JP3741447B2 - エンドセリン−１遺伝子の機能が欠損したマウス - Google Patents
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Description
【０００１】
【産業上の利用分野】
本発明は、文献未記載の新規な系統の動物自体およびその作出方法に関する。
本発明動物は、実験、研究用のマウスであり、エンドセリン−１構造遺伝子の一部に変異を有する。従って、ペプチドの合成は抑制される。この特質は、高血圧、動脈硬化、虚血性心疾患などの循環器疾患の病態生理、原因の解明および治療法の開発等の研究のための実験用動物として、極めて有用である。
【０００２】
【従来の技術】
高血圧、動脈硬化、虚血性心疾患などの循環器疾患の病態生理において、いくつかの心血管作動性物質の役割が注目されている。この中でエンドセリンは、心血管内皮細胞から単離、精製された２１個のアミノ酸からなる血管収縮ペプチドであり、その本体は、１９８８年に明らかにされた(Yanagisawa, M., Kurihara, H., Kimura, S. et al. Nature 332:411, 1988)。
【０００３】
エンドセリンの組織分布は、心臓、腎臓、副腎、肺、脳など多彩である。また、作用部位も、組織分布同様、多岐に渡っており、平滑筋、血管内皮、心筋、腎、副腎、中枢神経系などに及んでいる。現在までの薬理実験や生化学的解析、臨床研究などを通して、エンドセリンの生理機能の解明が試みられてきたが、その本質に迫るまでには至っていない。また、この様な生理機能の解明に必要な、エンドセリン遺伝子の機能が欠損したマウスは知られていない。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
上記の実情に基づき、本発明者らは心血管作動性物質の遺伝子を欠損したマウスを作成して、その循環動態をはじめとする生理機能の変化を解析することによって、心血管作動性物質の生理的な役割を直接明らかにすることを可能にするとともに、同時に、循環器疾患の病態解明あるいは治療法の研究のために、遺伝的背景の明確な動物モデルを提供しようとするものである。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
従って、本発明は、遺伝子工学的方法でエンドセリン−１遺伝子（ＥＴ−１遺伝子）の機能を人為的に欠損させたマウスを提供する。
【０００６】
【具体的な説明】
エンドセリン−１の遺伝子の機能を人為的に欠損させたマウスを得るためには、エンドセリン−１の遺伝子をクローニングし、それを試験管内でなんらかの方法により失活させた後にマウスにもどす方法が用いられる。エンドセリン遺伝子のクローニングは、例えばマウスの肝臓からジェノミックＤＮＡを抽出し、常法に従ってＤＮＡライブラリーを作製し、次にこれをすでにクローニングされているエンドセリン−１をコードするＤＮＡ、例えばｃＤＮＡ（文献：Yanagisawa, M., Kurihara, H., Kimura, S.et al.Nature 332：411, 1988)を用いてスクリーニングすればよい。
【０００７】
エンドセリン−１の前駆体の遺伝子は、図１に示すごとくＩ〜Ｖの５個のエクソンを含んでおり、エンドセリン−１自体は第２エクソンにコードされている。エンドセリン−１の遺伝子の機能の欠損には、エンドセリン−１の前駆体をコードする遺伝子（以下、単に「エンドセリン−１遺伝子」と称する）のいずれかの部分を欠失させてもよく、又いずれかの部位に他の遺伝子を挿入してもよいが、エンドセリン−１遺伝子の欠損を検出するための遺伝子マーカーとしても機能する他の遺伝子を挿入するのが好ましく、この様な遺伝子としてはネオマイシン耐性遺伝子（Ｇ４１８耐性により選択）、チミジンキナーゼ遺伝子（ガンシクロビル耐性により選択）、ジフテリアトキシンＡフラグメント遺伝子、又はこれらの組合せ等が用いられる。挿入場所は特に限定されない。これらの遺伝子の挿入は試験管内で常用のＤＮＡ組換技法により行うことができる。
【０００８】
次に、こうして得られた相同組換え用ＤＮＡをマウス胚性幹細胞（ＥＳ ｃｅｌｌ）に導入し、ＥＳ ｃｅｌｌ中のエンドセリン−１遺伝子と相同組換えを行う。相同組換え用ＤＮＡの挿入は、例えば常用のエレクトロポレーションにより行うことができる。この相同組換えにおいては、ＥＳ ｃｅｌｌ中のエンドセリン−１遺伝子のＤＮＡと相同組換え用ＤＮＡの対応する領域との間で組換えが生じ、相同組換え用ＤＮＡ中に挿入されていたマーカー遺伝子がＥＳ ｃｅｌｌのジェノミックエンドセリン−１遺伝子に挿入される。この結果ＥＳ ｃｅｌｌはエンドセリン−１遺伝子を欠失し、同時にマーカー遺伝子を得る。このマーカー遺伝子に基いてエンドセリン−１遺伝子を欠失したＥＳ ｃｅｌｌを得ることができる。
【０００９】
次に、このＥＳ細胞をマウスの胚盤胞に注入し、さらに偽妊娠マウスの子宮角に移植して産仔を得る。次に、こうして得たキメラマウスを適当な系統のマウスと交配することにより産仔を得る。キメラマウスの生殖細胞が相同性組換え体（ＥＴ−１遺伝子が破壊されている）に由来すればＥＴ−１遺伝子が破壊されたマウスを得ることができる。
【００１０】
以下、上記の方法を工程に分けて簡単に説明した後、具体的な操作について説明する。
【００１１】
１）マウスエンドセリン−１（ＥＴ−１）遺伝子ＤＮＡの相同組換え用コンストラクトの作成
マウスの肝臓から抽出したジェノミックＤＮＡを、制限酵素を用いて部分消化して作成したジェノミックライブラリーに、マウスＥＴ−１ｃＤＮＡの部分配列をプローブとしてハイブリダイズし、陽性クローンを得た。これをベクターに挿入した後、制限酵素で消化して第２エクソンから第５エクソンを含む、全長７．５kbのジェノミックＤＮＡをサブクローニングした。
次いで、ＥＴ−１遺伝子の構造を破壊するために、Ｍａｎｓｏｕｒらの報告(Mansour, S.L., Thomas, K.R. & Capacchi, M.R. Nature 336:348-352, 1988) に従って、ポジティブ／ネガティブセレクションを行なうために、ネオマイシン耐性遺伝子およびチミジンキナーゼ遺伝子を挿入した。
