TWI334886B - Genetic variants predicting warfarin sensitivity - Google Patents

Description

1334886 . 九、發明說明： 【發明所屬之技術領域】 ，本發明係關於一種供藥劑量之方法，特別是華法林 (warfarin)。 t 【先前技術】 華法林是一種廣泛被使用地抗凝血劑，用以預防深層靜脈 检塞(deep vein thrombosis)、心房纖維性顫動(atrial fibrillation) 或機械性人工瓣膜更換(mechanical heart valve replacement)[l-4] 。然而’華法林治療是困難的，因為華法林治療劑量無論是在 ®個體間或是種族間其變異性皆相當大[5-7]。亞洲族群，包含中 國人’ 一般需要比高加索人或西班牙人更低的維持劑量[6_9]。 出血是目前使用華法林治療最嚴重的併發症[1〇_12]，因此需花 費時間監控此一口服抗凝血劑之使用安全。目前華法林所使用 劑量會密切以標準化的國際標準凝血時間比（Internati〇nal Normalized Ratio; INR)量測血液前凝血素時間（prothr〇mbin time )監控之。 細胞色素P450 (Cytochrome P450)亞族IIC，多胜肽9 _ (CYP2C9)為催化華法林水解的主要藥物代謝酵素[13_15]。 CYP2C9*2與CYP2C9*3為高加索族群中最常被發現的多型性。 以CYP2C9*1作為野生型’則單套型（Haplotype) CYP2C9*1/ CYP2C9*2以及CYP2C9*1/CYP2C9*3機率相對約為20%以及約 12% [16，17]。CYP2C9*2與CYP2C9*3變異體會降低CYP2C9之酵 素活性導致華法林敏感，在較嚴重的案例會有出金性併發症 [18,20]。然而，CYP2C9*2與CYP2C9*3鮮少出現於在亞洲&群 中[9,21]。CYP2C9的遺傳變異只能部分解釋個體間對於華法林 劑量使用差異性，但無法解釋族群間的差異性[6,7，16]。 需要維他命K之γ-緩基化（γ-carboxylation)之凝血因子（因 5 1334886 子II，VII，IX與X)對於/旋血相當重要，γ_幾基酶利用還原態的維 他命Κ以及氧，將二氧化碳分子加入凝血分子中的麩胺酸旁鍊。-在敌基化過程中，還原,％的維他命尺被氧化成維他命κ 2,3-環氧 ，藉由維他命Κ環氧還原酶進行另一個催化循環以重生還原態的 維他命Κ。華法林係藉由抑制維他命κ環氧還原酶來阻止凝^因 子的合成[22,23]。最近，維他命Κ環氧還原酶複合體之基因-次 單元1 (VKORC1)被定位出來Ρ5，26]。在義大利病患的研£究當$ ，亦發現一内插子多型性(intronic polymorphism)與個體間華法 林敏感差異性有關。[27] 然而這些研究無法解釋所有華法林劑量差異的變異性，尤 其是種族間的差異’也無法解釋占世界大量人口的族群-亞洲人· 的變異性。因此尋找-方法以預測適當之華法林劑量範圍成 一值得研究與廣泛應用的課題。 【發明内容】 申請人發現一個位於VK0RC1基因之啟動子之多型性與華 法林敏感性有關。此-多型性可解釋華法林所需劑量在個^ 與種族間差異H步，此—多型性亦與啟動子活性有關。 =〇船基因之啟動子於3673位置之核普酸（相對於起始密瑪-子（initiation codon)第一個核苷酸)為G，其活性比相同位置為 A者活性高44%。病患具有3673A多型性者對於華法林較敏感: 3673的AA純合型病患劑量需求最低，AG異合型之劑量需求居 中，〇〇純合型病患劑量需求最高，因此啟動子序列或VK〇RC1 基因之活性可被用以預測病患受試對象給藥時應該給予多少華 法林。本方法可顯著改善華法林劑量的準確度。目前病患會先 被給予-初始劑量’並定期監控其INR並調整華法林劑^直 到達到對病患為安全之-維持劑量。使用本發明之方法，所預 6 丄：)J外ΟΟϋ 測之劑量將會較接近維持劑量， 安全以及經濟。 ^里因此爭法林劑量會比較快速、 因此本發明之一目的在於提供一 一 林劑量範_方法，包含難較崎、====華法 動子序列。本發明之另—目的在 RC1基因之啟 林後:發:顺_，包 之啟動子序列。當施用受試對象 土 發症，例如出血的風_越^象對於細_感，其產生併 調查位於VK0RC1基因3673之序列。如果 肩位置之核苷g文為A’則該受試對象對 該受試對象於vk〇rc1基因3673位\^去林較為敏感。若 γ里曰士 位置為ΑΑ純合型，比起相同 位置具有Α與其他核_邮或τ)之異合 次，相同的異合型其對於華法軚 敏AI·生要问依 對象要高。 孩林之敏祕比此位置無A的受試 藉由評估3673A或3673G/C/T對偶基因之等效基因標 ί因中等效基因標記之存在可表示具有相對應對偶 =ί=，、==™基因之 cvm , rSA35%12及rs7294之群組中選出之— SNP，珂述群組皆可表示華法林敏感。 νκοίτίΐ明之—具體實施例巾，序列可藉由—寡核苦酸與 C1基因進行專—性雜交以調查之。較佳為寡核苦酸之專 生雜父至少橫跨VK0RC1基因3673位置 条，1〇，12，14，16，18,20,22或24個核酸。調查序列係使用由受試對 象之周邊血液所製備之DNA取得。 本發明之文試對象較佳為人類，更佳為一亞洲人高加索 非/州人、非裔美國人或西班牙人。 其他給藥方法可與本發明之調查VK〇RC1基因結合。例 7 886 H覆：9基因之序列可以該技術領域之任何 如，CYP2C9*2與CYP2C9*3皆與華法林敏感有關。一 本發明之另-目的在於提供—受試對象華法林劑量範圍的 =法，包含喊射試縣之VK〇Rci基因之啟動子活性。啟 動子活性越咼則華法林所需劑量越高。 % 八目:白在於提供—決定華法林劑量範圍之套 、=’包含至^-成为選自以下群族包括：⑷一侧vkorci基 :置序列^之工具；以及⑻—偵測VK〇RC1基因3673 位置序列G之工具。 前述套組可進-步包含一分職測VK〇RCl基因迎位 置序列C與T之卫具。在某些具體實施例中，前述套組可包含 -偵測此-位置四個驗基對的方法。在其他具體實施例中，前 述套組可含有-偵測相同位置A以及—細相同位置g，c或T 之方法’因為A，在於此位置表示對於華法林敏感性較高。前 述工具較佳為1核魏。前述套組可轉性包含寡核苦酸雜 交反應劑、PCR增幅反應劑與/或使用指示。 μ Γ目的在於提供—隸酸或其互補股，其係雜 父至 、，土因啟動子區域，其中前述區域需橫跨啟動子 3673位，亚至少由6個核普g复組成。較佳地 一性雜交至少横跨VK〇RC1基因初/位^ 6,8，1〇，12，14，16，18,20,22 4 24健酸。前述寡核苦酸可雜交至此 一區域’其中前述核苦酸為A，G，C或τ，較佳為A或g。在一 些具體實施例中，前述寡核賊包含約15個核普酸或更少， 16-20個核普酸，20-25個核苦酸，25_30個核皆酸或3〇_4〇個核 皆g吏。本=明亦可提供—微陣列包含上述本發明之寡核普酸。 以下供本發明之數個或多個實施例細節如以下圖式及說 明所述。其他的特徵、元件及優點可明確地從圖式、說明及 1334886 求項中獲得。. 【實施方式】 我們發現- VKORC1基因啟動子之多型性與華法林敏感 性有關。此-多型性可解釋個體間與種族間對於華 求之差異性H ’此-多型性亦與啟動子之活性^ VK〇RC1基因之啟動子於3673位置之核㈣（相對於起始密瑪 子（initiation codon)第一個核苷酸)為G，其活性比相同位置為 A者活性高44%。病患具有3673A多型性者對於華法林較敏感。 3673的AA純合型病患劑夏需求最低，ag異合型之劑量需求居 _，GG純合型病患劑量需求最高，因此啟動子序列或VK〇RC1 基因之活性可被用以預測病患受試對象給藥時應該給予多少華 法林。 再進一步說明本發明之前，以下將本發明所使用之名詞定 義如下。 定義 “華法林（warfarin)，，包含香豆素（coumarin)衍生物，具 有抗凝血活性。一較佳實施例，華法林，係為4-羥基-3-(3-氧代 籲-1- 笨基丁基 ）_2 氫 -1- 苯 °比π南二酮 (4-Hydroxy-3-(3-ox〇-l-phenylbutyl)-2H-l-benzopyran-2-one ) 〇 目前商業產品為R異構物或S異構物的外消旋混合物。”華法林” 包含R異構物、S異構物以及任何外消旋混合物。特別是包含 Courmadin, Marevan, Panwarfin, Prothromadin, Tintorane, Warfilone, Waran, Athrombin-K, warfarin-deanol, Adoisine, warfarin acide，Coumafene，Zoocoumarin，Phenprocoumon,雙香豆 素（dicumarol),溴鼠靈原藥（brodifacoum),二苯乙醜茚二酮 (diphenadione )，氯鼠酮（chlorophacinone )，溴敵鼠 (bromadiolone)以及醋石肖香豆素（acenocoumarol)。 9 山4886 本赉明所指”寡核苷酸”(〇lig〇nucleotide)係為一含有由2至 〇個以核苷酸鍵結鄰接之之核苷酸。一寡核苷酸至少有約 個==50或60個核皆酸長。此外’一寡核苦酸較佳達2〇〇 乂皆§文長’更佳為約150，10〇,75,50,40,30或20個核苷酸長。 特显Γ*作為雜交使用之，，探針，，(probe)，係為一寡核苷酸以一鹼基 .異性方式連結至核酸之互補股。探針包含胜肽核酸。探針可^ 任何與標^賊有特殊敍之適和長度。最佳探針長度需視所 =用之雜父方法而定，例如，微小化陣列（micr〇fabricated array ) 而使用t寺，長度的探針，而傳統雜交方式則適用其他長度的探 、十此頭隶L化方式可為熟知此技藝之人所熟知。適合的探針 以及引子長度自8個核苷酸長至1〇〇個核苷酸長。例如，探針 以及引子長度可為8-20,1〇-30，15-40,50-80探針以及引子長度， 較佳為12 - 2 0個探針以及引子長度。核苷酸序列為基因之轉譯序 列或是其互補序列。 方法及組合物 為比較華人病患CYP2C9以及VK0RC1 DNA序列對於華 法林之敏感度與抗性（實施例一），我們發現CYp2C9 DNA序 列變異只出現在5.4-7.3%漢裔華人族群。此一變異主要為 CYP2C9*3。此外’兩種胺基酸被取代之突變於此研究中被發 現’包含一新的突變(P382L)未曾被報導過，這一類突變相當稀 少’只存於對warfrin敏感之病患身上發現。CYP2C9變異在不 同人種間有不同的分佈狀態。CYP2C9* 1/CYP2C9*2在高加索 人種約有20% [17];然而在中國人種則完全沒有。因此，CYP2C9 突變可以解釋中國人種只有少數比例的人有華法林敏感，但仍 無法解釋華法林劑量需求在種族内的不同。 另一方面’本發明之發明人發現VKORC1基因可以改變中 1334886 國與高加索人種之個體間以及種族間華法林劑量需求。具有 3673啟動子多型性AA基因型之病患具有 了 AG/GG基因型具有較高劑量需求(實施例一與二步而 同合型在高加索人種較稀少，然而這一類基因型在令國=種 卻屬於錄（I施例三）。這種巾國人種與高加索人種間的基因 頻率差異以及ΑΑ與華法林敏感之間的相關性，和臨床上所觀察 到的中國人種對於華法林比起高加索人有較低劑量需求的現 不謀而合。 口此，本發明之一目的在於提供一種用於判斷一受試對象 之華法林劑量範_方法，包含調查該受試對象之VK〇Rci基 因啟動子之序列。此-啟動子序列較佳含有自轉譯啟始位置猶 ，域和SEQIDNO:1有少於10%，8%肩，4%，3%，挪或ι%變 八性。