KR100992972B1 - 심근경색의 리스크 진단 방법 - Google Patents

심근경색의 리스크 진단 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 고정밀도로 예지확률이 높은 심근경색의 리스크 진단수단을 제공한다. 본 발명에서는 하기 공정을 포함하는 방법에 의해 심근경색의 리스크 진단을 행한다: (i) 심근경색과의 관련이 인지된 10개의 유전자 다형, 또는 5개의 유전자 다형으로부터 2개 이상의 다형을 해석하는 공정, (ii) 상기 공정에 의해서 얻어지는 다형 정보로부터 핵산시료의 유전자형을 결정하는 공정, 및 (iii) 결정된 유전자형으로부터 심근경색의 유전적 리스크를 구하는 공정.
유전자형, 심근경색, 리스크 진단

Description

심근경색의 리스크 진단 방법 {METHOD OF DIAGNOSING RISK OF MYOCARDIAL INFARCTION}
본 발명은 심근경색에 관련된 유전자를 이용한 검출 방법에 관한 것이다. 보다 상세하게는, 심근경색에 관련된 복수개의 유전자 다형(多型)을 이용한 검출 방법 및 상기 방법에 이용되는 키트에 관한 것이다. 본 발명은, 예를 들어, 심근경색 위험 진단에 이용할 수 있다.
심근경색은 다인자(多因子) 질환으로, 개개인의 유전적 배경과 여러 가지 환경인자의 상호작용에 의해 발증(發症)이 정해진다. (참조: Marenberg ME, Risch N, Berkman LF, Floderus B, de Faire U. Genetic susceptibility to death from coronary heart disease in a study of twins. N Engl J Med 1994; 330: 1041-1046., Nora JJ, Lortscher RH, Spangler RD, Nora AH, Kimberling WJ. Genetic-epidemiologic study of early-onset ischemic heart disease. Circulation 1980; 61: 503-508) 일반적으로 심근경색의 발병률은 고혈압·당뇨병·고지혈증 등, 종래의 위험인자 수에 비례하여 높아진다. (참조: Nora JJ, Lortscher RH, Spangler RD, Nora AH, Kimberling WJ. Genetic-epidemiologic study of early-onset ischemic heart disease. Circulation 1980; 61: 503-508) 상기 위험인자 자체도 일부는 유전적 요인에 의해 제어되고 있지만, 가족력이 독립적인 심근경색의 예지(豫知)인자이기 때문에, 종래의 위험인자 이외에도 심근경색 감수성 인자가 존재한다고 시사되고 있다. (참조: Marenberg ME, Risch N, Berkman LF, Floderus B, de Faire U. Genetic susceptibility to death from coronary heart disease in a study of twins. N Engl J Med 1994; 330: 1041-1046) 또한, 종래의 위험인자를 전혀 가지지 않더라도 심근경색이 발병하는 예가 있다는 사실도, 유전인자와의 관련을 시사한다.
심근경색은 구미 제국에서 가장 사망율이 높은 질환으로, 설사 사망에 이르지 않는다고 하더라도, 심부전 또는 협심증·난치성 부정맥을 동반하여 환자의 삶의 질을 현저하게 저하시키기 때문에, 이를 예방하는 것은 매우 중요하다. 심근경색의 예방을 위한 하나의 방법으로서, 심근경색 감수성 유전자를 동정하는 것을 들 수 있다. 연쇄 해석(참조: Broeckel U, Hengstenberg C, Mayer B, et al. A comprehensive linkage analysis for myocardial infarction and its related risk factors. Nature genet 2002; 30: 210-214.) 및 후보 유전자에 의한 관련해석(참조: Cambien F, Poirier O, Lecerf L, et al. Deletion polymorphism in the gene for angiotensin-converting enzyme is a potent risk factor for myocardial infarction. Nature 1992; 359: 641-644., Weiss EJ, Bray PF, Tayback M, et al. A polymorphism of a platelet glycoprotein receptor as an inherited risk factor for coronary thrombosis. N Engl J Med 1996; 334: 1090-1094., Iacoviello L, Di Castelnuovo A, De Knijff P, et al. Polymorphisms in the coagulation factor VII gene and the risk of myocardial infarction. N Engl J Med 1998; 338: 79-85., Kuivenhoven JA, Jukema JW, Zwinderman AH, et al. The role of a common variant of the cholesterol ester transfer protein gene in the progression of coronary atherosclerosis. N Engl J Med 1998; 338: 86-93)에 의해, 심근경색과 관련된 염색체 상의 유전자좌 및 몇 개의 후보 유전자군이 동정되었다. 지금까지의 게놈 역학적 연구에 의해 안지오텐신 변환효소(angiotensin-converting enzyme) (참조: Cambien F, Poirier O, Lecerf L, et al. Deletion polymorphism in the gene for angiotensin-converting enzyme is a potent risk factor for myocardial infarction. Nature 1992; 359: 641-644), 혈소판 당단백 IIIa (참조: Weiss EJ, Bray PF, Tayback M, et al. A polymorphism of a platelet glycoprotein receptor as an inherited risk factor for coronary thrombosis. N Engl J Med 1996; 334: 1090-1094), 제 7혈액 응고인자, 콜레스테롤에스테르 이송단백(참조: Kuivenhoven JA, Jukema JW, Zwinderman AH, et al. The role of a common variant of the cholesterol ester transfer protein gene in the progression of coronary atherosclerosis. N Engl J Med 1998; 338: 86-93.) 등의 유전자 다형과 심근 경색사이의 관련이 보고되어 있지만, 상반되는 보고도 있어 아직 어떤 결론에 도달한 것은 아니다. 또한, 인종이 다를 경우, 다른 게놈 다형을 가지므로, 각각의 인종에서의 다형과 심근 경색간의 관련에 대한 데이터 베이스를 구축하는 것이 중요하다.
발명의 개시
전술한 바와 같이, 지금까지의 수많은 유전자 다형과 관상 동맥질환 혹은 심근경색과의 관련해석이 행해져 왔으나, 많은 연구에 관해서는 그 의의에 대해 일정한 견해를 얻을 수 없었다. 그 주된 이유로는, 많은 연구에서 대상집단의 크기가 충분하지 않았던 점 및, 유전자 다형 뿐만 아니라 환경인자도 인종 간에 상이한 점 등을 들 수 있다. 나아가, 가령 심근 경색과의 관련이 알려져 있다고 하더라도, 대규모 집단에서의 해석에는 상대 위험도 (오즈비: odds ratio)가 낮은 것이 일반적이다.
본 발명은 이러한 배경을 감안하여 이루어진 것으로서, 그 목적은 높은 정밀도로 예지확률이 높은 심근경색의 유전적 리스크를 진단하는 수단을 제공하여, 심근경색의 1차 예방에 공헌하고자 하는 것이다.
본 발명자들은, 상기 목적을 달성하기 위하여 수개의 종류의 공적(公的) 데이터 베이스를 이용하여, 관동맥경화, 관동맥 연축(攣縮), 고혈압, 당뇨병, 고지혈증 등으과의 관련이 추정되는 71종의 유전자를 발췌하여, 유전자 기능 변화와의 관련이 예상되는 것 등을 중심으로 112개의 다형을 선택했다. 계속해서, 상기 71개 유전자의 112개 다형에 관해서 5000회의 사례를 초과하는 대규모 관련해석을 수행하였다. 그 결과, 심근경색과 관련된 SNP (단일 뉴클레오티드 다형성: single nucleotide polymorphism)를 남성으로부터 10개, 여성으로부터 5개 동정하는 것에 성공했다. 또한, 이들 다형을 조합하고 이용하여, 다인자 로지스틱(logistic) 회귀분석의 단계별 변수 선택법 (stepwise forward selection)에 의해, 남성의 경우, 최대 오즈비 11.26, 여성의 경우, 최대 오즈비 88.51을 나타내는 것을 알아내었다. 상기 결과로부터, 이들 SNP 중, 복수개의 SNP를 선택하고, 각 SNP을 해석한 결과를 조합시켜 이용하여 신뢰성과 예지확률이 높은 심근경색의 리스크 진단을 행할 수 있다는 지견이 얻었다. 한편, 여성의 경우, 심근 경색과의 관련이 밝혀진 5개의 SNP의 중의 하나에 관해, 그 다형을 단독으로 해석한 경우에도 매우 높은 오즈비가 얻어졌다. 본 발명은 전술한 지견에 기초하는 것으로, 하기의 구성을 제공한다;
[1] 이하의 공정 (a)을 포함하는 핵산 시료의 유전자형을 검출하는 방법:
(a) 핵산 시료에 있어, 하기 (1) 내지 (10)으로 이루어지는 군으로부터 선택된 2개 이상의 다형을 해석하는 공정:
(1) 코넥신 37(connexin 37) 유전자의 염기번호 1019 위치의 다형,
(2) 종양괴사인자 α(tumor necrosis factor-α) 유전자의 염기번호 -863 위치의 다형,
(3) NADH/NADPH 옥시다제 p22 폭스(NADH/NADPH oxidase p22 phox) 유전자의 염기번호 242 위치의 다형,
(4) 안지오텐시노겐(angiotensinogen) 유전자의 염기번호 -6 위치의 다형,
(5) 아포리포프로테인 E (apolipoprotein E) 유전자의 염기번호 -219 위치의 다형,
(6) 혈소판 활성화 인자 아세틸 하이드롤라제(platelet-activating factor acetylhydrolase) 유전자의 염기번호 994 위치의 다형,
(7) 아포리포프로테인 C-III 유전자의 염기번호 -482 위치의 다형,
(8) 트롬보스폰딘 4(thrombospondin 4) 유전자의 염기번호 1186 위치의 다형,
(9) 인터로이킨 10 (interleukin-10) 유전자의 염기번호 -819 위치의 다형, 및,
(10) 인터로이킨 10 유전자의 염기번호 -592 위치의 다형.
[2] 하기 공정(b)를 포함하는 핵산 시료의 유전자형을 검출하는 방법:
(b) 핵산시료에 있어, 하기 (11) 내지 (15)로 이루어진 군으로부터 선택되는 2개 이상의 다형을 해석하는 공정:
(11) 스트로메라이신 1 (stromelysin-1) 유전자의 염기번호 -1171 위치의 다형,
(12) 플라스미노겐 활성화 인자 억제제-1 유전자의 염기번호 -668 위치의 다형,
(13) 글리코프로테인 Ibα(glycoprotein Ibα) 유전자의 염기번호 1018 위치의 다형,
(14) 파라옥소나아제(paraoxonase) 유전자의 염기번호 584 위치의 다형, 및
(15) 아포리포프로테인 E 유전자의 염기번호4070 위치의 다형.
[3] 하기 공정(c)을 포함하는 핵산 시료의 유전자형을 검출하는 방법:
(c) 핵산시료에 있어 아포리포프로테인 E 유전자의 염기번호 4070 위치의 다형을 해석하는 공정.
[4] 하기 공정 (i) 내지 (iii)을 포함하는 심근경색의 리스크 진단 방법:
(i) 핵산 시료에 있어, 하기 (1) 내지 (10)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 2개 이상의 다형을 해석하는 공정:
(1) 코넥신 37 유전자의 염기번호 1019 위치의 다형,
(2) 종양괴사인자 α 유전자의 염기번호 -863 위치의 다형,
(3) NADH/NADPH 옥시다제 p22 폭스 유전자의 염기번호 242 위치의 다형,
(4) 안지오텐시노겐 유전자의 염기번호 -6 위치의 다형,
(5) 아포리포프로테인 E 유전자의 염기번호 -219 위치의 다형,
(6) 혈소판 활성화 인자 아세틸 하이드롤라제 유전자의 염기번호 994 위치의 다형,
(7) 아포리포프로테인 C-III 유전자의 염기번호 -482 위치의 다형,
(8) 트롬보스폰딘 4 유전자의 염기번호 1186 위치의 다형,
(9) 인터로이킨 10 유전자의 염기번호 -819 위치의 다형, 및,
(10) 인터로이킨 10 유전자의 염기번호 -592 위치의 다형.
(ii) 상기 공정에 의해서 수득한 다형 정보로부터 핵산시료의 유전자형을 결정하는 공정; 및,
(iii) 결정된 유전자형으로부터 심근 경색의 유전적 리스크를 구하는 공정.
[5] 하기 공정 (iv) 내지 (vi)을 포함하는 심근경색의 리스크 진단 방법:
(iv) 핵산 시료에 있어, 하기 (11) 내지 (15)로 이루어진 군으로부터 선택되는 2개 이상의 다형을 해석하는 공정;
(11) 스트로메라이신 1 (stromelysin-1) 유전자의 염기번호 -1171 위치의 다 형,
(12) 플라스미노겐 활성화 인자 억제제-1 유전자의 염기번호 -668 위치의 다형,
(13) 글리코프로테인 Ibα 유전자의 염기번호 1018 위치의 다형,
(14) 파라옥소나아제 유전자의 염기번호 584 위치의 다형, 및
(15) 아포리포프로테인 E 유전자의 염기번호 4070 위치의 다형.
(v) 상기 공정에서 수득한 다형정보로부터 상기 핵산시료의 유전자형을 결정하는 공정; 및,
(vi) 결정된 유전자형으로부터 심근경색의 유전적 리스크를 구하는 공정.
[6] 하기 공정 (vii) 내지 (ix)을 포함하는 심근경색의 리스크 진단 방법:
(vii) 핵산시료에 있어, 아포리포프로테인 E 유전자의 염기번호 4070 위치의 다형을 해석하는 공정;
(viii) 상기 공정에서 수득한 다형정보로부터 핵산 시료의 유전자형을 결정하는 공정; 및,
(ix) 결정된 유전자형으로부터 심근 경색의 유전적 리스크를 구하는 공정.
[7] 하기 (1) 내지 (10)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 2개 이상의 핵산을 포함하는 유전자형 검출용 키트:
(1) 코넥신 37 유전자의 염기번호 1019 위치의 다형을 해석하기 위한 핵산,
(2) 종양괴사인자 α 유전자의 염기번호 -863 위치의 다형을 해석하기 위한 핵산,
(3) NADH/NADPH 옥시다제 p22 폭스 유전자의 염기번호 242 위치의 다형을 해석하기 위한 핵산,
(4) 안지오텐시노겐 유전자의 염기번호 -6 위치의 다형을 해석하기 위한 핵산,
(5) 아포리포프로테인 E 유전자의 염기번호 -219 위치의 다형을 해석하기 위한 핵산,
(6) 혈소판 활성화 인자 아세틸 하이드롤라제 유전자의 염기번호 994 위치의 다형을 해석하기 위한 핵산,
(7) 아포리포프로테인 C-III 유전자의 염기번호 -482 위치의 다형을 해석하기 위한 핵산,
(8) 트롬보스폰딘 4 유전자의 염기번호 1186 위치의 다형을 해석하기 위한 핵산,
(9) 인터로이킨 10 유전자의 염기번호 -819 위치의 다형을 해석하기 위한 핵산, 및,
(10) 인터로이킨 10 유전자의 염기번호 -592 위치의 다형을 해석하기 위한 핵산.
[8] 하기 (11) 내지 (15)로 이루어진 군으로부터 선택되는 2개 이상의 핵산을 포함하는 유전자형 검출용 키트:
(11) 스트로메라이신 1 유전자의 염기번호 -1171 위치의 다형을 해석하기 위한 핵산,
(12) 플라스미노겐 활성화 인자 억제제-1 유전자의 염기번호 -668 위치의 다형을 해석하기 위한 핵산,
(13) 글리코프로테인 Ibα 유전자의 염기번호 1018 위치의 다형을 해석하기 위한 핵산,
(14) 파라옥소나아제 유전자의 염기번호 584 위치의 다형을 해석하기 위한 핵산, 및
(15) 아포리포프로테인 E 유전자의 염기번호 4070 위치의 다형을 해석하기 위한 핵산.
[9] 아포리포프로테인 E 유전자의 염기번호 4070 위치의 다형을 해석하기 위한 핵산을 포함하는 유전자형 검출용 키트.
[10] 하기 (1) 내지 (10)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 2개 이상의 핵산이 불용성 지지체에 고정된 고정화 핵산:
(1) 코넥신 37 유전자의 염기번호 1019 위치의 다형을 해석하기 위한 핵산,
(2) 종양괴사인자 α 유전자의 염기번호 -863 위치의 다형을 해석하기 위한 핵산,
(3) NADH/NADPH 옥시다제 p22 폭스 유전자의 염기번호 242 위치의 다형을 해석하기 위한 핵산,
(4) 안지오텐시노겐 유전자의 염기번호 -6 위치의 다형을 해석하기 위한 핵산,
(5) 아포리포프로테인 E 유전자의 염기번호 -219 위치의 다형을 해석하기 위 한 핵산,
(6) 혈소판 활성화 인자 아세틸 하이드롤라제 유전자의 염기번호 994 위치의 다형을 해석하기 위한 핵산,
(7) 아포리포프로테인 C-III 유전자의 염기번호 -482 위치의 다형을 해석하기 위한 핵산,
(8) 트롬보스폰딘 4 유전자의 염기번호 1186 위치의 다형을 해석하기 위한 핵산,
(9) 인터로이킨 10 유전자의 염기번호 -819 위치의 다형을 해석하기 위한 핵산, 및,
(10) 인터로이킨 10 유전자의 염기번호 -592 위치의 다형을 해석하기 위한 핵산.
[11] 하기 (11) 내지 (15)로 이루어진 군으로부터 선택되는 2개 이상의 핵산이 불용성 지지체에 고정된 고정화 핵산:
(11) 스트로메라이신 1 유전자의 염기번호 -1171 위치의 다형을 해석하기 위한 핵산,
(12) 플라스미노겐 활성화 인자 억제제-1 유전자의 염기번호 -668 위치의 다형을 해석하기 위한 핵산,
(13) 글리코프로테인 Ibα 유전자의 염기번호 1018 위치의 다형을 해석하기 위한 핵산,
(14) 파라옥소나아제 유전자의 염기번호 584 위치의 다형을 해석하기 위한 핵산, 및
(15) 아포리포프로테인 E 유전자의 염기번호4070 위치의 다형을 해석하기 위한 핵산.
[12] 아포리포프로테인 E 유전자의 염기번호 4070 위치의 다형을 해석하기 위한 핵산이 불용성 지지체에 고정되어 이루어지는 고정화 핵산.
발명을 실시하기 위한 최선의 형태
본 발명의 제1 측면은 핵산 시료의 유전자형을 검출하는 방법에 관한 것으로, 그 하나의 양태는, 하기 (1) 내지 (10)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 2개 이상의 다형을 해석하는 공정을 포함하는 것을 특징으로 한다. 본 발명의 다른 양태의 경우, 하기 (11) 내지 (15)로 이루어진 군으로부터 선택되는 2개 이상의 다형을 해석하는 공정을 포함하는 것을 특징으로 한다. 본 발명의 또 다른 양태의 경우, 하기 (15)의 다형을 해석하는 공정을 최소한 포함하는 것을 특징으로 한다. 한편, 상기 공정의 결과로부터 수득되는 다형 정보로부터 핵산 시료의 유전자형을 결정함에 의해 심근경색의 유전적 리스크를 구할 수 있다.
