JPH1033087A - グルタミン酸トランスポーター遺伝子機能欠損非ヒト動物 - Google Patents
グルタミン酸トランスポーター遺伝子機能欠損非ヒト動物Info
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- JPH1033087A JPH1033087A JP8193655A JP19365596A JPH1033087A JP H1033087 A JPH1033087 A JP H1033087A JP 8193655 A JP8193655 A JP 8193655A JP 19365596 A JP19365596 A JP 19365596A JP H1033087 A JPH1033087 A JP H1033087A
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 グルタミン酸が関与する神経変性疾患や神経
細胞死などの病態生理、病因の解明及び治療方法の開発
等の研究のための実験用動物の提供。 【解決手段】 動物のグルタミン酸トランスポーター遺
伝子の機能を欠損させる。特に、グルタミン酸トランス
ポーター遺伝子であるＧｌｕＴ−１遺伝子及び／又はＧ
ＬＴ１遺伝子の機能を体細胞及び生殖細胞の染色体にお
いて欠損させ、ノックアウト動物を作成する。
細胞死などの病態生理、病因の解明及び治療方法の開発
等の研究のための実験用動物の提供。 【解決手段】 動物のグルタミン酸トランスポーター遺
伝子の機能を欠損させる。特に、グルタミン酸トランス
ポーター遺伝子であるＧｌｕＴ−１遺伝子及び／又はＧ
ＬＴ１遺伝子の機能を体細胞及び生殖細胞の染色体にお
いて欠損させ、ノックアウト動物を作成する。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、グルタミン酸トラ
ンスポーター遺伝子の機能が欠損したいわゆるノックア
ウト動物に関する。かかるグルタミン酸トランスポータ
ー欠損動物は、神経変性疾患や神経細胞死などの病態生
理、病因の解明及び治療方法の開発等の研究のための実
験用動物として極めて有用である。
ンスポーター遺伝子の機能が欠損したいわゆるノックア
ウト動物に関する。かかるグルタミン酸トランスポータ
ー欠損動物は、神経変性疾患や神経細胞死などの病態生
理、病因の解明及び治療方法の開発等の研究のための実
験用動物として極めて有用である。
【０００２】
【従来の技術】グルタミン酸は主要な興奮性神経伝達物
質であると同時に、中枢神経系においてニューロンの可
塑性や神経毒性に重要な役割を演じている。一般的に神
経伝達物質にとって重要な性質は、それがシナプスから
放出された後、その作用が急速に消失することである。
グルタミン酸トランスポーターは、中枢神経系におい
て、グリア細胞及び神経細胞の細胞膜に存在し、シナプ
ス前部から放出されたグルタミン酸を取り込んで細胞外
から取り除き、細胞外濃度を毒性濃度以下に低下させる
メカニズムに関与する膜蛋白質であり、その存在する細
胞によりグリア細胞型（ＧｌｕＴ−１とＧＬＴ１）と神
経細胞型（ＥＡＡＣ１とＥＡＡＴ４）とに分類される。
これらのグルタミン酸トランスポーターの異常により引
き起こされる過剰な濃度のグルタミン酸が、神経変性疾
患や脳虚血に伴う神経細胞死等の原因となっていると考
えられており、例えば、グルタミン酸トランスポーター
の活性の低下が、アルツハイマー症や筋萎縮性側索硬化
症（ＡＬＳ）に関与しているという報告がなされてい
る。また、これらのグルタミン酸トランスポーターのう
ち、マウスのＧｌｕＴ−１、ＧＬＴ１及びＥＡＡＣ１を
それぞれコードするｃＤＮＡがマウス脳から単離され、
クローニングされている（Tanaka, Neuroscience Lette
rs,159, 183-186(1993)及び Mukainaka et al., Biochi
mica et Biophysica Acta,1244, 233-237(1995))。
質であると同時に、中枢神経系においてニューロンの可
塑性や神経毒性に重要な役割を演じている。一般的に神
経伝達物質にとって重要な性質は、それがシナプスから
放出された後、その作用が急速に消失することである。
グルタミン酸トランスポーターは、中枢神経系におい
て、グリア細胞及び神経細胞の細胞膜に存在し、シナプ
ス前部から放出されたグルタミン酸を取り込んで細胞外
から取り除き、細胞外濃度を毒性濃度以下に低下させる
メカニズムに関与する膜蛋白質であり、その存在する細
胞によりグリア細胞型（ＧｌｕＴ−１とＧＬＴ１）と神
経細胞型（ＥＡＡＣ１とＥＡＡＴ４）とに分類される。
これらのグルタミン酸トランスポーターの異常により引
き起こされる過剰な濃度のグルタミン酸が、神経変性疾
患や脳虚血に伴う神経細胞死等の原因となっていると考
えられており、例えば、グルタミン酸トランスポーター
の活性の低下が、アルツハイマー症や筋萎縮性側索硬化
症（ＡＬＳ）に関与しているという報告がなされてい
る。また、これらのグルタミン酸トランスポーターのう
ち、マウスのＧｌｕＴ−１、ＧＬＴ１及びＥＡＡＣ１を
それぞれコードするｃＤＮＡがマウス脳から単離され、
クローニングされている（Tanaka, Neuroscience Lette
rs,159, 183-186(1993)及び Mukainaka et al., Biochi
mica et Biophysica Acta,1244, 233-237(1995))。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】したがって、グルタミ
ン酸トランスポーターの欠損した遺伝的に安定な変異動
物が系統的に得られれば、該蛋白質の生理的機能の研究
だけでなく、上記神経変性疾患や神経細胞死等の病態生
理、病因の解明及び治療方法の開発等の研究のための実
験動物として極めて有用であると期待される。しかしな
がら、現在のところグルタミン酸トランスポーター遺伝
子の機能が欠損した遺伝的に安定な動物は知られていな
い。上記の実情に基づき、本発明者らはグルタミン酸ト
ランスポーター遺伝子の機能が欠損した遺伝的背景の明
確な動物モデルを提供すべく鋭意検討を重ねた結果、本
発明を完成するに至った。
ン酸トランスポーターの欠損した遺伝的に安定な変異動
物が系統的に得られれば、該蛋白質の生理的機能の研究
だけでなく、上記神経変性疾患や神経細胞死等の病態生
理、病因の解明及び治療方法の開発等の研究のための実
験動物として極めて有用であると期待される。しかしな
がら、現在のところグルタミン酸トランスポーター遺伝
子の機能が欠損した遺伝的に安定な動物は知られていな
い。上記の実情に基づき、本発明者らはグルタミン酸ト
ランスポーター遺伝子の機能が欠損した遺伝的背景の明
確な動物モデルを提供すべく鋭意検討を重ねた結果、本
発明を完成するに至った。
【０００４】
【課題を解決するための手段】したがって、本発明はグ
ルタミン酸トランスポーター遺伝子の機能が欠損した非
ヒト動物を提供する。特に、本発明はグルタミン酸トラ
ンスポーター遺伝子の機能欠損が体細胞及び生殖細胞の
染色体に存在する上記非ヒト動物を提供する。さらに、
本発明はグルタミン酸トランスポーター遺伝子であるＧ
ｌｕＴ−１遺伝子及び／又はＧＬＴ１遺伝子の機能が欠
損した非ヒト動物、特にマウスを提供する。
ルタミン酸トランスポーター遺伝子の機能が欠損した非
ヒト動物を提供する。特に、本発明はグルタミン酸トラ
ンスポーター遺伝子の機能欠損が体細胞及び生殖細胞の
染色体に存在する上記非ヒト動物を提供する。さらに、
本発明はグルタミン酸トランスポーター遺伝子であるＧ
ｌｕＴ−１遺伝子及び／又はＧＬＴ１遺伝子の機能が欠
損した非ヒト動物、特にマウスを提供する。
【０００５】
【発明の実施の形態】本発明において、グルタミン酸ト
ランスポーター遺伝子の機能の欠損とは、該遺伝子が生
来の構造とは異なっているために発現されず、グルタミ
ン酸トランスポーターが産生されないことをいう。グル
タミン酸トランスポーター遺伝子の機能を人為的に欠損
させた動物を得るためには、グルタミン酸トランスポー
ター遺伝子をクローニングし、それをインビトロで何ら
かの方法によりその遺伝子の機能を欠損させた後に、該
欠損遺伝子を動物に戻して、その動物自体又はその子孫
の該遺伝子の機能を欠損させるという方法が用いられ
る。グルタミン酸トランスポーター遺伝子のクローニン
グは、例えばマウスの肝からゲノムＤＮＡを抽出し、常
法に従ってＤＮＡライブラリーを作製し、次にこれを、
すでにクローニングされているグルタミン酸トランスポ
ーター遺伝子をコードするＤＮＡ、例えばｃＤＮＡ（Ｇ
ｌｕＴ−１については、上述の Tanaka, Neuroscience
Letters, 159, 183-186(1993)、ＧＬＴ１については、上
述の Mukainaka et al., Biochimica et Biophysica Ac
ta, 1244, 233-237(1995) 参照）の部分配列をプローブ
として用いてスクリーニングすることにより取得するこ
とができる。
ランスポーター遺伝子の機能の欠損とは、該遺伝子が生
来の構造とは異なっているために発現されず、グルタミ
ン酸トランスポーターが産生されないことをいう。グル
タミン酸トランスポーター遺伝子の機能を人為的に欠損
させた動物を得るためには、グルタミン酸トランスポー
ター遺伝子をクローニングし、それをインビトロで何ら
