JP2004113093A - 冠動脈攣縮のリスク診断方法 - Google Patents

Abstract

【課題】高精度で予知確率の高い冠動脈攣縮の遺伝的リスクを診断する手段を提供する。
【解決手段】以下の工程を含んでなる方法により冠動脈攣縮のリスク診断を行う。
（ｉ）冠動脈攣縮との関連が認められた４個の遺伝子多型、又は５個の遺伝子多型より選択される二つ以上の多型を解析する工程、
（ｉｉ）前記工程によって得られる多型情報から核酸試料の遺伝子型を決定する工程、及び
（ｉｉｉ）決定された遺伝子型から冠動脈攣縮の遺伝的リスクを求める工程。
【選択図】　　図１１

Description

【０００１】
【産業上の利用分野】
本発明は冠動脈攣縮に関連する遺伝子を利用した検出方法に関する。詳しくは冠動脈攣縮に関連する複数の遺伝子の多型を利用した検出方法及び該方法に用いられるキットに関する。冠動脈攣縮を発症するリスクを求めることに本発明を利用できる。
【０００２】
【従来の技術】
冠動脈攣縮は異型狭心症、心筋梗塞および心突然死の病因に重要な役割を有している。カルシウム拮抗薬（ジルチアゼム）や亜硝酸剤が冠動脈攣縮に有効であることが知られているが、冠動脈攣縮の分子メカニズムは未だ不明である。冠動脈攣縮を予防するための一つの方法は冠動脈攣縮感受性遺伝子を同定することである。今までにゲノム疫学的研究により内皮型一酸化窒素合成酵素（非特許文献１、２）、アンギオテンシン変換酵素（非特許文献３）、アンギオテンシンＩＩタイプ１受容体（非特許文献４）、パラオキソナーゼ（非特許文献５）、ホスホリパーゼＣ−δ１（非特許文献６）などの遺伝子多型と冠動脈攣縮発症との関連が報告されているが、冠動脈攣縮感受性遺伝子は未だ十分に同定されていない。冠動脈攣縮の罹患頻度は白人に比較し日本人で高いことが報告されており、人種による遺伝因子の多様性が冠動脈攣縮の病態に関連する可能性がある（非特許文献１）。したがって、それぞれの人種で多型と冠動脈攣縮との関連についてのデータベースを構築することが重要である。
【０００３】
【非特許文献１】
Ｎａｋａｙａｍａ　Ｍ，　Ｙａｓｕｅ　Ｈ，　Ｙｏｓｈｉｍｕｒａ　Ｍ，　ｅｔ　ａｌ．　Ｔ^−７８６→Ｃ　ｍｕｔａｔｉｏｎ　ｉｎ　ｔｈｅ　５’−ｆｌａｎｋｉｎｇ　ｒｅｇｉｏｎ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ　ｎｉｔｒｉｃ　ｏｘｉｄｅ　ｓｙｎｔｈａｓｅ　ｇｅｎｅ　ｉｓ　ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ　ｗｉｔｈ　ｃｏｒｏｎａｒｙ　ｓｐａｓｍ．　Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ．　１９９９；９９：２８６４−２８７０．
【非特許文献２】
Ｙｏｓｈｉｍｕｒａ　Ｍ，　Ｙａｓｕｅ　Ｈ，　Ｎａｋａｍｕｒａ　Ｍ，　ｅｔ　ａｌ．　Ｇｅｎｅｔｉｃ　ｒｉｓｋ　ｆａｃｔｏｒｓ　ｆｏｒ　ｃｏｒｏｎａｒｙ　ａｒｔｅｒｙ　ｓｐａｓｍ：　ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｃｅ　ｏｆ　ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ　ｎｉｔｒｉｃ　ｏｘｉｄｅ　ｓｙｎｔｈａｓｅ　ｇｅｎｅ　Ｔ−７８６→Ｃ　ａｎｄ　ｍｉｓｓｅｎｓｅ　Ｇｌｕ２９８Ａｓｐ．　Ｊ　Ｉｎｖｅｓｔ　Ｍｅｄ．　２０００；４８：３６７−３７４．
【非特許文献３】
Ｏｉｋｅ　Ｙ，　Ｈａｔａ　Ａ，　Ｏｇａｔａ　Ｙ，　ｅｔ　ａｌ．　　Ａｎｇｉｏｔｅｎｓｉｎ　ｃｏｎｖｅｒｔｉｎｇ　ｅｎｚｙｍｅ　ａｓ　ａ　ｇｅｎｅｔｉｃ　ｒｉｓｋ　ｆａｃｔｏｒ　ｆｏｒ　ｃｏｒｏｎａｒｙ　ａｒｔｅｒｙ　ｓｐａｓｍ：　ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓ　ｏｆ　ｍｙｏｃａｒｄｉａｌ　ｉｎｆａｒｃｔｉｏｎ．　Ｊ　Ｃｌｉｎ　Ｉｎｖｅｓｔ．　１９９５；９６：２９７５−２９７９．
【非特許文献４】
Ａｍａｎｔ　Ｃ，　Ｈａｍｏｎ　Ｍ，　Ｂａｕｔｅｒｓ　Ｃ，　ｅｔ　ａｌ．　Ｔｈｅ　ａｎｇｉｏｔｅｎｓｉｎ　ＩＩ　ｔｙｐｅ　１　ｒｅｃｅｐｔｏｒｇｅｎｅ　ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ　ｉｓ　ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ　ｗｉｔｈ　ｃｏｒｏｎａｒｙ　ａｒｔｅｒｙ　ｖａｓｏｃｏｎｓｔｒｉｃｔｉｏｎ．　Ｊ　Ａｍ　Ｃｏｌｌ　Ｃａｒｄｉｏｌ．　１９９７；２９：４８６−４９０．
【非特許文献５】
Ｉｔｏ　Ｔ，　Ｙａｓｕｅ　Ｈ，　Ｙｏｓｈｉｍｕｒａ　Ｍ，　ｅｔ　ａｌ．　Ｐａｒａｏｘｏｎａｓｅ　ｇｅｎｅ　Ｇｌｎ１９２Ａｒｇ　（Ｑ１９２Ｒ）ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ　ｉｓ　ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ　ｗｉｔｈ　ｃｏｒｏｎａｒｙ　ａｒｔｅｒｙ　ｓｐａｓｍ．　Ｈｕｍ　Ｇｅｎｅｔ．　２００２；１１０：８９−９４．
【非特許文献６】
Ｎａｋａｎｏ　Ｔ，　Ｏｓａｎａｉ　Ｔ，　Ｔｏｍｉｔａ　Ｈ，　ｅｔ　ａｌ．　Ｅｎｈａｎｃｅｄ　ａｃｔｉｖｉｔｙ　ｏｆ　ｖａｒｉａｎｔ　ｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐａｓｅ　Ｃ−ｄ１　ｐｒｏｔｅｉｎ　（Ｒ２５７Ｈ）　ｄｅｔｅｃｔｅｄ　ｉｎ　ｐａｔｉｅｎｔｓ　ｗｉｔｈ　ｃｏｒｏｎａｒｙ　ａｒｔｅｒｙｓｐａｓｍ．　Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ．　２００２；１０５：２０２４−２０２９．
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
以上のように、今までに幾つかの遺伝子多型と冠動脈攣縮との関連解析が行われてきた。しかし冠動脈攣縮感受性遺伝子は未だ十分同定されていない。その主な理由は多くの研究においては対象集団の大きさが十分でないことと、遺伝子多型のみならず喫煙などの環境因子が人種間で異なっていることに起因する。
本発明は以上の背景に鑑みなされたものであって、その目的は高精度で予知確率の高い冠動脈攣縮の遺伝的リスクを診断する手段を提供し、冠動脈攣縮に起因する異型狭心症、心筋梗塞および心突然死の一次予防に貢献することである。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、以上の目的を達成するために数種類の公的データベースを用いて冠動脈硬化、冠動脈攣縮、高血圧、糖尿病、高脂血症などとの関連が推定される７１遺伝子を抜粋し、遺伝子の機能変化との関連が予想されるものなどを中心に１１２多型を選択した。続いて、この７１遺伝子１１２多型に関して心筋梗塞との関連解析を心筋梗塞４４５例と対照４６４例について行い、男性で１９個、女性で１８個の一塩基多型（ＳＮＰ：ｓｉｎｇｌｅ　ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ　ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ）が心筋梗塞発症と関連することを見出したが（Ｙａｍａｄａ　Ｙ，　Ｉｚａｗａ　Ｈ，　Ｉｃｈｉｈａｒａ　Ｓ，　ｅｔ　ａｌ．　Ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ　ｏｆ　ｒｉｓｋ　ｏｆ　ｍｙｏｃａｒｄｉａｌ　ｉｎｆａｒｃｔｉｏｎ　ｆｒｏｍ　ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍｓ　ｉｎ　ｃａｎｄｉｄａｔｅ　ｇｅｎｅｓ．　Ｎ　Ｅｎｇｌ　Ｊ　Ｍｅｄ．　ｉｎ　ｐｒｅｓｓ．）、それらの多型群の中には冠動脈攣縮の候補遺伝子も含まれていた。そこで、これらのＳＮＰと冠動脈攣縮との関連について大規模関連解析を行った。その結果、冠動脈形攣縮と関連するＳＮＰを男性で４個、女性で５個同定することに成功した。更に、これらの多型を組み合わせて解析する多因子ロジスティック回帰分析のｓｔｅｐｗｉｓｅ　ｆｏｒｗａｒｄ　ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ　ｍｅｔｈｏｄにより、冠動脈攣縮の最大オッズ比が男性で５．０８、女性で５３．３７を呈し、過去に報告された関連解析の中で最大のオッズ比を示した。この結果から、これらのＳＮＰの中から複数のＳＮＰを選択し、各ＳＮＰを解析した結果を組み合わせて用いれば、信頼性が高く、予知確率の高い冠動脈攣縮のリスク診断が行えるとの知見が得られた。本発明は以上の知見に基づくものであって、次の構成を提供する。
［１］　以下の工程（ａ）を含んでなる、核酸試料の遺伝子型を検出する方法、
（ａ）核酸試料における、以下の（１）〜（４）からなるグループより選択される二つ以上の多型を解析する工程、
（１）腫瘍壊死因子α遺伝子の塩基番号−８６３位の多型、
（２）ＮＡＤＨ／ＮＡＤＰＨオキシダーゼｐ２２フォックス遺伝子の塩基番号２４２位の多型、
（３）アポリポプロテインＥ遺伝子の塩基番号−２１９位の多型、及び
（４）アポリポプロテインＣ−ＩＩＩ遺伝子の塩基番号−４８２位の多型。
［２］　以下の工程（ｂ）を含んでなる、核酸試料の遺伝子型を検出する方法、
（ｂ）核酸試料における、以下の（５）〜（９）からなるグループより選択される二つ以上の多型を解析する工程、
（５）ストロメライシン１遺伝子の塩基番号−１１７１位の多型、
（６）アポリポプロテインＥ遺伝子の塩基番号４０７０位の多型、
（７）インターロイキン６遺伝子の塩基番号−６３４位の多型、
（８）内皮型一酸化窒素合成酵素遺伝子の塩基番号−７８６位の多型、及び
（９）脂肪酸結合タンパク質２遺伝子の塩基番号２４４５位の多型。
［３］　以下の工程（ｉ）〜（ｉｉｉ）を含んでなる、冠動脈攣縮のリスク診断方法、
（ｉ）核酸試料における、以下の（１）〜（４）からなるグループより選択される二つ以上の多型を解析する工程、
（１）腫瘍壊死因子α遺伝子の塩基番号−８６３位の多型、
（２）ＮＡＤＨ／ＮＡＤＰＨオキシダーゼｐ２２フォックス遺伝子の塩基番号２４２位の多型、
（３）アポリポプロテインＥ遺伝子の塩基番号−２１９位の多型、及び
（４）アポリポプロテインＣ−ＩＩＩ遺伝子の塩基番号−４８２位の多型、
（ｉｉ）前記工程によって得られる多型情報から核酸試料の遺伝子型を決定する工程、及び
（ｉｉｉ）決定された遺伝子型から冠動脈攣縮の遺伝的リスクを求める工程。
［４］　以下の工程（ｉｖ）〜（ｖｉ）を含んでなる、冠動脈攣縮のリスク診断方法、
（ｉｖ）核酸試料における、以下の（５）〜（９）からなるグループより選択される二つ以上の多型を解析する工程、
（５）ストロメライシン１遺伝子の塩基番号−１１７１位の多型、
（６）アポリポプロテインＥ遺伝子の塩基番号４０７０位の多型、
（７）インターロイキン６遺伝子の塩基番号−６３４位の多型、
（８）内皮型一酸化窒素合成酵素遺伝子の塩基番号−７８６位の多型、及び
（９）脂肪酸結合タンパク質２遺伝子の塩基番号２４４５位の多型、
（ｖ）前記工程によって得られる多型情報から核酸試料の遺伝子型を決定する工程、及び
（ｖｉ）決定された遺伝子型から冠動脈攣縮の遺伝的リスクを求める工程。
［５］　以下の（１）〜（４）からなるグループより選択される二つ以上の核酸を含んでなる遺伝子型検出用キット、
（１）腫瘍壊死因子α遺伝子の塩基番号−８６３位の多型を解析するための核酸、
（２）ＮＡＤＨ／ＮＡＤＰＨオキシダーゼｐ２２フォックス遺伝子の塩基番号２４２位の多型を解析するための核酸、
（３）アポリポプロテインＥ遺伝子の塩基番号−２１９位の多型を解析するための核酸、及び
（４）アポリポプロテインＣ−ＩＩＩ遺伝子の塩基番号−４８２位の多型を解析するための核酸。
［６］　以下の（５）〜（９）からなるグループより選択される二つ以上の核酸を含んでなる遺伝子型検出用キット、
（５）ストロメライシン１遺伝子の塩基番号−１１７１位の多型を解析するための核酸、
（６）腫瘍壊死因子アポリポプロテインＥ遺伝子の塩基番号４０７０位の多型を解析するための核酸、
（７）インターロイキン６遺伝子の塩基番号−６３４位の多型を解析するための核酸、
（８）内皮型一酸化窒素合成酵素遺伝子の塩基番号−７８６位の多型を解析するための核酸、及び
（９）脂肪酸結合タンパク質２遺伝子の塩基番号２４４５位の多型を解析するための核酸。
［７］　以下の（１）〜（４）からなるグループより選択される二つ以上の核酸が不溶性支持体に固定されてなる固定化核酸、
（１）腫瘍壊死因子α遺伝子の塩基番号−８６３位の多型を解析するための核酸、
（２）ＮＡＤＨ／ＮＡＤＰＨオキシダーゼｐ２２フォックス遺伝子の塩基番号２４２位の多型を解析するための核酸、
（３）アポリポプロテインＥ遺伝子の塩基番号−２１９位の多型を解析するための核酸、及び
（４）アポリポプロテインＣ−ＩＩＩ遺伝子の塩基番号−４８２位の多型を解析するための核酸。
［８］　以下の（５）〜（９）からなるグループより選択される二つ以上の核酸が不溶性支持体に固定されてなる固定化核酸、
（５）ストロメライシン１遺伝子の塩基番号−１１７１位の多型を解析するための核酸、
（６）アポリポプロテインＥ遺伝子の塩基番号４０７０位の多型を解析するための核酸、
（７）インターロイキン６遺伝子の塩基番号−６３４位の多型を解析するための核酸、
（８）内皮型一酸化窒素合成酵素遺伝子の塩基番号−７８６位の多型を解析するための核酸、及び
（９）脂肪酸結合タンパク質２遺伝子の塩基番号２４４５位の多型を解析するための核酸。
【０００６】
【発明の実施の形態】
本発明の第１の局面は核酸試料の遺伝子型を検出する方法に関し、その一態様は以下の（１）〜（４）からなるグループより選択される二つ以上の多型を解析する工程を含むことを特徴とする。他の態様としては、以下の（５）〜（９）からなるグループより選択される二つ以上の多型を解析する工程を含むことを特徴とする。尚、以上の工程の結果得られる多型情報から核酸試料の遺伝子型を決定することにより冠動脈攣縮の遺伝的リスクを求めることができる。
（１）腫瘍壊死因子α（Ｔｕｍｏｒ　ｎｅｃｒｏｓｉｓ　ｆａｃｔｏｒ−α）遺伝子の塩基番号−８６３位の多型：−８６３Ｃ→Ａ（以下、「ＴＮＦα（−８６３Ｃ→Ａ）多型」ともいう）
（２）ＮＡＤＨ／ＮＡＤＰＨオキシダーゼｐ２２フォックス（ＮＡＤＨ／ＮＡＤＰＨ　ｏｘｉｄａｓｅ　ｐ２２　ｐｈｏｘ）遺伝子の塩基番号２４２位の多型：２４２Ｃ→Ｔ（以下、「ｐ２２フォックス（２４２Ｃ→Ｔ）多型」ともいう）
（３）アポリポプロテインＥ（Ａｐｏｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ　Ｅ）遺伝子の塩基番号−２１９位の多型：−２１９Ｇ→Ｔ（以下、「ＡｐｏＥ（−２１９Ｇ→Ｔ）多型」ともいう）
（４）　アポリポプロテインＣ−ＩＩＩ（Ａｐｏｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ　Ｃ−ＩＩＩ）遺伝子の塩基番号−４８２位の多型：−４８２Ｃ→Ｔ（以下、「ＡｐｏＣ−ＩＩＩ（−４８２Ｃ→Ｔ）多型」ともいう）
（５）ストロメライシン１（Ｓｔｒｏｍｅｌｙｓｉｎ−１）遺伝子の塩基番号−１１７１位の多型：−１１７１／５Ａ→６Ａ（以下、「ストロメライシン１（−１１７１／５Ａ→６Ａ）多型」ともいう）
（６）アポリポプロテインＥ（Ａｐｏｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ　Ｅ）遺伝子の塩基番号４０７０位の多型：４０７０Ｃ→Ｔ（以下、「ＡｐｏＥ（４０７０Ｃ→Ｔ）多型」ともいう）
（７）インターロイキン６（Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−６）遺伝子の塩基番号−６３４位の多型：−６３４Ｃ→Ｇ（以下、「ＩＬ−６（−６３４Ｃ→Ｇ）多型」ともいう）
