WO2019225638A1 - 融合タンパク質、核酸、細胞及び動物の製造方法 - Google Patents

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文博 杉山
高橋　智
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    • C12N2310/20—Type of nucleic acid involving clustered regularly interspaced short palindromic repeats [CRISPRs]

Definitions

  • the present invention relates to a method for producing fusion proteins, nucleic acids, cells and animals.
  • Knockout mice in which only a specific gene is invalidated and knockin mice (hereinafter also referred to as “KI”) in which a foreign gene is introduced into a specific locus. Since gene function can be directly evaluated in vivo, it is used in many medical and life science researches.
  • KO mice and KI mice have been produced by a gene targeting method using embryonic stem (Embryonic Stem, hereinafter sometimes referred to as “ES”) cells.
  • ES embryonic stem
  • a target gene can be KOed by introducing an artificial restriction enzyme that recognizes only a specific DNA sequence and cuts only that site. It is also possible to KI a foreign gene at its target locus by introducing a donor DNA, in which a foreign gene to be introduced is inserted between sequences near the cleavage site, into the cell simultaneously with the artificial restriction enzyme.
  • CRISPR-Cas9 Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats-CRISPR Associated Protein 9
  • CRISPR-Cas9 CRISPR-Cas9 derived from Streptococcus pyogenes (hereinafter sometimes referred to as “Sp”) is simple and efficient. It has been used in many studies to have the ability to cut.
  • the Sp-CRISPR-Cas9 system mainly consists of a single guide RNA (hereinafter sometimes referred to as “sgRNA”) having a function of recognizing a target sequence and a Cas9 protein mainly having a function of cleaving the target sequence.
  • sgRNA single guide RNA
  • Cas9 protein mainly having a function of cleaving the target sequence.
  • RNA-protein complex By introducing these sgRNA and Cas9 protein simultaneously into a mouse fertilized egg, a KO mouse can be obtained.
  • the region can be excised from the chromosome (excised KO).
  • NHEJ non-homologous end-joining
  • HDR Homology-directed Repair
  • Non-Patent Document 1 discloses a fusion protein in which a part of human Geminin protein is linked to Cas9 (hereinafter sometimes referred to as “SpCas9-hGem”), and a part of human Cdt1 protein to Cas9. It is described that a fusion protein (hereinafter sometimes referred to as “SpCas9-hCdt1”) was produced.
  • Non-Patent Document 1 SpCas9-hGem is decomposed into 1 phase G
  • SpCas9-hCdt1 the S / G that is decomposed into two terms are described (non-patent document 1, Fig.1C, etc.).
  • Non-patent document 1 also shows that the KI efficiency by SpCas9 at the DNMT3B locus is 17.1%, the KI efficiency by SpCas9-hGem is 16.5%, and the KI efficiency by SpCas9-hCdt1 is 9. It is described that it was 9% (Non-Patent Document 1, FIG. 2C, etc.).
  • an object of the present invention is to provide a modified Cas9 that improves KO efficiency and KI efficiency.
  • a fusion protein comprising a Cas9 protein and a modified peptide that modifies the Cas9 protein, wherein the modified peptide is a peptide consisting of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 29, or the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 29
  • the modified peptide comprises a peptide consisting of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 1, or an amino acid sequence in which one or several amino acids are deleted, substituted or added in the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 1. And a peptide having an activity of localizing the Cas9 protein in the nucleus by forming a fusion protein with the Cas9 protein.
  • the modified peptide consists of a peptide consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2, or an amino acid sequence in which one or several amino acids are deleted, substituted or added in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2, and further comprising a peptide having an activity to decompose the Cas9 protein G 1 phase by forming a fusion protein with the Cas9 protein, a fusion protein according to [1] or [2].
  • the fusion protein according to any one of [1] to [3], wherein the modified peptide is arranged at the N-terminal, C-terminal, or a site other than the N-terminal or C-terminal of the Cas9 protein.
  • [5] A nucleic acid encoding the fusion protein according to any one of [1] to [4].
  • [6] A method for producing a cell in which genomic DNA is edited, comprising contacting the fusion protein according to any one of [1] to [4] with genomic DNA in the cell. [7] The production method according to [6], wherein the cell is a fertilized egg. [8] Contacting the fusion protein according to any one of [1] to [4] with genomic DNA in a fertilized egg to obtain a fertilized egg in which the genomic DNA is edited; and fertilization in which the genomic DNA is edited A method for producing an animal with edited genomic DNA, comprising growing an egg into an individual to obtain an animal with edited genomic DNA.
  • (A) is a diagram in which the first to 110th amino acid sequences of human Geminin protein and the first to 107th amino acid sequences of mouse Geminin protein are arranged.
  • (B) is a diagram in which the 30th to 120th amino acid sequences of human Cdt1 protein and the 29th to 132nd amino acid sequences of mouse Cdt1 protein are arranged.
  • the upper part of (c) is a schematic diagram showing the structure of the pX330 vector, the middle part is a schematic diagram showing the structure of the pX330-mG vector, and the lower part is a schematic diagram showing the structure of the pX330-mC vector.
  • (A) to (d) are fluorescence micrographs showing the results of immunostaining in Experimental Example 2.
  • FIG. (A) is a schematic diagram explaining the excision method of the Tyr gene in Experimental Example 3.
  • FIG. (B) and (c) are photographs showing representative mice obtained in Experimental Example 3. It is a schematic diagram explaining the excision method of Dmd gene in Experimental example 4.
  • (A) is a schematic diagram showing the structure of the wild-type ROSA26 gene locus.
  • (B) is a schematic diagram showing the structure of the pRosa-CAG-fEGFP-Cables1 donor DNA plasmid used in Experimental Example 5.
  • FIG. (C) is a schematic diagram showing the structure of the ROSA26 gene locus when a target knock-in occurs in Experimental Example 5.
  • FIG. (A) is a schematic diagram showing the structure of the wild-type Prdm14 locus.
  • FIG. (B) is a schematic diagram showing the structure of the pflox-Prdm14 donor DNA plasmid used in Experimental Example 6.
  • FIG. (C) is a schematic diagram showing the structure of the Prdm14 locus when a target knock-in occurs in Experimental Example 6.
  • FIG. (A) to (c) are fluorescence micrographs showing the results of immunostaining in Experimental Example 7.
  • (A) is a schematic diagram showing the structure of the pX330-mC vector.
  • (B) is a schematic diagram showing the structure of the pX330-pFmC vector.
  • C) is a schematic diagram showing the structure of the pX330-pCmC vector.
  • (D) is a schematic diagram showing the structure of the pX330-pMmC vector.
  • (E) is a schematic diagram showing the structure of the pX330-pNmC vector.
  • (F) is a schematic diagram showing the structure of the pX330-pNNmC vector.
  • (G) is a schematic diagram showing the structure of the pX330-pNCmC vector. It is a fluorescence micrograph which shows the result of the immuno-staining in Experimental example 9.
  • (A) is a photograph showing the results of detecting each Cas9 fusion protein with an anti-FLAG antibody in Experimental Example 10.
  • (B) is a photograph showing the results of detecting each Cas9 fusion protein with anti-Cas9 antibody in Experimental Example 10.
  • FIG. 6 is a fluorescence micrograph showing the results of immunostaining in Experimental Example 11.
  • the present invention is a fusion protein comprising a Cas9 protein and a modified peptide that modifies the Cas9 protein, wherein the modified peptide is a peptide consisting of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 1, or SEQ ID NO: 1.
  • An activity that localizes the Cas9 protein in the nucleus by forming an amino acid sequence in which one or several amino acids are deleted, substituted, or added in the amino acid sequence according to 1, and forming a fusion protein with the Cas9 protein
  • a fusion protein comprising a peptide having:
  • Cas9 protein examples include those derived from Streptococcus pyogenes, Staphylococcus aureus, Streptococcus thermophilus, Geobacillus stearothermophilus, and the like. Among these, Cas9 (SpCas9) derived from Streptococcus pyogenes can be preferably used.
  • modified peptide that modifies Cas9 protein examples include a peptide having the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 1.
  • the peptide consisting of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 1 is a peptide consisting of the 29th to 132nd amino acid sequences of mouse Cdt1 protein.
  • Cdt1 is one of the licensing regulators that ensures that chromosome replication occurs exactly once in the cell cycle. Expression of Cdt1 is high in 1 phase G, the S-phase is known to be lower by ubiquitin dependent degradation.
  • Non-Patent Document 1 is decomposed into Cas9 and abundance of the fusion protein linked to a portion of human Cdt1 protein (SpCas9-Cdt1) shows the cell cycle-dependent, S / G 2 phase It is known.
  • the fusion protein of the present embodiment obtained by fusing a part of Cas9 and a part of mouse Cdt1 protein (hereinafter sometimes referred to as “Cas9-mC”), contrary to expectation, depends on the cell cycle. Sex was not confirmed, and it became clear that it was localized in the nucleus in any cell cycle. The localization to the nucleus was confirmed not only in mouse cells but also in human cells.
  • genome editing using Cas9-mC can produce a large-scale genome-deficient mouse having several tens of kilobase pairs to several megabase pairs with high efficiency and is difficult to produce. It was revealed that knock-in mice and flox mice can be produced with high efficiency.
  • the modified peptide is not limited to the peptide consisting of the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 1, and has a mutation as long as it has an activity of localizing the Cas9 protein in the nucleus by forming a fusion protein with the Cas9 protein. Also good.
  • it may be a peptide consisting of an amino acid sequence in which one or several amino acids are deleted, substituted or added in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1.
  • one or several may be, for example, 1 to 20, 1 to 15, 1 to 10, or 1 to 5 1 to 3 may be used.
  • the modified peptide that modifies Cas9 protein also has the activity of localizing Cas9 protein in the nucleus, even in the peptide consisting of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 29. Revealed.
  • the peptide consisting of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 29 is a peptide consisting of the 29th to 80th amino acid sequences of mouse Cdt1 protein.
  • the peptide consisting of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 29 is shorter than the peptide consisting of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 1. For this reason, the molecular weight of the fusion protein can be reduced. In addition, the size of the expression vector of the fusion protein can be reduced. Therefore, a fusion protein that is easier to use or a nucleic acid that encodes the fusion protein can be provided.
  • the modified peptide is not limited to the peptide consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 29, and has a mutation as long as it has an activity to localize the Cas9 protein in the nucleus by forming a fusion protein with the Cas9 protein. Also good.
  • it may be a peptide consisting of an amino acid sequence in which one or several amino acids are deleted, substituted or added in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 29.
  • one or several may be, for example, 1 to 20, 1 to 15, 1 to 10, or 1 to 5 1 to 3 may be used.
  • a peptide consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 a peptide consisting of an amino acid sequence in which one or several amino acids are deleted, substituted or added in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1
  • a peptide comprising an amino acid sequence, or a peptide comprising an amino acid sequence in which one or several amino acids have been deleted, substituted or added in the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 29 may be referred to as “mouse Cdt1-derived peptide”.
  • the modified peptide may further include a peptide consisting of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 2.
  • the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 is a peptide consisting of the 1st to 107th amino acid sequences of mouse Geminin protein.
  • Geminin is a licensing inhibitor that inhibits the binding of the licensing agent to the replication origin of the genome that has been replicated once in the S phase. It is known that the expression of Geminin is high in the S / G 2 / M phase, but decreases due to ubiquitin-dependent degradation when entering the G 1 phase.
  • a fusion protein obtained by fusing Cas9 and a part of mouse Geminin protein exhibits cell cycle dependency, and is from S phase to early G2 phase. the present in the cytoplasm, is degraded in early S from G 1 phase late.
  • the modified peptides and further comprises and a peptide comprising the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 2, the ubiquitin-dependent degradation can be decomposed into 1 phase G.
  • the ubiquitin-dependent degradation can be decomposed into 1 phase G.
  • it suppresses NHEJ activity in 1 phase G, when knock by genomic editing, it is possible to prevent the unintended Indel mutation is introduced.
  • Peptides further included in the modified peptide is not limited to a peptide having an amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 2, the Cas9 protein by forming a fusion protein with Cas9 proteins as long as they have activity to degrade to 1 phase G, It may have a mutation.
  • it may be a peptide consisting of an amino acid sequence in which one or several amino acids are deleted, substituted or added in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2.
  • one or several may be, for example, 1 to 20, 1 to 15, 1 to 10, or 1 to 5 1 to 3 may be used.
  • a peptide consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 and a peptide consisting of an amino acid sequence in which one or several amino acids are deleted, substituted or added in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 are referred to as “Geminin-derived peptide” "
  • the Geminin-derived peptide may have a partial amino acid sequence of human Geminin protein.
  • the position of the modified peptide is not particularly limited.
  • the position of the modified peptide may be the N-terminus of the Cas9 protein, the C-terminus, or a site other than the N-terminus or the C-terminus.
  • the mouse Cdt1-derived peptide and the Geminin-derived peptide may be adjacent to each other or may be separated from each other. Moreover, any of the mouse Cdt1-derived peptide and the Geminin-derived peptide may be arranged on the N-terminal side. That is, the Geminin-derived peptide may be arranged on the C-terminal side of the mouse Cdt1-derived peptide, or the mouse Cdt1-derived peptide may be arranged on the C-terminal side of the Geminin-derived peptide.
  • the position of the mouse Cdt1-derived peptide and the Geminin-derived peptide may be independently the N-terminus of the Cas9 protein, or It may be present, or may be a site other than the N-terminal or C-terminal.
  • the Geminin-derived peptide may be arranged at the N-terminus of the Cas9 protein, and the mouse Cdt1-derived peptide may be arranged at the C-terminus of the Cas9 protein.
  • the mouse Cdt1-derived peptide may be arranged at the N-terminus of the Cas9 protein, and the Geminin-derived peptide may be arranged at the C-terminus of the Cas9 protein.
  • one of the mouse Cdt1-derived peptide and the Geminin-derived peptide may be arranged at the N-terminal or C-terminal of the Cas9 protein, and the other may be arranged at the central portion.
  • the N-terminal may include the vicinity of the N-terminal.
  • the C terminal may include the vicinity of the C terminal. That is, even when the modified peptide is not adjacent to the first amino acid from the N-terminal side of the Cas9 protein, when the modified peptide is located near the N-terminus of the Cas9 protein, the position of the modified peptide is In some cases, it is the N-terminus of Cas9 protein.
  • the position of the modified peptide May be the C-terminus of the Cas9 protein.
  • the neighborhood may be, for example, a distance of 1 to 100 amino acids, a distance of 1 to 50 amino acids, or a distance of 1 to 30 amino acids, It may be a distance of 1-20 amino acids.
  • the position of the modified peptide may be a site other than the N-terminal or C-terminal of the Cas9 protein, for example, the central part of the Cas9 protein.
  • the fusion protein of this embodiment may have an additional peptide in addition to the Cas9 protein and the modified peptide as long as the effects of the present invention are obtained.
