べて高い個人由来の試料であると予測することを特徴とする上記３の方法。
７．ビタミンＤ受容体遺伝子を特異的に増幅し得るプライマー対、エストロゲン受容体遺伝子を特異的に増幅し得るプライマー対およびアポリポ蛋白Ｅ遺伝子を特異的に増幅し得るプライマー対、および／またはビタミンＤ受容体遺伝子と特異的にハイブリダイズし得る核酸プローブ、エストロゲン受容体遺伝子と特異的にハイブリダイズし得る核酸プローブおよびアポリポ蛋白Ｅ遺伝子と特異的にハイブリダイズし得る核酸プローブを含むことを特徴とするヒトゲノムＤＮＡ含有試料の遺伝子多型分析用キット。
【００１１】
【発明の実施の形態】
本発明の分析方法に供され得るヒト由来試料は、ヒトゲノムＤＮＡを含有するものであれば特に限定されない。好ましくは、各種ヒト細胞から単離されたゲノムＤＮＡが例示される。ゲノムＤＮＡの抽出は、ＳＤＳ／フェノール法、グアニジンチオシアネート法、ＣＴＡＢ法等の慣用の方法で行えばよい。また、全血、分画された血球細胞、擦過診材料として使用される表皮細胞や粘膜細胞、あるいは毛髪などの、入手が容易で且つＰＣＲ法の鋳型ＤＮＡ試料として従来より使用されている細胞・組織も好ましく用いられる。この場合、例えば細胞・組織を水中で煮沸したり、あるいはアルカリ溶液中で加熱することにより、細胞を破砕してゲノムＤＮＡ試料とする。
【００１２】
本発明の分析方法は、ＶＤＲ遺伝子、ＥＲ遺伝子およびＡｐｏＥ遺伝子についての遺伝子多型を調べることを特徴とする。
ＶＤＲ遺伝子は第１２番染色体上にある。ＶＤＲ遺伝子の多型の１つは、第８エクソンと第９エクソンの間のイントロン領域内での制限酵素Bsm I による切断の可否によって検出される。Bsm I で切断されない対立遺伝子をＢ、同酵素により切断される対立遺伝子をｂで表すと、ＢＢ、Ｂｂおよびｂｂの３つの遺伝子型をとり得るが、本発明においては、ＶＤＲ遺伝子多型は、対立遺伝子Ｂを有する遺伝子型B(+)（すなわち、ＢＢおよびＢｂ）と対立遺伝子Ｂを有しない遺伝子型B(-)（すなわち、ｂｂ）とに類別される。また、ＶＤＲ遺伝子の多型部位とは、対立遺伝子ｂの第８エクソンと第９エクソンの間のイントロン領域内のBsm I 制限部位（ＧＡＡＴＧＣ）および対立遺伝子Ｂのそれに対応する部位（ＧＡＡＴＧＴ）をいうものとする。
【００１３】
ＥＲ遺伝子は第６番染色体上にある。ＥＲ遺伝子の多型の１つは、第１エクソンと第２エクソンの間のイントロン領域内での制限酵素Xba I による切断の可否によって検出される。Xba I で切断されない対立遺伝子をＸ、同酵素で切断される対立遺伝子をｘで表すと、ＸＸ、Ｘｘおよびｘｘの３つの遺伝子型をとり得るが、本発明においては、ＥＲ遺伝子多型は、対立遺伝子Ｘを有する遺伝子型X(+)（すなわち、ＸＸおよびＸｘ）と対立遺伝子Ｘを有しない遺伝子型X(-)（すなわち、ｘｘ）とに類別される。また、ＥＲ遺伝子の多型部位とは、対立遺伝子ｘの第１エクソンと第２エクソンの間のイントロン領域内のXba I 制限部位（ＴＣＴＡＧＡ）および対立遺伝子Ｘのそれに対応する部位（ＴＣＣＡＧＡ）をいうものとする。
【００１４】
