ES2339710T5 - Células que coexpresan vitamina K reductasa y proteína dependiente de vitamina K y uso de las mismas para mejorar la productividad de dicha proteína dependiente de vitamina K - Google Patents

Células que coexpresan vitamina K reductasa y proteína dependiente de vitamina K y uso de las mismas para mejorar la productividad de dicha proteína dependiente de vitamina K Download PDF

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Description

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DESCRIPCION
Celulas que coexpresan vitamina K reductasa y protelna dependiente de vitamina K y uso de las mismas para mejorar la productividad de dicha protelna dependiente de vitamina K
Campo de la invencion
La presente invencion se refiere a las realizaciones caracterizadas en las reivindicaciones.
Antecedentes de la invencion
La funcion de numerosas protelnas requiere la modificacion de multiples residuos de acido glutamico a g-carboxi- glutamato. Entre estas, las protelnas de coagulacion dependientes de vitamina K (VKD), FIX (factor Christmas), FVII y protrombina son las mejor conocidas. La observacion de que la desactivacion del gen de la protelna Gla de la matriz da como resultado la calcificacion de las arterias del raton (Luo et al. (1997) “Spontaneous calcification of arteries and cartilage in mice lacking matrix GLA protein” Nature 386:78-81) enfatiza la importancia del ciclo de la vitamina K para protelnas con funciones diferentes a la coagulacion. Ademas, Gas6 y otras protelnas Gla de funcion desconocida se expresan en el tejido neural y la exposicion a warfarina in utero da como resultado retraso mental y anomallas faciales. Esto concuerda con la observacion de que la expresion de VKD carboxilasa, la enzima que consigue la modificacion de Gla, esta regulada temporalmente de una manera especlfica de tejido con alta expresion en el sistema nervioso durante las fases embrionarias tempranas. De manera simultanea a la carboxilacion, la vitamina K reducida, un cosustrato de la reaccion, se convierte en vitamina K epoxido. Debido a que la cantidad de vitamina K en la dieta humana es limitada, la vitamina K epoxido debe convertirse de nuevo en vitamina K mediante la vitamina K epoxido reductasa (VKOR) para evitar su agotamiento. La warfarina, el farmaco anticoagulante mas ampliamente usado, selecciona como diana la VKOR y evita la regeneracion de la vitamina K. La consecuencia es una disminucion en la concentracion de vitamina K reducida, lo que da como resultado una tasa de carboxilacion reducida mediante la g-glutamil carboxilasa y la production de protelnas dependientes de vitamina K infracarboxiladas.
En los Estados Unidos solo, se prescribe warfarina a mas de un millon de pacientes al ano y en Holanda, se ha notificado que aproximadamente el 2% de la poblacion esta recibiendo un tratamiento con warfarina a largo plazo. Debido a que la dosis de warfarina requerida para un nivel terapeutico de anticoagulacion varla enormemente entre los pacientes, la utilization de warfarina va acompanada de un riesgo significativo de efectos secundarios. Por ejemplo, se ha notificado que tras el inicio del tratamiento con warfarina se produclan episodios de hemorragias importantes en el 1-2% de los pacientes y se producla la muerte en el 0,1-0,7% de los pacientes. A pesar de los peligros, se ha estimado que el uso de warfarina puede prevenir 20 accidentes cerebrovasculares por episodio de hemorragia inducida y probablemente esta utilizandose menos de lo debido por el miedo a la hemorragia inducida.
Sumario de la invencion
La presente invencion proporciona una celula que contiene y expresa un acido nucleico recombinante que comprende un acido nucleico que codifica para una vitamina K epoxido reductasa operativamente asociada a un promotor heterologo, y ademas contiene y expresa un acido nucleico heterologo que codifica una carboxilasa dependiente de vitamina K y expresa un acido nucleico que codifica una protelna dependiente de vitamina K, en la que dicha vitamina K epoxido reductasa convierte la vitamina K epoxido en vitamina K.
Un aspecto adicional de la invencion es metodo para preparar una protelna dependiente de vitamina K que comprende cultivar una celula huesped que expresa para un acido nucleico que codifica una protelna dependiente de vitamina K en presencia de vitamina K y produce una protelna dependiente de vitamina K y luego recolectar la protelna dependiente de vitamina K del cultivo, conteniendo y expresando la celula huesped un acido nucleico heterologo que codifica la carboxilasa dependiente de vitamina K, y la celula huesped conteniendo y expresando ademas un acido nucleico heterologo que codifica la vitamina K epoxido reductasa (VKOR).
Preferiblemente, en los metodos de la invencion, el acido nucleico que codifica para la protelna dependiente de vitamina K se selecciona del grupo que comprende factor VII, factor IX, factor X, protrombina, protelna C y protelna S.
Breve description de los dibujos
Figura 1. Para cada uno de los 13 conjuntos de ARNip, se transfectaron tres frascos T7 que contenlan celulas A549 y se determino la actividad VKOR tras 72 h. En el ensayo de VKOR se uso vitamina K epoxido 25 pM. Un conjunto de ARNip especlfico para el gen gi:13124769 redujo la actividad VKOR en un 64%-70% en ocho repeticiones.