かの方法によりその遺伝子の機能を欠損させた後に、該
欠損遺伝子を動物に戻して、その動物自体又はその子孫
の該遺伝子の機能を欠損させるという方法が用いられ
る。グルタミン酸トランスポーター遺伝子のクローニン
グは、例えばマウスの肝からゲノムＤＮＡを抽出し、常
法に従ってＤＮＡライブラリーを作製し、次にこれを、
すでにクローニングされているグルタミン酸トランスポ
ーター遺伝子をコードするＤＮＡ、例えばｃＤＮＡ（Ｇ
ｌｕＴ−１については、上述の Tanaka, Neuroscience
Letters, 159, 183-186(1993)、ＧＬＴ１については、上
述の Mukainaka et al., Biochimica et Biophysica Ac
ta, 1244, 233-237(1995) 参照）の部分配列をプローブ
として用いてスクリーニングすることにより取得するこ
とができる。
【０００６】本発明でいう非ヒト動物とはヒトを除く全
ての動物をいい、好ましくは哺乳動物、より好ましくは
齧歯動物、さらに好ましくはマウスである。動物に遺伝
子を導入してその動物の個体又は子孫にその遺伝子を発
現させる手法としては、（１）遺伝子ＤＮＡを受精卵の
前核期胚に注入する、（２）組換えレトロウイルスを初
期胚に感染させる、（３）相同組換えを起こさせた胚性
幹細胞（ＥＳ細胞）を胚盤胞又は８細胞期胚に注入す
る、等の方法によって得られた宿主胚を動物に移植して
産仔を得、これを他の個体と交配し、Ｆ１ヘテロ変異動
物、さらにはＦ２ホモ変異動物を作成するという、従来
からトランスジェニック動物の作成に常用されている公
知の手法を挙げることができる。上記の手法のうち、Ｅ
Ｓ細胞を用いる遺伝子導入の方法は、ＥＳ細胞に遺伝子
を導入する工程とキメラ動物を作出する工程とを分けて
行えるという利点を有しているので好ましい。ＥＳ細胞
の培養は原理的には哺乳動物一般で可能であると考えら
れ、マウスの他に、 ラット、ウサギ又はブタ、ウシ等の
家畜についてもＥＳ細胞を確立すべく研究が進展してい
ると考えられる。なお、ＥＳ細胞が培養されていない
か、又は培養されていても生殖細胞にまで分化する細胞
系が確立していない動物種については、上記（１）又は
（２）等の方法を用いることができる。特に、 ＥＳ細胞
を用いる遺伝子導入の方法はマウスについて確立されて
いるので、以下マウスを例にして本発明を説明するが、
本発明は何らこの例によって限定されるものではない。
ての動物をいい、好ましくは哺乳動物、より好ましくは
齧歯動物、さらに好ましくはマウスである。動物に遺伝
子を導入してその動物の個体又は子孫にその遺伝子を発
現させる手法としては、（１）遺伝子ＤＮＡを受精卵の
前核期胚に注入する、（２）組換えレトロウイルスを初
期胚に感染させる、（３）相同組換えを起こさせた胚性
幹細胞（ＥＳ細胞）を胚盤胞又は８細胞期胚に注入す
る、等の方法によって得られた宿主胚を動物に移植して
産仔を得、これを他の個体と交配し、Ｆ１ヘテロ変異動
物、さらにはＦ２ホモ変異動物を作成するという、従来
からトランスジェニック動物の作成に常用されている公
知の手法を挙げることができる。上記の手法のうち、Ｅ
Ｓ細胞を用いる遺伝子導入の方法は、ＥＳ細胞に遺伝子
を導入する工程とキメラ動物を作出する工程とを分けて
行えるという利点を有しているので好ましい。ＥＳ細胞
の培養は原理的には哺乳動物一般で可能であると考えら
れ、マウスの他に、 ラット、ウサギ又はブタ、ウシ等の
家畜についてもＥＳ細胞を確立すべく研究が進展してい
ると考えられる。なお、ＥＳ細胞が培養されていない
か、又は培養されていても生殖細胞にまで分化する細胞
系が確立していない動物種については、上記（１）又は
（２）等の方法を用いることができる。特に、 ＥＳ細胞
を用いる遺伝子導入の方法はマウスについて確立されて
いるので、以下マウスを例にして本発明を説明するが、
本発明は何らこの例によって限定されるものではない。
【０００７】グルタミン酸トランスポーター遺伝子の機
能を欠損させるためには、グルタミン酸トランスポータ
ーをコードする遺伝子のいずれかの部分に欠失を生じさ
せるか、若しくは点変異を導入してもよく、又は他の遺
伝子を挿入してもよい。挿入する他の遺伝子としては、
グルタミン酸トランスポーター遺伝子の欠損を選別する
ためのマーカー遺伝子として機能する遺伝子を用いるこ
とが好ましい。そのような遺伝子としては、ポジティブ
選別に用いるマーカー遺伝子、例えばネオマイシン（ｎ
ｅｏ）耐性遺伝子が好ましい。このネオマイシン耐性遺
伝子は、ネオマイシン類似体であるＧ４１８を用いるこ
とにより目的遺伝子の選別を可能にする。また、目的遺
伝子を選別除去するためにネガティブ選別に用いるマー
カー遺伝子を上記ポジティブ選別用マーカー遺伝子とと
もに用いることもできる。このような遺伝子としては、
チミジンキナーゼ（ｔｋ）遺伝子（選別剤としてガンシ
クロビル、ＦＩＡＵ等を用い、それに対する感受性によ
り非相同組換え体を選別除去する。）及びジフテリアト
キシンＡフラグメント（ＤＴ−Ａ）遺伝子（ＤＴ−Ａに
より発現されたジフテリア毒素により、非相同組換え体
を選別除去する。）又はこれらの組み合わせ等が用いら
れる。遺伝子の機能欠損とともにポジティブ選別の目的
で用いられるマーカー遺伝子の挿入場所は特に限定され
ないが、通常エキソンに欠損が生じるように挿入する。
マウスのＧｌｕＴ−１遺伝子は１０個のエキソンを含
み、ゲノム遺伝子の組織図（制限酵素地図）及び各エキ
ソン−イントロン連結点の詳細は知られている（Hagiwa
ra, Tanaka et al., GENOMICS, 33, 508-515(1996)) 。
マウスのＧＬＴ１遺伝子については、本発明者らが図２
に示すようなゲノム遺伝子の組織図（制限酵素地図）を
作成し、該ゲノム遺伝子が１１個のエキソンを含むこと
を見い出した。本発明者らは、マウスＧＬＴ１遺伝子の
各エキソン−イントロン連結点を解析し、その詳細を表
１に示す。
能を欠損させるためには、グルタミン酸トランスポータ
ーをコードする遺伝子のいずれかの部分に欠失を生じさ
せるか、若しくは点変異を導入してもよく、又は他の遺
伝子を挿入してもよい。挿入する他の遺伝子としては、
グルタミン酸トランスポーター遺伝子の欠損を選別する
ためのマーカー遺伝子として機能する遺伝子を用いるこ
とが好ましい。そのような遺伝子としては、ポジティブ
選別に用いるマーカー遺伝子、例えばネオマイシン（ｎ
ｅｏ）耐性遺伝子が好ましい。このネオマイシン耐性遺
伝子は、ネオマイシン類似体であるＧ４１８を用いるこ
とにより目的遺伝子の選別を可能にする。また、目的遺
伝子を選別除去するためにネガティブ選別に用いるマー
カー遺伝子を上記ポジティブ選別用マーカー遺伝子とと
もに用いることもできる。このような遺伝子としては、
チミジンキナーゼ（ｔｋ）遺伝子（選別剤としてガンシ
クロビル、ＦＩＡＵ等を用い、それに対する感受性によ
り非相同組換え体を選別除去する。）及びジフテリアト
キシンＡフラグメント（ＤＴ−Ａ）遺伝子（ＤＴ−Ａに
より発現されたジフテリア毒素により、非相同組換え体
を選別除去する。）又はこれらの組み合わせ等が用いら
れる。遺伝子の機能欠損とともにポジティブ選別の目的
で用いられるマーカー遺伝子の挿入場所は特に限定され
ないが、通常エキソンに欠損が生じるように挿入する。
マウスのＧｌｕＴ−１遺伝子は１０個のエキソンを含
み、ゲノム遺伝子の組織図（制限酵素地図）及び各エキ
ソン−イントロン連結点の詳細は知られている（Hagiwa
ra, Tanaka et al., GENOMICS, 33, 508-515(1996)) 。
マウスのＧＬＴ１遺伝子については、本発明者らが図２
に示すようなゲノム遺伝子の組織図（制限酵素地図）を
作成し、該ゲノム遺伝子が１１個のエキソンを含むこと
を見い出した。本発明者らは、マウスＧＬＴ１遺伝子の
各エキソン−イントロン連結点を解析し、その詳細を表
１に示す。
【０００８】
【表１】 表１ マウスＧＬＴ１遺伝子のエキソン−イントロン組織図 したがって、例えば、ＧｌｕＴ−１遺伝子についてはエ
キソン６（４番目の膜貫通領域をコードしている。）
に、ＧＬＴ１遺伝子についてはエキソン４（３番目の膜
貫通領域をコードしている。）にグルタミン酸トランス
ポーター遺伝子の欠損が生じるようにマーカー遺伝子を
挿入して、各々の遺伝子についてターゲティングベクタ
ー（相同組換え用ＤＮＡ）を構築するのが好ましい。こ
れらの遺伝子の挿入はインビトロで常用のＤＮＡ組換え
技術により行うことができる。
キソン６（４番目の膜貫通領域をコードしている。）
に、ＧＬＴ１遺伝子についてはエキソン４（３番目の膜
貫通領域をコードしている。）にグルタミン酸トランス
ポーター遺伝子の欠損が生じるようにマーカー遺伝子を
挿入して、各々の遺伝子についてターゲティングベクタ
ー（相同組換え用ＤＮＡ）を構築するのが好ましい。こ
れらの遺伝子の挿入はインビトロで常用のＤＮＡ組換え
技術により行うことができる。
【０００９】次に、こうして得られたターゲティングベ
クター（相同組換え用ＤＮＡ）を、ＥＳ細胞に導入し、
ＥＳ細胞中のグルタミン酸トランスポーター遺伝子との
間で相同組換えを行う。相同組換え用ＤＮＡのＥＳ細胞
への導入は、例えば常用のエレクトロポレーションによ
り行うことができる。この相同組換えにおいては、ＥＳ
細胞中のグルタミン酸トランスポーター遺伝子のＤＮＡ
と相同組換え用ＤＮＡの対応する領域との間で組換えが
生じ、相同組換え用ＤＮＡ中に挿入されていたマーカー
