CN101142322B - 用于预测华法令敏感性的基因变体 - Google Patents

Abstract

本发明发现VKORC1基因启动子的多态性与华法令敏感性有关。此多态性可解释个体间与种族间对于华法令剂量需求的差异性。进一步，此多态性也与启动子活性有关，因此受试者的VKORC1基因的启动子序列或活性可用以预测应给药受试者多少华法令。本发明也提供相关方法与组合物。

Description

用于预测华法令敏感性的基因变体

【交叉申请】

本申请要求2004年11月21日提交的美国临时申请60/638,837，以及2005年5月10日提交的美国临时申请60/679,694的权益。这些申请的内容全部包含在此作为参考。

【技术领域】

本发明涉及确定药物剂量的方法，所述药物具体是华法令(warfarin)。

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以上以及本发明其他地方引用的公开出版物，专利及专利申请以其全部内容包含在此作为参考，如同每篇单独的出版物、专利申请或专利的内容被单独具体地以其全部内容包含在此作为参考一样。

【背景技术】

华法令是一种广泛使用的抗凝血剂，用以预防患有深层静脉栓塞(deep vein thrombosis)、心房纤维性颤动(atrial fibrillation)或人工心脏瓣膜更换(mechanical heart valve replacement)[1-4]的个体的血栓栓塞性疾病。然而，华法治疗是有问题的，因为华法令治疗剂量无论是在个体间或是种族间其差异均相当大[5-7]。亚洲群体，包括华人(Chinese)，一般需要比高加索人或西班牙人低得多的维持剂量[6-9]。出血是目前使用华法令治疗最严重的并发症[10-12]，因此需花费精力监控此口服抗凝血剂的安全性。目前华法令的使用剂量须通过使用标准的国际标准化比值(International Normalized Ratio；INR)连续测定血液凝血酶原时间(prothrombin time)来密切监控。

细胞色素P450(Cytochrome P450)亚家族IIC，多肽9(CYP2C9)为催化华法令水解的主要药物代谢酶[13-15]。CYP2C9*2与CYP2C9*3为最常见于高加索群体中的多态性。以CYP2C9*1作为野生型，则CYP2C9*1/CYP2C9*2以及CYP2C9*1/CYP2C9*3的单元型(Haplotype)机率分别约为20％以及约12％[16，17]。CYP2C9*2与CYP2C9*3变体中CYP2C9酶活性的降低导致华法令敏感性，在较严重的情况中会有出血性并发症[18，20]。然而，CYP2C9*2与CYP2C9*3根本不存在或很少出现于在亚洲群体中[9，21]。CYP2C9中的基因变异只能部分解释个体间的华法令剂量差异性，但无法解释种族间的差异性[6，7，16]。

需要维生素K的γ-羧基化(γ-carboxylation)的凝血因子(因子II，VII，IX与X)对于凝血相当重要。γ-羧基酶利用还原态的维生素K以及氧，将二氧化碳分子加入凝血因子中的谷氨酸侧链。在羧基化过程中，还原态的维生素K被氧化成维生素K2，3-环氧化物，通过维生素K环氧化物还原酶从所述维生素K2，3-环氧化物重新产生还原态的维生素K用于另一个催化循环。华法令通过抑制维生素K环氧化物还原酶来阻止凝血因子的合成[22，23]。最近，编码维生素K环氧化物还原酶复合体-亚基1的基因(VKORC1)被克隆出来[24，25]，VKORC1基因见于华法令抗性患者[25，26]。在意大利患者中，也发现内含子多态性(intronic polymorphism)与个体间华法令敏感差异性有关。

然而这些研究无法解释所有华法令剂量的多样性，尤其是种族间的差异，也无法解释占世界人口很大部分的亚洲人群体的所述多样性。因此需要寻找一种方法以预测可广泛应用的适当的华法令剂量范围。

【发明内容】

申请人发现VKORC1基因的启动子的多态性与华法令敏感性有关。这种多态性可解释华法令剂量需求在个体间与种族间的差异。更进一步，该多态性也与启动子活性有关。VKORC1基因的启动子在-1639位置的核苷酸(相对于起始密码子的第一个核苷酸进行编号)为G，其活性比其中的相同位置为A的启动子的活性高44％。具有-1639A多态性的患者对于华法令较敏感。在-1639位具有纯合型AA的患者的剂量需求最低，在该位置具有杂合型AG的患者的剂量需求居中，在该位置具有纯合型GG的患者的剂量需求最高。因此受试者的VKORC1基因的启动子序列或活性可被用以预测应该给予受试者多少华法令。本方法可显著改善华法令剂量确定的准确度。目前，给予患者初始剂量，定期监测其INR并相应地调整华法令剂量，直到达到对患者安全的维持剂量。使用本发明的方法，所预测的剂量将会更接近维持剂量，因此华法令的剂量确定会更快速、更安全以及更经济。

因此本发明的一个方面在于提供确定受试者的华法令剂量范围的方法，包含研究该受试者的VKORC1基因的启动子序列。本发明另一方面在于提供评估患者服用华法令后出现并发症的风险的方法，包含研究该受试者的VKORC1基因的启动子序列。当受试者对于华法令越敏感，其产生并发症例如出血的风险就越高。

