JP4516990B2 - ワルファリンの投与量の範囲を予想する方法 - Google Patents

Description

相互参照
本出願は、２００４年１２月２１日に出願された米国仮出願第６０／６３８，８３７号、及び２００５年５月１０日に出願された米国仮出願第６０／６７９，６９４号の優先権を主張する。これらの先行出願の各々の開示は、全体として本明細書中に援用されている。

本発明は薬物、具体的にはワルファリンの投与方法に関する。
参考文献
１． Ｈｉｒｓｈ， Ｊ．（１９９２） Ａｎｔｉｔｈｒｏｍｂｏｔｉｃ ｔｈｅｒａｐｙ ｉｎ ｄｅｅｐ ｖｅｉｎ ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ ａｎｄ ｐｕｌｍｏｎａｒｙ ｅｍｂｏｌｉｓｍ． Ａｍ． Ｈｅａｒｔ Ｊ．， １２３， １１１５−１１２２．
２． Ｌａｕｐａｃｉｓ， Ａ．， Ａｌｂｅｒｓ， Ｇ．， Ｄａｌｅｎ， Ｊ．，Ｄｕｎｎ， Ｍ．， Ｆｅｉｎｂｅｒｇ， Ｗ． ａｎｄ Ｊａｃｏｂｓｏｎ， Ａ． （１９９５） Ａｎｔｉｔｈｒｏｍｂｏｔｉｃ ｔｈｅｒａｐｙ ｉｎ ａｔｒｉａｌ ｆｉｂｒｉｌｌａｔｉｏｎ． Ｃｈｅｓｔ， １０８， ３５２Ｓ−３５９Ｓ．
３． Ｓｔｅｉｎ， Ｐ．Ｄ．，Ａｌｐｅｒｔ， Ｊ．Ｓ．， Ｃｏｐｅｌａｎｄ， Ｊ．， Ｄａｌｅｎ， Ｊ．Ｅ．， Ｇｏｌｄｍａｎ， Ｓ． ａｎｄ Ｔｕｒｐｉｅ， Ａ．Ｇ．（１９９５） Ａｎｔｉｔｈｒｏｍｂｏｔｉｃ ｔｈｅｒａｐｙ ｉｎ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ｍｅｃｈａｎｉｃａｌ ａｎｄ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｐｒｏｓｔｈｅｔｉｃ ｈｅａｒｔ ｖａｌｖｅｓ． Ｃｈｅｓｔ， １０８， ３７１Ｓ−３７９Ｓ．
４． Ｈｉｒｓｈ， Ｊ．， Ｄａｌｅｎ， Ｊ．， Ａｎｄｅｒｓｏｎ， Ｄ．Ｒ．， Ｐｏｌｌｅｒ， Ｌ．， Ｂｕｓｓｅｙ， Ｈ．， Ａｎｓｅｌｌ， Ｊ． ａｎｄ Ｄｅｙｋｉｎ， Ｄ． （２００１） Ｏｒａｌ ａｎｔｉｃｏａｇｕｌａｎｔｓ： ｍｅｃｈａｎｉｓｍ ｏｆ ａｃｔｉｏｎ， ｃｌｉｎｉｃａｌ ｅｆｆｅｃｔｉｖｅｎｅｓｓ， ａｎｄ ｏｐｔｉｍａｌ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｒａｎｇｅ Ｃｈｅｓｔ， １１９， ８Ｓ−２１Ｓ．
５． Ｌｏｅｂｓｔｅｉｎ， Ｒ．， Ｙｏｎａｔｈ， Ｈ．， Ｐｅｌｅｇ， Ｄ．， Ａｌｍｏｇ， Ｓ．， Ｒｏｔｅｎｂｅｒｇ， Ｍ．， Ｌｕｂｅｔｓｋｙ， Ａ．， Ｒｏｉｔｅｌｍａｎ， Ｊ．， Ｈａｒａｔｓ， Ｄ．， Ｈａｌｋｉｎ， Ｈ． ａｎｄ Ｅｚｒａ， Ｄ． （２００１） Ｉｎｔｅｒｉｎｄｉｖｉｄｕａｌ ｖａｒｉａｂｉｌｉｔｙ ｉｎ ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ ｔｏ ｗａｒｆａｒｉｎ− Ｎａｔｕｒｅ ｏｒ ｎｕｒｔｕｒｅ？ Ｃｌｉｎ． Ｐｈａｒｍａｃｏｌ． Ｔｈｅｒ．， ７０， １５９−１６４．
６． Ｔａｋａｈａｓｈｉ， Ｈ．， Ｗｉｌｋｉｎｓｏｎ， Ｇ．Ｒ．， Ｃａｒａｃｏ， Ｙ．， Ｍｕｓｚｋａｔ， Ｍ．， Ｋｉｍ， Ｒ．Ｂ．， Ｋａｓｈｉｍａ， Ｔ．， Ｋｉｍｕｒａ， Ｓ． ａｎｄ Ｅｃｈｉｚｅｎ， Ｈ． （２００３） Ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅｓ ｉｎ Ｓ−ｗａｒｆａｒｉｎ ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ ｂｅｔｗｅｅｎ ＣＹＰ２Ｃ９ ｇｅｎｏｔｙｐｅ−ｍａｔｃｈｅｄ Ｃａｕｃａｓｉａｎ ａｎｄ Ｊａｐａｎｅｓｅ ｐａｔｉｅｎｔｓ．Ｃｌｉｎ． Ｐｈａｒｍａｃｏｌ． Ｔｈｅｒ．， ７３， ２５３−２６３．
７． Ｚｈａｏ， Ｆ．， Ｌｏｋｅ， Ｃ．， Ｒａｎｋｉｎ， Ｓ．Ｃ．， Ｇｕｏ， Ｊ．Ｙ．， Ｌｅｅ， Ｈ．Ｓ．， Ｗｕ， Ｔ．Ｓ．， Ｔａｎ， Ｔ．， Ｌｉｕ， Ｔ．Ｃ．， Ｌｕ， Ｗ．Ｌ．， Ｌｉｍ， Ｙ．Ｔ． ｅｔ ａｌ． （２００４） Ｎｏｖｅｌ ＣＹＰ２Ｃ９ ｇｅｎｅｔｉｃ ｖａｒｉａｎｔｓ ｉｎ Ａｓｉａｎ ｓｕｂｊｅｃｔｓ ａｎｄ ｔｈｅｉｒ ｉｎｆｌｕｅｎｃｅ ｏｎ ｍａｉｎｔｅｎａｎｃｅ ｗａｒｆａｒｉｎ ｄｏｓｅ．Ｃｌｉｎ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｔｈｅｒ．， ７６， ２１０−２１９．
８． Ｙｕ， Ｈ．Ｃ．， Ｃｈａｎ， Ｔ．Ｙ．， Ｃｒｉｔｃｈｌｅｙ， Ｊ．Ａ． ａｎｄ Ｗｏｏ， Ｋ．Ｓ． （１９９６） Ｆａｃｔｏｒｓ ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ ｔｈｅ ｍａｉｎｔｅｎａｎｃｅ ｄｏｓｅ ｏｆ ｗａｒｆａｒｉｎ ｉｎ Ｃｈｉｎｅｓｅ ｐａｔｉｅｎｔｓ． ＱＪＭ， ８９， １２７−１３５．
９． Ｘｉｅ， Ｈ．Ｇ．， Ｋｉｍ， Ｒ．Ｂ．， Ｗｏｏｄ， Ａ．ｊ． ａｎｄ Ｓｔｅｉｎ， Ｃ．Ｍ． （２００１） Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｂａｓｉｓ ｏｆ ｅｔｈｎｉｃ ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅｓ ｉｎ ｄｒｕｇ ｄｉｓｐｏｓｉｔｉｏｎ ａｎｄ ｒｅｓｐｏｎｓｅ． Ａｎｎｕ． Ｒｅｖ． Ｐｈａｒｍａｃｏｌ． Ｔｏｘｉｃｏｌ．， ４１， ８１５−８５０．
１０． Ｂｏｇｏｕｓｓｌａｖｓｋｙ， Ｊ． ａｎｄ Ｒｅｇｌｉ， Ｆ． （１９８５） Ａｎｔｉｃｏａｇｕｌａｎｔ−ｉｎｄｕｃｅｄ ｉｎｔｒａｃｅｒｅｂｒａｌ ｂｌｅｅｄｉｎｇ ｉｎ ｂｒａｉｎ ｉｓｃｈｅｍｉａ．Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ｉｎ ２００ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ＴＩＡｓ， ｅｍｂｏｌｉ ｆｒｏｍ ｔｈｅ ｈｅａｒｔ，ａｎｄ ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｎｇ ｓｔｒｏｋｅ． Ａｃｔａ． Ｎｅｕｒｏｌ． Ｓｃａｎｄ．， ７１， ４６４−４７１．
１１． Ｌａｎｄｅｆｅｌｄ， Ｃ．Ｓ． ａｎｄ Ｂｅｙｔｈ， Ｒ．Ｊ． （１９９３） Ａｎｔｉｃｏａｇｕｌａｎｔ−ｒｅｌａｔｅｄ ｂｌｅｅｄｉｎｇ： ｃｌｉｎｉｃａｌ ｅｐｉｄｅｍｉｏｌｏｇｙ， ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ， ａｎｄ ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ． Ａｍ． Ｊ． Ｍｅｄ．， ９５， ３１５−３２８．
１２． Ｇｕｌｌｏｖ， Ａ．Ｌ．， Ｋｏｅｆｏｅｄ， Ｂ．Ｇ． ａｎｄ Ｐｅｔｅｒｓｅｎ， Ｐ． （１９９４） Ｂｌｅｅｄｉｎｇ Ｃｏｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｔｏ Ｌｏｎｇ−Ｔｅｒｍ Ｏｒａｌ Ａｎｔｉｃｏａｇｕｌａｎｔ Ｔｈｅｒａｐｙ． Ｊ． Ｔｈｒｏｍｂ． Ｔｈｒｏｍｂｏｌｙｓｉｓ， １， １７−２５．
１３． Ｋａｍｉｎｓｋｙ， Ｌ．Ｓ．， Ｄｕｎｂａｒ， Ｄ．Ａ．， Ｗａｎｇ， Ｐ．Ｐ．， Ｂｅａｕｎｅ， Ｐ．， Ｌａｒｒｅｙ， Ｄ．， Ｇｕｅｎｇｅｒｉｃｈ， Ｆ．Ｐ．， Ｓｃｈｎｅｌｌｍａｎｎ， Ｒ．Ｇ． ａｎｄ Ｓｉｐｅｓ， Ｉ．Ｇ． （１９８４） Ｈｕｍａｎ ｈｅｐａｔｉｃ ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ Ｐ−４５０ ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ ａｓ ｐｒｏｂｅｄ ｂｙ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｍｉｃｒｏｓｏｍａｌ ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ ｏｆ ｗａｒｆａｒｉｎ． Ｄｒｕｇ Ｍｅｔａｂ． Ｄｉｓｐｏｓ．， １２， ４７０−４７７．
１４． Ｒｅｔｔｉｅ， Ａ．Ｅ．、 Ｋｏｒｚｅｋｗａ， Ｋ．Ｒ．， Ｋｕｎｚｅ， Ｋ．Ｌ．， Ｌａｗｒｅｎｃｅ， Ｒ．Ｆ．， Ｅｄｄｙ， Ａ．Ｃ．， Ａｏｙａｍａ， Ｔ．， Ｇｅｌｂｏｉｎ， Ｈ．Ｖ．， Ｇｏｎｚａｌｅｚ， Ｆ．Ｊ． ａｎｄ Ｔｒａｇｅｒ， Ｗ．Ｆ． （１９９２） Ｈｙｄｒｏｘｙｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｗａｒｆａｒｉｎ ｂｙ ｈｕｍａｎ ｃＤＮＡ−ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ Ｐ−４５０：ａ ｒｏｌｅ ｆｏｒ Ｐ−４５０２Ｃ９ ｉｎ ｔｈｅ ｅｔｉｏｌｏｇｙ ｏｆ （Ｓ）−ｗａｒｆａｒｉｎ−ｄｒｕｇ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ．Ｃｈｅｍ． Ｒｅｓ． Ｔｏｘｉｃｏｌ．， ５， ５４−５９．
１５． Ｋａｍｉｎｓｋｙ， Ｌ．Ｓ．， ｄｅ Ｍｏｒａｉｓ， Ｓ．Ｍ．， Ｆａｌｅｔｔｏ， Ｍ．Ｂ．， Ｄｕｎｂａｒ， Ｄ．Ａ． ａｎｄ Ｇｏｌｄｓｔｅｉｎ， Ｊ．Ａ． （１９９３） Ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ Ｐ４５０２Ｃ ｓｕｂｓｔｒａｔｅ ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｉｅｓ ｗｉｔｈ ｐｒｉｍａｒｙ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ：ｗａｒｆａｒｉｎ ａｓ ａ ｐｒｏｂｅ． Ｍｏｌ． Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．， ４３， ２３４−２３９．
１６． Ｘｉｅ， Ｈ．Ｇ．， Ｐｒａｓａｄ， Ｈ．Ｃ．， Ｋｉｍ， Ｒ．Ｂ． ａｎｄ Ｓｔｅｉｎ， Ｃ．Ｍ． （２００２） ＣＹＰ２Ｃ９ ａｌｌｅｌｉｃ ｖａｒｉａｎｔｓ： ｅｔｈｎｉｃ ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ ａｎｄ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｃｅ． Ａｄｖ． Ｄｒｕｇ． Ｄｅｌｉｖ． Ｒｅｖ．， ５４， １２５７−１２７０．
１７． Ｋｉｒｃｈｈｅｉｎｅｒ， Ｊ． ａｎｄ Ｂｒｏｃｋｍｏｌｌｅｒ， Ｊ． （２００５） Ｃｌｉｎｉｃａｌ ｃｏｎｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ Ｐ４５０ ２Ｃ９ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍｓ． Ｃｌｉｎ． Ｐｈａｒｍａｃｏｌ． Ｔｈｅｒ．， ７７， １−１６．
１８． Ｆｕｒｕｙａ， Ｈ．， Ｆｅｒｎａｎｄｅｚ−Ｓａｌｇｕｅｒｏ， Ｐ．， Ｇｒｅｇｏｒｙ， Ｗ．， Ｔａｂｅｒ， Ｈ．， Ｓｔｅｗａｒｄ， Ａ．， Ｇｏｎｚａｌｅｚ， Ｆ．Ｊ． ａｎｄ Ｉｄｌｅ， Ｊ．Ｒ． （１９９５） Ｇｅｎｅｔｉｃ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ ｏｆ ＣＹＰ２Ｃ９ ａｎｄ ｉｔｓ ｅｆｆｅｃｔ ｏｎ ｗａｒｆａｒｉｎ ｍａｉｎｔｅｎａｎｃｅ ｄｏｓｅ ｒｅｑｕｉｒｅｍｅｎｔ ｉｎ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｕｎｄｅｒｇｏｉｎｇ ａｎｔｉｃｏａｇｕｌａｔｉｏｎ ｔｈｅｒａｐｙ．Ｐｈａｒｍａｃｏｇｅｎｅｔｉｃｓ， ５， ３８９−３９２．