  • additional peptides include tag peptides such as FLAG tag, His ⁇ 6 tag, MYC tag, HA tag, and V5 tag; fluorescent proteins such as green fluorescent protein (GFP) and GFP derivatives; Examples thereof include peptides introduced in the course of gene recombination, such as peptides derived from, peptides derived from a part of primers; nuclear translocation signals (NLS) originally incorporated into vectors.
  • protein and “peptide” are used without being strictly distinguished, and may be referred to as a peptide or a protein depending on the number of amino acids.
  • the present invention provides a nucleic acid encoding the fusion protein described above.
  • the nucleic acid of this embodiment By introducing the nucleic acid of this embodiment into a cell, the above-described fusion protein can be expressed.
  • mRNA which codes the fusion protein mentioned above can be obtained by transcribe
  • the nucleic acid of this embodiment may be an expression vector.
  • the expression vector is not particularly limited, and examples thereof include a transposon vector, a viral vector, an episomal vector, and a plasmid vector.
  • the present invention provides a method for producing a cell in which genomic DNA is edited, comprising contacting the fusion protein described above with genomic DNA in the cell.
  • the above fusion protein is brought into contact with genomic DNA together with gRNA corresponding to the target sequence. More specifically, the above-described fusion protein can be brought into contact with genomic DNA in the cell by introducing it into the cell together with gRNA. As a result, DNA double-strand break (DSB) can be formed in the target sequence portion.
  • DSB DNA double-strand break
  • Examples of cells include ES cells, iPS cells, fertilized eggs, and cultured cells.
  • Examples of cultured cells include animal cells, insect cells, plant cells, yeast cells and the like.
  • a fertilized egg obtained by editing the genomic DNA is obtained.
  • an animal in which genomic DNA is edited can be obtained. It is not particularly limited as an animal, mammals such as mice, rats, sheep, pigs, monkeys, humans, birds such as chickens, amphibians such as Xenopus laevis, reptiles such as geckos, fish such as zebrafish and medaka, silkworms, etc. Insects.
  • the fusion protein and gRNA can be introduced into cells by lipofection, microinjection, electroporation, and the like.
  • the gRNA may be a complex of CRISPR RNA (crRNA) and trans-activated CRISPR RNA (tracrRNA), or may be a single gRNA (sgRNA) in which tracrRNA and crRNA are combined.
  • crRNA CRISPR RNA
  • tracrRNA trans-activated CRISPR RNA
  • sgRNA single gRNA
  • GRNA may be introduced into cells in the form of RNA, or may be introduced into cells in the form of an expression vector.
  • a method for preparing gRNA in the form of RNA include a method in which a construct in which a promoter such as T7 is added upstream of a nucleic acid fragment encoding gRNA and synthesized by an in vitro transcription reaction, a chemical synthesis method, and the like.
  • gRNA is chemically synthesized, chemically modified RNA may be used.
  • a plasmid vector or a viral vector that transcribes gRNA from a Pol III promoter such as H1 promoter or U6 promoter can be used as the expression vector.
  • gRNA When gRNA is expressed using an expression vector, gRNA may be expressed constantly or under the control of an expression-inducible promoter.
  • the fusion protein may be introduced into the donor cell in the form of an expression vector expressed from the Pol II promoter, or may be introduced into the donor cell in the form of a purified protein.
  • fusion protein expression vectors include transposon vectors, viral vectors, episomal vectors, plasmid vectors, and the like.
  • Indel mutation can be introduced in the process in which the formed DSB is repaired by NHEJ.
  • the region can be excised from the chromosome by simultaneously cleaving upstream and downstream of the target gene region using two different sgRNAs.
  • donor DNA may be introduced into cells together with the fusion protein and gRNA.
  • the donor DNA preferably has a 5 'homology arm region, a target base sequence region, and a 3' homology arm region.
  • DSB is repaired by homologous recombination repair (HDR) using donor DNA as a template, and the target nucleotide sequence region in donor DNA can be knocked in.
  • donor DNA can be knocked in by a method that does not depend on HDR, such as the PITCh method or the HITI method.
  • the present invention contacts the above-described fusion protein with genomic DNA in a fertilized egg to obtain a fertilized egg in which the genomic DNA is edited, and grows the fertilized egg in which the genomic DNA is edited into an individual. And obtaining an animal whose genome DNA has been edited, and a method for producing an animal whose genome DNA has been edited.
  • the process of obtaining a fertilized egg with edited genomic DNA is the same as that in the case of using a fertilized egg as a cell in the above-described method for producing a cell with edited genomic DNA.
  • a fertilized egg By growing this fertilized egg into an individual, an animal in which genomic DNA is edited can be obtained. Examples of animals include those described above.
  • the method of growing fertilized eggs whose genome DNA has been edited into individuals can be appropriately selected depending on the animal species. For example, in the case of a mammal, it can be grown into an individual by generating a fertilized egg whose genomic DNA has been edited by transplanting it into the oviduct or uterus of a temporary parent. In the case of birds, amphibians, reptiles, fishes, insects, etc., fertilized eggs whose genome DNA has been edited can be grown and cultured in an appropriate environment to be grown into individuals.
  • mice C57BL / J mice were purchased from Nippon Charles River. An ICR mouse (Charles River Japan) was used as a pseudopregnant mouse used for mouse preparation. The mice were housed in an environment with a light-dark cycle of room temperature 23.5 ° C. ⁇ 2.5 ° C., humidity 52.5 ° ⁇ 12.5%, light period 14 hours: dark period 10 hours.
  • the pX330 vector, pX330-mG vector, and pX330-mC vector were diluted to 5 ng / ⁇ L with sterilized distilled water and filtered through a PVDF membrane having a pore size of 0.22 ⁇ m.
  • Various donor vectors were diluted to 10 ng / ⁇ L with sterilized distilled water and filtered through a PVDF membrane having a pore size of 0.22 ⁇ m.
  • Each vector was microinjected into the male pronucleus of the pronuclear embryo. Fertilized eggs that survived 15 minutes to 2 hours after microinjection were transplanted into the oviducts of pseudopregnant mice and developed into individuals.
  • Genomic DNA was extracted and purified from the tip of a mouse tail of 0.5 mm or less using PI-200, a genome extraction device, and used for genotype analysis.
  • the KI allele and the flox allele were confirmed by PCR using PrimeSTAR GXL DNA Polymerase (TAKARA).
  • the KO allele was confirmed by PCR using AmpliTaq Gold 360 Master Mix (Thermo Fisher Scientific).
  • pX330 (Plasmid # 42230, Addgene) is a vector that can express both sgRNA and Cas9.
  • the structure of the pX330 vector is shown in the upper part of FIG.
  • sgRNA is expressed by the U6 promoter.
  • the SpCas9 protein is expressed by the CBh promoter.
  • the nuclear translocation signal (NLS) derived from SV40 virus is linked to the N-terminus and C-terminus of the SpCas9 protein.
  • a 3 ⁇ FLAG tag peptide is linked to the N-terminal side of the N-terminal side NLS.
  • An expression vector for Cas9 fusion protein was prepared based on the pX330 vector. More specifically, a fusion protein (hereinafter sometimes referred to as “Cas9-mG”) in which a peptide consisting of the first to 107th mouse-derived Geminin protein, not human, is linked to the C-terminus of the SpCas9 protein.
  • An expression vector (SEQ ID NO: 5, hereinafter sometimes referred to as “pX330-mG”) was prepared.
  • FIG. 1 (a) shows a diagram in which the first to 110th amino acid sequences of human Geminin protein (SEQ ID NO: 4) and the first to 107th amino acid sequences of mouse Geminin protein (SEQ ID NO: 2) are arranged.
  • the structure of the pX330-mG vector is shown in the middle part of FIG.
  • a vector that expresses a fusion protein (hereinafter sometimes referred to as “Cas9-mC”) in which a peptide consisting of the 29th to 132nd Cdt1 protein derived from a mouse rather than a human is linked to the C terminus of the SpCas9 protein (hereinafter, sometimes referred to as “Cas9-mC”) SEQ ID NO: 6, hereinafter, sometimes referred to as “pX330-mC”) was prepared.
  • FIG. 1 (b) shows a diagram in which the 30th to 120th amino acid sequences of human Cdt1 protein (SEQ ID NO: 3) and the 29th to 132nd amino acid sequences of mouse Cdt1 protein (SEQ ID NO: 1) are arranged.
  • the structure of the pX330-mC vector is shown in the lower part of FIG.
  • Cas9-mG mRNA, Cas9-mC mRNA, and Cas9 mRNA were prepared by transferring each expression vector prepared in Experimental Example 1 in an in vitro transcription reaction system.
  • Cas9-mG mRNA and Cas9-mC mRNA were respectively injected into the cytoplasm of mouse fertilized eggs obtained by microinsemination.
  • the same examination was performed on a fertilized egg injected with normal Cas9 mRNA and a fertilized egg injected with nothing.
  • the 3 ⁇ FLAG tag peptide is linked to the Cas9-mG protein, Cas9-mC protein, and normal Cas9 protein encoded by each vector prepared in Experimental Example 1. Therefore, Cas9-mG mRNA, Cas9-mC mRNA, Cas9-mG protein translated from Cas9 mRNA, Cas9-mC protein, and normal Cas9 protein injected into mouse fertilized eggs in this experimental example are each 3 ⁇ FLAG. A tag peptide is linked. Thus, each Cas9 protein can be detected by immunostaining using an anti-FLAG antibody.
  • FIG. 2 (a) to 2 (d) are fluorescence micrographs showing the results of immunostaining.
  • FIG. 2 (a) shows the results for Cas9-mG protein
  • FIG. 2 (b) shows the results for Cas9-mC protein
  • FIG. 2 (c) shows the results for normal Cas9 protein
  • FIG. 2 (d) Is a control that does not introduce anything.
  • Cas9-mG protein is not detected in the early S from G 1 phase late, it was confirmed that decomposed. Cas9-mG protein was detected as a dot-like signal in the cytoplasm from the S phase to the early G2 phase. As described above, the nuclear translocation signal of SV40 virus is bound to the N-terminal and C-terminal of the Cas9-mG protein used in this experimental example, but the translocation of Cas9 protein into the nucleus was not observed.
  • a completely excised Tyr gene mouse (excised KO mouse) was prepared using Cas9-mC.
  • a Tyr gene completely excised mouse was prepared by the same method except that ordinary Cas9 was used.
  • the Tyr gene controls the hair color of mice, and mice lacking the Tyr gene in both alleles show albino traits.
  • One allele-deficient mice do not show albino traits.
  • FIG. 3 (a) is a schematic diagram for explaining a method for excision of the Tyr gene.
  • “Tyr-G5F primer” SEQ ID NO: 7
  • “Tyr-G3R primer” SEQ ID NO: 8
  • a pX330-mC-Tyr-L vector expressing sgRNA and Cas9-mC protein targeting the genomic sequence upstream of the Tyr gene (Left CRISPR Target, SEQ ID NO: 9)
  • a pX330-mC-Tyr-R vector expressing sgRNA and Cas9-mC protein targeting the genomic sequence (Right CRISPR Target, SEQ ID NO: 10) was prepared.
  • a pX330-Tyr-L vector expressing sgRNA targeting the genome sequence upstream of the Tyr gene (Left CRISPR Target, SEQ ID NO: 9) and a normal Cas9 protein, and a genome sequence downstream of the Tyr gene (Right CRISPR Target) PX330-Tyr-R vector expressing sgRNA targeting the SEQ ID NO: 10) and normal Cas9 protein was prepared.
  • the distance between the Left CRISPR Target (SEQ ID NO: 9) and the Right CRISPR Target (SEQ ID NO: 10) was 72,172 base pairs.
  • the pX330-mC-Tyr-L vector (5 ng / ⁇ L) was obtained by microinjection into the male pronucleus of fertilized eggs (pronuclear stage) of C57BL6 / J mice with black hair obtained by natural mating. And a mixture of pX330-mC-Tyr-R vector (5 ng / ⁇ L) and a mixture of pX330-Tyr-L vector (5 ng / ⁇ L) and pX330-Tyr-R vector (5 ng / ⁇ L), respectively. . Subsequently, the fertilized egg into which the vector was introduced was transplanted into the oviduct of a pseudopregnant mouse and developed into a mouse, and the hair color was observed.
  • FIGS. 3B and 3C are photographs showing representative mice obtained.
  • FIG. 3 (b) is a photograph of a mouse generated from a fertilized egg introduced with Cas9-mC
  • FIG. 3 (c) is a photograph of a mouse generated from a fertilized egg introduced with normal Cas9.
  • “*” indicates a mouse exhibiting a complete albino trait
  • “#” indicates a mouse exhibiting a mosaic albino trait.
  • the complete albino trait is the result of deletion of the full length of the Tyr gene in both alleles, probably at the 1 cell stage of the fertilized egg, and the mosaic albino trait is the result of any cell after the 2 cell stage of the fertilized egg. This is considered to be the result of deletion of the full length of the Tyr gene in both alleles.
  • mice were obtained from fertilized eggs into which normal Cas9 had been introduced, one of which exhibited mosaic albino traits, and no mouse that exhibited complete albino traits.
  • Table 1 shows the results of the production of large-scale mice with a Tyr gene.
  • a completely excised mouse (excised KO mouse) of the Dmd gene was prepared using Cas9-mC.
  • the Dmd gene is known to be the longest gene encoding a protein.
  • a completely excised mouse of the Dmd gene was prepared by the same method except that ordinary Cas9 was used. Since the Dmd gene is on the X chromosome, males have 1 copy and females have 2 copies.
  • FIG. 4 is a schematic diagram for explaining the excision method of the Dmd gene.
  • “Dmd-G5F” (SEQ ID NO: 11), “Dmd-GMF” (SEQ ID NO: 12), “Dmd-GMR” (SEQ ID NO: 13), and “Dmd-G3R” (SEQ ID NO: 14) are: Represents the primer used to confirm the genotype of the mouse.
  • a pX330-mC-Dmd-L vector expressing sgRNA and Cas9-mC protein targeting the genomic sequence upstream of the Dmd gene (Left CRISPR Target, SEQ ID NO: 15)
  • a pX330-mC-Dmd-R vector expressing sgRNA and Cas9-mC protein targeting the genomic sequence (Right CRISPR Target, SEQ ID NO: 16) was prepared.
  • a pX330-Dmd-L vector expressing sgRNA targeting the genomic sequence upstream of the Dmd gene (Left CRISPR Target, SEQ ID NO: 15) and a normal Cas9 protein, and a downstream genomic sequence of the Dmd gene (Right CRISPR Target) PX330-Dmd-R vector expressing sgRNA targeting the SEQ ID NO: 16) and normal Cas9 protein was prepared.
  • the distance between the Left CRISPR Target (SEQ ID NO: 15) and the Right CRISPR Target (SEQ ID NO: 16) was 2,265,855 base pairs.