(1) 코넥신 37 (Connexin 37)유전자의 염기번호 1019 위치의 다형: 1019C→T (이하, 「코넥신 37 (1019C→T)다형」이라고도 함)
(2) 종양괴사인자α 유전자 (Tumor necrosis factor-α)의 염기번호 -863 위치의 다형: -863C→A (이하, 「TNFα(-863C→A)다형」이라고도 함)
(3) NADH/NADPH 옥시다제 p22 폭스(NADH/NADPH oxidase p22 phox) 유전자의 염기번호 242 위치의 다형: 242C→T (이하,「NADH/NADPH 옥시다제 p22 폭스 (242C →T)다형」이라고도 함),
(4) 안지오텐시노겐(Angiotensinogen)유전자의 염기번호 -6 위치의 다형: -6G→A (이하, 「안지오텐시노겐(-6G→A)다형」이라고도 함)
(5) 아포리포프로테인 E (Apolipoprotein E)유전자의 염기번호 -219 위치의 다형: -219G→T(이하,「아포 E-219 (-219G→T)다형」이라고도 함)
(6) 혈소판 활성화 인자 아세틸 하이드롤라제 (Platelet-activating factor acetylhydrolase) 유전자의 염기번호 994 위치의 다형: 994G →T (이하,「PAF 아세틸 하이드롤라제 (994G→T)다형」이라고도 함)
(7) 아포리포프로테인 C-III (Apolipoprotein C-III)유전자의 염기번호 -482위치의 다형: -482C→T (이하,「아포 C-III(-482C→T)다형」이라고도 함)
(8) 트롬보스폰딘 4 (Thrombospondin 4) 유전자의 염기번호 1186 위치의 다형: 1186 G→C (이하, 「TSP4(1186G→ C)다형」이라고도 함)
(9) 인터로이킨 10 (Interleukin-10) 유전자의 염기번호 -819 위치의 다형: -819T→ C (이하, 「IL-10(-819T→C)다형」이라고도 함)
(10) 인터로이킨 10 (Interleukin-10)유전자의 염기번호 -592 위치의 다형: -592A→C (이하, 「IL-10(-592A→C)다형」이라고도 함)
(11) 스트로메라이신-1 (Stromelysin-1) 유전자의 염기번호 -1171 위치의 다형: -1171/5A→6A (이하, 「스트로메라이신1(-1171/5A→ 6A)다형」이라고도 함)
(12) 플라스미노겐 활성화 인자 억제제-1 (Plasminogen activator inhibitor-1) 유전자의 염기번호 -668 위치의 다형: -668/4G→ 5G (이하, 「PAI1 (-668/4G→ 5G)다형」이라고도 함)
(13) 글리코프로테인 Ibα(Glycoprotein Ibα)유전자의 염기번호 1018 위치의 다형: 1018C→T (이하,「글리코프로테인 Ibα(1018C→T)다형」이라고도 함)
(14) 파라옥소나아제(Paraoxonase) 유전자의 염기번호 584 위치의 다형: 584G→A (이하, 「파라옥소나아제(584G→A)다형」이라고도 함)
(15) 아포리포프로테인 E (Apolipoprotein E)유전자의 염기번호 4070 위치의 다형: 4070C→T (이하, 「아포 E(4070C→T)다형」이라고도 함)
상기에 있어, 1019C→T 와 같은 표기는, 상기 염기번호 위치의 다형이 화살표의 전 또는 후의 염기인 2개의 유전자형으로 이루어지는 것을 의미한다. 단, -1171/5A→ 6A는 염기번호 -1171 위치로부터 3' 방향으로 A(아데닌)이 연속하여 5개 존재하는 유전자형과, 6개 존재하는 유전자형으로 이루어지는 다형을 의미한다. 마찬가지로, -668/4G→5G는 염기번호 -668 위치로부터 3' 방향으로 G(guanine)가 연속하여 4개 존재하는 유전자형과 5개 존재하는 유전자형으로 이루어지는 다형을 의미한다.
각 유전자에서의 염기번호는 공공의 데이터 베이스인 GenBank (NCBI)에 등록되어 있는 공지된 배열을 기준으로 나타낸다. 또한, 배열번호 1의 염기배열(Accession No. M96789: Homo sapiens connexin 37 (GJA4m) RNA, complete cds)에 있어서 1019번째의 염기는 코넥신 37 유전자의 1019 위치 염기에 상당한다. 마찬가지로, 배열번호 2의 염기배열 (Accession No. L11698: Homo sapiens tumor necrosis factor alpha gene, promoter region)에 있어서 197번째의 염기는 종양괴 사인자α 유전자의 -863 위치 염기에 상당하고, 배열번호 3의 염기배열(Accession No. M61107: Homo sapiens cytochrome b light chain(CYBA) gene, exons 3 and 4)에 있어서 684번째의 염기는 NADH/NADPH 옥시다제 p22 폭스 유전자의 242 위치 염기에 상당하며, 배열번호 4의 염기배열(Accession No. X15323: H.sapiens angiotensinogen gene 5' region and exon 1)에 있어서 463번째의 염기가 안지오텐시노겐 유전자의 -6 위치 염기에 상당하고, 배열번호 5의 염기배열(Accession No. AF055343: Homo sapiens apolipoprotein E(APOE) gene, 5' regulatory region, partial sequence)에 있어서 801번째의 염기는 아포리포프로테인 E 유전자의 -219위치 염기에 상당하고, 배열번호 6의 염기배열(Accession No. U20157: Human platelet-activating factor acetylhydrolase mRNA, complete cds)에 있어서 996번째의 염기가 혈소판 활성화 인자 아세틸 하이드롤라제 유전자의 994위치 염기에 상당하고, 배열번호 7의 염기배열(Accession No. X13367: Human DNA for apolipoprotein C-III 5'-flank)에 있어서 936번째의 염기가 아포리포프로테인 C-III 유전자의 -482위치 염기에 상당하고, 배열번호 8의 염기배열 (Accession No. Z19585: H.sapiens mRNA for thrombospondin-4)에 있어서 1186번째의 염기가 트롬보스폰딘 4 유전자의 1186 위치 염기에 상당하고, 배열번호 9의 염기배열 (Accession No. Z30175: H.sapiens IL-10 gene for interleukin 10(promoter))에 있어서 455번째의 염기가 인터로이킨 10 유전자의 -819 위치 염기에, 682번째의 염기가 -592 위치 염기에 각각 상당하고, 배열번호 10의 염기배열 (Accession No. U43511: Homo sapiens stromelysin-1 gene, promoter region)에 있어서 698번째의 염기가 스트로메라이신1 유전자의 -1171 위치 염기에 상당하고, 배열번호 11의 염기배열 (Accession No. X13323: Human gene for plasminogen activator inhibitor 1(PAI-1) 5'-flank and exon 1)에 있어서 131번째의 염기가 플라스미노겐 활성화 인자억제제-1 유전자의 -668 위치 염기에 상당하고, 배열번호 12의 염기배열 (Accession No. J02940: Human platelet glycoprotein Ib alpha chain mRNA, complete cds)에 있어서 524번째의 염기가 글리코프로테인 Ibα 유전자의 1018 위치 염기에 상당하고, 배열번호 13의 염기배열 (Accession No. M63012: H.sapiens serum paraoxonase (PON) mRNA, complete cds)에 있어서 584번째의 염기가 파라옥소나아제 유전자의 584 위치 염기에 상당하고, 배열번호 14의 염기배열 (Accession No. M10065: Human apolipoprotein E(epsilon-4 allele) gene, complete cds)에 있어서 4070번째의 염기가 아포리포프로테인 E 유전자의 4070 위치 염기에 상당한다.
본 발명에 있어서「다형을 해석한다」라고 하는 것은, 해석대상의 유전자 다형에 대해 핵산시료가 어떠한 유전자형을 가지는가에 대해 조사하는 것을 의미하며, 이는 다형이 존재하는 위치의 염기(염기배열)을 조사하는 것과 같은 의미이다. 전형적으로는, 코넥신 37 (1019C→T)다형의 해석을 예로 들어 설명하면, 핵산시료에서의 코넥신 37의 유전자형이 TT (1019 위치 염기가 양 대립 유전자(allele) 모두 T인 호모 접합체), CT (1019 위치 염기가 C인 대립유전자와 T인 대립 유전자인 헤테로 접합체), 및 CC (1019 위치 염기가 양 대립 유전자 모두 C인 호모 접합체)의 중 어떤 것인지를 조사하는 것을 의미한다.
전술한 (1)∼(10)의 다형은, 후술하는 실시예에 나타낸 바와 같이, 일본인 남성을 대상으로 한 해석에 있어, 심근경색의 유전적 리스크의 판정에 이용하는 것이 특히 유효하다고 인지된 다형이다. 따라서, 이들 다형을 해석대상으로 삼는 것은, 남성, 특히 일본인 남성을 피험자라고 할 때, 보다 높은 정밀도로 예지확률이 높은 진단을 가능하게 한다.
마찬가지로, (11)∼(15)의 다형은, 후술하는 실시예에 나타낸 바와 같이, 일본인 여성을 대상으로 한 해석에 있어, 심근경색의 유전적 리스크의 판정에 이용하는 것이 유효하다고 인지된 다형이다. 따라서, 이들 다형을 해석 대상으로 삼는 것은, 여성, 특히 일본인 여성을 피험자라 할 때, 보다 높은 정밀도로 예지확률이 높은 진단을 가능하게 한다. 이들 다형 중에서도 (15)의 다형에 관해서는, 후술하는 실시예에 나타낸 바와 같이, 이를 해석함에 의해 매우 높은 오즈비로 심근경색의 유전적 리스크를 판별할 수 있는 것이 확인되었다. 따라서, 상기 다형을 단독으로 해석함에 의해서도, 심근 경색 유전적 리스크를 높은 정밀도 및 높은 예지확률로 판정하는 것이 가능하다. 물론, 상기 (15)의 다형 해석에 추가하여, (11)∼(14)로부터 선택된 임의의 것 또는 복수개의 다형 해석을 조합하여 실시함으로써, 유전자형의 검출 또는 심근경색의 유전적 리스크의 진단을 행하는 것도 가능하다.
여기서, 원칙적으로는 해석하는 다형의 수의 증가에 비례하여 핵산 시료의 유전자형이 보다 미세히 분류되며, 이에 따라 예지확률이 한층 더 높은, 심근경색 유전적 리스크 진단을 수행할 수 있다. 이러한 견지로부터, 상기 (1) 내지 (10)의 다형 내에서, 보다 많은 다형을 해석하여 유전자형을 검출하는 것이 바람직하다. 따라서, (1) 내지 (10)의 모든 다형을 해석하는 것이 가장 바람직하다. 9개 이하 의 다형을 조합 유전자형의 검출을 행하는 경우에는, 후술하는 실시예에서 나타내는 오즈비가 높은 다형을 우선적으로 선택하여 이용하는 것이 바람직하다. 예를 들면 8개의 다형을 조합하여 이용하는 것이면, 오즈비가 높은 순으로 9개, 즉 (1), (3), (5), (6), (7), (8), (9) 및 (10)을 선택하는 것이 바람직하다. 마찬가지로, 예를 들면 일곱개의 다형을 조합하여 이용하는 것이라면, (1), (3), (5), (6), (8), (9) 및 (10)을 선택하는 것이 바람직하다. 마찬가지로, 예를 들면 여섯의 다형을 조합하여 이용하는 것이라면, (1), (5), (6), (8), (9) 및 (10)을 선택하는 것이 바람직하다. 마찬가지로, 예를 들면 다섯의 다형을 조합하여 이용하는 것이라면 (1), (5), (6), (8) 및 (9)를 선택하는 것이 바람직하다.
(11) 내지 (15)의 다형으로부터 선택되는 2개 이상의 다형을 해석하는 경우도, 마찬가지로, 상기 다형 모두, 즉 다섯개의 다형을 해석하는 것이 가장 바람직하다. 4개 이하의 다형을 조합 유전자형의 검출을 행하는 경우라면, 후술하는 실시예로 나타내는 오즈비가 높은 다형을 우선적으로 선택하여 이용하는 것이 바람직하다. 예를 들면 4개의 다형을 조합하여 이용하는 것이면, 오즈비가 높은 순으로 4개, 즉 (11), (12), (14) 및 (15)를 선택하는 것이 바람직하다. 마찬가지로, 예를 들면 셋의 다형을 조합하여 이용하는 것이면 (11), (12) 및 (15)를 선택하는 것이 바람직하다. 마찬가지로, 예를 들면 2개의 다형을 조합하여 이용하는 것이면 (11) 및 (15)를 선택하는 것이 바람직하다.
각 유전자 다형을 해석하는 방법은 특별히 한정되지 않으며, 예를 들어, 대립 유전자(allele) 특이적 프라이머 (및 프로브)를 이용하여, PCR (polymerase chain reaction) 법에 의한 증폭, 및 증폭산물의 다형을 형광 또는 발광에 의해서 해석하는 방법이나, PCR법을 이용한 PCR-RFLP(restriction fragment length polymorphism: 제한효소 분절길이 다형성)법, PCR-SSCP (single strand conformation polymorphism: 단쇄 고차 구조 다형성)법 (Orita, M. et al., Proc. Natl. Acad. Sci., U.S.A., 86, 2766-2770(1989) 등), PCR-SSO (specific sequence oligonucleotide: 특이적 배열 올리고뉴클레오티드)법, PCR-SSO 법과 도트 하이브리다이제이션법을 조합한 ASO (allele specific oligonucleotide: 대립 유전자 특이적 올리고뉴클레오티드) 하이브리다이제이션법 (Saiki, Nature, 324, 163-166(1986) 등), 또는 TaqMan-PCR 법(Livak, KJ, Genet Anal, 14, 143(1999), Morris, T. et al., J. Clin. Microbiol., 34, 2933(1996)), Invader 법(Lyamichev V et al., Nat Biotechnol, 17, 292(1999)), 프라이머 신장법을 이용한 MALDI-TOF/MS(matrix)법 (Haff LA, Smirnov IP, Genome Res 7, 378(1997)), RCA (rolling cycle amplification)법 (Lizardi PM et al., Nat Genet 19, 225(1998)), DNA 칩 또는 마이크로어레이를 이용한 방법 (Wang DG et al., Science 280, 1077(1998) 등), 프라이머 신장법, 써던 블롯팅 하이브리다이제이션 (Southern Blotting hybridization)법, 도트 하이브리다이제이션법 (Southern, E., J. Mol. Biol. 98, 503-517(1975)) 등의 공지된 방법을 채용할 수 있다. 또한, 해석대상의 다형부분을 직접 시퀀스함에 의해 해석할 수도 있다. 또한, 이들 방법을 임의로 조합하여 다형 해석을 행하여도 무방하다.
핵산 시료가 소량인 경우에는, 검출감도 내지 정밀도의 면에서 PCR 법을 이 용한 방법 (예를 들면, PCR-RFLP 법)에 의해 해석하는 것이 바람직하다. 또, PCR 법 또는 PCR 법을 응용한 방법 등의 유전자 증폭법에 의해 핵산시료를 미리 증폭 (핵산시료의 일부영역의 증폭을 포함함)시킨 후, 상기 중 어느 하나의 해석 방법을 적용할 수도 있다.
한편, 다수의 핵산 시료를 해석하는 경우에는, 특히, 대립 유전자 특이적 PCR법, 대립유전자 특이적 하이브리다이제이션법, TaqMan-PCR법, Invader법, 프라이머 신장법을 이용한 MALDI-TOF/MS(matrix)법, RCA(rolling cycle amplification)법, 또는 DNA 칩 또는 마이크로 어레이를 이용한 방법 등, 다수의 검체를 비교적 단시간에 해석할 수 있는 해석방법을 이용하는 것이 바람직하다.
전술한 방법에서는, 각 방법에 따른 프라이머나 프로브 등의 핵산 (본 발명에서는, 「다형 해석용 핵산」이라고도 함)이 사용된다. 다형 해석용 핵산의 예를 들면, 해석대상의 다형을 포함하는 유전자에 있어, 당해 다형부위를 포함하는 일정영역 (부분 DNA 영역)에 상보적인 배열을 가지는 핵산을 들 수 있다. 또한, 해석대상의 다형을 포함한 유전자에 있어, 상기 다형부위를 포함하는 일정영역 (부분 DNA 영역)에 상보적인 배열을 가지고, 상기 다형부분을 포함하는 DNA 단편(fragment)을 특이적으로 증폭할 수 있도록 설계된 핵산(프라이머)을 들 수 있다. 이와 같은 핵산으로서는, 예를 들면 코넥신 37 유전자의 1019 위치의 다형이 해석대상의 경우, 1019 위치의 염기가 C(시토신)인 코넥신 37 유전자의 1019 위치 염기를 함유한 부분 DNA 영역에 상보적인 배열을 가지는 핵산, 또는 1019 위치의 염기가 T(티민)인 코넥신 37 유전자의 1019 위치 염기를 포함하는 부분 DNA 영역에 상 보적인 배열을 가지는 핵산이 해당한다.
다형 해석용 핵산의 다른 구체적인 예로는, 해석대상의 다형부위가 어느 하나의 유전자형인 경우에만, 당해 다형부위를 포함하는 부분 DNA 영역을 특이적으로 증폭하도록 설계된 핵산세트를 들 수 있다. 보다 구체적으로, 해석대상의 다형부위를 포함하는 부분 DNA 영역을 특이적으로 증폭하도록 설계된 핵산세트로서, 다형부위가 어느 하나의 유전자형인 안티센스 사슬의 당해 다형부위를 포함하는 부분 DNA 영역에 대하여 특이적으로 하이브리다이즈(hybridize)하는 센스 프라이머와 센스사슬의 일부 영역에 대하여 특이적으로 하이브리다이즈하는 안티센스 프라이머로 이루어지는 핵산세트를 예시할 수 있다. 이러한 핵산세트로는, 코넥신 37 유전자의 1019 위치의 다형이 해석대상의 경우, 코넥신 37 유전자의 1019 위치 염기를 포함하는 부분 DNA 영역을 특이적으로 증폭하도록 설계된 핵산세트로서, 1019 위치 염기가 C(시토신)인 코넥신 37 유전자의 안티센스 사슬에서 1019 위치 염기를 포함한 부분 DNA영역에 대하여 특이적으로 하이브리다이즈하는 센스 프라이머와 센스사슬의 일부 영역에 대하여 특이적으로 하이브리다이즈하는 안티센스 프라이머로 이루어지는 핵산세트, 또는 1019 위치 염기가 T(티민)인 코넥신 37 유전자의 안티센스사슬에서 1019 위치 염기를 포함한 부분 DNA영역에 대하여 특이적으로 하이브리다이즈하는 센스 프라이머, 및 센스사슬의 일부영역에 대하여 특이적으로 하이브리다이즈하는 안티센스 프라이머로 이루어지는 핵산세트를 들 수 있다. 이 때, 증폭되는 부분 DNA 영역의 길이는 당해 검출에 알맞은 범위에서 적절하게 설정되는 바, 예를 들어 50bp∼200bp, 바람직하게는 80bp∼150bp 이다. 보다 구체적으로, 예를 들어, 코넥신 37 (1019C→T)다형 해석용 핵산세트로서, 하기 배열을 가지는 것을 예시할 수 있다. 나아가, 하기 배열의 하선부(下線部)는 다형에 대응하는 부분을 나타낸다. 또, 배열 중, N은 A, T, C, 및 G 중 어느 하나인 것을 의미한다;
센스 프라이머
CTCAGAATGGCCAAAANCC: 배열번호 15, 또는
CCTCAGAATGGCCAAAANTC: 배열번호 16
안티센스 프라이머
GCAGAGCTGCTGGGACGA: 배열번호 17
마찬가지로, TNFα(-863C→A)다형 해석용 핵산프라이머로서 하기 배열을 가지는 것을 예시할 수 있다:
안티센스 프라이머
GGCCCTGTCTTCGTTAANGG: 배열번호 18, 또는
ATGGCCCTGTCTTCGTTAANTG: 배열번호 19
센스 프라이머
CCAGGGCTATGGAAGTCGAGTATC: 배열번호 20
마찬가지로, NADH/NADPH 옥시다제 p22 폭스 (242C→T) 다형 해석용 핵산 프라이머로서 하기 배열을 가지는 것을 예시할 수 있다:
안티센스 프라이머
ACCACGGCGGTCATGNGC: 배열번호 21, 또는
ACCACGGCGGTCATGNAC: 배열번호 22
센스 프라이머
GCAGCAAAGGAGTCCCGAGT: 배열번호 23
마찬가지로, 안지오텐시노겐 (-6G→A) 다형 해석용 핵산 프라이머로서 하기 배열을 가지는 것을 예시할 수 있다:
안티센스 프라이머
CGGCAGCTTCTTCCCNCG: 배열번호 24, 또는
CGGCAGCTTCTTCCCNTG: 배열번호 25
센스 프라이머
CCACCCCTCAGCTATAAATAGG: 배열번호 26
마찬가지로, 아포E (-219G→T) 다형 해석용 핵산프라이머로서 하기 배열을 가지는 것을 예시할 수 있다:
센스 프라이머
GAATGGAGGAGGGTGTCTNGA: 배열번호 27, 또는
AGAATGGAGGAGGGTGTCTNTA: 배열번호 28
안티센스 프라이머
CCAGGAAGGGAGGACACCTC: 배열번호 29
마찬가지로, PAF 아세틸 하이드롤라제 (994G→T)다형 해석용 핵산프라이머로서 하기 배열을 가지는 것을 예시할 수 있다:
센스 프라이머
TTCTTTTGGTGGAGCAACNGT: 배열번호 30, 또는
ATTCTTTTGGTGGAGCAACNTT: 배열번호 31
안티센스 프라이머
TCTTACCTGAATCTCTGATCTTCA: 배열번호 32
마찬가지로, 아포 C-III (-482C→T) 다형 해석용 핵산 프라이머로서 하기 배열을 가지는 것을 예시할 수 있다:
센스 프라이머
CGGAGCCACTGATGCNCG: 배열번호 33, 또는
CGGAGCCACTGATGCNTG: 배열번호 34
안티센스 프라이머
TGTTTGGAGTAAAGGCACAGAA: 배열번호 35
마찬가지로, TSP4(1186G→C)다형 해석용 핵산프라이머로서 하기 배열을 가지는 것을 예시할 수 있다:
센스 프라이머
CGAGTTGGGAACGCACNCT: 배열번호 36, 또는
CGAGTTGGGAACGCACNGT: 배열번호 37
안티센스 프라이머
GGTCTGCACTGACATTGATGAG: 배열번호 38
마찬가지로, IL-10 (-819T→C)다형 해석용 핵산프라이머로서 하기 배열을 가지는 것을 예시할 수 있다:
센스 프라이머
TACCCTTGTACAGGTGATGTANTA: 배열번호 39, 또는
TACCCTTGTACAGGTGATGTANCA: 배열번호 40
안티센스 프라이머
ATAGTGAGCAAACTGAGGCACA: 배열번호 41
마찬가지로, IL-10 (-592A→C)다형 해석용 핵산프라이머로서 하기 배열을 가지는 것을 예시할 수 있다:
안티센스 프라이머
CAGAGACTGGCTTCCTACANGA: 배열번호 42, 또는
CCAGAGACTGGCTTCCTACANTA: 배열번호 43
센스 프라이머
GCCTGGAACACATCCTGTGA: 배열번호 44
마찬가지로, 스트로메라이신1 (-1171/5A→6A) 다형 해석용 핵산프라이머로서 하기 배열을 가지는 것을 예시할 수 있다:
센스 프라이머
TTTGATGGGGGGAAAANAC: 배열번호 45, 또는
TTGATGGGGGGAAAANCC: 배열번호 46
안티센스 프라이머
CCTCATATCAATGTGGCCAA: 배열번호 47
마찬가지로, PAI1(-668/4G→5G)다형 해석용 핵산프라이머로서 하기 배열을 가지는 것을 예시할 수 있다.