Figura 2. Transcurso de tiempo de la inhibicion de la actividad VKOR mediante el conjunto de ARNip especlfico para gi: 13124769 en celulas A549. La actividad VKOR disminuyo de manera continua durante este periodo de tiempo mientras que el nivel de su ARNm disminuyo rapidamente hasta aproximadamente un 20% del normal. Se uso vitamina K epoxido 25 pM para este ensayo. El ARNip no afecto a la actividad de VKD carboxilasa o al nivel de 5 ARNm de lamin A/C.
Figura 3. Se detecto actividad VKOR cuando se expreso mGC_11276 en celulas de insecto Sf9. Se usaron ~1X106 celulas en este ensayo. Se realizaron las reacciones usando KO 32 pM a 30°C durante 30 minutos en tampon D. Celulas Sf9 blanco sirvieron como control negativo y celulas A549 como referencia.
Figura 4. Inhibicion de VKOR mediante warfarina. Se realizaron las reacciones usando 1,6 mg de protelnas 10 microsomales preparadas a partir de celulas VKOR_Sf9, KO 60 pM y diversas concentraciones de warfarina a 30°C durante 15 minutos en tampon D.
Descripcion detallada de la invencion
Tal como se usa en el presente documento, “un,” “una” o “el/la” pueden significar uno o mas de uno. Por ejemplo, “una” celula puede significar una unica celula o una multiplicidad de celulas.
15 La presente invencion se explica en mayor detalle a continuacion. La descripcion no pretende ser un catalogo detallado de todas las diferentes formas en las que la invencion puede ponerse en practica, o todas las caracterlsticas que pueden anadirse a la presente invencion. Por ejemplo, las caracterlsticas ilustradas con respecto a una realizacion pueden incorporarse en otras realizaciones, y las caracterlsticas ilustradas con respecto a una realizacion particular pueden eliminarse de esa realizacion. Ademas, numerosas variaciones y adiciones a las 20 diversas realizaciones sugeridas en el presente documento resultaran evidentes para los expertos en la tecnica en vista de la presente descripcion que no se apartan de la presente invencion. Por tanto, la siguiente memoria descriptiva pretende ilustrar algunas realizaciones particulares de la invencion, y no especificar exhaustivamente todas las permutaciones, combinaciones y variaciones de la misma.
La “lista de secuencias” adjunta al presente documento forma una parte de la presente memoria descriptiva como si 25 se expusiese completamente en la misma.
La presente invencion puede llevarse a cabo basandose en la presente descripcion y utilizando ademas metodos, componentes y caracterlsticas conocidos en la tecnica, incluyendo pero sin limitarse a los descritos en la patente estadounidense numero 5.268.275 concedida a Stafford y Wu y la patente estadounidense numero 6.531.298 concedida a Stafford y Chang.
30 Tal como se usa en el presente documento, “acidos nucleicos” abarca tanto ARN como ADN, incluyendo ADNc, ADN genomico, ADN sintetico (por ejemplo, sintetizado qulmicamente) y quimeras de ARN y ADN. El acido nucleico puede ser bicatenario o monocatenario. Cuando es monocatenario, el acido nucleico puede ser una cadena sentido o una cadena antisentido. El acido nucleico puede sintetizarse usando analogos o derivados de oligonucleotido (por ejemplo, nucleotidos de fosforotioato o inosina). Tales oligonucleotidos pueden usarse, por ejemplo, para preparar 35 acidos nucleicos que tienen capacidades de apareamiento de bases alteradas o resistencia a nucleasas aumentada.
Un “acido nucleico aislado” es un ADN o ARN que no es inmediatamente contiguo a ambas secuencias codificantes con las que es inmediatamente continuo (una en el extremo 5' y otra en el extremo 3') en el genoma que se produce de manera natural del organismo del que se deriva. Por tanto, en una realizacion, un acido nucleico aislado incluye algunas de o todas las secuencias no codificantes en 5' (por ejemplo, el promotor) que son inmediatamente 40 contiguas a la secuencia codificante. La expresion incluye por tanto, por ejemplo, un aDn recombinante que se incorpora en un vector, en un virus o plasmido de replicacion autonoma, o en el ADN genomico de un procariota o eucariota, o que existe como una molecula separada (por ejemplo, un ADNc o un fragmento de ADN genomico producido mediante PCR o tratamiento con endonucleasas de restriccion), independiente de otras secuencias. Tambien incluye un ADN recombinante que es parte de un gen hlbrido que codifica para una secuencia polipeptldica 45 adicional.
El termino “aislado” puede referirse a un acido nucleico o polipeptido que esta sustancialmente libre de material celular, material viral o medio de cultivo (cuando se produce mediante tecnicas de ADN recombinante), o precursores qulmicos u otros productos qulmicos (cuando se sintetiza qulmicamente). Ademas, un “fragmento de acido nucleico aislado” es un fragmento de acido nucleico que no se produce de manera natural como fragmento y 50 que no se encontrarla en estado natural.
