JP2001333799A - 骨粗鬆症薬剤感受性予測方法およびそのための試薬キット - Google Patents
骨粗鬆症薬剤感受性予測方法およびそのための試薬キットInfo
- Publication number
- JP2001333799A JP2001333799A JP2000155993A JP2000155993A JP2001333799A JP 2001333799 A JP2001333799 A JP 2001333799A JP 2000155993 A JP2000155993 A JP 2000155993A JP 2000155993 A JP2000155993 A JP 2000155993A JP 2001333799 A JP2001333799 A JP 2001333799A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- gene
- vitamin
- sensitivity
- polymorphism
- estrogen
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
Landscapes
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
- Acyclic And Carbocyclic Compounds In Medicinal Compositions (AREA)
Abstract
(57)【要約】
【解決手段】 ヒト由来試料に含まれるゲノムＤＮＡか
ら、ビタミンＤ受容体遺伝子、エストロゲン受容体遺伝
子およびアポリポ蛋白Ｅ３遺伝子のそれぞれの多型を分
析し、該遺伝子多型の組み合わせに基づいて、該試料が
複数の骨粗鬆症治療薬に対する感受性において特定の優
先性を示す個人由来のものであると予測することを特徴
とする骨粗鬆症治療薬感受性予測方法。 【効果】 本発明の方法によれば、投薬前にどの骨粗鬆
症治療薬が対象患者に対して最も治療効果が高いかを予
測することが出きるので、適切な薬剤の選択が可能とな
り、患者のＱＯＬを向上させるのに極めて有用である。
ら、ビタミンＤ受容体遺伝子、エストロゲン受容体遺伝
子およびアポリポ蛋白Ｅ３遺伝子のそれぞれの多型を分
析し、該遺伝子多型の組み合わせに基づいて、該試料が
複数の骨粗鬆症治療薬に対する感受性において特定の優
先性を示す個人由来のものであると予測することを特徴
とする骨粗鬆症治療薬感受性予測方法。 【効果】 本発明の方法によれば、投薬前にどの骨粗鬆
症治療薬が対象患者に対して最も治療効果が高いかを予
測することが出きるので、適切な薬剤の選択が可能とな
り、患者のＱＯＬを向上させるのに極めて有用である。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、骨粗鬆症の治療に
おいて有用な情報を提供し得る新規なヒト由来試料の分
析方法に関する。詳細には、本発明は、骨粗鬆症治療
薬、特にビタミンＤ、エストロゲンおよびビタミンＫ2
のうち、いずれの薬剤を使用することが最も有効な治療
効果を示すかを予測するための、ヒト由来試料中のゲノ
ムＤＮＡの遺伝子多型の分析方法に関する。また、本発
明はヒト由来試料中のゲノムＤＮＡの遺伝子多型の組み
合わせから、該試料が前記薬剤に対する感受性において
特定の優先性を示す個人由来のものであると予測する方
法に関する。さらに、本発明は上記の方法において使用
し得る遺伝子多型分析用キットに関する。また、該遺伝
子多型分析用試薬キットを用いて分析された遺伝子多型
の組み合わせから、適当な骨粗鬆症治療薬を選択する方
法に関する。
おいて有用な情報を提供し得る新規なヒト由来試料の分
析方法に関する。詳細には、本発明は、骨粗鬆症治療
薬、特にビタミンＤ、エストロゲンおよびビタミンＫ2
のうち、いずれの薬剤を使用することが最も有効な治療
効果を示すかを予測するための、ヒト由来試料中のゲノ
ムＤＮＡの遺伝子多型の分析方法に関する。また、本発
明はヒト由来試料中のゲノムＤＮＡの遺伝子多型の組み
合わせから、該試料が前記薬剤に対する感受性において
特定の優先性を示す個人由来のものであると予測する方
法に関する。さらに、本発明は上記の方法において使用
し得る遺伝子多型分析用キットに関する。また、該遺伝
子多型分析用試薬キットを用いて分析された遺伝子多型
の組み合わせから、適当な骨粗鬆症治療薬を選択する方
法に関する。
【０００２】
【従来の技術】骨粗鬆症は骨量（骨に含まれるカルシウ
ムを中心としたミネラルの量）が減少し、かつ、骨組織
の微細構造が変化し、そのために骨が脆くなり骨折しや
すくなった病態であり。閉経後の女性や高齢の男性に多
く、我が国の患者数は推定１０００万人といわれてい。
人口の高齢化に伴い、今後も患者数は不可避的に増加す
るものと予測される。
ムを中心としたミネラルの量）が減少し、かつ、骨組織
の微細構造が変化し、そのために骨が脆くなり骨折しや
すくなった病態であり。閉経後の女性や高齢の男性に多
く、我が国の患者数は推定１０００万人といわれてい。
人口の高齢化に伴い、今後も患者数は不可避的に増加す
るものと予測される。
【０００３】現在、骨粗鬆症の治療薬として、カルシウ
ム製剤、ビタミンＤ等の骨活性化薬、エストロゲン等の
骨吸収抑制薬、ビタミンＫ等の骨形成促進薬など、種々
の薬剤が用いられているが、その治療効果は患者によっ
てまちまちであり、それらをどのように使い分けるかに
ついての検討はほとんどなされていない。これらの治療
薬は単剤投与が原則とされているので、どの治療薬が最
も効果的であるかを調べるには、実際に１つの薬剤を数
年間患者に投与して、その結果を見て判断するしかない
のが現状であり、極めて非効率的である。
ム製剤、ビタミンＤ等の骨活性化薬、エストロゲン等の
骨吸収抑制薬、ビタミンＫ等の骨形成促進薬など、種々
の薬剤が用いられているが、その治療効果は患者によっ
てまちまちであり、それらをどのように使い分けるかに
ついての検討はほとんどなされていない。これらの治療
薬は単剤投与が原則とされているので、どの治療薬が最
も効果的であるかを調べるには、実際に１つの薬剤を数
年間患者に投与して、その結果を見て判断するしかない
のが現状であり、極めて非効率的である。
【０００４】一方、近年の遺伝子研究から、いくつかの
遺伝子の多型と患者の骨粗鬆症治療薬に対する感受性と
の関連が提唱されている。例えば、ビタミンＤ受容体
（以下、ＶＤＲという）遺伝子の第８エクソンと第９エ
クソンの間のイントロン領域内でApa Iにより切断され
ない遺伝子型Ａは、同制限酵素によって切断される遺伝
子型ａに比べて、ビタミンＤに対して高感受性であると
の報告がある［例えば、特開平8-126497号公報および特
開平8-126500号公報参照］。
遺伝子の多型と患者の骨粗鬆症治療薬に対する感受性と
の関連が提唱されている。例えば、ビタミンＤ受容体
（以下、ＶＤＲという）遺伝子の第８エクソンと第９エ
クソンの間のイントロン領域内でApa Iにより切断され
ない遺伝子型Ａは、同制限酵素によって切断される遺伝
子型ａに比べて、ビタミンＤに対して高感受性であると
の報告がある［例えば、特開平8-126497号公報および特
開平8-126500号公報参照］。
【０００５】また、白木ら［１９９７年骨代謝学会要旨
集第５２頁］には、ＶＤＲ遺伝子の多型とビタミンＤ感
受性、エストロゲン受容体（以下、ＥＲという）遺伝子
の多型とエストロゲン感受性およびアポリポ蛋白Ｅ（以
下、ＡｐｏＥという）遺伝子の多型とビタミンＫ２感受
性について調べた結果、ＶＤＲ遺伝子多型ＡＡＢ（Ｂは
第８エクソンと第９エクソンの間のイントロン領域内で
Bsm Iにより切断されない遺伝子型）は、ａａｂｂに比
べてビタミンＤ３に対する感受性が有意に低く、またＥ
Ｒ遺伝子多型ＰｐＸｘ（ＰおよびＸはそれぞれPvu Iお
よびXba Iで切断されない遺伝子型）は他の遺伝子型群
に比べて、エストロゲンに対する感受性が有意に高く、
さらに、ＡｐｏＥ４（＋）群はＡｐｏＥ４（−）群に比
べてビタミンＫ２に対する感受性が有意に低かったと記
載されている。
集第５２頁］には、ＶＤＲ遺伝子の多型とビタミンＤ感
受性、エストロゲン受容体（以下、ＥＲという）遺伝子
の多型とエストロゲン感受性およびアポリポ蛋白Ｅ（以
下、ＡｐｏＥという）遺伝子の多型とビタミンＫ２感受
性について調べた結果、ＶＤＲ遺伝子多型ＡＡＢ（Ｂは
第８エクソンと第９エクソンの間のイントロン領域内で
Bsm Iにより切断されない遺伝子型）は、ａａｂｂに比
べてビタミンＤ３に対する感受性が有意に低く、またＥ
Ｒ遺伝子多型ＰｐＸｘ（ＰおよびＸはそれぞれPvu Iお
よびXba Iで切断されない遺伝子型）は他の遺伝子型群
に比べて、エストロゲンに対する感受性が有意に高く、
さらに、ＡｐｏＥ４（＋）群はＡｐｏＥ４（−）群に比
べてビタミンＫ２に対する感受性が有意に低かったと記
載されている。
【０００６】さらに、ビタミンＤ結合蛋白（以下、ＤＢ
Ｐという）遺伝子をHae IIIおよびSty Iで切断して得ら
れるＲＦＬＰパターンがＧＣ−２型のものは、他の群に
比べてビタミンＤ類に対する感受性が高いと記載されて
いる［特開平8-201373号公報］。
Ｐという）遺伝子をHae IIIおよびSty Iで切断して得ら
れるＲＦＬＰパターンがＧＣ−２型のものは、他の群に
比べてビタミンＤ類に対する感受性が高いと記載されて
いる［特開平8-201373号公報］。
【０００７】しかしながら、これらのいずれも１遺伝子
の多型から１つの薬剤に対する感受性を予測するもので
あり、１つの薬剤について他の遺伝子型よりも感受性が
高いか否かを予測するものでしかない。すなわち、ＶＤ
Ｒ遺伝子型がａａｂｂであり、かつＡｐｏＥ遺伝子型が
ＡｐｏＥ４（−）である人は、他のＶＤＲ遺伝子型およ
びＡｐｏＥ遺伝子型を有する人に比べてビタミンＤおよ
びビタミンＫ２に対する感受性が高いと予測されるが、
それでは、このような遺伝子型を有する患者に対してビ
タミンＤを投与するのと、ビタミンＫ２を投与するのと
では、どちらがより高い治療効果が得られるかについて
は、依然として予測することができない。したがって、
結局のところ、異なる薬剤のいずれに対して患者がより
感受性が高いかを知るには、上述のように、実際に各薬
剤を、１つの薬剤について数年間のスパンで順次患者に
投与して結果を見るしかなかった。特に、エストロゲン
は、治療効果は大きいが副作用も大きいため、感受性の
低い患者への長期投与は患者のＱＯＬ（Quality of Lif
e）を著しく損なうおそれがあった。
の多型から１つの薬剤に対する感受性を予測するもので
あり、１つの薬剤について他の遺伝子型よりも感受性が
高いか否かを予測するものでしかない。すなわち、ＶＤ
Ｒ遺伝子型がａａｂｂであり、かつＡｐｏＥ遺伝子型が
ＡｐｏＥ４（−）である人は、他のＶＤＲ遺伝子型およ
びＡｐｏＥ遺伝子型を有する人に比べてビタミンＤおよ
びビタミンＫ２に対する感受性が高いと予測されるが、
それでは、このような遺伝子型を有する患者に対してビ
タミンＤを投与するのと、ビタミンＫ２を投与するのと
では、どちらがより高い治療効果が得られるかについて
は、依然として予測することができない。したがって、
結局のところ、異なる薬剤のいずれに対して患者がより
感受性が高いかを知るには、上述のように、実際に各薬
剤を、１つの薬剤について数年間のスパンで順次患者に
投与して結果を見るしかなかった。特に、エストロゲン
は、治療効果は大きいが副作用も大きいため、感受性の
低い患者への長期投与は患者のＱＯＬ（Quality of Lif
e）を著しく損なうおそれがあった。
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】したがって、本発明の
目的は、骨粗鬆症患者もしくは将来、骨粗鬆症を発症す
る可能性のある人が、複数の骨粗鬆症治療薬のいずれか
に対してより高い感受性を有するかを予測する手段を提
供することであり、それによって治療効果の低い薬剤の
長期投与による病状の進行を回避し、患者のＱＯＬを向
上させることである。
目的は、骨粗鬆症患者もしくは将来、骨粗鬆症を発症す
る可能性のある人が、複数の骨粗鬆症治療薬のいずれか
に対してより高い感受性を有するかを予測する手段を提
供することであり、それによって治療効果の低い薬剤の
長期投与による病状の進行を回避し、患者のＱＯＬを向
上させることである。
【０００９】
【発明が解決するための手段】本発明者らは、上記目的
を達成するために鋭意検討を重ねた結果、ゲノムＤＮＡ
を含有するヒト由来試料を、ＶＤＲ遺伝子、ＥＲ遺伝子
およびＡｐｏＥ遺伝子の多型について分析することによ
り、得られる多型の組み合わせに基づいて、ビタミン
Ｄ、エストロゲンおよびビタミンＫ２のうちのいずれか
の薬剤に対する感受性が、他の２つの薬剤に対する感受
性に比べて高いことが予測可能であることを見出した。
を達成するために鋭意検討を重ねた結果、ゲノムＤＮＡ
を含有するヒト由来試料を、ＶＤＲ遺伝子、ＥＲ遺伝子
およびＡｐｏＥ遺伝子の多型について分析することによ
り、得られる多型の組み合わせに基づいて、ビタミン
Ｄ、エストロゲンおよびビタミンＫ２のうちのいずれか
の薬剤に対する感受性が、他の２つの薬剤に対する感受
性に比べて高いことが予測可能であることを見出した。
【００１０】すなわち、本発明者らは、ＡｐｏＥ遺伝子
型として、対立遺伝子３を有する遺伝子型３（＋）（＝
3/3）はそれ以外に比べて、ビタミンＫ２に関する薬剤
感受性が高くなることを見出した。また、２／３、３／
４型が２／２、２／４または４／４型に比べて有意にビ
タミンＫ２感受性が高いことも同時に見出した。すなわ
ち、他の遺伝子型に比べてエストロゲンに高感受性のＥ
Ｒ遺伝子型および他の遺伝子型に比べてビタミンＫ２に
高感受性のＡｐｏＥ遺伝子型｛ここで、ビタミン感受性
