BR112016013400B1 - Método in vitro para modificar um genoma em um lócus genômico de interesse em uma célula pluripotente - Google Patents

Método in vitro para modificar um genoma em um lócus genômico de interesse em uma célula pluripotente Download PDF

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Abstract

MÉTODOS PARA MODIFICAR UM GENOMA E PARA PRODUZIR UM CAMUNDONGO. Composições e métodos são providos para modificar um locus genômico de interesse em uma célula eucariótica, uma célula de mamífero, uma célula humana ou uma célula não humana de mamífero usando um vetor direcionado amplo (LTVEC) compreendendo várias sequências de ácido nucleico endógenas ou exógenas como descrito nesse documento. Métodos adicionais combinam o uso do LTVEC com um sistema CRISPR/Cas. Composições e métodos para gerar um animal não humano geneticamente modificado compreendendo uma ou mais modificações genéticas direcionadas em sua linha germinal são também providas.

Description

REFERÊNCIA CRUZADA A PEDIDOS RELACIONADOS
[0001] Este pedido reivindica o benefício do Pedido de Patente Provisório U.S. Pedido de Patente Provisória 61/914,768, arquivado 11 de dezembro de 2013, US Pedido de Patente Provisória No. 62/017.416, apresentado 26 de junho de 2014, US Pedido de Patente Provisória 62/029,261, arquivado 25 de julho de 2014, US Pedido de Patente Provisória No. 62/052,906, arquivado 19 de setembro de 2014, US Pedido de Patente Provisória No. 62/059.527, arquivado 03 de outubro de 2014, e US Pedido de Patente Provisória No. 62/064.384, depositado em 15 de outubro de 2014, cada uma das quais é aqui incorporada por referência na sua totalidade para todos os fins.
REFERÊNCIA A UMA LISTAGEM DE SEQUÊNCIA SUBMETIDA COMO ARQUIVO DE TEXTO VIA EFS-WEB
[0002] A cópia oficial da listagem de sequências é submetida eletronicamente através de EFS-Web como uma listagem de seqüência de formato ASCII com um arquivo nomeado 453460SEQLIST.TXT, criado em 15 de Outubro de 2014, e que tem um tamanho de 27,5 kilobytes e foi arquivado simultaneamente com o relatório descritivo. A listagem de sequências contidas neste documento de formato ASCII é parte do relatório descritivo e é aqui incorporada por referência em sua totalidade.
FUNDAMENTOS DA INVENÇÃO
[0003] Embora ratos tenham sido considerados como um importante sistema de modelo animal que podem recapitular a patologia de várias doenças humanas, incluindo, mas não se limitando a, doenças cardiovasculares (por exemplo., Hipertensão), metabólicos (por exemplo., Obesidade, diabetes), neurológicas (por exemplo., patologias de dor) e uma variedade de cânceres, o uso de ratos no molde de doenças humanas tem sido limitado, em comparação com camundongos, em parte devido à indisponibilidade de células de ratos pluripotentes germinativas- transmissíveis, que podem sustentar a sua pluripotência após uma série de modificações genéticas in vitro, por exemplo, uma ou mais eletroporações em série, e, em parte, devido à falta de tecnologias de alvejamento eficientes que permitem a introdução ou supressão de grandes sequências de DNA genômico ou a substituição de grandes sequências de DNA genômico endógeno por sequências de ácidos nucleicos exógenos em células de rato pluripotentes.
[004] Existe uma necessidade na técnica por composições e métodos que permitem alterações específicas precisas no genoma de um organismo, o que pode abrir ou expandir atuais áreas de descoberta direcionais e validar os agentes terapêuticos mais rapidamente e facilmente.