１９． Ａｉｔｈａｌ， Ｇ．Ｐ．， Ｄａｙ， Ｃ．Ｐ．， Ｋｅｓｔｅｖｅｎ， Ｐ．Ｊ． ａｎｄ Ｄａｌｙ， Ａ．Ｋ． （１９９９） Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍｓ ｉｎ ｔｈｅ ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ Ｐ４５０ ＣＹＰ２Ｃ９ ｗｉｔｈ ｗａｒｆａｒｉｎ ｄｏｓｅ ｒｅｑｕｉｒｅｍｅｎｔ ａｎｄ ｒｉｓｋ ｏｆ ｂｌｅｅｄｉｎｇ ｃｏｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ． Ｌａｎｃｅｔ， ３５３， ７１７−７１９．
２０． Ｈｉｇａｓｈｉ，Ｍ．Ｋ．， Ｖｅｅｎｓｔｒａ， Ｄ．Ｌ．， Ｋｏｎｄｏ， Ｌ．Ｍ．， Ｗｉｔｔｋｏｗｓｋｙ， Ａ．Ｋ．， Ｓｒｉｎｏｕａｎｐｒａｃｈａｎｈ， Ｓ．Ｌ．， Ｆａｒｉｎ， Ｆ．Ｍ． ａｎｄ Ｒｅｔｔｉｅ， Ａ．Ｅ． （２００２） Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ｂｅｔｗｅｅｎ ＣＹＰ２Ｃ９ ｇｅｎｅｔｉｃ ｖａｒｉａｎｔｓ ａｎｄ ａｎｔｉｃｏａｇｕｌａｔｉｏｎ−ｒｅｌａｔｅｄ ｏｕｔｃｏｍｅｓ ｄｕｒｉｎｇ ｗａｒｆａｒｉｎ ｔｈｅｒａｐｙ． ＪＡＭＡ， ２８７， １６９０−１６９８．
２１． Ｎａｓｕ， Ｋ．， Ｋｕｂｏｔａ， Ｔ． ａｎｄ Ｉｓｈｉｚａｋｉ， Ｔ． （１９９７） Ｇｅｎｅｔｉｃ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ＣＹＰ２Ｃ９ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ ｉｎ ａ Ｊａｐａｎｅｓｅ ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ． Ｐｈａｒｍａｃｏｇｅｎｅｔｉｃｓ， ７， ４０５−４０９．
２２． Ｂｅｌｌ，Ｒ．Ｇ． ａｎｄ Ｍａｔｓｃｈｉｎｅｒ， Ｊ．Ｔ． （１９７２） Ｗａｒｆａｒｉｎ ａｎｄ ｔｈｅ ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｏｆ ｖｉｔａｍｉｎ Ｋ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｂｙ ａｎ ｏｘｉｄｅ ｍｅｔａｂｏｌｉｔｅ． Ｎａｔｕｒｅ， ２３７， ３２−３３．
２３． Ｗａｌｌｉｎ， Ｒ． ａｎｄ Ｍａｒｔｉｎ， Ｌ．Ｆ． （１９８５） Ｖｉｔａｍｉｎ Ｋ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｃａｒｂｏｘｙｌａｔｉｏｎ ａｎｄ ｖｉｔａｍｉｎ Ｋ ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ ｉｎ ｌｉｖｅｒ． Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｗａｒｆａｒｉｎ． Ｊ．Ｃｌｉｎ． Ｉｎｖｅｓｔ．， ７６， １８７９−１８８４．
２４． Ｌｉ， Ｔ．， Ｃｈａｎｇ， Ｃ．Ｙ．， Ｊｉｎ， Ｄ．Ｙ．， Ｌｉｎ，Ｐ．Ｊ．， Ｋｈｖｏｒｏｖａ， Ａ． ａｎｄ Ｓｔａｆｆｏｒｄ， Ｄ．Ｗ． （２００４） Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｇｅｎｅ ｆｏｒ ｖｉｔａｍｉｎ Ｋ ｅｐｏｘｉｄｅ ｒｅｄｕｃｔａｓｅ．Ｎａｔｕｒｅ, ４２７， ５４１−５４４．
２５. Ｒｏｓｔ， Ｓ．， Ｆｒｅｇｉｎ， Ａ．， Ｉｖａｓｋｅｖｉｃｉｕｓ， Ｖ．， Ｃｏｎｚｅｌｍａｎｎ， Ｅ．， Ｈｏｒｔｎａｇｅｌ， Ｋ．， Ｐｅｌｚ， Ｈ．Ｊ．， Ｌａｐｐｅｇａｒｄ， Ｋ．， Ｓｅｉｆｒｉｅｄ， Ｅ．， Ｓｃｈａｒｒｅｒ， Ｉ， Ｔｕｄｄｅｎｈａｍ， Ｅ．Ｇ，ｅｔ ａｌ （２００４） Ｍｕｔａｔｉｏｎｓ ｉｎ ＶＫＯＲＣ１ ｃａｕｓｅ ｗａｒｆａｒｉｎ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ａｎｄ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｃｏａｇｕｌａｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒ ｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ ｔｙｐｅ ２． Ｎａｔｕｒｅ， ４２７， ５３７−５４１．
２６． Ｈａｒｒｉｎｇｔｏｎ， Ｄ．Ｊ．， Ｕｎｄｅｒｗｏｏｄ， Ｓ．， Ｍｏｒｓｅ， Ｃ．， Ｓｈｅａｒｅｒ， Ｍ．Ｊ．， Ｔｕｄｄｅｎｈａｍ， Ｅ．Ｇ． ａｎｄ Ｍｕｍｆｏｒｄ， Ａ．Ｄ． （２００５） Ｐｈａｒｍａｃｏｄｙｎａｍｉｃ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｔｏ ｗａｒｆａｒｉｎ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｗｉｔｈ ａ Ｖａｌ６６Ｍｅｔ ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎ ｉｎ ｖｉｔａｍｉｎ Ｋ ｅｐｏｘｉｄｅ ｒｅｄｕｃｔａｓｅ ｃｏｍｐｌｅｘ ｓｕｂｕｎｉｔ １． Ｔｈｒｏｍｂ． Ｈａｅｍｏｓｔ．， ９３， ２３−２６．
２７. Ｄ’Ａｎｄｒｅａ， Ｇ．， Ｄ’Ａｍｂｒｏｓｉｏ， Ｒ．Ｌ．， Ｄｉ Ｐｅｒｎａ， Ｐ．， Ｃｈｅｔｔａ， Ｍ．， Ｓａｎｔａｃｒｏｃｅ， Ｒ．， Ｂｒａｎｃａｃｃｉｏ， Ｖ．， Ｇｒａｎｄｏｎｅ， Ｅ． ａｎｄ Ｍａｒｇａｇｌｉｏｎｅ， Ｍ． （２００５） Ａ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ ｉｎ ｔｈｅ ＶＫＯＲＣ１ ｇｅｎｅ ｉｓ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｗｉｔｈ ａｎ ｉｎｔｅｒｉｎｄｉｖｉｄｕａｌ ｖａｒｉａｂｉｌｉｔｙ ｉｎ ｔｈｅ ｄｏｓｅ−ａｎｔｉｃｏａｇｕｌａｎｔ ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｗａｒｆａｒｉｎ． Ｂｌｏｏｄ， １０５， ６４５−６４９．
２８． Ｍａｓｓａｒｉ， Ｍ．Ｅ． ａｎｄ Ｍｕｒｒｅ， Ｃ． （２０００） Ｈｅｌｉｘ−ｌｏｏｐ−ｈｅｌｉｘ ｐｒｏｔｅｉｎｓ： ｒｅｇｕｌａｔｏｒｓ ｏｆ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｉｎ ｅｕｃａｒｙｏｔｉｃ ｏｒｇａｎｉｓｍｓ． Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．， ２０， ４２９−４４０．
２９. Ｔｅｒａｉ， Ｓ．， Ａｏｋｉ， Ｈ．， Ａｓｈｉｄａ， Ｋ． ａｎｄ Ｔｈｏｒｇｅｉｒｓｓｏｎ， Ｓ．Ｓ． （２０００） Ｈｕｍａｎ ｈｏｍｏｌｏｇｕｅ ｏｆ ｍａｉｄ： Ａ ｄｏｍｉｎａｎｔ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ ｈｅｌｉｘ−ｌｏｏｐ−ｈｅｌｉｘ ｐｒｏｔｅｉｎ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｗｉｔｈ ｌｉｖｅｒ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ． Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ， ３２， ３５７−３６６．
３０. Ｂｏｄｉｎ, Ｌ．， Ｖｅｒｓｔｕｙｆｔ， Ｃ．， Ｔｒｅｇｏｕｅｔ， Ｄ．Ａ．， Ｒｏｂｅｒｔ， Ａ．， Ｄｕｂｅｒｔ， Ｌ．， Ｆｕｎｃｋ−Ｂｒｅｎｔａｎｏ， Ｃ．， Ｊａｉｌｌｏｎ， Ｐ．， Ｂｅａｕｎｅ， Ｐ．， Ｌａｕｒｅｎｔ−Ｐｕｉｇ， Ｐ．， Ｂｅｃｑｕｅｍｏｎｔ， Ｌ． ｅｔ ａｌ．（２００５） Ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ Ｐ４５０ ２Ｃ９ （ＣＹＰ２Ｃ９） ａｎｄ ｖｉｔａｍｉｎ Ｋ ｅｐｏｘｉｄｅ ｒｅｄｕｃｔａｓｅ （ＶＫＯＲＣ１） ｇｅｎｏｔｙｐｅｓ ａｓ ｄｅｔｅｒｍｉｎａｎｔｓ ｏｆ ａｃｅｎｏｃｏｕｍａｒｏｌ ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ．Ｂｌｏｏｄ， １０６（１）：１３５−１４０．
３１. Ｊｏｎｅｓ, Ｋ．Ａ．，Ｋａｄｏｎａｇａ， Ｊ．Ｔ．， Ｒｏｓｅｎｆｅｌｄ， Ｐ．Ｊ．， Ｋｅｌｌｙ， Ｔ．Ｊ． ａｎｄ Ｔｊｉａｎ， Ｒ． （１９８７） Ａ ｃｅｌｌｕｌａｒ ＤＮＡ−ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ ｔｈａｔ ａｃｔｉｖａｔｅｓ ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ａｎｄ ＤＮＡ ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ． Ｃｅｌｌ， ４８， ７９−８９．
３２． Ｒｉｅｄｅｒ， Ｍ． Ｊ．， Ａ．Ｐ． Ｒｅｉｎｅｒ， ｅｔ ａｌ． （２００５）． Ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ＶＫＯＲＣ１ ｈａｐｌｏｔｙｐｅｓ ｏｎ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ａｎｄ ｗａｒｆａｒｉｎ ｄｏｓｅ． Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ， ３５２（２２）：２２８５−９３．
３３． Ｇｅｉｓｅｎ， Ｃ．， Ｍ． Ｗａｔｚｋａ， ｅｔ ａｌ． （２００５）． ＶＫＯＲＣ１ ｈａｐｌｏｔｙｐｅｓ ａｎｄ ｔｈｅｉｒ ｉｍｐａｃｔ ｏｎ ｔｈｅ ｉｎｔｅｒ−ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌ ａｎｄ ｉｎｔｅｒ−ｅｔｈｎｉｃａｌ ｖａｒｉａｂｉｌｉｔｙ ｏｆ ｏｒａｌ ａｎｔｉｃｏａｇｕｌａｔｉｏｎ． Ｔｈｒｏｍｂ Ｈａｅｍｏｓｔ， ９４（４）：７７３−９．
３４． Ｖｅｅｎｓｔｒａ， Ｄ．Ｌ．， Ｊ．Ｈ． Ｙｏｕ， ｅｔ ａｌ． （２００５）． Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ｏｆ Ｖｉｔａｍｉｎ Ｋ ｅｐｏｘｉｄｅ ｒｅｄｕｃｔａｓｅ ｃｏｍｐｌｅｘ １ （ＶＫＯＲＣ１） ｖａｒｉａｎｔｓ ｗｉｔｈ ｗａｒｆａｒｉｎ ｄｏｓｅ ｉｎ ａ Ｈｏｎｇ Ｋｏｎｇ Ｃｈｉｎｅｓｅ ｐａｔｉｅｎｔ ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ． Ｐｈａｒｍａｃｏｇｅｎｅｔ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ， １５（１０）：６８７−９１．
３５． Ｓｃｏｎｃｅ， Ｅ．Ａ．， Ｔ．Ｉ． Ｋｈａｎ， ｅｔ ａｌ． （２００５）． Ｔｈｅ ｉｍｐａｃｔ ｏｆ ＣＹＰ２Ｃ９ ａｎｄ ＶＫＯＲＣ１ ｇｅｎｅｔｉｃ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ ａｎｄ ｐａｔｉｅｎｔ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ ｕｐｏｎ ｗａｒｆａｒｉｎ ｄｏｓｅ ｒｅｑｕｉｒｅｍｅｎｔｓ： ｐｒｏｐｏｓａｌ ｆｏｒ ａ ｎｅｗ ｄｏｓｉｎｇ ｒｅｇｉｍｅｎ． Ｂｌｏｏｄ， １０６（７）： ２３２９−３３．
本出願において上記または他の場所で引用された刊行物、特許及び特許出願の全ては、個々の刊行物、特許出願または特許の開示が全体として参照によって援用されていることを具体的におよび個々に示されたのと同じ程度にまで、全体として参照によって本願中に援用されている。