較佳，啟動子於船區域含有少於冰⑻㈣从4 3或 2—單獨驗基變異^上序艘如及啟動子活性之改變可用以顯 示華法林之劑量範圍。 特別是位於暫)RC1基因3673位置之序列被調查。_ 二獨可用以預麟法林敏紐，而無須參考任何其他基因型。 =，:匕位ΐί AA純合型表示對於有華法林敏感性。Μ異 ^型之顯示巾錄雜，GG純合型顯示相對抗性。而給予 法林敏感性、巾度敏祕以目對抗性 因華法林配方以及個體之症狀有所不同，可由醫師二處= 定。例如，本發明之研究(實施例一)顯示:一;選擇 患群體中，病患具有最低劑量需求 ΐ Γΐ日，範圍机1.5。1^每日）具有AA基因 ，’而那，中需求者（平均值8〇 /每日 mg/母曰，祕57-1〇mg/每曰）為郎基因型。隨機選擇病患 1334886 (實施例二）’ AA基因型與AG與GG(3.81+/-1.24mg/每曰）相較 之下，具有一較低之維持劑量(2.61+/-i.i〇mg/每日）。這些範圍 可作為華法林劑量之起始點。 VK0RC1基因之基因序列可於Genbank Accession No. AY587020(SEQ ID N0:1)取得。轉錄起始位置係於圖上核苷酸 5086位置，傳統命名其為基因+1。圖中，ATG轉譯起始密碼子 A係位於核苷酸5312位置，在新的命名系統中，其根據人類基 因體變異社群(Human Genome Variation Society)所建議的序列 變異性描述定義為+ 1。本發明所述之啟動子的多型性係序列中 之核普酸3673位置’其在傳統的系統中係位於_丨413，新的及建 議的系統中係位於-1639。VKORC1序列之異型1 mRNA序列可 於 Genbank Accession No. NM—024006.4 取得。以上序列之轉錄 起始點標記為+1，則此處表示華法林敏感性之多型性啟動子位 於-1413位置。然而，根據人類基因體變異社群(HumanGen〇me Variation Society)(HGVS)所建議的序列變異性描述 (http://www.genomic.unimdb.edu.au/mdi/mutunomen/)，啟動子 SNP較佳之描述方式為為與轉譯起始密碼ATG中a之相對位 置’根據此命名方法，以NM—024006.4或AY587020之轉譯起 始密碼ATG (Met)中的A作為+1 ’則本發明所使用之啟動子 SNP 位於 3673 ，而此處 G>A 多型性為 NM一024006.4:c.3673G>A。此處需澄清3673G>A多型性（或是 更精確為NM_024006.4:c.3673G>A)與前述根據傳統啟動子序 列命名之-1413G>A多型性相同。 除了多型性之特異性（例如：3673位置之AA，AG或GG)， 連接每一特異性SNP之遺傳標記可用以預測相對之華法林敏感 性。因為SNP附近之基因標記會傾向於被共同分離或是顯示一 不均衡的連鎖。因此這些標記之存在（等價基因標記）顯示我 12 1334886 .們有興趣的SNP存在，也就是顯示華法林敏感性程度。 VKORC13673G>A啟動子多型性與VKORC1 6484C>T内含 子多型性近來被發現（D，Andreaetal.) [27]具有不均衡之連鎖， 可用以解釋具有6484TT基因型的義大利病患比起CT或CC基 因型具有較低的每日平均劑量。本發明亦顯示位於3,端未轉譯 區域之9041G>A多型性與3673A>G和64840T在中國人種間 具有不均衡連鎖。特別是9041G對偶基因與3673A對偶基因以 及6484T對偶基因。其他3673A SNp之等價基因標記包含 rs9934438、rs805894、rs2359612 與 rs7294。等價基因標記可為 籲任何標記’包括微隨體（microsatellite)以及單一核苦酸多型性標 記(SNP)。較佳地’有益之基因標記分子為自VK〇Rcl3673位 置起算約200kb或少於200kb。更佳地，標記約為自 VKORC13673 位置起算約等於或少於 100kb，80kb，60kb，40kb，20kb，15kb，10kb 或 5kb。 本發明亦提供一能夠與本發明之SNP雜交之寡核苷酸。此 寡核酸可以作為’例如，一雜交探針或引子，用以偵測VK〇RC1 • 基因之序列。該寡核苷酸較佳包含一 TGGCCGGGTGC序列 ‘（SEQ ID N0:1位置3668至3678)，或其互補股。為了雜交，與 3673位置對應之序列較佳能位於募核苷酸中間。且較佳至少有 4個核苷酸位於與3673位置對應之序列兩邊，與3673位置對應 之序列兩邊，更佳有至少5,6,7,8或9個核苷酸位於兩邊。 雜交通常需於較嚴格的條件下進行，例如，鹽濃度不超過 1M以及溫度至少25°C。比方單一核苷酸特異性探針雜交適合在 5XSSPE (750mMNaCl，mM 磷酸鈉，mMEDTA,pH7.4)狀態以及 溫度25°C至30°C或類似環境作用。較佳地，雜交後可以一低嚴 格洗液（Stringent Wash Solution)洗滌，例如，42°C，5xSSC 以 及0.1% SDS，或50°C,2xSSC以及0.1% SDS。高嚴格洗滌較佳 13 1334886 狀惑為65 C，〇.lxSSC以及0.1% SDS。當維持標的辑普酸與所使 用之引子或探針之間一類似程度一致性時，相等的狀態可藉由 變動一個或多個參數決定，此為此領域所熟知。 3673啟動子SNP位於E-Box(E-Box的同義序列卜⑽记如仍 sequence)為CANNTG)，在一短距離（2〇〇bp)具有三個額外的 E-Boxes。E-B〇xes是對於導引細胞/組織特異性轉錄的重要因 子，例如在肌肉、神經元、肝臟、胰臟[28,29]。將位於3673位 置的第二個驗基A改為G會破壞Ε-Β〇χ相同性並改變啟動子的 活性。