WO2006073183A1 - 一塩基多型を用いた炎症性疾患の判定方法 - Google Patents

一塩基多型を用いた炎症性疾患の判定方法 Download PDF

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Toshihiro Tanaka
Yusuke Nakamura
Yozo Ohnishi
Koichi Ozaki
Aritoshi Iida
Masatsugu Hori
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Riken
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    • C12Q2600/172—Haplotypes

Definitions

  • the present invention relates to a method for diagnosing an inflammatory disease comprising detecting genetic polymorphisms present in the LBP-32 gene, TSBP gene, and WAP gene, the oligonucleotide used in the method, and the oligonucleotide
  • the present invention relates to kits for diagnosing inflammatory diseases including the same, and use thereof.
  • a common genetic variation may strongly affect the expression level and Z or function of a gene product. This common mutation may be associated with disease susceptibility and Z or pharmacological response (Dean M, et al. (1996) Genetic restriction of HIV-1 infection and progression to AIDS by a deletion allele of the CKR5 structural gene. Hemophilia G rowth and Development Study, Multicenter AIDS Cohort Study, Multicenter Hemop hilia Cohort Study, San Francisco City Cohort, ALIVE Study.Science 273: 1856-1862; Risch N, et al. (1996) The luture of Science 273: 1516-1517; and Kruglyak L (1997) The use of a genetic map of biallelic markers in linkage studies. Nat Genet 17: 21-24).
  • SNP is the simplest and most common DNA polymorphism. SNPs exist on the genome every few hundred bases on average, and it is relatively easy to identify genotypes and analyze data. In recent years, the hypothesis that common mutations contribute to general diseases and pharmacological constitutions has been proposed, which is referred to as the “common mutation common mutation” hypothesis (Rise h N, et al. (1996) The future of genetic studies of complex human diseases. Science 27 3: 1516-1517). From this point of view, SNP is a useful marker for identifying genes related to common diseases (Kruglyak L (1999) Prospects for whole-genome linkage disequilibrium mapping of common disease genes. 22: 139— ⁇ 44).
  • Myocardial infarction is one of the most common diseases in Japan. Obesity, smoking, diabetes, hypertension and hyperlipidemia are well known risk factors for myocardial infarction. But various Family was an independent risk factor for myocardial infarction in the population (Andresdottir MB, et al., (200
  • the present inventors constructed a large SNP database containing SNPs based on more than 170,000 genes (Haga H, et al. (2002) Gene-based SNP discovery as part of the Japan se Millennium Genome Project: identification of 190,562 genetic variations in the hu man genome. Single—nucleotide polymorphism. J Hum Genet 47: 605—610). The present inventors also developed a high-throughput genotyping system and performed 450,000 genotyping per day (Ohnishi Y, et al. (2001) A high-throughput SNP typing system for genome). -wide association studies. J Hum Genet 46: 471-477).
  • An object of the present invention is to identify a novel single nucleotide polymorphism (SNP) involved in the development of inflammatory diseases such as myocardial infarction. Another object of the present invention is to provide a method for diagnosing inflammatory diseases such as myocardial infarction or a method for developing a therapeutic agent for inflammatory diseases using the identified SNPs. Means for solving the problem
  • the present invention was completed by identifying that the single nucleotide polymorphism (SNP) present in the P gene and the WAP gene is related to the progression of myocardial infarction.
  • SNP single nucleotide polymorphism
  • the present invention comprises detecting at least one gene polymorphism present in at least one gene selected from the group consisting of LBP-32 gene, TSBP gene, and WAP gene.
  • a method for determining an inflammatory disease is provided.
  • the method comprises detecting at least one single nucleotide polymorphism present in at least one gene selected from the group force consisting of LBP-32 gene, TSBP gene, and WAP gene.
  • a method for determining an inflammatory disease is provided.
  • a method for determining an inflammatory disease comprising detecting at least one single nucleotide polymorphism that is also selected from the following group forces (1) to (3):
  • LBP Polymorphism of GZA at the 151st base of the nucleotide sequence of intron 1 of 32 genes
  • the inflammatory disease is myocardial infarction.
  • the sequence is hybridized to a sequence of at least 10 bases including at least one site selected from the following group forces (1) to (3) or a complementary sequence thereof:
  • an oligonucleotide used as a probe is provided by the above-described method of the present invention.
  • LBP the 151st base of the intron 1 base sequence of 32 genes
  • the oligonucleotide can be amplified and used as a primer in the method of the present invention described above.
  • LBP the 151st base of the intron 1 base sequence of 32 genes
  • the primer is a forward primer and a Z or reverse primer
  • an inflammatory disease diagnostic kit comprising one or more of the oligonucleotides of the present invention described above.
  • the inflammatory disease is myocardial infarction.
  • the method includes detecting at least one single nucleotide polymorphism selected from the following group forces consisting of (1) to (3): LBP_32, TSBP, or A method for analyzing the expression state of WAP is provided.
  • LBP Polymorphism of GZA at the 151st base of the nucleotide sequence of intron 1 of 32 genes
  • an expression level of an LBP-32 gene, a TSBP gene, or a WAP gene in a cell is analyzed in the presence of a candidate substance, and a substance that changes the expression level is selected.
  • a method for screening for a therapeutic agent for inflammatory diseases is provided.
  • SNPs single nucleotide polymorphisms in the LBP-32 gene, the TSBP gene, and the WAP gene are identified, and genotype typing is performed for the myocardial infarction patient group and the control group, respectively.
  • genotype typing is performed for the myocardial infarction patient group and the control group, respectively.
  • SN in the LBP-32 gene, TSBP gene, or WAP gene is used.
  • P is related to diseases such as myocardial infarction. Therefore, by using the SNP in the LBP-32 gene, TSBP gene, or WAP gene identified by the present invention, it is possible to develop new diagnosis, prevention methods, and therapeutic drugs for inflammatory diseases such as myocardial infarction. become.
  • embodiments of the present invention will be described more specifically.
  • the method of the present invention detects inflammation by detecting gene polymorphisms, particularly single nucleotide polymorphisms (SNPs) present in the LBP-32 gene, TSBP gene, or WAP gene that are associated with inflammatory diseases.
  • SNPs single nucleotide polymorphisms
  • “at least one gene polymorphism (single nucleotide polymorphism, etc.) present in at least one gene selected from the group consisting of LBP-32 gene, TSBP gene, and WAP gene is detected.
  • LBP polymorphism of GZA at base 151 of the base sequence of intron 1 of the 32 gene (its base sequence is shown in SEQ ID NO: 1);
  • determination of a disease means determination of whether or not a disease has occurred, determination of the possibility of disease development (prediction of risk of morbidity), elucidation of genetic factors of the disease, and the like. .
  • the "judgment" of a disease may be performed in combination with the result of the above-described single nucleotide polymorphism detection method and, if desired, other polymorphism analysis (VNTR or RFLP) and Z or other test results. it can.
  • the term "inflammatory disease” is not particularly limited as long as it is a disease in which induction of cell adhesion factor or site force-in, which is known to be correlated with an inflammatory disease state, is observed. Examples include rheumatoid arthritis, systemic lupus erythematosus, inflammatory bowel disease, various allergic reactions, bacterial shock, arteriosclerotic diseases such as myocardial infarction and stroke, and particularly myocardial infarction.
  • Genomic DNA is preferred as the target for detection of genetic polymorphism, but in some cases (ie, when the polymorphic site and its adjacent region are identical or completely complementary to the genome), cDNA or mRNA is used. You can also The sample from which the subject is collected includes any biological sample, for example, body fluid such as blood, bone marrow fluid, semen, peritoneal fluid, urine; tissue cell such as liver; body hair such as hair. . Genomic DNA and the like can be extracted, purified and prepared from these samples according to a conventional method.
  • a portion containing the gene polymorphism is amplified.
  • the amplification may be performed by, for example, the force performed by the PCR method or other known amplification methods such as NASBA method, LCR method, SDA method, LAMP method and the like.
  • the selection of the primer is, for example, a sequence of at least 10 bases or more, preferably 10 to: L00 bases, more preferably 10 to 50 bases, including the above-described single nucleotide polymorphic site of the present invention, and Z Alternatively, it is carried out so as to amplify its complementary sequence.
  • the primer may include one or more substitutions, deletions, and additions in the sequence as long as it can function as a primer for amplifying a sequence having a predetermined number of bases including the single nucleotide polymorphism site.
  • the primer used for amplification is selected so that one of the forward primer and the reverse primer is allowed to hybridize to the single nucleotide polymorphism site so that it is amplified only when the sample is of one allele type. Moyo.
  • the primer can be labeled with a fluorescent substance or a radioactive substance if necessary.
  • Genetic polymorphism can be detected by hybridization with a probe specific to one allele type.
  • the probe may be labeled with an appropriate means such as a fluorescent substance or a radioactive substance, if necessary.
  • the probe is not particularly limited as long as it contains the single nucleotide polymorphism site described above, hybridizes with the sample to be tested, and provides specificity that is detectable under the detection conditions employed.
  • the probe for example, at least 10 or more consecutive bases containing the single nucleotide polymorphic site, preferably 10 to: a sequence of L00 base, more preferably a sequence of 10 to 50 bases, or a complementary sequence thereof is hybridized. Oligonucleotides that can be used.
  • the invader method or TaqMan-PCR method can be used.
  • the oligonucleotide is capable of functioning as a probe, i.e., capable of hybridizing to the allelic sequence of interest, as long as it does not hybridize to other allelic sequences and is noblyzed under conditions, It may contain one or more substitutions, deletions, additions.
  • the probe is annealed with the genomic DNA as in the single-stranded probe (padlock probe) used for amplification by the RCA (rolling circle amplification) method. Probes that satisfy the probe conditions are included.
  • the hybridization conditions used in the present invention are sufficient to distinguish allelic types. It is a condition.
  • the conditions such as stringent conditions are such that the ability to hybridize if the sample is of one allelic type does not hybridize if the sample is of the other allelic form.
  • examples of the “stringent conditions” include the conditions described in Molecular Cloning Laboratories, Second Edition (Sambrook et al., 1989).