ワルファリンは深部静脈血栓症、心房細動、または機械的心臓弁置換術（１乃至４）を有する披験者に対する血栓塞栓症の予防のための抗凝固剤として広く処方されている。しかしながら、ワルファリンに対する用量要求性が個体間および民族間の両方で極めて変わりやすいため、ワルファリン処理は問題が多い（５乃至７）。一般的に、アジア集団は、中国を含めて、白人およびヒスパニックよりはるかに低い維持量を要求する（６乃至９）。出血がワルファリン処置の圧倒的に最も深刻な問題である（１０乃至１２）。この経口抗凝固剤の安全性をモニタするために、多くの努力がなされてきた。これまでは、標準化された国際標準比率（ＩＮＲ）を用いて血液プロトロンビン時間の連続定量によって用量が綿密にモニタされなければならなかった。

チトクロームＰ４５０，サブファミリーＩＩＣ，ポリペプチド９（ＣＹＰ２Ｃ９）は、ワルファリンの水酸化を触媒する主要な薬物代謝酵素である（１３乃至１５）。ＣＹＰ２Ｃ９^＊２およびＣＹＰ２Ｃ９^＊３は白人集団において最も頻繁に見出された多型である。ＣＹＰ２Ｃ９^＊１を野生型と考えると、ＣＹＰ２Ｃ９^＊１／^＊２およびＣＹＰ２Ｃ９^＊１／^＊３のハプロタイプ頻度はそれぞれ２０％以下および１２％以下である（１６乃至１７）。ＣＹＰ２Ｃ９^＊２およびＣＹＰ２Ｃ９^＊３変異は、ＣＹＰ２Ｃ９の酵素活性を減少させることが示されてきており、ワルファリン感受性および、深刻な場合には、出血性合併症を引き起こす（１８乃至２０）。しかしながら、ＣＹＰ２Ｃ９^＊２およびＣＹＰ２Ｃ９^＊３はアジア集団においては完全に存在しないか、または稀かのいずれかである（９乃至２１）。ＣＹＰ２Ｃ９において見出された遺伝的変異は、今までのところワルファリン投与における個体間の差異の幾つかをほんの部分的に説明することができるが、それらの変異は民族間の差異を説明することができない（６，７および１６）。

ビタミンＫ依存性凝固因子（因子ＩＩ，ＶＩＩ，ＩＸ，およびＸ）のガンマカルボキシル化は血液凝固にとって必須である。凝固因子内のグルタミン酸の側鎖に二酸化炭素を付加するために、ガンマカルボキシシラーゼはビタミンＫの還元型および酸素を使用する。カルボキシル化の間、還元型ビタミンＫはビタミンＫ２，３−エポキシドに酸化され、そこから還元型ビタミンＫは他の触媒サイクルのためのビタミンＫエポキシド還元酵素によって再生される。ワルファリン阻害凝固因子はビタミンＫエポキシド還元酵素を抑制することによって合成する（２２，２３）。近年、ビタミンＫエポキシド還元酵素複合体、サブユニット１（ＶＫＯＲＣ１）をコードする遺伝子がクローニングされ（２４，２５）、ＶＫＯＲＣ１遺伝子における変異がワルファリン抵抗性患者において見出された（２５，２６）。また、イントロンの多型がイタリア人患者における特定のワルファリン個体間変動と関連があることが発見された（２７）。これらの研究は、全てのワルファリン用量による変動、特に民族間変動を説明することができない。さらに、世界人口の大部分であるアジア集団においては説明されない。したがって、より広範囲に適用されることができる適切なワルファリン用量範囲を予想するための方法を見出すことが望まれる。

本研究において、我々はＶＫＯＲＣ１のプロモータにおける多型がワルファリン感受性と関連があることを発見した。この多型は、ワルファリン用量要求性における個体間および民族間の差異の両方を説明することができる。さらにまた、この多型はプロモータ活性と関連がある。−１６３９位（開始コドンの第一ヌクレオチドに対して番号付けされた）にＧを有するＶＫＯＲＣ１プロモータは、同じ位置にＡを有するプロモータより４４％活性が高い。−１６３９位にＡの多型を有する患者は、ワルファリンに対してより感受性である。−１６３９位のホモ接合のＡＡ患者は最も低い用量要求性を有し、ヘテロ接合のＡＧ患者は中間の用量要求性を有し、ホモ接合のＧＧ患者は最も高い用量要求性を有した。したがって、どの程度のワルファリンが被験者に対して処方されるべきかを予想するために、被験者のＶＫＯＲＣ１遺伝子のプロモータ配列または活性が使用されることができる。本方法はワルファリン用量の正確性を有意に改良する。これまでのところ、患者に初回投与量が与えられ、かれらのＩＮＲが定期的にモニタされ、患者に対して安全である維持量が獲得されることができるまで、それに応じてワルファリン投与量が調整されている。本発明を用いれば、予想投与量が維持量に極めて近づき、その結果ワルファリン投与量がより迅速に、より安全に、およびより経済的になるであろう。

