JP2004538009A - 方法 - Google Patents
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Abstract
本発明は、ヒトＣＰＢ２遺伝子における多型と、それによりコードされる対応の新規対立遺伝子ポリペプチドに関する。本発明はまた、ＣＰＢ２遺伝子における対立遺伝子変異を解析するための方法及び材料と、ＣＰＢ２薬剤を用いた疾患の治療におけるＣＰＢ２多型の使用に関する。
Description
【０００１】
本発明は、ヒトＣＰＢ２遺伝子における多型と、それによりコードされる対応の新規対立遺伝子ポリペプチドに関する。本発明はまた、ＣＰＢ２遺伝子における対立遺伝子変異を解析するための方法及び材料と、ＣＰＢ２輸送可能薬剤を用いた疾患の治療におけるＣＰＢ２多型の使用に関する。
【０００２】
ヒト血漿カルボキシペプチダーゼＢ２（ＣＰＢ２）は、カルボキシペプチダーゼＵ（ＣＰＵ）としても知られている、トロンビン活性化線溶阻害剤であり；本明細書では用語「ＣＰＢ２」を使用する。これは不安定な塩基性カルボキシペプチダーゼであり、ヒト血漿中ではそのプロ酵素型、プロカルボキシペプチダーゼＢ２（ｐｒｏＣＰＢ２）で循環する。Vanhoof et al (1996) は、ｐｒｏＣＰＢ２がプラスミノーゲンへのアフィニティーを示し、トロンビン及びプラスミンの作用によりその活性型へ変換されることに注目した。Bazjar et al (1996) は、ｐｒｏＣＰＢ２の最もあり得る生理学的アクチベータがトロンビン−トロンボモジュリン複合体であることに注目した。このタンパク質の演繹アミノ酸配列は、組織型カルボキシペプチダーゼＡ及びＢに非常に類似した一次翻訳産物を明らかにする。Eaton et al (1991) は、ｐｒｏＣＰＢ２のｃＤＮＡをクローニングした。予測される４２３アミノ酸のタンパク質は、２２アミノ酸のシグナルペプチド、９２アミノ酸の活性化ペプチド、及び、３０９アミノ酸の触媒ドメインからなる。
【０００３】
トリプシンにより活性化されると、それは、カルボキシペプチダーゼＢの基質、ヒップリル−Ａｒｇ及びヒップリル−Ｌｙｓを加水分解するが、カルボキシペプチダーゼＡの基質は加水分解しない。それは、特異的なカルボキシペプチダーゼＢ阻害剤の（ＤＬ−５−グアニジノエチル）メルカプトコハク酸により阻害される。Tsai 及び Drayna (1992) は、その遺伝子がヒトの第１３染色体に位置することを明示した。この遺伝子は、Vanhoof et al (1996) により、蛍光 in situ ハイブリダイゼーションを使用して、１３ｑ１４．１１へ位置決定された。この領域へマップされた、ＣＰＢ２が関っていそうな遺伝障害はない。
【０００４】
ＣＰＢ２のあり得る役割は、フィブリンの沈着及び除去を触媒する酵素、プラスミノーゲンの活性化にある。凝固及び線溶のカスケードの活性間の均衡は、損傷時に過剰な血液損失を防ぎ、血管系内での血液流動性を維持するのに不可欠である。不均衡を特徴づけるのは、出血性又は血栓性の傾向であり、その後者は、心臓発作や卒中として表出される。ＣＰＢ２を阻害して線溶を促進すれば、血栓塞栓性障害の治療になり得るだろう。
【０００５】
１つのアプローチは、多型の知識を使用して、特定の薬剤を用いた療法に最も適している患者の同定に役立てることである（これは、しばしば、「薬理遺伝学」と呼ばれる）。薬理遺伝学はまた、製薬研究に使用して、医薬選別プロセスを支援することができる。多型は、ヒトゲノムのマッピングと疾患の遺伝成分を解明することに使用される。薬理遺伝学に関する背景詳細と多型検出の他の使用については、以下の文献が読者の参考になる：Linder et al. (1997), Clinical Chemistry, 43, 254; Marshall (1997), Nature Biotecnology, 15, 1249; 国際特許出願ＷＯ９７／４０４６２，Spectra Biomedical; 及び Schafer et al. (1998), Nature Biotechnology, 16, 33．
臨床試験は、医薬品を用いた治療に対する患者応答がしばしば不均一であることを示してきた。従って、薬剤の設計及び療法への改善されたアプローチへのニーズがある。
【０００６】
ポリペプチドにおける点突然変異は以下のように言及される：天然アミノ酸（１若しくは３文字命名法を使用する）、位置、新規アミノ酸。（仮定の）例を挙げると、「Ｄ２５Ｋ」又は「Ａｓｐ２５Ｌｙｓ」は、２５位でアスパラギン酸（Ｄ）がリジン（Ｋ）へ変換されたことを意味する。１つのポリペプチドにおける多数の突然変異は、カンマで区切られた個々の突然変異を含む四角い括弧の間で示す。
【０００７】
ＣＰＢ２のコード配列における１つの多型は、ＳＮＰ協会からのデータ、ＴＳＣ０９８５６２０に記載された。Zhao et al, Thromb Haemost 80, 949-55, 1998 は、ＴＡＦＩ（本明細書ではＡ１６９Ｔに等しい）の名称でのＡ１４７Ｔタンパク質多型と、６９７位でのサイレント塩基変化多型を開示した。本発明は、ＣＰＢ２とそのハプロタイプにおける追加の多型に関する。
【０００８】
ＣＰＢ２ポリヌクレオチドにおける多型の本明細書での位置はいずれも、特に断らないか、又は文脈から明らかであれば、配列番号１の位置に関する。
ＣＰＢ２ポリペプチドにおける多型の本明細書での位置はいずれも、特に断らないか、又は文脈から明らかであれば、配列番号２の位置に関する。
【０００９】
本発明の１つの側面によれば、ヒトにおけるＣＰＢ２中の多型の検出の方法が提供され、該方法は、以下の多型位置：
配列番号１の位置により規定されるＣＰＢ２ポリヌクレオチド中の３１０、５４９、６８２、及び７７２位；並びに
配列番号２の位置により規定されるＣＰＢ２ポリペプチド中の１７７位
の少なくとも１つでヒトの配列を決定することを含む。
【００１０】
１７７位のＤは、人間とマウスの間で保存されていて、人間とマウスの間で保存されている２６アミノ酸配列の一部であり、これが機能的に重要な部位であることを示唆する。ＤにＧを代用することは、より大きな陰電荷アミノ酸の代わりに小さな非電荷アミノ酸を用いることであり、このタンパク質の特性に影響を及ぼすことが予測される。
【００１１】
本発明の１つの側面によれば、ヒトにおけるＣＰＢ２中の多型の検出の方法が提供され、該方法は、以下の多型位置：
配列番号１の位置により規定されるＣＰＢ２ポリヌクレオチド中の３１０、５２４、５４９、６８２、６９７、及び７７２位；並びに
配列番号２の位置により規定されるＣＰＢ２ポリペプチド中の１６９及び１７７位
の少なくとも１つでヒトの配列を決定することを含む。
【００１２】
好ましくは、本方法は、以下の６つのハプロタイプ：
【００１３】
【表１】
【００１４】
のいずれか１つの検出を含む。
別の態様において、本方法は、好ましくは、配列番号２に同定される位置に基づいて決定された対立遺伝子変異体アミノ酸の以下の４つの組合せ：
【００１５】
【表２】
【００１６】
のいずれか１つの検出を含む。
用語「ヒト」には、ＣＰＢ２仲介性の疾患を有するか又は有することが疑われるヒトと、そのような疾患への素因又は感受性を検査する場合がある無症候性のヒトの両方が含まれる。それぞれの位置で、ヒトは対立遺伝子についてホモ接合であっても、又はヒトはヘテロ接合体であってもよい。
【００１７】
用語「多型」には、単一のヌクレオチド置換、ヌクレオチド挿入、及びヌクレオチド欠失が含まれ、挿入及び欠失の場合は、遺伝子のある位置での１以上のヌクレオチドの挿入又は欠失と、それによりコードされるポリペプチド中の対応する変化が含まれる。
【００１８】
ヌクレオチド配列検出の方法は、好ましくは、増幅拒否性突然変異系及び制限酵素断片長多型より選択される方法により配列が決定されるものである。
個体の状態は、１、２、３、４、５、６、７、８、又はそれより多くのどの位置でも対立遺伝子変異への参照により決定することができる。
【００１９】
核酸の検査試料は、簡便には、個体より入手される血液、気管支肺胞洗浄液、痰、又は他の体液若しくは組織の試料である。検査試料は、同等にも、検査試料中の配列に対応する核酸配列であってよいこと、即ち、試料核酸中の領域の全部若しくは一部を対立遺伝子変異の解析の前に簡便な技術、例えばＰＣＲを使用してはじめに増幅してもよいことが理解されよう。
【００２０】
当業者には、本発明の１以上の多型位置で変異ヌクレオチドの存在又は非存在を検出するために使用可能である多数の解析方法があることが明らかであろう。一般に、対立遺伝子変異の検出には、突然変異識別技術と、場合により増幅反応、並びに、場合によりシグナル産生系が必要となる。表１は、いくつかの突然変異検出技術を収載し、そのいくつかはＰＣＲに基づく。これらは、いくつかのシグナル産生系と組み合わせて使用してよく、その抜粋を表２に収載する。さらなる増幅技術を表３に収載する。対立遺伝子変異の検出用の多くの現行法が Nollau et al., Clin. Chem. 43, 1114-1120, 1997；及び、標準的な教科書、例えば「突然変異検出の実験プロトコール（Laboratory Protocols for Mutation Detection）」U. Landegren 監修、オックスフォード大学出版局（1996）及び「ＰＣＲ」、第２版、Newton & Graham 監修、ＢＩＯＳサイエンティフィック・パブリッシャーズ社（1997）により概説されている。