Ｋ２に高感受性のＡｐｏＥ遺伝子型とは、対立遺伝子３
を有する遺伝子型３（＋）（すなわち、3/3）と該対立
遺伝子３を有しない遺伝子型３（−）（すなわち、2/
2、2/3、2/4、3/4または4/4）と類別される遺伝子型の
うち、前者をいう。｝を有する場合、エストロゲンより
もビタミンＫ２に対してより感受性が高く、他の遺伝子
型に比べてビタミンＤに高感受性のＶＤＲ遺伝子型およ
び他の遺伝子型に比べてビタミンＫ２に高感受性のＡｐ
ｏＥ遺伝子型を有する場合、ビタミンＫ２よりもビタミ
ンＤに対してより感受性が高い傾向にあることを見出し
た。
型として、対立遺伝子３を有する遺伝子型３（＋）（＝
3/3）はそれ以外に比べて、ビタミンＫ２に関する薬剤
感受性が高くなることを見出した。また、２／３、３／
４型が２／２、２／４または４／４型に比べて有意にビ
タミンＫ２感受性が高いことも同時に見出した。すなわ
ち、他の遺伝子型に比べてエストロゲンに高感受性のＥ
Ｒ遺伝子型および他の遺伝子型に比べてビタミンＫ２に
高感受性のＡｐｏＥ遺伝子型｛ここで、ビタミン感受性
Ｋ２に高感受性のＡｐｏＥ遺伝子型とは、対立遺伝子３
を有する遺伝子型３（＋）（すなわち、3/3）と該対立
遺伝子３を有しない遺伝子型３（−）（すなわち、2/
2、2/3、2/4、3/4または4/4）と類別される遺伝子型の
うち、前者をいう。｝を有する場合、エストロゲンより
もビタミンＫ２に対してより感受性が高く、他の遺伝子
型に比べてビタミンＤに高感受性のＶＤＲ遺伝子型およ
び他の遺伝子型に比べてビタミンＫ２に高感受性のＡｐ
ｏＥ遺伝子型を有する場合、ビタミンＫ２よりもビタミ
ンＤに対してより感受性が高い傾向にあることを見出し
た。
【００１１】本発明は、ヒトから採取した試料中に含ま
れるゲノムＤＮＡから、ビタミンＤ受容体遺伝子、エス
トロゲン受容体遺伝子およびアポリポ蛋白Ｅ３対立遺伝
子（２／２、２／３、２／４、３／３、３／４または４
／４）のそれぞれの遺伝子多型を分析し、これらの遺伝
子多型の組み合わせに基づいて、該試料が複数の骨粗鬆
症治療薬に対する感受性において特定の優先性を示す個
人由来のものであると予測することを特徴とする骨粗鬆
症薬剤感受性予測方法である。
れるゲノムＤＮＡから、ビタミンＤ受容体遺伝子、エス
トロゲン受容体遺伝子およびアポリポ蛋白Ｅ３対立遺伝
子（２／２、２／３、２／４、３／３、３／４または４
／４）のそれぞれの遺伝子多型を分析し、これらの遺伝
子多型の組み合わせに基づいて、該試料が複数の骨粗鬆
症治療薬に対する感受性において特定の優先性を示す個
人由来のものであると予測することを特徴とする骨粗鬆
症薬剤感受性予測方法である。
【００１２】また、本発明はビタミンＤ受容体（以下、
ＶＤＲ）遺伝子、アポリポタンパク（以下、ＡｐｏＥ）
遺伝子およびエストロゲン受容体（以下、ＥＲ）遺伝子
のそれぞれの遺伝子に対して、特異的な増幅プライマ
ー、およびＶＤＲ遺伝子多型、アポリポ蛋白Ｅ３対立遺
伝子（２／２、２／３、２／４、３／３、３／４または
４／４）多型およびＥＲ遺伝子多型をそれぞれ検出する
ための検出プローブを含むことを特徴とするＶＤＲ、Ａ
ｐｏＥおよびＥＲ遺伝子の遺伝子多型分析用試薬キット
である。
ＶＤＲ）遺伝子、アポリポタンパク（以下、ＡｐｏＥ）
遺伝子およびエストロゲン受容体（以下、ＥＲ）遺伝子
のそれぞれの遺伝子に対して、特異的な増幅プライマ
ー、およびＶＤＲ遺伝子多型、アポリポ蛋白Ｅ３対立遺
伝子（２／２、２／３、２／４、３／３、３／４または
４／４）多型およびＥＲ遺伝子多型をそれぞれ検出する
ための検出プローブを含むことを特徴とするＶＤＲ、Ａ
ｐｏＥおよびＥＲ遺伝子の遺伝子多型分析用試薬キット
である。
【００１３】さらに、本発明は、上記したＶＤＲ、Ａｐ
ｏＥおよびＥＲ遺伝子の遺伝子多型分析用キットを用い
て分析されたＶＤＲ、ＡｐｏＥおよびＥＲ遺伝子の遺伝
子多型の組み合わせと骨関連疾患の治療薬を結びつける
ことを特徴とする骨関連疾患治療薬の選択方法である。
ｏＥおよびＥＲ遺伝子の遺伝子多型分析用キットを用い
て分析されたＶＤＲ、ＡｐｏＥおよびＥＲ遺伝子の遺伝
子多型の組み合わせと骨関連疾患の治療薬を結びつける
ことを特徴とする骨関連疾患治療薬の選択方法である。
【００１４】
【発明の実施態様】本発明の分析に供され得るヒト由来
試料は、ヒトゲノムＤＮＡを含有するものであれば、特
に限定されない。好ましくは、各種ヒト細胞から単離さ
れたゲノムが例示される。ゲノムＤＮＡの抽出は、ＳＤ
Ｓ／フェノール法、グアニジンチオシナネート法、ＣＴ
ＡＢ法等の慣用の方法で行えばよい。また、全血、分画
された血球細胞、擦過材料として使用される表皮細胞や
粘膜細胞、あるいは毛髪などの、入手が容易で且つＰＣ
Ｒ法の鋳型ＤＮＡ試料として従来から使用されている細
胞・組織も好ましくは用いられる。この場合、例えば細
胞・組織を水中で煮沸したり、あるいはアルカリ溶液中
で加熱することにより、細胞を破砕してゲノムＤＮＡ試
料とする。
試料は、ヒトゲノムＤＮＡを含有するものであれば、特
に限定されない。好ましくは、各種ヒト細胞から単離さ
れたゲノムが例示される。ゲノムＤＮＡの抽出は、ＳＤ
Ｓ／フェノール法、グアニジンチオシナネート法、ＣＴ
ＡＢ法等の慣用の方法で行えばよい。また、全血、分画
された血球細胞、擦過材料として使用される表皮細胞や
粘膜細胞、あるいは毛髪などの、入手が容易で且つＰＣ
Ｒ法の鋳型ＤＮＡ試料として従来から使用されている細
胞・組織も好ましくは用いられる。この場合、例えば細
胞・組織を水中で煮沸したり、あるいはアルカリ溶液中
で加熱することにより、細胞を破砕してゲノムＤＮＡ試
料とする。
【００１５】本発明の分析方法は、ＶＤＲ遺伝子、ＥＲ
遺伝子およびＡｐｏＥ遺伝子についての遺伝子型を調べ
ることを特徴とする。ＶＤＲ遺伝子は第１２染色体上に
ある。ＶＤＲ遺伝子多型の１つは、第８エクソンと第９
エクソンの間のイントロン領域内での制限酵素Bsm Iに
よる切断の可否によって検出される。Bsm Iで切断され
ない対立遺伝子をＢ、同酵素により切断される対立遺伝
子をｂで表すと、ＢＢ、Ｂｂおよびｂｂの３つの遺伝子
型をとり得るが、本発明においては、ＶＤＲ遺伝子多型
は、対立遺伝子Ｂを有する遺伝子B(+)（すなわち、ＢＢ
およびＢｂ）と対立遺伝子Ｂを有しない遺伝子型B(-)
（すなわち、ｂｂ）とに類別される。また、ＶＤＲ遺伝
子の多型部位とは、対立遺伝子ｂの第８エクソンと第９
エクソンの間のイントロン領域内のBsm I制限部位（Ｇ
ＡＡＴＧＣ）および対立遺伝子Ｂのそれに対応する部位
（ＧＡＡＴＧＴ）をいうものとする。
遺伝子およびＡｐｏＥ遺伝子についての遺伝子型を調べ
ることを特徴とする。ＶＤＲ遺伝子は第１２染色体上に
ある。ＶＤＲ遺伝子多型の１つは、第８エクソンと第９
エクソンの間のイントロン領域内での制限酵素Bsm Iに
よる切断の可否によって検出される。Bsm Iで切断され
ない対立遺伝子をＢ、同酵素により切断される対立遺伝
子をｂで表すと、ＢＢ、Ｂｂおよびｂｂの３つの遺伝子
型をとり得るが、本発明においては、ＶＤＲ遺伝子多型
は、対立遺伝子Ｂを有する遺伝子B(+)（すなわち、ＢＢ
およびＢｂ）と対立遺伝子Ｂを有しない遺伝子型B(-)
（すなわち、ｂｂ）とに類別される。また、ＶＤＲ遺伝
子の多型部位とは、対立遺伝子ｂの第８エクソンと第９
エクソンの間のイントロン領域内のBsm I制限部位（Ｇ
ＡＡＴＧＣ）および対立遺伝子Ｂのそれに対応する部位
（ＧＡＡＴＧＴ）をいうものとする。
【００１６】ＥＲ遺伝子は第６番染色体上にある。ＥＲ
遺伝子の多型の１つは、第１エクソンと第２エクソンの
間のイントロン領域内での制限酵素Xba Iによる切断の
可否によって検出される。Xba Iで切断されない対立遺
伝子をＸ、同酵素で切断される対立遺伝子をｘで表す
と、ＸＸ、Ｘｘおよびｘｘの３つの遺伝子型を取り得る
が、本発明においては、ＥＲ遺伝子多型は、対立遺伝子
Ｘを有する遺伝子型X(+)（すなわち、ＸＸおよびＸｘ）
と対立遺伝子Ｘを有しない遺伝子型X(-)（すなわち、ｘ
ｘ）とに類別される。また、ＥＲ遺伝子の多型部位と
は、対立遺伝子ｘの第１エクソンと第２エクソンの間の
イントロン領域内のXba I制限部位（ＴＣＴＡＧＡ）お
よび対立遺伝子Ｘのそれに対応する部位（ＴＣＣＡＧ
Ａ）をいうものとする。
遺伝子の多型の１つは、第１エクソンと第２エクソンの
間のイントロン領域内での制限酵素Xba Iによる切断の
可否によって検出される。Xba Iで切断されない対立遺
伝子をＸ、同酵素で切断される対立遺伝子をｘで表す
と、ＸＸ、Ｘｘおよびｘｘの３つの遺伝子型を取り得る
が、本発明においては、ＥＲ遺伝子多型は、対立遺伝子
Ｘを有する遺伝子型X(+)（すなわち、ＸＸおよびＸｘ）
と対立遺伝子Ｘを有しない遺伝子型X(-)（すなわち、ｘ
ｘ）とに類別される。また、ＥＲ遺伝子の多型部位と
は、対立遺伝子ｘの第１エクソンと第２エクソンの間の
イントロン領域内のXba I制限部位（ＴＣＴＡＧＡ）お
よび対立遺伝子Ｘのそれに対応する部位（ＴＣＣＡＧ
Ａ）をいうものとする。
【００１７】ＡｐｏＥ遺伝子は第１９染色体上にあり、
４つのエクソンと３つのイントロンからなり、２９９個
のアミノ酸からなる蛋白質をコードする。ＡｐｏＥ蛋白
はリポ蛋白によるトリグリセリドやコレステロールの輸
送に関与し、ビタミンＫ２の転送蛋白でもある。Ａｐｏ
Ｅ蛋白には３つのアイソフォーム（Ｅ２、Ｅ３およびＥ
４）が知られており、このうち、Ｅ３が野生型（第１１
２番目がシステイン、第１５８番目がアルギニン）であ
ると考えられている。Ｅ４は第１１２番目のシステイン
（コドン：ＴＧＣ）がアルギニン（コドン：ＣＧＣ）に
置換されたものである。また、Ｅ２は第１５８番目のア
ルギニンがシステインに置換されたものである。したが
って、ＡｐｏＥ４対立遺伝子は変異部位において制限酵
素Hha Iにより切断されるが、ＡｐｏＥ２およびＡｐｏ
Ｅ３対立遺伝子は同部位において同酵素により切断され
ない。これらを要約すると下記の通りである。 １１２番目のアミノ酸 １５８番目のアミノ酸 ＡｐｏＥ２： 切断されない 切断されない ＡｐｏＥ３： 切断されない 切断される ＡｐｏＥ４： 切断される 切断される
４つのエクソンと３つのイントロンからなり、２９９個
のアミノ酸からなる蛋白質をコードする。ＡｐｏＥ蛋白
はリポ蛋白によるトリグリセリドやコレステロールの輸
送に関与し、ビタミンＫ２の転送蛋白でもある。Ａｐｏ
Ｅ蛋白には３つのアイソフォーム（Ｅ２、Ｅ３およびＥ
４）が知られており、このうち、Ｅ３が野生型（第１１
２番目がシステイン、第１５８番目がアルギニン）であ
ると考えられている。Ｅ４は第１１２番目のシステイン
（コドン：ＴＧＣ）がアルギニン（コドン：ＣＧＣ）に
置換されたものである。また、Ｅ２は第１５８番目のア
ルギニンがシステインに置換されたものである。したが
って、ＡｐｏＥ４対立遺伝子は変異部位において制限酵
素Hha Iにより切断されるが、ＡｐｏＥ２およびＡｐｏ
Ｅ３対立遺伝子は同部位において同酵素により切断され
ない。これらを要約すると下記の通りである。 １１２番目のアミノ酸 １５８番目のアミノ酸 ＡｐｏＥ２： 切断されない 切断されない ＡｐｏＥ３： 切断されない 切断される ＡｐｏＥ４： 切断される 切断される
【００１８】ＡｐｏＥ２、ＡｐｏＥ３およびＡｐｏＥ４
対立遺伝子をそれぞれ２、３および４で表すと、2/2、2
/3、2/4、3/3、3/4および4/4の遺伝子型をとり得るが、
本発明においては、ＡｐｏＥ遺伝子多型を、3/3を有す
る遺伝子型3(+)（すなわち、3/3）と、これを有しない
遺伝子型3(-)（すなわち、2/2、2/3、2/4、3/4および4/
4）とに類別する。
対立遺伝子をそれぞれ２、３および４で表すと、2/2、2
/3、2/4、3/3、3/4および4/4の遺伝子型をとり得るが、
本発明においては、ＡｐｏＥ遺伝子多型を、3/3を有す
る遺伝子型3(+)（すなわち、3/3）と、これを有しない
遺伝子型3(-)（すなわち、2/2、2/3、2/4、3/4および4/
4）とに類別する。
【００１９】本発明の遺伝子多型の測定方法は、ＶＤＲ
遺伝子の多型B(+)とB(-)、ＥＲ遺伝子の多型X(+)とX(-)
およびＡｐｏＥ遺伝子の多型3(+)と3(-)をそれぞれ区別
し得る方法であれば、特に制限されず、サザンハイブリ
ダイゼーション法、シーケンス法、ＰＣＲ法等の通常の
ゲノムＤＮＡの検出・分析法を適宜組み合わせた種々の
方法が利用できる。
遺伝子の多型B(+)とB(-)、ＥＲ遺伝子の多型X(+)とX(-)
およびＡｐｏＥ遺伝子の多型3(+)と3(-)をそれぞれ区別
し得る方法であれば、特に制限されず、サザンハイブリ
ダイゼーション法、シーケンス法、ＰＣＲ法等の通常の
ゲノムＤＮＡの検出・分析法を適宜組み合わせた種々の
方法が利用できる。
【００２０】これらの遺伝子多型の測定方法は、その原
理に基づいて３つに大別される。すなわち、（１）多型
部位を含む遺伝子断片を単離して当該部位の塩基配列を
決定するか、あるいは特異的なプローブまたはプライマ
ーを用いて多型部位を直接検出する方法、（２）多型部
位を含む遺伝子断片の高次構造の差を利用して、電気泳
動度により多型を判別する方法および（３）多型部位で
の制限酵素による切断の可否を利用して、電気泳動度に
より多型を判別する方法である。（１）の具体的な方法
として、例えば、シーケンス法、配列特異的オリゴプロ
ーブ（sequence-specific pligonucleotide probes; Ｓ
ＳＯＰ）法、アレル特異的増幅（mutantallele specifi
c amplification; ＭＡＳＡ）法などが挙げられる。
理に基づいて３つに大別される。すなわち、（１）多型
部位を含む遺伝子断片を単離して当該部位の塩基配列を
決定するか、あるいは特異的なプローブまたはプライマ
ーを用いて多型部位を直接検出する方法、（２）多型部