SUMÁRIO
[005] São fornecidos métodos para a modificação de um locus genômico de interesse numa célula eucariótica através de modificação genética alvejada. Tal método compreende: (a) introduzir na célula eucariótica: (i) um vetor de alvejamento grande (LTVEC) que compreende um primeiro ácido nucleico flanqueado por um braço de homologia 5' e um braço de homologia 3' , em que o LTVEC é, pelo menos, 10 kb; (ii) uma construção de primeira expressão que compreende um primeiro promotor ligado operativamente a um segundo ácido nucleico que codifica uma proteína Cas, (iii) uma segunda construção de expressão que compreende um segundo promotor ligado operativamente a um terceiro ácido nucleico que codifica para um RNA guia (gRNA), que compreende um sequência de nucleotídeos que hibridiza para uma sequência alvo e uma CRISPR RNA (tracrRNA) de trans-ativação, em que o primeiro e o segundo promotores são ativos na célula eucariótica; e (b) a identificação de uma célula eucariótica modificada que compreende uma modificação genética alvejada no locus genômico de interesse.
[006] Numa modalidade, a modificação genética de alvo é uma modificação genética bialélica.
[007] Em uma modalidade o LTVEC é pelo menos 15 kb, pelo menos 20 kb, pelo menos 30 kb, pelo menos 40 kb, pelo menos 50 kb, pelo menos 60 kb, pelo menos 70 kb, pelo menos 80 kb ou pelo menos 90 kb. Numa outra modalidades, o LVTEC é pelo menos 100 kb, pelo menos 150 kb ou pelo menos 200 kb.
[008] Em uma modalidade, a célula eucariótica é uma célula de mamífero. Numa modalidades, a célula de mamífero é um fibroblasto.
[009] Em uma modalidade, a célula eucariótica é uma célula pluripotente. Numa modalidade, a célula pluripotente é uma célula pluripotente humana. Numa modalidade a célula pluripotente humana é uma célula tronco embrionária humana (ES) ou uma célula tronco adulta humana. Numa outra modalidade, a célula pluripotente humana é uma célula humana progenitora de desenvolvimento restrito. Numa outra modalidade, a célula pluripotente humana é uma célula tronco pluripotentes de indução humana (iPS).
[0010] Numa modalidade, a proteína Cas é Cas9.
[0011] Numa modalidade, a sequência alvo é flanqueada por uma sequência de motivo adjacente ao protoespaçador (PAM). Numa modalidade, a sequência alvo está imediatamente flanqueada na extremidade 3 'por uma sequência do motivo adjacente ao protoespaçador (PAM).
[0012] Em algumas modalidades, a soma total das porções de homologia 5 'e 3' é de cerca de 10 kb até cerca de 150 kb. Em algumas modalidades, a soma total das porções de homologia 5’ e 3’ do LTVEC é de a partir de cerca de 10 kb a cerca de 20 kb, de a partir de cerca de 20 kb a cerca de 40 kb, de a partir de cerca de 40 kb a cerca de 60 kb, de a partir de cerca de 60 kb a cerca de 80 kb, de a partir de cerca de 80 kb a cerca de 100 kb, de a partir de cerca de 100 kb a cerca de 120 kb, ou de a partir de cerca de 120 kb to 150 kb.