【００１２】
２）相同組換えによるＥＳ細胞でのＥＴ−１遺伝子欠失
相同組換え用コンストラクトＤＮＡをマウス胚性幹細胞（ＥＳ ｃｅｌｌｓ）Ａ３−１株（東と豊田、家畜繁殖誌３７，３７−４３，１９９１）を含むエレクトロポレーション用緩衝液に懸濁し、遺伝子導入を行った。次いで、Ｇ４１８およびガンシクロビルで選択培養を行った。Ｇ４１８およびガンシクロビル耐性コロニーについては、相同組換え体の確認を、ＰＣＲおよびサザンブロットによって行った。
【００１３】
３）エンドセリン遺伝子欠損ＥＳ細胞によるキメラマウスの作成
ａ）エンドセリン遺伝子欠損ＥＳ細胞の核型解析および浮遊培養による分化能の検定
相同組換えを確認したエンドセリン遺伝子欠損ＥＳ細胞株については、染色体標本を作成して、マウスの正常核型である２ｎ＝４０本の染色体を有している細胞の割合を算定した。さらに、シングルセルにしたエンドセリン遺伝子欠損ＥＳ細胞株の胚様体形成能についても観察した。
ｂ）エンドセリン遺伝子欠損ＥＳ細胞の胚盤胞へのインジェクション
核型解析および分化能の検定によって、正常性の確認されたＥＳ細胞については、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ系マウスの胚盤胞へ注入した後、偽妊娠マウスの子宮角に移植して産仔を得た。
【００１４】
４）相同組換え体の生殖系列への伝達の検定
移植によって得られたキメラマウスについては、１２９／Ｊ系あるいはＩＣＲ系マウスと交配させ、エンドセリン遺伝子欠損ＥＳ細胞由来の産仔が得られるか否かを検定した。キメラマウスの生殖細胞が相同組換え体に由来していれば、娩出される産仔の毛色は、アルビノを呈し、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ系マウスの胚盤胞に由来していれば野性色を呈する。さらに、離乳に至った後に採血し、ＤＮＡを抽出後、上述の方法でＰＣＲを行なって、エンドセリン遺伝子の欠損を確認した。
【００１５】
具体的な操作
（１）マウスエンドセリン−１（ＥＴ−１）遺伝子ＤＮＡの相同組換え用コンストラクトの作成
ＢＡＬＢ／ｃ系マウスの肝臓から抽出したジェノミックＤＮＡを、制限酵素Ｓａｕ３ＡＩを用いて部分消化して作成したジェノミックライブラリーＥＭＢＬ（東京大学医学部第３内科 宮川清先生から分与された）に、マウスＥＴ−１ｃＤＮＡの部分配列をプローブとしてハイブリダイズし、１，０００，０００個のコロニーについて検索した結果、１個の陽性クローンを得た。これをラムダＥ１０に挿入した後、制限酵素ＥｃｏＲＩで消化して第２エクソンから第５エクソンを含む、全長７．５kbのジェノミックＤＮＡ（ｐＥ１０−２９）をサブクローニングした（図１）。
次いで、ＥＴ−１遺伝子の構造を破壊するために、第２エクソンに、ネオマイシン耐性遺伝子を挿入し、さらに、３′側下流には、チミジンキナーゼ遺伝子を挿入した。ジェノミックＤＮＡとの相同部分は、ネオマイシン耐性遺伝子の上流が０．９kb、ネオマイシン耐性遺伝子とチミジンキナーゼ遺伝子との間が６．６kbとした。相同組換え用コンストラクトは、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＳＫ+ に挿入し、ＥＳ細胞への導入の際に制限酵素ＮｏｔＩで切断して線状化した（図２）。
【００１６】
（２）相同組換え用コンストラクトの導入によるＥＳ細胞のＥＴ−１遺伝子欠失
相同組換え用コンストラクトＤＮＡ１５０μｇをＡ３−１株１×１０8 個を含むエレクトロポレーション用緩衝液(20mM HEPES, 137mM NaCl, 5mM KCl, 0.7mM Na2HPO4, 6mM Dextrose, 0.1mM Mercaptoethanol) に懸濁し、Field Strength 2000V/cm, Capacitance 3μＦの条件で、遺伝子導入を行った。導入後２４時間から３００μｇ／ml Ｇ４１８（Ｇｅｎｅｔｉｓｉｎ，Ｓｉｇｍａ）で選択培養を行ない、その４８時間後からは、０．５μｇ／mlガンシクロビルも添加して、選択培養を継続した。
【００１７】
Ｇ４１８およびガンシクロビル耐性コロニーについては、遺伝子導入後１２０時間後から、マイクロピペットを用いて６０μｌのＴＥ溶液を含む９６穴のマイクロプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ ２５８６ＯＭＰ）に移し換え、数分間処理した後、ピペッティングすることによって単一細胞にした後、２４穴のマイクロプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ ２５８２０ＧＥＬ）に移し換え培養を継続した。採取したコロニーは、その長径がマイクロチップの内径の１／２以上に達したもので、この時の細胞数は、１×１０4 〜１０5 個であった。エレクトロポレーション後の生存細胞数は、４．０×１０7 個であった。Ｇ４１８およびガンシクロビル耐性コロニー数は、２．８×１０2 個で、生存細胞数の１／１．４×１０5 であった。
【００１８】
２４穴のマイクロプレート上の細胞が３〜４日の培養でコンフルエントに達した段階で、ＴＥ処理後、順次、３５mm（Ｃｏｒｎｉｎｇ ２５０００ＧＥＬ）あるいは６０mm（Ｃｏｒｎｉｎｇ ２５０１０ＧＥＬ）の組織培養用シャーレ内で培養し、細胞の増殖を図った。尚、ＥＳ細胞の培養は、すべてフィーダー細胞上で行なった。相同組換え体の確認は、ＰＣＲおよびサザンブロットによって以下の通りに行った。ＰＣＲプライマーは、相同組換え用コンストラクトの３′端と第１イントロンとの間、約１kbが増幅されるように設計した。
【００１９】