  • 6 X SSC composition of 1 X SSC: 0.15 M NaCl, 0.015 M sodium citrate, pH 7.0), 0.5% SDS, 5 X dentonate and 100 mgZml-
  • composition of 1 X SSC 0.15 M NaCl, 0.015 M sodium citrate, pH 7.0
  • 0.5% SDS 0.5% SDS
  • 5 X dentonate 100 mgZml-
  • the condition of keeping the solution at 65 ° C with a probe in solution containing synsperm DNA For example, the condition of keeping the solution at 65 ° C with a probe in solution containing synsperm DNA.
  • the probe can also be used as a DNA chip with one end fixed to a substrate.
  • the probe corresponding to one allele type may be fixed to the DNA chip, or the probes corresponding to both allele types may be fixed.
  • the detection of gene polymorphism can also be performed by restriction fragment length polymorphism (RFLP) analysis.
  • RFLP restriction fragment length polymorphism
  • the sample nucleic acid is digested with restriction enzymes that differ in their ability to be cleaved by the restriction enzyme depending on the genotype of the single nucleotide polymorphism site, and the size of the digest fragments is determined. By examining, whether or not the sample nucleic acid has been cleaved with the restriction enzyme is examined, and thereby the polymorphism of the sample is analyzed.
  • Detection of a gene polymorphism may be performed by directly sequencing an amplification product (direct sequencing method). Sequencing can be performed by a known method such as the dideoxy method or the Maxam-Gilbert method.
  • Detection of gene polymorphism is also possible by denaturing gradient gel electrophoresis (DGGE), single strand conformation polymorphism (SSCP), allele-specific.
  • DGGE denaturing gradient gel electrophoresis
  • SSCP single strand conformation polymorphism
  • PCR allele-specific PCR
  • ASO all ele-specific oligonucleotide hybridization
  • CCM chemical cleavage of mismatches
  • HET heteroduplex method
  • PEX primer extension
  • RCA rolling circle amplification
  • Kit for diagnosis of inflammatory diseases The oligonucleotide as the primer or probe can be provided as a kit for diagnosing inflammatory diseases including the kit.
  • the kit is a restriction enzyme, polymerase, nucleoside triphosphate, label, used in the above-described method for analyzing a gene polymorphism. It may contain a buffer solution or the like.
  • the expression state of LBP_32, TSBP or WAP can also be analyzed by detecting the single nucleotide polymorphism described above.
  • inflammation is detected by analyzing the expression level of LBP-32 gene, TSBP gene, or WAP gene in cells in the presence of a candidate substance, and selecting a substance that changes the expression level.
  • Therapeutic agents for sexual diseases can be screened. For example, by analyzing the expression level of LBP-32 gene, TSBP gene, or WAP gene in cells in the presence of a candidate substance, a substance that increases or decreases the expression level can be selected. Substances that increase the amount can be selected.
  • Examples of the screening include a step of contacting a cell with a candidate substance, a step of analyzing the expression level of LBP-32 gene, TSBP gene, or WAP gene in the cell, and absence of the candidate substance. It can be carried out by selecting a candidate substance that changes the expression level of the gene as compared with the following conditions as a therapeutic agent for inflammatory diseases.
  • Any substance can be used as a candidate substance.
  • the types of candidate substances are not particularly limited, and may be individual low-molecular synthetic compounds, compounds existing in natural product extracts, compound libraries, phage display libraries, and combinatorial libraries. .
  • the candidate substance is preferably a low molecular compound, and a compound library of low molecular compounds is preferable.
  • the construction of compound libraries is known to those skilled in the art, and commercially available compound libraries can also be used.
  • LBP-32 gene comprising the single nucleotide polymorphism as described above, TSBP gene,
  • the transcriptional activity of the LBP-32 gene, the TSBP gene, or the WAP gene can be measured by introducing a WAP gene fragment into a cell, culturing the cell, and analyzing the expression of the gene.
  • a transcription unit in which a reporter gene is bound downstream of the LBP-32 gene, TSBP gene, or WAP gene fragment is introduced into cells, the cells are cultured, and reporter activity is induced. Analyzing the expression of the gene by measuring
  • the cells into which the reporter gene is inserted downstream of the gene containing the single nucleotide polymorphism are cultured, and the reporter activity is measured. By doing so, it is possible to measure differences in transcription efficiency due to single nucleotide polymorphisms.
  • reporter gene genes such as luciferase, chloramphene-coal, facetyltransferase, and galactosidase are used.
  • the LBP-32 gene, TSBP gene, or WAP gene fragment containing the single nucleotide polymorphism described above is introduced into cells, and the transcriptional activity of the LBP-32 gene, TSBP gene, or WAP gene is measured. Screening a substance that inhibits or promotes the transcriptional activity of LBP-32 gene, TSBP gene, or WAP gene by culturing the cell in the presence of a candidate substance to be inhibited or promoted and analyzing the expression of the gene it can.
  • a transcription unit in which a reporter gene is bound downstream of the LBP-32 gene, TSBP gene, or WAP gene fragment is introduced into cells, the cells are cultured, and reporter activity is induced. Analyzing the expression of the gene by measuring
  • a cell introduced with a system in which a reporter gene is inserted downstream of a gene having a single nucleotide polymorphism in which the expression level of LBP-32 gene, TSBP gene, or WAP gene is significantly high is observed. If the reporter activity decreases when cultured in the presence or absence of the candidate substance and cultured in the presence of the candidate substance, the candidate substance is LBP-32 gene, TSBP gene, or WAP. Selected as a gene transcriptional activity inhibitor Can be selected.
  • candidate substance Any substance can be used as a candidate substance.
  • the types of candidate substances are not particularly limited, and may be individual low-molecular synthetic compounds, compounds existing in natural product extracts, compound libraries, phage display libraries, and combinatorial libraries. .
  • the candidate substance is preferably a low molecular compound, and a compound library of low molecular compounds is preferable.
  • the construction of compound libraries is known to those skilled in the art, and commercially available compound libraries can also be used.
  • Substances that inhibit or promote the transcriptional activity of the LBP-32 gene, TSBP gene, or WAP gene obtained by the above screening method are also within the scope of the present invention.
  • Such substances that inhibit or promote the transcriptional activity of LBP-32 gene, TSBP gene, or WAP gene are useful as candidate substances for various drugs such as therapeutic agents for myocardial infarction, anti-inflammatory agents, and immunosuppressive agents. .
  • the gene fragment containing the single nucleotide polymorphism described above is brought into contact with a sample expected to contain a transcriptional regulatory factor for the LBP-32 gene, TSBP gene, or WAP gene, and the fragment is subjected to transcriptional control.
  • a transcriptional control factor of LBP-32 gene, T SBP gene, or WAP gene can also be screened.
  • the detection of the binding between the gene fragment containing the single nucleotide polymorphism described above and a substance expected to have a transcription factor of the LBP-32 gene, TSBP gene, or WAP gene is detected by gel shift method (electrophoresis).
  • Mobility shift analysis Force that can be performed by electrophoretic mobility shift assay (EMSA), DNase I footprint method, etc.
  • Gel shift method is preferable.
  • a protein transcription regulator
  • the molecular size increases and the mobility of DNA in electrophoresis decreases, so mix the gene fragment labeled with 32 P with a transcription regulator and apply it to gel electrophoresis.
  • the factor-bound DNA moves slowly, and is detected as a band that moves later than the normal band.
  • a Japanese patient with myocardial infarction was used. Two of the following three criteria are required for a clear diagnosis of myocardial infarction: (i) central pressure lasting 30 minutes or more, history of pain or suffering, (ii) at least one criterion or 2 ST-segment increase of 0.1 mV or more in two chest leads, or (iii) serum creatine kinase concentration increased more than 2-fold from normal experimental values.
  • the control group consisted of Japanese people. All patients agreed to participate in this study.
  • the SNP genotype of the critical region was determined by direct sequencing of PCR products using Invader Atssey or Cavity Sequencer (ABI3700, Applied Biosystems, CA) (Iida A, et al., ( 2001) Catalog of 258 single-nucleotide polymorphisms (SNPs) in genes encoding tnree organic anion trans porters, three organic anion— transporting characteristics, and three NADH: ubiquinone oxidoreductase flavoproteins. J Hum Genet 46: 668-683; and Ohnishi Y, et al. (2001) A high-throughput SNP typing system for genome-wide association studies. J Hum Genet 46: 471-477).
  • Haplotype fading was estimated by the EM-algorithm (Excoffier L, et al., (1995) Maximum-likelihood estimation of mole cular haplotype frequencies in a diploid population. Mol Biol Evol 12: 921-927). Haplotype blocks were constructed as previously described (Daly MJ, et al. (2001) High-resolution haplotype structure in the human genome. Nat Genet 29: 229-232), with the following improvements. First, to simplify the next analysis, adjacent SNPs that are absolutely linked to a single representative SNP were clustered. Next, we constrained that a common set of haplotypes of maxN + 1, 2 ° (where N is the number of SNPs in the block) cover more than 90% of the population. In order to eliminate ambiguity, the SNP site misalignment was excluded from the calculation of the haplotype frequency.
  • nuclear extracts were prepared from HeLa cells and labeled with 32 P 28 bp oligonucleotide 5'-TCCACGCCGCCACGGCCTTTGCCCCTTA-3 '(allele G) (SEQ ID NO: 4); -Incubated with 3 '(allele A) (SEQ ID NO: 5).
  • extracted nuclei were preincubated with unlabeled oligonucleotides (100-fold excess) prior to the addition of 32 P-labeled oligonucleotides. Protein DNA complexes were separated on native 8% polyacrylamide gels in 0.5 X Tris-borate-EDTA buffer. The signal was detected by Autographi.
  • cDNAs are in the form of cages, and 5'-ACTTTGGCTGTCATCCTGAC-3 '(SEQ ID NO: 6) and 5'-CTTGATAGGTCC TGTAGCTC-3' (SEQ ID NO: 7) (for TSBP), 5'-AGCGCGATGACACAGGAGTA-3 '( SEQ ID NO: 8) and 5'-CGTTGCTATGGAGACAGTGA-3, (SEQ ID NO: 9) (for LBP-32), 5 -TGGTATCGTGGAAGGACTCAT-3 '(SEQ ID NO: 10) and 5'- GTGGGTGTCGC TGTTGAAGTC-3' (SEQ ID NO: 11) (PCR amplification was performed using GAPDH as an internal reference.