（８）内皮型一酸化窒素合成酵素（Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ　ｎｉｔｒｉｃ　ｏｘｉｄｅ　ｓｙｎｔｈａｓｅ）遺伝子の塩基番号−７８６位の多型：−７８６Ｔ→Ｃ（以下、「ＥＮＯＳ（−７８６Ｔ→Ｃ）多型」ともいう）
（９）脂肪酸結合タンパク質２（Ｆａｔｔｙ　ａｃｉｄ−ｂｉｎｄｉｎｇ　ｐｒｏｔｅｉｎ　２）遺伝子の塩基番号２４４５位の多型：２４４５Ｇ→Ａ（以下、「ＦＡＢＰ２（２４４５Ｇ→Ａ）多型」ともいう）
【０００７】
以上において−８６３Ｃ→Ａのような表記は、当該塩基番号位置の多型が矢印の前又は後の塩基である二つの遺伝子型からなることを意味する。但し、−１１７１／５Ａ→６Ａは塩基番号−１１７１位から３’方向にＡ（アデニン）が連続して５個存在する遺伝子型と６個存在する遺伝子型からなる多型を意味する。
【０００８】
各遺伝子における塩基番号は公共のデータベースであるＧｅｎＢａｎｋ（ＮＣＢＩ）に登録されている公知の配列を基準として表される。尚、配列番号１の塩基配列（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　Ｎｏ．　Ｌ１１６９８：Ｈｏｍｏ　ｓａｐｉｅｎｓ　ｔｕｍｏｒ　ｎｅｃｒｏｓｉｓ　ｆａｃｔｏｒ　ａｌｐｈａ　ｇｅｎｅ，　ｐｒｏｍｏｔｅｒ　ｒｅｇｉｏｎ）において１９７番目の塩基が腫瘍壊死因子α遺伝子の−８６３位塩基に相当する。同様に配列番号２の塩基配列（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　Ｎｏ．　Ｍ６１１０７：Ｈｏｍｏ　ｓａｐｉｅｎｓ　ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ　ｂ　ｌｉｇｈｔ　ｃｈａｉｎ　（ＣＹＢＡ）　ｇｅｎｅ，　ｅｘｏｎｓ　３　ａｎｄ　４）において６８４番目の塩基がＮＡＤＨ／ＮＡＤＰＨオキシダーゼｐ２２フォックス遺伝子の２４２位塩基に相当し、配列番号３の塩基配列（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　Ｎｏ．　ＡＦ０５５３４３：Ｈｏｍｏ　ｓａｐｉｅｎｓ　ａｐｏｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ　Ｅ　（ＡＰＯＥ）　ｇｅｎｅ，　５’　ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ　ｒｅｇｉｏｎ，　ｐａｒｔｉａｌ　ｓｅｑｕｅｎｃｅ）において８０１番目の塩基がアポリポプロテインＥ遺伝子の−２１９位塩基に相当し、配列番号４の塩基配列（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　Ｎｏ．　Ｘ１３３６７：Ｈｕｍａｎ　ＤＮＡ　ｆｏｒ　ａｐｏｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ　Ｃ−ＩＩＩ　５’−ｆｌａｎｋ）において９３６番目の塩基がアポリポプロテインＣ−ＩＩＩ遺伝子の−４８２位塩基に相当し、配列番号５の塩基配列（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　Ｎｏ．　Ｕ４３５１１：Ｈｏｍｏ　ｓａｐｉｅｎｓ　ｓｔｒｏｍｅｌｙｓｉｎ−１　ｇｅｎｅ，ｐｒｏｍｏｔｅｒ　ｒｅｇｉｏｎ）において６９８番目の塩基がストロメライシン１遺伝子の−１１７１位塩基に相当し、配列番号６の塩基配列（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　Ｎｏ．　Ｍ１００６５　Ｊ０３０５３　Ｊ０３０５４：Ｈｕｍａｎ　ａｐｏｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ　Ｅ　（ｅｐｓｉｌｏｎ−４　ａｌｌｅｌｅ）　ｇｅｎｅ，　ｃｏｍｐｌｅｔｅ　ｃｄｓ）において４０７０番目の塩基がアポリポプロテインＥ遺伝子の４０７０位塩基に相当し、配列番号７の塩基配列（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　Ｎｏ．　ＡＦ３７２２１４：Ｈｏｍｏ　ｓａｐｉｅｎｓ　ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ　６　（ＩＬ６）　ｇｅｎｅ，　ｃｏｍｐｌｅｔｅ　ｃｄｓ）において１１１１番目の塩基がインターロイキン６遺伝子の−６３４位塩基に相当し、配列番号８の塩基配列（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　Ｎｏ．　Ｌ１０６９３：Ｈｕｍａｎ　ｃｏｎｓｔｉｔｕｔｉｖｅ　ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ　ｎｉｔｒｉｃ　ｏｘｉｄｅ　ｓｙｎｔｈａｓｅ　ｇｅｎｅ，　ｅｘｏｎ　１　ａｎｄ　ｐｒｏｍｏｔｅｒ　ｒｅｇｉｏｎ）において８１５番目の塩基が内皮型一酸化窒素合成酵素遺伝子の−７８６位塩基に相当し、配列番号９の塩基配列（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　Ｎｏ．　Ｍ１８０７９　Ｊ０３４６５：Ｈｕｍａｎ，　ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ　ｆａｔｔｙ　ａｃｉｄ　ｂｉｎｄｉｎｇ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｇｅｎｅ，　ｃｏｍｐｌｅｔｅ　ｃｄｓ，　ａｎｄ　ａｎ　Ａｌｕ　ｒｅｐｅｔｉｔｉｖｅ　ｅｌｅｍｅｎｔ）において２４４５番目の塩基が脂肪酸結合タンパク質２遺伝子の２４４５位塩基に相当する。
【０００９】
本発明において「多型を解析する」とは、解析対象の遺伝子多型について核酸試料がどのような遺伝子型を有するかを調べることを意味し、多型が存在する位置の塩基（塩基配列）を調べることと同義である。典型的には、ＴＮＦα（−８６３Ｃ→Ａ）多型の解析を例に採れば、核酸試料における腫瘍壊死因子αの遺伝子型がＣＣ（−８６３位塩基が両アレル共にＣのホモ接合体）、ＣＡ（−８６３位塩基がＣのアレルとＡのアレルとのヘテロ接合体）、及びＡＡ（−８６３位塩基が両アレル共にＡのホモ接合体）の中のいずれであるかを調べることを意味する。
【００１０】
上記の（１）〜（４）の多型は、後述の実施例で示されるように、日本人男性を対象とした解析において冠動脈攣縮の遺伝的リスクの判定に利用することが特に有効と認められた多型である。従ってこれらの多型を解析対象とすることは、被験者として男性（特に日本人男性）を採用するときに、より高精度で予知確率の高い診断を可能とする。
【００１１】
同様に、上記の（５）〜（９）の多型は、後述の実施例で示されるように、日本人女性を対象とした解析において冠動脈攣縮の遺伝的リスクの判定に利用することが特に有効と認められた多型である。従ってこれらの多型を解析対象とすることは、被験者として女性（特に日本人女性）を採用するときに、より高精度で予知確率の高い診断を可能とする。
【００１２】
ここで、原則的には解析する多型の数の増加に比例して核酸試料の遺伝子型がより細かく分類され、これによって一層予知確率の高い冠動脈攣縮の遺伝的リスクの診断を行うことができる。かかる見地から、上記の（１）〜（４）の多型の中でより多くの多型を解析して遺伝子型を検出することが好ましい。従って、（１）〜（４）のすべての多型を解析することが最も好ましい。三つ以下の多型を組み合わせて遺伝子型の検出を行う場合には、後述の実施例で示されるオッズ比の高い多型を優先的に選択して用いることが好ましい。例えば三つの多型を組み合わせて用いるのであれば、オッズ比が上位である三つの多型、即ち（２）、（３）、及び（４）を選択することが好ましい。同様に例えば二つの多型を組み合わせて用いるのであれば（３）及び（４）を選択することが好ましい。
【００１３】
（５）〜（９）の多型から選択される二つ以上の多型を解析する場合も同様に、これらすべての多型、即ち五つの多型を解析することが最も好ましい。四つ以下の多型を組み合わせて遺伝子型の検出を行う場合には、後述の実施例で示されるオッズ比の高い多型を優先的に選択して用いることが好ましい。例えば四つの多型を組み合わせて用いるのであれば、オッズ比が上位である四つの多型、即ち（５）、（６）、（７）、及び（８）を選択することが好ましい。同様に例えば三つの多型を組み合わせて用いるのであれば（５）、（６）、及び（７）を選択することが好ましい。同様に例えば二つの多型を組み合わせて用いるのであれば（５）及び（７）を選択することが好ましい。
【００１４】
各遺伝子多型を解析する方法は特に限定されるものではなく例えば、アリル特異的プライマー（及びプローブ）を用い、ＰＣＲ法による増幅、及び増幅産物の多型を蛍光又は発光によって解析する方法や、ＰＣＲ（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ　ｃｈａｉｎ　ｒｅａｃｔｉｏｎ）法を利用したＰＣＲ−ＲＦＬＰ（ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ　ｆｒａｇｍｅｎｔ　ｌｅｎｇｔｈ　ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ：制限酵素断片長多型）法、ＰＣＲ−ＳＳＣＰ（ｓｉｎｇｌｅ　ｓｔｒａｎｄ　ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ　ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ：単鎖高次構造多型）法（Ｏｒｉｔａ，Ｍ．　ｅｔ　ａｌ．，　Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．，　Ｕ．Ｓ．Ａ．，　８６，　２７６６−２７７０（１９８９）等）、ＰＣＲ−ＳＳＯ（ｓｐｅｃｉｆｉｃ　ｓｅｑｕｅｎｃｅ　ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ：特異的配列オリゴヌクレオチド）法、ＰＣＲ−ＳＳＯ法とドットハイブリダイゼーション法を組み合わせたＡＳＯ（ａｌｌｅｌｅ　ｓｐｅｃｉｆｉｃ　ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ：アレル特異的オリゴヌクレオチド）ハイブリダイゼーション法（Ｓａｉｋｉ，　Ｎａｔｕｒｅ，　３２４，　１６３−１６６（１９８６）等）、又はＴａｑＭａｎ−ＰＣＲ法（Ｌｉｖａｋ，　ＫＪ，　Ｇｅｎｅｔ　Ａｎａｌ，１４，１４３（１９９９），Ｍｏｒｒｉｓ，　Ｔ．　ｅｔ　ａｌ．，　Ｊ．　Ｃｌｉｎ．　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，３４，２９３３（１９９６））、Ｉｎｖａｄｅｒ法（Ｌｙａｍｉｃｈｅｖ　Ｖ　ｅｔ　ａｌ．，　Ｎａｔ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，１７，２９２（１９９９））、プライマー伸長法を用いたＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ／ＭＳ（ｍａｔｒｉｘ）法（Ｈａｆｆ　ＬＡ，　Ｓｍｉｒｎｏｖ　ＩＰ，　Ｇｅｎｏｍｅ　Ｒｅｓ　７，３７８（１９９７））、ＲＣＡ（ｒｏｌｌｉｎｇ　ｃｙｃｌｅ　ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）法（Ｌｉｚａｒｄｉ　ＰＭ　ｅｔ　ａｌ．，　Ｎａｔ　　Ｇｅｎｅｔ　１９，２２５（１９９８））、ＤＮＡチップ又はマイクロアレイを用いた方法（Ｗａｎｇ　ＤＧ　ｅｔ　ａｌ．，　Ｓｃｉｅｎｃｅ　２８０，１０７７（１９９８）等）、プライマー伸長法、サザンブロットハイブリダイゼーション法、ドットハイブリダイゼーション法（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ，Ｅ．，　Ｊ．　Ｍｏｌ．　Ｂｉｏｌ．　９８，　５０３−５１７（１９７５））等、公知の方法を採用できる。さらに、解析対象の多型部分を直接シークエンスすることにより解析してもよい。尚、これらの方法を任意に組み合わせて多型解析を行ってもよい。
【００１５】
核酸試料が少量の場合には、検出感度ないし精度の面からＰＣＲ法を利用した方法（例えばＰＣＲ−ＲＦＬＰ法）により解析することが好ましい。また、ＰＣＲ法又はＰＣＲ法を応用した方法などの遺伝子増幅法により核酸試料を予め増幅（核酸試料の一部領域の増幅を含む）した後、上記いずれかの解析方法を適用することもできる。一方、多数の核酸試料を解析する場合には、アリル特異的ＰＣＲ法、アリル特異的ハイブリダイゼーション法、ＴａｑＭａｎ−ＰＣＲ法、Ｉｎｖａｄｅｒ法、プライマー伸長法を用いたＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ／ＭＳ（ｍａｔｒｉｘ）法、ＲＣＡ（ｒｏｌｌｉｎｇ　ｃｙｃｌｅ　ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）法、又はＤＮＡチップ又はマイクロアレイを用いた方法等、多数の検体を比較的短時間で解析することが可能な解析方法を用いることが特に好ましい。
【００１６】
以上の方法では、各方法に応じたプライマーやプローブ等の核酸（本発明において、「多型解析用核酸」ともいう）が使用される。多型解析用核酸の例としては、解析対象の多型を含む遺伝子において当該多型部位を含む一定領域（部分ＤＮＡ領域）に相補的な配列を有する核酸を挙げることができる。また、解析対象の多型を含む遺伝子において当該多型部位を含む一定領域（部分ＤＮＡ領域）に相補的な配列を有し、当該多型部分を含むＤＮＡフラグメントを特異的に増幅できるように設計された核酸（プライマー）を挙げることができる。このような核酸としては、例えば腫瘍壊死因子α遺伝子の−８６３位の多型が解析対象の場合には−８６３位の塩基がＣ（シトシン）である腫瘍壊死因子α遺伝子の−８６３位塩基を含む部分ＤＮＡ領域に相補的な配列を有する核酸、又は−８６３位の塩基がＡ（アデニン）である腫瘍壊死因子α遺伝子の３９３２位塩基を含む部分ＤＮＡ領域に相補的な配列を有する核酸が該当する。
【００１７】
多型解析用核酸の他の具体例としては、解析対象の多型部位がいずれかの遺伝子型である場合にのみ当該多型部位を含む部分ＤＮＡ領域を特異的に増幅するように設計された核酸セットを挙げることができる。より具体的には解析対象の多型部位を含む部分ＤＮＡ領域を特異的に増幅するように設計された核酸セットであって、多型部位がいずれかの遺伝子型であるアンチセンス鎖の当該多型部位を含む部分ＤＮＡ領域に対して特異的にハイブリダイズするセンスプライマーと、センス鎖の一部領域に対して特異的にハイブリダイズするアンチセンスプライマーとからなる核酸セットを例示することができる。このような核酸セットとしては、腫瘍壊死因子α遺伝子の−８６３位の多型が解析対象の場合には腫瘍壊死因子α遺伝子の−８６３位塩基を含む部分ＤＮＡ領域を特異的に増幅するように設計された核酸セットであって、−８６３位塩基がＣ（シトシン）である腫瘍壊死因子α遺伝子のアンチセンス鎖において−８６３位塩基を含む部分ＤＮＡ領域に対して特異的にハイブリダイズするセンスプライマーと、センス鎖の一部領域に対して特異的にハイブリダイズするアンチセンスプライマーとからなる核酸セット、又は−８６３位塩基がＡ（アデニン）である腫瘍壊死因子α遺伝子のアンチセンス鎖において−８６３位塩基を含む部分ＤＮＡ領域に対して特異的にハイブリダイズするセンスプライマーと、センス鎖の一部領域に対して特異的にハイブリダイズするアンチセンスプライマーとからなる核酸セットが該当する。ここで、増幅される部分ＤＮＡ領域の長さはその検出に適した範囲で適宜設定され例えば５０ｂｐ〜２００ｂｐ、好ましくは８０ｂｐ〜１５０ｂｐである。より具体的には例えばＴＮＦα（−８６３Ｃ→Ａ）多型解析用の核酸プライマーとして次の配列を有するものを例示できる。尚、以下の配列の下線部は多型に対応する部分を表す。また、配列中のＮはＡ、Ｔ、Ｃ、及びＧのいずれかであることを意味する。
【００１８】
アンチセンスプライマー

