WO2017175745A1 - 生殖細胞欠損動物を用いる遺伝子改変動物の作製方法 - Google Patents

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WO2017175745A1
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genetic modification
animal
cells
cell
gene
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PCT/JP2017/014042
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啓光 中内
山口　智之
英樹 正木
めぐみ 加藤
秀征 佐藤
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国立大学法人 東京大学
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/10—Cells modified by introduction of foreign genetic material
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology

Definitions

  • the present invention relates to a method for producing a genetically modified animal using a germ cell-deficient animal.
  • Genetically modified animals are frequently used to analyze the function of genes in vivo, and transgenic animals that introduce foreign genes and knockout animals that disrupt endogenous genes are known.
  • the production of a genetically modified animal is performed by introducing a pluripotent cell having a desired genetic modification into a wild-type animal embryo, or by directly introducing a desired genetic modification into an animal embryo.
  • an animal embryo into which a pluripotent cell having the desired genetic modification is introduced and transplanted into the uterus of a pseudopregnant foster parent an individual that develops from the animal embryo is partly composed of wild-type cells.
  • the part is in a chimera state consisting of cells with genetic modification. This also applies to germ cells, but when mating sperm and ovum having the target gene modification of an individual contributed by the pluripotent stem cell introduced into the germ cell, the gene having the target gene modification is homozygous Modified animals can be obtained.
  • a genetically modified animal having the desired genetic modification in heterogeneity is obtained.
  • Obtainable by introducing DNA or RNA for gene modification of interest into a pronuclear embryo that has just been fertilized, it is possible to obtain an individual whose whole or part of the cells have the gene modification of interest. it can. If the target genetic modification is reflected in germ cells, a genetically modified animal can be stably obtained. In this way, a genetically modified animal is produced.
  • Patent Document 1 discloses a method for efficiently obtaining a genetically modified animal having a genetic modification that exhibits a lethal phenotype in a developmental stage or an adult.
  • a genetically modified animal since a genetically modified animal has a genetic modification in which all or part of an organ or tissue is deleted and should be lethal due to this, conventionally, a parent having a genetic modification in heterogeneous form is prepared. According to Mendel's law of inheritance, individuals with a homologous genetic modification were obtained with a quarter probability.
  • Patent Document 1 discloses a method for remarkably improving this probability, but Patent Document 1 uses the following principle.
  • genetically modified animals are usually lethal and do not develop, but when normal pluripotent cells are introduced into the developing embryo, this deletion is complemented by pluripotent cells (blastocyst complementation) The animals can survive to adulthood. And since the resulting adult gametes are almost 100% homozygous and have genetic modification, it is possible to obtain a genetically modified animal having genetic modification with homogeneity with high probability when mating the obtained sperm and egg This is a technological technology.
  • Non-Patent Document 1 discloses that a Prdm14 gene knockout mouse lacks germ cells. Prdm14 gene knockout mice cannot be mated because germ cells are deleted.
  • the present invention provides a method for producing a genetically modified animal using a germ cell deficient animal.
  • the present inventors have found that in a gene disrupted animal of the Prdm14 gene, the sperm is completely deleted in the case of a male and the egg is completely deleted in the case of a female.
  • the present inventors have also shown that when pluripotent cells that do not have the abnormality are introduced into animal embryos that lack their germ cells at the developmental stage, sperm or eggs derived only from the introduced cells can be obtained. I found it.
  • the present inventors used a Prdm14 gene-disrupted animal as an example of an animal having a cell-autonomous defect that lacks its own germ cells at the developmental stage, and puts normal pluripotent cells related to Prdm14 in the embryo.
  • sperm or ovum derived only from the introduced cells can be obtained by introduction. Further, when the present inventors use a pluripotent cell having a genetic modification as a cell to be introduced into an embryo in the above, the obtained sperm or egg is substantially genetically modified in the body of the Prdm14 gene disrupted animal. Was found to be only sperm or eggs having According to the present invention, genetically modified animals can be reliably obtained with a probability of almost 100% by mating sperm and eggs having the genetic modification thus obtained. According to the present invention, when an animal having a genetic modification exhibiting a dominant trait is produced, the sperm or egg having the genetic modification obtained as described above is crossed with another egg or sperm. A genetically modified animal can be reliably obtained with a probability of 100%.
  • pluripotent cells for Prdm14 into animal embryos that lack autologous germ cells at the developmental stage (eg, animal embryos with reduced Prdm14 expression or activity), It was found that the introduced pluripotent cells contribute to germ cells at a higher rate than before. Furthermore, the present inventors further use an pluripotent cell having a genetic modification as a cell to be introduced into an embryo in the above case, for example, an animal that lacks its own germ cells at the developmental stage (for example, a Prdm14 gene disrupted animal). It has been found that sperm or ova with genetic modification can be obtained in the body with a higher probability than before. According to the present invention, genetically modified animals can be obtained with improved probability by mating sperm and eggs having genetic modifications obtained in this manner, and the procedure for producing genetically modified animals is greatly simplified. .
  • a method for producing a genetically modified animal having a target genetic modification (A) introducing a pluripotent cell having a genetic modification of interest in both a paternal chromosome and a maternal chromosome into an animal embryo deficient in its germline at a developmental stage.
  • a method for producing a genetically modified animal having a target genetic modification (A) The method according to (1) above, wherein the abnormality in which self germ cells are lost in the developmental stage is a decrease or deletion of the expression or activity of the Prdm14 gene or a protein encoded by the gene.
  • the method according to (3) above, wherein the genetic modification is introduction of a foreign gene.
  • a method for producing a germ cell having a target genetic modification A method comprising introducing a pluripotent cell having a genetic modification of interest in both a paternal chromosome and a maternal chromosome into an animal embryo having an abnormality that lacks its own germ cells at a developmental stage. (12) The method according to (11) above, wherein the abnormality in which self germ cells are lost in the developmental stage is a decrease or deletion in expression or activity of the Prdm14 gene. Method. (13) Use of germ cell-deficient animal embryos in the production of genetically modified animals.
  • genetically modified animals can be obtained with high probability.
  • the present invention is particularly useful in that a genetically modified animal having a genetic modification that is lethal in the developmental stage can be obtained with an improved probability.
  • FIG. 1 shows an example of the first embodiment.
  • FIG. 2A shows an example of the second embodiment.
  • FIG. 2B shows an example of the second embodiment.
  • FIG. 3 shows an example of the third embodiment.
  • FIG. 4A shows an example of the fourth embodiment.
  • FIG. 4B shows an example of the fourth embodiment.
  • FIG. 5A shows an example of a germ cell-specific cell death induction system.
  • FIG. 5B shows an example of a germ cell-specific cell death induction system.
  • FIG. 5C shows an example of a germ cell-specific cell death induction system.
  • FIG. 5D shows an example of a germ cell specific cell death induction system.
  • FIG. 6 shows the targeting site of the guide RNA at the gene disruption site of the Prdm14 locus.
  • FIG. 6 shows the targeting site of the guide RNA at the gene disruption site of the Prdm14 locus.
  • FIG. 7 shows the resulting destruction site of the Prdm14 locus.
  • FIG. 8 shows that the germ cells of animals generated from Prdm14 knockout animal embryos transplanted with ES cells (ESC) consist essentially of ES cell-derived cells introduced.
  • FIG. 9 is auxiliary data showing that germ cells are deleted in Prdm14 knockout animals.
  • FIG. 10A is derived from an ES cell by introducing a Pdx1 knockout ES cell that spontaneously forms a germ cell into a Prdm14 knockout embryo that does not spontaneously form a germ cell, and mating the resulting chimeric mouse. An experimental scheme for confirming that a genotype can be passed on to progeny with high efficiency is shown.
  • FIG. 10B shows the Pdx1 genotype of an individual obtained by mating the obtained female chimeric mouse and wild type mouse.
  • Prdm14 means a gene encoding PR domain-containing protein 14 (PR domain-containing protein 14). Prdm14 is also called PR domain zinc finger protein 14 (RP (domain zinc finger protein 14). Prdm14 protein has, for example, an amino acid sequence registered under HPRD ID: 11457, and the gene is known to be located at 8q13.3 on the chromosome. In addition, it is known that Prdm14 gene knockout mice lack germ cells in the ovary and testis (Yamaji (M. Et al., Nature Genetics, 40: 1016-1022, 2008).
  • germ cells are cell tumors that arise from differentiation of primordial germ cells as a specific cell population that forms germ cells, and gametes such as sperm and eggs are formed from the primordial germ cells. Refers to all germline cell types that arise during the differentiation process.
  • an animal that lacks its own germ cells at the developmental stage” or its embryo means an animal or its embryo that does not produce its own germ cells at the developmental stage.
  • such animals include animals with cell-autonomous abnormalities that lack their germ cells at the developmental stage.
  • cell-autonomous abnormality means that an abnormality that a cell has has only an qualitative or quantitative effect on the cell.
  • a “cell-autonomous abnormality” is preferably not an abnormality of a mechanism that acts on other cells.
  • a “cell-autonomous abnormality” is, for example, an abnormality that affects only a cell having the abnormality. Therefore, when a normal cell is introduced, the cell is not affected by the abnormality from the host.
  • Examples of the “cell-autonomous abnormality” include a modification that induces tissue-specific cell death and a modification that lacks a cell-autonomous factor necessary for tissue differentiation. For example, a decrease or deletion of Prdm14 gene expression or activity can be a cell-autonomous abnormality.
  • an enhancer and / or promoter such as Prdm14, Blimp1, Nanos3, Stella, Ddx4, Tnap, Nanog, Oct4, Fut4, and Sox17
  • Modifications that incorporate a system that specifically causes germ cells to cause cell death when driven by the desired enhancer and / or promoter can also be cell-autonomous abnormalities.
  • a gene exhibiting germ cell-specific expression can be, for example, a gene that is specifically expressed in germ cells for a certain period of time or for a long time.
  • Induction of cell death can be achieved by, for example, combining cytotoxic genes such as caspase-8, caspase-9, barnase, and diphtheria toxin by combining with a drug-inducible gene expression system (for example, a tetracycline-responsive expression induction system). It can be achieved by expression in germ cells (eg primordial germ cells) in a utero-dependent manner (eg doxycycline) concentration.
  • a drug-inducible gene expression system for example, a tetracycline-responsive expression induction system
  • germ cells eg primordial germ cells
  • a utero-dependent manner eg doxycycline
  • FIG. 5A shows a system in which drug concentration-dependent cell death is induced specifically in germ cells in combination with a germ cell-specific promoter and a drug-inducible gene expression system.
  • the drug-inducible gene expression system is a Tet-On system. Illustrate the system.
  • a reverse tetracycline-regulated transactivator rtTA
  • a fetus incorporating this system expresses rtTA specifically in germ cells.
  • cytotoxic genes are induced only in germ cells expressing rtTA by tetracycline compounds such as doxycycline (Dox), and cell death can be induced specifically in germ cells.
  • Dox doxycycline
  • FIG. 5B illustrates a system that induces cell death specifically in germ cells using a tissue-specific genetic recombination system such as Cre-LoxP.
  • a physiologically meaningless gene dummy gene
  • a cytotoxic gene are linked downstream of the constitutively activated promoter. In this state, the cell does not induce cell death.
  • LoxP sequences are arranged upstream and downstream of the dummy gene.
  • the cell also has Cre operably linked to a germ cell specific promoter.
  • Cre driven by a germ cell specific promoter is expressed specifically in the germ cell and acts on the LoxP sequence to remove the dummy gene, thereby constitutive activation.
  • the cytotoxic gene By operably linking a cytotoxic gene to a type promoter, the cytotoxic gene can be expressed in a germ cell-specific manner, and as a result, the cell can be induced in a germ cell-specific manner.
  • CreER activated by 4-hydroxy tamoxifen may be used instead of Cre recombinase. CreER is known as a fusion protein of Cre recombinase and a mutant of the ligand binding region of the estrogen receptor and is activated by 4-hydroxy tamoxifen.
  • FIG. 5C incorporates into the cell a system in which a cytotoxic signal receptor is operably linked to a germ cell specific promoter. When cells differentiate into germ cells, cytotoxic signal receptors are expressed on the cell surface, and cell death is induced in a ligand-dependent manner. Examples of cytotoxic signal receptors and their ligands include diphtheria toxin receptor and diphtheria toxin.