El termino “oligonucleotido” se refiere a una secuencia de acido nucleico de al menos aproximadamente seis nucleotidos a aproximadamente 100 nucleotidos, por ejemplo, de aproximadamente 15 a 30 nucleotidos, o de aproximadamente 20 a 25 nucleotidos, que puede usarse, por ejemplo, como cebador en una amplificacion por PCR
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o como sonda en un ensayo de hibridacion o en una micromatriz. Los oligonucleotidos pueden ser naturales o sinteticos, por ejemplo, ADN, ARN, estructuras principales modificadas, etc.
Cuando se dice que una secuencia de nucleotidos particular tiene un tanto por ciento de identidad especlfica con respecto a una secuencia de nucleotidos de referencia, el tanto por ciento de identidad esta en relacion con la secuencia de nucleotidos de referencia. Por ejemplo, una secuencia de nucleotidos que es el 50%, 75%, 85%, 90%, 95% o 99% identica a una secuencia de nucleotidos de referencia que tiene 100 bases de longitud puede tener 50, 75, 85, 90, 95 o 99 bases que son completamente identicas a una secuencia de 50, 75, 85, 90, 95 o 99 nucleotidos de la secuencia de nucleotidos de referencia. La secuencia de nucleotidos tambien puede ser una secuencia de nucleotidos de 100 bases de longitud que es el 50%, 75%, 85%, 90%, 95% o 99% identica a la secuencia de nucleotidos de referencia a lo largo de toda su longitud. Por supuesto, hay otras secuencias de nucleotidos que cumpliran tambien los mismos criterios.
Una secuencia de acido nucleico que es “sustancialmente identica” a una secuencia de nucleotidos de VKOR es al menos el 80%, 85%, 90%, 95% o 99% identica a la secuencia de nucleotidos de SEQ ID NO:8 o 9. Para fines de comparacion de acidos nucleicos, la longitud de la secuencia de acido nucleico de referencia sera generalmente de al menos 40 nucleotidos, por ejemplo, al menos 60 nucleotidos o mas nucleotidos. La identidad de secuencia puede medirse usando software de analisis de secuencias (por ejemplo, paquete de software de analisis de secuencias del Genetics Computer Group, University of Wisconsin Biotechnology Center, 1710 University Avenue, Madison, Wis. 53705).
Tal como se conoce en la tecnica, pueden usarse varios programas diferentes para identificar si un acido nucleico o aminoacido tiene similitud o identidad de secuencia con respecto a una secuencia conocida. La similitud o identidad de secuencia puede determinarse usando tecnicas convencionales conocidas en la tecnica, incluyendo, pero sin limitarse a, el algoritmo de identidad de secuencia local de Smith y Waterman, Adv. Appl. Math. 2, 482 (1981), mediante el algoritmo de alineacion de identidad de secuencia de Needleman y Wunsch, J. Mol. Biol. 48,443 (1970), mediante el metodo de busqueda por similitud de Pearson y Lipman, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85, 2444 (1988), mediante implementaciones informatizadas de estos algoritmos (GAP, BESTFIT, FASTA y TFASTA en el paquete de software de Wisconsin Genetics, Genetics Computer Group, 575 Science Drive, Madison, WI), el programa de secuencias Best Fit descrito por Devereux et al., Nucl. Acid Res. 12, 387-395 (1984), preferiblemente usando los parametros por defecto, o mediante inspeccion.
Un ejemplo de un algoritmo util es PILEUP. PILEUP crea una alineacion de secuencias multiples a partir de un grupo de secuencias relacionadas usando alineaciones por parejas, progresivas. Tambien puede representar graficamente un arbol que muestra las relaciones de agrupamiento usadas para crear la alineacion. PILEUP usa una simplificacion del metodo de alineacion progresiva de Feng y Doolittle, J. Mol. Evol. 35, 351-360 (1987); el metodo es similar al descrito por Higgins y Sharp, CABIOS 5, 151-153 (1989).
Otro ejemplo de un algoritmo util es el algoritmo BLAST, descrito en Altschul et al., J. Mol. Biol. 215, 403-410, (1990) y Karlin et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, 5873-5787 (1993). Un programa de BLAST particularmente util es el programa WU-BLAST-2 que se obtuvo de Altschul et al., Methods in Enzymology, 266, 460-480 (1996). WU-BLAST- 2 usa varios parametros de busqueda, que se fijan preferiblemente en los valores por defecto. Los parametros son valores dinamicos y se establecen mediante el propio programa dependiendo de la composicion de la secuencia particular y la composicion de la base de datos particular en la que esta buscandose la secuencia de interes; sin embargo, los valores pueden ajustarse para aumentar la sensibilidad. Un algoritmo util adicional es BLAST con huecos (gapped BLAST) tal como se notifica por Altschul et al. Nucleic Acids Res. 25, 3389-3402.
Tambien puede usarse el programa CLUSTAL para determinar la similitud de secuencia. Este algoritmo se describe por Higgins et al. (1988) Gene 73:237; Higgins et al. (1989) CABIOS 5:151-153; Corpet et al. (1988) Nucleic Acids Res. 16: 10881-90; Huang et al. (1992) CABIOS 8: 155-65; y Pearson et al. (1994) Meth. Mol. Biol. 24: 307-331.