【００１９】
同様に、ｐ２２フォックス（２４２Ｃ→Ｔ）多型解析用の核酸プライマーとして次の配列を有するものを例示できる。

【００２０】
同様に、ＡｐｏＥ（−２１９Ｇ→Ｔ）多型解析用の核酸プライマーとして次の配列を有するものを例示できる。

【００２１】
同様に、ＡｐｏＣ−ＩＩＩ（−４８２Ｃ→Ｔ）多型解析用の核酸プライマーとして次の配列を有するものを例示できる。

【００２２】
同様に、ストロメライシン１（−１１７１／５Ａ→６Ａ）多型解析用の核酸プライマーとして次の配列を有するものを例示できる。

【００２３】
同様に、ＡｐｏＥ（４０７０Ｃ→Ｔ）多型解析用の核酸プライマーとして次の配列を有するものを例示できる。

【００２４】
同様に、ＩＬ−６（−６３４Ｃ→Ｇ）多型解析用の核酸プライマーとして次の配列を有するものを例示できる。

【００２５】
同様に、ＥＮＯＳ（−７８６Ｔ→Ｃ）多型解析用の核酸プライマーとして次の配列を有するものを例示できる。

【００２６】
同様にＦＡＢＰ２（２４４５Ｇ→Ａ）多型解析用の核酸プライマーとして次の配列を有するものを例示できる。

【００２７】
一方、プローブの具体例として以下のものを挙げることができる。
ＡｐｏＣ−ＩＩＩ（−４８２Ｃ→Ｔ）多型解析用プローブとして

【００２８】
ＦＡＢＰ２（２４４５Ｇ→Ａ）多型解析用プローブとして

【００２９】
以上の核酸プライマー、核酸プローブは単なる一例であって、核酸プライマーであれば目的の増幅反応を支障なく行える限度において、他方核酸プローブであれば目的のハイブリダイゼーション反応を支障なく行える限度において一部の塩基配列に改変が施されたものであってもよい。ここでの「一部の改変」とは、塩基の一部が欠失、置換、挿入及び／又は付加されていることを意味する。改変にかかる塩基数は例えば１〜７個、好ましくは１〜５個、更に好ましくは、１〜３個である。尚、このような改変は、原則として多型部位に対応する塩基以外の部分において行われる。ただし、解析対象の多型がストロメライシン１（−１１７１／５Ａ→６Ａ）多型の場合には、多型部位に対応する塩基の一部を改変して得られる核酸をプライマー又はプローブとして用いることも可能である。
【００３０】
多型解析用核酸（プローブ、プライマー）には、解析方法に応じて適宜ＤＮＡ断片又はＲＮＡ断片が用いられる。多型解析用核酸の塩基長はそれぞれの機能が発揮される長さであればよく、プライマーとして用いられる場合の塩基長の例としては１０〜５０ｂｐ程度、好ましくは１５〜４０ｂｐ程度、更に好ましくは１５〜３０ｂｐ程度である。
尚、プライマーとして用いられる場合には増幅対象に特異的にハイブリダイズし、目的のＤＮＡフラグメントを増幅することができる限り鋳型となる配列に対して多少のミスマッチがあってもよい。プローブの場合も同様に、検出対象の配列と特異的なハイブリダイズが行える限り、検出対象の配列に対して多少のミスマッチがあってもよい。ミスマッチの程度としては、１〜数個、好ましくは１〜５個、更に好ましくは１〜３個である。
多型解析用核酸（プライマー、プローブ）はホスホジエステル法など公知の方法によって合成することができる。尚、多型解析用核酸の設計、合成等に関しては成書（例えばＭｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ｔｈｉｒｄ　Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ，　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ）を参考にすることができる。
【００３１】
本発明における多型解析用核酸を予め標識物質で標識しておくことができる。このような標識化核酸を用いることにより例えば増幅産物の標識量を指標として多型の解析を行うことができる。また、多型を構成する各遺伝子型の遺伝子における部分ＤＮＡ領域をそれぞれ特異的に増幅するように設計された２種類のプライマーを互いに異なる標識物質で標識しておけば、増幅産物から検出される標識物質及び標識量によって核酸試料の遺伝子型を判別できる。このような標識化プライマーを用いた検出方法の具体例としては、多型を構成する各遺伝子型のセンス鎖にそれぞれ特異的にハイブリダイズする２種類の核酸プライマー（アリル特異的センスプライマー）をフルオレセインイソチオシアネートとテキサスレッドでそれぞれ標識し、これら標識化プライマーとアンチセンス鎖に特異的にハイブリダイズするアンチセンスプライマーとを用いて多型部位を含む部分ＤＮＡ領域を増幅し、得られた増幅産物における各蛍光物質の標識量を測定して多型を検出する方法を挙げることができる。尚、ここでのアンチセンスプライマーを例えばビオチンで標識しておけば、ビオチンとアビジンとの特異的な結合を利用して増幅産物の分離を行うことができる。
【００３２】
多型解析用核酸の標識に用いられる標識物質としては^３２Ｐなどの放射性同位元素、フルオレセインイソチオシアネート、テトラメチルローダミンイソチオシアネート、テキサスレッドなどの蛍光物質を例示でき、標識方法としてはアルカリフォスファターゼ及びＴ４ポリヌクレオチドキナーゼを用いた５’末端標識法、Ｔ４　ＤＮＡポリメラーゼやＫｌｅｎｏｗ断片を用いた３’末端標識法、ニックトランスレーション法、ランダムプライマー法（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ｔｈｉｒｄ　Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｈａｐｔｅｒ　９，Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ，　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ）などを例示できる。
【００３３】
以上の多型解析用核酸を不溶性支持体に固定化した状態で用いることもできる。固定化に使用する不溶性支持体をチップ状、ビーズ状などに加工しておけば、これら固定化核酸を用いて多型の解析をより簡便に行うことができる。
【００３４】
核酸試料は、被験者の血液、皮膚細胞、粘膜細胞、毛髪等から公知の抽出方法、精製方法を用いて調製することができる。多型解析対象の遺伝子を含むものであれば、任意の長さのゲノムＤＮＡを核酸試料として用いることができる。また、必ずしも解析対象の遺伝子のすべてが一の核酸上に存在する核酸試料を用いる必要はない。即ち、本発明の核酸試料としては、解析対象の遺伝子のすべてが一の核酸上に存在しているもの、解析対象の遺伝子が二以上の核酸上に分かれて存在しているもののいずれをも用いることができる。尚、核酸試料において解析対象の遺伝子が完全な状態（即ち、遺伝子の全長が存在する状態）でなくても、少なくとも解析される多型部位が存在している限りにおいて断片的、部分的な状態であってもよい。
【００３５】
各遺伝子多型の解析は遺伝子多型ごとに、又は複数若しくは全部を同時に行う。前者の場合としては例えば、被験者から得た核酸試料を解析対象の多型の数に合わせて分注し、各多型の解析を個別に行う。後者の場合としては例えばＤＮＡチップまたはマイクロアレイによって行うことができる。尚、ここでいう同時とは解析過程のすべての操作が同時に行われることのみを意味するのではなく、一部の操作（例えば核酸増幅操作、プローブのハイブリダイズ、又は検出）が同時に行われる場合も含む。
【００３６】
解析対象の遺伝子の転写産物であるｍＲＮＡを利用して各遺伝子の多型を解析することもできる。例えば被験者の血液、尿等から解析対象である遺伝子のｍＲＮＡを抽出、精製した後、ノーザンブロット法（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ，　Ｔｈｉｒｄ　Ｅｄｉｔｉｏｎ，７．４２，Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ，　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ）、ドットブロット法（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ，　Ｔｈｉｒｄ　Ｅｄｉｔｉｏｎ，７．４６，Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ，　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ）、ＲＴ−ＰＣＲ法（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ，　Ｔｈｉｒｄ　Ｅｄｉｔｉｏｎ，８．４６，Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ，　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ）、ＤＮＡチップ（ＤＮＡアレイ）を用いた方法などを実行することにより、ｍＲＮＡを出発材料として多型解析を行うことができる。
【００３７】
さらに、上記の多型の中でアミノ酸の変化を伴うものについては、解析対象の遺伝子の発現産物を用いて多型解析を行うこともできる。この場合、多型部位に対応するアミノ酸を含んでいる限り、部分タンパク質、部分ペプチドであっても解析用試料として用いることができる。
【００３８】
このような遺伝子の発現産物を用いて解析する方法としては、多型部位のアミノ酸を直接分析する方法、又は立体構造の変化を利用して免疫学的に分析する方法などが挙げられる。前者としては、周知のアミノ酸配列分析法（エドマン法を利用した方法）を用いることができる。後者としては、多型を構成するいずれかの遺伝子型を有する遺伝子の発現産物に特異的な結合活性を有するモノクローナル抗体又はポリクローナル抗体を用いた、ＥＬＩＳＡ法（酵素結合免疫吸着定量法）、ラジオイムノアッセイ、免疫沈降法、免疫拡散法等などを用いることができる。
【００３９】
以上説明した本発明の検出方法を実行することにより得られる多型情報を、冠動脈攣縮の遺伝的リスクの診断に利用することができる。即ち、本発明は以上の検出方法によって得られる多型情報から核酸試料の遺伝子型を決定する工程、及び決定された核酸試料の遺伝子型から遺伝的リスクを求める工程を含んでなる、冠動脈攣縮のリスク診断方法も提供する。ここでの遺伝子型の決定は、典型的には、検出対象の多型に関して核酸試料の両アレルがいずれの遺伝子型をそれぞれ有するかを決定することである。ＴＮＦα（−８６３Ｃ→Ａ）多型が検出対象である場合を例に採れば、典型的には核酸試料における腫瘍壊死因子αの遺伝子型がＣＣ（−８６３位塩基が両アレル共にＣのホモ接合体）、ＣＡ（−８６３位塩基がＣのアレルとＡのアレルとのヘテロ接合体）、及びＡＡ（−８６３位塩基が両アレル共にＡのホモ接合体）の中のいずれであるかを決定することである。
【００４０】
後述の実施例で得られた結果を考慮すれば、高精度かつ予知確率の高い冠動脈攣縮の遺伝的リスクの診断を可能とするために、例えばＴＮＦα（−８６３Ｃ→Ａ）多型であれば核酸試料の遺伝子型がＡＡであるか、それともＣＡ又はＣＣのいずれかであるかが決定される。同様にｐ２２フォックス（２４２Ｃ→Ｔ）多型であればＴＴ又はＣＴのいずれかであるか、それともＣＣであるか、ＡｐｏＥ（−２１９Ｇ→Ｔ）多型であればＴＴであるか、それともＧＴ又はＧＧのいずれかであるか、ＡｐｏＣ−ＩＩＩ（−４８２Ｃ→Ｔ）多型であればＴＴ又はＣＴのいずれかであるか、それともＣＣであるか、ストロメライシン１（−１１７１／５Ａ→６Ａ）多型であれば６Ａ／６Ａ又は５Ａ／６Ａのいずれかであるか、それとも５Ａ／５Ａであるか、ＡｐｏＥ（４０７０Ｃ→Ｔ）多型であればＴＴ又はＣＴのいずれかであるか、それともＣＣであるか、ＩＬ−６（−６３４Ｃ→Ｇ）多型であればＧＧであるか、それともＣＧ又はＣＣのいずれかであるか、ＥＮＯＳ（−７８６Ｔ→Ｃ）多型であればＣＣ又はＴＣのいずれかであるか、それともＴＴであるか、ＦＡＢＰ２（２４４５Ｇ→Ａ）多型であればＡＡであるか、それともＧＡ又はＧＧのいずれかであるかが決定される。
【００４１】
冠動脈攣縮の遺伝的リスクを診断することにより、将来的に冠動脈攣縮を罹患するおそれの程度（発症し易さ）、即ち発症リスク（発症脆弱性）が予測され、また遺伝子型という客観的指標に基づいて冠動脈攣縮の認定や病状の把握を行うことが可能となる。換言すれば、本発明の診断方法によって冠動脈攣縮の発症リスクの評価、冠動脈攣縮に罹患していることの認定、又は症状の把握を行うことができる。中でも発症リスクの評価を行えることは臨床上極めて有意義である。発症リスクを事前に知ることは冠動脈攣縮の一次予防に貢献し、適切な予防措置を講じることを可能とするからである。
本発明の診断方法によって得られる情報は、適切な治療法の選択や、予後の改善、患者のＱＯＬ（クオリティー・オブ・ライフ）の向上、又は発症リスクの低減などに利用することができる。
【００４２】
本発明の診断方法を実行することにより、冠動脈攣縮の発症リスク等をモニターすることができる。このようなモニターの結果、ある外的因子（環境因子、薬剤の投与など）と発症リスク等の増加との間に相関関係が認められれば、当該外的因子を危険因子と認定し、この情報を基に発症リスク等の低減を図ることが可能と考えられる。
【００４３】
本発明で得られる冠動脈攣縮の発症に関連する遺伝情報は冠動脈攣縮の治療（予防的処置を含む）に利用され得る。例えば本発明の診断方法を実施した結果、解析対象の多型が冠動脈攣縮の発症リスクを高める遺伝子型であった場合に、発症リスクの低い遺伝子型を有する遺伝子を生体内に導入して発現させれば、当該遺伝子が発現することによって症状の軽減、発症の抑制、発症リスクの軽減などを期待できる。発症リスクの高い遺伝子型を有する遺伝子のｍＲＮＡに対するアンチセンス鎖を導入し、当該ｍＲＮＡの発現を抑制する方法によっても、同様の治療効果が期待される。
【００４４】
遺伝子又はアンチセンス鎖の導入は例えば、遺伝子導入用プラスミド又はウイルスベクターを用いた方法、エレクトロポーレーション（Ｐｏｔｔｅｒ，Ｈ．　ｅｔ　ａｌ．，　Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．　Ｕ．Ｓ．Ａ．　８１，　７１６１−７１６５（１９８４））、超音波マイクロバブル（Ｌａｗｒｉｅ，　Ａ．，　ｅｔ　ａｌ．　Ｇｅｎｅ　Ｔｈｅｒａｐｙ　７，　２０２３−２０２７　（２０００））、リポフェクション（Ｆｅｌｇｎｅｒ，　Ｐ．Ｌ．　ｅｔ　ａｌ．，　　Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．　Ｕ．Ｓ．Ａ．　８４，７４１３−７４１７（１９８４））、マイクロインジェクション（Ｇｒａｅｓｓｍａｎｎ，Ｍ．　＆　Ｇｒａｅｓｓｍａｎｎ，Ａ．，　Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．　Ｕ．Ｓ．Ａ．　７３，３６６−３７０（１９７６））等の方法により行うことができる。これらの方法を利用して所望の遺伝子などを生体に対して直接的に導入（ｉｎ　ｖｉｖｏ法）又は間接的に導入（ｅｘ　ｖｉｖｏ法）することができる。
【００４５】
本発明の第２の局面は、上述した本発明の検出方法又は診断方法に使用されるキット（遺伝子型検出用キット、又は冠動脈攣縮診断用キット）を提供する。かかるキットには上記の（１）〜（４）の多型からなるグループより選択される二つ以上の多型を解析するための核酸（多型解析用核酸）が含まれる。他の態様としては上記の（５）〜（９）の多型からなるグループより選択される二つ以上の多型を解析するための核酸（多型解析用核酸）を含んでキットが構築される。