  • FIG. 5D illustrates an HSV-TK / GCV system.
  • ganciclovir GCV is weakly cytotoxic in its non-phosphorylated form.
  • HSV-TK thymidine kinase gene
  • GCV thymidine kinase gene
  • Inducible caspase-9 is a protein in which CARD is replaced by FKBP12 in caspase-9, and can be dimerized only in the presence of a tacrolimus derivative such as AP1903 and activated to cause cell death in the cell. Can be triggered.
  • germline-specific cell death is induced by the tacrolimus derivative.
  • these methods may be further combined.
  • a person skilled in the art will be able to achieve germ cell-specific induction of cell death based on the contents of this specification and common general knowledge.
  • Germ cells of animal embryos with cell-autonomous defects that lack germ cells at the developmental stage are replaced by pluripotent cells introduced into the embryo by the principle of blastocyst complementation.
  • reduced or deleted Prdm14 gene expression or activity or similar expression is used to decrease or delete Prdm14 gene expression and decrease Prdm14 protein level or activity or Means deletion.
  • animal means mammals and birds. Examples of animals include, but are not limited to, rodents such as mice and rats, domestic animals such as pigs and cattle, pets such as dogs and cats, birds such as chickens, and primates such as monkeys. . As used herein, an animal is a non-human animal.
  • pluripotent cells means pluripotent stem cells such as ES cells and iPS cells, and pluripotent cells such as internal cell mass (ICM). Pluripotent cells are known to be able to differentiate into any cell and can contribute to the germline.
  • ICM internal cell mass
  • pluripotent cell with genetic modification means a cell that has genetic modification and can contribute to the germline.
  • gene modification means that a gene is different from the wild type, and includes natural modification and artificial modification.
  • Representative examples of genetic modification include transgenic and knockout.
  • “dominant trait”, when used for genetic modification, means that the genetic modification phenotype is manifested by including only one genetic modification on either the paternal or maternal chromosome. To do.
  • Representative examples of genetic alterations that exhibit dominant traits include functional disruption of genes that cause haploinsufficiency, disruption of genes on the Y chromosome, introduction of genes encoding dominant negative proteins, and transgenics.
  • proliferative trait when used for genetic modification, means that the genetic modification phenotype cannot be expressed unless the genetic modification is performed on both the paternal and maternal chromosomes. To do. For example, knockout of a recessive gene is a typical example of genetic modification that exhibits a recessive trait.
  • homo when used for genetic modification, means having genetic modification in both the paternal and maternal chromosomes.
  • hetero when used for genetic modification, means having only genetic modification in either the paternal or maternal side.
  • mating means performing fertilization between two individuals of an organism in order to obtain the next generation.
  • the mating includes mating by artificial insemination and mating a male and a female for the purpose of reproduction.
  • a method for producing a genetically modified animal having a target genetic modification wherein (a) a pluripotent cell having the target genetic modification in both a paternal chromosome and a maternal chromosome is generated. Embryos that are deficient in their germ cells (eg, animal embryos that have cell-autonomous defects that are deficient in their germ cells during development, eg, animal embryos that have reduced or deleted Prdm14 gene expression or activity) ) Is provided. According to the above (a), a germ cell having the target gene modification in both the paternal chromosome and the maternal chromosome (that is, a germ cell having the target gene modification homozygously) can be obtained with high probability.
  • a germ cell having the target gene modification in both the paternal chromosome and the maternal chromosome that is, a germ cell having the target gene modification homozygously
  • the number of germ cells having a genetic modification per 100 germ cells is 90 or more, 95 or more, 98 according to (a). As mentioned above, it can be 99 or more or 100. In the present invention, when Prdm14 is knocked out heterozygously, the number of germ cells having genetic modification per 100 germ cells can be 5 or more or 10 or more according to (a).
  • pluripotent cells include pluripotent stem cells such as ES cells and iPS cells, and pluripotent cells such as internal cell mass (ICM), which can be introduced into embryos in the present invention.
  • the number of pluripotent stem cells to be introduced into the embryo can also be appropriately determined, and is not particularly limited. For example, when introduced into a blastocyst, it can be about 3 to 10 cells.
  • pluripotent cells having the desired genetic modification in both the paternal chromosome and the maternal chromosome it is necessary to use pluripotent cells having the desired genetic modification in both the paternal chromosome and the maternal chromosome.
  • animal embryos that lack their own germ cells in the development process eg, animal embryos that have cell-autonomous defects that lack their germ cells in the development process, such as decrease or deletion of the expression or activity of the Prdm14 gene.
  • a Prdm14 gene knockdown or knockout can be prepared by genetic engineering techniques. Animal embryos that have reduced or deleted Prdm14 gene expression or activity, when developed, lack germ cells.
  • a Prdm14 knockdown animal embryo can be prepared by expressing an RNA causing RNA interference such as shRNA in the animal embryo.
  • Prdm14 knockdown animal embryos can be transformed into the germ line by tetraploid complementation or normal chimera formation that injects embryos into Prdm14 knockdown pluripotent cells (eg, pluripotent cells that constitutively express shRNA against the Prdm14 gene). It can be obtained by shifting and mating.
  • Prdm14 knockout animal embryos can be obtained by crossing males and females of Prdm14 hetero knockout animals.
  • Gene knockout can be performed by methods well known to those skilled in the art, such as homologous recombination and genome editing (CRISPR / CAS9 system).
  • the genetic modification is a single or multiple genetic modification that exhibits a recessive trait.
  • the present invention is a method for producing a genetically modified animal having a target genetic modification,
  • An pluripotent cell having the desired genetic modification in both the paternal chromosome and the maternal chromosome is an animal embryo that lacks its own germ cells during development (eg, lacks its own germ cells during development) Introduction into animal embryos having cell-autonomous abnormalities, such as animal embryos with reduced or deleted Prdm14 gene expression or activity),
  • C-2 A method comprising mating the obtained male individual and the obtained female individual to obtain a genetically modified animal is provided.
  • the male individual obtained in the above (b) and the female individual are mated. This aspect will be described later with reference to FIG. 1 as an example of the first embodiment.
  • the genetic modification is a single or multiple genetic modification that exhibits a dominant trait.
  • the present invention is a method for producing a genetically modified animal having a target genetic modification,
  • An pluripotent cell having the desired genetic modification in both the paternal chromosome and the maternal chromosome is an animal embryo that lacks its own germ cells during development (eg, lacks its own germ cells during development) Introduction into animal embryos having cell-autonomous abnormalities, such as animal embryos with reduced or deleted Prdm14 gene expression or activity),
  • one gender individual shall be the individual obtained in (b) above, and the other gender individual shall be the other individual. Can do. This aspect will be described later with reference to FIG. 2 as an example in which the case of a single genetic modification is a second embodiment.
  • the genetic modification includes both a genetic modification that exhibits a dominant trait and a genetic modification that exhibits a recessive trait.
  • a method for producing a genetically modified animal having a target genetic modification (A) An pluripotent cell having the desired genetic modification in both the paternal chromosome and the maternal chromosome is an animal embryo that lacks its own germ cells during development (eg, lacks its own germ cells during development) Introduction into animal embryos having cell-autonomous abnormalities, such as animal embryos with reduced or deleted Prdm14 gene expression or activity), (B) generating the resulting animal embryo in the host animal's womb to obtain an individual; (C-2) a method comprising mating the obtained male individual and the obtained female individual to obtain a genetically modified animal, wherein in (c-2) either male or female A method is also provided that has a genetic modification that also exhibits a recessive trait in homo and that either male or female has a genetic modification that exhibits a dominant
  • both sexes must be homozygous, and for genetic alterations that exhibit a dominant trait, it is sufficient that at least one of males and females is homozygous. This aspect will be described later as an example of the third embodiment with reference to FIG.
  • the genetic modification includes only a plurality of genetic modifications that exhibit dominant traits.
  • the present invention is a method for producing a genetically modified animal having a target genetic modification,
  • An pluripotent cell having the desired genetic modification in both the paternal chromosome and the maternal chromosome is an animal embryo that lacks its own germ cells during development (eg, lacks its own germ cells during development) Introduction into animal embryos having cell-autonomous abnormalities, such as animal embryos with reduced or deleted Prdm14 gene expression or activity),
  • the genetic modification is only a genetic modification showing a dominant trait, even if there are a plurality of genetic modifications, in (c-1) above, the individual of one sex is the individual obtained in (b) above, and An individual of one gender can be another individual. This aspect will be described later with reference to FIG. 4 as an example of a fourth embodiment where the gene modification is single.
  • the genetic modification when the genetic modification is a modification of one gene and is a genetic modification exhibiting a recessive trait (see FIG. 1), as a second embodiment, the genetic modification is a modification of one gene and is dominant. When it is a genetic modification showing a trait (see FIG. 2), as a third embodiment, when the genetic modification is a modification of multiple genes and includes a genetic modification showing a recessive trait (see FIG. 3), and fourth As an embodiment, the case where the genetic modification is a modification of a plurality of genes and all the genetic modifications are genetic modifications exhibiting dominant traits (see FIG. 4) will be described in order. In the figure, PRDM14 ⁇ / ⁇ will be described as an example, but the invention is not limited to this. The invention is not limited to animal embryos that lack their germ cells in the development process (for example, cells that lack their germ cells in the development process). It is understood that it is established in animal embryos having autonomous abnormalities.
  • the genetic modification is a single genetic modification exhibiting a recessive trait.
  • the goal is to obtain a genetically modified animal that has this genetic modification homozygously.
  • the first embodiment will be described as an example of a method for obtaining a genetically modified animal having a genetic modification exhibiting a recessive character.
  • the expression or activity of Prdm14 is decreased, and it is sufficient that the germ cell is deleted.
  • FIG. 1 shows an example of Prdm14 homoknockout as an example. Yes.
  • an animal embryo that lacks its own germ cells in the development process so as to include both male and female embryos.
  • animal embryos with reduced or deleted Prdm14 expression or activity For example, animal embryos with reduced or deleted Prdm14 expression or activity.
  • FIG. 1 shows an example of providing male and female animal embryos in which Prdm14 is homo knocked out.
  • the reason for providing the embryo so as to include males and females in (a) is that in (c), it is necessary to cross males and females obtained from the embryos. Since Prdm14 is located on the autosome, for example, if Prdm14 hetero knockout animals are mated, males and females can be obtained equally.
  • the obtained animal embryo is developed in the host animal's womb to obtain an individual.
  • the host animal can be a pseudopregnant foster mother of the same kind as the embryo, and a method for generating the obtained animal embryo in the host animal's mother's fetus can be performed by methods well known to those skilled in the art.
  • Individuals can be obtained by caesarean section surgery or delivery.
  • FIGS. 2A and B an example of transgenic (TG) is shown as an example of genetic modification, but it is not necessarily TG, and if it is a genetic modification exhibiting a dominant trait, for example, a gene that is haploinsufficient It may be destruction.
  • TG transgenic
  • an animal embryo that lacks its own germ cells in the development process for example, an animal embryo having a cell-autonomous defect that lacks its germ cells in the development process, such as Prdm14 expression or activity
  • Animal embryos that have been reduced or deleted can be male or female or both.
  • the target genetically modified animal has the genetic modification as paternal and This is because it is sufficient that the individual to be mated has a germ cell having a genetic modification as a germ cell in (c-1) because it is sufficient to have it in at least one of the maternal chromosomes. is there.
  • the other individuals in (c-1) can be arbitrary individuals.
  • the pluripotent cell which has the gene modification which shows a dominant character by homology is not specifically limited, For example, it can obtain by the gene modification of the specific gene or locus of a pluripotent cell.
  • (b) since it is the same as 1st embodiment, description is abbreviate
  • FIG. 3 the case where it has two genetic modifications which show a recessive character and has one genetic modification which shows a dominant character as an example is illustrated. That is, the third embodiment corresponds to a combination of the first embodiment and the second embodiment.
  • knockout is exemplified as an example of genetic modification exhibiting a recessive trait
  • transgenic is illustrated as an example of genetic modification exhibiting a dominant trait.
  • FIG. 3 the present invention is not limited to these as long as each exhibits a recessive trait and a dominant trait.