それ故に、本発明の一態様は、被験者に対するワルファリンの用量範囲を決定する方法を提供し、本方法は被験者のＶＫＯＲＣ１遺伝子のプロモータの配列を解析する工程を含む。本発明の他の態様は、患者がワルファリンを服用した後の合併症の危険性を評価する方法を提供し、本方法は被験者のＶＫＯＲＣ１遺伝子のプロモータの配列を解析する工程を含む。被験者がワルファリンに対して感受性になるにつれて、出血等の合併症を進展させる危険性が高くなる。

具体的には、ＶＫＯＲＣ１遺伝子の−１６３９位の配列が解析されている。この位置のヌクレオチドがＡである場合、被験者はワルファリンに対してより感受性である。したがって、ＶＫＯＲＣ１遺伝子の−１６３９位にホモ接合のＡＡを有する被験者は、この位置にＡおよび他のヌクレオチド（Ｇ，ＣまたはＴ）を有するヘテロ接合を有する被験者より感受性が高い。同様に、同じヘテロ接合を有する被験者はこの位置にＡを有さない被験者よりワルファリン感受性が高い。

−１６３９位のＡまたは−１６３９位のＧ／Ｃ／Ｔアレルと等価の遺伝子マーカーに対するアッセイによって、配列が解析されることができ、等価の遺伝子マーカーの存在は対応するアレルの存在の指標である。例えば、等価の遺伝子マーカーは、ＶＫＯＲＣ１遺伝子のｒｓ９９３４４３８、ｒｓ８０５０８９４、ｒｓ２３５９６１２およびｒｓ７２９４からなる群より選択されたＳＮＰであってもよく、その多型の各々はワルファリン感受性の指標である。

本発明の幾つかの実施形態において、ＶＫＯＲＣ１遺伝子のプロモータと特異的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドを用いることによって、配列が解析されている。オリゴヌクレオチドは、ＶＫＯＲＣ１遺伝子の−１６３９位の少なくとも６，８，１０，１２，１４，１６，１８，２０，２２または２４ヌクレオチド範囲と特異的にハイブリダイズすることが好ましい。被験者の末梢血から調製されたＤＮＡを用いることによって配列が解析されてもよい。

本発明の主題は、好ましくはヒト、より好ましくはアジア人、白人、アフリカ人、アフリカ系アメリカ人、またはヒスパニック系である。
ワルファリン投与の他の方法は、ＶＫＯＲＣ１遺伝子の解析と結合されることが可能である。例えば、ＣＹＰ２Ｃ９の配列も、当技術分野において入手可能な知識に基づいて解析されることが可能である。例えば、ＣＹＰ２Ｃ９^＊２およびＣＹＰ２Ｃ９^＊３はともに、ワルファリン感受性と関連がある。

本発明の付加的な態様は被験者に対するワルファリンの投与範囲を決定する方法を提供し、本方法は被験者のＶＫＯＲＣ１遺伝子のプロモータ活性を解析する工程を含む。プロモータ活性がより高くなれば、ワルファリン用量要求性のより高い指標となる。

さらに本発明の他の態様は、ワルファリンの投与範囲を決定するためのキットを提供し、本キットは、
（ａ）ＶＫＯＲＣ１遺伝子の−１６３９位の配列Ａを検出するための手段と、
（ｂ）ＶＫＯＲＣ１遺伝子の−１６３９位の配列Ｇを検出するための手段と
からなる群より選択された少なくとも一成分を含む。

さらに、キットはそれぞれＶＫＯＲＣ１遺伝子の−１６３９位の配列ＣおよびＴを検出するための手段を含むことができる。したがって、ある実施形態において、キットはこの位置における四つの可能性のある塩基の各々を検出するための手段を含んでもよい。他の実施形態において、この位置におけるＡの存在がワルファリン感受性の最も良い指標となるので、キットはこの位置におけるＡを検出するための手段、およびＧ，ＣまたはＴを検出するための手段を含んでもよい。その手段はオリゴヌクレオチドであることが好ましい。キットは必要に応じてオリゴヌクレオチドハイブリダイゼーション、ＰＣＲ増幅、および／または使用説明書を含んでもよい。

本発明の他の態様はＶＫＯＲＣ１遺伝子プロモータ領域とハイブリダイズするオリゴヌクレオチド、またはその相補体を提供し、その領域はプロモータの−１６３９位まで及び、少なくとも六ヌクレオチドから構成される。オリゴヌクレオチドはＶＫＯＲＣ１遺伝子の−１６３９位まで及ぶ少なくとも６，８，１０，１２，１４，１６，１８，２０または２４ヌクレオチドと特異的にハイブリダイズすることが好ましい。オリゴヌクレオチドは−１６３９位のヌクレオチドがＡ，Ｇ，ＣまたはＴ，好ましくはＡまたはＧであるこの領域とハイブリダイズすることができる。ある実施形態において、オリゴヌクレオチドは約１５ヌクレオチドまたはそれより少ないヌクレオチド、１６乃至２０ヌクレオチド、２０乃至２５ヌクレオチド、２５乃至３０ヌクレオチド、または３０乃至４０ヌクレオチドから構成されてもよい。また、本発明のオリゴヌクレオチドを構成するアレイが提供される。

本発明の１つまたはそれ以上の実施形態の詳細は以下の添付図面および明細書に記載されている。本発明の他の特徴、目的、および利点は明細書および図面、ならびに特許請求の範囲から明らかとなろう。

我々は、ＶＫＯＲＣ１遺伝子のプロモータにおける多型がワルファリン感受性と関連があることを発見した。この多型はワルファリン用量要求性における個体間および民族間の差異の両方を説明することができる。さらに、この多型はプロモータ活性とも関連がある。−１６３９位（開始コドンの第一ヌクレオチドに対して番号付けされた）にＧを有するＶＫＯＲＣ１プロモータは、同じ位置にＡを有するプロモータより４４％活性が高い。−１６３９位にＡの多型を有する患者は、ワルファリンに対してより感受性である。−１６３９位におけるホモ接合のＡＡ患者は最も低い用量要求性を有し、ヘテロ接合のＡＧ患者は中間の用量要求性を有し、ホモ接合のＧＧ患者は最も高い用量要求性を有していた。したがって、被験者のＶＫＯＲＣ１遺伝子のプロモータ配列または活性は、その被験者に対して処方されるべきワルファリン投与量を予想するために使用されることができる。さらなる発明の詳細な説明の前に、本出願において使用される用語は特に指示がなければ以下のように定義される。

（定義）
用語「ワルファリン」は、抗凝固活性を有するクマリン誘導体を包含する。好ましい実施形態において、ワルファリンは４−ヒドロキシ−３−（３−オキソ−１−フェニルブチル）−２Ｈ−１−ベンゾピラン−２−ワン（すなわち３−α−フェニル−β−アセチルエチル−４−ヒドロキシクマリン）である。現在の市販品はＲ−異性体およびＳ−異性体のラセミ混合物である。用語「ワルファリン」はＲ−異性体、Ｓ−異性体、任意のラセミ混合物、およびそれらの任意の塩を包含する。クマディン、マレバン（Ｍａｒｅｖａｎ）、パンワルフィン（Ｐａｎｗａｒｆｉｎ）、プロスロマディン（Ｐｒｏｔｈｒｏｍａｄｉｎ）、チントラン（Ｔｉｎｔｏｒａｎｅ）、ワルフィロン（Ｗａｒｆｉｌｏｎｅ）、ワラン（Ｗａｒａｎ）、アスロンビン−Ｋ、ワルファリン−デアノール、アドイジン、ワルファリン酸、クマフェン（Ｃｏｕｍａｆｅｎｅ）、ズークマリン（Ｚｏｏｃｏｕｍａｒｉｎ）、フェンプロクモン（Ｐｈｅｎｐｒｏｃｏｕｍｏｎ）、ジクマロール、ブロディファクム（ｂｒｏｄｉｆａｃｏｕｍ）、ジフェナディオン（ｄｉｐｈｅｎａｄｉｏｎｅ）、クロロファシノン、ブロマジオロン、およびアセノクマロールが、具体的にワルファリンとして含まれている。

本願中で使用される用語「オリゴヌクレオチド」は、ヌクレオチド結合を介して結合された２〜約１００の連続的ヌクレオチドを構成する分子である。オリゴヌクレオチドは少なくとも約１０，２０，３０，４０，５０、または６０ヌクレオチド長であってもよい。さらに、オリゴヌクレオチドは約２００までが好ましく、より好ましくは約１５０，１００，７５，５０，４０，３０、または２０ヌクレオチド長までである。

ハイブリダイゼーション「プローブ」は、核酸の相補鎖に対して塩基特異的態様で結合するオリゴヌクレオチドである。そのようなプローブはペプチド核酸を含む。プローブは標的核酸配列に対する特異的ハイブリダイゼーションに適した任意の長さにすることができる。プローブの最も適切な長さは、プローブが使用されているハイブリダイゼーション法に依存して変化してもよい。例えば、微細加工のアレイにおいて使用されるために特別な長さがより適切であっても、従来のハイブリダイゼーション法において使用されるために他の長さがより適切である。そのような最適化は当業者にとって周知である。具体的に、適切なプローブおよびプライマは約８ヌクレオチド長から約１００ヌクレオチド長の範囲である。例えば、プローブおよびプライマは、約８〜２０、１０〜３０、１５〜４０、５０〜８０ヌクレオチド長であり、好ましくは１２〜２０ヌクレオチド長である。ヌクレオチド配列は遺伝子のコード配列またはその遺伝子のコード配列の相補体に対応することができる。

（方法および組成物）
ワルファリン感受性またはワルファリン抵抗性を有する中国人患者のＣＹＰ２Ｃ９およびＶＫＯＲＣ１のＤＮＡ配列の比較に基づいて（実施例１）、我々はＣＹＰ２Ｃ９のＤＮＡ配列変異が漢民族集団の５．４％〜７．３％にしか表れていないことを見出した。変異は主としてＣＹＰ２Ｃ９^＊３であった。さらに、未だ報告されていない新規の変異（Ｐ３８２Ｌ）を含めて、本研究において同定された二つのミスセンス変異は、ワルファリン感受性患者において稀有およびわずかに存在していた。また、ＣＹＰ２Ｃ９変異は異なる民族集団において異なる有病率を示した。ＣＹＰ２Ｃ９^＊１／^＊２は白人集団の２０％において存在していた（１７）。しかしながら、本研究における中国人集団においてはＣＹＰ２Ｃ９^＊１／^＊２は全く存在しなかった。したがって、ＣＹＰ２Ｃ９における変異は中国人集団におけるほんの少数のワルファリン感受性を説明することが可能であり、ワルファリン用量要求性における民族間の差異を説明することができない。

