WO2004001037A1 - 心筋梗塞のリスク診断方法 - Google Patents

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WO2004001037A1
WO2004001037A1 PCT/JP2003/003477 JP0303477W WO2004001037A1 WO 2004001037 A1 WO2004001037 A1 WO 2004001037A1 JP 0303477 W JP0303477 W JP 0303477W WO 2004001037 A1 WO2004001037 A1 WO 2004001037A1
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nucleic acid
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Yoshiji Yamada
Mitsuhiro Yokota
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Nagoya Industrial Science Research Institute
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    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/156—Polymorphic or mutational markers

Definitions

  • the present invention relates to a detection method using a gene associated with myocardial infarction. More specifically, the present invention relates to a detection method using polymorphisms of a plurality of genes associated with myocardial infarction and a kit used for the method. The present invention can be used, for example, for risk diagnosis of myocardial infarction. Background art
  • Myocardial infarction is a multifactorial disease, whose onset is defined by the interaction of the individual's genetic background with various environmental factors (Marenberg ME, Risch, Berktnan LF, Floderus B, de Faire U. Genetic suscept i bi lity to death f rom coronary heart di sease in a study of twins.N Engl J Med 1994; 330: 1041-1046., Nora JJ, Lortscher RH, Spangler RD, Nora AH, K i mbe r I i ng J. Gene tic-ep idemio Iogic study of early-onset ischemic heart disease. Circul at ion 1980; 61: 503-508.
  • the incidence of myocardial infarction in the general ⁇ -stomach is higher in proportion to the number of conventional risk factors such as hypertension and diabetes ⁇ hyperlipidemia (Nora ”J, Lortscher RH, Spangler RD, Nora AH, Kimberling WJ Genetic c-ep idemio iogic study of early-onset ischemic heart disease.Circulat ion 1980; 61: 503-508.) plague these risk factors themselves are also partially dependent on genetic factors. Although controlled, family history is an independent predictor of myocardial infarction, suggesting that there are myocardial infarction susceptibility factors in addition to conventional risk factors (Marenberg ME, Risch, Berktnan LF).
  • Myocardial infarction is the disease with the highest mortality rate in the United States and Europe, and is prevented, if not fatal, from heart failure and angina pectoris, which can cause intractable arrhythmias and significantly reduce patients' quality of life. It goes without saying that it is important to do so.
  • a polymorphism of a platelet glycoprotein rece ptor as an inheri ted risk factor for coronary thrombos is.N Enl J Med 1 996; 334: 1090-1094.), 7th blood coagulation factor, cholesterol ester transfer protein (Kuivenhoven JA, Jukema JW, Zwi nde) rman AH, eta I.The role of a common variant of the cholesterol ester transfer protein gene in the progress ion of coronary atherosclerosis.N Engl J Med 1998; 338: 86-93.) However, there are conflicting reports, and no conclusion has been reached yet. Furthermore, since different races have different genomic polymorphisms, it is important to build a database on the association between polymorphisms and myocardial infarction in each race. Disclosure of the invention
  • the present invention has been made in view of the above background, and an object of the present invention is to provide a means for diagnosing a genetic risk of myocardial infarction with high accuracy and high predictive probability, thereby contributing to the primary prevention of myocardial infarction. is there.
  • the present inventors have used several public databases to achieve the above object, and have extracted 7 ⁇ genes that are presumed to be associated with coronary atherosclerosis, coronary artery spasm, hypertension, diabetes, hyperlipidemia, etc.
  • 112 polymorphisms mainly those that are expected to be associated with changes in gene function.
  • a large-scale association analysis of more than 5000 cases was performed for the 112 polymorphisms of the 71 genes.
  • SNPs single e nucl eo tide polymorphism
  • a method for detecting a genotype of a nucleic acid sample which comprises the following step (a): — (a) Two methods selected from the group consisting of the following (1) to (10) in a nucleic acid sample A step of analyzing the above polymorphisms,
  • Tumor necrosis factor 0 polymorphism at base number-863 of the gene
  • a method for detecting the genotype of a nucleic acid sample comprising the following step (b): (b) a method for detecting a genotype of a nucleic acid sample, the method comprising the steps of: Analyzing at least one polymorphism,
  • a method for detecting the genotype of a nucleic acid sample comprising the following step (c): (c) a step of analyzing a polymorphism at the base number 4070 of the apolipoprotein E gene in the nucleic acid sample.
  • a method for diagnosing risk of myocardial infarction comprising the following steps (i) to (iii):
  • Tumor necrosis factor 0 polymorphism at base number-863 of the gene
  • a method for diagnosing a risk of myocardial infarction comprising the following steps (iv) to (vi): (iv) two selected from the group consisting of the following ( ⁇ ) to (15) in a nucleic acid sample A step of analyzing the above polymorphisms,
  • a method for diagnosing a risk of myocardial infarction comprising the following steps (vi i) to (ix): (vi i) a step of analyzing a polymorphism at base number 4070 of apolipoprotein E gene in a nucleic acid sample ,
  • a genotype detection kit comprising two or more nucleic acids selected from the group consisting of the following (1) to (10):
  • nucleic acid for analyzing a polymorphism at nucleotide number 242 of the NADH / NADPH oxidase p22 fox gene (4) a nucleic acid for analyzing the polymorphism at base number -6 of the angiotensinogen gene
  • a genotype detection kit comprising two or more nucleic acids selected from the group consisting of the following (11) to (15):
  • a genotype detection kit comprising: a nucleic acid for analyzing a polymorphism at base number 4070 of apolipoprotein E gene;
  • nucleic acid for analyzing the polymorphism at nucleotide position 1186 of the Uguchi nbospondin 4 gene
  • An immobilized nucleic acid comprising two or more nucleic acids selected from the group consisting of the following (11) to (15) fixed to an insoluble support, 11) Nucleic acid for analyzing polymorphism at base number-1171 of stromelysin 1 gene,
  • FIG. 1 is a table summarizing the 112 gene polymorphisms examined in the screening-related analysis in Examples.
  • FIG. 2 is a table summarizing the 112 gene polymorphisms also examined in the screening-related analysis in Examples.
  • FIG. 3 shows the primers (SEQ ID NOs: 30, 31, 32, 21, 22, 23, 15, 15, 16 and 17) used in order to determine the genotype in the examples. , 24, 25, 26, 18, 18, 19, 20, 33, 34, 35, 42, 43, 44), and probes (sequence numbers 59, 6 in order from the top) 0) and other conditions.
  • FITC stands for full-year-old resinin isothiosinate
  • TxR stands for Texas Red.
  • FIG. 4 shows the primers used for genotyping, also in the examples. 1 (sequence numbers 27, 28, 29, 39, 40, 41, 36, 37, 38, 53, 54, 55, 56, 57, 5 8, 48, 49, 45, 46, 47, 50, 51, 52), probe (sequence numbers 61, 62, 63, 64) in order from the top and other conditions Is a table summarizing.
  • FITC represents the full-year-old Resin Isoti-aged channel
  • TxR represents the Texas Red, respectively.
  • FIG. 6 is a table summarizing gene polymorphisms that were found to be associated with myocardial infarction in the screening association analysis of the examples.
  • FIG. 8 is a table summarizing the genotype distributions of polymorphisms that were found to be associated with myocardial infarction in all 5061 subjects of the association analysis in the examples.
  • FIG. 9 is a table showing the results of a multifactor logistic regression analysis of gene polymorphisms and myocardial infarction in all of the target subjects for association analysis in the examples.
  • 0R represents the odds ratio
  • CI represents the confidence interval.
  • Figure 10 is a table showing the results of the stepwise forward selection method of multifactor logistic regression analysis for genetic polymorphisms associated with myocardial infarction.
  • CI represents the confidence interval.
  • FIG. 11 is a table showing the results of a diagnosis of a genetic risk (risk of developing) of myocardial infarction using five combination gene polymorphisms in men.
  • FIG. 12 is a table showing the results of a diagnosis of a genetic risk (risk of developing) of myocardial infarction using five combination gene polymorphisms in women.
  • FIG. 13 is a graph showing the relationship between the number of combined gene polymorphisms and the odds ratio of myocardial infarction. Note that (A) is for men and (B) is for women. BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION
  • a first aspect of the present invention relates to a method for detecting a genotype of a nucleic acid sample, and one embodiment thereof includes a step of analyzing two or more polymorphisms selected from the group consisting of the following (1) to (10). It is characterized by including. In another embodiment, the method includes a step of analyzing two or more polymorphisms selected from the group consisting of the following (11) to 5). Still another embodiment is characterized by including at least a step of analyzing the following polymorphism (15). The genetic risk of myocardial infarction can be determined by determining the genotype of the nucleic acid sample from the polymorphism information obtained as a result of the above steps.
  • TNFa (_863C ⁇ A) polymorphism Polymorphism at nucleotide position -863 of Tumor necrosis factor-a: -863C ⁇ A (hereinafter also referred to as “TNFa (_863C ⁇ A) polymorphism”)
  • Interleukin 10 (9) Interleukin 10 (lnterleukin-10) gene base number-polymorphism at position 819:-819T ⁇ C (hereinafter also referred to as “IL-10 (-819T ⁇ C) polymorphism”)
  • Stromelysin-1 (Stromelysin-1) gene base number-Polymorphism at position 1171:-1171 / 5A ⁇ 6A (hereinafter also referred to as "stromelysin-1 (-1171 / 5A-6A) polymorphism”) )
  • glycoprotein Ibex (1018C ⁇ T) polymorphism Polymorphism at nucleotide number 1018 of glycoprotein Ibex (Glycoprotein Iba) gene: 1018C ⁇ T (hereinafter also referred to as “glycoprotein Ibex (1018C ⁇ T) polymorphism”)
  • Polymorphism at base number 4070 of Apolipoprotein E (Apol ipoprotein E) gene: 4070C ⁇ T (hereinafter also referred to as “Apo E (4070C ⁇ Cho) polymorphism”) Means that the polymorphism at the base number position consists of two genotypes that are bases before or after the arrow. However,- ⁇ 71/5 ⁇ ⁇ 6 ⁇ means a polymorphism consisting of a genotype having 5 consecutive ⁇ (adenine) and a genotype having 6 ⁇ ⁇ (adenine) in the 3 ′ direction from base number ⁇ 1171.
  • -668 / 4G ⁇ 5G is salt It means a polymorphism consisting of four genotypes and five genotypes in which G (guanine) continuously exists in the 3 ′ direction from base number -668.
  • the base number of each gene is represented based on a known sequence registered in the public database GenBank (NCBI).
  • NCBI GenBank
  • the 1019th base corresponds to the 1019th base of connexin 37 gene.
  • Rooster himself ⁇ 1 J number 2 bases th c ⁇ U (Access ion No.
  • L11698 Homo sapiens tumor necros is factor alpha gene, promoter region) of the 197th in the nucleotide of tumor necrosis factor a gene - 863 of base
  • the 684th base is the MADH / NADPH old cytidase p22 fox gene
  • nucleotide sequence of SEQ ID NO: 4 accesion No. XI 5323: H.
  • the 463th base is the angiotensinogen gene
  • the 801st base is apolipo.
  • SEQ ID NO: 6 corresponds to the -219 base of the protein E gene.
  • U20157 994th base in the platelet activating factor acetyl hydrolase gene in the 996th base in the human pIate I et-activat factor factor acety I hydrolase mRNA, complete cds
  • the 936th base corresponds to the -482 base of the apolipoprotein Cl II gene.
  • the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 8 accesion No. Z19585: H.
  • the 1186th nucleotide corresponds to the 1186th nucleotide of thrombospondin 4 gene, and the nucleotide of SEQ ID NO: 9 Array (Accession No. Z30175: H. sapiens I L-10 gene for in ter I euk in 10 (promoter)), the 455th base is -819th base of the interleukin 10 gene, and the 682th base is- In the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 10 (Accession No.
  • U43511 Homo sapiens strome I ysin-1 gene, promoter region
  • the 698th base in the base sequence of the stromelysin 1 gene corresponds to the 592th base. corresponds to 1171 of bases of SEQ ID NO: 1 1 salt 3 ⁇ 4 Rooster himself da 1 J: ⁇ 31 th in (Accession No. XI 3323 Human gene for plasminogen activator inhibitor 1 (PA Bok 1) 5 '-flank and exon 1 ) ! bases plasmid Nogen activator inhibitor 1 gene - equivalent to 668 of nucleotide SEQ ID NO: 1 2 bases th: ⁇ 1 J (Accession No.
  • J02940 Human platelet glycoprotein lb alpha chain mRNA, complete cds
  • the 524th base corresponds to the 1018 base of glycoprotein Ibex gene, and SEQ ID NO: 13
  • the 584th nucleotide corresponds to the 584th nucleotide of the para-xonase gene, and the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 14 (Accession No.
  • M10065 In the human apoI poprote in E (epsi Ion-4 al lele) gene, complete cds, the 4070th base corresponds to the 4070th base of the apolipoprotein E gene.
  • “analyzing a polymorphism” means examining the genotype of a nucleic acid sample with respect to a gene polymorphism to be analyzed.
  • the genotype of connexin 37 in a nucleic acid sample is TT (base 1019 is homozygous for T in both alleles), CT ( This means to check whether the base at position 1019 is a heterozygote of the C allele and the allele of T) or CC (both the allele at position 1019 is a homozygote of C).
  • the polymorphisms (1) to (10) described above are particularly effective for use in determining the genetic risk of myocardial infarction in an analysis of Japanese men, as shown in the examples below. It is a recognized polymorphism.
  • the polymorphisms (11) to (15) can be effectively used to determine the genetic risk of myocardial infarction in analyzes targeting Japanese women, as shown in the examples below. It is a recognized polymorphism. Therefore, analysis of these polymorphisms enables more accurate and highly predictive diagnosis when using females, especially Japanese females as subjects.
  • the polymorphism (15) was confirmed to be able to determine the genetic risk of myocardial infarction at an extremely high age-specific ratio by analyzing it, as shown in the examples below. Was done.
  • any or a plurality of polymorphisms selected from (11) to (14) is performed in combination to detect genotype or Diagnosis of the genetic risk of myocardial infarction can also be made.
  • the genotype of a nucleic acid sample is classified more finely in proportion to the increase in the number of polymorphisms to be analyzed, thereby making a diagnosis of a genetic risk of myocardial infarction with a higher prediction probability. Can be.
  • a genotype it is preferable to detect a genotype by analyzing more polymorphisms among the above polymorphisms (1) to (10). Therefore, it is most preferable to analyze all polymorphisms (1) to (10).
  • a genotype is detected by combining nine or less polymorphisms, it is preferable to preferentially select and use polymorphisms having a high odds ratio as shown in the examples described later. For example, using a combination of eight polymorphisms If it is, nine from the order of the highest odds ratio, ie. ), (3), (5), (6), (7), (8), (9) and (10) are preferably selected.
  • polymorphisms for example, if seven polymorphisms are used in combination, it is preferable to select (1), (3), (5), (6), (8), (9), and (10). . Similarly, if six polymorphisms are used in combination, it is preferable to select (1), (5), (6), (8), (9) and (10). Similarly, if, for example, five polymorphisms are used in combination, it is preferable to select (1), (5), (6), (8) and (9).
  • polymorphisms (11) to (15) when analyzing two or more polymorphisms selected from the polymorphisms (11) to (15), it is most preferable to analyze all these polymorphisms, that is, five polymorphisms.
  • a genotype is detected by combining four or less polymorphisms, it is preferable to preferentially select and use a polymorphism having a high head ratio as described in Examples below. For example, if four polymorphisms are used in combination, it is preferable to select four, ie, 1), (12), (14), and (15), in descending order of age ratio. Similarly, if, for example, three polymorphisms are used in combination, it is preferable to select (11), (12), and (5).
  • the method for analyzing each gene polymorphism is not particularly limited.
  • a method using PCR using an aryl specific primer (and a probe) and a method for analyzing a polymorphism of an amplification product by fluorescence or luminescence can be used.
  • PCR-SS0 (speciic sequence o I i gonuc I) eo ti de: Specific sequence talent Rigonu A S0 (allele specific oI i gonuc Ieotide: allele-specific oligonucleotide) hybridization method (Saiki, Nature, 324) that combines the PCR-SS0 method with the dot hybridization method. , 163-166 (1986)) or the TaqMan-PCR method (Livak, KJ, Genet Anal, 14, 143 (1999), Morris, T. et a, J. CI in.
  • a method using a PCR method for example, PCR-RFLP
  • any of the above analysis methods can be applied after the nucleic acid sample has been amplified (including amplification of a partial region of the nucleic acid sample) in advance by a gene amplification method such as a method applying the PCR method or the PC method. .
  • nucleic acid samples in particular, MALD using the aryl-specific PCR method, the aryl-specific hybridization method, the TaqMan-PCR method, the Invader method, and the primer extension method.
  • Analysis that can analyze a large number of samples in a relatively short time such as the TOF / MS (matrix) method, RCA (rol ining cycle amp I if cat on) method, or a method using a DMA chip or microarray
  • a method is used.
  • nucleic acids such as primers and probes (also referred to as “polymorphism analysis nucleic acids” in the present invention) corresponding to each method are used.
  • nucleic acid for polymorphism analysis examples include a nucleic acid having a sequence complementary to a certain region (partial DNA region) containing the polymorphic site in a gene containing the polymorphism to be analyzed.
  • the gene containing the polymorphism to be analyzed has a sequence complementary to a certain region (partial DMA region) containing the polymorphism site so that a DNA fragment containing the polymorphism portion can be specifically amplified.
  • Designed nucleic acids (primers) can be mentioned.
  • nucleic acid for example, when the polymorphism at position 109 of the connexin 37 gene is to be analyzed, the nucleotide sequence at position 109 of the connexin 37 gene is C (cytosine).
  • a nucleic acid having a sequence corresponds to this.
  • nucleic acid for polymorphism analysis is that the partial DMA region containing the polymorphic site is specifically amplified only when the polymorphic site to be analyzed is any of the genotypes.
  • nucleic acid set include: More specifically, a nucleic acid set designed to specifically amplify a partial DNA region containing a polymorphic site to be analyzed, wherein the polymorphic site is an antisense strand having any genotype.
  • the partial DNA region containing the nucleotide position 109 of the connexin 37 gene is specifically amplified. Specifically designed for the partial DNA region containing the base at position 109 in the antisense strand of the connexin 37 gene in which the base at position 109 is C (cytosine).
  • High Pri die Nucleic acid set consisting of a sense primer to be hybridized and an antisense primer that specifically hybridizes to a partial region of the sense strand, or an antisense strand of the connexin 37 gene in which the 109th base is T (thymine).
  • the length of the partial DNA region to be amplified is appropriately set within a range suitable for the detection, and is, for example, 50 bp to 200 bp, preferably 80 bp to 150 bp.
  • a nucleic acid set for connexin 37 (109C ⁇ T) polymorphism analysis having the following sequence can be exemplified.
  • the underlined portions in the following sequences represent portions corresponding to polymorphisms.
  • N in the sequence means that it is any of A, T, and G.
  • CTCAGAATGGCCAAAANCC SEQ ID NO: 15, or
  • GCAGAGCTGCTGGGACGA SEQ ID NO: 17
  • one having the following sequence can be exemplified as a nucleic acid primer for TNFa (-863C ⁇ A) polymorphism analysis.
  • GGCCCTGTCTTCGTTAAN G SEQ ID NO: 18, or
  • CCAGGGCTATGGAAGTCGAGTATC SEQ ID NO: 20
  • one having the following sequence can be exemplified as a nucleic acid primer for NADH / MADPH old oxidase p22 fox (242C-T) polymorphism analysis.
  • ACCACGGCGGTCATGNGC SEQ ID NO: 21 or
  • nucleic acid primers for angiotensinogen (-6G ⁇ A) polymorphism analysis include those having the following sequences.
  • CGGCAGCTTCTTCCCNCG SEQ ID NO: 24, or
  • nucleic acid primers for apoE ( ⁇ 219 G ⁇ T) polymorphism analysis that have the following sequences can be exemplified.
  • GAATGGAGGAGGGTGTCTNGA SEQ ID NO: 27, or
  • nucleic acid primer having the following sequence can be exemplified as a nucleic acid primer for PAF acetyl hydrolase (994G ⁇ T) polymorphism analysis.
  • TTCTTTTGGTGGAGCAACNGT SEQ ID NO: 30 or
  • TCTTACCTGAATCTCTGATCTTCA SEQ ID NO: 32
  • examples of nucleic acid primers for apoC-III (-482CT) polymorphism analysis which have the following sequences can be exemplified.
  • TGTTTGGAGTAAAGGCACAGAA SEQ ID NO: 35
  • TSP4 118 G ⁇ C
  • GGTCTGCACTGACATTGATGAG SEQ ID NO: 38 Similarly, has the following sequence as a nucleic acid primer for-10 (-81 9T ⁇ C) polymorphism analysis Can be exemplified.
  • nucleic acid primers for the ⁇ 10 ( ⁇ 592A ⁇ C) polymorphism analysis include those having the following sequences.
  • CAGAGACTGGCTTCCTACANGA SEQ ID NO: 42, or
  • GCCTGGAACACATCCTGTGA SEQ ID NO: 44
  • one having the following sequence can be exemplified as a nucleic acid primer for polymorphism analysis of stromelysin 1 ( ⁇ 1171 / 5A-6A).
  • TTTGATGGGGGGAAAANAC SEQ ID NO: 45, or
  • TTGATGGGGGGAAAANCC Rooster self II number 4 6
  • CCTCATATCAATGTGGCCAA SEQ ID NO: 47
  • one having the following sequence can be exemplified as a nucleic acid primer for polymorphism analysis of PAI1 (-668 / 4G ⁇ 5G).
  • nucleic acid primers for glycoprotein Iba (1108C ⁇ T) polymorphism analysis include those having the following sequences.
  • CCCAGGGCTCCTGNCG SEQ ID NO: 50, or
  • nucleic acid primer having the following sequence can be exemplified as a nucleic acid primer for polymorphism analysis of para-xonase (584G ⁇ A).
  • ACCCAAATACATCTCCCAGGANCG SEQ ID NO: 53, or
  • AACCCAAATACATCTCCCAGGNCT SEQ ID NO: 54
  • nucleic acid primer having the following sequence as an example of a nucleic acid primer for apoE (4070C ⁇ T) polymorphism analysis can be exemplified.
  • CCGATGACCTGCAGAANCG SEQ ID NO: 56
  • GCCGATGACCTGCAGAANTG SEQ ID NO: 57
  • CGGCCTGGTACACTGCCAG SEQ ID NO: 58
  • specific examples of the probe include the following.
  • GTACAGGTGATGTANCATCTCTGTG SEQ ID NO: 62.
  • PA ⁇ (-668 / 4G ⁇ 5G) as a probe for polymorphism analysis
  • TGGACACGTGGGGGAGTCAG SEQ ID NO: 63, or
  • nucleic acid primers and nucleic acid probes with SEQ ID NO: 64 or more are merely examples.
  • nucleic acid primers can perform the desired amplification reaction without hindrance, other nucleic acid probes can be used for hybridization. Modifications may be made to some of the base sequences as long as the reaction can be carried out without hindrance. / Or means added.
  • the number of bases to be modified is, for example, 1 to 7, preferably 1 to 5, and more preferably 3. In addition, such a modification is performed in a part other than the base corresponding to the polymorphic site in principle.
  • the polymorphism to be analyzed is stromelysin 1 (-1 1 71 / 5A ⁇ 6A)
  • Polymorphism or PAM (- 668 / 4G 5G) in the case of a polymorphism
  • the use of nucleic acids obtained by modifying a part of the base corresponding to the polymorphic site as a primer or probe can also be t polymorphism analysis
  • a DMA fragment or an RNA fragment is appropriately used depending on the analysis method.
  • the base length of the nucleic acid for polymorphism analysis may be any length as long as each function is exhibited, and examples of the base length when used as a primer are about 10 to 50 bp, preferably about 15 to 40 bp, more preferably It is about 15 to 30 bp.
  • the degree of mismatch is one to several, preferably one to five, and more preferably one to three.
  • Nucleic acids for polymorphism analysis can be synthesized by a known method such as the phosphodiester method.
  • a known method such as the phosphodiester method.
  • the nucleic acid for polymorphism analysis in the present invention can be labeled in advance with a labeling substance.
  • polymorphism analysis can be performed using, for example, the labeling amount of the amplification product as an index.
  • amplification products The genotype of the nucleic acid sample can be determined based on the detected labeling substance and labeling amount.
  • labeling As a specific example of a detection method using a primer, two types of nucleic acid primers (aryl-specific sense primers) that specifically hybridize to the sense strands of each genotype constituting a polymorphism are used, respectively.
  • a method for detecting a polymorphism by measuring the labeling amount of each fluorescent substance in a product can be mentioned. If the antisense primer is labeled with, for example, bitin, amplification products can be separated using specific binding of bitin and avidin.
  • Examples of the labeling substance used for labeling the nucleic acid for polymorphism analysis include a radioisotope such as 32 P, a fluorescent substance such as a full-year restained isothiocyanate, a tetramethylrhodamine isothiocyanate, and a Texas red.
  • Labeling methods include 5 'end labeling using alkaline phosphatase and T4 polynucleotide kinase, 3' end labeling using T4 DNA polymerase ⁇ Kenow fragment, nick translation, IecuCDC Cloning, Third Edition, Chapter 9, 'Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York).
  • nucleic acids for polymorphism analysis can be used in a state of being immobilized on an insoluble support. If the insoluble support used for immobilization is processed into chips, beads, or the like, these immobilized nucleic acids can be used. Can be used to more easily analyze polymorphisms.