  • (A) is the same as in the first embodiment. That is, first, as (a) above, an animal embryo that lacks its own germ cells in the development process so as to include both male and female embryos (for example, cell autonomous that lacks its germ cells in the development process). Animal embryos having abnormal abnormalities, such as animal embryos with reduced or deleted Prdm14 expression or activity. This is because the target genetically modified animal must have a homozygous gene modification that exhibits a recessive trait, and as (c-2), male and female having germ cells having the genetic modification homozygous This is because it is necessary to cross.
  • the feature of the third embodiment is that the pluripotent cell introduced into the animal embryo in (a) has a homologous genetic modification showing a recessive trait in both the male and female pluripotent cells. Although it is necessary, for genetic modification showing a dominant trait, only males and females need to be homozygous. For genetic modifications that show dominant traits, both males and females may be homozygous.
  • both male and female germ cells have a genetic modification showing a recessive trait, and the germ cell has a genetic modification that either male or female shows a dominant trait In homo.
  • a gene showing a recessive trait is always homozygous in a litter obtained after mating, and a gene showing a dominant trait is a litter obtained after mating. Therefore, it is possible to obtain a genetically modified animal having the target genetic modification with a probability of almost 100%.
  • the fourth embodiment is the same as the second embodiment except that a genetically modified animal having a plurality of genetic modifications exhibiting dominant traits is obtained. Therefore, description of each process is omitted.
  • FIG. 4A shows only the diagram corresponding to FIG. 2A, but the embodiment corresponding to FIG. 2B is also included in the fourth embodiment. It is understood that there are a plurality of genetic modifications, and the rest is the same as in the second embodiment.
  • FIG. 4B shows a scheme in which two genetic modifications are introduced into different pluripotent cells, and a male and a female are mated to produce a genetically modified animal having two genetic modifications heterogeneously.
  • a sperm having a gene modification of the target gene A can be produced by a process corresponding to FIG. 2A
  • an egg having a gene modification of the target gene B can be produced by a process corresponding to FIG.
  • the target genes A and B are preferably located on different chromosomes, or preferably located at distant gene loci.
  • the other individual has reduced or deleted Prdm14 gene expression or activity in a pluripotent cell having another gene modification of interest in both the paternal and maternal chromosomes. It is an individual obtained by (a) and (b) introduced into an animal embryo.
  • an animal embryo in which the expression or activity of Prdm14 is not completely lost in (a) is used.
  • Prdm14 modified embryos such as Prdm14 +/ ⁇ animal embryos and Prdm14 knockdown embryos can be used.
  • the Prdm14 knockdown embryo can be easily prepared by a method using RNA interference well known to those skilled in the art.
  • Prdm14 +/ ⁇ animal embryos about 16% of germ cells were germ cells derived from RHT-ES cells. . That is, Prdm14 may not have completely lost its expression or activity, and if the expression or activity is partially reduced, pluripotent cells introduced into the embryo provide room for contribution to germ cells. It will be.
  • the germ cells thus obtained are composed of germ cells having a homologous genetic modification, and by crossing with another sex gamete, the target gene is obtained with a certain probability.
  • a genetically modified animal having heterogeneity can be obtained.
  • the modified example seems to be disadvantageous in that the probability of obtaining the target genetically modified animal is low as compared with the first to fourth embodiments.
  • pluripotent cells having a genetic modification are introduced into an animal embryo, and a chimeric mouse is obtained from the animal embryo. Is selected and mated with a wild-type mouse to obtain the target genetically modified animal as F1.
  • F1 the target genetically modified animal
  • the proportion of germ cells with genetic modification in germ cells is low, and in practice, the first screening step for selecting chimeric individuals and the target genetically modified animals are selected from offspring obtained by mating the chimeric individuals Two screening steps of the second screening step are necessary, and the work is complicated.
  • the first screening step since the first generation germ cells are incorporated into all the first generation mice in a substantial proportion, the first screening step can be omitted, and The second screening is also easy because the genetically modified animals having the desired genetic modification are stably contained at a certain rate (for example, even about 16% for hetero knockout). Further, if the expression or activity of Prdm14 is more strongly reduced, a genetically modified animal having the target genetic modification can be obtained more efficiently.
  • the pluripotent cell is introduced into the animal embryo by introducing a pluripotent cell having a heterogeneous genetic modification of the target gene into the first generation.
  • Individuals chimeric individuals
  • some individuals contribute to pluripotent cells introduced into the germ line, so after selection, they are mated with wild type and whole body cells heterozygously modify the target gene.
  • a second-generation individual consisting of cells possessed by Further, by mating the second generation individuals, a genetically modified animal having the desired genetic modification in heterogeneity was obtained as the third generation with a probability of one-fourth according to Mendel's genetic law.
  • pluripotent cells having heterogeneous gene modification of the target gene always contribute to the obtained sperm or egg at a certain rate.
  • the second generation and the third generation can be crossed in the same manner as in the conventional method.
  • pluripotent cells in the first generation, pluripotent cells always contribute to germ cells at a certain rate, so by multiplying the first generations with a certain probability as the second generation It is possible to obtain a genetically modified animal having a target genetic modification heterogeneously. In this way, mating up to the third generation is unnecessary, and a genetically modified animal can be easily obtained.
  • germ cell deficient animal embryos in the production of genetically modified animals.
  • germline-deficient animal embryos for example, cells that have undergone a desired genetic modification are introduced as shown in the first to fourth embodiments and modifications thereof, and a genetically modified animal having the desired genetic modification is introduced. Can be manufactured.
  • an animal embryo that lacks its own germ cells in the development process for example, an animal embryo having a cell-autonomous defect that lacks its germ cells in the development process, such as Prdm14 expression or activity is decreased.
  • wild-type normal ES cells are introduced into an animal embryo
  • all germ cells of the individual obtained by developing the animal embryo are occupied by the introduced ES cells.
  • Prdm14 heteroknockout mice (Prdm14 +/ ⁇ ) and knockout embryos (Prdm14 ⁇ / ⁇ ) were produced.
  • Prdm14 hetero knockout mice C57BL6, BDF1, and ICR were purchased from Japan SLC.
  • hCas9 expression plasmid (addgene 41815. Mali et al. Science., 339: 823-826,2013), and guide RNA expression vector (addgene 41823. Mali et al. Science., 339: 823-826,2013) to mouse Prdm14
  • a pronucleus derived from BDF1 ⁇ C57BL6 using a micromanipulator under a microscope with a solution containing a plasmid see FIG.
  • each of the above sequences (SEQ ID NO: 1, its amino acid sequence is SEQ ID NO: 2) is incorporated at a concentration of 10 ng / ⁇ l Injection into the pronucleus of the stage embryo.
  • Embryos were collected and cultured with KSOM-AA (Millipore) for 1 day. Embryos that had developed to the 2-cell stage were transplanted into the oviducts of pseudopregnant ICR strain mice 0.5 days after mating. Three weeks after delivery, a part of the ear was collected, treated in 90 ⁇ l of 50 mM NaOH at 95 ° C. for 10 minutes, neutralized with 1M Tris HCl (pH 8.0), and a genomic DNA solution was collected.
  • the obtained genomic DNA solution was subjected to PCR using Gene Amp PCR system 9700 (Applied Biosystems; AB) using TKS GFlex (TAKARA) and Prdm14 forward primer: TACAATCTGCCCTGGTACAA (SEQ ID NO: 3) and Prdm14 reverse primer: AGAACTCTCTGTGGGAACCA (SEQ ID NO: 4). Reaction was performed.
  • the DNA was purified from the PCR product by Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System (Promega), and then the DNA sequence of the target site was analyzed using a contract sequencing service provided by FASMAC. As a result, two types of Prdm14 mutants were obtained (see # 1 and # 4 in FIG. 7).
  • ES cells were knocked in by electroporation with a vector containing a DNA sequence encoding a protein in which histone H2B and tdTomato (red fluorescent protein) were fused to the ROSA26 locus of mouse B6 ES cells.
  • histone H2B and tdTomato red fluorescent protein
  • RHT-ES cells were prepared on gelatin-coated dishes in Glagow's Modified Eagle's; Medium (GMEM; Sigma, St. Louis, MO), 10% fetal bovine serum (FBS; Nichirei), 0.1 mM 2-mercaptomethanol. (Invitrogen), 0.1 mM non-essential amino acid (Invitrogen), 1 mM pyruvic acid sodium salt (Invitrogen), 1% L-glutamine-penicillin-streptomycin (Sigma), 1,000 U / ml leukiemia inhibitory factor (LIF; Millipore) added Incubated on the prepared medium. Of course, RHT-ES cells are normal with respect to the Prdm14 gene.
  • RHT-ES cells were injected into the cavity at a ratio of about 5 to one blastocyst using a micromanipulator. After waiting for embryo recovery, transplanted into the uterus of pseudopregnant ICR strain mice 2.5 days after mating, and emperor on the 11th day after transplantation (13.5 days of gestation, also referred to as “E13.5”) An incision was made and the fetus was removed. The resulting fetus was observed under a fluorescence microscope to determine the chimera formation.
  • Mouse anti-CD45-PE-Cy7 antibody (manufactured by eBio) is added to the cell suspension containing blood cells obtained above, and anti-SSEA1-APC antibody (manufactured by eBio) is added to the cell suspension containing germ cells. .5 ⁇ l was added and allowed to stand for 30 minutes on ice protected from light. Blood cells, MEFs and germ cells were washed with PBS (staining medium; SM), resuspended in PBS containing 1 ⁇ g / ml propidium iodide (PI), and analyzed with FACSAria II (BD Biosciences). Analysis was performed using software Flow-jo. In addition, tdTomato negative cells were collected from the remaining MEF suspension using FACSAria II, and the mutant sequence was analyzed in the same manner as described above.
  • PBS staining medium
  • PI propidium iodide
  • FACSAria II BD Biosciences
  • the proportion of ES cell-derived cells in SSEA1-expressing cells was very low at 0.057%.
  • the proportion of tdTomato-expressing cells in SSEA1-expressing cells is equal to or higher than that when using Prdm14 gene wild-type embryos (for example, 16.1%).
  • Prdm14 +/ ⁇ embryos were used, embryo-derived cells and RHT-ES cell-derived cells were mixed in germ cells, and RHT-ES cells could contribute.
  • ES cells having a specific genotype were introduced into Pdx1 + / + and Prdm14 ⁇ / ⁇ embryos, and it was confirmed that the genotype can be inherited by progeny.
  • Pdx1 ⁇ / ⁇ , Prdm14 + / + ES cells female
  • Pdx1 + / + , Prdm14 ⁇ / ⁇ embryos female
  • the obtained chimeric mouse was mated with a wild type mouse, and the Pdx1 genotype of the obtained pup was confirmed.
  • the germ cells of the chimeric mice are occupied by the germ cells of Pdx1 ⁇ / ⁇ , Prdm14 + / + , so that it is obtained when this chimeric mouse is bred with a wild type mouse
  • the individual genotype is expected to be all Pdx1 ⁇ / + .
  • embryo-derived Pdx + / + cells are mixed in germ cells of a chimeric mouse, the individuals obtained by mating should be observed with a mixture of Pdx1 + / + and Pdx1 +/- genotypes. become.
  • the DNA of 11 individuals obtained by crossing was extracted and the Pdx1 genotype was determined. The result was as shown in FIG. 10B.
  • the primers used for PCR to determine the genotype of Pdx1 are the same as those reported previously (Kobayashi et al., Cell 2010, 142 (5) 787-799). Wild-type Pdx1 has a Pdx1 band observed at 405 bp (black arrowhead position), and mutant Pdx1 has a Pdx1 band observed at a white arrowhead position. It was confirmed that the genotypes of individuals obtained by mating were all Pdx1 ⁇ / + having wild type and mutant type.
  • Example 1 From the results of Example 1, it was found that when pluripotent cells having wild-type Pdrm14 were introduced into Pdrm14 knockout animals, individuals with germ cells could be obtained from the introduced pluripotent cells. . From the results of Example 1, it is also possible to obtain individuals having genes derived from ES cells with high efficiency by growing and mating Prdm14 ⁇ / ⁇ embryos (male and female) into which ES cells have been introduced. .
  • the genotype was examined by mating a chimeric animal and a wild type animal.