多型解析用核酸は、それが適用される解析方法（上述したアリル特異的核酸等を用いたＰＣＲ法を利用する方法、ＰＣＲ−ＲＦＬＰ法、ＰＣＲ−ＳＳＣＰ、ＴａｑＭａｎ−ＰＣＲ法、Ｉｎｖａｄｅｒ法等）において、解析対象の多型部分を含むＤＮＡ領域又はそれに対応するｍＲＮＡを特異的に増幅できるもの（プライマー）又は特異的に検出できるもの（プローブ）として設計される。以下に本発明において提供されるキットの具体例を示す。
【００４６】
以下の（１）〜（４）からなるグループより選択される二つ以上の核酸を含んでなる遺伝子型検出用キット、
（１）−８６３位塩基がＣである腫瘍壊死因子α遺伝子の−８６３位塩基を含む部分ＤＮＡ領域に相補的な配列を有する核酸、又は−８６３位塩基がＡである腫瘍壊死因子α遺伝子の−８６３位塩基を含む部分ＤＮＡ領域に相補的な配列を有する核酸、
（２）２４２位塩基がＣであるＮＡＤＨ／ＮＡＤＰＨオキシダーゼｐ２２フォックス遺伝子の２４２位塩基を含む部分ＤＮＡ領域に相補的な配列を有する核酸、又は２４２位塩基がＴであるＮＡＤＨ／ＮＡＤＰＨオキシダーゼｐ２２フォックス遺伝子の２４２位塩基を含む部分ＤＮＡ領域に相補的な配列を有する核酸、
（３）−２１９位塩基がＧであるアポリポプロテインＥ遺伝子の−２１９位塩基を含む部分ＤＮＡ領域に相補的な配列を有する核酸、又は−２１９位塩基がＴであるアポリポプロテインＥ遺伝子の−２１９位塩基を含む部分ＤＮＡ領域に相補的な配列を有する核酸、及び
（４）−４８２位塩基がＣであるアポリポプロテインＣ−ＩＩＩ遺伝子の−４８２位塩基を含む部分ＤＮＡ領域に相補的な配列を有する核酸、又は−４８２位塩基がＴであるアポリポプロテインＣ−ＩＩＩ遺伝子の−４８２位塩基を含む部分ＤＮＡ領域に相補的な配列を有する核酸。
以上では、（１）〜（４）からなるグループから二つ以上の核酸を選択してキットを構成しているが、（１）〜（４）の中から二つ以上を任意に選択してグループとし、かかるグループから二つ以上の核酸を選択してキットを構成してもよい。例えば（２）〜（４）からなるグループ（後述の実施例においてオッズ比が上位３位までの多型を解析するための核酸）より二つ以上の核酸を選択してキットを構成することができる。
【００４７】
以下の（５）〜（９）からなるグループより選択される二つ以上の核酸を含んでなる遺伝子型検出用キット、
（５）−１１７１位から３’方向に連続して５個のＡが存在するストロメライシン１遺伝子の該配列部分を含む部分ＤＮＡ領域に相補的な配列を有する核酸、又は−１１７１位から３’方向に連続して６個のＡが存在するストロメライシン１遺伝子の該配列部分を含む部分ＤＮＡ領域に相補的な配列を有する核酸、
（６）４０７０位塩基がＣであるアポリポプロテインＥ遺伝子の４０７０位塩基を含む部分ＤＮＡ領域に相補的な配列を有する核酸、又は４０７０位塩基がＴであるアポリポプロテインＥ遺伝子の４０７０位塩基を含む部分ＤＮＡ領域に相補的な配列を有する核酸、
（７）−６３４位塩基がＣであるインターロイキン６遺伝子の−６３４位塩基を含む部分ＤＮＡ領域に相補的な配列を有する核酸、又は−６３４位塩基がＧであるインターロイキン６遺伝子の−６３４位塩基を含む部分ＤＮＡ領域に相補的な配列を有する核酸、
（８）−７８６位塩基がＴである内皮型一酸化窒素合成酵素遺伝子の−７８６位塩基を含む部分ＤＮＡ領域に相補的な配列を有する核酸、又は−７８６位塩基がＣである内皮型一酸化窒素合成酵素遺伝子の−７８６位塩基を含む部分ＤＮＡ領域に相補的な配列を有する核酸、及び
（９）２４４５位塩基がＧである脂肪酸結合タンパク質２遺伝子の２４４５位塩基を含む部分ＤＮＡ領域に相補的な配列を有する核酸、又は２４４５位塩基がＡである脂肪酸結合タンパク質２遺伝子の２４４５位塩基を含む部分ＤＮＡ領域に相補的な配列を有する核酸。以上では、（５）〜（９）からなるグループから二つ以上の核酸を選択してキットを構成しているが、（５）〜（９）の中から二つ以上を任意に選択してグループとし、かかるグループから二つ以上の核酸を選択してキットを構成してもよい。例えば（５）〜（８）からなるグループ（後述の実施例においてオッズ比が上位４位までの多型を解析するための核酸）より二つ以上の核酸を選択してキットを構成したり、（５）〜（７）からなるグループ（後述の実施例においてオッズ比が上位３位までの多型を解析するための核酸）より二つ以上の核酸を選択してキットを構成することができる。
【００４８】
以下の（１）〜（４）からなるグループより選択される二つ以上の核酸セットを含んでなる遺伝子型検出用キット、
（１）核酸試料中の腫瘍壊死因子α遺伝子の−８６３位塩基がＣである場合にのみ、該腫瘍壊死因子α遺伝子の−８６３位塩基を含む部分ＤＮＡ領域を特異的に増幅するように設計された核酸セット、又は核酸試料中の腫瘍壊死因子α遺伝子の−８６３位塩基がＡである場合にのみ、該腫瘍壊死因子α遺伝子の−８６３位塩基を含む部分ＤＮＡ領域を特異的に増幅するように設計された核酸セット、
（２）核酸試料中のＮＡＤＨ／ＮＡＤＰＨオキシダーゼｐ２２フォックス遺伝子の２４２位塩基がＣである場合にのみ、該ＮＡＤＨ／ＮＡＤＰＨオキシダーゼｐ２２フォックス遺伝子の２４２位塩基を含む部分ＤＮＡ領域を特異的に増幅するように設計された核酸セット、又は核酸試料中のＮＡＤＨ／ＮＡＤＰＨオキシダーゼｐ２２フォックス遺伝子の２４２位塩基がＴである場合にのみ、該ＮＡＤＨ／ＮＡＤＰＨオキシダーゼｐ２２フォックス遺伝子の２４２位塩基を含む部分ＤＮＡ領域を特異的に増幅するように設計された核酸セット、
（３）核酸試料中のアポリポプロテインＥ遺伝子の−２１９位塩基がＧである場合にのみ、該アポリポプロテインＥ遺伝子の−２１９位塩基を含む部分ＤＮＡ領域を特異的に増幅するように設計された核酸セット、又は核酸試料中のアポリポプロテインＥ遺伝子の−２１９位塩基がＴである場合にのみ、該アポリポプロテインＥ遺伝子の−２１９位塩基を含む部分ＤＮＡ領域を特異的に増幅するように設計された核酸セット、及び
（４）核酸試料中のアポリポプロテインＣ−ＩＩＩ遺伝子の−４８２位塩基がＣである場合にのみ、該アポリポプロテインＣ−ＩＩＩ遺伝子の−４８２位塩基を含む部分ＤＮＡ領域を特異的に増幅するように設計された核酸セット、又は核酸試料中のアポリポプロテインＣ−ＩＩＩ遺伝子の−４８２位塩基がＴである場合にのみ、該アポリポプロテインＣ−ＩＩＩ遺伝子の−４８２位塩基を含む部分ＤＮＡ領域を特異的に増幅するように設計された核酸セット。
以上では、（１）〜（４）からなるグループから二つ以上の核酸セットを選択してキットを構成しているが、（１）〜（４）の中から二つ以上を任意に選択してグループとし、かかるグループから二つ以上の核酸セットを選択してキットを構成してもよい。例えば（２）〜（４）からなるグループ（後述の実施例においてオッズ比が上位３位までの多型を解析するための核酸セット）より二つ以上の核酸セットを選択してキットを構成することができる。
【００４９】
以下の（５）〜（９）からなるグループより選択される二つ以上の核酸セットを含んでなる遺伝子型検出用キット、
（５）核酸試料中のストロメライシン１遺伝子において−１１７１位から３’方向にＡが５個連続して存在する場合にのみ、ストロメライシン１遺伝子の該配列部分を含む部分ＤＮＡ領域を特異的に増幅するように設計された核酸セット、又は核酸試料中のストロメライシン１遺伝子において−１１７１位から３’方向にＡが６個連続して存在する場合にのみ、該ストロメライシン１遺伝子の該配列部分を含む部分ＤＮＡ領域を特異的に増幅するように設計された核酸セット、
（６）核酸試料中のアポリポプロテインＥ遺伝子の４０７０位塩基がＣである場合にのみ、該アポリポプロテインＥ遺伝子の４０７０位塩基を含む部分ＤＮＡ領域を特異的に増幅するように設計された核酸セット、又は核酸試料中のアポリポプロテインＥ遺伝子の４０７０位塩基がＴである場合にのみ、該アポリポプロテインＥ遺伝子の４０７０位塩基を含む部分ＤＮＡ領域を特異的に増幅するように設計された核酸セット、
（７）核酸試料中のインターロイキン６遺伝子の−６３４位塩基がＣである場合にのみ、該インターロイキン６遺伝子の−６３４位塩基を含む部分ＤＮＡ領域を特異的に増幅するように設計された核酸セット、又は核酸試料中のインターロイキン６遺伝子の−６３４位塩基がＧである場合にのみ、該インターロイキン６遺伝子の−６３４位塩基を含む部分ＤＮＡ領域を特異的に増幅するように設計された核酸セット、
（８）核酸試料中の内皮型一酸化窒素合成酵素遺伝子の−７８６位塩基がＴである場合にのみ、該内皮型一酸化窒素合成酵素遺伝子の−７８６位塩基を含む部分ＤＮＡ領域を特異的に増幅するように設計された核酸セット、又は核酸試料中の内皮型一酸化窒素合成酵素遺伝子の−７８６位塩基がＣである場合にのみ、該内皮型一酸化窒素合成酵素遺伝子の−７８６位塩基を含む部分ＤＮＡ領域を特異的に増幅するように設計された核酸セット、及び
（９）核酸試料中の脂肪酸結合タンパク質２遺伝子の２４４５位塩基がＧである場合にのみ、該脂肪酸結合タンパク質２遺伝子の２４４５位塩基を含む部分ＤＮＡ領域を特異的に増幅するように設計された核酸セット、又は核酸試料中の脂肪酸結合タンパク質２遺伝子の２４４５位塩基がＡである場合にのみ、該脂肪酸結合タンパク質２遺伝子の２４４５位塩基を含む部分ＤＮＡ領域を特異的に増幅するように設計された核酸セット。
以上では、（５）〜（９）からなるグループから二つ以上の核酸セットを選択してキットを構成しているが、（５）〜（９）の中から二つ以上を任意に選択してグループとし、かかるグループから二つ以上の核酸セットを選択してキットを構成してもよい。例えば（５）〜（８）からなるグループ（後述の実施例においてオッズ比が上位４位までの多型を解析するための核酸セット）より二つ以上の核酸セットを選択してキットを構成したり、（５）〜（７）からなるグループ（後述の実施例においてオッズ比が上位３位までの多型を解析するための核酸セット）より二つ以上の核酸セットを選択してキットを構成することができる。
【００５０】
以下の（１）〜（４）からなるグループより選択される二つ以上の核酸セットを含んでなる遺伝子型検出用キット、
（１）腫瘍壊死因子α遺伝子の−８６３位塩基を含む部分ＤＮＡ領域を特異的に増幅するように設計された核酸セットであって、−８６３位塩基がＣである腫瘍壊死因子α遺伝子の−８６３位塩基を含む部分ＤＮＡ領域、に対して特異的にハイブリダイズするアンチセンスプライマー及び／又は−８６３位塩基がＡである腫瘍壊死因子α遺伝子において−８６３位塩基を含む部分ＤＮＡ領域、に対して特異的にハイブリダイズするアンチセンスプライマーと、腫瘍壊死因子α遺伝子の一部領域に対して特異的にハイブリダイズするセンスプライマーと、からなる核酸セット、
（２）ＮＡＤＨ／ＮＡＤＰＨオキシダーゼｐ２２フォックス遺伝子の２４２位塩基を含む部分ＤＮＡ領域を特異的に増幅するように設計された核酸セットであって、２４２位塩基がＣであるＮＡＤＨ／ＮＡＤＰＨオキシダーゼｐ２２フォックス遺伝子において２４２位塩基を含む部分ＤＮＡ領域、に対して特異的にハイブリダイズするアンチセンスプライマー及び／又は２４２位塩基がＴであるＮＡＤＨ／ＮＡＤＰＨオキシダーゼｐ２２フォックス遺伝子において２４２位塩基を含む部分ＤＮＡ領域、に対して特異的にハイブリダイズするアンチセンスプライマーと、ＮＡＤＨ／ＮＡＤＰＨオキシダーゼｐ２２フォックス遺伝子の一部領域に対して特異的にハイブリダイズするセンスプライマーと、からなる核酸セット、
（３）アポリポプロテインＥ遺伝子の−２１９位塩基を含む部分ＤＮＡ領域を特異的に増幅するように設計された核酸セットであって、−２１９位塩基がＧであるアポリポプロテインＥ遺伝子において−２１９位塩基を含む部分ＤＮＡ領域、に対して特異的にハイブリダイズするセンスプライマー及び／又は−２１９位塩基がＴであるアポリポプロテインＥ遺伝子において−２１９位塩基を含む部分ＤＮＡ領域、に対して特異的にハイブリダイズするセンスプライマーと、アポリポプロテインＥ遺伝子の一部領域に対して特異的にハイブリダイズするアンチセンスプライマーと、からなる核酸セット、及び
（４）アポリポプロテインＣ−ＩＩＩ遺伝子の−４８２位塩基を含む部分ＤＮＡ領域を特異的に増幅するように設計された核酸セットであって、−４８２位塩基がＣであるアポリポプロテインＣ−ＩＩＩ遺伝子において−４８２位塩基を含む部分ＤＮＡ領域、に対して特異的にハイブリダイズするセンスプライマー及び／又は−４８２位塩基がＴであるアポリポプロテインＣ−ＩＩＩ遺伝子において−４８２位塩基を含む部分ＤＮＡ領域、に対して特異的にハイブリダイズするセンスプライマーと、アポリポプロテインＣ−ＩＩＩ遺伝子の一部領域に対して特異的にハイブリダイズするアンチセンスプライマーと、からなる核酸セット。
以上では、（１）〜（４）からなるグループから二つ以上の核酸セットを選択してキットを構成しているが、（１）〜（４）の中から二つ以上を任意に選択してグループとし、かかるグループから二つ以上の核酸セットを選択してキットを構成してもよい。例えば（２）〜（４）からなるグループ（後述の実施例においてオッズ比が上位３位までの多型を解析するための核酸セット）より二つ以上の核酸セットを選択してキットを構成することができる。
【００５１】
以下の（５）〜（９）からなるグループより選択される二つ以上の核酸セットを含んでなる遺伝子型検出用キット、
（５）ストロメライシン１遺伝子の−１１７１位塩基を含む部分ＤＮＡ領域を特異的に増幅するように設計された核酸セットであって、−１１７１位から３’方向にＡが５個連続して存在するストロメライシン１遺伝子において該配列部分を含む部分ＤＮＡ領域、に対して特異的にハイブリダイズするセンスプライマー及び／又は−１１７１位から３’方向にＡが６個連続して存在するストロメライシン１遺伝子において該配列部分を含む部分ＤＮＡ領域、に対して特異的にハイブリダイズするセンスプライマーと、ストロメライシン１遺伝子の一部領域に対して特異的にハイブリダイズするアンチセンスプライマーと、からなる核酸セット、
（６）アポリポプロテインＥ遺伝子の４０７０位塩基を含む部分ＤＮＡ領域を特異的に増幅するように設計された核酸セットであって、４０７０位塩基がＣであるアポリポプロテインＥ遺伝子において４０７０位塩基を含む部分ＤＮＡ領域、に対して特異的にハイブリダイズするセンスプライマー及び／又は４０７０位塩基がＴであるアポリポプロテインＥ遺伝子において４０７０位塩基を含む部分ＤＮＡ領域、に対して特異的にハイブリダイズするセンスプライマーと、アポリポプロテインＥ遺伝子の一部領域に対して特異的にハイブリダイズするアンチセンスプライマーと、からなる核酸セット、
（７）インターロイキン６遺伝子の−６３４位塩基を含む部分ＤＮＡ領域を特異的に増幅するように設計された核酸セットであって、−６３４位塩基がＣであるインターロイキン６遺伝子において−６３４位塩基を含む部分ＤＮＡ領域、に対して特異的にハイブリダイズするセンスプライマー及び／又は−６３４位塩基がＧであるインターロイキン６遺伝子において−６３４位塩基を含む部分ＤＮＡ領域、に対して特異的にハイブリダイズするセンスプライマーと、インターロイキン６遺伝子の一部領域に対して特異的にハイブリダイズするアンチセンスプライマーと、からなる核酸セット、
（８）内皮型一酸化窒素合成酵素遺伝子の−７８６位塩基を含む部分ＤＮＡ領域を特異的に増幅するように設計された核酸セットであって、−７８６位塩基がＴである内皮型一酸化窒素合成酵素遺伝子において−７８６位塩基を含む部分ＤＮＡ領域、に対して特異的にハイブリダイズするセンスプライマー及び／又は−７８６位塩基がＣである内皮型一酸化窒素合成酵素遺伝子において−７８６位塩基を含む部分ＤＮＡ領域、に対して特異的にハイブリダイズするセンスプライマーと、内皮型一酸化窒素合成酵素遺伝子の一部領域に対して特異的にハイブリダイズするアンチセンスプライマーと、からなる核酸セット、及び