具体而言，研究位于VKORC1基因的-1639位的序列。如果该位置的核苷酸为A，则该受试者对于华法令较为敏感。因此，在VKORC1基因-1639位置具有纯合型AA的受试者比在相同位置具有A与其它核苷酸(G，C或T)的杂合子的敏感性要高。但所述的杂合子对于华法令的敏感性比在该位置无A的受试者要高。

所述序列可通过分析-1639A或-1639G/C/T等位基因的等效基因标记(equivalent genetic marker)来研究，其中所述等效基因标记的存在指示相对应等位基因的存在。例如，等效基因标记可为选自VKORC1基因的rs9934438、rs805894、rs2359612及rs7294组成的组的SNP，前述基因中的每一种都指示华法令敏感性。

在本发明的一些实施方案中，所述序列可通过使用与VKORC1基因启动子特异性杂交的寡核苷酸来研究。优选所述寡核苷酸与跨VKORC1基因-1639位置的至少6，8，10，12，14，16，18，20，22或24个核苷酸特异性杂交。所述序列可使用从受试者的外周血制备的DNA来研究。

本发明的受试者优选为人类，更优选亚洲人、高加索人、非洲人、非州裔美国人或西班牙人。

其它确定华法令给药剂量的方法可与VKORC1基因的研究结合。例如，CYP2C9基因的序列也可基于本技术领域可得的知识进行检验。例如，CYP2C9*2与CYP2C9*3均与华法令敏感性有关。

本发明的另一方面在于提供确定受试者华法令剂量范围的方法，包含研究该受试者VKORC1基因启动子的活性。启动子活性越高则所需的华法令的剂量越高。

本发明另一方面在于提供用于确定华法令剂量范围的试剂盒，包含至少一种选自下组的组成部分：(a)检测VKORC1基因-1639位置的序列A的工具(means)；以及(b)检测VKORC1基因-1639位置的序列G的工具。

所述试剂盒可进一步包含分别检测VKORC1基因-1639位置的序列C与T的工具。在某些具体实施方案中，所述试剂盒可包含用于在该位置检测四种可能的碱基中的每一种的工具。在其它具体实施方案中，所述试剂盒可含有在所述位置检测A的工具，以及检测在该位置检测G，C或T的工具，因为A在该位置的存在表示对于华法令敏感性较高。所述工具优选为寡核苷酸。所述试剂盒可选包含寡核苷酸杂交反应剂、PCR扩增剂与/或使用说明。

本发明另一方面在于提供寡核酸或其互补链，其与VKORC1基因启动子的区域特异性杂交，其中所述区域跨启动子的-1639位置并至少由6个核苷酸组成。优选地，寡核苷酸与跨VKORC1基因-1639位置的至少6，8，10，12，14，16，18，20，22或24个核苷酸特异性杂交。所述寡核苷酸与该区域杂交，其中在-1639位的核苷酸为A，G，C或T，优选为A或G。在一些具体实施方案中，前述寡核苷酸包含约15个核苷酸或更少，16-20个核苷酸，20-25个核苷酸，25-30个核苷酸或30-40个核苷酸。本发明也提供包含本发明的寡核苷酸的微阵列。

本发明一或数个实施方案的细节如以下图式及说明书所述。其它的特征、目的及优点可明确地从附图、说明书及权利要求获得。

【附图说明】

图1为华法令剂量相对于VKORC1-1639基因型的散点图。用具有华法令敏感性或抗性的所选患者的华法令剂量(参见表1)相对于VKORC1启动子-1639位置的不同基因型进行作图。*具有CYP2C9变异的个体包括CYP2C9*3，T299A(即氨基酸残基299从T变成A)以及P382L(即氨基酸残基382从P变成L)。

图2为HepG2细胞中萤光素酶活性水平的相对检测。pGL3萤光素酶报告子在启动子-1639位置含有A(pGL3-A)或G等位基因(pGL3-G)。显示从9个实验获得的数据的平均值，且误差条(error bar)代表标准偏差。pGL3-basic用作没有插入任何启动子序列的对照。

图3为VKORC1基因的基因组序列(Genb ank登录号AY587020)。转录起始位置是图中的核苷酸5086(粗体字并加框)，传统的命名法中称为基因的+1。图中，ATG翻译起始密码子(粗体字)的A位于图中的核苷酸5312，在新的命名系统中，其根据人类基因体变异协会(Human Genome Variation Society)的建议而定义为+1。本发明所述的启动子多态性均被标示下划线且为粗体(该序列中的核苷酸3679)，其在常规的系统中位于-1413，而在新的建议的系统中位于-1639。

【实施方式】

我们发现VKORC1基因启动子的多态性与华法令敏感性有关。此多态性可解释个体间与种族间对于华法令剂量需求的差异性。进一步，此多态性亦与启动子活性有关。在-1639位的核苷酸(相对于起始密码子的第一个核苷酸)为G的VKORC1基因启动子的活性比在相同位置具有A的启动子的活性高44％。具有-1639A多态性的患者对于华法令更敏感。在-1639位具有的AA纯合型的患者的剂量需求最低，在-1639位具有AG杂合型的患者的剂量需求居中，在-1639位具有GG纯合型的患者的剂量需求最高，因此VKORC1基因的启动子序列或活性可用以预测应该给予受试者多少华法令。