ＡｐｏＥ遺伝子は第１９番染色体上にあり、４つのエクソンと３つのイントロンからなり、２９９個のアミノ酸からなる蛋白質をコードする。ＡｐｏＥ蛋白はリポ蛋白によるトリグリセリドやコレステロールの輸送に関与し、ビタミンＫ2 の転送蛋白でもある。ＡｐｏＥ蛋白には３つのアイソフォーム（Ｅ2 、Ｅ3 およびＥ4 ）が知られており、このうちＥ3 が野生型であると考えられている。Ｅ4 は第１１２番目のシステイン（コドン：ＴＧＣ）がアルギニン（コドン：ＣＧＣ）に置換されたものである。また、Ｅ2 は第１５８番目のアルギニンがシステインに置換されたものである。したがって、ＡｐｏＥ4 対立遺伝子は変異部位において制限酵素Hha I により切断されるが、ＡｐｏＥ2 およびＡｐｏＥ3 対立遺伝子は同部位において同酵素により切断されない。ＡｐｏＥ2 、ＡｐｏＥ3 およびＡｐｏＥ4 対立遺伝子をそれぞれ２、３および４で表すと、2/2 、2/3 、2/4 、3/3 、3/4 および4/4 の遺伝子型をとり得るが、本発明においては、ＡｐｏＥ遺伝子多型は、対立遺伝子４を有する遺伝子型4(+)（すなわち、2/4 、3/4 および4/4 ）と、対立遺伝子４を有しない遺伝子型4(-)（すなわち、2/2 、2/3 および3/3 ）とに類別される。また、ＡｐｏＥ遺伝子の多型部位とは、対立遺伝子４の第１１２コドンにおけるHha I 制限部位（ＧＣＧＣ）および対立遺伝子２および３のそれに対応する部位（ＧＴＧＣ）をいうものとする。
【００１５】
本発明の遺伝子多型の測定方法は、ＶＤＲ遺伝子の多型B(+)とB(-)、ＥＲ遺伝子の多型X(+)とX(-)およびＡｐｏＥ遺伝子の多型4(+)と4(-)をそれぞれ区別し得る方法であれば特に制限されず、サザンハイブリダイゼーション法、シーケンス法、ＰＣＲ法等の通常のゲノムＤＮＡの検出・分析法を適宜組み合わせた種々の方法が利用できる。
【００１６】
これらの遺伝子多型の測定方法は、その原理に基づいて３つに大別される。すなわち、（１）多型部位を含む遺伝子断片を単離して当該部位の塩基配列を決定するかあるいは特異的なプローブまたはプライマーを用いて多型部位を直接検出する方法、（２）多型部位を含む遺伝子断片の高次構造の差を利用して、電気泳動度により多型を判別する方法および（３）多型部位での制限酵素による切断の可否を利用して、電気泳動度により多型を判別する方法である。（１）の具体的な方法として、例えば、シーケンス法、配列特異的オリゴプローブ（sequence-specific oligonucleotide probe;ＳＳＯＰ）法、アレル特異的増幅（mutant allele specific amplification; ＭＡＳＡ）法などが挙げられる。
【００１７】
シーケンス法では、まず、ＶＤＲ遺伝子、ＥＲ遺伝子およびＡｐｏＥ遺伝子のそれぞれの多型部位を内部に含む適当な長さの各遺伝子断片を増幅し得るような特異的プライマー対を合成する。該プライマー対は約１５〜約４０塩基で、通常のＰＣＲプライマーに要求される好適な条件を満たすものであれば特に制限されない。次いで、該プライマー対を用い、ヒト由来試料を鋳型としてＰＣＲを行い、目的の各遺伝子断片を増幅させる。ＰＣＲの反応条件は通常使用される範囲で適宜選択することができる。各遺伝子断片の増幅は別個に行っても同時に行ってもよい。得られた増幅断片を適当なベクターにそれぞれサブクローニングし、マキサム・ギルバート法やジデオキシ法を用いた通常のシーケンスにより各多型部位の塩基配列を決定することができる。また、サブクローニングすることなく直接サイクルシーケンス法により配列決定することもできる。
【００１８】