（９）脂肪酸結合タンパク質２遺伝子の２４４５位塩基を含む部分ＤＮＡ領域を特異的に増幅するように設計された核酸セットであって、２４４５位塩基がＧである脂肪酸結合タンパク質２遺伝子において２４４５位塩基を含む部分ＤＮＡ領域、に対して特異的にハイブリダイズするセンスプライマー及び／又は２４４５位塩基がＡである脂肪酸結合タンパク質２遺伝子において２４４５位塩基を含む部分ＤＮＡ領域、に対して特異的にハイブリダイズするセンスプライマーと、脂肪酸結合タンパク質２遺伝子の一部領域に対して特異的にハイブリダイズするアンチセンスプライマーと、からなる核酸セット。
以上では、（５）〜（９）からなるグループから二つ以上の核酸セットを選択してキットを構成しているが、（５）〜（９）の中から二つ以上を任意に選択してグループとし、かかるグループから二つ以上の核酸セットを選択してキットを構成してもよい。例えば（５）〜（８）からなるグループ（後述の実施例においてオッズ比が上位４位までの多型を解析するための核酸セット）より二つ以上の核酸セットを選択してキットを構成したり、（５）〜（７）からなるグループ（後述の実施例においてオッズ比が上位３位までの多型を解析するための核酸セット）より二つ以上の核酸セットを選択してキットを構成することができる。
【００５２】
以下の（１）〜（４）からなるグループより選択される二つ以上の核酸セットを含んでなる遺伝子型検出用キット、
（１）−８６３位塩基がＣである腫瘍壊死因子α遺伝子のセンス鎖において−８６３位塩基を含む部分領域、に対して特異的にハイブリダイズし且つ第１の標識物質で標識された第１核酸と、−８６３位塩基がＡである腫瘍壊死因子α遺伝子のセンス鎖において−８６３位塩基を含む部分領域、に対して特異的にハイブリダイズし且つ第２の標識物質で標識された第２核酸と、及び腫瘍壊死因子α遺伝子のアンチセンス鎖の一部領域に対して特異的にハイブリダイズし且つ前記第１核酸又は前記第２核酸とともに使用されて腫瘍壊死因子α遺伝子の−８６３位塩基を含む部分ＤＮＡ領域を特異的に増幅することが可能な第３核酸と、からなる核酸セット、
（２）２４２位塩基がＣであるＮＡＤＨ／ＮＡＤＰＨオキシダーゼｐ２２フォックス遺伝子のセンス鎖において２４２位塩基を含む部分領域、に対して特異的にハイブリダイズし且つ第１の標識物質で標識された第１核酸と、２４２位塩基がＴであるＮＡＤＨ／ＮＡＤＰＨオキシダーゼｐ２２フォックス遺伝子のセンス鎖において２４２位塩基を含む部分領域、に対して特異的にハイブリダイズし且つ第２の標識物質で標識された第２核酸と、及びＮＡＤＨ／ＮＡＤＰＨオキシダーゼｐ２２フォックス遺伝子のアンチセンス鎖の一部領域に対して特異的にハイブリダイズし且つ前記第１核酸又は前記第２核酸とともに使用されてＮＡＤＨ／ＮＡＤＰＨオキシダーゼｐ２２フォックス遺伝子の２４２位塩基を含む部分ＤＮＡ領域を特異的に増幅することが可能な第３核酸と、からなる核酸セット、
（３）−２１９位塩基がＧであるアポリポプロテインＥ遺伝子のアンチセンス鎖において−２１９位塩基を含む部分領域、に対して特異的にハイブリダイズし且つ第１の標識物質で標識された第１核酸と、−２１９位塩基がＴであるアポリポプロテインＥ遺伝子のアンチセンス鎖において−２１９位塩基を含む部分領域、に対して特異的にハイブリダイズし且つ第２の標識物質で標識された第２核酸と、及びアポリポプロテインＥ遺伝子のセンス鎖の一部領域に対して特異的にハイブリダイズし且つ前記第１核酸又は前記第２核酸とともに使用されてアポリポプロテインＥ遺伝子の−２１９位塩基を含む部分ＤＮＡ領域を特異的に増幅することが可能な第３核酸と、からなる核酸セット、
（４）−４８２位がＣであるアポリポプロテインＣ−ＩＩＩ遺伝子のアンチセンス鎖において−４８２位塩基を含む部分領域、に対して特異的にハイブリダイズする第１核酸と、−４８２位がＴであるアポリポプロテインＣ−ＩＩＩ遺伝子のアンチセンス鎖において−４８２位塩基を含む部分領域、に対して特異的にハイブリダイズする第２核酸と、アポリポプロテインＣ−ＩＩＩ遺伝子のセンス鎖の一部領域に対して特異的にハイブリダイズし且つ前記第１核酸又は前記第２核酸とともに使用されてアポリポプロテインＣ−ＩＩＩ遺伝子の−４８２位塩基を含む部分ＤＮＡ領域を特異的に増幅することが可能な第３核酸と、−４８２位がＣであるアポリポプロテインＣ−ＩＩＩ遺伝子を鋳型として前記第１核酸及び前記第３核酸を用いて増幅される核酸に対して特異的にハイブリダイズし且つ第１の標識物質で標識された第４核酸と、及び−４８２位がＴであるアポリポプロテインＣ−ＩＩＩ遺伝子を鋳型として前記第２核酸及び前記第３核酸を用いて増幅される核酸に対して特異的にハイブリダイズし且つ第２の標識物質で標識された第５核酸と、からなる核酸セット。
以上では、（１）〜（４）からなるグループから二つ以上の核酸セットを選択してキットを構成しているが、（１）〜（４）の中から二つ以上を任意に選択してグループとし、かかるグループから二つ以上の核酸セットを選択してキットを構成してもよい。例えば（２）〜（４）からなるグループ（後述の実施例においてオッズ比が上位３位までの多型を解析するための核酸セット）より二つ以上の核酸セットを選択してキットを構成することができる。
【００５３】
以下の（５）〜（９）からなるグループより選択される二つ以上の核酸セットを含んでなる遺伝子型検出用キット、
（５）−１１７１位から３’方向にＡが５個連続して存在するストロメライシン１遺伝子のアンチセンス鎖において該塩基部分を含む部分領域、に対して特異的にハイブリダイズし且つ第１の標識物質で標識された第１核酸と、−１１７１位塩基から３’方向にＡが６個連続して存在するストロメライシン１遺伝子のアンチセンス鎖において該塩基部分を含む部分領域、に対して特異的にハイブリダイズし且つ第２の標識物質で標識された第２核酸と、及びストロメライシン１遺伝子のセンス鎖の一部領域に対して特異的にハイブリダイズし且つ前記第１核酸又は前記第２核酸とともに使用されてストロメライシン１遺伝子の−１１７１位塩基部分を含む部分ＤＮＡ領域を特異的に増幅することが可能な第３核酸と、からなる核酸セット、
（６）４０７０位塩基がＣであるアポリポプロテインＥ遺伝子のアンチセンス鎖において４０７０位塩基を含む部分領域、に対して特異的にハイブリダイズし且つ第１の標識物質で標識された第１核酸と、４０７０位塩基がＴであるアポリポプロテインＥ遺伝子のアンチセンス鎖において４０７０位塩基を含む部分領域、に対して特異的にハイブリダイズし且つ第２の標識物質で標識された第２核酸と、及びアポリポプロテインＥ遺伝子のセンス鎖の一部領域に対して特異的にハイブリダイズし且つ前記第１核酸又は前記第２核酸とともに使用されてアポリポプロテインＥ遺伝子の４０７０位塩基を含む部分ＤＮＡ領域を特異的に増幅することが可能な第３核酸と、からなる核酸セット、
（７）−６３４位塩基がＣであるインターロイキン６遺伝子のアンチセンス鎖において−６３４位塩基を含む部分領域、に対して特異的にハイブリダイズし且つ第１の標識物質で標識された第１核酸と、−６３４位塩基がＧであるインターロイキン６遺伝子のアンチセンス鎖において−６３４位塩基を含む部分領域、に対して特異的にハイブリダイズし且つ第２の標識物質で標識された第２核酸と、及びインターロイキン６遺伝子のセンス鎖の一部領域に対して特異的にハイブリダイズし且つ前記第１核酸又は前記第２核酸とともに使用されてインターロイキン６遺伝子の−６３４位塩基を含む部分ＤＮＡ領域を特異的に増幅することが可能な第３核酸と、からなる核酸セット、
（８）−７８６位塩基がＴである内皮型一酸化窒素合成酵素遺伝子のアンチセンス鎖において−７８６位塩基を含む部分領域、に対して特異的にハイブリダイズし且つ第１の標識物質で標識された第１核酸と、−７８６位塩基がＣである内皮型一酸化窒素合成酵素遺伝子のアンチセンス鎖において−７８６位塩基を含む部分領域、に対して特異的にハイブリダイズし且つ第２の標識物質で標識された第２核酸と、及び内皮型一酸化窒素合成酵素遺伝子のセンス鎖の一部領域に対して特異的にハイブリダイズし且つ前記第１核酸又は前記第２核酸とともに使用されて内皮型一酸化窒素合成酵素遺伝子の−７８６位塩基を含む部分ＤＮＡ領域を特異的に増幅することが可能な第３核酸と、からなる核酸セット、及び
（９）２４４５位がＧである脂肪酸結合タンパク質２遺伝子のアンチセンス鎖において２４４５位塩基を含む部分領域、に対して特異的にハイブリダイズする第１核酸と、２４４５位がＡである脂肪酸結合タンパク質２遺伝子のアンチセンス鎖において２４４５位塩基を含む部分領域、に対して特異的にハイブリダイズする第２核酸と、脂肪酸結合タンパク質２遺伝子のセンス鎖の一部領域に対して特異的にハイブリダイズし且つ前記第１核酸又は前記第２核酸とともに使用されて脂肪酸結合タンパク質２遺伝子の２４４５位塩基を含む部分ＤＮＡ領域を特異的に増幅することが可能な第３核酸と、２４４５位がＧである脂肪酸結合タンパク質２遺伝子を鋳型として前記第１核酸及び前記第３核酸を用いて増幅される核酸に対して特異的にハイブリダイズし且つ第１の標識物質で標識された第４核酸と、及び２４４５位がＡである脂肪酸結合タンパク質２遺伝子を鋳型として前記第２核酸及び前記第３核酸を用いて増幅される核酸に対して特異的にハイブリダイズし且つ第２の標識物質で標識された第５核酸と、からなる核酸セット。
以上では、（５）〜（９）からなるグループから二つ以上の核酸セットを選択してキットを構成しているが、（５）〜（９）の中から二つ以上を任意に選択してグループとし、かかるグループから二つ以上の核酸セットを選択してキットを構成してもよい。例えば（５）〜（８）からなるグループ（後述の実施例においてオッズ比が上位４位までの多型を解析するための核酸セット）より二つ以上の核酸セットを選択してキットを構成したり、（５）〜（７）からなるグループ（後述の実施例においてオッズ比が上位３位までの多型を解析するための核酸セット）より二つ以上の核酸セットを選択してキットを構成することができる。
【００５４】
以上の各キットにおいては、キットの使用方法に応じた一又は二以上の試薬（バッファー、反応用試薬、検出用試薬など）などを組み合わせてもよい。
以下、実施例を用いて本発明をより詳細に説明する。
【００５５】
【実施例】
＜実施例１＞　遺伝子多型の選択
ＰｕｂＭｅｄ［Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ｃｅｎｔｅｒ　ｆｏｒ　Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ　（ＮＣＢＩ）］，　Ｏｎｌｉｎｅ　Ｍｅｎｄｅｌｉａｎ　ｉｎｈｅｒｉｔａｎｃｅ　ｉｎ　Ｍｅｎ　（ＮＣＢＩ），　Ｓｉｎｇｌｅ　Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ　Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ　（ＮＣＢＩ）などの数種類の公的データベースを用いて、今までに報告された遺伝子の中から血管生物学、血小板・白血球生物学、凝固線溶系、脂質・糖・その他の代謝因子などの総合的側面から冠動脈硬化、冠動脈攣縮、高血圧、糖尿病、高脂血症などとの関連が推定される７１遺伝子を抜粋した。さらにこれらの遺伝子に存在する多型の中でプロモーター領域やエクソンに存在するもの、あるいはスプライスドナー部位やアクセプター部位に位置し、遺伝子産物の機能変化との関連が予想されるものを中心に１１２多型を選択した（図１及び図２）。
【００５６】
＜実施例２＞　遺伝子多型の決定
対象は１９９４年７月から２００１年１２月の間に参加１５施設を受診（または入院）した日本人２１８８例（男性１２１５例、女性９７３例）である。冠動脈攣縮５９３例（男性４５３例、女性１４０例）は、全例冠動脈造影と左室造影を行っており、心電図のＳＴ変化を伴う冠動脈攣縮が自発的に生じるか、またはエルゴノビンかアセチルコリンの冠動脈内注入により誘発されることを血管造影で確認した。
対照は１５９５例（男性７６２例、女性８３３例）で、参加施設を受診し冠動脈疾患の従来の危険因子、即ち喫煙（１日１０本以上）、肥満（ｂｏｄｙ　ｍａｓｓ　ｉｎｄｅｘ　＞　２６　ｋｇ／ｍ２）、高血圧（収縮期血圧　＞　１４０　ｍｍＨｇまたは拡張期血圧　＞　９０　ｍｍＨｇ、あるいはその両方）、糖尿病（空腹時血糖　＞　１２６　ｍｇ／ｄＬまたはヘモグロビンＡ１ｃ　＞　６．５％、あるいはその両方）、高脂血症（血清総コレステロール　＞　２２０　ｍｇ／ｄＬ）、高尿酸血症（男性では血清尿酸　＞　７．７　ｍｇ／ｄＬ、女性では血清尿酸　＞　５．５　ｍｇ／ｄＬ）の少なくとも一つを有するが冠動脈疾患あるいは冠動脈攣縮を有しない症例である。これらの対照は安静時心電図が正常であり、運動負荷試験でも心筋虚血性変化は認められなかった。
心臓カテーテル検査は次のように行った。すべての投薬は冠動脈造影の２４−４８時間前に中止した。冠動脈攣縮の誘発は既報の方法（Ｎａｋａｙａｍａ　Ｍ，　Ｙａｓｕｅ　Ｈ，　Ｙｏｓｈｉｍｕｒａ　Ｍ，　ｅｔ　ａｌ．　Ｔ^−７８６→Ｃ　ｍｕｔａｔｉｏｎ　ｉｎ　ｔｈｅ　５’−ｆｌａｎｋｉｎｇ　ｒｅｇｉｏｎ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ　ｎｉｔｒｉｃ　ｏｘｉｄｅ　ｓｙｎｔｈａｓｅ　ｇｅｎｅ　ｉｓ　ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ　ｗｉｔｈ　ｃｏｒｏｎａｒｙ　ｓｐａｓｍ．　Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ．　１９９９；９９：２８６４−２８７０．、Ｙｏｓｈｉｍｕｒａ　Ｍ，　Ｙａｓｕｅ　Ｈ，　Ｎａｋａｍｕｒａ　Ｍ，　ｅｔ　ａｌ．Ｇｅｎｅｔｉｃ　ｒｉｓｋ　ｆａｃｔｏｒｓ　ｆｏｒ　ｃｏｒｏｎａｒｙ　ａｒｔｅｒｙ　ｓｐａｓｍ：　ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｃｅ　ｏｆ　ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ　ｎｉｔｒｉｃ　ｏｘｉｄｅ　ｓｙｎｔｈａｓｅ　ｇｅｎｅ　Ｔ^−７８６→Ｃ　ａｎｄ　ｍｉｓｓｅｎｓｅ　Ｇｌｕ２９８Ａｓｐ．　Ｊ　Ｉｎｖｅｓｔ　Ｍｅｄ．　２０００；４８：３６７−３７４．）に従い、一部変更して行った。概説すると、左および右冠動脈造影を行った後、アセチルコリンを５０　ｍｇと１００　ｍｇ　の２回に分けて左冠動脈内　に注入し、冠動脈造影をそれぞれの注入の１分後に行った。次にアセチルコリン５０　ｍｇを右冠動脈内に注入し、冠動脈造影を再度行った。冠動脈攣縮は胸痛と心電図のＳＴ変化を伴う冠動脈の完全または部分閉塞、または高度の血管収縮と定義した。最後に、硝酸イソソルビド１ｍｇを冠動脈内に注入し、左および右冠動脈造影を多方面から行った。全症例において冠動脈の狭窄は２５％以下であった。
【００５７】
それぞれの対象から静脈血７　ｍＬを５０　ｍｍｏｌ／Ｌ　ＥＤＴＡ−２Ｎａを含むチューブに採血し、ゲノムＤＮＡをＤＮＡ抽出キット（Ｑｉａｇｅｎ，　Ｃｈａｔｓｗｏｒｔｈ，　ＣＡ）を用いて抽出した。一塩基多型の遺伝子型の決定は蛍光・発光法によるアリル特異的プライマー・プローブ測定システム（東洋紡ジーンアナリシス、敦賀、日本）により行った（図３）。多型部位を含むＤＮＡ断片は５’末端にｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ　ｉｓｏｔｈｉｏｃｙａｎａｔｅ（ＦＩＴＣ）またはＴｅｘａｓ　ｒｅｄ（ＴｘＲ）で標識した２種類のアリル特異的センス（またはアンチセンス）プライマーと５’末端をビオチンで標識したアンチセンス（またはセンス）プライマーを用いてｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ　ｃｈａｉｎ　ｒｅａｃｔｉｏｎ（ＰＣＲ）により増幅した。また別法として、多型部位を含むＤＮＡ断片は２種類のアリル特異的センス（またはアンチセンス）プライマーと５’末端をビオチンで標識したアンチセンス（またはセンス）プライマーを用いて、またはセンスプライマーと５’末端をビオチンで標識したアンチセンスプライマーを用いてＰＣＲにより増幅した。反応溶液（２５　ｍＬ）　には２０　ｎｇのＤＮＡ、５　ｐｍｏｌの各プライマー、０．２　ｍｍｏｌ／Ｌの各デオキシヌクレオシド三リン酸、１−４ｍｍｏｌ／Ｌの塩化マグネシウム、１　ＵのＤＮＡポリメラーゼ（ｒＴａｑ　ｏｒ　ＫＯＤｐｌｕｓ；　東洋紡、大阪、日本）を含み、それぞれのＤＮＡポリメラーゼ緩衝液を用いた。増幅プロトコールは初期変性が９５℃で５分、３５−４５サイクルで変性が９５℃で３０秒、　アニーリングが５５−６７．５℃で３０秒、伸展が７２℃で３０秒、そして最終伸展が７２℃で２分とした。