  • the pX330-mC-Dmd-L vector (5 ng / ⁇ L) and pX330-mC-Dmd were obtained by microinjection into the male pronucleus of fertilized eggs (pronuclear stage) of C57BL6 / J mice obtained by natural mating.
  • a mixture of -R vector (5 ng / ⁇ L) and a mixture of pX330-Dmd-L vector (5 ng / ⁇ L) and pX330-Dmd-R vector (5 ng / ⁇ L) were introduced, respectively.
  • the fertilized egg introduced with the vector was transplanted into the oviduct of a pseudopregnant mouse and generated into a mouse, and the genotype was confirmed by PCR.
  • mice were obtained from fertilized eggs introduced with normal Cas9. Moreover, as a result of analyzing the genotype by PCR, it is clear that 6 out of 70 mice (8.6%) generated from fertilized eggs introduced with normal Cas9 have an allele in which the Dmd gene is completely excised. It became.
  • mice with the Dmd fully excised KO allele obtained by the introduction of normal Cas9 were mosaic or heterozygous mutants that also carry other Dmd alleles
  • Cas9 -Five male mice and one female mouse with Dmd complete excision type KO allele obtained by introduction of mC were Dmd gene complete deletion individuals with only Dmd complete excision type KO allele.
  • Table 2 below shows the results of preparation of mice with a large-scale deficient Dmd gene.
  • FIGS. 5 (a) to 5 (c) are schematic diagrams for explaining a method for knocking in a CAG-flox EGFP-Cables1 gene fragment to the ROSA26 locus.
  • FIG. 5 (a) is a schematic diagram showing the structure of the wild-type ROSA26 locus.
  • FIG. 5 (a) also shows the position of the target sequence (SEQ ID NO: 17) of the sgRNA, the 5 'homology arm region, and the 3' homology arm region.
  • FIG. 5 (b) is a schematic diagram showing the structure of the pRosa-CAG-fEGFP-Cables1 donor DNA plasmid.
  • FIG. 5 (c) is a schematic diagram showing the structure of the ROSA26 locus when the target knock-in occurs.
  • “ROSA-G5F” SEQ ID NO: 18
  • “CAG-G5R” SEQ ID NO: 19
  • “pA-G3F” SEQ ID NO: 20
  • ROSA-G3R Nested SEQ ID NO: 21
  • ROSA-G3R 1st SEQ ID NO: 22
  • a sgRNA targeted in the first intron of the ROSA26 locus and a pX330-mC-ROSA vector expressing the Cas9-mC protein was prepared.
  • the pX330-mC-ROSA vector (5 ng / ⁇ L) and pRosa-CAG-fEGFP-Cables1 were applied to the male pronucleus of fertilized eggs (pronuclear stage) of C57BL6 / J mice obtained by natural mating by the microinjection method.
  • a mixture of vector (10 ng / ⁇ L) and a mixture of pX330-ROSA vector (5 ng / ⁇ L) and pRosa-CAG-fEGFP-Cables1 vector (10 ng / ⁇ L) were introduced, respectively.
  • the fertilized egg introduced with the vector was transplanted into the oviduct of a pseudopregnant mouse and generated into a mouse, and the genotype was confirmed by PCR.
  • mice were obtained from fertilized eggs into which normal Cas9 had been introduced. As a result of analyzing the genotype by PCR, it was found that mice having the desired knock-in allele could not be obtained. Table 3 below shows the production results of knock-in mice.
  • FIGS. 6 (a) to 6 (c) are schematic diagrams illustrating a method for knocking in a LoxP sequence into the Prdm14 locus.
  • FIG. 6A is a schematic diagram showing the structure of the wild-type Prdm14 locus.
  • the sgRNA targeting the genome sequence upstream of the sixth exon of the Prdm14 gene (Left CRISPR Target, SEQ ID NO: 23), the genome sequence downstream of the sixth exon of the Prdm14 gene (Right CRISPR Target, The position of the sgRNA, 5 ′ homology arm region and 3 ′ homology arm region targeting SEQ ID NO: 24) is also shown.
  • FIG. 6 (b) is a schematic diagram showing the structure of the pflox-Prdm14 donor DNA plasmid.
  • FIG. 6C is a schematic diagram showing the structure of the Prdm14 locus when the target knock-in occurs.
  • “Prdm14-GF” SEQ ID NO: 25
  • “Prdm14-GR” SEQ ID NO: 26
  • “LoxP” represents the knocked-in LoxP. Represents an array.
  • a pX330-mC-Prdm14-L vector expressing sgRNA and Cas9-mC protein targeting the genomic sequence upstream of the Prdm14 gene (Left CRISPR Target, SEQ ID NO: 23), and downstream of the Prdm14 gene
  • a pX330-mC-Prdm14-R vector expressing sgRNA and Cas9-mC protein targeting the genomic sequence (Right CRISPR Target, SEQ ID NO: 24) was prepared.
  • a pX330-Prdm14-L vector expressing sgRNA targeting the upstream genomic sequence of the Prdm14 gene (Left CRISPR Target, SEQ ID NO: 23) and a normal Cas9 protein
  • a downstream genomic sequence of the Prdm14 gene (Right CRISPR Target PX330-Prdm14-R vector expressing sgRNA targeting the SEQ ID NO: 24) and normal Cas9 protein was prepared.
  • the pX330-mC-Prdm14-L vector (5 ng / ⁇ L), pX330-mC-Prdm14 were obtained by microinjection into the male pronucleus of fertilized eggs (pronuclear stage) of C57BL6 / J mice obtained by natural mating.
  • -R vector (5 ng / ⁇ L) and pflox-Prdm14 vector (10 ng / ⁇ L) and pX330-Prdm14-L vector (5 ng / ⁇ L), pX330-Prdm14-R vector (5 ng / ⁇ L) and pflox-
  • Prdm14 vector 10 ng / ⁇ L
  • the fertilized egg introduced with the vector was transplanted into the oviduct of a pseudopregnant mouse and generated into a mouse, and the genotype was confirmed by PCR.
  • mice were obtained from fertilized eggs introduced with Cas9-mC. Moreover, as a result of analyzing the genotype by PCR, it was revealed that 4 out of 22 mice (18.2%) generated from fertilized eggs into which Cas9-mC had been introduced had the target knock-in allele.
  • mice were obtained from fertilized eggs into which normal Cas9 had been introduced, but as a result of analyzing the genotype by PCR, it was found that mice having the desired knock-in allele could not be obtained.
  • Table 4 shows the production results of the knock-in mouse.
  • Example 7 (Examination of intracellular localization of Cas9, Cas9-mG, Cas9-mC) Using HEK293T cells, which are cells derived from human fetal kidney, the intracellular localization of Cas9-mG protein and Cas9-mC protein expressed by introducing the expression vector prepared in Experimental Example 1 was examined.
  • the pX330-mG vector and the pX330-mC vector were introduced into HEK293T cells, respectively.
  • HEK293T cells introduced with the pX330 vector were also prepared.
  • the 3 ⁇ FLAG tag peptide is linked to the Cas9-mG protein, the Cas9-mC protein and the normal Cas9 protein encoded by these vectors.
  • each Cas9 protein can be detected by immunostaining using an anti-FLAG antibody.
  • each cell was fixed with formaldehyde and immunostained with an anti-FLAG antibody.
  • nuclei were stained with 4 ', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI). Subsequently, each stained cell was observed with a fluorescence microscope.
  • FIGS. 7A to 7C are fluorescence micrographs showing the results of immunostaining.
  • FIG. 7 (a) shows the results for normal Cas9 protein
  • FIG. 7 (b) shows the results for Cas9-mG protein
  • FIG. 7 (c) shows the results for Cas9-mC protein.
  • “Overlay” indicates the result of synthesizing the staining result with the anti-FLAG antibody and the staining result with DAPI.
  • Cas9-mG protein was localized in the nucleus.
  • Cas9-mC protein was also found to be localized in the nucleus. From this result, it became clear that Cas9-mC protein shows high localization to the nucleus even in human cells.
  • Example 8 (Preparation of Cas9 fusion protein expression vector 2)
  • the SpCas9 protein expressed from the pX330-mC vector prepared in Experimental Example 1 had SV40 virus-derived nuclear translocation signals (NLS) at the N-terminus and C-terminus of the SpCas9 protein.
  • FIG. 8 (a) shows the structure of the pX330-mC vector.
  • FIG. 8 (b) shows the structure of the pX330-pFmC vector.
  • a fusion protein was produced in which the position and length of the mouse Cdt1-derived peptide to be linked to the C-terminus of the SpCas9 protein were variously modified.
  • a fusion protein (hereinafter referred to as “Cas9”, which does not have a nuclear translocation signal derived from the SV40 virus, and is linked to the C-terminal of the SpCas9 protein with the 81st to 132rd peptides of the mouse-derived Cdt1 protein.
  • a vector (SEQ ID NO: 31, hereinafter, sometimes referred to as “pX330-pCmC”) was produced.
  • FIG. 8 (c) shows the structure of the pX330-pCmC vector.
  • a fusion protein (hereinafter referred to as “Cas9-pMmC”) which does not have a nuclear translocation signal derived from SV40 virus and which is linked to the C-terminal of SpCas9 protein with the 55th to 106th peptides of mouse Cdt1 protein.
  • a vector (SEQ ID NO: 32, hereinafter sometimes referred to as “pX330-pMmC”) was produced.
  • FIG. 8 (d) shows the structure of the pX330-pMmC vector.
  • a fusion protein (hereinafter referred to as “Cas9-pNmC”) which does not have a nuclear translocation signal derived from SV40 virus and which is linked to the C-terminal of SpCas9 protein with a peptide consisting of the 29th to 80th mouse Cdt1 protein
  • a vector (SEQ ID NO: 33, hereinafter sometimes referred to as “pX330-pNmC”) was produced.
  • FIG. 8 (e) shows the structure of the pX330-pNmC vector.
  • a fusion protein (hereinafter referred to as “Cas9-pNNmC”) which does not have a nuclear translocation signal derived from SV40 virus and which is linked to the C-terminal of SpCas9 protein and the 29th to 54th peptides of Cdt1 protein derived from mouse.
  • a vector (SEQ ID NO: 34, hereinafter sometimes referred to as “pX330-pNNmC”) was produced.
  • FIG. 8 (f) shows the structure of the pX330-pNNmC vector.
  • a fusion protein (hereinafter referred to as “Cas9-pNCmC”) which does not have a nuclear translocation signal derived from SV40 virus and which is linked to the C-terminal of SpCas9 protein with a peptide consisting of the 54th to 80th mouse-derived Cdt1 protein.
  • a vector (SEQ ID NO: 35, hereinafter sometimes referred to as “pX330-pNCmC”) was produced.
  • FIG. 8 (g) shows the structure of the pX330-pNCmC vector.
  • Example 9 (Examination of intracellular localization of Cas9 fusion protein 1) Using HEK293T cells, which are cells derived from human fetal kidney, the intracellular localization of each fusion protein expressed by introducing the expression vector prepared in Experimental Example 8 was examined.
  • pX330-pFmC vector, pX330-pCmC vector, pX330-pMmC vector, pX330-pNmC vector, pX330-pNNmC vector, and pX330-pNCmC vector were introduced into HEK293T cells, respectively.
  • HEK293T cells introduced with the pX330 vector were also prepared.
  • each Cas9 protein can be detected by immunostaining using an anti-FLAG antibody.
  • each cell was fixed with formaldehyde and immunostained with an anti-FLAG antibody. Also, nuclei were stained with DAPI. Subsequently, each stained cell was observed with a fluorescence microscope.
  • FIG. 9 is a fluorescence micrograph showing the results of immunostaining.
  • pX330 indicates the result of introducing the pX330 vector
  • pX330-pFmC indicates the result of introducing the pX330-pFmC vector
  • pX330-pCmC indicates pX330-pCmC.
  • PX330-pMmC indicates the result of introducing the pX330-pMmC vector
  • pX330-pNmC indicates the result of introducing the pX330-pNmC vector.
  • PX330-pNNmC indicates the result of introducing the pX330-pNNmC vector
  • pX330-pNCmC indicates the result of introducing the pX330-pNCmC vector.
  • DAPI indicates the result of staining the nucleus with DAPI
  • FLAG indicates the result of detecting each Cas9 protein by immunostaining using an anti-FLAG antibody
  • “Overlay” indicates , Shows the result of synthesizing the staining result with DAPI and the staining result with anti-FLAG antibody.
  • the Cas9-pFmC fusion protein and the Cas9-pNmC fusion protein migrated to the nucleus.
  • the SpCas9 protein, Cas9-pCmC fusion protein, Cas9-pMmC fusion protein, Cas9-pNNmC fusion protein and Cas9-pNCmC fusion protein expressed by introducing the pX330 vector were not observed to migrate to the nucleus. It was.
  • Example 10 (Examination of intracellular localization of Cas9 fusion protein 2) A soluble nucleoprotein fraction and a cytoplasmic protein fraction were extracted from HEK293T cells in which each fusion protein was expressed in Experimental Example 9 using a commercially available kit (code number “295-73901”, Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) Each Cas9 fusion protein was detected by Western blotting.
  • FIG. 10 (a) is a photograph showing the results of detecting each Cas9 fusion protein with an anti-FLAG antibody.
  • FIG. 10 (b) is a photograph showing the results of detecting each Cas9 fusion protein with an anti-Cas9 antibody.
  • FIG. 10 (c) is a photograph showing the result of detecting PARP1, which is a nucleoprotein, with an anti-PARP1 antibody as a control.
  • FIG. 10 (d) is a photograph showing the result of detecting GAPDH, which is a cytoplasmic protein, with an anti-GAPDH antibody as a control. As a result, it was confirmed that each protein fraction and cytoplasmic fraction could be extracted.
  • FIG. 11 is a diagram summarizing the structure and nuclear transferability of each Cas9 fusion protein based on the results of Experimental Examples 9 and 10.
  • “ ⁇ ” indicates that the nuclear transferability is high
  • “x” indicates that the nuclear transferability is not recognized.
  • the pX330-pFmC vector and the pX330-pNmC vector were introduced into HEK293T cells, respectively.
  • HEK293T cells introduced with the pX330 vector were also prepared.
  • each cell was fixed with formaldehyde and immunostained with an anti-FLAG antibody. Also, nuclei were stained with DAPI. Subsequently, each stained cell was observed with a fluorescence microscope.
  • FIG. 12 is a fluorescence micrograph showing the results of immunostaining.
  • pX330 indicates the result of introducing the pX330 vector
  • pX330-pFmC indicates the result of introducing the pX330-pFmC vector
  • pX330-pNmC indicates pX330-pNmC.
  • DAPI indicates the result of staining the nucleus with DAPI
  • FLAG indicates the result of detecting each Cas9 protein by immunostaining using an anti-FLAG antibody.