他方で、我々は、ＶＫＯＲＣ１遺伝子における変異が、中国人集団における個体間および中国人と白人との間の民族間のワルファリン用量要求性を変化させることができることを見出した。−１６３９位のプロモータの多型ＡＡ遺伝子型を有する患者がより低い用量要求性を有するのに対して、ＡＧ／ＧＧ遺伝子型を有する患者はより高い用量要求性を有していた（実施例１および２）。さらに、ホモ接合ＡＡが白人集団において稀有である一方で、この遺伝子型は多数の中国人集団を形成している（実施例３）。白人と中国人との間の遺伝子型頻度における差異、およびＡＡのワルファリン感受性との相関は、中国人集団が白人集団より低い用量を要求するといった臨床的に観察されてきたことに従っている。

したがって、本発明の一態様は被験者に対するワルファリンの投与範囲を決定する方法を提供し、本方法はその被験者のＶＫＯＲＣ１遺伝子のプロモータの配列を解析する工程を含む。プロモータ配列は、配列番号１と比べて転写開始位置から３キロベース以内の１０％未満、８％未満、６％未満、４未満％、３％未満、２％未満、または１％未満の変異を含むことが好ましい。プロモータは、この３キロベース領域内に２０未満、１５未満、１２未満、１０未満、８未満、６未満、４未満、３未満、または２未満の単一塩基変異を含むことがより好ましい。そのような配列変異は、プロモータ活性における変化と相まって、処方されるべきワルファリンの投与範囲の指標となる。

具体的には、ＶＫＯＲＣ１遺伝子の−１６３９位の配列が解析された。任意の他の遺伝子型を調べる必要がなくワルファリン感受性を予想するために、このＳＮＰのみが使用されることができる。したがって、この位置におけるホモ接合のＡＡはワルファリン感受性の指標であり、ヘテロ接合のＡＧは中間の感受性を示し、ホモ接合のＧＧを有する被験者は比較的抵抗性である。感受性の被験者、中間の感受性の被験者、または比較的抵抗性の被験者に投与されるべきワルファリンの実際の投与量は、ワルファリンの剤形および被験者の指示および症状に伴って変化し、ワルファリンを処方する医師によって決定されることができる。例えば、我々の研究によって（実施例１）、ワルファリン感受性またはワルファリン抵抗性を有する選択された患者集団において、最も低い用量要求性（一日当たり平均１．１９ｍｇ、一日当たり０．７１〜１．５０ｍｇの範囲）を有する患者はＡＡ遺伝子型を有し、中間の用量要求性（一日当たり平均８．０４ｍｇ、一日当たり６．０７〜１０ｍｇの範囲）を有する患者はヘテロ接合ＡＧを有し、最も高い用量要求性（一日当たり平均９．１１ｍｇ、一日当たり８．５７〜１０ｍｇの範囲）を有する患者はホモ接合ＧＧの遺伝子型に関連していた。無作為に選択された患者において（実施例２）、ＡＡ遺伝子型はＡＧおよびＧＧ（一日当たり３．８１プラスマイナス１．２４ｍｇ）より低い維持量（一日当たり２．６１プラスマイナス１．１０ｍｇ）に関連している。これらの範囲はワルファリン投与における出発点としての機能を果たすことができる。

ＶＫＯＲＣ１遺伝子のゲノム配列はＧｅｎｂａｎｋ登録番号ＡＹ５８７０２０（配列番号１；図３）として入手可能である。ＶＫＯＲＣ１アイソフォーム１のｍＲＮＡの配列は登録番号ＮＭ_０２４００６．４．として入手可能である。これらの配列の両方において、転写開始位置は＋１として指定されており、したがって本明細書中に記載されたワルファリン感受性のプロモータ多型の指標は１４１３位に位置されるだろう。しかしながら、配列変異の記載に対するヒトゲノム変異学会（Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｏｍｅ Ｖａｒｉａｔｉｏｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ（ＨＧＶＳ）による最近の推奨に従って（ｈｔｔｐ:／／ｗｗｗ．ｇｅｎｏｍｉｃ．ｕｎｉｍｅｌｂ．ｅｄｕ．ａｕ／ｍｄｉ／ｍｕｔｎｏｍｅｎ／）、プロモータＳＮＰはＡＴＧ転写開始コドンのＡに関して記載することを推奨されている。この命名法に基づいて、ＮＭ_０２４００６．４またはＡＹ５８７０２０のＡＴＧ転写開始
コドン（Ｍｅｔ）のＡは、＋１に位置付けられ、本明細書中に記載されたプロモータＳＮＰは−１６３９位であり、この位置におけるＧ＞Ａ多型は「ＮＭ_０２４００６．４：Ｃ．−１６３９Ｇ＞Ａ」として参照されるだろう。本開示の−１６３９位のＧ＞Ａ多型（すなわちより正確には「ＮＭ_０２４００６．４：Ｃ．−１６３９Ｇ＞Ａ」）は、従来のプロモータ配列番号付けに従って１４１３位のＧ＞Ａ多型と同じであることが明らかにされるべきである。

特異的多型（例えば、−１６３９位のＡＡ，ＡＧまたはＧＧ）に加えて、特異的ＳＮＰｓの各々に結合される遺伝子マーカーは、同様に対応するワルファリン感受性を予想するために使用されることができる。これは対象のＳＮＰ近傍の遺伝子マーカーが対象のＳＮＰと共分離する傾向にあるか、あるいは対象のＳＮＰと連鎖不均衡を示すためである。その結果、これらのマーカー（同等の遺伝子マーカー）の存在は、対象のＳＮＰの存在の指標であり、換言すると、ワルファリン感受性レベルの指標となる。

ＶＫＯＲＣ１の−１６３９位のＡ＞Ｇプロモータ多型は、Ｄ‘Ａｎｄｒｅａらによって最近報告されたＶＫＯＲＣ１の１１７３位のＣ＞Ｔイントロン多型（２７）と連鎖不均衡状態にあり、この結果によって、１１７３位のＴＴ遺伝子型を有するイタリア人患者がＣＴまたはＣＣ遺伝子型を有する患者より低い平均一日服用量を有していたことが説明されるかもしれない。また、我々の研究によって、３７３０位（すなわちｒｓ７２９４）のＧ＞Ａ多型は、３’非翻訳領域に位置されるが、中国人集団における−１６３９位のＡ＞Ｇおよび１１７３位のＣ＞Ｔと連鎖不均衡状態にあることが示された。具体的には、３７３０位のＧアレルは−１６３９位のＡアレルおよび１１７３位のＴアレルと関連がある。−１６３９位のＳＮＰの他の等価の遺伝子マーカーは、ｒｓ９９３４４３８（イントロン１）、ｒｓ８０５０８９４（イントロン２）およびｒｓ２３５９６１２（イントロン２）を含む。したがって、−１６３９位のＡがｒｓ９９３４４３８におけるＴ，ｒｓ８０５０８９４におけるＣ，ｒｓ２３５９６１２におけるＴおよびｒｓ７２９４におけるＧと関連している一方で、−１６３９位のＧは、ｒｓ９９３４４３８におけるＣ，ｒｓ８０５０８９４におけるＧ、ｒｓ２３５９６１２におけるＣおよびｒｓ７２９４におけるＡと関連している。

等価の遺伝子マーカーは、マイクロサテライトマーカーおよび一ヌクレオチド多型（ＳＮＰ）マーカーを含めて任意のマーカーであることが可能である。有用な遺伝子マーカーはＶＫＯＲＣ１の−１６３９位から約２００キロベースまたはそれより小さい距離であることが好ましい。遺伝子マーカーはＶＫＯＲＣ１の−１６３９位から約１００キロベース、８０キロベース、６０キロベース、４０キロベース、２０キロベース、１５キロベース、１０キロベース、または５キロベースあるいはそれより小さい距離であることがより好ましい。

本発明の一態様は、本発明のＳＮＰｓとハイブリダイズすることが可能なオリゴヌクレオチドを提供する。例えば、オリゴヌクレオチドはＶＫＯＲＣ１遺伝子のプロモータ配列の検出のためのハイブリダイゼーションプローブまたはプライマとして有用であろう。オリゴヌクレオチドは、配列ＴＧＧＣＣＧＧＧＴＧＣ（配列番号１の３６６８位から３６７８位）、またはその相補体から構成されることが好ましい。ハイブリダイゼーションの目的のために、−１６３９位に対応する配列がオリゴヌクレオチドの中心近傍であることが好ましい。−１６３９位に対応する配列の両側上に少なくとも４ヌクレオチドあることが好ましい。−１６３９位に対応する位置は両側上の少なくとも５，６，７，８または９ヌクレオチドによって側面を守られていることがより好ましい。

通常、ハイブリダイゼーションはストリンジェントな条件、例えば、１Ｍ程度の塩濃度および少なくとも２５℃の温度で行われる。例えば、５倍濃度のＳＳＰＥ（７５０ｍＭの塩化ナトリウム、１ｍＭのリン酸ナトリウム、１ｍＭのＥＤＴＡ，ｐＨ７．４）の条件、および２５℃〜３０℃の温度、またはそれと同等の条件が、単一ヌクレオチド特異的プローブハイブリダイゼーションにとって適している。例えば、４２℃、５倍濃度のＳＳＣ、および０．１％ＳＤＳ、あるいは５０℃、２倍濃度のＳＳＣ、および０．１％ＳＤＳを含むハイブリダイゼーション後の低ストリンジェント洗浄が行われることがより好ましい。高ストリンジェント洗浄条件が最も好ましく、例えば、６５℃、０．１倍濃度のＳＳＣ、および０．１％ＳＤＳを含む。標的ヌクレオチド配列と使用されるプライマまたはプローブとの間の同程度の同一性または相同性を維持する間、当業者に周知のように、一つまたはそれ以上のパラメータを変更することによって、同等の条件が決定されることができる。

−１６３９位のプロモータＳＮＰはＥ−ＢＯＸ（Ｅ−ＢＯＸのコンセンサス配列はＣＡＮＮＴＧである）内に位置され、短距離（２００塩基対）以内にさらに三つのＥ−ＢＯＸが存在する。Ｅ−ＢＯＸが筋肉、神経細胞、肝臓および膵臓等の細胞／組織型特異的転写を媒介するための重要な要素であることが示されてきた（２８，２９）。−１６３９位において観察されたＡからＧへの第二塩基の置換はＥ−ＢＯＸコンセンサスを無効にしてプロモータ活性を変えるだろう。コンセンサス配列が無効にされる場合、ＨｅｐＧ２細胞においてプロモータ活性が４４％増加されることがプロモータアッセイによって、明確に例証された（図２）。理論によって限定したい訳ではなく、このことはＥ−ＢＯＸがＨｅｐＧ２におけるリプレッサ結合部位として機能することを示唆する。ＨｅｐＧ２が肝臓癌由来であるため、−１６３９位のＥ−ＢＯＸは肝臓において転写を抑制しそうである。