遺伝子がＥＳ細胞のゲノムのグルタミン酸トランスポー
ター遺伝子に挿入される。この結果、ＥＳ細胞はグルタ
ミン酸トランスポーター遺伝子の機能を欠損し、同時に
マーカー遺伝子を含むことになる。このマーカー遺伝子
の選別機能に基づいて、グルタミン酸トランスポーター
遺伝子機能を欠損したＥＳ細胞を選別することができ
る。
クター（相同組換え用ＤＮＡ）を、ＥＳ細胞に導入し、
ＥＳ細胞中のグルタミン酸トランスポーター遺伝子との
間で相同組換えを行う。相同組換え用ＤＮＡのＥＳ細胞
への導入は、例えば常用のエレクトロポレーションによ
り行うことができる。この相同組換えにおいては、ＥＳ
細胞中のグルタミン酸トランスポーター遺伝子のＤＮＡ
と相同組換え用ＤＮＡの対応する領域との間で組換えが
生じ、相同組換え用ＤＮＡ中に挿入されていたマーカー
遺伝子がＥＳ細胞のゲノムのグルタミン酸トランスポー
ター遺伝子に挿入される。この結果、ＥＳ細胞はグルタ
ミン酸トランスポーター遺伝子の機能を欠損し、同時に
マーカー遺伝子を含むことになる。このマーカー遺伝子
の選別機能に基づいて、グルタミン酸トランスポーター
遺伝子機能を欠損したＥＳ細胞を選別することができ
る。
【００１０】次に、このＥＳ細胞をマウスの胚盤胞又は
８細胞期胚等の宿主胚に注入し、得られた胚を偽妊娠マ
ウスの子宮角に移植してキメラマウスを得る。このキメ
ラマウスを適当な系統のマウスと交配することによりＦ
１ヘテロ型の産仔を得る。キメラマウスの生殖細胞が相
同組換え体、すなわちグルタミン酸トランスポーター遺
伝子が破壊されているＥＳ細胞に由来していれば、グル
タミン酸トランスポーター遺伝子の機能が欠損したマウ
スを得ることができる。ここでＦ１ヘテロ型産仔どうし
を交配してＦ２ホモ型産仔を得ることができる。本発明
の動物は、キメラ型動物、Ｆ１ヘテロ型動物及びＦ２ホ
モ型動物を包含する。グルタミン酸トランスポーター遺
伝子の機能欠損の効果の点からＦ２ホモ型動物が好まし
い。以下、上記の方法を工程に分けて説明する。
８細胞期胚等の宿主胚に注入し、得られた胚を偽妊娠マ
ウスの子宮角に移植してキメラマウスを得る。このキメ
ラマウスを適当な系統のマウスと交配することによりＦ
１ヘテロ型の産仔を得る。キメラマウスの生殖細胞が相
同組換え体、すなわちグルタミン酸トランスポーター遺
伝子が破壊されているＥＳ細胞に由来していれば、グル
タミン酸トランスポーター遺伝子の機能が欠損したマウ
スを得ることができる。ここでＦ１ヘテロ型産仔どうし
を交配してＦ２ホモ型産仔を得ることができる。本発明
の動物は、キメラ型動物、Ｆ１ヘテロ型動物及びＦ２ホ
モ型動物を包含する。グルタミン酸トランスポーター遺
伝子の機能欠損の効果の点からＦ２ホモ型動物が好まし
い。以下、上記の方法を工程に分けて説明する。
【００１１】１）マウスグルタミン酸トランスポーター
遺伝子のターゲティングベクター（相同組換え用ＤＮ
Ａ）の作成 マウスの肝から抽出したゲノムＤＮＡを、制限酵素で部
分消化してゲノムライブラリーを作成する。このゲノム
ライブラリーについて、グルタミン酸トランスポーター
ｃＤＮＡの部分配列をプローブとして用いてハイブリダ
イゼーションを行い、陽性クローンを得る。これを適当
なベクターに挿入した後、制限酵素で消化して、Ｇｌｕ
Ｔ−１については第６エキソンから第８エキソンを含む
全長約９ｋｂのゲノムＤＮＡを、ＧＬＴ１については第
２エキソンから第４エキソンを含む全長１１．２ｋｂの
ゲノムＤＮＡをサブクローニングする。次いで、グルタ
ミン酸トランスポーター遺伝子の構造を破壊するととも
に、目的とする相同組換え体を選別するために、ポジテ
ィブ／ネガティブ選別を行う。かかる選別のために、例
えば、ＧｌｕＴ−１については、Ｙａｇｉらの報告（Ya
gi, Nada, Watanabeet al., Analytical Biochemistry
214，77-86 （1993))に従って、ネオマイシン耐性遺伝
子及びジフテリアトキシンＡフラグメント遺伝子を挿入
し、ＧＬＴ１については、Ｍａｎｓｏｕｒらの報告 (Ma
nsour, Thomas, Capacchi, Nature 336 ，348-352 （19
88) ）に従って、ネオマイシン耐性遺伝子及びチミジン
キナーゼ遺伝子を挿入する。
遺伝子のターゲティングベクター（相同組換え用ＤＮ
Ａ）の作成 マウスの肝から抽出したゲノムＤＮＡを、制限酵素で部
分消化してゲノムライブラリーを作成する。このゲノム
ライブラリーについて、グルタミン酸トランスポーター
ｃＤＮＡの部分配列をプローブとして用いてハイブリダ
イゼーションを行い、陽性クローンを得る。これを適当
なベクターに挿入した後、制限酵素で消化して、Ｇｌｕ
Ｔ−１については第６エキソンから第８エキソンを含む
全長約９ｋｂのゲノムＤＮＡを、ＧＬＴ１については第
２エキソンから第４エキソンを含む全長１１．２ｋｂの
ゲノムＤＮＡをサブクローニングする。次いで、グルタ
ミン酸トランスポーター遺伝子の構造を破壊するととも
に、目的とする相同組換え体を選別するために、ポジテ
ィブ／ネガティブ選別を行う。かかる選別のために、例
えば、ＧｌｕＴ−１については、Ｙａｇｉらの報告（Ya
gi, Nada, Watanabeet al., Analytical Biochemistry
214，77-86 （1993))に従って、ネオマイシン耐性遺伝
子及びジフテリアトキシンＡフラグメント遺伝子を挿入
し、ＧＬＴ１については、Ｍａｎｓｏｕｒらの報告 (Ma
nsour, Thomas, Capacchi, Nature 336 ，348-352 （19
88) ）に従って、ネオマイシン耐性遺伝子及びチミジン
キナーゼ遺伝子を挿入する。
【００１２】２）相同組換えによるＥＳ細胞のグルタミ
ン酸トランスポーター遺伝子欠損 相同組換え用ＤＮＡを、マウスＥＳ細胞（例えば、Ｅ１
４株）（Hooper, Hardy, Handside et al., Nature 32
6, 292-295 (1987)) を含むエレクトロポレーション用
緩衝液に懸濁させ、ＥＳ細胞への遺伝子導入を行う。次
いで、ＧｌｕＴ−１についてはＧ４１８を、ＧＬＴ１に
ついてはＧ４１８及びガンシクロビルを選択剤として用
いて選択培養を行う。選択剤に耐性のコロニーについ
て、相同組換え体の確認をサザンブロットによって行
う。
ン酸トランスポーター遺伝子欠損 相同組換え用ＤＮＡを、マウスＥＳ細胞（例えば、Ｅ１
４株）（Hooper, Hardy, Handside et al., Nature 32
6, 292-295 (1987)) を含むエレクトロポレーション用
緩衝液に懸濁させ、ＥＳ細胞への遺伝子導入を行う。次
いで、ＧｌｕＴ−１についてはＧ４１８を、ＧＬＴ１に
ついてはＧ４１８及びガンシクロビルを選択剤として用
いて選択培養を行う。選択剤に耐性のコロニーについ
て、相同組換え体の確認をサザンブロットによって行
う。
【００１３】３）相同組換えＥＳ細胞によるキメラマウ
スの作成 グルタミン酸トランスポーター遺伝子機能が欠損してい
る相同組換えＥＳ細胞を適切な系列のマウス、例えばＣ
５７ＢＬ／６Ｊ系マウスの胚盤胞又は８細胞期胚等の宿
主胚に注入した後、得られた宿主胚に偽妊娠マウスの子
宮角に移植して産仔を得る。宿主胚をどのような系統の
マウスから得るかの選択は、常法に従い毛色等の表現型
によりＥＳ細胞由来の細胞と宿主胚由来の細胞とを区別
することができるように行う。
スの作成 グルタミン酸トランスポーター遺伝子機能が欠損してい
る相同組換えＥＳ細胞を適切な系列のマウス、例えばＣ
５７ＢＬ／６Ｊ系マウスの胚盤胞又は８細胞期胚等の宿
主胚に注入した後、得られた宿主胚に偽妊娠マウスの子
宮角に移植して産仔を得る。宿主胚をどのような系統の
マウスから得るかの選択は、常法に従い毛色等の表現型
によりＥＳ細胞由来の細胞と宿主胚由来の細胞とを区別
することができるように行う。
【００１４】４）相同組換えＥＳ細胞の生殖系列への伝
達の検定 移植によって得られたキメラマウスを、例えばＣ５７Ｂ
Ｌ／６Ｊ系、１２９／Ｊ系又はＩＣＲ系マウスと交配
し、グルタミン酸トランスポーター遺伝子機能が欠損し
たＥＳ細胞由来の産仔が得られるか否かを検定する。た
とえば、Ｅ１４株のＥＳ細胞とＣ５７ＢＬ／６Ｊ系の宿
主胚を用いて得られたキメラマウスをＣ５７ＢＬ／６Ｊ
系と交配する場合は、娩出される産仔は、キメラマウス
の生殖細胞が、相同組換えＥＳ細胞に由来していれば該
ＥＳ細胞が由来するマウスと同じ野生色を呈し、宿主胚
に由来していれば該宿主胚が由来するマウスと同じ黒色
を呈する。グルタミン酸トランスポーター遺伝子の欠損
は、離乳に至った後に尾からＤＮＡを抽出後、サザンブ
ロットを行って、確認することができる。
達の検定 移植によって得られたキメラマウスを、例えばＣ５７Ｂ
Ｌ／６Ｊ系、１２９／Ｊ系又はＩＣＲ系マウスと交配
し、グルタミン酸トランスポーター遺伝子機能が欠損し
たＥＳ細胞由来の産仔が得られるか否かを検定する。た
とえば、Ｅ１４株のＥＳ細胞とＣ５７ＢＬ／６Ｊ系の宿
主胚を用いて得られたキメラマウスをＣ５７ＢＬ／６Ｊ
系と交配する場合は、娩出される産仔は、キメラマウス
の生殖細胞が、相同組換えＥＳ細胞に由来していれば該
ＥＳ細胞が由来するマウスと同じ野生色を呈し、宿主胚
に由来していれば該宿主胚が由来するマウスと同じ黒色
を呈する。グルタミン酸トランスポーター遺伝子の欠損
は、離乳に至った後に尾からＤＮＡを抽出後、サザンブ
ロットを行って、確認することができる。
【００１５】以下、実施例により本発明をより詳細に説