  • the genotype of the animal obtained by mating can be changed to the desired genotype by mating an animal having a germ cell having a desired genotype with a chimeric animal instead of the wild type animal to be mated.
  • the inventors have utilized this principle to obtain a germ cell (sperm or egg) having a genetic modification with increased efficiency, for example, with a probability of almost 100%, and to easily obtain a germ cell having a genetic modification. And a method for obtaining a genetically modified animal having a desired genetic modification.

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Abstract

本発明は、目的の遺伝子改変を有する遺伝子改変動物を簡便に、改善された効率で、例えば、ほぼ１００％の確率で得る方法を提供する。　目的の遺伝子改変を有する遺伝子改変動物を作製する方法であって、（ａ）目的の遺伝子改変を父方の染色体および母方の染色体の両方に有する多能性細胞を、発生段階において自己の生殖細胞を欠損する動物胚に導入することを含む方法。

Description

生殖細胞欠損動物を用いる遺伝子改変動物の作製方法
　本発明は、生殖細胞欠損動物を用いる遺伝子改変動物の作製方法に関する。
　遺伝子改変動物は、遺伝子の生体内での機能を解析するために多用されており、外来遺伝子を導入するトランスジェニック動物、および、内在性遺伝子を破壊するノックアウト動物が知られている。
　遺伝子改変動物の作製は、野生型の動物胚に目的の遺伝子改変を有する多能性細胞を導入すること、または動物胚に直接目的の遺伝子改変を導入することにより行われる。目的の遺伝子改変を有する多能性細胞を導入した動物胚を偽妊娠仮親の子宮に移植して発生させると動物胚から発生する個体は、細胞の一部は野生型の細胞からなり、他の部分は遺伝子改変を有する細胞からなるというキメラ状態となる。これは生殖細胞においても、同様であるが、生殖細胞に導入した多能性幹細胞が寄与した個体の目的の遺伝子改変を有する精子と卵子とを交配させると、目的の遺伝子改変をホモで有する遺伝子改変動物を得ることができる。生殖細胞に導入した多能性幹細胞が寄与した個体の生殖腺から得られる目的の遺伝子改変を有する精子または卵子を野生型の配偶子と交配させると、目的の遺伝子改変をヘテロで有する遺伝子改変動物を得ることができる。また、受精後間もない前核期の胚に目的の遺伝子改変を行うためのDNA、またはRNAを導入することにより、全身またはその一部の細胞が目的の遺伝子改変を有する個体を得ることもできる。目的とする遺伝子改変が生殖細胞にも反映されていれば、安定的に遺伝子改変動物を得ることができる。このようにして、遺伝子改変動物の作製が行われている。
　特許文献１は、発生段階または成体において致死的な表現型を示す遺伝子改変を有する遺伝子改変動物を効率よく得る方法を開示する。特許文献１では、遺伝子改変動物は、臓器や組織の全部または一部が欠失する遺伝子改変を有し、これにより致死的であるはずなので、従来は、遺伝子改変をヘテロで有する親を用意し、メンデルの遺伝法則により遺伝子改変をホモで有する個体を４分の１の確率で得ていた。特許文献１は、この確率を顕著に向上させる方法を開示するが、特許文献１では、以下の原理が用いられている。すなわち、遺伝子改変動物（－／－）は通常は致死であり発生しないが、発生段階の胚において正常な多能性細胞を導入すると、この欠失が多能性細胞により補完（胚盤胞補完ともいう）され、動物を成体まで生存させることができる。そして得られた成体の配偶子はほぼ１００％ホモで遺伝子改変を有するから、得られた精子と卵子とを交配させると高い確率で、遺伝子改変をホモで有する遺伝子改変動物を得ることができるという画期的な技術である。
　非特許文献１は、Ｐｒｄｍ１４遺伝子のノックアウトマウスが生殖細胞を欠失することを開示する。Ｐｒｄｍ１４遺伝子のノックアウトマウスは、生殖細胞が欠失するので交配させることができない。
ＵＳ２０１１／００６７１２５Ａ１
Yamaji, M. et al., Nature Genetics, 40(8):1016-1022, 2008
　このような状況下、本発明者らは、さらに簡便な遺伝子改変動物の作製方法が開発されれば、そのニーズは大きいと考えるに至った。本発明は、生殖細胞欠損動物を用いる遺伝子改変動物の作製方法を提供する。
　本発明者らは、Ｐｒｄｍ１４遺伝子の遺伝子破壊動物において、雄の場合は精子が完全に欠失し、雌の場合は卵子が完全に欠失することを見出した。本発明者らはまた、発生段階において自己の生殖細胞を欠損する動物の胚に、該異常を有しない多能性細胞を導入すると、導入した細胞のみから由来する精子または卵子が得られることを見出した。本発明者らは、発生段階において自己の生殖細胞を欠損する細胞自律的な異常を有する動物の例としてＰｒｄｍ１４遺伝子の遺伝子破壊動物を用いて、その胚に、Ｐｒｄｍ１４に関して正常な多能性細胞を導入すると、導入した細胞のみから由来する精子または卵子が得られることを見出した。本発明者らはさらに、上記において胚に導入する細胞として、遺伝子改変を有する多能性細胞を用いると、Ｐｒｄｍ１４遺伝子の遺伝子破壊動物の体内で、得られる精子または卵子が、実質的に遺伝子改変を有する精子のみまたは卵子のみであることを見出した。本発明によれば、このようにして得られた遺伝子改変を有する精子および卵子を交配させることでほぼ１００％の確率で確実に遺伝子改変動物が得られる。本発明によればまた、優性形質を示す遺伝子改変を有する動物を作製する場合には、上記により得られた遺伝子改変を有する精子または卵子のいずれかを、他の卵子または精子と交配させることで１００％の確率で確実に遺伝子改変動物が得られる。
　本発明者らはまた、発生段階において自己の生殖細胞を欠損する動物の胚（例えば、Ｐｒｄｍ１４の発現または活性を低下させた動物の胚）に、Ｐｒｄｍ１４に関して正常な多能性細胞を導入すると、導入した多能性細胞が生殖細胞に従来よりも高い割合で寄与することを見出した。本発明者らはさらに、上記において胚に導入する細胞として、遺伝子改変を有する多能性細胞を用いると、発生段階において自己の生殖細胞を欠損する動物（例えば、Ｐｒｄｍ１４遺伝子の遺伝子破壊動物）の体内で、遺伝子改変を有する精子または卵子が従来よりも高い確率で得られることを見出した。本発明によれば、このようにして得られた遺伝子改変を有する精子および卵子を交配させることで改善された確率で遺伝子改変動物が得られ、遺伝子改変動物の作製手順が大幅に簡略化される。
　本発明は、このような知見に基づく発明である。すなわち、本発明によれば、以下の発明が提供される。
（１）目的の遺伝子改変を有する遺伝子改変動物を作成する方法であって、
　（ａ）目的の遺伝子改変を父方の染色体および母方の染色体の両方に有する多能性細胞を、発生段階において自己の生殖細胞を欠損する動物胚に導入することを含む、方法。
（２）目的の遺伝子改変を有する遺伝子改変動物を作製する方法であって、
　（ａ）発生段階において自己の生殖細胞を欠損する異常が、Ｐｒｄｍ１４遺伝子若しくは当該遺伝子によりコードされるタンパク質の発現若しくは活性の低下または欠失である、上記（１）に記載の方法。
（３）上記（１）または（２）に記載の方法であって、遺伝子改変が優性形質を示し、
　（ｂ）得られた動物胚を宿主動物の母胎中で発生させて個体を得ることと、
　（ｃ－１）得られた個体を他の個体と交配して、遺伝子改変動物を得ることと
をさらに含む、方法。
（４）遺伝子改変が、１または複数の遺伝子改変を含み、全ての遺伝子改変が優性形質を示す、上記（３）に記載の方法。
（５）上記（１）または（２）に記載の方法であって、遺伝子改変が劣性形質を示す遺伝子改変を含み、
　（ｂ）得られた動物胚を宿主動物の母胎中で発生させて個体を得ることと、
　（ｃ－２）得られた雄の個体と得られた雌の個体とを交配して、遺伝子改変動物を得ることと
をさらに含む、方法。
（６）目的の遺伝子改変が、１または複数の遺伝子改変を含むものである、上記（４）に記載の方法。
（７）上記（５）に記載の方法であって、
　目的の遺伝子改変が、優性形質を示す遺伝子改変と劣性形質を示す遺伝子改変を含み、
　方法は、
　（ｃ－２）において、雄および雌のどちらも劣性形質を示す遺伝子改変をホモで有し、かつ、雄または雌のどちらかが優性形質を示す遺伝子改変をホモで有する、方法。
（８）上記（３）に記載の方法であって、遺伝子改変がハプロ不全の形質を示す遺伝子改変である、方法。
（９）上記（３）に記載の方法であって、遺伝子改変が外来遺伝子の導入である、方法。
（１０）上記（５）に記載の方法であって、遺伝子改変がノックアウトである、方法。
（１１）目的の遺伝子改変を有する生殖細胞を作製する方法であって、
　目的の遺伝子改変を父方の染色体および母方の染色体の両方に有する多能性細胞を発生段階において自己の生殖細胞を欠損する異常を有する動物胚に導入することを含む方法。
（１２）発生段階において自己の生殖細胞を欠損する異常が、Ｐｒｄｍ１４遺伝子の発現若しくは活性の低下または欠失である、上記（１１）に記載の方法。方法。
（１３）遺伝子改変動物の製造における、生殖細胞欠損動物胚の使用。
　本発明によれば、遺伝子改変動物を高い確率で得ることができる。本発明によれば、特に発生段階において致死性である遺伝子改変を有する遺伝子改変動物を改善された確率で得られる点で有用である。
図１は、第一の実施形態の一例を示す。 図２Ａは、第二の実施形態の一例を示す。 図２Ｂは、第二の実施形態の一例を示す。 図３は、第三の実施形態の一例を示す。 図４Ａは、第四の実施形態の一例を示す。 図４Ｂは、第四の実施形態の一例を示す。 図５Ａは、生殖細胞特異的な細胞死誘導システムの一例を示す。 図５Ｂは、生殖細胞特異的な細胞死誘導システムの一例を示す。 図５Ｃは、生殖細胞特異的な細胞死誘導システムの一例を示す。 図５Ｄは、生殖細胞特異的な細胞死誘導システムの一例を示す。 図６は、Ｐｒｄｍ１４遺伝子座の遺伝子破壊部位におけるガイドRNAのターゲッティング部位を示す。 図７は、得られたＰｒｄｍ１４遺伝子座の破壊部位を示す。変異型＃１では、１１塩基対が欠失し、変異型＃４では、１７塩基対が欠失した。 図８は、ＥＳ細胞（ＥＳＣ）を移植されたＰｒｄｍ１４ノックアウト動物胚から発生させた動物の生殖細胞が導入したＥＳ細胞由来の細胞から実質的になることを示す。 図９は、Ｐｒｄｍ１４ノックアウト動物では生殖細胞が欠失することを示す補助データである。 図１０Ａは、生殖細胞を自発的に形成しないＰｒｄｍ１４ノックアウト胚に、生殖細胞を自発的に形成するがＰｄｘ１ノックアウトＥＳ細胞を導入し、得られたキメラマウスを交配させることで、ＥＳ細胞に由来する遺伝子型を高効率で後代に受け継がせることが可能であることを確認するための実験スキームを示す。 図１０Ｂは、得られた雌キメラマウスと野生型マウスとを交配させて得た個体のＰｄｘ１遺伝子型を示す。