此現象可以啟動子試驗說明，在HepG2細胞中，當相同 序列被破壞時，啟動子活性可增加約44% (參考第二圖），由此 可推測E-Box其功能為一抑制子鍵結位置。由於HepG2細胞來 自肝癌細胞，因此3673E-Box可能在肝臟中抑制轉錄作用。 具有3673 GG基因型的人需要較高華法林劑量可解釋如 :。VKORC1基因可轉譯出維他命κ環氧還原酶次單元卜負 貝將維他命Κ再生為還原態。γ_羧基酶以及維他命κ依賴之凝 血因子（因子II，VII,IX與X)的幾基化皆需要還原態的維他命 Κ。當JKORC1啟動子之活性增加時，一升高的VK〇RCl抓财 會提高VKORC1之活性间，因此增加了還原態維他命κ再生 勺政率由於大畺的還原態維他命κ使得維他命κ依賴之凝血 因子絲化增強。華法林係作用在抑鑛血因子的合成，因此 f有越多凝血因子會需要更多華法林㈣抗凝血。因為肝臟是 。成維他命K依賴凝血因子的主要器官，且VK〇RC1的表現量 ，肝，中最高’肝臟中VK0RC1約44%的變化對於凝血過程會 顯著影響，因此華法林所需劑量與VK0RC1基因多型性以及 啟動子活性有關。 本發明之發明人認為，位於VK〇RC1基因36乃位置之任 可歹）除了 A以外，會破壞Eb〇x並增加啟動子活性。意即 1334886 增加啟動子活性會增加華法林所需劑 是，3673位置可用以推測華法林劑量。進—上動=列特別 二實施例提供利用偵測VK0RC1基因活性以：丄二二之其 定華法林敏感性。同樣地，VK〇Rei /劑夏或決 或蛋白基因產物的多寡（_A 虫白貝）A VKQRC1的活性也㈣反映 ，之彻RC1啟動子活性、mRNA4、蛋㈣d-二 ❶的活性比起AA基因型至少多1〇%，⑽，2〇125%，= ’3挪或40% ’顯示相較於AA基因型需要較高華法林劑量。 決，啟動子活性或mRNA或蛋白f量財法已為此領 ，。在1實施例中’ PCR可被用來作為伯測爪纽八量^方 去。在其他實_巾’特殊的㈣可絲測量νκ⑽Ο蛋白質。 啟動子活性可被侧’例如制試縣的周邊血㈣本中分離 啟動子序列，將啟動子序列連結至報告子基因，表現報告子基 因並定量報告子。測量VKORC1活性的方法為此領域之又所 知。 本發明之另一目的在於提供一決定給予一突變VK〇Rcl基 因疋否會影響華法林劑量的方法。在此方法中，將測量此一突 變所產生的啟動子活性、mRNA量、蛋白質量或VKORC1活性 並與野生型VKORC1基因比較。如果啟動子活性、mRNA量、 蛋白質量或VKORC1活性相較於野生型增加或減少1〇%，15%， 20%，25%，30%，35%或40%，醫師便應該考慮增減華法林劑量。 本發明之又一目的在於提供一決定華法林劑量範圍之套 組，包含至少一選自以下群族之成分：⑻一偵測VKORC1基因 3673位置序列A之工具；以及(b)—偵測VKORC1基因3673位 置序列G之工具。 前述套組可進一步包含一分別偵測VKORC1基因3673位 置的序列C與T之方法。因此在一些實施例中，包含一偵測此 1334886 位置四種可能鹼基的方法。在其他實施例中，因為在此位置的a ： 最有可能為華法林敏感’此套組可包含一偵測A的工具以及搞 . 測同樣位置上G、C或T的工具。此工具較佳為一募核芽酸。、 此套組可選擇性包含寡核苷酸雜交反應液、PCR放大及/ 用說明書。 吏 本發明之另一目的在於提供一寡核苷酸或其互補股與 VK0RC1基因啟動子一區域雜交，其中前述區域橫跨啟動子 3673位置，並至少由6個核苷酸組成。較佳地，寡核苷酸之專 一性雜交至少橫跨VK0RC1基因3673位置 M，l〇，12，14，16，18,20,22或24個核_酸。前述寡核芽酸可雜交至 此-區域’其中前述核苦酸為A，G，C或τ，較佳為A或g。在鲁 一些具體實施例中，前述寡核酸包含約15個核苷酸或更少， ^•=0個核苷酸，20-25個核苷酸，25-30個核苷酸或30_40個核 —以下係提供利用本發明之實施例，然本實施例並非用以限 定本發明，任何熟悉此技藝者，在不脫離本發明之精神和範^ 内田可作各種之更動與潤飾，因此，本發明之保護範圍 視後附之t料·騎界技為準。 ^ · 實施例 * 以下實施例中所使用之縮寫符號之意義表 之縮寫則具有一般可接受之意義。 木弋義 C==攝氏溫度 hr=小時 min=分鐘 sec或s=秒 16 1334886 μΜ=微莫耳濃度 mM=毫莫耳濃度 莫耳濃度 ml=毫升 μ卜微升 mg=毫克 pg=微克 mol=莫耳 pmol=微微莫耳 ASO=對偶基因特異性募核苷酸（allde speciflc oligonucleotide ) CYP2C9=細胞色素P45〇亞族nc，多胜肽9 (Cytochrome P450,subfamilyIIC,polypeptide 9) IND=國際標準比例（International normalized ratio) LD=遺傳聯鎖(linkage disequilibrium) NTP=核三—酸(nucleotide triphosphate) PBS=石粦酸生理食鹽水(phosphate buffered saline) PCR=聚合酶鏈反應(polymerase chain reaction) SNP=單一核酸多樣性(single nucleotide polymorphism) VK0RC1=維他命K環氧還原酶複合體次單元1 材料與方法 病患：我們由四個醫學中心（台灣大學、高雄醫學院、台 北榮民總醫院、新光醫院）臨床心金管科找到16位在接受低劑 量或高劑量華法林病人。華人的華法林的平均維持劑量約為 17 1334886 3mg/天[8,9]。因此’我們認為接受維持劑量在$ 1 5吨/天的病 ，為對華法林有敏感性（參見表一，11位病人），而接受維持劑 里在^6mg/天的病患為對華法林有抗性（參見表一，5位病人）。 此一對華法林有抗性病人的定義可由無隨機選取之病患其華法 林劑量超過6mg/天的數據支持（參見表二）。