센스 프라이머
GGCACAGAGAGAGTCTGGACACG: 배열번호 48
안티센스 프라이머
GGCCGCCTCCGATGATACA: 배열번호 49
마찬가지로, 글리코프로테인 Ibα(1018C→T)다형 해석용 핵산프라이머로서 하기 배열을 가지는 것을 예시할 수 있다:
센스 프라이머
CCCAGGGCTCCTGNCG: 배열번호 50, 또는
CCCCAGGGCTCCTGNTG: 배열번호 51
안티센스 프라이머
TGAGCTTCTCCAGCTTGGGTG: 배열번호 52
마찬가지로, 파라옥소나아제(584G→A)다형 해석용 핵산프라이머로서 하기 배열을 가지는 것을 예시할 수 있다:
센스 프라이머
ACCCAAATACATCTCCCAGGANCG: 배열번호 53, 또는
AACCCAAATACATCTCCCAGGNCT: 배열번호 54
안티센스 프라이머
GAATGATATTGTTGCTGTGGGAC: 배열번호 55
마찬가지로, 아포 E(4070C→T)다형 해석용 핵산프라이머로서 하기 배열을 가지는 것을 예시할 수 있다:
센스 프라이머
CCGATGACCTGCAGAANCG: 배열번호 56, 또는
GCCGATGACCTGCAGAANTG: 배열번호 57
안티센스 프라이머
CGGCCTGGTACACTGCCAG: 배열번호 58
한편, 프로브의 구체적인 예로서 하기의 것을 들 수 있다:
아포 C-III(-482C→T)다형 해석용프로브로서,
AGCCACTGATGCNCGGTCT: 배열번호 59, 또는
AGCCACTGATGCNTGGTCT: 배열번호 60.
IL-10(-819T→C)다형 해석용프로브로서,
GTACAGGTGATGTANTATCTCTGTG: 배열번호 61, 또는
GTACAGGTGATGTANCATCTCTGTG: 배열번호 62.
PAI1(-668/4G→5G)다형 해석용프로브로서.
TGGACACGTGGGGGAGTCAG: 배열번호 63, 또는
TGGACACGTGGGGAGTCAGC: 배열번호 64.
전술한 핵산프라이머, 핵산프로브는 단순한 예시이며, 핵산 프라이머라면 목적하는 증폭반응을 지장없이 행할 수 있는 한도에서, 다른 쪽 핵산 프로브라면 목적의 하이브리다이제이션 반응을 지장없이 행할 수 있는 한도에서 일부의 염기배열에 개변(改變)이 실시된 수도 있다. 이 때,「일부의 개변」이란, 염기의 일부가 결실, 치환, 삽입 및/또는 부가되는 것을 의미한다. 개변에 관한 염기수는, 예를 들면 1∼7, 바람직하게는 1∼5개, 더욱 바람직하게는, 1∼3개이다. 또한, 이러한 개변은, 원칙적으로, 다형부위에 대응하는 염기 이외의 부분에서 행해진다. 단, 해석대상의 다형이 스트로메라이신1 (-1171/5A→6A)다형 또는 PAI1 (-668/4G→5G)다형 인 경우에는, 다형부위에 대응하는 염기의 일부를 개변하여 얻어지는 핵산을 프라이머 또는 프로브로서 이용하는 것도 가능하다.
다형 해석용 핵산 (프로브, 프라이머)에는, 해석방법에 따라 적절한 DNA 단편 또는 RNA 단편이 이용된다. 다형 해석용 핵산의 염기길이는 각각의 기능이 발휘되는 길이이면 되고, 프라이머로서 이용되는 경우의 염기길이의 예를 들면, 10∼50bp정도, 바람직하게는 15∼40bp정도, 더욱 바람직하게는 15∼30bp 정도이다.
또한, 프라이머로서 이용되는 경우에는 증폭 대상에 특이적으로 하이브리다이즈하여 목적하는 DNA 단편(fragment)을 증폭하는 것이 가능한 한도에서, 주형이 되는 배열에 대해 다소의 미스매치가 있을 수도 있다. 프로브의 경우도 마찬가지로, 검출대상의 배열과의 특이적인 하이브리다이즈가 가능한 한도에서, 검출대상의 배열에 대하여 다소의 미스매치가 있을 수도 있다. 미스매치의 정도로는, 1∼수개, 바람직하게는 1∼5개, 더욱 바람직하게는 1∼3개다.
다형 해석용 핵산 (프라이머, 프로브)은 포스포디에스테르법 등 공지된 방법에 의해 합성할 수 있다. 또한, 다형 해석용 핵산의 설계, 합성 등에 관해서는 참고서적 (예를 들면, Molecular Cloning, Third Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York)을 참고할 수 있다.
본 발명에서의 다형 해석용 핵산을 미리 표식 물질로 표식해 둘 수 있다. 이러한 표식화 핵산을 이용함에 의해, 예를 들어, 증폭산물의 표식량을 지표로 하여 다형 해석을 행하는 것도 가능하다. 또, 다형을 구성하는 각 유전자형의 유전자에서 부분 DNA 영역을 각각 특이적으로 증폭하도록 설계된 2종류의 프라이머를 서로 상이한 표식 물질로 표시하는 경우, 증폭산물로부터 검출되는 표식 물질 및 표식량에 의해 핵산시료의 유전자형을 판별할 수 있다. 이러한 표식화 프라이머를 이용한 검출 방법의 구체적인 예로는, 다형을 구성하는 각 유전자형의 센스 사슬에 각각 특이적으로 하이브리다이즈하는 2 종류의 핵산 프라이머 (대립 유전자 특이적 센스 프라이머)를 플루오레세인 이소티오시아네이트(FITC: fluorescein isotiocyanate)와 텍사스 레드로 각각 표시하고, 이들 표식화된 프라이머와 안티센스 사슬에 특이적으로 하이브리다이즈하는 안티센스 프라이머를 이용하여 다형부위를 포함하는 부분 DNA 영역을 증폭하고, 수득된 증폭산물에서 각 형광물질의 표식량을 측정하여 다형을 검출하는 방법을 들 수 있다. 또한, 여기서의 안티센스 프라이머를, 예를 들어, 비오틴으로 표식해 두면, 비오틴과 아비딘과의 특이적인 결합을 이용하여 증폭산물의 분리을 행할 수 있다.
다형 해석용 핵산의 표식에 이용되는 표식 물질로는 32P 등의 방사성 동위원소, 플루오레세인이소티오시아네이트, 테트라메틸로다민이소티오시아네이트, 텍사스 레드 등의 형광물질을 예시할 수 있고, 표식 방법으로는 알칼리 포스파타아제 및 T4 폴리뉴클레오티드 키나제를 이용한 5' 말단표식법, T4 DNA 폴리머라아제 또는 Klenow 단편을 이용한 3' 말단표식법, 닉 트랜슬레이션(nick translation)법, 랜덤프라이머법 (참조: Molecular Cloning, 3판, 제9장, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York) 등을 예시할 수 있다.
전술한 다형 해석용 핵산을 불용성 지지체에 고정화한 상태에서 사용하는 것 도 가능하다. 고정화에 사용하는 불용성 지지체를 칩형, 비드형 등으로 가공해 두면, 이들 고정화 핵산을 이용하여 다형의 해석을 보다 간편하게 행할 수 있다.
핵산시료는, 피험자의 혈액, 피부세포, 점막세포, 모발 등으로부터 공지된 추출 방법과 정제 방법을 이용하여 조제할 수 있다. 다형해석 대상의 유전자를 포함하는 것이면, 임의의 길이의 게놈 DNA를 핵산시료로 이용할 수 있다. 또, 반드시 해석 대상의 유전자의 전부가 하나의 핵산상에 존재하는 핵산시료를 이용할 필요는 없다. 즉, 본 발명의 핵산 시료로서는, 해석대상의 유전자의 전부가 하나의 핵산상에 존재하고 있는 것, 해석 대상의 유전자가 2 이상의 핵산 상에 분리되어 존재하고 있는 것 중 어느 하나를 이용할 수도 있다. 또한, 핵산 시료에 있어서 해석대상의 유전자는, 완전한 상태(즉, 유전자의 전체 길이가 존재하고 있는 상태)가 아니더라도, 적어도 해석되는 다형부위가 존재하고 있는 한, 부분적인 상태여도 무방하다.
각 유전자 다형의 해석은 유전자 다형마다, 또는, 복수 또는 전부를 동시에 행한다. 전자의 경우, 예를 들어, 피험자로부터 수득한 핵산시료를 해석대상의 다형의 수에 맞춰 나누어 주입하고, 각 다형해석을 개별적으로 행한다. 후자의 경우, 예를 들면 DNA 칩 또는 마이크로 어레이에 의해 행할 수 있다. 또한, 여기서 말하는 "동시"라는 것은, 해석과정의 모든조작이 동시에 행하여지는 것만을 의미하는 것이 아니라, 일부의 조작 (예를 들면, 핵산증폭조작, 프로브의 하이브리다이즈, 또는 검출)이 동시에 행하여지는 경우도 포함한다.
해석 대상의 유전자의 전사 산물인 mRNA를 이용하여 각 유전자의 다형을 해 석할 수도 있다. 예를 들면, 피험자의 혈액, 소변(尿) 등으로부터 해석대상인 유전자의 mRNA를 추출, 정제한 후, 노던 블롯팅(Northern Blotting)법 (Molecular Cloning, 제3판, 7.42, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York), 도트 블롯팅(dot blotting)법 (Molecular Cloning, 제3판, 7.46, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York), RT-PCR 법 (Molecular Cloning, 제3판, 8.46, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York), DNA 칩 (DNA 어레이)를 이용한 방법 등을 실행함으로써, mRNA를 출발 재료로서 다형 해석을 행할 수 있다.
또한, 상기 다형 중에서, 아미노산의 변화를 수반하는 것에 관해서는, 해석대상의 유전자의 발현산물을 이용하여 다형해석을 행하는 것도 가능하다. 이 경우, 다형 부위에 대응하는 아미노산을 포함하고 있는 한, 부분 단백질, 부분 펩티드도 해석용 시료로서 이용할 수 있다.
이와 같은, 유전자의 발현산물을 이용하여 해석하는 방법으로서는, 다형부위의 아미노산을 직접 분석하는 방법, 또는 입체구조의 변화를 이용하여 면역학적으로 분석하는 방법 등을 들 수 있다. 전자의 경우, 주지의 아미노산 배열 분석법 (에드만법을 이용한 방법)을 이용할 수 있다. 후자의 경우, 다형을 구성하는 어느 하나의 유전자형을 가지는 유전자의 발현산물에 특이적인 결합활성을 가지는 모노클로날 항체 또는 폴리클로날 항체를 이용한 ELISA 법 (효소결합 면역흡착 정량법), 방사면역 측정법(radio immuno assay), 면역 침강법, 면역 확산법 등을 이용할 수 있다.
이상 설명한 본 발명의 검출방법을 수행하여 수득된 다형정보는, 심근경색의 유전적 리스크의 진단에 이용할 수 있다. 즉, 본 발명은 이상의 검출 방법에 의해 수득되는 다형정보로부터 핵산시료의 유전자형을 결정하는 공정 및, 결정된 핵산 시료의 유전자형으로부터 유전적 리스크를 구하는 공정을 포함한 심근경색의 리스크 진단방법을 제공한다. 여기서의 유전자 형의 결정은, 전형적으로는, 검출대상의 다형에 관해 핵산시료의 양 대립 유전자가 어느 유전자형을 각각 갖는지를 결정하는 것이다. 코넥신 37 (1019C→T)다형이 검출대상인 경우를 예로 들면, 전형적으로는 핵산시료에서의 코넥신 37의 유전자형이 TT (1019 위치 염기가 양 대립 유전자 모두 T인 호모 접합체), CT(1019 위치 염기가 C인 대립 유전자와 T인 대립유전자의 헤테로 접합체), 및 CC (1019 위치 염기가 양 대립 유전자가 모두 C인 호모접합체) 중 어느 것인지를 결정하는 것이다.
후술하는 실시예로부터 얻어진 결과를 고려하면, 높은 정밀도 및 높은 예지확률로, 심근경색의 유전적 리스크의 진단을 가능하게 하기 위해서는, 예를 들면 코넥신 37 (1019C→T)다형일 경우, 핵산시료의 유전자형이 TT 또는 CT 중 어느 하나인지, 아니면, CC인지가 결정된다. 마찬가지로, TNFα(-863C→A)다형이라면, AA 또는 CA 중 어느 하나인지, 그렇지 않으면 CC인지, NADH/NADPH 옥시다제 p22 폭스(242C→T) 다형이라면 TT 또는 CT 중 어느 하나인지, 그렇지 않으면 CC인지, 안지오텐시노겐(-6G→A) 다형이라면 AA인지, 그렇지 않으면 GA 또는 GG 중 어느 하나인지, 아포 E-219(-219G→T)다형이라면 TT 인지, 그렇지 않으면 GT 또는 GG 중 어느 하나인지, PAF 아세틸 하이드롤라제 (994G→T)다형이라면 TT 또는 GT 중 어느 하나인지, 그렇지 않으면 GG 인지, 아포C-III (-482C→T)다형이라면 TT 인지, 그렇지 않으면 CT 또는 CC 중 어느 하나인지, TSP4 (1186G→C)다형이라면 CC 또는 GC 중 어느 하나인지, 그렇지 않으면 GG인지, IL-10 (-819T→C)다형이면 CC인지, 그렇지 않으면 CT 또는 TT 중 어느 하나인지, IL-10(-592A→C)다형이면 CC인지, 그렇지 않으면 CA 또는 AA 중 어느 하나인지, 스트로메라이신1(-1171/5A→6A)다형이면 6A/6A 또는 5A/6A 중 어느 하나인지, 그렇지 않으면 5A/5A인지, PAI1(-668/4G→5G)다형이면 5G/5G 또는 4G/5G 중 어느 하나인지, 그렇지 않으면 4G/4G인지, 글리코프로테인 Ibα(1018C→T)다형이면 TT 인지, 그렇지 않으면 CT 또는 CC 중 어느 하나인지, 파라옥소나아제(584G→A)다형이면 AA인지, 그렇지 않으면 GA 또는 GG 중 어느 하나인지, 아포 E(4070C→T)다형이면 TT인지, 그렇지 않으면 CT 또는 CC 중 어느 하나인지가 결정된다.
심근경색의 유전적 리스크를 진단함에 의해, 장래 심근경색을 이환할 우려의 정도 (발증의 가능성), 즉 발증 리스크 (발증 취약성)이 예측되고, 나아가, 유전자형이라는 객관적 지표에 기초하여, 심근 경색의 인정 또는 병상의 파악을 행하는 것이 가능하게 된다. 바꾸어 말하면, 본 발명의 진단 방법에 의해 심근경색의 발병 리스크의 평가, 심근경색으로 이환하고 있음의 인정, 또는 증상의 파악을 행할 수 있다. 이 중, 발증 리스크의 평가를 행할 수 있는 것은 임상적으로 큰 의의를 가진다. 발증 리스크를 사전에 아는 것은, 심근 경색의 1차 예방에 공헌하고, 적절한 예방조치를 강구하는 것을 가능하게 하기 때문이다.
본 발명의 진단 방법에 의해서 얻어지는 정보는, 적절한 치료법의 선택 또는, 예후개선, 환자의 QOL(삶의 질: quality of life)의 향상, 또는 발증 리스크의 저감 등에 이용할 수 있다.
본 발명의 진단 방법을 정기적으로 실행함에 의해, 심근경색의 발증 리스크 를 모니터할 수 있다. 이러한 모니터의 결과, 어떤 외적인자 (환경인자, 약제의 투여 등)와 발증 리스크 등의 증가의 사이에 상관관계가 인지되면, 상기 외적 인자를 위험인자로 인정하고, 이러한 정보를 기초로 발증 리스크 등의 저감을 도모하는 것이 가능할 것이라 생각된다.
본 발명에서 얻어지는 심근경색의 발증에 관련되는 유전정보를 이용하여, 심근경색의 치료(예방적 처치를 포함함)를 행할 수 있다. 예를 들면, 본 발명의 진단 방법을 실시한 결과, 해석대상의 다형이 심근경색의 발증 리스크를 높이는 유전자형인 경우에, 발증 리스크가 낮은 유전자형을 가진 유전자를 생체 내에 도입하여 발현시키면, 상기 유전자가 발현함에 의해 증상의 경감, 발병의 억제, 발증 리스크의 경감 등을 기대할 수 있다. 발증 리스크가 높은 유전자형을 가지는 유전자의 mRNA에 대한 안티 센스사슬을 도입하여 상기 mRNA의 발현을 억제하는 방법에 의해서도, 동일한 치료효과를 기대할 수 있다.
유전자 또는 안티센스 사슬의 도입은, 예를 들어, 유전자 도입용 플라스미드 또는 바이러스 벡터를 이용한 방법, 일렉트로포레이션(electroporation) [참조: Potter, H. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 81, 7161-7165(1984)], 초음파 마이크로 버블(참조: Lawrie, A. et al., Gene Therapy 7, 2023-2027 (2000)], 리포펙션(lipofection) [참조: Felgner, P.L. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 84, 7413-7417(1984)], 마이크로 인젝션 [Graessmann, M. & Graessmann, A., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 73, 366-370(1976)] 등의 방법에 의해 행할 수 있다. 이들 방법을 이용하여, 원하는 유전자 등을 생체로 직접적으로 도입 (생체 내법) 또는 간접적으로 도입(ex vivo 법)할 수 있다.
본 발명의 제2 측면은, 전술한 본 발명의 검출방법 또는 진단방법에 사용되는 키트 (유전자형 검출용 키트 또는 심근경색 진단용 키트)를 제공한다. 이러한 키트에는, 상기 (1) 내지 (10)의 다형으로 이루어진 군으로부터 선택되는 2개 이상의 다형을 해석하기 위한 핵산 (다형 해석용 핵산)이 포함된다. 또는, 상기 (11) 내지 (15)의 다형으로 이루어진 군으로부터 선택되는 2개 이상의 다형을 해석하기 위한 핵산 (다형 해석용 핵산)이 포함된다. 또 다른 양태로서, 상기 (15)의 다형을 해석하기 위한 핵산이 포함된 키트가 구성된다.
다형 해석용 핵산은, 그것이 적용되는 해석 방법 (전술한 대립 유전자 특이적 핵산 등을 사용한 PCR 법을 이용하는 방법, PCR-RFLP법, PCR-SSCP, TaqMan-PCR법, Invader 법 등)에 있어서, 해석 대상의 다형부분을 포함하는 DNA 영역 또는 그것에 대응하는 mRNA를 특이적으로 증폭할 수 있는 것 (프라이머) 또는 특이적으로 검출할 수 있는 것(프로브)으로서 설계된다. 이하, 본 발명에 있어서 제공되는 키트의 구체적인 예를 나타낸다.
하기 (1) 내지 (10)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 2개 이상의 핵산을 포함하는 유전자형 검출용 키트:
(1) 1019 위치 염기가 C 인 코넥신 37 유전자의 1019 위치 염기를 포함하는 부분 DNA 영역에 상보적인 배열을 가지는 핵산, 또는 1019 위치 염기가 T 인 코넥신 37 유전자의 1019 위치 염기를 포함하는 부분 DNA 영역에 상보적인 배열을 가지는 핵산.