蛍光法による遺伝子型の決定では、増幅したＤＮＡを９６穴プレートの各ウェルでストレプトアビジン結合磁気ビーズを含む溶液中で室温インキュベートした。このプレートを磁気スタンド上に置き、各ウェルから上清を採取し、０．０１　Ｍ　ＮａＯＨを含む９６穴プレートの各ウェルに移した後、マイクロプレートリーダーによりＦＩＴＣは励起・蛍光波長が４８５と５３８　ｎｍ、ＴｘＲは励起・蛍光波長が５８４と６１２　ｎｍで蛍光を測定した。また発光法による遺伝子型の決定では、増幅したＤＮＡ　を０．３　Ｍ　ＮａＯＨで変性させ、９６穴プレートの各ウェルの底面に固定したいずれかのアリル特異的補足プローブと３５−４０％ホルムアミドを含むハイブリダイゼーション緩衝液で３７℃、３０分間ハイブリダイゼーションを行った。ウェルを十分に洗浄した後、アルカリフォスファターゼ結合ストレプトアビジンを各ウェルに加え、プレートを３７℃、１５分間振騰した。ウェルを再度洗浄し、０．８　ｍＭ　２−（４−ｉｏｄｏｐｈｅｎｙｌ）−３−（４−ｎｉｔｒｏｐｈｅｎｙｌ）−５−（２，４−ｄｉｓｕｌｆｏｐｈｅｎｙｌ）−２Ｈ−ｔｅｔｒａｚｏｌｉｕｍ　（ｍｏｎｏｓｏｄｉｕｍ　ｓａｌｔ）と０．４　ｍＭ５−ｂｒｏｍｏ−４−ｃｈｌｏｒｏ−３−ｉｎｄｏｌｙｌ　ｐｈｏｓｐｈａｔｅ　ｐ−ｔｏｌｕｉｄｉｎｅ　ｓａｌｔを含む溶液を加えた後、４５０　ｎｍでの吸光度を測定した。
【００５８】
本方法による遺伝子型決定の精度を確認するために、５０人のＤＮＡサンプルを無作為に選びＰＣＲ−制限酵素断片長多型法またはＰＣＲ産物の直接塩基配列決定法を行った。いずれのサンプルにおいてもアリル特異的プライマー・プローブ測定システムにより決定された遺伝子型はＰＣＲ−制限酵素断片長多型法またはＤＮＡ塩基配列決定法によって決定されたものと同一であった。
【００５９】
以下の関連解析における統計解析は次のように行った。臨床データは冠動脈攣縮例と対照との間でｕｎｐａｉｒｅｄ　Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ　ｔ　ｔｅｓｔ　またはＭａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ　Ｕ　ｔｅｓｔを用いて比較した。定性的データはｃｈｉ−ｓｑｕａｒｅ　ｔｅｓｔで検定した。アリル頻度は　ｇｅｎｅ　ｃｏｕｎｔｉｎｇ　ｍｅｔｈｏｄにより推定し、Ｈａｒｄｙ−Ｗｅｉｎｂｅｒｇ平衡から逸脱しているかどうかはｃｈｉ−ｓｑｕａｒｅ　ｔｅｓｔによって検定した。本発明者らは危険因子を補正した多項ロジスティック回帰分析を行った。冠動脈攣縮を従属因子とし、年齢、ｂｏｄｙ　ｍａｓｓ　ｉｎｄｅｘ（ＢＭＩ）、喫煙状況　（０＝非喫煙，１＝喫煙）、代謝因子（０＝高血圧・糖尿病・高コレステロール血症・高尿酸血症の経歴なし、１＝経歴あり）、各多型の遺伝子型を独立因子とした。それぞれの遺伝子型はｄｏｍｉｎａｎｔ（優性）、ｒｅｃｅｓｓｉｖｅ（劣性）、ａｄｄｉｔｉｖｅ（付加）遺伝モデルで解析し、Ｐ値、オッズ比、９５％信頼区間を算出した。組み合わせ遺伝子型解析では、ロジスティック回帰分析のｓｔｅｐｗｉｓｅ　ｆｏｒｗａｒｄ　ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ　ｍｅｔｈｏｄによりそれぞれの遺伝子型についてのオッズ比を算出した。
【００６０】
＜実施例３＞　冠動脈攣縮に関連する多型の選択、及び冠動脈攣縮リスク診断法の開発
本発明者らは先の報告において７１候補遺伝子１１２多型と心筋梗塞との関連解析を男性４５１例（心筋梗塞２１９例、対照２３２例）と女性４５８例（心筋梗塞２２６例、対照２３２例）について行った（Ｙａｍａｄａ　Ｙ，　Ｉｚａｗａ　Ｈ，　Ｉｃｈｉｈａｒａ　Ｓ，　ｅｔ　ａｌ．　Ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ　ｏｆ　ｒｉｓｋ　ｏｆ　ｍｙｏｃａｒｄｉａｌ　ｉｎｆａｒｃｔｉｏｎ　ｆｒｏｍ　ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍｓ　ｉｎ　ｃａｎｄｉｄａｔｒｅ　ｇｅｎｅｓ．　Ｎ　Ｅｎｇｌ　Ｊ　Ｍｅｄ．　ｉｎ　ｐｒｅｓｓ．）。この研究により男性で１９個、女性で１８個の一塩基多型が心筋梗塞発症と関連することを見出したが、それらの多型群の中には冠動脈攣縮の候補遺伝子も含まれていた（図１、図２、図４を参照）。本実施例ではこれらの一塩基多型と冠動脈攣縮との関連について２１８８例の大規模関連解析を行った。
【００６１】
検討した全対象２１８８例（男性１２１５例　、女性９７３例）の背景データを図５に示す。男性では、喫煙と高コレステロール血症の頻度が対照に比較し冠動脈攣縮例で有意に高く、年齢は対照群に比較し冠動脈攣縮例で有意に低かった。女性では、喫煙、高血圧と高尿酸血症の頻度が対照に比較し冠動脈攣縮例で有意に高く、年齢は対照群に比較し冠動脈攣縮例で有意に低かった。
【００６２】
男性１９多型、女性１８多型と冠動脈攣縮との関連解析において、年齢、ＢＭＩ、および喫煙、高血圧、糖尿病、高コレステロール血症、高尿酸血症の頻度を補正した多項ロジスティック回帰分析により男性で４　個、女性で５個の多型が冠動脈攣縮発症と有意な関連を示した（ｄｏｍｉｎａｎｔまたはｒｅｃｅｓｓｉｖｅ遺伝モデルのいずれかがＰ＜０．０５）（図６）。これらの多型の遺伝子型分布を図７に示す。
【００６３】
本発明者らは多項ロジスティック回帰分析のｓｔｅｐｗｉｓｅ　ｆｏｒｗａｒｄ　ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ　ｍｅｔｈｏｄを行った（図８）。本法では、図６に示したそれぞれの多型の冠動脈攣縮との関連におけるＰ値（より低いＰ値）に基づいてｄｏｍｉｎａｎｔまたはｒｅｃｅｓｓｉｖｅ遺伝モデルを採用した。これらの遺伝子の染色体上の遺伝子座を図８に示す。Ｓｔｅｐｗｉｓｅ　ｆｏｒｗａｒｄ　ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ　ｍｅｔｈｏｄにより算出した組み合わせ遺伝子型による冠動脈攣縮発症のオッズ比を、男性は図９と図１１（Ａ）に、女性は図１０と図１１（Ｂ）に示す。男性では、４個の多型の組み合わせ遺伝子型（ＴＮＦα（−８６３Ｃ→Ａ）多型、ｐ２２フォックス（２４２Ｃ→Ｔ）多型、ＡｐｏＣ−ＩＩＩ（−４８２Ｃ→Ｔ）多型、及びＡｐｏＥ（−２１９Ｇ→Ｔ）多型）により、最大オッズ比が５．０８となった（図９、図１１（Ａ））。女性では、５個の多型の組み合わせ遺伝子型（ストロメライシン１（−１１７１／５Ａ→６Ａ）多型、ＩＬ−６（−６３４Ｃ→Ｇ）多型、ＦＡＢＰ２（２４４５Ｇ→Ａ）多型、ＡｐｏＥ（４０７０Ｃ→Ｔ）多型、及びＥＮＯＳ（−７８６Ｔ→Ｃ）多型）により、最大のオッズ比が５３．３７となった（図１０、図１１（Ｂ））。
【００６４】
以上のように、多項ロジスティック回帰分析により男性で４個、女性で５個の一塩基多型が冠動脈攣縮と関連した。即ち、本発明者らは男性で１９個、女性で１８個の一塩基多型と冠動脈攣縮との関連について２１８８例の大規模関連解析を行い、冠動脈攣縮発症と関連する多型を男性で４個、女性で５個同定した。さらに、多項ロジスティック回帰分析のｓｔｅｐｗｉｓｅ　ｆｏｒｗａｒｄ　ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ　ｍｅｔｈｏｄにより男性では最大オッズ比５．０８、女性では最大オッズ比５３．３７を呈する組み合わせ遺伝子型を用いた冠動脈攣縮の遺伝子リスク診断法を開発した。
【００６５】
本実施例の結果においては、喫煙頻度が対照に比較し冠動脈攣縮例で著明に高く、既報の結果に一致する（Ｓｕｇｉｉｓｈｉ　Ｍ，　Ｔａｋａｔｓｕ　Ｆ．　Ｃｉｇａｒｅｔｔｅ　ｓｍｏｋｉｎｇ　ｉｓ　ａ　ｍａｊｏｒ　ｒｉｓｋ　ｆａｃｔｏｒ　ｆｏｒ　ｃｏｒｏｎａｒｙ　ｓｐａｓｍ．　Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ．　１９９３；８７：７６−７９．）。冠動脈攣縮の主要な原因は、血管内皮細胞の機能障害（Ｙａｓｕｅ　Ｈ，　Ｈｏｒｉｏ　Ｙ，　Ｎａｋａｍｕｒａ　Ｎ，　ｅｔ　ａｌ．　Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ　ｏｆ　ｃｏｒｏｎａｒｙ　ａｒｔｅｒｙ　ｓｐａｓｍ　ｂｙ　ａｃｅｔｙｌｃｈｏｌｉｎｅ　ｉｎ　ｐａｔｉｅｎｔｓ　ｗｉｔｈ　ｖａｒｉａｎｔ　ａｎｇｉｎａ：　ｐｏｓｓｉｂｌｅ　ｒｏｌｅ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｐａｒａｓｙｍｐａｔｈｅｔｉｃ　ｎｅｒｖｏｕｓ　ｓｙｓｔｅｍ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓ　ｏｆ　ｃｏｒｏｎａｒｙ　ａｒｔｅｒｙ　ｓｐａｓｍ．　Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ．　１９８６；７４：９５５−９６３．、Ｖａｎｈｏｕｔｔｅ　ＰＭ，　Ｓｈｉｍｏｋａｗａ　Ｈ．　Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉｕｎ−ｄｅｒｉｖｅｄ　ｒｅｌａｘｉｎｇ　ｆａｃｔｏｒ　ａｎｄ　ｃｏｒｏｎａｒｙ　ｖａｓｏｓｐａｓｍ．　Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ．　１９８９；８０：１−９．）と血管平滑筋の過剰な収縮反応であり（Ｅｇａｓｈｉｒａ　Ｋ，　Ｉｎｏｕ　Ｔ，　Ｙａｍａｄａ　Ａ，　ｅｔ　ａｌ．　Ｐｒｅｓｅｒｖｅｄ　ｅｎｄｏｔｈｅｌｉｕｍ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ　ｖａｓｏｄｉｌａｔｉｏｎ　ａｔ　ｔｈｅ　ｖａｓｏｓｐａｓｔｉｃ　ｓｉｔｅ　ｉｎ　ｐａｔｉｅｎｔｓ　ｗｉｔｈ　ｖａｒｉａｎｔ　ａｎｇｉｎａ．　Ｊ　Ｃｌｉｎ　Ｉｎｖｅｓｔ．　１９９２；８９：１０４７−１０５２．）、その結果として血管の収縮弛緩調節の破綻をきたす。さらに、血管作動性物質は活性化された血小板から放出される（Ｖａｎｈｏｕｔｔｅ　ＰＭ，　Ｓｈｉｍｏｋａｗａ　Ｈ．　Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉｕｎ−ｄｅｒｉｖｅｄ　ｒｅｌａｘｉｎｇ　ｆａｃｔｏｒ　ａｎｄ　ｃｏｒｏｎａｒｙ　ｖａｓｏｓｐａｓｍ．　Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ．　１９８９；８０：１−９．）。基礎病変として動脈硬化性変化が存在することも重要である（Ｓｈｉｍｏｋａｗａ　Ｈ，　Ｔｏｍｏｉｋｅ　Ｈ，　ＮａｂｅｙａｍａＳ，　ｅｔ　ａｌ．　Ｃｏｒｏｎａｒｙ　ａｒｔｅｒｙ　ｓｐａｓｍ　ｉｎｄｕｃｅｄ　ｉｎ　ａｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｔｉｃ　ｍｉｎｉａｔｕｒｅ　ｓｗｉｎｅ．　Ｓｃｉｅｎｃｅ．　１９８３；２２１：５６０−５６２．）。本発明者らは血管生物学、血小板・白血球生物学、線溶系、脂質・糖・その他の代謝因子などの包括的視点に基づいて男性１９個、女性１８個の一塩基多型と冠動脈攣縮との関連について検討した。実際、冠動脈攣縮と関連した遺伝子群はその病態において多彩な役割を有していた。すなわち、血管生物学（ＮＡＤＨ／ＮＡＤＰＨオキシダーゼｐ２２フォックス、及び内皮型一酸化窒素合成酵素）、血管の炎症（腫瘍壊死因子α、及びインターロイキン６）、脂質代謝（アポリポプロテインＣ−ＩＩＩ、アポリポプロテインＥ、及び脂肪酸結合タンパク質２）、基質代謝（ストロメライシン１）などである。冠動脈攣縮と関連した９個の多型のうち、内皮型一酸化窒素合成酵素の−７８６Ｔ→Ｃの多型を除く他の８多型については冠動脈攣縮との関連は今までに報告されていない。これらの多型の中で、ストロメライシン１遺伝子の−１１７１／５Ａ→６Ａの多型が最大のオッズ比を呈した。この多型は、今までに冠動脈疾患（Ｙｅ　Ｓ，　Ｗａｔｔｓ　ＧＦ，　Ｍａｎｄａｌｉａ　Ｓ，　ｅｔ　ａｌ．Ｐｒｅｌｉｍｉｎａｒｙ　ｒｅｐｏｒｔ：　ｇｅｎｅｔｉｃ　ｖａｒｉａｔｉｏｎ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｈｕｍａｎ　ｓｔｒｏｍｅｌｙｓｉｎ　ｐｒｏｍｏｔｅｒｉｓ　ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ　ｗｉｔｈ　ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｏｎ　ｏｆ　ｃｏｒｏｎａｒｙ　ａｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ．　Ｂｒ　Ｈｅａｒｔ　Ｊ．１９９５；７３：２０９−１５．）やバルーン拡張術後再狭窄との関連が報告されており（Ｈｕｍｐｈｒｉｅｓ　Ｓ，　Ｂａｕｔｅｒｓ　Ｃ，　Ｍｅｉｒｈａｅｇｈｅ　Ａ，　ｅｔ　ａｌ．　Ｔｈｅ　５Ａ６Ａ　ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｐｒｏｍｏｔｅｒ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｓｔｒｏｍｅｌｙｓｉｎ−１　（ＭＭＰ３）　ｇｅｎｅ　ａｓ　ａ　ｒｉｓｋ　ｆａｃｔｏｒ　ｆｏｒ　ｒｅｓｔｅｎｏｓｉｓ．Ｅｕｒ　Ｈｅａｒｔ　Ｊ．　２００２；２３：７２１−７２５．）、特に後者の病態においては、慢性血管リモデリング（血管収縮）が重要であることが知られている。本発明者らの遺伝子リスク診断システムは冠動脈攣縮発症の最大オッズ比が男性で５．０８、女性で５３．３７を呈し、とりわけ女性においては、今までに報告された大規模関連解析の中で最大のオッズ比を示した。
【００６６】
本実施例で検討した多型のいくつかは、その近傍に存在する冠動脈攣縮と真に関連する遺伝子の多型と連鎖不平衡にある可能性がある。しかしながら、本発明者らの結果は男性で４個、女性で５個の遺伝子が日本人の冠動脈攣縮感受性遺伝子座であることを示した。さらに、これらの遺伝子多型の組み合わせ遺伝子型は冠動脈攣縮の遺伝的リスク診断に有用であると考えられる。
【００６７】
この発明は、上記発明の実施の形態及び実施例の説明に何ら限定されるものではない。特許請求の範囲の記載を逸脱せず、当業者が容易に想到できる範囲で種々の変形態様もこの発明に含まれる。
【００６８】
【発明の効果】
本発明によれば冠動脈攣縮に関連する遺伝子多型が解析され、そして核酸試料の遺伝子型が検出される。この遺伝子型の検出によって得られる多型情報を用いることにより、高精度で予知確率の高い冠動脈攣縮のリスク診断を行うことができる。したがって、本発明は冠動脈攣縮の発症リスクを事前に知る有効な手段となり、冠動脈攣縮に起因する異型狭心症、心筋梗塞および心突然死の一次予防への貢献が期待できる。また、本発明によれば冠動脈攣縮の診断に有用な補助的情報が得られ、より適切な治療を可能とし予後の改善などを図ることができる。更に本発明は冠動脈攣縮の発症メカニズムを解明する上での有効な情報を提供することから、冠動脈攣縮の予防法の確立にとって極めて重要な一手段ともなる。
【００６９】
【配列表】