  • the nucleic acid sample can be prepared from the subject's blood, skin cells, mucous membrane cells, hair, etc. by using known extraction methods and purification methods. Any length of genomic DNA can be used as a nucleic acid sample as long as it contains the gene to be analyzed. Also, It is not necessary to use a nucleic acid sample in which all the genes to be analyzed are present on one nucleic acid.
  • the nucleic acid sample of the present invention may be any of those in which all of the genes to be analyzed are present on one nucleic acid, and those in which the genes to be analyzed are present on two or more nucleic acids. Can be used. Even if the gene to be analyzed in the nucleic acid sample is not in an intact state (that is, in a state where the full length of the gene is present), fragmentation or partial fragmentation is possible as long as at least the polymorphic site to be analyzed exists. It may be in the state. Analysis of each gene polymorphism is performed for each gene polymorphism, or a plurality or all of them are simultaneously performed.
  • nucleic acid sample obtained from a subject is dispensed according to the number of polymorphisms to be analyzed, and each polymorphism is individually analyzed.
  • DNA chips or microarrays can be used.
  • the term “simultaneous” as used herein does not only mean that all the operations in the analysis process are performed simultaneously, but also that some of the operations (for example, nucleic acid amplification operation, probe hybridization, or detection) are performed simultaneously. Including cases. Polymorphism of each gene can also be analyzed using mRNA which is a transcription product of the gene to be analyzed.
  • mRNA analysis can be performed using mRNA as a starting material by performing a method using a DNA chip (DNA array). .
  • polymorphism analysis can also be performed using the expression product of the gene to be analyzed. In this case, a partial protein or partial peptide can be used as a sample for analysis as long as it contains an amino acid corresponding to the polymorphic site.
  • Methods for analyzing using such gene expression products include a method for directly analyzing the amino acid at the polymorphic site and a method for immunologically analyzing a change in the three-dimensional structure.
  • a well-known amino acid sequence analysis method (a method using the Edman method) can be used.
  • the latter includes an ELISA method (enzyme-linked immunosorbent assay) using a monoclonal antibody or a polyclonal antibody having a specific binding activity to the expression product of a gene having any genotype constituting the polymorphism. Radioimmunoassay, immunoprecipitation, immunodiffusion, and the like can be used.
  • the polymorphism information obtained by executing the above-described detection method of the present invention can be used for diagnosis of a genetic risk of myocardial infarction. That is, the present invention comprises the steps of determining the genotype of a nucleic acid sample from the polymorphism information obtained by the above detection method, and determining the genetic risk from the determined genotype of the nucleic acid sample. Methods for diagnosing risk of infarction are also provided.
  • the determination of the genotype is typically to determine which genotype each of the alleles of the nucleic acid sample has with respect to the polymorphism to be detected.
  • the genotype of connexin 37 in a nucleic acid sample is TT (Homozygous for bases 101 and 9 in both alleles of both T).
  • CT base 1910 is a heterozygote of the C allele and T allele
  • CC base 1019 is a homozygote of both C alleles
  • the connexin 37 (1019C ⁇ T) polymorphism It is determined whether the genotype of the nucleic acid sample is either TT or CT or CC. Similarly, if the TNFcz (-863C ⁇ A) polymorphism is either AA or CA, CC, or NADH / NADPH-old oxidase p22 fox (242C ⁇ T) polymorphism.
  • TT or CT, or CC AA if angiotensinogen (-6G ⁇ A) polymorphism, or GA or GG, E-219 (-219G ⁇ T) polymorphism is TT, GT or GG, or PAF acetylhydrolase (994G ⁇ T) polymorphism is either TT or GT Or GG, Apo C-1 II (-482C ⁇ T) If the polymorphism is TT, or CT or CC, TSP4 (1186 G ⁇ C) If it is a type, it is either CC or GC, or it is GG, if it is a IL-10 (-819T ⁇ C) polymorphism, it is CC, or it is either CT or TT If the IL-10 (-592A ⁇ C) polymorphism is CC or CA or AA, or stromelysin 1 (-1171 / 5A-6A) polymorphism is 6A / 6A or 5A / 6A, or 5A
  • the diagnosis method of the present invention enables the evaluation of the risk of developing myocardial infarction, the recognition of having myocardial infarction, or the grasp of symptoms. Among them, the ability to evaluate the risk of development is of great clinical significance. Knowing the risk of development in advance contributes to the primary prevention of myocardial infarction and enables appropriate precautionary measures to be taken.
  • the information obtained by the diagnostic method of the present invention can be used for selection of an appropriate treatment method, improvement of prognosis, improvement of patient Q0L (Quality of Life), or reduction of onset risk. .
  • the diagnostic method of the present invention By periodically executing the diagnostic method of the present invention, the risk of developing myocardial infarction and the like can be monitored. As a result of such monitoring, if there is a correlation between an external factor (environmental factor, administration of a drug, etc.) and an increase in the risk of onset, the external factor is identified as a risk factor, Based on this information, it is considered possible to reduce the risk of onset.
  • myocardial infarction can be treated (including prophylactic treatment).
  • the polymorphism to be analyzed is a genotype that increases the risk of developing myocardial infarction
  • a gene having a genotype with a low risk of developing is introduced into a living body. If expressed, the expression of the gene can be expected to reduce symptoms, suppress the onset of disease, and reduce the risk of onset.
  • a similar therapeutic effect can be expected by introducing an antisense strand to the mRNA of a gene having a genotype with a high risk of onset and suppressing the expression of the mRNA.
  • the gene or antisense strand can be introduced by, for example, a method using a plasmid for gene introduction or a virus vector, an electoral poration (Potter, ⁇ ⁇ et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81, 7161-7165 (1984)), ultrasonic microbubbles (Lawrie, A., et al. Gene Therapy 7, 2023-2027 (2000)), lipofection (Fe Igner, PL et a, Proc. Nat I. Acad. Sci. USA 84, 7413-7417 (1984)), microinjection (Graessmann, M. & Graessmann, A., Proc. Natl. Acad.
  • a second aspect of the present invention provides a kit (a kit for detecting a genotype or a kit for diagnosing myocardial infarction) used in the above-described detection method or diagnostic method of the present invention.
  • a kit includes a nucleic acid (polymorphism analysis nucleic acid) for analyzing two or more polymorphisms selected from the group consisting of the polymorphisms (1) to (10) above. .
  • a nucleic acid for analyzing two or more polymorphisms selected from the group consisting of the polymorphisms of the above (11) to (15) is included.
  • a kit comprises a nucleic acid for analyzing the polymorphism of the above (15).
  • Nucleic acids for polymorphism analysis are analyzed using the analysis method to which they are applied (eg, the above-mentioned method using PCR using an allyl-specific nucleic acid, PCR-RFLP method, PCR-SSCP, TaqMan-PCR method, Invader method, etc.).
  • the DNA region containing the polymorphic portion to be analyzed or the mRNA corresponding thereto is specifically designed to be amplified (primer) or specifically detected (probe).
  • the kit provided in the present invention will be described. It does not contain two or more nucleic acids selected from the group consisting of the following (1) to (10) Genotype detection kit,
  • a nucleic acid having a sequence complementary to the partial DNA region containing the 101-position 9 base of the connexin 37 gene whose 101-position 9 base is C, or a connexin 37 gene whose T-position is 101 T A nucleic acid having a sequence complementary to the partial DNA region containing the 101-position 9 base,
  • nucleic acid having a sequence complementary to the partial DMA region containing the ⁇ 863 base of the tumor necrosis factor ⁇ gene where the ⁇ 863 base is C, or the tumor necrosis factor ⁇ gene where the ⁇ 863 base is A A nucleic acid having a sequence complementary to a portion containing a base at position ⁇ 863 of a child D ⁇ ⁇ region,
  • nucleic acid having a sequence complementary to a partial DNA region containing the -219 base of the apolipopin E gene in which the -219 base is T
  • apolipoprotein having a base at position -482 C A nucleic acid having a sequence complementary to the partial DNA region containing the base at position -482 of the C-MI gene, or apolipoprotein having a base at position -482 at position T A nucleic acid having a sequence complementary to the partial DNA region containing the base at position ⁇ 482 of the C-III gene, (8) A nucleic acid having a sequence complementary to the DNA region containing the base at position 1186 of the thrompospondin 4 gene in which the base at position 1186 is G, or A nucleic acid having a sequence complementary to the partial DNA region containing the 1186 base,
  • two or more nucleic acids are selected from the group consisting of (1) to (10) to form a kit.
  • two or more nucleic acids (1) to (10) are arbitrarily selected to form a kit.
  • a kit may be formed by selecting two or more nucleic acids from such a group.
  • a group consisting of (1), (5), (6), (8), (9), and (10) (a nucleic acid for analyzing a polymorphism having an odds ratio of 1 or more in Examples described later).
  • a kit consisting of (1), (5), (6), (8) and (9) can be selected by selecting at least two lini nucleic acids to form a kit.
  • a nucleic acid for analyzing polymorphisms up to position 5) A kit can be constructed by selecting two or more nucleic acids.
  • a genotype detection kit comprising two or more nucleic acids selected from the group consisting of the following (11) to (15):
  • a nucleic acid having a sequence complementary to the partial DMA region including the 1018 base of the glycoprotein Iba gene having the C base at position 1018, or the 1018 base of the daricopeptide tin Iba gene having the T base at position 1018 is T
  • (14) Includes a nucleic acid having a sequence complementary to the partial DNA region containing base 584 of the paraoxonase gene whose base 584 is G, or base 584 of the para-xonase gene whose base 584 is A A nucleic acid having a sequence complementary to the partial DMA region; and
  • a nucleic acid having a sequence complementary to the partial DNA region containing the base at position 4070 of the apolipoprotein E gene having base C at position 4070, or base 4040 of the apolipoprotein E gene having base T at position 4070 A nucleic acid having a sequence complementary to a partial DNA region containing '
  • two or more nucleic acids are selected from the group consisting of (11) to (15) to form a kit.
  • the kit may be constituted by selecting two or more nucleic acids from such a group.
  • a group consisting of (11), (12), (14), and (15) (a nucleic acid for analyzing a polymorphism having an odds ratio of 1 or more in the examples described later).
  • a kit is selected by selecting a set, and a group consisting of (11), (12), and (15) (in the examples described below, for analyzing the top three polymorphisms by young Jt).
  • a nucleic acid) can be used to construct a kit by selecting two or more nucleic acids.
  • a genotype detection kit comprising the following nucleic acids:
  • a nucleic acid having a sequence complementary to the partial DNA region containing the base at position 4070 of the apolipoprotein E gene in which the base at position 4070 is C, or the base at position 4070 of the apolipoprotein E gene in which the base at position 4070 is T A nucleic acid having a sequence complementary to a partial DNA region containing the nucleic acid.
  • a genotype detection kit comprising two or more nucleic acid sets selected from the group consisting of the following (1) to (10):
  • nucleic acid set designed to specifically amplify a partial DMA region containing a base
  • the partial DNA region containing the ⁇ 6 base of the angiotensinogen gene is specifically identified. Only when the ⁇ 6 base of the angiotensinogen gene in the nucleic acid set or the nucleic acid sample designed to amplify the DNA is A, the partial DMA region containing the ⁇ 6 base of the angiotensinogen gene Nucleic acid set designed to specifically amplify
  • the partial DNA region containing the ⁇ 219 base of the apolipoprotein tin E gene can be specifically amplified. Only when the ⁇ 219 base of the apolipoprotein E gene in the nucleic acid set or the nucleic acid sample designed in the above is T, the partial DNA region containing the ⁇ 219 base of the apolipoprotein E gene is deleted. Nucleic acid sets designed to specifically amplify,
  • nucleic acid sets designed to are C, the partial DMA region containing the -819 base of the interleukin 10 gene is specifically amplified.
  • nucleic acid set designed to amplify nucleic acids is constructed by selecting two or more nucleic acid sets from the group consisting of (1) to (10), but two or more of (1) to (10) are arbitrarily selected.
  • a kit may be formed by selecting two or more nucleic acid sets from the group. For example, a group consisting of (1), (5), (6), (8), (9), and (10) (to analyze polymorphisms with an odds ratio of 1 or more in the examples described below). Two or more nucleic acid sets are selected from the nucleic acid set to form a kit, or a group consisting of (1), (5), (6), (8) and (9) (described later) In this embodiment, a kit can be formed by selecting two or more nucleic acid sets for analyzing polymorphisms having the top five odds ratios.
  • a genotype detection kit comprising two or more nucleic acid sets selected from the group consisting of the following (11) to (15):
  • Plasminogen activator inhibitor inhibitor in the nucleic acid sample The plasminogen activator inhibitor inhibitor is present only when there are four consecutive G's in the 3 'direction from position -668 in the gene.
  • a kit is configured by selecting two or more nucleic acid sets from the group consisting of (11) to (15). However, two or more of ( ⁇ ) to (15) can be arbitrarily selected.
  • two or more sets of nucleic acids may be selected from the group to form a kit.
  • two or more groups (11), (12), (14), and (15) (a nucleic acid set for analyzing a polymorphism having an odds ratio of 1 or more in the examples described later)
  • a kit can be constructed by selecting a nucleic acid set, or a group consisting of (11), (12), and (15) (to analyze polymorphisms with the highest odds ratio of 3 in the examples described below). More than two nucleic acid sets can be selected to form a kit.
  • a genotype detection kit comprising the following nucleic acid set:
  • a genotype detection kit comprising two or more nucleic acid sets selected from the group consisting of the following (1) to (10):
  • a nucleic acid set comprising: an antisense primer that specifically hybridizes to, and a sense primer that specifically hybridizes to a partial region of the tumor necrosis factor ⁇ gene;
  • NADH / NADPH A nucleic acid set designed to specifically amplify the partial DNA region containing the base at position 242 of the human psidase gene, and wherein the base at position 242 is C.
  • Antisense primer specifically hybridizing to the partial DMA region containing the -863 base in the NADPH-old oxidase p22 fox gene and / or NADH / NADPH old oxidase p22 fox that has a T at position 242
  • Nucleic acid set designed to specifically amplify the partial DMA region containing the 6-position base of the angiotensinogen gene,-In the angiotensinogen gene whose 6-position base is G-
  • An antisense primer that specifically hybridizes to a partial DNA region containing a base at position 6 and / or a partial DNA region containing a base at position 6 in an angiotensinogen gene having base A at position A;
  • a nucleic acid set comprising: an antisense primer that specifically and specifically hybridizes to a region; and a sense primer that specifically hybridizes to a partial region of the angiotensinogen gene.
  • Apolipoprotein E which is a nucleic acid set designed to specifically amplify a partial DNA region containing the ⁇ 21 9th base of the apolipoprotein E gene, wherein the ⁇ 21 9th base is G
  • a nucleic acid set comprising: a sense primer that specifically hybridizes to, and an antisense primer that specifically hybridizes to a partial region of the apolipoprotein E gene;
  • Apolipoprotein C which is a nucleic acid set designed to specifically amplify a partial DNA region containing the -482 base of the apolipoprotein C-1 II gene, wherein the -482 base is C. -1 Part of the DMA region containing the -482 base in the II gene, a sense primer that specifically hybridizes to and a part containing the -482 base in the apolipoprotein C-III gene in which the Z or -482 base is T
  • a nucleic acid set comprising: a sense primer that specifically hybridizes to a DNA region, and an antisense primer that specifically hybridizes to a partial region of the apolipoprotein C-III gene.
  • An antisense primer that specifically hybridizes to a partial region of
  • a nucleic acid set comprising: a sense primer that specifically hybridizes to a partial DMA region containing a base, and an antisense primer that specifically hybridizes to a partial region of the interleukin 10 gene. as well as
  • a nucleic acid set comprising: an antisense primer that specifically hybridizes to a region, and a sense primer that specifically hybridizes to a partial region of the interleukin 10 gene.
  • two or more nucleic acid sets are selected from the group consisting of (1) to (10) to constitute a kit.
  • two or more nucleic acid sets (1) to (10) may be arbitrarily selected.
  • Select to group, or A kit may be constructed by selecting two or more nucleic acid sets from such a group.
  • a group consisting of (1), (5), (6), (8), (9), and (10) for analyzing polymorphisms having an odds ratio of ⁇ or more in the examples described later).
  • (Nucleic acid set) A group consisting of (1), (5), (6), (8), and (9), which is a kit consisting of more than two nucleic acid sets selected (see below).
  • a kit can be constructed by selecting more than two nucleic acid sets (a nucleic acid set for analyzing polymorphisms having the top five odds ratios).
  • a genotype detection kit comprising two or more nucleic acid sets selected from the group consisting of the following (11) to (15):
  • a nucleic acid set comprising: an antisense primer that specifically hybridizes to
  • a set of primers designed to specifically amplify the partial DNA region including the polymorphic portion at position -668 of the plasminogen activator inhibitor-1 gene, and -668 A probe and / or a probe that specifically hybridizes to a partial DNA region containing the sequence portion in the plasminogen activator inhibitor 1 gene, in which four Gs are continuously present in the 3 ′ direction from -A probe that specifically hybridizes to a partial DNA region containing the sequence portion in the plasminogen activator inhibitor-1 gene in which five Gs are consecutively present in the 3 'direction from position 668,
  • a nucleic acid set consisting of (13) Glycoprotein Ibex gene which is a nucleic acid set designed to specifically amplify the partial DMA region containing the 1018th base of the glycoprotein Iba gene, wherein 101-8th base is C In the partial DMA region containing the base at position 1018, a sense primer specifically hybridizing to and the partial DNA region containing the base at position 1018 in the dalico
  • a nucleic acid set comprising: a sense primer that hybridizes specifically and specifically; and an antisense primer that hybridizes specifically to a partial region of the paraoxonase gene; and
  • kits are configured by selecting two or more nucleic acid sets from the group consisting of (11) to (15), but two or more of (11) to 5) may be arbitrarily selected.
  • a kit may be constructed by selecting two or more nucleic acid sets from such a group. For example, a group consisting of (11), (12), (14), and (15) (a nucleic acid set for analyzing a polymorphism having an age ratio of 1 or more in Examples described later)
  • a kit is selected by selecting a nucleic acid set, or a group consisting of (11), (12), and (15) (a nucleic acid for analyzing polymorphisms whose odds ratio is the top three in the examples described below).
  • Set More than one nucleic acid set can be selected to form a kit.
  • a genotype detection kit comprising the following nucleic acid set:
  • a sense primer that specifically hybridizes to the partial DMA region, and a sense primer that specifically hybridizes to the partial DNA region containing the 4070 base in the apolipoprotein E gene where the Z or 4070 base is T A nucleic acid set comprising: and an antisense primer that specifically hybridizes to a partial region of the apolipoprotein E gene.
  • a genotype detection kit comprising two or more nucleic acid sets selected from the group consisting of the following ( ⁇ to do);
  • a partial region containing a base corresponding to the base at position 101-9 is specifically hybridized to and labeled with the first labeling substance. Specifically hybridized to the first nucleic acid and a partial region containing a base corresponding to the 1019 base in the antisense strand of the connexin 37 gene in which the 1019 base is ⁇ , and a second labeling substance.
  • nucleic acid set Specifically hybridizes to the labeled second nucleic acid and to a part of the sense strand of the connexin 37 gene And a third nucleic acid which is used together with the first nucleic acid and / or the second nucleic acid and capable of specifically amplifying a partial DNA region containing the base at position 109 of the connexin 37 gene.
  • nucleic acid set comprising: a third nucleic acid that can be used together with the nucleic acid to specifically amplify a partial DNA region containing the 242th base of the NADH / NAD PH oxidase p22 fox gene;
  • the first nucleic acid specifically hybridized to the partial region containing the -6th base and labeled with the first labeling substance And a specific region that hybridizes to the partial region containing the -6 base in the sense strand of the angiotensinogen gene in which the -6 base is A.
  • a nucleic acid set comprising: a third nucleic acid that can be used to specifically amplify a partial DNA region containing the ⁇ 6 base of the angiotensinogen gene;
  • the antisense strand of the apolipoprotein E gene in which the -219th base is G it specifically hybridizes to the partial region containing the base corresponding to the -219th base.
  • a first nucleic acid labeled with the first labeling substance, and a partial region containing a base corresponding to the -219 base in the antisense strand of the apolipoprotein E gene in which the -219 base is T A second nucleic acid specifically hybridized to the first nucleic acid and a second nucleic acid labeled with a second labeling substance; and a second nucleic acid specifically hybridized to a partial region of a sense strand of an apolipoprotein E gene and Or a third nucleic acid used together with the second nucleic acid and capable of specifically amplifying a partial DMA region containing the -219 base of the apolipopin tin E gene, and a nucleic acid set comprising:
  • a nucleic acid set comprising: a third nucleic acid that can be used to specifically amplify a partial DMA region containing the base at position 1186 of the thrombosbondin 4 gene;
  • the first nucleic acid that specifically hybridizes to a partial region containing the base corresponding to base -81 at position 9 A nucleic acid that specifically hybridizes to a partial region containing a base corresponding to the ⁇ 81 9th base in antisense synthesis of the interleukin 10 gene in which the ⁇ 81 9th base is C. And specifically hybridize to a partial region of the sense strand of the 0 gene, and combine with the first nucleic acid or the second nucleic acid.
  • a third nucleic acid that can be used together to specifically amplify a partial DMA region containing the -819 base of the interleukin 10 gene, and a nucleic acid amplified using the first nucleic acid and the third nucleic acid
  • a nucleic acid set comprising: a fourth nucleic acid that specifically hybridizes to a nucleic acid; and a fifth nucleic acid that specifically hybridizes to a nucleic acid amplified using the second nucleic acid and the third nucleic acid.
  • nucleic acid set comprising: a third nucleic acid capable of specifically amplifying a partial DMA region containing the 592th base;
  • two or more nucleic acid sets are selected from the group consisting of (1) to (10) to constitute a kit.
  • a kit may be formed by selecting two or more nucleic acid sets from such a group. For example, a group consisting of (1), (5), (6), (8), (9), and (10) (to analyze polymorphisms with an odds ratio of 1 or more in the examples described below).
  • kits Two or more nucleic acid sets are selected from the nucleic acid set to form a kit, or a group consisting of (1), (5), (6), (8) and (9) (described later)
  • a kit can be constructed by selecting two or more nucleic acid sets from the nucleic acid sets for analyzing polymorphisms with the highest odds ratio of 5).
  • a genotype detection kit comprising two or more nucleic acid sets selected from the group consisting of the following ( ⁇ ) to (15): (Specifically hybridizes to a partial region containing a sequence corresponding to the sequence portion in the antisense strand of the stromelysin 1 gene in which five consecutive As are present in the 3 ′ direction from position 1D-1171.
  • a set of nucleic acids designed to specifically amplify a partial DNA region containing a polymorphic portion at position ⁇ 668 of the plasminogen activator inhibitor-1 gene
  • the plasminogen activator inhibitor 1 gene in which four G's are present continuously in the 3 'direction from position -668 to the ⁇ type, and specifically for nucleic acids amplified using the set of nucleic acids.
  • the third nucleic acid to be hybridized, and the plasminogen activator inhibitor 1 gene in which five Gs are present continuously in the 3 ′ direction from position ⁇ 668 to the ⁇ gene and amplified using the set of nucleic acids A fourth nucleic acid specifically hybridizing to the nucleic acid to be prepared, and a nucleic acid set comprising:
  • a nucleic acid set comprising: a third nucleic acid that can be used to specifically amplify a partial DNA region containing the base at position 108 of the daricoprotein Ibex gene;
  • a partial region containing a base corresponding to the base at position 584 is specifically hybridized and is labeled with the first labeling substance.
  • a nucleic acid set consisting of: a third nucleic acid capable of specifically amplifying a partial DMA region containing the base at position 584; and
  • the antisense strand of the apolipoprotein E gene in which the base at position 4070 is C it specifically hybridizes to the partial region containing the base corresponding to base 4070 and is labeled with the first labeling substance. Specifically hybridized to the labeled first nucleic acid and a partial region containing a base corresponding to the 407D-base in the antisense strand of the apolypopin tin E gene in which the 4070-base is T, and Specifically hybridizing to a second nucleic acid labeled with a second labeling substance and a partial region of a sense strand of an apolipoprotein E gene, and used together with the first nucleic acid or the second nucleic acid. And a third nucleic acid capable of specifically amplifying a partial DNA region containing the base at position 4070 of the polypoprotein E gene.
  • two or more nucleic acid sets are selected from the group consisting of ( ⁇ ) to (15) to form a kit, but two or more of (11) to (15) are optional.
  • a kit may be formed by selecting two or more nucleic acid sets from such a group. For example, a group consisting of (11), (12), (14) and (15) (a nucleic acid set for analyzing a polymorphism having an odds ratio of 1 or more in the examples described later) Two or more nucleic acid sets 3477
  • a kit can be constructed by selecting two or more nucleic acid sets.
  • a genotype detection kit comprising the following nucleic acid set:
  • Position 4070 of the apolipoprotein E gene which specifically hybridizes to the second nucleic acid and to a partial region of the sense strand of the apolipoprotein E gene and is used together with the first nucleic acid and / or the second nucleic acid.
  • a nucleic acid set comprising: a third nucleic acid capable of specifically amplifying a partial DNA region containing bases;
  • one or more reagents buffers, reaction reagents, detection reagents, etc.
  • buffers buffers, reaction reagents, detection reagents, etc.
  • PubMed [l ⁇ la ti ona I Center for Biological Information (NCBI)], Online Mende Iian inheritance in Men (NCBI), Single Nucleotide Polymorphism (NCB Among the genes reported so far, vascular biology, platelet ⁇ leukocyte biology, coagulation and fibrinolysis, lipid ⁇ sugar ⁇ other metabolic factors, and other aspects of coronary atherosclerosis, coronary artery spasm, hypertension, diabetes, Is likely to be linked to hyperlipidemia, etc. Selected 71 genes were extracted.