明する。
明する。
【実施例】例１ ＧｌｕＴ−１遺伝子機能欠損マウスの作成 １）マウスＧｌｕＴ−１遺伝子ＤＮＡの相同組換え用Ｄ
ＮＡの作成 １２９ＳＶマウスの肝から抽出したゲノムＤＮＡ( 野生
型マウスＧｌｕＴ−１遺伝子）を、制限酵素Ｓａｕ３Ａ
Ｉで部分消化して得たゲノムライブラリーラムダＦＩＸ
ＩＩについて、マウスＧｌｕＴ−１遺伝子のｃＤＮＡの
部分配列をプローブとして用いてハイブリダイゼーショ
ンを行い、１ｘ１０6 個のコロニーについて検索した結
果、２６個の陽性クローンを得た。これを制限酵素Ｅｃ
ｏＲＶ及びＸｈｏＩで不完全消化させて、第６エキソン
から第８エキソンを含む、全長９ｋｂｐのゲノムＤＮＡ
１をサブクローニングした（図１）。次いで、ＧｌｕＴ
−１遺伝子を破壊するために、第６エキソンのＢａｍＨ
Ｉ以降１．５ｋｂｐを欠損させ、そこににネオマイシン
耐性遺伝子を、さらに第８エキソンの下流にジフテリア
トキシンＡフラグメント遺伝子を挿入した。ゲノムＤＮ
Ａとの相同部分は、ネオマイシン耐性遺伝子の上流が
２．５ｋｂ、ネオマイシン耐性遺伝子とジフテリアトキ
シンＡフラグメント遺伝子との間が５ｋｂとなるように
構築した。得られた構築体を、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ
ＳＫに挿入し、ＥＳ細胞への導入の際に制限酵素Ｎｏｔ
Ｉで切断して線状化することによりターゲティングベク
ター２（相同組換え用ＤＮＡ：ｐＧｌｕＴ１ＮｅｏＤ
Ｔ）を得た（図１）。
ＮＡの作成 １２９ＳＶマウスの肝から抽出したゲノムＤＮＡ( 野生
型マウスＧｌｕＴ−１遺伝子）を、制限酵素Ｓａｕ３Ａ
Ｉで部分消化して得たゲノムライブラリーラムダＦＩＸ
ＩＩについて、マウスＧｌｕＴ−１遺伝子のｃＤＮＡの
部分配列をプローブとして用いてハイブリダイゼーショ
ンを行い、１ｘ１０6 個のコロニーについて検索した結
果、２６個の陽性クローンを得た。これを制限酵素Ｅｃ
ｏＲＶ及びＸｈｏＩで不完全消化させて、第６エキソン
から第８エキソンを含む、全長９ｋｂｐのゲノムＤＮＡ
１をサブクローニングした（図１）。次いで、ＧｌｕＴ
−１遺伝子を破壊するために、第６エキソンのＢａｍＨ
Ｉ以降１．５ｋｂｐを欠損させ、そこににネオマイシン
耐性遺伝子を、さらに第８エキソンの下流にジフテリア
トキシンＡフラグメント遺伝子を挿入した。ゲノムＤＮ
Ａとの相同部分は、ネオマイシン耐性遺伝子の上流が
２．５ｋｂ、ネオマイシン耐性遺伝子とジフテリアトキ
シンＡフラグメント遺伝子との間が５ｋｂとなるように
構築した。得られた構築体を、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ
ＳＫに挿入し、ＥＳ細胞への導入の際に制限酵素Ｎｏｔ
Ｉで切断して線状化することによりターゲティングベク
ター２（相同組換え用ＤＮＡ：ｐＧｌｕＴ１ＮｅｏＤ
Ｔ）を得た（図１）。
【００１６】２）相同組換え用ＤＮＡの導入によるＥＳ
細胞のＧｌｕＴ−１遺伝子の欠損 相同組換え用ＤＮＡ７５μｇをマウスＥＳ細胞（Ｅ１４
株）３ｘ１０7 個を含むエレクトロポレーション用緩衝
液(137mM NaCl, 2.7mM KCl, 10mM Na2HPO4, 1.8mM KH2P
O4) に懸濁させ、Field Strength 210V/cm, Capacitanc
e 500 μＦの条件で、遺伝子導入を行った。導入後２４
時間から２５０μｇ／ｍｌのＧ４１８（Ｇｅｎｅｔｉｓ
ｉｎ， ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ）濃度で選択培養を行っ
た。
細胞のＧｌｕＴ−１遺伝子の欠損 相同組換え用ＤＮＡ７５μｇをマウスＥＳ細胞（Ｅ１４
株）３ｘ１０7 個を含むエレクトロポレーション用緩衝
液(137mM NaCl, 2.7mM KCl, 10mM Na2HPO4, 1.8mM KH2P
O4) に懸濁させ、Field Strength 210V/cm, Capacitanc
e 500 μＦの条件で、遺伝子導入を行った。導入後２４
時間から２５０μｇ／ｍｌのＧ４１８（Ｇｅｎｅｔｉｓ
ｉｎ， ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ）濃度で選択培養を行っ
た。
【００１７】Ｇ４１８耐性コロニーを、遺伝子導入後１
９２時間後から、マイクロピペットを用いて６０μｌの
Ｔｒｉｓ−ＥＤＴＡ溶液（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ
ｐＨ８．０と１ｍＭ ＥＤＴＡ ｐＨ８．０とからな
る溶液）を含む９６穴のマイクロプレート（ＦＡＬＣＯ
Ｎ ３０７７）に移し換え、数分間処理した後、ピペッ
ティングすることによって単一細胞にし、これらを２４
穴のマイクロプレート（ＦＡＬＣＯＮ ３０４７）に移
し換え、培養を継続した。採取したコロニーは、その長
径がマイクロチップの内径の１／２以上に達したもの
で、この時の細胞数は、１ｘ１０4 〜１０5 個であっ
た。エレクトロポレーション後の生存細胞数は、６．０
ｘ１０7 個であった。Ｇ４１８耐性コロニー数は、２．
４ｘ１０2 個で、生存細胞数の１／２．５ｘ１０5 であ
った。
９２時間後から、マイクロピペットを用いて６０μｌの
Ｔｒｉｓ−ＥＤＴＡ溶液（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ
ｐＨ８．０と１ｍＭ ＥＤＴＡ ｐＨ８．０とからな
る溶液）を含む９６穴のマイクロプレート（ＦＡＬＣＯ
Ｎ ３０７７）に移し換え、数分間処理した後、ピペッ
ティングすることによって単一細胞にし、これらを２４
穴のマイクロプレート（ＦＡＬＣＯＮ ３０４７）に移
し換え、培養を継続した。採取したコロニーは、その長
径がマイクロチップの内径の１／２以上に達したもの
で、この時の細胞数は、１ｘ１０4 〜１０5 個であっ
た。エレクトロポレーション後の生存細胞数は、６．０
ｘ１０7 個であった。Ｇ４１８耐性コロニー数は、２．
４ｘ１０2 個で、生存細胞数の１／２．５ｘ１０5 であ
った。
【００１８】２４穴のマイクロプレート上の細胞が３〜
４日の培養でコンフルエントに達した段階で、細胞を
０．２５％トリプシンで、３７℃で５分間処理後、順
次、３５ｍｍ（ＦＡＬＣＯＮ ３００１）又は６０ｍｍ
（ＦＡＬＣＯＮ ３００２）の組織培養用シャーレ内で
培養し、細胞の増殖を図った。なお、ＥＳ細胞の培養
は、すべてフィーダー細胞上で行った。相同組換え体の
確認をサザンブロットによって以下の通りに行った。
４日の培養でコンフルエントに達した段階で、細胞を
０．２５％トリプシンで、３７℃で５分間処理後、順
次、３５ｍｍ（ＦＡＬＣＯＮ ３００１）又は６０ｍｍ
（ＦＡＬＣＯＮ ３００２）の組織培養用シャーレ内で
培養し、細胞の増殖を図った。なお、ＥＳ細胞の培養
は、すべてフィーダー細胞上で行った。相同組換え体の
確認をサザンブロットによって以下の通りに行った。
【００１９】サザンブロット解析については、Ｇ４１８
耐性細胞からゲノムＤＮＡを抽出し、制限酵素ＰｖｕＩ
Ｉで消化後、第５イントロンのＡｐａＩ−ＥｃｏＲＶ断
片、０．５ｋｂをプローブとして用いて行った。破壊さ
れた対立遺伝子を含む相同組換え体３（図１）及び非相
同組換え体の確認は、それぞれ、４．２ｋｂ及び７ｋｂ
のバンドの検出によって行った。相同組換え体コロニー
数は、Ｇ４１８耐性コロニー２４２個中１個（２Ｂ７）
であった。
耐性細胞からゲノムＤＮＡを抽出し、制限酵素ＰｖｕＩ
Ｉで消化後、第５イントロンのＡｐａＩ−ＥｃｏＲＶ断
片、０．５ｋｂをプローブとして用いて行った。破壊さ
れた対立遺伝子を含む相同組換え体３（図１）及び非相
同組換え体の確認は、それぞれ、４．２ｋｂ及び７ｋｂ
のバンドの検出によって行った。相同組換え体コロニー
数は、Ｇ４１８耐性コロニー２４２個中１個（２Ｂ７）
であった。
【００２０】３）ＥＳ細胞及びその培養方法 ＥＳ細胞として、１２９／ＳｖＪ系マウス胚盤胞由来の
Ｅ１４株を用いた。ＥＳ細胞の培養には、ダルベッコウ
修正イーグル培養液（ＤＭＥＭ，１１９６０−０１０
ＧＩＢＣＯ）に１５％牛胎児血清（ＦＣＳ）、０．１ｍ
Ｍの２−メルカプトエタノール、核酸混合液、非必須ア
ミノ酸溶液及び１０3 ｕｎｉｔ／ｍｌのＬＩＦ（ＡＭＲ
ＡＤ）を添加したＳＣＭ培養液（Roberson, Teratocarc
inomas and embryonicstem cells a practical approac
h 1987) を用いた。
Ｅ１４株を用いた。ＥＳ細胞の培養には、ダルベッコウ
修正イーグル培養液（ＤＭＥＭ，１１９６０−０１０
ＧＩＢＣＯ）に１５％牛胎児血清（ＦＣＳ）、０．１ｍ
Ｍの２−メルカプトエタノール、核酸混合液、非必須ア
ミノ酸溶液及び１０3 ｕｎｉｔ／ｍｌのＬＩＦ（ＡＭＲ
ＡＤ）を添加したＳＣＭ培養液（Roberson, Teratocarc
inomas and embryonicstem cells a practical approac
h 1987) を用いた。
【００２１】また、ＥＳ細胞のフィーダー細胞として用
いるマウス胎児繊維芽細胞の培養には、ＤＭＥＭに１０
％ＦＳＣを添加したものを用いた。マウス胎児繊維芽細
胞の調製及び培養は、以下の通りに行った。胎齢１３〜
１４日のＩＣＲ系マウスの胎児を無菌的に採取し、カル
シウム及びマグネシウムを含まないリン酸緩衝生理食塩
水（ＰＢＳ- ）で洗浄後、ピンセットを用いて心臓、肝
臓及び腸管を除き、眼科用のハサミを用いて細切した。