相較於高加索病患 的平均華法林維持劑量則介於5 j以及5 5 mg/天之間[2〇,27]。 華法林平均每曰劑量係以一週其間為單位，記錄每一位病 心的INR國際標準比例(Internati〇nal⑽腿丨㈣恤〇)。隨機選 擇的104位接受華法林的病患中，無論劑量多寡，四個醫院皆 具有相同的目標證值，約為丨.4至3。受測病患之背景：人工 〜瓣更換（90位病患）、深層靜脈血栓(deep —㈣（$ 位病心）％房顫動（Atrial Fibrillation)( 5位病患）、中風（4 位病患）。病患之臨床資料（包括年齡、性別、體重以及每 均維持劑1)由受試者提供。抽血時，每一位病患皆持續 持劑量至少三健拜。有肝癌、腎臟癌、腸癌以 不常 出血問題之病患將被排除。 力个止吊 此外’ 92位非相關高加索人的祖樣本（ HD100CAU，醫學科璺猫办Λ 0 干村予研九中心（NIGMS)人類基因細胞保存中 心，Camden，m，USA)作為高加索人 = 係隨機選取自-全_群研究下的生物資料庫 受華„受試者係為互不相關之居住於台灣的= 人為構成口㈣大之族群，約佔超過98%之人口 ·欠針 象不包含佔台灣人口約2%的原住民。 本人又測對 音、。本研究㈣研究機構許可，並騎有受試者進行告知後同 定序以及以單—核*酸多型性標記(SNP)定基因型 1334886 基因組QNA係以PUREGENE™DNA純化系統（Gentra system，Minnesota，USA)分離之。16位對華法林具有敏感性 (£1.5mg/天，11位病患）以及具有抗性(^6_0mg/天，5位病患)之漢人 病患的CYP2C9以及VK0RC1 DNA序列變異，先直接以定序 決定之（Applied Biosystem 3730 DNA 分析儀，Applied Biosystems，Foster City，CA，USA)。引子特別設計於内含子與外 含子(intron-exon)連接處，CYP2C9 以及 VKORC1 係使用 Primer3 PCR 引 子程式 (http://fokker.wi.mit.edu/cgi-bin/primer3/primer3_www.cgi)設計 馨包含外含子以及轉錄起始位置上游2kbps。此引子用以债測 VKORC1 啟動 子變異 ， 序列為 5’-CAGAAGGGTAGGTGCAACAGTAA(SEQ ID N0:2;義股 (sense strand)位於轉錄起始位置上游 i.5kbps)以及 5’-CACTGCAACTTGTTTCTCTTTCC(SEQ ID NO:3;反義股 (anti-sense strand)位於轉錄起始位置上游〇.9kb)。PCR係以最終 體積 25μ卜含有引子各 〇.4μΜ，10mM Tris-HCl(pH8.3)，50mM • KC1，1.5mM MgCl2 0.2mM dNTPs 以及 1 單位价说抓 7i^TM(Qiagen Inc，Valencia，CA USA)。增幅狀態包含起始變性 _ 1211^11，96。(：，34 個 PCR 循環 30 sec，96°C，30sec，60°C，40sec，72 C。接者用MALDI-TOF質譜儀鑑定系統（Mass Spectrometry) (SEQUENOM MassARRAY 系統,Sequenom, San Diego，CA，USA) 篩選’以於104位隨機選取之接受華法林治療之漢人、95位正 常漢人控制組以及92位正常高加索人控制組中確認變異。引子 與探針係使用Spectro DESIGNER軟體設計（Sequenom)。接著 進行複合聚合鏈反應(multiplex-PCR)，使用蝦的驗性礙酸酶 (Shrimp alkaline phosphatase, SAP, Hoffman-LaRoche, Basel, Switzerland)將未混和之dNTPs去磷酸化，接著以引子增長。 1334886 純化後之增長引子點於384元件矽晶片（SpectroCHIP，Sequenom) 並以 Bruker Biflex III MALDI-TOF SpectroREADER 質譜儀分析 (Spequenom) ’ 且結果光譜以 SpectroTYPER 處理(Spequenom)。 螢光酵素報告子試驗 載體構築 為試驗VKORC1啟動子活性，從具有3673AA以及3673GG 基因型病患的包含3673多型性（-1798至-35)的VKORC1啟動 子’先轉植於具有前置引子（forward primer): 5’-ccgctcgagtagatgtgagaaacagcatatgg(SEQ ID NO :4;含有一办〇1 限制酶位置）以及反置引子（reverse primer): 5’-cccaagcttaaaccagccacggagcag(SEQ ID N0:5;含有一 //ζ>2ί/ΙΙΙ 限 制 i# 位置）之 pGEM-T Easy 載體（Promega，Madison， WI，USA)。含有VK0RC1啟動子的片段藉由瓜01以及//y饥/in 限制酶切下之後，再轉殖至pGL3-basic載體(Promega)中多選殖 位(multiple cloning site) ( Z/zoI 和 )。當與啟動子融合時， 前述pGL3-basic載體含有可轉譯出螢火蟲冷光酶之cDNA，且 當轉染至哺乳動物細胞時，可用以分析插入的啟動子活性。此 含有3673G/G基因型之一載體被稱做pGL3-G，而含有3673A/A 基因型之載體被稱做pGL3-A。此兩種載體中的VK0RC1啟動 子序列直接以定序分析。 細胞培養以及雙冷光酶報告子試驗 以 Dulbecco modified Eagle培養液(DMEM)以及 10% 胎牛血 清並添加100單位/mL盤尼西林、l〇〇pg/mL鏈黴素 (Streptomycin)以及2mM左旋麩醯胺酸(L-Glutamine)用以培養 HepG2細胞。