【図面の簡単な説明】
【図１】図１は実施例におけるスクリーニング関連解析において検討した１１２遺伝子多型をまとめた表である。
【図２】図２は同じく実施例におけるスクリーニング関連解析において検討した１１２遺伝子多型をまとめた表である。
【図３】図３は実施例において遺伝子型を決定するために使用されるプライマー（上から順に配列番号１９、２０、２１、１６、１７、１８、２５、２６、２７、３１、３２、３３、３４、３５、３６、２８、２９、３０、１３、１４、１５、２２、２３、２４、１０、１１、１２）、プローブ（上から順に配列番号３７、３８、３９、４０）及びその他の条件をまとめた表である。図中、ＦＩＴＣはフルオレセインイソチオシアネートを、ＴｘＲはテキサスレッドを、Ｂｉｏｔｉｎはビオチンをそれぞれ表す。
【図４】図４は実施例の関連解析において検討した一塩基多型をまとめた表である。
【図５】図５は実施例における関連解析の対象とした男性１２１５例及び女性９７３例の背景データをまとめた表である。年齢及びＢｏｄｙ　ｍａｓｓ　ｉｎｄｅｘの各データは平均±標準偏差で表される。表中、＊１はＰ＜０．０００１を、＊２はＰ＜０．０５を、＊３はＰ＜０．００１を、＊４はＰ＜０．０１をそれぞれ表す。
【図６】図６は関連解析の対象とした遺伝子多型と多項ロジスティック回帰分析の結果をまとめた表である。各ＳＮＰにおいて低い方のＰ値は太字で表される。
【図７】図７は冠動脈攣縮と関連のある遺伝子多型について遺伝子型の分布を示した図である。
【図８】図８は冠動脈攣縮と関連のある遺伝子多型における多項ロジスティック回帰分析のｓｔｅｐ　ｆｏｒｗａｒｄ　ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ　ｍｅｔｈｏｄを行った結果を示す表である。
【図９】図９は男性における４個の組合せ遺伝子多型を用いた冠動脈攣縮の遺伝的リスク診断を行った結果を示す表である。
【図１０】図１０は女性における４個の組合せ遺伝子多型を用いた冠動脈攣縮の遺伝的リスク診断を行った結果を示す表である。
【図１１】図１１は冠動脈攣縮のリスク診断における累積オッズ比と一塩基多型の数の関連を表したグラフである。（Ａ）は男性、（Ｂ）は女性における関連を示す。（Ａ）における各ＳＮＰは、ＳＮＰ１：　ＴＮＦα（−８６３Ｃ→Ａ）多型、ＳＮＰ２：ｐ２２フォックス（２４２Ｃ→Ｔ）多型、ＳＮＰ３：ＡｐｏＣ−ＩＩＩ（−４８２Ｃ→Ｔ）多型、ＳＮＰ４：ＡｐｏＥ（−２１９Ｇ→Ｔ）多型である。（Ｂ）における各ＳＮＰは、ＳＮＰ１：ストロメライシン１（−１１７１／５Ａ→６Ａ）多型、ＳＮＰ２：ＩＬ−６（−６３４Ｃ→Ｇ）多型、ＳＮＰ３：ＦＡＢＰ２　（２４４５Ｇ→Ａ）多型、ＳＮＰ４：ＡｐｏＥ（４０７０Ｃ→Ｔ）多型、ＳＮＰ５：ＥＮＯＳ（−７８６Ｔ→Ｃ）多型である。