进一步说明本发明之前，除非另有说明，本申请中所用术语如下定义。

定义

术语“华法令”包含具有抗凝血活性的香豆素(coumarin)衍生物。优选实施方案中，华法令为4-羟基-3-(3-氧代-1-

苯基丁基)-2氢-1-苯吡喃二酮(4-Hydroxy-3-(3-oxo-1-phenylbutyl)-2H-1-benzopyran-2-one)(即3-α-苯基(pheneyl)-β-乙酰乙基-4-羟基香豆素)。目前商业产品为R异构物或S异构物的外消旋混合物。术语“华法令”包含R异构物、S异构物，任何外消旋混合物，以及任何其盐。特别是包含古马丁(Courmadin)，玛尔维(Marevan)，番维芬(Panwarfin)，Prothromadin，Tintorane，Warfilone，Waran，Athrombin-K，华法令-地阿诺(deanol)，Adoisine，华法令酸(warfarin acid)，Coumafene，Zoocoumarin，Phenprocoumon，双香豆素(dicumarol)，溴鼠灵原药(brodifacoum)，二苯乙酰茚二酮(diphenadione)，氯鼠酮(chlorophacinone)，溴敌鼠(bromadiolone)以及醋硝香豆素(acenocoumarol)。

本发明所述“寡核苷酸”为含有经由核苷酸键合连接的2-约100个相邻核苷酸。寡核苷酸的长度至少为约10，20，30，40，50或60个核苷酸。此外，寡核苷酸的长度优选达200个核苷酸，优选为达约150，100，75，50，40，30或20个核苷酸。

杂交“探针”为以碱基特异性方式与核酸的互补链相结合的寡核苷酸。所述探针包含肽核酸。探针可为适合与靶核苷酸序列进行特异性杂交的任何长度。最适宜的探针长度视使用该探针的杂交方法而定，例如，具体的长度可能更适合用于显微制作的阵列(microfabricated array)，而其它长度的探针可能更适合用于传统杂交方法中，此类优化是本领域所熟知的。适合的探针以及引物的长度通常为约8个核苷酸至约100个核苷酸。例如，探针以及引物长度可为8-20，10-30，15-40，50-80个核苷酸，优选为12-20个核苷酸。核苷酸序列可对应基因的编码序列或基因编码序列的互补序列。

方法及组合物

通过比较具有华法令敏感性或抗性的中国患者的CYP2C9以及VKORC1 DNA序列(实施例1)，我们发现CYP2C9DNA序列变异只出现在5.4-7.3％汉族华人群体。此变异主要为CYP2C9*3。此外，在该研究中鉴定的两种错义突变，包括以前未曾报道过的新突变(P382L)，非常少见并且仅仅存在华法令敏感的患者中。CYP2C9变异在不同种族群体间有不同的发病率。CYP2C9*1/CYP2C9*2存在20％的高加索人群中[17]；然而在该研究中其在华人群体中则完全缺失。因此，CYP2C9中的突变可以解释华人群体中只有较小比例的人有华法令敏感性，但仍无法解释华法令剂量需求在种族间的不同。

另一方面，本发明人发现VKORC1基因中的改变可以改变华人群体中的个体间华法令剂量需要差异以及华人与高加索人之间的种族间华法令剂量需求差异。具有-1639启动子多态性AA基因型的患者具有较低剂量需求，而AG/GG基因型具有较高剂量需求(实施例1与2)。更进一步，AA纯合型在高加索人种较少，然而该基因型见于华人群中的大部分(实施例3)。这种高加索人和华人之间的基因型频率差异以及AA与华法令敏感性的相关性，和临床上所观察到的华人群对于华法令的剂量需要低于高加索人群的情况相符合。

因此，本发明一个方面在于提供一种用于确定受试者的华法令剂量范围的方法，包含研究该受试者的VKORC1基因的启动子的序列。与SEQ ID NO：1相比，此启动子序列优选在自翻译起始位点3kb之内含有少于10％，8％，6％，4％，3％，2％或1％的变异。更优选，启动子在该3kb区域含有少于20，15，12，10，8，6，4，3或2个单碱基变异。以上序列变异结合启动子活性改变可用以指示应当给予的华法令剂量范围。

具体地，研究位于VKORC1基因-1639位置的序列。可使用单独的SNP预测华法令敏感性，而无须参考任何其它基因型。因此，在此位置，AA纯合型指示华法令敏感性。AG杂合型指示中度敏感性，GG纯合型指示相对抗性。而应当给予对华法令敏感、中度敏感或相对抵抗的个体的华法令的实际剂量根据华法令配制剂以及个体症状而有所不同，可由开药的医师决定。例如，本发明的研究(实施例1)显示在被选择的具有华法令敏感性或抗性的患者群体中，具有最低剂量需求(平均值1.19mg/每日，范围0.71-1.50mg/每日)的患者具有AA基因型，而那些中度剂量需求者(平均值8.04mg/每日，范围6.07-10mg/每日)为AG基因型，而最高剂量需求者(平均值9.11mg/每日，范围8.57-10mg/每日)为GG基因型。在随机选择的患者中(实施例2)，AA基因型与AG和GG(3.81+/-1.24mg/每日)相比，具有较低维持剂量(2.61+/-1.10mg/每日)。这些范围可作为华法令剂量确定的起始点。