  • pTSBP-myc was constructed by inserting TSBP cDNA cleaved with Not Xhol into pCMV-myc (Clontech, Palo Alto, Calif.).
  • pLBP32-Flag was constructed by inserting LBP-32 cDNA cut with Notl-Sall into pFLAG-CMV5a (Sigma).
  • HCASMC cells (5 ⁇ 10 5 ) were transfected with 5 ⁇ g of pTSBP-myc or pLBP32-Flag using human AoSMC Nucleofector Kit (amaxa biosystems) and inoculated on a collagen-coated glass slide. After 24 hours, cells were fixed and treated with antibodies. Nuclei were stained with DAPI (Sigma).
  • LBP-32 region LBP-32 region
  • LBP-32 To identify all gene mutations in LBP-32, approximately 52 kb encompassing all of the LBP-32 exons was screened. A total of 40 polymorphisms were identified in this region, and the genotypes of 190 myocardial infarction patients and 190 healthy subjects were determined. As a result of this genotyping, there was no significant correlation except for LBP-32 intron 1 + 151G> A.
  • TSBP TSBP
  • approximately 80 kb encompassing all of its etasons was screened. A total of 216 polymorphisms were identified in this region.
  • SNP SNP found above with an allele frequency of 20% or more to determine the genotype of 95 patients with myocardial infarction and 95 healthy subjects.
  • a halotype block containing TSBP Exon 25 306A> G that shows a significant correlation (Fig. 2b).
  • WAP7-13 and TNNC2 were screened. A total of 54 polymorphisms were identified in this region, and the genotypes of 95 patients with myocardial infarction and 95 healthy subjects were determined. As a result of this genotyping, a halotype block containing SNP in the 3 ′ flanking region of the WAP12 gene was found. This halotype block is composed of 18 SNPs spanning approximately 1 OOkb. Another 475 minds about these 18 SNPs Genotypes were further determined for 475 healthy subjects, separate from patients with myocardial infarction. As a result, the most significant correlation was observed among multiple SNPs including WAP12 gene 3, flanking region + 1264G> A (Fig. 3b).
  • RT-PCR was used to analyze the gene expression of TSBP and LBP-32.
  • TSBP transcripts were detected in coronary artery endothelial cells (HCAEC) and coronary artery smooth muscle cells (HCASMC) ( Figure 4a).
  • LBP-32 transcripts were detected in human heart tissue and HCAEC ( Figure 4a).
  • TSBP labeled with Myc or LBP-32 labeled with Flag was transfected into HACSMC.
  • TSBP was localized in the cytoplasm
  • LBP-32 was localized in the nucleus! /, (Figs. 4b and c).
  • SNPs Of these four SNPs, one SNP is located on the LTA, which is already reported (Ozaki K, et al. (2002) Functional SNPs in the lymphotoxin-alpha gene that are associated with susceptibility to myocardial infarction. Nat Genet 32: 6 50-654.). The other two SNPs were located on TSBP and LBP-32. The last SNP was at the WAP locus on chromosome 20ql3.
  • LBP-32 was cloned as a protein that binds to the promoter region of cytochrome P450scc (Huang N, et al., (2000) Cloning of factors related to HIV-inducible LB P proteins that regulate steroidogenic factor— 1— independent human placental trans cription of the cholesterol side-chain cleavage enzyme, P450scc. J Biol. hem 275: 28 52-2858.).
  • the G allele has no motif, but the A allele has a COUPZHNF-4 heterodimer binding motif.
  • the LBP-32 intron 1 + 151G> A minority allele force suppresses the expression level of LBP-32, and as a result, the expression level of the downstream gene changes! It was done.
  • P450scc is also called estrogen synthetase. Since estrogen plays an important role for the heart, changes in the expression level of P450SCC may be associated with the development of myocardial infarction. The mechanism that affects the expression level is thought to be the binding of nuclear factors to a few A alleles ( Figure lb)
  • TSBP was first identified from testis cDNA (Liang ZG, et al. (1994) Human testis cDN As identified oy sera from infertile patients: a molecular biological approach to immu nocontraceptive development. Reprod Fertil Dev 6: 297-305 ). Strong force S et al., TSBP c DNA was detected in human heart tissue and HCAEC ( Figure 3). In HCASMC, TSBP is localized in the cytoplasm. An important SNP in TSBP (Exon 25 306A> G) is present in the coding region, resulting in an amino acid substitution (I306V). TSBP maps to 6p21 where LTA is also located.
  • the two genes are located at approximately 700 kb intervals and are located in different linkage disequilibrium blocks. This means that the D 'between the important SNPs of TSBP and LTA is 0.4. A significant correlation between TSBP and myocardial infarction is independent of LTA.
  • the locus on chromosome 20ql3 contains a number of genes that encode proteins that are homologous to whey acidic protein (WAP).
  • WAP whey acidic protein
  • the function of WAP may exist in the host response to microorganisms (Clauss A, et al., (2002) A locus on human chromosome 20 contains several genes expressing protease inhibitor domains with homology to whey acidic protein. Biochem J 368: 233-242).
  • the target region was limited to lOOkb for haplotype block analysis.
  • SNP single nucleotide polymorphism
  • FIG. 1 shows the results of LBP-32.
  • A shows a pair of linkage disequilibrium between SNPs measured by D ′ in the genomic region containing TAF1B and LBP-32. Eleven common SNP genotypes were determined. The allele frequency of these SNPs was over 30%. LBP-32 was localized to one linkage disequilibrium block. The black area shows strong linkage disequilibrium, and the white area shows D ' ⁇ 0.5.
  • (B) shows the binding of an unknown nuclear factor to intron 1 of LBP-32. arrow The symbol indicates a band indicating nuclear factor binding to the A allele rather than the G allele.
  • FIG. 2 shows the results of TSBP.
  • A shows a pair of linkage disequilibrium between SNPs measured with D 'in the genomic region containing BTNL2, TSBP and NOTCH4. Twenty-two common SNP genotypes were determined. The allele frequency of these SNPs was over 30%.
  • the T SBP gene was localized in one linkage disequilibrium block. The black area shows strong linkage disequilibrium, and the white area shows D ' ⁇ 0.5.
  • (B) shows the distribution of haplotype blocks and P values. The haplotype block contained 11 common SNPs including exon25 306A> G. The most significant correlation was found in the last exon of TSBP (exon25 306A> G) (arrow).
  • FIG. 3 shows the results for the WAP gene region.
  • (a) shows a pair of linkage disequilibrium between SNPs as measured by D 'in the genomic region containing WAP7-13 and TNNC2. Fifteen common SNP genotypes were determined. The allele frequency of these SNPs was more than 30%.
  • the WAP8-13 gene was present in one linkage disequilibrium block. The black area shows strong linkage disequilibrium, and the white area shows D ' ⁇ 0.5.
  • (B) shows the distribution of haplotype blocks and P values.
  • the haplotype block contained 18 common SNPs, including WAP12 3 'flanking + 1264G> A. The most significant correlation was observed among multiple SNPs including WAP12 3 'flanking + 1264G> A.
  • FIG. 4 shows the expression and localization analysis.
  • LBP-32 was expressed in human heart tissue, HCASMC and HCAEC.
  • TSBP was expressed in human heart tissue and HCAEC.
  • TSBP was localized in the cytoplasm in HCASMC.