位を含む遺伝子断片の高次構造の差を利用して、電気泳
動度により多型を判別する方法および（３）多型部位で
の制限酵素による切断の可否を利用して、電気泳動度に
より多型を判別する方法である。（１）の具体的な方法
として、例えば、シーケンス法、配列特異的オリゴプロ
ーブ（sequence-specific pligonucleotide probes; Ｓ
ＳＯＰ）法、アレル特異的増幅（mutantallele specifi
c amplification; ＭＡＳＡ）法などが挙げられる。
【００２１】シーケンス法では、まず、ＶＤＲ遺伝子、
ＥＲ遺伝子およびＡｐｏＥ遺伝子のそれぞれの多型部位
を内部に含む適当な長さの各遺伝子断片を増幅し得るよ
うな特異的プライマー対を合成する。該プライマー対は
約１５〜約４０塩基であり、通常のＰＣＲプライマーに
要求される好適な条件を満たすものであれば、特に制限
されない。次いで、該プライマー対を用い、ヒト由来試
料を鋳型としてＰＣＲを行い、目的の各遺伝子断片を増
幅させる。ＰＣＲの反応条件は通常使用される範囲で適
宜選択することができる。各遺伝子断片を適当なベクタ
ーにそれぞれサブクローニングし、マキサム・ギルバー
ト法やジデオキシ法を用いた通常のシーケンスにより各
多型部位の塩基配列を決定することができる。また、サ
ブクローニングすることなく直接サイクリングシーケン
ス法により配列決定することもできる。
ＥＲ遺伝子およびＡｐｏＥ遺伝子のそれぞれの多型部位
を内部に含む適当な長さの各遺伝子断片を増幅し得るよ
うな特異的プライマー対を合成する。該プライマー対は
約１５〜約４０塩基であり、通常のＰＣＲプライマーに
要求される好適な条件を満たすものであれば、特に制限
されない。次いで、該プライマー対を用い、ヒト由来試
料を鋳型としてＰＣＲを行い、目的の各遺伝子断片を増
幅させる。ＰＣＲの反応条件は通常使用される範囲で適
宜選択することができる。各遺伝子断片を適当なベクタ
ーにそれぞれサブクローニングし、マキサム・ギルバー
ト法やジデオキシ法を用いた通常のシーケンスにより各
多型部位の塩基配列を決定することができる。また、サ
ブクローニングすることなく直接サイクリングシーケン
ス法により配列決定することもできる。
【００２２】ＳＳＯＰ法は、多型部位を吹くむ約１５〜
約１００塩基の、一方の対立遺伝子配列に完全相補的な
プローブを作製し、ハイブリダイゼーション温度を厳密
に制御しながらヒト由来試料から抽出したゲノムＤＮＡ
とサザンハイブリダイゼーションを行い、ハイブリッド
形成の有無により遺伝子多型を判別する方法である。ハ
イブリダイゼーションは各遺伝子について別個に行って
も、あるいは同時に行ってもよい。但し、本発明におい
て測定される３つの遺伝子の多型はいずれも１塩基置換
であるので、ミスマッチによる不安定効果を最大限にす
るために、プローブの中央付近に多型部位が存在するよ
うにプローブを設計することが望ましい。好ましい変法
として、ハイブリダイゼーションに先立って多型部位を
含む断片をＰＣＲで増幅しておくＰＣＲ−ＳＳＯＰ法が
挙げられる。また、両方の対立遺伝子に完全相補的な２
つのプローブを作製し、その一方のみを標識して両者共
存下にハイブリダイゼーション法は、ハイブリダイゼー
ション条件を厳密に制御することなく１塩基置換を判別
することができる。
約１００塩基の、一方の対立遺伝子配列に完全相補的な
プローブを作製し、ハイブリダイゼーション温度を厳密
に制御しながらヒト由来試料から抽出したゲノムＤＮＡ
とサザンハイブリダイゼーションを行い、ハイブリッド
形成の有無により遺伝子多型を判別する方法である。ハ
イブリダイゼーションは各遺伝子について別個に行って
も、あるいは同時に行ってもよい。但し、本発明におい
て測定される３つの遺伝子の多型はいずれも１塩基置換
であるので、ミスマッチによる不安定効果を最大限にす
るために、プローブの中央付近に多型部位が存在するよ
うにプローブを設計することが望ましい。好ましい変法
として、ハイブリダイゼーションに先立って多型部位を
含む断片をＰＣＲで増幅しておくＰＣＲ−ＳＳＯＰ法が
挙げられる。また、両方の対立遺伝子に完全相補的な２
つのプローブを作製し、その一方のみを標識して両者共
存下にハイブリダイゼーション法は、ハイブリダイゼー
ション条件を厳密に制御することなく１塩基置換を判別
することができる。
【００２３】ＭＡＳＡ法は、多型部位を含む約１５〜約
４０塩基の、一方の対立遺伝子配列に完全相同的（また
は完全相補的）なオリゴＤＮＡを一方のプライマーとし
て合成し、アニーリング温度を厳密に制御しながら、ヒ
ト由来試料を鋳型としてＰＣＲを行い、増幅産物の存在
の有無により遺伝子多型を判別する方法である。該方法
も上記と同様、交叉反応を防ぐためにＰＣＲの条件を高
度に制御する必要があるが、自動サーマルサイクラー中
で反応を行えば、比較的容易に正確な判別が可能であ
る。
４０塩基の、一方の対立遺伝子配列に完全相同的（また
は完全相補的）なオリゴＤＮＡを一方のプライマーとし
て合成し、アニーリング温度を厳密に制御しながら、ヒ
ト由来試料を鋳型としてＰＣＲを行い、増幅産物の存在
の有無により遺伝子多型を判別する方法である。該方法
も上記と同様、交叉反応を防ぐためにＰＣＲの条件を高
度に制御する必要があるが、自動サーマルサイクラー中
で反応を行えば、比較的容易に正確な判別が可能であ
る。
【００２４】上記（２）の方法としては、以下のＰＣＲ
−ＳＳＣＰ（single-strand conformation polymorphis
m）法、ＰＣＲ−ＤＧＧＥ（denaturing gradient gel e
lectrophoresis）法、ＰＣＲ−ＣＦＬＰ（cleavase fra
gment length polymorphism）法等が挙げられる。これ
らの方法は、いずれの方法は、いずれも（１）のシーケ
ンス法と同様にして、多型部位を内部に含む適当な長さ
の各遺伝子断片を増幅することを第一の工程とし含む。
−ＳＳＣＰ（single-strand conformation polymorphis
m）法、ＰＣＲ−ＤＧＧＥ（denaturing gradient gel e
lectrophoresis）法、ＰＣＲ−ＣＦＬＰ（cleavase fra
gment length polymorphism）法等が挙げられる。これ
らの方法は、いずれの方法は、いずれも（１）のシーケ
ンス法と同様にして、多型部位を内部に含む適当な長さ
の各遺伝子断片を増幅することを第一の工程とし含む。
【００２５】ＰＣＲ−ＳＳＣＰ法では、増幅産物を加熱
またはアルカリ処理等により一本鎖に変性する。一本鎖
に解離したＤＮＡ断片はその塩基配列に依存した独自の
高次構造を形成するので、これをポリアクリルアミド等
の非変性ゲル上で電気泳動することにより、１塩基置換
の多型を移動度の差として検出することができる。
またはアルカリ処理等により一本鎖に変性する。一本鎖
に解離したＤＮＡ断片はその塩基配列に依存した独自の
高次構造を形成するので、これをポリアクリルアミド等
の非変性ゲル上で電気泳動することにより、１塩基置換
の多型を移動度の差として検出することができる。
【００２６】ＰＣＲ−ＤＧＧＥ法では、増幅産物を変性
・再会合させた後、変性剤（ＳＤＳ、尿素、ホルムアミ
ドなど）の濃度勾配をつけた変性ゲル上で電気泳動す
る。１塩基置換の多型は、それを含むドメインの融解温
度（Ｔｍ）を変化させるので、異なる変性剤濃度の位置
で部分解離し、その結果異なる移動度を示す。特に、へ
テロ接合体のＤＮＡの場合、変性・再会合により、野生
型および変異型のホモデュプレックスと、ミスマッチを
有する２種のヘテロデュプレックスとが生成されるの
で、４本のバンドが検出される。但し、最もＴｍの高い
ドメイン中に変異を有する場合は移動度に差が生じな
い。その場合は、ＧＣクランプと呼ばれる約２０〜約５
０ｂｐのＧＣリッチな配列を５’側に付加すれば、その
部分が最もＴｍの高いドメインになるので、多型を移動
度の差として検出することができる。
・再会合させた後、変性剤（ＳＤＳ、尿素、ホルムアミ
ドなど）の濃度勾配をつけた変性ゲル上で電気泳動す
る。１塩基置換の多型は、それを含むドメインの融解温
度（Ｔｍ）を変化させるので、異なる変性剤濃度の位置
で部分解離し、その結果異なる移動度を示す。特に、へ
テロ接合体のＤＮＡの場合、変性・再会合により、野生
型および変異型のホモデュプレックスと、ミスマッチを
有する２種のヘテロデュプレックスとが生成されるの
で、４本のバンドが検出される。但し、最もＴｍの高い
ドメイン中に変異を有する場合は移動度に差が生じな
い。その場合は、ＧＣクランプと呼ばれる約２０〜約５
０ｂｐのＧＣリッチな配列を５’側に付加すれば、その
部分が最もＴｍの高いドメインになるので、多型を移動
度の差として検出することができる。
【００２７】ＰＣＲ−ＣＦＬＰ法は、増幅産物を加熱ま
たはアルカリ処理等により一本鎖に変性し、さらにclea
vageと呼ばれるヘアピン構造を認識して切断する酵素で
処理した後、ゲル電気泳動を行う方法であり、多型によ
るヘアピン構造の有無またはヘアピン形成部位の相違を
バンドの数および／または移動度の差として検出するこ
とができる。
たはアルカリ処理等により一本鎖に変性し、さらにclea
vageと呼ばれるヘアピン構造を認識して切断する酵素で
処理した後、ゲル電気泳動を行う方法であり、多型によ
るヘアピン構造の有無またはヘアピン形成部位の相違を
バンドの数および／または移動度の差として検出するこ
とができる。
【００２８】上記（３）の方法も、迅速且つ簡便に遺伝
子多型を測定できるので好ましい。このような方法とし
ては、ＲＦＬＰ法、ＰＣＲ−ＲＦＬＰ法等が挙げられ
る。
子多型を測定できるので好ましい。このような方法とし
ては、ＲＦＬＰ法、ＰＣＲ−ＲＦＬＰ法等が挙げられ
る。
【００２９】ＲＦＬＰ法は、ヒト由来試料から単離した
ゲノムＤＮＡを、一方の遺伝子多型を多型部位で切断し
得る酵素（さらに必要に応じて、該多型部位の上流およ
び下流の適当な部位でゲノムＤＮＡを切断し得る他の制
限酵素）で消化し、当該遺伝子の部分配列または全配列
をプローブとしてサザンハイブリダイゼーションを行
い、バンドの長さおよび数に基づいて多型を判別する方
法である。本発明においては、ＶＤＲ遺伝子の分析には
Bsm Iが、ＥＲ遺伝子の分析にはXba Iが、ＡｐｏＥ遺伝
子の分析には、Hha Iがそれぞれ使用される。
ゲノムＤＮＡを、一方の遺伝子多型を多型部位で切断し
得る酵素（さらに必要に応じて、該多型部位の上流およ
び下流の適当な部位でゲノムＤＮＡを切断し得る他の制
限酵素）で消化し、当該遺伝子の部分配列または全配列
をプローブとしてサザンハイブリダイゼーションを行
い、バンドの長さおよび数に基づいて多型を判別する方
法である。本発明においては、ＶＤＲ遺伝子の分析には
Bsm Iが、ＥＲ遺伝子の分析にはXba Iが、ＡｐｏＥ遺伝
子の分析には、Hha Iがそれぞれ使用される。
【００３０】ＰＣＲ−ＲＦＬＰ法は、ＶＤＲ遺伝子、Ｅ
Ｒ遺伝子およびＡｐｏＥ遺伝子のそれぞれの多型部位を
内部に含む適当な長さの各遺伝子断片を増幅し得るよう
な特異的プライマー対を合成し、該プライマー対を用
い、ヒト由来試料を鋳型としてＰＣＲを行い、目的の各
遺伝子断片を増幅させた後、増幅産物について上記のＲ
ＦＬＰ法と同様の制限酵素処理を行い、ゲル電気泳動し
てバンドの長さおよび数から多型を判別する方法であ
る。また、ＰＣＲに先立って制限酵素処理を行えば、制
限酵素で切断されるＤＮＡは遺伝子増幅されないので、
バンドの有無により多型を判別することができる。
Ｒ遺伝子およびＡｐｏＥ遺伝子のそれぞれの多型部位を
内部に含む適当な長さの各遺伝子断片を増幅し得るよう
な特異的プライマー対を合成し、該プライマー対を用
い、ヒト由来試料を鋳型としてＰＣＲを行い、目的の各
遺伝子断片を増幅させた後、増幅産物について上記のＲ
ＦＬＰ法と同様の制限酵素処理を行い、ゲル電気泳動し
てバンドの長さおよび数から多型を判別する方法であ
る。また、ＰＣＲに先立って制限酵素処理を行えば、制
限酵素で切断されるＤＮＡは遺伝子増幅されないので、
バンドの有無により多型を判別することができる。
【００３１】上記のような本発明の多型分析により、ヒ
ト由来試料は、ＶＤＲ遺伝子、ＥＲ遺伝子およびＡｐｏ
Ｅ遺伝子の遺伝子多型の組み合わせに基づいて、３型遺
伝子については、[B(-)X(-)3(-)], [B(-)X(-)3(+)], [B
(-)X(+)3(-)], [B(-)X(+)3(+)], [B(+)X(-)3(+)], [B
(+)X(+)3(+)]に類別される。
ト由来試料は、ＶＤＲ遺伝子、ＥＲ遺伝子およびＡｐｏ
Ｅ遺伝子の遺伝子多型の組み合わせに基づいて、３型遺
伝子については、[B(-)X(-)3(-)], [B(-)X(-)3(+)], [B
(-)X(+)3(-)], [B(-)X(+)3(+)], [B(+)X(-)3(+)], [B
(+)X(+)3(+)]に類別される。
【００３２】本発明は、上記の遺伝子多型の組み合わせ
に基づいて、該ヒト由来試料が、複数の骨粗鬆症治療薬
に対する感受性において特定の優先性を示す個人由来の
ものであると予測することを特徴とする。本発明におい
て、複数の骨粗鬆症治療薬とは、好ましくはビタミン
Ｄ、エストロゲンおよびビタミンＫ２である。また、こ
こで骨粗鬆症治療薬に対する感受性とは、治療薬の骨粗
鬆症治療効果の度合いの大きさ意味する。すなわち、あ
る患者において薬剤Ａが薬剤Ｂよりも治療効果が高い場
合には、「その患者の薬剤Ａに対する感受性は薬剤Ｂに
対する感受性に比べて高い」。本発明においては、薬剤
投与前後での骨塩量の変化率を感受性の指標とし、［骨
塩量変化率］−［期待骨塩量変化率］の値が大きい程、
その薬剤に対する感受性が高いと定義する。
に基づいて、該ヒト由来試料が、複数の骨粗鬆症治療薬