[0013] Os métodos proporcionam, ainda, que a modificação genética alvo compreende: (a) substituição de uma sequência endógena de ácidos nucleicos por uma sequência de ácido nucléico homóloga ou ortóloga; (b) uma deleção de uma sequência endógena de ácidos nucleicos; (c) uma deleção de uma sequência endógena de ácidos nucleicos, em que a deleção varia de cerca de 5 kb a cerca de 10 kb, de cerca de 10 kb a cerca de 20 kb, de cerca de 20 kb a cerca de 40 kb, de cerca de 40 kb a cerca de 60 kb, de cerca de 60 kb a cerca de 80 kb, de cerca de 80 kb a cerca de 100 kb , de cerca de 100 kb a cerca de 150 kb, ou de cerca de 150 kb a cerca de 200 kb, de cerca de 200 kb a cerca de 300 kb, de cerca de 300 kb a cerca de 400 kb, de cerca de 400 kb a cerca de 500 kb, de cerca de 500 kb a cerca de 1 Mb, de cerca de 1 Mb a cerca de 1,5 Mb, de cerca de 1,5 Mb a cerca de 2 Mb , de cerca de 2 Mb a cerca de 2,5 Mb ou de cerca de 2,5 Mb a cerca de 3 Mb; (d) a inserção de uma sequência do ácido nucleico exógena; (e) a inserção de uma sequência do ácido nucleico exógena que varia de cerca de 5 kb a cerca de 10 kb, de cerca de 10 kb a cerca de 20 kb, de cerca de 20 kb a cerca de 40 kb, de cerca de 40 kb a cerca de 60 kb, de cerca de 60 kb a cerca de 80 kb, de cerca de 80 kb a cerca de 100 kb, de cerca de 100 kb a cerca de 150 kb , de cerca de 150 kb a cerca de 200 kb, de cerca de 200 kb a cerca de 250 kb, de cerca de 250 kb a cerca de 300 kb, de cerca de 300 kb a cerca de 350 kb, ou de cerca de 350 kb a cerca de 400 kb; (f) a inserção de uma sequência exógena de ácido nucleico que compreende uma sequência de ácidos nucléicos homóloga ou ortóloga; (g) a inserção de uma sequência de ácidos nucleicos quimérica que compreende uma sequência de ácidos nucleicos humana e não-humana; (h) inserção de um alelo condicional flanqueado por uma sequência alvejada de recombinase de locus específico; (i) inserção de um marcador selecionável ou um gene repórter ligado operativamente a um terceiro promotor ativo na célula pluripotente; ou (j) uma combinação dos mesmos.
[0014] Numa modalidade, o locus genômico de interesse compreende (i) uma sequência alvo que é homóloga à porção de homologia 5'; e (ii) uma sequência alvo 3' que é homóloga à porção de homologia 3'.
[0015] Em algumas modalidades, a sequência alvo 5' e a sequência alvo 3' são separadas por, pelo menos, 5 kb, mas menos do que 3 MB. Em algumas modalidades, "sequência alvo 5' e a sequência alvo 3' são separadas por, pelo menos, 5 kb, mas menos do que 10 kb, pelo menos, 10 kb, mas menos do que 20 kb, pelo menos, 20 kb, mas menos do que 40 kb, pelo menos 40 kb, mas menos de 60 kb, pelo menos 60 kb, mas menos de 80 kb, pelo menos cerca de 80 kb, mas menos de 100 kb, pelo menos 100 kb, mas menos de 150 kb ou, pelo menos, 150 kb, mas menos de 200 KB, pelo menos cerca de 200 kb, mas em menos do que cerca de 300 kb, pelo menos cerca de 300 kb, mas menos do que cerca de 400 kb, pelo menos cerca de 400 kb, mas menos do que cerca de 500 kb, pelo menos cerca de 500 kb, mas menos do que cerca de 1 Mb, pelo menos cerca de 1 MB, mas menos do que cerca de 1,5 Mb, pelo menos cerca de 1.5 MB, mas menos do que cerca de 2 Mb, pelo menos cerca de 2 MB, mas menos do que cerca de 2.5 MB, ou pelo menos cerca de 2.5 MB, mas menos do que cerca de 3 MB.
[0016] Numa modalidade, o locus genômico de interesse compreende o locus (da subunidade) gama do receptor da interleucina-2, o locus ApoE , o locus RAG1 , o locus RAG2 ou ambos loci RAG1 e RAG2.
[0017] Numa modalidade, a primeira e a segunda construções de expressão estão em uma única molécula de ácido nucleico.
[0018] É ainda proporcionado um método para modificar um genoma, que compreende a exposição do genoma a uma proteína Cas e um RNA CRISPR na presença de um vetor de alvejamento grande (LTVEC) que compreende uma sequência de ácido nucleico de pelo menos 10 kb, em que, após a exposição à CAS proteína, ao RNA CRISPR e ao LTVEC, o genoma é modificado para conter, pelo menos, 10 kb de sequência de ácido nucleico.