すなわち、第１イントロンのＥｃｏＲｌ認識部位により７６bp５′上流からの配列５′-GCAGATAAACTGCGCGCGATCTGT-３′配列番号：１およびネオマイシン耐性遺伝子の５′端、５′-AATCCATCTTGTTCAATGGCCGAT-３′配列番号：２のそれぞれ２４ｍｅｒの塩基配列を持つオリゴヌクレオチドをＤＮＡ合成器（ＢｉｏＲａｄ）を用いて合成し、９４℃，５分間の処理後、ＤＮＡの変性９５℃，１分、プライマーのアニーニング６４℃，１分、プライマーの伸長７２℃，１分、で４０サイクルの増幅後、７２℃，１分間ＤＮＡ伸長反応を行ない、アガロース電気泳動により、１kbのバンドを検出した。
【００２０】
サザンブロット解析については、Ｇ４１８およびガンシクロビル耐性細胞からジェノミックＤＮＡを抽出し、制限酵素ＳａｃＩで消化後、第１イントロンのＳａｃＩ−ＥｃｏＲＩ断片、０．４kbをプローブとして行った。相同組換え体および野性型の確認は、それぞれ、３．１kbおよび４．４kbのバンドの検出によって行った。相同組換え体のコロニー数は、Ｇ４１８およびガンシクロビル耐性コロニー２８１個中３５個であった。（１／１．１×１０6 ）。尚、ＰＣＲの検査成績とサザンブロット解析による成績は、完全に一致した。
【００２１】
（３）ＥＳ細胞および培養方法
ＥＳ細胞として、１２９／ＳｖＪ系マウス胚盤胞由来のＡ３−１株（東と豊田、家畜繁殖誌３７，３７−４３，１９９１）を用いた。ＥＳ細胞の培養には、ダルッベッコウ修正イーグル培養液（ＤＭＥＭ，Ｃｏｒｄ．４３０−２１００ ＧＩＢＣＯ）に２０％牛胎児血清（ＦＣＳ）、０．１mMの２−メルカプトエタノール、核酸混合液、非必須アミノ酸溶液および１０3 ｕｎｉｔ／mlのＬＩＦ（ＡＭＲＡＤ）を添加したＳＣＭ培養液(Robertson, Teratocarcinomas and embryonic stem cells a practical approach 1987)を用いた。
【００２２】
また、ＥＳ細胞のフィーダー細胞として用いるマウス胎児線維芽細胞の培養には、ＤＭＥＭに１０％ＦＣＳを添加したものを用いた。マウス胎児線維芽細胞の調製および培養は、以下の通りに行った。胎齢１３〜１４日のＩＣＲ系マウスの胎児を無菌的に採取し、カルシウムおよびマグネシウムを含まないリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ- ）で洗浄後、ピンセットを用いて心臓、肝臓および腸管を除き、眼科用のハサミを用いて細切した。次いで、０．２５％トリプシンおよび０．０４％ＥＤＴＡを含むＰＢＳ- （ＴＥ溶液）で、室温で２０分間処理して細胞浮遊液を得た。
【００２３】
細胞浮遊液を１５００rpm 、５分間の遠心後、上清を除去し、１０％ＦＣＳ加ＤＭＥＭに懸濁して２分間静置した。そして、下部に沈んだ組織片を除いた細胞浮遊液を１００×２０mmの組織培養用シャーレ（Ｃｏｒｎｉｎｇ，２５０２０）に移し、３７℃，５％，ＣＯ2 ，９５％空気の条件で培養に供した。翌日、ＰＢＳ- で１回洗浄し、培養を継続した。継代は、３〜４日間隔で行ない、継代が３代目までの細胞をフィーダーとして使用するためにマイトマイシン処理を施した。
【００２４】
コンフルエント状態に増殖したマウス胎児線維芽細胞を１０μｇ／mlのマイトマイシンＣで３〜４時間処理し、ＰＢＳ- で３回の洗浄後、ＴＥ溶液で室温で２分間処理して細胞を剥離した。次いで、遠心後、細胞数を３×１０5 ／mlに調整し、６０×１０mmのゼラチンコートディッシュ（Ｃｏｒｎｉｎｇ，２５０１０ＧＥＬ）に３mlずつ分注した。以上のように作成したフィーダー細胞は、１週間以内に使用した。ＥＳ細胞の継代は、室温で５分間のＴＥ処理後、ピペッティングによって単一細胞に分散させ、１×１０6 個の細胞をフィーダー細胞層上に播種することによって行った。
【００２５】
培養液は、２４時間間隔で交換し、継代間隔は、５６〜６４時間とした。また、凍結保存する際には、４〜５×１０6 個の細胞をＳＣＭに懸濁してセラムチューブ（１．２ml，Ｃｏｒｎｉｎｇ，２５７０３ＶＩＡＬ１）に移し、０．５mlの凍結用培地（２０％ＤＭＳＯ加ＤＭＥＭ）を滴下した後、−８０℃で一晩放置し、液体窒素中で保存した。
【００２６】
（４）エンドセリン遺伝子欠損ＥＳ細胞によるキメラマウスの作成
ａ）エンドセリン遺伝子欠損ＥＳ細胞の核型解析および浮遊培養による分化能の検定
相同組換えを確認したエンドセリン遺伝子欠損ＥＳ細胞株については、染色体標本を作成して、マウスの正常核型である２ｎ＝４０本の染色体を有している細胞の割合を算定した。継代２日目の細胞に、最終濃度が０．１μｇ／mlとなるようにコルセミド（ＧＩＢＣＯ）を添加して１．５時間培養した。
【００２７】
ＴＥ処理後、０．５６％KCl 溶液で３０分間室温で低張処理を行ない、メタノール：酢酸＝３：１で５分間室温で固定し、遠心を２回繰り返した。次いで、細胞を少量の固定液とともに滴下し、一晩風乾した。そして、１０％ギムザ液で３０分間染色後、鏡検した。ＰＣＲおよびサザンブロットによってエンドセリン遺伝子欠損を確認した３５ラインのうち、１７ラインについて核型検査をした結果、正２倍体の割合は５％から５７％の範囲で、１０％未満が１ライン、１０％以上３０％未満が７ライン、３０％以上４０％未満が１ライン、そして４０％以上が８ラインであった。
【００２８】
体外での分化誘導は、正２倍体の割合が最も高かったラインであったＣ３１について行なった。継代３日目の細胞にＴＥ処理を施した後、ゼラチンコートディッシュに３０分間静置することによって、フィーダー細胞をディッシュの底に接着させることによって、ＥＳ細胞のみを回収した。そして、６×１０6 個／mlに調整し、１００mmのバクテリア用ディッシュ内で、１０％ＦＣＳ加ＤＭＥＭを用いて浮遊培養を行い、胚様体形成能について観察した。
【００２９】
胚様体形成の判定は、ディッシュ内に胚様体が１０個以上観察された日を胚様体形成日とした。尚、培養液の交換は、４日毎に行った。その結果、初期胚様体（Ｓｉｍｐｌｅ Ｅｍｂｒｙｏｉｄ Ｂｏｄｙ）は、培養後４日目、および嚢胞胚様体（Ｃｙｓｔｉｃ Ｅｍｂｒｙｏｉｄ Ｂｏｄｙ）は、培養後８日目に認められた。
【００３０】
ｂ）エンドセリン遺伝子欠損ＥＳ細胞の胚盤胞へのインジェクション