に対する感受性において特定の優先性を示す個人由来の
ものであると予測することを特徴とする。本発明におい
て、複数の骨粗鬆症治療薬とは、好ましくはビタミン
Ｄ、エストロゲンおよびビタミンＫ２である。また、こ
こで骨粗鬆症治療薬に対する感受性とは、治療薬の骨粗
鬆症治療効果の度合いの大きさ意味する。すなわち、あ
る患者において薬剤Ａが薬剤Ｂよりも治療効果が高い場
合には、「その患者の薬剤Ａに対する感受性は薬剤Ｂに
対する感受性に比べて高い」。本発明においては、薬剤
投与前後での骨塩量の変化率を感受性の指標とし、［骨
塩量変化率］−［期待骨塩量変化率］の値が大きい程、
その薬剤に対する感受性が高いと定義する。
【００３３】本発明では、ＶＤＲ遺伝子、ＥＲ遺伝子お
よびＡｐｏＥ遺伝子の遺伝子多型の組み合わせが、[B
(+)X(+)3(+)]および[B(+)X(-)3(+)]の場合、ビタミンＫ
２に対する感受性が、ビタミンＤに対する感受性および
エストロゲンに対する感受性に比べて高い個人由来の試
料であると予測し、遺伝子多型の組み合わせが、[B(-)X
(-)3(+)]および [B(-)X(-)3(-)]の場合、ビミタンＤに
対する感受性が、ビタミンＫ２に対する感受性およびエ
ストロゲンに対する感受性に比べて高い個人由来の試料
であると予測し、遺伝子多型の組み合わせが、[B(-)X
(+)3(+)], [B(-)X(+)3(-)]および[B(+)X(+)3(-)]の場
合、エストロゲンに対する感受性が、ビタミンＤに対す
る感受性およびビタミンＫ２に対する感受性に比べて高
い個人由来の試料であると予測することを特徴とする。
よびＡｐｏＥ遺伝子の遺伝子多型の組み合わせが、[B
(+)X(+)3(+)]および[B(+)X(-)3(+)]の場合、ビタミンＫ
２に対する感受性が、ビタミンＤに対する感受性および
エストロゲンに対する感受性に比べて高い個人由来の試
料であると予測し、遺伝子多型の組み合わせが、[B(-)X
(-)3(+)]および [B(-)X(-)3(-)]の場合、ビミタンＤに
対する感受性が、ビタミンＫ２に対する感受性およびエ
ストロゲンに対する感受性に比べて高い個人由来の試料
であると予測し、遺伝子多型の組み合わせが、[B(-)X
(+)3(+)], [B(-)X(+)3(-)]および[B(+)X(+)3(-)]の場
合、エストロゲンに対する感受性が、ビタミンＤに対す
る感受性およびビタミンＫ２に対する感受性に比べて高
い個人由来の試料であると予測することを特徴とする。
【００３４】
【表１】 [B(+)X(-)3(-)]については、３つの治療薬のいずれにも
感受性がないと推定される。
感受性がないと推定される。
【００３５】本発明はまた、上記の分析方法を実施する
のに有用なヒトゲノムＤＮＡ含有試料の遺伝子多型分析
用試薬キットに関する。本発明の試薬キットは、ＶＤＲ
遺伝子を特異的に増幅し得るプライマー対、ＥＲ遺伝子
を特異的に増幅し得るプライマー対、およびＡｐｏＥ遺
伝子を特異的に増幅し得るプライマー対、および／また
はＶＤＲ遺伝子と特異的にハイブリダイズし得る核酸プ
ローブ、ＥＲ遺伝子と特異的にハイブリダイズし得る核
酸プローブおよびＡｐｏＥ遺伝子と特異的にハイブリダ
イズし得る核酸プローブを含む。
のに有用なヒトゲノムＤＮＡ含有試料の遺伝子多型分析
用試薬キットに関する。本発明の試薬キットは、ＶＤＲ
遺伝子を特異的に増幅し得るプライマー対、ＥＲ遺伝子
を特異的に増幅し得るプライマー対、およびＡｐｏＥ遺
伝子を特異的に増幅し得るプライマー対、および／また
はＶＤＲ遺伝子と特異的にハイブリダイズし得る核酸プ
ローブ、ＥＲ遺伝子と特異的にハイブリダイズし得る核
酸プローブおよびＡｐｏＥ遺伝子と特異的にハイブリダ
イズし得る核酸プローブを含む。
【００３６】多型分析にシーケンス法、ＰＣＲ−ＳＳＯ
Ｐ法、ＰＣＲ−ＳＳＣＰ法、ＰＣＲ−ＤＧＧＥ法、ＰＣ
Ｒ−ＣＦＬＰ法等を用いる場合、各プライマー対は、多
型部位を含む各遺伝子断片を増幅し得るように、各遺伝
子の多型部位よりも上流の配列と、多型部位よりも下流
の配列と同一の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドが
使用される。一方、ＭＡＳＡ法を用いる場合は、一方の
プライマーは、各遺伝子の多型部位を含む領域に完全相
同的（＝センス）または完全相補的（＝アンチセンス）
な塩基配列を有するものである。
Ｐ法、ＰＣＲ−ＳＳＣＰ法、ＰＣＲ−ＤＧＧＥ法、ＰＣ
Ｒ−ＣＦＬＰ法等を用いる場合、各プライマー対は、多
型部位を含む各遺伝子断片を増幅し得るように、各遺伝
子の多型部位よりも上流の配列と、多型部位よりも下流
の配列と同一の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドが
使用される。一方、ＭＡＳＡ法を用いる場合は、一方の
プライマーは、各遺伝子の多型部位を含む領域に完全相
同的（＝センス）または完全相補的（＝アンチセンス）
な塩基配列を有するものである。
【００３７】また、多型分析にＲＦＬＰ法を用いる場
合、核酸プローブは各遺伝子の一部または全部の配列を
含むものであれば、特に制限されず、多型部位の配列を
必ずしも含む必要はない。一方、多型分析にＳＳＯＰ法
またはＰＣＲ−ＳＳＯＰ法を用いる場合、核酸プローブ
は、各遺伝子の多型部位を含む領域の配列に完全相補的
な塩基配列を有するものである。
合、核酸プローブは各遺伝子の一部または全部の配列を
含むものであれば、特に制限されず、多型部位の配列を
必ずしも含む必要はない。一方、多型分析にＳＳＯＰ法
またはＰＣＲ−ＳＳＯＰ法を用いる場合、核酸プローブ
は、各遺伝子の多型部位を含む領域の配列に完全相補的
な塩基配列を有するものである。
【００３８】本発明において使用するＶＤＲ遺伝子に特
的なプライマーとは、ポリメラーゼ・チェイン・リアク
ション（以下、ＰＣＲ）法によって、本発明の検出目標
部位であるＶＤＲのイントロン８のBsm I制限酵素多型
を含むようなＶＤＲ遺伝子領域を増幅するように設計さ
れたオリゴヌクレオチドのうち、ＡｐｏＥ遺伝子、ＥＲ
遺伝子の増幅プライマーと似通ってＴｍを有するもので
ある。具体的には、ＰＣＲ時のアニーリング温度が５０
℃のものとして、下記増幅プライマーを例示することが
できる。 gtgcaggcga ttcggtaggg 20 (1) （配列番号１）および ccagcggaag aggtcaaggg 20 (2) （配列番号２）
的なプライマーとは、ポリメラーゼ・チェイン・リアク
ション（以下、ＰＣＲ）法によって、本発明の検出目標
部位であるＶＤＲのイントロン８のBsm I制限酵素多型
を含むようなＶＤＲ遺伝子領域を増幅するように設計さ
れたオリゴヌクレオチドのうち、ＡｐｏＥ遺伝子、ＥＲ
遺伝子の増幅プライマーと似通ってＴｍを有するもので
ある。具体的には、ＰＣＲ時のアニーリング温度が５０
℃のものとして、下記増幅プライマーを例示することが
できる。 gtgcaggcga ttcggtaggg 20 (1) （配列番号１）および ccagcggaag aggtcaaggg 20 (2) （配列番号２）
【００３９】本発明において使用するＡｐｏＥ遺伝子に
特異的なプライマーとは、ＰＣＲ法によって、本発明の
検出目標部位であるＡｐｏＥの多型領域を含むようなＡ
ｐｏＥ遺伝子領域を増幅するように設計されたオリゴヌ
クレオチドのうち、ＶＤＲ遺伝子、ＥＲ遺伝子の増幅プ
ライマーと似通ったＴｍを有するものである。具体的に
はＰＣＲ時のアニーリング温度が５０℃のものとして、
下記増幅プライマーを例示することができる。 ctgggcgcgg acatgg 16 (3) （配列番号３）および cccggcctgg tacact 16 (4) （配列番号４）、 または ctgggcgcc acatggagga 20 (5) （配列番号５）および cccggcctgg tacactgcca 20 (6) （配列番号６）
特異的なプライマーとは、ＰＣＲ法によって、本発明の
検出目標部位であるＡｐｏＥの多型領域を含むようなＡ
ｐｏＥ遺伝子領域を増幅するように設計されたオリゴヌ
クレオチドのうち、ＶＤＲ遺伝子、ＥＲ遺伝子の増幅プ
ライマーと似通ったＴｍを有するものである。具体的に
はＰＣＲ時のアニーリング温度が５０℃のものとして、
下記増幅プライマーを例示することができる。 ctgggcgcgg acatgg 16 (3) （配列番号３）および cccggcctgg tacact 16 (4) （配列番号４）、 または ctgggcgcc acatggagga 20 (5) （配列番号５）および cccggcctgg tacactgcca 20 (6) （配列番号６）
【００４０】本発明において使用するＥＲ遺伝子に特異
的なプライマーとは、ＰＣＲ法によって、本発明の検出
目標部位であるＥＲのイントロン１のXba I制限酵素多
型を含むようなＥＲ遺伝子領域を増幅するように設計さ
れたオリゴヌクレオチドのうち、ＶＤＲ遺伝子、Ａｐｏ
Ｅ遺伝子の増幅プライマーと似通ったＴｍを有するもの
である。具体的にはＰＣＲ時のアニーリング温度が５０
℃のものとして、下記増幅プライマーを例示することが
できる。 gttccaaatg tcccagccgt 20 (7) （配列番号７）および cctgcaccag aatatgtacc 20 (8) （配列番号８）、 または gttccaaatg tcccagccgt 20 (7) (配列番号７) および cctgcaccag aatatgttacc 21 (9) （配列番号９）
的なプライマーとは、ＰＣＲ法によって、本発明の検出
目標部位であるＥＲのイントロン１のXba I制限酵素多
型を含むようなＥＲ遺伝子領域を増幅するように設計さ
れたオリゴヌクレオチドのうち、ＶＤＲ遺伝子、Ａｐｏ
Ｅ遺伝子の増幅プライマーと似通ったＴｍを有するもの
である。具体的にはＰＣＲ時のアニーリング温度が５０
℃のものとして、下記増幅プライマーを例示することが
できる。 gttccaaatg tcccagccgt 20 (7) （配列番号７）および cctgcaccag aatatgtacc 20 (8) （配列番号８）、 または gttccaaatg tcccagccgt 20 (7) (配列番号７) および cctgcaccag aatatgttacc 21 (9) （配列番号９）
【００４１】本発明において使用するＶＤＲ遺伝子を検
出するためのプローブとは、ＶＤＲ遺伝子のBsam I多型
部分において、Ｂ型またはｂ型と結合するオリゴヌクレ
オチドのうち、ＡｐｏＥ遺伝子、ＥＲ遺伝子の検出プロ
ーブと似通ったＴｍを有するものである。具体的にはハ
イブリダイゼーション時の温度が４５℃の場合のものと
して、下記検出用プローブを例示することができる。 caggcctgcg cattcc 16 (10) （配列番号１０）および caggcctgca cattcc 16 (11) （配列番号１１）
出するためのプローブとは、ＶＤＲ遺伝子のBsam I多型
部分において、Ｂ型またはｂ型と結合するオリゴヌクレ
オチドのうち、ＡｐｏＥ遺伝子、ＥＲ遺伝子の検出プロ
ーブと似通ったＴｍを有するものである。具体的にはハ
イブリダイゼーション時の温度が４５℃の場合のものと
して、下記検出用プローブを例示することができる。 caggcctgcg cattcc 16 (10) （配列番号１０）および caggcctgca cattcc 16 (11) （配列番号１１）
【００４２】本発明において使用するＡｐｏＥ遺伝子を
検出するためのプローブとは、ＡｐｏＥ遺伝子の多型部
分において３（＋）型または３（−）型と結合するオリ
ゴヌクレオチドのうち、ＶＤＲ遺伝子、ＥＲ遺伝子の検
出プローブと似通ったＴｍを有するものである。具体的
にハイブリダイゼーション時の温度が４５℃の場合のも
のとして、下記検出用プローブを例示することができ
る。 aggacgtgcg cggc 14 (12) （配列番号１２） aggacgtgtg cggcc 15 (13) （配列番号１３） cagaagcgcc tggcag 16 (18) （配列番号１８）および cagaagtgcc tggcag 16 (19) （配列番号１９）
検出するためのプローブとは、ＡｐｏＥ遺伝子の多型部
分において３（＋）型または３（−）型と結合するオリ
ゴヌクレオチドのうち、ＶＤＲ遺伝子、ＥＲ遺伝子の検
出プローブと似通ったＴｍを有するものである。具体的
にハイブリダイゼーション時の温度が４５℃の場合のも
のとして、下記検出用プローブを例示することができ
る。 aggacgtgcg cggc 14 (12) （配列番号１２） aggacgtgtg cggcc 15 (13) （配列番号１３） cagaagcgcc tggcag 16 (18) （配列番号１８）および cagaagtgcc tggcag 16 (19) （配列番号１９）
【００４３】本発明において使用するＥＲ遺伝子を検出
するためのプローブとは、ＥＲ遺伝子のXba I多型部分
においてＸ型またはｘ型と結合するオリゴヌクレオチド
のうち、ＶＤＲ遺伝子、ＡｐｏＥ遺伝子の検出プローブ
と似通ったＴｍを有するものである。具体的にハイブリ
ダイゼーション時の温度が４５℃の場合として、下記検
出用プローブを例示することができる。 gtgtggtcta gagttg 16 (14) （配列番号１４）および gtgtggtctg gagtta 16 (15) （配列番号１５）、 または tctggagttg ggatga 16 (16) （配列番号１６）および gtggtctaga gttggg 16 (17) （配列番号１７）
するためのプローブとは、ＥＲ遺伝子のXba I多型部分
においてＸ型またはｘ型と結合するオリゴヌクレオチド
のうち、ＶＤＲ遺伝子、ＡｐｏＥ遺伝子の検出プローブ
と似通ったＴｍを有するものである。具体的にハイブリ