轉染的24小時以前，在12-well多孔盤之每個孔 植入1.5xl05細胞。轉染當天，每一孔以iip〇fetamine — 20 " — ----- 1334886 2000(Invitrogen Corporation,Carlsbad，CA，USA)共同轉染 l.5pg 的 PGL3載體以及5〇ng的pRL-TK载體(Promega>pRL-TK載體藉 由HSV-TK啟動子轉譯出水母冷光酶（Reniuaiuciferase)，用以 作為内部控制組以均化螢火蟲冷光酶的表現。轉染48小時候， 以被動分解緩衝液（promega)將細胞溶解，溶解液加入冷光酶 的受質（雙冷光酶報告子系統，promega)，之後以冷光儀 (Luminometer ’ SIRIUS，Pforzheim, Germany)檢測螢火蟲以及 水母冷光酶活性。 統計分析 母一 SNP基因型頻率被計算。卡方檢定(chi-square test)用 以比較三重複之每一 SNP的基因型頻率。T檢定以及

Wilcoxon-Mann-Whitney檢定被用以多重比較不同基因型族群 之間之平均劑量。内標記不均衡連鎖以兩種方法D’以及r2檢 測’利用不均衡連鎖綜觀圖形（Graphical Overview of Linkage Disequilibrium ) (GOLD，http.//www.sph.umich.edu/csg/abecasis/GOLD/)計算。 實施例 實施例一、所選擇對華法林敏感以及抗性之的漢人病患 CYP2C9以及VK0RC1 DNA序列變異 漢人的華法林平均維持劑量為3.3mg/天[8,9]。因此我們認 為接受維持劑量在天的病患為對華法林有敏感性（參見 表一 ’ 11位病人），而接受維持劑量在^6mg/天的病患為對華法 林有抗性（參見表一’ 5位病人參考前述的材料與方法）。轉譯 21 1334886 區域的序列、外插子-内插子連接處以及CYP2C9啟動子區域顯 示11位華法林敏感病患中4位有三個序列變異。變異為： 1075A>C(I359L 為 CYP2C9*3)，895A〉G(T299a/以及 1145C>T(P382L)。3個病患偵測到CYP2C9*3 (參見表一，個體 1、3、5)。個體 5 除了 CYp2C9*3，亦有 895A>G(T299A)之改 變，如前述[7]。於第四個病患（個體6)發現一新穎的外插子 突變1145C>T(P382L)。如表一所示，CYP2C9基因變異並未於 所有華法林敏感的病患中發現，且於所有華法林抗性之病患亦 未發現。 我們也將啟動子、轉譯區域和VK0RC1基因的外插子-内 插子連接處定序，偵測到位於VK0RC1基因的3,未轉譯區域 (3 UTR)的一變異（9041 G>A)。此外，一啟動子多型性3673 G>A(或-1413當轉錄起始位置為+ 1時），被偵測到位於VK〇RC1 上游區域。此一多型性顯示華法林與敏感性之關連，因所有華 法林敏感性病患於3673位置皆為aa同合子。另一方面，華 法林抗性病患則為AG異合子或GG同合子(表一）。當華法林劑 量與3673基因型對照時顯示，基因型為AA之病患具有最低劑 里品求（平均1.19mg/母曰，範圍〇 7i_i 50mg/每曰），基因型為 AG之病患為具有中度劑量需求者（平均值8〇4mg/每曰，範圍 6.07-10mg/每曰）’具有GG基因型之病患為高度劑量需求者（平 均值9.11mg/每曰，範圍8.57-l〇mg/每曰）（參照第一圖）。 除了 3673 G>A以外，一内插子j多型性6484C>T亦曾為 D’Andrea等人所描述P7]與本發明之病患有一致性。此兩種多 型性顯示有強烈的不平衡連鎖（LD)(表一）。具有3673AA基 因型之華法林敏感病患，除個體6的病人以外，被發現與6484 同合子ττ有關。在華法林抗性病人中，具有3673異合子AG 基因型被發現與6484異合子CT有關，3673同合子GG被發現 22 1334886 與6484同合子TT有關（參見表一）。 表一、病患人口統計以及DNA序列變異確認

Case No. Dose (mg/d) INR Age (yr) Sex Weight (kg) VKORC1 •1639 VKORC1 1173 紀YP2C9 variants Warferin sensitive group (dose =1.5mg^day, tt =11) 1 0.71 3.23 65 F 42 AA TT CYP2C9*3 2 1 2.69 74 M 65 AA TT ronml 3 1 3.23 70 M 66 AA TT CYP2C9*3 4 1.25 1.5 84 F 50 AA TT nonml 5 1.25 1.96 68 M 75 AA TT CYP2C9*3 895A>G(T299A) 6 1.25 2.5 71 F Ί0 AA CT 1145C>TXP3S2L) 7 1.25 2 71 F SO AA TT normal 3 1.25 2.9 72 F 67 AA TT nom^l 9 1.25 1.59 67 M 33 AA TT nDimal 10 1.43 2.05 58 F 42 AA TT 11 1.5 2.24 61 M 65 AA TT nonml Warferin resistant group (dose= 6mg^day, n=5) 12 6.07 2.32 48 F 52 AG CT vbrmsl 13 8.57 2.09 63 F 33 GG cc nontul 14 3.75 2.32 26 M 83 GG cc normal 15 10 1.3 46 M 64 AG CT nontol 16 10 2.33 53 F 61 GG cc nom^l 23 1334886 實施例二、接受華法林之隨機選擇漢人病患的VK0RC1 3673 G>A多型性 為了進一步研究3673 G>A多型性是否與個體間對於華法 林劑量差異有關，1〇4位接受華法林病患不問其劑量，以 MALDI-TOF質譜儀定其基因型。AA以及ag/GG群體並不因 年紀、性別以及INR有所不同（參見表二）。只有兩位病患被發 現具有GG同合子，統計時被併入八〇群體。我們分析數據時將 排除其他變因’例如減肥或藥物治療。如表二所示，AA群體相 較於AG/GG(3.81mg/每曰）群體有顯著較低的劑量需求(2 61mg/ 每日）。此一差異無論是使用T檢定（p<0.〇〇〇l)或 鲁