次いで、得られた細切片を０．２５％トリプシン及び
０．０４％ＥＤＴＡを含むＰＢＳ- （以下ＴＥ溶液とい
う）で、室温で２０分間処理して細胞浮遊液を得た。
いるマウス胎児繊維芽細胞の培養には、ＤＭＥＭに１０
％ＦＳＣを添加したものを用いた。マウス胎児繊維芽細
胞の調製及び培養は、以下の通りに行った。胎齢１３〜
１４日のＩＣＲ系マウスの胎児を無菌的に採取し、カル
シウム及びマグネシウムを含まないリン酸緩衝生理食塩
水（ＰＢＳ- ）で洗浄後、ピンセットを用いて心臓、肝
臓及び腸管を除き、眼科用のハサミを用いて細切した。
次いで、得られた細切片を０．２５％トリプシン及び
０．０４％ＥＤＴＡを含むＰＢＳ- （以下ＴＥ溶液とい
う）で、室温で２０分間処理して細胞浮遊液を得た。
【００２２】細胞浮遊液を１５００ｒｐｍ、５分間の遠
心後、上清を除去し、１０％ＦＣＳ加ＤＭＥＭに懸濁さ
せて２分間静置した。そして、下部に沈んだ組織片を除
いた細胞浮遊液を１００ｘ２０ｍｍの組織培養用シャー
レ（ＦＡＬＣＯＮ ３００３）に移し、３７℃，５％Ｃ
Ｏ2 ，９５％空気の条件で培養に供した。翌日、細胞浮
遊液をＰＢＳ- で１回洗浄し、培養を継続した。継代
は、３〜４日間隔で行い、継代が三代目までの細胞をフ
ィーダーとして使用するためにマイトマイシン処理を施
した。
心後、上清を除去し、１０％ＦＣＳ加ＤＭＥＭに懸濁さ
せて２分間静置した。そして、下部に沈んだ組織片を除
いた細胞浮遊液を１００ｘ２０ｍｍの組織培養用シャー
レ（ＦＡＬＣＯＮ ３００３）に移し、３７℃，５％Ｃ
Ｏ2 ，９５％空気の条件で培養に供した。翌日、細胞浮
遊液をＰＢＳ- で１回洗浄し、培養を継続した。継代
は、３〜４日間隔で行い、継代が三代目までの細胞をフ
ィーダーとして使用するためにマイトマイシン処理を施
した。
【００２３】コンフルエント状態にまで増殖したマウス
胎児繊維芽細胞を２ｍｇ／ｍｌのマイトマイシンＣ７５
μｌで３〜４時間処理し、ＰＢＳ- で３回洗浄後、ＴＥ
溶液で室温で３分間処理して細胞を剥離した。次いで、
遠心後、細胞数を５ｘ１０5／ｍｌに調整し、６０ｘ１
０ｍｍのゼラチンコートディッシュ（ＦＡＬＣＯＮ３０
０２）に３ｍｌずつ分注した。以上のように作成したフ
ィーダー細胞は、１週間以内に使用した。ＥＳ細胞の継
代は、室温で５分間ＴＥ溶液で処理後、ピペッティング
によってＥＳ細胞を単一細胞に分散させ、４ｘ１０5 個
の細胞をフィーダー細胞層上に播種することによって行
った。
胎児繊維芽細胞を２ｍｇ／ｍｌのマイトマイシンＣ７５
μｌで３〜４時間処理し、ＰＢＳ- で３回洗浄後、ＴＥ
溶液で室温で３分間処理して細胞を剥離した。次いで、
遠心後、細胞数を５ｘ１０5／ｍｌに調整し、６０ｘ１
０ｍｍのゼラチンコートディッシュ（ＦＡＬＣＯＮ３０
０２）に３ｍｌずつ分注した。以上のように作成したフ
ィーダー細胞は、１週間以内に使用した。ＥＳ細胞の継
代は、室温で５分間ＴＥ溶液で処理後、ピペッティング
によってＥＳ細胞を単一細胞に分散させ、４ｘ１０5 個
の細胞をフィーダー細胞層上に播種することによって行
った。
【００２４】培養液は、２４時間間隔で交換し、継代間
隔は、５６〜６４時間とした。また、凍結保存する際に
は、１ｘ１０6 個の細胞をＳＣＭに懸濁して凍結用チュ
ーブ（２ｍｌ，ＦＡＬＣＯＮ ４８１８）に移し、０．
５ｍｌの凍結用培地（２０％ＤＭＳＯ加ＤＭＥＭ）を滴
下した後、−８０℃で一晩放置し、液体窒素中で保存し
た。
隔は、５６〜６４時間とした。また、凍結保存する際に
は、１ｘ１０6 個の細胞をＳＣＭに懸濁して凍結用チュ
ーブ（２ｍｌ，ＦＡＬＣＯＮ ４８１８）に移し、０．
５ｍｌの凍結用培地（２０％ＤＭＳＯ加ＤＭＥＭ）を滴
下した後、−８０℃で一晩放置し、液体窒素中で保存し
た。
【００２５】４）ＧｌｕＴ−１遺伝子欠損ＥＳ細胞によ
るキメラマウスの作成 ａ）ＧｌｕＴ−１遺伝子欠損ＥＳ細胞の胚盤胞への注入 ＥＳ細胞を、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ系マウスの胚盤胞に注入
した後、得られた宿主胚を偽妊娠マウスの子宮角に移植
して産仔を得た。宿主胚の採取は、自然交配４日目に、
Ｈｅｐｅｓ−ｂｕｆｆｅｒｅｄ−Ｗｈｉｔｔｅｎ’ｓ培
地で、子宮を灌流することによって行った。注入に用い
たＥＳ細胞は、継代２日目又は３日目にＴＥ溶液で処理
を行った後、ゼラチンコートディッシュに３０分間静置
することによって、フィーダー細胞を除去し、顕微操作
に供するまで、氷上に静置した。
るキメラマウスの作成 ａ）ＧｌｕＴ−１遺伝子欠損ＥＳ細胞の胚盤胞への注入 ＥＳ細胞を、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ系マウスの胚盤胞に注入
した後、得られた宿主胚を偽妊娠マウスの子宮角に移植
して産仔を得た。宿主胚の採取は、自然交配４日目に、
Ｈｅｐｅｓ−ｂｕｆｆｅｒｅｄ−Ｗｈｉｔｔｅｎ’ｓ培
地で、子宮を灌流することによって行った。注入に用い
たＥＳ細胞は、継代２日目又は３日目にＴＥ溶液で処理
を行った後、ゼラチンコートディッシュに３０分間静置
することによって、フィーダー細胞を除去し、顕微操作
に供するまで、氷上に静置した。
【００２６】ＥＳ細胞の注入用ピペットは、外径１ｍｍ
の微小ガラス管（ＮＡＲＩＳＨＩＧＥ）を微小電極作製
器（ＮＡＲＩＳＨＩＧＥ，ＰＮ−３）を用いて細かく引
き延ばし、研磨器（ＮＡＲＩＳＨＩＧＥ）で、内径が約
２０μｍとなるように先端を研磨し、さらにマイクロフ
ォージ（Ｄｅ Ｆｏｎｂｕｒｕｎ）で先端を鋭利に加工
した。胚保定用ピペットは、上述の方法で引き延ばした
ガラス管をマイクロフォージを用いて、外径５０〜１０
０μｍの部分で切断した後、さらに口径を１０〜２０μ
ｍに加工して用いた。
の微小ガラス管（ＮＡＲＩＳＨＩＧＥ）を微小電極作製
器（ＮＡＲＩＳＨＩＧＥ，ＰＮ−３）を用いて細かく引
き延ばし、研磨器（ＮＡＲＩＳＨＩＧＥ）で、内径が約
２０μｍとなるように先端を研磨し、さらにマイクロフ
ォージ（Ｄｅ Ｆｏｎｂｕｒｕｎ）で先端を鋭利に加工
した。胚保定用ピペットは、上述の方法で引き延ばした
ガラス管をマイクロフォージを用いて、外径５０〜１０
０μｍの部分で切断した後、さらに口径を１０〜２０μ
ｍに加工して用いた。
【００２７】注入用ピペットと保定用ピペットは、先端
から約５ｍｍの部分を約３０度曲げて、マイクロマニピ
ュレーター（ＬＥＩＴＺ）に接続した。顕微操作に用い
たチャンバーは、穴あきスライドグラスにカバーグラス
を密蝋で接着させたものを用い、その上に約２０μｌの
５％ＦＣＳ加Ｈｅｐｅｓ−ｂｕｆｆｅｒｅｄ−Ｗｈｉｔ
ｔｅｎ’ｓ培地のドロップを２個置き、その上面をミネ
ラルオイル（Ｍ８４１０，Ｓｉｇｍａ）で覆った。一方
のドロップには、約１００個のＥＳ細胞を入れ、他方に
は、拡張胚盤胞を１０〜１５個入れ、胚１個あたり１０
〜１５個のＥＳ細胞を注入した。
から約５ｍｍの部分を約３０度曲げて、マイクロマニピ
ュレーター（ＬＥＩＴＺ）に接続した。顕微操作に用い
たチャンバーは、穴あきスライドグラスにカバーグラス
を密蝋で接着させたものを用い、その上に約２０μｌの
５％ＦＣＳ加Ｈｅｐｅｓ−ｂｕｆｆｅｒｅｄ−Ｗｈｉｔ
ｔｅｎ’ｓ培地のドロップを２個置き、その上面をミネ
ラルオイル（Ｍ８４１０，Ｓｉｇｍａ）で覆った。一方
のドロップには、約１００個のＥＳ細胞を入れ、他方に
は、拡張胚盤胞を１０〜１５個入れ、胚１個あたり１０
〜１５個のＥＳ細胞を注入した。
【００２８】顕微操作はすべて、倒立顕微鏡下で行っ
た。操作胚は、１〜２時間の培養後、偽妊娠２日目のＩ
ＣＲ系受容雌の子宮角に移植した。分娩予定日に至って
も産仔を娩出しなかった受容雌については、帝王切開を
施し、里親に哺育させた。自然交配４日目に、子宮を灌
流することによって採取したＣ５７ＢＬ／６Ｊ系マウス
の胚盤胞１６０個にＥＳ細胞２Ｂ７を注入した結果、１
２３個が生存し、成功率は７７％であった。１２３個を
偽妊娠２日目のＩＣＲ系受容雌の子宮角に移植した結
果、１０３個に着床が認められ、９５匹の産仔が得られ
た。離乳に至った８３匹の産仔のうち、毛色でキメラマ
ウスと判定できたのは３０匹で、このうち２６匹が、形
態的に雄を示していた。これらのキメラマウスにおける
ＥＳ細胞の寄与率は、１０〜９５％の幅であり、寄与率
が６０％未満が１０例、６０％以上９０％未満が１４
例、９０％以上が２例であった。
た。操作胚は、１〜２時間の培養後、偽妊娠２日目のＩ
ＣＲ系受容雌の子宮角に移植した。分娩予定日に至って
も産仔を娩出しなかった受容雌については、帝王切開を
施し、里親に哺育させた。自然交配４日目に、子宮を灌
流することによって採取したＣ５７ＢＬ／６Ｊ系マウス
の胚盤胞１６０個にＥＳ細胞２Ｂ７を注入した結果、１
２３個が生存し、成功率は７７％であった。１２３個を
偽妊娠２日目のＩＣＲ系受容雌の子宮角に移植した結
果、１０３個に着床が認められ、９５匹の産仔が得られ
た。離乳に至った８３匹の産仔のうち、毛色でキメラマ
ウスと判定できたのは３０匹で、このうち２６匹が、形
態的に雄を示していた。これらのキメラマウスにおける
ＥＳ細胞の寄与率は、１０〜９５％の幅であり、寄与率
が６０％未満が１０例、６０％以上９０％未満が１４
例、９０％以上が２例であった。
【００２９】ｂ）キメラマウスの交配 移植によって得られたキメラマウスを、Ｃ５７ＢＬ／６
Ｊ系マウスと交配し、娩出される産仔（Ｆ１ヘテロ型マ
ウス）がＧｌｕＴ−１遺伝子欠損ＥＳ細胞由来であるか
否かを検定した。キメラマウスの生殖細胞がＥＳ細胞に