【００２１】
略語：
【００２２】
【表３】
【００２３】
表１−突然変異検出技術
一般法：ＤＮＡ配列決定、ハイブリダイゼーションによる配列決定。
走査法：ＰＴＴ*、ＳＳＣＰ、ＤＧＧＥ、ＴＧＧＥ、Ｃｌｅａｖａｓｅ（切断酵素）、ヘテロ二本鎖解析、ＣＭＣ、酵素ミスマッチ切断法。
*註：プロモーター多型の検出には有用でない。
【００２４】
ハイブリダイゼーションに基づく：
固相ハイブリダイゼーション：ドットブロット法、ＭＡＳＤＡ、逆ドットブロット法、オリゴヌクレオチドアレイ（ＤＮＡチップ）
液相ハイブリダイゼーション：ＴａｑｍａｎTM−ＵＳ５２１００１５及びＵＳ５４８７９７２（ホフマン・ラ・ロッシュ）、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｅａｃｏｎｓ（分子ビーコン）−Tyagi et al (1996), Nature Biotechnology, 14, 303；ＷＯ９５／１３３９９（公衆衛生研究所、ニューヨーク）
伸長に基づく：ＡＲＭＳTM、ＡＬＥＸTM−ヨーロッパ特許第ＥＰ３３２４３５ Ｂ１号（ゼネカ社）、ＣＯＰＳ−Gibbs et al (1989), Nucleic Acids Research, 17, 2347．
取込みに基づく：Ｍｉｎｉ（ミニ）配列決定、ＡＰＥＸ
制限酵素に基づく：ＲＦＬＰ、制限酵素認識部位産生ＰＣＲ
連結に基づく：ＯＬＡ
他の方法：インベーダーアッセイ
表２−シグナル産生又は検出系
蛍光：ＦＲＥＴ、蛍光消光法、蛍光分極法−英国特許第２２２８９９８号（ゼネカ社）
他の方法：化学発光法、電気化学発光法、ラマン法、放射活性法、熱量測定法、ハイブリダイゼーション保護アッセイ、質量分析法
表３−さらなる増幅法
ＳＳＲ、ＮＡＳＢＡ、ＬＣＲ、ＳＤＡ、ｂ−ＤＮＡ
表４−タンパク質変異検出法
イムノアッセイ
免疫組織学
ペプチド配列決定法
好ましい突然変異検出技術には、ＡＲＭＳTM、ＡＬＥＸTM、ＣＯＰＳ、Ｔａｑｍａｎ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｅａｃｏｎｓ、ＲＦＬＰ、及び制限酵素認識部位ベースのＰＣＲ、及びＦＲＥＴ技術が含まれる。イムノアッセイ技術は、当該技術分野において、例えば、「ＥＬＩＳＡへの実践ガイド（A Practical Guide to ELISA）」D M Kemeny 著、ペルガモン・プレス（1991）；「イムノアッセイの原理と実践（Principles and Practice of Immunoassay）」第２版、C P Price & D J Newman（1997）、米国及びカナダではストックトン・プレスにより、英国ではマクミラン・レファレンスにより出版、に知られている。組織学上の技術は、「組織学的技術の理論と実践（Theory and Practice of Histological Techniques）」J D Bancroft & A Stevens 著、第４版、チャーチル・リヴィングストン（1996）に記載されている。タンパク質の配列決定は、「生化学及び分子生物学の実験技術（Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology）」第９巻、「タンパク質及びペプチドの配列決定（Sequencing of Proteins and Peptides）」、G Allen, 第２改訂版、エルセヴィエ（1989）に記載されている。
【００２５】
特に好ましい方法には、ＡＲＭＳTMとＲＦＬＰベースの方法が含まれる。ＡＲＭＳTMが特に好ましい方法である。
さらなる側面において、ＣＰＢ２薬剤の薬理遺伝学を評価するための本明細書に記載される方法の使用が提供される。
【００２６】
１以上の上記多型が転写レベル、及び／又はメッセージ安定性、及び／又は薬物結合性に影響を及ぼすかどうかを検出するために、アッセイ、例えばレポーターベースのアッセイを設計することができる。ＣＰＢ２における多型変異が例えば投与量や効力のような薬物性能（performance）に対して影響を及ぼすかどうかを試験するために、潜在的な薬物をスクリーニングすることができる。
【００２７】
故に、ＣＰＢ２遺伝子の特別な対立遺伝子変異体を担う個体は、異なる生理学的条件の下でタンパク質生合成を調節するその能力において差異を示す場合があり、異なる疾患に対して反応する改変された能力を示すものである。さらに、対立遺伝子変異の結果として生じる差異は、薬物療法に対する個体の応答に対して直接的な効果を及ぼす場合がある。本発明の方法は、そうした薬剤への臨床応答を予測することと治療用量を決定することの両方に有用であり得る。
【００２８】
さらなる側面において、本発明の方法は、ＣＰＢ２により仲介される疾患に対する個体の素因及び／又は感受性を評価するために使用される。このことは、心臓血管系疾患の発症に特に関連する場合があり、本発明は、特にこういった病態を発症するリスクがある個体を認知するために使用することができる。
【００２９】
さらなる側面において、本発明の方法は、ＣＰＢ２の１以上の対立遺伝子変異体を選択的に標的にする新しい薬物療法の開発に使用される。特別な対立遺伝子変異体と疾患発症への素因又は薬物療法への応答性との間の連関を同定することは、新しい薬剤の設計に有意義な影響を及ぼすかもしれない。他の変異体に対する影響を最小化しながら、疾患プロセスへの関与が示唆される変異体の生物学的活性を調節する薬剤を設計することができる。
【００３０】
本発明のさらなる側面において、変異ヌクレオチドの存在又は非存在は、随意に工学処理された、制限酵素により認識される部位の喪失又は獲得への参照により検出される。
本発明の別の側面は、ヒトＣＰＢ２遺伝子の少なくとも２０の塩基を含んでなり、以下：
【００３１】
【表４】
【００３２】
のいずれか１つより選択される対立遺伝子変異体を含んでなるポリヌクレオチドを提供する。
本発明の別の側面によれば、ヒトＣＰＢ２遺伝子の少なくとも２０の塩基を含んでなり、以下：
【００３３】
【表５】
【００３４】
のいずれか１つより選択される対立遺伝子変異体を含んでなるポリヌクレオチドが提供される。
断片は、少なくとも１７塩基、より好ましくは少なくとも２０塩基、より好ましくは少なくとも３０塩基である。
【００３５】
好ましいポリヌクレオチドは、配列番号１の位置に関連した以下の６つのＣＰＢ２ハプロタイプ：
【００３６】
【表６】
【００３７】
のいずれか１つを含む。
さらに本発明は、本発明の多型を検出することができるヌクレオチドプライマーを提供する。
【００３８】
本発明の別の側面によれば、本明細書に記載の１以上の位置でＣＰＢ２遺伝子多型を検出することが可能な対立遺伝子特異的プライマーが提供される。
対立遺伝子特異的プライマーは、ＰＣＲ反応のような増幅反応において、一般的には定常プライマーとともに使用され、これは、例えばＡＲＭＳTMアッセイについて使用されるように、特別な配列位置での１つの対立遺伝子の選択増幅により、対立遺伝子間の識別をもたらす。対立遺伝子特異的プライマーは、好ましくは１７〜５０ヌクレオチド、より好ましくは約１７〜３５ヌクレオチド、より好ましくは約１７〜３０ヌクレオチドである。
【００３９】
対立遺伝子特異的プライマーは、好ましくは、検出すべき対立遺伝子と正確に対応するが、その誘導体も考慮され、そこでは、その３'末端にある約６〜８のヌクレオチドが検出すべき対立遺伝子に対応し、残るヌクレオチドの８、６、４、２、又は１までのように１０までは、プライマーの特性に有意に影響を及ぼさなければ変動させてよい。
【００４０】
プライマーは、簡便な合成法を使用して製造することができる。そのような方法の例は、標準的な教科書、例えば、「オリゴヌクレオチド及び類似体のプロトコール；合成及び特性（Protocols for Oligonucleotides and Analogues; Synthesis and Properties）」、分子生物学の方法シリーズ（Methods in Molecular Biology Series）；第20巻；Sudhir Agrawal 監修；ヒュマナ ＩＳＢＮ：０−８９６０３−２４７−７；１９９３；初版、に見出すことができる。必要とあれば、検出を容易にするために、プライマーを標識化してよい。
【００４１】
本発明の別の側面によれば、好ましくは本明細書に記載の１以上の位置でＣＰＢ２遺伝子多型を検出することが可能な対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチドプローブが提供される。
【００４２】
この対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチドプローブは、好ましくは１７〜５０ヌクレオチド、より好ましくは約１７〜３５ヌクレオチド、より好ましくは約１７〜３０ヌクレオチドである。
【００４３】