Ademas, para secuencias que contienen o bien mas o bien menos nucleotidos que los acidos nucleicos descritos en el presente documento, se entiende que en una realizacion, el porcentaje de identidad de secuencia se determinara basandose en el numero de nucleotidos identicos en relacion con el numero total de bases de nucleotido. Por tanto, por ejemplo, la identidad de secuencia de secuencias mas cortas que una secuencia dada a conocer especlficamente en el presente documento se determinara usando el numero de bases de nucleotido en la secuencia mas corta, en una realizacion. En calculos del tanto por ciento de identidad, no se asigna peso relativo a diversas manifestaciones de la variacion de secuencia, tales como, inserciones, deleciones, sustituciones, etc.
Los polipeptidos VKOR no se limitan a polipeptidos recombinantes, peptidos sinteticos y polipeptidos naturales. La invention tambien describe secuencias de acido nucleico que codifican para formas de polipeptidos VKOR en los que se alteran o delecionan secuencias de aminoacidos que se producen de manera natural. Los acidos nucleicos preferidos codifican para polipeptidos que son solubles en condiciones fisiologicas normales. Se describen tambien acidos nucleicos que codifican para protelnas de fusion en las que todo o una parte de VKOR se fusiona con un polipeptido no relacionado (por ejemplo, un polipeptido marcador o una pareja de fusion) para crear una protelna de
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fusion. Por ejemplo, el polipeptido puede fusionarse con una cola de hexa-histidina para facilitar la purificacion de polipeptidos expresados de manera bacteriana, o con una etiqueta de hemaglutinina para facilitar la purificacion de polipeptidos expresados en celulas eucariotas, o con una etiqueta de HPC4 para facilitar la purificacion de polipeptidos mediante cromatografla de afinidad o inmunoprecipitacion. Se describen tambien polipeptidos aislados (y los acidos nucleicos que codifican para estos polipeptidos) que incluyen una primera parte y una segunda parte; la primera parte incluye, por ejemplo, todo o parte de un polipeptido VKOR, y la segunda parte incluye, por ejemplo, un marcador detectable.
La pareja de fusion puede ser, por ejemplo, un polipeptido que facilita la secrecion, por ejemplo, una secuencia secretora. Un polipeptido fusionado de este tipo se denomina normalmente preprotelna. La secuencia secretora puede escindirse por la celula para formar la protelna madura. Se describen tambien acidos nucleicos que codifican para VKOR fusionados a una secuencia de polipeptido para producir una preprotelna inactiva. Las preprotelnas pueden convertirse en la forma activa de la protelna mediante la eliminacion de la secuencia inactivante.
Se describen tambien acidos nucleicos que se hibridan, por ejemplo, en condiciones de hibridacion rigurosas (tal como se define en el presente documento) con toda o parte de la secuencia de nucleotidos de SEQ ID NOS: 1-6, 8 o 9 o sus complementos. En realizaciones particulares, la parte de hibridacion del acido nucleico de hibridacion es normalmente de al menos 15 (por ejemplo, 20, 30 o 50) nucleotidos de longitud. La parte de hibridacion del acido nucleico de hibridacion es de al menos el 80%, por ejemplo, al menos el 95%, al menos el 98% o el 100% identica a la secuencia de una parte de o todo un acido nucleico que codifica para un polipeptido VKOR. Los acidos nucleicos de hibridacion del tipo descrito en el presente documento pueden usarse, por ejemplo, como sonda de clonacion, cebador (por ejemplo, cebador de PCR) o sonda de diagnostico. Tambien se incluyen dentro de la invencion ARN inhibidores pequenos (ARNip) y/o ARN antisentido que inhiben la funcion de VKOr, tal como se determina, por ejemplo, en un ensayo de actividad, tal como se describe en el presente documento y tal como se conoce en la tecnica.
En otra realizacion, la invencion muestra celulas, por ejemplo, celulas transformadas, que contienen un acido nucleico de esta invencion. Una “celula transformada” es una celula en la que (o en un antecesor de la cual) se ha introducido, por medio de tecnicas de acido nucleico recombinante, un acido nucleico que codifica para todo o parte de un polipeptido VKOR, y/o un acido nucleico antisentido o ARNip. Se incluyen celulas tanto procariotas como eucariotas, por ejemplo, de bacterias, levaduras, insectos, ratones, ratas, seres humanos, plantas y similares.
Se describen tambien constructos de acido nucleico (por ejemplo, vectores y plasmidos) que incluyen un acido nucleico de la invencion que esta operativamente unido a elementos de control de la transcripcion y/o traduccion para permitir la expresion, por ejemplo, vectores de expresion. Por “operativamente unido” quiere decirse que un acido nucleico seleccionado, por ejemplo, una molecula de ADN que codifica para un polipeptido VKOR, se coloca adyacente a uno o mas elementos reguladores, por ejemplo, un promotor que dirige la transcripcion y/o traduccion de la secuencia de manera que los elementos reguladores pueden controlar la transcripcion y/o traduccion del acido nucleico seleccionado.