−１６３９位にＧＧ遺伝子型を有する人々がより高いワルファリン投与量を要求することは、以下のように説明されることができる。ＶＫＯＲＣ１遺伝子はビタミンＫエポキシド還元酵素複合体のサブユニット１をコードし、ビタミンＫの還元型を再生することに関与している。ビタミンＫの還元型はガンマカルボキシラーゼによって要求され、ビタミンＫ依存性凝固因子（因子ＩＩ，ＶＩＩ，ＩＸおよびＸ）のガンマカルボキシル化が血液凝固にとって必須である。ＶＫＯＲＣ１プロモータ活性が増加される場合、ＶＫＯＲＣ１ｍＲＮＡの増加レベルがより高いＶＫＯＲ活性に通じることができ、その結果還元型ビタミンＫの再生効率を増長する。それ故に、ビタミンＫ依存性凝固因子のガンマカルボキシル化は、より高レベルの還元型ビタミンＫによって増長される。ワルファリンは凝固因子の合成を阻害することによって作用し、より活性的な凝固因子を有することによってその抗凝固効果のためにより多くのワルファリンが要求されるだろう。肝臓がビタミンＫ依存性凝固因子の合成のための主要な器官であり、ＶＫＯＲＣ１の発現が肝臓で最も高いために、肝臓におけるＶＫＯＲＣ１のレベルの４４％の変化は血液凝固過程に関して重要な影響を与える可能性がある。したがって、ワルファリンの用量要求性はＶＫＯＲＣ１遺伝子多型およびそのプロモータ活性に関連がある。

ＶＫＯＲＣ１プロモータの−１６３９位におけるＡ以外の任意の配列が、Ｅ−ＢＯＸを破壊してプロモータ活性を増加させることを、我々は予想している。換言すれば、プロモータ活性における増加がワルファリンの用量要求性を増加させる。したがって、プロモータ配列、具体的に−１６３９位の配列は、ワルファリン投与量の指標となる。さらに、本発明の他の実施形態は、ＶＫＯＲＣ１遺伝子のプロモータ活性を検出することによって、ワルファリンの投与方法、あるいはワルファリン感受性の決定方法を提供する。同様に、ＶＫＯＲＣ１遺伝子の遺伝子産物（ｍＲＮＡまたはタンパク質）あるいはＶＫＯＲ活性のレベルもワルファリンの用量要求性を反映することができる。ＶＫＯＲＣ１プロモータ活性、ｍＲＮＡレベル、タンパク質レベル、またはＡＡ遺伝子型を有する被験者のＶＫＯＲ活性より少なくとも１０％，１５％，２０％，２５％，３０％，３５％または４０％高いＶＫＯＲ活性が、ＡＡの遺伝子型を有する被験者より高いワルファリンの用量要求性の指標となる。

プロモータ活性あるいはｍＲＮＡまたはタンパク質レベルを決定する方法は当技術分野において周知である。ある実施形態において、ｍＲＮＡレベルを検出するためにＰＣＲが使用されることができる。他の実施形態において、ＶＫＯＲＣ１タンパク質を測定するために特異的抗体が使用される。例えば、末梢血サンプルを用いて対象の被験者からプロモータ配列を分離し、そのプロモータ配列をレポータ遺伝子に結合させ、そのレポータ遺伝子を発現させて、産生されたレポータの量を決定することによって、プロモータ活性が解析されることができる。ＶＫＯＲ活性を測定する方法も当技術分野において周知である。

本発明の付加的な態様は、ＶＫＯＲＣ１遺伝子の既知の変異がワルファリン投与量に影響を与えるかどうか決定する方法を提供する。本方法において、その変異から生じたプロモータ活性、ｍＲＮＡレベル、タンパク質レベル、またはＶＫＯＲ活性が決定され、対応する野生型ＶＫＯＲＣ１遺伝子のプロモータ活性、ｍＲＮＡレベル、タンパク質レベル、またはＶＫＯＲ活性と比較される。野生型と比べて、プロモータ活性、ｍＲＮＡレベル、タンパク質レベル、またはＶＫＯＲ活性が少なくとも１０％，１５％，２０％，２５％，３０％，３５％または４０％増加するかあるいは減少する場合、医師はワルファリン投与量を増加させるかあるいは減少させることを考慮するべきである。

さらに本発明の他の態様は、ワルファリンの投与範囲を決定するためのキットを提供し、本キットは、
（ａ）ＶＫＯＲＣ１遺伝子の−１６３９位における配列Ａを検出するための手段と、
（ｂ）ＶＫＯＲＣ１遺伝子の−１６３９位における配列Ｇを検出するための手段と
からなる群より選択された少なくとも一成分を含む。

さらに、そのキットは、それぞれＶＫＯＲＣ１遺伝子の−１６３９位における配列ＣおよびＴを検出するための手段を含むことができる。したがって、ある実施形態において、そのキットはこの位置における四つの可能性のある塩基の各々を検出するための手段を含んでもよい。他の実施形態において、この位置におけるＡの存在がワルファリン感受性の最も良い指標であるため、キットはこの位置におけるＡを検出するための手段、およびＧ，ＣまたはＴを検出するための手段を含んでもよい。その手段はオリゴヌクレオチドであることが好ましい。キットは必要に応じてオリゴヌクレオチドハイブリダイゼーション、ＰＣＲ増幅法のための試薬、および／または使用説明書を含んでいてもよい。

本発明の他の態様は、ＶＫＯＲＣ１遺伝子のプロモータ領域とハイブリダイズするオリゴヌクレオチド、またはその相補体を提供し、その領域はプロモータの−１６３９位まで及び、少なくとも６ヌクレオチドから構成される。オリゴヌクレオチドはＶＫＯＲＣ１遺伝子の−１６３９位まで及ぶ少なくとも６，８，１０，１２，１４，１６，１８，２０，２２，または２４ヌクレオチドと特異的にハイブリダイズすることが好ましい。オリゴヌクレオチドは、−１６３９位におけるヌクレオチドがＡ，Ｇ，ＣまたはＴ、好ましくはＡまたはＧであるこの領域とハイブリダイズすることができる。ある実施形態において、オリゴヌクレオチドは約１５ヌクレオチドまたはそれより小さいヌクレオチド、１６〜２０ヌクレオチド、２０〜２５ヌクレオチド、２５〜３０ヌクレオチド、または３０〜４０ヌクレオチドから構成されてもよい。また、本発明のオリゴヌクレオチドを構成するアレイも提供される。

本発明を説明するために以下の実施例が提供されるが、本発明の範囲を限定するような方法において解釈されない。本発明がその好ましい実施例を参照して具体的に示され、記載されているので、添付の特許請求の範囲によって定義された発明の精神および範囲から逸脱することなく、形式および詳細における種々の変化がその中になされてもよいことは当業者によって理解されよう。

下記の実施例において、以下の略語は以下の意味を有する。定義されていない略語はそれらが一般的に受け入れられた意味を有する。
℃ ＝セ氏温度
ｈｒ ＝時間
ｍｉｎ ＝分
ｓｅｃまたはｓ ＝秒
μＭ ＝マイクロモル
ｍＭ ＝ミリモル
Ｍ ＝モル
ｍｌ ＝ミリリットル
μｌ ＝マイクロリットル
ｍｇ ＝ミリグラム
μｇ ＝マイクログラム
ｍｏｌ ＝モル
ｐｍｏｌ ＝ピコモル
ＡＳＯ ＝アレル特異的オリゴヌクレオチド
ＣＹＰ２Ｃ９ ＝チトクロームＰ４５０，サブファミリーＩＩＣ，ポリペプチド９
ＩＮＤ ＝国際標準比率
ＬＤ ＝連鎖不均衡
ＮＴＰ ＝ヌクレオチド三リン酸
ＰＢＳ ＝リン酸緩衝液
ＰＣＲ ＝ポリメラーゼ連鎖反応
ＳＮＰ ＝一ヌクレオチド多型
ＶＫＯＲＣ１ ＝ビタミンＫエポキシド還元酵素複合体，サブユニット１
材料および方法
患者
我々は台湾における四つの主要な医療センター（国立台湾大学病院、高雄医科大学病院、台北退役軍人病院、および新光Ｗｕ Ｈｏ−Ｓｕ記念病院）の循環器クリニックから低用量または高用量のワルファリンを処方された１６患者を採用した。中国人患者におけるワルファリンの平均維持量は一日当たり３．３ｍｇである（８，９）。したがって、我々は一日当たり１．５ｍｇ以下の維持量を処方された患者をワルファリン感受性と見なし（表１、１１患者）、一日当たり６ｍｇ以上のワルファリン維持量を処方された患者をワルファリン抵抗性と見なした（表１、５患者）。ワルファリン抵抗性患者の定義は、無作為に選択された患者（表２）のいずれも一日当たり６ｍｇより多いワルファリン用量を有しないという我々独自のデータによって支持された。このことは、一日当たり５．１ｍｇと５．５ｍｇとの間の平均維持量を有する白人患者（２０，２７）と対照的である。

ワルファリンの平均一日服用量を一週間の期間から算出し、各患者の最新の国際標準比率（ＩＮＲ）を記録した。投与量に関係なく、ワルファリンを投与され、無作為に採用された１０４患者が、同じ四つの病院から１．４〜３の標的ＩＮＲを有していた（表２）。ワルファリンの指標は、弁置換術（９０患者）、深部静脈血栓症（５患者）、心房細動（５患者）、および発作（４患者）であった。（年齢、性別、体重、および平均一日維持量を含めた）臨床情報を全ての患者から入手した。採血時に、全ての患者は、少なくとも三週間の間一定の維持量を有していた。ワルファリン治療前に、肝臓、腎臓、胃腸に腫瘍を有する患者、または異常出血疾患を有する患者を除外した。

さらに、９２人の血縁関係のない白人から得たＤＮＡサンプル（アメリカ、ニュージャージー州、カムデン、米国立総合医科学研究所（ＮＩＧＭＳ）ヒト遺伝細胞貯蔵所、カタログ番号ＨＤ１００ＣＡＵ）を、白人対照として使用した。台湾を横断する地理的分布に基づいて３３１２人の漢民族の子孫が採用された全国的な人口調査の下、バイオバンクから無作為に選択された９５人の健常人被験者から得たＤＮＡサンプルを、中国人対照として使用した。中国人対照およびワルファリン治療を受けている全ての参加患者が、台湾に居住する血縁関係のない漢民族であった。漢民族は台湾において最大民族集団を形成し、人口の約９８％を構成している。参加者の中には、台湾人口の残り２％を占める先住台湾人はいなかった。