由来していれば、娩出される産仔の毛色は野生色を呈
し、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ系マウスの胚盤胞に由来していれ
ば黒色を呈する。ＥＳ細胞の寄与率の高い（７０％以
上）９例（Ｎｏ．１，５，１３，２０，３３，４１，５
４，６２，８１）のキメラマウスのうち、現在までに８
例（Ｎｏ．１，５，２０，３３，４１，５４，６２，８
１）について、ＥＳ細胞の生殖系列への伝達が確認され
た。
Ｊ系マウスと交配し、娩出される産仔（Ｆ１ヘテロ型マ
ウス）がＧｌｕＴ−１遺伝子欠損ＥＳ細胞由来であるか
否かを検定した。キメラマウスの生殖細胞がＥＳ細胞に
由来していれば、娩出される産仔の毛色は野生色を呈
し、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ系マウスの胚盤胞に由来していれ
ば黒色を呈する。ＥＳ細胞の寄与率の高い（７０％以
上）９例（Ｎｏ．１，５，１３，２０，３３，４１，５
４，６２，８１）のキメラマウスのうち、現在までに８
例（Ｎｏ．１，５，２０，３３，４１，５４，６２，８
１）について、ＥＳ細胞の生殖系列への伝達が確認され
た。
【００３０】Ｎｏ．５とＣ５７ＢＬ／６Ｊ系雌マウスと
の交配では、３回の分娩で合計２３匹の産仔が得られ、
このうち、２３匹が野生色の毛色を示していた。また、
Ｎｏ．３３とＣ５７ＢＬ／６Ｊ系雌マウスとの交配で得
られた１５匹の産仔のうち、１２匹が野生色の毛色を示
した。これらの野生色マウスのうち２３例についてサザ
ンブロットによる解析を行った結果、１１例でＧｌｕＴ
−１遺伝子の欠損を確認した。次に、遺伝子の欠損が確
認されたＦ１ヘテロ型マウスどうしを交配し、１０１匹
の産仔が得られた。これらマウス全例をサザンブロット
による解析を行った結果、２８例でＧｌｕＴ−１遺伝子
欠損についてＦ２ホモ型のマウスを得た。
の交配では、３回の分娩で合計２３匹の産仔が得られ、
このうち、２３匹が野生色の毛色を示していた。また、
Ｎｏ．３３とＣ５７ＢＬ／６Ｊ系雌マウスとの交配で得
られた１５匹の産仔のうち、１２匹が野生色の毛色を示
した。これらの野生色マウスのうち２３例についてサザ
ンブロットによる解析を行った結果、１１例でＧｌｕＴ
−１遺伝子の欠損を確認した。次に、遺伝子の欠損が確
認されたＦ１ヘテロ型マウスどうしを交配し、１０１匹
の産仔が得られた。これらマウス全例をサザンブロット
による解析を行った結果、２８例でＧｌｕＴ−１遺伝子
欠損についてＦ２ホモ型のマウスを得た。
【００３１】例２ ＧＬＴ１遺伝子機能欠損マウスの作
成 １）マウスＧＬＴ１遺伝子ＤＮＡの相同組換え用ＤＮＡ
の作成 １２９ＳＶマウスの肝から抽出したゲノムＤＮＡ（野生
型マウスＧＬＴ１遺伝子）を、制限酵素Ｓａｕ３ＡＩで
部分消化して得たゲノムライブラリーラムダＦＩＸＩＩ
に、マウスＧＬＴ１遺伝子ｃＤＮＡの部分配列をプロー
ブとして用いてハイブリダイゼーションを行い、１ｘ１
０6 個のコロニーについて検索した結果、３３個の陽性
クローンを得た。これを制限酵素ＡｐａＩ及びＮｏｔＩ
で不完全消化させて、第２エキソンから第４エキソンを
含む、全長１１．２ｋｂのゲノムＤＮＡ４をサブクロー
ニングした（図３）。次いで、ＧＬＴ１遺伝子を破壊す
るために、第４エキソンのＮｏｔＩ以降０．９ｋｂｐを
欠失させ、そこにネオマイシン耐性遺伝子を挿入し、さ
らに第２エキソンの上流にチミジンキナーゼ遺伝子を挿
入した。ゲノムＤＮＡとの相同部分は、ネオマイシン耐
性遺伝子の下流が４．２ｋｂ、ネオマイシン耐性遺伝子
とチミジンキナーゼ遺伝子との間が６．１ｋｂとなるよ
うに構築した。得られた構築体を、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉ
ｐｔＳＫに挿入し、ＥＳ細胞への導入の際に制限酵素Ｋ
ｐｎＩで切断して線状化することによりターゲッティン
グベクター５（相同組換え用ＤＮＡ：ｐＧＬＴ１Ｎｅｏ
ＴＫ）を得た（図３）。
成 １）マウスＧＬＴ１遺伝子ＤＮＡの相同組換え用ＤＮＡ
の作成 １２９ＳＶマウスの肝から抽出したゲノムＤＮＡ（野生
型マウスＧＬＴ１遺伝子）を、制限酵素Ｓａｕ３ＡＩで
部分消化して得たゲノムライブラリーラムダＦＩＸＩＩ
に、マウスＧＬＴ１遺伝子ｃＤＮＡの部分配列をプロー
ブとして用いてハイブリダイゼーションを行い、１ｘ１
０6 個のコロニーについて検索した結果、３３個の陽性
クローンを得た。これを制限酵素ＡｐａＩ及びＮｏｔＩ
で不完全消化させて、第２エキソンから第４エキソンを
含む、全長１１．２ｋｂのゲノムＤＮＡ４をサブクロー
ニングした（図３）。次いで、ＧＬＴ１遺伝子を破壊す
るために、第４エキソンのＮｏｔＩ以降０．９ｋｂｐを
欠失させ、そこにネオマイシン耐性遺伝子を挿入し、さ
らに第２エキソンの上流にチミジンキナーゼ遺伝子を挿
入した。ゲノムＤＮＡとの相同部分は、ネオマイシン耐
性遺伝子の下流が４．２ｋｂ、ネオマイシン耐性遺伝子
とチミジンキナーゼ遺伝子との間が６．１ｋｂとなるよ
うに構築した。得られた構築体を、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉ
ｐｔＳＫに挿入し、ＥＳ細胞への導入の際に制限酵素Ｋ
ｐｎＩで切断して線状化することによりターゲッティン
グベクター５（相同組換え用ＤＮＡ：ｐＧＬＴ１Ｎｅｏ
ＴＫ）を得た（図３）。
【００３２】２）相同組換え用ＤＮＡの導入によるＥＳ
細胞のＧＬＴ１遺伝子欠損 相同組換え用ＤＮＡ７５μｇをマウスＥＳ細胞（Ｅ１４
株）３ｘ１０7 個を含むエレクトロポレーション用緩衝
液（137mM NaCl, 27mM KCl, 10mM Na2HPO4, 1.8mM KH2P
O4) に懸濁させ、Field Strength 210V/cm, Capacitanc
e 500 μＦの条件で、遺伝子導入を行った。導入後２４
時間から２５０μｇ／ｍｌのＧ４１８（Ｇｅｎｅｔｉｓ
ｉｎ， ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ）で選択培養を行ない、そ
の４８時間後からは、０．５μｇ／ｍｌガンシクロビル
も添加して、選択培養を継続した。
細胞のＧＬＴ１遺伝子欠損 相同組換え用ＤＮＡ７５μｇをマウスＥＳ細胞（Ｅ１４
株）３ｘ１０7 個を含むエレクトロポレーション用緩衝
液（137mM NaCl, 27mM KCl, 10mM Na2HPO4, 1.8mM KH2P
O4) に懸濁させ、Field Strength 210V/cm, Capacitanc
e 500 μＦの条件で、遺伝子導入を行った。導入後２４
時間から２５０μｇ／ｍｌのＧ４１８（Ｇｅｎｅｔｉｓ
ｉｎ， ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ）で選択培養を行ない、そ
の４８時間後からは、０．５μｇ／ｍｌガンシクロビル
も添加して、選択培養を継続した。
【００３３】Ｇ４１８及びガンシクロビル耐性コロニー
を、遺伝子導入後１９２時間後から、マイクロピペット
を用いて６０μｌのＴｒｉｓ−ＥＤＴＡ溶液を含む９６
穴のマイクロピペット（ＦＡＬＣＯＮ ３０７７）に移
し換え、数分間処理した後、ピペッティングすることに
よって単一細胞にし、これらを２４穴のマイクロプレー
ト（ＦＡＬＣＯＮ ３０４７）に移し換え、培養を継続
した。採取したコロニーは、その長径がマイクロチップ
の内径の１／２以上に達したもので、この時の細胞数
は、１ｘ１０4 〜１０5 個であった。エレクトロポレー
ション後の生存細胞数は、４ｘ１０7 個であった。Ｇ４
１８及びガンシクロビル耐性コロニー数は、１．４ｘ１
０2 個で、生存細胞数の１／２．９ｘ１０5 であった。
を、遺伝子導入後１９２時間後から、マイクロピペット
を用いて６０μｌのＴｒｉｓ−ＥＤＴＡ溶液を含む９６
穴のマイクロピペット（ＦＡＬＣＯＮ ３０７７）に移
し換え、数分間処理した後、ピペッティングすることに
よって単一細胞にし、これらを２４穴のマイクロプレー
ト（ＦＡＬＣＯＮ ３０４７）に移し換え、培養を継続
した。採取したコロニーは、その長径がマイクロチップ
の内径の１／２以上に達したもので、この時の細胞数
は、１ｘ１０4 〜１０5 個であった。エレクトロポレー
ション後の生存細胞数は、４ｘ１０7 個であった。Ｇ４
１８及びガンシクロビル耐性コロニー数は、１．４ｘ１
０2 個で、生存細胞数の１／２．９ｘ１０5 であった。
【００３４】２４穴のマイクロプレート上の細胞が３〜
４日の培養でコンフルエントに達した段階で、細胞を
０．２５％トリプシンで、３７℃で５分間で処理後、順
次、３５ｍｍ（ＦＡＬＣＯＮ ３００１）又は６０ｍｍ
（ＦＡＬＣＯＮ ３００２）の組織培養用シャーレ内で
培養し、細胞の増殖を図った。なお、ＥＳ細胞の培養
は、すべてフィーダー細胞上で行った。相同組換え体の
確認をサザンブロットによって以下の通りに行った。
４日の培養でコンフルエントに達した段階で、細胞を
０．２５％トリプシンで、３７℃で５分間で処理後、順
次、３５ｍｍ（ＦＡＬＣＯＮ ３００１）又は６０ｍｍ
（ＦＡＬＣＯＮ ３００２）の組織培養用シャーレ内で
培養し、細胞の増殖を図った。なお、ＥＳ細胞の培養
は、すべてフィーダー細胞上で行った。相同組換え体の
確認をサザンブロットによって以下の通りに行った。
【００３５】サザンブロット解析については、Ｇ４１８
及びガンシクロビル耐性細胞からゲノムＤＮＡを抽出
し、制限酵素ＥｃｏＲＶで消化後、第４イントロンのＡ