  • the subjects were 5061 Japanese males and females (3309 males and 1752 females) who visited 15 outpatient facilities or were hospitalized between July 1994 and December 2001.
  • Myocardial infarction occurred in 2819 patients (2003 in males, 816 in females), and coronary angiography and left ventricular angiography were performed in all cases.
  • Diagnosis of myocardial infarction was made based on typical ECG changes and elevated serum CK, G0T, and LDH.
  • a definitive diagnosis of myocardial infarction was made based on wall motion abnormalities due to left ventricular angiography and corresponding stenosis of the left main artery or major coronary artery.
  • the DMA fragment containing the polymorphic site may be prepared using one aryl-specific sense primer and an antisense primer labeled at the 5 'end with bitin, or with the sense primer 5'. Amplification was performed by PCR using an antisense primer labeled at the end with biotin.
  • the reaction solution 25 L contained 20 ng of DNA, 5 pmol of each primer, 0.2 rel / L of each of dexyl nucleoside triphosphates (dATP, dGTP, dCTP, dTTP), and 4 mmol / MgCl. 2, 1 U of DNA polymerase Ichize (rTaq or KODplus; Toyobo, Osaka, Japan), with using each DNA polymerase buffer.
  • the amplification protocol is 95C for 5 minutes for initial denaturation; 95 ° C for 30 minutes for 35-45 cycles, 30 minutes for annealing, 30 seconds at 55-67.5 ° C, 30 seconds for extension at 72 ° C, and final extension. Two minutes at 72 ° C.
  • the amplified DMA was incubated at room temperature in a solution containing streptavidin-bound magnetic beads in each well of a 96-well plate. Place this plate on a magnetic stand, collect the supernatant from each well, transfer it to each well of a 96-well plate containing 0.01 M NaOH, and excite F1TC with a microplate reader.
  • TxR measured fluorescence at excitation and emission wavelengths of 584 and 612 nm.
  • amplified DNA was denatured with 0.3 M NaOH, and any of the aryl-specific capture probes immobilized on the bottom of each well of a 96-well plate and 35-4 (U-formamide) were used. Hybridization was carried out for 30 minutes at 37 ° C with a hybridization buffer containing the gel. Thereafter, alkaline phosphatase-conjugated streptavidin was added to each well, and the plate was shaken at 37 ° C for 15 minutes.
  • the genotypes determined by the aryl-specific primer / probe measurement system were the same as those determined by the PCR-restriction fragment length polymorphism method or the DMA sequencing method.
  • Statistical analysis was performed as follows: First, the data were shown as the average soil standard deviation. The data were compared using unpai red S tudent 'st test or Mann- «l h itney U test. Data between three groups ( ⁇ one-way analysis of variance or Kruska II Mia II is tes t The qualitative data were tested by the chi-square test, and the frequency was determined by the gene counting method, deviating from the Hardy-einberg equil ibrium.
  • Each genotype was dominant, recessive, recessive, and additive. Analyzed by heat transfer model, it was calculated P-value, old Tsu's ratio, 95% confidence interval (CI).
  • logistics The heads ratio for each genotype was calculated by the stepwise forward selection method of regression analysis. '
  • Figure 5 shows the background data of 909 cases (451 men and 458 women) for which screening-related analysis was performed by the above method.
  • men age, BMI, and the frequency of conventional risk factors for coronary artery disease, such as smoking, hypertension, diabetes, hypercholesterolemia, and hyperuricemia, were significantly lower than those between myocardial infarction and control groups. No significant difference was observed.
  • age, BMI, and frequency of hypertension, hypercholesterolemia, and hyperuricemia were not significantly different between myocardial infarction and control groups, but the frequency of smoking and diabetes was not significant. The value was significantly higher in the myocardial infarction group than in the control group.
  • FIG. 7 shows the background data of all 5061 cases (3309 males and 1752 females) in the large-scale association analysis.
  • males there was no significant difference in age, BMI, and frequency of smoking between the myocardial infarction group and the control group.However, hypertension and hyperuricemia were significantly lower in the myocardial infarction group than in the control group. The frequency of diabetes and hypercholesterolemia was significantly higher in the myocardial infarction group than in the control group.
  • FIGS. 8 and 9 The distribution of genotypes and the results of oral regression analysis for these SNPs are shown in FIGS. 8 and 9, respectively.
  • a stepwise forward selection ion method of multi-factor oral regression analysis was performed (FIG. 10).
  • a dominant or recessive genetic model was adopted based on the / 3 value of each SNP shown in FIG. 9 in relation to myocardial infarction.
  • the loci on the chromosome of these genes are shown in FIG.
  • the -819T ⁇ C polymorphism and -592A ⁇ C polymorphism of the interleukin 10 (Interleukin-10) gene were in equilibrium with each other [pa i rwise l inkage disequi l ibrium coeff i ci ent, D (> / D fflax ), of 0.406; standard ized linkage disequil ibrium coefficient, r, of 0.396; P ⁇ 0.0001, ch sq uare test].
  • Tumor necros is factor- a gene and platelet activity
  • the loci of the platelet-acting factor acety I hydrolase gene were close to each other, but no association was found in the genotype distribution of both polymorphisms.
  • the plasminogen activator inhibitor-1 (gene) gene and the para-raoxonase 1E gene are close to each other, but the genotype distribution of both polymorphisms is No association was found.
  • Figs. 11 and 13 (A) The odds ratio of myocardial infarction due to the combination genotype calculated by the stepwise forward selection method is shown in Figs. 11 and 13 (A) for males and Figs. 12 and 13 (B) for females. Show.
  • 5 SNPs TSP4 (1186G ⁇ C) polymorphism
  • connexin 37 (1019 C ⁇ T) polymorphism
  • angiotensinogen -6G—A Combination genotype of polymorphism and tumor necrosis factor ⁇ (-863C ⁇ A) polymorphism
  • 5 SNPs apoE (4070C ⁇ T) polymorphism, glycoprotein I ba (1 018C ⁇ T) polymorphism, stromelysin 1 (-U71 / 5A ⁇ 6A) polymorphism, PAI ⁇ (- The combination genotype of the 668 / 4G ⁇ 5G) polymorphism and the paraoxonase (584G ⁇ A) polymorphism resulted in a maximum age ratio of 88.51 (see FIGS. 12 and 13 (B)).
  • the present inventors examined the association between 112 polymorphisms selected from 71 candidate genes and myocardial infarction, and conducted a large-scale association analysis of 5061 cases to find that 10 SNPs associated with myocardial infarction 5 were identified.
  • a stepwise forward selection method of multifactorial logistic regression analysis was used to assess the risk of myocardial infarction (maximum odds ratio 11.26 for males and 88.51 for females). Diagnostic system).
  • the main cause of myocardial infarction is atherosclerotic coronary artery disease, which causes significant hemodynamic narrowing of the inner diameter of the artery, causes abnormal regulation of vasoconstriction and expansion, rupture of atherosclerotic lesions and thrombosis Facilitates formation.
  • the present inventors selected 71 candidate genes based on comprehensive viewpoints such as vascular biology, platelet / leukocyte biology, coagulation, fibrinolytic system, lipid / sugar / other metabolic factors. Indeed, the genes associated with myocardial infarction had diverse roles in the pathogenesis.
  • Vascular biology (connexin 37, NADH / NADPH oxidase p22 phox, and trombospond in 4), vascular inflammation (tumor necrosis factor-a, piate I et-act i vat ng factor acety I hydro I ase, and interleukin-10), hypertension (ang io tens i nogen), lipid metabolism (apo 1 i popro.te in E and C-III and paraoxonase), platelet metabolism (glycoprotein ⁇ b) substrate metabolism (stromelysin-1) ) And fibrinolytic system (PA 1-1) (Boerma M, Forsberg L, van Zei j IL, eta I.A genetic polymorphism in conne in 37 as a prognostic marker for atherosclerot ic plaque development.J Intern Med 1999; 246: 211-218., I noue N, Ka ash ima S, Kanaza a, Yamada S
  • a total of 179,402 genotypes were determined from 112 gene polymorphisms in 909 patients, 19 SNPs in 2858 males, and 18 SNPs in 1294 females. This genotyping number is the largest among the polymorphism association analyzes reported so far.
  • the method of diagnosing risk of myocardial infarction shown in the above example showed a maximum odds ratio of 11.26 for men and 88.51 for women, which is also the largest odds ratio among large-scale related prayers reported so far. It is.
  • Apolipoprotein E is a major component of chylomicron and very low density lipoprotein (VLDL) remnants, and is a ligand for uptake of these lipoproteins by receptors in the liver.
  • VLDL very low density lipoprotein
  • 158Cys ( ⁇ 2) aryl of the apolipoprotein E gene causes abnormal binding of remnant lipoprotein to liver receptors (Schneider J, Kovanen P, Brown MS, et al. Fain iI ia I dysbetal ipoproteinemia Abnormal binding of mutant apo I i poprote in E to low dens ity l ipoprotein receptors of human f ibroblasts and membranes f rom l iver and adrenal of rats, rabbi ts, and cows .J Cl in Invest 1981; 68 : 1075- 1085 ⁇ ), resulting in delayed removal from plasma (Gregg RE, Zech LA, Schaefer EJ, Brewer HB Jr.
  • Type III hyperl ipoproteinemia defect ive metabol ism of an abnormal apo I i poprote in E. Science) 1981; 211 ⁇ ⁇ 584-586.). Many patients with familial dysbeta I ipoproteinemia (FD or type III hyperlipoproteinemia) are homozygous for the Arg158 Cys polymorphism (Bres low JL, Zannis VI, SanGiacomo TR, Thi rd JL, Tracy T, GI ueck CJ. Studies of family type III hyperl ipoproteinemi a us i ng as a genet ic marker the apo E pheno type El / 2.
  • SNPs studied in the above examples may be in linkage disequilibrium with SNPs of genes that are closely related to the occurrence of myocardial infarction in the vicinity.
  • nine genes in men and five genes in women were shown to be myocardial infarction susceptibility loci in Japanese.
  • combination genotypes have enabled highly reliable and predictive risk diagnosis. From this, it is expected that the diagnostic method of the present invention can contribute to primary prevention of myocardial infarction, improvement of the quality of life of middle-aged and elderly people, and reduction of medical expenses.
  • the present invention is not limited to the description of the embodiment and the example of the above invention. Various modifications are included in the present invention without departing from the scope of the claims and within the scope of those skilled in the art. The following items are disclosed below.
  • a method for detecting the genotype of a nucleic acid sample comprising the following steps (al): (aD analyzing the following polymorphisms (1) to (10) in a nucleic acid sample;
  • a method for detecting the genotype of a nucleic acid sample comprising the following steps (bl): (bl) a step of analyzing the following polymorphisms (11) to (15) in the nucleic acid sample;
  • a method for diagnosing risk of myocardial infarction comprising the following steps (l) to (III):
  • tumor necrosis factor ⁇ gene base number-polymorphism at position 863
  • polymorphism at base number 994 of the platelet activating factor acetylhydrolase gene (7) polymorphism at base number -482 of the apolipoprotein C-1II gene,
  • a method for diagnosing risk of myocardial infarction comprising the following steps (IV) to (VI):
  • a genetic polymorphism associated with myocardial infarction is analyzed, and the genotype of a nucleic acid sample is detected.
  • the present invention is an effective means to know in advance the risk of developing myocardial infarction.
  • auxiliary information useful for diagnosis of these diseases can be obtained, and more appropriate treatment can be performed, and the prognosis can be improved.
  • the present invention is expected to provide effective information for elucidating the pathogenic mechanism of myocardial infarction and to contribute to the prevention and treatment of myocardial infarction.

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Abstract

　高精度で予知確率の高い心筋梗塞のリスクを診断する手段を提供する。以下の工程を含んでなる方法により心筋梗塞のリスク診断を行う。(i)心筋梗塞との関連が認められた10個の遺伝子多型、又は5個の遺伝子多型から二つ以上の多型を解析する工程、(ii)前記工程によって得られる多型情報から核酸試料の遺伝子型を決定する工程、及び(iii)決定された遺伝子型から心筋梗塞の遺伝的リスクを求める工程。

Description

明 細 書 心筋梗塞のリスク診断方法 技術分野
本発明は心筋梗塞に関連する遺伝子を利用した検出方法に関する。 詳しくは、 心筋梗塞に関連する複数の遺伝子の多型を利用した検出方法及び該方法に用いら れるキッ トに関する。 本発明は、 例えば心筋梗塞のリスク診断に利用できる。 背景技術