発明の具体的な説明
　本明細書では、「Ｐｒｄｍ１４」は、ＰＲドメイン含有タンパク質１４（PR domain-containing protein 14）をコードする遺伝子を意味する。Ｐｒｄｍ１４は、ＰＲドメインジンクフィンガータンパク質１４（RP domain zinc finger protein 14）とも呼ばれる。Ｐｒｄｍ１４タンパク質は、例えば、ＨＰＲＤ　ＩＤ：１１４５７で登録されたアミノ酸配列を有し、その遺伝子は、染色体上の８ｑ１３．３に位置することが知られている。また、Ｐｒｄｍ１４遺伝子のノックアウトマウスでは、卵巣および精巣において生殖細胞が欠損することが知られている（Yamaji M. et al., Nature Genetics, 40: 1016-1022, 2008）。
　本明細書では、「生殖細胞」とは、生殖細胞を形成する特異な細胞集団として始原生殖細胞から分化して生じる細胞腫であって、始原生殖細胞から精子および卵などの配偶子が形成されるまでの分化過程で生じるすべての生殖細胞系列の細胞種を指す。
　本明細書では、「発生段階において自己の生殖細胞を欠損する動物」またはその胚とは、発生段階において自己の生殖細胞を生じない動物またはその胚を意味する。例えば、そのような動物としては、発生段階において自己の生殖細胞を欠損する細胞自律的（cell-autonomous）な異常を有する動物が挙げられる。
　本明細書では、「細胞自律的な異常」とは、細胞が有する異常が当該細胞に対する影響しか質的にまたは量的に実質的に有しないことを意味する。「細胞自律的な異常」は、好ましくは他の細胞に働きかける機構の異常ではない。「細胞自律的な異常」は、例えば、その異常を有する細胞にのみ影響が生じる異常であるから、正常な細胞を導入すると、その細胞は、当該宿主からは異常の影響を受けない。「細胞自律的な異常」としては、例えば、組織特異的な細胞死を誘発する改変、および、組織分化に必要でかつ細胞自律的な因子を欠損した改変が挙げられる。例えば、Ｐｒｄｍ１４遺伝子の発現若しくは活性の低下または欠失は、細胞自律的な異常であり得る。また、生殖細胞特異的な発現を示す遺伝子、より具体的には例えばＰｒｄｍ１４、Ｂｌｉｍｐ１、Ｎａｎｏｓ３、Ｓｔｅｌｌａ、Ｄｄｘ４、Ｔｎａｐ、Ｎａｎｏｇ、Ｏｃｔ４、Ｆｕｔ４、およびＳｏｘ１７などのエンハンサーおよび／またはプロモーターを利用して、所望のエンハンサーおよび／またはプロモーターが駆動するタイミングで、生殖細胞に特異的に細胞死を引き起こさせるシステムを組込んだ改変も、細胞自律的な異常であり得る。生殖細胞特異的な発現を示す遺伝子は、例えば、生殖細胞に一時期または長期に特異的に発現する遺伝子とすることができる。
　細胞死の誘導は、例えば、薬剤誘導性遺伝子発現システム（例えば、テトラサイクリン応答性発現誘導システム）と組み合わせることで、Ｃａｓｐａｓｅ－８、Ｃａｓｐａｓｅ－９、Ｂａｒｎａｓｅ、およびジフテリアトキシンなどの細胞障害性遺伝子を、胎内の薬物（例えば、ドキシサイクリン）濃度依存的に生殖細胞（例えば、始原生殖細胞）で発現させることによって達成され得る。以下、生殖細胞特異的に細胞傷害性を発生させる方法の例を図５Ａ～Ｄを参照して説明する。
　図５Ａは、生殖細胞特異的プロモーターと薬剤誘導性遺伝子発現システムと組み合わせて生殖細胞特異的に薬物濃度依存的な細胞死を誘導する系において、薬剤誘導性遺伝子発現システムがＴｅｔ－Ｏｎシステムである系を例示する。図５Ａでは、生殖細胞特異的プロモーターに作動可能にリバーステトラサイクリン制御性トランス活性化因子（ｒｔＴＡ）が連結されている。この系が組込まれた胎児は、生殖細胞特異的にｒｔＴＡを発現している。ここで、ドキシサイクリン（Ｄｏｘ）などのテトラサイクリン系化合物により、ｒｔＴＡが発現する生殖細胞でのみ、細胞傷害性遺伝子が誘導され、生殖細胞特異的に細胞死を誘発させることができる。
　同じ目的の他の方法としては、Ｃｒｅ－ＬｏｘＰなどの遺伝子組換えシステムによって生殖細胞特異的に細胞障害性遺伝子を発現させる方法が挙げられる。図５Ｂは、Ｃｒｅ－ＬｏｘＰなどの組織特異的遺伝子組換えシステムを用いて生殖細胞特異的に細胞死を誘導する系を例示する。図５Ｂでは、構成的活性化型プロモーターの下流に、生理学的に意味の無い遺伝子（ダミー遺伝子）と細胞傷害性遺伝子とを連結させている。この状態では、細胞が細胞死を誘発することがない。しかし、上記においてダミー遺伝子の上流と下流にＬｏｘＰ配列を配置されている。また、この細胞は、生殖細胞特異的プロモーターに作動可能に連結されたＣｒｅを有する。この系では、細胞が生殖細胞に分化すると、生殖細胞特異的プロモーターにより駆動されるＣｒｅが生殖細胞特異的に発現し、ＬｏｘＰ配列に作用してダミー遺伝子を除去し、これにより、構成的活性化型プロモーターに作動可能に細胞傷害性遺伝子を連結させることで、生殖細胞特異的に細胞傷害性遺伝子を発現させ、結果として生殖細胞特異的に細胞を誘発することができる。この系において、Ｃｒｅリコンビナーゼに代えて、４－水酸化タモキシフェンにより活性化されるＣｒｅＥＲを用いてもよいであろう。ＣｒｅＥＲは、Ｃｒｅリコンビナーゼとエストロゲン受容体のリガンド結合領域の変異体との融合タンパク質として知られ、４－水酸化タモキシフェンにより活性化される。
　同じ目的のさらに他の方法としては、生殖細胞特異的に細胞障害性シグナルのレセプターを発現させたのちに任意のタイミングでリガンドを作用させて生殖細胞特異的に細胞死を誘導する方法が挙げられる。この場合、細胞傷害性シグナルのレセプターを発現しない細胞は、リガンドに非感受性であることが好ましい。図５Ｃは、生殖細胞特異的プロモーターに作動可能に細胞傷害性シグナルレセプターを連結した系を細胞に組込んでいる。細胞が生殖細胞に分化すると、細胞表面に細胞傷害性シグナルレセプターが発現し、リガンド依存的に細胞死が誘発される。細胞傷害性シグナルレセプターとそのリガンドの例としては、ジフテリアトキシンレセプターとジフテリアトキシンが挙げられる。
　同じ目的のさらに他の方法としては、化合物誘導性細胞障害システムが例示できる。他化合物誘導性細胞傷害システムの例としては、HSV-TK/GCVシステムHSV-TK/GCVシステム(Moolten FL et al., Hum. Gene Ther. 1990; 1: 125-134) を用いる系や、inducible caspase-9 (Straathof KC et al., Blood 2005; 105: 4247-4254)を用いる系が挙げられる。
図５Ｄは、HSV-TK/GCVシステムを例示する。具体的には、ガンシクロビル（ＧＣＶ）は、非リン酸化形態では細胞傷害性が弱い。しかしながら、ヘルペスウイルス属が有するチミジンキナーゼ遺伝子（ＨＳＶ－ＴＫ）を作用させると、ＧＣＶはリン酸化され、ＧＣＶ三リン酸に変換され、細胞傷害性を獲得する。従って、ＨＳＶ－ＴＫを生殖細胞特異的プロモーターに作動可能に連結し、ＨＳＶ－ＴＫを生殖細胞特異的に発現させることにより、生殖細胞特異的に細胞死を誘発できる。また、inducible caspase-9は、caspase-9において、ＣＡＲＤがＦＫＢＰ１２により置き換えられたタンパク質であり、ＡＰ１９０３などのタクロリムス誘導体存在下でのみ二量体化することができ、活性化して細胞に細胞死を誘発させることができる。inducible caspase-9を生殖細胞特異的プロモーターに作動可能に連結した系を導入した細胞が生殖細胞に分化すると、タクロリムス誘導体により生殖細胞特異的に細胞死が誘発される。
　本発明においては、これらの方法をさらに組み合わせて用いてもよい。当業者であれば、本明細書の内容および技術常識に基づいて生殖細胞特異的な細胞死の誘導を実現することができるであろう。発生段階で生殖細胞を欠損する細胞自律的な異常を有する動物胚の生殖細胞は、胚盤胞補完法の原理により、胚に導入した多能性細胞に置き換わる。
　本明細書では、「Ｐｒｄｍ１４遺伝子の発現または活性を低下または欠失させた」またはこの類似の表現は、Ｐｒｄｍ１４遺伝子の発現を低下または欠失させること、および、Ｐｒｄｍ１４のタンパク質レベルまたは活性を低下または欠失させることを意味する。
　本明細書では、「動物」とは、哺乳動物および鳥類を意味する。動物としては、特に限定されないが、例えば、マウスおよびラットなどの齧歯類、ブタおよびウシなどの家畜動物、イヌおよびネコなどの愛玩動物、ニワトリなどの鳥類、並びにサルなどの霊長類が挙げられる。本明細書では、動物は非ヒト動物である。
　本明細書では、「多能性細胞」（pluripotent cell）とは、ＥＳ細胞およびｉＰＳ細胞などの多能性幹細胞、並びに、内部細胞塊（ＩＣＭ）などの多能性細胞を意味する。多能性細胞は、あらゆる細胞に分化できることで知られ、生殖系列に寄与することができる。
　本明細書では、「遺伝子改変を有する多能性細胞」とは、遺伝子改変を有し、かつ生殖系列に寄与することができる細胞を意味する。
　本明細書では、「遺伝子改変」とは、遺伝子が野生型と異なることを意味し、天然の改変および人工の改変が含まれる。遺伝子改変の代表的な例としては、トランスジェニックおよびノックアウトが挙げられる。
　本明細書では、「優性形質」とは、遺伝子改変に対して用いられる場合、遺伝子改変が父方または母方のどちらかの染色体上に１つ含むだけで遺伝子改変の表現型が表われることを意味する。優性形質を示す遺伝子改変の代表的な例としては、ハプロ不全を引き起こす遺伝子の機能破壊、Ｙ染色体上の遺伝子の破壊、ドミナントネガティブのタンパク質をコードする遺伝子の導入、およびトランスジェニックが挙げられる。
　本明細書では、「劣性形質」とは、遺伝子改変に対して用いられる場合、遺伝子改変が父方および母方の両方の染色体で行われていなければ、遺伝子改変の表現型が表われないことを意味する。例えば、劣性遺伝子のノックアウトは、劣性形質を示す遺伝子改変の代表的な例として挙げられる。
　本明細書では、「ホモ」とは、遺伝子改変に対して用いられる場合、父方および母方の染色体の両方に遺伝子改変を有することを意味する。
　本明細書では、「ヘテロ」とは、遺伝子改変に対して用いられる場合、父方または母方のいずれか一方のみに遺伝子改変を有することを意味する。
　本明細書では、「交配」とは、次世代を得るために生物の二個体間で受精を行うことを意味する。交配としては、人工授精により交配すること、および生殖を目的として雄と雌とを対合させることが挙げられる。
　本発明によれば、目的の遺伝子改変を有する遺伝子改変動物を作製する方法であって、（ａ）目的の遺伝子改変を父方の染色体および母方の染色体の両方に有する多能性細胞を、発生過程において自己の生殖細胞を欠損する動物胚（例えば、発生過程において自己の生殖細胞を欠損する細胞自律的な異常を有する動物胚、例えば、Ｐｒｄｍ１４遺伝子の発現または活性を低下または欠失させた動物胚）に導入することを含む方法が提供される。上記（ａ）により、目的の遺伝子改変を父方の染色体および母方の染色体の両方に有する生殖細胞（すなわち、目的の遺伝子改変をホモで有する生殖細胞）を高い確率で得ることができる。（ａ）を実施した後は、動物胚を仮親の子宮に移植して発生させると目的の遺伝子改変を父方の染色体および母方の染色体の両方に有する生殖細胞を得ることができるので、その後は、常法により遺伝子改変動物を得ることができる。