Se describen tambien fragmentos u oligonucleotidos de los acidos nucleicos, que pueden usarse como cebadores o sondas. Por tanto, en algunas realizaciones, un fragmento u oligonucleotido de esta invencion es una secuencia de nucleotidos que tiene al menos 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 100, 125, 150, 175, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 1000, 1500, 2000, 2500 o 3000 nucleotidos contiguos de la secuencia de nucleotidos expuesta en SEQ ID NO:8 o SEQ ID NO:9. Se proporcionan ejemplos de oligonucleotidos de esta invencion en la lista de secuencias incluida con el presente documento. Tales fragmentos u oligonucleotidos pueden modificarse o marcarse de manera detectable, por ejemplo, para que incluyan y/o incorporen un sitio de escision de enzimas de restriccion cuando se emplean como cebador en un ensayo de amplificacion (por ejemplo, PCR).
Se describen tambien polipeptidos VKOR purificados o aislados, tales como, por ejemplo, un polipeptido que comprende, que consiste esencialmente en y/o que consiste en la secuencia de aminoacidos de SEQ ID NO:10 o un peptido o fragmento biologicamente activo de la misma. Tales fragmentos o peptidos tienen normalmente al menos aproximadamente diez aminoacidos de la secuencia de aminoacidos de SEQ ID NO:10 (por ejemplo, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 75, 85, 95, 100, 125 o 150 aminoacidos de la secuencia de aminoacidos de SEQ ID NO:10) y pueden ser peptidos o un fragmento de aminoacidos contiguos de la secuencia de aminoacidos de la protelna VKOR (por ejemplo, tal como se expone en SEQ ID NO:10). La actividad biologica de un fragmento o peptido de esta invencion puede determinarse segun los metodos proporcionados en el presente documento y tal como se conocen en la tecnica para identificar la actividad VKOR. Los fragmentos y peptidos de la protelna VKOR de esta invencion tambien pueden ser activos como antlgenos para la produccion de anticuerpos. La identificacion de epltopos en un fragmento o peptido de esta invencion se lleva a cabo mediante protocolos bien conocidos y estarla dentro del conocimiento de un experto habitual en la tecnica.
Tal como se usa en el presente documento, tanto “protelna” como “polipeptido” significan cualquier cadena de aminoacidos, independientemente de la longitud o modificacion postraduccional (por ejemplo, glicosilacion,
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fosforilacion o N-miristilacion). Por tanto, la expresion “polipeptido VKOR” incluye protelnas VKOR de longitud completa, que se producen de manera natural, respectivamente, as! como polipeptidos producidos de manera recombinante o sintetica que corresponden a una protelna VKOR de longitud completa, que se produce de manera natural, o a una parte de un polipeptido VKOR que se produce de manera natural o sintetico.
Un polipeptido o compuesto “purificado” o “aislado” es una composicion que tiene al menos el 60% en peso del compuesto de interes, por ejemplo, un anticuerpo o polipeptido VKOR que esta separado o sustancialmente libre de al menos alguno de los otros componentes del virus u organismo que se produce de manera natural, por ejemplo, los componentes estructurales virales o celulares u otros polipeptidos o acidos nucleicos comunmente encontrados asociados con el polipeptido. Tal como se usa en el presente documento, el polipeptido “aislado” es al menos aproximadamente el 25%, 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99% o mas puro (p/p). Preferiblemente, la preparacion tiene al menos el 75% (por ejemplo, al menos el 90% o 99%) en peso del compuesto de interes. La pureza puede medirse mediante cualquier metodo convencional apropiado, por ejemplo, cromatografla en columna, electroforesis en gel de poliacrilamida o analisis de HPLC.
Los polipeptidos VKOR preferidos incluyen una secuencia sustancialmente identica a todo o una parte de un polipeptido VKOR que se produce de manera natural. Los polipeptidos “sustancialmente identicos” a las secuencias de polipeptido VKOR descritas en el presente documento tienen una secuencia de aminoacidos que es al menos el 80% u 85% (por ejemplo, el 90%, 95% o 99%) identica a la secuencia de aminoacidos de los polipeptidos VKOR de SEQ ID NO: 10. Para fines de comparacion, la longitud de la secuencia de polipeptido VKOr de referencia sera generalmente de al menos 16 aminoacidos, por ejemplo, al menos 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 75 o 100 aminoacidos.
En el caso de secuencias de polipeptido que son menos del 100% identicas a una secuencia de referencia, las posiciones no identicas son preferiblemente, pero no necesariamente, sustituciones conservativas para la secuencia de referencia. Las sustituciones conservativas incluyen normalmente, pero no se limitan a, sustituciones dentro de los siguientes grupos: glicina y alanina; valina, isoleucina y leucina; acido aspartico y acido glutamico; asparagina y glutamina; serina y treonina; lisina y arginina; y fenilalanina y tirosina.