心筋梗塞は多因子疾患であり、 個人個人の遺伝的背景とさまざまな環境因子の 相互作用により発症が規定される （Marenberg ME, Risch , Berktnan LF, Floderus B, de Fa i re U. Genet ic suscept i bi l i ty to death f rom coronary heart di sease in a study of twins. N Engl J Med 1994 ; 330 : 1041-1046. , Nora J J, Lortscher RH, Spangler RD, Nora AH, K i mbe r I i ng J . Gene t i c-ep i dem i o I og i c study of early— onset ischemic heart disease. Ci rcul at ion 1980 ; 61 : 503— 508. )。 一般 β勺 に心筋梗塞の発症率は高血圧 ·糖尿病 ■ 高脂血症などの従来の危険因子の数に比 例して高くなる （Nora」J， Lortscher RH, Spangler RD, Nora AH, Kimberl ing WJ. Gene t i c-ep i dem i o I og i c study of early - onset ischemi c heart disease. Ci rculat ion 1980 ; 61 : 503-508. )„ これらの危険因子自体も一部は遺伝的要因によ り制御されているが、 家族歴が独立した心筋梗塞の予知因子であることから、 従 来の危険因子以外にも心筋梗塞感受性因子が存在することが示唆されている ( Marenberg ME, Risch , Berktnan LF, Floderus B, de Fa i re U. Genet ic suscept i bi l i ty to death f rom coronary heart disease in a study of twins. N Engl J Med 1994 ; 330 : 1041-1046. ) 0 さらに、 従来の危険因子を全く持たなくても 心筋梗塞を発症する例があることも、 遺伝因子との関連を示唆する。 心筋梗塞は欧米諸国において最も死亡率の高い疾患であり、 たとえ致死的では ないにしても、 心不全や狭心症■ 難治性不整脈を合併し患者の生活の質を著しく 低下させるため、 これを予防することが重要であることは言うまでもない。 心筋 梗塞を予防するための一つの方法は心筋梗塞感受性遺伝子を同定することである c 連鎖解析 (Broecke I U, Hengstenberg C, Mayer B， e t a I . A comprehensive I i nkage analysis for myocardial infarction and i ts related risk factors. N ature genet 2002;30:210-214. ) および候補遺伝子による関連解析（Cambien F， Poi rier 0， Lecer f し， e t aに Deletion polymorphism in the gene for angiot ens i n- convert i ng enzyme is a potent risk factor for myocardial infarctio n. Nature 1992;359:641-644. , Weiss EJ, Bray PF， Tayback M， et a A poly morphism of a platelet glycoprotein receptor as an inherited risk factor for coronary thrombosis. N Engl J Med 1996 ; 334 : 1090- 1094.、 1 acov i e I I o し， D i Casteinuovo A, De K n i j f f P， et a I . Polymorphisms in the coagulation factor VI I gene and the risk of myocardial infarction. N Engl J Med 199 8 ; 338 : 79 - 85.、 Ku i venhoven JA, Jukema JW， Zwi nderman AH， et aに The role of a common variant of the cholesterol ester transfer protein gene i n t h e progress ion of coronary atherosclerosis. N Engl J Med 1998； 338 : 86-93. ) により、 心筋梗塞と関連する染色体上の遺伝子座およびいくつかの候補遺伝子群 が同定された。 今までにゲノム疫学的研究によりアンギオテンシン変換酵素 （Ca mb i en F， Poi rier 0， Lecer f し et a I . Deletion polymorphism in the gene f or angi otens i n-convert i ng enzyme is a potent risk factor for myocardial infarction. Nature 1992 ; 359 : 641 -644. ) , 血小板糖タンパク I l ia (Weiss EJ, B ray PF， Tayback M, et a I . A polymorphism of a platelet glycoprotein rece ptor as an inheri ted ri sk factor for coronary thrombos is. N En l J Med 1 996;334: 1090-1094. ), 第 7血液凝固因子、 コレステロールエステル移送タンパク (Kuivenhoven JA, J ukema JW, Zw i nde rman AH, e t a I . The role of a common variant of the cholesterol ester transfer protein gene in the progress i o n of coronary atherosclerosis. N Engl J Med 1998 ; 338 : 86- 93. )などの遺伝'子 多型と心筋梗塞との関連が報告されているが、 相反する報告もあり、 未だ一定の 結論を得るに至っていない。 さらに、 異なる人種では異なるゲノム多型を有する ため、 それぞれの人種で多型と心筋梗塞との関連についてのデータベースを構築 することが重要である。 発明の開示
以上のように、 今までに数多くの遺伝子多型と冠動脈疾患あるいは心筋梗塞と の関連解析が行われてきた。 しかし多くの研究についてはその意義について一定 の見解は得られていない。 その主な理由は多くの研究における対象集団の大きさ が十分でないことと、 遺伝子多型のみならず環境因子が人種間で異なっているこ とに起因する。 さらに、 たとえ心筋梗塞との関連が認められたとしても、 大規模 集団における解析では相対危険度 （才ッズ比） が低いのが一般的である。
本発明は以上の背景に鑑みなされたものであって、 その目的は高精度で予知確 率の高い心筋梗塞の遺伝的リスクを診断する手段を提供し、 心筋梗塞の一次予防 に貢献することである。
本発明者らは、 以上の目的を達成するために数種類の公的データベースを用い て、 冠動脈硬化、 冠動脈攣縮、 高血圧、 糖尿病、 高脂血症などとの関連が推定さ れる 7Ί遺伝子を抜粋し、遺伝子の機能変化との関連が予想されるものなどを中心 に 112多型を選択した。 続いて、 この 71遺伝子 112多型に関して 5000例を越え る大規模関連解析を行った。 その結果、 心筋梗塞と関連する SNP (singl e nucl eo tide polymorphism)を男性で 10個、女性で 5個同定することに成功した。更に、 これらの多型を組み合わせて用いることにより、 多因子口ジスティック回帰分析 の stepwise forward selection によリ男性では最大才ッズ比 11.26、女性では最 大ォッズ比 88.51 を呈することが認められた。 この結果から、 これらの SMPの中 から複数の SNPを選択し、 各 SNPを解析した結果を組み合わせて用いれば、 信頼 性が高く、 予知確率の高い心筋梗塞のリスク診断が行えるとの知見が得られた。 一方で、 女性において心筋梗塞との関連が認められた 5個の SNPの中の一つにつ いては、 その多型を単独で解析することによつても極めて高い才ッズ比が得られ るものであった。 本発明は以上の知見に基づくものであって、 次の構成を提供す る。
[1 ] 以下の工程（a)を含んでなる、 核酸試料の遺伝子型を検出する方法、 — (a) 核酸試料における、 以下の（1)~ (10)からなるグループより選択される二 つ以上の多型を解析する工程、
(1)コネキシン 37遺伝子の塩基番号 1019位の多型、
(2)腫瘍壊死因子 0：遺伝子の塩基番号- 863位の多型、
(3) NADH/NADPH才キシダーゼ p22フォックス遺伝子の塩基番号 242位の多型、
(4)アンギオテンシノーゲン遺伝子の塩基番号- 6位の多型、
(5)ァポリポプロティン E遺伝子の塩基番号- 219位の多型、
(6)血小板活性化因子ァセチルヒドロラーゼ遺伝子の塩基番号 994位の多型、 ひ）アポリポプロテイン C- I I I遺伝子の塩基番号- 482位の多型、
(8) 卜ロンボスボンジン 4遺伝子の塩基番号 1186位の多型、
(9)インターロイキン 10遺伝子の塩基番号- 819位の多型、 及び
(10)インターロイキン 10遺伝子の塩基番号- 592位の多型。
[2] 以下の工程（b)を含んでなる、 核酸試料の遺伝子型を検出する方法、 (b) 核酸試料における、 以下の（11)~(15)からなるグループより選択される二 つ以上の多型を解析する工程、
(Π)ストロメライシン 1遺伝子の塩基番号- 1171位の多型、
(12)プラスミノ一ゲン活性化因子ィンヒビター 1遺伝子の塩基番号 - 668位の 多型、
(13)グリコプロテイン Iba遺伝子の塩基番号 1018位の多型、
(14)パラ才キソナーゼ遺伝子の塩基番号 584位の多型、 及び
(15)ァポリポプロティン E遺伝子の塩基番号 4070位の多型。
[3] 以下の工程（c)を含んでなる、 核酸試料の遺伝子型を検出する方法、 (c) 核酸試料における、 アポリポプロテイン E遺伝子の塩基番号 4070位の多 型を解析する工程。
[4] 以下の工程（i)~(i i i)を含んでなる、 心筋梗塞のリスク診断方法、
(i)核酸試料における、 以下の（1)〜 0)からなるグループより選択される二つ 以上の多型を解析する工程、
(1)コネキシン 37遺伝子の塩基番号 1019位の多型、
(2)腫瘍壊死因子 0：遺伝子の塩基番号- 863位の多型、
(3) NADH/NADPH才キシダ一ゼ p22フォックス遺伝子の塩基番号 242位の多型、
(4)アンギオテンシノ一ゲン遺伝子の塩基番号- 6位の多型、
(5)アポリポプロテイン E遺伝子の塩基番号- 219位の多型、
(6)血小板活性化因子ァセチルヒドロラ一ゼ遺伝子の塩基番号 994位の多型、 (7)アポリポプロテイン C- I I I遺伝子の塩基番号- 482位の多型、
(8) ト口ンボスポンジン 4遺伝子の塩基番号 1186位の多型、
(9)イン夕一ロイキン 10遺伝子の塩基番号- 819位の多型、 及び
(10)インターロイキン 10遺伝子の塩基番号- 592位の多型、
(ii)前記工程によって得られる多型情報から核酸試料の遺伝子型を決定するェ 程、 及び (i i i)決定された遺伝子型から心筋梗塞の遺伝的リスクを求める工程。
[5] 以下の工程（iv)~(vi)を含んでなる、 心筋梗塞のリスク診断方法、 (iv)核酸試料における、 以下の（Π)~ (15)からなるグループより選択される二 つ以上の多型を解析する工程、
(11)ストロメライシン 1遺伝子の塩基番号- 1171位の多型、
(12)プラスミノーゲン活性化因子インヒビター 1遺伝子の塩基番号- 668位の 多型、
(13)ダリコプロティン Iba遺伝子の塩基番号 1018位の多型、
(14)パラォキソナーゼ遺伝子の塩基番号 584位の多型、 及び
(15)アポリポプロテイン E遺伝子の塩基番号 4070位の多型、
(V)前記工程によって得られる多型情報から核酸試料の遺伝子型を決定するェ 程、 及び
(vi)決定された遺伝子型から心筋梗塞の遺伝的リスクを求める工程。
[6] 以下の工程（vi i)~(ix)を含んでなる、 心筋梗塞のリスク診断方法、 (vi i)核酸試料における、 アポリポプロテイン E遺伝子の塩基番号 4070位の多 型を解析する工程、
(vi i i)前記工程によって得られる多型情報から核酸試料の遺伝子型を決定する 工程、 及び
(ix)決定された遺伝子型から心筋梗塞の遺伝的リスクを求める工程。
[7] 以下の（1)〜（10)からなるグループより選択される二つ以上の核酸を含 んでなる遺伝子型検出用キッ 卜、
(1)コネキシン 37遺伝子の塩基番号 1019位の多型を解析するための核酸、
(2)腫瘍壊死因子 α遺伝子の塩基番号- 863位の多型を解析するための核酸、
(3) NADH/NADPHォキシダ一ゼ p22 フォックス遺伝子の塩基番号 242位の多型を 解析するための核酸、 (4)アンギオテンシノ一ゲン遺伝子の塩基番号- 6 位の多型を解析するための核 酸、
(5)ァポリポプロティン E遺伝子の塩基番号- 219位の多型を解析するための核 酸、
(6)血小板活性化因子ァセチルヒドロラ一ゼ遺伝子の塩基番号 994 位の多型を 解析するための核酸、
(7)アポリポプロテイン C-l I I 遺伝子の塩基番号- 482位の多型を解析するため の核酸、
(8) トロンボスボンジン 4遺伝子の塩基番号 1186位の多型を解析するための核 酸、
(9)インターロイキン 10遺伝子の塩基番号- 819位の多型を解析するための核酸、 及び
(10)インタ一ロイキン 10遺伝子の塩基番号- 592位の多型を解析するための核 酸。
[8] 以下の（11)〜（15)からなるグループより選択される二つ以上の核酸を含 んでなる遺伝子型検出用キッ ト、
(11)ストロメライシン 1 遺伝子の塩基番号 -1171 位の多型を解析するための核 酸、
(12)プラスミノ一ゲン活性化因子インヒビ夕一 1遺伝子の塩基番号- 668位の多 型を解析するための核酸、
(13)ダリコプロティン Iba遺伝子の塩基番号 1018位の多型を解析するための 核酸、
(14)パラォキソナ一ゼ遺伝子の塩基番号 584位の多型を解析するための核酸、 及び
(15)ァポリポプ口ティン E遺伝子の塩基番号 4070位の多型を解析するための核 酸。
[9] アポリポプロテイン E遺伝子の塩基番号 4070位の多型を解析するための 核酸、 を含んでなる遺伝子型検出用キッ ト。
[1 0] 以下の（1)~(10)からなるグループより選択される二つ以上の核酸が 不溶性支持体に固定されてなる固定化核酸、
(1)コネキシン 37遺伝子の塩基番号 1019位の多型を解析するための核酸、
(2)腫瘍壊死因子 a遺伝子の塩基番号- 863位の多型を解析するための核酸、
(3) NADH/NADPH才キシダーゼ p22 フォックス遺伝子の塩基番号 242位の多型を 解析するための核酸、
(4)アンギオテンシノ一ゲン遺伝子の塩基番号- 6 位の多型を解析するための核 酸、
(5)アポリポプロテイン E遺伝子の塩基番号- 219位の多型を解析するための核 酸、
(6)血小板活性化因子ァセチルヒドロラーゼ遺伝子の塩基番号 994 位の多型を 解析するための核酸、
(7)アポリポプロテイン C- 111 遺伝子の塩基番号- 482位の多型を解析するため の核酸、
(8)卜口ンボスポンジン 4遺伝子の塩基番号 1186位の多型を解析するための核 酸、
(9)インタ一ロイキン 10遺伝子の塩基番号- 819位の多型を解析するための核酸、 及び
(10)イン夕一ロイキン 10遺伝子の塩基番号- 592位の多型を解析するための核 酸。
[1 1 ] 以下の（11)〜（15)からなるグループより選択される二つ以上の核酸が 不溶性支持体に固定されてなる固定化核酸、 く11)ストロメライシン 1 遺伝子の塩基番号- 1171 位の多型を解析するための核 酸、
(12)プラスミノ一ゲン活性化因子ィンヒビター 1遺伝子の塩基番号- 668位の多 型を解析するための核酸、
(13)グリコプロテイン Iba遺伝子の塩基番号 1018位の多型を解析するための 核酸、
(14)パラ才キソナーゼ遺伝子の塩基番号 584位の多型を解析するための核酸、 及び
(15)ァポリポプ口ティン E遺伝子の塩基番号 4070位の多型を解析するための核 酸。
[1 2] アポリポプロテイン E遺伝子の塩基番号 4070位の多型を解析するため の核酸が不溶性支持体に固定されてなる固定化核酸。 図面の簡単な説明
図 1 は、 実施例におけるスクリーニング関連解析において検討した 112遺伝子 多型をまとめた表である。
図 2は、 同じく実施例におけるスクリーニング関連解析において検討した 112 遺伝子多型をまとめた表である。
図 3は、 実施例において遺伝子型を決定するために使用されるプライマー （上 から順に配列番号 3 0、 3 1 、 3 2、 2 1 、 2 2、 2 3、 1 5、 1 6、 1 7、 2 4、 2 5、 2 6、 1 8、 1 9、 2 0、 3 3、 3 4、 3 5、 4 2、 4 3、 4 4 )、 プ ローブ（上から順に配列番号 5 9、 6 0 )及びその他の条件をまとめた表である。 図中、 FITCはフル才レセインイソチオシァネー卜を、 TxRはテキサスレッ ドをそ れぞれ表す。
図 4は、 同じく実施例において遺伝子型を決定するために使用されるプライマ 一 （上から順に配列番号 2 7、 2 8、 2 9、 3 9、 4 0、 4 1 、 3 6、 3 7、 3 8、 5 3、 5 4、 5 5、 5 6、 5 7、 5 8、 4 8、 4 9、 4 5、 4 6、 4 7、 5 0、 5 1 、 5 2 )、 プローブ （上から順に配列番号 6 1 、 6 2、 6 3、 6 4 ) 及び その他の条件をまとめた表である。 図中、 FITCはフル才レセインイソチ才シァネ 一卜を、 TxRはテキサスレッ ドをそれぞれ表す。
図 5は、 実施例の クリ一ニング関連解析における対象 909例の背景をまとめ た表である。 年齢と Body mass i ndexのデータは平均士標準偏差で表される。 表 中、 *1 は Ρ=0· 0278を、 *2は P〈0.0001 versus con t ro I sをそれぞれ表す。
図 6は、 実施例のスクリ一二ング関連解析において心筋梗塞との関連が認めら れた遺伝子多型をまとめた表である。
図 7は、 実施例における関連解析の全対象 5061例の背景をまとめた表である。 年齢と Body mass indexのデータは平均士標準偏差で表される。表中、 *1 は Ρ=0· 022を、 *2は Ρ〈0.001 を、 *3は Ρ=0· 017をそれぞれ表す。
図 8は、実施例における関連解析の全対象 5061例において心筋梗塞との関連が 認められた遺伝子多型の遺伝子型分布をまとめた表である。
図 9は、実施例における関連解析の全対象 5061例における遺伝子多型と心筋梗 塞の多因子ロジスティック回帰分析の結果を示す表である。 表中、 0Rは才ッズ比 を、 CI は信頼区間をそれぞれ表す。
図 1 0は、 心筋梗塞と関連のある遺伝子多型における多因子ロジスティック回 帰分析の stepwise forward selection methodの結果を示す表である。 表中、 CI は信頼区間を表す。
図 1 1 は、 男性における 5個の組合せ遺伝子多型を用いた心筋梗塞の遺伝的リ スク （発症リスク） 診断の結果を示す表である。
図 1 2は、 女性における 5個の組合せ遺伝子多型を用いた心筋梗塞の遺伝的リ スク （発症リスク） 診断の結果を示す表である。 図 1 3は、 組み合わせる遺伝子多型の数と心筋梗塞罹患のォッズ比の関係を表 すグラフである。 尚、 （A) が男性を対象とした場合、 （B)が女性を対象とした場合 である。 発明を実施するための最良の形態
本発明の第 1 の局面は核酸試料の遺伝子型を検出する方法に関し、 その一態様 は以下の（1)~ (10)からなるグループより選択される二つ以上の多型を解析する 工程を含むことを特徴とする。 また他の態様としては、 以下の（11)〜 5)からな るグループより選択される二つ以上の多型を解析する工程を含むことを特徴とす る。 さらに他の態様としては、 以下の（15)の多型を解析する工程を少なくとも含 むことを特徴とする。 尚、 以上の工程の結果得られる多型情報から核酸試料の遺 伝子型を決定することにより心筋梗塞の遺伝的リスクを求めることができる。
(1)コネキシン 37 (Connexin 37) 遺伝子の塩基番号 1019位の多型 ： 1019C→T (以下、 「コネキシン 37(1019C→T)多型」ともいう）
(2)腫瘍壊死因子 a遺伝子 （Tumor necrosis factor- a) の塩基番号- 863 位の 多型 ： -863C→A (以下、 「TNFa (_863C→A)多型」ともいう）
(3)I DH/NADPH才キシダ一ゼ p22フォックス （ ADH/NADPH oxidase p22 phox) 遺伝子の塩基番号 242位の多型 ： 242C→T (以下、 「MADH/NADPH才キシダ一ゼ p22 フォックス（242C→T)多型」ともいう）、
(4)アンギオテンシノーゲン （Angiotensinogen) 遺伝子の塩基番号- 6 位の多 型 ： - 6G→A (以下、 「アンギオテンシノ一ゲン（-6G→A)多型」ともいう）
(5)アポリポプロテイン E (Apol ipoprotein E) 遺伝子の塩基番号- 219 位の多 型 ： -219G→T (以下、 「アポ E- 219(- 219G→T)多型」ともいう）
(6)血小板活性化因子ァセチルヒ ドロラーゼ （Platelet-activating factor ac ety Ihydrolase) 遺伝子の塩基番号 994位の多型： 994G→T (以下、 「PAFァセチル ヒドロラ一ゼ（994G→T)多型」ともいう）
(7)アポリポプロテイン C- 1 I I (Apol ipoprotein C- II I) 遺伝子の塩基番号- 482 位の多型 ： - 482C→T (以下、 「アポ C-l I I (- 482C→T)多型 Jともいう）
(8) トロンボスポンジン 4 (Thrombospondin 4) 遺伝子の塩基番号 〗186位の多 型 ： 1186G→C (以下、 「TSP4(1186G→C)多型」ともいう）
(9)インターロイキン 10 (lnterleukin-10) 遺伝子の塩基番号- 819位の多型： - 819T→C (以下、 「IL- 10(- 819T→C)多型」ともいう）
(10)インターロイキン 10 (lnterleukin-10) 遺伝子の塩基番号- 592位の多型 ： -592A→C (以下、 「 - 10 (-592A→C)多型」ともいう）
(11)ストロメライシン 1 (Stromelysin- 1) 遺伝子の塩基番号- 1171位の多型： - 1171/5A→6A (以下、 「ストロメライシン 1 (-1171/5A—6A)多型」ともいう）
(12)プラスミノーゲン活性化因子インヒビ夕一 1 (Plasminogen activator inh ibi tor-1) 遺伝子の塩基番号- 668位の多型 ： -668/4G→5G (以下、 「PAM(- 668/4G →5G)多型」ともいう）
(13)グリコプロテイン Ibex (Glycoprotein Iba) 遺伝子の塩基番号 1018位の 多型.： 1018C→T (以下、 「グリコプロテイン Ibex (1018C→T)多型」ともいう）
(14)パラォキソナ一ゼ （Paraoxonase) 遺伝子の塩基番号 584 位の多型 ： 584G →A (以下、 「パラ才キソナ一ゼ（584G→A)多型」ともいう）
(15)アポリポプロテイン E (Apol ipoprotein E) 遺伝子の塩基番号 4070位の多 型 ： 4070C→T (以下、 「アポ E(4070C→丁）多型」ともいう） 以上において 1019C→Tのような表記は、当該塩基番号位置の多型が矢印の前又 は後の塩基である二つの遺伝子型からなることを意味する。 但し、 - Π71/5Α→6Α は塩基番号- 1171 位から 3'方向に Α (アデニン） が連続して 5個存在する遺伝子 型と 6個存在する遺伝子型からなる多型を意味する。 同様に、 - 668/4G→5G は塩 基番号- 668位から 3'方向に G (グァニン） が連続して 4個存在する遺伝子型と 5 個存在する遺伝子型からなる多型を意味する。 各遺伝子における塩基番号は公共のデータベースである GenBank (NCBI) に登 録されている公知の配列を基準として表される。 尚、 配列番号 1 の塩基配列 (Access ion No. M96789： Homo sapiens connex i n 37 (GJA4) mRNA, complete cds) において 1019番目の塩基がコネキシン 37遺伝子の 1019位塩基に相当する。同様 に酉己歹1 J番号 2の塩基目 c歹 U (Access ion No. L11698： Homo sapiens tumor necros is factor alpha gene, promoter region) において 197番目の塩基が腫瘍壊死因子 a 遺伝子の- 863位塩基に相当し、 配列番号 3の塩基配列 （Access ion No. M61107： Homo sapiens cytochrome b l ight chain (CYBA) gene, exons 3 and 4) におい て 684番目の塩基が MADH/NADPH才キシダ一ゼ p22フォックス遺伝子の 242位塩基 に相当 し、 配列番号 4 の塩基配列 （ Access ion No. XI 5323 ： H. sap i ens angi otens i nogen gene 5' region and exon 1) において 463番目の塩基がアンギ 才テンシノーゲン遺伝子の- 6位塩基に相当し、配列番号 5の塩基配列（Accession No. AF055343 ： Homo sapiens apo I i poprote i n E (APOE) gene, ¾ regul atory region, part ial sequence) において 801番目の塩基がアポリポプロテイン E遺伝 子の- 219位塩基に相当し、 配列番号 6の塩基配列 （Access ion No. U20157： Human p I ate I et-ac t i vat i ng factor ace ty I hyd ro I ase mRNA, complete cds) において 996番目の塩基が血小板活性化因子ァセチルヒドロラーゼ遺伝子の 994位塩基に 相当 し、 配列番号 7 の塩基配列 （Access ion No. X13367 ： Human DNA for apol ipoprotein C- I I I 5' - f lank) において 936番目の塩基がアポリポプロテイン C-l I I 遺伝子の- 482 位塩基に相当し、 配列番号 8の塩基配列 （Accession No. Z19585： H. sapiens mRNA for th rombospond i n-4) において 1186番目の塩基がト ロンボスポンジン 4 遺伝子の 1186 位塩基に相当し、 配列番号 9の塩基配列 (Accession No. Z30175： H. sapiens I L-10 gene for i n te r I euk i n 10 (promoter) ) において 455番目の塩基がィンターロイキン 10遺伝子の- 819位塩基に、 682番目 の塩基が- 592位塩基にそれぞれ相当し、配列番号 1 0の塩基配列 （Accession No. U43511 ： Homo sapiens s t rome I ys i n-1 gene, promoter region) において 698番 目の塩基がス トロメライシン 1 遺伝子の- 1171 位塩基に相当し、 配列番号 1 1 の 塩 ¾酉己ダ1 J (Accession No. XI 3323 ： Human gene for plasminogen activator inhibitor 1 (PA卜 1) 5' -flank and exon 1) において 〗31番目の塩基がプラスミ ノーゲン活性化因子インヒビター 1遺伝子の- 668位塩基に相当し、 配列番号 1 2 の塩基目!：歹1 J (Accession No. J02940： Human platelet glycoprotein lb alpha chain mRNA, complete cds) において 524番目の塩基がグリコプロティン Ibex 遺伝子の 1018位塩基に相当し、配列番号 1 3の塩基配列（Accession Mo. M63012:H. sapiens serum paraoxonase (PON) mRNA, complete cds) において 584番目の塩基がパラ 才キソナーゼ遺伝子の 584位塩基に相当し、 配列番号 1 4の塩基配列 （Accession No. M10065： Human apo I i poprote i n E (epsi I on-4 al lele) gene, complete cds) において 4070番目の塩基がアポリポプロテイン E遺伝子の 4070位塩基に相当す る。 本発明において「多型を解析する」とは、 解析対象の遺伝子多型について核酸試 料がどのような遺伝子型を有するかを調べることを意味し、 多型が存在する位置 の塩基 （塩基配列） を調べることと同義である。 典型的には、 コネキシン 37(101 9C→T)多型の解析を例に採れば、 核酸試料におけるコネキシン 37の遺伝子型が T T (1019位塩基が両ァレル共に Tのホモ接合体）、 CT (1019位塩基が Cのアレルと Tのアレルとのヘテロ接合体）、 及び CC (1019位塩基が両アレル共に Cのホモ接 合体） の中のいずれであるかを調べることを意味する。 上記の（1 )〜（1 0)の多型は、後述の実施例で示されるように、 日本人男性を対象 とした解析において心筋梗塞の遺伝的リスクの判定に利用することが特に有効と 認められた多型である。 従って、 これらの多型を解析対象とすることは、 男性、 特に日本人男性を被験者とするときにより高精度で予知確率の高い診断を可能と する。 同様に（1 1 )〜（1 5)の多型は、 後述の実施例で示されるように、 日本人女性を対 象とした解析において心筋梗塞の遺伝的リスクの判定に利用することが有効と認 められた多型である。 従って、 これらの多型を解析対象とすることは、 女性、 特 に日本人女性を被験者とするときにより高精度で予知確率の高い診断を可能とす る。 これらの多型の中でも（1 5)の多型については、 後述の実施例で示されるよう に、 それを解析することにより極めて高い才ッズ比で心筋梗塞の遺伝的リスクを 判別できることが確認された。 従って、 この多型を単独で解析することによって も高精度かつ予知確率の高い心筋梗塞の遺伝的リスクを判定することが可能であ る。 勿論、 この（1 5)の多型の解析に加えて、 （1 1 )〜（1 4)から選択されるいずれか 又は複数の多型の解析を組み合わせて実施し、 遺伝子型の検出或は心筋梗塞の遺 伝的リスクの診断を行うこともできる。 ここで、 原則的には解析する多型の数の増加に比例して核酸試料の遺伝子型が より細かく分類され、 これによつて一層予知確率の高い心筋梗塞の遺伝的リスク の診断を行うことができる。かかる見地から、 上記の（1 )〜（1 0)の多型の中でより 多くの多型を解析して遺伝子型を検出することが好ましい。 従って、 （1 ) ~ ( 1 0) のすベての多型を解析することが最も好ましい。 九つ以下の多型を組み合わせて 遺伝子型の検出を行う場合には、 後述の実施例で示される才ッズ比の高い多型を 優先的に選択して用いることが好ましい。 例えば八つの多型を組み合わせて用い るのであれば、 才ッズ比の高い順から九つ、 即ち。）、 (3)、 （5)、 （6)、 （7)、 （8)、 (9)及び（10)を選択することが好ましい。 同様に、例えば七つの多型を組み合わせ て用いるのであれば（1)、 （3)、 （5)、 （6)、 （8)、 （9)及び（10)を選択することが好 ましい。同様に、例えば六つの多型を組み合わせて用いるのであれば（1)、（5)、（6)、 (8)、 （9)及び（10)を選択することが好ましい。 同様に、 例えば五つの多型を組み 合わせて用いるのであれば（1)、 （5)、 （6)、 (8) 及び（9)を選択することが好まし い。