　本発明では、Ｐｒｄｍ１４をノックアウトするか実質的に完全にノックダウンすると、上記（ａ）により、生殖細胞１００個あたりの遺伝子改変を有する生殖細胞の数を、９０個以上、９５個以上、９８個以上、９９個以上、または１００個とすることができる。本発明ではまた、Ｐｒｄｍ１４をヘテロでノックアウトすると、上記（ａ）により、生殖細胞１００個あたりの遺伝子改変を有する生殖細胞の数を５個以上または１０個以上とすることができる。
　動物胚は、８細胞期の胚から胚盤胞期の胚まで様々な胚を用いることができ、このような動物胚に多能性細胞を導入する方法は当業者に周知である。多能性細胞としては、ＥＳ細胞およびｉＰＳ細胞などの多能性幹細胞や内部細胞塊（ＩＣＭ）などの多能性細胞が挙げられ、本発明において胚に導入することができる。胚に導入する多能性幹細胞の数も、適宜決定することができ、特に限定されないが例えば、胚盤胞に導入する場合には３個～１０個程度とすることができる。
　本発明によれば、上記（ａ）では、目的の遺伝子改変を父方の染色体および母方の染色体の両方に有する多能性細胞を用いることが必要である。また、発生過程において自己の生殖細胞を欠損する動物胚（例えば、発生過程において自己の生殖細胞を欠損する細胞自律的な異常を有する動物胚、例えば、Ｐｒｄｍ１４遺伝子の発現または活性を低下または欠失させた動物胚）は、例えば、遺伝子工学的な手法、例えば、Ｐｒｄｍ１４遺伝子のノックダウンやノックアウトにより作製することができる。Ｐｒｄｍ１４遺伝子の発現または活性を低下または欠失させた動物胚は、発生させると生殖細胞を欠失する。
　例えば、Ｐｒｄｍ１４ノックダウン動物胚は、動物胚にｓｈＲＮＡなどのＲＮＡ干渉を引き起こすＲＮＡを発現させることにより作製することができる。Ｐｒｄｍ１４ノックダウン動物胚は、Ｐｒｄｍ１４ノックダウン多能性細胞（例えば、Ｐｒｄｍ１４遺伝子に対するｓｈＲＮＡを恒常的に発現する多能性細胞）をテトラプロイド補完法や胚に注入する通常のキメラ形成法で生殖系列に移行させて、交配することにより得ることができる。また、Ｐｒｄｍ１４ノックアウト動物胚は、Ｐｒｄｍ１４のヘテロノックアウト動物の雄と雌とを掛け合わせることで得ることができる。遺伝子のノックアウトは、相同組換え、およびゲノム編集（CRISPR/CAS9系）などの当業者に周知の方法により行うことができる。
　本発明のある態様では、遺伝子改変が劣性形質を示す単一または複数の遺伝子改変である。この態様においては、本発明は、目的の遺伝子改変を有する遺伝子改変動物を作製する方法であって、
　（ａ）目的の遺伝子改変を父方の染色体および母方の染色体の両方に有する多能性細胞を、発生過程において自己の生殖細胞を欠損する動物胚（例えば、発生過程において自己の生殖細胞を欠損する細胞自律的な異常を有する動物胚、例えば、Ｐｒｄｍ１４遺伝子の発現または活性を低下または欠失させた動物胚）に導入すること、
　（ｂ）得られた動物胚を宿主動物の母胎中で発生させて個体を得ることと、
　（ｃ－２）得られた雄の個体と得られた雌の個体とを交配して、遺伝子改変動物を得ることと
を含む方法が提供される。上記の（ｃ－２）において、上記（ｂ）で得られた雄の個体と雌の個体とを交配することを特徴とする。この態様は、第一の実施形態として一例を図１を参照しながら後述する。
　本発明のある態様では、遺伝子改変が優性形質を示す単一または複数の遺伝子改変である。この態様においては、本発明は、目的の遺伝子改変を有する遺伝子改変動物を作製する方法であって、
　（ａ）目的の遺伝子改変を父方の染色体および母方の染色体の両方に有する多能性細胞を、発生過程において自己の生殖細胞を欠損する動物胚（例えば、発生過程において自己の生殖細胞を欠損する細胞自律的な異常を有する動物胚、例えば、Ｐｒｄｍ１４遺伝子の発現または活性を低下または欠失させた動物胚）に導入すること、
　（ｂ）得られた動物胚を宿主動物の母胎中で発生させて個体を得ることと、
　（ｃ－１）得られた個体を他の個体と交配して、遺伝子改変動物を得ることと
を含み得る。遺伝子改変が優性形質を示す場合には、上記（ｃ－１）では、片方の性別の個体を上記（ｂ）で得られた個体とし、もう片方の性別の個体は、他の個体とすることができる。この態様は、遺伝子改変が単一の場合を第二の実施形態として一例を図２を参照しながら後述する。
　本発明のある態様では、遺伝子改変が優性形質を示す遺伝子改変と劣性形質を示す遺伝子改変の両方を含む。この態様では、
　目的の遺伝子改変を有する遺伝子改変動物を作製する方法であって、
　（ａ）目的の遺伝子改変を父方の染色体および母方の染色体の両方に有する多能性細胞を、発生過程において自己の生殖細胞を欠損する動物胚（例えば、発生過程において自己の生殖細胞を欠損する細胞自律的な異常を有する動物胚、例えば、Ｐｒｄｍ１４遺伝子の発現または活性を低下または欠失させた動物胚）に導入すること、
　（ｂ）得られた動物胚を宿主動物の母胎中で発生させて個体を得ることと、
　（ｃ－２）得られた雄の個体と得られた雌の個体とを交配して、遺伝子改変動物を得ることと
を含む方法であって、（ｃ－２）において、雄および雌のどちらも劣性形質を示す遺伝子改変をホモで有し、かつ、雄または雌のどちらかが優性形質を示す遺伝子改変をホモで有する、方法が提供される。劣性形質を示す遺伝子改変については、雌雄両方がホモで有しなければならず、優性形質を示す遺伝子改変については、雄および雌の少なくとも一方がホモで有していればよい。この態様は、第三の実施形態として一例を図３を参照しながら後述する。
　本発明のある態様では、遺伝子改変が優性形質を示す複数の遺伝子改変のみを含む。この態様においても、本発明は、目的の遺伝子改変を有する遺伝子改変動物を作製する方法であって、
　（ａ）目的の遺伝子改変を父方の染色体および母方の染色体の両方に有する多能性細胞を、発生過程において自己の生殖細胞を欠損する動物胚（例えば、発生過程において自己の生殖細胞を欠損する細胞自律的な異常を有する動物胚、例えば、Ｐｒｄｍ１４遺伝子の発現または活性を低下または欠失させた動物胚）に導入すること、
　（ｂ）得られた動物胚を宿主動物の母胎中で発生させて個体を得ることと、
　（ｃ－１）得られた個体を他の個体と交配して、遺伝子改変動物を得ることと
を含み得る。遺伝子改変が優性形質を示す遺伝子改変のみの場合には、遺伝子改変が複数であっても、上記（ｃ－１）では、片方の性別の個体を上記（ｂ）で得られた個体とし、もう片方の性別の個体は、他の個体とすることができる。この態様は、遺伝子改変が単一の場合を第四の実施形態として一例を図４を参照しながら後述する。
　以下、第一の実施形態として、遺伝子改変が１遺伝子の改変であり劣性形質を示す遺伝子改変である場合（図１参照）、第二の実施形態として、遺伝子改変が１遺伝子の改変であり優性形質を示す遺伝子改変である場合（図２参照）、第三の実施形態として、遺伝子改変が複数遺伝子の改変であり、劣性形質を示す遺伝子改変を含む場合（図３参照）、および、第四の実施形態として、遺伝子改変が複数遺伝子の改変であり、全ての遺伝子改変が優性形質を示す遺伝子改変である場合（図４参照）を順に説明する。図中、一例としてＰＲＤＭ１４－／－で説明をするが、これに限定されず、発明は、発生過程において自己の生殖細胞を欠損する動物胚（例えば、発生過程において自己の生殖細胞を欠損する細胞自律的な異常を有する動物胚）において成立するものと理解される。
第一の実施形態
　第一の実施形態では、遺伝子改変が劣性形質を示す単一の遺伝子改変である。第一の実施形態では、遺伝子改変が劣性であるから、この遺伝子改変をホモで有する遺伝子改変動物を得ることが目標となる。以下、劣性形質を示す遺伝子改変を有する遺伝子改変動物を得る方法の例として、第一の実施形態を説明する。なお、第一の実施形態では、Ｐｒｄｍ１４はその発現または活性が低下しており、これにより生殖細胞が欠失していればよいが、図１では、一例としてＰｒｄｍ１４ホモノックアウトの例が示されている。
　まず、上記（ａ）として、雄および雌の両方の胚を含むように、発生過程において自己の生殖細胞を欠損する動物胚（例えば、発生過程において自己の生殖細胞を欠損する細胞自律的な異常を有する動物胚、例えば、Ｐｒｄｍ１４の発現または活性を低下または欠失させた動物胚）を提供する。図１では、Ｐｒｄｍ１４がホモでノックアウトされた雄と雌の動物胚を提供する例が示されている。上記（ａ）において雄と雌を含むように胚を提供する理由は、上記（ｃ）において、上記胚から得られた雄と雌とを交配させることが必要であるためである。Ｐｒｄｍ１４は常染色体上に位置するため、例えば、Ｐｒｄｍ１４ヘテロノックアウト動物同士を交配させれば、均等に雄と雌とが得られることとなる。
　次に、上記（ｂ）として、得られた動物胚を宿主動物の母胎中で発生させて個体を得る。宿主動物は、胚と同種の偽妊娠仮親とすることができ、得られた動物胚を宿主動物の母胎中で発生させる方法は、当業者に周知の方法により実施することができる。個体は、帝王切開手術または分娩により得ることができる。
　さらに上記（ｃ－２）として、上記（ｂ）により得られた雄と雌とを交配させて、遺伝子改変動物を得る。上記（ｂ）では、雄も雌も生殖細胞はほぼ１００％が遺伝子改変をホモで有する個体が得られるので、得られた雄と雌とを交配させれば、ほぼ１００％の確率で遺伝子改変をホモで有する遺伝子改変動物を得ることができる。遺伝子改変が劣性形質を示す場合には、遺伝子改変をホモで有する遺伝子改変動物を得る必要があるが、第一の実施形態では、このような動物がほぼ１００％の確率で得られることとなり有利である。
第二の実施形態
　以下、図２ＡおよびＢを参照しながら、第二の実施形態について説明する。図２ＡおよびＢでは、遺伝子改変の例としてトランスジェニック（ＴＧ）の例が示されているが、必ずしもＴＧである必要は無く、優性形質を示す遺伝子改変であれば、例えば、ハプロ不全である遺伝子の破壊であってもよい。
　まず、上記（ａ）として、発生過程において自己の生殖細胞を欠損する動物胚（例えば、発生過程において自己の生殖細胞を欠損する細胞自律的な異常を有する動物胚、例えば、Ｐｒｄｍ１４の発現または活性を低下または欠失させた動物胚）を提供する。動物胚は、雄若しくは雌またはその両方とすることができる。第二の実施形態において（ａ）において雄および雌の少なくとも一方の動物胚を提供すればよい理由は、遺伝子改変が優性形質を示す場合には、目的の遺伝子改変動物は、遺伝子改変を父方および母方の染色体の少なくとも一方に有していればよいため、（ｃ－１）において、交配させる一方の性の個体が生殖細胞として遺伝子改変を有する生殖細胞を有していれば十分であるからである。従って、（ｃ－１）における他の個体は任意の個体とすることができる。優性形質を示す遺伝子改変をホモで有する多能性細胞は、特に限定されないが例えば、多能性細胞の特定遺伝子または遺伝子座の遺伝子改変により得ることができる。（ｂ）については、第一の実施形態と同じであるため説明は省略する。
第三の実施形態