  • the Cas9-pNmC fusion protein was detected to have higher fluorescence intensity of the anti-FLAG antibody than the Cas9-pFmC fusion protein. This result indicates that the Cas9-pNmC fusion protein is less prone to degradation than the Cas9-pFmC fusion protein.

Abstract

Ｃａｓ９タンパク質と、前記Ｃａｓ９タンパク質を修飾する修飾ペプチドとを含む融合タンパク質であって、前記修飾ペプチドは、配列番号２９に記載のアミノ酸配列からなるペプチド、又は配列番号２９に記載のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ前記Ｃａｓ９タンパク質との融合タンパク質を形成することにより前記Ｃａｓ９タンパク質を核に局在させる活性を有するペプチド、を含む、融合タンパク質。

Description

融合タンパク質、核酸、細胞及び動物の製造方法
　本発明は、融合タンパク質、核酸、細胞及び動物の製造方法に関する。
　特定の遺伝子だけを無効化したノックアウト（以下、「ＫＯ」という場合がある。）マウスや特定の遺伝子座に外来性の遺伝子を導入したノックイン（以下、「ＫＩ」という場合がある。）マウスは、遺伝子の機能を生体内で直接的に評価することができるため、多くの医学・生命科学研究で使用されている。
　従来、ＫＯマウスやＫＩマウスは、胚性幹（Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ　Ｓｔｅｍ、以下、「ＥＳ」という場合がある。）細胞を用いた遺伝子ターゲティング法により作製されてきた。しかしながら、その作製には多額の費用と年単位の時間がかかる点が問題であった。この問題を解決したのが、ゲノム編集技術である。
　ゲノム編集では、特定のＤＮＡ配列だけを認識し、その部位だけを切断する人工制限酵素を細胞に導入することで、標的遺伝子をＫＯすることができる。また、導入したい外来性遺伝子を切断部位の近傍配列で挟み込んだドナーＤＮＡを、人工制限酵素と同時に細胞に導入することで、その標的遺伝子座に外来性遺伝子をＫＩすることも可能である。
　ゲノム編集に利用できる人工制限酵素として、現時点で最も有力なものがＣｌｕｓｔｅｒｅｄ　Ｒｅｇｕｌａｒｌｙ　Ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ　Ｓｈｏｒｔ　Ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ　Ｒｅｐｅａｔｓ－ＣＲＩＳＰＲ　Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　９（以下「ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９」という場合がある。）システムである。
　ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９の中でも、化膿連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｐｙｏｇｅｎｅｓ、以下、「Ｓｐ」という場合がある。）に由来するＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９（以下、「ＳｐＣａｓ９」という場合がある。）が単純かつ効率的にＤＮＡを切断する能力を持つために、多くの研究で利用されている。
　Ｓｐ－ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９システムは、主に、標的配列を認識する機能を持つｓｉｎｇｌｅ　ｇｕｉｄｅ　ＲＮＡ（以下、「ｓｇＲＮＡ」という場合がある。）と、その標的配列を切断する機能を主に持つＣａｓ９タンパク質からなるＲＮＡ－タンパク複合体である。これらのｓｇＲＮＡとＣａｓ９タンパク質を同時にマウス受精卵に導入することにより、ＫＯマウスを得ることができる。
　また、異なる２つのｓｇＲＮＡを用いて、標的遺伝子領域の上流及び下流を同時に切断することで、当該領域を染色体から切除すること（切除型ＫＯ）ができる。この過程では、エラーを起こしやすい非相同末端結合（ｎｏｎ－ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ　ｅｎｄ－ｊｏｉｎｉｎｇ、以下、「ＮＨＥＪ」という場合がある。）が利用される。この方法により、従来の遺伝子ターゲティング法で困難であった、数百万塩基対を切除することも可能となった。
　また、ｓｇＲＮＡとＣａｓ９タンパク質とドナーＤＮＡを同時に受精卵に導入することで、切断部位がドナーＤＮＡを鋳型とした相同組換え修復（Ｈｏｍｏｌｏｇｙ－ｄｉｒｅｃｔｅｄ　Ｒｅｐａｉｒ、以下「ＨＤＲ」という場合がある。）により修復され、ＫＩマウスを得ることができる。
　従来の研究から、ＨＤＲ活性はＧ１期では認められず、Ｓ期で急激に上昇し、Ｇ２／Ｍ期で減少することが明らかにされている。また、ＮＨＥＪ活性は、細胞周期全体で認められることが明らかにされている。そこで、Ｃａｓ９タンパク質の存在を細胞周期特異的に制御し、ＮＨＥＪにより目的外の挿入又は欠失変異（Ｉｎｄｅｌ）が導入されるのを抑制する検討がなされている。
　例えば、ヒトＧｅｍｉｎｉｎタンパク質はＧ１期に分解されることが知られている。また、ヒトＣｄｔ１タンパク質はＳ／Ｇ２期に分解されることが知られている。そして、非特許文献１には、Ｃａｓ９にヒトＧｅｍｉｎｉｎタンパク質の一部を連結した融合タンパク質（以下、「ＳｐＣａｓ９－ｈＧｅｍ」という場合がある。）、及び、Ｃａｓ９にヒトＣｄｔ１タンパク質の一部を連結した融合タンパク質（以下、「ＳｐＣａｓ９－ｈＣｄｔ１」という場合がある。）を作製したことが記載されている。
　非特許文献１にはまた、ＳｐＣａｓ９－ｈＧｅｍはＧ１期に分解され、ＳｐＣａｓ９－ｈＣｄｔ１はＳ／Ｇ２期に分解されたことが記載されている（非特許文献１、Ｆｉｇ．１Ｃ等）。
　非特許文献１にはまた、ＤＮＭＴ３Ｂ遺伝子座における、通常のＳｐＣａｓ９によるＫＩ効率は１７．１％であり、ＳｐＣａｓ９－ｈＧｅｍによるＫＩ効率は１６．５％であり、ＳｐＣａｓ９－ｈＣｄｔ１によるＫＩ効率は９．９％であったことが記載されている（非特許文献１、Ｆｉｇ．２Ｃ等）。
Howden S. E., et, al., A Cas9 Variant for Efficient Generation of Indel-Free Knockin or Gene-Corrected Human Pluripotent Stem Cells, Stem Cell Reports, Vol. 7, 508-517, 2016.
　受精卵のゲノム編集によるＫＯマウス、ＫＩマウスの作製は、ＥＳ細胞を利用する方法と比較して、費用と時間が大幅に削減されることから、多くの研究施設で利用されている。しかしながら、切除型ＫＯマウスの作出効率や、ＨＤＲに依存したＫＩマウスの作出効率は高くない。そこで、本発明は、ＫＯ効率やＫＩ効率を向上させる修飾型Ｃａｓ９を提供することを目的とする。
　本発明は以下の態様を含む。
［１］Ｃａｓ９タンパク質と、前記Ｃａｓ９タンパク質を修飾する修飾ペプチドとを含む融合タンパク質であって、前記修飾ペプチドは、配列番号２９に記載のアミノ酸配列からなるペプチド、又は配列番号２９に記載のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ前記Ｃａｓ９タンパク質との融合タンパク質を形成することにより前記Ｃａｓ９タンパク質を核に局在させる活性を有するペプチド、を含む、融合タンパク質。
［２］前記修飾ペプチドは、配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるペプチド、又は配列番号１に記載のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ前記Ｃａｓ９タンパク質との融合タンパク質を形成することにより前記Ｃａｓ９タンパク質を核に局在させる活性を有するペプチド、を含む、［１］に記載の融合タンパク質。
［３］前記修飾ペプチドが、配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるペプチド、又は配列番号２に記載のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ前記Ｃａｓ９タンパク質との融合タンパク質を形成することにより前記Ｃａｓ９タンパク質をＧ１期に分解させる活性を有するペプチド、を更に含む、［１］又は［２］に記載の融合タンパク質。
［４］前記修飾ペプチドが、前記Ｃａｓ９タンパク質のＮ末端、Ｃ末端又はＮ末端若しくはＣ末端以外の部位に配置されている、［１］～［３］のいずれかに記載の融合タンパク質。
［５］［１］～［４］のいずれかに記載の融合タンパク質をコードする核酸。
［６］［１］～［４］のいずれかに記載の融合タンパク質を細胞中のゲノムＤＮＡに接触させることを含む、ゲノムＤＮＡが編集された細胞の製造方法。
［７］前記細胞が受精卵である、［６］に記載の製造方法。
［８］［１］～［４］のいずれかに記載の融合タンパク質を受精卵中のゲノムＤＮＡに接触させ、ゲノムＤＮＡが編集された受精卵を得ることと、前記ゲノムＤＮＡが編集された受精卵を個体に成長させ、ゲノムＤＮＡが編集された動物を得ることと、を含む、ゲノムＤＮＡが編集された動物の製造方法。
　本発明により、ＫＯ効率やＫＩ効率を向上させる修飾型Ｃａｓ９を提供することができる。
（ａ）は、ヒトＧｅｍｉｎｉｎタンパク質の第１～１１０番目のアミノ酸配列とマウスＧｅｍｉｎｉｎタンパク質の第１～１０７番目のアミノ酸配列とを並べた図である。（ｂ）は、ヒトＣｄｔ１タンパク質の第３０～１２０番目のアミノ酸配列とマウスＣｄｔ１タンパク質の第２９～１３２番目のアミノ酸配列とを並べた図である。（ｃ）の上段は、ｐＸ３３０ベクターの構造を示す模式図であり、中段はｐＸ３３０－ｍＧベクターの構造を示す模式図であり、下段はｐＸ３３０－ｍＣベクターの構造を示す模式図である。 （ａ）～（ｄ）は、実験例２における免疫染色の結果を示す蛍光顕微鏡写真である。 （ａ）は、実験例３におけるＴｙｒ遺伝子の切除方法を説明する模式図である。（ｂ）及び（ｃ）は、実験例３で得られた代表的なマウスを示す写真である。 実験例４におけるＤｍｄ遺伝子の切除方法を説明する模式図である。 （ａ）は、野生型のＲＯＳＡ２６遺伝子座の構造を示す模式図である。（ｂ）は、実験例５で用いたｐＲｏｓａ－ＣＡＧ－ｆＥＧＦＰ－Ｃａｂｌｅｓ１ドナーＤＮＡプラスミドの構造を示す模式図である。（ｃ）は、実験例５において、目的のノックインが生じた場合のＲＯＳＡ２６遺伝子座の構造を示す模式図である。 （ａ）は、野生型のＰｒｄｍ１４遺伝子座の構造を示す模式図である。（ｂ）は、実験例６で用いたｐｆｌｏｘ－Ｐｒｄｍ１４ドナーＤＮＡプラスミドの構造を示す模式図である。（ｃ）は、実験例６において、目的のノックインが生じた場合のＰｒｄｍ１４遺伝子座の構造を示す模式図である。 （ａ）～（ｃ）は、実験例７における免疫染色の結果を示す蛍光顕微鏡写真である。 （ａ）はｐＸ３３０－ｍＣベクターの構造を示す模式図である。（ｂ）はｐＸ３３０－ｐＦｍＣベクターの構造を示す模式図である。（ｃ）はｐＸ３３０－ｐＣｍＣベクターの構造を示す模式図である。（ｄ）はｐＸ３３０－ｐＭｍＣベクターの構造を示す模式図である。（ｅ）はｐＸ３３０－ｐＮｍＣベクターの構造を示す模式図である。（ｆ）はｐＸ３３０－ｐＮＮｍＣベクターの構造を示す模式図である。（ｇ）はｐＸ３３０－ｐＮＣｍＣベクターの構造を示す模式図である。 実験例９における免疫染色の結果を示す蛍光顕微鏡写真である。 （ａ）は、実験例１０において、抗ＦＬＡＧ抗体で各Ｃａｓ９融合タンパク質を検出した結果を示す写真である。（ｂ）は、実験例１０において、抗Ｃａｓ９抗体で各Ｃａｓ９融合タンパク質を検出した結果を示す写真である。（ｃ）は、実験例１０において、核タンパク質であるＰＡＲＰ１を抗ＰＡＲＰ１抗体で検出した結果を示す写真である。（ｄ）は、実験例１０において、細胞質タンパク質であるＧＡＰＤＨを抗ＧＡＰＤＨ抗体で検出した結果を示す写真である。 実験例９及び１０の結果に基づいて、各Ｃａｓ９融合タンパク質の構造と核移行性をまとめた図である。 実験例１１における免疫染色の結果を示す蛍光顕微鏡写真である。
［融合タンパク質］
　１実施形態において、本発明は、Ｃａｓ９タンパク質と、前記Ｃａｓ９タンパク質を修飾する修飾ペプチドとを含む融合タンパク質であって、前記修飾ペプチドは、配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるペプチド、又は配列番号１に記載のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ前記Ｃａｓ９タンパク質との融合タンパク質を形成することにより前記Ｃａｓ９タンパク質を核に局在させる活性を有するペプチド、を含む、融合タンパク質を提供する。