  • LBP-32 localized to the nucleus in HCASMC

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Abstract

　本発明の目的は、心筋梗塞等の炎症性疾患の発症進展に関与する新規な一塩基多型（ＳＮＰ）を同定することである。本発明によれば、LBP-32遺伝子、TSBP遺伝子、及びWAP遺伝子より成る群から選ばれる少なくとも1つの遺伝子に存在する少なくとも一種の遺伝子多型を検出することを含む、炎症性疾患の判定方法が提供される。

Description

明 細 書
一塩基多型を用いた炎症性疾患の判定方法
技術分野
[0001] 本発明は、 LBP- 32遺伝子、 TSBP遺伝子、及び WAP遺伝子に存在する遺伝子多 型を検出することを含む炎症性疾患の診断方法、該方法に使用されるオリゴヌクレオ チド、該オリゴヌクレオチドを含む炎症性疾患診断用キット、並びにそれらの利用に 関する。
背景技術
[0002] 共通の遺伝変異が、遺伝子産物の発現量及び Z又は機能に強 、影響をもたらす 場合がある。この共通の変異は、疾患への感受性及び Z又は薬理学的応答に関連 している場合がある（Dean M,他、 （1996) Genetic restriction of HIV- 1 infection and progression to AIDS by a deletion allele of the CKR5 structural gene. Hemophilia G rowth and Development Study, Multicenter AIDS Cohort Study, Multicenter Hemop hilia Cohort Study, San Francisco City Cohort, ALIVE Study. Science 273:1856—18 62 ; Risch N,他、 (1996) The luture of genetic studies of complex human diseases. S cience 273: 1516- 1517 ;及び Kruglyak L (1997) The use of a genetic map of biallelic markers in linkage studies. Nat Genet 17:21-24)。
[0003] SNPは DNA多型の最も簡単かつ最もありふれたものである。 SNPはゲノム上に平 均して数百塩基毎に存在し、遺伝子型を特定してデータを分析することが比較的容 易である。近年、共通する変異が一般の疾患及び薬理学的体質に寄与しているとい う仮説が提唱されており、これは「一般の疾患一共通変異」仮説と称されている（Rise h N,他、 (1996) The future of genetic studies of complex human diseases. Science 27 3: 1516-1517)。この点から見て、 SNPは、一般の疾患に関連のある遺伝子を同定す るための有用なマーカーである (Kruglyak L (1999) Prospects for whole-genome linka ge disequilibrium mapping of common disease genes. Nat Genet 22:139—丄 44)。
[0004] 心筋梗塞は日本において多く見られる疾患の一つである。肥満、喫煙、糖尿病、高 血圧及び高脂血症は、心筋梗塞の危険因子としてよく知られている。しかし、様々な 集団では家系が心筋梗塞の独立した危険因子であった (Andresdottir MB,他、（200
2) Fifteen percent or myocardial infarctions and coronary revascularizations explaine d by family history unrelated to conventional risk factors. The Reykjavik Cohort Stu dy. Eur Heart J 23: 1637-1638 ; Piegas LS,他、 AFIRMAR Study Investigators. (200
3) Risk factors for myocardial infarction in Brazil. Am Heart J 146: 331- 338 ;及び Ya rnell J,他、 (2003) Family history, longevity, and risk of coronary heart disease: the PRIME Study. Int J Epidemiol 32: 71-77)。心筋梗塞の感受性遺伝子を同定するた めに、多くの候補遺伝子アプローチがなされた (Topol EJ,他、（2001) Single nucleotid e polymorpnisms in multiple novel thrombospondin genes may be associated with ram ilial premature myocardial infarction. し lrculation 104:2641— 2b44 ; Fumeron F,他、 ( 2002) Serotonin transporter gene polymorphism and myocardial infarction: Etude Ca s- Temoins de l'lnfarctus du Myocarde (ECTIM). Circulation 105:2943- 2945；及び Y amada Y,他、 (2002) Prediction of the risk of myocardial infarction from polymorphis ms in candidate genes. N Engl J Med 347:1916—1923)。し力し、心筋梗塞の関連遺伝 子を同定するための体系的調査の報告はほとんどない。
[0005] 本発明者らは、 170, 000以上の遺伝子に基づいた SNPを含む大 SNPデータべ ースを構築した (Haga H,他（2002) Gene-based SNP discovery as part of the Japane se Millennium Genome Project: identification of 190,562 genetic variations in the hu man genome. Single— nucleotide polymorphism. J Hum Genet 47:605—610)。本発明者 らはまた、ハイスループットの遺伝子タイピングシステムを開発し、これにより 1日に 45 0, 000の遺伝子タイピングを行った (Ohnishi Y,他 （2001) A high-throughput SNP t yping system for genome-wide association studies. J Hum Genet 46:471-477)。
発明の開示
発明が解決しょうとする課題
[0006] 本発明は、心筋梗塞等の炎症性疾患の発症進展に関与する新規な一塩基多型（ SNP)を同定することを解決すべき課題とした。さらに本発明は、同定した SNPを利 用して、心筋梗塞等の炎症性疾患の診断法、又は炎症性疾患の治療薬の開発法を 提供することを解決すべき課題とした。 課題を解決するための手段
[0007] 本発明者らは上記課題を解決するために鋭意検討した結果、 LBP-32遺伝子、 TSB
P遺伝子、及び WAP遺伝子中に存在する一塩基多型（SNP)が心筋梗塞の発症進 展に関連していることを同定することにより本発明を完成するに至った。
[0008] 即ち、本発明によれば、 LBP-32遺伝子、 TSBP遺伝子、及び WAP遺伝子より成る群 カゝら選ばれる少なくとも 1つの遺伝子に存在する少なくとも一種の遺伝子多型を検出 することを含む、炎症性疾患の判定方法が提供される。
[0009] 好ましくは、本発明によれば、 LBP-32遺伝子、 TSBP遺伝子、及び WAP遺伝子より 成る群力 選ばれる少なくとも 1つの遺伝子に存在する少なくとも一種の一塩基多型 を検出することを含む、炎症性疾患の判定方法が提供される。
[0010] 好ましくは、本発明によれば、下記の（1)から（3)よりなる群力も選ばれる少なくとも 一種の一塩基多型を検出することを含む、炎症性疾患の判定方法が提供される。
(1) LBP— 32遺伝子のイントロン 1の塩基配列の 151番目の塩基における GZAの 多型
(2) TSBP遺伝子のェキソン 25の塩基配列の 306番目の塩基における AZGの多 型
(3) WAP12遺伝子の 3'フランキング領域の塩基配列の 1264番目の塩基における GZAの多型
[0011] 好ましくは、炎症性疾患は心筋梗塞である。
[0012] 本発明の別の側面によれば、下記の（1)から（3)よりなる群力 選ばれる少なくとも 1つの部位を含む連続する少なくとも 10塩基の配列、又はその相補配列にハイプリ ダイズすることができ、上記した本発明の方法にぉ 、てプローブとして用いるオリゴヌ クレオチドが提供される。
(1) LBP— 32遺伝子のイントロン 1の塩基配列の 151番目の塩基
(2) TSBP遺伝子のェキソン 25の塩基配列の 306番目の塩基
(3) WAP 12遺伝子の 3，フランキング領域の塩基配列の 1264番目
[0013] 本発明のさらに別の側面によれば、下記の（1)から（3)よりなる群力も選ばれる少な くとも 1つの部位を含む連続する少なくとも 10塩基の配列、及び Z又はその相補配 列を増幅することができ、上記した本発明の方法においてプライマーとして用いるォ リゴヌクレオチドが提供される。
(1) LBP— 32遺伝子のイントロン 1の塩基配列の 151番目の塩基
(2) TSBP遺伝子のェキソン 25の塩基配列の 306番目の塩基
(3) WAP 12遺伝子の 3，フランキング領域の塩基配列の 1264番目
[0014] 好ましくは、プライマーはフォワードプライマー及び Z又はリバースプライマーである
[0015] 本発明のさらに別の側面によれば、上記した本発明のオリゴヌクレチドの 1種以上を 含む、炎症性疾患診断用キットが提供される。好ましくは、炎症性疾患は心筋梗塞で ある。
[0016] 本発明のさらに別の側面によれば、下記の（1)から（3)よりなる群力も選ばれる少な くとも一種の一塩基多型を検出することを含む、 LBP_32、 TSBP,又は WAPの発現状 態の分析方法が提供される。
(1) LBP— 32遺伝子のイントロン 1の塩基配列の 151番目の塩基における GZAの 多型
(2) TSBP遺伝子のェキソン 25の塩基配列の 306番目の塩基における AZGの多 型
(3) WAP12遺伝子の 3'フランキング領域の塩基配列の 1264番目の塩基における GZAの多型
[0017] 本発明のさらに別の側面によれば、候補物質の存在下で細胞内の LBP-32遺伝子 、 TSBP遺伝子、又は WAP遺伝子の発現量を分析し、その発現量を変化させる物質 を選択する工程を含む、炎症性疾患の治療薬のスクリーニング方法が提供される。 発明を実施するための最良の形態
[0018] 本発明では、 LBP-32遺伝子、 TSBP遺伝子、及び WAP遺伝子内の一塩基多型（S NP)を同定し、それぞれ心筋梗塞患者群とコントロール群について遺伝子型のタイ ビングを行い、相関解析を行った結果、この新規 SNPの遺伝子型は、心筋梗塞患者 群とコントロール群との間で統計学的に有意な差があることを見出した。
[0019] 上記の通り、本発明では、 LBP-32遺伝子、 TSBP遺伝子、又は WAP遺伝子内の SN Pが心筋梗塞等の疾患に関連することを同定した。従って、本発明により同定された LBP-32遺伝子、 TSBP遺伝子、又は WAP遺伝子内の SNPを利用することにより、心 筋梗塞等の炎症性疾患の新たな診断、予防法、治療薬の開発が可能になる。以下、 本発明の実施の形態についてさらに具体的に説明する。
[0020] [1] 炎症性疾患の判定方法
本発明の方法は、炎症性疾患と関連性を示す LBP-32遺伝子、 TSBP遺伝子、又は WAP遺伝子に存在する遺伝子多型、特には一塩基多型（SNPs)を検出することによ つて、炎症性疾患の発症の有無、あるいは炎症性疾患の発症の可能性を判定する 方法である。
[0021] 本発明にお 、て「LBP-32遺伝子、 TSBP遺伝子、及び WAP遺伝子より成る群から選 ばれる少なくとも 1つの遺伝子に存在する少なくとも一種の遺伝子多型（一塩基多型 など)を検出する」とは、 (i)当該遺伝子多型 (遺伝子側多型と称する)を直接検出す ること、及び (ii)前記遺伝子の相補配列側に存在する遺伝子多型 (相補側多型と称 する）を検出し、その検出結果から遺伝子側多型を推定することの双方を指すものと する。ただし、遺伝子側の塩基と相補配列側の塩基とが完全に相補的な関係にある とは限らないという理由から、遺伝子側多型を直接検出することがより好ましい。
[0022] LBP-32遺伝子、 TSBP遺伝子、及び WAP遺伝子に存在する遺伝子多型の好ま ヽ 具体例としては、
(1) LBP— 32遺伝子のイントロン 1 (その塩基配列を配列番号 1に示す)の塩基配列 の 151番目の塩基における GZAの多型；