(2) -863 위치 염기가 C 인 종양괴사인자α 유전자의 -863 위치 염기를 포함하는 부분 DNA 영역에 상보적인 배열을 가지는 핵산, 또는 -863 위치 염기가 A 인 종양괴사인자α 유전자의 -863 위치 염기를 포함하는 부분 DNA 영역에 상보적인 배열을 가지는 핵산,
(3) 242 위치 염기가 C 인 NADH/NADPH 옥시다제 p22 폭스 유전자의 242 위치 염기를 포함하는 부분 DNA 영역에 상보적인 배열을 가지는 핵산, 또는 242 위치 염기가 T인 종양괴사인자α 유전자의 242 위치 염기를 포함하는 부분 DNA 영역에 상보적인 배열을 가지는 핵산,
(4) -6 위치 염기가 G 인 안지오텐시노겐 유전자의 -6 위치 염기를 포함하는 부분 DNA 영역에 상보적인 배열을 가지는 핵산, 또는 -6 위치 염기가 A 인 안지오텐시노겐 유전자의 -6 위치 염기를 포함하는 부분 DNA 영역에 상보적인 배열을 가지는 핵산,
(5) -219 위치 염기가 G 인 아포리포프로테인 E 유전자의 -219 위치 염기를 포함하는 부분 DNA 영역에 상보적인 배열을 가지는 핵산, 또는 -219 위치 염기가 T 인 아포리포프로테인 E 유전자의 -219 위치 염기를 포함하는 부분 DNA 영역에 상보적인 배열을 가지는 핵산,
(6) 994 위치 염기가 G 인 혈소판 활성화 인자 아세틸 하이드롤라제 유전자 의 994 위치 염기를 포함하는 부분 DNA 영역에 상보적인 배열을 가지는 핵산, 또는 994 위치 염기가 T 인 혈소판 활성화 인자 아세틸 하이드롤라제 유전자의 994 위치 염기를 포함하는 부분 DNA 영역에 상보적인 배열을 가지는 핵산,
(7) -482 위치 염기가 C 인 아포리포프로테인 C-III 유전자의 -482 위치 염기를 포함하는 부분 DNA 영역에 상보적인 배열을 가지는 핵산, 또는 -482 위치 염기가 T 인 아포리포프로테인 C-III 유전자의 -482 위치 염기를 포함하는 부분 DNA 영역에 상보적인 배열을 가지는 핵산,
(8) 1186 위치 염기가 G 인 트롬보스폰딘 4 유전자의 1186 위치 염기를 포함하는 부분 DNA 영역에 상보적인 배열을 가지는 핵산, 또는 1186 위치 염기가 C 인 트롬보스폰딘 4 유전자의 1186 위치 염기를 포함하는 부분 DNA 영역에 상보적인 배열을 가지는 핵산,
(9) -819 위치 염기가 T 인 인터로이킨 10 유전자의 -819 위치 염기를 포함하는 부분 DNA 영역에 상보적인 배열을 가지는 핵산, 또는-819 위치 염기가 C 인 인터로이킨 10 유전자의 -819 위치 염기를 포함하는 부분 DNA 영역에 상보적인 배열을 가지는 핵산, 및
(10) -592 위치 염기가 A 인 인터로이킨 10 유전자의 -592 위치 염기를 포함하는 부분 DNA 영역에 상보적인 배열을 가지는 핵산, 또는 -592 위치 염기가 C 인 인터로이킨 10 유전자의 -592 위치 염기를 포함하는 부분 DNA 영역에 상보적인 배열을 가지는 핵산.
상기에서는, (1)∼(10) 으로 이루어진 군으로부터 2개 이상의 핵산을 선택하 여 키트를 구성하고 있지만, (1)∼(10) 중 2개 이상을 임의로 선택하여 군으로 하고, 이러한 군으로부터 2개 이상의 핵산을 선택하여 키트를 구성할 수도 있다.
예를 들면, (1), (5), (6), (8), (9) 및 (10)으로 이루어진 군 (후술하는 실시예에 있어서 오즈비가 1 이상인 다형을 해석하기 위한 핵산)으로부터 2개 이상의 핵산을 선택하여 키트를 구성하거나, (1), (5), (6), (8) 및 (9)로 이루어진 군(후술하는 실시예에 있어서 오즈비가 상위 5위까지인 다형을 해석하기 위한 핵산)으로부터 2개 이상의 핵산을 선택하여 키트를 구성할 수 있다.
하기 (11)∼(15)로 이루어진 군으로부터 선택되는 2개 이상의 핵산을 포함하는 유전자형 검출용 키트:
(11) -1171 위치로부터 3'방향으로 A가 5개 연속하여 존재하는 스트로메라이신1 유전자의 상기 배열부분을 포함하는 부분 DNA 영역에 상보적인 배열을 가지는 핵산, 또는 -1171 위치로부터 3'방향으로 A가 6개 연속하여 존재하는 스트로메라이신1 유전자의 상기 배열부분을 포함하는 부분 DNA 영역에 상보적인 배열을 가지는 핵산,
(12) -668 위치로부터 3'방향으로 연속하여 4개의 G가 존재하는 플라스미노겐 활성화 인자 억제제-1 유전자의 상기 배열부분을 포함하는 부분 DNA 영역에 상보적인 배열을 가지는 핵산, 또는 -668 위치로부터 3'방향으로 연속하여 5개의 G가 존재하는 플라스미노겐 활성화 인자 억제제-1 유전자의 상기 배열부분을 포함하는 부분 DNA 영역에 상보적인 배열을 가지는 핵산,
(13) 1018 위치 염기가 C 인 글리코프로테인 Ibα 유전자의 1018 위치 염기를 포함하는 부분 DNA 영역에 상보적인 배열을 가지는 핵산, 또는 1018 위치 염기가 T 인 글리코프로테인 Ibα 유전자의 1018 위치 염기를 포함하는 부분 DNA 영역에 상보적이다 배열을 가지는 핵산,
(14) 584 위치 염기가 G 인 파라옥소나아제 유전자의 584 위치 염기를 포함하는 부분 DNA 영역에 상보적인 배열을 가지는 핵산, 또는 584 위치 염기가 A 인 파라옥소나아제 유전자의 584 위치 염기를 포함하는 부분 DNA 영역에 상보적인 배열을 가지는 핵산, 및
(15) 4070 위치 염기가 C 인 아포리포프로테인 E 유전자의 4070 위치 염기를 포함하는 부분 DNA 영역에 상보적인 배열을 가지는 핵산, 또는 4070 위치 염기가 T 인 아포리포프로테인 E 유전자의 4070 위치 염기를 포함하는 부분 DNA 영역에 상보적인 배열을 가지는 핵산.
상기의 경우, (11)∼(15)로 이루어진 군으로부터 2개 이상의 핵산을 선택하여 키트를 구성하고 있지만, (11)∼(15)의 2개 이상을 임의로 선택하여 군으로 하고, 이러한 군으로부터 2개 이상의 핵산을 선택하여 키트를 구성할 수도 있다. 예를 들면, (11), (12), (14) 및 (15)로 이루어진 군 (후술하는 실시예에 있어서 오즈비가 1 이상인 다형을 해석하기 위한 핵산)으로부터 2개 이상의 핵산세트를 선택하여 키트를 구성하거나, (11), (12) 및 (15)로 이루어진 군 (후술하는 실시예에 있어서 오즈비가 상위3위까지의 다형을 해석하기 위한 핵산)으로부터 2개 이상의 핵산을 선택하여 키트를 구성할 수 있다.
하기 핵산을 포함하는 유전자형 검출용 키트:
4070 위치 염기가 C 인 아포리포프로테인 E 유전자의 4070 위치 염기를 포함하는 부분 DNA 영역에 상보적인 배열을 가지는 핵산, 또는 4070 위치 염기가 T 인 아포리포프로테인 E 유전자의 4070 위치 염기를 포함하는 부분 DNA 영역에 상보적인 배열을 가지는 핵산.
하기의 (1)∼(10)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 2개 이상의 핵산세트를 포함하는 유전자형 검출용 키트:
(1) 핵산 시료 중의 코넥신 37 유전자의 1019 위치 염기가 C 인 경우에만, 상기 코넥신 37 유전자의 1019 위치 염기를 포함하는 부분 DNA 영역을 특이적으로 증폭하도록 설계된 핵산 세트, 또는 핵산 시료 중의 코넥신 37 유전자의 1019 위치 염기가 T 인 경우에만, 상기 코넥신 37 유전자의 1019 위치 염기를 포함하는 부분 DNA 영역을 특이적으로 증폭하도록 설계된 핵산세트,
(2) 핵산 시료 중의 종양괴사인자α 유전자의 -863 위치 염기가 C 인 경우에만, 상기 종양괴사인자α 유전자의 -863 위치 염기를 포함하는 부분 DNA 영역을 특이적으로 증폭하도록 설계된 핵산세트, 또는 핵산 시료중의 종양괴사인자α 유전자의 -863 위치 염기가 A 인 경우에만, 상기 종양괴사인자α 유전자의 -863 위치 염기를 포함하는 부분 DNA 영역을 특이적으로 증폭하도록 설계된 핵산세트,
(3) 핵산 시료 중의 NADH/NADPH 옥시다제 p22 폭스 유전자의 242 위치 염기 가 C 인 경우에만, 상기 NADH/NADPH 옥시다제 p22 폭스 유전자의 242 위치 염기를 포함하는 부분 DNA 영역을 특이적으로 증폭하도록 설계된 핵산세트, 또는 핵산 시료중의 NADH/NADPH 옥시다제 p22 폭스 유전자의 242 위치 염기가 T 인 경우에만, 상기 NADH/NADPH 옥시다제 p22 폭스 유전자의 242 위치 염기를 포함하는 부분 DNA 영역을 특이적으로 증폭하도록 설계된 핵산세트,
(4) 핵산 시료 중의 안지오텐시노겐 유전자의 -6 위치 염기가 G 인 경우에만, 상기 안지오텐시노겐 유전자의 -6 위치 염기를 포함하는 부분 DNA 영역을 특이적으로 증폭하도록 설계된 핵산세트, 또는 핵산 시료 중의 안지오텐시노겐 유전자의 -6 위치 염기가 A 인 경우에만, 상기 안지오텐시노겐 유전자의 -6 위치 염기를 포함하는 부분 DNA 영역을 특이적으로 증폭하도록 설계된 핵산세트,
(5) 핵산 시료 중의 아포리포프로테인 E 유전자의 -219 위치 염기가 G 인 경우에만, 상기 아포리포프로테인 E 유전자의 -219 위치 염기를 포함하는 부분 DNA 영역을 특이적으로 증폭하도록 설계된 핵산세트, 또는 핵산 시료 중의 아포리포프로테인 E 유전자의 -219 위치 염기가 T 인 경우에만, 상기 아포리포프로테인 E 유전자의 -219 위치 염기를 포함하는 부분 DNA 영역을 특이적으로 증폭하도록 설계된 핵산세트,
(6) 핵산 시료 중의 혈소판 활성화 인자 아세틸 하이드롤라제 유전자의 994위치 염기가 G 인 경우에만, 상기 혈소판 활성화 인자 아세틸 하이드롤라제 유전자의 994 위치 염기를 포함하는 부분 DNA 영역을 특이적으로 증폭하도록 설계된 핵산세트, 또는 핵산 시료 중의 혈소판 활성화 인자 아세틸 하이드롤라제 유전자의 994 위치 염기가 T 인 경우에만, 상기 혈소판 활성화 인자 아세틸 하이드롤라제 유전자의 994위치 염기를 포함하는 부분 DNA 영역을 특이적으로 증폭하도록 설계된 핵산세트,
(7) 핵산 시료 중의 아포 리포프로테인 C-III 유전자의 -482 위치 염기가 C 인 경우에만, 상기 아포리포프로테인 C-III 유전자의 -482 위치 염기를 포함하는 부분 DNA 영역을 특이적으로 증폭하도록 설계된 핵산세트, 또는 핵산 시료 중의 아포리포프로테인 C-III 유전자의 -482 위치 염기가 T 인 경우에만, 상기 아포리포프로테인 C-III 유전자의 -482 위치 염기를 포함하는 부분 DNA 영역을 특이적으로 증폭하도록 설계된 핵산세트,
(8) 핵산 시료 중의 트롬보스폰딘 4 유전자의 1186 위치 염기가 G 인 경우에만, 상기 트롬보스폰딘 4 유전자의 1186 위치 염기를 포함하는 부분 DNA 영역을 특이적으로 증폭하도록 설계된 핵산세트, 또는 핵산 시료 중의 트롬보스폰딘 4 유전자의 1186 위치 염기가 C 인 경우에만, 상기 트롬보스폰딘 4 유전자의 1186 위치 염기를 포함하는 부분 DNA 영역을 특이적으로 증폭하도록 설계된 핵산세트,
(9) 핵산 시료 중의 인터로이킨 10 유전자의 -819 위치 염기가 T 인 경우에만, 상기 인터로이킨 10 유전자의 -819 위치 염기를 포함하는 부분 DNA 영역을 특이적으로 증폭하도록 설계된 핵산세트, 또는 핵산 시료중의 인터로이킨 10 유전자의 -819 위치 염기가 C 인 경우에만, 상기 인터로이킨 10 유전자의 -819 위치 염기를 포함하는 부분 DNA 영역을 특이적으로 증폭하도록 설계된 핵산세트, 및
(10) 핵산 시료 중의 인터로이킨 10 유전자의 -592 위치 염기가 A 인 경우에 만, 상기 인터로이킨 10 유전자의 -592위치 염기를 포함하는 부분 DNA 영역을 특이적으로 증폭하도록 설계된 핵산세트, 또는 핵산 시료중의 인터로이킨 10 유전자의 -592 위치 염기가 C 인 경우에만, 상기 인터로이킨 10 유전자의 -592 위치 염기를 포함하는 부분 DNA 영역을 특이적으로 증폭하도록 설계된 핵산세트.
상기에서는, (1)∼(10) 으로 이루어진 군으로부터 2개 이상의 핵산세트를 선택하여 키트를 구성하고 있지만, (1)∼(10) 중 2개 이상을 임의로 선택하여 군으로 하고, 이러한 군으로부터 2개 이상의 핵산세트를 선택하여 키트를 구성할 수도 있다. 예를 들면, (1), (5), (6), (8), (9) 및 (10)으로 이루어진 군 (후술하는 실시예에 있어서 오즈비가 1 이상의 다형을 해석하기 위한 핵산세트)로부터 2개 이상의 핵산 세트를 선택하여 키트를 구성하거나, (1), (5), (6), (8) 및 (9)로 이루어진 군 (후술하는 실시예에 있어서 오즈비가 상위 5위까지의 다형을 해석하기 위한 핵산세트)으로부터 2개 이상의 핵산 세트를 선택하여 키트를 구성할 수 있다.
하기 (11) 내지 (15)로 이루어진 군으로부터 선택된 2개 이상의 핵산세트를 포함하는 유전자형 검출용 키트:
(11) 핵산 시료 중, 스트로메라이신1 유전자에서 -1171 위치로부터 3'방향으로 A가 5개 연속하여 존재하는 경우에만, 상기 스트로메라이신1 유전자의 상기 배열부분을 포함하는 부분 DNA 영역을 특이적으로 증폭하도록 설계된 핵산세트, 또는 핵산 시료중의 스트로메라이신1 유전자에 있어서 -1171 위치로부터 3'방향으로 A가 6 개 연속하여 존재하는 경우에만, 상기 스트로메라이신1 유전자의 상기 배열부분 을 포함하는 부분 DNA 영역을 특이적으로 증폭하도록 설계된 핵산세트,
(12) 핵산 시료 중, 플라스미노겐 활성화 인자억제제-1 유전자에 있어서 -668 위치로부터 3'방향으로 G가 4개 연속하여 존재하는 경우에만, 플라스미노겐 활성화 인자억제제-1 유전자의 상기 배열부분을 포함하는 부분 DNA 영역을 특이적으로 증폭하도록 설계된 핵산세트, 또는 핵산 시료중의 플라스미노겐 활성화 인자억제제-1 유전자에 있어서 -668 위치로부터 3'방향으로 G가 5개 연속하여 존재하는 경우에만, 상기 플라스미노겐 활성화 인자억제제-1 유전자의 상기 배열부분을 포함하는 부분 DNA 영역을 특이적으로 증폭하도록 설계된 핵산세트,
(13) 핵산 시료 중, 글리코프로테인 Ibα 유전자의 1018 위치 염기가 C 인 경우에만, 상기 글리코프로테인 Ibα 유전자의 1018 위치 염기를 포함하는 부분 DNA 영역을 특이적으로 증폭하도록 설계된 핵산세트, 또는 핵산 시료중의 글리코프로테인 Ibα 유전자의 1018 위치 염기가 T 인 경우에만, 상기 글리코프로테인 Ibα 유전자의 1018 위치 염기를 포함하는 부분 DNA 영역을 특이적으로 증폭하도록 설계된 핵산세트,
(14) 핵산 시료 중, 파라옥소나아제 유전자의 584 위치 염기가 G 인 경우에만, 상기 파라옥소나아제 유전자의 584 위치 염기를 포함하는 부분 DNA 영역을 특이적으로 증폭하도록 설계된 핵산세트, 또는 핵산 시료중의 파라옥소나아제 유전자의 584 위치 염기가 A 인 경우에만, 상기 파라옥소나아제 유전자의 584 위치 염기를 포함하는 부분 DNA 영역을 특이적으로 증폭하도록 설계된 핵산세트, 및
(15) 핵산 시료 중, 아포리포프로테인 E 유전자의 4070 위치 염기가 C 인 경 우에만, 상기 아포리포프로테인 E 유전자의 4070 위치 염기를 포함하는 부분 DNA 영역을 특이적으로 증폭하도록 설계된 핵산세트, 또는 핵산 시료중의 아포리포프로테인 E 유전자의 4070 위치 염기가 T 인 경우에만, 상기 아포리포프로테인 E 유전자의 4070 위치 염기를 포함하는 부분 DNA 영역을 특이적이다 증폭하도록 설계된 핵산세트.
상기에서는, (11)∼(15)로 이루어진 군으로부터 2개 이상의 핵산세트를 선택하여 키트를 구성하고 있지만, (11)∼(15) 중 2개 이상을 임의로 선택하여 군으로 하고, 이러한 군으로부터 2개 이상의 핵산세트를 선택하여 키트를 구성할 수도 있다. 예를 들면, (11), (12), (14) 및 (15)로 이루어진 군 (후술하는 실시예에 있어서 오즈비가 1 이상의 다형을 해석하기 위한 핵산세트)으로부터 2개 이상의 핵산세트를 선택하여 키트를 구성하거나, (11), (12) 및 (15)로 이루어진 군(후술하는 실시예에 있어서 오즈비가 상위3위까지의 다형을 해석하기 위한 핵산세트)으로부터 2개 이상의 핵산세트를 선택하여 키트를 구성할 수 있다.
하기의 핵산세트를 포함하는 유전자형 검출용 키트:
핵산 시료 중, 아포리포프로테인 E 유전자의 4070 위치 염기가 C 인 경우에만, 상기 아포리포프로테인 E 유전자의 4070 위치 염기를 포함하는 부분 DNA 영역을 특이적으로 증폭하도록 설계된 핵산세트, 또는 핵산 시료 중, 아포리포프로테인 E 유전자의 4070 위치 염기가 T 인 경우에만, 상기 아포리포프로테인 E 유전자의 4070 위치 염기를 포함하는 부분 DNA 영역을 특이적으로 증폭하도록 설계된 핵산세 트.