VKORC1基因的基因序列可作为Genbank登录号AY587020(SEQ ID NO：1)(参见图3)获得。VKORC1序列异构体1mRNA的序列可作为Genbank登录号NM_024006.4获得。以上所述两条序列，转录起始点标记为+1，则本发明所述指示华法令敏感性的多态性启动子位于-1413位。然而，根据人类基因体变异协会(Human Genome Variation Society)(HGVS)最近所建议的对    序    列    变    异    性    的    描    述(http://www.genomic.unimelb.edu.au/mdi/mutunomen/)，推荐相对于ATG翻译起始密码子的A描述启动子SNP。根据此命名方法，以NM_024006.4或AY587020的翻译起始密码子ATG(Met)中的A作为+1，则本发明所使用的启动子SNP位于-1639，而此位置处G>A多态性为“NM_024006.4：c.-1639G>A”。此处需澄清本发明中-1639G>A多态性(或是更精确为NM_024006.4：c.-1639G>A)与前述根据传统启动子序列编号命名的-1413G>A多态性相同。

除了特定多态性(例如：-1639位置的AA，AG或GG)，与每种特异性SNP相连的遗传标记也可用以预测相应的华法令敏感性。因为感兴趣的SNP附近的遗传标记会倾向于被共同隔离或是显示连锁不平衡。因此这些标记(等同的遗传标记)的存在指示感兴趣的SNP存在，从而指示华法令敏感性程度。

近来发现(D’Andrea et al.)[27]VKORC1-1639G>A启动子多态性与VKORC11173C>T内含子多态性处于连锁不平衡中，可用以解释具有1173TT基因型的意大利患者与CT或CC基因型相比具有较低的平均日剂量这一结果。本发明还显示，在华人群体中，位于3’端未翻译区的3730G>A多态性与-1639A>G和11173C>T处于连锁不平衡中。特别是3730G等位基因与-1639A等位基因以及1173T等位基因相关联。-1639A SNP的其他等同遗传标记包含rs9934438、rs805894、rs2359612与rs7294。等同遗传标记可为任何标记，包括微卫星(microsatellite)以及单核苷酸多态性标记(SNP)。优选地，有用的遗传标记为自VKORC1-1639位置起约200kb或少于200kb。更优选，标记约为自VKORC1-1639位置起约等于或少于100kb，80kb，60kb，40kb，20kb，15kb，10kb或5kb。

本发明也提供能够与本发明SNP杂交的寡核苷酸。此寡核酸可以作为，例如，杂交探针或引物，用以检测VKORC1基因的启动子序列。该寡核苷酸优选包含TGGCCGGGTGC序列(SEQ IDNO：1位置3668至3678)，或其互补链。为了杂交，与-1639位置对应的序列优选接近寡核苷酸中部。优选至少有4个核苷酸位于与-1639位置对应的序列的每一侧。更优选，与-1639位置对应的序列的每一侧侧接有至少5，6，7，8或9个核苷酸。

杂交通常需于严格的条件下进行，例如，盐浓度不超过1M以及温度至少25℃。例如单核苷酸特异性探针杂交适合在5XS SPE(750mM NaCl，mM磷酸钠，mM EDTA，pH7.4)、温度25℃至30℃的条件或类似条件下进行。优选地，杂交后可以进行低严格度洗涤，包括例如，42℃，5xSSC以及0.1％SDS，或50℃，2xSSC以及0.1％SDS。高严格度洗涤条件最为优选，包括例如65℃，0.1xSSC以及0.1％SDS。本领域技术人员熟知，等同的条件可通过变动一个或多个参数确定，同时维持靶核苷酸与所使用的引物或探针之间的相似程度的一致性或相似性。

-1639启动子SNP位于E-框(box)(E-框的共有序列为CANNTG)中，并在短距离(200bp)内有三个额外的E-框。E-框是介导细胞/组织特异性转录的重要因子，例如在肌肉、神经元、肝脏、胰脏中[28，29]。如观察到的那样，将位于-1639位置的第二个碱基A改为G会破坏E-框共有序列并改变启动子的活性。可通过启动子分析明确证实，在HepG2细胞中，当所述的共有序列被破坏时，启动子活性可增加约44％(参考图2)。不受理论限制，这说明E-框的功能可为HepG2中的抑制子结合位点。由于HepG2细胞来自肝癌细胞，因此-1639E-框可能抑制在肝脏中的转录作用。

具有-1639GG基因型的人需要较高华法令剂量可解释如下。VKORC1基因编码维生素K环氧化物还原酶亚单元1，其负责还原态维生素K的再生。γ-羧基酶需要还原态的维生素K，维生素K依赖型凝血因子(因子II，VII，IX与X)的γ-羧基化是凝血所需的。当VKORC1启动子活性增加时，升高的水平的VKORC1mRNA会提高VKOR活性[25]，因此增加还原态维生素K再生的效率。因此高水平的还原态维生素K使得维生素K依赖型凝血因子的γ-羧基化增强。华法令通过阻断凝血因子的合成起作用，因此具有越多的凝血因子会需要更多的华法令以实现其抗凝血效果。因为肝脏是合成维生素K依赖型凝血因子的主要器官，且VKORC1的表达量在肝脏中最高，肝脏中VKORC1水平约44％的变化很可能对于凝血过程会有显著影响。因此所需华法令剂量与VKORC1基因多态性以及启动子活性有关。