そのようなプローブの設計は、通常の技量のある分子生物学者にとって明らかであろう。そのようなプローブは、５０塩基まで、４０塩基までのような簡便な長さのものであり、より簡便には、例えば８〜２５又は８〜１５塩基の長さのような、３０塩基までの長さである。一般に、そうしたプローブは、その遺伝子における対応する野生型又は変異体の座に完全に相補的な塩基配列を含む。しかしながら、必要とあれば、該オリゴヌクレオチドプローブの識別力が不当に影響されないという条件付きで、１以上のミスマッチを導入してよい。本発明のプローブは、検出を容易にするために１以上の標識を担ってよい。
【００４４】
本発明の別の側面によれば、本明細書に記載の位置の１つでＣＰＢ２遺伝子多型を検出することが可能な対立遺伝子特異的プライマー又は対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチドプローブが提供される。
【００４５】
本発明の別の側面によれば、本発明の対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチドプローブ、及び／又は本発明の対立遺伝子特異的プライマーを含んでなるキットが提供される。
該キットは、適切な包装と本発明の方法における使用の説明書を含む場合がある。そうしたキットは、さらに、適切な緩衝剤と、熱安定性ポリメラーゼ、例えばｔａｑポリメラーゼのようなポリメラーゼを含んでよい。
【００４６】
本発明の別の側面において、本発明の多型は、連鎖試験における遺伝マーカーとして使用することができる。これは、特に、相対的に高い頻度の多型へ適用される。ＣＰＢ２遺伝子は、染色体１３ｑ１４．１１上にある。低頻度多型は、以下に記載のように、ハプロタイプ決定（haplotyping）に特に有用であるかもしれない。ハプロタイプは、単一（父方又は母方）染色体上の連鎖多型部位（遺伝子内部のような）に見出される対立遺伝子のセットである。この遺伝子内の組換えがランダムであれば、２nほど多くのハプロタイプが存在する場合がある（ここで、２は各ＳＮＰでの対立遺伝子の数であり、ｎはＳＮＰの数である）。臨床応答に相関する突然変異又は多型を同定するための１つのアプローチは、注目の人口集団において同定可能であるすべてのハプロタイプを使用する関連試験を行うことである。各ハプロタイプの頻度は、その最も稀な対立遺伝子の頻度により制限されるので、低頻度対立遺伝子のあるＳＮＰは、低頻度ハプロタイプのマーカーとして特に有用である。有害事象や異常事象のようなある種の臨床特徴に関連した特別の突然変異又は多型は、人口集団の内部で低頻度となりやすいので、低頻度ＳＮＰは、これらの突然変異を同定するのに特に有用である場合がある（例えば：「シスタチオニンβ−シンターゼ（ＣＢＳ）座での連鎖不均衡と、ＣＢＳ座での遺伝変異とホモシステインの血漿レベルとの関連性（Linkage disequilibrium at the cystathionine beta synthase (CBS) locus and the association between genetic variation at the CBS locus and plasma level of homocysteine）」 Ann Hum Genet (1998) 62: 481-90, De Stefano V, Dekou V, Nicaud V, Chasse JF, London J, Stansbie D, Humphries SE, and Gudnason V；及び、「フォンビルブランド因子（ｖＷＦ）遺伝子座での変異は、血漿ｖＷＦ：Ａｇレベルに関連する：ｖＷＦ遺伝子プロモーター中の３つの新規一塩基多型の同定（Variation at the von willebrand factor (vWF) gene locus is associated with plasma vWF:Ag levels: identification of three novel single nucleotide polymorphisms in the vWF gene promoter）」 Blood (1999) 93: 4277-83, Keightley AM, Lam YM, Brady JN, Cameron CL, Lillicrap D を参照のこと）。
【００４７】
本発明の別の側面によれば、コンピュータ可読媒体に保存された本発明の少なくとも１つの新規配列を含んでなる、該媒体が提供される。このコンピュータ可読媒体は、例えば、相同性検索、マッピング、ハプロタイプ決定、遺伝子型決定、又は薬理遺伝学の解析に使用することができる。
【００４８】
本発明の別の側面は、ＣＰＢ２薬剤を用いた治療の必要なヒトを治療する方法を提供し、ここで該方法は：
ｉ）ヒトにおけるＣＰＢ２中の多型の検出（該検出は、以下の位置：
配列番号１の位置により規定されるＣＰＢ２ポリヌクレオチド中の３１０、５４９、６８２、及び７７２位；並びに
配列番号２の位置により規定されるＣＰＢ２ポリペプチド中の１７７位
の１以上でヒトの配列を決定すること；及び
ＣＰＢ２中の多型への参照によりヒトの状態を決定することを含む）；並びに
ｉｉ）該薬剤の有効量を投与すること
を含む。
【００４９】
本発明の別の側面によれば、ＣＰＢ２薬剤を用いた治療の必要なヒトを治療する方法が提供され、ここで該方法は：
ｉ）ヒトにおけるＣＰＢ２中の多型の検出（該検出は、以下の位置：
配列番号１の位置により規定されるＣＰＢ２ポリヌクレオチド中の３１０、５２４、５４９、６８２、６９７、及び７７２位；並びに
配列番号２の位置により規定されるＣＰＢ２ポリペプチド中の１６９及び１７７位
の１以上でヒトの配列を決定すること；及び
ＣＰＢ２遺伝子における多型への参照によりヒトの状態を決定することを含む）；並びに
ｉｉ）該薬剤の有効量を投与すること
を含む。
【００５０】
好ましくは、ヒトの状態の決定が臨床上有用である。臨床有用性の例には、どの薬剤又は薬剤群を投与すべきかを決定すること、及び／又はＣＰＢ２薬剤若しくは薬剤群の有効量を決定することが含まれる。読者には、ＣＰＢ２に作用する化合物に関連する、アストラゼネカ社からの以下のＰＣＴ特許出願が参考になる：ＷＯ００／６６１５２、ＷＯ００／６６５５０、及びＷＯ００／６６５５７。用語「ＣＰＢ２薬剤」は、ヒトにおいてＣＰＢ２に影響を及ぼす薬剤がヒトにおいてその医薬効果を発揮する薬物の重要部分であることを意味する。
【００５１】
本発明の別の側面によれば、本明細書に記載の１以上の位置に多型を有するものとして検出されたヒトの疾患を治療するための医薬品の製造におけるＣＰＢ２薬剤の使用が提供される。好ましくは、該疾患が心臓血管系である。
【００５２】
本発明の別の側面によれば、ＣＰＢ２薬剤と、本明細書に記載の１以上の位置での多型を検査するヒトへ該薬剤を投与するための説明書を含んでなる医薬パックが提供される。
本発明の別の側面は、配列番号２の１７７位にグリシンを含んでなるヒトＣＰＢ２ポリペプチドの対立遺伝子変異体；
又は、少なくとも１０のアミノ酸を含んでなる、その断片（但し、該断片は、少なくとも１つの対立遺伝子変異体を含む）を提供する。
【００５３】
１７７位のＤは、人間とマウスの間で保存されていて、人間とマウスの間で保存されている２６アミノ酸配列の一部であり、これが機能的に重要な部位であることを示唆する。ＤにＧを代用することは、保存領域において、より大きな陰電荷アミノ酸の代わりに小さな非電荷アミノ酸を用いることであり、このタンパク質の特性に影響を及ぼすことが予測される。
【００５４】
本発明の別の側面によれば、以下の少なくとも１つ：
配列番号２の１６９位にアラニン；
配列番号２の１７７位にグリシン；
を含んでなるヒトＣＰＢ２ポリペプチドの対立遺伝子変異体、又は少なくとも１０のアミノ酸を含んでなる、その断片（但し、該断片は、少なくとも１つの対立遺伝子変異体を含む）が提供される。
【００５５】
ポリペプチドの断片は、少なくとも１０のアミノ酸、より好ましくは少なくとも１５のアミノ酸、より好ましくは少なくとも２０のアミノ酸である。
本発明の別の側面によれば、本明細書に記載のヒトＣＰＢ２ポリペプチドの対立遺伝子変異体に特異的な抗体が提供される。
【００５６】
抗体は、適切な方法を使用して調製することができる。例えば、精製されたポリペプチドを利用して特異抗体を調製してよい。用語「抗体」には、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、及び、例えばＦ（ａｂ’）2、Ｆａｂ、及び単鎖Ｆｖのような様々な種類の抗体構築体が含まれることを意味する。抗体は、ＣＰＢ２の対立遺伝子変異体へ約１０7Ｍ-1以上のＫaで結合すれば、特異結合性であると確かめられる。結合のアフィニティーは、慣用の技術、例えば Scatchard et al., Ann. N. Y. Acad. Sci., 51: 660 (1949) により記載のものを使用して定量することができる。
【００５７】