本研究は施設内倫理委員会によって承認され、参加者の全ての人からインフォームドコンセントが得られた。
ＤＮＡ塩基配列および一ヌクレオチド多型（ＳＮＰ）遺伝子型決定
ＰＵＲＥＧＥＮＥ（登録商標）ＤＮＡ精製システム（アメリカ、ミネソタ州、Ｇｅｎｔｒａ ｓｙｓｔｅｍ社）を用いて、ゲノムＤＮＡを単離した。ワルファリン感受性（一日当たり１．５ｍ以下、１１患者）およびワルファリン抵抗性（一日当たり６．０ｍｇ以上、５患者）を有する１６人の漢民族患者におけるＣＹＰ２Ｃ９およびＶＫＯＲＣ１のＤＮＡ配列変異を、直接配列決定法（アメリカ、カリフォルニア州、フォスターシティ（Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ），Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ３７３０ ＤＮＡ アナライザー，）によって初めに決定した。具体的には、Ｐｒｉｍｅｒ３ ＰＣＲ プライマ プログラム（ｈｔｔｐ：／／ｆｏｋｋｅｒ．ｗｉ．ｍｉｔ．ｅｄｕ／ｃｇｉ−ｂｉｎ／ｐｒｉｍｅｒ３／ｐｒｉｍｅｒ３_ｗｗｗ．ｃｇｉ）を用いて、ＣＹＰ２Ｃ９およびＶＫＯＲＣ１の両方のためのイントロン−エクソン接合部、エクソン、および転写開始位置の２キロ塩基対上流に対するプライマを設計した。ＶＫＯＲＣ１プロモータにおける変異を検出するために使用されたプライマは、５’−ＣＡＧＡＡＧＧＧＴＡＧＧＴＧＣＡＡＣＡＧＴＡＡ（配列番号２；転写開始位置の１．５キロベース上流に位置するセンス鎖）および５‘−ＣＡＣＴＧＣＡＡＣＴＴＧＴＴＴＣＴＣＴＴＴＣＣ（配列番号３;転写開始位置の０．９キロベース上流に位置するアンチセンス鎖）であった。０．４μＭの各プライマ、１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．３）、５０ｍＭのＫＣｌ、１．５ｍＭのＭｇＣｌ_２、０．２ｍＭのｄＮＴＰｓおよび１単位のＨｏｔＳｔａｒｔ Ｔａｑ（登録商標）（アメリカ、カリフォルニア州、バレンシア、Ｑｉａｇｅｎ社）を含む、２５μｌの最終濃度において、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を行った。増幅条件を、９６℃，１２分の第一変性、次に９６℃，３０秒で３４回のＰＣＲサイクル、６０℃，３０秒、７２℃，４０秒で構成した。

次に、ワルファリンを処方されている、無作為に選択された１０４人の中国人患者、９５人の正常中国人対照および９２人の正常白人対照において同定された変異をスクリーニングするために、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析法（アメリカ、アリフォルニア州、サンディエゴ、Ｓｅｑｕｅｎｏｍ社、ＳＥＱＵＥＮＯＭ ＭａｓｓＡＲＲＡＹ システム）を使用した。概説すると、ＳｐｅｃｔｒｏＤＥＳＩＧＮＥＲ ソフトウェア（Ｓｅｑｕｅｎｏｍ社）を用いてプライマおよびプローブを設計した。マルチプレックスＰＣＲを行い、エビアルカリフォスファターゼ（スイス、バーゼル、ホフマン・ラ・ローシュ（Ｈｏｆｆｍａｎ−ＬａＲｏｃｈｅ社）を用いて、組み込まれていないｄＮＴＰｓ（デオキシヌクレオチド三リン酸）を脱リン酸化した後、プライマ伸張反応を行った。精製されたプライマ伸張反応物を３８４成分シリコンチップ（Ｓｅｑｕｅｎｏｍ社、ＳｐｅｃｔｒｏＣＨＩＰ）上にスポットし、Ｂｒｕｋｅｒ Ｂｉｆｌｅｘ ＩＩＩ ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＳｐｅｃｔｒｏＲＥＡＤＥＲ質量分析装置（Ｓｅｑｕｅｎｏｍ社）において解析し、結果として生じたスペクトルを、ＳｐｅｃｔｒｏＴＹＰＥＲ（Ｓｅｑｕｅｎｏｍ社）を用いて処理した。

ルシフェラーゼレポータ分析
プラスミドの構築
ＶＫＯＲＣ１プロモータ活性に対して分析するために、順方向プライマ：５’−ｃｃｇｃｔｃｇａｇｔａｇａｔｇｔｇａｇａａａｃａｇｃａｔｃｔｇｇ（配列番号４；ＸｈｏＩの制限酵素部位を含む）および逆方向プライマ：５‘−ｃｃｃａａｇｃｔｔａａａｃｃａｇｃｃａｃｇｇａｇｃａｇ（配列番号５；ＨｉｎｄＩＩの制限酵素部位を含む）を用いて、−１６３９位のＡＡおよび−１６３９位のＧＧ遺伝子型を有する患者から得た−１６３９位の多型（１７９８位から３５位）を網羅するＶＫＯＲＣ１プロモータを、ｐＧＥＭ−Ｔ Ｅａｓｙ ベクター（アメリカ、ウィスコンシン州、マディソン、Ｐｒｏｍｅｇａ社）中にまずクローニングした。ＸｈｏＩおよびＨｉｎｄＩＩＩ制限酵素部位を用いてベクターを切断することによって、ＶＫＯＲＣ１プロモータを含む断片をｐＧＥＭ−Ｔ ＥＡＳＹ ベクターから切り離し、ｐＧＬ３−標準ベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ社）の多重クローニング部位（ＸｈｏＩおよびＨｉｎｄＩＩＩ）中にサブクローニングした。ｐＧＬ−３ベクターは、蛍ルシフェラーゼに対してコードされたｃＤＮＡを含み、プロモータとともに融合された場合、哺乳類細胞中へのトランフェクション上に挿入されたプロモータ活性を解析するために使用されることができる。−１６３９位のＧ／Ｇ遺伝子型を含むベクターをｐＧＬ３−Ｇに設定し、−１６３９位のＡ／Ａ遺伝子型を含むベクターをｐＧＬ３−Ａに設定した。両ベクター中のＶＫＯＲＣ１プロモータ配列を直接配列決定解析によって確認した。

細胞培養および二重ルシフェラーゼレポータ解析
ＨｅｐＧ２細胞を、Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ 培地（ＤＭＥＭ）、ならびに１ｍｌ当たり１００単位のペニシリン、１ｍｌ当たり１００μｇのストレプトマイシンおよび２ｍＭのＬ−グルタミンが添加された１０％ウシ胎仔血清中で成長させた。トランフェクションの２４時間前に、１２穴のプレートの各ウェル中に１．５×１０^５個の細胞を播いた。トランスフェクションの当日に、リポフェクタミン２０００（アメリカ、カリフォルニア州、カールズバッド、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を用いて、１．５μｇのｐＧＬ３ベクターおよび５０ナノグラムのｐＲＬ−ＴＫベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ社）とともに、各ウェルを共トランスフェフトした。ｐＲＬ−ＴＫベクターはＨＳＶ−ＴＫプロモータによって転写されたＲｅｎｉｌｌａルシフェラーゼをコードしており、蛍ルシフェラーゼ発現を標準化するための内部コントロールとしてｐＲＬ−ＴＫベクターを使用した。トランスフェクションの４８時間後、細胞を受動的溶解緩衝液（Ｐｒｏｍｅｇａ社）中に溶解した。細胞溶解物をルシフェラーゼ基質（Ｐｒｏｍｅｇａ社、二重ルシフェラーゼレポータシステム）に添加し、蛍ルシフェラーゼおよびＲｅｎｉｌｌａルシフェラーゼ活性が照度計（ドイツ、プフォルツハイム、ＳＩＲＩＵＳ社）を用いて測定した。

統計分析
各ＳＮＰの遺伝子型頻度を集計した。三サンプル集団に対する各ＳＮＰの遺伝子頻度を比較するために、χ二乗検定を使用した。異なる遺伝子型集団間の平均投与量レベルの多重比較のために、Ｔ−検定およびＷｉｌｃｏｘｏｎ−Ｍａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ検定を行った。二つの測定値、Ｄ’およびｒ^２によって内部マーカー連鎖不均衡（ＬＤ）を評価し、Ｇｒａｐｈｉｃａｌ Ｏｖｅｒｖｉｅｗ ｏｆ Ｌｉｎｋａｇｅ Ｄｉｓｅｑｕｉｌｉｂｒｉｕｍ（ＧＯＬＤ、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｓｐｈ．ｕｍｉｃｈ．ｅｄｕ／ｃｓｇ／ａｂｅｃａｓｉｓ／ＧＯＬＤ）を用いて算出した。

実施例１
ワルファリン感受性または抵抗性を有する、選択された中国人患者におけるＣＹＰ２Ｃ９およびＶＫＯＲＣ１のＤＮＡ配列変異
中国人におけるワルファリンの平均維持量は一日当たり３．３ｍｇであった（８，９）。したがって、我々は一日当たり１．５ｍｇ以下の維持量を受けた患者をワルファリン感受性と見なし（表１，１１患者）、一日当たり６ｍｇ以上のワルファリン維持量をうけた患者をワルファリン抵抗性と見なした（表１、５患者、さらなる詳細のために材料および方法を参照のこと）。ＣＹＰ２Ｃ９遺伝子のコード領域、エクソン−イントロン接合部、およびプロモータ領域の配列によって、１１人のワルファリン感受性患者の４人において三つの配列変異が明らかとなった。その変異は、１０７５位のＡ＞Ｃ（ＣＹＰ２Ｃ９^＊３として知られるＩ３５９Ｌ）、８９５位のＡ＞Ｇ（Ｔ２９９Ａ）、および１１４５位のＣ＞Ｔ（Ｐ３８２Ｌ）であった。ＣＹＰ２Ｃ９^＊３は３患者において検出された（表１、被験者１，３，および５）。また、ＣＹＰ２Ｃ９^＊３に加えて、被験者５は前述のように８９５位のＡ＞Ｇ（Ｔ２９９Ａ）の変異を有していた（７）。新規エクソンの変異である１１４５位のＣ＞Ｔ（Ｐ３８２Ｌ）は、４番目の患者（被験者６）において検出された。表１に示されるように、ＣＹＰ２Ｃ９遺伝子変異は全てのワルファリン感受性患者において見られず、全てのワルファリン抵抗性患者において全く見られなかった。

また、我々はＶＫＯＲＣ１遺伝子のプロモータ、コード領域、およびエクソン−イントロン接合部の配列を解析した。ＶＫＯＲＣ１の３‘非翻訳領域（ＵＴＲ）に位置する一変異（３７３０位のＧ＞Ａ）が検出された。さらに、プロモータ多型である−１６３９位のＧ＞Ａ（すなわち＋１として転写開始位置を用いる１４１３位）が、ＶＫＯＲＣ１の上流領域において検出された。この多型は、全てのワルファリン感受性患者が−１６３９位においてホモ接合のＡＡであるという点で、ワルファリン感受性と相関を示した。その一方で、ワルファリン抵抗性患者は、へテロ接合のＡＧまたはホモ接合のＧＧのいずれかであった（表１）。ワルファリン用量が−１６３９位の遺伝子型に対してプロットされた場合、ＡＡ遺伝子型を有する患者が最も低い用量要求性（平均一日当たり１．１９ｍｇ、一日当たり０．７１〜１．５０ｍｇの範囲）を有し、ヘテロ接合のＡＧを有する患者は中間の用量要求性（平均一日当たり８．０４ｍｇ、一日当たり６．０７〜１０ｍｇの範囲）を有し、およびホモ接合のＧＧを有する患者は最も高い用量要求性（平均一日当たり９．１１ｍｇ、一日当たり８．５７〜１０ｍｇの範囲）を有していた（表１）。

−１６３９位のＧ＞Ａに加えて、イントロン１の多型である１１７３位のＣ＞Ｔは、Ｄ‘Ａｎｄｒｅａらによって記載されてきたが、我々の患者においても同定された。これら二つの多型は強力な連鎖不均衡（ＬＤ）の関係にあるように思われる（表１）。−１６３９位のＡＡ遺伝子型を有するワルファリン感受性患者が一患者（被験者６）を除いて１１７３位のホモ接合のＴＴと相関することが見出された。ワルファリン抵抗性患者において、−１６３９位のヘテロ接合のＡＧを有する患者は１１７３位のヘテロ接合のＣＴと相関することが見出され、ホモ接合の−１６３９位のＧＧは１１７３位のホモ接合のＴＴと相関があることが見出された（表１）。