하기 (1)∼(10)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 2개 이상의 핵산세트를 포함하는 유전자형 검출용 키트:
(1) 코넥신 37 유전자의 1019 위치 염기를 포함하는 부분 DNA 영역을 특이적으로 증폭하도록 설계된 핵산세트로서, 1019 위치 염기가 C 인 코넥신 37 유전자에 서 1019 위치 염기를 포함하는 부분 DNA영역에 대하여 특이적으로 하이브리다이즈하는 센스 프라이머 및/또는 1019 위치 염기가 T 인 코넥신 37 유전자에 있어서 1019 위치 염기를 포함하는 부분 DNA영역에 대하여 특이적으로 하이브리다이즈하는 센스 프라이머와, 코넥신 37 유전자의 일부 영역에 대하여 특이적으로 하이브리다이즈하는 안티센스 프라이머와로 이루어지는 핵산세트,
(2) 종양괴사인자α 유전자의 -863 위치 염기를 포함하는 부분 DNA 영역을 특이적으로 증폭하도록 설계된 핵산세트로서, -863 위치 염기가 C 인 종양괴사인자α유전자에서 -863 위치 염기를 포함하는 부분 DNA 영역에 대하여 특이적으로 하이브리다이즈하는 안티센스 프라이머 및/또는 -863 위치 염기가 A 인 종양괴사인자α 유전자에서 -863 위치 염기를 포함하는 부분 DNA 영역에 대하여 특이적으로 하이브리다이즈하는 안티센스 프라이머와, 종양괴사인자α 유전자의 일부 영역에 대하여 특이적으로 하이브리다이즈하는 센스 프라이머로 이루어진 핵산세트,
(3) NADH/NADPH 옥시다제 p22 폭스 유전자의 242 위치 염기를 포함하는 부분 DNA 영역을 특이적으로 증폭하도록 설계된 핵산세트로서, 242 위치 염기가 C 인 NADH/NADPH 옥시다제 p22 폭스유전자에 있어서 -863 위치 염기를 포함하는 부분 DNA영역에 대하여 특이적으로 하이브리다이즈하는 안티센스 프라이머 및/또는 242 위치 염기가 T 인 NADH/NADPH 옥시다제 p22 폭스유전자에 있어서 242 위치염기를 포함하는 부분 DNA영역에 대하여 특이적으로 하이브리다이즈하는 안티센스 프라이머와, NADH/NADPH 옥시다제 p22 폭스유전자의 일부 영역에 대하여 특이적으로 하이브리다이즈하는 센스 프라이머로 이루어진 핵산세트,
(4) 안지오텐시노겐 유전자의 -6 위치 염기를 포함하는 부분 DNA 영역을 특이적으로 증폭하도록 설계된 핵산세트로서, -6 위치 염기가 G 인 안지오텐시노겐 유전자에 있어, -6 위치 염기를 포함하는 부분 DNA영역에 대하여 특이적으로 하이브리다이즈하는 안티센스 프라이머 및/또는 -6 위치 염기가 A 인 안지오텐시노겐 유전자에 있어서 -6 위치 염기를 포함하는 부분 DNA영역에 대하여 특이적으로 하이브리다이즈하는 안티센스 프라이머와, 안지오텐시노겐 유전자의 일부 영역에 대하여 특이적으로 하이브리다이즈하는 센스 프라이머로 이루어진 핵산세트,
(5) 아포리포프로테인 E 유전자의 -219 위치 염기를 포함하는 부분 DNA 영역을 특이적으로 증폭하도록 설계된 핵산세트로서, -219 위치 염기가 G 인 아포리포프로테인 E 유전자에 있어서 -219 위치 염기를 포함하는 부분 DNA 영역에 대하여 특이적으로 하이브리다이즈하는 센스 프라이머 및/또는 -219 위치 염기가 T 인 아포리포프로테인 E 유전자에 있어서 -219 위치 염기를 포함하는 부분 DNA 영역에 대하여 특이적으로 하이브리다이즈하는 센스 프라이머와, 아포리포프로테인 E 유전자의 일부 영역에 대하여 특이적으로 하이브리다이즈하는 안티센스 프라이머로 이루 어진 핵산세트,
(6) 혈소판 활성화 인자 아세틸 하이드롤라제 유전자의 994 위치 염기를 포함하는 부분 DNA 영역을 특이적으로 증폭하도록 설계된 핵산세트로서, 994 위치 염기가 G 인 혈소판 활성화 인자 아세틸하이드롤라제 유전자에 있어서 994 위치 염기를 포함하는 부분 DNA 영역에 대하여 특이적으로 하이브리다이즈하는 센스 프라이머 및/또는 994 위치 염기가 T 인 혈소판 활성화 인자 아세틸 하이드롤라제 유전자에 있어 994 위치 염기를 포함하는 부분 DNA영역에 대하여 특이적으로 하이브리다이즈하는 센스 프라이머와, 혈소판 활성화 인자 아세틸 하이드롤라제 유전자의 일부 영역에 대하여 특이적으로 하이브리다이즈하는 안티센스 프라이머로 이루어진 핵산세트,
(7) 아포리포프로테인 C-III 유전자의 -482 위치 염기를 포함하는 부분 DNA 영역을 특이적으로 증폭하도록 설계된 핵산세트로서, -482 위치 염기가 C 인 아포리포프로테인 C-III 유전자에 있어서 -482 위치 염기를 포함하는 부분 DNA 영역에 대하여 특이적으로 하이브리다이즈하는 센스 프라이머 및/또는 -482 위치 염기가 T 인 아포리포프로테인 C-III 유전자에 있어서 -482 위치 염기를 포함하는 부분 DNA영역에 대하여 특이적으로 하이브리다이즈하는 센스 프라이머와, 아포리포프로테인 C-III 유전자의 일부 영역에 대하여 특이적으로 하이브리다이즈하는 안티센스 프라이머로 이루어진 핵산세트,
(8) 트롬보스폰딘 4 유전자의 1186 위치 염기를 포함하는 부분 DNA 영역을 특이적으로 증폭하도록 설계된 핵산세트로서, 1186 위치 염기가 G 인 트롬보스폰딘 4유전자에 있어, 1186 위치 염기를 포함하는 부분 DNA영역에 대하여 특이적으로 하이브리다이즈하는 센스 프라이머 및/또는 1186 위치 염기가 C 인 트롬보스폰딘 4 유전자에 있어 1186 위치 염기를 포함하는 부분 DNA영역에 대하여 특이적으로 하이브리다이즈하는 센스 프라이머와, 트롬보스폰딘 4유전자의 일부 영역에 대하여 특이적으로 하이브리다이즈하는 안티센스 프라이머로 이루어진 핵산세트,
(9) 인터로이킨 10 유전자의 -819 위치 염기를 포함하는 부분 DNA 영역을 특이적으로 증폭하도록 설계된 핵산세트로서, -819 위치 염기가 T 인 인터로이킨 10 유전자에 있어서 -819 위치 염기를 포함하는 부분 DNA영역에 대하여 특이적으로 하이브리다이즈하는 센스 프라이머 및/또는 1186 위치 염기가 C 인 인터로이킨 10 유전자에 있어서 -819 위치 염기를 포함하는 부분 DNA영역에 대하여 특이적으로 하이브리다이즈하는 센스 프라이머와, 인터로이킨 10 유전자의 일부 영역에 대하여 특이적으로 하이브리다이즈하는 안티센스 프라이머로 이루어지는 핵산세트, 및
(10) 인터로이킨 10 유전자의 -592 위치 염기를 포함하는 부분 DNA 영역을 특이적으로 증폭하도록 설계된 핵산세트로서, -592 위치 염기가 A 인 인터로이킨 10 유전자에 있어서 -592 위치 염기를 포함하는 부분 DNA영역에 대하여 특이적으로 하이브리다이즈하는 안티센스 프라이머 및/또는 -592 위치 염기가 C 인 인터로이킨 10 유전자에 있어서 -592 위치 염기를 포함하는 부분 DNA영역에 대하여 특이적으로 하이브리다이즈하는 안티센스 프라이머와, 인터로이킨 10 유전자의 일부 영역에 대하여 특이적으로 하이브리다이즈하는 센스 프라이머로 이루어지는 핵산세트.
상기의 경우, (1)∼(10)으로 이루어진 군으로부터 2개 이상의 핵산세트를 선 택하여 키트를 구성하고 있지만, (1)∼(10)의 2개 이상을 임의로 선택하여 군으로 하고, 이러한 군으로부터 2개 이상의 핵산세트를 선택하여 키트를 구성할 수도 있다. 예를 들면, (1), (5), (6), (8), (9) 및 (10)으로 이루어진 군(후술하는 실시예에 있어서 오즈비가 1 이상의 다형을 해석하기 위한 핵산세트)으로부터 2개 이상의 핵산세트를 선택하여 키트를 구성하거나, (1), (5), (6), (8) 및 (9)로 이루어진 군(후술하는 실시예에 있어서 오즈비가 상위 5위까지의 다형을 해석하기 위한 핵산세트)보다 2개 이상의 핵산세트를 선택하여 키트를 구성할 수 있다.
하기 (11)∼(15)로 이루어진 군으로부터 선택되는 2개 이상의 핵산세트를 포함하는 유전자형 검출용 키트:
(11) 스트로메라이신1 유전자의 -1171 위치에서의 다형부분을 포함하는 부분 DNA 영역을 특이적으로 증폭하도록 설계된 핵산세트로서, -1171 위치로부터 3'방향으로 A가 5개 연속하여 존재하는 스트로메라이신1 유전자에 있어 상기 배열부분을 포함하는 부분 DNA영역에 대하여 특이적으로 하이브리다이즈하는 센스 프라이머 및/또는 -1171 위치로부터 3' 방향으로 A가 6개 연속하여 존재하는 스트로메라이신1 유전자에 있어 상기 배열부분을 포함하는 부분 DNA영역에 대하여 특이적으로 하이브리다이즈하는 센스 프라이머와, 스트로메라이신1 유전자의 일부 영역에 대하여 특이적으로 하이브리다이즈하는 안티센스 프라이머로 이루어지는 핵산세트,
(12) 플라스미노겐 활성화 인자억제제-1 유전자의 -668 위치에서의 다형부분을 포함하는 부분 DNA 영역을 특이적으로 증폭하도록 설계된 한 조(一組)의 프라이 머와, 및 -668 위치로부터 3' 방향으로 G가 4개 연속하여 존재하는 플라스미노겐 활성화 인자억제제-1 유전자에 있어 상기 배열부분을 포함하는 부분 DNA영역에 대하여 특이적으로 하이브리다이즈하는 프로브 및/또는 -668 위치로부터 3'방향으로 G가 5개 연속하여 존재하는 플라스미노겐 활성화 인자억제제-1 유전자에 있어서 상기 배열부분을 포함하는 부분 DNA영역에 대하여 특이적으로 하이브리다이즈하는 프로브로 이루어지는 핵산세트,
(13) 글리코프로테인 Ibα 유전자의 1018 위치 염기를 포함하는 부분 DNA 영역을 특이적으로 증폭하도록 설계된 핵산세트로서, 1018 위치 염기가 C 인 글리코프로테인 Ibα 유전자에 있어서 1018 위치 염기를 포함하는 부분 DNA영역에 대하여 특이적으로 하이브리다이즈하는 센스 프라이머 및/또는 1018 위치 염기가 T 인 글리코프로테인 Ibα 유전자에 있어서 1018 위치 염기를 포함하는 부분 DNA영역에 대하여 특이적으로 하이브리다이즈하는 센스 프라이머와, 글리코프로테인 Ibα 유전자의 일부 영역에 대하여 특이적으로 하이브리다이즈하는 안티센스 프라이머로 이루어지는 핵산세트,
(14) 파라옥소나아제 유전자의 584 위치 염기를 포함하는 부분 DNA 영역을 특이적으로 증폭하도록 설계된 핵산세트로서, 584 위치 염기가 G 인 파라옥소나아제 유전자에 있어 584 위치 염기를 포함하는 부분 DNA 영역에 대하여 특이적으로 하이브리다이즈하는 센스 프라이머 및/또는 584 위치 염기가 A 인 파라옥소나아제 유전자에 있어서 584 위치 염기를 포함하는 부분 DNA 영역에 대하여 특이적으로 하이브리다이즈하는 센스 프라이머와, 파라옥소나아제 유전자의 일부 영역에 대하여 특이적으로 하이브리다이즈하는 안티센스 프라이머로 이루어지는 핵산세트, 및
(15) 아포리포프로테인 E 유전자의 4070 위치 염기를 포함하는 부분 DNA 영역을 특이적으로 증폭하도록 설계된 핵산세트로서, 4070 위치 염기가 C 인 아포리포프로테인 E 유전자에 있어서 4070 위치 염기를 포함하는 부분 DNA영역에 대하여 특이적으로 하이브리다이즈하는 센스 프라이머 및/또는 4070 위치 염기가 T 인 아포리포프로테인 E 유전자에 있어서 4070 위치 염기를 포함하는 부분 DNA영역에 대하여 특이적으로 하이브리다이즈하는 센스 프라이머와, 아포리포프로테인 E 유전자의 일부 영역에 대하여 특이적으로 하이브리다이즈하는 안티센스 프라이머로 이루어지는 핵산세트.
상기의 경우, (11)∼(15)로 이루어진 군으로부터 2개 이상의 핵산세트를 선택하여 키트를 구성하고 있지만, (11)∼(15) 중 2개 이상을 임의로 선택하여 군으로 하고, 이러한 군으로부터 2개 이상의 핵산세트를 선택하여 키트를 구성할 수도 있다. 예를 들면, (11), (12), (14) 및 (15)로 이루어진 군(후술하는 실시예에 있어서 오즈비가 1 이상의 다형을 해석하기 위한 핵산세트)으로부터 2개 이상의 핵산세트를 선택하여 키트를 구성하거나, (11), (12) 및 (15)로 이루어진 군 (후술하는 실시예에 있어서 오즈비가 상위3위까지의 다형을 해석하기 위한 핵산세트)으로부터 2개 이상의 핵산세트를 선택하여 키트를 구성할 수 있다.
하기의 핵산세트를 포함하는 유전자형 검출용 키트:
아포리포프로테인 E 유전자의 4070 위치염기를 포함하는 부분 DNA 영역을 특 이적으로 증폭하도록 설계된 핵산세트로서, 4070 위치염기가 C 인 아포리포프로테인 E 유전자에 있어서 4070 위치염기를 포함하는 부분 DNA 영역에 대하여 특이적으로 하이브리다이즈하는 센스 프라이머 및/또는 4070 위치염기가 T 인 아포리포프로테인 E 유전자에 있어서 4070 위치 염기를 포함하는 부분 DNA영역에 대하여 특이적으로 하이브리다이즈하는 센스 프라이머와, 아포리포프로테인 E 유전자의 일부 영역에 대하여 특이적으로 하이브리다이즈하는 안티센스 프라이머로 이루어지는 핵산세트.
하기 (1) 내지 (10)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 2개 이상의 핵산세트를 포함하는 유전자형 검출용 키트:
(1) 1019 위치 염기가 C 인 코넥신 37 유전자의 안티센스 사슬에 있어서 1019 위치 염기에 대응하는 염기를 포함하는 부분영역에 대하여 특이적으로 하이브리다이즈하고 제 1 표식 물질로 표식된 제 1 핵산, 1019 위치 염기가 T 인 코넥신 37 유전자의 안티센스 사슬에 있어서 1019 위치 염기에 대응하는 염기를 포함하는 부분 영역에 대하여 특이적으로 하이브리다이즈하고 제 2 표식물질로 표식된 제 2 핵산, 및 코넥신 37 유전자의 센스 사슬의 일부 영역에 대하여 특이적으로 하이브리다이즈하고 상기 제 1 핵산 /또는 상기 제 2 핵산과 함께 사용되어 코넥신 37 유전자의 1019 위치 염기를 포함하는 부분 DNA 영역을 특이적으로 증폭하는 것이 가능한 제 3 핵산으로 이루어지는 핵산세트,
(2) -863 위치 염기가 C 인 종양괴사인자α 유전자의 센스사슬에 있어서 -863 위치 염기를 포함하는 부분영역에 대하여 특이적으로 하이브리다이즈하고 제 1 표식물질로 표식된 제 1 핵산, -863 위치 염기가 A 인 종양괴사인자α 유전자의 센스 사슬에 있어서 -863 위치 염기를 포함하는 부분영역에 대하여 특이적으로 하이브리다이즈하고 제 2 표식물질로 표식된 제 2 핵산, 및 종양괴사인자α 유전자의 안티 센스사슬의 일부 영역에 대하여 특이적으로 하이브리다이즈하고 상기 제 1 핵산 /또는 상기 제 2 핵산과 함께 사용되어 종양괴사인자α 유전자의 -863 위치 염기를 포함하는 부분 DNA 영역을 특이적으로 증폭하는 것이 가능한 제 3 핵산으로 이루어지는 핵산세트,
(3) 242 위치 염기가 C 인 NADH/NADPH 옥시다제 p22 폭스 유전자의 센스사슬에 있어서 242 위치 염기를 포함하는 부분영역에 대하여 특이적으로 하이브리다이즈하고 제 1 표식물질로 표식된 제 1 핵산, 242 위치 염기가 T 인 NADH/NADPH 옥시다제 p22 폭스 유전자의 센스사슬에 있어서 242 위치 염기를 포함하는 부분영역에 대하여 특이적으로 하이브리다이즈하고 제 2 표식물질로 표식된 제 2 핵산, 및 NADH/NADPH 옥시다제 p22 폭스 유전자의 안티센스사슬의 일부 영역에 대하여 특이적으로 하이브리다이즈하고 상기 제 1 핵산 /또는 상기 제 2 핵산과 함께 사용되어 NADH/NADPH 옥시다제 p22 폭스유전자의 242 위치 염기를 포함하는 부분 DNA 영역을 특이적으로 증폭하는 것이 가능한 제 3 핵산으로 이루어지는 핵산세트,
(4) -6 위치 염기가 G 인 안지오텐시노겐 유전자의 센스사슬에 있어서 -6 위치 염기를 포함하는 부분영역에 대하여 특이적으로 하이브리다이즈하고 제 1 표식물질로 표식된 제 1 핵산, -6 위치 염기가 A 인 안지오텐시노겐 유전자의 센스사슬 에 있어 -6 위치염기를 포함하는 부분영역에 대하여 특이적으로 하이브리다이즈하고 제 2 표식물질로 표식된 제 2 핵산, 및 안지오텐시노겐 유전자의 안티센스사슬의 일부 영역에 대하여 특이적으로 하이브리다이즈하고 상기 제 1 핵산 /또는 상기 제 2 핵산과 함께 사용되어 안지오텐시노겐 유전자의 -6 위치 염기를 포함하는 부분 DNA 영역을 특이적으로 증폭하는 것이 가능한 제 3 핵산으로 이루어지는 핵산세트,
(5) -219 위치 염기가 G 인 아포리포프로테인 E 유전자의 안티센스 사슬에 있어서 -219 위치 염기에 대응하는 염기를 포함하는 부분영역에 대하여 특이적으로 하이브리다이즈하고 제 1 표식물질로 표식된 제 1 핵산, -219 위치 염기가 T 인 아포리포프로테인 E 유전자의 안티센스사슬에 있어서 -219 위치 염기에 대응하는 염기를 포함하는 부분영역에 대하여 특이적으로 하이브리다이즈하고 제 2 표식물질로 표식된 제 2 핵산, 및 아포리포프로테인 E 유전자의 센스사슬의 일부 영역에 대하여 특이적으로 하이브리다이즈하고 상기 제 1 핵산 /또는 상기 제 2 핵산과 함께 사용되어 아포리포프로테인 E 유전자의 -219 위치 염기를 포함하는 부분 DNA 영역을 특이적으로 증폭하는 것이 가능한 제 3 핵산으로 이루어지는 핵산세트,
(6) 994 위치 염기가 G 인 혈소판 활성화 인자 아세틸 하이드롤라제 유전자의 안티센스사슬에 있어서 994 위치 염기에 대응하는 염기를 포함하는 부분영역에 대하여 특이적으로 하이브리다이즈하고 제 1 표식물질로 표식된 제 1 핵산, 994 위치 염기가 T 인 혈소판 활성화 인자 아세틸 하이드롤라제 유전자의 안티센스사슬에 있어서 994위치 염기에 대응하는 염기를 포함하는 부분영역에 대하여 특이적으로 하이브리다이즈하고 제 2 표식물질로 표식된 제 2 핵산, 및 혈소판 활성화 인자 아세틸 하이드롤라제 유전자의 센스사슬의 일부 영역에 대하여 특이적으로 하이브리다이즈하고 상기 제 1 핵산 /또는 상기 제 2 핵산과 함께 사용되어 혈소판 활성화 인자 아세틸 하이드롤라제 유전자의 994 위치 염기를 포함하는 부분 DNA 영역을 특이적으로 증폭하는 것이 가능한 제 3 핵산으로 이루어지는 핵산세트,
(7) -482 위치 염기가 C 인 아포리포프로테인 C-III 유전자의 안티센스 사슬에 있어서 -482 위치 염기에 대응하는 염기를 포함하는 부분영역에 대하여 특이적으로 하이브리다이즈하는 제 1 핵산, -482 위치 염기가 T 인 아포리포프로테인 C-III 유전자의 안티센스 사슬에 있어서 -482위치 염기에 대응하는 염기를 포함하는 부분영역에 대하여 특이적으로 하이브리다이즈하는 제 2 핵산, 아포리포프로테인 C-III 유전자의 센스 사슬의 일부 영역에 대하여 특이적으로 하이브리다이즈하고 상기 제 1 핵산 /또는 상기 제 2 핵산과 함께 사용되어 아포리포프로테인 C-III 유전자의 -482 위치 염기를 포함하는 부분 DNA 영역을 특이적으로 증폭하는 것이 가능한 제 3 핵산, 상기 제 1 핵산 및 상기 제 3 핵산을 이용하여 증폭된 핵산에 대하여 특이적으로 하이브리다이즈하는 제 4 핵산, 및 상기 제 2 핵산과 상기 제 3 핵산을 이용하여 증폭된 핵산에 대하여 특이적으로 하이브리다이즈하는 제5핵산으로 이루어지는 핵산세트,
(8) 1186 위치 염기가 G 인 트롬보스폰딘 4 유전자의 안티센스 사슬에 있어서 1186 위치 염기에 대응하는 염기를 포함하는 부분영역에 대하여 특이적으로 하이브리다이즈하고 제 1 표식물질로 표식된 제 1 핵산, 1186 위치 염기가 C 인 트롬 보스폰딘 4 유전자의 안티센스 사슬에 있어서 1186 위치 염기에 대응하는 염기를 포함하는 부분 영역에 대하여 특이적으로 하이브리다이즈하고 제 2 표식물질로 표식된 제 2 핵산, 및 트롬보스폰딘 4 유전자의 센스 사슬의 일부 영역에 대하여 특이적으로 하이브리다이즈하고 상기 제 1 핵산 /또는 상기 제 2 핵산과 동시에 사용되어 트롬보스폰딘 4 유전자의 1186 위치 염기를 포함하는 부분 DNA 영역을 특이적으로 증폭하는 것이 가능한 제 3 핵산으로 이루어지는 핵산세트,
(9) -819 위치 염기가 T 인 인터로이킨 10 유전자의 안티센스 사슬에 있어서 -819 위치 염기에 대응하는 염기를 포함하는 부분영역에 대하여 특이적으로 하이브리다이즈하는 제 1 핵산, -819 위치 염기가 C 인 인터로이킨 10 유전자의 안티센스 사슬에 있어서 -819 위치 염기에 대응하는 염기를 포함하는 부분영역에 대하여 특이적으로 하이브리다이즈하는 제 2 핵산, 인터로이킨 10 유전자의 센스 사슬의 일부 영역에 대하여 특이적으로 하이브리다이즈하고 상기 제 1 핵산 /또는 상기 제 2 핵산과 함께 사용되어 인터로이킨 10 유전자의 -819 위치 염기를 포함하는 부분 DNA 영역을 특이적으로 증폭하는 것이 가능한 제 3 핵산, 상기 제 1 핵산 및 상기 제 3 핵산을 이용하여 증폭된 핵산에 대하여 특이적으로 하이브리다이즈하는 제 4 핵산, 및 상기 제 2 핵산 및 상기 제 3 핵산을 이용하여 증폭된 핵산에 대하여 특이적으로 하이브리다이즈하는 제 5 핵산으로 이루어지는 핵산세트, 및
(10) -592 위치 염기가 A 인 인터로이킨 10 유전자의 센스 사슬에 있어서 -592 위치 염기를 포함하는 부분영역에 대하여 특이적으로 하이브리다이즈하고 제 1 표식물질로 표식된 제 1 핵산, -592 위치 염기가 C 인 인터로이킨 10 유전자의 센스 사슬에 있어서 -592위치 염기를 포함하는 부분영역에 대하여 특이적으로 하이브리다이즈하고 제 2 표식물질로 표식된 제 2 핵산 및, 인터로이킨 10 유전자의 안티센스 사슬의 일부 영역에 대하여 특이적으로 하이브리다이즈하고 상기 제 1 핵산 /또는 상기 제 2 핵산과 동시에 사용되어 인터로이킨 10 유전자의 -592 위치 염기를 포함하는 부분 DNA 영역을 특이적으로 증폭하는 것이 가능한 제 3 핵산으로 이루어지는 핵산세트.