ポリクローナル抗体は、多様な供給源、例えば、ウマ、ウシ、ヤギ、ヒツジ、イヌ、ニワトリ、ウサギ、マウス、又はラットより、当該技術分野でよく知られた方法を使用して容易に産生することができる。一般に、典型的には非経口注射により宿主動物へ抗原を投与する。抗原の免疫原性は、アジュバント、例えばフロイント完全若しくは不完全アジュバントの使用により増強してよい。追加免疫化に続き、血清の少量試料を採取し、抗原への反応性を検査する。そのような定量に有用な様々なアッセイの例には、「抗体：実験マニュアル（Antibodies: A Laboratory Manual）」Harlow and Lane（監修）、コールドスプリングハーバーラボラトリー・プレス（1988）に記載のもの；並びに、向流免疫電気泳動（ＣＩＥＰ）、ラジオイムノアッセイ、放射性免疫沈降法、酵素結合性免疫吸着剤検定（ＥＬＩＳＡ）、ドットブロットアッセイ、及びサンドイッチアッセイのような方法が含まれる。米国特許第４，３７６，１１０号及び４，４８６，５３０号を参照のこと。
【００５８】
モノクローナル抗体は、よく知られた方法を使用して容易に調製することができる。例えば、米国特許第ＲＥ３２，０１１号、４，９０２，６１４号、４，５４３，４３９号、及び４，４１１，９９３号；「モノクローナル抗体、ハイブリドーマ：生物学的分析の新次元（Monoclonal Antibodies, Hybridomas: A New Dimension in Biological Analyses）」プレナム・プレス、Kennett, McKearn, and Bechtol (監修)（1980）に記載の方法を参照のこと。
【００５９】
本発明のモノクローナル抗体は、参照により本明細書に援用される、Alting-Mees et al.,「モノクローナル抗体発現ライブラリー：ハイブリドーマに代わる迅速法（Monoclonal Antibody Expression Libraries: A Rapid Alternative to Hybridomas）」Strategies in Molecular Biology 3: 1-9 (1990) により記載される技術のような代替技術を使用して産生することができる。同様に、特異結合抗体をコードする遺伝子の可変領域を取込むための組換えＤＮＡ技術を使用して、結合パートナーを構築してよい。こうした技術は、Larrick et al., Biotechnology, 7: 394 (1989) に記載されている。
【００６０】
ひとたび単離されて精製されたならば、この抗体を使用して、確立されたアッセイプロトコールを使用して試料中の抗原の存在を検出することができる。例えば、「ＥＬＩＳＡの実践ガイド（A Practical Guide to ELISA）」D. M. Kemeny 著、ペルガモン・プレス、オックスフォード、イギリス、を参照のこと。
【００６１】
本発明の別の側面によれば、本発明の抗体を含んでなるキットが提供される。
本発明の別の側面によれば、配列番号２に同定される位置に基づいて決定された対立遺伝子変異体アミノ酸の以下の４つの組合せ：
【００６２】
【表７】
【００６３】
の１つを含んでなるヒトＣＰＢ２ポリペプチドが提供される。
本発明の別の側面によれば、上記に記載の対立遺伝子変異体のヒトＣＰＢ２ポリペプチドの４つの組合せのいずれかをコードするポリヌクレオチドが提供される。
【００６４】
参考文献
Eaton, D.L.; Malloy, B. E.; Tsai, S.P.; Henzel, W.; Drayna, D.「新規カルボキシペプチダーゼＢのヒト血漿からの単離、分子クローニング、及び部分特性決定（Isolation, molecular cloning, and partial characterization of a novel carboxypeptidase B from human plasma）」J. Biol. Chem. 266, 21833-21838, 1991．
Tsai, S.P.; Drayna, D「ヒト血漿カルボキシペプチダーゼＢ（ＣＰＢ２）をコードする遺伝子は第１３染色体上に存する（The gene encoding human plasma carboxypeptidase B (CPB2) resides on chromosome 13）」Genomics 14, 549-550, 1992．
Vanhoof, G.; Wauters, J.; Schatteman, K.; Hendriks, D.; Goossens, F.; Bossuyt, P.; Scharpe, S.「ヒトカルボキシペプチダーゼＵ（ＣＰＢ２）の遺伝子−プラスミノーゲン活性化の提起された新規制御因子−は、１３ｑ１４．１１にマップされる（The gene for human carboxypeptidase U (CPB2) - a proposed novel regulator of plasmingogen activation - maps to 13q14.11）」Genomics 38: 454-455, 1996．
Bazjar, L.; Morser, J.; Nesheim, E.「ＴＡＦＩ、又は血漿プロカルボキシペプチダーゼＢは、トロンビン−トロンボモジュリン複合体を介して凝固及び線溶のカスケードを連結させる（TAFI, or plasma procarboxypeptidase B, couples the coagulation and fibrinolytic cascades through the thrombin - thrombomodulin complex）」J. Biol. Chem. 271, 16603-16608, 1996．
以下、本発明を以下の実施例を参照にして例示するが、本発明はそれに限定されるわけではない。温度はいずれも摂氏（℃）である。
【００６５】
以下の実施例において、特に断らなければ、以下の方法論と材料を適用した。
パーキン−エルマー Ｃｅｔｕｓより入手可能なＡＭＰＬＩＴＡＱTMを熱安定性ＤＮＡポリメラーゼの供給源として使用する。
【００６６】
全般的な分子生物学の方法は、「分子クローニング−実験マニュアル（Molecular Cloning - A Laboratory Manual）」第２版、Sambrook, Fritsch and Maniatis（コールドスプリングハーバーラボラトリー、1989）、又は「分子生物学の最新プロトコール（Current Protocols in Molecular Biology）」１〜３巻、F M Asubel, R Brent & R E Kingston（監修）、ジョン・ウィリー出版（1998）に記載の方法のいずれに従ってもよい。
【００６７】
電気泳動図は、標準的なやり方で入手した：ＡＢＩ３７７データ回収ソフトウェアによりデータを回収し、ＡＢＩ Ｐｒｉｓｍ配列決定解析（２．１．２）により波形を作成した。
【００６８】
実施例１
多型の同定
１．１ 方法
ＣＰＢ２のゲノム構造を、ヒトゲノム配列に対するｃＤＮＡ配列を使用するＢＬＡＳＴ解析により決定した。これは１１のエクソンを示した。２９名の血縁でないヨーロッパ人のゲノムＤＮＡ由来の個別エクソンを増幅するために、隣接（flanking）イントロン配列においてプライマーを設計した。このＰＣＲプライマーにＭ１３ｆ若しくはＭ１３ｒ配列のいずれかのタグを付けた。Ｍ１３ｆ若しくはＭ１３ｒプライマーを使用する両方向でのダイターミネーター配列決定法により個々のＰＣＲ産物を配列決定した。
【００６９】
１．２ 結果
【００７０】
【表８】
【００７１】
１７７位のＤは、人間とマウスの間で保存されていて、人間とマウスの間で保存されている２６アミノ酸配列の一部であり、これが機能的に重要な部位であることを示唆する。ＤにＧを代用することは、より大きな陰電荷アミノ酸の代わりに小さな非電荷アミノ酸を用いることであり、このタンパク質の特性に影響を及ぼすことが予測される。
【００７２】
この分析により、ＴＳＣ ＳＮＰ ＴＳＣ０９８５６２０が、１０５９位でＣの代わりにＴを用いることでアミノ酸変化ｔｈｒ３４７ｉｌｅをもたらす、真の多型であることが確かめられた。４０名のヨーロッパ人におけるＴ対立遺伝子の頻度は７８％であった。
【００７３】
実施例２
ハプロタイプ
３１０、５２４、６８２、６９７、７７２、及び１０５９位での多型は、６つの共通ハプロタイプとして遺伝される。
【００７４】
【表９】
【００７５】
これらのハプロタイプは、ＣＰＢ２タンパク質の４つの共通型があることを示す：Ｔｈｒ１６９／ｔｈｒ３４７（５０％）、ａｌａ１６９／ｔｈｒ３４７（２１％）、ｔｈｒ１６９／ｉｌｅ３４７（１９％）、及びａｌａ１６９／ｉｌｅ３４７（１０％）。
本発明は、ヒトＣＰＢ２遺伝子における多型と、それによりコードされる対応の新規対立遺伝子ポリペプチドに関する。本発明はまた、ＣＰＢ２遺伝子における対立遺伝子変異を解析するための方法及び材料と、ＣＰＢ２輸送可能薬剤を用いた疾患の治療におけるＣＰＢ２多型の使用に関する。
【０００２】