ｐａＩ−ＥｃｏＲＶ、０．８ｋｂをプローブとして用い
て行った。破壊された対立遺伝子を含む相同組換え体６
（図３）及び非相同組換え体の確認は、それぞれ、９．
５ｋｂ及び５．４ｋｂのバンドの検出によって行った。
相同組換え体コロニー数は、Ｇ４１８及びガンシクロビ
ル耐性コロニー１４４個中４個（１Ｂ９、１Ｃ４、１Ｆ
８、２Ａ５）であった。
及びガンシクロビル耐性細胞からゲノムＤＮＡを抽出
し、制限酵素ＥｃｏＲＶで消化後、第４イントロンのＡ
ｐａＩ−ＥｃｏＲＶ、０．８ｋｂをプローブとして用い
て行った。破壊された対立遺伝子を含む相同組換え体６
（図３）及び非相同組換え体の確認は、それぞれ、９．
５ｋｂ及び５．４ｋｂのバンドの検出によって行った。
相同組換え体コロニー数は、Ｇ４１８及びガンシクロビ
ル耐性コロニー１４４個中４個（１Ｂ９、１Ｃ４、１Ｆ
８、２Ａ５）であった。
【００３６】３）ＥＳ細胞及びその培養方法 ＥＳ細胞として、１２９／ＳｖＪ系マウス胚盤胞由来の
Ｅ１４株を用いた。ＥＳ細胞の培養には、ダルベッコウ
修正イーグル培養液（ＤＭＥＭ，１１９６０−０１０
ＧＩＢＣＯ）に１５％牛胎児血清（ＦＣＳ）、０．１ｍ
Ｍの２−メルカプトエタノール、核酸混合液、非必須ア
ミノ酸溶液及び１０3 ｕｎｉｔ／ｍｌのＬＩＦ（ＡＭＲ
ＡＤ）を添加したＳＣＭ培養液（Roberson, Teratocarc
inomas and embryonicstem cells a practical approac
h 1987) を用いた。
Ｅ１４株を用いた。ＥＳ細胞の培養には、ダルベッコウ
修正イーグル培養液（ＤＭＥＭ，１１９６０−０１０
ＧＩＢＣＯ）に１５％牛胎児血清（ＦＣＳ）、０．１ｍ
Ｍの２−メルカプトエタノール、核酸混合液、非必須ア
ミノ酸溶液及び１０3 ｕｎｉｔ／ｍｌのＬＩＦ（ＡＭＲ
ＡＤ）を添加したＳＣＭ培養液（Roberson, Teratocarc
inomas and embryonicstem cells a practical approac
h 1987) を用いた。
【００３７】また、ＥＳ細胞のフィーダー細胞として用
いるマウス胎児繊維芽細胞の培養には、ＤＭＥＭに１０
％ＦＳＣを添加したものを用いた。マウス胎児繊維芽細
胞の調製及び培養は、以下の通りに行った。胎齢１３〜
１４日のＩＣＲ系マウスの胎児を無菌的に採取し、カル
シウム及びマグネシウムを含まないリン酸緩衝生理食塩
水（ＰＢＳ- ）で洗浄後、ピンセットを用いて心臓、肝
臓及び腸管を除き、眼科用のハサミを用いて細切した。
次いで、得られた細切片をＴＥ溶液で室温下２０分間処
理して細胞浮遊液を得た。
いるマウス胎児繊維芽細胞の培養には、ＤＭＥＭに１０
％ＦＳＣを添加したものを用いた。マウス胎児繊維芽細
胞の調製及び培養は、以下の通りに行った。胎齢１３〜
１４日のＩＣＲ系マウスの胎児を無菌的に採取し、カル
シウム及びマグネシウムを含まないリン酸緩衝生理食塩
水（ＰＢＳ- ）で洗浄後、ピンセットを用いて心臓、肝
臓及び腸管を除き、眼科用のハサミを用いて細切した。
次いで、得られた細切片をＴＥ溶液で室温下２０分間処
理して細胞浮遊液を得た。
【００３８】細胞浮遊液を１５００ｒｐｍ、５分間の遠
心後、上清を除去し、１０％ＦＣＳ加ＤＭＥＭに懸濁さ
せて２分間静置した。そして、下部に沈んだ組織片を除
いた細胞浮遊液を１００ｘ２０ｍｍの組織培養用シャー
レ（Ｃｏｒｎｉｎｇ，２５０２０）に移し、３７℃，５
％，ＣＯ2 ９５％空気の条件で培養に供した。翌日、細
胞浮遊液をＰＢＳ- で１回洗浄し、培養を継続した。継
代は、３〜４日間隔で行い、継代が三代目までの細胞を
フィーダーとして使用するためにマイトマイシン処理を
施した。
心後、上清を除去し、１０％ＦＣＳ加ＤＭＥＭに懸濁さ
せて２分間静置した。そして、下部に沈んだ組織片を除
いた細胞浮遊液を１００ｘ２０ｍｍの組織培養用シャー
レ（Ｃｏｒｎｉｎｇ，２５０２０）に移し、３７℃，５
％，ＣＯ2 ９５％空気の条件で培養に供した。翌日、細
胞浮遊液をＰＢＳ- で１回洗浄し、培養を継続した。継
代は、３〜４日間隔で行い、継代が三代目までの細胞を
フィーダーとして使用するためにマイトマイシン処理を
施した。
【００３９】コンフルエント状態にまで増殖したマウス
胎児繊維芽細胞を２ｍｇ／ｍｌのマイトマイシンＣ７５
μｌで３〜４時間処理し、ＰＢＳ- で３回洗浄後、ＴＥ
溶液で室温で３分間処理して細胞を剥離した。次いで、
遠心後、細胞数を５ｘ１０5／ｍｌに調整し、６０ｘ１
０ｍｍのゼラチンコートディッシュ（ＦＡＬＣＯＮ３０
０２）に３ｍｌずつ分注した。以上のように作成したフ
ィーダー細胞は、１週間以内に使用した。ＥＳ細胞の継
代は、室温で５分間ＴＥ溶液で処理後、ピペッティング
によってＥＳ細胞を単一細胞に分散させ、４ｘ１０5 個
の細胞をフィーダー細胞層上に播種することによって行
った。
胎児繊維芽細胞を２ｍｇ／ｍｌのマイトマイシンＣ７５
μｌで３〜４時間処理し、ＰＢＳ- で３回洗浄後、ＴＥ
溶液で室温で３分間処理して細胞を剥離した。次いで、
遠心後、細胞数を５ｘ１０5／ｍｌに調整し、６０ｘ１
０ｍｍのゼラチンコートディッシュ（ＦＡＬＣＯＮ３０
０２）に３ｍｌずつ分注した。以上のように作成したフ
ィーダー細胞は、１週間以内に使用した。ＥＳ細胞の継
代は、室温で５分間ＴＥ溶液で処理後、ピペッティング
によってＥＳ細胞を単一細胞に分散させ、４ｘ１０5 個
の細胞をフィーダー細胞層上に播種することによって行
った。
【００４０】培養液は、２４時間間隔で交換し、継代間
隔は、５６〜６４時間とした。また、凍結保存する際に
は、１ｘ１０6 個の細胞をＳＣＭに懸濁して凍結用チュ
ーブ（２ｍｌ，ＦＡＬＣＯＮ ４８１８）に移し、０．
５ｍｌの凍結用培地（２０％ＤＭＳＯ加ＤＭＥＭ）を滴
下した後、−８０℃で一晩放置し、液体窒素中で保存し
た。
隔は、５６〜６４時間とした。また、凍結保存する際に
は、１ｘ１０6 個の細胞をＳＣＭに懸濁して凍結用チュ
ーブ（２ｍｌ，ＦＡＬＣＯＮ ４８１８）に移し、０．
５ｍｌの凍結用培地（２０％ＤＭＳＯ加ＤＭＥＭ）を滴
下した後、−８０℃で一晩放置し、液体窒素中で保存し
た。
【００４１】４）ＧＬＴ１遺伝子欠損ＥＳ細胞によるキ
メラマウスの作成 ａ）ＧＬＴ１遺伝子欠損ＥＳ細胞の胚盤胞への注入 ＥＳ細胞をＣ５７ＢＬ／６Ｊ系マウスの胚盤胞に注入し
た後、得られた宿主胚を偽妊娠マウスの子宮角に移植し
て産仔を得た。宿主胚の採取は、自然交配４日目に、Ｈ
ｅｐｅｓ−ｂｕｆｆｅｒｅｄ−Ｗｈｉｔｔｅｎ’ｓ培地
で、子宮を灌流することによって行った。注入に用いた
ＥＳ細胞は、継代２日目又は３日目にＴＥ溶液で処理を
行った後、上述の方法でフィーダー細胞を除去し、顕微
操作に供するまで、氷上に静置した。ピペットの作成及
び顕微操作は、例１と同様に行った。操作胚は、１〜２
時間の培養後、偽妊娠２日目のＩＣＲ系受容雌の子宮角
に移植した。分娩予定日に至っても産仔を娩出しなかっ
た受容雌については、帝王切開を施し、里親に哺育させ
た。自然交配４日目に、子宮を灌流することによって採
取したＣ５７ＢＬ／６Ｊ系マウスの胚盤胞１４５個にＥ
Ｓ細胞１Ｆ８を注入した結果、１０７個が生存し、成功
率は７４％であった。１０７個を偽妊娠２日目のＩＣＲ
系受容雌の子宮角に移植した結果、８８個に着床が認め
られ、７８匹の産仔が得られた。離乳に至った６５匹の
産仔のうち、毛色でキメラマウスと判定できたのは３２
匹で、このうち２８匹が、形態的に雄を示していた。こ
れらのキメラマウスにおけるＥＳ細胞の寄与率は、１０
〜９５％の幅であり、寄与率が６０％未満が１０例、６
０％以上９０％未満が１５例、９０％以上が３例であっ
た。
メラマウスの作成 ａ）ＧＬＴ１遺伝子欠損ＥＳ細胞の胚盤胞への注入 ＥＳ細胞をＣ５７ＢＬ／６Ｊ系マウスの胚盤胞に注入し
た後、得られた宿主胚を偽妊娠マウスの子宮角に移植し
て産仔を得た。宿主胚の採取は、自然交配４日目に、Ｈ
ｅｐｅｓ−ｂｕｆｆｅｒｅｄ−Ｗｈｉｔｔｅｎ’ｓ培地
で、子宮を灌流することによって行った。注入に用いた
ＥＳ細胞は、継代２日目又は３日目にＴＥ溶液で処理を
行った後、上述の方法でフィーダー細胞を除去し、顕微
操作に供するまで、氷上に静置した。ピペットの作成及
び顕微操作は、例１と同様に行った。操作胚は、１〜２
時間の培養後、偽妊娠２日目のＩＣＲ系受容雌の子宮角
に移植した。分娩予定日に至っても産仔を娩出しなかっ
た受容雌については、帝王切開を施し、里親に哺育させ
た。自然交配４日目に、子宮を灌流することによって採
取したＣ５７ＢＬ／６Ｊ系マウスの胚盤胞１４５個にＥ
Ｓ細胞１Ｆ８を注入した結果、１０７個が生存し、成功
率は７４％であった。１０７個を偽妊娠２日目のＩＣＲ
系受容雌の子宮角に移植した結果、８８個に着床が認め
られ、７８匹の産仔が得られた。離乳に至った６５匹の
産仔のうち、毛色でキメラマウスと判定できたのは３２
匹で、このうち２８匹が、形態的に雄を示していた。こ
れらのキメラマウスにおけるＥＳ細胞の寄与率は、１０
〜９５％の幅であり、寄与率が６０％未満が１０例、６
０％以上９０％未満が１５例、９０％以上が３例であっ
た。
【００４２】ｂ）キメラマウスの交配 移植によって得られたキメラマウスを、Ｃ５７ＢＬ／６
Ｊ系マウスと交配し、娩出される産仔（Ｆ１ヘテロ型マ
ウス）がＧＬＴ１遺伝子欠損ＥＳ細胞由来であるか否か
を検定した。キメラマウスの生殖細胞がＥＳ細胞に由来
していれば、娩出される産仔の毛色は野生色を呈し、Ｃ
５７ＢＬ／６Ｊ系マウスの胚盤胞に由来していれば黒色
を呈する。ＥＳ細胞の寄与率の高い（７０％以上）１０