実施例２
ワルファリンを受けている無作為中国人患者におけるＶＫＯＲＣ１の−１６３９位のＧ＞Ａ多型
−１６３９位のＧ＞Ａ多型がワルファリン用量における個体間の差異と相関があるかどうかさらに解析するために、我々は用量に関係なくワルファリンを受けている１０４人の患者に、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析法を用いて遺伝子解析を行った。ＡＡおよびＡＧ／ＧＧ集団は年齢、性別、およびＩＮＲに関して差異がなかった（表２）。二患者においてのみＧＧに対してホモ接合であることが見出され、彼らは統計解析のためにＡＧを有する患者と一緒に集団化された。我々は食事または他の投薬等の他の混乱させる変数の有無に関係なくデータを解析した。表２に示されるように、ＡＡ集団は、ＡＧ／ＧＧ集団（一日当たり３．８１ｍｇ）より有意に低い用量要求性（一日当たり２．６１ｍｇ）を有していた。Ｔ検定（ｐ＜０．０００１）またはＷｉｌｃｏｘｏｎ Ｍａｎｎ Ｗｈｉｔｎｅｙ検定（ｐ＝０．０００２）によって、ＡＡ集団とＡＧ／ＧＧ集団との間の差異は優位なものとなった。

実施例３
中国人および白人におけるＶＫＯＲＣ１の−１６３９位のＧ＞Ａ多型およびＣＹＰ２Ｃ９変異の遺伝子型頻度
中国人集団は白人集団より極めて低いワルファリン維持量を要求することが知られていた。ＶＫＯＲＣ１の−１６３９位の遺伝子型における差異がワルファリン用量における民族間の差異を説明することが可能かどうか調べるために、９５人の正常漢民族被験者および９２人の正常白人被験者が遺伝子解析された。白人集団において、ホモ接合のＡＡは最も低い頻度を有したのに対して、ＡＧおよびＧＧ遺伝子型が多数の集団を構成した（表３、それぞれ１４．２％、４６．７％および３９．１％）。逆に、中国人集団において、ホモ接合のＡＡが多数派集団を構成し（８２．１％）、集団の残りは、ヘテロ接合のＡＧ（１７．９％）であった。無作為に選択されたこの集団においては、ホモ接合のＧＧは検出されなかった。また、この割合は７９．８％がホモ接合のＡＡであり、１８．３％がヘテロ接合のＡＧであり、残りの１．８％がホモ接合のＧＧであることが見出された１０４人のワルファリン患者における割合と同じであった。白人集団と二つの中国人集団との間の遺伝子型頻度における差異は、０．０００１未満のｐ値を有して優位であった。二つの民族集団（白人および中国人）の間のこれらの差異、およびＡＡのワルファリン感受性との相関は、中国人集団が白人集団より低い用量を要求するという臨床的所見に従う。

−１６３９位のＧ＞Ａに加えて、我々は中国人集団において、三つのイントロンの多型（ｒｓ９９３４４３８、イントロン１の１１７３位のＣ＞Ｔ，ｒｓ８０５０８９４、イントロン２ｇ．５０９＋１２４Ｃ、およびｒｓ２３５９６１２、イントロン２ｇ．５０９＋８３７Ｃ）、および一つの３‘非翻訳領域の多型（ｒｓ７２９４，３７３０位のＧ＞Ａ）のためにスクリーニングを行った。四つの多型の全てが−１６３９位のプロモータ多型と連鎖不均衡（ＬＤ）の関係にあった（内部マーカー Ｄ’およびｒ^２値が１．０）
また、ＣＹＰ２Ｃ９の変異が中国人集団において遺伝子解析された。ＣＹＰ２Ｃ９^＊１／^＊３の頻度は、中国人の正常集団において７．３％であり、ワルファリンを受けている無作為に選択された中国人患者において５．４％であった、ＣＹＰ２Ｃ９^＊２の変異は中国人患者および対照において検出されなかった。白人におけるＣＹＰ２Ｃ９変異の頻度に関する刊行物のデータに比べて、白人集団は中国人よりはるかに高いＣＹＰ２Ｃ９変異の頻度を有し（３０％未満対７％未満）、さらに白人がワルファリンに対してより抵抗性であった。ワルファリン感受性患者において検出された他のミスセンス変異である８９５位のＡ＞Ｇ（Ｔ２９９Ａ）および１１４５位のＣ＞Ｔ（Ｐ３８２Ｌ）（表１）は無作為に選択された患者および対照のいずれにおいても見出されず、このことはこれらの変異が稀な変異であることを示唆している。

実施例４
ＶＫＯＲＣ１プロモータ活性
ＡＡ遺伝子型の患者とＧＧ遺伝子型の患者との間のワルファリン感受性における差異は、ＶＫＯＲＣ１プロモータ活性における変化によって説明されることができよう。−１６３９位のプロモータＳＮＰがＥ−ＢＯＸ（ＣＡＮＮＴＧ）の第二ヌクレオチドにおいて位置され、その結果、この多型はＥ−ＢＯＸコンセンサス配列を変化させ、ＶＫＯＲＣ１プロモータ活性における変化に通じるであろう。この仮説を調べるために、−１６３９位を網羅するＶＫＯＲＣ１プロモータを、−１６３９位のＡＡ遺伝子型またはＧＧ遺伝子型を有する患者からＰＣＲ増幅し、ｐＧＬ−３ベクター中にクローニングした。ＶＫＯＲＣ１が肝臓において最も高いレベルで発現されるので、ＨｅｐＧ２細胞（ヒト肝臓癌細胞株）をプロモータ解析のために選択した。合計九回の実験を行い、全ての実験が（図２に示されるように）一貫した結果を示した。ＶＫＯＲＣ１プロモータの−１６３９位のＧは、プロモータの−１６３９位のＡと比べてより高いルシフェラーゼ活性（約４４％高い）を示した。ｐＧＬ−３ 標準 ベクターは多重クローニング部位内に挿入されたプロモータを全く有さず、ごく少量のルシフェラーゼ活性を有していた。したがって、−１６３９位の配列はプロモータ活性にとって重要であり、より高いプロモータ活性（例えば、−１６３９位のＧ）がより高いワルファリン用量要求性と相関する。

実施例５
ワルファリン用量におけるＶＫＯＲＣ１の−１６３９位のＳＮＰとＣＹＰ２Ｃ９との組合せ
ワルファリン感受性を予想するためにＶＫＯＲＣ１の−１６３９位のＳＮＰ単独で使用されることが可能であるが、このＳＮＰは必要に応じて他の遺伝子マーカーと組み合わせられことが可能である。例えば、ＶＫＯＲＣ１遺伝子およびＣＹＰ２Ｃ９遺伝子の両方の配列がワルファリン用量において解析されることが可能である。以下の表にこれら二つの遺伝子がともに考慮される場合に各ハプロタイプに対するクマディンの推奨用量を示す。

本発明の多数の実施形態が記載されてきた。それにもかかわらず、本発明の精神および範囲から逸脱することなく種々の変更がなされてもよいことが理解されよう。

ＶＫＯＲＣ１の−１６３９位の遺伝子型に対するワルファリン投与の散布図である。ＶＫＯＲＣ１プロモータの−１６３９位の異なる遺伝子型に対して、ワルファリン感受性またはワルファリン抵抗性を有する選択された患者におけるワルファリン用量（詳細な説明における表１を参照のこと）を座標で示した。＊は、ＣＹＰ２ｃ９^＊３、Ｔ２９９Ａ（すなわちＴからＡに置換されたアミノ酸残基２９９）およびＰ３８２Ｌ（すなわちＰからＬに置換されたアミノ酸残基３８２）を含めたＣＹＰ２Ｃ９変異を有する患者を示す。 ＨｅｐＧ２細胞中のルシフェラーゼ活性レベルの相対測定。プロモータ−１６３９位におけるＡアレル（ｐＧＬ３−Ａ）またはＧアレル（ｐＧＬ３−Ｇ）を含むｐＧＬ３ルシフェラーゼレポーター。九回の実験から得たデータの平均値を表示し、エラーバーは標準偏差を表している。任意のプロモータ配列が挿入されていないコントロールとして、ｐＧＬ３−標準を使用した。 ＶＫＯＲＣ１遺伝子のゲノム配列（Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号ＡＹ５８７０２０）。転写開始位置は、この図におけるヌクレオチド番号５０８６（太字かつ囲み線）であり、従来の命名法において遺伝子の＋１として表されている。ＡＴＧ転写開始コドン（太字）のＡが、この図におけるヌクレオチド番号５３１２であり、ヒトゲノム変異学会（Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｏｍｅ Ｖａｒｉａｔｉｏｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ）によって新規命名システムにおいて＋１として表されるように推奨されている。本発明において記載されたプロモータの多型は下線および太字で表記されており（この配列中ヌクレオチド番号３６７３）、従来システムにおける１４１３位および新規推奨システムにおいて−１６３９位である。

Claims (7)

1. ヒト患者に対するワルファリンの投与量の範囲を予想する方法において、
   前記患者の配列番号１のＶＫＯＲＣ１遺伝子の３６７３位のヌクレオチドを解析する工程であって、前記ヌクレオチドは前記配列番号１のＶＫＯＲＣ１遺伝子の３６７３位のヌクレオチドを含むプロモータ領域と特異的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドを用いることによって解析される工程と、
   前記３６７３位のヌクレオチドに基づいて前記患者がワルファリン感受性か、またはワルファリン抵抗性かを決定する工程であって、前記３６７３位におけるホモ接合のＡＡ、ヘテロ接合のＡＧ、およびホモ接合のＧＧは、それぞれ前記患者がワルファリン感受性、中間の感受性、およびワルファリン抵抗性であることを示す工程と、
   前記患者のワルファリン感受性またはワルファリン抵抗性に基づいてワルファリンの投与量の範囲を予想する工程と
   からなる方法。
2. 前記オリゴヌクレオチドは前記配列番号１のＶＫＯＲＣ１遺伝子の３６７３位まで及ぶ少なくとも６ヌクレオチドと特異的にハイブリダイズする請求項１に記載の方法。
3. 前記ヌクレオチドは前記患者の末梢血から調製されたＤＮＡを用いることによって解析される請求項１または請求項２に記載の方法。
4. 前記患者はアジア人である請求項１乃至請求項３のいずれか一項に記載の方法。
5. 前記患者は白人である請求項１乃至請求項３のいずれか一項に記載の方法。
6. 前記患者はアフリカ人、アフリカ系アメリカ人、またはヒスパニックである請求項１乃至請求項３のいずれか一項に記載の方法。
7. ＣＹＰ２Ｃ９遺伝子の配列を解析する工程と、前記配列番号１のＶＫＯＲＣ１遺伝子の３６７３位のヌクレオチドおよび前記ＣＹＰ２Ｃ９遺伝子の配列に基づいてワルファリンの投与量の範囲を予想する工程とをさらに含む請求項１乃至請求項６のいずれか一項に記載の方法。

Images