ヒト血漿カルボキシペプチダーゼＢ２（ＣＰＢ２）は、カルボキシペプチダーゼＵ（ＣＰＵ）としても知られている、トロンビン活性化線溶阻害剤であり；本明細書では用語「ＣＰＢ２」を使用する。これは不安定な塩基性カルボキシペプチダーゼであり、ヒト血漿中ではそのプロ酵素型、プロカルボキシペプチダーゼＢ２（ｐｒｏＣＰＢ２）で循環する。Vanhoof et al (1996) は、ｐｒｏＣＰＢ２がプラスミノーゲンへのアフィニティーを示し、トロンビン及びプラスミンの作用によりその活性型へ変換されることに注目した。Bazjar et al (1996) は、ｐｒｏＣＰＢ２の最もあり得る生理学的アクチベータがトロンビン−トロンボモジュリン複合体であることに注目した。このタンパク質の演繹アミノ酸配列は、組織型カルボキシペプチダーゼＡ及びＢに非常に類似した一次翻訳産物を明らかにする。Eaton et al (1991) は、ｐｒｏＣＰＢ２のｃＤＮＡをクローニングした。予測される４２３アミノ酸のタンパク質は、２２アミノ酸のシグナルペプチド、９２アミノ酸の活性化ペプチド、及び、３０９アミノ酸の触媒ドメインからなる。
【０００３】
トリプシンにより活性化されると、それは、カルボキシペプチダーゼＢの基質、ヒップリル−Ａｒｇ及びヒップリル−Ｌｙｓを加水分解するが、カルボキシペプチダーゼＡの基質は加水分解しない。それは、特異的なカルボキシペプチダーゼＢ阻害剤の（ＤＬ−５−グアニジノエチル）メルカプトコハク酸により阻害される。Tsai 及び Drayna (1992) は、その遺伝子がヒトの第１３染色体に位置することを明示した。この遺伝子は、Vanhoof et al (1996) により、蛍光 in situ ハイブリダイゼーションを使用して、１３ｑ１４．１１へ位置決定された。この領域へマップされた、ＣＰＢ２が関っていそうな遺伝障害はない。
【０００４】
ＣＰＢ２のあり得る役割は、フィブリンの沈着及び除去を触媒する酵素、プラスミノーゲンの活性化にある。凝固及び線溶のカスケードの活性間の均衡は、損傷時に過剰な血液損失を防ぎ、血管系内での血液流動性を維持するのに不可欠である。不均衡を特徴づけるのは、出血性又は血栓性の傾向であり、その後者は、心臓発作や卒中として表出される。ＣＰＢ２を阻害して線溶を促進すれば、血栓塞栓性障害の治療になり得るだろう。
【０００５】
１つのアプローチは、多型の知識を使用して、特定の薬剤を用いた療法に最も適している患者の同定に役立てることである（これは、しばしば、「薬理遺伝学」と呼ばれる）。薬理遺伝学はまた、製薬研究に使用して、医薬選別プロセスを支援することができる。多型は、ヒトゲノムのマッピングと疾患の遺伝成分を解明することに使用される。薬理遺伝学に関する背景詳細と多型検出の他の使用については、以下の文献が読者の参考になる：Linder et al. (1997), Clinical Chemistry, 43, 254; Marshall (1997), Nature Biotecnology, 15, 1249; 国際特許出願ＷＯ９７／４０４６２，Spectra Biomedical; 及び Schafer et al. (1998), Nature Biotechnology, 16, 33．
臨床試験は、医薬品を用いた治療に対する患者応答がしばしば不均一であることを示してきた。従って、薬剤の設計及び療法への改善されたアプローチへのニーズがある。
【０００６】
ポリペプチドにおける点突然変異は以下のように言及される：天然アミノ酸（１若しくは３文字命名法を使用する）、位置、新規アミノ酸。（仮定の）例を挙げると、「Ｄ２５Ｋ」又は「Ａｓｐ２５Ｌｙｓ」は、２５位でアスパラギン酸（Ｄ）がリジン（Ｋ）へ変換されたことを意味する。１つのポリペプチドにおける多数の突然変異は、カンマで区切られた個々の突然変異を含む四角い括弧の間で示す。
【０００７】
ＣＰＢ２のコード配列における１つの多型は、ＳＮＰ協会からのデータ、ＴＳＣ０９８５６２０に記載された。Zhao et al, Thromb Haemost 80, 949-55, 1998 は、ＴＡＦＩ（本明細書ではＡ１６９Ｔに等しい）の名称でのＡ１４７Ｔタンパク質多型と、６９７位でのサイレント塩基変化多型を開示した。本発明は、ＣＰＢ２とそのハプロタイプにおける追加の多型に関する。
【０００８】
ＣＰＢ２ポリヌクレオチドにおける多型の本明細書での位置はいずれも、特に断らないか、又は文脈から明らかであれば、配列番号１の位置に関する。
ＣＰＢ２ポリペプチドにおける多型の本明細書での位置はいずれも、特に断らないか、又は文脈から明らかであれば、配列番号２の位置に関する。
【０００９】
本発明の１つの側面によれば、ヒトにおけるＣＰＢ２中の多型の検出の方法が提供され、該方法は、以下の多型位置：
配列番号１の位置により規定されるＣＰＢ２ポリヌクレオチド中の３１０、５４９、６８２、及び７７２位；並びに
配列番号２の位置により規定されるＣＰＢ２ポリペプチド中の１７７位
の少なくとも１つでヒトの配列を決定することを含む。
【００１０】
１７７位のＤは、人間とマウスの間で保存されていて、人間とマウスの間で保存されている２６アミノ酸配列の一部であり、これが機能的に重要な部位であることを示唆する。ＤにＧを代用することは、より大きな陰電荷アミノ酸の代わりに小さな非電荷アミノ酸を用いることであり、このタンパク質の特性に影響を及ぼすことが予測される。
【００１１】
本発明の１つの側面によれば、ヒトにおけるＣＰＢ２中の多型の検出の方法が提供され、該方法は、以下の多型位置：
配列番号１の位置により規定されるＣＰＢ２ポリヌクレオチド中の３１０、５２４、５４９、６８２、６９７、及び７７２位；並びに
配列番号２の位置により規定されるＣＰＢ２ポリペプチド中の１６９及び１７７位
の少なくとも１つでヒトの配列を決定することを含む。
【００１２】
好ましくは、本方法は、以下の６つのハプロタイプ：
【００１３】
【表１】
のいずれか１つの検出を含む。
別の態様において、本方法は、好ましくは、配列番号２に同定される位置に基づいて決定された対立遺伝子変異体アミノ酸の以下の４つの組合せ：
【００１５】
【表２】
のいずれか１つの検出を含む。
用語「ヒト」には、ＣＰＢ２仲介性の疾患を有するか又は有することが疑われるヒトと、そのような疾患への素因又は感受性を検査する場合がある無症候性のヒトの両方が含まれる。それぞれの位置で、ヒトは対立遺伝子についてホモ接合であっても、又はヒトはヘテロ接合体であってもよい。
【００１７】
用語「多型」には、単一のヌクレオチド置換、ヌクレオチド挿入、及びヌクレオチド欠失が含まれ、挿入及び欠失の場合は、遺伝子のある位置での１以上のヌクレオチドの挿入又は欠失と、それによりコードされるポリペプチド中の対応する変化が含まれる。
【００１８】
ヌクレオチド配列検出の方法は、好ましくは、増幅拒否性突然変異系及び制限酵素断片長多型より選択される方法により配列が決定されるものである。
個体の状態は、１、２、３、４、５、６、７、８、又はそれより多くのどの位置でも対立遺伝子変異への参照により決定することができる。
【００１９】
核酸の検査試料は、簡便には、個体より入手される血液、気管支肺胞洗浄液、痰、又は他の体液若しくは組織の試料である。検査試料は、同等にも、検査試料中の配列に対応する核酸配列であってよいこと、即ち、試料核酸中の領域の全部若しくは一部を対立遺伝子変異の解析の前に簡便な技術、例えばＰＣＲを使用してはじめに増幅してもよいことが理解されよう。
【００２０】
当業者には、本発明の１以上の多型位置で変異ヌクレオチドの存在又は非存在を検出するために使用可能である多数の解析方法があることが明らかであろう。一般に、対立遺伝子変異の検出には、突然変異識別技術と、場合により増幅反応、並びに、場合によりシグナル産生系が必要となる。表１は、いくつかの突然変異検出技術を収載し、そのいくつかはＰＣＲに基づく。これらは、いくつかのシグナル産生系と組み合わせて使用してよく、その抜粋を表２に収載する。さらなる増幅技術を表３に収載する。対立遺伝子変異の検出用の多くの現行法が Nollau et al., Clin. Chem. 43, 1114-1120, 1997；及び、標準的な教科書、例えば「突然変異検出の実験プロトコール（Laboratory Protocols for Mutation Detection）」U. Landegren 監修、オックスフォード大学出版局（1996）及び「ＰＣＲ」、第２版、Newton & Graham 監修、ＢＩＯＳサイエンティフィック・パブリッシャーズ社（1997）により概説されている。
【００２１】
略語：
【００２２】
【表３】
表１−突然変異検出技術
一般法：ＤＮＡ配列決定、ハイブリダイゼーションによる配列決定。
走査法：ＰＴＴ*、ＳＳＣＰ、ＤＧＧＥ、ＴＧＧＥ、Ｃｌｅａｖａｓｅ（切断酵素）、ヘテロ二本鎖解析、ＣＭＣ、酵素ミスマッチ切断法。
*註：プロモーター多型の検出には有用でない。
【００２４】
ハイブリダイゼーションに基づく：
固相ハイブリダイゼーション：ドットブロット法、ＭＡＳＤＡ、逆ドットブロット法、オリゴヌクレオチドアレイ（ＤＮＡチップ）
液相ハイブリダイゼーション：ＴａｑｍａｎTM−ＵＳ５２１００１５及びＵＳ５４８７９７２（ホフマン・ラ・ロッシュ）、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｅａｃｏｎｓ（分子ビーコン）−Tyagi et al (1996), Nature Biotechnology, 14, 303；ＷＯ９５／１３３９９（公衆衛生研究所、ニューヨーク）