(11)~ (15)の多型から選択される二つ以上の多型を解析する場合も同様に、 こ れらすべての多型、 即ち五つの多型を解析することが最も好ましい。 四つ以下の 多型を組み合わせて遺伝子型の検出を行う場合には、 後述の実施例で示される才 ッズ比の高い多型を優先的に選択して用いることが好ましい。 例えば四つの多型 を組み合わせて用いるのであれば、才ッズ比の高い順から四つ、即ちり 1)、 （12)、 (14)、 及び（15)を選択することが好ましい。 同様に、 例えば三つの多型を組み合 わせて用いるのであれば（11)、 （12)、 及びり 5)を選択することが好ましい。 同様 に、 例えば二つの多型を組み合わせて用いるのであれば（11)及び（15)を選択する ことが好ましい。 各遺伝子多型を解析する方法は特に限定されるものではなく、 例えばァリル特 異的プライマー （及びプローブ） を用い、 PCR 法による増幅、 及び増幅産物の多 型を蛍光又は発光によって解析する方法や、 PCR(polymerase chain reaction)法 を利用した PCR- RFLP(restriction fragment length po I ymorph i sm：制限酵素断 片長多型）法、 PCR- SSCP(single strand conformation po I ymo rph ί sm：単鎖高次搆 造多型）法（Orita'M. et al . , Proc. Natl. Acad. Sci. , U.S.A., 86, 2766-2770 (1989)等）、 PCR- SS0(specif ic sequence o I i gonuc I eo t i de： 特異的配列才リゴヌ クレオチド）法、 PCR- SS0法と ドッ トハイプリダイゼーシヨン法を組み合わせた A S0(al lele specif ic o I i gonuc I eo t i de：アレル特異的オリゴヌクレオチド）ハイブ リダィゼーシヨン法（Saiki, Nature, 324， 163- 166 (1986)等）、 又は TaqMan- PCR 法（Livak, KJ, Genet Anal, 14, 143 (1999) , Mo r r i s, T. et aし， J. CI in. Microb iol.， 34, 2933 (1996))、 I nvade r法（Lyam i chev V et al . , Nat B i o techno 1 , 17, 292 (1999))、 プライマ一伸長法を用いた MALD卜 TOF/MS(matrix)法（Haff LA, Smi rnov
IP, Genome Res 7, 378 (1997) )、 RCA、ro I I i ng cycle amp I i f i ca t i on) ;s (L i za rd i PM et al. , Nat Genet 19, 225 (1998) )、 DNAチップ又はマイクロアレイを用いた 方法（Wang DG et a ， Science 280, 1077 (1998)等）、 プライマー伸長法、 サザン プロッ トハイプリダイゼーシヨン法、 ドッ トハイプリダイゼ一シヨン法 （Southe rn,E.， J. Mo I. Biol. 98， 503-517 (1975)) 等、 公知の方法を採用できる。 さら に、解析対象の多型部分を直接シークェンスすることにより解析してもよい。尚、 これらの方法を任意に組み合わせて多型解析を行ってもよい。 核酸試料が少量の場合には、 検出感度ないし精度の面から PCR法を利用した方 法 （例えば、 PCR- RFLP ) により解析することが好ましい。 また、 PCR法又は PC 法を応用した方法などの遺伝子増幅法により核酸試料を予め増幅 （核酸試料の 一部領域の増幅を含む） した後、 上記いずれかの解析方法を適用することもでき る。
—方、 多数の核酸試料を解析する場合には、 特に、 ァリル特異的 PCR法、 ァリ ル特異的ハイプリダイゼーシヨン法、 TaqMan- PCR法、 Invader法、 プライマ一伸 長法を用いた MALD卜 TOF/MS(matrix)法、 RCA(rol I ing cycle amp I i f i cat ί on)法、 又は DMAチップ又はマイクロアレイを用いた方法等、 多数の検体を比較的短時間 で解析することが可能な解析方法を用いることが好ましい。 以上の方法では、 各方法に応じたプライマーやプローブ等の核酸 （本発明にお いて、 「多型解析用核酸」ともいう）が使用される。多型解析用核酸の例としては、 解析対象の多型を含む遺伝子において、 当該多型部位を含む一定領域 （部分 DNA 領域） に相補的な配列を有する核酸を挙げることができる。 また、 解析対象の多 型を含む遺伝子において、 当該多型部位を含む一定領域 （部分 DMA領域） に相補 的な配列を有し、 当該多型部分を含む DNAフラグメントを特異的に増幅できるよ うに設計された核酸 （プライマー） を挙げることができる。 このような核酸とし ては、 例えばコネキシン 37遺伝子の 1 01 9位の多型が解析対象の場合には、 1 01 9 位の塩基が C (シ卜シン）であるコネキシン 37遺伝子の 1 01 9位塩基を含む部分 D NA領域に相補的な配列を有する核酸、 又は 1 01 9位の塩基が T (チミン） であるコ ネキシン 37遺伝子の 1 01 9位塩基を含む部分 DNA領域に相補的な配列を有する核 酸が該当する。 多型解析用核酸の他の具体例としては、 解析対象の多型部位がいずれかの遺伝 子型である場合にのみ、 当該多型部位を含む部分 DMA領域を特異的に増幅するよ うに設計された核酸セッ トを挙げることができる。 より具体的には、 解析対象の 多型部位を含む部分 D N A領域を特異的に増幅するように設計された核酸セッ トで あって、 多型部位がいずれかの遺伝子型であるアンチセンス鎖の当該多型部位を 含む部分 D N A領域に対して特異的にハイプリダイズするセンスプライマーとセン ス鎖の一部領域に対して特異的にハイブリダイズするアンチセンスプライマーか らなる核酸セッ トを例示することができる。 このような核酸セッ トとしては、 コ ネキシン 37遺伝子の 1 01 9位の多型が解析対象の場合には、コネキシン 37遺伝子 の 1 01 9位塩基を含む部分 DNA領域を特異的に増幅するように設計された核酸セッ 卜であって、 1 01 9位塩基が C (シ卜シン） であるコネキシン 37遺伝子のアンチセ ンス鎖において 1 01 9位塩基を含む部分 DNA領域、に対して特異的にハイプリダイ ズするセンスプライマーとセンス鎖の一部領域に対して特異的にハイブリダィズ するアンチセンスプライマーからなる核酸セッ 卜、又は 1 01 9位塩基が T (チミン） であるコネキシン 37遺伝子のアンチセンス鎖において 1 01 9位塩基を含む部分 DN A 領域、 に対して特異的にハイプリダイズするセンスプライマー、 及びセンス鎖 の一部領域に対して特異的にハイブリダィズするアンチセンスプライマーからな る核酸セッ トが該当する。 ここで、 増幅される部分 DNA領域の長さはその検出に 適した範囲で適宜設定され、 例えば 50 bp~ 200 bp、 好ましくは 80 bp〜1 50 bp である。 より具体的には、 例えばコネキシン 37 (1 01 9C→T)多型解析用の核酸セッ 卜として次の配列を有するものを例示できる。 尚、 以下の配列の下線部は多型に 対応する部分を表す。 また、 配列中の Nは A、 T、 及び Gのいずれかであるこ とを意味する。 センスプライマー
CTCAGAATGGCCAAAANCC： 配列番号 1 5、 又は
CCTCAGAATGGCCAAAANTC： 配列番号 1 6
アンチセンスプライマー
GCAGAGCTGCTGGGACGA： 配列番号 1 7 同様に、 TNF a (-863C→A)多型解析用の核酸プライマ一として次の配列を有する ものを例示できる。
アンチセンスプライマー
GGCCCTGTCTTCGTTAAN G： 配列番号 1 8、 又は
ATGGCCCTGTCTTCGTTAANTG： 配列番号 1 9
センスプライマー
CCAGGGCTATGGAAGTCGAGTATC： 配列番号 2 0 同様に、 NADH/MADPH才キシダーゼ p22 フォックス（242C—T)多型解析用の核酸 プライマ一として次の配列を有するものを例示できる。
アンチセンスプライマー
ACCACGGCGGTCATGNGC： 配列番号 2 1 、 又は
ACCACGGCGGTCATGNAC： 配列番号 2 2
センスプライマ一
GCAGCAAAGGAGTCCCGAGT： 配列番号 2 3 同様に、 アンギオテンシノ一ゲン（-6G→A)多型解析用の核酸プライマーとして 次の配列を有するものを例示できる。
アンチセンスプライマー
CGGCAGCTTCTTCCCNCG： 配列番号 2 4、 又は
CGGCAGCTTCTTCCCNTG： 配列番号 2 5
センスプライマー
CCACCCCTCAGCTATAAATAGG： 配列番号 2 6 同様に、 アポ E (-21 9G→T)多型解析用の核酸プライマーとして次の配列を有す るものを例示できる。
センスプライマ一
GAATGGAGGAGGGTGTCTNGA： 配列番号 2 7、 又は
AGAATGGAGGAGGGTGTCTNTA： 配列番号 2 8
ァンチセンスプライマー
CCAGGAAGGGAGGACACCTC： 配列番号 2 9 同様に、 PAFァセチルヒ ドロラーゼ（994G→T)多型解析用の核酸プライマ一とし て次の配列を有するものを例示できる。
センスプライマー
TTCTTTTGGTGGAGCAACNGT： 配列番号 3 0、 又は
ATTCTTTTGGTGGAGCAACNTT： 配列番号 3 1
アンチセンスプライマー
TCTTACCTGAATCTCTGATCTTCA： 配列番号 3 2 同様に、 アポ C- I I I (- 482C T)多型解析用の核酸プライマーとして次の配列を 有するものを例示できる。
センスプライマ一
CGGAGCCACTGATGCNCG：配列番号 3 3、 又は
CGGAGCCACTGATGCNTG： 配列番号 3 4
アンチセンスプライマ一
TGTTTGGAGTAAAGGCACAGAA： 配列番号 3 5 同様に、 TS P4 ( 1 1 86G→C)多型解析用の核酸プライマ一として次の配列を有する ものを例示できる。
センスプライマー
CGAGTTGGGAACGCACN T： 配列番号 3 6、 又は
CGAGTTGGGAACGCACNGT： 配列番号 3 7
アンチセンスプライマ一
GGTCTGCACTGACATTGATGAG： 配列番号 3 8 同様に、 - 1 0 (-81 9T→C)多型解析用の核酸プライマーとして次の配列を有する ものを例示できる。
センスプライマ一
TACCCTTGTACAGGTGATGTANTA：配列番号 3 9、 又は
TACCCTTGTACAGGTGATGTANCA：配列番号 4 0
アンチセンスプライマー
ATAGTGAGCAAACTGAGGCACA： 配列番号 4 1 同様に、 - 1 0 (-592A→C)多型解析用の核酸プライマーとして次の配列を有する ものを例示できる。
アンチセンスプライマー
CAGAGACTGGCTTCCTACANGA： 配列番号 4 2、 又は
CCAGAGACTGGCTTCCTACANTA： 配列番号 4 3
センスプライマー
GCCTGGAACACATCCTGTGA： 配列番号 4 4 同様に、 ストロメライシン 1 (- 1 1 71 /5A—6A)多型解析用の核酸プライマ一とし て次の配列を有するものを例示できる。
センスプライマ一
TTTGATGGGGGGAAAANAC： 配列番号 4 5、 又は
TTGATGGGGGGAAAANCC： 酉己歹 II番号 4 6
アンチセンスプライマ一
CCTCATATCAATGTGGCCAA： 配列番号 4 7 同様に、 PA I 1 (-668/4G→5G)多型解析用の核酸プライマ一として次の配列を有す るものを例示できる。 センスプライマー
GGCACAGAGAGAGTCTGGACACG：配列番号 4 8
アンチセンスプライマー
GGCCGCCTCCGATGATACA：配列番号 4 9 同様に、 グリコプロテイン I b a (1 01 8C→T)多型解析用の核酸プライマーとして 次の配列を有するものを例示できる。
センスプライマー
CCCAGGGCTCCTGNCG： 配列番号 5 0、 又は
CCCCAGGGCTCCTGNTG： 配列番号 5 1
ァンチセンスプライマー
TGAGCTTCTCCAGCTTGGGTG： 配列番号 5 2 同様に、パラ才キソナーゼ（584G→A)多型解析用の核酸プライマ一として次の配 列を有するものを例示できる。
センスプライマー
ACCCAAATACATCTCCCAGGANCG： 配列番号 5 3、 又は
AACCCAAATACATCTCCCAGGNCT： 配列番号 5 4
アンチセンスプライマー
GAATGATATTGTTGCTGTGGGAC： 配列番号 5 5 同様に、 アポ E (4070C→T)多型解析用の核酸プライマ一として次の配列を有す るものを例示できる。
センスプライマー
CCGATGACCTGCAGAANCG：配列番号 5 6、 又は GCCGATGACCTGCAGAANTG：配列番号 5 7
アンチセンスプライマー
CGGCCTGGTACACTGCCAG： 配列番号 5 8 一方、 プローブの具体例として以下のものを挙げることができる。
アポ C- 1 I I (- 482C→T)多型解析用プローブとして
AGCCACTGATGCNCGGTCT： 配列番号 5 9、 又は
AGCCACTGATGCNTGGTCT： 配列番号 6 0。
I L- 1 0 (- 81 9T→C)多型解析用プローブとして
GTACAGGTGATGTANTATCTCTGTG： 配列番号 6 1 、 又は
GTACAGGTGATGTANCATCTCTGTG： 配列番号 6 2。
PA门（- 668/4G→5G)多型解析用プローブとして
TGGACACGTGGGGGAGTCAG： 配列番号 6 3、 又は
TGGACACGTGGGGAGTCAGC： 配列番号 6 4„ 以上の核酸プライマ一、 核酸プローブは単なる一例であって、 核酸プライマー であれば目的の増幅反応を支障なく行える限度において、 他方核酸プローブであ れば目的のハイプリダイゼーション反応を支障なく行える限度において一部の塩 基配列に改変が施されたものであってもよい。 ここでの「一部の改変」とは、 塩基 の一部が欠失、 置換、 挿入及び/又は付加されていることを意味する。 改変にか かる塩基数は、 例えば 1〜7個、 好ましくは 1〜5個、 更に好ましくは、 〜 3個で ある。 尚、 このような改変は、 原則として多型部位に対応する塩基以外の部分に おいて行われる。 ただし、 解析対象の多型がストロメライシン 1 (- 1 1 71 /5A→6A) 多型又は PAM (- 668/4G 5G)多型の場合には、 多型部位に対応する塩基の一部を 改変して得られる核酸をプライマー又はプローブとして用いることも可能である t 多型解析用核酸 （プローブ、 プライマ一） には、 解析方法に応じて適宜 DMA断 片又は RNA断片が用いられる。 多型解析用核酸の塩基長はそれぞれの機能が発揮 される長さであればよく、 プライマーとして用いられる場合の塩基長の例として は 10〜50bp程度、好ましくは 15〜40bp程度、 更に好ましくは 15~30bp程度であ る。
尚、 プライマーとして用いられる場合には増幅対象に特異的にハイブリダィズ し、 目的の DNAフラグメントを増幅することができる限り錶型となる配列に対し て多少のミスマッチがあってもよい。 プローブの場合も同様に、 検出対象の配列 と特異的なハィブリダィズが行える限り、 検出対象の配列に対して多少のミスマ ツチがあってもよい。 ミスマッチの程度としては、 1 〜数個、 好ましくは 1 ~ 5 個、 更に好ましくは 1 ~ 3個である。
多型解析用核酸 （プライマー、 プローブ） はホスホジエステル法など公知の方 法によって合成することができる。 尚、 多型解析用核酸の設計、 合成等に関して は成書 （例えば、 Molecular Cloning, Thi rd Ed i tion , Col d Spring Harbor Laboratory Press, New York) を参考にすることができる。 本発明における多型解析用核酸を予め標識物質で標識しておくことができる。 このような標識化核酸を用いることにより、 例えば増幅産物の標識量を指標とし て多型の解析を行うことができる。 また、 多型を構成する各遺伝子型の遺伝子に おける部分 DNA領域をそれぞれ特異的に増幅するように設計された 2種類のブラ イマ一を互いに異なる標識物質で標識しておけば、 増幅産物から検出される標識 物質及び標識量によって核酸試料の遺伝子型を判別できる。 このような標識化プ ライマ一を用いた検出方法の具体例としては、 多型を構成する各遺伝子型のセン ス鎖にそれぞれ特異的にハイブリダィズする 2種類の核酸プライマー （ァリル特 異的センスプライマー） をフルォレセインイソチオシァネートとテキサスレッ ド でそれぞれ標識し、 これら標識化プライマーとアンチセンス鎖に特異的にハイブ リダィズするアンチセンスプライマーとを用いて多型部位を含む部分 D N A領域を 増幅し、 得られた増幅産物における各蛍光物質の標識量を測定して多型を検出す る方法を挙げることができる。 尚、 ここでのアンチセンスプライマーを例えばビ 才チンで標識しておけば、 ビ才チンとアビジンとの特異的な結合を利用して増幅 産物の分離を行うことができる。 多型解析用核酸の標識に用いられる標識物質としては 32P などの放射性同位元 素、 フル才レセインイソチ才シァネー卜、 テトラメチルローダミンイソチ才シァ ネ一卜、 テキサスレッ ドなどの蛍光物質を例示でき、 標識方法としてはアルカリ フォスファターゼ及び T4ポリヌクレオチドキナーゼを用いた 5'末端標識法、 T4 DNAポリメラ一ゼゃ Kl enow断片を用いた 3'末端標識法、ニック トランスレーショ ン法、 ランタ厶プライマー法 (Mo I ecu I ar Cloning, Thi rd Edi t ion, Chapter 9, ' Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York) などを例示できる。 以上の多型解析用核酸を不溶性支持体に固定化した状態で用いることもできる, 固定化に使用する不溶性支持体をチップ状、 ビーズ状などに加工しておけば、 こ れら固定化核酸を用いて多型の解析をより簡便に行うことができる。 核酸試料は、 被験者の血液、 皮膚細胞、粘膜細胞、 毛髪等から公知の抽出方法、 精製方法を用いて調製することができる。 多型解析対象の遺伝子を含むものであ れば、 任意の長さのゲノム DNAを核酸試料として用いることができる。 また、 必 ずしも解析対象の遺伝子のすべてが一の核酸上に存在する核酸試料を用いる必要 はない。 即ち、 本発明の核酸試料としては、 解析対象の遺伝子のすべてが一の核 酸上に存在しているもの、 解析対象の遺伝子が二以上の核酸上に分かれて存在し ているもののいずれをも用いることができる。 尚、 核酸試料において解析対象の 遺伝子が完全な状態 （即ち、 遺伝子の全長が存在する状態） でなくても、 少なく とも解析される多型部位が存在している限りにおいて断片的、 部分的な状態であ つてもよい。 各遺伝子多型の解析は遺伝子多型ごとに、又は複数若しくは全部を同時に行う。 前者の場合としては、 例えば被験者から得た核酸試料を解析対象の多型の数に合 わせて分注し、 各多型の解析を個別に行う。 後者の場合としては、 例えば DNAチ ップまたはマイクロアレイによって行うことができる。 尚、 ここでいう同時とは 解析過程のすべての操作が同時に行われることのみを意味するのではなく、 一部 の操作 （例えば、 核酸増幅操作、 プローブのハイブリダィズ、 又は検出） が同時 に行われる場合も含む。 解析対象の遺伝子の転写産物である mRNA を利用して各遺伝子の多型を解析す ることもできる。 例えば、 被験者の血液、 尿等から解析対象である遺伝子の mRNA を抽出、 精製した後、 ノーザンブロット法 （Molecular Cl oning, Th i rd Edi t ion, 7.42, Co I d Spring Harbor Laboratory Press, New York) , ドッ 卜プロッ 卜法 (M 0 I ecu I ar Cloning, Th i rd Ed i t i on, 7.46, Co I d Spring Harbor Laboratory Press, New York), RT-PCR；'去 (Mo I ecu I ar Cloning, Thi rd Edi t ion, 8.46, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York). DNAチップ （DNAアレイ） を用いた方法な どを実行することにより、 mRNAを出発材料として多型解析を行うことができる。 さらに、 上記の多型の中でアミノ酸の変化を伴うものについては、 解析対象の 遺伝子の発現産物を用いて多型解析を行うこともできる。 この場合、 多型部位に 対応するアミノ酸を含んでいる限り、 部分タンパク質、 部分ペプチドであっても 解析用試料として用いることができる。
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このような遺伝子の発現産物を用いて解析する方法としては、 多型部位のアミ ノ酸を直接分析する方法、 又は立体構造の変化を利用して免疫学的に分析する方 法などが挙げられる。 前者としては、 周知のアミノ酸配列分析法 （エドマン法を 利用した方法） を用いることができる。 後者としては、 多型を構成するいずれか の遺伝子型を有する遺伝子の発現産物に特異的な結合活性を有するモノクローナ ル抗体又はポリクローナル抗体を用いた、 E L I S A法 （酵素結合免疫吸着定量 法）、 ラジオィ厶ノアツセィ、 免疫沈降法、 免疫拡散法等などを用いることができ る。 以上説明した本発明の検出方法を実行することにより得られる多型情報は、 心 筋梗塞の遺伝的リスクの診断に利用することができる。 即ち、 本発明は以上の検 出方法によって得られる多型情報から核酸試料の遺伝子型を決定する工程、 及び 決定された核酸試料の遺伝子型から遺伝的リスクを求める工程を含んでなる、 心 筋梗塞のリスク診断方法も提供する。 ここでの遺伝子型の決定は、 典型的には、 検出対象の多型に関して核酸試料の両ァレルがいずれの遺伝子型をそれぞれ有す るかを決定することである。 コネキシン 37(1019C→T)多型が検出対象である場合 を例に採れば、 典型的には核酸試料におけるコネキシン 37の遺伝子型が TT (101 9位塩基が両ァレル共に Tのホモ接合体）、 CT (1019位塩基が Cのアレルと Tのァ レルとのへテロ接合体）、 及び CC (1019位塩基が両アレル共に Cのホモ接合体） の中のいずれであるかを決定することである。 後述の実施例で得られた結果を考慮すれば、 高精度かつ予知確率の高い心筋梗 塞の遺伝的リスクの診断を可能とするために、例えばコネキシン 37(1019C→T)多 型であれば核酸試料の遺伝子型が TT又は CTのいずれかであるか、 それとも CC であるかが決定される。同様に、 TNFcz (- 863C→A)多型であれば AA又は CAのいず れかであるか、それとも CCであるか、 NADH/NADPH才キシダーゼ p22フォックス（2 42C→T)多型であれば TT又は CTのいずれかであるか、 それとも CCであるか、 ァ ンギオテンシノーゲン（-6G→A)多型であれば AAであるか、 それとも GA又は GG のいずれかであるか、 アポ E-219(- 219G→T)多型であれば TTであるか、 それとも GT又は GGのいずれかであるか、 PAFァセチルヒドロラ一ゼ（994G→T)多型であれ ば TT又は GTのいずれかであるか、 それとも GGであるか、 アポ C- 1 I I (- 482C→T) 多型であれば TTであるか、 それとも CT又は CCのいずれかであるか、 TSP4(1186 G→C)多型であれば CC又は GCのいずれかであるか、 それとも GGであるか、 IL- 1 0( - 819T→C)多型であれば CCであるか、それとも CT又は TTのいずれかであるか、 IL- 10 (- 592A→C)多型であれば CCであるか、 それとも CA又は AAのいずれかであ るか、 ストロメライシン 1 (-1171/5A—6A)多型であれば 6A/6A又は 5A/6Aのいず れかであるか、 それとも 5A/5Aであるか、 PAM (- 668/4G 5G)多型であれば 5G/5G 又は 4G/5Gのいずれかであるか、 それとも 4G/4Gであるか、 グリコプロテイン lb (1018C→T)多型であれば TTであるか、それとも CT又は CCのいずれかであるか、 パラォキソナーゼ（584G→A)多型であれば AAであるか、 それとも GA又は GGのい ずれかであるか、アポ E(4070C→T)多型であれば TTであるか、それとも CT又は C Cのいずれかであるかが決定される。 心筋梗塞の遺伝的リスクを診断することにより、 将来的に心筋梗塞を罹患する おそれの程度 （発症し易さ）、 即ち発症リスク （発症脆弱性） が予測され、 また遺 伝子型という客観的指標に基づいて心筋梗塞の認定や病状の把握を行うことが可 能となる。換言すれば、本発明の診断方法によって心筋梗塞の発症リスクの評価、 心筋梗塞に罹患していることの認定、 又は症状の把握を行うことができる。 中で も発症リスクの評価を行えることは臨床上極めて有意義である。 発症リスクを事 前に知ることは心筋梗塞の一次予防に貢献し、 適切な予防措置を講じることを可 能とするからである。
本発明の診断方法によって得られる情報は、 適切な治療法の選択や、 予後の改 善、 患者の Q0L (クォリティー ■ ォブ · ライフ） の向上、 又は発症リスクの低減 などに利用することができる。 本発明の診断方法を定期的に実行することにより、 心筋梗塞の発症リスク等を モニターすることができる。 このようなモニタ一の結果、 ある外的因子 （環境因 子、 薬剤の投与など） と発症リスク等の増加との間に相関関係が認められれば、 当該外的因子を危険因子と認定し、 この情報を基に発症リスク等の低減を図るこ とが可能と考えられる。 本発明で得られる心筋梗塞の発症に関連する遺伝情報を利用して、 心筋梗塞の 治療 （予防的処置を含む） を行うことができる。 例えば、 本発明の診断方法を実 施した結果、 解析対象の多型が心筋梗塞の発症リスクを高める遺伝子型であった 場合に、 発症リスクの低い遺伝子型を有する遺伝子を生体内に導入して発現させ れば、 当該遺伝子が発現することによって症状の軽減、 発症の抑制、 発症リスク の軽減などを期待できる。発症リスクの高い遺伝子型を有する遺伝子の mRNAに対 するアンチセンス鎖を導入し、 当該 mRNAの発現を抑制する方法によっても、 同様 の治療効果が期待される。 遺伝子又はアンチセンス鎖の導入は、 例えば、 遺伝子導入用プラスミ ド又はゥ ィルスべクタ一を用いた方法、 エレク ト口ポーレーシヨン（Potter, Η· et al.， P roc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 81， 7161 -7165 (1984) )、超音波マイクロバブル（ L awrie, A. , et al. Gene Therapy 7, 2023-2027 (2000))、 リポフエクシヨン（Fe Igner, P. L. et a ， Proc. Nat I . Acad. Sci . U.S.A. 84, 7413-7417 (1984) ) , マイクロインジェクション (Graessmann, M. & Graessmann, A. , Proc. Natl. Acad.