　Ｃａｓ９タンパク質としては、例えば、化膿連鎖球菌、黄色ブドウ球菌、ストレプトコッカス・サーモフィルス、ゲオバチルス・ステアロサーモフィルス等に由来するものが挙げられる。中でも、化膿連鎖球菌に由来するＣａｓ９（ＳｐＣａｓ９）を好適に利用することができる。
　Ｃａｓ９タンパク質を修飾する修飾ペプチドとしては、配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるペプチドが挙げられる。配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるペプチドは、マウスＣｄｔ１タンパク質の第２９～１３２番目のアミノ酸配列からなるペプチドである。
　Ｃｄｔ１は、細胞周期において、染色体の複製が正確に１回だけ行われることを保証するライセンス化制御因子の１つである。Ｃｄｔ１の発現はＧ１期に高く、Ｓ期ではユビキチン依存的分解により低くなることが知られている。
　非特許文献１に記載されているように、Ｃａｓ９とヒトＣｄｔ１タンパク質の一部を連結した融合タンパク質（ＳｐＣａｓ９－Ｃｄｔ１）の存在量は細胞周期依存性を示し、Ｓ／Ｇ２期に分解されることが知られている。
　しかしながら、実施例において後述するように、Ｃａｓ９とマウスＣｄｔ１タンパク質の一部を融合した本実施形態の融合タンパク質（以下、「Ｃａｓ９－ｍＣ」という場合がある。）は、予想に反して細胞周期依存性が確認されず、いずれの細胞周期においても核に局在することが明らかとなった。核への局在性は、マウス細胞のみならず、ヒト細胞においても確認された。
　更に、実施例において後述するように、Ｃａｓ９－ｍＣを用いたゲノム編集により、数十キロ塩基対から数メガ塩基対の大規模ゲノム欠損マウスを高効率で作製することができること、作製が困難なノックインマウスやｆｌｏｘマウスを高効率で作製することができることが明らかとなった。
　修飾ペプチドは、配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるペプチドに限定されず、Ｃａｓ９タンパク質との融合タンパク質を形成することによりＣａｓ９タンパク質を核に局在させる活性を有する限り、変異を有していてもよい。
　具体的には、配列番号１に記載のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなるペプチドであってもよい。ここで、１若しくは数個とは、例えば１～２０個であってもよく、１～１５個であってもよく、１～１０個であってもよく、１～５個であってもよく、１～３個であってもよい。
　実施例において後述するように、発明者らはＣａｓ９タンパク質を修飾する修飾ペプチドとして、配列番号２９に記載のアミノ酸配列からなるペプチドも、Ｃａｓ９タンパク質を核に局在させる活性を維持していることを明らかにした。配列番号２９に記載のアミノ酸配列からなるペプチドは、マウスＣｄｔ１タンパク質の第２９～８０番目のアミノ酸配列からなるペプチドである。
　配列番号２９に記載のアミノ酸配列からなるペプチドは、配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるペプチドよりも短い。このため、融合タンパク質の分子量を小さくすることができる。また、融合タンパク質の発現ベクターのサイズを小さくすることもできる。このため、より使いやすい融合タンパク質又は当該融合タンパク質をコードする核酸を提供することができる。
　修飾ペプチドは、配列番号２９に記載のアミノ酸配列からなるペプチドに限定されず、Ｃａｓ９タンパク質との融合タンパク質を形成することによりＣａｓ９タンパク質を核に局在させる活性を有する限り、変異を有していてもよい。
　具体的には、配列番号２９に記載のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなるペプチドであってもよい。ここで、１若しくは数個とは、例えば１～２０個であってもよく、１～１５個であってもよく、１～１０個であってもよく、１～５個であってもよく、１～３個であってもよい。
　以下、配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるペプチド、配列番号１に記載のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなるペプチド、配列番号２９に記載のアミノ酸配列からなるペプチド、配列番号２９に記載のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなるペプチドのことを「マウスＣｄｔ１由来ペプチド」という場合がある。
　本実施形態の融合タンパク質において、修飾ペプチドは、配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるペプチドを更に含んでいてもよい。配列番号２に記載のアミノ酸配列はマウスＧｅｍｉｎｉｎタンパク質の第１～１０７番目のアミノ酸配列からなるペプチドである。
　Ｇｅｍｉｎｉｎは、Ｓ期に一度複製が開始されたゲノムの複製開始地点へのライセンス化因子の結合を阻害するライセンス化阻害因子である。Ｇｅｍｉｎｉｎの発現は、Ｓ／Ｇ２／Ｍ期では高いが、Ｇ１期に入るとユビキチン依存的分解により低くなることが知られている。
　実施例において後述するように、Ｃａｓ９とマウスＧｅｍｉｎｉｎタンパク質の一部を融合した融合タンパク質（以下、「Ｃａｓ９－ｍＧ」という場合がある。）は、細胞周期依存性を示し、Ｓ期からＧ２期初期には細胞質中に存在し、Ｇ１期後期からＳ期初期では分解される。
　したがって、修飾ペプチドが、配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるペプチドを更に含んでいると、ユビキチン依存的分解により、Ｇ１期に分解させることができる。この結果、Ｇ１期におけるＮＨＥＪ活性を抑制し、ゲノム編集によるノックイン時に、意図しないＩｎｄｅｌ変異が導入されることを抑制することができる。
　修飾ペプチドに更に含ませるペプチドは、配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるペプチドに限定されず、Ｃａｓ９タンパク質との融合タンパク質を形成することによりＣａｓ９タンパク質をＧ１期に分解させる活性を有する限り、変異を有していてもよい。
　具体的には、配列番号２に記載のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなるペプチドであってもよい。ここで、１若しくは数個とは、例えば１～２０個であってもよく、１～１５個であってもよく、１～１０個であってもよく、１～５個であってもよく、１～３個であってもよい。
　以下、配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるペプチド、配列番号２に記載のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなるペプチドのことを「Ｇｅｍｉｎｉｎ由来ペプチド」という場合がある。Ｇｅｍｉｎｉｎ由来ペプチドは、ヒトＧｅｍｉｎｉｎタンパク質の一部のアミノ酸配列を有するものであってもよい。
　本実施形態の融合タンパク質において、修飾ペプチドの位置は特に限定されない。例えば、修飾ペプチドの位置は、Ｃａｓ９タンパク質のＮ末端であってもよいし、Ｃ末端であってもよいし、Ｎ末端又はＣ末端以外の部位であってもよい。
　また、本実施形態の融合タンパク質において、マウスＣｄｔ１由来ペプチド及びＧｅｍｉｎｉｎ由来ペプチドは、互いに隣接していてもよいし、離れていてもよい。また、マウスＣｄｔ１由来ペプチド及びＧｅｍｉｎｉｎ由来ペプチドは、いずれがＮ末端側に配置されていてもよい。すなわち、マウスＣｄｔ１由来ペプチドのＣ末端側にＧｅｍｉｎｉｎ由来ペプチドが配置されていてもよいし、Ｇｅｍｉｎｉｎ由来ペプチドのＣ末端側にマウスＣｄｔ１由来ペプチドが配置されていてもよい。
　また、マウスＣｄｔ１由来ペプチド及びＧｅｍｉｎｉｎ由来ペプチドが離れて配置されている場合、マウスＣｄｔ１由来ペプチド及びＧｅｍｉｎｉｎ由来ペプチドの位置は、それぞれ独立に、Ｃａｓ９タンパク質のＮ末端であってもよいし、Ｃ末端であってもよいし、Ｎ末端又はＣ末端以外の部位であってもよい。
　例えば、Ｇｅｍｉｎｉｎ由来ペプチドがＣａｓ９タンパク質のＮ末端に配置されており、マウスＣｄｔ１由来ペプチドがＣａｓ９タンパク質のＣ末端に配置されていてもよい。あるいは、マウスＣｄｔ１由来ペプチドがＣａｓ９タンパク質のＮ末端に配置されており、Ｇｅｍｉｎｉｎ由来ペプチドがＣａｓ９タンパク質のＣ末端に配置されていてもよい。
　あるいは、マウスＣｄｔ１由来ペプチド及びＧｅｍｉｎｉｎ由来ペプチドの一方がＣａｓ９タンパク質のＮ末端又はＣ末端に配置されており、他方が中央部分に配置されていてもよい。
　本明細書において、Ｎ末端とはＮ末端の近傍を含む場合がある。また、Ｃ末端とはＣ末端の近傍を含む場合がある。つまり、Ｃａｓ９タンパク質のＮ末端側から第１番目のアミノ酸に修飾ペプチドが隣接していない場合であっても、Ｃａｓ９タンパク質のＮ末端の近傍に修飾ペプチドが位置している場合、修飾ペプチドの位置は、Ｃａｓ９タンパク質のＮ末端であるという場合がある。
　同様に、Ｃａｓ９タンパク質のＣ末端側から第１番目のアミノ酸に修飾ペプチドが隣接していない場合であっても、Ｃａｓ９タンパク質のＣ末端の近傍に修飾ペプチドが位置している場合、修飾ペプチドの位置は、Ｃａｓ９タンパク質のＣ末端であるという場合がある。
　ここで、近傍とは、例えば１～１００個のアミノ酸の距離であってもよく、１～５０個のアミノ酸の距離であってもよく、１～３０個のアミノ酸の距離であってもよく、１～２０個のアミノ酸の距離であってもよい。
　修飾ペプチドの位置は、Ｃａｓ９タンパク質のＮ末端又はＣ末端以外の部位であってもよく、例えば、Ｃａｓ９タンパク質の中央部分であってもよい。
　本実施形態の融合タンパク質は、本発明の効果が得られる限り、Ｃａｓ９タンパク質と修飾ペプチドの他に付加的なペプチドを有していてもよい。付加的なペプチドとしては、例えば、ＦＬＡＧタグ、Ｈｉｓ×６タグ、ＭＹＣタグ、ＨＡタグ、Ｖ５タグ等のタグペプチド；緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、ＧＦＰ誘導体等の蛍光タンパク質；ベクターのマルチクローニングサイトに由来するペプチド、プライマーの一部に由来するペプチド等の遺伝子組換えの過程で導入されたペプチド；ベクターに本来組み込まれていた核移行シグナル（ＮＬＳ）等が挙げられる。
　なお、本明細書において、「タンパク質」、「ペプチド」の用語は厳密な区別なく用いられ、アミノ酸の数の多少によりペプチドという場合やタンパク質という場合がある。
［核酸］
　１実施形態において、本発明は、上述した融合タンパク質をコードする核酸を提供する。本実施形態の核酸を細胞内に導入することにより、上述した融合タンパク質を発現させることができる。また、本実施形態の核酸を試験管内転写反応系で転写することにより、上述した融合タンパク質をコードするｍＲＮＡを得ることができる。
　本実施形態の核酸は発現ベクターであってもよい。発現ベクターとしては、特に限定されず、例えば、トランスポゾンベクター、ウイルスベクター、エピソーマルベクター、プラスミドベクター等が挙げられる。
［ゲノムＤＮＡが編集された細胞の製造方法］
　１実施形態において、本発明は、上述した融合タンパク質を細胞中のゲノムＤＮＡに接触させることを含む、ゲノムＤＮＡが編集された細胞の製造方法を提供する。
　上述した融合タンパク質は、標的配列に対応したｇＲＮＡと共にゲノムＤＮＡに接触させる。より具体的には、上述した融合タンパク質をｇＲＮＡと共に細胞に導入することにより、細胞中のゲノムＤＮＡに接触させることができる。この結果、標的配列部分にＤＮＡ二本鎖切断（ＤＳＢ）を形成させることができる。
　細胞としては、ＥＳ細胞、ｉＰＳ細胞、受精卵、培養細胞等が挙げられる。培養細胞としては、例えば、動物細胞、昆虫細胞、植物細胞、酵母細胞等が挙げられる。
　細胞が受精卵である場合、ゲノムＤＮＡが編集された受精卵が得られる。この受精卵を個体に成長させることにより、ゲノムＤＮＡが編集された動物を得ることができる。動物としては特に限定されず、マウス、ラット、ヒツジ、ブタ、サル、ヒト等の哺乳動物、ニワトリ等の鳥類、アフリカツメガエル等の両生類、ヤモリ等の爬虫類、ゼブラフィッシュ、メダカ等の魚類、カイコ等の昆虫等が挙げられる。
　融合タンパク質及びｇＲＮＡの細胞への導入は、リポフェクション、マイクロインジェクション、エレクトロポレーション等により行うことができる。
　ｇＲＮＡは、ＣＲＩＳＰＲ　ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）とトランス活性化型ＣＲＩＳＰＲ　ＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）との複合体であってもよいし、ｔｒａｃｒＲＮＡとｃｒＲＮＡを組み合わせた単一のｇＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）であってもよい。