ＳＳＯＰ法は、多型部位を含む約１５〜約１００塩基の、一方の対立遺伝子配列に完全相補的なプローブを作製し、ハイブリダイゼーション温度を厳密に制御しながらヒト由来試料から抽出したゲノムＤＮＡとサザンハイブリダイゼーションを行い、ハイブリッド形成の有無により遺伝子多型を判別する方法である。ハイブリダイゼーションは各遺伝子について別個に行っても、あるいは同時に行ってもよい。但し、本発明において測定される３つの遺伝子の多型はいずれも１塩基置換であるのでミスマッチを含むプローブとの交叉反応を防ぐためにはハイブリダイゼーション条件を高度に制御する必要がある。また、ミスマッチによる不安定化効果を最大限にするために、プローブの中央付近に多型部位が存在するようにプローブを設計することが望ましい。好ましい変法として、ハイブリダイゼーションに先立って多型部位を含む断片をＰＣＲで増幅しておくＰＣＲ−ＳＳＯＰ法が挙げられる。また、両方の対立遺伝子に完全相補的な２つのプローブを作製し、その一方のみを標識して両者共存下にハイブリダイゼーションを行う競合的ハイブリダイゼーション法は、ハイブリダイゼーション条件を厳密に制御することなく１塩基置換を判別することができる。
【００１９】
ＭＡＳＡ法は、多型部位を含む約１５〜約４０塩基の、一方の対立遺伝子配列に完全相同的（または完全相補的）なオリゴＤＮＡを一方のプライマーとして合成し、アニーリング温度を厳密に制御しながらヒト由来試料を鋳型としてＰＣＲを行い、増幅産物の存在の有無により遺伝子多型を判別する方法である。該方法も上記と同様、交叉反応を防ぐためにＰＣＲの条件を高度に制御する必要があるが、自動サーマルサイクラー中で反応を行えば、比較的に容易に正確な判別が可能である。
【００２０】
上記（２）の方法としては、以下のＰＣＲ−ＳＳＣＰ（single-strand conformation polymorphism ）法、ＰＣＲ−ＤＧＧＥ（denaturing gradient gel electrophoresis ）法、ＰＣＲ−ＣＦＬＰ（cleavase fragment length polymorphism ）法等が挙げられる。これらの方法は、いずれも（１）のシーケンス法と同様にして、多型部位を内部に含む適当な長さの各遺伝子断片を増幅することを第一の工程として含む。
【００２１】
ＰＣＲ−ＳＳＣＰ法では、増幅産物を加熱またはアルカリ処理等により一本鎖に変性する。一本鎖に解離したＤＮＡ断片はその塩基配列に依存した独自の高次構造を形成するので、これをポリアクリルアミドゲル等の非変性ゲル上で電気泳動することにより、１塩基置換の多型を移動度の差として検出することができる。
【００２２】
ＰＣＲ−ＤＧＧＥ法では、増幅産物を変性・再会合させた後、変性剤（ＳＤＳ、尿素、ホルムアミドなど）の濃度勾配をつけた変性ゲル上で電気泳動する。１塩基置換の多型は、それを含むドメインの融解温度（Ｔm ）を変化させるので、異なる変性剤濃度の位置で部分解離し、その結果異なる移動度を示す。特に、ヘテロ接合体のＤＮＡの場合、変性・再会合により、野生型および変異型のホモデュプレックスと、ミスマッチを有する２種のヘテロデュプレックスとが生成されるので、４本のバンドが検出される。但し、最もＴm の高いドメイン中に変異を有する場合は移動度に差が生じない。その場合は、ＧＣクランプと呼ばれる約２０〜約５０ｂｐのＧＣリッチな配列を５’側に付加すれば、その部分が最もＴm の高いドメインになるので、多型を移動度の差として検出することができる。