[0019] Em alguns desses métodos, o LTVEC compreende uma sequência de ácido nucleico de pelo menos 20 kb, pelo menos, 30 kb, pelo menos 40 kb, pelo menos 50 kb, pelo menos 60 kb, pelo menos 70 kb, pelo menos 80 kb ou pelo menos 90 kb. Em alguns desses métodos, o LTVEC compreende uma sequência de ácidos nucleicos de pelo menos 100 kb, pelo menos 150 kb ou pelo menos 200 kb.
[0020] É ainda proporcionado um método para modificar um genoma, que compreende o contacto do genoma com uma proteína Cas, um RNA CRISPR que hibridiza com uma sequência alvo, e um tracrRNA na presença de um vetor de alvejamento grande (LVTEC), em que o LVTEC tem pelo menos 10 kb e compreende um primeiro ácido nucleico flanqueado com um braço de homologia 5' e um braço de homologia 3', em que após o contato com a proteína Cas, RNA CRISPR e tracrRNA na presença do LTVEC, o genoma é modificado num locus genômico de interesse para conter o primeiro ácido nucleico. A sequência alvo pode ser em ou perto do locus genômico de interesse.
[0021] Em alguns desses métodos, o genoma está em uma célula eucariótica e a proteína Cas, o RNA CRISPR, o tracrRNA e o LTVEC são introduzidos na célula eucariótica. Alguns desses métodos compreendem ainda a identificação de uma célula eucariótica modificada que compreende uma modificação genética alvejada no locus genômico de interesse.
[0022] Em alguns desses métodos, o RNA CRISPR e o tracrRNA são introduzidos em conjunto na forma de um único RNA guia (gRNA). Em outros métodos, o RNA CRISPR e o tracrRNA são introduzidos separadamente.
[0023] Em algumas de tais métodos (a) a proteína Cas é introduzida na célula eucariótica sob a forma de uma proteína, um RNA mensageiro (mRNA) que codifica a proteína Cas ou um DNA que codifica a proteína Cas; (B) o RNA CRISPR é introduzido na célula eucariótica sob a forma de um RNA ou um DNA que codifica o RNA CRISPR; e (c) o tracrRNA é introduzido na célula eucariótica sob a forma de um RNA ou um DNA que codifica o tracrRNA.
[0024] Em alguns métodos (a) o DNA que codifica a proteína CAS está na forma de uma construção de expressão que compreende um primeiro promotor ligado operativamente a um segundo ácido nucleico que codifica a proteína Cas; (b) o DNA que codifica o RNA CRISPR tem a forma de uma segunda construção de expressão que compreende um segundo promotor ligado operativamente a um terceiro ácido nucleico que codifica o RNA CRISPR; e (c) o DNA que codifica o tracrRNA está na forma de uma construção de expressão que compreende um terceiro promotor ligado operativamente a um quarto ácido nucleico que codifica o tracrRNA, em que o primeiro, segundo e terceiro promotores estão activos na célula eucariótica. Opcionalmente, a primeira, segunda e/ou terceira construções de expressão estão em uma única molécula de ácido nucleico.
[0025] Em alguns métodos (a) o DNA que codifica a proteína CAS está na forma de uma construção de expressão que compreende em primeiro lugar um primeiro promotor ligado operativamente a um segundo ácido nucleico que codifica a proteína Cas; e (b) o DNA que codifica o RNA CRISPR e o DNA que codifica o tracrRNA estão sob a forma de uma segunda construção de expressão que compreende um segundo promotor ligado operativamente a um terceiro ácido nucleico que codifica um RNA que compreende o gRNA CRISPR e o tracrRNA; em que os primeiro e segundo promotores estão activos na célula eucariótica. Opcionalmente, a primeira e a segunda construções de expressão estão em uma única molécula de ácido nucleico.