　ｇＲＮＡは、ＲＮＡの形態で細胞に導入してもよいし、発現ベクターの形態で細胞に導入してもよい。ｇＲＮＡをＲＮＡの形態で調製する方法としては、ｇＲＮＡをコードする核酸断片の上流にＴ７等のプロモーターを付加したコンストラクトを作製して試験管内転写反応で合成する方法、化学合成する方法等が挙げられる。ｇＲＮＡを化学合成する場合、化学修飾されたＲＮＡを用いてもよい。
　ｇＲＮＡを発現ベクターの形態で調製する場合、発現ベクターとしては、Ｈ１プロモーター又はＵ６プロモーター等のＰｏｌ　ＩＩＩプロモーターからｇＲＮＡを転写するプラスミドベクターやウイルスベクターを用いることができる。発現ベクターを用いてｇＲＮＡを発現させる場合には、ｇＲＮＡを恒常的に発現させてもよいし、発現誘導型プロモーターの制御下で発現させてもよい。
　融合タンパク質は、Ｐｏｌ　ＩＩプロモーターから発現する発現ベクターの形態でドナー細胞に導入してもよいし、精製タンパク質の形態でドナー細胞に導入してもよい。融合タンパク質の発現ベクターとしては、トランスポゾンベクター、ウイルスベクター、エピソーマルベクター、プラスミドベクター等が挙げられる。
　形成されたＤＳＢがＮＨＥＪにより修復される過程で、Ｉｎｄｅｌ変異を導入することができる。あるいは、異なる２つのｓｇＲＮＡを用いて、標的遺伝子領域の上流及び下流を同時に切断することで、当該領域を染色体から切除することができる。
　また、融合タンパク質及びｇＲＮＡと共に、ドナーＤＮＡを細胞に導入してもよい。ドナーＤＮＡは、５’相同アーム領域、目的塩基配列領域、及び３’相同アーム領域を有することが好ましい。この場合、ＤＳＢがドナーＤＮＡを鋳型とした相同組換え修復（ＨＤＲ）により修復され、ドナーＤＮＡ中の目的塩基配列領域をノックインさせることができる。あるいは、ＰＩＴＣｈ法やＨＩＴＩ法等のＨＤＲに依存しない方法によってドナーＤＮＡをノックインさせることもできる。
［ゲノムＤＮＡが編集された動物の製造方法］
　１実施形態において、本発明は、上述した融合タンパク質を受精卵中のゲノムＤＮＡに接触させ、ゲノムＤＮＡが編集された受精卵を得ることと、前記ゲノムＤＮＡが編集された受精卵を個体に成長させ、ゲノムＤＮＡが編集された動物を得ることと、を含む、ゲノムＤＮＡが編集された動物の製造方法を提供する。
　ゲノムＤＮＡが編集された受精卵を得る工程は、上述したゲノムＤＮＡが編集された細胞の製造方法において、細胞として受精卵を用いる場合と同様である。この受精卵を個体に成長させることにより、ゲノムＤＮＡが編集された動物を得ることができる。動物としては上述したものが挙げられる。
　ゲノムＤＮＡが編集された受精卵を個体に成長させる方法は、動物種によって適宜選択することができる。例えば、哺乳動物である場合には、ゲノムＤＮＡが編集された受精卵を仮親の卵管や子宮に移植して発生させることにより、個体に成長させることができる。また、鳥類、両生類、爬虫類、魚類、昆虫等である場合には、ゲノムＤＮＡが編集された受精卵を適切な環境下で培養して発生させることにより、個体に成長させることができる。
　次に実施例を示して本発明を更に詳細に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
［材料及び方法］
（マウス）
　Ｃ５７ＢＬ／Ｊマウスは日本チャールスリバー社より購入した。マウス作製に使用した偽妊娠マウスとしてはＩＣＲマウス（日本チャールスリバー社）を用いた。マウスは、室温２３．５℃±２．５℃、湿度５２．５°±１２．５％、明期１４時間：暗期１０時間の明暗周期の環境下で飼育した。
（マウスの作製）
　１２～２０週齢の雌のＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスに５ｕｎｉｔの妊馬血清性性腺刺激ホルモンを皮下投与し、その４８時間後に５ｕｎｉｔのヒト絨毛性ゴナドトロピンを腹腔内投与し、雄のオスＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスと交配させた。膣栓の存在により交配を確認し、卵管より受精卵（前核期）を採取した。なお、凍結受精卵や体外受精卵は使用しなかった。ｐＸ３３０ベクター、ｐＸ３３０－ｍＧベクター、ｐＸ３３０－ｍＣベクターは滅菌蒸留水で５ｎｇ／μＬに希釈し、ポアサイズ０．２２μｍのＰＶＤＦ膜で濾過して使用した。各種ドナーベクターは滅菌蒸留水で１０ｎｇ／μＬに希釈し、ポアサイズ０．２２μｍのＰＶＤＦ膜で濾過して使用した。各ベクターは前核期胚の雄性前核に顕微注入（マイクロインジェクション）した。顕微注入の１５分から２時間後に生存していた受精卵を偽妊娠マウスの卵管に移植し、個体へと発生させた。
（遺伝型の解析）
　０．５ｍｍ以下のマウスの尾の先端からゲノム抽出機器のＰＩ－２００を用いてゲノムＤＮＡを抽出・精製し、遺伝型の解析に用いた。ＫＩアレル及びｆｌｏｘアレルの確認は、ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ　ＧＸＬ　ＤＮＡ　Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ＴＡＫＡＲＡ社）を用いたＰＣＲにより行なった。ＫＯアレルの確認は、ＡｍｐｌｉＴａｑ　Ｇｏｌｄ　３６０　Ｍａｓｔｅｒ　Ｍｉｘ（サーモフィッシャーサイエンティフィック社）を用いたＰＣＲにより行なった。
［実験例１］
（Ｃａｓ９融合タンパク質発現ベクターの作製１）
　ｐＸ３３０（Ｐｌａｓｍｉｄ　＃４２２３０、Ａｄｄｇｅｎｅ社）は、ｓｇＲＮＡとＣａｓ９の双方を発現させることができるベクターである。図１（ｃ）の上段にｐＸ３３０ベクターの構造を示す。ｐＸ３３０ベクターでは、Ｕ６プロモーターによりｓｇＲＮＡが発現する。また、ＣＢｈプロモーターによりＳｐＣａｓ９タンパク質が発現する。ＳｐＣａｓ９タンパク質のＮ末端及びＣ末端にはＳＶ４０ウイルス由来の核移行シグナル（ＮＬＳ）が連結されている。また、Ｎ末端側のＮＬＳの更にＮ末端側に３×ＦＬＡＧタグペプチドが連結されている。
　ｐＸ３３０ベクターに基づいて、Ｃａｓ９融合タンパク質の発現ベクターを作製した。より具体的には、ＳｐＣａｓ９タンパク質のＣ末端に、ヒトではなくマウス由来のＧｅｍｉｎｉｎタンパク質の第１～１０７番目からなるペプチドを連結した融合タンパク質（以下、「Ｃａｓ９－ｍＧ」という場合がある。）を発現するベクター（配列番号５、以下、「ｐＸ３３０－ｍＧ」という場合がある。）を作製した。
　図１（ａ）に、ヒトＧｅｍｉｎｉｎタンパク質の第１～１１０番目のアミノ酸配列（配列番号４）とマウスＧｅｍｉｎｉｎタンパク質の第１～１０７番目のアミノ酸配列（配列番号２）とを並べた図を示す。また、図１（ｃ）の中段にｐＸ３３０－ｍＧベクターの構造を示す。
　また、ＳｐＣａｓ９タンパク質のＣ末端に、ヒトではなくマウス由来のＣｄｔ１タンパク質の第２９～１３２番目からなるペプチドを連結した融合タンパク質（以下、「Ｃａｓ９－ｍＣ」という場合がある。）を発現するベクター（配列番号６、以下、「ｐＸ３３０－ｍＣ」という場合がある。）を作製した。
　図１（ｂ）に、ヒトＣｄｔ１タンパク質の第３０～１２０番目のアミノ酸配列（配列番号３）とマウスＣｄｔ１タンパク質の第２９～１３２番目のアミノ酸配列（配列番号１）とを並べた図を示す。また、図１（ｃ）の下段にｐＸ３３０－ｍＣベクターの構造を示す。
［実験例２］
（Ｃａｓ９、Ｃａｓ９－ｍＧ、Ｃａｓ９－ｍＣの細胞周期依存性と細胞内局在の検討）
　マウス受精卵を用いて、実験例１で作製した発現ベクターの導入により発現するＣａｓ９－ｍＧタンパク質及びＣａｓ９－ｍＣタンパク質の細胞周期依存性と細胞内局在を検討した。
　まず、実験例１で作製した各発現ベクターを試験管内転写反応系で転写することにより、Ｃａｓ９－ｍＧ　ｍＲＮＡ、Ｃａｓ９－ｍＣ　ｍＲＮＡ、Ｃａｓ９　ｍＲＮＡをそれぞれ調製した。
　続いて、顕微授精で得たマウス受精卵の細胞質に、Ｃａｓ９－ｍＧ　ｍＲＮＡ及びＣａｓ９－ｍＣ　ｍＲＮＡをそれぞれ注入した。また、比較のために通常のＣａｓ９　ｍＲＮＡを注入したマウス受精卵及び何も注入していないマウス受精卵についても同様の検討を行った。
　上述したように、実験例１で作製した各ベクターにコードされるＣａｓ９－ｍＧタンパク質、Ｃａｓ９－ｍＣタンパク質及び通常のＣａｓ９タンパク質には、３×ＦＬＡＧタグペプチドが連結されている。このため、本実験例でマウス受精卵に注入したＣａｓ９－ｍＧ　ｍＲＮＡ、Ｃａｓ９－ｍＣ　ｍＲＮＡ及びＣａｓ９　ｍＲＮＡから翻訳されるＣａｓ９－ｍＧタンパク質、Ｃａｓ９－ｍＣタンパク質及び通常のＣａｓ９タンパク質にも、それぞれ３×ＦＬＡＧタグペプチドが連結される。そこで、抗ＦＬＡＧ抗体を用いた免疫染色により、各Ｃａｓ９タンパク質を検出することができる。
　続いて、受精卵を体外で培養し、Ｇ１期後期からＳ期初期の２細胞期胚、及びＳ期後期からＧ２期初期の２細胞期胚を抗ＦＬＡＧ抗体を用いて免疫染色し、蛍光顕微鏡で観察した。
　図２（ａ）～（ｄ）は、免疫染色の結果を示す蛍光顕微鏡写真である。図２（ａ）はＣａｓ９－ｍＧタンパク質の結果であり、図２（ｂ）はＣａｓ９－ｍＣタンパク質の結果であり、図２（ｃ）は通常のＣａｓ９タンパク質の結果であり、図２（ｄ）は何も導入していない対照である。
　その結果、通常のＣａｓ９タンパク質は、いずれの細胞周期においても細胞質中にドット状のシグナルとして検出された。上述したように、本実験例で用いたＣａｓ９タンパク質のＮ末端及びＣ末端にはＳＶ４０ウイルスの核移行シグナルが結合されているが、Ｃａｓ９タンパク質の核への移行性は認められなかった。
　一方、Ｃａｓ９－ｍＧタンパク質は、Ｇ１期後期からＳ期初期では検出されず、分解されたことが確認された。また、Ｃａｓ９－ｍＧタンパク質は、Ｓ期からＧ２期初期には細胞質中でドット状のシグナルとして検出された。上述したように、本実験例で用いたＣａｓ９－ｍＧタンパク質のＮ末端及びＣ末端にはＳＶ４０ウイルスの核移行シグナルが結合されているが、Ｃａｓ９タンパク質の核への移行性は認められなかった。
　また、Ｃａｓ９－ｍＣタンパク質は、予想に反して細胞周期依存性が確認されず、いずれの細胞周期においてもシグナルが検出された。更に、いずれの細胞周期においても核が強く染色された。この結果から、Ｃａｓ９－ｍＣタンパク質が核への高い局在性を示すことが明らかとなった。
［実験例３］
（Ｃａｓ９－ｍＣを用いた大規模ゲノム欠損マウスの作製１）
　Ｃａｓ９－ｍＣにより、大規模なゲノム領域の切除効率が上昇するか否かについて検討した。
　具体的には、Ｃａｓ９－ｍＣを用いてＴｙｒ遺伝子の完全切除マウス（切除型ＫＯマウス）の作製を行った。また、比較のために、通常のＣａｓ９を用いた以外は同様の方法によりＴｙｒ遺伝子の完全切除マウスの作製を行った。Ｔｙｒ遺伝子はマウスの毛色を支配する遺伝子であり、Ｔｙｒ遺伝子を両アレルで欠損したマウスはアルビノ形質を示す。なお、片アレル欠損マウスはアルビノ形質を示さない。
　図３（ａ）は、Ｔｙｒ遺伝子の切除方法を説明する模式図である。図３（ａ）中、「Ｔｙｒ－Ｇ５Ｆプライマー」（配列番号７）及び「Ｔｙｒ－Ｇ３Ｒプライマー」（配列番号８）は、マウスの遺伝型の確認に用いたプライマーを表す。
　具体的には、まず、Ｔｙｒ遺伝子の上流のゲノム配列（Ｌｅｆｔ　ＣＲＩＳＰＲ　Ｔａｒｇｅｔ、配列番号９）を標的とするｓｇＲＮＡ及びＣａｓ９－ｍＣタンパク質を発現するｐＸ３３０－ｍＣ－Ｔｙｒ－Ｌベクターと、Ｔｙｒ遺伝子の下流のゲノム配列（Ｒｉｇｈｔ　ＣＲＩＳＰＲ　Ｔａｒｇｅｔ、配列番号１０）を標的とするｓｇＲＮＡ及びＣａｓ９－ｍＣタンパク質を発現するｐＸ３３０－ｍＣ－Ｔｙｒ－Ｒベクターを作製した。
　また、Ｔｙｒ遺伝子の上流のゲノム配列（Ｌｅｆｔ　ＣＲＩＳＰＲ　Ｔａｒｇｅｔ、配列番号９）を標的とするｓｇＲＮＡ及び通常のＣａｓ９タンパク質を発現するｐＸ３３０－Ｔｙｒ－Ｌベクターと、Ｔｙｒ遺伝子の下流のゲノム配列（Ｒｉｇｈｔ　ＣＲＩＳＰＲ　Ｔａｒｇｅｔ、配列番号１０）を標的とするｓｇＲＮＡ及び通常のＣａｓ９タンパク質を発現するｐＸ３３０－Ｔｙｒ－Ｒベクターを作製した。Ｌｅｆｔ　ＣＲＩＳＰＲ　Ｔａｒｇｅｔ（配列番号９）とＲｉｇｈｔ　ＣＲＩＳＰＲ　Ｔａｒｇｅｔ（配列番号１０）の間の距離は７２，１７２塩基対であった。
　続いて、自然交配より得た、黒色の毛をもつＣ５７ＢＬ６／Ｊマウスの受精卵（前核期）の雄性前核に、マイクロインジェクション法により、ｐＸ３３０－ｍＣ－Ｔｙｒ－Ｌベクター（５ｎｇ／μＬ）とｐＸ３３０－ｍＣ－Ｔｙｒ－Ｒベクター（５ｎｇ／μＬ）の混合液、及び、ｐＸ３３０－Ｔｙｒ－Ｌベクター（５ｎｇ／μＬ）とｐＸ３３０－Ｔｙｒ－Ｒベクター（５ｎｇ／μＬ）の混合液をそれぞれ導入した。続いて、ベクターを導入した受精卵を、偽妊娠マウスの卵管に移植してマウスへと発生させ、毛色を観察した。