Wilcoxon-Mann-Whitney 檢定(p=〇.〇〇〇2)，在 AA 以及 AG/GG 群 體之間接都相當顯著。 表二、隨機擇接受華法林治療的病患根據基因型分類之平均劑量 以及其他臨床特徵

Warfarin Genotype dose , INR Age (Years) Sex (M/ F) (mg/day) VKORCl-1639 AA (n=83) 2.61 士 1.10a 2.03 ± 0.45 57.5 ± 14.8 43/40 AG + GG(n=21 ) 3_81 ± 1.24 2.08 ± 0.47 60.4 ± 13.1 13/8 aP value of comparison between AA and AG+GG groups P-value<0.0001 using T test. P-value=0.0002 using Wilcoxon Mann Whitney test. Data represent mean ± SD. 24 1334886 實施例三、漢人與高加索人之VKORC1 3673 G>A多型性以及 CYP2C9變異 漢人族群相較於高加索人種具有較低華法林維持劑量。為 測試VKQRC13673制㈣齡是何以轉觀間對於華法 f劑量的差異，進行確認95位正常漢人受試者以及92位正常 高加^人受試者之基因型。在高加索人族群中，AA同合子相較 :佔知群大多數的AG以及GG族群具有較低頻率（分別為μ 2 %、46.7%以及39·1% )(參見表三）。相反地，在漢人族群中’， 同合子ΑΑ為族群中的多數（82.1% )，其餘為AG異合子（17 9 % )。隨機選擇之族群中未發現GG同合子。此一比例與1〇4位 接义華法林治療的病患含有79.8% ΑΑ同合子、18.3% AG異合 子以及僅有1.8% GG同合子大致相符。此一基因型差異在高加 索群體以及兩個漢人群體之間明顯，其ρ值低於〇〇〇〇1。此兩 種族之間的差異（漢人與高加索人）與華法林敏感之ΑΑ相關 f生和床所觀察到漢人比两加索人需要較低劑量一致。 25 1334886 表三、漢人以及高加索人之VK0RC1啟動子多型性(3673 G>A)以及 CYP2C9變異

Genotype Caucasian (n=92) Chinese (n=95) Random Selected Chinese Warfarin Patients (n=104) VKORC1-1639 AA 13 (14.2%) 78 (82.1%) 83 (79.8%) AG 43 (46.7%) 17(17.9%) 19(18.3%) GG 36 (39.1%) 0 (0%) 2(1.9%) CYP2C9 variants3 2C9*1*2 20.4% 0 (0%) 0 (0%)b 2C9*2*2 0.9% 0 (0%) 0 (0%)b 2C9*1*3 11.6% 7 (7.3%) 4 (5.4%)b 2C9*3*3 0.4% 0 (0%) 0 (0%)b P值<0.0001比較高加索人與漢人族群。 P值<0.0001比較高加索人與隨機選取接受華法林治療的漢人族 P值=0.817比較漢人族群與隨機選取接受華法林治療的漢人族^° a CYP2C9*1 為 CYP2C9 之野生型。CYP2C9*2 以 β CYP2rQ'*f: ^

胺機酸胱氨酸（cystine)以精氨酸（arginine)取代以^&第359個144個 以異白氨酸(isoleucine)取代。高加索人之頻率由取得「171胺。機酸白^^(leucine) bCYP2C9*3頻率來自74位接受華法林病患之基因型f J 26 1334886 除了 3673· G>A，我們亦於漢人族群篩選了三種内含子多型 性（rs9934438，内含子 1 6484C>T ; Γ_5〇894，内含子 2 6853G>C ; rs2359612 ’ 内含子 2 7566C>T)以及一個 3，Utr 多 型性(rs7294 ’ 9041G>A)。所以四種多型性皆與3673啟動子多型 性具有不平衡連鎖（内標記D，以及r2值=1.〇)。 CYP2C9變異亦於漢人族群中定基因型。CYp2C9*1/5(；3在 正苇漢人私群中之比例為7.3%，而在隨機選取之接受華法林病 患為5.4%。CYP2C9*2變異並未於漢人病患或控制組中發現。 相較於高加索人公布資料中的CYP2C9變異，高加索族群相較 籲於漢人具有較高頻率的CYP2C9變異（約30%與7% )，因此高 加索人對於華法林抗性較高。其他於華法林敏感病患偵測到之 錯義突變（missense mutation) ’ 895A>G(T299A)以及 1145C>T(P382L)(表一）並未於任何隨機選擇的病人以及控制組 找到，顯示此為罕見的變異。 實施例四、VKORC1啟動子活性 AA與GG基因型病患對於華法林敏感性之差異可以由 • VKORC1啟動子活性之改變來解釋。3673啟動子SNP位於 E-Box (CANNTG)的第二個核苷酸，因此，此一多型性將會改 變E-Box的同義序列並能夠造成Vk〇RC1啟動子活性之改變。 為檢驗此一假設，以PCR放大3673AA或GG基因型之病患包 含3673位置的VK0RC1啟動子，並轉殖於pGL-3載體。