[0026] Em alguns métodos, a proteína Cas, o RNA CRISPR, e o tracrRNA são introduzidos na célula eucariótica como um complexo RNA- proteína.
[0027] Em alguns métodos, a modificação genética alvejada compreende eliminação simultânea de uma sequência de ácido nucleico endógeno no locus genômico de interesse e inserção do primeiro ácido nucleico no locus genômico de interesse. Em alguns métodos, a sequência de ácido nucleico endógena é suprimida cerca de 30 kb até cerca de 110 kb e o primeiro ácido nucleico introduzido é de cerca de 40 kb até cerca de 140 kb. Em alguns métodos, a sequência de ácido nucleico endógena suprimida é de cerca de 38 kb até cerca de 110 kb e o primeiro ácido nucleico inserido é cerca de 43 kb até cerca de 134 kb.
[0028] Em alguns métodos, a modificação genética alvo é uma modificação genética bialélica. Opcionalmente, a modificação genética bialélica compreende supressão de uma sequência de ácido nucleico endógena e inserção do primeiro ácido nucleico no locus genômico de interesse em dois cromossomos homólogos.
[0029] Em alguns métodos, a célula eucariótica modificada é um composto heterozigoto no locus genômico de interesse. Em alguns métodos, a célula eucariótica modificada é hemizigótica no locus genômico de interesse. Opcionalmente, a modificação genética alvejada no locus genômico de interesse em um cromossomo compreende supressão de uma sequência de ácido nucleico endógena e inserção do primeiro ácido nucleico. Opcionalmente, a modificação genética alvejada compreende: (1) deleção de uma sequência de ácido nucleico endógena no locus genômico de interesse em dois cromossomos homólogos; e (2) inserção do primeiro ácido nucleico no locus genômico de interesse no primeiro cromossomo e rompimento do locus genômico de interesse no segundo cromossomo. O primeiro cromossomo pode ser um dos dois cromossomos homólogos e o segundo cromossomo pode ser o outro cromossoma homólogo.
[0030] Em alguns métodos, o LTVEC é pelo menos 15 kb, pelo menos 20 kb, pelo menos 30 kb, pelo menos 40 kb, pelo menos 50 kb, pelo menos 60 kb, pelo menos 70 kb, pelo menos 80 kb ou pelo menos 90 kb. Opcionalmente, o LTVEC é pelo menos 100 kb, pelo menos 150 kb ou pelo menos 200 kb.
[0031] Em alguns métodos, o primeiro ácido nucleico é de pelo menos 20 kb, pelo menos, 30 kb, pelo menos, 40 kb, pelo menos, 50 kb, pelo menos, 60 kb, pelo menos, 70 kb, pelo menos, 80 kb, pelo menos, 90 kb, em pelo menos 100 kb, 150 kb, pelo menos, pelo menos 200 kb, pelo menos 250 kb, ou pelo menos 300 kb. Em alguns métodos, o primeiro ácido nucleico é de cerca de 40 kb até cerca de 140 kb. Em alguns métodos, o primeiro ácido nucleico é de cerca de 43 kb até cerca de 134 kb.
[0032] Em alguns métodos, a célula eucariótica é uma célula de mamífero, um fibroblasto, uma célula pluripotente, uma célula pluripotente não-humana, uma célula pluripotente de roedor, uma célula tronco embrionária (ES) de rato ou camundongo, uma célula pluripotente humana, uma célula tronco embrionária (ES) humana, uma célula tronco adulta humana, uma célula progenitora humana de desenvolvimento limitado ou uma célula tronco pulripotente de indução humana (iPS).
[0033] Em alguns métodos, a proteína Cas é Cas9. Em alguns métodos, a sequência alvo é imediatamente flanqueada por uma sequência de Motivo Adjacente ao Protoespaçador (PAM).