상기의 경우, (1)∼(10)으로 이루어진 군으로부터 2개 이상의 핵산세트를 선택하여 키트를 구성하고 있지만, (1)∼(10)의 2개 이상을 임의로 선택하여 군으로 하고, 이러한 군으로부터 2개 이상의 핵산세트를 선택하여 키트를 구성할 수도 있다. 예를 들면, (1), (5), (6), (8), (9) 및 (10)으로 이루어진 군(후술하는 실시예에 있어서 오즈비가 1 이상의 다형을 해석하기 위한 핵산세트)으로부터 2개 이상의 핵산세트를 선택하여 키트를 구성하거나, (1), (5), (6), (8) 및 (9)로 이루어진 군(후술하는 실시예에 있어서 오즈비가 상위 5위까지의 다형을 해석하기 위한 핵산세트)으로부터 2개 이상의 핵산세트를 선택하여 키트를 구성할 수 있다.
하기 (11)∼(15)로 이루어진 군으로부터 선택되는 2개 이상의 핵산세트를 포함하는 유전자형 검출용 키트:
(11) -1171 위치로부터 3' 방향으로 A가 5개 연속하여 존재하는 스트로메라이신1 유전자의 안티센스 사슬에 있어서 상기 배열 부분에 대응하는 배열을 포함하는 부분영역에 대하여 특이적으로 하이브리다이즈하고 제 1 표식물질로 표식된 제 1 핵산, -1171 위치로부터 3' 방향으로 A가 6개 연속하여 존재하는 스트로메라이신1 유전자의 안티센스 사슬에 있어서 상기 배열부분에 대응하는 배열을 포함하는 부분영역에 대하여 특이적으로 하이브리다이즈하고 제 2 표식물질로 표식된 제 2 핵산, 및 스트로메라이신1 유전자의 센스 사슬의 일부 영역에 대하여 특이적으로 하이브리다이즈하고 상기 제 1 핵산 /또는 상기 제 2 핵산과 함께 사용되어 스트로메라이신1 유전자의 -1171 위치에서의 다형부분을 포함하는 부분 DNA 영역을 특이적으로 증폭하는 것이 가능한 제 3 핵산으로 이루어지는 핵산세트,
(12) 플라스미노겐 활성화 인자억제제-1 유전자의 -668 위치에서 다형부분을 포함하는 부분 DNA 영역을 특이적으로 증폭하도록 설계된 한 조(一組)의 핵산 (제 1 핵산 및 제 2 핵산), -668 위치로부터 3' 방향으로 G가 4개 연속하여 존재하는 플라스미노겐 활성화 인자억제제-1 유전자를 주형으로 하고 상기 한 조의 핵산을 이용하여 증폭된 핵산에 대하여 특이적으로 하이브리다이즈하는 제 3 핵산, 및 -668 위치로부터 3' 방향으로 G가 5개 연속하여 존재하는 플라스미노겐 활성화 인자억제제-1 유전자를 주형으로 하고 상기 한 조의 핵산을 이용하여 증폭되는 핵산에 대하여 특이적으로 하이브리다이즈하는 제 4 핵산으로 이루어지는 핵산세트,
(13) 1018 위치 염기가 C 인 글리코프로테인 Ibα 유전자의 안티센스 사슬에 있어서 1018 위치 염기에 대응하는 염기를 포함하는 부분 영역에 대하여 특이적으로 하이브리다이즈하고 제 1 표식물질로 표식된 제 1 핵산, 1018 위치 염기가 T 인 글리코프로테인 Ibα 유전자의 안티센스 사슬에 있어서 1018 위치 염기에 대응하는 염기를 포함하는 부분영역에 대하여 특이적으로 하이브리다이즈하고 제 2 표식물질 로 표식된 제 2 핵산 및, 글리코프로테인 Ibα 유전자의 센스 사슬의 일부 영역에 대하여 특이적으로 하이브리다이즈하고 상기 제 1 핵산 /또는 상기 제 2 핵산과 함께 사용되어 글리코프로테인 Ibα 유전자의 1018 위치 염기를 포함하는 부분 DNA 영역을 특이적으로 증폭하는 것이 가능한 제 3 핵산으로 이루어지는 핵산세트,
(14) 584 위치 염기가 G 인 파라옥소나아제 유전자의 안티센스 사슬에 있어서 584 위치 염기에 대응하는 염기를 포함하는 부분영역에 대하여 특이적으로 하이브리다이즈하고 제 1 표식물질로 표식된 제 1 핵산, 584 위치 염기가 A 인 파라옥소나아제 유전자의 안티센스 사슬에 있어서 584 위치 염기에 대응하는 염기를 포함하는 부분영역에 대하여 특이적으로 하이브리다이즈하고 제 2 표식물질로 표식된 제 2 핵산, 및 파라옥소나아제 유전자의 센스 사슬의 일부 영역에 대하여 특이적으로 하이브리다이즈하고 상기 제 1 핵산 /또는 상기 제 2 핵산과 동시에 사용되어 파라옥소나아제 유전자의 584 위치 염기를 포함하는 부분 DNA 영역을 특이적으로 증폭하는 것이 가능한 제 3 핵산으로 이루어지는 핵산세트, 및
(15) 4070 위치 염기가 C 인 아포리포프로테인 E 유전자의 안티센스 사슬에 있어서 4070 위치 염기에 대응하는 염기를 포함하는 부분영역에 대하여 특이적으로 하이브리다이즈하고 제 1 표식물질로 표식된 제 1 핵산, 4070 위치 염기가 T 인 아포리포프로테인 E 유전자의 안티센스 사슬에 있어서 4070 위치 염기에 대응하는 염기를 포함하는 부분영역에 대하여 특이적으로 하이브리다이즈하고 제 2 표식물질로 표식된 제 2 핵산, 및 아포리포프로테인 E 유전자의 센스 사슬의 일부 영역에 대하여 특이적으로 하이브리다이즈하고 상기 제 1 핵산 /또는 상기 제 2 핵산과 동시에 사용되어 아포리포프로테인 E 유전자의 4070 위치 염기를 포함하는 부분 DNA 영역을 특이적으로 증폭하는 것이 가능한 제 3 핵산으로 이루어지는 핵산세트.
상기의 경우, (11)∼(15)로 이루어진 군으로부터 2개 이상의 핵산세트를 선택하여 키트를 구성하고 있지만, (11)∼(15)의 2개 이상을 임의로 선택하여 군으로 하고, 이러한 군으로부터 2개 이상의 핵산세트를 선택하여 키트를 구성할 수도 있다. 예를 들면, (11), (12), (14) 및 (15)로 이루어진 군(후술하는 실시예에 있어서 오즈비가 1 이상의 다형을 해석하기 위한 핵산세트)으로부터 2개 이상의 핵산세트를 선택하여 키트를 구성하거나, (11), (12) 및 (15)로 이루어진 군 (후술하는 실시예에 있어서 오즈비가 상위3위까지의 다형을 해석하기 위한 핵산세트)으로부터 2개 이상의 핵산세트를 선택하여 키트를 구성할 수 있다.
이하의 핵산세트를 포함하는 유전자형 검출용 키트:
4070 위치 염기가 C 인 아포리포프로테인 E 유전자의 안티센스 사슬에 있어서 4070 위치 염기에 대응하는 염기를 포함하는 부분영역에 대하여 특이적으로 하이브리다이즈하고 제 1 표식물질로 표식된 제 1 핵산, 4070 위치 염기가 T 인 아포리포프로테인 E 유전자의 안티센스 사슬에 있어서 4070 위치 염기에 대응하는 염기를 포함하는 부분영역에 대하여 특이적으로 하이브리다이즈하고 제 2 표식물질로 표식된 제 2 핵산, 및 아포리포프로테인 E 유전자의 센스 사슬의 일부 영역에 대하여 특이적으로 하이브리다이즈하고 상기 제 1 핵산 /또는 상기 제 2 핵산과 동시에 사용되고 아포리포프로테인 E 유전자의 4070 위치 염기를 포함하는 부분 DNA 영역 을 특이적으로 증폭하는 것이 가능한 제 3 핵산으로 이루어지는 핵산세트.
전술한 키트의 경우, 키트의 사용 방법에 따라 1 또는 2 이상의 시약 (버퍼, 반응용 시약, 검출용 시약 등) 등을 조합하여도 무방하다.
도 1은, 실시예에서의 스크리닝 관련해석에서 검토한 112개 유전자 다형을 정리한 표이다.
도 2는, 마찬가지로, 실시예에서의 스크리닝 관련해석에서 검토한 112개 유전자다형을 정리한 표이다.
도 3는, 실시예에 있어, 유전자형을 결정하기 위해 사용된 프라이머 (위로부터, 순차로 배열번호 30, 31, 32, 21, 22, 23, 15, 16, 17, 24, 25, 26, 18, 19, 20, 33, 34, 35, 42, 43, 44), 프로브 (위로부터 순차로 배열번호 59, 60) 및 기타 조건을 통합한 표이다. 도면 중, FITC은 플루오레세인 이소티오시아네이트를, TxR는 텍사스 레드를 각각 나타낸다.
도 4는, 동일하게, 실시예에 있어 유전자형을 결정하기 위해 사용된 프라이머 (위로부터 순차로 배열번호 27, 28, 29, 39, 40, 41, 36, 37, 38, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 48, 49, 45, 46, 47, 50, 51, 52), 프로브 (위로부터 순차로 배열번호61, 62, 63, 64) 및 기타 조건을 정리한 표이다. 도면 중, FITC은 플루오레세인 이소티오시아네이트를, TxR는 텍사스 레드를 각각 나타낸다.
도 5는, 실시예의 스크리닝 관련해석에서 대상 909 사례의 배경을 통합한 표이다. 연령과 신체질량지수(BMI: Body mass index)의 데이터는 평균±표준편차로 나타내었다. 표 중에서, *1은 P= 0.0278 (대조군 대비: versus controls)을, *2는 P<0.0001 (대조군 대비)를 각각 나타낸다.
도 6은, 실시예의 스크리닝 관련해석에 있어 심근경색과의 관련이 인지된 유전자 다형을 통합한 표이다.
도 7는, 실시예에 있어 관련해석의 전체 대상 5061명 사례의 배경을 정리한 표이다. 연령과 신체질량지수(BMI)의 데이터는 평균±표준편차로 나타내었다. 표 중, *1은 P = 0.022을, *2는 P<0.001을, *3은 P= 0.017을 각각 나타낸다.
도 8는, 실시예에 있어 관련해석의 전체 대상 5061 사례에 있어서 심근 경색과의 관련이 인지된 유전자 다형의 유전자형 분포를 정리한 표이다.
도 9는, 실시예에 있어, 관련해석의 전체 대상 5061 사례에서의 유전자 다형과 심근경색의 다인자 로지스틱 회귀분석의 결과를 나타내는 표이다. 표 중, OR는 오즈비를, CI는 신뢰구간을 각각 나타낸다.
도 10은, 심근경색과 관련이 있는 유전자 다형에서의 다인자 로지스틱 회귀분석의 단계별 변수 선택법의 결과를 나타내는 표이다. 표 중, CI는 신뢰구간을 나타낸다.
도 11은, 남성에 있어, 5개의 조합 유전자 다형을 이용한 심근경색의 유전적 리스크 (발증 리스크) 진단의 결과를 나타내는 표이다.
도 12는, 여성에 있어, 5개의 조합 유전자 다형을 이용한 심근경색의 유전적 리스크 (발증 리스크)진단의 결과를 나타내는 표이다.
도 13은, 조합시킨 유전자 다형의 수와, 심근경색 이환(罹患)의 오즈비의 관계를 나타내는 그래프이다. 여기서, (A)는 남성을 대상으로 한 경우이고, (B)는 여성을 대상으로 한 경우이다.
이하, 실시예를 이용하여 본 발명을 보다 상세하게 설명한다.
실시예 1: 유전자 다형의 선택
PubMed [National Center for Biological Information(NCBI)], Online Mendelian inheritance in Men (NCBI), Single Nucleotide Polymorphism (NCBI) 등의 수 종류의 공적 데이터 베이스를 이용하여, 지금까지 보고된 유전자 중에서, 혈관 생물학, 혈소판·백혈구 생물학, 응고선용계, 지질·당·기타 대사인자 등의 종합적 측면에서 관동맥경화, 관동맥 연축, 고혈압, 당뇨병, 고지혈증 등으로의 관련이 추정되는 71개의 유전자를 발췌하였다. 나아가, 이들 유전자에 존재하는 다형 중에서 프로모터 영역 또는 엑손에 존재하는 것, 또는 스플라이스 도너(splice doner) 부위 또는 억셉터 (acceptor) 부위에 위치하고, 유전자 산물의 기능 변화와의 관련이 예상되는 것을 중심으로 112개의 다형을 선택하였다(도 1 및 도 2).
실시예 2: 유전자 다형의 결정
대상은 일본인 남녀 5061명의 예 (남성 3309명의 예, 여성 1752명의 예)로 서, 1994년 7월에서 2001년 12월의 사이에 153개의 캐나다 시설에서 외래 진찰을 받거나 혹은 입원한 증례(症例)이다. 심근경색은 2819명의 예 (남성 2003명의 예, 여성 816명의 예)에 있어, 모든 경우, 관동맥 조영 및 좌실(左室) 조영을 수행했다. 심근경색의 진단은 전형적인 심전도 변화 및 혈청 CK, GOT, LDH의 상승에 의해 수행하였다. 또 좌실조영에 의한 벽운동 이상 및 그것에 대응하는 좌주간(左主幹)동맥 또는 주요한 관동맥의 협착에 의해 심근경색의 확정진단을 행했다.
대조군은, 남녀 2242명의 예(남성 1306명의 예, 여성 936명의 예)로서, 참가 시설에서 진료를 받고, 관동맥 질환의 종래의 위험인자, 즉 흡연(하루 10가치 이상), 비만[신체질량지수(body mass index)≥26kg/㎡], 고혈압(수축기 혈압≥140mmHg 이거나, 확장기 혈압≥ 90mmHg 이거나, 혹은 이들 모두에 해당), 당뇨병(공복 시 혈당≥ 126mg/dL 이거나 헤모글로빈 A1c≥ 6.5% 이거나, 혹은 이들 모두에 해당), 고지혈증(혈청 총콜레스테롤≥ 220mg/dL), 고 요산(尿酸) 혈증 (남성의 경우, 혈청요산≥ 7.7mg/dL, 여성의 경우, 혈청 요산≥ 5.5mg/dL) 중 적어도 하나의 질환을 갖지만 관동맥 질환은 갖지 않는 증례이다. 이들 대조군은 안정 상태에서 심전도가 정상이며, 운동부하시험에서도 심근 허혈성 변화는 인지되지 않았다.
각각의 대상으로부터 정맥혈 7mL를 50mmol/L EDTA-2Na를 포함하는 튜브에 채혈하고, DNA 추출키트 (Qiagen, Chatsworth, CA)를 이용하여 게놈 DNA를 추출했다. 71개의 후보 유전자의 112개 다형의 결정은 형광·발광법에 의한 대립 유전자 특이적 프라이머·프로브 측정시스템 (東洋紡 진 아날리시스, 쓰루가, 일본)에 의해 행하였다(참조: 도 3 및 도 4). 다형부위를 포함하는 DNA 단편은 5' 말단에 플루오 레세인이소티오시아네이트 (fluorescein isothiocyanate: FITC) 또는 텍사스 레드(Texas red: TxR)로 표식한 두 가지의 대립 유전자 특이적 센스 프라이머 (또는 안티센스 프라이머)와 5' 말단을 비오틴으로 표식한 안티센스 프라이머 (또는 센스 프라이머)를 이용하여 폴리머라제 연쇄 반응 (polymerase chain reaction:PCR)에 의해 증폭시켰다. 또한 별개의 방법으로서, 다형부위를 포함하는 DNA 단편은 2 종류의 대립 유전자 특이적 센스 프라이머와 5' 말단을 비오틴으로 표식한 안티센스 프라이머를 이용하거나, 또는 센스 프라이머와 5'말단을 비오틴으로 표식한 안티센스 프라이머를 이용하여 PCR에 의해 증폭시켰다. 반응용액 (25㎕)에는 20ng의 DNA, 5pmol의 각 프라이머, 0.2mmol/L의 각 데옥시뉴클레오시드 3인산 (dATP, dGTP, dCTP, dTTP), 1-4 mmol/L의 MgCl2, 1U의 DNA 폴리머라아제 (rTaq 또는 KODplus; 東洋紡, 오오사까, 일본)을 포함하여, 각각의 DNA 폴리머라아제 완충액을 이용했다. 증폭 프로토콜은, 초기변성이 95℃, 5분; 35-45 사이클(cycles)로 변성이 95℃, 30분, 어닐링이 55-67.5℃에서 30초, 신전(伸展)이 72℃에서 30초, 그리고 최종신전을 72℃에서 2분으로 하였다.