伸長に基づく：ＡＲＭＳTM、ＡＬＥＸTM−ヨーロッパ特許第ＥＰ３３２４３５ Ｂ１号（ゼネカ社）、ＣＯＰＳ−Gibbs et al (1989), Nucleic Acids Research, 17, 2347．
取込みに基づく：Ｍｉｎｉ（ミニ）配列決定、ＡＰＥＸ
制限酵素に基づく：ＲＦＬＰ、制限酵素認識部位産生ＰＣＲ
連結に基づく：ＯＬＡ
他の方法：インベーダーアッセイ
表２−シグナル産生又は検出系
蛍光：ＦＲＥＴ、蛍光消光法、蛍光分極法−英国特許第２２２８９９８号（ゼネカ社）
他の方法：化学発光法、電気化学発光法、ラマン法、放射活性法、熱量測定法、ハイブリダイゼーション保護アッセイ、質量分析法
表３−さらなる増幅法
ＳＳＲ、ＮＡＳＢＡ、ＬＣＲ、ＳＤＡ、ｂ−ＤＮＡ
表４−タンパク質変異検出法
イムノアッセイ
免疫組織学
ペプチド配列決定法
好ましい突然変異検出技術には、ＡＲＭＳTM、ＡＬＥＸTM、ＣＯＰＳ、Ｔａｑｍａｎ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｅａｃｏｎｓ、ＲＦＬＰ、及び制限酵素認識部位ベースのＰＣＲ、及びＦＲＥＴ技術が含まれる。イムノアッセイ技術は、当該技術分野において、例えば、「ＥＬＩＳＡへの実践ガイド（A Practical Guide to ELISA）」D M Kemeny 著、ペルガモン・プレス（1991）；「イムノアッセイの原理と実践（Principles and Practice of Immunoassay）」第２版、C P Price & D J Newman（1997）、米国及びカナダではストックトン・プレスにより、英国ではマクミラン・レファレンスにより出版、に知られている。組織学上の技術は、「組織学的技術の理論と実践（Theory and Practice of Histological Techniques）」J D Bancroft & A Stevens 著、第４版、チャーチル・リヴィングストン（1996）に記載されている。タンパク質の配列決定は、「生化学及び分子生物学の実験技術（Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology）」第９巻、「タンパク質及びペプチドの配列決定（Sequencing of Proteins and Peptides）」、G Allen, 第２改訂版、エルセヴィエ（1989）に記載されている。
【００２５】
特に好ましい方法には、ＡＲＭＳTMとＲＦＬＰベースの方法が含まれる。ＡＲＭＳTMが特に好ましい方法である。
さらなる側面において、ＣＰＢ２薬剤の薬理遺伝学を評価するための本明細書に記載される方法の使用が提供される。
【００２６】
１以上の上記多型が転写レベル、及び／又はメッセージ安定性、及び／又は薬物結合性に影響を及ぼすかどうかを検出するために、アッセイ、例えばレポーターベースのアッセイを設計することができる。ＣＰＢ２における多型変異が例えば投与量や効力のような薬物性能（performance）に対して影響を及ぼすかどうかを試験するために、潜在的な薬物をスクリーニングすることができる。
【００２７】
故に、ＣＰＢ２遺伝子の特別な対立遺伝子変異体を担う個体は、異なる生理学的条件の下でタンパク質生合成を調節するその能力において差異を示す場合があり、異なる疾患に対して反応する改変された能力を示すものである。さらに、対立遺伝子変異の結果として生じる差異は、薬物療法に対する個体の応答に対して直接的な効果を及ぼす場合がある。本発明の方法は、そうした薬剤への臨床応答を予測することと治療用量を決定することの両方に有用であり得る。
【００２８】
さらなる側面において、本発明の方法は、ＣＰＢ２により仲介される疾患に対する個体の素因及び／又は感受性を評価するために使用される。このことは、心臓血管系疾患の発症に特に関連する場合があり、本発明は、特にこういった病態を発症するリスクがある個体を認知するために使用することができる。
【００２９】
さらなる側面において、本発明の方法は、ＣＰＢ２の１以上の対立遺伝子変異体を選択的に標的にする新しい薬物療法の開発に使用される。特別な対立遺伝子変異体と疾患発症への素因又は薬物療法への応答性との間の連関を同定することは、新しい薬剤の設計に有意義な影響を及ぼすかもしれない。他の変異体に対する影響を最小化しながら、疾患プロセスへの関与が示唆される変異体の生物学的活性を調節する薬剤を設計することができる。
【００３０】
本発明のさらなる側面において、変異ヌクレオチドの存在又は非存在は、随意に工学処理された、制限酵素により認識される部位の喪失又は獲得への参照により検出される。
本発明の別の側面は、ヒトＣＰＢ２遺伝子の少なくとも２０の塩基を含んでなり、以下：
【００３１】
【表４】
のいずれか１つより選択される対立遺伝子変異体を含んでなるポリヌクレオチドを提供する。
本発明の別の側面によれば、ヒトＣＰＢ２遺伝子の少なくとも２０の塩基を含んでなり、以下：
【００３３】
【表５】
のいずれか１つより選択される対立遺伝子変異体を含んでなるポリヌクレオチドが提供される。
断片は、少なくとも１７塩基、より好ましくは少なくとも２０塩基、より好ましくは少なくとも３０塩基である。
【００３５】
好ましいポリヌクレオチドは、配列番号１の位置に関連した以下の６つのＣＰＢ２ハプロタイプ：
【００３６】
【表６】
のいずれか１つを含む。
さらに本発明は、本発明の多型を検出することができるヌクレオチドプライマーを提供する。
【００３８】
本発明の別の側面によれば、本明細書に記載の１以上の位置でＣＰＢ２遺伝子多型を検出することが可能な対立遺伝子特異的プライマーが提供される。
対立遺伝子特異的プライマーは、ＰＣＲ反応のような増幅反応において、一般的には定常プライマーとともに使用され、これは、例えばＡＲＭＳTMアッセイについて使用されるように、特別な配列位置での１つの対立遺伝子の選択増幅により、対立遺伝子間の識別をもたらす。対立遺伝子特異的プライマーは、好ましくは１７〜５０ヌクレオチド、より好ましくは約１７〜３５ヌクレオチド、より好ましくは約１７〜３０ヌクレオチドである。
【００３９】
対立遺伝子特異的プライマーは、好ましくは、検出すべき対立遺伝子と正確に対応するが、その誘導体も考慮され、そこでは、その３'末端にある約６〜８のヌクレオチドが検出すべき対立遺伝子に対応し、残るヌクレオチドの８、６、４、２、又は１までのように１０までは、プライマーの特性に有意に影響を及ぼさなければ変動させてよい。
【００４０】
プライマーは、簡便な合成法を使用して製造することができる。そのような方法の例は、標準的な教科書、例えば、「オリゴヌクレオチド及び類似体のプロトコール；合成及び特性（Protocols for Oligonucleotides and Analogues; Synthesis and Properties）」、分子生物学の方法シリーズ（Methods in Molecular Biology Series）；第20巻；Sudhir Agrawal 監修；ヒュマナ ＩＳＢＮ：０−８９６０３−２４７−７；１９９３；初版、に見出すことができる。必要とあれば、検出を容易にするために、プライマーを標識化してよい。
【００４１】
本発明の別の側面によれば、好ましくは本明細書に記載の１以上の位置でＣＰＢ２遺伝子多型を検出することが可能な対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチドプローブが提供される。
【００４２】
この対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチドプローブは、好ましくは１７〜５０ヌクレオチド、より好ましくは約１７〜３５ヌクレオチド、より好ましくは約１７〜３０ヌクレオチドである。
【００４３】
そのようなプローブの設計は、通常の技量のある分子生物学者にとって明らかであろう。そのようなプローブは、５０塩基まで、４０塩基までのような簡便な長さのものであり、より簡便には、例えば８〜２５又は８〜１５塩基の長さのような、３０塩基までの長さである。一般に、そうしたプローブは、その遺伝子における対応する野生型又は変異体の座に完全に相補的な塩基配列を含む。しかしながら、必要とあれば、該オリゴヌクレオチドプローブの識別力が不当に影響されないという条件付きで、１以上のミスマッチを導入してよい。本発明のプローブは、検出を容易にするために１以上の標識を担ってよい。
【００４４】
本発明の別の側面によれば、本明細書に記載の位置の１つでＣＰＢ２遺伝子多型を検出することが可能な対立遺伝子特異的プライマー又は対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチドプローブが提供される。
【００４５】
本発明の別の側面によれば、本発明の対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチドプローブ、及び／又は本発明の対立遺伝子特異的プライマーを含んでなるキットが提供される。
該キットは、適切な包装と本発明の方法における使用の説明書を含む場合がある。そうしたキットは、さらに、適切な緩衝剤と、熱安定性ポリメラーゼ、例えばｔａｑポリメラーゼのようなポリメラーゼを含んでよい。