[0034] Em algumas modalidades, a soma total das porções de homologia 5 'e 3' é de cerca de 10 kb até cerca de 150 kb. Opcionalmente, a soma total das porções de homologia 5’ e 3’ do LTVEC é de a partir de cerca de 10 kb a cerca de 20 kb, de a partir de cerca de 20 kb a cerca de 40 kb, de a partir de cerca de 40 kb a cerca de 60 kb, de a partir de cerca de 60 kb a cerca de 80 kb, de a partir de cerca de 80 kb a cerca de 100 kb, de a partir de cerca de 100 kb a cerca de 120 kb, ou de a partir de cerca de 120 kb to 150 kb.
[0035] Em alguns métodos, a modificação genética alvo compreende: (a) substituição de uma sequência endógena de ácidos nucleicos por uma sequência de ácido nucleicos de homóloga ou ortóloga; (b) deleção de uma seqüência de ácidos nucleicos endógena; (c) deleção de uma seqüência de endógena de ácidos nucleicos, em que a exclusão varia de cerca de 5 kb de cerca de 10 kb, de cerca de 10 kb para cerca de 20 kb, de cerca de 20 kb para cerca de 40 kb, de cerca de 40 kb a cerca de 60 kb, de cerca de 60 kb a cerca de 80 kb, de cerca de 80 kb a cerca de 100 kb , de cerca de 100 kb a cerca de 150 kb, ou de cerca de 150 kb a cerca de 200 kb, de cerca de 200 kb a cerca de 300 kb, de cerca de 300 kb a cerca de 400 kb, de cerca de 400 kb a cerca de 500 kb, de cerca de 500 kb a cerca de 1 Mb, de cerca de 1 Mb a cerca de 1,5 Mb, de cerca de 1,5 Mb a cerca de 2 Mb , de cerca de 2 Mb a cerca de 2,5 Mb, ou de cerca de 2,5 Mb a cerca de 3 Mb; (d) inserção de uma sequência de ácido nucleico exógena; (e) inserção de uma sequência do ácido nucleico exógena que varia de cerca de 5kb a cerca de 10 kb, de cerca de 10 kb a cerca de 20 kb, de cerca de 20 kb a cerca de 40 kb, de cerca de 40 kb a cerca de 60 kb, de cerca de 60 kb a cerca de 80 kb, de cerca de 80 kb a cerca de 100 kb, de cerca de 100 kb a cerca de 150 kb , de cerca de 150 kb a cerca de 200 kb, de cerca de 200 kb a cerca de 250 kb, de aproximadamente 250 kb a cerca de 300 kb, de cerca de 300 kb a cerca de 350 kb, ou de cerca de 350 kb a cerca de 400 kb; (f) inserção de uma seqüência de ácidos nucleicos exógena que compreende uma seqüência de ácidos nucléicos homóloga ou ortóloga; (g) a inserção de uma seqüência de ácidos nucleicos quimérica que compreende uma sequência de ácidos nucleicos humane e uma não-humana; (h) inserção de um alelo condicional flanqueado por sequência alvo de recombinase de locus específico; (i) inserção de um marcador selecionável ou de um gene repórter ligado operativamente a um terceiro promotor ativo na célula pluripotente; ou (j) uma combinação dos mesmos.