例（Ｎｏ．２，５，１２，２１，３５，４０，５５，６
３，７０，７５）のキメラマウスのうち、現在までに９
例（Ｎｏ．２，５，１２，３５，４０，５５，６３，７
０，７５）について、ＥＳ細胞の生殖系列への伝達が確
認された。
Ｊ系マウスと交配し、娩出される産仔（Ｆ１ヘテロ型マ
ウス）がＧＬＴ１遺伝子欠損ＥＳ細胞由来であるか否か
を検定した。キメラマウスの生殖細胞がＥＳ細胞に由来
していれば、娩出される産仔の毛色は野生色を呈し、Ｃ
５７ＢＬ／６Ｊ系マウスの胚盤胞に由来していれば黒色
を呈する。ＥＳ細胞の寄与率の高い（７０％以上）１０
例（Ｎｏ．２，５，１２，２１，３５，４０，５５，６
３，７０，７５）のキメラマウスのうち、現在までに９
例（Ｎｏ．２，５，１２，３５，４０，５５，６３，７
０，７５）について、ＥＳ細胞の生殖系列への伝達が確
認された。
【００４３】Ｎｏ．１２とＣ５７ＢＬ／６Ｊ系雌マウス
との交配では、３回の分娩で合計２１匹の産仔が得ら
れ、このうち、２１匹が野生色の毛色を示していた。ま
た、Ｎｏ．６３とＣ５７ＢＬ／６Ｊ系雌マウスとの交配
で得られた１８匹の産仔のうち、１６匹が野生色の毛色
を示した。これらの野生色マウスのうち２１例について
サザンブロットによる解析を行った結果、９例でＧＬＴ
１遺伝子の欠損を確認した。次に、遺伝子の欠損が確認
されたＦ１ヘテロ型マウスどうしを交配し、９８匹の産
仔が得られた。これらマウス全例をサザンブロットによ
る解析を行った結果、２０例でＧＬＴ１遺伝子欠損につ
いてＦ２ホモ型のマウスを得た。
との交配では、３回の分娩で合計２１匹の産仔が得ら
れ、このうち、２１匹が野生色の毛色を示していた。ま
た、Ｎｏ．６３とＣ５７ＢＬ／６Ｊ系雌マウスとの交配
で得られた１８匹の産仔のうち、１６匹が野生色の毛色
を示した。これらの野生色マウスのうち２１例について
サザンブロットによる解析を行った結果、９例でＧＬＴ
１遺伝子の欠損を確認した。次に、遺伝子の欠損が確認
されたＦ１ヘテロ型マウスどうしを交配し、９８匹の産
仔が得られた。これらマウス全例をサザンブロットによ
る解析を行った結果、２０例でＧＬＴ１遺伝子欠損につ
いてＦ２ホモ型のマウスを得た。
【００４４】
【発明の効果】以上の通り、本発明は、遺伝子工学的方
法でグルタミン酸トランスポーター遺伝子の機能を欠損
させた動物を提供する。この動物は、神経変性疾患や神
経細胞死などの病態生理、原因の解明及び治療方法の開
発等の研究のための実験用動物として極めて有用であ
る。
法でグルタミン酸トランスポーター遺伝子の機能を欠損
させた動物を提供する。この動物は、神経変性疾患や神
経細胞死などの病態生理、原因の解明及び治療方法の開
発等の研究のための実験用動物として極めて有用であ
る。
【図１】マウスＧｌｕＴ−１遺伝子のターゲティング破
壊を示す模式図。各記号が示す制限部位に関与する制限
酵素は以下の通りである。Ｐ：ＰｖｕＩＩ、ＲＶ：Ｅｃ
ｏＲＶ、Ｂ：ＢａｍＨＩ、Ｅ：ＥｃｏＲＩ、Ｘ：Ｘｈｏ
Ｉ。
壊を示す模式図。各記号が示す制限部位に関与する制限
酵素は以下の通りである。Ｐ：ＰｖｕＩＩ、ＲＶ：Ｅｃ
ｏＲＶ、Ｂ：ＢａｍＨＩ、Ｅ：ＥｃｏＲＩ、Ｘ：Ｘｈｏ
Ｉ。
【図２】マウスＧＬＴ１遺伝子のゲノム遺伝子の組織図
（制限地図）。各記号が示す制限部位に関与する制限酵
素は以下の通りである。Ｅ：ＥｃｏＲＩ、Ｂ：ＢａｍＨ
Ｉ、Ｘ：ＸｈｏＩ、Ｎ：ＮｏｔＩ。
（制限地図）。各記号が示す制限部位に関与する制限酵
素は以下の通りである。Ｅ：ＥｃｏＲＩ、Ｂ：ＢａｍＨ
Ｉ、Ｘ：ＸｈｏＩ、Ｎ：ＮｏｔＩ。
【図３】マウスＧＬＴ１遺伝子のターゲティング破壊を
示す模式図。各記号が示す制限部位に関与する制限酵素
は以下の通りである。Ｋ：ＫｐｎＩ、Ａ：ＡｐａＩ、
Ｐ：ＰｖｕＩＩ、ＲＶ：ＥｃｏＲＶ、Ｂ：ＢａｍＨＩ、
Ｅ：ＥｃｏＲＩ、Ｘ：ＸｈｏＩ、Ｎ：ＮｏｔＩ。
示す模式図。各記号が示す制限部位に関与する制限酵素
は以下の通りである。Ｋ：ＫｐｎＩ、Ａ：ＡｐａＩ、
Ｐ：ＰｖｕＩＩ、ＲＶ：ＥｃｏＲＶ、Ｂ：ＢａｍＨＩ、
Ｅ：ＥｃｏＲＩ、Ｘ：ＸｈｏＩ、Ｎ：ＮｏｔＩ。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 和田 圭司 東京都小平市小川東町４−１−１ Ｉ− 301
Claims (9)
- 【請求項１】 グルタミン酸トランスポーター遺伝子の
機能の欠損が体細胞及び生殖細胞の染色体に存在する非
ヒト動物。 - 【請求項２】 前記グルタミン酸トランスポーター遺伝
子がＧｌｕＴ−１遺伝子及びＧＬＴ１遺伝子からなる群
より選ばれる少なくとも一つである請求項１に記載の動
物。 - 【請求項３】 グルタミン酸トランスポーター遺伝子の
いずれかの部位が欠失しているか、又はいずれかの部位
に他の遺伝子が挿入されることによりグルタミン酸トラ
ンスポーター遺伝子の機能が欠損している請求項１また
は２に記載の動物。 - 【請求項４】 前記他の遺伝子がマーカー遺伝子である
請求項３に記載の動物。 - 【請求項５】 前記他の遺伝子がネオマイシン耐性遺伝
子である請求項３または４に記載の動物。 - 【請求項６】 ＧｌｕＴ−１遺伝子の第６エキソンにネ
オマイシン耐性遺伝子が挿入されている請求項１〜５の
いずれか１項に記載の動物。 - 【請求項７】 ＧＬＴ１遺伝子の第４エキソンにネオマ
イシン耐性遺伝子が挿入されている請求項１〜５のいず
れか１項に記載の動物。 - 【請求項８】 前記動物が齧歯動物である、請求項１〜
７のいずれか１項に記載の動物。 - 【請求項９】 前記齧歯動物がマウスである、請求項８
に記載の動物。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP8193655A JPH1033087A (ja) | 1996-07-23 | 1996-07-23 | グルタミン酸トランスポーター遺伝子機能欠損非ヒト動物 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP8193655A JPH1033087A (ja) | 1996-07-23 | 1996-07-23 | グルタミン酸トランスポーター遺伝子機能欠損非ヒト動物 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH1033087A true JPH1033087A (ja) | 1998-02-10 |
Family
ID=16311567
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP8193655A Pending JPH1033087A (ja) | 1996-07-23 | 1996-07-23 | グルタミン酸トランスポーター遺伝子機能欠損非ヒト動物 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH1033087A (ja) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2004092371A1 (ja) * | 2003-04-18 | 2004-10-28 | Japan Science And Technology Agency | グルタミン酸トランスポーターｇｌａｓｔ機能欠損マウス |
| JP2006526634A (ja) * | 2003-06-02 | 2006-11-24 | サマリタン，ファーマスーティカルス，インク． | 神経保護作用を有するベンゾアート化合物およびベンズアミド化合物 |
-
1996
- 1996-07-23 JP JP8193655A patent/JPH1033087A/ja active Pending
Cited By (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2004092371A1 (ja) * | 2003-04-18 | 2004-10-28 | Japan Science And Technology Agency | グルタミン酸トランスポーターｇｌａｓｔ機能欠損マウス |
| JPWO2004092371A1 (ja) * | 2003-04-18 | 2006-07-06 | 独立行政法人科学技術振興機構 | グルタミン酸トランスポーターｇｌａｓｔ機能欠損マウス |
| US7642399B2 (en) | 2003-04-18 | 2010-01-05 | Japan Science And Technology Agency | Mouse with deficiency of glutamate transporter GLAST function |
| JP4494340B2 (ja) * | 2003-04-18 | 2010-06-30 | 独立行政法人科学技術振興機構 | グルタミン酸トランスポーターｇｌａｓｔ機能欠損マウス |
| JP2006526634A (ja) * | 2003-06-02 | 2006-11-24 | サマリタン，ファーマスーティカルス，インク． | 神経保護作用を有するベンゾアート化合物およびベンズアミド化合物 |
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20060317 |
|
| A02 | Decision of refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02 Effective date: 20060707 |