Cuando se dice que un polipeptido particular tiene un tanto por ciento de identidad especlfica con respecto a un polipeptido de referencia de una longitud definida, el tanto por ciento de identidad es en relacion con el polipeptido de referencia. Por tanto, por ejemplo, un polipeptido que es el 50%, 75%, 85%, 90%, 95% o 99% identico a un polipeptido de referencia que tiene 100 aminoacidos de longitud puede ser un polipeptido de 50, 75, 85, 90, 95 o 99 aminoacidos que es completamente identico a una parte de 50, 75, 85, 90, 95 o 99 aminoacidos de longitud del polipeptido de referencia. Puede ser tambien un polipeptido de 100 aminoacidos de longitud que es el 50%, 75%, 85%, 90%, 95% o 99% identico al polipeptido de referencia a lo largo de toda su longitud. Por supuesto, otros polipeptidos cumpliran tambien los mismos criterios.
Un aspecto adicional de la presente invencion es un metodo de preparacion de una protelna dependiente de vitamina K que comprende cultivar una celula huesped que expresa un acido nucleico que codifica para una protelna dependiente de vitamina K en presencia de vitamina K y produce una protelna dependiente de vitamina K, y luego recoger la protelna dependiente de vitamina K del cultivo, conteniendo y expresando la celula huesped un acido nucleico heterologo que codifica para carboxilasa dependiente de vitamina K, y conteniendo y expresando ademas la celula huesped un acido nucleico heterologo que codifica para vitamina K epoxido reductasa (VKOR) y que produce VKOR tal como se describe en el presente documento. La expresion del acido nucleico que codifica para VKOR y la produccion de la VKOR provoca que la celula produzca mayores niveles de la protelna dependiente de vitamina K que los que producirla en ausencia de la VKOR.
Por tanto, en algunas realizaciones, la presente invencion proporciona tambien un metodo de produccion de una protelna dependiente de vitamina K, que comprende:
a) introducir en una celula un acido nucleico que codifica para una protelna dependiente de vitamina K en condiciones por las que se expresa el acido nucleico y se produce la protelna dependiente de vitamina K en presencia de vitamina K, en el que la celula comprende un acido nucleico heterologo que codifica para carboxilasa dependiente de vitamina K y comprende ademas un acido nucleico heterologo que codifica para vitamina K epoxido reductasa; y
b) recoger opcionalmente la protelna dependiente de vitamina K de la celula. La protelna dependiente de vitamina K que puede producirse puede ser cualquier protelna dependiente de vitamina K conocida ahora o identificada mas adelante como tal, incluyendo pero sin limitarse a factor VII, factor IX, factor X, protelna C, protelna S y protrombina, en cualquier combinacion. Cualquier celula huesped que pueda transformarse con los acidos nucleicos descritos puede usarse tal como se describe en el presente documento, aunque en algunas realizaciones pueden usarse celulas huesped no humanas o incluso no de mamlfero. Los acidos nucleicos que codifican para carboxilasa dependiente de vitamina K y los acidos nucleicos que codifican para protelnas dependientes de vitamina K tal como se describen en el presente documento se conocen bien en la tecnica y su introduccion en celulas para su expresion se llevarla a cabo segun protocolos de rutina.
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La presente invencion se describe mas particularmente en los siguientes ejemplos que pretenden ser solo ilustrativos puesto que numerosas modificaciones y variaciones en los mismos resultaran evidentes para los expertos en la tecnica.
EJEMPLOS
EJEMPLO 1 DISENO Y SINTESIS DE ARNip
Se seleccionaron ARNip usando una version avanzada de un algoritmo de diseno racional (Reynolds et al. (2004) “Rational ARNip design for RNA interference” Nature Biotechnology 22:326-330). Para cada uno de los 13 genes, se seleccionaron cuatro duplex de ARNip con las puntuaciones mas altas y se realizo una busqueda BLAST usando la base de datos Human EST. Para minimizar el potencial de efectos de silenciamiento fuera de diana, solo se seleccionaron aquellas dianas de secuencia con mas de tres apareamientos erroneos frente a secuencias no relacionadas (Jackson et al. (2003) “Expression profiling reveals off-target gene regulation by RNAi” Nat Biotechnol 21:635-7). Se sintetizaron todos los duplex en Dharmacon (Lafayette, CO) como 21-meros con proyecciones UU usando un metodo modificado de qulmica de 2'-ACE (Scaringe (2000) “Advanced 5'-silyl-2'-orthoester approach to RNA oligonucleotide synthesis” Methods Enzymol 317:3-18) y se fosforilo qulmicamente la cadena AS para garantizar una actividad maxima (Martinez et al. (2002) “Single-stranded antisense siRNAs guide target RNA cleavage en RNAi” Cell 110:563-74).
EJEMPLO 2 Transfeccion con ARNip
La transfeccion fue esencialmente tal como se describio anteriormente (Harborth et al. (2001) “Identification of essential genes in cultured mammalian cells using small interfering RNAs” J Cell Sci 114:4557-65) con modificaciones menores.