[0036] Em alguns métodos, o locus genômico de interesse compreende (i) uma sequência alvo que é homóloga à porção de homologia 5'; e (ii) uma sequência alvo 3' que é homóloga à porção de homologia 3'. Opcionalmente, a sequência alvo 5'e a sequência alvo 3'são separadas por, pelo menos, 5kb, mas menos do que 3 Mb. Opcionalmente, sequência alvo 5' e a sequência alvo 3' são separadas por pelo menos 5 kb, mas menos do que 10 kb, pelo menos 10 kb, mas menos do que 20 kb, pelo menos 20 kb, mas menos do que 40 kb, pelo menos 40 kb, mas menos de 60 kb, pelo menos 60 kb, mas menos de 80 kb, pelo menos cerca de 80 kb, mas menos de 100 kb, pelo menos 100 kb, mas menos de 150 kb ou, pelo menos, 150 kb, mas menos de 200 KB, pelo menos cerca de 200 kb, mas em menos do que cerca de 300 kb, pelo menos cerca de 300 kb, mas menos do que cerca de 400 kb, pelo menos cerca de 400 kb, mas menos do que cerca de 500 kb, pelo menos cerca de 500 kb, mas menos do que cerca de 1 Mb, pelo menos cerca de 1 MB, mas menos do que cerca de 1,5 Mb, pelo menos cerca de 1.5 MB, mas menos do que cerca de 2 Mb, pelo menos cerca de 2 MB, mas menos do que cerca de 2.5 MB, ou pelo menos cerca de 2.5 MB, mas menos do que cerca de 3 MB. Opcionalmente, a sequência alvo 5' e a sequência alvo 3' são separadas por pelo menos 20 kb, pelo menos 30 kb, pelo menos 40 kb, pelo menos 50 kb, pelo menos 60 kb, pelo menos 70 kb, pelo menos 80 kb, pelo menos 90 kb, pelo menos 100 kb, pelo menos 110 kb, pelo menos 120 kb, pelo menos 130 kb, pelo menos 140 kb, pelo menos 150 kb, pelo menos 160 kb, pelo menos 170 kb, pelo menos 180 kb, pelo menos 190 kb ou pelo menos 200 kb. Em alguns métodos, as sequências alvo 5 'e 3' alvo são separadas por cerca de 30 kb até cerca de 110 kb. Em alguns métodos, as sequências alvo 5 'e 3' são separadas por cerca de 38 kb até cerca de 110 kb.
[0037] Em alguns métodos, o locus genômico de interesse compreende o locus (da subunidade) gama do receptor da interleucina-2, o locus ApoE , o locus RAG1 , o locus Rag2 ou ambos loci Rag1 e Rag2. Em outros métodos, o locus genômico de interesse compreende o locus Adamts5 , locus Trpa1 , locus Folh1 , ou o locus Erbb4 . Em ainda outros métodos, o locus genômico de interesse compreende o locus Lrp5 . Em ainda outros métodos, o locus genômico de interesse compreende o locus C5 (Hc) , o locus Ror1 , ou o locus Dpp4 .
[0038] Fornece-se ainda um método para produção de um animal não- humano de geração F0 quw compreende uma modificação genômica alvejada em um locus genômico de interesse, o método compreende: (a) contactar o genoma de uma célula ES não humana com uma proteína Cas, um RNA CRISPR e um tracrRNA na presença de um vetor de alvejamento grande (LTVEC) para formar uma célula ES não humana modificada, em que o LTVEC tem pelo menos 10 kb e compreende um primeiro ácido nucleico flanqueado por um braço de homologia 5' e um braço de homologia 3'; (b) identificar a célula ES não humana modificada que compreende a modificação genética alvejada no locus genômico de interesse; (C) a introdução da célula ES não humana modificada num embrião hospedeiro não humano; e (d) gestar o embrião hospedeiro não humano em uma mãe substituta, em que a mãe substituta produz o animal não-humano de geração F0 que compreende a modificação genética alvejada no locus genômico de interesse.
[0039] Em alguns desses métodos, o RNA CRISPR e o tracrRNA são introduzidos em conjunto na forma de um único RNA guia (gRNA). Em outros métodos, o RNA CRISPR e o tracrRNA são introduzidos separadamente.
[0040] Em algumas de tais métodos (a) a proteína Cas é introduzida na célula ES nõ-humana sob a forma de uma proteína, um RNA mensageiro (mRNA) que codifica a proteína Cas ou um DNA que codifica a proteína Cas; (B) o RNA CRISPR é introduzido na célula ES não-humana sob a forma de um RNA ou um DNA que codifica o RNA CRISPR; e (c) o tracrRNA é introduzido na célula ES não-humana sob a forma de um RNA ou um DNA que codifica o tracrRNA.