本发明的发明人认为，除了A以外，位于VKORC1基因-1639位置的任何序列，会破坏E box并增加启动子活性。而启动子活性增加会增加华法令所需剂量，因此启动子序列特别是位于-1639位置的序列可用以指示华法令剂量。进一步，本发明其它实施方案提供通过检测VKORC1基因的启动子活性，确定华法令剂量或决定华法令敏感性的方法。同样地，VKORC1基因产物的水平(mRNA或蛋白质)或VKOR的活性也能够反映华法令剂量需求。个体的VKORC1启动子活性、mRNA量、蛋白质量或VKOR的活性比具有AA基因型的受试者高至少10％，15％，20％，25％，30％，35％或40％，表明与具有AA基因型的受试者相比需要更高剂量的华法令。

确定启动子活性或mRNA或蛋白质量的方法已为本领域所熟知。在一些实施例中，PCR可被用来作为检测mRNA量的方法。在其它实施例中，特定的抗体可用来测定VKORC1蛋白质。启动子活性可被检测，例如从测试对象的外周血液样本中分离启动子序列，将启动子序列连结于报告子基因，表达报告子基因并定量产生的报告子。测量VKOR活性的方法为本领域所熟知。

本发明另一目的在于提供确定VKORC1基因的给定突变是否会影响华法令剂量的方法。在此方法中，将测量此突变所产生的启动子活性、mRNA量、蛋白质量或VKOR活性并与相应的野生型VKORC1基因比较。如果启动子活性、mRNA量、蛋白质量或VKOR活性相较于野生型增加或减少10％，15％，20％，25％，30％，35％或40％，医师便应该考虑增加或减少华法令剂量。

本发明又一目的在于提供确定华法令剂量范围的试剂盒，包含至少选自下组的至少一种组分：(a)检测VKORC1基因-1639位置的序列A的工具；以及(b)检测VKORC1基因-1639位置的序列G的工具。

前述试剂盒可进一步包含分别检测VKORC1基因-1639位置的序列C与T的工具。因此在一些实施方案中，该试剂盒包含检测此位置四种可能碱基中每一种的工具。在其它实施方案中，因为在此位置A的存在指示最有可能为华法令敏感，此试剂盒可包含检测A的工具以及检测同样位置上的G、C或T的工具。此工具优选为寡核苷酸。此试剂盒可选择性包含寡核苷酸杂交反应剂、PCR扩增剂，及/或使用说明书。

本发明另一方面在于提供寡核苷酸或其互补链，所述寡核苷酸或其互补链与VKORC1基因启动子的区域杂交，其中所述区域横跨启动子的-1639位置并至少由6个核苷酸组成。优选地，所述寡核苷酸与跨VKORC1基因-1639位置的至少6，8，10，12，14，16，18，20，22或24个核苷酸特异性杂交。所述寡核苷酸可与该区域杂交，其中-1639位的核苷酸是A，G，C或T，优选A或G。在一些具体实施方案中，所述寡核酸由约15个核苷酸或更少，16-20个核苷酸，20-25个核苷酸，25-30个核苷酸或30-40个核苷酸组成。包含本发明寡核苷酸的微阵列也在本发明提供。

提供以下实施例说明本发明，而不应理解为用以限定本发明的范围。虽然本发明具体通过参考其优选实施方案来显示并描述，本领域技术人员应理解，可作各种形式和细节上的改变而不脱离本发明的精神和权利要求定义的范围。

实施例

以下实施例中所使用缩写符号的含义表示如下。未定义的缩写则具有一般可接受的意义。

℃＝摄氏温度

hr＝小时

min＝分钟

sec或s＝秒

μM＝微摩尔浓度

mM＝毫摩尔浓度

M＝摩尔浓度

ml＝毫升

μl＝微升

mg＝毫克

μg＝微克

mol＝摩尔

pmol＝微微摩尔

ASO＝等位基因特异性寡核苷酸(allele specificoligonucleotide)

CYP2C9＝细胞色素P450亚家族IIC，多肽9(CytochromeP450，subfamilyIIC，polypeptide9)

IND＝国际标准化比值(International normalized ratio)

LD＝连锁不平衡(linkage disequilibrium)

NTP＝三磷酸核苷(nucleoside triphosphate)

PBS＝磷酸缓冲的盐水(phosphate buffered saline)

PCR＝聚合酶链反应(polymerase chain reaction)

SNP＝单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism)

VKORC1＝维生素K环氧化物还原酶复合体亚单位1

材料与方法

患者：我们从台湾的四个较大的医学中心(国立台湾大学医院、高雄医科大学医院、台北荣民总医院、新光医院)的心血管门诊找到16位接受低剂量或高剂量华法令的患者。华人的华法令平均维持剂量约为3.3mg/天[8，9]。因此，我们认为接受的维持剂量在≤1.5mg/天的患者为对华法令有敏感性(参见表1，11位患者)，而接受的维持剂量在≥6mg/天的患者为对华法令有抗性(参见表1，5位患者)。对华法令有抗性的患者的定义可由随机选出的患者中没有人的华法令剂量超过6mg/天的数据支持(参见表2)。这与高加索患者的情况不同，其平均华法令维持剂量介于5.1-5.5mg/天之间[20，27]。

华法令平均日剂量以一周期间为单位计算，并记录每一位患者的最近的国际标准化比值(International normalizedratio)(INR)。随机召集的104位接受华法令的患者中，无论剂量多少，在四个医院中经检测均具有相同的目标INR值，为1.4至3。华法令指征为：人工心瓣膜更换(90位患者)、深层静脉血栓(deep vein thrombosis)(5位患者)、心房纤颤(Atrial Fibrillation)(5位患者)、中风(4位患者)。患者的临床数据(包括年龄、性别、体重以及每日平均维持剂量)由每位受试者提供。抽血时，每一位患者已经接受恒定的维持剂量至少三周。在华法令治疗前有肝癌、肾癌、胃-肠癌或异常出血问题的患者将被排除。