　図３（ｂ）及び（ｃ）は、得られた代表的なマウスを示す写真である。図３（ｂ）は、Ｃａｓ９－ｍＣを導入した受精卵から発生したマウスの写真であり、図３（ｃ）は、通常のＣａｓ９を導入した受精卵から発生したマウスの写真である。図３（ｂ）及び（ｃ）中、「＊」は完全なアルビノ形質を示すマウスを示し、「＃」はモザイクアルビノ形質を示すマウスを示す。
　なお、完全なアルビノ形質は、受精卵のおそらく１細胞期に双方のアレルにおいてＴｙｒ遺伝子の全長が欠失した結果であり、モザイクアルビノ形質は、受精卵の２細胞期以降にいずれかの細胞の双方のアレルにおいてＴｙｒ遺伝子の全長が欠失した結果であると考えられる。
　その結果、Ｃａｓ９－ｍＣを導入した受精卵から全３４匹のマウスが得られ、そのうち５匹が完全なアルビノ形質を示し、３匹がモザイクアルビノ形質を示した。また、ＰＣＲにより遺伝型を解析した結果、Ｃａｓ９－ｍＣを導入した受精卵から発生したマウス３４匹中１７匹（５０．０％）が、Ｔｙｒ遺伝子が完全に切除されたアレルを有することが明らかとなった。
　また、通常のＣａｓ９を導入した受精卵から全２１匹のマウスが得られ、そのうち１匹がモザイクアルビノ形質を示し、完全なアルビノ形質を示すマウスは得られなかった。また、ＰＣＲにより遺伝型を解析した結果、通常のＣａｓ９を導入した受精卵から発生したマウス２１匹中６匹（２８．６％）が、Ｔｙｒ遺伝子が完全に切除されたアレルを有することが明らかとなった。下記表１に、Ｔｙｒ遺伝子大規模欠損マウスの作製結果を示す。
　以上の結果は、Ｃａｓ９－ｍＣを用いることにより、数十キロ塩基対の大規模ゲノム欠損マウスを高効率で作製することができることを示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
 ａ：大規模欠損アレルを有する新生仔の数／誕生した新生仔の総数×１００
［実験例４］
（Ｃａｓ９－ｍＣを用いた大規模ゲノム欠損マウスの作製２）
　Ｃａｓ９－ｍＣにより、大規模なゲノム領域の切除効率が上昇するか否かについて検討した。
　具体的には、Ｃａｓ９－ｍＣを用いてＤｍｄ遺伝子の完全切除マウス（切除型ＫＯマウス）の作製を行った。Ｄｍｄ遺伝子は、タンパク質をコードする遺伝子としては最長であることが知られている。また、比較のために、通常のＣａｓ９を用いた以外は同様の方法によりＤｍｄ遺伝子の完全切除マウスの作製を行った。Ｄｍｄ遺伝子はＸ染色体にあるため、雄は１コピーを有し、雌は２コピーを有する。
　図４は、Ｄｍｄ遺伝子の切除方法を説明する模式図である。図４中、「Ｄｍｄ－Ｇ５Ｆ」（配列番号１１）、「Ｄｍｄ－ＧＭＦ」（配列番号１２）、「Ｄｍｄ－ＧＭＲ」（配列番号１３）、及び「Ｄｍｄ－Ｇ３Ｒ」（配列番号１４）は、マウスの遺伝型の確認に用いたプライマーを表す。
　具体的には、まず、Ｄｍｄ遺伝子の上流のゲノム配列（Ｌｅｆｔ　ＣＲＩＳＰＲ　Ｔａｒｇｅｔ、配列番号１５）を標的とするｓｇＲＮＡ及びＣａｓ９－ｍＣタンパク質を発現するｐＸ３３０－ｍＣ－Ｄｍｄ－Ｌベクターと、Ｄｍｄ遺伝子の下流のゲノム配列（Ｒｉｇｈｔ　ＣＲＩＳＰＲ　Ｔａｒｇｅｔ、配列番号１６）を標的とするｓｇＲＮＡ及びＣａｓ９－ｍＣタンパク質を発現するｐＸ３３０－ｍＣ－Ｄｍｄ－Ｒベクターを作製した。
　また、Ｄｍｄ遺伝子の上流のゲノム配列（Ｌｅｆｔ　ＣＲＩＳＰＲ　Ｔａｒｇｅｔ、配列番号１５）を標的とするｓｇＲＮＡ及び通常のＣａｓ９タンパク質を発現するｐＸ３３０－Ｄｍｄ－Ｌベクターと、Ｄｍｄ遺伝子の下流のゲノム配列（Ｒｉｇｈｔ　ＣＲＩＳＰＲ　Ｔａｒｇｅｔ、配列番号１６）を標的とするｓｇＲＮＡ及び通常のＣａｓ９タンパク質を発現するｐＸ３３０－Ｄｍｄ－Ｒベクターを作製した。Ｌｅｆｔ　ＣＲＩＳＰＲ　Ｔａｒｇｅｔ（配列番号１５）とＲｉｇｈｔ　ＣＲＩＳＰＲ　Ｔａｒｇｅｔ（配列番号１６）の間の距離は２，２６５，８５５塩基対であった。
　続いて、自然交配より得たＣ５７ＢＬ６／Ｊマウスの受精卵（前核期）の雄性前核に、マイクロインジェクション法により、ｐＸ３３０－ｍＣ－Ｄｍｄ－Ｌベクター（５ｎｇ／μＬ）とｐＸ３３０－ｍＣ－Ｄｍｄ－Ｒベクター（５ｎｇ／μＬ）の混合液、及び、ｐＸ３３０－Ｄｍｄ－Ｌベクター（５ｎｇ／μＬ）とｐＸ３３０－Ｄｍｄ－Ｒベクター（５ｎｇ／μＬ）の混合液をそれぞれ導入した。続いて、ベクターを導入した受精卵を、偽妊娠マウスの卵管に移植してマウスへと発生させ、ＰＣＲにより遺伝型を確認した。
　その結果、Ｃａｓ９－ｍＣを導入した受精卵から全６８匹のマウスが得られた。また、ＰＣＲにより遺伝型を解析した結果、Ｃａｓ９－ｍＣを導入した受精卵から発生したマウス６８匹中１１匹（１６．２％）が、Ｄｍｄ遺伝子が完全に切除されたアレルを有することが明らかとなった。
　また、通常のＣａｓ９を導入した受精卵から全７０匹のマウスが得られた。また、ＰＣＲにより遺伝型を解析した結果、通常のＣａｓ９を導入した受精卵から発生したマウス７０匹中６匹（８．６％）が、Ｄｍｄ遺伝子が完全に切除されたアレルを有することが明らかとなった。
　更に特筆すべきは、通常のＣａｓ９の導入により得られた、Ｄｍｄ完全切除型ＫＯアレルを有する６匹のマウスは、それ以外のＤｍｄアレルも保持するモザイク又はヘテロ変異体だったのに対し、Ｃａｓ９－ｍＣの導入により得られた、Ｄｍｄ完全切除型ＫＯアレルを有する５匹の雄マウスと１匹の雌マウスは、Ｄｍｄ完全切除型ＫＯアレルのみを有するＤｍｄ遺伝子完全欠失個体であった。下記表２に、Ｄｍｄ遺伝子大規模欠損マウスの作製結果を示す。
　以上の結果は、Ｃａｓ９－ｍＣを用いることにより、数メガ塩基対の大規模ゲノム欠損マウスを高効率で作製することができることを示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
 ａ：大規模欠損アレルを有する新生仔の数／誕生した新生仔の総数×１００
［実験例５］
（Ｃａｓ９－ｍＣを用いたノックインマウスの作製１）
　受精卵のゲノム編集では、高いＧＣ含量を有する塩基配列からなる遺伝子断片をノックインしたマウスの作出や、同時的に２箇所にＬｏｘＰ配列を導入しなくてはいけないｆｌｏｘマウスの作出は難しいことが知られている。これらの高難易度のノックインマウス又はｆｌｏｘマウス作製にＣａｓ９－ｍＣが有用かどうかを検討した。
　まず、高いＧＣ含量の塩基配列を含むＣＡＧプロモーター及び高いＧＣ含量の塩基配列を含むＣａｂｌｅｓ１遺伝子ｃＤＮＡを含む発現カセットＣＡＧ－ｆｌｏｘ　ＥＧＦＰ－Ｃａｂｌｅｓ１をノックインする実験を行った。ノックインする遺伝子座も、５’相同アーム領域が、高いＧＣ含量の塩基配列を含むＲＯＳＡ２６遺伝子座とした。
　図５（ａ）～（ｃ）は、ＲＯＳＡ２６遺伝子座へのＣＡＧ－ｆｌｏｘ　ＥＧＦＰ－Ｃａｂｌｅｓ１遺伝子断片をノックイン方法を説明する模式図である。図５（ａ）は野生型のＲＯＳＡ２６遺伝子座の構造を示す模式図である。図５（ａ）にはｓｇＲＮＡの標的配列（配列番号１７）、５’相同アーム領域及び３’相同アーム領域の位置も示す。
　図５（ｂ）は、ｐＲｏｓａ－ＣＡＧ－ｆＥＧＦＰ－Ｃａｂｌｅｓ１ドナーＤＮＡプラスミドの構造を示す模式図である。図５（ｃ）は、目的のノックインが生じた場合のＲＯＳＡ２６遺伝子座の構造を示す模式図である。図５（ｃ）中、「ＲＯＳＡ－Ｇ５Ｆ」（配列番号１８）、「ＣＡＧ－Ｇ５Ｒ」（配列番号１９）、「ｐＡ－Ｇ３Ｆ」（配列番号２０）、「ＲＯＳＡ－Ｇ３Ｒ　Ｎｅｓｔｅｄ」（配列番号２１）、及び「ＲＯＳＡ－Ｇ３Ｒ　１ｓｔ」（配列番号２２）は、マウスの遺伝型の確認に用いたプライマーを表す。
　具体的には、まず、ＲＯＳＡ２６遺伝子座の第一イントロン中を標的としたｓｇＲＮＡ及びＣａｓ９－ｍＣタンパク質を発現するｐＸ３３０－ｍＣ－ＲＯＳＡベクターと、ＲＯＳＡ２６遺伝子座の第一イントロン中を標的としたｓｇＲＮＡ及び通常のＣａｓ９タンパク質を発現するｐＸ３３０－ＲＯＳＡベクターを作製した。
　続いて、自然交配より得たＣ５７ＢＬ６／Ｊマウスの受精卵（前核期）の雄性前核に、マイクロインジェクション法により、ｐＸ３３０－ｍＣ－ＲＯＳＡベクター（５ｎｇ／μＬ）とｐＲｏｓａ－ＣＡＧ－ｆＥＧＦＰ－Ｃａｂｌｅｓ１ベクター（１０ｎｇ／μＬ）の混合液、及び、ｐＸ３３０－ＲＯＳＡベクター（５ｎｇ／μＬ）とｐＲｏｓａ－ＣＡＧ－ｆＥＧＦＰ－Ｃａｂｌｅｓ１ベクター（１０ｎｇ／μＬ）の混合液をそれぞれ導入した。続いて、ベクターを導入した受精卵を、偽妊娠マウスの卵管に移植してマウスへと発生させ、ＰＣＲにより遺伝型を確認した。
　その結果、Ｃａｓ９－ｍＣを導入した受精卵から全１９匹のマウスが得られた。また、ＰＣＲにより遺伝型を解析した結果、Ｃａｓ９－ｍＣを導入した受精卵から発生したマウス１９匹中４匹（２１．１％）が、目的のノックインアレルを有することが明らかとなった。
　また、通常のＣａｓ９を導入した受精卵から全４４匹のマウスが得られたが、ＰＣＲにより遺伝型を解析した結果、目的のノックインアレルを有するマウスは得られなかったことが明らかとなった。下記表３に、ノックインマウスの作製結果を示す。
　以上の結果は、Ｃａｓ９－ｍＣを用いることにより、高難易度のＫＩマウスの作製やｆｌｏｘマウスの作製が可能であることを示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
 ａ：ノックインアレルを有する新生仔又は胎仔の数／遺伝子型を解析した新生仔又は胎仔の総数×１００
ｂ：受精後１８．５日胚
［実験例６］
（Ｃａｓ９－ｍＣを用いたノックインマウスの作製２）
　続いて、Ｐｒｄｍ１４遺伝子の第６エクソンの上流及び下流にＬｏｘＰ配列を導入し、Ｐｒｄｍ１４　ｆｌｏｘマウスを作製した。
　図６（ａ）～（ｃ）は、Ｐｒｄｍ１４遺伝子座へのＬｏｘＰ配列のノックイン方法を説明する模式図である。図６（ａ）は野生型のＰｒｄｍ１４遺伝子座の構造を示す模式図である。
　図６（ａ）には、Ｐｒｄｍ１４遺伝子の第６エクソンの上流のゲノム配列（Ｌｅｆｔ　ＣＲＩＳＰＲ　Ｔａｒｇｅｔ、配列番号２３）を標的とするｓｇＲＮＡ、Ｐｒｄｍ１４遺伝子の第６エクソンの下流のゲノム配列（Ｒｉｇｈｔ　ＣＲＩＳＰＲ　Ｔａｒｇｅｔ、配列番号２４）を標的とするｓｇＲＮＡ、５’相同アーム領域及び３’相同アーム領域の位置も示す。
　図６（ｂ）は、ｐｆｌｏｘ－Ｐｒｄｍ１４ドナーＤＮＡプラスミドの構造を示す模式図である。図６（ｃ）は、目的のノックインが生じた場合のＰｒｄｍ１４遺伝子座の構造を示す模式図である。図６（ｃ）中、「Ｐｒｄｍ１４－ＧＦ」（配列番号２５）及び「Ｐｒｄｍ１４－ＧＲ」（配列番号２６）は、マウスの遺伝型の確認に用いたプライマーを表し、「ＬｏｘＰ」はノックインしたＬｏｘＰ配列を表す。
　具体的には、まず、Ｐｒｄｍ１４遺伝子の上流のゲノム配列（Ｌｅｆｔ　ＣＲＩＳＰＲ　Ｔａｒｇｅｔ、配列番号２３）を標的とするｓｇＲＮＡ及びＣａｓ９－ｍＣタンパク質を発現するｐＸ３３０－ｍＣ－Ｐｒｄｍ１４－Ｌベクターと、Ｐｒｄｍ１４遺伝子の下流のゲノム配列（Ｒｉｇｈｔ　ＣＲＩＳＰＲ　Ｔａｒｇｅｔ、配列番号２４）を標的とするｓｇＲＮＡ及びＣａｓ９－ｍＣタンパク質を発現するｐＸ３３０－ｍＣ－Ｐｒｄｍ１４－Ｒベクターを作製した。
　また、Ｐｒｄｍ１４遺伝子の上流のゲノム配列（Ｌｅｆｔ　ＣＲＩＳＰＲ　Ｔａｒｇｅｔ、配列番号２３）を標的とするｓｇＲＮＡ及び通常のＣａｓ９タンパク質を発現するｐＸ３３０－Ｐｒｄｍ１４－Ｌベクターと、Ｐｒｄｍ１４遺伝子の下流のゲノム配列（Ｒｉｇｈｔ　ＣＲＩＳＰＲ　Ｔａｒｇｅｔ、配列番号２４）を標的とするｓｇＲＮＡ及び通常のＣａｓ９タンパク質を発現するｐＸ３３０－Ｐｒｄｍ１４－Ｒベクターを作製した。
　続いて、自然交配より得たＣ５７ＢＬ６／Ｊマウスの受精卵（前核期）の雄性前核に、マイクロインジェクション法により、ｐＸ３３０－ｍＣ－Ｐｒｄｍ１４－Ｌベクター（５ｎｇ／μＬ）、ｐＸ３３０－ｍＣ－Ｐｒｄｍ１４－Ｒベクター（５ｎｇ／μＬ）及びｐｆｌｏｘ－Ｐｒｄｍ１４ベクター（１０ｎｇ／μＬ）の混合液、並びに、ｐＸ３３０－Ｐｒｄｍ１４－Ｌベクター（５ｎｇ／μＬ）、ｐＸ３３０－Ｐｒｄｍ１４－Ｒベクター（５ｎｇ／μＬ）及びｐｆｌｏｘ－Ｐｒｄｍ１４ベクター（１０ｎｇ／μＬ）の混合液をそれぞれ導入した。続いて、ベクターを導入した受精卵を、偽妊娠マウスの卵管に移植してマウスへと発生させ、ＰＣＲにより遺伝型を確認した。
　その結果、Ｃａｓ９－ｍＣを導入した受精卵から全２２匹のマウスが得られた。また、ＰＣＲにより遺伝型を解析した結果、Ｃａｓ９－ｍＣを導入した受精卵から発生したマウス２２匹中４匹（１８．２％）が、目的のノックインアレルを有することが明らかとなった。
　また、通常のＣａｓ９を導入した受精卵から全２５匹のマウスが得られたが、ＰＣＲにより遺伝型を解析した結果、目的のノックインアレルを有するマウスは得られなかったことが明らかとなった。下記表４に、ノックインマウスの作製結果を示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
 ａ：ノックインアレルを有する新生仔の数／離乳まで成長した新生仔の総数×１００
［実験例７］
（Ｃａｓ９、Ｃａｓ９－ｍＧ、Ｃａｓ９－ｍＣの細胞内局在の検討）
　ヒト胎児腎由来の細胞であるＨＥＫ２９３Ｔ細胞を用いて、実験例１で作製した発現ベクターの導入により発現するＣａｓ９－ｍＧタンパク質及びＣａｓ９－ｍＣタンパク質の細胞内局在を検討した。