核型解析および分化能の検定によって、正常性の確認されたＥＳ細胞については、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ系マウスの胚盤胞へ注入した後、偽妊娠マウスの子宮角に移植して産仔を得た。胚の採取は、自然交配４日目に、Ｈｅｐｅｓ−ｂｕｆｆｅｒｅｄ−Ｗｈｉｔｔｅｎ’ｓ培地で、子宮を灌流することによって行った。注入に用いたＥＳ細胞は、継代２あるいは３日目にＴＥ処理を行った後、上述の方法でフィーダー細胞を除去し、顕微操作に供するまで、氷上に静置した。
【００３１】
ＥＳ細胞の注入用ピペットは、外径１mmの微小ガラス管（ＮＡＲＩＳＨＩＧＥ）を微小電極作製器（ＮＡＲＩＳＨＩＧＥ，ＰＮ−３）を用いて細く引き延ばし、研磨器（ＮＡＲＩＳＨＩＧＥ）で、内径が約２０μｍとなるように先端を研磨し、さらに、マイクロフォージ（Ｄｅ Ｆｏｎｂｕｒｕｎ）で先端を鋭利に加工した。胚保定用ピペットは、上述の方法で引き延ばしたガラス管をマイクロフォージを用いて、外径５０〜１００μｍの部分で切断した後、さらに、口径を１０〜２０μｍに加工して用いた。
【００３２】
注入用ピペットと保定用ピペットは、先端から約５mmの部分を約３０度曲げて、マイクロマニプレーター（ＬＥＩＴＺ）に接続した。顕微操作に用いたチャンバーは、穴あきスライドグラスにカバーグラスを蜜蝋で接着させたものを用い、その上に約２０μｌの５％ＦＣＳ加Ｈｅｐｅｓ−ｂｕｆｆｅｒｅｄ Ｗｈｉｔｔｅｎ’ｓ培地のドロップを２個置き、上面を流動パラフィン（Ａｒｔ ７１６２，Ｍｅｒｃｋ）で覆った。一方のドロップには、約１００個のＥＳ細胞を入れ、他方には拡張胚盤胞を１０〜１５個入れ、胚１個あたり１０〜１５個のＥＳ細胞を注入した。
【００３３】
顕微操作はすべて、倒立顕微鏡下で行った。操作胚は、１〜２時間の培養後、偽妊娠２日目のＩＣＲ系受容雌の子宮角に移植した。分娩予定日に至っても産仔を娩出しなかった受容雌については、帝王切開を施し、里親に哺育させた。
自然交配４日目に、子宮を灌流することによって採取したＣ５７ＢＬ／６Ｊ系マウスの胚盤胞４３個にＥＳ細胞Ｃ３１を注入した結果、３２個が生存し、成功率は７４％であった。このうち３１個を偽妊娠２日目のＩＣＲ系受容雌の子宮角に移植した結果、２７個に着床が認められ、１９匹の産仔が得られた。離乳に至った１６匹の産仔のうち、毛色でキメラマウスと判定できたのは１０匹で、このうち９匹が、形態的に雄を示していた。これらのキメラマウスにおけるＥＳ細胞の寄与率は、１０〜９５％の幅であり、寄与率が６０％未満が３例、６０％以上９０％未満が２例、９０％以上が４例であった。
【００３４】
ｃ）キメラマウスの交配
移植によって得られたキメラマウスについては、１２９／Ｊ系あるいはＩＣＲ系マウスと交配させ、エンドセリン遺伝子欠損ＥＳ細胞由来の産仔が得られるか否かを検定した。キメラマウスの生殖細胞が相同組換え体に由来していれば、娩出される産仔の毛色は、アルビノを呈し、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ系マウスの胚盤胞に由来していれば野性色を呈する。性成熟に達する前に死亡した２例を除いた８例（Ｎｏ．１，２，４，５，６，７，２１，２３，２４）のキメラマウスのうち、現在までに２例（Ｎｏ．１，５）についてのＥＳ細胞の生殖系列への伝達が確認された。
【００３５】
Ｎｏ．１とＩＣＲ系雌マウスとの交配では、３回の分娩で合計３８匹の産仔が得られ、このうち３０匹がアルビノの毛色を示していた。また、Ｎｏ．５とＩＣＲ系雌との交配で得られた１１匹の産仔のうち３匹がアルビノであった。これらのアルビノマウスのうち２９例についてＰＣＲおよびサザンブロットによる解析を行なった結果、８例でエンドセリン−１遺伝子の欠損を確認した。
【００３６】
前記の方法を忠実に実施することにより、本発明のマウスを容易に作出することができる。
【００３７】
【発明の効果】
以上の通り、本発明は、エンドセリン−１遺伝子へのネオマイシン耐性遺伝子及び／又はチミジンキナーゼ遺伝子の挿入によってエンドセリン−１遺伝子が破壊されているマウスを提出する。このマウスは、高血圧、動脈硬化、虚血性心疾患など循環器系疾患の病態生理、原因の解明、治療法の開発等のための実験用動物として有用である。
【００３８】
【配列表】
配列番号：１
配列の長さ：１４
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：合成ＤＮＡ
配列
GCAGATAAAC TGCGCGCGAT CTGT
【００３９】
配列番号：２
配列の長さ：１４
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：合成ＤＮＡ
配列
AATCCATCTT GTTCAATGGC CGAT
【図面の簡単な説明】
【図１】図１はベクターｐＥ１０−２９中にクローニングされた７．５kbのマウスジェノミックＥＴ−１遺伝子断片の構造を示す。図中Ｉ〜Ｖは第１〜第５エクソンを示す。
【図２】図２は、図１に示す遺伝子の第１エクソン中にネオマイシン耐性遺伝子（ｎｅｏr ）を挿入し、且つ第５エクソンの下流にチミジンキナーゼ遺伝子（ＨＳＶ−ｔｋ）を挿入した状態を示す。
【産業上の利用分野】
本発明は、文献未記載の新規な系統の動物自体およびその作出方法に関する。
本発明動物は、実験、研究用のマウスであり、エンドセリン−１構造遺伝子の一部に変異を有する。従って、ペプチドの合成は抑制される。この特質は、高血圧、動脈硬化、虚血性心疾患などの循環器疾患の病態生理、原因の解明および治療法の開発等の研究のための実験用動物として、極めて有用である。
【０００２】
【従来の技術】
高血圧、動脈硬化、虚血性心疾患などの循環器疾患の病態生理において、いくつかの心血管作動性物質の役割が注目されている。この中でエンドセリンは、心血管内皮細胞から単離、精製された２１個のアミノ酸からなる血管収縮ペプチドであり、その本体は、１９８８年に明らかにされた(Yanagisawa, M., Kurihara, H., Kimura, S. et al. Nature 332:411, 1988)。
【０００３】