Claims (8)

1. 以下の工程（ａ）を含んでなる、核酸試料の遺伝子型を検出する方法、
   （ａ）核酸試料における、以下の（１）〜（４）からなるグループより選択される二つ以上の多型を解析する工程、
   （１）腫瘍壊死因子α遺伝子の塩基番号−８６３位の多型、
   （２）ＮＡＤＨ／ＮＡＤＰＨオキシダーゼｐ２２フォックス遺伝子の塩基番号２４２位の多型、
   （３）アポリポプロテインＥ遺伝子の塩基番号−２１９位の多型、及び
   （４）アポリポプロテインＣ−ＩＩＩ遺伝子の塩基番号−４８２位の多型。
2. 以下の工程（ｂ）を含んでなる、核酸試料の遺伝子型を検出する方法、
   （ｂ）核酸試料における、以下の（５）〜（９）からなるグループより選択される二つ以上の多型を解析する工程、
   （５）ストロメライシン１遺伝子の塩基番号−１１７１位の多型、
   （６）アポリポプロテインＥ遺伝子の塩基番号４０７０位の多型、
   （７）インターロイキン６遺伝子の塩基番号−６３４位の多型、
   （８）内皮型一酸化窒素合成酵素遺伝子の塩基番号−７８６位の多型、及び
   （９）脂肪酸結合タンパク質２遺伝子の塩基番号２４４５位の多型。
3. 以下の工程（ｉ）〜（ｉｉｉ）を含んでなる、冠動脈攣縮のリスク診断方法、
   （ｉ）核酸試料における、以下の（１）〜（４）からなるグループより選択される二つ以上の多型を解析する工程、
   （１）腫瘍壊死因子α遺伝子の塩基番号−８６３位の多型、
   （２）ＮＡＤＨ／ＮＡＤＰＨオキシダーゼｐ２２フォックス遺伝子の塩基番号２４２位の多型、
   （３）アポリポプロテインＥ遺伝子の塩基番号−２１９位の多型、及び
   （４）アポリポプロテインＣ−ＩＩＩ遺伝子の塩基番号−４８２位の多型、
   （ｉｉ）前記工程によって得られる多型情報から核酸試料の遺伝子型を決定する工程、及び
   （ｉｉｉ）決定された遺伝子型から冠動脈攣縮の遺伝的リスクを求める工程。
4. 以下の工程（ｉｖ）〜（ｖｉ）を含んでなる、冠動脈攣縮のリスク診断方法、
   （ｉｖ）核酸試料における、以下の（５）〜（９）からなるグループより選択される二つ以上の多型を解析する工程、
   （５）ストロメライシン１遺伝子の塩基番号−１１７１位の多型、
   （６）アポリポプロテインＥ遺伝子の塩基番号４０７０位の多型、
   （７）インターロイキン６遺伝子の塩基番号−６３４位の多型、
   （８）内皮型一酸化窒素合成酵素遺伝子の塩基番号−７８６位の多型、及び
   （９）脂肪酸結合タンパク質２遺伝子の塩基番号２４４５位の多型、
   （ｖ）前記工程によって得られる多型情報から核酸試料の遺伝子型を決定する工程、及び
   （ｖｉ）決定された遺伝子型から冠動脈攣縮の遺伝的リスクを求める工程。
5. 以下の（１）〜（４）からなるグループより選択される二つ以上の核酸を含んでなる遺伝子型検出用キット、
   （１）腫瘍壊死因子α遺伝子の塩基番号−８６３位の多型を解析するための核酸、
   （２）ＮＡＤＨ／ＮＡＤＰＨオキシダーゼｐ２２フォックス遺伝子の塩基番号２４２位の多型を解析するための核酸、
   （３）アポリポプロテインＥ遺伝子の塩基番号−２１９位の多型を解析するための核酸、及び
   （４）アポリポプロテインＣ−ＩＩＩ遺伝子の塩基番号−４８２位の多型を解析するための核酸。
6. 以下の（５）〜（９）からなるグループより選択される二つ以上の核酸を含んでなる遺伝子型検出用キット、
   （５）ストロメライシン１遺伝子の塩基番号−１１７１位の多型を解析するための核酸、
   （６）腫瘍壊死因子アポリポプロテインＥ遺伝子の塩基番号４０７０位の多型を解析するための核酸、
   （７）インターロイキン６遺伝子の塩基番号−６３４位の多型を解析するための核酸、
   （８）内皮型一酸化窒素合成酵素遺伝子の塩基番号−７８６位の多型を解析するための核酸、及び
   （９）脂肪酸結合タンパク質２遺伝子の塩基番号２４４５位の多型を解析するための核酸。
7. 以下の（１）〜（４）からなるグループより選択される二つ以上の核酸が不溶性支持体に固定されてなる固定化核酸、
   （１）腫瘍壊死因子α遺伝子の塩基番号−８６３位の多型を解析するための核酸、
   （２）ＮＡＤＨ／ＮＡＤＰＨオキシダーゼｐ２２フォックス遺伝子の塩基番号２４２位の多型を解析するための核酸、
   （３）アポリポプロテインＥ遺伝子の塩基番号−２１９位の多型を解析するための核酸、及び
   （４）アポリポプロテインＣ−ＩＩＩ遺伝子の塩基番号−４８２位の多型を解析するための核酸。
8. 以下の（５）〜（９）からなるグループより選択される二つ以上の核酸が不溶性支持体に固定されてなる固定化核酸、
   （５）ストロメライシン１遺伝子の塩基番号−１１７１位の多型を解析するための核酸、
   （６）アポリポプロテインＥ遺伝子の塩基番号４０７０位の多型を解析するための核酸、
   （７）インターロイキン６遺伝子の塩基番号−６３４位の多型を解析するための核酸、
   （８）内皮型一酸化窒素合成酵素遺伝子の塩基番号−７８６位の多型を解析するための核酸、及び
   （９）脂肪酸結合タンパク質２遺伝子の塩基番号２４４５位の多型を解析するための核酸。

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