【００２３】
ＰＣＲ−ＣＦＬＰ法は、増幅産物を加熱またはアルカリ処理等により一本鎖に変性し、さらにcleavaseと呼ばれるヘアピン構造を認識して切断する酵素で処理した後、ゲル電気泳動を行う方法であり、多型によるヘアピン構造の有無またはヘアピン形成部位の相違をバンドの数および／または移動度の差として検出することができる。
【００２４】
上記（３）の方法も、迅速且つ簡便に遺伝子多型を測定できるので好ましい。このような方法としては、ＲＦＬＰ法、ＰＣＲ−ＲＦＬＰ法等が挙げられる。
【００２５】
ＲＦＬＰ法は、ヒト由来試料から単離したゲノムＤＮＡを、一方の遺伝子多型を多型部位で切断し得る制限酵素（さらに必要に応じて、該多型部位の上流および下流の適当な部位でゲノムＤＮＡを切断し得る他の制限酵素）で消化し、当該遺伝子の部分配列または全配列をプローブとしてサザンハイブリダイゼーションを行い、バンドの長さおよび数に基づいて多型を判別する方法である。本発明においては、ＶＤＲ遺伝子の分析にはBsm I が、ＥＲ遺伝子の分析にはXba I が、ＡｐｏＥ遺伝子の分析にはHha I がそれぞれ使用される。
【００２６】
ＰＣＲ−ＲＦＬＰ法は、ＶＤＲ遺伝子、ＥＲ遺伝子およびＡｐｏＥ遺伝子のそれぞれの多型部位を内部に含む適当な長さの各遺伝子断片を増幅し得るような特異的プライマー対を合成し、該プライマー対を用い、ヒト由来試料を鋳型としてＰＣＲを行い、目的の各遺伝子断片を増幅させた後、増幅産物について上記のＲＦＬＰ法と同様の制限酵素処理を行い、ゲル電気泳動してバンドの長さおよび数から多型を判別する方法である。また、ＰＣＲに先立って制限酵素処理を行えば、制限酵素で切断されるＤＮＡは遺伝子増幅されないので、バンドの有無により多型を判別することができる。
【００２７】
上記のような本発明の多型分析により、ヒト由来試料は、ＶＤＲ遺伝子、ＥＲ遺伝子およびＡｐｏＥ遺伝子の遺伝子多型の組み合わせに基づいて、[B(-) X(-) 4(-)], [B(-) X(-) 4(+)], [B(-) X(+) 4(-)], [B(-) X(+) 4(+)], [B(+) X(-) 4(-)], [B(+) X(-) 4(+)], [B(+) X(+) 4(-)]および[B(+) X(+) 4(+)]に類別される。
【００２８】
本発明は、上記の遺伝子多型の組み合わせに基づいて、該ヒト由来試料が、複数の骨粗鬆症治療薬に対する感受性において特定の優先性を示す個人由来のものであると予測することを特徴とする。本発明において、複数の骨粗鬆症治療薬とは、好ましくはビタミンＤ、エストロゲンおよびビタミンＫ2 である。また、ここで骨粗鬆症治療薬に対する感受性とは、治療薬の骨粗鬆症治療効果の度合いの大きさを意味する。すなわち、ある患者において薬剤Ａが薬剤Ｂよりも治療効果が高い場合には、「その患者の薬剤Ａに対する感受性は薬剤Ｂに対する感受性に比べて高い」。本発明においては、薬剤投与前後での骨塩量の変化率を感受性の指標とし、［骨塩量変化率］−［期待骨塩量変化率］の値が大きい程、その薬剤に対する感受性が高いと定義する。
【００２９】