형광법에 의한 유전자형의 결정에서는, 증폭한 DNA 를 96구멍 플레이트의 각 웰에서 스트랩토아비딘(Streptavidin) 결합 자기(磁氣) 비드를 포함하는 용액 속에서 실온에서 배양했다. 상기 플레이트를 자기 스탠드 위에 두고, 각 웰로부터 상청을 회수하여 취하고, 0.01M NaOH를 포함하는 96구멍 플레이트의 각 웰에 옮긴 후, 마이크로 플레이트 리더를 사용하여, FITC는, 여기·형광파장 485와 538nm에서, TxR은 여기·형광파장이 584와 612nm에서, 각각 형광을 측정했다. 또한 발광법에 의한 유전자형의 결정에서는, 증폭한 DNA 를 0.3M NaOH 로 변성시키고, 96구멍 플레이트의 각 웰의 바닥면에 고정하고 싶은 임의의 대립 유전자 특이적 보족(補足)프로브와 35-40% 포름아미드를 포함하는 하이브리다이제이션 완충액으로 37℃에서 30분간 하이브리다이제이션을 행했다. 웰을 충분히 세정한 후, 알칼리 포스파타아제 결합 스트렙토 아비딘을 각 웰에 부가하고, 플레이트를 37℃에서 15분간 흔들었다. 웰을 다시 세정하고, 0.8mM 2-(4-요오도페닐)-3-(4-니트로페닐)-5-(2,4-디설포닐)-2H-테트라졸리움(모노소듐염) [2-(4-iodophenyl)-3-(4-nitrophenyl)-5-(2,4-disulfophenyl)-2H-tetrazolium(monosodium salt)]과 0.4mM의 5-브로모-4-클로로-3-인돌릴포스페이트 p-톨루이딘염 (5-bromo-4-chloro-3-indolyl phosphate p-toluidine salt)를 포함하는 용액을 부가한 후, 450nm에서의 흡광도를 측정하였다.
전술한 방법에 의한 유전자형 결정의 정확도를 확인하기 위해, 50명의 DNA 샘플을 무작위로 선택하여 PCR-제한효소 분절길이 다형성(PCR-RFLP)법 또는 PCR 산물의 직접 염기배열 결정법을 수행하였다. 모든 샘플에 있어서, 대립 유전자 특이적 프라이머·프로브측정시스템에 의해 결정된 상기 유전자형은 PCR-제한효소 분절길이 다형성법 또는 DNA 염기배열결정법에 의해서 결정된 결과와 동일하였다.
한편, 하기 관련해석에서의 통계해석은 다음과 같이 수행하였다. 우선, 데이터는 평균±표준편차로 표시했다. 임상데이터는 심근경색 환자와 대조군간에 언페어드 스튜던트 T 검정 (unpaired Student's t test) 또는 만-휘트니 U 검정(Mann- Whitney U test)를 수행하여 비교하였다. 3개의 군 간의 데이터는 원-웨이 분산분석 (one-way analysis of variance) 또는 크루스칼-왈리스 검정(Kruskal-Wallis test) 및 쉐프 포스트-호크 검정(Scheffe's post-hoc test)을 사용하여 비교하였다. 정성적 데이터는 카이-스퀘어 검정(chi-square test)으로 검정하였다. 대립 유전자 빈도는 유전자 카운팅법(gene counting method)으로 추정하고, 하디-웨인버그 평형 (Hardy-Weinberg equilibrium)으로부터 일탈하고 있는지의 여부는 카이 스퀘어 검정에 의해 검정하였다. 또, 위험인자를 보정한 다인자 로지스틱 회귀분석을 수행하였다. 심근경색을 종속인자로 하여, 연령, 신체질량지수(BMI), 흡연상황(0=비흡연, 1=흡연) 및 대사인자 (0=고혈압·당뇨병·고콜레스테롤혈증·고요산혈증의 경력 없음, 1=경력 있음) 각각의 다형의 유전자형을 독립인자로 했다. 각각의 유전자형은 dominant (우성), recessive (열성), additive (부가) 유전모델로 해석하여, P값, 오즈비, 95% 신뢰구간 (CI)을 산출하였다. 조합 유전자형 해석에서는, 로지스틱 회귀분석의 단계별 변수 선택법에 의해 각각의 유전자형으로 대한 오즈비를 산출했다.
실시예 3: 심근경색 관련 다형의 선택 및 심근경색진단 방법의 개발
최초에 71개의 유전자의 112개 다형에 관한 스크리닝 관련해석을 남성 451명의 예(심근경색 219명의 예, 대조군 232명의 예), 여성 458명의 예(심근경색 226명의 예, 대조군 232명의 예)에 대해 행했다. 이들 증례는 전체의 5061예로부터 무작위로 선택했다.
상기 방법으로 스크리닝 관련해석을 행한 909명의 예 (남성 451명의 예, 여성 458명의 예)의 배경 데이터를 도 5에 나타내었다. 남성의 경우, 연령, BMI, 및 종래의 관동맥질환의 위험인자인 흡연, 고혈압, 당뇨병, 고콜레스테롤혈증, 고요산혈증 등의 빈도에서는, 심근 경색군과 대상 그룹간에 유의차(有意差)가 나타나지 않았다. 여성으로서는, 연령, BMI, 및 고혈압, 고콜레스테롤혈증, 고 요산혈증 등의 빈도에는 심근경색군과 대상 그룹과의 사이에 유의차가 나타나지 않았지만, 흡연 및 당뇨병의 빈도는 심근경색군의 경우 대상 그룹에 비해 유의적으로 높은 값이었다. 112개의 다형과 심근경색간의 스크리닝 관련해석에 있어, 연령, BMI, 및 흡연, 고혈압, 당뇨병, 고콜레스테롤혈증, 고요산혈증의 빈도를 보정한 다인자 로지스틱 회귀분석에 의해, 남성에서는 19개, 여성에서는 18 개의 1염기다형(SNP)이 심근경색과의 관련을 나타내었다(도 6). 또한, 스크리닝 관련해석의 경우, 로지스틱 회귀분석에 있어서 'P값 < 0.1인 경우 관련있음'으로 하는 분류를 이용했다. 이들 SNP 중, 4개의 SNP는 남녀 모두에서 심근경색과 관련되고, 다른 SNP들은 남녀 중 어느 일방의 심근경색과 관련되었다.
이어서, 이들 다형의 유전자형을 나머지의 4152 예 (남성 심근경색 1784명의 예, 남성 대조군 1074명의 예, 여성 심근경색 590명의 예, 여성 대조군 704명의 예)에 대해 결정했다. 이어서, 이들 다형과 심근 경색과의 관련에 대한 대규모 관련해석을 총 5061명의 예 (남성 심근경색 2003명의 예, 남성 대조군 1306명의 예, 여성 심근경색 816명의 예, 여성 대조군 936명의 예)에서 수행하였다.
대규모 관련해석에서, 전체 5061명의 예 (남성 3309명, 여성 1752명의 예)의 배경 데이터를 도 7에 나타내었다. 남성의 경우, 연령, BMI 및 흡연의 빈도에는 심근 경색군과 대상 그룹간에 유의차가 인정되지 않았지만, 고혈압, 고요산혈증은 심근 경색군이 대상 그룹에 비해 유의적으로 낮고, 당뇨병과 고콜레스테롤혈증의 빈도는 심근경색군이 대상 그룹에 비교하고 유의적으로 높았다. 여성의 경우, 연령 및 고혈압의 빈도에는 심근경색군과 대상 그룹과의 사이에 유의차를 인정하지 않았지만, BMI 및 흡연, 당뇨병, 고콜레스테롤혈증, 고요산혈증의 빈도는 심근경색군이 대상 그룹에 비교하고 유의적으로 높았다. 남성의 19개 SNP, 여성의 18개 SNP과 심근경색과의 대규모 관련해석에 있어서는, 연령, BMI, 및 흡연, 고혈압, 당뇨병, 고콜레스테롤혈증, 고요산혈증의 빈도를 보정한 다인자 로지스틱 회귀분석에 의해 남성으로 10개, 여성으로 5개의 SNP가 심근경색과 유의한 관련을 나타내었다(우성 또는 열성 유전모델 중 어느 하나가 P < 0.05)(도 8). 이들 SNP에 대한 유전자형의 분포 및 로지스틱 회귀분석의 결과를 도 8과 도 9에 각각 나타내었다.
본 실시예에서는 다인자 로지스틱 회귀분석의 단계별 변수 선택법을 행하였다(도 10). 상기 방법의 경우, 도 9에 나타낸 각각의 SNP의 심근 경색과의 관련에서의 P 치에 따라 우성(dominant) 또는 열성(recessive) 유전모델을 채용했다. 이들 유전자의 염색체상의 유전자 자리를 도 10에 나타낸다. 인터로이킨 10 (Interleukin-10)유전자의 -819T→C 다형과 -592A→C 다형은 연쇄 불평형에 있었다 [pairwise linkage disequilibrium coefficient인 D'(D/Dmax)는 0.406; standardized linkage disequilibrium coefficient인 r은 0.396; P < 0.0001, 카이제곱 검정]. 종양괴사인자α (Tumor necrosis factor-α)유전자와 혈소판 활성 화 인자 아세틸 하이드롤라제 (platelet-activating factor acetylhydrolase) 유전자의 유전자위는 근접하고 있지만, 양자의 다형에서의 유전자형의 분포에는 관련을 인정하지 않았다. 마찬가지로, 플라스미노겐 활성화 인자억제제-1 (plasminogen activator inhibitor-1) 유전자와 파라옥소나아제(paraoxonase) 유전자의 유전자위는 근접하고 있지만, 양자의 다형에서의 유전자형의 분포에는 관련을 인정하지 않았다.
단계별 변수 선택법에 의해 산출한 조합 유전자형으로 의한 심근경색 이환의 오즈비를, 남성의 경우, 도 11과 도 13(A)에, 여성의 경우, 도 12과 도 13(B)에 나타낸다. 남성으로서는, 5개의 SNP (TSP4(1186G→C)다형, 코넥신 37(1019C→T)다형, PAF 아세틸하이드롤라제 (994G→T) 다형, 안지오텐시노겐(-6G→A) 다형, 종양괴사인자α (-863C→A)다형)를 조합한 유전자형으로 의해, 최대의 오즈비가 4.50로 된다(도 11, 도 13(A) 참조). 또, 5개의 SNP [NADH/NADPH 옥시다제 p22 폭스 (242C→T) 다형, 아포E (-219G→T) 다형, 아포 C-III(-482C→T)다형, IL-10(-819T→C)다형, IL-10(-592A→C)다형]을 더하여, 전부 10개의 SNP로 한 경우에는 최대의 오즈비가 11.26로 된다(도10, 도13(A) 참조). 여성의 경우, 5개의 SNP [아포 E(4070C→T)다형, 글리코프로테인 Ibα(1018C→T)다형, 스트로메라이신1(-1171/5A→6A)다형, PAI1(-668/4G→5G)다형, 파라옥소나아제(584G→A)다형]가 조합하고 유전자형으로 의해, 최대의 오즈비가 88.51가(로)된(도 12와 도 13(B)참조).
전술한 바와 같이, 본 발명자들은 71개의 후보 유전자로부터 선택한 112개 다형과 심근경색의 관련에 대해 검토하여, 5061명의 예의 대규모 관련해석에 의해 심근경색과 관련되는 SNP를 남성으로 10개, 여성으로 5개 동정하였다. 또한, 다인자 로지스틱 회귀분석의 단계별 변수 선택법에 의해 남성의 경우, 최대오즈비11.26, 여성의 경우, 최대오즈비 88.51를 나타내는 심근경색 리스크 진단 방법(심근경색의 유전적 리스크 진단시스템)을 개발하였다.
심근경색의 주된 원인은 동맥 경화성 관동맥 질환으로서, 상기가 동맥 내측직경의 혈액순환 역학적인 유의협착을 발생시켜, 혈관의 수축확장 조절의 이상을 초래하고, 동맥 경화 둥지의 파열 또는 혈전 형성을 쉽게 일으킨다. 본 발명자들은 혈관 생물학, 혈소판·백혈구 생물학, 응고·선용계, 지질·당·기타 대사인자 등의 포괄적 시점에서, 71 개의 후보 유전자를 선택하였다. 실제로, 심근경색과 관련된 유전자군은 그 발현 병태에 있어서 다양한 역할을 가지고 있다. 즉, 혈관 생물학 (코넥신 37, NADH/NADPH 옥시다제 p22 폭스, 및 트롬보스폰딘 4), 혈관염증(종양괴사인자-α, 혈소판-활성화 인자 아세틸하이드롤라제 및 인터로이킨-10), 고혈압(안지오텐시노겐), 지질대사(아포리포프로테인 E 및 C-III 및 파라옥소나아제), 혈소판기능(글리코프로테인 Ibα), 기질대사(스트로메라이신-1), 선용계(PAI-1) 등이 있다(참조: Boerma M, Forsberg L, van Zeijl L, et al. A genetic polymorphism in connexin 37as a prognostic marker for atherosclerotic plaque development. J Intern Med 1999; 246: 211-218., Inoue N, Kawashima S, Kanazawa K, Yamada S, Akita H, Yokoyama M. Polymorphism of the NADH/NADPH oxidase p22 phox gene in patients with coronary artery disease. Circulation 1998; 97: 135-137., Topol EJ, McCarthy J, Gabriel S, et al. Single nucleotide polymorphisms in multiple novel thrombospondin genes may be associated with familial premature myocardial infarction. Circulation 2001; 104: 2641-2644., Skoog T, van' t Hooft FM, Kallin B, et al. A common functional polymorphism(C→A substitution at position -863i)n the promoter region of the tumor necrosis factor-α(TNF-α)gene associated with reduced circulating level of TNF-α. Hum Mol Genet 1999; 8: 1443-1449., Yamada Y, Ichihara S, Fujimura T, Yokota M. Identification of the G994→T missense mutation in exon 9of the plasma platelet-activating factor acetylhydrolase gene as an independent risk factor for coronary artery disease in Japanese men. Metabolism 1998; 47: 177-181., Koch W, Kastrati A, Bottiger C, Mehilli J, von Beckerath N, Schomig A. Interleukin-10 and tumor necrosis factor gene polymorphisms and risk of coronary artery disease and myocardial infarction. Atherosclerosis 2001; 159: 137-144., Inoue I, Nakajima T, Williams CS, et al. A nucleotide substitution in the promoter of human angiotensinogen is associated with essential hypertension and affects basal transcription in vitro. J. Clin. Invest. 1997; 99: 1786-1797., Lambert J-C, Brousseau T, Defosse V, et al. Independent association of an APOE gene promoter polymorphism with increased risk of myocardial infarction and decreased APOE plasma concentreationsthe ECTIM study. Hum Mol Genet 2000; 9: 57-61., Eto M, Watanabe K, Makino I. Increased frequency of apolipoprotein epsilon 2and epsilon 4alleles in patients with ischemic heart disease. Clin Genet 1989; 36: 183-188., Ruiz J, Blanche H, James RW, et al. Gln-Arg192polymorphism of paraoxonase and coronary heart disease in type 2diabetes. Lancet 1995; 346: 869-72., Murata M, Matsubara Y, Kawano K, et al. Coronary artery disease and polymorphisms in a receptor mediating shear stress-dependent platelet activation. Circulation 1997; 96: 3281-3286., Eriksson P, Kallin B, van' t Hooft FM, Bavenholm P, Hamsten A. Allele-specific increase in basal transcription of the plasminogen-activator inhibitor 1gene is associated with myocardial infarction. Proc Natl Acad Sci USA 1995; 92: 1851-1855., Ye S, Watts GF, Mandalia S, Humphries SE, Henney AM. Preliminary report: genetic variation in the human stromelysin promoter is associated with progression of coronary atyherosclerosis. Br Heart J 1995; 73: 209-215.). 본 발명자들은 112개의 유전자 다형을 909명의 예에 있어서 검토하고, 나아가 19 개의 SNP를 남성2858명의 예에서, 18개의 SNP를 여성 1294명의 예에서 검토한 결과, 합계 179, 402개의 유전자형을 결정했다. 상기 유전자형 결정수는 지금까지 보고된 유전자다형의 관련해석 중 최대의 것이다. 이상의 실시예로 나타낸 심근경색리스크 진단 방법은 최대 오즈비가 남성의 경우, 11.26, 여성의 경우, 88.51를 나타났는 바, 상기 결과도 지금까지의 보고된 대규모 관련해석 중 최대의 오즈비이다.
심근경색과 관련된 15개의 SNP 중, 아포리포프로테인 E 유전자의 4070T→ C (Arg158Cys) 다형이 여성의 심근경색 리스크로서 최대의 오즈비를 나타내었다. 아포리포프로테인 E는 카이로 미크론과 초 저밀도 리포프로테인 (very low density lipoprotein: VLDL) 잔류물(remnant)의 주요 구성성분으로서, 간에서의 수용체에 의한 상기 리포프로테인의 취입시, 리간드로서 작용한다(Mahley RW. Apolipoprotein E: cholesterol transport protein with expanding role in cell biology. Science 1998; 240: 622-630.). 아포리포프로테인 E 유전자의 158Cys(ε 2) 대립유전자는 잔류 리포프로테인의 간 수용체로의 결합 이상을 초래하고(참조: Schneider WJ, Kovanen PT, Brown MS, et al. Familial dysbetalipoproteinemia. Abnormal binding of mutant apolipoprotein E to low density lipoprotein receptors of human fibroblasts and membranes from liver and adrenal of rats, rabbits, and cows. J Clin Invest 1981; 68: 1075-1085), 혈장으로부터의 제거 지연을 발생시킨다(참조: Gregg RE, Zech LA, Schaefer EJ, Brewer HB Jr. Type III hyperlipoproteinemia: defective metabolism of an abnormal apolipoprotein E. Science 1981; 211: 584-586). 가족성 디스베타리포프로테니미아(dysbetalipoproteinemia)(FD, 또는 III 형고리포프로테인혈증) 환자 중 많은 사람들은, Arg158Cys 다형의 호모접합체였다(참조: Breslow JL, Zannis VI, SanGiacomo TR, Third JL, Tracy T, Glueck CJ. Studies of familial type III hyperlipoproteinemia using as a genetic marker the apo E phenotype E 2/2.J Lipid Res 1982; 23: 1224-1235). 그러나, 158Cys/Cys 호모 접합체 중 겨우 1∼4%밖에 가족성 디스베타리포프로테니미아를 발증하지 않은 사실로부터, 다른 유전인 자 또는 환경인자가 본 질환의 발병에 필요하다고 생각된다. 가족성 디스베타리포프로테니미아 환자에서의 동맥 경화성 잔류 리포프로테인(β-VLDL)의 혈장 중으로의 축적 (참조: Mahley RW. Apolipoprotein E: cholesterol transport protein with expanding role in cell biology. Science 1998; 240: 622-630.) 혹은 인간158Cys/Cys를 과잉 발현시킨 마우스 (참조: Sullivan PM, Mezdour H, Quarfordt SH, Maeda N. Type III hyperlipoproteinemia and spontaneous atherosclerosis in mice resulting from gene replacement of mouse Apoe with human APOE* 2.J Clin Invest 1998; 102: 130-135.)는, 동맥 경화의 진전 촉진이 인지된다. Eto 등은 ε2 (158Cys) 대립유전자가 일본인의 남성 (오즈비 2.44, ε2 대립유전자 대 ε3/ε3형) 및 여성 (오즈비 3.03)에서 관동맥 질환과 관련되는 것을 보고하였다(참조: Eto M, Watanabe K, Makino I. Increased frequency of apolipoprotein epsilon 2and epsilon 4alleles in patients with ischemic heart disease. Clin Genet 1989; 36: 183-188.). TT형 (158Cys/Cys)이 심근경색 이환의 위험인자로 된다고 한 본 발명자들의 결과는, Eto 등의 결과와 일치한다.
이상의 실시예에서 검토한 SNP의 일부는, 그 근방에 존재하는 심근경색 발현과 진정으로 관련되는 유전자의 SNP와 연쇄 불평형에 있을 가능성이 있다. 그러나, 남성의 경우 9 개, 여성의 경우, 5개의 유전자가 일본인의 심근경색 감수성 유전자위인 것이 밝혀졌다. 또한, 조합 유전자형으로 의해 신뢰성 및 예지확률이 높은 리스크 진단이 가능하게 되었다. 이러한 점에서, 본 발명의 진단 방법은 심근경색의 1차 예방 및 중노년자의 생활의 질의 개선 및 의료비의 삭감에 공헌할 수 있는 것 이 기대된다.
본 발명은, 상기 발명의 실시예 및 실시예의 설명에 전혀 한정되지 않는다. 특허청구의 범위의 기재를 일탈하지 않고, 당업자가 용이하게 안출할 수 있는 범위내에서 여러 가지 변형된 형태도 본 발명에 포함된다.
이하, 다음의 사항을 개시한다:
11. 이하의 공정 (a1)을 포함하는 핵산 시료의 유전자형을 검출하는 방법:
(a1) 핵산 시료에 있어, 하기 (1) 내지 (10)의 다형을 해석하는 공정:
(1) 코넥신 37 유전자의 염기번호 1019 위치의 다형,
(2) 종양괴사인자α 유전자의 염기번호 -863 위치의 다형,
(3) NADH/NADPH 옥시다제 p22 폭스 유전자의 염기번호 242 위치의 다형,
(4) 안지오텐시노겐 유전자의 염기번호 -6 위치의 다형,
(5) 아포리포프로테인 E 유전자의 염기번호 -219 위치의 다형,
(6) 혈소판 활성화 인자 아세틸 하이드롤라제 유전자의 염기번호 994 위치의 다형,
(7) 아포리포프로테인 C-III 유전자의 염기번호 -482 위치의 다형,
(8) 트롬보스폰딘 4 유전자의 염기번호 1186 위치의 다형,
(9) 인터로이킨 10 유전자의 염기번호 -819 위치의 다형, 및,
(10) 인터로이킨 10 유전자의 염기번호 -592 위치의 다형.