(2) TSBP遺伝子のェキソン 25の塩基配列（その塩基配列を配列番号 2に示す）の 3 06番目の塩基における AZGの多型；
(3) WAP12遺伝子の 3'フランキング領域の塩基配列（その塩基配列を配列番号 3 に示す）の 1264番目の塩基における GZAの多型；
を挙げることができる。
[0023] 例えば、後記表 2に示すように、 LBP— 32遺伝子のイントロン 1の塩基配列の 151 番目の塩基が Aである場合には、炎症性疾患が発症している、あるいは発症の可能 性が高いと判定できる。同様に、 TSBP遺伝子のェキソン 25の塩基配列の 306番目 の塩基が Gである場合には、炎症性疾患が発症している、あるいは発症の可能性が 高いと判定できる。さらに、 WAP12遺伝子の 3'フランキング領域の塩基配列の 126 4番目の塩基が Aである場合には炎症性疾患が発症している、あるいは発症の可能 性が高いと判定できる。
[0024] 反対に、 LBP— 32遺伝子のイントロン 1の塩基配列の 151番目の塩基が Gである場 合、 TSBP遺伝子のェキソン 25の塩基配列の 306番目の塩基が Aである場合、そし て WAP12遺伝子の 3'フランキング領域の塩基配列の 1264番目の塩基が Gである 場合には、炎症性疾患の発症の可能性が低!、と判定できる。
[0025] 本明細書にぉ 、て、疾患の「判定」とは疾患発症の有無の判断、疾患発症の可能 性の判断 (罹患危険性の予想）、疾患の遺伝的要因の解明などをいう。
[0026] また、疾患の「判定」は、上記の一塩基多型の検出法による結果と、所望により他の 多型分析 (VNTRや RFLP)及び Z又は他の検査結果と合わせて行うこともできる。
[0027] また、本明細書において、「炎症性疾患」とは、炎症性病態との相関が知られている 細胞接着因子やサイト力インの誘導が認められる疾患であれば特に限定はされない 力 例えば慢性関節リウマチ、全身性エリマト一デス、炎症性腸炎、種々のアレルギ 一反応、細菌性ショック、心筋梗塞や脳卒中などの動脈硬化性疾患などが挙げられ 、特には心筋梗塞が挙げられる。
[0028] (検出対象）
遺伝子多型の検出の対象は、ゲノム DNAが好ましいが、場合によっては（つまり多 型部位及びその隣接領域の配列がゲノムと同一または完全相補的になっている場 合) cDNA、又は mRNAを使用することもできる。また、上記対象を採取する試料とし ては、任意の生物学的試料、例えば血液、骨髄液、精液、腹腔液、尿等の体液;肝 臓等の組織細胞；毛髪等の体毛等が挙げられる。ゲノム DNA等は、これらの試料よ り常法に従い抽出、精製し、調製することができる。
[0029] (増幅）
遺伝子多型を検出するにあたっては、まず遺伝子多型を含む部分を増幅する。増 幅は、例えば PCR法によって行われる力 他の公知の増幅方法、例えば NASBA法 、 LCR法、 SDA法、 LAMP法等で行ってもよい。 [0030] プライマーの選択は、例えば、前記した本発明の一塩基多型部位を含む連続する 少なくとも 10塩基以上、好ましくは 10〜： L00塩基、より好ましくは 10〜50塩基の配 列、及び Z又はその相補配列を増幅するように行う。
プライマーは、前記の一塩基多型部位を含む所定塩基数の配列を増幅するための プライマーとして機能し得る限り、その配列において 1又はそれ以上の置換、欠失、 付加を含んでいてもよい。
[0031] 増幅のために用いるプライマーは、試料が一の対立遺伝子型の場合にのみ増幅さ れるようにフォワードプライマー又はリバースプライマーの一方が一塩基多型部位に ノ、イブリダィズするように選択してもよ 、。プライマーは必要に応じて蛍光物質や放射 性物質等により標識することができる。
[0032] (遺伝子多型の検出）
遺伝子多型の検出は、一の対立遺伝子型に特異的なプローブとのハイブリダィゼ ーシヨンにより行うことができる。プローブは、必要に応じて、蛍光物質や放射性物質 等の適当な手段により標識してもよい。プローブは、前記の一塩基多型部位を含み、 被検試料とハイブリダィズし、採用する検出条件下に検出可能な程度の特異性を与 えるものである限り何等限定はない。プローブとしては、例えば前記の一塩基多型部 位を含む連続する少なくとも 10塩基以上、好ましくは 10〜： L00塩基の配列、より好ま しくは 10〜50塩基の配列、又はそれらの相補配列にハイブリダィズすることのできる オリゴヌクレオチドを用いることができる。例えばインベーダー法、 TaqMan— PCR法を 用いることができる。また、一塩基多型部位がプローブのほぼ中心部に存在するよう にオリゴヌクレオチドを選択するのが好ましい。該オリゴヌクレオチドは、プローブとし て機能し得る限り、即ち、 目的の対立遺伝子型の配列とハイブリダィズする力 他の 対立遺伝子型の配列とはハイブリダィズしな 、条件下でノヽイブリダィズする限り、その 配列において 1又はそれ以上の置換、欠失、付加を含んでいてもよい。また、プロ一 ブには、 RC A (rolling circle amplification)法による増幅に用いられる一本鎖プ ローブ (パドロックプローブ）のように、ゲノム DNAとァニールし、環状になることによつ て上記のブロープの条件を満たすプローブが含まれる。
[0033] 本発明に用いるハイブリダィゼーシヨン条件は、対立遺伝子型を区別するのに十分 な条件である。例えば、試料が一の対立遺伝子型の場合にはハイブリダィズする力 他の対立遺伝子型の場合にはハイブリダィズしな 、ような条件、例えばストリンジェン トな条件である。ここで、「ストリンジェントな条件」としては、例えば、モレキュラークロ 一-ング.ァ.ラボラトリーマ-ユアル第 2版（Sambrook et al. , 1989)に記載の 条件等が挙げられる。具体的には、例えば、 6 X SSC (1 X SSCの組成： 0. 15M N aCl、 0. 015Mクェン酸ナトリウム、 pH7. 0)、 0. 5%SDS、 5 Xデンノヽート及び 100 mgZml-シン精子 DNAを含む溶液中プローブとともに 65°Cでー晚保温するという 条件等が挙げられる。
[0034] プローブは、一端を基板に固定して DNAチップとして用いることもできる。この場合 、 DNAチップには、一の対立遺伝子型に対応するプローブのみが固定されていても 、両方の対立遺伝子型に対応するプローブが固定されて 、てもよ 、。
[0035] 遺伝子多型の検出は、制限酵素断片長多型分析法 (RFLP :Restriction fragm ent length polymorphism)により行うこともできる。この方法では、一塩基多型部 位がいずれの遺伝子型をとるかによって制限酵素により切断される力否かが異なつ てくる制限酵素で試料核酸を消化し、消化物の断片の大きさを調べることにより、該 制限酵素で試料核酸が切断されたカゝ否かを調べ、それによつて試料の多型を分析 する。
[0036] 遺伝子多型の検出は、増幅産物を直接配列決定することによって行ってもよい (ダ ィレクトシークェンシング法）。配列決定は、例えばジデォキシ法、 Maxam- Gilbert 法等の公知の方法により行うことができる。
[0037] 遺伝子多型の検出はまた、変性勾配ゲル電気泳動法（DGGE： denaturing gradien t gel electrophoresis)、一本鎖コンフオメーシヨン多型解析（SSCP : single strand con formation polymorphism)、対立遺伝子特異的 PCR (allele- specific PCR)、 ASO (all ele- specific oligonucleotide)によるハイブリダィーゼーシヨン法、ミスマッチ部位のィ匕 ギ的切断 (CCM : chemical cleavage of mismatches)、 HET (heteroduplex method) 法、 PEX (primer extension)法、 RCA (rolling circle amplification)法等を用いること ができる。
[0038] [2] 炎症性疾患診断用キット 前記のプライマー又はプローブとしてのオリゴヌクレオチドは、これを含む炎症疾患 診断用キットとして提供できる、キットは、上記遺伝子多型の分析法に使用される制 限酵素、ポリメラーゼ、ヌクレオシド三リン酸、標識、緩衝液等を含んでいてもよい。
[0039] [3]LBP-32、 TSBP,及び WAPの発現状態の分析方法
本発明によればまた、前記した一塩基多型を検出することによって、 LBP_32、 TSBP 、又は WAPの発現状態を分析することができる。
例えば、 LBP— 32遺伝子のイントロン 1の塩基配列の 151番目の塩基における GZ Aの多型において、当該塩基が Aである場合は、 LBP— 32の発現量が低いと判断 でき、当該塩基が Gである場合は、 LBP— 32の発現量は高いと判断できる。
[0040] [4] 炎症性疾患の治療薬のスクリーニング方法
本発明によれば、候補物質の存在下で細胞内の LBP-32遺伝子、 TSBP遺伝子、又 は WAP遺伝子の発現量を分析し、その発現量を変化させる物質を選択することによ つて、炎症性疾患の治療薬をスクリーニングすることができる。例えば、候補物質の存 在下で細胞内の LBP-32遺伝子、 TSBP遺伝子、又は WAP遺伝子の発現量を分析し 、その発現量を増大又は減少させる物質を選択することができ、特に好ましくはその 発現量を増大させる物質を選択することができる。
[0041] 上記スクリーニングの一例としては、細胞と候補物質とを接触させる工程、細胞内に おける LBP-32遺伝子、 TSBP遺伝子、又は WAP遺伝子の発現量を分析する工程、及 び候補物質の非存在下の条件と比較して当該遺伝子の発現量を変化させる候補物 質を炎症性疾患の治療薬として選択する工程により行うことができる。
[0042] 候補物質としては任意の物質を使用することができる。候補物質の種類は特に限 定されず、個々の低分子合成化合物でもよいし、天然物抽出物中に存在する化合 物でもよぐあるいは化合物ライブラリー、ファージディスプレーライブラリー、コンビナ トリアルライブラリーでもよい。候補物質は、好ましくは低分子化合物であり、低分子 化合物の化合物ライブラリーが好ましい。化合物ライブラリーの構築は当業者に公知 であり、また市販の化合物ライブラリーを使用することもできる。
[0043] [5] LBP-32遺伝子、 TSBP遺伝子、又は WAP遺伝子の転写活性の測定方法
本発明によればまた、前記した一塩基多型を含む LBP-32遺伝子、 TSBP遺伝子、 又は WAP遺伝子の断片を細胞に導入し、該細胞を培養し、該遺伝子の発現を分析 することによって LBP-32遺伝子、 TSBP遺伝子、又は WAP遺伝子の転写活性を測定 することができる。
本発明の好ましい態様によれば、前記 LBP-32遺伝子、 TSBP遺伝子、又は WAP遺 伝子の断片の下流にリポーター遺伝子を結合させた転写ユニットを細胞に導入し、 該細胞を培養し、リポーター活性を測定することによって該遺伝子の発現を分析する
[0044] 例えば、一塩基多型がプロモーター部位に存在する場合は、その一塩基多型を含 む遺伝子の下流にレポーター遺伝子を挿入した系を導入した細胞を培養し、レポ一 ター活性を測定すれば、一塩基多型による転写効率に違いを測定することができる。
[0045] ここでリポーター遺伝子としては、ルシフェラーゼ、クロラムフエ-コール、ァセチルト ランスフェラーゼ、ガラクトシダーゼなどの遺伝子が用いられる。
[0046] [6] LBP-32遺伝子、 TSBP遺伝子、又は WAP遺伝子の転写活性を阻害又は促進 する物質のスクリーニング方法
本発明においては、前記した一塩基多型を含む LBP-32遺伝子、 TSBP遺伝子、又 は WAP遺伝子の断片を細胞に導入し、 LBP-32遺伝子、 TSBP遺伝子、又は WAP遺 伝子の転写活性を阻害又は促進する候補物質の存在下で該細胞を培養し、該遺伝 子の発現を分析することによって LBP-32遺伝子、 TSBP遺伝子、又は WAP遺伝子の 転写活性を阻害又は促進する物質をスクリーニングすることできる。
本発明の好ましい態様によれば、前記 LBP-32遺伝子、 TSBP遺伝子、又は WAP遺 伝子の断片の下流にリポーター遺伝子を結合させた転写ユニットを細胞に導入し、 該細胞を培養し、リポーター活性を測定することによって該遺伝子の発現を分析する
[0047] 例えば、 LBP-32遺伝子、 TSBP遺伝子、又は WAP遺伝子の発現量が有意に高 、こ とが認められる一塩基多型を有する遺伝子の下流にレポーター遺伝子を挿入した系 を導入した細胞を候補物質の存在下又は非存在下の両方の場合について培養し、 候補物質の存在下で培養を行った場合にレポーター活性が下がれば、その候補物 質は LBP-32遺伝子、 TSBP遺伝子、又は WAP遺伝子の転写活性阻害物質として選 択することができる。
[0048] ここでリポーター遺伝子としては、上記に挙げた遺伝子が用いられる。
候補物質としては任意の物質を使用することができる。候補物質の種類は特に限 定されず、個々の低分子合成化合物でもよいし、天然物抽出物中に存在する化合 物でもよぐあるいは化合物ライブラリー、ファージディスプレーライブラリー、コンビナ トリアルライブラリーでもよい。候補物質は、好ましくは低分子化合物であり、低分子 化合物の化合物ライブラリーが好ましい。化合物ライブラリーの構築は当業者に公知 であり、また市販の化合物ライブラリーを使用することもできる。