本発明の分析方法では、ＶＤＲ遺伝子、ＥＲ遺伝子およびＡｐｏＥ遺伝子の遺伝子多型の組み合わせが[B(-) X(-) 4(-)]および[B(+) X(-) 4(-)]の場合、ビタミンＫ2 に対する感受性が、ビタミンＤに対する感受性およびエストロゲンに対する感受性に比べて高い個人由来の試料であると予測し、遺伝子多型の組み合わせが[B(-) X(-) 4(+)]の場合、ビタミンＤに対する感受性が、ビタミンＫ2 に対する感受性およびエストロゲンに対する感受性に比べて高い個人由来の試料であると予測し、遺伝子多型の組み合わせが[B(-) X(+) 4(-)], [B(-) X(+) 4(+)]および[B(+) X(+) 4(-)]の場合、エストロゲンに対する感受性が、ビタミンＤに対する感受性およびビタミンＫ2 に対する感受性に比べて高い個人由来の試料であると予測することを特徴とする。
【００３０】
本発明はまた、上記の分析方法を実施するのに有用なヒトゲノムＤＮＡ含有試料の遺伝子多型分析用キットを提供する。本発明のキットは、ＶＤＲ遺伝子を特異的に増幅し得るプライマー対、ＥＲ遺伝子を特異的に増幅し得るプライマー対およびＡｐｏＥ遺伝子を特異的に増幅し得るプライマー対、および／またはＶＤＲ遺伝子と特異的にハイブリダイズし得る核酸プローブ、ＥＲ遺伝子と特異的にハイブリダイズし得る核酸プローブおよびＡｐｏＥ遺伝子と特異的にハイブリダイズし得る核酸プローブを含む。
【００３１】
多型分析にシーケンス法、ＰＣＲ−ＳＳＯＰ法、ＰＣＲ−ＳＳＣＰ法、ＰＣＲ−ＤＧＧＥ法、ＰＣＲ−ＣＦＬＰ法等を用いる場合、各プライマー対は、多型部位を内部に含む各遺伝子断片を増幅し得るように、各遺伝子の多型部位よりも上流の配列と、多型部位よりも下流の配列と同一の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドが使用される。一方、ＭＡＳＡ法を用いる場合は、一方のプライマーは、各遺伝子の多型部位を含む領域に完全相同的（＝センス）または完全相補的（＝アンチセンス）な塩基配列を有するものである。
【００３２】
また、多型分析にＲＦＬＰ法を用いる場合、核酸プローブは各遺伝子の一部または全部の配列を含むものであれば特に制限されず、多型部位の配列を必ずしも含む必要はない。一方、多型分析にＳＳＯＰ法またはＰＣＲ−ＳＳＯＰ法を用いる場合、核酸プローブは、各遺伝子の多型部位を含む領域の配列に完全相補的な塩基配列を有するものである。
【００３３】
本発明のキットは、本発明の分析方法を実施するのに好適な各種試薬および／または器具等をさらに含んでいてもよい。
【００３４】
【実施例】
以下、参考例および実施例を用いて、本発明を詳細に説明する。
【００３５】
参考例１
無作為に選んだ閉経後の１７７人の日本人女性から血液を採取し、血球細胞を分画して、常法によりゲノムＤＮＡを抽出精製した。該ゲノムＤＮＡを鋳型とし、下記のプライマー対を用いてＶＤＲ遺伝子断片、ＥＲ遺伝子断片およびＡｐｏＥ遺伝子断片をそれぞれ別個に増幅した。
ＶＤＲ遺伝子断片増幅用プライマー：
センス： 5'-CAACCAAGACTACAAGTACCGCGTCAGTGA-3' （配列番号１）
アンチセンス：5'-AACCAGCGGGAAGAGGTCAAGGG-3' （配列番号２）
ＥＲ遺伝子断片増幅用プライマー：
センス： 5'-CTGCCACCCTATCTGTATCTTTTCCTATTCTCC-3' （配列番号３）
アンチセンス：5'-TCTTTCTCTGCCACCCTGGCGTCGATTATCTGA-3' （配列番号４）
ＡｐｏＥ遺伝子断片増幅用プライマー：
センス： 5'-TAAGCTTTGGCACGGCTGTCCAAGGA-3' （配列番号５）