　以下、図３を参照しながら、第三の実施形態について説明する。図３では、一例として劣性形質を示す遺伝子改変を２つ有し、かつ、優性形質を示す遺伝子改変を１つ有する場合が例示されている。すなわち、第三の実施形態は、第一の実施形態と第二の実施形態との組合せに相当するものである。図３ではまた、劣性形質を示す遺伝子改変の例として、ノックアウトが例示され、優性形質を示す遺伝子改変の例としてトランスジェニックが例示されているが、第一の実施形態および第二の実施形態において説明されたように、それぞれ劣性形質を示し、優性形質を示す限りこれらに限定されない。
　（ａ）は、第一の実施形態と同様である。すなわち、まず、上記（ａ）として、雄および雌の両方の胚を含むように、発生過程において自己の生殖細胞を欠損する動物胚（例えば、発生過程において自己の生殖細胞を欠損する細胞自律的な異常を有する動物胚、例えば、Ｐｒｄｍ１４の発現または活性を低下または欠失させた動物胚）を提供する。この理由は、目的の遺伝子改変動物が、劣性形質を示す遺伝子改変に関してはホモで有さなければならないため、（ｃ－２）として、当該遺伝子改変をホモで有する生殖細胞を有する雄と雌とを交配させる必要があるためである。
　第三の実施形態における特徴は、（ａ）において動物胚に導入する多能性細胞は、雄および雌のどちらに導入する多能性細胞も、劣性形質を示す遺伝子改変をホモで有することが必要であるが、優性形質を示す遺伝子改変については、雄および雌の少なくとも一方のみがホモで有していればよい点である。優性形質を示す遺伝子改変については、雄および雌の両方がホモで有していてもよい。
　そして、（ｃ－２）において、雄および雌のどちらもその生殖細胞は劣性形質を示す遺伝子改変をホモで有し、かつ、その生殖細胞は雄または雌のどちらかが優性形質を示す遺伝子改変をホモで有する。このようにすることで、図３に示されるように、劣性形質を示す遺伝子は、必ず交配後得られる産仔ではホモで有することになり、優性形質を示す遺伝子は、交配後得られる産仔で少なくともヘテロで有することになって、目的の遺伝子改変を有する遺伝子改変動物をほぼ１００％の確率で得ることができる。
第四の実施形態
　以下、図４ＡおよびＢを参照しながら、第四の実施形態を説明する。第四の実施形態は、優性形質を示す遺伝子改変を複数有する遺伝子改変動物を得ること以外は、第二の実施形態と同一である。従って、各工程についての説明は省略する。
　図４Ａは、図２のＡに対応する図のみを示しているが、図２Ｂに対応する実施形態も、第四の実施形態には含まれる。遺伝子改変が複数になった点が相違し、それ以外は第二の実施形態と同一であることが理解される。
　図４Ｂは、２つの遺伝子改変を別々の多能性細胞にそれぞれ導入し、雄と雌とを交配させて、２つの遺伝子改変をヘテロで有する遺伝子改変動物を作製するスキームを示すものである。図４Ｂでは、目的遺伝子Ａの遺伝子改変を有する精子については、図２Ａに対応する工程により、目的遺伝子Ｂの遺伝子改変を有する卵子については図２Ｂに対応する工程により作製することができる。この態様では、目的遺伝子ＡとＢとは別の染色体上に位置するものとすることが好ましく、または、離れた遺伝子座に位置するものとすることが好ましい。この態様においては、（ｃ－１）において、他の個体は、別の目的遺伝子改変を父方の染色体および母方の染色体の両方に有する多能性細胞をＰｒｄｍ１４遺伝子の発現または活性を低下または欠失させた動物胚に導入する（ａ）と（ｂ）により得られた個体である。
変形例
　以下、変形例を説明する。この変形例は、（ａ）において、Ｐｒｄｍ１４の発現または活性が低下した形態であり、完全に消失していない場合を想定するものである。この変形例においては、第一の実施形態から第四の実施形態までのいずれの形態の変形例も可能であるが、まず、最初に、第二および第四の実施形態の変形例について以下説明する。
　（ａ）においてＰｒｄｍ１４の発現または活性が欠失した場合には、図８に示されるように生殖細胞のほぼ全てがＲＨＴ－ＥＳ細胞に由来した。そのため、目的の遺伝子改変を有する多能性細胞をＲＨＴ－ＥＳ細胞の代わりに胚に導入すれば、ほぼ全ての生殖細胞が、目的の遺伝子改変を有することになるということが、上記第一から第四の実施形態における利点であり、（ｃ－１）または（ｃ－２）においてほぼ１００％の確率で目的の遺伝子改変の表現型を示す遺伝子改変動物を得ることができる。
　変形例では（ａ）において、Ｐｒｄｍ１４の発現または活性が完全には消失していない動物胚を用いる。このような動物胚の一例として、例えば、Ｐｒｄｍ１４＋／－の動物胚およびＰｒｄｍ１４ノックダウン胚などのＰｒｄｍ１４改変胚を用いることができる。Ｐｒｄｍ１４ノックダウン胚は、当業者に周知のＲＮＡ干渉を用いた方法により容易に作製することができる。
　例えば、後述する実施例に記載するように、Ｐｒｄｍ１４＋／－の動物胚に、ＲＨＴ－ＥＳ細胞を導入すると、生殖細胞のうちの約１６％程度がＲＨＴ－ＥＳ細胞に由来する生殖細胞であった。すなわち、Ｐｒｄｍ１４は、完全にその発現または活性が消失していなくてもよく、部分的に発現や活性が低下していれば、胚に導入した多能性細胞が生殖細胞に寄与する余地を与えることとなる。
　そしてそのようにして得られた、少なくとも一部の生殖細胞は、遺伝子改変をホモで有する生殖細胞で構成されることとなり、別の性の配偶子と交配させることにより、一定確率で目的遺伝子をヘテロで有する遺伝子改変動物を得ることができる。
　変形例は、第一から第四の実施形態に比べると、目的の遺伝子改変動物を得る確率が低い点で不利であるようにも思われる。しかしながら、従来の方法と比較すると、従来の方法では遺伝子改変を有する多能性細胞は、動物胚に導入され、該動物胚からキメラマウスを取得して、キメラマウスの内、キメラ率の高いマウスを選択して野生型マウスと交配させ、Ｆ１として目的の遺伝子改変動物を得る。しかし、従来法では、第一世代において、目的の遺伝子改変を有する細胞の生殖細胞への寄与が実質的に確認できない個体が多く、また、仮に生殖細胞に寄与した個体が見出されたとしても、生殖細胞に占める遺伝子改変を有する生殖細胞の割合が低く、実用上は、キメラ個体を選別する第一のスクリーニング工程と、キメラ個体を交配させて得られる産仔から目的の遺伝子改変動物を選別する第二のスクリーニング工程の２回のスクリーニング工程が必要であり、作業が繁雑であった。これに対して、本発明の変形例では、第一世代の生殖細胞は実質的な割合で全ての第一世代のマウスに組込まれるため、第一のスクリーニング工程を省略することができ、かつ第二のスクリーニングも、目的の遺伝子改変を有する遺伝子改変動物が安定して一定の割合（例えば、ヘテロノックアウトですら約１６％）で含まれることから、容易である。また、Ｐｒｄｍ１４の発現または活性をより強く低下させれば、より効率よく目的の遺伝子改変を有する遺伝子改変動物が得られる。
　次に、第一および第三の実施形態の変形例について以下説明する。この変形例では、（ａ）において、Ｐｒｄｍ１４の発現または活性が低下した形態であり、完全に消失していないこと以外は、第一および第三の実施形態の説明と同一であるので、第一および第三の実施形態を参照し、説明は省略する。また、変形例における（ａ）については、上記第二および第四の実施形態の変形例と同一であるため、上記第二および第四の実施形態の変形例を参照し、説明は省略する。以下では、従来法との対比を行い、本変形例の特徴を説明する。
　従来法では、目的遺伝子が劣性形質を示す遺伝子である場合であっても、多能性細胞としては目的遺伝子の遺伝子改変をヘテロで有する多能性細胞を動物胚に導入して、第一世代の個体（キメラ個体）を得た。キメラ個体のうち、一部の個体は生殖系列に導入した多能性細胞か寄与しているので、これを選別した上で、野生型と交配し、全身の細胞が目的遺伝子の遺伝子改変をヘテロで有する細胞からなる第二世代の個体を得ていた。そして、さらに第二世代の個体同士を交配させることで、メンデルの遺伝法則に従い、４分の１の確率で目的の遺伝子改変をヘテロで有する遺伝子改変動物を第三世代として得ていた。
　これに対して、本発明の変形例では、第一世代では、得られた精子または卵子には、必ず目的遺伝子の遺伝子改変をヘテロで有する多能性細胞が一定割合で寄与するので、キメラ個体を選別する作業は不要であり、省略することができるという利点を有する。第二世代と第三世代の交配については従来法と同様に行うことができる。
　あるいは、本発明の変形例の別の態様では、第一世代において、多能性細胞が生殖細胞に一定割合で必ず寄与するので、第一世代同士を掛け合わせることで第二世代として一定確率で目的の遺伝子改変をヘテロで有する遺伝子改変動物を得ることが可能である。このようにすると、第三世代までの交配が不要であり、遺伝子改変動物を容易に得ることができる。
　このように、いずれの実施形態およびその変形例においても、従来法よりも遙かに簡便に目的遺伝子の遺伝子改変動物を得ることが可能となる。
　本発明の別の側面では、遺伝子改変動物の製造における生殖細胞欠損動物胚の使用が提供される。生殖細胞欠損動物胚には、例えば、所望の遺伝子改変を施した細胞を第一から第四の実施形態およびその変形例で示した通りに導入して、所望の遺伝子改変を有する遺伝子改変動物を製造することができる。
　以下、実施例によって発生過程において自己の生殖細胞を欠損する動物胚（例えば、発生過程において自己の生殖細胞を欠損する細胞自律的な異常を有する動物胚、例えば、Ｐｒｄｍ１４の発現または活性を低下させた動物胚）に、野生型の正常なＥＳ細胞を導入すると、前記動物胚を発生させて得られる個体の生殖細胞がすべて導入したＥＳ細胞で占有されることを示す。
実施例１：Ｐｒｄｍ１４ヘテロノックアウト動物およびノックアウト胚の作製
　本実施例では、Ｐｒｄｍ１４ヘテロノックアウトマウス（Ｐｒｄｍ１４＋／－）およびノックアウト胚（Ｐｒｄｍ１４－／－）を作製した。
Ｐｒｄｍ１４ヘテロノックアウトマウスの作製
　Ｃ５７ＢＬ６、ＢＤＦ１、およびＩＣＲは日本ＳＬＣから購入した。ｈＣａｓ９発現プラスミド（addgene 41815. Mali et al. Science., 339:823-826,2013）、およびガイドＲＮＡ発現ベクター（addgene 41823. Mali et al. Science., 339:823-826,2013） にマウスＰｒｄｍ１４の配列（配列番号１、そのアミノ酸配列が配列番号２）を組み込んだプラスミド（図６参照）をそれぞれ１０ｎｇ／μｌの濃度で含む溶液を顕微鏡下でマイクロマニピュレーターを用いてＢＤＦ１×Ｃ５７ＢＬ６由来の前核期胚の前核へ注入した。胚を回収しＫＳＯＭ-ＡＡ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製）で１日培養し２細胞期まで発生した胚を交配後０．５日目の偽妊娠ＩＣＲ系統マウスの卵管へと移植した。出産から３週後に耳の一部を採取し５０ｍＭ　ＮａＯＨ　９０μｌ中で９５℃、１０分間処理した後１Ｍ　Ｔｒｉｓ　ＨＣｌ（ｐＨ８．０）で中和しゲノムＤＮＡ溶液を採取した。得られたゲノムＤＮＡ溶液をＴＫＳ　ＧＦｌｅｘ（ＴＡＫＡＲＡ）とＰｒｄｍ１４フォワードプライマー：TACAATCTGCCCTGGTACAA（配列番号３）、Ｐｒｄｍ１４リバースプライマー：AGAACTCTCTGTGGGAACCA（配列番号４）を用いてGene Amp PCR system 9700(Applied Biosystems;AB)によりＰＣＲ反応を行った。ＰＣＲ産物からWizard SV Gel and PCR Clean-Up System (Promega)によりＤＮＡを精製したのち、ＦＡＳＭＡＣ社により提供される受託シークエンスサービスを利用して標的部位のＤＮＡ配列を解析した。その結果、２種のＰｒｄｍ１４変異型が得られた（図７中の＃１および＃４を参照）。