Sci. U.S.A. 73,366-370 (1976))等の方法により行うことができる。 これらの方 法を利用して、 所望の遺伝子などを生体に対して直接的に導入 （in vivo 法） 又 は間接的に導入 （ex vivo法） することができる。 本発明の第 2の局面は、 上述した本発明の検出方法又は診断方法に使用される キッ ト （遺伝子型検出用キッ ト、 又は心筋梗塞診断用キッ ト） を提供する。 かか るキッ 卜には、上記の（1)~ (10)の多型からなるグループよリ選択される二つ以上 の多型を解析するための核酸（多型解析用核酸）が含まれる。又は上記の（11)~(1 5)の多型からなるグループより選択される二つ以上の多型を解析するための核酸 (多型解析用核酸） が含まれる。 更に他の態様としては、 上記の（15)の多型を解 析するための核酸が含まれてキッ 卜が構成される。
多型解析用核酸は、 それが適用される解析方法 （上述したァリル特異的核酸等 を用いた PCR法を利用する方法、 PCR- RFLP法、 PCR- SSCP、 TaqMan- PCR法、 Invad er法等） において、 解析対象の多型部分を含む DNA領域又はそれに対応する mRN A を特異的に増幅できるもの （プライマー） 又は特異的に検出できるもの （プロ ーブ） として設計される。 以下に、 本発明において提供されるキッ トの具体例を 示す。 以下の（1)〜（10)からなるグループより選択される二つ以上の核酸を含んでな る遺伝子型検出用キッ 卜、
( 1 ) 1 01 9位塩基が Cであるコネキシン 37遺伝子の 1 01 9位塩基を含む部分 DNA 領域に相補的な配列を有する核酸、 又は 1 01 9位塩基が Tであるコネキシン 37遺 伝子の 1 01 9位塩基を含む部分 DNA領域に相補的な配列を有する核酸、
(2) - 863位塩基が Cである腫瘍壊死因子 α遺伝子の- 863位塩基を含む部分 DMA 領域に相補的な配列を有する核酸、 又は- 863位塩基が Aである腫瘍壊死因子 α遺 伝子の- 863位塩基を含む部分 D Ν Α領域に相補的な配列を有する核酸、
(3) 242位塩基が Cである NADH/NADPHォキシダ一ゼ p22 フォックス遺伝子の 24 2位塩基を含む部分 DNA領域に相補的な配列を有する核酸、 又は 242位塩基が T である腫瘍壊死因子 0；遺伝子の 242位塩基を含む部分 DNA領域に相補的な配列を 有する核酸、
(4) -6位塩基が Gであるアンギオテンシノーゲン遺伝子の- 6位塩基を含む部分 D N A領域に相補的な配列を有する核酸、 又は- 6位塩基が Aであるアンギオテンシ ノーゲン遺伝子の- 6位塩基を含む部分 D N A領域に相補的な配列を有する核酸、 (5) - 21 9位塩基が Gであるアポリポプロテイン E遺伝子の- 2 1 9位塩基を含む部 分 DNA領域に相補的な配列を有する核酸、 又は- 21 9位塩基が Tであるァポリポプ 口ティン E遺伝子の- 2 1 9位塩基を含む部分 D N A領域に相補的な配列を有する核酸、
(6) 994位塩基が Gである血小板活性化因子ァセチルヒ ドロラーゼ遺伝子の 994 位塩基を含む部分 DMA領域に相補的な配列を有する核酸、 又は 994位塩基が丁で ある血小板活性化因子ァセチルヒ ドロラーゼ遺伝子の 994位塩基を含む部分 DNA 領域に相補的な配列を有する核酸、
(7) -482位塩基が Cであるァポリポプロティン C- M I 遺伝子の- 482位塩基を含 む部分 DNA領域に相補的な配列を有する核酸、 又は- 482位塩基が Tであるァポリ ポプロティン C- I I I遺伝子の- 482位塩基を含む部分 DNA領域に相補的な配列を有 する核酸、 (8) 1186位塩基が Gである トロンポスポンジン 4遺伝子の 1186位塩基を含む部 分 DNA領域に相補的な配列を有する核酸、又は 1186位塩基が Cである卜口ンボス ボンジン 4遺伝子の 1186位塩基を含む部分 DNA領域に相補的な配列を有する核酸,
(9) - 819位塩基が Tであるインターロイキン 10遺伝子の- 819位塩基を含む部分 DNA領域に相補的な配列を有する核酸、 又は- 819位塩基が Cであるインタ一ロイ キン 10遺伝子の- 819位塩基を含む部分 DNA領域に相補的な配列を有する核酸、 及び
(10) -592位塩基が Aであるインターロイキン 10遺伝子の- 592位塩基を含む部 分 DNA領域に相補的な配列を有する核酸、 又は- 592位塩基が Cであるインタ一口 ィキン 10遺伝子の- 592位塩基を含む部分 D N A領域に相補的な配列を有する核酸。 以上では、（1) ~ (10)からなるグループから二つ以上の核酸を選択してキッ 卜を 構成しているが、 （1)〜（10)の二つ以上を任意に選択してグループとし、 かかるグ ループから二つ以上の核酸を選択してキッ 卜を構成してもよい。例えば、 （1)、 (5) (6)、 （8)、 （9)及び（10)からなるグループ （後述の実施例においてォッズ比が 1 以 上の多型を解析するための核酸） よリニつ以上の核酸を選択してキッ トを構成し たり、 （1)、 （5)、 （6)、 （8)及び（9)からなるグループ （後述の実施例において才ッ ズ比が上位 5位までの多型を解析するための核酸） よリニつ以上の核酸を選択し てキットを構成することができる。 以下の（11)~(15)からなるグループより選択される二つ以上の核酸を含んでな る遺伝子型検出用キッ ト、
(11) - 1171位から 3'方向に Aが 5個連続して存在するス卜ロメライシン 1遺伝 子の該配列部分を含む部分 DNA領域に相補的な配列を有する核酸、 又は- 1171 位 から 3'方向に Aが 6個連続して存在するストロメライシン 1遺伝子の該配列部分 を含む部分 DNA領域に相補的な配列を有する核酸、 (12)- 668位から 3'方向に連続して 4個の Gが存在するプラスミノ一ゲン活性化 因子インヒビ夕一 1 遺伝子の該配列部分を含む部分 DNA領域に相補的な配列を有 する核酸、又は- 668位から 3'方向に連続して 5個の Gが存在するプラスミノーゲ ン活性化因子ィンヒビ夕一〗 遺伝子の該配列部分を含む部分 DNA領域に相補的な 配列を有する核酸、
(13) 1018位塩基が Cであるグリコプロティン Iba遺伝子の 1018位塩基を含む 部分 DMA領域に相補的な配列を有する核酸、又は 1018位塩基が Tであるダリコプ 口ティン Iba遺伝子の 1018位塩基を含む部分 DNA領域に相補的な配列を有する 核酸、
(14) 584位塩基が Gであるパラォキソナーゼ遺伝子の 584位塩基を含む部分 DN A領域に相補的な配列を有する核酸、 又は 584位塩基が Aであるパラ才キソナー ゼ遺伝子の 584位塩基を含む部分 DMA領域に相補的な配列を有する核酸、 及び
(15) 4070位塩基が Cであるァポリポプロティン E遺伝子の 4070位塩基を含む 部分 DNA領域に相補的な配列を有する核酸、又は 4070位塩基が Tであるアポリポ プロテイン E遺伝子の 4070位塩基を含む部分 DNA領域に相補的な配列を有する核 酸。 '
以上では、 （11)~ (15)からなるグループから二つ以上の核酸を選択してキッ 卜 を構成しているが、 （11)~(15)の二つ以上を任意に選択してグループとし、 かか るグループから二つ以上の核酸を選択してキッ トを構成してもよい。 例えば、 （1 1)、 （12)、 （14)及び（15)からなるグループ （後述の実施例において才ッズ比が 1 以上の多型を解析するための核酸） よリニつ以上の核酸セッ 卜を選択してキッ ト を構成したり、 （11)、 （12)及び（15)からなるグループ （後述の実施例において才 ッズ Jtが上位 3位までの多型を解析するための核酸） より二つ以上の核酸を選択 してキッ 卜を構成することができる。 以下の核酸を含んでなる遺伝子型検出用キッ 卜、
4070位塩基が Cであるァポリポプロティン E遺伝子の 4070位塩基を含む部分 D NA領域に相補的な配列を有する核酸、 又は 4070位塩基が Tであるァポリポプ口 ティン E遺伝子の 4070位塩基を含む部分 D N A領域に相補的な配列を有する核酸。 以下の（1 ) ~ (1 0)からなるグループよリ選択される二つ以上の核酸セッ 卜を含 んでなる遺伝子型検出用キッ 卜、
(1 )核酸試料中のコネキシン 37遺伝子の 1 01 9位塩基が Cである場合にのみ、該 コネキシン 37遺伝子の 101 9位塩基を含む部分 DNA領域を特異的に増幅するよう に設計された核酸セッ ト、 又は核酸試料中のコネキシン 37遺伝子の 1 01 9位塩基 が Tである場合にのみ、 該コネキシン 37遺伝子の 1 01 9位塩基を含む部分 DNA領 域を特異的に増幅するように設計された核酸セッ 卜、
(2)核酸試料中の腫瘍壊死因子 α遺伝子の- 863位塩基が Cである場合にのみ、 該腫瘍壊死因子 α遺伝子の- 863位塩基を含む部分 DMA領域を特異的に増幅するよ うに設計された核酸セッ 卜、 又は核酸試料中の腫瘍壊死因子 α遺伝子の- 863位塩 基が Αである場合にのみ、 該腫瘍壊死因子 α遺伝子の- 863位塩基を含む部分 DNA 領域を特異的に増幅するように設計された核酸セッ 卜、
(3)核酸試料中の NADH/NADPH才キシダーゼ ρ22フォックス遺伝子の 242位塩基 が Cである場合にのみ、該 NADH/NADPH才キシダーゼ p22フォックス遺伝子の 242 位塩基を含む部分 DNA領域を特異的に増幅するように設計された核酸セッ ト、 又 は核酸試料中の NADH/NADPH才キシダーゼ p22フォックス遺伝子の 242位塩基が T である場合にのみ、該 MADH/NADPH才キシダ一ゼ p22フォックス遺伝子の 242位塩 基を含む部分 DMA領域を特異的に増幅するように設計された核酸セッ ト、
(4)核酸試料中のアンギオテンシノーゲン遺伝子の- 6位塩基が Gである場合に のみ、該アンギオテンシノーゲン遺伝子の- 6位塩基を含む部分 DNA領域を特異的 に増幅するように設計された核酸セッ 卜、 又は核酸試料中のアンギオテンシノー ゲン遺伝子の- 6位塩基が Aである場合にのみ、該アンギオテンシノーゲン遺伝子 の - 6位塩基を含む部分 DMA領域を特異的に増幅するように設計された核酸セッ 卜、
(5)核酸試料中のアポリポプロティン E遺伝子の- 21 9位塩基が Gである場合に のみ、 該ァポリポプ口ティン E遺伝子の- 21 9位塩基を含む部分 DN A領域を特異的 に増幅するように設計された核酸セッ 卜、 又は核酸試料中のアポリポプロティン E遺伝子の- 21 9位塩基が Tである場合にのみ、該ァポリポプロティン E遺伝子の - 21 9位塩基を含む部分 D N A領域を特異的に増幅するように設計された核酸セッ ト、
(6)核酸試料中の血小板活性化因子ァセチルヒドロラーゼ遺伝子の 994 位塩基 が Gである場合にのみ、 該血小板活性化因子ァセチルヒドロラーゼ遺伝子の 994 位塩基を含む部分 DMA領域を特異的に増幅するように設計された核酸セッ 卜、 又 は核酸試料中の血小板活性化因子ァセチルヒ ドロラーゼ遺伝子の 994位塩基が T である場合にのみ、 該血小板活性化因子ァセチルヒ ドロラーゼ遺伝子の 994位塩 基を含む部分 DMA領域を特異的に増幅するように設計された核酸セッ 卜、
(7)核酸試料中のアポリポプロテイン C- I I I 遺伝子の- 482位塩基が Cである場 合にのみ、該ァポリポプ口ティン C- I I I遺伝子の- 482位塩基を含む部分 DMA領域 を特異的に増幅するように設計された核酸セッ 卜、 又は核酸試料中のァポリポプ ロティン C- 1 I I遺伝子の- 482位塩基が Tである場合にのみ、該ァポリポプロティ ン C- I I I遺伝子の- 482位塩基を含む部分 DNA領域を特異的に増幅するように設計 された核酸セッ ト、
(8)核酸試料中のト口ンポスポンジン 4遺伝子の 1 1 86位塩基が Gである場合に のみ、該卜口ンボスポンジン 4遺伝子の 1 1 86位塩基を含む部分 DNA領域を特異的 に増幅するように設計された核酸セッ 卜、 又は核酸試料中の卜ロンボスボンジン 4遺伝子の 1 1 86位塩基が Cである場合にのみ、 該トロンボスポンジン 4遺伝子の 1 1 86位塩基を含む部分 DMA領域を特異的に増幅するように設計された核酸セッ 卜、 (9)核酸試料中のィンターロイキン 10遺伝子の- 819位塩基が Tである場合にの み、 該ィンターロイキン 10遺伝子の- 819位塩基を含む部分 DMA領域を特異的に 増幅するように設計された核酸セッ ト、 又は核酸試料中のインターロイキン 10 遺伝子の- 819位塩基が Cである場合にのみ、該インターロイキン 10遺伝子の - 81 9位塩基を含む部分 DMA領域を特異的に増幅するように設計された核酸セッ 卜、 及び
(10)核酸試料中のィン夕一ロイキン 10遺伝子の- 592位塩基が Aである場合に のみ、 該インターロイキン 10遺伝子の- 592位塩基を含む部分 DNA領域を特異的 に増幅するように設計された核酸セッ 卜、 又は核酸試料中のィンターロイキン 10 遺伝子の- 592位塩基が Cである場合にのみ、該ィンターロイキン 10遺伝子の- 59 2位塩基を含む部分 DNA領域を特異的に増幅するように設計された核酸セッ 卜。 以上では、（1)〜（10)からなるグループから二つ以上の核酸セッ トを選択してキ ッ 卜を構成しているが、 （1)〜（10)の二つ以上を任意に選択してグループとし、 か かるグループから二つ以上の核酸セッ 卜を選択してキッ 卜を構成し もよい。 例 えば、 （1)、 （5)、 （6)、 （8)、 （9)及び（10)からなるグループ （後述の実施例におい て才ッズ比が 1以上の多型を解析するための核酸セッ 卜） より二つ以上の核酸セ ッ 卜を選択してキッ トを構成したり、 （1)、 （5)、 （6)、 （8)及び（9)からなるグルー プ （後述の実施例において才ッズ比が上位 5位までの多型を解析するための核酸 セッ ト） よリニつ以上の核酸セッ 卜を選択してキッ 卜を構成することができる。 以下の（11 ) ~ (15)からなるグループより選択される二つ以上の核酸セッ トを含 んでなる遺伝子型検出用キッ ト、
(11)核酸試料中のス卜ロメライシン 1 遺伝子において- 117〗 位から 3'方向に A が 5個連続して存在する場合にのみ、 該ス卜ロメライシン 1遺伝子の該配列部分 を含む部分 DMA領域を特異的に増幅するように設計された核酸セッ ト、 又は核酸 試料中のストロメライシン 1遺伝子において- Π 71位から 3 '方向に Aが 6個連続 して存在する場合にのみ、 該ス卜ロメライシン 1遺伝子の該配列部分を含む部分 DNA領域を特異的に増幅するように設計された核酸セッ 卜、
(1 2)核酸試料中のプラスミノーゲン活性化因子インヒビ夕一 1 遺伝子において -668位から 3 '方向に Gが 4個連続して存在する場合にのみ、プラスミノーゲン活 性化因子インヒビタ一1 遺伝子の該配列部分を含む部分 DNA領域を特異的に増幅 するように設計された核酸セッ 卜、 又は核酸試料中のプラスミノーゲン活性化因 子インヒビ夕一 1遺伝子において- 668位から 3 '方向に Gが 5個連続して存在する 場合にのみ、 該プラスミノーゲン活性化因子インヒビター 1 遺伝子の該配列部分 を含む部分 DMA領域を特異的に増幅するように設計された核酸セッ 卜、
(1 3)核酸試料中のダリコプロティン I b a遺伝子の 1 018位塩基が Cである場合 にのみ、 該グリコプロテイン I b a遺伝子の 1 01 8位塩基を含む部分 DNA領域を特 異的に増幅するように設計された核酸セッ 卜、 又は核酸試料中のグリコプロティ ン I b a遺伝子の 1 01 8位塩基が Tである場合にのみ、 該グリコプロティン I b α遺 伝子の 1 0 1 8位塩基を含む部分 DMA領域を特異的に増幅するように設計された核酸 セッ 卜、
(14)核酸試料中のパラ才キソナーゼ遺伝子の 584位塩基が Gである場合にのみ、 該パラ才キソナ一ゼ遺伝子の 584位塩基を含む部分 DNA領域を特異的に増幅する ように設計された核酸セッ ト、 又は核酸試料中のパラ才キソナーゼ遺伝子の 584 位塩基が Aである場合にのみ、 該パラ才キソナーゼ遺伝子の 584位塩基を含む部 分 DNA領域を特異的に増幅するように設計された核酸セッ 卜、 及び
(1 5)核酸試料中のアポリポプロティン E遺伝子の 4070位塩基が Cである場合に のみ、該ァポリポプロティン E遺伝子の 4070位塩基を含む部分 DNA領域を特異的 に増幅するように設計された核酸セッ 卜、 又は核酸試料中のアポリポプロテイン E遺伝子の 4070位塩基が Tである場合にのみ、該ァポリポプ口ティン E遺伝子の 4070位塩基を含む部分 DNA領域を特異的に増幅するように設計された核酸セッ 卜。 以上では、 （11)~(15)からなるグループから二つ以上の核酸セッ 卜を選択して キッ 卜を構成しているが、（Π)〜（15)の二つ以上を任意に選択してグループとし、 かかるグループから二つ以上の核酸セッ トを選択してキッ トを搆成してもよい。 例えば、 （11)、 （12)、 （14)及び（15)からなるグループ （後述の実施例においてォ ッズ比が 1 以上の多型を解析するための核酸セッ 卜） より二つ以上の核酸セッ 卜 を選択してキッ トを構成したり、 （11)、 （12)及び（15)からなるグループ （後述の 実施例において才ッズ比が上位 3位までの多型を解析するための核酸セッ 卜） よ り二つ以上の核酸セッ 卜を選択してキッ 卜を構成することができる。 以下の核酸セッ 卜を含んでなる遺伝子型検出用キッ 卜、
核酸試料中のアポリポプロティン Ε遺伝子の 4070位塩基が Cである場合にのみ、 該ァポリポプ口ティン Ε遺伝子の 4070位塩基を含む部分 DNA領域を特異的に増幅 するように設計された核酸セッ 卜、 又は核酸試料中のアポリポプロティン Ε遺伝 子の 4070位塩基が Τである場合にのみ、 該ァポリポプ口ティン Ε遺伝子の 4070 位塩基を含む部分 DMA領域を特異的に増幅するように設計された核酸セッ ト。 以下の（1)〜（10)からなるグループより選択される二つ以上の核酸セッ トを含 んでなる遺伝子型検出用キッ 卜、
(1)コネキシン 37遺伝子の 1019位塩基を含む部分 DMA領域を特異的に増幅する ように設計された核酸セッ 卜であって、 1019位塩基が Cであるコネキシン 37遺 伝子において 1019位塩基を含む部分 D M A領域、に対して特異的にハイブリダィズ するセンスプライマ一及び/又は 〗019位塩基が Tであるコネキシン 37遺伝子に おいて 1019位塩基を含む部分 D N A領域、に対して特異的にハイブリダィズするセ ンスプライマーと、コネキシン 37遺伝子の一部領域に対して特異的にハイブリダ ィズするアンチセンスプライマ一と、 からなる核酸セッ ト、
(2)腫瘍壊死因子 a 遺伝子の- 863位塩基を含む部分 DMA領域を特異的に増幅す るように設計された核酸セッ 卜であって、- 863位塩基が Cである腫瘍壊死因子 a 遺伝子において- 863位塩基を含む部分 DMA領域、 に対して特異的にハイブリダイ ズするアンチセンスプライマー及び/又は- 863位塩基が Aである腫瘍壊死因子 a 遺伝子において- 863位塩基を含む部分 DM A領域、 に対して特異的にハイブリダィ ズするアンチセンスプライマ一と、腫瘍壊死因子 α 遺伝子の一部領域に対して特 異的にハイブリダィズするセンスプライマーと、 からなる核酸セッ ト、
(3) NADH/NADPH才キシダーゼ p22フ才ックス遺伝子の 242位塩基を含む部分 DN A領域を特異的に増幅するように設計された核酸セッ 卜であって、 242位塩基が C である NADH/NADPH才キシダ一ゼ p22 フォックス遺伝子において- 863位塩基を含 む部分 DMA領域、 に対して特異的にハイブリダィズするアンチセンスプライマー 及び/又は 242位塩基が Tである NADH/NADPH才キシダーゼ p22フ才ックス遺伝子 において 242位塩基を含む部分 DNA領域、 に対して特異的にハイブリダィズする アンチセンスプライマーと、 NADH/MADPH才キシダーゼ p22フォックス遺伝子の一 部領域に対して特異的にハイプリダイズするセンスプライマ一と、 からなる核酸 セッ 卜、
(4)アンギオテンシノーゲン遺伝子の- 6位塩基を含む部分 DMA領域を特異的に 増幅するように設計された核酸セッ トであって、 - 6位塩基が Gであるアンギ才テ ンシノーゲン遺伝子において- 6位塩基を含む部分 DNA領域、 に対して特異的にハ ィブリダイズするアンチセンスプライマー及び/又は- 6位塩基が Aであるアンギ ォテンシノーゲン遺伝子において- 6位塩基を含む部分 DNA領域、 に対して特異的 にハイプリダイズするアンチセンスプライマーと、 アンギオテンシノ一ゲン遺伝 子の一部領域に対して特異的にハイプリダイズするセンスプライマーと、 からな る核酸セッ 卜、 (5)ァポリポプロティン E遺伝子の- 21 9位塩基を含む部分 DNA領域を特異的に 増幅するように設計された核酸セッ トであって、 - 21 9位塩基が Gであるアポリポ プロティン E遺伝子において- 21 9位塩基を含む部分 DNA領域、 に対して特異的に ハイブリダィズするセンスプライマー及びノ又は- 21 9位塩基が Tであるアポリポ プロテイン E遺伝子において- 21 9位塩基を含む部分 DMA領域、 に対して特異的に ハイブリダィズするセンスプライマーと、 アポリポプロテイン E遺伝子の一部領 域に対して特異的にハイブリダィズするアンチセンスプライマーと、 からなる核 酸セッ 卜、
(6)血小板活性化因子ァセチルヒドロラーゼ遺伝子の 994位塩基を含む部分 DNA 領域を特異的に増幅するように設計された核酸セッ 卜であって、 994 位塩基が G である血小板活性化因子ァセチルヒドロラーゼ遺伝子において 994位塩基を含む 部分 D N A領域、 に対して特異的にハイブリダィズするセンスプライマー及びノ又 は 994位塩基が Tである血小板活性化因子ァセチルヒドロラ一ゼ遺伝子において 994位塩基を含む部分隐領域、 に対して特異的にハイプリダイズするセンスプ ライマーと、 血小 ί反活性化因子ァセチルヒドロラーゼ遺伝子の一部領域に対して 特異的にハイプリダイズするアンチセンスプライマーと、 からなる核酸セッ ト、
(7)アポリポプロティン C- 1 I I 遺伝子の- 482位塩基を含む部分 DNA領域を特異 的に増幅するように設計された核酸セッ トであって、 - 482位塩基が Cであるアポ リポプロティン C- 1 I I遺伝子において- 482位塩基を含む部分 DMA領域、 に対して 特異的にハイブリダィズするセンスプライマー及び Z又は- 482位塩基が Tである アポリポプロテイン C- I I I遺伝子において- 482位塩基を含む部分 DNA領域、 に対 して特異的にハイブリダィズするセンスプライマーと、 アポリポプロテイン C- I I I 遺伝子の一部領域に対して特異的にハイブリダィズするアンチセンスプライマ 一と、 からなる核酸セッ 卜、
(8) トロンボスボンジン 4遺伝子の 1 1 86位塩基を含む部分 DNA領域を特異的に 増幅するように設計された核酸セッ 卜であって、 1 186位塩基が Gである 卜ロンボ スポンジン 4遺伝子において 1 1 86位塩基を含む部分 DMA領域、に対して特異的に 八イブりダイズするセンスプライマー及び/又は 1 186位塩基が Cである 卜ロンボ スポンジン 4遺伝子において 1 1 86位塩基を含む部分 DNA領域、に対して特異的に ハイプリダイズするセンスプライマ一と、 卜ロンポスポンジン 4遺伝子の一部領 域に対して特異的にハイブリダイズするアンチセンスプライマーと、 からなる核 酸セッ ト、
(9)インターロイキン 1 0遺伝子の- 81 9位塩基を含む部分 DNA領域を特異的に増 幅するように設計された核酸セッ 卜であって、 -81 9位塩基が Tであるイン夕一口 ィキン 1 0遺伝子において- 81 9位塩基を含む部分 DNA領域、 に対して特異的にハ イブリダィズするセンスプライマ一及び Z又は 1 186位塩基が Cであるイン夕一口 ィキン 1 0遺伝子において- 81 9位塩基を含む部分 DMA領域、 に対して特異的にハ イブリダィズするセンスプライマーと、インターロイキン 10遺伝子の一部領域に 対して特異的に八イブリダィズするアンチセンスプライマーと、 からなる核酸セ ッ ト、 及び
(1 0)インターロイキン 1 0遺伝子の- 592位塩基を含む部分 DNA領域を特異的に 増幅するように設計された核酸セッ 卜であって、 -592位塩基が Aであるインター ロイキン 1 0遺伝子において- 592位塩基を含む部分 DMA領域、 に対して特異的に ハイブリダイズするアンチセンスプライマー及び/又は- 592位塩基が Cであるィ ンタ一ロイキン 1 0遺伝子において- 592位塩基を含む部分 DNA領域、 に対して特 異的にハイブリダィズするアンチセンスプライマーと、インタ一ロイキン 10遺伝 子の一部領域に対して特異的にハイブリダィズするセンスプライマーと、 からな る核酸セッ 卜。
以上では、（1 )〜（10)からなるグループから二つ以上の核酸セッ 卜を選択してキ ッ 卜を構成しているが、 （1 )〜（1 0)の二つ以上を任意に選択してグループとし、 か かるグループから二つ以上の核酸セッ 卜を選択してキッ 卜を構成してもよい。 例 えば、 （1 )、 （5)、 （6)、 （8)、 （9)及び（1 0)からなるグループ （後述の実施例におい てォッズ比が Ί 以上の多型を解析するための核酸セッ 卜） よリニつ以上の核酸セ ッ 卜を選択してキッ トを構成したリ、 （1 )、 （5)、 （6)、 （8)及び（9)からなるグルー プ （後述の実施例において才ッズ比が上位 5位までの多型を解析するための核酸 セッ ト） よリニつ以上の核酸セッ 卜を選択してキッ 卜を構成することができる。 以下の（1 1 ) ~ ( 1 5)からなるグループより選択される二つ以上の核酸セッ トを含 んでなる遺伝子型検出用キッ 卜、
( 1 1 )ストロメライシン 1 遺伝子の- 1 1 7 1 位における多型部分を含む部分 DMA領 域を特異的に増幅するように設計された核酸セッ 卜であって、 - 1 1位から 3 '方 向に Aが 5個連続して存在するス卜ロメライシン 1遺伝子において当該配列部分 を含む部分 D N A領域、 に対して特異的にハイブリダィズするセンスプライマー及 び/又は- 1 1 71位から 3 '方向に Aが 6個連続して存在するス卜ロメライシン 1遺 伝子において当該配列部分を含む部分 DMA領域、 に対して特異的にハイブリダィ ズするセンスプライマーと、 ストロメライシン 1遺伝子の一部領域に対して特異 的にハイブリダィズするアンチセンスプライマーと、 からなる核酸セッ 卜、
( 1 2)プラスミノ一ゲン活性化因子インヒビ夕一 1遺伝子の- 668位における多型 部分を含む部分 DNA領域を特異的に増幅するように設計された一組のプライマ一 と、並びに- 668位から 3 '方向に Gが 4個連続して存在するプラスミノ一ゲン活性 化因子インヒビ夕一 1 遺伝子において該配列部分を含む部分 DNA領域、 に対して 特異的にハイブリダイズするプロ一ブ及び/又は- 668位から 3 '方向に Gが 5個連 続して存在するプラスミノ一ゲン活性化因子インヒビ夕一 1 遺伝子において該配 列部分を含む部分 D N A領域、 に対して特異的にハイブリダィズするプローブと、 からなる核酸セッ ト、 (1 3)グリコプロティン I b a 遺伝子の 1018位塩基を含む部分 DMA領域を特異的 に増幅するように設計された核酸セッ トであって、 101 8位塩基が Cであるグリコ プロテイン I b ex 遺伝子において 1018位塩基を含む部分 DMA領域、 に対して特異 的にハイブリダィズするセンスプライマー及びノ又は 1 01 8位塩基が Tであるダリ コプロテイン I b a 遺伝子において 1 018位塩基を含む部分 DNA領域、 に対して特 異的にハイブリダィズするセンスプライマーと、ダリコプロテイン I b a 遺伝子の —部領域に対して特異的にハイブリダィズするアンチセンスプライマーと、 から なる核酸セッ 卜、