此外，92位非相关高加索人的DNA样本(C at.No，HD100CAU，医学科学研究中心(NIGMS)人类基因细胞保存中心，Camden，NJ，USA)作为高加索人的对照组。95位健康受测者的DNA样品随机选取自用于全国群体研究的生物数据库，其中基于在台湾的地理分布选出3312位汉人作为华人对照组。华人对照组以及所有接受华法令治疗的受试者为互不相关的居住于台湾的汉人。汉人构成台湾最大的种族群体，约占超过人口的98％，本次受测对象不包含占台湾人口约2％的原住民。

本研究经过研究机构许可，并在对所有受试者进行告知后得到同意。

DNA测序以及以单核苷酸多态性标记(SNP)基因分型

基因组DNA利用PUREGENE^TMDNA纯化系统(Gentrasystem，Minnesota，USA)分离。CYP2C9以及VKORC1DNA序列变体首先通过直接测序(Applied Biosystem3730DNA分析仪，Applied Biosystems，Foster City，CA，USA)在16位对华法令具有敏感性(≤1.5mg/天，11位患者)以及具有抗性(≥6.0mg/天，5位患者)的 汉 人 患 者 中 测 定。使 用 Primer3 PCR 引 物 程 序(http://fokker.wi.mit.edu/cgi-bin/primer3/primer3_www.cgi)，特别针对CYP2C9以及VKORC1的内含子与外显子(intron-exon)连接处，外显子，以及转录起始位点上游2kbp来设计引物。用以检测 VKORC1 启 动 子 中 的 变 异 的 引 物 的 序 列 为5’-CAGAAGGGTAGGTGCAACAGTAA(SEQ ID NO：2；有义链位于  转  录  起  始  位  点  上  游  1.5kbps)以  及5’-CACTGCAACTTGTTTCTCTTTCC(SEQ ID NO：3；反义链位于转录起始位置上游0.9kb)。聚合酶链反应(PCR)在最终体积25μl中进行，其中含有每种引物各0.4μM，10mM Tris-HC1(pH8.3)，50mM KCl，1.5mM MgCl₂0.2mM dNTPs以及1单位HotStartTaq^TM(Qiagen Inc，Valencia，CA USA)。扩增条件包含96℃起始变性12min，34个下述PCR循环：30sec，96℃，30sec，60℃，40sec，72℃。

接  着  用  MALDI-TOF  质  谱  仪  鉴  定  系  统  (MassSpectrometry)(SEQUENOM MassARRAY系统，Sequenom，SanDiego，CA，USA)筛选，在104位随机选取的接受华法令治疗的华人、95位正常华人对照组以及92位正常高加索人对照组中鉴定变体。引物与探针使用Spectro DESIGNER软件(S equenom)设计。接着进行多元PCR(multiplex-PCR)，使用虾的碱性磷酸酶(Shrimpalkaline phosphatase，SAP，Hoffman-LaRoche，Basel，Switzerland)将未掺入的dNTPs去磷酸化，接着进行引物增伸。将纯化后的引物延伸反应产物点于384组件硅芯片(SpectroCHIP，Sequenom)，并在Bruker Biflex III MALDI-TOF SpectroREADER质谱仪(Spequenom)中分析，所得光谱用SpectroTYPER(Spequenom)处理。

荧光酶报告子试验

质粒构建

为检测VKORC1启动子活性，将来自具有-1639AA以及-1639GG基因型患者的、包含-1639多态性(-1798至-35)的VKORC1启动子，首先克隆入pGEM-T Easy载体(Promega，Madison，WI，USA)，所述克隆利用前向引物(forward primer)：5’-ccgctcgagtagatgtgagaaacagcatatgg(SEQ ID NO：4；含有XhoI限制  位  点)  以  及  反  向  引  物  (reverse primer)：5’-cccaagcttaaaccagccacggagcag(SEQ ID NO：5；含有HindIII限制位点)进行。含有VKORC1启动子的片段通过用XhoI以及HindIII限制酶消化pGEM-T Easy载体而从所述载体释放，亚克隆至pGL3-basic载体(Promega)的多克隆位点(XhoI和HindIII)。所述pGL3-basic载体含有编码萤火虫萤光素酶的cDNA，当与启动子融合时，可用于分析在转染到哺乳动物细胞时插入的启动子的活性。此含有-1639G/G基因型的载体被称做pGL3-G，而含有-1639A/A基因型的载体被称做pGL3-A。这两种载体中的VKORC1启动子序列通过直接测序分析确定。

细胞培养以及双萤光素酶报告子试验

HepG2细胞生长在Dulbecco改良的Eagle培养液(DMEM)以及10％胎牛血清中，其中添加了100单位/mL青霉素、100μg/mL链霉素以及2mML-谷氨酰胺。转染的24小时以前，在12-孔板的每个孔中植入1.5x10⁵细胞。转染当天，每一孔利用lipofetamine2000(Invitrogen Corporation，Carlsbad，CA，USA)共同转染1.5μg的pGL3载体以及50ng的pRL-TK载体(Promega)。pRL-TK载体编码通过HSV-TK启动子转录的水母萤光素酶(Renilla luciferase)，用以作为内部对照以标准化萤火虫萤光素酶的表达。转染48小时后，在被动裂解缓冲液(promega)中将细胞裂解。将裂解液加入萤光素酶基质(双萤光素酶报告子系统，Promega)，之后用萤光素仪(Luminometer，SIRIUS，Pforzheim，Germany)检测萤火虫以及水母萤光素酶活性。