ＥＳ細胞の調製
　ＥＳ細胞は、マウスＢ６ ＥＳ細胞のＲＯＳＡ２６遺伝子座にヒストンＨ２ＢとｔｄＴｏｍａｔｏ（赤色蛍光タンパク）を融合させたタンパク質をコードするＤＮＡ配列を発現可能に含むベクターをエレクトロポレーション法によりノックインして作製した（例えば、Molecular Reproduction and Development, Volume 82, Issue 12, pages 916-917, 2015参照）。このＥＳ細胞（以下、ＲＨＴ－ＥＳ細胞という）は、赤色蛍光を指標として移植した他の動物中でその存在部位、分布を可視化することが可能である。
　ＲＨＴ－ＥＳ細胞は、ゼラチンコートを施したディッシュにて、Glagow's Modified Eagle's Medium(GMEM;Sigma,St.Louis,MO)に、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ；Ｎｉｃｈｉｒｅｉ）、０．１ｍＭ ２-メルカプトメタノール（Ｉｎｖｉｔｏｒｏｇｅｎ）、０．１ｍＭ非必須アミノ酸（Ｉｎｖｉｔｏｒｏｇｅｎ）、１ｍＭ ピルビン酸ナトリウム塩（Ｉｎｖｉｔｏｒｏｇｅｎ）、１％ Ｌ－グルタミン－ペニシリン－ストレプトマイシン（Ｓｉｇｍａ）、1,000 U/ml leukiemia inhibitory factor (LIF; Millipore)を添加した培地で培養した。なお、当然のことであるが、ＲＨＴ－ＥＳ細胞は、Ｐｒｄｍ１４遺伝子に関しては正常である。
胚盤胞注入法を用いたキメラマウスの作製
　図７に示される変異型＃１と＃４の個体を交配させ、交配後２．５日目に桑実胚を卵管と子宮還流により採取し、ＫＳＯＭ-ＡＡにより１日培養してノックアウト胚（Ｐｒｄｍ１４－／－）を胚盤胞として得た。
　顕微鏡下でマイクロマニピュレーターを用いてＲＨＴ－ＥＳ細胞を１個の胚盤胞に対して約５個の割合で、腔へ注入した。胚の回復を待った後、交配後２．５日目の偽妊娠ＩＣＲ系統マウスの子宮へと移植し、移植後１１日目（胎齢１３．５日目、「Ｅ１３．５」ともいう）に帝王切開し、胎仔を取り出した。得られた胎仔を蛍光顕微鏡下で観察しキメラ形成の判定を行った。
フローサイトメーターを用いたキメラ形成率の測定とＰｒｄｍ１４ノックアウトマウスの判定
　ＲＨＴ－ＥＳ細胞に組込まれたｔｄＴｏｍａｔｏに起因する赤色蛍光から、ＲＨＴ－ＥＳ細胞とＰｒｄｍ１４－／－細胞とのキメラであることが確認されたＥ１３．５マウス胚から胎児繊維芽細胞（ＭＥＦ）、血球細胞、および生殖細胞を取り分けた。具体的には、臓器を含まない胚体をハサミで細切後、０．０２５％トリプシン－ＥＤＴＡ（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）によって３７℃で１０分間処理することで、ＭＥＦを得た。また、生殖堤をハサミで細切後、０．０２５％トリプシン－ＥＤＴＡ（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）によって３７℃下で１０分間処理することで、生殖細胞を含む細胞懸濁液を得た。さらに、肝臓をピペッティングにより解離することで、血球細胞を含む細胞懸濁液を得た。
　上記で得られた血球細胞を含む細胞懸濁液にマウス抗ＣＤ４５－ＰＥ－Ｃｙ７抗体（ｅＢｉｏ社製）、生殖細胞を含む細胞懸濁液に抗ＳＳＥＡ１－ＡＰＣ抗体（ｅＢｉｏ社製）をそれぞれ０．５μｌ加え、遮光した氷上で３０分間静置した。血球細胞、ＭＥＦ、および生殖細胞それぞれをＰＢＳ（ｓｔａｉｎｉｎｇ　ｍｅｄｉｕｍ；ＳＭ）で洗浄後、１μｇ／ｍｌヨウ化プロピジウム（Ｐｒｏｐｉｄｉｕｍ　ｉｏｄｉｄｅ；ＰＩ）を含んだＰＢＳで再懸濁し、ＦＡＣＳＡｒｉａ　ＩＩ（ＢＤ　Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）と解析ソフトウェア、Ｆｌｏｗ－ｊｏを用いて解析した。
　また、残りのＭＥＦ懸濁液をＦＡＣＳＡｒｉａ　ＩＩを用いてｔｄＴｏｍａｔｏ陰性細胞を分取し、上記と同様に変異配列解析をした。
　その結果、図８に示されるように、Ｐｒｄｍ１４－／－胚にＲＨＴ－ＥＳ細胞を導入して得た胚では、ＳＳＥＡ１発現細胞（すなわち、生殖細胞）におけるｔｄＴｏｍａｔｏ発現細胞の割合が９９．６％であり、生殖細胞は実質的にＲＨＴ－ＥＳ細胞に由来する細胞により占有されていた。すなわち、Ｐｒｄｍ１４－／－胚にＲＨＴ－ＥＳ細胞を導入して得た胚では、ＲＨＴ－ＥＳ細胞は、正常に生殖系列に分化し、生殖堤に移動し、始原生殖細胞に特徴的なＳＳＥＡ－１陽性の特徴を示すことが明らかとなると共に、生殖細胞のほぼ全てがＲＨＴ－ＥＳ細胞からなることが明らかとなった。また、陰性対照としての野生胚に野生型ＥＳ細胞を導入して得た胚では、ＳＳＥＡ１発現細胞におけるＥＳ細胞由来細胞の割合は０．０５７％と非常に低かった。その一方で、Ｐｒｄｍ１４＋／－胚にＲＨＴ－ＥＳ細胞を導入して得た胚では、ＳＳＥＡ１発現細胞におけるｔｄＴｏｍａｔｏ発現細胞の割合はＰｒｄｍ１４遺伝子野生型の胚を用いたときと同等かそれ以上（例えば、１６．１％）であった。Ｐｒｄｍ１４＋／－胚を用いると、生殖細胞において胚由来の細胞とＲＨＴ－ＥＳ細胞由来の細胞とが混在し、かつＲＨＴ－ＥＳ細胞の寄与することができた。
　なお、図９に示されるように上記で得られるＰｒｄｍ１４－／－胚は、生殖細胞を欠失することが確認された。
　このように、Ｐｒｄｍ１４－／－胚にＥＳ細胞を導入すると、得られた胚における生殖細胞は、導入したＥＳ細胞により占有されることが明らかとなった。
　特定の遺伝子型を有するＥＳ細胞をＰｄｘ１＋／＋、Ｐｒｄｍ１４－／－胚に導入して、当該遺伝子型が後代に受け継ぐことができることを確認した。実験は、図１０Ａに示されるように、Ｐｄｘ１－／－、Ｐｒｄｍ１４＋／＋のＥＳ細胞（雌性）をＰｄｘ１＋／＋、Ｐｒｄｍ１４－／－胚（雌性）に移植し、キメラマウスを作製した。得られたキメラマウスを野生型マウスと交配し、得られた仔のＰｄｘ１遺伝子型を確認した。上記の実施例の結果を考慮すると、キメラマウスの生殖細胞は、Ｐｄｘ１－／－、Ｐｒｄｍ１４＋／＋の生殖細胞により占有されるので、このキメラマウスと野生型マウスとを交配させると、得られる個体の遺伝子型はすべてＰｄｘ１－／＋となると予想される。一方、キメラマウスの生殖細胞に胚由来のＰｄｘ＋／＋細胞が混入している場合、交配により得られる個体にはＰｄｘ１＋／＋とＰｄｘ１＋／－の遺伝子型が混在して観察されることになる。交配して得られた１１の個体のＤＮＡを抽出し、Ｐｄｘ１遺伝子型を決定した。結果は、図１０Ｂに示される通りであった。
　Ｐｄｘ１の遺伝子型を判定するためのＰＣＲに用いたプライマーは既報のものと同じである（Ｋｏｂａｙａｓｈｉ　ｅｔ　ａｌ．，　Ｃｅｌｌ　２０１０，　１４２（５）　７８７－７９９）。野生型Ｐｄｘ１は、４０５ｂｐ（黒い矢じりの位置）にＰｄｘ１のバンドが観察され、変異型Ｐｄｘ１は、白い矢じりの位置にＰｄｘ１のバンドが観察される。交配して得られた個体の遺伝子型は、全て野生型と変異型を有するＰｄｘ１－／＋となっていることが確認された。
　このように、実施例１の結果から、Ｐｄｒｍ１４ノックアウト動物に、野生型Ｐｄｒｍ１４を有する多能性細胞を導入すると、導入多能性細胞から生殖細胞がなる個体を得ることができることが明らかになった。実施例１の結果からはまた、ＥＳ細胞を導入したＰｒｄｍ１４－／－胚（雄および雌）を成長させて交配させれば、ＥＳ細胞に由来する遺伝子を有する個体を高効率で得ることができる。
　本実施例では、遺伝子型が後代に受け継がれることの確認のため、キメラ動物と野生型動物とを交配させて遺伝子型を調べた。しかし、交配させる野生型動物に変えて、所望の遺伝子型を有する生殖細胞を有する動物をキメラ動物と交配させることにより、交配により得られる動物の遺伝子型を所望の遺伝子型にすることができる。
　発明者らは、この原理を活用して、高められた効率で、例えば、ほぼ１００％の確率で遺伝子改変を有する生殖細胞（精子または卵子）を得る方法、簡便に遺伝子改変を有する生殖細胞を得る方法、および簡便に目的の遺伝子改変を有する遺伝子改変動物を得る方法を考案した。

Claims (13)

  1. 　目的の遺伝子改変を有する遺伝子改変動物を作成する方法であって、
    　（ａ）目的の遺伝子改変を父方の染色体および母方の染色体の両方に有する多能性細胞を、発生段階において自己の生殖細胞を欠損する動物胚に導入することを含む、方法。
  2. 　発生段階において自己の生殖細胞を欠損する異常が、Ｐｒｄｍ１４遺伝子若しくは当該遺伝子によりコードされるタンパク質の発現若しくは活性の低下または欠失である、請求項１に記載の方法。
  3. 　請求項１または２に記載の方法であって、遺伝子改変が優性形質を示し、
    　（ｂ）得られた動物胚を宿主動物の母胎中で発生させて個体を得ることと、
    　（ｃ－１）得られた個体を他の個体と交配して、遺伝子改変動物を得ることと
    をさらに含む、方法。
  4. 　遺伝子改変が、１または複数の遺伝子改変を含み、全ての遺伝子改変が優性形質を示す、請求項３に記載の方法。
  5. 　請求項１または２に記載の方法であって、遺伝子改変が劣性形質を示す遺伝子改変を含み、
    　（ｂ）得られた動物胚を宿主動物の母胎中で発生させて個体を得ることと、
    　（ｃ－２）得られた雄の個体と得られた雌の個体とを交配して、遺伝子改変動物を得ることと
    をさらに含む、方法。
  6. 　目的の遺伝子改変が、１または複数の遺伝子改変を含むものである、請求項４に記載の方法。
  7. 　請求項５に記載の方法であって、
    　目的の遺伝子改変が、優性形質を示す遺伝子改変と劣性形質を示す遺伝子改変を含み、
    　方法は、
    　（ｃ－２）において、雄および雌のどちらも劣性形質を示す遺伝子改変をホモで有し、かつ、雄または雌のどちらかが優性形質を示す遺伝子改変をホモで有する、方法。
  8. 　請求項３に記載の方法であって、遺伝子改変がハプロ不全の形質を示す遺伝子改変である、方法。
  9. 　請求項３に記載の方法であって、遺伝子改変が外来遺伝子の導入である、方法。
  10. 　請求項５に記載の方法であって、遺伝子改変がノックアウトである、方法。
  11. 　目的の遺伝子改変を有する生殖細胞を作製する方法であって、
    　目的の遺伝子改変を父方の染色体および母方の染色体の両方に有する多能性細胞を、発生段階において自己の生殖細胞を欠損する動物胚に導入すること、
    を含む、方法。
  12. 　発生段階において自己の生殖細胞を欠損する動物胚が、Ｐｒｄｍ１４遺伝子の発現若しくは活性を低下または欠失させた動物胚である、請求項１１に記載の方法。
  13. 　遺伝子改変動物の製造における、生殖細胞欠損動物胚の使用。
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