EJEMPLO 3 Ensayo de actividad VKOR
Se tripsinizaron celulas A549 transfectadas con ARNip y se lavaron dos veces con PBS frlo. Se tomaron 1,5x107 celulas para cada ensayo de VKOR. Se anadieron 200 ml de tampon D (Na2HPO4-NaH2PO4 250 mM, KCl 500 mM, glicerol al 20% y CHAPS al 0,75%, pH 7,4) al sedimento celular, seguido por sonicacion del lisado celular. Para ensayos de microsomas solubilizados, se prepararon microsomas a partir de 2x109 celulas tal como se describe (Lin et al. (2002) “The putative vitamin K-dependent gamma-glutamyl carboxilase internal propeptide appears to be the propeptide binding site” J Biol Chem 277:28584-91); se usaron de 10 a 50 ml de microsomas solubilizados para cada ensayo. Se anadio vitamina K epoxido a la concentracion indicada en las leyendas de las figuras y se anadio DTT hasta 4 mM para iniciar la reaccion. Se incubo la mezcla de reaccion en luz amarilla a 30°C durante 30 minutos y se detuvo anadiendo 500 ml de AgNO3 0,05 M:isopropanol (5:9). Se anadieron 500 ml de hexano y se agito con vortex vigorosamente la mezcla durante 1 minuto para extraer la vitamina K y el KO. Tras una centrifugacion de 5 minutos, se transfirio la fase organica superior a un vial marron de 5 ml y se seco con N2. Se anadieron 150 ml de tampon de HPLC, acetonitrilo:isopropanol:agua (100:7:2), para disolver la vitamina K y el KO y se analizo la muestra mediante HPLC en una columna A C-18 (Vydac, n.° de cat. 218TP54).
EJEMPLO 4 RT-qPCR (PCR cuantitativa con transcriptasa inversa)
Se lavaron 1x106 celulas con PBS dos veces y se aislo el ARN total con reactivo Trizol segun el protocolo del fabricante (Invitrogen). Se digirio 1 mg de ARN mediante RQ1 DNasel (Promega) y se inactivo con calor. Se preparo la primera cadena de ADNc con transcriptasa inversa de M-MLV (Invitrogen). Se mezclaron los ADNc con la premezcla DyNAmo SYBR Green qPCR (Finnzymes) y se realizo la PCR en tiempo real con un termociclador de PCR Opticon II (MJ Research). Se usaron los siguientes cebadores:
13124769-5' (F): (TCCAACAGCATATTCGGTTGC, SEQ ID NO: 1);
13124769-3 (R)': (TTCTTGGACCTTCCGGAAACT, SEQ ID NO: 2);
GAPDH-F: (GAAGGTGAAGGTCGGAGTC, SEQ ID NO: 3);
GAPDH-R: (GAAGATGGTGATGGGATTTC, SEQ ID NO: 4);
Lamin-RT-F: (CTAGGTGAGGCCAAGAAGCAA, SEQ ID NO: 5) y
Lamin-RT-R: (CTGTTCCTCTCAGCAGACTGC, SEQ ID NO: 6).
EJEMPLO 5 Sobreexpresion de VKOR en la llnea de celulas de insecto Sf9
Se clono el ADNc para la region codificante de mGC11276 en pVL1392 (Pharmingen), con la etiqueta de HPC4 (EDQVDPRLIDGK, SEQ ID NO: 7) en su extremo amino terminal y se expreso en celulas Sf9 tal como se describio (Li et al. (2000) “Identification of a Drosophila vitamin K-dependent gamma-glutamyl carboxylase” J Biol Chem 275:18291-6).
5 EJEMPLO 6 Seleccion genica
La busqueda del gen de VKOR se centro en el cromosoma dieciseis humano entre los marcadores D16S3131 y D16S419. Esta region corresponde al cromosoma 16 a 50 cM-65 cM en el mapa genetico y 26-46,3 Mb en el mapa flsico. Se analizaron 190 regiones codificantes pronosticadas en esta region mediante una busqueda BLASTX de la base de datos de protelnas no redundante del NCBI. Se eliminaron los genes humanos y ortologos de especies 10 relacionadas con funcion conocida. Debido a que VKOR parece ser una protelna transmembrana (Carlisle y Suttie (1980) “Vitamin K dependent carboxylase: subcellular location of the carboxylase and enzymes involved in vitamin K metabolism in rat liver” Biochemistry 19:1161-7), se tradujeron los genes restantes segun las secuencias de ADNc en la base de datos del NCBI y se analizaron con los programas TMHMM y TMAP (Biology WorkBench, San Diego Supercomputer System) para pronosticar aquellas con dominios transmembrana. Se eligieron trece genes que se 15 pronostico que codificaban para protelnas integrales de la membrana para el analisis adicional.