[0049] 上記のスクリーニング法により得られる LBP-32遺伝子、 TSBP遺伝子、又は WAP遺 伝子の転写活性を阻害又は促進する物質もまた本発明の範囲内である。このような L BP-32遺伝子、 TSBP遺伝子、又は WAP遺伝子の転写活性を阻害又は促進する物質 は、心筋梗塞治療剤、抗炎症剤、免疫抑制剤などの各種薬剤の候補物質として有 用である。
[0050] [7]LBP-32遺伝子、 TSBP遺伝子、又は WAP遺伝子の転写制御因子のスクリーニン グ方法
本発明においてはまた、前記した一塩基多型を含む遺伝子断片と、 LBP-32遺伝 子、 TSBP遺伝子、又は WAP遺伝子の転写制御因子の存在が予想される試料を接触 させ、上記断片と転写制御因子との結合を検出することによって、 LBP-32遺伝子、 T SBP遺伝子、又は WAP遺伝子の転写制御因子をスクリーニングすることもできる。前 記の一塩基多型を含む遺伝子断片と、 LBP-32遺伝子、 TSBP遺伝子、又は WAP遺 伝子の転写制御因子の存在が予想される物質との結合の検出は、ゲルシフト法 (電 気泳動移動度シフト解析： electrophoretic mobility shift assay, EMSA)、 DNase Iフッ トプリント法等によって行うことがきる力 ゲルシフト法が好ましい。ゲルシフト法では、 タンパク質 (転写制御因子）が結合すると、分子サイズが大きくなり電気泳動における DNAの移動度が低下するので、 32Pで標識した遺伝子断片と転写制御因子を混ぜ、 ゲル電気泳動にかける。オートラジオグラフィ一で DNAの位置を見ると、因子の結合 した DNAはゆっくり動くので、通常のバンドよりも遅れて移動するバンドとして検出さ れる。 以下の実施例により本発明をさらに具体的に説明する力 本発明は実施例によつ て限定されるものではない。
実施例
[0051] (A)材料と方法
(1)被験者
心筋梗塞の日本人患者を用いた。明確な心筋梗塞の診断には以下の 3つの基準 のうちの 2つが必要である（i) 30分以上持続する中心位の圧迫、痛み又は苦しさの 病歴、（ii)少なくとも 1つの基準又は 2つの胸部誘導における 0. lmV以上の ST—セ グメントの上昇、又は (iii)通常の実験値より 2倍以上への血清クレアチンキナーゼ濃 度の上昇。コントロール群は日本人の通常者力 構成した。全ての患者からは本実 験への参加の同意を得た。
[0052] (2) SNPの遺伝子タイピング
大規模相関分析のために、本発明者自身の SNPデータベース（Haga H,他（2002) ene— based SNP discovery as part of the Japanese Millennium enome Project: ide ntification of 190,562 genetic variations in the human genome. Single— nucleotide pol ymorphism. J Hum Genet 47:605-610)を使用して、既報の通り SNPのスクリーニング を ίτつた (Ohnism ,他、 (2001 A high-throughput SNP typing system for genome- w ide association studies. J Hum Genet 46:471-477)。重要な領域に SNPマップを構築 するために、参照配列として LBP-32用に AC010969.i lを組み立てることによって参 照配列を作成した。 Z84814.1, AL034394.2, AL035445.4, AF044083.1及び U89335. 1を TSBP用に使用し、 AL031663.2, AL121778.12, AL031671.12, AL109656.10及び AL050348.21を WAP領域用に使用した。次に、 SNPを参照配列中に預けた。強い連 鎖不均衡を評価するために、 SNP部位の 190名の心筋梗塞患者と 190名のコント口 ール被験者の遺伝子型を決定した。
[0053] (3) SNPの同定
重要領域中の遺伝子に基づいた変異を全て同定するために、重要領域に位置す ることが知られている全ての遺伝子をスクリーニングした。 PCRプライマーの設計、 P CR実験、 DNA抽出、 DNAシークェンス、及び SNP同定のプロトコールは既報の通 りである (Iida et al. 2001)。重要領域の SNPの遺伝子型は、既報の通り、インべーダ 一アツセィ又はキヤビラリ一シークェンサ一 (ABI3700, Applied Biosystems, CA)を用 いた PCR産物の直接シークェンスにより決定した (Iida A,他、（2001) Catalog of 258 single- nucleotide polymorphisms (SNPs) in genes encoding tnree organic anion trans porters, three organic anion— transporting polypeptides, and three NADH : ubiquinone oxidoreductase flavoproteins. J Hum Genet 46:668- 683；及び Ohnishi Y,他、（2001 ) A high-throughput SNP typing system for genome-wide association studies. J Hum Genet 46:471-477)。
[0054] (4)ハプロタイプ構造の解析
EM—アルゴリズム（Excoffier L,他、（1995) Maximum-likelihood estimation of mole cular haplotype frequencies in a diploid population. Mol Biol Evol 12: 921- 927)によ りハプロタイプフェージングを見積もった。ハプロタイプブロックを、以下の改良を除き 既報の通り構築した（Daly MJ,他、（2001) High-resolution haplotype structure in the human genome. Nat Genet 29: 229-232)。先ず、次の解析を簡単にするために、単 一の代表的な SNPに絶対的にリンクしている隣接する SNPをクラスター化した。次に 、 maxN+ 1 , 2°·™ (式中、 Nはブロック中の SNPの数を示す）の共通のハプロタイプ のセットが集団の 90%以上をカバーするという制約をカ卩えた。曖昧さをなくすために 、 SNP部位の 、ずれもがハロタイプ頻度の計算から遺伝子タイピングできな力つた試 料は除いた。
[0055] (5)統計解析
既報の通り (Yamada R,他、 (2001) Association between a single- nucleotide polymo rphism in the promoter of the human interleukin— 3 gene and rheumatoid arthritis in Japanese patients, and maximum-likelihood estimation of combinatorial effect that t wo genetic loci have on susceptibility to the disease. Am J Hum Genet 68:674—685) 、相関研究、 Hardy-Weinberg均衡、及び連鎖不均衡係数 (D')の計算について統計 解析を行った。
[0056] (6)ルシフェラーゼ活性
LBP-32のイントロン 1の +5から +350に対応する DNA断片を、 Hindlll及び Ncol配列 を用いてゲノム DNAを铸型として使用して PCRによる増幅し、 5'-3'方向に pGL3-プロ モーターベクターの Hindlll及び Ncol部位にクローユングした。 10%牛胎児血清を添 加した DMEM培地で HeLa細胞を生育した。次いで、細胞 (3X105)に 0.5 gの野生型 構築物又は変異体構築物及び 0.5 μ gの pRL-TKベクター（トランスフエクシヨン効率 用の内部コントロールとして）を FuGeneトランスフエクシヨン試薬 (Roche, IN)を用いてト ランスフエクシヨンした。 24時間後、細胞を回収し、 Dua卜 Luciferase Reporter Assay S ystem (Promega, WI)を用いてルシフェラーゼ活性を測定した。
[0057] (7)ゲノレーシフトアツセィ
既報の通り (Andrews and Faller 1991)、 HeLa細胞から核抽出物を調製し、 32Pで標 識した 28bpのオリゴヌクレオチド 5'- TCCACGCCGCCACGGCCTTTGCCCCTTA- 3' (アレル G) (配列番号 4) ; 5し TCCACGCCGCCACGACCTTTGCCCCTTA- 3' (ァレ ル A) (配列番号 5)と一緒にインキュベートした。競合実験のために、32 P-標識したォ リゴヌクレオチドの添加前に、未標識のオリゴヌクレオチド（100倍過剰）と一緒に、抽 出した核をプレインキュペートした。タンパク質 DNA複合体は、 0. 5 X Tris-ホウ酸 -EDTA緩衝液中で未変性 8%ポリアクリルアミドゲル上で分離した。シグナルはォー トラジ才グラフィ一で検出した。
[0058] (8) RT-PCRを用いた発現解析
TRIZOL試薬（GibcoBRL)を用いて HCASMC (BioWhittaker)及び HCAEC (BioWhit taker)から全 RNAを単離した。 HCASMC及び HCAECの全 RNA、及びヒト心臓組 織のポリ A RNA(Clontech)から、オリゴ dTプライマーと Superscript II逆転写酵素（In vitrogen)を用いて一本鎖 cDNAを調製した。これらの cDNAを铸型とし、プライマーとし て 5'- ACTTTGGCTGTCATCCTGAC- 3' (配列番号 6)及び 5'- CTTGATAGGTCC TGTAGCTC- 3' (配列番号 7) (TSBP用）， 5'- AGCGCGATGACACAGGAGTA- 3' ( 配列番号 8)及び 5'-CGTTGCTATGGAGACAGTGA-3， （配列番号 9) (LBP-32用）， 5 -TGGTATCGTGGAAGGACTCAT-3' (配列番号 10)及び 5'- GTGGGTGTCGC TGTTGAAGTC-3' (配列番号 11) (内部参照としての GAPDH )を用いて、 PCR増 幅を行った。
[0059] (9)発現ベクターの構築 ヒト全長 TSBP及び LBP- 32 cDNAを以下の PCRプライマーセットを用いて RT- PCRに より作製した。
5 -ATAGCGGCCGCAATGACAGTCTTGGAAATAAC-3' (配列番号 12)及び 5し AGACTCGAGTTACTCTTCCACTTTTTTGTTGTAC- 3' (；配列番号 13；)； 5'- GAGGCGGCCGCGATGACACAGGAGTACGACAAC-3' (配列番号 14)及び 5'- AGAGTCGACGATCTCCGTCAGGGTGAGC- 3' (配列番号 15)；
pTSBP- mycは、 Notト Xholで切断した TSBP cDNAを pCMV- myc (Clontech, Palo A lto, CA)に挿入することによって構築した。 pLBP32-Flagは、 Notl-Sallで切断した LBP -32 cDNAを pFLAG- CMV5a (Sigma)に挿入することによって構築した。
[0060] (10)免疫蛍光分析
HCASMC細胞 (5X105)にヒト AoSMC Nucleofector Kit (amaxa biosystems)を用いて 5 μ gの pTSBP- myc又は pLBP32- Flagをトランスフエクシヨンし、コラーゲンコートしたガ ラススライドに接種した。 24時間後、細胞を固定し、抗体で処理した。核を DAPI(Sigm a)で染色した。
[0061] (B)結果
(l) SNP相関研究
先ず、 65, 671個の SNPについて、 94名の心筋梗塞患者の遺伝子型の頻度と 65 8名の健常人の遺伝子型の頻度とを比較し、その後、 0. 01未満の P値を有する SN Pについてより大きな複製パネルでさらに遺伝子タイピングを行った。表 1に示す通り 、 LTA部位を含む 4個の SNP部位が心筋梗塞と有意な相関を示した (Pく 0. 0001 )。他の 3個の部位は、染色体 2p25.1上の LBP-32遺伝子内、染色体 6p21上の TSBP 遺伝子内、及び染色体 20ql 3上の WAP12遺伝子内にそれぞれ位置した。
[0062] [表 1]
表 1
Dominant Recessive
P値 model model
>= 0.01 1 ,299 1 ,307
< 0.01 27 18
< 0.001 6 5
< 0.0001 1 3 total 1 ,333 1 ,333 [0063] [表 2]
表 2
Chi square Odds ratio 遺伝子型 心筋梗塞 対照 (p value) (95% c.i.)