アンチセンス：5'-ACAGAATTCGCCCCGGCCTGGTACAC-3' （配列番号６）
ＰＣＲ条件は、ＶＤＲ遺伝子については、変性：９４℃、６０秒；アニーリング：６２℃、６０秒；伸長：７２℃、６０秒（３０サイクル）、ＥＲ遺伝子については、変性：９４℃、３０秒；アニーリング：６５℃、３０秒；伸長：７２℃、３０秒（３０サイクル）、ＡｐｏＥ遺伝子については、変性：９４℃、３０秒；アニーリング：６１℃、４０秒；伸長：７２℃、９０秒（３０サイクル）であった。このＰＣＲ増幅により、多型部位を含む７．２ｋｂｐのＶＤＲ遺伝子断片、１．３ｋｂｐのＥＲ遺伝子断片および２４４ｂｐのＡｐｏＥ遺伝子断片がそれぞれ得られる。ＶＤＲ遺伝子増幅反応液をBsm I で、ＥＲ遺伝子増幅反応液をXba I で、ＡｐｏＥ遺伝子増幅反応液をHha I でそれぞれ処理した後、アガロースゲル電気泳動にかけた。各増幅産物が多型部位において制限酵素で切断される場合、ＶＤＲ増幅産物では４．６ｋｂｐと２．６ｋｂｐ、ＥＲ増幅産物では９００ｂｐと４００ｂｐ、ＡｐｏＥ増幅産物では７２、４８、３８、３５、１９、１７および１５ｂｐのバンドが検出される。４型を持たない（すなわち、4(-)）場合は認められない７２ｂｐのバンドが検出される。泳動終了後、エチジウムブロマイドでゲルを染色し、バンドパターンからＶＤＲ、ＥＲおよびＡｐｏＥの遺伝子多型を判別し、８つの多型群に類別した（表２）。
【００３６】
上記のように多型分析を行った日本人女性１７７人の骨塩量をそれぞれ測定した。次いで、これらの患者にビタミンＤ3 、エストロゲンまたはビタミンＫ2 のいずれかを６ヶ月間投与した。投与量はビタミンＤ3 が１μｇ／日、エストロゲンが０．３１２ｍｇ／日およびビタミンＫ2 が４５ｍｇ／日であった。６ヶ月後に再度骨塩量を測定し、薬剤投与前の骨塩量に対する変化率を求めた。各遺伝子型別の平均骨塩量変化率から各薬剤の治療効果期待値（無作為に抽出した患者に対する全平均治療効果；表１）を差し引いた値を各遺伝子型における薬剤感受性とした。その結果を表２に示す。
【００３７】
【表１】
【表２】
表２から明らかなように、遺伝子型が[B(-) X(-) 4(-)]および[B(+) X(-) 4(-)]の場合、ビタミンＫ2 に対する感受性が、ビタミンＤに対する感受性およびエストロゲンに対する感受性に比べて高く、遺伝子型が[B(-) X(-) 4(+)]の場合、ビタミンＤに対する感受性が、ビタミンＫ2 に対する感受性およびエストロゲンに対する感受性に比べて高く、遺伝子型が[B(-) X(+) 4(-)], [B(-) X(+) 4(+)]および[B(+) X(+) 4(-)]の場合、エストロゲンに対する感受性が、ビタミンＤに対する感受性およびビタミンＫ2 に対する感受性に比べて高かった。
【００４０】
実施例１
ある日本人の骨粗鬆症患者から血液を採取し、血球細胞を分画して、常法によりゲノムＤＮＡを抽出精製する。該ゲノムＤＮＡを鋳型とし、参考例１と同様の方法でＶＤＲ遺伝子、ＥＲ遺伝子およびＡｐｏＥ遺伝子の多型を分析する。得られた遺伝子型が[B(-) X(-) 4(-)]および[B(+) X(-) 4(-)]の場合、該ゲノムＤＮＡは、ビタミンＫ2 に対する感受性が、ビタミンＤに対する感受性およびエストロゲンに対する感受性に比べて高い個人由来のものであると判定し、遺伝子型が[B(-) X(-) 4(+)]の場合、該ゲノムＤＮＡは、ビタミンＤに対する感受性が、ビタミンＫ2 に対する感受性およびエストロゲンに対する感受性に比べて高い個人由来のものであると判定する。さらに、遺伝子型が[B(-) X(+) 4(-)], [B(-) X(+) 4(+)]および[B(+) X(+) 4(-)]の場合、該ゲノムＤＮＡは、エストロゲンに対する感受性が、ビタミンＤに対する感受性およびビタミンＫ2 に対する感受性に比べて高い個人由来のものであると判定する。