12. 하기 공정(b1)를 포함하는 핵산 시료의 유전자형을 검출하는 방법:
(b) 핵산시료에 있어, 하기 (11) 내지 (15)의 다형을 해석하는 공정:
(11) 스트로메라이신 1 유전자의 염기번호 -1171 위치의 다형,
(12) 플라스미노겐 활성화 인자 억제제-1 유전자의 염기번호 -668 위치의 다형,
(13) 글리코프로테인 Ibα 유전자의 염기번호 1018 위치의 다형,
(14) 파라옥소나아제 유전자의 염기번호 584 위치의 다형, 및
(15) 아포리포프로테인 E 유전자의 염기번호4070 위치의 다형.
13. 하기 공정 (I) 내지 (III)을 포함하는 심근경색의 리스크 진단 방법:
(i) 핵산 시료에 있어, 하기 (1) 내지 (10)의 다형을 해석하는 공정:
(1) 코넥신 37 유전자의 염기번호 1019 위치의 다형,
(2) 종양괴사인자 α 유전자의 염기번호 -863 위치의 다형,
(3) NADH/NADPH 옥시다제 p22 폭스 유전자의 염기번호 242 위치의 다형,
(4) 안지오텐시노겐 유전자의 염기번호 -6 위치의 다형,
(5) 아포리포프로테인 E 유전자의 염기번호 -219 위치의 다형,
(6) 혈소판 활성화 인자 아세틸 하이드롤라제 유전자의 염기번호 994 위치의 다형,
(7) 아포리포프로테인 C-III 유전자의 염기번호 -482 위치의 다형,
(8) 트롬보스폰딘 4 유전자의 염기번호 1186 위치의 다형,
(9) 인터로이킨 10 유전자의 염기번호 -819 위치의 다형, 및,
(10) 인터로이킨 10 유전자의 염기번호 -592 위치의 다형,
(II) 상기 공정에 의해서 수득한 다형 정보로부터 핵산시료의 유전자형을 결 정하는 공정; 및,
(III) 결정된 유전자형으로부터 심근 경색의 유전적 리스크를 구하는 공정.
14. 하기 공정 (IV) 내지 (VI)을 포함하는 심근경색의 리스크 진단 방법:
(IV) 핵산 시료에 있어, 하기 (11) 내지 (15)의 다형을 해석하는 공정;
(11) 스트로메라이신 1 유전자의 염기번호 -1171 위치의 다형,
(12) 플라스미노겐 활성화 인자 억제제-1 유전자의 염기번호 -668 위치의 다형,
(13) 글리코프로테인 Ibα 유전자의 염기번호 1018 위치의 다형,
(14) 파라옥소나아제 유전자의 염기번호 584 위치의 다형, 및
(15) 아포리포프로테인 E 유전자의 염기번호 4070 위치의 다형,
(V) 상기 공정에서 수득한 다형정보로부터 상기 핵산시료의 유전자형을 결정하는 공정; 및,
(VI) 결정된 유전자형으로부터 심근경색의 유전적 리스크를 구하는 공정.
본 발명에 의하면 심근경색에 관련되는 유전자 다형이 해석되어, 핵산시료의 유전자형이 검출된다. 상기 유전자형의 검출에 의해 얻어지는 다형정보를 이용함으로써, 고정밀도로 예지확률이 높은 심근경색의 리스크 진단을 행할 수 있다. 따라서, 본 발명은 심근경색의 발증 리스크를 사전에 아는 유효한 수단이 된다. 또, 본 발명에 의하면 이들 질환의 진단에 유용한 보조적 정보가 수득되어, 보다 적절한 치료를 가능하게 하며 예후의 개선 등을 도모할 수 있다. 또한 본 발명은, 심근경 색의 발증 메커니즘을 해명하는 데에 있어서가 유효한 정보를 제공하여, 심근경색의 예방, 치료에 공헌하는 것이 기대된다.
SEQUENCE LISTING <110> NAGOYA INDUSTRIAL SCIENCE RESEARCH INSTITUTE GIFU INTERNATIONAL INSTITUTE OF BIOTECHNOLOGY YAMADA, Yoshiji YOKOTA, Mitsuhiro <120> Method for diagnosing myocardial infarction risk <130> C0200201 <150> JP P2002-181580 <151> 2002-06-21 <160> 64 <170> PatentIn version 3.1 <210> 1 <211> 1601 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 1 ctccggccat cgtccccacc tccacctggg ccgcccgcga ggcagcggac ggaggccggg 60 agccatgggt gactggggct tcctggagaa gttgctggac caggtccagg agcactcgac 120 cgtggtgggt aagatctggc tgacggtgct cttcatcttc cgcatcctca tcctgggcct 180 ggccggcgag tcagtgtggg gtgacgagca gtcagatttc gagtgtaaca cggcccagcc 240 aggctgcacc aacgtctgct atgaccaggc cttccccatc tcccacatcc gctactgggt 300 gctgcagttc ctcttcgtca gcacacccac cctggtctac ctgggccatg tcatttacct 360 gtctcggcga gaagagcggc tgcggcagaa ggagggggag ctgcgggcac tgccggccaa 420 ggacccacag gtggagcggg cgctggcggc cgtagagcgt cagatggcca agatctcggt 480 ggcagaagat ggtcgcctgc gcatccgcgg agcactgatg ggcacctatg tcgccagtgt 540 gctctgcaag agtgtgctag aggcaggctt cctctatggc cagtggcgcc tgtacggctg 600 gaccatggag cccgtgtttg tgtgccagcg agcaccctgc ccctacctcg tggactgctt 660 tgtctctcgc cccacggaga agaccatctt catcatcttc atgttggtgg ttggactcat 720 ctccctggtg cttaacctgc tggagttggt gcacctgctg tgtcgctgcc tcagccgggg 780 gatgagggca cggcaaggcc aagacgcacc cccgacccag ggcacctcct cagaccctta 840 cacggaccag gtcttcttct acctccccgt gggccagggg ccctcatccc caccatgccc 900 cacctacaat gggctctcat ccagtgagca gaactgggcc aacctgacca cagaggagag 960 gctggcgtct tccaggcccc ctctcttcct ggacccaccc cctcagaatg gccaaaaacc 1020 cccaagtcgt cccagcagct ctgcttctaa gaagcagtat gtatagaggc ctgtggctta 1080 tgtcacccaa cagaggggtc ctgagaagtc tggctgcctg ggatgccccc tgccccctcc 1140 tggaaggctc tgcagagatg actgggctgg ggaagcagat gcttgctggc catggagcct 1200 cattgcaagt tgttcttgaa cacctgaggc cttcctgtgg cccaccaggc actacggctt 1260 cctctccaga tgtgctttgc ctgagcacag acagtcagca tggaatgctc ttggccaagg 1320 gtactggggc cctctggcct tttgcagctg atccagagga acccagagcc aacttacccc 1380 aacctcaccc tatggaacag tcacctgtgc gcaggttgtc ctcaaaccct ctcctcacag 1440 gaaaaggcgg attgaggctg ctgggtcagc cttgatcgca cagacagagc ttgtgccgga 1500 tttggccctg tcaaggggac tggtgccttg ttttcatcac tccttcctag ttctactgtt 1560 caagcttctg aaataaacag gacttgatca caaaaaaaaa a 1601 <210> 2 <211> 1178 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> misc_feature <222> (881)..(881) <223> n stands for any base <400> 2 ggggaagcaa aggagaagct gagaagatga aggaaaagtc agggtctgga ggggcggggg 60 tcagggagct cctgggagat atggccacat gtagcggctc tgaggaatgg gttacaggag 120 acctctgggg agatgtgacc acagcaatgg gtaggagaat gtccagggct atggaagtcg 180 agtatcgggg accccccctt aacgaagaca gggccatgta gagggcccca gggagtgaaa 240 gagcctccag gacctccagg tatggaatac aggggacgtt taagaagata tggccacaca 300 ctggggccct gagaagtgag agcttcatga aaaaaatcag ggaccccaga gttccttgga 360 agccaagact gaaaccagca ttatgagtct ccgggtcaga atgaaagaag aaggcctgcc 420 ccagtggtct gtgaattccc gggggtgatt tcactccccg ggctgtccca ggcttgtccc 480 tgctaccccc acccagcctt tcctgaggcc tcaagctgcc accaagcccc cagctccttc 540 tccccgcaga cccaaacaca ggcctcagga ctcaacacag cttttccctc caaccccgtt 600 ttctctccct caaggactca gctttctgaa gcccctccca gttctagttc tatctttttc 660 ctgcatcctg tctggaagtt agaaggaaac agaccacaga cctggtcccc aaaagaaatg 720 gaggcaatag gttttgaggg gcatggggac ggggttcagc ctccagggtc ctacacacaa 780 atcagtcagt ggcccagaag acccccctcg gaatcggagc agggaggatg gggagtgtga 840 ggggtatcct tgatgcttgt gtgtccccaa ctttccaaat ncccgccccc gcgatggaga 900 agaaaccgag acagaaggtg cagggcccac taccgcttcc tccagatgag cttatgggtt 960 tctccaccaa ggaagttttc cgctggttga atgattcttt ccccgccctc ctctcgcccc 1020 agggacatat aaaggcagtt gttggcacac ccagccagca gacgctccct cagcaaggac 1080 agcagaggac cagctaagag ggagagaagc aactgcagac cccccctgaa aacaaccctc 1140 agacgccaca tcccctgaca agctgccagg caggttct 1178 <210> 3 <211> 971 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 3 ccaggctgca gtgcagtggt gcagctgtga ctcatggcag cctccacctg gctcaggcca 60 ccctcttacc tcagcctctg gagtagctgg gaccacaggc acacaccact gcacctggct 120 tttaaatttt ttgtagagat gagggtctca ctatgttgcc caggctggtc tcaaactcct 180 gggctccagt gatcctcccg cctcagcctc ccaaaatgct gggattccag gcatgagcca 240 ccgtgctcgg gcccctctct gtgttgtctt cagtaaaggg agttccctgt ggcccctcag 300 gctgagctgg gctgttcctt aaccacatgg cttcagtgtg gcgggcgtgt ttgtgtgcct 360 gctggagtac ccccggggga agaggaagaa gggctccacc atggagcgct ggtgagtctc 420 ctcctgatct ggggtctctc cgggggctgc ggggcccagg cagggctcac agggttgggt 480 ggagcttggt ttctcacttg gaggctccgg aaccaaccct ttggtgcttg tgggtaaacc 540 aaggccggtg cctgcccggt gtgttttgtg ggaggaaaga ggcctgggtg ccctggggtg 600 gtcagcaggg cagcaaagga gtcccgagtg ggagaggccc agccgcgccg tctcgccttc 660 ctccctcccc caggggacag aagtacatga ccgccgtggt gaagctgttc gggcccttta 720 ccaggaatta ctatgttcgg gccgtcctgc atctcctgtg agtccccgtc ccgcaccccc 780 tctagggctc aggagggctt ggagccgacc ctccccactg tcccaccggc cgggctgcct 840 ggacaggagc cacccccact tacctcagtg tttttccaaa caaaaattcg ggtccctggc 900 tctggcaggg cctgtgtctg ctgtctagtg tgcaggattt gtaaggatcc actccaaatc 960 cgaggagctc g 971 <210> 4 <211> 1278 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 4 ccagacaagt gatttttgag gagtccctat ctataggaac aaagtaatta aaaaaatgta 60 tttcagaatt tacaggccca tgtgagatat gattttttta aatgaagatt tagagtaatg 120 ggtaaaaaag aggtatttgt gtgtttgttg attgttcagt cagtgaatgt acagcttctg 180 cctcatatcc aggcaccatc tcttcctgct ctttgttgtt aaatgttcca ttcctgggta 240 atttcatgtc tgccatcgtg gatatgccgt ggctccttga acctgcttgt gttgaagcag 300 gatcttcctt cctgtccctt cagtgcccta ataccatgta tttaaggctg gacacatcac 360 cactcccaac ctgcctcacc cactgcgtca cttgtgatca ctggcttctg gcgactctca 420 ccaaggtctc tgtcatgccc tgttataacg actacaaaag caagtcttac ctataggaaa 480 ataagaatta taaccctttt actggtcatg tgaaacttac catttgcaat ttgtacagca 540 taaacacaga acagcacatc tttcaatgcc tgcatcctga aggcattttg tttgtgtctt 600 tcaatctggc tgtgctattg ttggtgttta acagtctccc cagctacact ggaaacttcc 660 agaaggcact tttcacttgc ttgtgtgttt tccccagtgt ctattagagg cctttgcaca 720 gggtaggctc tttggagcag ctgaaggtca cacatcccat gagcgggcag cagggtcaga 780 agtggccccc gtgttgccta agcaagactc tcccctgccc tctgccctct gcacctccgg 840 cctgcatgtc cctgtggcct cttgggggta catctcccgg ggctgggtca gaaggcctgg 900 gtggttggcc tcaggctgtc acacacctag ggagatgctc ccgtttctgg gaaccttggc 960 cccgactcct gcaaacttcg gtaaatgtgt aactcgaccc tgcaccggct cactctgttc 1020 agcagtgaaa ctctgcatcg atcactaaga cttcctggaa gaggtcccag cgtgagtgtc 1080 gcttctggca tctgtccttc tggccagcct gtggtctggc caagtgatgt aaccctcctc 1140 tccagcctgt gcacaggcag cctgggaaca gctccatccc cacccctcag ctataaatag 1200 ggcctcgtga cccggccagg ggaagaagct gccgttgttc tgggtactac agcagaaggt 1260 aagccggggg ccccctca 1278 <210> 5 <211> 1426 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 5 caaggtcaca cagctggcaa ctggcagagc caggattcac gccctggcaa tttgactcca 60 gaatcctaac cttaacccag aagcacggct tcaagcccct ggaaaccaca atacctgtgg 120 cagccagggg gaggtgctgg aatctcattt cacatgtggg gagggggctc ccctgtgctc 180 aaggtcacaa ccaaagagga agctgtgatt aaaacccagg tcccatttgc aaagcctcga 240 cttttagcag gtgcatcata ctgttcccac ccctcccatc ccacttctgt ccagccgcct 300 agccccactt tctttttttt ctttttttga gacagtctcc ctcttgctga ggctggagtg 360 cagtggcgag atctcggctc actgtaacct ccgcctcccg ggttcaagcg attctcctgc 420 ctcagcctcc caagtagcta ggattacagg cgcccgccac cacgcctggc taacttttgt 480 atttttagta gagatggggt ttcaccatgt tggccaggct ggtctcaaac tcctgacctt 540 aagtgattcg cccactgtgg cctcccaaag tgctgggatt acaggcgtga gctaccgccc 600 ccagcccctc ccatcccact tctgtccagc cccctagccc tactttcttt ctgggatcca 660 ggagtccaga tccccagccc cctctccaga ttacattcat ccaggcacag gaaaggacag 720 ggtcaggaaa ggaggactct gggcggcagc ctccacattc cccttccacg cttggccccc 780 agaatggagg agggtgtctg tattactggg cgaggtgtcc tcccttcctg gggactgtgg 840 ggggtggtca aaagacctct atgccccacc tccttcctcc ctctgccctg ctgtgcctgg 900 ggcaggggga gaacagccca cctcgtgact gggggctggc ccagcccgcc ctatccctgg 960 gggagggggc gggacagggg gagccctata attggacaag tctgggatcc ttgagtccta 1020 ctcagcccca gcggaggtga aggacgtcct tccccaggag ccggtgagaa gcgcagtcgg 1080 gggcacgggg atgagctcag gggcctctag aaagagctgg gaccctggga agccctggcc 1140 tccaggtagt ctcaggagag ctactcgggg tcgggcttgg ggagaggagg agcgggggtg 1200 aggcaagcag caggggactg gacctgggaa gggctgggca gcagagacga cccgacccgc 1260 tagaaggtgg ggtggggaga gcagctggac tgggatgtaa gccatagcag gactccacga 1320 gttgtcacta tcatttatcg agcacctact gggtgtcccc agtgtcctca gatctccata 1380 actggggagc caggggcagc gacacggtag ctagccgtcg attgga 1426 <210> 6 <211> 1505 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 6 gctggtcgga ggctcgcagt gctgtcggcg agaagcagtc gggtttggag cgcttgggtc 60 gcgttggtgc gcggtggaac gcgcccaggg accccagttc ccgcgagcag ctccgcgccg 120 cgcctgagag actaagctga aactgctgct cagctcccaa gatggtgcca cccaaattgc 180 atgtgctttt ctgcctctgc ggctgcctgg ctgtggttta tccttttgac tggcaataca 240 taaatcctgt tgcccatatg aaatcatcag catgggtcaa caaaatacaa gtactgatgg 300 ctgctgcaag ctttggccaa actaaaatcc cccggggaaa tgggccttat tccgttggtt 360 gtacagactt aatgtttgat cacactaata agggcacctt cttgcgttta tattatccat 420 cccaagataa tgatcgcctt gacacccttt ggatcccaaa taaagaatat ttttggggtc 480 ttagcaaatt tcttggaaca cactggctta tgggcaacat tttgaggtta ctctttggtt 540 caatgacaac tcctgcaaac tggaattccc ctctgaggcc tggtgaaaaa tatccacttg 600 ttgttttttc tcatggtctt ggggcattca ggacacttta ttctgctatt ggcattgacc 660 tggcatctca tgggtttata gttgctgctg tagaacacag agatagatct gcatctgcaa 720 cttactattt caaggaccaa tctgctgcag aaatagggga caagtcttgg ctctacctta 780 gaaccctgaa acaagaggag gagacacata tacgaaatga gcaggtacgg caaagagcaa 840 aagaatgttc ccaagctctc agtctgattc ttgacattga tcatggaaag ccagtgaaga 900 atgcattaga tttaaagttt gatatggaac aactgaagga ctctattgat agggaaaaaa 960 tagcagtaat tggacattct tttggtggag caacggttat tcagactctt agtgaagatc 1020 agagattcag atgtggtatt gccctggatg catggatgtt tccactgggt gatgaagtat 1080 attccagaat tcctcagccc ctctttttta tcaactctga atatttccaa tatcctgcta 1140 atatcataaa aatgaaaaaa tgctactcac ctgataaaga aagaaagatg attacaatca 1200 ggggttcagt ccaccagaat tttgctgact tcacttttgc aactggcaaa ataattggac 1260 acatgctcaa attaaaggga gacatagatt caaatgtagc tattgatctt agcaacaaag 1320 cttcattagc attcttacaa aagcatttag gacttcataa agattttgat cagtgggact 1380 gcttgattga aggagatgat gagaatctta ttccagggac caacattaac acaaccaatc 1440 aacacatcat gttacagaac 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Claims (12)

  1. 하기 공정 (a)를 포함하는, 심근경색의 리스크에 관한 정보를 제공하는 방법:
    (a) 핵산 시료에 있어서, 하기 (1) 및 (2)의 다형을 해석하는 공정:
    (1) 코넥신 37 (connexin 37) 유전자의 염기번호 1019 위치의 다형, 및
    (2) NADH/NADPH 옥시다제 p22 폭스 (NADH/NADPH oxidase p22 phox) 유전자의 염기번호 242 위치의 다형.
  2. 삭제
  3. 삭제
  4. 하기 공정 (i) 및 (ii)를 포함하는 심근경색의 리스크에 관한 정보를 제공하는 방법;
    (i) 핵산 시료에 있어, 하기 (1) 및 (2)의 다형을 해석하는 공정:
    (1) 코넥신 37 유전자의 염기번호 1019 위치의 다형, 및
    (2) NADH/NADPH 옥시다제 p22 폭스 유전자의 염기번호 242 위치의 다형; 및
    (ii) 상기 공정에 의해 수득한 다형 정보로부터 핵산시료의 유전자형을 결정하는 공정.
  5. 삭제
  6. 삭제
  7. 하기 (1) 및 (2)의 핵산을 포함하는, 심근경색 리스크 검사용 키트:
    (1) 코넥신 37 유전자의 염기번호 1019 위치의 다형을 해석하기 위한 핵산, 및
    (2) NADH/NADPH 옥시다제 p22 폭스 유전자의 염기번호 242 위치의 다형을 해석하기 위한 핵산.
  8. 삭제
  9. 삭제
  10. 삭제
  11. 삭제
  12. 삭제
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