【００４６】
本発明の別の側面において、本発明の多型は、連鎖試験における遺伝マーカーとして使用することができる。これは、特に、相対的に高い頻度の多型へ適用される。ＣＰＢ２遺伝子は、染色体１３ｑ１４．１１上にある。低頻度多型は、以下に記載のように、ハプロタイプ決定（haplotyping）に特に有用であるかもしれない。ハプロタイプは、単一（父方又は母方）染色体上の連鎖多型部位（遺伝子内部のような）に見出される対立遺伝子のセットである。この遺伝子内の組換えがランダムであれば、２nほど多くのハプロタイプが存在する場合がある（ここで、２は各ＳＮＰでの対立遺伝子の数であり、ｎはＳＮＰの数である）。臨床応答に相関する突然変異又は多型を同定するための１つのアプローチは、注目の人口集団において同定可能であるすべてのハプロタイプを使用する関連試験を行うことである。各ハプロタイプの頻度は、その最も稀な対立遺伝子の頻度により制限されるので、低頻度対立遺伝子のあるＳＮＰは、低頻度ハプロタイプのマーカーとして特に有用である。有害事象や異常事象のようなある種の臨床特徴に関連した特別の突然変異又は多型は、人口集団の内部で低頻度となりやすいので、低頻度ＳＮＰは、これらの突然変異を同定するのに特に有用である場合がある（例えば：「シスタチオニンβ−シンターゼ（ＣＢＳ）座での連鎖不均衡と、ＣＢＳ座での遺伝変異とホモシステインの血漿レベルとの関連性（Linkage disequilibrium at the cystathionine beta synthase (CBS) locus and the association between genetic variation at the CBS locus and plasma level of homocysteine）」 Ann Hum Genet (1998) 62: 481-90, De Stefano V, Dekou V, Nicaud V, Chasse JF, London J, Stansbie D, Humphries SE, and Gudnason V；及び、「フォンビルブランド因子（ｖＷＦ）遺伝子座での変異は、血漿ｖＷＦ：Ａｇレベルに関連する：ｖＷＦ遺伝子プロモーター中の３つの新規一塩基多型の同定（Variation at the von willebrand factor (vWF) gene locus is associated with plasma vWF:Ag levels: identification of three novel single nucleotide polymorphisms in the vWF gene promoter）」 Blood (1999) 93: 4277-83, Keightley AM, Lam YM, Brady JN, Cameron CL, Lillicrap D を参照のこと）。
【００４７】
本発明の別の側面によれば、コンピュータ可読媒体に保存された本発明の少なくとも１つの新規配列を含んでなる、該媒体が提供される。このコンピュータ可読媒体は、例えば、相同性検索、マッピング、ハプロタイプ決定、遺伝子型決定、又は薬理遺伝学の解析に使用することができる。
【００４８】
本発明の別の側面は、ＣＰＢ２薬剤を用いた治療の必要なヒトを治療する方法を提供し、ここで該方法は：
ｉ）ヒトにおけるＣＰＢ２中の多型の検出（該検出は、以下の位置：
配列番号１の位置により規定されるＣＰＢ２ポリヌクレオチド中の３１０、５４９、６８２、及び７７２位；並びに
配列番号２の位置により規定されるＣＰＢ２ポリペプチド中の１７７位
の１以上でヒトの配列を決定すること；及び
ＣＰＢ２中の多型への参照によりヒトの状態を決定することを含む）；並びに
ｉｉ）該薬剤の有効量を投与すること
を含む。
【００４９】
本発明の別の側面によれば、ＣＰＢ２薬剤を用いた治療の必要なヒトを治療する方法が提供され、ここで該方法は：
ｉ）ヒトにおけるＣＰＢ２中の多型の検出（該検出は、以下の位置：
配列番号１の位置により規定されるＣＰＢ２ポリヌクレオチド中の３１０、５２４、５４９、６８２、６９７、及び７７２位；並びに
配列番号２の位置により規定されるＣＰＢ２ポリペプチド中の１６９及び１７７位
の１以上でヒトの配列を決定すること；及び
ＣＰＢ２遺伝子における多型への参照によりヒトの状態を決定することを含む）；並びに
ｉｉ）該薬剤の有効量を投与すること
を含む。
【００５０】
好ましくは、ヒトの状態の決定が臨床上有用である。臨床有用性の例には、どの薬剤又は薬剤群を投与すべきかを決定すること、及び／又はＣＰＢ２薬剤若しくは薬剤群の有効量を決定することが含まれる。読者には、ＣＰＢ２に作用する化合物に関連する、アストラゼネカ社からの以下のＰＣＴ特許出願が参考になる：ＷＯ００／６６１５２、ＷＯ００／６６５５０、及びＷＯ００／６６５５７。用語「ＣＰＢ２薬剤」は、ヒトにおいてＣＰＢ２に影響を及ぼす薬剤がヒトにおいてその医薬効果を発揮する薬物の重要部分であることを意味する。
【００５１】
本発明の別の側面によれば、本明細書に記載の１以上の位置に多型を有するものとして検出されたヒトの疾患を治療するための医薬品の製造におけるＣＰＢ２薬剤の使用が提供される。好ましくは、該疾患が心臓血管系である。
【００５２】
本発明の別の側面によれば、ＣＰＢ２薬剤と、本明細書に記載の１以上の位置での多型を検査するヒトへ該薬剤を投与するための説明書を含んでなる医薬パックが提供される。
本発明の別の側面は、配列番号２の１７７位にグリシンを含んでなるヒトＣＰＢ２ポリペプチドの対立遺伝子変異体；
又は、少なくとも１０のアミノ酸を含んでなる、その断片（但し、該断片は、少なくとも１つの対立遺伝子変異体を含む）を提供する。
【００５３】
１７７位のＤは、人間とマウスの間で保存されていて、人間とマウスの間で保存されている２６アミノ酸配列の一部であり、これが機能的に重要な部位であることを示唆する。ＤにＧを代用することは、保存領域において、より大きな陰電荷アミノ酸の代わりに小さな非電荷アミノ酸を用いることであり、このタンパク質の特性に影響を及ぼすことが予測される。
【００５４】
本発明の別の側面によれば、以下の少なくとも１つ：
配列番号２の１６９位にアラニン；
配列番号２の１７７位にグリシン；
を含んでなるヒトＣＰＢ２ポリペプチドの対立遺伝子変異体、又は少なくとも１０のアミノ酸を含んでなる、その断片（但し、該断片は、少なくとも１つの対立遺伝子変異体を含む）が提供される。
【００５５】
ポリペプチドの断片は、少なくとも１０のアミノ酸、より好ましくは少なくとも１５のアミノ酸、より好ましくは少なくとも２０のアミノ酸である。
本発明の別の側面によれば、本明細書に記載のヒトＣＰＢ２ポリペプチドの対立遺伝子変異体に特異的な抗体が提供される。
【００５６】
抗体は、適切な方法を使用して調製することができる。例えば、精製されたポリペプチドを利用して特異抗体を調製してよい。用語「抗体」には、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、及び、例えばＦ（ａｂ’）2、Ｆａｂ、及び単鎖Ｆｖのような様々な種類の抗体構築体が含まれることを意味する。抗体は、ＣＰＢ２の対立遺伝子変異体へ約１０7Ｍ-1以上のＫaで結合すれば、特異結合性であると確かめられる。結合のアフィニティーは、慣用の技術、例えば Scatchard et al., Ann. N. Y. Acad. Sci., 51: 660 (1949) により記載のものを使用して定量することができる。
【００５７】
ポリクローナル抗体は、多様な供給源、例えば、ウマ、ウシ、ヤギ、ヒツジ、イヌ、ニワトリ、ウサギ、マウス、又はラットより、当該技術分野でよく知られた方法を使用して容易に産生することができる。一般に、典型的には非経口注射により宿主動物へ抗原を投与する。抗原の免疫原性は、アジュバント、例えばフロイント完全若しくは不完全アジュバントの使用により増強してよい。追加免疫化に続き、血清の少量試料を採取し、抗原への反応性を検査する。そのような定量に有用な様々なアッセイの例には、「抗体：実験マニュアル（Antibodies: A Laboratory Manual）」Harlow and Lane（監修）、コールドスプリングハーバーラボラトリー・プレス（1988）に記載のもの；並びに、向流免疫電気泳動（ＣＩＥＰ）、ラジオイムノアッセイ、放射性免疫沈降法、酵素結合性免疫吸着剤検定（ＥＬＩＳＡ）、ドットブロットアッセイ、及びサンドイッチアッセイのような方法が含まれる。米国特許第４，３７６，１１０号及び４，４８６，５３０号を参照のこと。
【００５８】
モノクローナル抗体は、よく知られた方法を使用して容易に調製することができる。例えば、米国特許第ＲＥ３２，０１１号、４，９０２，６１４号、４，５４３，４３９号、及び４，４１１，９９３号；「モノクローナル抗体、ハイブリドーマ：生物学的分析の新次元（Monoclonal Antibodies, Hybridomas: A New Dimension in Biological Analyses）」プレナム・プレス、Kennett, McKearn, and Bechtol (監修)（1980）に記載の方法を参照のこと。