统计分析

计算每种SNP的基因型频率。卡方检验(Chi-square test)用以比较三个样品组中每种SNP的基因型频率。进行T检验以及Wilcoxon-Mann-Whitney检验用以对不同基因型组之间的平均剂量水平进行多重比较。内部标记连锁不平衡通过两种测定方法即D’及r²来评估，利用连锁不平衡综观图形(Graphical Overview of LinkageDisequilibrium)(GOLD，http://www.sph.umich.edu/csg/abecasis/GOLD/)计算。

实施例

实施例1、所选择具有华法令敏感性或抗性的华人患者中的 CYP2C9以及VKORC1DNA序列变体

华人的华法令平均维持剂量为3.3mg/天[8，9]。因此我们认为接受的维持剂量≤1.5mg/天的患者为对华法令有敏感性(参见1，11位患者)，而接受的维持剂量≥6mg/天的患者为对华法令有抗性(参见表1，5位病人，参见前述的材料与方法)。CYP2C9基因的编码区域、外显子-内含子连接处以及启动子区域的测序显示11位华法令敏感患者中的4位具有三种序列变异。所述变异为：1075A>C(I359L为CYP2C9*3)，895A>G(T299A)以及1145C>T(P382L)。在3名患者中检测到CYP2C9*3(参见表1，受试者1、3、5)。受试者5中除了CYP2C9*3，还有895A>G(T299A)改变，如前述[7]。在第四名患者(个体6)中检测到新的外显子突变1145C>T(P382L)。如表1所示，CYP2C9基因变异并未于所有华法令敏感的患者中发现，且在所有华法令抗性患者中完全缺失。

表一、患者人口统计以及DNA序列变异确认

表1：患者人口统计以及鉴定的DNA序列变体

我们也对VKORC1基因的启动子、编码区域和外显子-内含子连接处进行测序。检测到位于VKORC1基因的3’未翻译区(UTR)的变异(3730G>A)。此外，检测到启动子多态性-1639G>A(或以转录起始位置为+1时为-1413)位于VKORC1上游区域。该多态性显示与华法令敏感性有关，因为所有华法令敏感性患者在-1639位置均为AA纯合型。另一方面，华法令抗性患者则为AG杂合型或GG纯合型(表1)。当用华法令剂量相对于-1639基因型作图时，基因型为AA的患者具有最低剂量需求(平均1.19mg/每日，范围0.71-1.50mg/每日)，基因型为AG杂合型的患者具有中度剂量需求(平均值8.04mg/每日，范围6.07-10mg/每日)，具有纯合GG基因型的患者具有最高的剂量需求(平均值9.11mg/每日，范围8.57-10mg/每日)(参照图1)。

除了-1639G>A以外，D’Andrea等人曾描述过的[27]内含子1多态性1173C>T也在本发明患者中鉴定。这两种多态性显示处于较强的连锁不平衡(LD)中(表1)。除一名患者(受试者6)以外，发现具有-1639AA基因型的华法令敏感患者与1173纯合TT有关。在华法令抗性患者中，发现具有-1639杂合AG基因型的患者与1173杂合CT有关，纯合-1639GG与1173纯合TT有关(参见表1)。

实施例2、接受华法令的随机华人患者中的VKORC1-1639G>A 多态性

为了进一步研究-1639G>A多态性是否与个体间的华法令剂量差异有关，我们用MALDI-TOF质谱仪对104位接受华法令患者进行基因分型而不论其剂量大小。AA以及AG/GG群体在年龄、性别以及INR方面没有不同(参见表2)。只有两位患者被发现具有GG纯合型，统计分析时被并入AG群体。我们分析数据时不考虑其它混杂的变因的存在，例如节食或其他药物治疗。如表2所示，AA组与AG/GG组(3.81mg/每日)相比有显著更低的剂量需求(2.61mg/每日)。此差异无论是使用T检验(p<0.0001)或Wilcoxon-Mann-Whitney检验(p＝0.0002)，在AA以及AG/GG群体之间都是显著的。

表2、随机选择接受华法令治疗的患者根据基因型分类之平均剂量以及其它临床特征

AA与AG+GG组之间的比较的^aP值。利用T检验P值<0.0001。利用Wilcoxon Mann Whjtney检验P值＝0.0002。数据表示为平均值±SD。

实施例3、华人与高加索人的VKORC1-1639G>A多态性以及 CYP2C9变异的基因型频率

已知华人群体与高加索人种相比其华法令维持剂量低得多。为检测VKORC1-1639基因型的频率差异是否可以解释种族间对于华法令剂量的差异，对95位正常汉人受试者以及92位正常高加索人受试者进行基因分型。在高加索人群体中，AA纯合子的频率最低，而AG以及GG基因型占群体大多数(分别为14.2％、46.7％以及39.1％)(参见表3)。相反地，在华人群体中，纯合子AA占群体中的多数(82.1％)，其余为AG杂合子(17.9％)。随机选择的群体中未发现GG纯合子。此比例与104位接受华法令治疗的患者中的比例相似，其中79.8％为AA纯合子、18.3％为AG异合子以及仅有1.8％GG纯合子相似。所述基因型差异在高加索群体以及两个华人群体之间明显，其p值低于0.0001。两个种族之间的差异(华人与高加索人)以及华法令敏感性与AA的相关性与临床所观察到华人与高加索人相比需要较低的剂量相符合。