ダイゼーション時の温度が４５℃の場合として、下記検
出用プローブを例示することができる。 gtgtggtcta gagttg 16 (14) （配列番号１４）および gtgtggtctg gagtta 16 (15) （配列番号１５）、 または tctggagttg ggatga 16 (16) （配列番号１６）および gtggtctaga gttggg 16 (17) （配列番号１７）
【００４４】本発明のＶＤＲ、ＡｐｏＥおよびＥＲ遺伝
子増幅用試薬とは、上記増幅プライマー(1),(2),(3),
(4),(7)および(8)、または(1),(2),(5),(6),(7),および
(8)、または(1),(2),(3),(4),(7)および(9)、または
(1),(2),(5),(6),(7)および(9)を含む。
子増幅用試薬とは、上記増幅プライマー(1),(2),(3),
(4),(7)および(8)、または(1),(2),(5),(6),(7),および
(8)、または(1),(2),(3),(4),(7)および(9)、または
(1),(2),(5),(6),(7)および(9)を含む。
【００４５】該増幅試薬は、さらに耐熱性ＤＮＡポリメ
ラーゼ、ｄＮＴＰｓおよび緩衝液を含む。耐熱性ＤＮＡ
ポリメラーゼとしては、Taq ＤＮＡポリメラーゼ、Tth
ＤＮＡポリメラーゼ、Pfu ＤＮＡポリメラーゼなどが例
示される。ｄＮＴＰｓとはdATP, dCTP, dGTP, dTTPの混
合物をいう。さらに緩衝液としては、使用する耐熱性Ｄ
ＮＡポリメラーゼに応じて選ばれる。例えば、Taq ＤＮ
Ａポリメラーゼで、Ｍｇイオン、グルセロールを含むト
リス緩衝液などを使用する。
ラーゼ、ｄＮＴＰｓおよび緩衝液を含む。耐熱性ＤＮＡ
ポリメラーゼとしては、Taq ＤＮＡポリメラーゼ、Tth
ＤＮＡポリメラーゼ、Pfu ＤＮＡポリメラーゼなどが例
示される。ｄＮＴＰｓとはdATP, dCTP, dGTP, dTTPの混
合物をいう。さらに緩衝液としては、使用する耐熱性Ｄ
ＮＡポリメラーゼに応じて選ばれる。例えば、Taq ＤＮ
Ａポリメラーゼで、Ｍｇイオン、グルセロールを含むト
リス緩衝液などを使用する。
【００４６】本発明のＶＤＲ、ＡｐｏＥおよびＥＲ遺伝
子の遺伝子多型分析用試薬キットは、上記検出用プロー
ブ (10),(11),(12),(13),(18),(19),(14)および(15)、
または(10),(11),(12),(13),(18),(19)(16)および(17)
を含む。増幅用プライマーまたは検出プローブは直接ま
たは間接に標識物質を結合してもよい。標準物質として
は、放射性物質、酵素、蛍光性物質またはビオチンなど
が例示される。標識物質が放射性物質であれば、その放
射線量を計測する。また、標準物質が酵素、例えばアル
カリホスファターゼであれば、その基質である５−ブロ
モ−４−クロロ−３−インドリールリン酸−ｐ−トルイ
ジン塩(BCIP)およびニトロ・ブルー・テトラゾリウム(N
BT)を作用させ、その生成物を発色強度を測定する。ま
た、アルカリホスファターゼには、１，２−ジオキセタ
ン化合物などの発光性物質を作用させ、該化合物が分解
する際に生じる発光量を測定することも可能である。標
識物質がビオチンであれば、ＰＣＲ後、例えばアルカリ
ホスファターゼ結合ビオチンを反応させ、反応後のアル
カリホスファターゼを常法に従い、測定する。
子の遺伝子多型分析用試薬キットは、上記検出用プロー
ブ (10),(11),(12),(13),(18),(19),(14)および(15)、
または(10),(11),(12),(13),(18),(19)(16)および(17)
を含む。増幅用プライマーまたは検出プローブは直接ま
たは間接に標識物質を結合してもよい。標準物質として
は、放射性物質、酵素、蛍光性物質またはビオチンなど
が例示される。標識物質が放射性物質であれば、その放
射線量を計測する。また、標準物質が酵素、例えばアル
カリホスファターゼであれば、その基質である５−ブロ
モ−４−クロロ−３−インドリールリン酸−ｐ−トルイ
ジン塩(BCIP)およびニトロ・ブルー・テトラゾリウム(N
BT)を作用させ、その生成物を発色強度を測定する。ま
た、アルカリホスファターゼには、１，２−ジオキセタ
ン化合物などの発光性物質を作用させ、該化合物が分解
する際に生じる発光量を測定することも可能である。標
識物質がビオチンであれば、ＰＣＲ後、例えばアルカリ
ホスファターゼ結合ビオチンを反応させ、反応後のアル
カリホスファターゼを常法に従い、測定する。
【００４７】本発明のＶＤＲ、ＡｐｏＥおよびＥＲ遺伝
子の遺伝子多型検出用試薬キットは、上記増幅プライマ
ー(1),(2),(3),(4),(7)および(8)、または(1),(2),(5),
(6),(7),および(8)、または(1),(2),(3),(4),(7)および
(9)、または(1),(2),(5),(6),(7)および(9)、さらに上
記検出用プローブ(10),(11),(12),(13),(18),(19),(14)
および(15)、または(10),(11),(12),(13),(18),(19),(1
6)および(17)を含んでいてもよい。上記増幅試薬におい
て、プライマーはＰＣＲ最終組成物中、０．１〜１．０
μＭであることが好ましい。また、上記検出試薬におい
て、プローブは、０．１〜１．０pmol／μＬであること
が好ましい。
子の遺伝子多型検出用試薬キットは、上記増幅プライマ
ー(1),(2),(3),(4),(7)および(8)、または(1),(2),(5),
(6),(7),および(8)、または(1),(2),(3),(4),(7)および
(9)、または(1),(2),(5),(6),(7)および(9)、さらに上
記検出用プローブ(10),(11),(12),(13),(18),(19),(14)
および(15)、または(10),(11),(12),(13),(18),(19),(1
6)および(17)を含んでいてもよい。上記増幅試薬におい
て、プライマーはＰＣＲ最終組成物中、０．１〜１．０
μＭであることが好ましい。また、上記検出試薬におい
て、プローブは、０．１〜１．０pmol／μＬであること
が好ましい。
【００４８】本発明において、上記遺伝子多型を検出す
る生体試料としては、上記タンパク（ＶＤＲ、Ａｐｏ
Ｅ、ＥＲ）を産生する生体から採取されるゲノムであれ
ば、特に制限されないが、例えば、ヒト血球成分からフ
ェノールなどにより抽出し、必要により精製したゲノム
（ＤＮＡ）がある。本発明のＶＤＲ、ＡｐｏＥおよびＥ
Ｒ遺伝子多型分析方法とは、通常の遺伝子分析法に従
う。すなわち、試料中のＤＮＡをＶＤＲ、ＡｐｏＥおよ
びＥＲ遺伝子に特異的に増幅プライマーを含む増幅試薬
を用いて増幅し、次いでＶＤＲ、ＡｐｏＥおよびＥＲ遺
伝子多型を検出するための検出プローブを含む検出用試
薬を用いて、試料中のＶＤＲ、ＡｐｏＥおよびＥＲ遺伝
子の遺伝子多型を分析する方法である。具体的には、試
料中のＤＮＡ、例えばヒト血液から精製したＤＮＡを上
記増幅プライマーを含む増幅試薬を用いて増幅し、増幅
された試料を上記検出用プローブを含む検出用試薬を用
いて、試料中のＶＤＲ、ＡｐｏＥおよびＥＲ遺伝子多型
を分析する方法である。
る生体試料としては、上記タンパク（ＶＤＲ、Ａｐｏ
Ｅ、ＥＲ）を産生する生体から採取されるゲノムであれ
ば、特に制限されないが、例えば、ヒト血球成分からフ
ェノールなどにより抽出し、必要により精製したゲノム
（ＤＮＡ）がある。本発明のＶＤＲ、ＡｐｏＥおよびＥ
Ｒ遺伝子多型分析方法とは、通常の遺伝子分析法に従
う。すなわち、試料中のＤＮＡをＶＤＲ、ＡｐｏＥおよ
びＥＲ遺伝子に特異的に増幅プライマーを含む増幅試薬
を用いて増幅し、次いでＶＤＲ、ＡｐｏＥおよびＥＲ遺
伝子多型を検出するための検出プローブを含む検出用試
薬を用いて、試料中のＶＤＲ、ＡｐｏＥおよびＥＲ遺伝
子の遺伝子多型を分析する方法である。具体的には、試
料中のＤＮＡ、例えばヒト血液から精製したＤＮＡを上
記増幅プライマーを含む増幅試薬を用いて増幅し、増幅
された試料を上記検出用プローブを含む検出用試薬を用
いて、試料中のＶＤＲ、ＡｐｏＥおよびＥＲ遺伝子多型
を分析する方法である。
【００４９】増幅方法の１つは、一般的にポリメラーゼ
・チェイン・リアクション（以下、ＰＣＲ）法と呼ばれ
る方法であって、２本鎖の試料ＤＮＡを加熱して、１本
鎖としてから、該１本鎖を鋳型として増幅プライマーを
アニールさせ、次いで加温してＤＮＡポリメラーゼによ
り該プライマーからｄＮＴＰｓを合成し、伸長させる。
得られた２本鎖を１本鎖に分離して、上記反応を繰り返
すことにより、効率的に目標領域を有するＤＮＡを増幅
することができる。一般に反応条件は９２〜９５℃で３
０秒間〜１分間、５０〜６５℃を２０秒〜１分間、７０
〜７５℃を２０秒から５分間を、２０〜４０回繰り返
す。５０〜６０℃を部分で上記アニールがおこり、反応
を成功させるためのアニール温度は、主にプライマー組
成によって規定される。７０〜７５℃の部分で伸長がお
こり、反応を成功させるための伸長時間は増幅する目標
領域の長さによって規定される。
・チェイン・リアクション（以下、ＰＣＲ）法と呼ばれ
る方法であって、２本鎖の試料ＤＮＡを加熱して、１本
鎖としてから、該１本鎖を鋳型として増幅プライマーを
アニールさせ、次いで加温してＤＮＡポリメラーゼによ
り該プライマーからｄＮＴＰｓを合成し、伸長させる。
得られた２本鎖を１本鎖に分離して、上記反応を繰り返
すことにより、効率的に目標領域を有するＤＮＡを増幅
することができる。一般に反応条件は９２〜９５℃で３
０秒間〜１分間、５０〜６５℃を２０秒〜１分間、７０
〜７５℃を２０秒から５分間を、２０〜４０回繰り返
す。５０〜６０℃を部分で上記アニールがおこり、反応
を成功させるためのアニール温度は、主にプライマー組
成によって規定される。７０〜７５℃の部分で伸長がお
こり、反応を成功させるための伸長時間は増幅する目標
領域の長さによって規定される。
【００５０】検出方法とは、上記増幅方法により増幅し
たＤＮＡを検出プローブによって検出する方法である。
増幅プライマーには何らかの標識物質が結合してあるこ
とが好ましい。標識物質はプライマーに複数結合してい
てもよい。
たＤＮＡを検出プローブによって検出する方法である。
増幅プライマーには何らかの標識物質が結合してあるこ
とが好ましい。標識物質はプライマーに複数結合してい
てもよい。
【００５１】本発明では、例えば１つの固相担体に３種
の検出プローブを固定化し、該検出プローブに増幅した
試料ＤＮＡを結合させることにより、固相担体上でＶＤ
Ｒ、ＡｐｏＥおよびＥＲ遺伝子多型を検出することが可
能である。固相担体としては、ナイロン膜、マイクロタ
イター・プレートなどが使用できる。検出プローブを固
相担体へ固定化するには、例えば、該検出プローブの末
端に、ターミナル・デオキシヌクレオジル・トランスフ
ェラーゼ(TdT)によってｄＴＴＰを鎖状に付加（polyT付
加）し、上記担体へ物理的吸着させる方法がある。１つ
の担体、例えばナイロン膜の別々な場所、あるいはマイ
クロタイター・プレートの個々のウェルにＶＤＲ、Ａｐ
ｏＥおよびＥＲ遺伝子の検出プローブを固定化すること
により、１つの増幅試料中の３種の遺伝子多型を同時に
判定することができる。
の検出プローブを固定化し、該検出プローブに増幅した
試料ＤＮＡを結合させることにより、固相担体上でＶＤ
Ｒ、ＡｐｏＥおよびＥＲ遺伝子多型を検出することが可
能である。固相担体としては、ナイロン膜、マイクロタ
イター・プレートなどが使用できる。検出プローブを固
相担体へ固定化するには、例えば、該検出プローブの末
端に、ターミナル・デオキシヌクレオジル・トランスフ
ェラーゼ(TdT)によってｄＴＴＰを鎖状に付加（polyT付
加）し、上記担体へ物理的吸着させる方法がある。１つ
の担体、例えばナイロン膜の別々な場所、あるいはマイ
クロタイター・プレートの個々のウェルにＶＤＲ、Ａｐ
ｏＥおよびＥＲ遺伝子の検出プローブを固定化すること
により、１つの増幅試料中の３種の遺伝子多型を同時に
判定することができる。
【００５２】固相担体上で検出プローブにハイブリダイ
ズした増幅ＤＮＡは、結合する標識物質を測定すること
により検出できる。例えば、検出プローブ（１）に対し
て反応し、（２）に反応しない試料はＶＤＲ遺伝子ＢＢ
型、検出プローブ（１）に対して反応せず、（２）に反
応する試料をｂｂ型、検出プローブ（１）および（２）
に反応する試料はＢｂ型である。ＢＢ型、およびＢｂ型
をＶＤＲ遺伝子Ｂ（＋）型、ｂｂ型をＢ（−）型と判定
する。同様に、検出プローブ（３）に対して反応する試
料は、ＡｐｏＥ遺伝子４型、検出プローブ（４）に反応
する試料は２または３型、検出プローブ（５）に反応す
る試料はＡｐｏＥ遺伝子３または４型、検出プローブ
（６）に対して反応する試料は、ＡｐｏＥ遺伝子２型で
ある。ＡｐｏＥ遺伝子３／３型（つまり、ＡｐｏＥ３
（＋）型）の場合、検出プローブ（４）および（５）が
反応し、検出プローブ（３）および（６）が反応しない
ことになる。ＡｐｏＥ３（−）型の場合（つまり３／３
型以外）、検出プローブ（３）、（４）、（５）および
（６）が上記反応を示すこととなる。検出プローブ
（７）または（９）に対して反応し、（８）および（１
０）に反応する試料をＥＲ遺伝子ＸＸ型、検出プローブ
（８）および（１０）に対して反応して、検出プローブ
（７）または（９）に対して反応しない試料は、Ｘｘ型
である。ＥＲ遺伝子ＸＸおよびＸｘ型の場合をＸ（＋）
型、ｘｘ型の場合をＸ（−）型とする。これらの組み合
わせにより、試料中の３つの遺伝子多型を分析すること
ができる。
ズした増幅ＤＮＡは、結合する標識物質を測定すること
により検出できる。例えば、検出プローブ（１）に対し
て反応し、（２）に反応しない試料はＶＤＲ遺伝子ＢＢ
型、検出プローブ（１）に対して反応せず、（２）に反