【００５９】
本発明のモノクローナル抗体は、参照により本明細書に援用される、Alting-Mees et al.,「モノクローナル抗体発現ライブラリー：ハイブリドーマに代わる迅速法（Monoclonal Antibody Expression Libraries: A Rapid Alternative to Hybridomas）」Strategies in Molecular Biology 3: 1-9 (1990) により記載される技術のような代替技術を使用して産生することができる。同様に、特異結合抗体をコードする遺伝子の可変領域を取込むための組換えＤＮＡ技術を使用して、結合パートナーを構築してよい。こうした技術は、Larrick et al., Biotechnology, 7: 394 (1989) に記載されている。
【００６０】
ひとたび単離されて精製されたならば、この抗体を使用して、確立されたアッセイプロトコールを使用して試料中の抗原の存在を検出することができる。例えば、「ＥＬＩＳＡの実践ガイド（A Practical Guide to ELISA）」D. M. Kemeny 著、ペルガモン・プレス、オックスフォード、イギリス、を参照のこと。
【００６１】
本発明の別の側面によれば、本発明の抗体を含んでなるキットが提供される。
本発明の別の側面によれば、配列番号２に同定される位置に基づいて決定された対立遺伝子変異体アミノ酸の以下の４つの組合せ：
【００６２】
【表７】
の１つを含んでなるヒトＣＰＢ２ポリペプチドが提供される。
本発明の別の側面によれば、上記に記載の対立遺伝子変異体のヒトＣＰＢ２ポリペプチドの４つの組合せのいずれかをコードするポリヌクレオチドが提供される。
【００６４】
参考文献
Eaton, D.L.; Malloy, B. E.; Tsai, S.P.; Henzel, W.; Drayna, D.「新規カルボキシペプチダーゼＢのヒト血漿からの単離、分子クローニング、及び部分特性決定（Isolation, molecular cloning, and partial characterization of a novel carboxypeptidase B from human plasma）」J. Biol. Chem. 266, 21833-21838, 1991．
Tsai, S.P.; Drayna, D「ヒト血漿カルボキシペプチダーゼＢ（ＣＰＢ２）をコードする遺伝子は第１３染色体上に存する（The gene encoding human plasma carboxypeptidase B (CPB2) resides on chromosome 13）」Genomics 14, 549-550, 1992．
Vanhoof, G.; Wauters, J.; Schatteman, K.; Hendriks, D.; Goossens, F.; Bossuyt, P.; Scharpe, S.「ヒトカルボキシペプチダーゼＵ（ＣＰＢ２）の遺伝子−プラスミノーゲン活性化の提起された新規制御因子−は、１３ｑ１４．１１にマップされる（The gene for human carboxypeptidase U (CPB2) - a proposed novel regulator of plasmingogen activation - maps to 13q14.11）」Genomics 38: 454-455, 1996．
Bazjar, L.; Morser, J.; Nesheim, E.「ＴＡＦＩ、又は血漿プロカルボキシペプチダーゼＢは、トロンビン−トロンボモジュリン複合体を介して凝固及び線溶のカスケードを連結させる（TAFI, or plasma procarboxypeptidase B, couples the coagulation and fibrinolytic cascades through the thrombin - thrombomodulin complex）」J. Biol. Chem. 271, 16603-16608, 1996．
以下、本発明を以下の実施例を参照にして例示するが、本発明はそれに限定されるわけではない。温度はいずれも摂氏（℃）である。
【００６５】
以下の実施例において、特に断らなければ、以下の方法論と材料を適用した。
パーキン−エルマー Ｃｅｔｕｓより入手可能なＡＭＰＬＩＴＡＱTMを熱安定性ＤＮＡポリメラーゼの供給源として使用する。
【００６６】
全般的な分子生物学の方法は、「分子クローニング−実験マニュアル（Molecular Cloning - A Laboratory Manual）」第２版、Sambrook, Fritsch and Maniatis（コールドスプリングハーバーラボラトリー、1989）、又は「分子生物学の最新プロトコール（Current Protocols in Molecular Biology）」１〜３巻、F M Asubel, R Brent & R E Kingston（監修）、ジョン・ウィリー出版（1998）に記載の方法のいずれに従ってもよい。
【００６７】
電気泳動図は、標準的なやり方で入手した：ＡＢＩ３７７データ回収ソフトウェアによりデータを回収し、ＡＢＩ Ｐｒｉｓｍ配列決定解析（２．１．２）により波形を作成した。
【００６８】
実施例１
多型の同定
１．１ 方法
ＣＰＢ２のゲノム構造を、ヒトゲノム配列に対するｃＤＮＡ配列を使用するＢＬＡＳＴ解析により決定した。これは１１のエクソンを示した。２９名の血縁でないヨーロッパ人のゲノムＤＮＡ由来の個別エクソンを増幅するために、隣接（flanking）イントロン配列においてプライマーを設計した。このＰＣＲプライマーにＭ１３ｆ若しくはＭ１３ｒ配列のいずれかのタグを付けた。Ｍ１３ｆ若しくはＭ１３ｒプライマーを使用する両方向でのダイターミネーター配列決定法により個々のＰＣＲ産物を配列決定した。
【００６９】
１．２ 結果
【００７０】
【表８】
１７７位のＤは、人間とマウスの間で保存されていて、人間とマウスの間で保存されている２６アミノ酸配列の一部であり、これが機能的に重要な部位であることを示唆する。ＤにＧを代用することは、より大きな陰電荷アミノ酸の代わりに小さな非電荷アミノ酸を用いることであり、このタンパク質の特性に影響を及ぼすことが予測される。
【００７２】
この分析により、ＴＳＣ ＳＮＰ ＴＳＣ０９８５６２０が、１０５９位でＣの代わりにＴを用いることでアミノ酸変化ｔｈｒ３４７ｉｌｅをもたらす、真の多型であることが確かめられた。４０名のヨーロッパ人におけるＴ対立遺伝子の頻度は７８％であった。
【００７３】
実施例２
ハプロタイプ
３１０、５２４、６８２、６９７、７７２、及び１０５９位での多型は、６つの共通ハプロタイプとして遺伝される。
【００７４】
【表９】
これらのハプロタイプは、ＣＰＢ２タンパク質の４つの共通型があることを示す：Ｔｈｒ１６９／ｔｈｒ３４７（５０％）、ａｌａ１６９／ｔｈｒ３４７（２１％）、ｔｈｒ１６９／ｉｌｅ３４７（１９％）、及びａｌａ１６９／ｉｌｅ３４７（１０％）。
Claims (12)
- ヒトにおけるＣＰＢ２中の多型の検出の方法であって、以下の多型位置：
配列番号１の位置により規定されるＣＰＢ２ポリヌクレオチド中の３１０、５４９、６８２、及び７７２位；並びに
配列番号２の位置により規定されるＣＰＢ２ポリペプチド中の１７７位
の少なくとも１つでヒトの配列を決定することを含む、前記方法。 - 以下の６つのハプロタイプ：
- 請求項１又は請求項２に記載の方法の、ＣＰＢ２薬剤の薬理遺伝学（pharmacogenetics）を評価するための使用。
- ヒトＣＰＢ２遺伝子の少なくとも２０の塩基を含んでなり、以下：
- 配列番号１の位置に関連した以下の６つのＣＰＢ２ハプロタイプ：
- 請求項１に記載の多型を検出することができるヌクレオチドプライマー。
- 請求項１に記載のＣＰＢ２遺伝子多型を検出することが可能な対立遺伝子特異的プライマー。
- ヒトＣＰＢ２遺伝子の少なくとも２０塩基を含んでなり、以下：
- 請求項１に記載のＣＰＢ２多型の、連鎖試験における遺伝マーカーとしての使用。
- ＣＰＢ２薬剤を用いる治療の必要なヒトを治療する方法であって：
ｉ）ヒトにおけるＣＰＢ２中の多型を検出し、該検出は、以下の位置：
配列番号１の位置により規定されるＣＰＢ２ポリヌクレオチド中の３１０、５４９、６８２、及び７７２位；並びに
配列番号２の位置により規定されるＣＰＢ２ポリペプチド中の１７７位
の１以上でヒトの配列を決定すること；及び
ＣＰＢ２中の多型への参照によりヒトの状態（status）を決定することを含み；並びに
ｉｉ）該薬剤の有効量を投与すること
を含む、前記方法。 - 配列番号２の１７７位にグリシンを含んでなるヒトＣＰＢ２ポリペプチドの対立遺伝子変異体；
又は、少なくとも１０のアミノ酸を含んでなる、その断片（但し、該断片は、少なくとも１つの対立遺伝子変異体を含む）。 - 請求項１１に記載のヒトＣＰＢ２ポリペプチドの対立遺伝子変異体に特異的な抗体。
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