( 14 )パラ才キソナーゼ遺伝子の 584位塩基を含む部分 D N A領域を特異的に増幅 するように設計された核酸セッ トであって、 584位塩基が Gであるパラ才キソナ
—ゼ遺伝子において 584位塩基を含む部分 DMA領域、 に対して特異的にハイプリ ダイズするセンスプライマー及び Z又は 584位塩基が Aであるパラ才キソナーゼ 遺伝子において 584位塩基を含む部分 DNA領域、 に対して特異的にハイブリダィ ズす ¾センスプライマーと、 パラォキソナ一ゼ遺伝子の一部領域に対して特異的 にハイブリダィズするアンチセンスプライマ一と、 からなる核酸セッ ト、 及び
(1 5)アポリポプロテイン E遺伝子の 4070位塩基を含む部分 DMA領域を特異的に 増幅するように設計された核酸セッ トであって、 4070位塩基が Cであるアポリポ プロティン E遺伝子において 4070位塩基を含む部分 DMA領域、に対して特異的に ハイブリダィズするセンスプライマー及びノ又は 4070位塩基が Tであるアポリポ プロティン E遺伝子において 4070位塩基を含む部分 DMA領域、に対して特異的に ハイブリダィズするセンスプライマーと、 アポリポプロテイン E遺伝子の一部領 域に対して特異的にハイブリダイズするァンチセンスプライマーと、 からなる核 酸セッ ト。
以上では、 （1 1 )〜（1 5)からなるグループから二つ以上の核酸セッ トを選択して キッ卜を構成しているが、（1 1 )〜 5)の二つ以上を任意に選択してグループとし、 かかるグループから二つ以上の核酸セッ 卜を選択してキッ 卜を構成してもよい。 例えば、 （11)、 （12)、 （14)及び（15)からなるグループ （後述の実施例において才 ッズ比が 1 以上の多型を解析するための核酸セッ 卜） よリニつ以上の核酸セッ 卜 を選択してキッ トを構成したり、 （11)、 （12)及び（15)からなるグループ （後述の 実施例においてォッズ比が上位 3位までの多型を解析するための核酸セッ ト） よ リニつ以上の核酸セッ 卜を選択してキッ トを搆成することができる。 以下の核酸セッ 卜を含んでなる遺伝子型検出用キッ 卜、
ァポリポプロティン E遺伝子の 4070位塩基を含む部分 DMA領域を特異的に増幅 するように設計された核酸セッ 卜であって、 4070位塩基が Cであるアポリポプロ ティン E遺伝子において 4070位塩基を含む部分 DMA領域、に対して特異的にハイ プリダイズするセンスプライマー及び Z又は 4070位塩基が Tであるアポリポプロ ティン E遺伝子において 4070位塩基を含む部分 DNA領域、に対して特異的にハイ プリダイズするセンスプライマーと、 アポリポプロテイン E遺伝子の一部領域に 対して特異的にハイブリダィズするアンチセンスプライマーと、 からなる核酸セ ッ 卜。 以下の（υ~ do)からなるグループより選択される二つ以上の核酸セッ トを含 んでなる遺伝子型検出用キッ 卜、
(1) 1019位塩基が Cであるコネキシン 37遺伝子のアンチセンス鎖において 101 9 位塩基に対応する塩基を含む部分領域、 に対して特異的にハイプリダイズし且 つ第 1 の標識物質で標識された第 1核酸と、 1019位塩基が Τであるコネキシン 3 7遺伝子のアンチセンス鎖において 1019位塩基に対応する塩基を含む部分領域、 に対して特異的にハイプリダイズし且つ第 2の標識物質で標識された第 2核酸と、 及びコネキシン 37 遺伝子のセンス鎖の一部領域に対して特異的にハイブリダィ ズし且つ前記第 1 核酸/又は前記第 2核酸とともに使用されてコネキシン 37 遺 伝子の 1 0 1 9位塩基を含む部分 DNA領域を特異的に増幅することが可能な第 3核酸 と、 からなる核酸セッ 卜、
(2) - 863位塩基が Cである腫瘍壊死因子 a遺伝子のセンス鎖において- 86 3位塩 基を含む部分領域、 に対して特異的にハイブリダィズし且つ第 1 の標識物質で標 識された第 1 核酸と、 -863位塩基が Aである腫瘍壊死因子 a 遺伝子のセンス鎖 において- 863位塩基を含む部分領域、 に対して特異的にハイプリダイズし且つ第 2の標識物質で標識された第 2核酸と、及び腫瘍壊死因子 a 遺伝子のアンチセン ス鎖の一部領域に対して特異的に八イブリダィズし且つ前記第 Ί 核酸/又は前記 第 2核酸とともに使用されて腫瘍壊死因子 a 遺伝子の- 863位塩基を含む部分 DM A領域を特異的に増幅することが可能な第 3核酸と、 からなる核酸セッ 卜、
( 3) 242位塩基が Cである NADH/NAD PH才キシダーゼ p 22フォックス遺伝子のセ ンス鎖において 242位塩基を含む部分領域、 に対して特異的にハイプリダイズし 且つ第 1 の標識物質で標識された第 1 核酸と、 242位塩基が Tである NADH/IJAD PH ォキシダ一ゼ p 22フォックス遺伝子のセンス鎖において 242位塩基を含む部分領 域、 に対して特異的にハイブリダイズし且つ第 2の標識物質で標識された第 2核 酸と、及び NADH/NAD PH才キシダーゼ p 22フォックス遺伝子のアンチセンス鎖の一 部領域に対して特異的にハイプリダイズし且つ前記第 1 核酸/又は前記第 2核酸 とともに使用されて NADH/NAD PHォキシダーゼ p 22フォックス遺伝子の 242位塩基 を含む部分 DNA領域を特異的に増幅することが可能な第 3核酸と、 からなる核酸 セッ 卜、
(4) -6位塩基が Gであるアンギオテンシノーゲン遺伝子のセンス鎖において - 6 位塩基を含む部分領域、 に対して特異的にハイプリダイズし且つ第 1 の標識物質 で標識された第 1 核酸と、 -6位塩基が Aであるアンギオテンシノーゲン遺伝子の センス鎖において- 6位塩基を含む部分領域、 に対して特異的にハイブリダィズし 且つ第 2の標識物質で標識された第 2核酸と、 及びアンギオテンシノーゲン遺伝 子のアンチセンス鎖の一部領域に対して特異的に八イブリダィズし且つ前記第 1 核酸 Z又は前記第 2核酸とともに使用されてアンギオテンシノーゲン遺伝子の - 6 位塩基を含む部分 D N A領域を特異的に増幅することが可能な第 3核酸と、 からな る核酸セッ ト、
(5) - 2 1 9位塩基が Gであるァポリポプロティン E遺伝子のアンチセンス鎖にお いて- 2 1 9位塩基に対応する塩基を含む部分領域、 に対して特異的にハイプリダイ ズし且つ第 1 の標識物質で標識された第 1 核酸と、 -2 1 9位塩基が Tであるァポリ ポプロティン E遺伝子のアンチセンス鎖において- 2 1 9位塩基に対応する塩基を含 む部分領域、 に対して特異的にハイブリダィズし且つ第 2の標識物質で標識され た第 2核酸と、 及びアポリポプロテイン E遺伝子のセンス鎖の一部領域に対して 特異的にハイプリダイズし且つ前記第 1 核酸ノ又は前記第 2核酸とともに使用さ れてァポリポプ口ティン E遺伝子の- 2 1 9位塩基を含む部分 DMA領域を特異的に増 幅することが可能な第 3核酸と、 からなる核酸セッ 卜、
( 6 ) 994位塩基が Gである血小板活性化因子ァセチルヒドロラーゼ遺伝子のアン チセンス鎖において 994位塩基に対応する塩基を含む部分領域、 に対して特異的 にハイブリダィズし且つ第 1 の標識物質で標識された第 1 核酸と、 994位塩基が T である血小板活性化因子ァセチルヒドロラーゼ遺伝子のアンチセンス鎖において 994 位塩基に対応する塩基を含む部分領域、 に対して特異的にハイブリダィズし 且つ第 2の標識物質で標識された第 2核酸と、 及び血小板活性化因子ァセチルヒ ド口ラーゼ遺伝子のセンス鎖の一部領域に対して特異的にハイプリダイズし且つ 前記第 1 核酸 Z又は前記第 2核酸とともに使用されて血小板活性化因子ァセチル ヒ ドロラ一ゼ遺伝子の 994位塩基を含む部分 DMA領域を特異的に増幅することが 可能な第 3核酸と、 からなる核酸セッ ト、
(7) -482位塩基が Cであるアポリポプロテイン C- I I I 遺伝子のアンチセンス鎖 において- 482位塩基に対応する塩基を含む部分領域、 に対して特異的にハイプリ ダイズする第 1 核酸と、 -482位塩基が Tであるアポリポプロテイン C- I M遺伝子 のアンチセンス鎖において- 482位塩基に対応する塩基を含む部分領域、 に対して 特異的にハイブリダィズする第 2核酸と、 アポリポプロテイン C- I I I遺伝子のセ ンス鎮の一部領域に対して特異的にハイブリダィズし且つ前記第 1 核酸/又は前 記第 2核酸とともに使用されてアポリポプロテイン C- 1 I I遺伝子の- 482位塩基を 含む部分 DMA領域を特異的に増幅することが可能な第 3核酸と、 前記第 1 核酸及 び前記第 3核酸を用いて増幅された核酸に対して特異的にハイブリダイズする第 4核酸と、 並びに前記第 2核酸及び前記第 3核酸を用いて増幅された核酸に対し て特異的にハイブリダィズする第 5核酸と、 からなる核酸セッ ト、
(8) 1 1 86位塩基が Gである卜ロンボスボンジン 4遺伝子のアンチセンス鎖にお いて 1 1 86位塩基に対応する塩基を含む部分領域、に対して特異的にハイプリダイ ズし且つ第 1 の標識物質で標識された第 1 核酸と、 1 1 86位塩基が Cである卜ロン ポスポンジン 4遺伝子のアンチセンス鎖において 1 1 86位塩基に対応する塩基を含 む部分領域、 に対して特異的にハイブリダィズし且つ第 2の標識物質で標識され た第 2核酸と、 及び卜ロンボスボンジン 4遺伝子のセンス鎖の一部領域に対して 特異的にハイブリダィズし且つ前記第 1 核酸ノ又は前記第 2核酸とともに使用さ れて卜ロンボスボンジン 4遺伝子の 1 1 86位塩基を含む部分 DMA領域を特異的に増 幅することが可能な第 3核酸と、 からなる核酸セッ ト、
(9) -8 1 9位塩基が Tであるイン夕一ロイキン 1 0遺伝子のァンチセンス鎖におい て - 81 9位塩基に対応する塩基を含む部分領域、 に対して特異的にハイブリダィズ する第 1 核酸と、 - 81 9位塩基が Cであるインタ一ロイキン 1 0遺伝子のアンチセ ンス鎮において- 81 9位塩基に対応する塩基を含む部分領域、 に対して特異的にハ ィプリダイズする箄 2核酸と、及びィン夕ーロイキン 〗 0遺伝子のセンス鎖の一部 領域に対して特異的にハイブリダィズし且つ前記第 1 核酸ノ又は前記第 2核酸と ともに使用されてィンターロイキン 10遺伝子の- 819位塩基を含む部分 DMA領域 を特異的に増幅することが可能な第 3核酸と、 前記第 1 核酸及び前記第 3核酸を 用いて増幅された核酸に対して特異的にハイブリダィズする第 4核酸と、 並びに 前記第 2核酸及び前記第 3核酸を用いて増幅された核酸に対して特異的にハイプ リダィズする第 5核酸と、 からなる核酸セッ ト、 及び
(10)- 592位塩基が Aであるインターロイキン 10遺伝子のセンス鎖において - 59 2 位塩基を含む部分領域、 に対して特異的にハイプリダイズし且つ第 1 の標識物 質で標識された第 1 核酸と、 -592位塩基が Cであるインタ一ロイキン 10遺伝子 のセンス鎖において- 592位塩基を含む部分領域、 に対して特異的にハイプリダイ ズし且つ第 2の標識物質で標識された第 2核酸と、及びィンタ一ロイキン 10遺伝 子のアンチセンス鎖の一部領域に対して特異的にハイプリダイズし且つ前記第 1 核酸/又は前記第 2核酸とともに使用されてインタ一ロイキン 10 遺伝子の- 592 位塩基を含む部分 DMA領域を特異的に増幅することが可能な第 3核酸と、 からな る核酸セッ卜。
以上では、（1)~(10)からなるグループから二つ以上の核酸セッ 卜を選択してキ ッ 卜を構成しているが、 （1)~ (10)の二つ以上を任意に選択してグループとし、 か かるグループから二つ以上の核酸セッ 卜を選択してキッ 卜を構成してもよい。 例 えば、 （1)、 （5)、 （6)、 （8)、 （9)及び（10)からなるグループ （後述の実施例におい て才ッズ比が 1 以上の多型を解析するための核酸セッ 卜） より二つ以上の核酸セ ッ 卜を選択してキッ トを構成したり、 （1)、 （5)、 （6)、 （8)及び（9)からなるグルー プ （後述の実施例においてォッズ比が上位 5位までの多型を解析するための核酸 セッ 卜） より二つ以上の核酸セッ 卜を選択してキッ 卜を構成することができる。 以下の（Π )〜（15)からなるグループより選択される二つ以上の核酸セッ トを含 んでなる遺伝子型検出用キッ ト、 (1D-1171位から 3'方向に Aが 5個連続して存在するストロメライシン 1遺伝 子のアンチセンス鎖において該配列部分に対応する配列を含む部分領域、 に対し て特異的にハイプリダイズし且つ第 1 の標識物質で標識された第 1 核酸と、 -117 1位から 3'方向に Aが 6個連続して存在するス卜ロメライシン 1遺伝子のアンチ センス鎖において該配列部分に対応する配列を含む部分領域、 に対して特異的に ハイプリダイズし且つ第 2の標識物質で標識された第 2核酸と、 及びス卜口メラ ィシン 1遺伝子のセンス鎖の一部領域に対して特異的にハイプリダイズし且つ前 記第 1 核酸/又は前記第 2核酸とともに使用されてストロメライシン 1遺伝子の -1171 位における多型部分を含む部分 DMA領域を特異的に増幅することが可能な 第 3核酸と、 からなる核酸セッ ト、
(12)プラスミノ一ゲン活性化因子ィンヒビタ一 1遺伝子の- 668位における多型 部分を含む部分 DNA領域を特異的に増幅するように設計された一組の核酸 （第 1 核酸及び第 2核酸） と、 -668位から 3'方向に Gが 4個連続して存在するプラスミ ノーゲン活性化因子インヒビター 1 遺伝子を錶型とし且つ前記一組の核酸を用い て増幅される核酸に対して特異的にハイブリダィズする第 3核酸と、及び- 668位 から 3'方向に Gが 5個連続して存在するプラスミノ一ゲン活性化因子インヒビ夕 一 1 遺伝子を鏵型とし且つ前記一組の核酸を用いて増幅される核酸に対して特異 的にハイブリダィズする第 4核酸と、 からなる核酸セッ 卜、
(13) 1018位塩基が Cであるグリコプロテイン Iba 遺伝子のアンチセンス鎖に おいて 1018位塩基に対応する塩基を含む部分領域、に対して特異的にハイブリダ ィズし且つ第 1 の標識物質で標識された第 1 核酸と、 1018位塩基が Tであるグリ コプロテイン I bex 遺伝子のアンチセンス鎖において 1018位塩基に対応する塩基 を含む部分領域、 に対して特異的にハイブリダィズし且つ第 2の標識物質で標識 された第 2核酸と、及びグリコプロテイン I ba 遺伝子のセンス鎖の一部領域に対 して特異的にハイプリダイズし且つ前記第 1 核酸ノ又は前記第 2核酸とともに使 用されてダリコプロティン I b ex 遺伝子の 1 01 8位塩基を含む部分 DNA領域を特異 的に増幅することが可能な第 3核酸と、 からなる核酸セッ 卜、
(1 4) 584位塩基が Gであるパラォキソナーゼ遺伝子のアンチセンス鎖において 5 84位塩基に対応する塩基を含む部分領域、 に対して特異的にハイブリダイズし且 つ第 1 の標識物質で標識された第 1核酸と、 584位塩基が Aであるパラ才キソナ ーゼ遺伝子のアンチセンス鎖において 584位塩基に対応する塩基を含む部分領域、 に対して特異的にハイブリダィズし且つ第 2の標識物質で標識された第 2核酸と, 及びパラ才キソナーゼ遺伝子のセンス鎖の一部領域に対して特異的にハイブリダ ィズし且つ前記第 1核酸/又は前記第 2核酸とともに使用されてパラォキソナー ゼ遺伝子の 584位塩基を含む部分 DMA領域を特異的に増幅することが可能な第 3 核酸と、 からなる核酸セッ ト、 及び
(1 5) 4070位塩基が Cであるアポリポプロテイン E遺伝子のアンチセンス鎖にお いて 4070位塩基に対応する塩基を含む部分領域、に対して特異的にハイプリダイ ズし且つ第 1 の標識物質で標識された第 1核酸と、 4070位塩基が Tであるァポリ ポプ口ティン E遺伝子のアンチセンス鎖において 407 D位塩基に対応する塩基を含 む部分領域、 に対して特異的にハイプリダイズし且つ第 2の標識物質で標識され た第 2核酸と、 及びアポリポプロテイン E遺伝子のセンス鎖の一部領域に対して 特異的にハィブリダイズし且つ前記第 1 核酸ノ又は前記第 2核酸とともに使用さ れてァポリポプロティン E遺伝子の 4070位塩基を含む部分 DNA領域を特異的に増 幅することが可能な第 3核酸と、 からなる核酸セッ ト。
以上では、 （Π )〜（1 5)からなるグループから二つ以上の核酸セッ 卜を選択して キッ トを構成しているが、（1 1 ) ~ (1 5)の二つ以上を任意に選択してグループとし、 かかるグループから二つ以上の核酸セッ 卜を選択してキッ 卜を構成してもよい。 例えば、 （1 1 )、 （1 2)、 （1 4)及び（1 5)からなるグループ （後述の実施例においてォ ッズ比が 1 以上の多型を解析するための核酸セッ 卜） より二つ以上の核酸セッ ト 3477
52 を選択してキッ トを搆成したり、 （11)、 （12)及び（15)からなるグループ （後述の 実施例において才ッズ比が上位 3位までの多型を解析するための核酸セッ 卜） よ リニつ以上の核酸セッ 卜を選択してキッ 卜を構成することができる。 以下の核酸セッ 卜を含んでなる遺伝子型検出用キッ 卜、
4070位塩基が Cであるアポリポプロテイン E遺伝子のアンチセンス鎖において 4070位塩基に対応する塩基を含む部分領域、 に対して特異的にハイプリダイズし 且つ第 1 の標識物質で標識された第 1 核酸と、 4070位塩基が Tであるァポリポプ 口ティン E遺伝子のアンチセンス鎖において 4070位塩基に対応する塩基を含む部 分領域、 に対して特異的にハイブリダィズし且つ第 2の標識物質で標識された第 2核酸と、 及びアポリポプロティン E遺伝子のセンス鎖の一部領域に対して特異 的にハイブリダイズし且つ前記第 1 核酸/又は前記第 2核酸とともに使用されて ァポリポプロティン E遺伝子の 4070位塩基を含む部分 DNA領域を特異的に増幅す ることが可能な第 3核酸と、 からなる核酸セッ 卜。 以上のキッ トにおいては、 キッ トの使用方法に応じた一又は二以上の試薬 （バ ッファー、 反応用試薬、 検出用試薬など） などを組み合わせてもよい。
以下、 実施例を用いて本発明をより詳細に説明する。 く実施例 1 > 遺伝子多型の選択
PubMed [l\la t i ona I Center for Biological Informat ion (NCBI)] , Onl ine Mend e I i a n inher i tance in Men (NCBI) , Single Nucleot ide Polymorphism (NCBリな どの数種類の公的データベースを用いて、 今までに報告された遺伝子の中から血管生 物学、 血小板■白血球生物学、 凝固線溶系、 脂質■糖■その他の代謝因子などの総合的 側面から冠動脈硬化、 冠動脈攣縮、 高血圧、 糖尿病、 高脂血症などとの関連が推 定される 71遺伝子を抜粋した。さらにこれらの遺伝子に存在する多型の中でプロ モーター領域ゃェクソンに存在するもの、 あるいはスプライスドナー部位ゃァク セプ夕一部位に位置し、 遺伝子産物の機能変化との関連が予想されるものを中心 に 112多型を選択した （図 1 及び図 2)。
<実施例 2 > 遺伝子多型の決定
対象は日本人男女 5061例 （男性 3309例、 女性 1752例） で、 1994年 7月から 2001 年 12月の間に 15参加施設に外来受診または入院した症例である。 心筋梗塞は 2819 例 （男性 2003例、 女性 816例） で、 全例に冠動脈造影および左室造影を行った。 心 筋梗塞の診断は典型的な心電図変化および血清 CK、G0T、LDHの上昇により行った。 さらに左室造影による壁運動異常およびそれに対応する左主幹動脈あるいは主要 な冠動脈の狭窄により心筋梗塞の確定診断を行った。 対照は 2242例 （男性 1306例、 女性 936例） で、 参加施設を受診し冠動脈疾患の 従来の危険因子、 即ち喫煙 （1 日 10本以上）、 肥満 （body mass index≥26 kg/m2), 高血圧 （収縮期血圧≥140 mmHgまたは拡張期血圧≥90 關 Hgあるいはその両方）、 糖尿病（空腹時血糖≥ 126 mg/dLまたはへモグロビン A1c≥ 6.5¾あるいはその両方）, 高脂血症 （血清総コレステロール≥220 mg/dい、 高尿酸血症 （男性では血清尿酸≥ 7.7 mg/dL, 女性では血清尿酸≥5·5 mg/dL) の少なくとも一つを有するが冠動脈疾 患を有しない症例である。 これらの対照は安静時心電図が正常であり、 運動負荷試 験でも心筋虚血性変化は認められなかった。 それぞれの対象から静脈血 7 mLを 50 mmol/L EDTA- 2Naを含むチューブに採血し、 ゲノム DNA を DMA 抽出キッ ト （Qiagen, Chatsworth, CA) を用いて抽出した。 71 候補遺伝子 112多型の決定は蛍光 .発光法によるァリル特異的プライマー ·プロ一 プ測定システム （東洋紡ジーンアナリシス、 敦賀、 日本） によリ行った （図 3及び 図 4 )。 多型部位を含む DNA 断片は 5'末端にフル才レセインイソチオシァネート (fluorescein i soth i ocyanate： FITC) またはテキサスレッ ド (Texas red： TxR) で標識した 2種類のァリル特異的センスプライマ一（またはアンチセンスプライマ 一） と 5'末端をピオチンで標識したアンチセンスプライマー （またはセンスブラ イマ一） を用いて polymerase chain reaction (PCR)により増幅した。 また別法と して、 多型部位を含む DMA断片は 1種類のァリル特異的センスプライマ一と 5'末 端をビ才チンで標識したアンチセンスプライマーを用いて、またはセンスプライマ 一と 5'末端をピオチンで標識したアンチセンスプライマーを用いて PCR により増 幅した。 反応溶液 （25 L) には 20 ngの DNA， 5 pmol の各プライマー， 0.2關 ol/L の各デ才キシヌクレオシド三リン酸 （dATP, dGTP, dCTP, dTTP) ， 卜 4 mmol /し の MgCI2, 1 Uの DNAポリメラ一ゼ（rTaq or KODplus; 東洋紡、 大阪、 日本） を含み、 それぞれの DNA ポリメラーゼ緩衝液を用いた。 増幅プロ トコールは初期変性が 95C、 5分 ； 35- 45 cyclesで変性が 95°C、 30分、 アニーリングが 55-67.5°Cで 30 秒、 伸展が 72°Cで 30秒、 そして最終伸展を 72°Cで 2分とした。 蛍光法による遺伝子型の決定では、 増幅した DMA を 96 穴プレー卜の各ゥエル でス卜レブ卜アビジン結合磁気ビーズを含む溶液中で室温でィンキュベー卜した。 このプレー卜を磁気スタンド上に置き、 各ゥエルから上清を採取し、 0.01 M NaO Hを含む 96穴プレー卜の各ゥエルに移した後、 マイクロプレー卜リーダ一により F1TCは励起 ■ 蛍光波長が 485 と 538 nm、 TxRは励起■ 蛍光波長が 584 と 612 nm で蛍光を測定した。 また発光法による遺伝子型の決定では、 増幅した DNA を 0.3 M NaOH で変性させ、 96 穴プレートの各ゥエルの底面に固定したいずれかのァリ ル特異的補足プローブと 35- 4(Uホルムアミ ドを含むハイプリダイゼーシヨン緩 衝液で 37°C、 30分間ハイブリダィゼーシヨンを行った。 ゥエルを十分に洗浄した 後、 アルカリフォスファタ一ゼ結合ストレプトアビジンを各ゥエルに加え、 プレ 一卜を 37°Cで 15分間振騰した。 ゥエルを再度洗浄し、 0.8 mM 2- (4- i odopheny I ) -3-(4-ni trophenyl)-5-(2, 4-disu l fophenyl)-2 /-tetrazol i urn (monosod i um sal りと 0.4 mM 5-bromo-4-ch I oro-3- i ndo I y I phosphate p- 1 o I u i d i n e sal t を含む 溶液を加えた後、 吸光度 450 nmを測定した。 以上の方法による遺伝子型決定の精度を確認するために、 50人の DNAサンプル を無作為に選び PCR-制限酵素断片長多型 （PCR-RFLP) 法または PCR産物の直接塩 基配列決定法を行った。 いずれのサンプルにおいてもァリル特異的プライマー · プローブ測定システムにより決定された遺伝子型は PCR-制限酵素断片長多型法 または DMA塩基配列決定法によって決定されたものと同一であった。 尚、 以下の関連解析における統計解析は次のように行った。 まず、 デ一夕は平 均土標準偏差で表示した。 臨床データは心筋梗塞患者と対照との間で unpai red S tudent' s t test または Mann- «lh i tney U tes tを用いて比較した。 3群間のデータ (ί one-way ana lysis of variance または Kruskaト Mia I I i s tes tな,らびに Schef f e' s post-hoc testにより比較した。 定性的デ一夕は chi- square testで検定した。 ァリノレ頻度は gene count ing methodにより 定し、 Hardy- e i nberg equi l ibriu mから逸脱しているかどうかは chi-square test によって検定した。 また、危険因 子を補正した多因子口ジスティック回帰分析を行った。心筋梗塞は従属因子とし、 年齢、 body mass index (BMI)、 喫煙状況（0=非喫煙， 1=喫煙）、 代謝因子 （0=高血 圧■糖尿病 ·高コレステロール血症■高尿酸血症の経歴なし、 1 = 経歴あリ）、 そ れぞれの多型の遺伝子型を独立因子とした。 それぞれの遺伝子型は dominant (優 性） , recess ive (劣性） ， addi t ive (付加） 遺伝モデルで解析し、 P値、 才ッズ 比、 95%信頼区間（CI)を算出した。 組み合わせ遺伝子型解析では、 ロジスティック 回帰分析の stepwise forward select ion method によりそれぞれの遺伝子型につ いての才ッズ比を算出した。 '
<実施例 3 > 心筋梗塞関連多型の選択、 及び心筋梗塞診断方法の開発
最初に 71遺伝子 112多型に関するスクリ一二ング関連解析を男性 451例（心筋 梗塞 219例、 対照 232例）、 女性 458例（心筋梗塞 226例、 対照 232例）について行 つた。 これらの症例は全体の 5061例から無作為に選んだ。
以上の方法でスクリーニング関連解析を行った 909例（男性 451例、 女性 458 例）の背景データを図 5に示す。 男性においては、 年齢、 BMI、 および従来の冠動 脈疾患の危険因子である喫煙、 高血圧、 糖尿病、 高コレステロール血症、 高尿酸 血症などの頻度には心筋梗塞群と対照群との間に有意差を認めなかつた。 女性で は、 年齢、 BMI、 および高血圧、 高コレステロール血症、 高尿酸血症などの頻度に は心筋梗塞群と対照群との間に有意差を認めなかったが、 喫煙および糖尿病の頻 度は心筋梗塞群では対照群に比べ有意に高値であった。 112多型と心筋梗塞との スクリーニング関連解析において、 年齢、 BMI、 および喫煙、 高血圧、 糖尿病、 高 ゴレステロール血症、 高尿酸血症の頻度を補正した多因子口ジスティック回帰分 析によリ男性で 19個、女性で 18個の一塩基多型 （SNP) が心筋梗塞との関連を示 した（図 6)。 尚、 スクリーニング関連解析においてはロジスティック回帰分析に おいて /3値 <0.1 の場合関連ありとするカテゴリーを用いた。 これらの SNPの中 で、 4個の SNPが男女両方の心筋梗塞と関連し、 他の SNPは男女いずれか一方の 心筋梗塞と関連した。 次に、 これらの多型の遺伝子型を残りの 4152例（男性心筋梗塞 1784例、男性対 照 1074例、 女性心筋梗塞 590例、 女性対照 704 例）について決定した。 次に、 こ れらの多型と心筋梗塞との関連についての大規模関連解析を合計 5061例（男性心 3003477