EJEMPLO 7 Examen en llneas celulares para determinar la actividad VKOR
La estrategia era identificar una llnea celular que expresara cantidades relativamente altas de actividad VKOR y usar ARNip para desactivar sistematicamente los trece genes candidatos. Se ha demostrado que el ARNip, ARN bicatenario de 21-23 nucleotidos, provoca degradacion de ARN especlfico en cultivo celular (Hara et al. (2002) 20 “Raptor, a binding partner of target of rapamycin (TOR), mediates TOR action” Cell 110:177-89; Krichevsky y Kosik (2002) “RNAi functions in cultured mammalian neurons” Proc Natl Acad Sci USA 99:11926-9; Burns et al. (2003) “Silencing of the Novel p53 Target Gene Snk/Plk2 Leads to Mitotic Catastrophe in Paclitaxel (Taxol)-Exposed Cells” Mol Cell Biol 23:5556-71). Sin embargo, la aplicacion de ARNip para el examen a gran escala en celulas de mamlfero no se ha notificado anteriormente debido a la dificultad de identificar una diana funcional para un ARNm de 25 celulas de mamlfero especlfico (Holen et al. (2003) “Similar behaviour of single-strand and double-strand siRNAs suggests they act through a common RNAi pathway” Nucleic Acids Res 31:2401-7). El desarrollo de un algoritmo de seleccion racional (Reynolds et al.) para el diseno de ARNip aumenta la probabilidad de que pueda desarrollarse un ARNip especlfico; ademas, la probabilidad de exito puede aumentarse agrupando cuatro ARNip seleccionados de manera racional. El uso de ARNip para la busqueda de genes no identificados previamente tiene la ventaja de que, 30 aunque la actividad VKOR requiera el producto de mas de un gen para determinar la actividad, el examen debe ser todavla eficaz porque el ensayo determina la perdida de actividad enzimatica.
Se examinaron quince llneas celulares y se identifico que una llnea de carcinoma de pulmon humano, A549, mostraba una actividad VKOR sensible a warfarina suficiente para conseguir una medicion facil. Se uso una segunda llnea celular de adenocarcinoma colorrectal humano, HT29, que expresaba muy poca actividad VKOR, 35 como referencia.
EJEMPLO 8 Inhibicion mediante ARNip de la actividad VKOR en celulas A549
Se transfectaron cada uno de los trece conjuntos de ARNip por triplicado en celulas A549 se sometieron a ensayo para determinar la actividad VKOR tras 72 horas. Un conjunto de ARNip especlfico para el gen gi: 13124769 redujo la actividad VKOR en un 64%-70% en ocho ensayos separados (figura 1).
40 Un posible motivo de que la actividad VKOR se inhibiese en solo ~35% de su actividad inicial tras 72 horas es que la semivida de las protelnas de mamlferos varla enormemente (desde minutos hasta dlas) (Zhang et al. (1996) “The major calpain isozymes are long-lived proteins. Design of an antisense strategy for calpain depletion in cultured cells” J Biol Chem 271:18825-30; Bohley (1996) “Surface hydrophobicity and intracellular degradation of proteins” Biol Chem 377:425-35; Dice y Goldberg (1975) “Relationship between in vivo degradative rates and isoelectric points of 45 proteins” Proc Natl Acad Sci USA 72: 3893-7), y que esta inhibiendose la traduccion de ARNm, no la actividad enzimatica. Por tanto, las celulas se mantuvieron durante once dlas y se siguio su actividad VKOR. La figura 2 muestra que el nivel de ARNm para el ARNm de gi: 13124769 disminuyo rapidamente hasta aproximadamente un 20% del normal mientras que la actividad VKOR disminuyo de manera continua durante este periodo de tiempo. Esta reduccion de la actividad no es un efecto general del ARNip ni el resultado de la muerte celular porque el nivel 50 de actividad VKD carboxilasa y el ARNm de lamin A/C permanecieron constantes. Ademas, el nivel de ARNm de gi: 132124769 es cuatro veces inferior en celulas HT-29, que tienen actividad VKOR baja, que en celulas A549 que muestran actividad VKOR alta. Estos datos indican que gi:13124769 corresponde al gen de VKOR.
EJEMPLO 9 Identificacion del gen que codifica para VKOR

Claims (3)

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REIVINDICACIONES
1. Una celula que contiene y expresa un acido nucleico recombinante que comprende un acido nucleico que codifica para una vitamina K epoxido reductasa operativamente asociada a un promotor heterologo y contiene ademas y expresa un acido nucleico heterologo que codifica para una carboxilasa dependiente de vitamina K y expresa un acido nucleico que codifica para una protelna dependiente de vitamina K, en la que dicha vitamina K epoxido reductasa convierte la vitamina K epoxido en vitamina K.
2. Un metodo para preparar una protelna dependiente de vitamina K que comprende cultivar una celula huesped que expresa para un acido nucleico que codifica una protelna dependiente de vitamina K en presencia de vitamina K y produce una protelna dependiente de vitamina K y luego recolectar la protelna dependiente de vitamina K del cultivo, conteniendo y expresando la celula huesped un acido nucleico heterologo que codifica la carboxilasa dependiente de vitamina K, y la celula huesped conteniendo y expresando ademas un acido nucleico heterologo que codifica la vitamina K epoxido reductasa (VKOR).
3. Un metodo de acuerdo con la reivindicacion 2 en donde el acido nucleico que codifica para la protelna dependiente de vitamina K se selecciona del grupo que comprende factor VII, factor IX, factor X, protrombina, protelna C y protelna S.
Porte nlajt restarts PorCfntsie de actk'idad VKOR
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