エンドセリンの組織分布は、心臓、腎臓、副腎、肺、脳など多彩である。また、作用部位も、組織分布同様、多岐に渡っており、平滑筋、血管内皮、心筋、腎、副腎、中枢神経系などに及んでいる。現在までの薬理実験や生化学的解析、臨床研究などを通して、エンドセリンの生理機能の解明が試みられてきたが、その本質に迫るまでには至っていない。また、この様な生理機能の解明に必要な、エンドセリン遺伝子の機能が欠損したマウスは知られていない。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
上記の実情に基づき、本発明者らは心血管作動性物質の遺伝子を欠損したマウスを作成して、その循環動態をはじめとする生理機能の変化を解析することによって、心血管作動性物質の生理的な役割を直接明らかにすることを可能にするとともに、同時に、循環器疾患の病態解明あるいは治療法の研究のために、遺伝的背景の明確な動物モデルを提供しようとするものである。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
従って、本発明は、遺伝子工学的方法でエンドセリン−１遺伝子（ＥＴ−１遺伝子）の機能を人為的に欠損させたマウスを提供する。
【０００６】
【具体的な説明】
エンドセリン−１の遺伝子の機能を人為的に欠損させたマウスを得るためには、エンドセリン−１の遺伝子をクローニングし、それを試験管内でなんらかの方法により失活させた後にマウスにもどす方法が用いられる。エンドセリン遺伝子のクローニングは、例えばマウスの肝臓からジェノミックＤＮＡを抽出し、常法に従ってＤＮＡライブラリーを作製し、次にこれをすでにクローニングされているエンドセリン−１をコードするＤＮＡ、例えばｃＤＮＡ（文献：Yanagisawa, M., Kurihara, H., Kimura, S.et al.Nature 332：411, 1988)を用いてスクリーニングすればよい。
【０００７】
エンドセリン−１の前駆体の遺伝子は、図１に示すごとくＩ〜Ｖの５個のエクソンを含んでおり、エンドセリン−１自体は第２エクソンにコードされている。エンドセリン−１の遺伝子の機能の欠損には、エンドセリン−１の前駆体をコードする遺伝子（以下、単に「エンドセリン−１遺伝子」と称する）のいずれかの部分を欠失させてもよく、又いずれかの部位に他の遺伝子を挿入してもよいが、エンドセリン−１遺伝子の欠損を検出するための遺伝子マーカーとしても機能する他の遺伝子を挿入するのが好ましく、この様な遺伝子としてはネオマイシン耐性遺伝子（Ｇ４１８耐性により選択）、チミジンキナーゼ遺伝子（ガンシクロビル耐性により選択）、ジフテリアトキシンＡフラグメント遺伝子、又はこれらの組合せ等が用いられる。挿入場所は特に限定されない。これらの遺伝子の挿入は試験管内で常用のＤＮＡ組換技法により行うことができる。
【０００８】
次に、こうして得られた相同組換え用ＤＮＡをマウス胚性幹細胞（ＥＳ ｃｅｌｌ）に導入し、ＥＳ ｃｅｌｌ中のエンドセリン−１遺伝子と相同組換えを行う。相同組換え用ＤＮＡの挿入は、例えば常用のエレクトロポレーションにより行うことができる。この相同組換えにおいては、ＥＳ ｃｅｌｌ中のエンドセリン−１遺伝子のＤＮＡと相同組換え用ＤＮＡの対応する領域との間で組換えが生じ、相同組換え用ＤＮＡ中に挿入されていたマーカー遺伝子がＥＳ ｃｅｌｌのジェノミックエンドセリン−１遺伝子に挿入される。この結果ＥＳ ｃｅｌｌはエンドセリン−１遺伝子を欠失し、同時にマーカー遺伝子を得る。このマーカー遺伝子に基いてエンドセリン−１遺伝子を欠失したＥＳ ｃｅｌｌを得ることができる。
【０００９】
次に、このＥＳ細胞をマウスの胚盤胞に注入し、さらに偽妊娠マウスの子宮角に移植して産仔を得る。次に、こうして得たキメラマウスを適当な系統のマウスと交配することにより産仔を得る。キメラマウスの生殖細胞が相同性組換え体（ＥＴ−１遺伝子が破壊されている）に由来すればＥＴ−１遺伝子が破壊されたマウスを得ることができる。
【００１０】
以下、上記の方法を工程に分けて簡単に説明した後、具体的な操作について説明する。
【００１１】
１）マウスエンドセリン−１（ＥＴ−１）遺伝子ＤＮＡの相同組換え用コンストラクトの作成
マウスの肝臓から抽出したジェノミックＤＮＡを、制限酵素を用いて部分消化して作成したジェノミックライブラリーに、マウスＥＴ−１ｃＤＮＡの部分配列をプローブとしてハイブリダイズし、陽性クローンを得た。これをベクターに挿入した後、制限酵素で消化して第２エクソンから第５エクソンを含む、全長７．５kbのジェノミックＤＮＡをサブクローニングした。
次いで、ＥＴ−１遺伝子の構造を破壊するために、Ｍａｎｓｏｕｒらの報告(Mansour, S.L., Thomas, K.R. & Capacchi, M.R. Nature 336:348-352, 1988) に従って、ポジティブ／ネガティブセレクションを行なうために、ネオマイシン耐性遺伝子およびチミジンキナーゼ遺伝子を挿入した。
【００１２】
２）相同組換えによるＥＳ細胞でのＥＴ−１遺伝子欠失
相同組換え用コンストラクトＤＮＡをマウス胚性幹細胞（ＥＳ ｃｅｌｌｓ）Ａ３−１株（東と豊田、家畜繁殖誌３７，３７−４３，１９９１）を含むエレクトロポレーション用緩衝液に懸濁し、遺伝子導入を行った。次いで、Ｇ４１８およびガンシクロビルで選択培養を行った。Ｇ４１８およびガンシクロビル耐性コロニーについては、相同組換え体の確認を、ＰＣＲおよびサザンブロットによって行った。
【００１３】
３）エンドセリン遺伝子欠損ＥＳ細胞によるキメラマウスの作成
ａ）エンドセリン遺伝子欠損ＥＳ細胞の核型解析および浮遊培養による分化能の検定
相同組換えを確認したエンドセリン遺伝子欠損ＥＳ細胞株については、染色体標本を作成して、マウスの正常核型である２ｎ＝４０本の染色体を有している細胞の割合を算定した。さらに、シングルセルにしたエンドセリン遺伝子欠損ＥＳ細胞株の胚様体形成能についても観察した。
ｂ）エンドセリン遺伝子欠損ＥＳ細胞の胚盤胞へのインジェクション