【００４１】
【発明の効果】
本発明の分析方法によれば、投薬前に対象となる患者がどの骨粗鬆症治療薬に対してより感受性が高いかを高い確率で予測することができるので、適切な薬剤の選択が可能となる。したがって、治療効果の乏しい薬剤を長期間投与するという非効率的な治療を回避することができ、患者のＱＯＬを向上することができる点で極めて有用である
【００４２】
【配列表のフリーテキスト】
配列番号１：多型部位を含むＶＤＲ遺伝子の断片を増幅するためのプライマーとして働くべく設計されたオリゴヌクレオチド。
配列番号２：多型部位を含むＶＤＲ遺伝子の断片を増幅するためのプライマーとして働くべく設計されたオリゴヌクレオチド。
配列番号３：多型部位を含むＥＲ遺伝子の断片を増幅するためのプライマーとして働くべく設計されたオリゴヌクレオチド。
配列番号４：多型部位を含むＥＲ遺伝子の断片を増幅するためのプライマーとして働くべく設計されたオリゴヌクレオチド。
配列番号５：多型部位を含むＡｐｏＥ遺伝子の断片を増幅するためのプライマーとして働くべく設計されたオリゴヌクレオチド。
配列番号６：多型部位を含むＡｐｏＥ遺伝子の断片を増幅するためのプライマーとして働くべく設計されたオリゴヌクレオチド。
【００４３】
【配列表】
Claims (1)
- ヒトから採取した試料中に含まれるゲノムＤＮＡから、ビタミンＤ受容体遺伝子、エストロゲン受容体遺伝子およびアポリポ蛋白Ｅ遺伝子のそれぞれの遺伝子多型を分析し、これらの遺伝子多型の組み合わせが、
（ｉ） [B(-) X(-) 4(+)] の場合、ビタミンＤに対する感受性が、ビタミンＫ ２ に対する感受性およびエストロゲンに対する感受性に比べて高い個人由来の試料であると予測し、
（ｉｉ） [B(-) X(-) 4(-)] および [B(+) X(-) 4(-)] の場合、ビタミンＫ ２ に対する感受性が、ビタミンＤに対する感受性およびエストロゲンに対する感受性に比べて高い個人由来の試料であると予測し、
（ｉｉｉ） [B(-) X(+) 4(-)] 、 [B(-) X(+) 4(+)] および [B(+) X(+) 4(-)] の場合、エストロゲンに対する感受性が、ビタミンＤに対する感受性およびビタミンＫ ２ に対する感受性に比べて高い個人由来の試料であると予測する
ことを特徴とする骨粗鬆症薬剤感受性予測方法（ここで、 B は第８エクソンと第９エクソンの間のイントロン領域内で Bsm I により切断されないビタミンＤ受容体対立遺伝子を、 X は第１エクソンと第２エクソンの間のイントロン領域内で Xba I により切断されないエストロゲン受容体対立遺伝子を、 4 はＡｐｏＥ ４ 型アポリポ蛋白Ｅ対立遺伝子をそれぞれ表し、（ + ）および（ - ）はその対立遺伝子を有するおよび有しないことをそれぞれ表している）。
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