応する試料をｂｂ型、検出プローブ（１）および（２）
に反応する試料はＢｂ型である。ＢＢ型、およびＢｂ型
をＶＤＲ遺伝子Ｂ（＋）型、ｂｂ型をＢ（−）型と判定
する。同様に、検出プローブ（３）に対して反応する試
料は、ＡｐｏＥ遺伝子４型、検出プローブ（４）に反応
する試料は２または３型、検出プローブ（５）に反応す
る試料はＡｐｏＥ遺伝子３または４型、検出プローブ
（６）に対して反応する試料は、ＡｐｏＥ遺伝子２型で
ある。ＡｐｏＥ遺伝子３／３型（つまり、ＡｐｏＥ３
（＋）型）の場合、検出プローブ（４）および（５）が
反応し、検出プローブ（３）および（６）が反応しない
ことになる。ＡｐｏＥ３（−）型の場合（つまり３／３
型以外）、検出プローブ（３）、（４）、（５）および
（６）が上記反応を示すこととなる。検出プローブ
（７）または（９）に対して反応し、（８）および（１
０）に反応する試料をＥＲ遺伝子ＸＸ型、検出プローブ
（８）および（１０）に対して反応して、検出プローブ
（７）または（９）に対して反応しない試料は、Ｘｘ型
である。ＥＲ遺伝子ＸＸおよびＸｘ型の場合をＸ（＋）
型、ｘｘ型の場合をＸ（−）型とする。これらの組み合
わせにより、試料中の３つの遺伝子多型を分析すること
ができる。
【００５３】本発明の試薬キットは、本発明の分析方法
を実施するのに好適な各種試薬および／または器具等を
さらに含んでいてもよい。
を実施するのに好適な各種試薬および／または器具等を
さらに含んでいてもよい。
【００５４】
【実施例】以下、参考例および実施例を用いて、本発明
を詳細に説明する。
を詳細に説明する。
【００５５】参考例１ 無作為に選んだ閉経後の１６７人の日本人女性から血液
を採取し、血球細胞を分画して、常法によりゲノムＤＮ
Ａを抽出精製した。該ゲノムＤＮＡを鋳型とし、下記プ
ライマー対を用いてＶＤＲ遺伝子断片、ＥＲ遺伝子断片
およびＡｐｏＥ遺伝子断片をそれぞれ別個に増幅した。 ＶＤＲ遺伝子断片増幅用プライマー： センス： 5'-caaccaagac tacaagtacc gcgtcagtga-3' （配列番号２０） アンチセンス： 5'-aaccagcggg aagaggtcaa ggg-3' （配列番号２１） ＥＲ遺伝子断片増幅用プライマー： センス： 5'-ctgccaccct atctgtatct tttcctattc tcc-3'（配列番号２２） アンチセンス：5-tctttctctg ccaccctggc gtcgattatc tga-3' (配列番号２３） ＡｐｏＥ遺伝子断片増幅用プライマー： センス： 5'-cgggcacggc tgtccaagga g-3' (配列番号２４) アンチセンス： 5'-cacgcggccc tgttccacga g-3' （配列番号２５）
を採取し、血球細胞を分画して、常法によりゲノムＤＮ
Ａを抽出精製した。該ゲノムＤＮＡを鋳型とし、下記プ
ライマー対を用いてＶＤＲ遺伝子断片、ＥＲ遺伝子断片
およびＡｐｏＥ遺伝子断片をそれぞれ別個に増幅した。 ＶＤＲ遺伝子断片増幅用プライマー： センス： 5'-caaccaagac tacaagtacc gcgtcagtga-3' （配列番号２０） アンチセンス： 5'-aaccagcggg aagaggtcaa ggg-3' （配列番号２１） ＥＲ遺伝子断片増幅用プライマー： センス： 5'-ctgccaccct atctgtatct tttcctattc tcc-3'（配列番号２２） アンチセンス：5-tctttctctg ccaccctggc gtcgattatc tga-3' (配列番号２３） ＡｐｏＥ遺伝子断片増幅用プライマー： センス： 5'-cgggcacggc tgtccaagga g-3' (配列番号２４) アンチセンス： 5'-cacgcggccc tgttccacga g-3' （配列番号２５）
【００５６】ＰＣＲ条件は、ＶＤＲ遺伝子については、
変性：９４℃、６０秒；アニーリング：６２℃、６０
秒；伸長７２℃、６０秒（３０サイクル）、ＥＲ遺伝子
については、変性９４℃、３０秒：アニーリング：６５
℃、３０秒；伸長：７２℃、３０秒（３０サイクル）；
ＡｐｏＥ遺伝子については、変性９４℃、３０秒；アニ
ーリング：６１℃、４０秒；伸長：７２℃、９０秒（３
０サイクル）であった。このＰＣＲ増幅を含む７．２ｋ
ｂｐのＶＤＲ遺伝子断片、１．３ｋｂｐのＥＲ遺伝子断
片および２４４ｂｐのＡｐｏＥ遺伝子断片がそれぞれ得
られる。ＶＤＲ遺伝子増幅反応液はBsm Iで、ＥＲ遺伝
子増幅反応液をXba Iで、ＡｐｏＥ遺伝子増幅反応液をH
ha Iでそれぞれ処理した後、アガロースゲル電気泳動に
かけた。各増幅産物が多型部位において制限酵素で切断
される場合、ＶＤＲ増幅産物では４．６ｋｂｐと２．６
ｋｂｐ、ＥＲ増幅産物では９００ｂｐと４００ｂｐ、Ａ
ｐｏＥ増幅産物では７２、４８、３８、３５、１９、１
７、および１５ｂｐのバンドが検出される。
変性：９４℃、６０秒；アニーリング：６２℃、６０
秒；伸長７２℃、６０秒（３０サイクル）、ＥＲ遺伝子
については、変性９４℃、３０秒：アニーリング：６５
℃、３０秒；伸長：７２℃、３０秒（３０サイクル）；
ＡｐｏＥ遺伝子については、変性９４℃、３０秒；アニ
ーリング：６１℃、４０秒；伸長：７２℃、９０秒（３
０サイクル）であった。このＰＣＲ増幅を含む７．２ｋ
ｂｐのＶＤＲ遺伝子断片、１．３ｋｂｐのＥＲ遺伝子断
片および２４４ｂｐのＡｐｏＥ遺伝子断片がそれぞれ得
られる。ＶＤＲ遺伝子増幅反応液はBsm Iで、ＥＲ遺伝
子増幅反応液をXba Iで、ＡｐｏＥ遺伝子増幅反応液をH
ha Iでそれぞれ処理した後、アガロースゲル電気泳動に
かけた。各増幅産物が多型部位において制限酵素で切断
される場合、ＶＤＲ増幅産物では４．６ｋｂｐと２．６
ｋｂｐ、ＥＲ増幅産物では９００ｂｐと４００ｂｐ、Ａ
ｐｏＥ増幅産物では７２、４８、３８、３５、１９、１
７、および１５ｂｐのバンドが検出される。
【００５７】ＡｐｏＥ３型遺伝子の検出には増幅産物を
制限酵素Hha Iで処理した後、ポリアクリルアミド・ゲ
ル電気泳動にかけ、電気泳動終了後にエチジウムプロマ
イドでゲルを染色し、バンド・パターンよりＡｐｏＥ遺
伝子の遺伝子多型を判別した。 2/2 型 16, 18, 38, 81, 91bp 2/3 型 16, 18, 33, 38, 48, 81, 91bp 2/4 型 16, 18, 19, 33, 38, 48, 72, 81, 91bp 3/3 型 16, 18, 33, 38, 48, 91bp 3/4 型 16, 18, 19, 33, 38, 48, 72, 91bp 4/4 型 16, 18, 19, 33, 38, 48, 72bp 泳動終了後、エチジウムブロマイドでゲルを染色し、バ
ンドバターンからＶＤＲ、ＥＲおよびＡｐｏＥ遺伝子多
型を判別し、８つの多型群に類別した（表２）。
制限酵素Hha Iで処理した後、ポリアクリルアミド・ゲ
ル電気泳動にかけ、電気泳動終了後にエチジウムプロマ
イドでゲルを染色し、バンド・パターンよりＡｐｏＥ遺
伝子の遺伝子多型を判別した。 2/2 型 16, 18, 38, 81, 91bp 2/3 型 16, 18, 33, 38, 48, 81, 91bp 2/4 型 16, 18, 19, 33, 38, 48, 72, 81, 91bp 3/3 型 16, 18, 33, 38, 48, 91bp 3/4 型 16, 18, 19, 33, 38, 48, 72, 91bp 4/4 型 16, 18, 19, 33, 38, 48, 72bp 泳動終了後、エチジウムブロマイドでゲルを染色し、バ
ンドバターンからＶＤＲ、ＥＲおよびＡｐｏＥ遺伝子多
型を判別し、８つの多型群に類別した（表２）。
【００５８】
【表２】遺伝子型別平均治療効果（％）−期待治療効果
（％）
（％）
【００５９】表２から明らかなように、遺伝子型が[B
(+)X(+)3(+)]または[B(+)X(-)3(+)]の場合、ビタミンＫ
２に対する感受性が、ビタミンＤに対する感受性および
エストロゲンに対する感受性に比べて高く、[B(-)X(-)3
(+)]または [B(-)X(-)3(-)]の場合、ビタミンＤに対す
る感受性が、ビタミンＫ２に対する感受性およびエスト
ロゲンに対する感受性に比べて高く、[B(-)X(+)3(+)],
[B(-)X(+)3(-)]または[B(+)X(+)3(-)]の場合、エストロ
ゲンに対する感受性が、ビタミンＤに対する感受性およ
びビタミンＫ２に対する感受性に比べて高かった。
(+)X(+)3(+)]または[B(+)X(-)3(+)]の場合、ビタミンＫ
２に対する感受性が、ビタミンＤに対する感受性および
エストロゲンに対する感受性に比べて高く、[B(-)X(-)3
(+)]または [B(-)X(-)3(-)]の場合、ビタミンＤに対す
る感受性が、ビタミンＫ２に対する感受性およびエスト
ロゲンに対する感受性に比べて高く、[B(-)X(+)3(+)],
[B(-)X(+)3(-)]または[B(+)X(+)3(-)]の場合、エストロ
ゲンに対する感受性が、ビタミンＤに対する感受性およ
びビタミンＫ２に対する感受性に比べて高かった。
【００６０】実施例１ ある日本人の骨粗鬆症患者から血液を採取し、血球細胞
を分画して、常法によりゲノムＤＮＡを抽出精製する。
該ゲノムＤＮＡを鋳型とし、参考例２と同様の方法でＶ
ＤＲ遺伝子、ＥＲ遺伝子およびＡｐｏＥ遺伝子の多型を
分析する。得られた遺伝子型が[B(+)X(+)3(+)]および[B
(+)X(-)3(+)]の場合、該ゲノムＤＮＡは、ビタミンＫ２
に対する感受性が、ビタミンＤに対する感受性およびエ
ストロゲンに対する感受性に比べて高い個人由来のもの
であると判定し、遺伝子型が[B(-)X(-)3(+)]または[B
(-)X(-)3(-)]の場合、該ゲノムＤＮＡは、ビタミンＤに
対する感受性が、ビタミンＫ２に対する感受性およびエ
ストロゲンに対する感受性に比べて高い個人由来のもの
であると判定する。さらに、遺伝子型が[B(-)X(-)3
(+)]、[B(-)X(-)3(-)]および[B(+)X(+)3(-)]の場合、該
ゲノムＤＮＡは、エストロゲンに対する感受性が、ビタ
ミンＤに対する感受性およびビタミンＫ２に対する感受
性に比べて高い個人由来のものであると判定する。
を分画して、常法によりゲノムＤＮＡを抽出精製する。
該ゲノムＤＮＡを鋳型とし、参考例２と同様の方法でＶ
ＤＲ遺伝子、ＥＲ遺伝子およびＡｐｏＥ遺伝子の多型を
分析する。得られた遺伝子型が[B(+)X(+)3(+)]および[B
(+)X(-)3(+)]の場合、該ゲノムＤＮＡは、ビタミンＫ２
に対する感受性が、ビタミンＤに対する感受性およびエ
ストロゲンに対する感受性に比べて高い個人由来のもの
であると判定し、遺伝子型が[B(-)X(-)3(+)]または[B
(-)X(-)3(-)]の場合、該ゲノムＤＮＡは、ビタミンＤに
対する感受性が、ビタミンＫ２に対する感受性およびエ
ストロゲンに対する感受性に比べて高い個人由来のもの
であると判定する。さらに、遺伝子型が[B(-)X(-)3
(+)]、[B(-)X(-)3(-)]および[B(+)X(+)3(-)]の場合、該
ゲノムＤＮＡは、エストロゲンに対する感受性が、ビタ
ミンＤに対する感受性およびビタミンＫ２に対する感受
性に比べて高い個人由来のものであると判定する。
【００６１】本発明の分析方法によれば、投薬前に対象
となる患者がどの骨粗鬆症治療薬に対してより感受性が
高いかを高い確率で予測することできるので、適切な薬
剤の選択が可能となる。したがって、治療効果の乏しい
薬剤を長期間投与するという非効率的な治療を回避する
ことができ、患者のＱＯＬを向上することができる点が
極めて有用である。
となる患者がどの骨粗鬆症治療薬に対してより感受性が
高いかを高い確率で予測することできるので、適切な薬
剤の選択が可能となる。したがって、治療効果の乏しい
薬剤を長期間投与するという非効率的な治療を回避する
ことができ、患者のＱＯＬを向上することができる点が
極めて有用である。
【００６２】
【発明の効果】本発明の分析試薬を使用して、ＶＤＲ、
ＡｐｏＥおよびＥＲ遺伝子の３つの遺伝子を増幅し、そ
の増幅物を用いて１回の操作で３つの遺伝子多型を分析
することができる。また、これらの遺伝子が骨粗鬆症に
関わっていることから、該分析試薬を使用して、ヒト検
体中のこれらの遺伝子の遺伝子多型を分析した結果か
ら、その組みあわせにより、有効な骨粗鬆症治療薬を選
択することが可能となる。
ＡｐｏＥおよびＥＲ遺伝子の３つの遺伝子を増幅し、そ
の増幅物を用いて１回の操作で３つの遺伝子多型を分析
することができる。また、これらの遺伝子が骨粗鬆症に
関わっていることから、該分析試薬を使用して、ヒト検
体中のこれらの遺伝子の遺伝子多型を分析した結果か
ら、その組みあわせにより、有効な骨粗鬆症治療薬を選
択することが可能となる。
【００６３】配列番号１、２、２０および２１：多型部
位を含むＶＤＲ遺伝子の断片を増幅するためのプライマ
ーとして働くべく設計されたオリゴヌクレオチド。 配列番号３、４、５、６、２４および２５：多型部位を
含むＡｐｏＥ遺伝子の断片を増幅するためのプライマー
として働くべく設計されたオリゴヌクレオチド。 配列番号７、８、９、２２および２３：多型部位を含む
ＥＲ遺伝子の断片を増幅するためのプライマーとして働
くべく設計されたオリゴヌクレオチド。 配列番号１０および１１：ＶＤＲ遺伝子の断片を検出す
るためのプローブとして働くべく設計されたオリゴヌク
レオチド。 配列番号１２、１３、１８および１９：ＡｐｏＥ遺伝子
の断片を検出するためのプローブとして働くべく設計さ
れたオリゴヌクレオチド。 配列番号１４、１５、１６および１７：ＥＲ遺伝子の断
片を検出するためのプローブとして働くべく設計された
オリゴヌクレオチド。
位を含むＶＤＲ遺伝子の断片を増幅するためのプライマ
ーとして働くべく設計されたオリゴヌクレオチド。 配列番号３、４、５、６、２４および２５：多型部位を