　まず、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞に、ｐＸ３３０－ｍＧベクター及びｐＸ３３０－ｍＣベクターをそれぞれ導入した。また、比較のためにｐＸ３３０ベクターを導入したＨＥＫ２９３Ｔ細胞も用意した。
　上述したように、これらのベクターにコードされるＣａｓ９－ｍＧタンパク質、Ｃａｓ９－ｍＣタンパク質及び通常のＣａｓ９タンパク質には、３×ＦＬＡＧタグペプチドが連結されている。そこで、抗ＦＬＡＧ抗体を用いた免疫染色により、各Ｃａｓ９タンパク質を検出することができる。
　続いて、各細胞をホルムアルデヒド固定し、抗ＦＬＡＧ抗体を用いて免疫染色した。また、４’，６－ジアミジノ－２－フェニルインドール（ＤＡＰＩ）で核を染色した。続いて、染色した各細胞を蛍光顕微鏡で観察した。
　図７（ａ）～（ｃ）は、免疫染色の結果を示す蛍光顕微鏡写真である。図７（ａ）は通常のＣａｓ９タンパク質の結果であり、図７（ｂ）はＣａｓ９－ｍＧタンパク質の結果であり、図７（ｃ）はＣａｓ９－ｍＣタンパク質の結果である。図７中、「Ｏｖｅｒｌａｙ」は、抗ＦＬＡＧ抗体による染色結果とＤＡＰＩによる染色結果を合成した結果であることを示す。
　その結果、通常のＣａｓ９タンパク質は、細胞質中に検出された。上述したように、本実験例で用いたＣａｓ９タンパク質のＮ末端及びＣ末端にはＳＶ４０ウイルスの核移行シグナルが結合されているが、Ｃａｓ９タンパク質の核への移行性は認められなかった。
　一方、Ｃａｓ９－ｍＧタンパク質は、核に局在することが明らかとなった。また、Ｃａｓ９－ｍＣタンパク質も、核に局在することが明らかとなった。この結果から、Ｃａｓ９－ｍＣタンパク質は、ヒト細胞内においても、核への高い局在性を示すことが明らかとなった。
［実験例８］
（Ｃａｓ９融合タンパク質発現ベクターの作製２）
　実験例１で作製したｐＸ３３０－ｍＣベクターから発現されるＳｐＣａｓ９タンパク質は、ＳｐＣａｓ９タンパク質のＮ末端及びＣ末端にＳＶ４０ウイルス由来の核移行シグナル（ＮＬＳ）を有していた。図８（ａ）に、ｐＸ３３０－ｍＣベクターの構造を示す。
　本実験例では、ＳｐＣａｓ９タンパク質のＮ末端及びＣ末端に存在していたこれらのＮＬＳを除去し、ＳｐＣａｓ９タンパク質のＣ末端に、マウス由来のＣｄｔ１タンパク質の第２９～１３２番目からなるペプチドを連結した融合タンパク質（以下、「Ｃａｓ９－ｐＦｍＣ」という場合がある。）を発現するベクター（配列番号３０、以下、「ｐＸ３３０－ｐＦｍＣ」という場合がある。）を作製した。図８（ｂ）に、ｐＸ３３０－ｐＦｍＣベクターの構造を示す。
　本実験例では、更に、ＳｐＣａｓ９タンパク質のＣ末端に連結させるマウスＣｄｔ１由来ペプチドの位置及び長さを様々に改変した融合タンパク質を作製した。具体的には、ＳＶ４０ウイルス由来の核移行シグナルを有しておらず、ＳｐＣａｓ９タンパク質のＣ末端に、マウス由来のＣｄｔ１タンパク質の第８１～１３２番目からなるペプチドを連結した融合タンパク質（以下、「Ｃａｓ９－ｐＣｍＣ」という場合がある。）を発現するベクター（配列番号３１、以下、「ｐＸ３３０－ｐＣｍＣ」という場合がある。）を作製した。図８（ｃ）に、ｐＸ３３０－ｐＣｍＣベクターの構造を示す。
　また、ＳＶ４０ウイルス由来の核移行シグナルを有しておらず、ＳｐＣａｓ９タンパク質のＣ末端に、マウス由来のＣｄｔ１タンパク質の第５５～１０６番目からなるペプチドを連結した融合タンパク質（以下、「Ｃａｓ９－ｐＭｍＣ」という場合がある。）を発現するベクター（配列番号３２、以下、「ｐＸ３３０－ｐＭｍＣ」という場合がある。）を作製した。図８（ｄ）に、ｐＸ３３０－ｐＭｍＣベクターの構造を示す。
　また、ＳＶ４０ウイルス由来の核移行シグナルを有しておらず、ＳｐＣａｓ９タンパク質のＣ末端に、マウス由来のＣｄｔ１タンパク質の第２９～８０番目からなるペプチドを連結した融合タンパク質（以下、「Ｃａｓ９－ｐＮｍＣ」という場合がある。）を発現するベクター（配列番号３３、以下、「ｐＸ３３０－ｐＮｍＣ」という場合がある。）を作製した。図８（ｅ）に、ｐＸ３３０－ｐＮｍＣベクターの構造を示す。
　また、ＳＶ４０ウイルス由来の核移行シグナルを有しておらず、ＳｐＣａｓ９タンパク質のＣ末端に、マウス由来のＣｄｔ１タンパク質の第２９～５４番目からなるペプチドを連結した融合タンパク質（以下、「Ｃａｓ９－ｐＮＮｍＣ」という場合がある。）を発現するベクター（配列番号３４、以下、「ｐＸ３３０－ｐＮＮｍＣ」という場合がある。）を作製した。図８（ｆ）に、ｐＸ３３０－ｐＮＮｍＣベクターの構造を示す。
　また、ＳＶ４０ウイルス由来の核移行シグナルを有しておらず、ＳｐＣａｓ９タンパク質のＣ末端に、マウス由来のＣｄｔ１タンパク質の第５４～８０番目からなるペプチドを連結した融合タンパク質（以下、「Ｃａｓ９－ｐＮＣｍＣ」という場合がある。）を発現するベクター（配列番号３５、以下、「ｐＸ３３０－ｐＮＣｍＣ」という場合がある。）を作製した。図８（ｇ）に、ｐＸ３３０－ｐＮＣｍＣベクターの構造を示す。
［実験例９］
（Ｃａｓ９融合タンパク質の細胞内局在の検討１）
　ヒト胎児腎由来の細胞であるＨＥＫ２９３Ｔ細胞を用いて、実験例８で作製した発現ベクターの導入により発現する各融合タンパク質の細胞内局在を検討した。
　まず、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞に、ｐＸ３３０－ｐＦｍＣベクター、ｐＸ３３０－ｐＣｍＣベクター、ｐＸ３３０－ｐＭｍＣベクター、ｐＸ３３０－ｐＮｍＣベクター、ｐＸ３３０－ｐＮＮｍＣベクター、ｐＸ３３０－ｐＮＣｍＣベクターをそれぞれ導入した。また、比較のためにｐＸ３３０ベクターを導入したＨＥＫ２９３Ｔ細胞も用意した。
　これらのベクターにコードされる各融合タンパク質には、３×ＦＬＡＧタグペプチドが連結されている。そこで、抗ＦＬＡＧ抗体を用いた免疫染色により、各Ｃａｓ９タンパク質を検出することができる。
　続いて、各細胞をホルムアルデヒド固定し、抗ＦＬＡＧ抗体を用いて免疫染色した。また、ＤＡＰＩで核を染色した。続いて、染色した各細胞を蛍光顕微鏡で観察した。
　図９は、免疫染色の結果を示す蛍光顕微鏡写真である。図９中、「ｐＸ３３０」は、ｐＸ３３０ベクターを導入した結果であることを示し、「ｐＸ３３０－ｐＦｍＣ」はｐＸ３３０－ｐＦｍＣベクターを導入した結果であることを示し、「ｐＸ３３０－ｐＣｍＣ」はｐＸ３３０－ｐＣｍＣベクターを導入した結果であることを示し、「ｐＸ３３０－ｐＭｍＣ」はｐＸ３３０－ｐＭｍＣベクターを導入した結果であることを示し、「ｐＸ３３０－ｐＮｍＣ」はｐＸ３３０－ｐＮｍＣベクターを導入した結果であることを示し、「ｐＸ３３０－ｐＮＮｍＣ」はｐＸ３３０－ｐＮＮｍＣベクターを導入した結果であることを示し、「ｐＸ３３０－ｐＮＣｍＣ」はｐＸ３３０－ｐＮＣｍＣベクターを導入した結果であることを示す。また、「ＤＡＰＩ」はＤＡＰＩで核を染色した結果であることを示し、「ＦＬＡＧ」は抗ＦＬＡＧ抗体を用いた免疫染色により、各Ｃａｓ９タンパク質を検出した結果であることを示し、「Ｏｖｅｒｌａｙ」は、ＤＡＰＩによる染色結果と抗ＦＬＡＧ抗体による染色結果を合成した結果であることを示す。
　その結果、Ｃａｓ９－ｐＦｍＣ融合タンパク質及びＣａｓ９－ｐＮｍＣ融合タンパク質は、核に移行したことが明らかとなった。これに対し、ｐＸ３３０ベクターを導入して発現させたＳｐＣａｓ９タンパク質、Ｃａｓ９－ｐＣｍＣ融合タンパク質、Ｃａｓ９－ｐＭｍＣ融合タンパク質、Ｃａｓ９－ｐＮＮｍＣ融合タンパク質及びＣａｓ９－ｐＮＣｍＣ融合タンパク質は、核への移行性が認められなかった。
［実験例１０］
（Ｃａｓ９融合タンパク質の細胞内局在の検討２）
　実験例９で各融合タンパク質を発現させたＨＥＫ２９３Ｔ細胞から、市販のキット（コード番号「２９５－７３９０１」、和光純薬工業）を用いて可溶性核タンパク質画分及び細胞質タンパク質画分をそれぞれ抽出し、ウエスタンブロッティング法により各Ｃａｓ９融合タンパク質を検出した。
　図１０（ａ）は、抗ＦＬＡＧ抗体で各Ｃａｓ９融合タンパク質を検出した結果を示す写真である。また、図１０（ｂ）は、抗Ｃａｓ９抗体で各Ｃａｓ９融合タンパク質を検出した結果を示す写真である。その結果、実験例９の結果と同様に、Ｃａｓ９－ｐＦｍＣ融合タンパク質及びＣａｓ９－ｐＮｍＣ融合タンパク質は、細胞質よりも核で多く検出され、核に移行したことが確認された。
　図１０（ｃ）は、対照として核タンパク質であるＰＡＲＰ１を抗ＰＡＲＰ１抗体で検出した結果を示す写真である。また、図１０（ｄ）は、対照として細胞質タンパク質であるＧＡＰＤＨを抗ＧＡＰＤＨ抗体で検出した結果を示す写真である。その結果、各タンパク質画分及び細胞質画分を抽出できていることが確認された。
　図１１は、実験例９及び１０の結果に基づいて、各Ｃａｓ９融合タンパク質の構造と核移行性をまとめた図である。図１１中、「〇」は核移行性が高いことを示し、「×」は核移行性が認められなかったことを示す。
［実験例１１］
（Ｃａｓ９融合タンパク質の分解性の検討）
　ヒト胎児腎由来の細胞であるＨＥＫ２９３Ｔ細胞を用いて、実験例８で作製したＣａｓ９－ｐＦｍＣ融合タンパク質及びＣａｓ９－ｐＮｍＣ融合タンパク質の分解性を検討した。
　まず、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞に、ｐＸ３３０－ｐＦｍＣベクター、ｐＸ３３０－ｐＮｍＣベクターをそれぞれ導入した。また、比較のためにｐＸ３３０ベクターを導入したＨＥＫ２９３Ｔ細胞も用意した。
　続いて、各細胞をホルムアルデヒド固定し、抗ＦＬＡＧ抗体を用いて免疫染色した。また、ＤＡＰＩで核を染色した。続いて、染色した各細胞を蛍光顕微鏡で観察した。
　図１２は、免疫染色の結果を示す蛍光顕微鏡写真である。図９中、「ｐＸ３３０」は、ｐＸ３３０ベクターを導入した結果であることを示し、「ｐＸ３３０－ｐＦｍＣ」はｐＸ３３０－ｐＦｍＣベクターを導入した結果であることを示し、「ｐＸ３３０－ｐＮｍＣ」はｐＸ３３０－ｐＮｍＣベクターを導入した結果であることを示しす。また、「ＤＡＰＩ」はＤＡＰＩで核を染色した結果であることを示し、「ＦＬＡＧ」は抗ＦＬＡＧ抗体を用いた免疫染色により、各Ｃａｓ９タンパク質を検出した結果であることを示す。
　その結果、Ｃａｓ９－ｐＮｍＣ融合タンパク質は、Ｃａｓ９－ｐＦｍＣ融合タンパク質よりも抗ＦＬＡＧ抗体の蛍光強度が高く検出された。この結果は、Ｃａｓ９－ｐＮｍＣ融合タンパク質がＣａｓ９－ｐＦｍＣ融合タンパク質よりも分解されにくいことを示す。
　本発明により、ＫＯ効率やＫＩ効率を向上させる修飾型Ｃａｓ９を提供することができる。

Claims (8)

  1. 　Ｃａｓ９タンパク質と、前記Ｃａｓ９タンパク質を修飾する修飾ペプチドとを含む融合タンパク質であって、
    　前記修飾ペプチドは、配列番号２９に記載のアミノ酸配列からなるペプチド、又は配列番号２９に記載のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ前記Ｃａｓ９タンパク質との融合タンパク質を形成することにより前記Ｃａｓ９タンパク質を核に局在させる活性を有するペプチド、を含む、
    　融合タンパク質。
  2. 　前記修飾ペプチドは、配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるペプチド、又は配列番号１に記載のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ前記Ｃａｓ９タンパク質との融合タンパク質を形成することにより前記Ｃａｓ９タンパク質を核に局在させる活性を有するペプチド、を含む、請求項１に記載の融合タンパク質。
  3. 　前記修飾ペプチドが、配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるペプチド、又は配列番号２に記載のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ前記Ｃａｓ９タンパク質との融合タンパク質を形成することにより前記Ｃａｓ９タンパク質をＧ１期に分解させる活性を有するペプチド、を更に含む、請求項１又は２に記載の融合タンパク質。
  4. 　前記修飾ペプチドが、前記Ｃａｓ９タンパク質のＮ末端、Ｃ末端又はＮ末端若しくはＣ末端以外の部位に配置されている、請求項１～３のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
  5. 　請求項１～４のいずれか一項に記載の融合タンパク質をコードする核酸。
  6. 　請求項１～４のいずれか一項に記載の融合タンパク質を細胞中のゲノムＤＮＡに接触させることを含む、ゲノムＤＮＡが編集された細胞の製造方法。
  7. 　前記細胞が受精卵である、請求項６に記載の製造方法。
  8. 　請求項１～４のいずれか一項に記載の融合タンパク質を受精卵中のゲノムＤＮＡに接触させ、ゲノムＤＮＡが編集された受精卵を得ることと、
    　前記ゲノムＤＮＡが編集された受精卵を個体に成長させ、ゲノムＤＮＡが編集された動物を得ることと、
    　を含む、ゲノムＤＮＡが編集された動物の製造方法。
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