選擇 HepG2細胞（一人類肝腫瘤細胞）作為啟動子測試，因為 VKORC1在肝臟有高量的表現。總共進行九次實驗，皆有一致 的結果（顯示於第二圖）。3673G VKORC1啟動子相較於3673A 啟動子有較高的冷光酶活性（約超過44% )。pGL-3載體控制組 並未包含任何内插於多選殖位(multiple cloning site)的任何啟動 27 1334886 子，並具有可忽略之冷光酶活性。因此，3673位置的序列對於 啟動子活性很重要，而高啟動子活性（例如3673G)與高華法 林劑量需求有關。 貫施例五、結合VKORCl 3673SNP以及CYP2C9變異來定華 法林劑量 + 雖然VK0RC1 3673SNP亦可單獨使用預測華法林敏感 性’此SNP亦可選擇性結合其他基因標記。例如，VK〇Rci 基因以及CYP2C9基因可被用以定華法林劑量。當這兩個基因 都考置時，下表顯示預測每一單型(haplotype)之Coumadin劑量。 JVK0RC1 3673 CYP2C9變異 預測劑量（mg) GG *1 5 *2 3.75 *3 3.75 AG --- *1 3.75 *2 2.5 *3 2.5 AA ^--- *1 — 2.5 *2 1.25 *3 1.25 其他實施態樣 本發明之實施方法已詳述於前述實施例中，任何熟悉本技 術領域之人士皆可依本發明之說明’在不背離本發明之精神與 28 1334886 範圍内視需要更動、修飾本發明，因此，其他實施態樣亦包人 在本發明之申請專利範圍中。 έ 【圖式簡單說明】 第一圖係為華法林劑量與VKORC13673基因型的關係 圖。具有對華法林有敏感性或抗性的病患之華法林劑量(表表」j 與於VK0RC1啟動子3673位置的不同基因型之關係^ ^有 CYP2CP變異的個體包含CYP2C9*3, T299A(即胺基酸序^殘 基299位置從T換成A)以及P382L(即胺基酸序列殘基382位 #置從P換成L)。 第二圖係為HepG2細胞中冷光酶活性程度的相對檢測。 PGL3冷光酶報告子包含在啟動子3673位置為A(pGL3-A)或G 對偶基因(pGL3-G)。圖中顯示從9個實驗中的平均數據，且誤 差段(error bar)係代表標準偏差。PGL3-basic係作為不具有任何 啟動子插入的控制組。 【主要元件符號】 M. - * 29 1334886

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Claims (1)

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曰修(更)正本 十、申請專利 1. 一種用於決定一受試對象之華法林（warfarin )劑量範圍的 方法，其係調查該受試對象之VK0RC1基因序列3673位 置之多型性。 2. 如申請專利範圍第1項所述之方法，其中前述VK0RC1基 因3673位置為AA純合型、GG純合型或AG異合型。 3. 如申請專利範圍第1項所述之方法，進一步包含檢測 VK0RC1基因序歹1 9041、6484、6853或7566位置之多型 性。 肇4.如申請專利範圍第1項所述之方法，進一步包含檢測 CYP2C9基因之序列。 5. 如申請專利範圍第1項所述之方法，其中前述vkorci基 因序列係藉由一與VKORC1基因在高度嚴格條件下進行專 一性雜交之含有寡核苷酸的分子來調查之。 6. 如申請專利範圍第5項所述之方法，其中前述專一性雜交之 含有寡核苷酸的分子為橫跨VKORC1基因3673位置之6_4〇 個核酸。 7·如申請專利範圍第1項所述之方法，其中前述被調查之序 • 列係由受試對象之周邊血液所製備之DNA製得。一 洲人。

加索人。 述受試對象為非 8·如申請專利範圍第1項所述之方法，其中前述受試對象為亞 10.如申請專利範圍第1項所述之方法’其中前 洲人、非裔美國人或西班牙人。 i包含調查該受 月1J述起動子之區 11·二種決定一受試對象華法林劑量範圍之方法， 試對象之VKORC1基因之啟動子活性，其中前 ^34886 域係為 SEQ ID NO : 1 中 2312 至 5312。 · 如申請專利範圍第U項所述之方法，其中若豉動子活性至 少低於一包含SEQ ID NO : 1中3514至5277之啟動子約 20%，則應施以一較低劑量。 13. —種含有寡核苷酸或其互補股的分子，其係由6_4〇個核苷酸 組成’且可與VK0RC1基因啟動子區域在高度嚴格條件下進 行專一性雜交，其中前述VK〇RC1基因啟動子區域係為seq ID NO : 1 中 2312 至 5312，橫跨 3673 位置。 14. =申請專利範圍第13項所述之含有寡核苷酸或其互補股的 分子，其中前述啟動子之3673位置之核苷酸為八或〇。 15. =申請專利範圍第13項所述之含有寡核苷酸或其互補股的 分子’其中前述寡核苷酸係TGGCCGGGTCc或 TGGCCAGGTGC序列或其互補股。 〆 16. =申請專利範圍第13項所述之含有寡核苷酸或其互補股的 分子，係由約15或小於15個核苷酸所構成。 17. =申請專利範圍第13項所述之含有寡核苷酸或其互補股的 分子，係由約16-20個核苷酸所構成。 18·如申請專利範圍第13項所述之含有寡核紐或其互補股的 分子，係由約20-25個核苷酸所構成。 19· =申請專利範圍第13項所述之含有寡核純或其互補股的 分子，係由約25-30個核苷酸所構成。 20. 如申請專利範圍第13項所述之含有寡核微或其互補股的 分子，係由約30-40個核苷酸所構成。 21. —種決定華法林劑量範圍之套組，其包含如申請專利範圍第 13項所述之含有寡核苷酸或其互補股的分子。 22. —寡=苷酸之微陣列，包含如申請專利範圍第13項所述之 含有寡核苷酸或其互補股的分子。