含むＡｐｏＥ遺伝子の断片を増幅するためのプライマー
として働くべく設計されたオリゴヌクレオチド。 配列番号７、８、９、２２および２３：多型部位を含む
ＥＲ遺伝子の断片を増幅するためのプライマーとして働
くべく設計されたオリゴヌクレオチド。 配列番号１０および１１：ＶＤＲ遺伝子の断片を検出す
るためのプローブとして働くべく設計されたオリゴヌク
レオチド。 配列番号１２、１３、１８および１９：ＡｐｏＥ遺伝子
の断片を検出するためのプローブとして働くべく設計さ
れたオリゴヌクレオチド。 配列番号１４、１５、１６および１７：ＥＲ遺伝子の断
片を検出するためのプローブとして働くべく設計された
オリゴヌクレオチド。
【００６４】
【配列表】SEQUENCING LIST <110> NISSHO CORPORATION <120> Method for Anticipating Sensitivity to Medi
cine for Osteoporosisand a Reagent Kit therefor <130> 12-040 <160> 25
cine for Osteoporosisand a Reagent Kit therefor <130> 12-040 <160> 25
【００６５】<210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Human <223> A part of the base sequence of vitamin D re
ceptor gene <400> 1 gtgcaggcga ttcggtaggg 20
ceptor gene <400> 1 gtgcaggcga ttcggtaggg 20
【００６６】<210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Human <223> A part of the base sequence of vitamin D re
ceptor gen <400> 2 ccagcggaag aggtcaaggg 20
ceptor gen <400> 2 ccagcggaag aggtcaaggg 20
【００６７】<210> 3 <211> 16 <212> DNA <213> Human <223> A part of the base sequence of apolipoprote
in E gene <400> 3 ctgggcgcgg acatgg 16
in E gene <400> 3 ctgggcgcgg acatgg 16
【００６８】<210> 4 <211> 16 <212> DNA <213> Human <223> A part of the base sequence of apolipoprote
in E gene <400> 4 cccggcctgg tacact 16
in E gene <400> 4 cccggcctgg tacact 16
【００６９】<210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Human <223> A part of the base sequence of apolipoprote
in E gene <400> 5 ctgggcgcc acatggagga 20
in E gene <400> 5 ctgggcgcc acatggagga 20
【００７０】<210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Human <222> A part of the base sequence of apolipoprote
in E gene <400> 6 cccggcctgg tacactgcca 20
in E gene <400> 6 cccggcctgg tacactgcca 20
【００７１】<210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> Human <223> A part of the base sequence of estrogen rec
eptor gene <400> 7 gttccaaatg tcccagccgt 20
eptor gene <400> 7 gttccaaatg tcccagccgt 20
【００７２】<210> 8 <211> 20 <212> DNA <213> Human <223> A part of the base sequence of estrogen rec
eptor gene <400> 8 cctgcaccag aatatgtacc 20
eptor gene <400> 8 cctgcaccag aatatgtacc 20
【００７３】<210> 9 <211> 21 <212> DNA <213> Human <223> A part of the base sequence of estrogen rec
eptor gene <400> 9 cctgcaccag aatatgttac c 21
eptor gene <400> 9 cctgcaccag aatatgttac c 21
【００７４】<210> 10 <211> 16 <212> DNA <213> Human <223> A part of the base sequence of vitamin D re
ceptor gene <400> 10 caggcctgcg cattcc 16
ceptor gene <400> 10 caggcctgcg cattcc 16
【００７５】<210> 11 <211> 16 <212> DNA <213> Human <223> A part of the base sequence of vitamin D re
ceptor gene <400> 11 caggcctgca cattcc 16
ceptor gene <400> 11 caggcctgca cattcc 16
【００７６】<210> 12 <211> 14 <212> DNA <213> Human <223> A part of the base sequence of apolipoprote
in E gene <400> 12 aggacgtgcg cggc 14
in E gene <400> 12 aggacgtgcg cggc 14
【００７７】<210> 13 <211> 15 <212> DNA <213> Human <223> A part of the base sequence of apolipoprote
in E gene <400> 13 aggacgtgtg cggcc 15
in E gene <400> 13 aggacgtgtg cggcc 15
【００７８】<210> 14 <211> 16 <212> DNA <213> Human <223> A part of the base sequence of estrogen rec
eptor gene <400> 14 gtgtggtcta gagttg 16
eptor gene <400> 14 gtgtggtcta gagttg 16
【００７９】<210> 15 <211> 16 <212> DNA <213> Human <223> A part of the base sequence of estrogen rec
eptor gene <400> 15 gtgtggtctg gagttg 16
eptor gene <400> 15 gtgtggtctg gagttg 16
【００８０】<210> 16 <211> 16 <212> DNA <213> Human <223> A part of the base sequence of estrogen rec
eptor gene <400> 16 tctggagttg ggatga 16
eptor gene <400> 16 tctggagttg ggatga 16
【００８１】<210> 17 <211> 16 <212> DNA <213> Human <223> A part of the base sequence of estrogen rec
eptor gene <400> 17 gtggtctaga gttggg 16
eptor gene <400> 17 gtggtctaga gttggg 16
【００８２】<210> 18 <211> 16 <212> DNA <213> Human <223> A part of the base sequence of apolipoprote
in E gene <400> 18 cagaagcgcc tggcag 16
in E gene <400> 18 cagaagcgcc tggcag 16
【００８３】<210> 19 <211> 16 <212> DNA <213> Human <223> A part of the base sequence of apolipoprote
in E gene <400> 19 cagaagtgcc tggcag 16
in E gene <400> 19 cagaagtgcc tggcag 16
【００８４】<210> 20 <211> 30 <212> Nuleic acid <213> Human <223> Oligonucleotide designed to act as primer f
or amplifying VDR genefragment containing polymorp
hic site <400> 20 caaccaagac tacaagtacc gctgtcagtga 30
or amplifying VDR genefragment containing polymorp
hic site <400> 20 caaccaagac tacaagtacc gctgtcagtga 30
【００８５】<210> 21 <211> 23 <212> DNA <213> Human <223> Oligonucleotide designed to act as primer f
or amplifying VDR genefragment containing polymorp
hic site <400> 21 aaccagcggg aagaggtcaa ggg 23
or amplifying VDR genefragment containing polymorp
hic site <400> 21 aaccagcggg aagaggtcaa ggg 23
【００８６】<210> 22 <211> 33 <212> DNA <213> Human <223> Oligonucleotide designed to act as primer f
or amplifying ER genefragment containing polymorph
ic site <400> 22 ctgccaccct atctgtatc tttcctattc tcc 33
or amplifying ER genefragment containing polymorph
ic site <400> 22 ctgccaccct atctgtatc tttcctattc tcc 33
【００８７】<210> 23 <211> 33 <212> DNA <213> Human <223> Oligonucleotide designed to act as primer f
or amplifying ER genefragment containing polymorph
ic site <400> 23 tctttctctg ccaccctggc gtcgattatc tga 33
or amplifying ER genefragment containing polymorph
ic site <400> 23 tctttctctg ccaccctggc gtcgattatc tga 33
【００８８】<210> 24 <211> 21 <212> DNA <213> Human <223> Oligonucleotide designed to act as primer f
or amplifying ApoE gene fragment containing polymo
rphic site <400> 24 cgggcacggc tgtccaagga g 21
or amplifying ApoE gene fragment containing polymo
rphic site <400> 24 cgggcacggc tgtccaagga g 21
【００８９】<210> 25 <211> 21 <212> DNA <213> Human <223> Oligonucleotide designed to act as primer f
or amplifying ApoE gene fragment containing polymo
rphic site <400> 25 cacgcggccc tgttccacga g 21
or amplifying ApoE gene fragment containing polymo
rphic site <400> 25 cacgcggccc tgttccacga g 21
Claims (9)
- 【請求項１】 ヒトから採取した試料中に含まれるゲノ
ムＤＮＡから、ビタミンＤ受容体遺伝子、エストロゲン
受容体遺伝子およびアポリポ蛋白Ｅ３対立遺伝子（２／
２、２／３、２／４、３／３、３／４または４／４）の
それぞれの遺伝子多型を分析し、これらの遺伝子多型の
組み合わせに基づいて、該試料が複数の骨粗鬆症治療薬
に対する感受性において特定の優先性を示す個人由来の