57 筋梗塞 2003例、 男性対照 1306例、 女性心筋梗塞 816例、 女性対照 936例）におい て遂行した。 大規模関連解析における全 5061例（男性 3309、 女性 1752例）の背景データを図 7に示す。 男性では、 年齢、 BMI および喫煙の頻度には心筋梗塞群と対照群との 間に有意差を認めなかったが、 高血圧、 高尿酸血症は心筋梗塞群が対照群に比べ て有意に低く、 糖尿病と高コレステロール血症の頻度は心筋梗塞群が対照群に比 ベ有意に高かった。 女性では、 年齢および高血圧の頻度には心筋梗塞群と対照群 との間に有意差を認めなかったが、 BMI および喫煙、 糖尿病、 高コレステロール 血症、高尿酸血症の頻度は心筋梗塞群が対照群に比べ有意に高かった。男性 19 SNP、 女性 18 SNP と心筋梗塞との大規模関連解析において、 年齢、 BMし および喫煙、 高血圧、 糖尿病、 高コレステロール血症、 高尿酸血症の頻度を補正した多因子口 ジスティック回帰分析により男性で 10個、女性で 5個の SNPが心筋梗塞と有意な 関連を示した （dominant または recess ive 遺伝モデルのいずれかが P< 0.05) (図 8)。これらの SNPについての遺伝子型の分布および口ジスティック回帰 分析の結果を図 8と図 9にそれぞれ示す。 本実施例では多因子口ジスティック回帰分析の s tepwi se forward select ion m ethod を行った（図 1 0 )。 この方法では、 図 9に示したそれぞれの SNPの心筋梗塞 との関連における/3値に基づいて dominant又は recessive遺伝モデルを採用した。 これらの遺伝子の染色体上の遺伝子座を図 1 0に示す。 インターロイキン 10 ( I n terleukin-10) 遺伝子の- 819T→C多型と- 592A→C多型は連鎮不平衡にあった [pa i rwise l inkage disequi l ibrium coeff i ci ent, D ( >/Dfflax)， of 0.406; standard i zed l inkage disequi l ibrium coeff icient, r, of 0.396; P く 0.0001, chト sq uare test]。 腫瘍壊死因子 a (Tumor necros is factor- a ) 遺伝子と血小板活性 化因子ァセチリレヒドロラーゼ (platelet - act ivat ing factor acety I hydro I ase) 遺伝子の遺伝子座は近接しているが、 両者の多型における遺伝子型の分布には関 連を認めなかった。 同様に、 プラスミノーゲン活性化因子インヒビタ一1 (plasm i nogen act ivator inhibi tor - 1 )遺伝子と pa raoxonase 遺 1E子の遺伝子 は近接 しているが、 両者の多型における遺伝子型の分布には関連を認めなかった。
Stepwise forward sel ect ion methodにより算出した組み合わせ遺伝子型によ る心筋梗塞罹患のォッズ比を、 男性は図 1 1 と図 1 3 (A)に、 女性は図 1 2と図 1 3 (B)に示す。 男性では、 5個の SNP(TSP4(1186G→C)多型、 コネキシン 37(1019 C→T)多型、 PAFァセチルヒドロラーゼ（994G→T)多型、アンギオテンシノ一ゲン（- 6G—A)多型、 腫瘍壊死因子 α (- 863C→A)多型） の組み合わせ遺伝子型により、 最 大の才ッズ比が 4.50となった（図 1 1 、 図 1 3 (A)参照）。 さらに 5個の SNP(MADH /NADPH才キシダ一ゼ p22フォックス（242C→T)多型、 アポ E (- 219G→T)多型、 アポ C- 1 i I (- 482C→T)多型、 IL- 10(- 819T→C)多型、 I L - 10 (- 592A→C)多型）を加え全部 で 10個の SNPとした場合には最大の才ッズ比が 11.26となった（図 1 0と図 1 3 (A)参照）。女性では、 5個の SNP (アポ E(4070C→T)多型、グリコプロティン I b a (1 018C→T)多型、ス卜ロメライシン 1 (- U71/5A→6A)多型、 PAI〗（- 668/4G→5G)多型、 パラォキソナーゼ（584G→A)多型）の組み合わせ遺伝子型により、 最大の才ッズ比 が 88.51 となった（図 1 2と図 1 3 (B)参照）。 以上のように、本発明者らは 71候補遺伝子から選択した 112多型と心筋梗塞と の関連について検討し、 5061例の大規模関連解析により心筋梗塞と関連する SNP を男性で 10個、 女性で 5個同定した。 さらに、 多因子ロジスティック回帰分析の stepwise forward select ion methodによリ男性では最大才ッズ比 11.26、 女性で は最大ォッズ比 88.51 を呈する心筋梗塞リスク診断方法 （心筋梗塞の遺伝的リス ク診断システム） を開発した。 心筋梗塞の主な原因は動脈硬化性冠動脈疾患であリ、 これにより動脈内径の血 行力学的な有意狭窄を生じ、 血管の収縮拡張調節の異常を来し、 動脈硬化巣の破 裂や血栓形成を起こしやすくする。 本発明者らは血管生物学、 血小板 · 白血球生 物学、 凝固 ■線溶系、 脂質 ·糖 · その他の代謝因子などの包括的視点に基づいて 71個の候補遺伝子を選択した。 実際、 心筋梗塞と関連した遺伝子群はその発症病 態において多彩な役割を有していた。 すなわち、 血管生物学（connexi n 37, NADH/NADPH oxidase p22 phox, and t rombospond i n 4)、 血管の炎症（tumor necrosi s factor- a , pi ate I et-act i vat i ng factor acety I hydro I ase, and interleukin - 10)、 高血圧 (ang i o tens i nogen)、 脂質代謝 (apo 1 i popro.te i n E and C - I I I and paraoxonase) , 血小板機肯 (glycoprotein \b ) 基質代謝 (stromelysin-1) , 線溶系（PA 1-1)などである (Boerma M, Forsberg L, van Zei j I L, e t a I . A genet ic polymorphism in conne in 37 as a prognost ic marker for atherosclerot ic plaque development. J Intern Med 1999;246:211-218. , I noue N, Ka ash ima S, Kanaza a , Yamada S， Ak i t a H, Yokoy ama M. Polymorphism of the NADH/NADPH ox i dase p22 phox gene in pat i ents wi th coronary artery disease. Ci rculation 1998;97: 135-137. , Topol EJ, McCarthy J, Gabriel S, et al . Si ngle nucl eot ide polymorphisms in mul t iple novel t rombospond i n genes may be associated wi th fami l ial premature myocardial infarct ion. Ci rculat ion 2001 ;104:2641-2644. , Skoog T, van' t Hoof t FM, Kai l in B, et al . A common funct ional polymorphi sm (C→A subst i tut ion at pos i t ion -863) in the promoter region of the tumor necros is factor - cc (TNF- ) gene associated wi th reduced ci rculating level of TNF- . Hum Mol Genet 1999 ; 8 : 1443-1449. , Yamada Y, I c h i a r a S, Fuj imura T， Yoko ta M. I dent i f i cat ion of the G994→T mi ssense t bo
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112遺伝子多型を 909 例において検討し、 さらに 19個の SNPを男性 2858例で、 18個の SNPを女性 1294例で検討した結果、 合計で 179, 402個の遺伝子型を決定 した。 この遺伝子型決定数は今まで報告された遺伝子多型の関連解析の中で最大 のものである。 以上の実施例で示された心筋梗塞リスク診断方法は最大才ッズ比 が男性で 11.26、 女性で 88.51 を呈し、 これも今までに報告された大規模関連解 祈の中で最大のォッズ比である。 心筋梗塞と関連した 15個の SNPの中で、 アポリポプロテイン E (apol ipoprote in E) 遺伝子の 4070T—C (Argl 58Cys)多型が女性の心筋梗塞リスクとして最大 の才ッズ比を示した。 アポリポプロテイン Eはカイロミクロンと超低密度リポプ ロティン (very low densi ty I i poprote i n： VLDL) レ厶ナン卜の主要構成成分で あり、 肝臓での受容体によるこれらのリポタンパクの取り込みに際し、 リガンド として働く ( ah I ey RW. Apo I ipoprote i n E： cholesterol transport protein w i th expanding role in eel I biology. Science 1998 '· 240 ·■ 622-630.)。 アポリポ プロテイン E遺伝子の 158Cys ( ε 2)ァリルはレ厶ナントリポタンパクの肝臓の受 容体への結合異常を来し （Schneider J, Kovanen P丁， Brown MS, et al . Fain i I i a I dysbetal ipoproteinemia. Abnormal bi nding of mutant apo I i poprote i n E to low dens i ty l ipoprotein receptors of human f ibroblasts and membranes f rom l iver and adrenal of rats, rabbi ts, and cows . J Cl i n I nvest 1981 ;6 8: 1075- 1085·)、血漿からの除去の遅延を生ずる （Gregg RE, Zech LA, Schaefer EJ , Brewer HB Jr. Type I I I hyperl ipoproteinemia: defect ive metabol ism of an abnormal apo I i poprote i n E. Sci ence 1981 ;211■· 584 - 586. )。 家族性 dysbeta I ipoproteinemia (FD， または I I I型高リポタンパク血症）患者の多くは、 Arg158 Cys多型のホモ接合体である （Bres low JL, Zannis VI, SanGiacomo TR, Thi rd J L, Tracy T, G I ueck CJ. Studies of fami l ial type I I I hyperl ipoproteinemi a us i ng as a genet i c marker the apo E pheno type El/2. J Lipid Res 1982； 2 3: 1224-1235. )„ しかし、 158Cys/Cysホモ接合体のうち わずか 〗〜 4¾しか家族性 dysbetal ipoproteinemiaを発症しないことから、 他の遺伝因子あるいは環境因子 が本疾患の発症に必要であると思われる。家族性 dysbetal ipoproteinemia患者に おける動脈硬化性レ厶ナントリポタンパク （/8 - VLDい の血漿中への蓄積 （Mahl e y RW. Apol ipoprotein E： cholesterol transport protein i th expanding ro I e in cel l biology. Science 1998 ; 240 : 622- 630· )あるいはヒ 卜 158Cy s/Cysを過 剰発現したマウス （Sul l ivan P , Mezdour H, Quarfordt SH， Maeda N. Type I I I hyperl ipoproteinemia and spontaneous atherosclerosi s in mi ce resul ting f rom gene replacement of mouse Apoe wi th human AP0E*2. J Cl in I nvest 19 98; 102: 130-135. ) は、動脈硬化の進展促進が認められる。 Eto らは ε 2 (158Cys) ァリルが日本人の男性（才ッズ比 2· 44, ε 2 al lele 対 ε 3/ ε 3 型） および女性 (才ッズ比 3.03)で冠動脈疾患と関連することを報告した （Eto , Watanabe K, Mak i no I . Increased f requency of apo I i popro te i n eps i Ion 2 and eps i I on 4 al leles in pat ients wi th ischemic heart disease. Cl in Genet 1989 ; 36 : 183- 188.)。 ΓΓ型 （158Cys/Cys) が心筋梗塞罹患の危険因子となるという本発明者ら の結果は、 Eto らの結果と一致する。 以上の実施例で検討した SNPのいくつかは、 その近傍に存在する心筋梗塞発症 と真に関連する遺伝子の SNPと連鎖不平衡にある可能性がある。 しかしながら、 男性で 9個、 女性で 5個の遺伝子が日本人の心筋梗塞感受性遺伝子座であること が示された。 さらに、 組み合わせ遺伝子型により信頼性および予知確率の高いリ スク診断が可能になった。 このことから、 本発明の診断方法は心筋梗塞の一次予 防および中高年者の生活の質の改善ならびに医療費の削減に貢献できることが期 待される。 この発明は、 上記発明の実施の形態及び実施例の説明に何ら限定されるもので はない。特許請求の範囲の記載を逸脱せず、当業者が容易に想到できる範囲で種々 の変形態様もこの発明に含まれる。 以下、 次の事項を開示する。
1 1 . 以下の工程（al)を含んでなる、 核酸試料の遺伝子型を検出する方法、 (aD 核酸試料における、 以下の（1)~(10)の多型を解析する工程、
(I)コネキシン 37遺伝子の塩基番号 1019位の多型、
(2)腫瘍壊死因子 ex遺伝子の塩基番号- 863位の多型、
(3) MADH/NADPH才キシダーゼ p22フォックス遺伝子の塩基番号 242位の多型、
(4)アンギオテンシノーゲン遺伝子の塩基番号- 6位の多型、
(5)アポリポプロテイン E遺伝子の塩基番号- 219位の多型、
(6)血小板活性化因子ァセチルヒドロラーゼ遺伝子の塩基番号 994位の多型、 ひ）アポリポプロテイン C- M l遺伝子の塩基番号- 482位の多型、
(8) 卜ロンボスボンジン 4遺伝子の塩基番号 1186位の多型、
(9)インターロイキン 10遺伝子の塩基番号- 819位の多型、 及び
(10)インターロイキン 10遺伝子の塩基番号- 592位の多型。
1 2. 以下の工程（bl)を含んでなる、 核酸試料の遺伝子型を検出する方法、 (bl) 核酸試料における、 以下の（11)〜（15)の多型を解析する工程、
(II)ス卜ロメライシン 1遺伝子の塩基番号- 1171位の多型、
(12)プラスミノ一ゲン活性化因子ィンヒビ夕一〗遺伝子の塩基番号- 668位の 多型、
(13)ダリコプロティン Iba遺伝子の塩基番号 1018位の多型、
(14)パラ才キソナーゼ遺伝子の塩基番号 584位の多型、 及び (15)アポリポプロテイン E遺伝子の塩基番号 4070位の多型。
1 3. 以下の工程（l)〜（III)を含んでなる、 心筋梗塞のリスク診断方法、
(|)核酸試料における、 以下の（i)〜 do)の多型を解析する工程、
(I)コネキシン 37遺伝子の塩基番号 1019位の多型、
(2)腫瘍壊死因子 α;遺伝子の塩基番号- 863位の多型、
(3) NADH/NADPH才キシダーゼ P22フォックス遺伝子の塩基番号 242位の多型、
(4)アンギオテンシノーゲン遺伝子の塩基番号- 6位の多型、
(5)アポリポプロテイン E遺伝子の塩基番号- 219位の多型、
(6)血小板活性化因子ァセチルヒドロラ一ゼ遺伝子の塩基番号 994位の多型、 (7)ァポリポプロティン C- 1 I I遺伝子の塩基番号- 482位の多型、
(8)トロンボスポンジン 4遺伝子の塩基番号 1186位の多型、
(9)インターロイキン 10遺伝子の塩基番号- 819位の多型、 及び
(10)インターロイキン 10遺伝子の塩基番号- 592位の多型、
(I I)前記工程によって得られる多型情報から核酸試料の遺伝子型を決定するェ 程、 及び
(I II)決定された遺伝子型から心筋梗塞の遺伝的リスクを求める工程。
1 4. 以下の工程（IV)〜（VI)を含んでなる、 心筋梗塞のリスク診断方法、
(IV)核酸試料における、 以下の（11) ~ (15)の多型を解析する工程、
(II)ストロメライシン 1遺伝子の塩基番号- 1171位の多型、
(12)プラスミノ一ゲン活性化因子ィンヒビ夕一 1遺伝子の塩基番号- 668位の 多型、
(13)グリコプロテイン Iba遺伝子の塩基番号 1018位の多型、
( )パラ才キソナーゼ遺伝子の塩基番号 584位の多型、 及び
(15)アポリポプロテイン E遺伝子の塩基番号 4070位の多型、
(V)前記工程によって得られる多型情報から核酸試料の遺伝子型を決定するェ 程、 及び
( V I )決定された遺伝子型から心筋梗塞の遺伝的リスクを求める工程。 産業上の利用の可能性
本発明によれば心筋梗塞に関連する遺伝子多型が解析され、 核酸試料の遺伝子 型が検出される。 この遺伝子型の検出によって得られる多型情報を用いることに より、 高精度で予知確率の高い心筋梗塞のリスク診断を行うことができる。 した がって、 本発明は心筋梗塞の発症リスクを事前に知る有効な手段となる。 また、 本発明によればこれらの疾患の診断に有用な補助的情報が得られ、 より適切な治 療を可能とし予後の改善などを図ることができる。 更に本発明は、 心筋梗塞の発 症メカニズムを解明する上での有効な情報を提供し、 心筋梗塞の予防、 治療へ貢 献することが期待される。

Claims

請 求 の 範 囲
1 . 以下の工程（a)を含んでなる、 核酸試料の遺伝子型を検出する方法、
(a) 核酸試料における、 以下の（1)〜（10)からなるグループより選択される二 つ以上の多型を解析する工程、
(1)コネキシン 37遺伝子の塩基番号 1019位の多型、
(2)腫瘍壊死因子 α遺伝子の塩基番号- 863位の多型、
(3) NADH/MADPHォキシダーゼ p22フォックス遺伝子の塩基番号 242位の多型、
(4)アンギオテンシノーゲン遺伝子の塩基番号- 6位の多型、
(5)アポリポプロテイン E遺伝子の塩基番号- 219位の多型、
(6)血小板活性化因子ァセチルヒドロラーゼ遺伝子の塩基番号 994位の多型、
(7)アポリポプロテイン C- I I I遺伝子の塩基番号- 482位の多型、
(8) トロンポスポンジン 4遺伝子の塩基番号 1186位の多型、
(9)インターロイキン 10遺伝子の塩基番号- 819位の多型、 及び
(10)インターロイキン 10遺伝子の塩基番号- 592位の多型。
2. 以下の工程（b)を含んでなる、 核酸試料の遺伝子型を検出する方法、
(b) 核酸試料における、 以下の（11)~(15)からなるグループより選択される二 つ以上の多型を解析する工程、
(Π)ス卜ロメライシン 1遺伝子の塩基番号- Π 71位の多型、
(12)プラスミノ一ゲン活性化因子ィンヒビター 1遺伝子の塩基番号- 668位の 多型、
(13)ダリコプロテイン Iba遺伝子の塩基番号 1018位の多型、
(14)パラ才キソナ一ゼ遺伝子の塩基番号 584位の多型、 及び
(15)ァポリポプロティン E遺伝子の塩基番号 4070位の多型。
3. 以下の工程（c)を含んでなる、 核酸試料の遺伝子型を検出する方法、
(c) 核酸試料における、 アポリポプロテイン E遺伝子の塩基番号 4070位の多 型を解析する工程。
4. 以下の工程（i)~(i ί i)を含んでなる、 心筋梗塞のリスク診断方法、
(i)核酸試料における、 以下の（1)〜（10)からなるグループより選択される二つ 以上の多型を解析する工程、
(1)コネキシン 37遺伝子の塩基番号 1019位の多型、
(2)腫瘍壊死因子 a遺伝子の塩基番号- 863位の多型、
(3) NADH/NADPH才キシダーゼ p22フォックス遺伝子の塩基番号 242位の多型、
(4)アンギオテンシノーゲン遺伝子の塩基番号- 6位の多型、
(5)アポリポプロティン E遺伝子の塩基番号- 219位の多型、
(6)血小板活性化因子ァセチルヒ ドロラーゼ遺伝子の塩基番号 994位の多型、 (7)アポリポプロテイン C-l I I 遺伝子の塩基番号- 482位の多型、
(8) 卜ロンポスポンジン 4遺伝子の塩基番号 1186位の多型、
(9)インタ一ロイキン 10遺伝子の塩基番号- 819位の多型、 及び
(10)インタ一ロイキン 10遺伝子の塩基番号- 592位の多型、
(i i)前記工程によって得られる多型情報から核酸試料の遺伝子型を決定するェ 程、 及び
(i i i)決定された遺伝子型から心筋梗塞の遺伝的リスクを求める工程。
5. 以下の工程（iv：)〜（vi)を含んでなる、 心筋梗塞のリスク診断方法、
(iv)核酸試料における、 以下の（Π) ~ (15)からなるグループより選択される二 つ以上の多型を解析する工程、 (11)ストロメライシン 1遺伝子の塩基番号- 1171位の多型、
(12)プラスミノーゲン活性化因子インヒビ夕一 1遺伝子の塩基番号 - 668位の 多型、
(U)ダリコプロティン Iba遺伝子の塩基番号 1018位の多型、
(14)パラ才キソナーゼ遺伝子の塩基番号 584位の多型、 及び
(15)ァポリポプロティン E遺伝子の塩基番号 4070位の多型、
(V)前記工程によって得られる多型情報から核酸試料の遺伝子型を決定するェ 程、 及び
(vi)決定された遺伝子型から心筋梗塞の遺伝的リスクを求める工程。
6. 以下の工程（vi i：)〜（ix)を含んでなる、 心筋梗塞のリスク診断方法、
(vi i)核酸試料における、 アポリポプロテイン E遺伝子の塩基番号 4070位の多 型を解析する工程、
(vi i 前記工程によって得られる多型情報から核酸試料の遺伝子型を決定する 工程、 及び
(ix)決定された遺伝子型から心筋梗塞の遺伝的リスクを求める工程。
7.以下の（ 1 ) ~ ( 10 )からなるグループより選択される二つ以上の核酸を含んでな る遺伝子型検出用キッ 卜、
(1)コネキシン 37遺伝子の塩基番号 1019位の多型を解析するための核酸、
(2)腫瘍壊死因子 α遺伝子の塩基番号- 863位の多型を解析するための核酸、
(3) NADH/NADPHォキシダ一ゼ p22 フ才ックス遺伝子の塩基番号 242位の多型を 解析するための核酸、
(4)アンギオテンシノーゲン遺伝子の塩基番号- 6 位の多型を解析するための核 酸、 (5)ァポリポプロティン E遺伝子の塩基番号- 219位の多型を解析するための核 酸、
(6)血小板活性化因子ァセチルヒドロラーゼ遺伝子の塩基番号 994 位の多型を 解析するための核酸、
(7)ァポリポプロティン C- I I I 遺伝子の塩基番号- 482位の多型を解析するため の核酸、
(8)卜口ンボスポンジン 4遺伝子の塩基番号 1186位の多型を解析するための核 酸、
(9)インターロイキン 10遺伝子の塩基番号- 819位の多型を解析するための核酸, 及び
(10)インターロイキン 10遺伝子の塩基番号- 592位の多型を解析するための核 酸。
8. 以下の（11)〜（15)からなるグループより選択される二つ以上の核酸を含んで なる遺伝子型検出用キッ ト、
(11)ストロメライシン 1 遺伝子の塩基番号- 1171 位の多型を解析するための核 酸、
(12)プラスミノ一ゲン活性化因子インヒビター 1遺伝子の塩基番号- 668位の多 型を解析するための核酸、
(13)グリコプロテイン Iba遺伝子の塩基番号 1018位の多型を解析するための 核酸、
(14)パラ才キソナ一ゼ遺伝子の塩基番号 584位の多型を解析するための核酸、 及び
(15)ァポリポプロティン E遺伝子の塩基番号 4070位の多型を解析するための核 酸。
9.ァポリポプロティン E遺伝子の塩基番号 4070位の多型を解析するための核酸、 を含んでなる遺伝子型検出用キッ 卜。 1 0.以下の（1)〜（10)からなるグループより選択される二つ以上の核酸が不溶性 支持体に固定されてなる固定化核酸、
(1)コネキシン 37遺伝子の塩基番号 1019位の多型を解析するための核酸、
(2)腫瘍壊死因子 α遺伝子の塩基番号- 863位の多型を解析するための核酸、
(3) NADH/NADPH才キシダーゼ p22 フォックス遺伝子の塩基番号 242位の多型を 解析するための核酸、
(4)アンギオテンシノーゲン遺伝子の塩基番号- 6 位の多型を解析するための核 酸、
(5)ァポリポプロティン E遺伝子の塩基番号- 219位の多型を解析するための核 酸、
(6)血小板活性化因子ァセチルヒドロラーゼ遺伝子の塩基番号 994 位の多型を 解析するための核酸、
(7)ァポリポプロティン C- I I I 遺伝子の塩基番号- 482位の多型を解析するため の核酸、
(8) 卜ロンボスボンジン 4遺伝子の塩基番号 1186位の多型を解析するための核 酸、
(9)インタ一ロイキン 10遺伝子の塩基番号- 819位の多型を解析するための核酸、 及び
(10)イン夕一ロイキン 10遺伝子の塩基番号- 592位の多型を解析するための核 酸。
1 1 . 以下の（10〜 5)からなるグループより選択される二つ以上の核酸が不溶 性支持体に固定されてなる固定化核酸、
(11)ス卜ロメライシン 〗 遺伝子の塩基番号- 1171 位の多型を解析するための核 酸、
(12)プラスミノ一ゲン活性化因子ィンヒビター 1遺伝子の塩基番号- 668位の多 型を解析するための核酸、
(13)グリコプロティン lb ¾遺伝子の塩基番号 1018位の多型を解析するための 核酸、
(14)パラ才キソナーゼ遺伝子の塩基番号 584位の多型を解析するための核酸、 及び
(15)アポリポプロテイン E遺伝子の塩基番号 4070位の多型を解析するための核 酸。
1 2.ァポリポプロティン E遺伝子の塩基番号 4070位の多型を解析するための核 酸が不溶性支持体に固定されてなる固定化核酸。
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