TSBP exon25 306A>G
AA 1077 1057 AA vs. GG+AG 1.32
(58.4%) (65.0%) 16.1 (1.15-1.52)
AG 661 496 (0.000062)
(35.8%) (30.5%)
GG 107 73
(5.8%) (4.5%)
LBP-32 intronl +151G>A
GG 1475 1247 AA vs. GG+GA 3.71
(79.3%) (77.3%) 15.7 (1.85-7.41)
GA 342 357 (0.000072)
(18.4%) (22.1%)
AA 42 10
(2.3%) (0.6%)
WAP12 3'flanking +1264G>A
GG 775 767 AA vs. GG+GA 1.60
(41.6%) (47.1%) 18.2 (1.29-1.99)
GA 837 717 (0.000019)
(45.0%) (44.0%)
AA 250 144
(13.4%) (8.8%)
[0064] [表 3] 名称 配列
TSBP exon25 306A>G 5'-TAAAAATCAGTGAGATGAGT
[A G]
TACCACAAGGACAGGGAGCC-3'
LBP-32 intronl +151G>A 5'-GTCCACTCCACGCCGCCACG
[G/A〗
CCTTTGCCCCTTAGCCCTGC-3'
WAP12 3'flanking +1264G>A 5'- AGACATCATCAGCAGTAGGT
[G/A]
GGCTATAAGGGCATGGTCTC -3'
[0065] (2)連鎖不均衡の解析
これらの重要領域における強 、連鎖不均衡 (LD)の伸長を見積もるために、これら の SNPにつ!/、て 95名の心筋梗塞患者と 95名のコントロール被験者にっ 、て遺伝子 型を決定した。 [0066] LBP- 32領域：
TAF1B及び LBP-32を含む染色体 2p25.1上の 157kbに及ぶ 11個の SNPの遺伝子 型を決定した。 LBP-32を含む強い連鎖不均衡の伸長したブロック（図 la)
[0067] TSBP領域：
BTNL2、 TSBP及び NOTCH4を含む染色体 6p21上の 250kbに及ぶ 22個の SNPの遺 伝子型を決定した。これらの SNPのアレル頻度は 30%以上であった。各対の SNP の D'値をプロットして標識した（図 la)。有意な SNPは強!、連鎖不均衡の一つのブ ロック内に存在し、 D'は TSBPの上流及び下流で低下している（図 2a)。
[0068] WAP領域：
WAP7-13及び TNNC2を含む染色体 20ql3上の 376kbに及ぶ 15個の SNPの遺伝子 型を決定した。 WAP8- 13を含む強い連鎖不均衡の伸長したブロック（図 3a)
[0069] (3)高密度 SNPマッピング及びハロタイプブロック解析
LBP— 32中の遺伝子の変異を全て同定するために、 LBP— 32のェクソンの全て を包含する約 52kbをスクリーニングした。この領域中に全部で 40個の多型を同定し 、 190名の心筋梗塞患者と 190名の健常被験者の遺伝子型を決定した。この遺伝子 タイピングの結果、 LBP-32イントロン 1 +151G〉A以外には、有意な相関は認められな かった。
[0070] TSBPについては、そのエタソンの全てを包含する約 80kbをスクリーニングした。こ の領域中に全部で 216個の多型を同定した。ハロタイプブロックを見積もるために、 アレル頻度が 20%以上である上記で見つけた SNPを用いて、 95名の心筋梗塞患 者と 95名の健常被験者の遺伝子型を決定した。この遺伝子タイピングの結果、有意 な相関が認められる TSBPェクソン 25 306A〉Gを含むハロタイプブロックを見出した (図 2b)。
[0071] WAP遺伝子領域については、 WAP7-13及び TNNC2をスクリーニングした。この領 域中に全部で 54個の多型を同定し、 95名の心筋梗塞患者と 95名の健常被験者の 遺伝子型を決定した。この遺伝子タイピングの結果、 WAP12遺伝子の 3'フランキング 領域中の SNPを含むハロタイプブロックを見出した。このハロタイプブロックは約 1 OOk bに及ぶ 18個の SNPから構成される。これら 18個の SNPについて、別の 475名の心 筋梗塞患者と別の 475名の健常被験者についてさらに遺伝子型を決定した。その結 果、 WAP12遺伝子の 3，フランキング領域 + 1264G>Aを含む複数の SNPにおいて 最も有意な相関が認められた (図 3b)。
[0072] (4)ヒト心臓における TSBP及び LBP-32遺伝子の発現と局在
RT-PCRを用いて TSBP及び LBP-32の遺伝子発現を解析した。 TSBP転写物は、冠 動脈内皮細胞 (HCAEC)及び冠動脈平滑筋細胞 (HCASMC)で検出された (図 4a)。 LB P-32転写物はヒト心臓組織及び HCAECで検出された（図 4a)。
[0073] TSBP及び LBP-32の細胞局在を調べるために、 Mycで標識した TSBP又は Flagで標 識した LBP-32を HACSMCにトランスフエクシヨンした。その結果、 TSBPは細胞質に局 在し、 LBP- 32は核に局在して!/、た（図 4b及び c)。
[0074] (5) SNP部位への核因子の結合
LBP-32中の SNP (イントロン 1 +151G〉A)に核因子が結合するかどうかを調べるた めに、 SNP部位を含むオリゴヌクレオチドを用いてゲルシフトアツセィを行った。ァレ ル Aを含むオリゴヌクレオチドを用いた場合にのみ、印をつけたシフトのバンドが見ら れた（図 lb)。
[0075] (6) SNPにより影響を受ける転写調節活性
LBP-32のイントロン 1 +151G〉Aの SNPがその発現量に影響を及ぼすかどうかを決定 するために、ルシフェラーゼ遺伝子転写ユニットの上流の各アレルに対応するゲノム DNA断片を用いて 2つのプラスミドを構築した。 Aアレルに対応するクローンの相対ル シフェラーゼ活性は、 Gアレルに対応するクローンの約半分であった（図 lc)。
[0076] (C)考察
92, 788個の SNPを用いて心筋梗塞について大規模相関研究を行った。 65, 671 個の SNP(70. 7%)において 94名の心筋梗塞患者の遺伝子型を決定した。これらの SNPは、 13,738個の遺伝子をカバーする。これは、今回のスクリーニングが全遺伝子 の約 43%をカバーしていることを意味する。一次スクリーニングについて 0. 01未満 の P値が得られたスクリーニングした SNPの 96%以上力 他の試料では有意な相関を 維持できなかった。この結果は、少数の試料を用いた相関研究は一般の疾患につい ては無意味であることを示して 、る。 [0077] 本実施例の大規模相関研究の結果、 4個の SNPにおいて心筋梗塞の危険の増大と 有意な相関を認めた。これらの 4個の SNPのうち、 1個の SNPは LTA上に位置し、これ は既報のものである (Ozaki K,他、（2002) Functional SNPs in the lymphotoxin- alpha gene that are associated with susceptibility to myocardial infarction. Nat Genet 32:6 50-654.)。その他の 2個の SNPは TSBP及び LBP-32上に位置した。最後の SNPは染色 体 20ql3上の WAP遺伝子座に存在した。
[0078] LBP-32はチトクロム P450sccのプロモーター領域に結合するタンパク質としてクロ 一-ングされた (Huang N,他、（2000) Cloning of factors related to HIV- inducible LB P proteins that regulate steroidogenic factor— 1— independent human placental trans c ription of the cholesterol side-chain cleavage enzyme, P450scc. J Biolし hem 275:28 52-2858.)。これはヒト p70 MGRと同一であり、 マウス MGRと 94%同一である (Wilanow SKI T,他、 (2002) A nighly conserved novel family of mammalian developmental trans cription factors related to Drosophila grainyhead. Mech Dev 114:37-50.)。 Wilanows ki他は、 p70 MGRがショウジヨウバエドーパデカルボキシラーゼ、ショウジヨウバエ PC NA及びヒト En-1のプロモーター領域に結合することを報告して 、る。 Flagで標識した LBP-32を用いた過剰発現研究の結果、 LBP-32は、マウス MGRと同様、核に局在し ていた。 LBP-32イントロン 1 +151G〉Aの置換により、核因子の結合モチーフに変化が 生じる。即ち、 Gアレルはモチーフを持たないが、 Aアレルは COUPZHNF— 4ヘテロ ダイマー結合モチーフを有している。ルシフェラーゼアツセィの結果、 LBP-32イントロ ン 1 +151G〉Aの少数アレル力 LBP-32の発現レベルを抑制し、その結果、その下流の 遺伝子の発現レベルが変化すると!、う可能性が示された。 P450sccはエストロゲンシ ンテターゼとも称される。エストロゲンは心臓に対して重要な役割を担って 、るので、 P450SCCの発現レベルの変化が心筋梗塞の発症に関連して 、る可能性がある。発現 レベルに影響する機構は少数 Aアレルへの核因子の結合であると考えられる（図 lb)