核型解析および分化能の検定によって、正常性の確認されたＥＳ細胞については、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ系マウスの胚盤胞へ注入した後、偽妊娠マウスの子宮角に移植して産仔を得た。
【００１４】
４）相同組換え体の生殖系列への伝達の検定
移植によって得られたキメラマウスについては、１２９／Ｊ系あるいはＩＣＲ系マウスと交配させ、エンドセリン遺伝子欠損ＥＳ細胞由来の産仔が得られるか否かを検定した。キメラマウスの生殖細胞が相同組換え体に由来していれば、娩出される産仔の毛色は、アルビノを呈し、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ系マウスの胚盤胞に由来していれば野性色を呈する。さらに、離乳に至った後に採血し、ＤＮＡを抽出後、上述の方法でＰＣＲを行なって、エンドセリン遺伝子の欠損を確認した。
【００１５】
具体的な操作
（１）マウスエンドセリン−１（ＥＴ−１）遺伝子ＤＮＡの相同組換え用コンストラクトの作成
ＢＡＬＢ／ｃ系マウスの肝臓から抽出したジェノミックＤＮＡを、制限酵素Ｓａｕ３ＡＩを用いて部分消化して作成したジェノミックライブラリーＥＭＢＬ（東京大学医学部第３内科 宮川清先生から分与された）に、マウスＥＴ−１ｃＤＮＡの部分配列をプローブとしてハイブリダイズし、１，０００，０００個のコロニーについて検索した結果、１個の陽性クローンを得た。これをラムダＥ１０に挿入した後、制限酵素ＥｃｏＲＩで消化して第２エクソンから第５エクソンを含む、全長７．５kbのジェノミックＤＮＡ（ｐＥ１０−２９）をサブクローニングした（図１）。
次いで、ＥＴ−１遺伝子の構造を破壊するために、第２エクソンに、ネオマイシン耐性遺伝子を挿入し、さらに、３′側下流には、チミジンキナーゼ遺伝子を挿入した。ジェノミックＤＮＡとの相同部分は、ネオマイシン耐性遺伝子の上流が０．９kb、ネオマイシン耐性遺伝子とチミジンキナーゼ遺伝子との間が６．６kbとした。相同組換え用コンストラクトは、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＳＫ+ に挿入し、ＥＳ細胞への導入の際に制限酵素ＮｏｔＩで切断して線状化した（図２）。
【００１６】
（２）相同組換え用コンストラクトの導入によるＥＳ細胞のＥＴ−１遺伝子欠失
相同組換え用コンストラクトＤＮＡ１５０μｇをＡ３−１株１×１０8 個を含むエレクトロポレーション用緩衝液(20mM HEPES, 137mM NaCl, 5mM KCl, 0.7mM Na2HPO4, 6mM Dextrose, 0.1mM Mercaptoethanol) に懸濁し、Field Strength 2000V/cm, Capacitance 3μＦの条件で、遺伝子導入を行った。導入後２４時間から３００μｇ／ml Ｇ４１８（Ｇｅｎｅｔｉｓｉｎ，Ｓｉｇｍａ）で選択培養を行ない、その４８時間後からは、０．５μｇ／mlガンシクロビルも添加して、選択培養を継続した。
【００１７】
Ｇ４１８およびガンシクロビル耐性コロニーについては、遺伝子導入後１２０時間後から、マイクロピペットを用いて６０μｌのＴＥ溶液を含む９６穴のマイクロプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ ２５８６ＯＭＰ）に移し換え、数分間処理した後、ピペッティングすることによって単一細胞にした後、２４穴のマイクロプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ ２５８２０ＧＥＬ）に移し換え培養を継続した。採取したコロニーは、その長径がマイクロチップの内径の１／２以上に達したもので、この時の細胞数は、１×１０4 〜１０5 個であった。エレクトロポレーション後の生存細胞数は、４．０×１０7 個であった。Ｇ４１８およびガンシクロビル耐性コロニー数は、２．８×１０2 個で、生存細胞数の１／１．４×１０5 であった。
【００１８】
２４穴のマイクロプレート上の細胞が３〜４日の培養でコンフルエントに達した段階で、ＴＥ処理後、順次、３５mm（Ｃｏｒｎｉｎｇ ２５０００ＧＥＬ）あるいは６０mm（Ｃｏｒｎｉｎｇ ２５０１０ＧＥＬ）の組織培養用シャーレ内で培養し、細胞の増殖を図った。尚、ＥＳ細胞の培養は、すべてフィーダー細胞上で行なった。相同組換え体の確認は、ＰＣＲおよびサザンブロットによって以下の通りに行った。ＰＣＲプライマーは、相同組換え用コンストラクトの３′端と第１イントロンとの間、約１kbが増幅されるように設計した。
【００１９】
すなわち、第１イントロンのＥｃｏＲｌ認識部位により７６bp５′上流からの配列５′-GCAGATAAACTGCGCGCGATCTGT-３′配列番号：１およびネオマイシン耐性遺伝子の５′端、５′-AATCCATCTTGTTCAATGGCCGAT-３′配列番号：２のそれぞれ２４ｍｅｒの塩基配列を持つオリゴヌクレオチドをＤＮＡ合成器（ＢｉｏＲａｄ）を用いて合成し、９４℃，５分間の処理後、ＤＮＡの変性９５℃，１分、プライマーのアニーニング６４℃，１分、プライマーの伸長７２℃，１分、で４０サイクルの増幅後、７２℃，１分間ＤＮＡ伸長反応を行ない、アガロース電気泳動により、１kbのバンドを検出した。
【００２０】
サザンブロット解析については、Ｇ４１８およびガンシクロビル耐性細胞からジェノミックＤＮＡを抽出し、制限酵素ＳａｃＩで消化後、第１イントロンのＳａｃＩ−ＥｃｏＲＩ断片、０．４kbをプローブとして行った。相同組換え体および野性型の確認は、それぞれ、３．１kbおよび４．４kbのバンドの検出によって行った。相同組換え体のコロニー数は、Ｇ４１８およびガンシクロビル耐性コロニー２８１個中３５個であった。（１／１．１×１０6 ）。尚、ＰＣＲの検査成績とサザンブロット解析による成績は、完全に一致した。
【００２１】
（３）ＥＳ細胞および培養方法