ものであると予測することを特徴とする骨粗鬆症薬剤感
受性予測方法。 - 【請求項２】 ビタミンＤ受容体遺伝子、エストロゲン
受容体遺伝子およびアポリポ蛋白Ｅ３対立遺伝子（２／
２、２／３、２／４、３／３、３／４または４／４）の
遺伝子多型の組み合わせが、[B(-)X(-)3(-)]、 [B(-)X
(-)3(+)]、 [B(-)X(+)3(-)]、 [B(-)X(+)3(+)]、 [B
(+)X(-)3(-)]、 [B(+)X(-)3(+)]、 [B(+)X(+)3(-)]お
よび [B(+)X(+)3(+)] からなる群から選択されたいずれ
かの組み合わせである請求項１記載の方法（ここで、Ｂ
は第８エクソンと第９エクソンの間のイントロン領域内
でBsm Iにより切断されないビタミンＤ受容体対立遺伝
子を、Ｘは第１エクソンと第２エクソンの間のイントロ
ン領域内でXba Iにより切断されないエストロゲン受容
体対立遺伝子をそれぞれ表し、Ｂ（＋）またはＸ（＋）
およびＢ（−）またはＸ（−）はその対立遺伝子を有す
るおよび有しないことをそれぞれ表し、３（＋）はアポ
リポ蛋白Ｅ遺伝子３／３型を、３（−）はアポリポ蛋白
Ｅ遺伝子３／３型以外の多型を表している。） - 【請求項３】 ビタミンＤ受容体遺伝子、エストロゲン
受容体遺伝子およびアポリポ蛋白Ｅ３対立遺伝子（２／
２、２／３、２／４、３／３、３／４または４／４）の
遺伝子多型の組み合わせが、[B(+)X(+)3(+)]または[B
(+)X(-)3(+)]の場合、ビタミンＫ２に対する感受性が、
ビタミンＤに対する感受性およびエストロゲンに対する
感受性に比べて高い個人由来の試料であると予測するこ
とを特徴とする請求項２記載の方法。 - 【請求項４】 ビタミンＤ受容体遺伝子、エストロゲン
受容体遺伝子およびアポリポ蛋白Ｅ３対立遺伝子（２／
２、２／３、２／４、３／３、３／４または４／４）の
遺伝子多型の組み合わせが、[B(-)X(-)3(+)]または [B
(-)X(-)3(-)]の場合、ビタミンＤに対する感受性が、ビ
タミンＫ２に対する感受性およびエストロゲンに対する
感受性に比べて高い個人由来の試料であると予測するこ
とを特徴とする請求項２記載の方法。 - 【請求項５】 ビタミンＤ受容体遺伝子、エストロゲン
受容体遺伝子およびアポリポ蛋白Ｅ３対立遺伝子（２／
２、２／３、２／４、３／３、３／４または４／４）の
遺伝子多型の組み合わせが、[B(-)X(+)3(+)], [B(-)X
(+)3(-)]または[B(+)X(+)3(-)]の場合、エストロゲンに
対する感受性が、ビタミンＤに対する感受性およびビタ
ミンＫ２に対する感受性に比べて高い個人由来の試料で
あると予測することを特徴とする請求項２記載の方法。 - 【請求項６】 ビタミンＤ受容体遺伝子、エストロゲン
受容体遺伝子およびアポリポ蛋白Ｅ３対立遺伝子（２／
２、２／３、２／４、３／３、３／４または４／４）の
遺伝子多型の組み合わせが、[B(+)X(+)3(+)]または[B
(+)X(-)3(+)]の場合、ビタミンＫ２に対する感受性が、
ビタミンＤに対する感受性およびエストロゲンに対する
感受性に比べて高い個人由来の試料であると予測し、[B
(-)X(-)3(+)]または [B(-)X(-)3(-)]の場合、ビタミン
Ｄに対する感受性が、ビタミンＫ2に対する感受性およ
びエストロゲンに対する感受性に比べて高い個人由来の
試料であると予測し、[B(-)X(+)3(+)], [B(-)X(+)3(-)]
または[B(+)X(+)3(-)]の場合、エストロゲンに対する感
受性が、ビタミンＤに対する感受性およびビタミンＫ２
に対する感受性に比べて高い個人由来の試料であると予
測することを特徴とする請求項２記載の方法。 - 【請求項７】 ビタミンＤ受容体（以下、ＶＤＲ）遺伝
子、アポリポタンパク（以下、ＡｐｏＥ）遺伝子および
エストロゲン受容体（以下、ＥＲ）遺伝子のそれぞれの
遺伝子に対して、特異的な増幅プライマー、およびＶＤ
Ｒ遺伝子多型、ＡｐｏＥ遺伝子多型およびＥＲ遺伝子多
型をそれぞれ検出するための検出プローブを含むことを
特徴とするＶＤＲ、ＡｐｏＥおよびＥＲ遺伝子の遺伝子
多型分析用試薬キット。 - 【請求項８】 ＶＤＲの遺伝子多型が、ＶＤＲのイント
ロン上のBsm I制限酵素断片長多型ＢＢ、Ｂｂまたはｂ
ｂであり、ＡｐｏＥの遺伝子多型が、ＡｐｏＥのHha I
制限酵素断片長多型３（＋）または３（−）であり、Ｅ
Ｒの遺伝子多型が、ＥＲのイントロン１上のXba I制限
酵素断片長多型ＸＸ、Ｘｘまたはｘｘである請求項７記
載の遺伝子多型分析用試薬キット。 - 【請求項９】 請求項７記載のＶＤＲ、ＡｐｏＥおよび
ＥＲ遺伝子の遺伝子多型分析用試薬キットを使用して分
析されたＶＤＲ、ＡｐｏＥおよびＥＲ遺伝子の遺伝子多
型の組み合わせと骨粗鬆症の治療薬を結びつけることを
特徴とする骨粗鬆症治療薬の選択方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2000155993A JP3682688B2 (ja) | 2000-05-26 | 2000-05-26 | 骨粗鬆症薬剤感受性予測方法およびそのための試薬キット |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2000155993A JP3682688B2 (ja) | 2000-05-26 | 2000-05-26 | 骨粗鬆症薬剤感受性予測方法およびそのための試薬キット |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2001333799A true JP2001333799A (ja) | 2001-12-04 |
| JP3682688B2 JP3682688B2 (ja) | 2005-08-10 |
Family
ID=18660844
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2000155993A Expired - Fee Related JP3682688B2 (ja) | 2000-05-26 | 2000-05-26 | 骨粗鬆症薬剤感受性予測方法およびそのための試薬キット |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP3682688B2 (ja) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2004065696A (ja) * | 2002-08-07 | 2004-03-04 | Yoshinobu Baba | 骨診断装置 |
| JP2006014653A (ja) * | 2004-07-01 | 2006-01-19 | Nipro Corp | 遺伝子多型検出キット |
-
2000
- 2000-05-26 JP JP2000155993A patent/JP3682688B2/ja not_active Expired - Fee Related
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2004065696A (ja) * | 2002-08-07 | 2004-03-04 | Yoshinobu Baba | 骨診断装置 |
| JP2006014653A (ja) * | 2004-07-01 | 2006-01-19 | Nipro Corp | 遺伝子多型検出キット |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JP3682688B2 (ja) | 2005-08-10 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| DK3260555T3 (en) | Hitherto UNKNOWN PROTOCOL FOR PREPARING SEQUENCE LIBRARIES | |
| Jakupciak et al. | Mitochondrial DNA as a cancer biomarker | |
| EP2447378B1 (en) | Probe for detection of polymorphism in EGFR gene, amplification primer, and use thereof | |
| AU2016286088A1 (en) | Single nucleotide polymorphism in HLA-B*15:02 and use thereof | |
| EP1054066B1 (en) | Method for anticipating sensitivity to medicine for osteoporosis and a reagent therefor | |
| EP1130123A2 (en) | Diagnostic method | |
| EP1194595A1 (en) | Polymorphisms in the human hmg-coa reductase gene | |
| US20030170674A1 (en) | Nitric oxide synthase gene diagnostic polymorphisms | |
| EP3494236B1 (en) | Method for conducting early detection of colon cancer and/or of colon cancer precursor cells and for monitoring colon cancer recurrence | |
| EP1848821B1 (en) | Polynucleotide associated with breast cancer comprising single nucleotide polymorphism, microarray and diagnostic kit comprising the same and method for diagnosing breast cancer using the same | |
| KR101100437B1 (ko) | 단일염기 다형을 포함하는 대장암과 관련된 폴리뉴클레오티드, 그를 포함하는 마이크로어레이 및 진단 키트 및 그를 이용한 대장암의 진단방법 | |
| JP3682688B2 (ja) | 骨粗鬆症薬剤感受性予測方法およびそのための試薬キット | |
| JP4111481B2 (ja) | 心筋梗塞の遺伝的要因を判定するための方法及びこれに使用されるオリゴヌクレオチド | |
| WO2002008468A1 (en) | Diagnostic polymorphisms for the tgf-beta1 promoter | |
| JP2002238577A (ja) | 脳動脈瘤感受性遺伝子 | |
| JP4048555B2 (ja) | 骨粗鬆症薬剤感受性予測方法 | |
| KR101187317B1 (ko) | 산재성 위암 감수성 예측용 다형성 마커 및 이를 이용한 산재성 위암 감수성 예측 방법 | |
| JP3684921B2 (ja) | 骨粗鬆症薬剤感受性予測方法 | |
| US20050084849A1 (en) | Diagnostic polymorphisms for the ecnos promoter | |
| JP2007068429A (ja) | Ｉｌ−１０多型検出による消化器系疾患罹患の判定方法およびそのキット | |
| JP2006061090A (ja) | 骨密度予測方法および遺伝子多型分析用試薬キット | |
| WO2006073183A1 (ja) | 一塩基多型を用いた炎症性疾患の判定方法 | |
| CN115927354A (zh) | 一种sh3tc2基因致病突变体及其在制备腓骨肌萎缩症4c型诊断试剂盒中的应用 | |
| WO2006135117A1 (en) | Method for diagnosing diabetic retinopathy by single nucleotide polymorphism, dna fragment thereof, and primer thereof | |
| US20050118579A1 (en) | Chemical compounds |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20041227 |
|
| A521 | Written amendment |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20050224 |
|
| TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
| A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20050502 |
|
| A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20050515 |
|
| R150 | Certificate of patent (=grant) or registration of utility model |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (prs date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20110603 Year of fee payment: 6 |
|
| LAPS | Cancellation because of no payment of annual fees |