表3、华人以及高加索人之VKORC1启动子多型性(-1639G>A)以及CYP2C9变异

P值<0.0001，比较高加索人与华人群体。

P值<0.0001，比较随机选取接受华法令治疗的高加索人与华人群体。

P值＝0.817，比较华人与随机选取的接受华法令治疗的患者。

^aCYP2C9*1为CYP2C9的野生型。CYP2C9*2以及CYP2C9*3为分别

在残基144用半胱氨酸取代精氨酸以及在残基359用亮氨酸白氨酸取代异亮氨酸的变体。高加索人中的频率由公开数据取得[17]。

^bCYP2C9*3频率来自对74位接受华法令患者的基因分型。

除了-1639G>A，我们也在华人群体中筛选了三种内含子多态性(rs9934438，内含子11173C>T；rs8050894，内含子2g.509+124C；rs2359612，内含子2g.509+837C)以及一种3’UTR多态性(rs7294，3730G>A)。所以四种多态性皆与-1639启动子多态性处于连锁不平衡中(标记间D’以及r2值＝1.0)。

CYP2C9变异也在华人群体中基因分型。CYP2C9*1/*3在正常华人群体中的比例为7.3％，而在随机选取的接受华法令的患者中为5.4％。CYP2C9*2变体并未于华人患者或对照组中发现。与关于高加索人中CYP2C9变异的频率的公开数据相比，高加索群体与华人相比具有CYP2C9变异的频率高得多(约30％相对于7％)，且高加索人对于华法令抗性较高。在华法令敏感患者中检测到的其他错义突变895A>G(T299A)以及1145C>T(P382L)(表1)并未于任何随机选择的病人以及对照组中发现，表明其为罕见的突变。

实施例4、VKORC1启动子活性

AA与GG基因型患者对于华法令敏感性的差异可以由VKORC1启动子活性的改变来解释。-1639启动子SNP位于E-框(CANNTG)的第二个核苷酸，因此，此多态性将会改变E-框的共有序列并能够造成VKORC1启动子活性的改变。为检验此假设，通过PCR从具有-1639AA或GG基因型的患者扩增包含-1639位置的VKORC1启动子，并克隆入pGL-3载体。选择HepG2细胞(人类肝肿瘤细胞)用于启动子实验，因为VKORC1在肝脏有高水平的表达。总共进行九次实验，皆有一致的结果(显示于图2)。-1639G VKORC1启动子与-1639A启动子相比有更高的萤光素酶活性(约超过44％)。pGL-3-basic载体对照并未包含任何插入多克隆位点的启动子，并具有可忽略的量的萤光素酶活性。因此，-1639位置的序列对于启动子活性很重要，而启动子活性越高(例如-1639G)，华法令剂量的需求越高。

实施例5、组合VKORC1-1639SNP与CYP2C9变体来确定华法 令剂量

虽然可使用单独的VKORC1-1639SNP预测华法令敏感性，此SNP可选与其它遗传标记组合。例如，可在华法令剂量确定中检验VKORC1基因以及CYP2C9基因的序列。当这两个基因都被考虑时，下表显示对于每种单元型的推荐的古马丁剂量。

其它实施方案

本发明已经描述了多种实施方案。应理解，可进行各种修饰而不背离本发明精神与范围。

Claims (8)

1.与VKORC1基因启动子特异性杂交的寡核苷酸或其互补序列在制备用于通过研究对象的VKORC1基因启动子的序列来确定该对象的华法令剂量范围的试剂盒中的用途，其中所述寡核苷酸用于研究位于VKORC1基因-1639位置的核苷酸，其中位于VKORC1基因-1639位置的AA纯合型指示华法令敏感性，位于VKORC1基因-1639位置的核苷酸的杂合型AG指示华法令中度敏感性，并且位于VKORC1基因-1639位置的GG纯合型指示华法令抗性。

2.权利要求1所述的用途，其中所述寡核苷酸与跨VKORC1基因-1639位置的至少6个核苷酸发生特异性杂交。

3.权利要求1所述的用途，其中所述寡核苷酸用于通过利用从对象的外周血所制备的DNA来研究VKORC1基因的-1639位置的核苷酸。

4.权利要求1所述的用途，其中所述试剂盒还包括用于检测CYP2C9基因的序列的工具。

5.用于研究对象VKORC1基因的启动子活性的工具在制备用于确定该对象的华法令剂量范围的试剂盒中的用途，其中所述工具用于研究位于VKORC1基因-1639位置的核苷酸。

6.权利要求5所述的用途，其中若启动子活性比包含SEQID NO：1的残基3541至5277的启动子的活性低至少约20％，则所述受试者需要较低剂量。

7.确定华法令剂量范围的试剂盒，包含至少一种选自以下物质组成的组的组分：

(a)检测VKORC1基因-1639位置的序列A的工具；以及

(b)检测VKORC1基因-1639位置的序列G的工具。

8.权利要求7所述的试剂盒，其中(a)中的工具与(b)中的工具为寡核苷酸。

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