ＥＳ細胞として、１２９／ＳｖＪ系マウス胚盤胞由来のＡ３−１株（東と豊田、家畜繁殖誌３７，３７−４３，１９９１）を用いた。ＥＳ細胞の培養には、ダルッベッコウ修正イーグル培養液（ＤＭＥＭ，Ｃｏｒｄ．４３０−２１００ ＧＩＢＣＯ）に２０％牛胎児血清（ＦＣＳ）、０．１mMの２−メルカプトエタノール、核酸混合液、非必須アミノ酸溶液および１０3 ｕｎｉｔ／mlのＬＩＦ（ＡＭＲＡＤ）を添加したＳＣＭ培養液(Robertson, Teratocarcinomas and embryonic stem cells a practical approach 1987)を用いた。
【００２２】
また、ＥＳ細胞のフィーダー細胞として用いるマウス胎児線維芽細胞の培養には、ＤＭＥＭに１０％ＦＣＳを添加したものを用いた。マウス胎児線維芽細胞の調製および培養は、以下の通りに行った。胎齢１３〜１４日のＩＣＲ系マウスの胎児を無菌的に採取し、カルシウムおよびマグネシウムを含まないリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ- ）で洗浄後、ピンセットを用いて心臓、肝臓および腸管を除き、眼科用のハサミを用いて細切した。次いで、０．２５％トリプシンおよび０．０４％ＥＤＴＡを含むＰＢＳ- （ＴＥ溶液）で、室温で２０分間処理して細胞浮遊液を得た。
【００２３】
細胞浮遊液を１５００rpm 、５分間の遠心後、上清を除去し、１０％ＦＣＳ加ＤＭＥＭに懸濁して２分間静置した。そして、下部に沈んだ組織片を除いた細胞浮遊液を１００×２０mmの組織培養用シャーレ（Ｃｏｒｎｉｎｇ，２５０２０）に移し、３７℃，５％，ＣＯ2 ，９５％空気の条件で培養に供した。翌日、ＰＢＳ- で１回洗浄し、培養を継続した。継代は、３〜４日間隔で行ない、継代が３代目までの細胞をフィーダーとして使用するためにマイトマイシン処理を施した。
【００２４】
コンフルエント状態に増殖したマウス胎児線維芽細胞を１０μｇ／mlのマイトマイシンＣで３〜４時間処理し、ＰＢＳ- で３回の洗浄後、ＴＥ溶液で室温で２分間処理して細胞を剥離した。次いで、遠心後、細胞数を３×１０5 ／mlに調整し、６０×１０mmのゼラチンコートディッシュ（Ｃｏｒｎｉｎｇ，２５０１０ＧＥＬ）に３mlずつ分注した。以上のように作成したフィーダー細胞は、１週間以内に使用した。ＥＳ細胞の継代は、室温で５分間のＴＥ処理後、ピペッティングによって単一細胞に分散させ、１×１０6 個の細胞をフィーダー細胞層上に播種することによって行った。
【００２５】
培養液は、２４時間間隔で交換し、継代間隔は、５６〜６４時間とした。また、凍結保存する際には、４〜５×１０6 個の細胞をＳＣＭに懸濁してセラムチューブ（１．２ml，Ｃｏｒｎｉｎｇ，２５７０３ＶＩＡＬ１）に移し、０．５mlの凍結用培地（２０％ＤＭＳＯ加ＤＭＥＭ）を滴下した後、−８０℃で一晩放置し、液体窒素中で保存した。
【００２６】
（４）エンドセリン遺伝子欠損ＥＳ細胞によるキメラマウスの作成
ａ）エンドセリン遺伝子欠損ＥＳ細胞の核型解析および浮遊培養による分化能の検定
相同組換えを確認したエンドセリン遺伝子欠損ＥＳ細胞株については、染色体標本を作成して、マウスの正常核型である２ｎ＝４０本の染色体を有している細胞の割合を算定した。継代２日目の細胞に、最終濃度が０．１μｇ／mlとなるようにコルセミド（ＧＩＢＣＯ）を添加して１．５時間培養した。
【００２７】
ＴＥ処理後、０．５６％KCl 溶液で３０分間室温で低張処理を行ない、メタノール：酢酸＝３：１で５分間室温で固定し、遠心を２回繰り返した。次いで、細胞を少量の固定液とともに滴下し、一晩風乾した。そして、１０％ギムザ液で３０分間染色後、鏡検した。ＰＣＲおよびサザンブロットによってエンドセリン遺伝子欠損を確認した３５ラインのうち、１７ラインについて核型検査をした結果、正２倍体の割合は５％から５７％の範囲で、１０％未満が１ライン、１０％以上３０％未満が７ライン、３０％以上４０％未満が１ライン、そして４０％以上が８ラインであった。
【００２８】
体外での分化誘導は、正２倍体の割合が最も高かったラインであったＣ３１について行なった。継代３日目の細胞にＴＥ処理を施した後、ゼラチンコートディッシュに３０分間静置することによって、フィーダー細胞をディッシュの底に接着させることによって、ＥＳ細胞のみを回収した。そして、６×１０6 個／mlに調整し、１００mmのバクテリア用ディッシュ内で、１０％ＦＣＳ加ＤＭＥＭを用いて浮遊培養を行い、胚様体形成能について観察した。
【００２９】
胚様体形成の判定は、ディッシュ内に胚様体が１０個以上観察された日を胚様体形成日とした。尚、培養液の交換は、４日毎に行った。その結果、初期胚様体（Ｓｉｍｐｌｅ Ｅｍｂｒｙｏｉｄ Ｂｏｄｙ）は、培養後４日目、および嚢胞胚様体（Ｃｙｓｔｉｃ Ｅｍｂｒｙｏｉｄ Ｂｏｄｙ）は、培養後８日目に認められた。
【００３０】
ｂ）エンドセリン遺伝子欠損ＥＳ細胞の胚盤胞へのインジェクション
核型解析および分化能の検定によって、正常性の確認されたＥＳ細胞については、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ系マウスの胚盤胞へ注入した後、偽妊娠マウスの子宮角に移植して産仔を得た。胚の採取は、自然交配４日目に、Ｈｅｐｅｓ−ｂｕｆｆｅｒｅｄ−Ｗｈｉｔｔｅｎ’ｓ培地で、子宮を灌流することによって行った。注入に用いたＥＳ細胞は、継代２あるいは３日目にＴＥ処理を行った後、上述の方法でフィーダー細胞を除去し、顕微操作に供するまで、氷上に静置した。
【００３１】
ＥＳ細胞の注入用ピペットは、外径１mmの微小ガラス管（ＮＡＲＩＳＨＩＧＥ）を微小電極作製器（ＮＡＲＩＳＨＩＧＥ，ＰＮ−３）を用いて細く引き延ばし、研磨器（ＮＡＲＩＳＨＩＧＥ）で、内径が約２０μｍとなるように先端を研磨し、さらに、マイクロフォージ（Ｄｅ Ｆｏｎｂｕｒｕｎ）で先端を鋭利に加工した。胚保定用ピペットは、上述の方法で引き延ばしたガラス管をマイクロフォージを用いて、外径５０〜１００μｍの部分で切断した後、さらに、口径を１０〜２０μｍに加工して用いた。
【００３２】