[0079] TSBPは精巣 cDNAから最初に同定された (Liang ZG,他、（1994) Human testis cDN As identified oy sera from infertile patients: a molecular biological approach to immu nocontraceptive development. Reprod Fertil Dev 6:297—305)。し力しな力 Sら、 TSBP c DNAはヒト心臓組織及び HCAECで検出された（図 3)。 HCASMCでは、 TSBPの局在 は細胞質である。 TSBPにおける重要な SNP (ェクソン 25 306A〉G)はコード領域に存 在し、アミノ酸置換 (I306V)を生じる。 TSBPは、 LTAも位置する 6p21にマッピングされる 。 2つの遺伝子は、約 700 kbの間隔で位置し、互いに異なる連鎖不均衡ブロックに位 置する。このことは TSBPと LTAの重要な SNP間の D'は 0.4である。 TSBPと心筋梗塞 との有意な相関は LTAとは独立していることを示す。
[0080] 染色体 20ql3上の遺伝子座は、乳清酸性タンパク質 (WAP)とホモロジ一を有するタ ンパク質をコードする多数の遺伝子を含んでいる。 WAPの機能は、微生物に対する 宿主応答に存在する可能性がある（Clauss A,他、（2002) A locus on human chromos ome 20 contains several genes expressing protease inhibitor domains with homology to whey acidic protein. Biochem J 368:233-242)。有意な相関が見られた SNPを含 む連鎖不均衡ブロックは約 300kbまで伸びた。ハプロタイプブロック解析のために、 標的領域は lOOkbに限定された。この限定された標的領域内には 4個の WAP遺伝 子が存在する。これらの遺伝子は重複する領域を含んでいるので、心筋梗塞関連遺 伝子に焦点を合わせることは困難である。
[0081] 上記の通り、本実施例の大規模相関研究により、心筋梗塞の発症に感受性のある 2つの候補遺伝子と 1つの候補遺伝子座が同定された。
産業上の利用可能性
[0082] 本発明により、心筋梗塞等の炎症性疾患の発症進展に関与する新規な一塩基多 型（SNP)が新たに同定された。本発明で同定された SNPを利用することにより、心 筋梗塞等の炎症性疾患の診断法、又は炎症性疾患の治療薬の開発法を提供するこ とが可能になる。
図面の簡単な説明
[0083] [図 1]図 1は LBP-32の結果を示す。（a)は、 TAF1B及び LBP-32を含むゲノム領域に おける D'で測定した、 SNP間の一対の連鎖不均衡を示す。 11個の共通する SNPの 遺伝子型を決定した。これらの SNPのアレル頻度は 30%以上であった。 LBP-32は 1 個の連鎖不均衡ブロックに局在した。黒の領域は強い連鎖不均衡を示し、白の領域 は D'〈0.5を示す。（b)は、 LBP-32のイントロン 1への未知の核因子の結合を示す。矢 印は、 Gアレルではなく Aアレルへの核因子の結合を示すバンドを示す。 （c)は、相 対ルシフェラーゼ活性に対する LBP-32のイントロン中の SNPの影響を示す。アレル A による相対ルシフェラーゼ活性は、アレル Gによるものより有意に低い。 *P=0.0001 (St udentの t-検定により、アレル Gとアレル Aの間の比較について）
[図 2]図 2は、 TSBPの結果を示す。（a)は、 BTNL2, TSBP及び NOTCH4を含むゲノム 領域中における D'で測定した、 SNP間の一対の連鎖不均衡を示す。 22個の共通す る SNPの遺伝子型を決定した。これらの SNPのアレル頻度は 30%以上であった。 T SBP遺伝子は 1個の連鎖不均衡ブロックに局在した。黒の領域は強い連鎖不均衡を 示し、白の領域は D'〈0.5を示す。（b)は、ハプロタイプブロック及び P値の分布を示す 。ハプロタイプブロックは、 exon25 306A〉Gを含む 11個の共通する SNPを含んでい た。最も有意な相関は TSBPの最後のェクソンに見られた (exon25 306A〉G) (矢印)。
[図 3]図 3は、 WAP遺伝子領域の結果を示す。 (a)は、 WAP7-13及び TNNC2を含む ゲノム領域中における D'で測定した、 SNP間の一対の連鎖不均衡を示す。 15個の 共通する SNPの遺伝子型を決定した。これらの SNPのアレル頻度は 30%以上であ つた。 WAP8-13遺伝子は 1つの連鎖不均衡ブロック中に存在した。黒い領域は強い 連鎖不均衡を示し、白の領域は D'〈0.5を示す。（b)は、ハプロタイプブロック及び P値 の分布を示す。ハプロタイプブロックは、 WAP12 3'フランキング +1264G〉Aを含む 18 個の共通する SNPを含んでいた。 WAP12 3'フランキング +1264G〉Aを含む複数の S NPにおいて、最も有意な相関が認められた。
[図 4]図 4は、発現及び局在の分析を示す。（a) LBP- 32は、ヒト心臓組織、 HCASMC 及び HCAECで発現させた。 TSBPは、ヒト心臓組織、及び HCAECで発現させた。 (b) TSBPは、 HCASMCでは細胞質に局在した。 LBP-32は、 HCASMCでは核に局在した

Claims

請求の範囲 [1] LBP-32遺伝子、 TSBP遺伝子、及び WAP遺伝子より成る群から選ばれる少なくとも 1 つの遺伝子に存在する少なくとも一種の遺伝子多型を検出することを含む、炎症性 疾患の判定方法。 [2] LBP-32遺伝子、 TSBP遺伝子、及び WAP遺伝子より成る群から選ばれる少なくとも 1 つの遺伝子に存在する少なくとも一種の一塩基多型を検出することを含む、炎症性 疾患の判定方法。 [3] 下記の（1)から（3)よりなる群力 選ばれる少なくとも一種の一塩基多型を検出するこ とを含む、炎症性疾患の判定方法。
(1) LBP— 32遺伝子のイントロン 1の塩基配列の 151番目の塩基における GZAの 多型
(2) TSBP遺伝子のェキソン 25の塩基配列の 306番目の塩基における AZGの多 型
(3) WAP12遺伝子の 3'フランキング領域の塩基配列の 1264番目の塩基における GZAの多型
[4] 炎症性疾患が心筋梗塞である、請求項 1から 3の何れかに記載の方法。
[5] 下記の（1)から（3)よりなる群力 選ばれる少なくとも 1つの部位を含む連続する少な くとも 10塩基の配列、又はその相補配列にハイブリダィズすることができ、請求項 1か ら 4の!、ずれかに記載の方法にお!、てプローブとして用いるオリゴヌクレオチド。
(1) LBP— 32遺伝子のイントロン 1の塩基配列の 151番目の塩基
(2) TSBP遺伝子のェキソン 25の塩基配列の 306番目の塩基
(3) WAP 12遺伝子の 3，フランキング領域の塩基配列の 1264番目
[6] 下記の（1)から（3)よりなる群力 選ばれる少なくとも 1つの部位を含む連続する少な くとも 10塩基の配列、及び Z又はその相補配列を増幅することができ、請求項 1から 4の 、ずれかに記載の方法にお!、てプライマーとして用いるオリゴヌクレオチド。
(1) LBP— 32遺伝子のイントロン 1の塩基配列の 151番目の塩基
(2) TSBP遺伝子のェキソン 25の塩基配列の 306番目の塩基
(3) WAP 12遺伝子の 3，フランキング領域の塩基配列の 1264番目
[7] プライマーがフォワードプライマー及び Z又はリバースプライマーである請求項 6に記 載のオリゴヌクレオチド。
[8] 請求項 5から 7のいずれかに記載のオリゴヌクレチドの 1種以上を含む、炎症性疾患 診断用キット。
[9] 炎症性疾患が心筋梗塞である請求項 8に記載のキット。
[10] 下記の（1)から（3)よりなる群力 選ばれる少なくとも一種の一塩基多型を検出するこ とを含む、 LBP-32、 TSBP,又は WAPの発現状態の分析方法。
(1) LBP— 32遺伝子のイントロン 1の塩基配列の 151番目の塩基における GZAの 多型
(2) TSBP遺伝子のェキソン 25の塩基配列の 306番目の塩基における AZGの多 型
(3) WAP12遺伝子の 3'フランキング領域の塩基配列の 1264番目の塩基における GZAの多型
[11] 候補物質の存在下で細胞内の LBP-32遺伝子、 TSBP遺伝子、又は WAP遺伝子の発 現量を分析し、その発現量を変化させる物質を選択する工程を含む、炎症性疾患の 治療薬のスクリ一ユング方法。
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