注入用ピペットと保定用ピペットは、先端から約５mmの部分を約３０度曲げて、マイクロマニプレーター（ＬＥＩＴＺ）に接続した。顕微操作に用いたチャンバーは、穴あきスライドグラスにカバーグラスを蜜蝋で接着させたものを用い、その上に約２０μｌの５％ＦＣＳ加Ｈｅｐｅｓ−ｂｕｆｆｅｒｅｄ Ｗｈｉｔｔｅｎ’ｓ培地のドロップを２個置き、上面を流動パラフィン（Ａｒｔ ７１６２，Ｍｅｒｃｋ）で覆った。一方のドロップには、約１００個のＥＳ細胞を入れ、他方には拡張胚盤胞を１０〜１５個入れ、胚１個あたり１０〜１５個のＥＳ細胞を注入した。
【００３３】
顕微操作はすべて、倒立顕微鏡下で行った。操作胚は、１〜２時間の培養後、偽妊娠２日目のＩＣＲ系受容雌の子宮角に移植した。分娩予定日に至っても産仔を娩出しなかった受容雌については、帝王切開を施し、里親に哺育させた。
自然交配４日目に、子宮を灌流することによって採取したＣ５７ＢＬ／６Ｊ系マウスの胚盤胞４３個にＥＳ細胞Ｃ３１を注入した結果、３２個が生存し、成功率は７４％であった。このうち３１個を偽妊娠２日目のＩＣＲ系受容雌の子宮角に移植した結果、２７個に着床が認められ、１９匹の産仔が得られた。離乳に至った１６匹の産仔のうち、毛色でキメラマウスと判定できたのは１０匹で、このうち９匹が、形態的に雄を示していた。これらのキメラマウスにおけるＥＳ細胞の寄与率は、１０〜９５％の幅であり、寄与率が６０％未満が３例、６０％以上９０％未満が２例、９０％以上が４例であった。
【００３４】
ｃ）キメラマウスの交配
移植によって得られたキメラマウスについては、１２９／Ｊ系あるいはＩＣＲ系マウスと交配させ、エンドセリン遺伝子欠損ＥＳ細胞由来の産仔が得られるか否かを検定した。キメラマウスの生殖細胞が相同組換え体に由来していれば、娩出される産仔の毛色は、アルビノを呈し、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ系マウスの胚盤胞に由来していれば野性色を呈する。性成熟に達する前に死亡した２例を除いた８例（Ｎｏ．１，２，４，５，６，７，２１，２３，２４）のキメラマウスのうち、現在までに２例（Ｎｏ．１，５）についてのＥＳ細胞の生殖系列への伝達が確認された。
【００３５】
Ｎｏ．１とＩＣＲ系雌マウスとの交配では、３回の分娩で合計３８匹の産仔が得られ、このうち３０匹がアルビノの毛色を示していた。また、Ｎｏ．５とＩＣＲ系雌との交配で得られた１１匹の産仔のうち３匹がアルビノであった。これらのアルビノマウスのうち２９例についてＰＣＲおよびサザンブロットによる解析を行なった結果、８例でエンドセリン−１遺伝子の欠損を確認した。
【００３６】
前記の方法を忠実に実施することにより、本発明のマウスを容易に作出することができる。
【００３７】
【発明の効果】
以上の通り、本発明は、エンドセリン−１遺伝子へのネオマイシン耐性遺伝子及び／又はチミジンキナーゼ遺伝子の挿入によってエンドセリン−１遺伝子が破壊されているマウスを提出する。このマウスは、高血圧、動脈硬化、虚血性心疾患など循環器系疾患の病態生理、原因の解明、治療法の開発等のための実験用動物として有用である。
【００３８】
【配列表】
配列番号：１
配列の長さ：１４
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：合成ＤＮＡ
配列
GCAGATAAAC TGCGCGCGAT CTGT
【００３９】
配列番号：２
配列の長さ：１４
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：合成ＤＮＡ
配列
AATCCATCTT GTTCAATGGC CGAT
【図面の簡単な説明】
【図１】図１はベクターｐＥ１０−２９中にクローニングされた７．５kbのマウスジェノミックＥＴ−１遺伝子断片の構造を示す。図中Ｉ〜Ｖは第１〜第５エクソンを示す。
【図２】図２は、図１に示す遺伝子の第１エクソン中にネオマイシン耐性遺伝子（ｎｅｏr ）を挿入し、且つ第５エクソンの下流にチミジンキナーゼ遺伝子（ＨＳＶ−ｔｋ）を挿入した状態を示す。
Claims (4)
- 破壊されたエンドセリン−１遺伝子を有する遺伝子操作されたマウスの製造方法において、
（ａ）エンドセリン−１遺伝子の第２エクソンに選択マーカー配列を挿入することにより破壊されたエンドセリン−１遺伝子を含んで成るDNA断片を調製し；
（ｂ）マウスから胚性幹細胞を調製し；
（ｃ）前記工程（ａ）からのDNA断片と、前記胚性幹細胞のゲノム中に含まれるエンドセリン−１遺伝子との間の相同組換えにより、該胚性幹細胞のゲノム中に含まれるエンドセリン−１遺伝子を欠損せしめ；
（ｄ）前記工程（ｃ）からの細胞を培養し；
（ｅ）前記工程（ｄ）からの細胞を、核型解析もしくは分化能の検定又はこの両者にかけ；
（ｆ）正常な核型もしくは正常な分化能又はこの両者を有する、前記工程（ｅ）からの細胞を選択し；
（ｇ）前記工程（ｆ）からの細胞をマウスの胚盤胞に注入し、そして該胚盤胞を偽妊娠マウスに移行させることにより、該杯胚胞からキメラマウスを生じさせ；そして
（ｈ）前記キメラマウスを育成することにより、破壊されたエンドセリン−１遺伝子を有する遺伝子操作されたマウスを生成せしめ、ここで前記破壊されたエンドセリン−１遺伝子が、野生型マウスに比べて変化した循環系動態を示すマウスをもたらす；
工程を含んで成る方法。 - 前記選択マーカー配列がネオマイシン耐性遺伝子である、請求項１に記載の方法。
- 破壊されたエンドセリン−１遺伝子を有し請求項１に記載の方法により製造される遺伝子操作されたマウスであって、前記破壊されたエンドセリン−１遺伝子により、野生型マウスに比べて変化した循環系動態を示すマウス。
- 破壊されたエンドセリン−１遺伝子を有する遺伝子操作されたマウスであって、該破壊されたエンドセリン−遺伝子は前記マウスの内因性エンドセリン−１遺伝子の第２エクソンに選択マーカー配列を挿入することにより破壊され、該選択マーカー遺伝子は前記マウス又は該マウスの先祖に胚段階において導入され、そして前期破壊されたエンドセリン−１遺伝子が野生型マウスに比べて変化した循環系動態をもたらすことを特徴とするマウス。
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