[0041] Em alguns destes tais métodos (a) o DNA que codifica a proteína CAS está na forma de uma construção de expressão que compreende um primeiro promotor ligado operativamente a um segundo ácido nucleico que codifica a proteína Cas; (b) o DNA que codifica o RNA CRISPR tem a forma de uma segunda construção de expressão que compreende um segundo promotor ligado operativamente a um terceiro ácido nucleico que codifica o RNA CRISPR; e (c) o DNA que codifica o tracrRNA está na forma de uma construção de expressão que compreende um terceiro promotor ligado operativamente a um quarto ácido nucleico que codifica o tracrRNA, em que o primeiro, segundo e terceiro promotores estão activos na célula ES não- humana. Opcionalmente, a primeira, segunda e terceira construções de expressão estão em uma única molécula de ácido nucleico.
[0042] Em alguns destes tais métodos (a) o DNA que codifica a proteína CAS está na forma de uma construção de expressão que compreende em primeiro lugar um primeiro promotor ligado operativamente a um segundo ácido nucleico que codifica a proteína Cas; e (b) o DNA que codifica o RNA CRISPR e o DNA que codifica o tracrRNA estão sob a forma de uma segunda construção de expressão que compreende um segundo promotor ligado operativamente a um terceiro ácido nucleico que codifica um RNA que compreende o gRNA CRISPR e o tracrRNA; em que os primeiro e segundo promotores estão activos na célula ES não-humana. Opcionalmente, a primeira e a segunda construções de expressão estão em uma única molécula de ácido nucleico.
[0043] Em alguns tais métodos, a proteína Cas, o RNA CRISPR, e o tracrRNA são introduzidos na célula ES não-humana como um complexo RNA-proteína.
[0044] Em alguns tais métodos, a modificação genética alvejada compreende eliminação simultânea de uma sequência de ácido nucleico endógeno no locus genômico de interesse e inserção do primeiro ácido nucleico no locus genômico de interesse.
[0045] Em alguns tais métodos, a modificação genética alvo é uma modificação genética bialélica. Opcionalmente, a modificação genética bialélica compreende supressão de uma sequência de ácido nucleico endógena e inserção do primeiro ácido nucleico no locus genômico de interesse em dois cromossomos homólogos.
[0046] Em alguns de tais métodos, a célula ES não humana modificada é heterozigoto composto no locus genômico de interesse. Em alguns de tais métodos, a célula ES não humana modificada é hemizigótica no locus genômico de interesse. Opcionalmente, a modificação genética alvejada no locus genômico de interesse em um cromossomo compreende supressão de uma sequência de ácido nucleico endógena e inserção do primeiro ácido nucleico. Opcionalmente, a modificação genética alvejada compreende: (1) deleção de uma sequência de ácido nucleico endógena no locus genômico de interesse em dois cromossomos homólogos; e (2) inserção do primeiro ácido nucleico no locus genômico de interesse no primeiro cromossomo e rompimento do locus genômico de interesse no segundo cromossomo. O primeiro cromossomo pode ser um dos dois cromossomos homólogos e o segundo cromossomo pode ser o outro cromossoma homólogo.
[0047] Em alguns tais métodos, a proteína Cas é Cas9.
[0048] São fornecidos ainda métodos para modificar um genoma em um locus genômico de interesse em uma célula eucariótica, uma célula de camundongo ou uma célula humana, que compreende contactar o genoma com uma proteína de Cas, um RNA CRISPR que se hibridiza para uma seqüência do alvo no locus genômico de interesse e um tracrRNA na presença de um vetor de alvejamento grande (LTVEC), no qual o LTVEC é pelo menos de 10 kb e é composto por um primeiro ácido nucleico, flanqueado por um braço de homologia 5' que é homólogo a uma sequência alvo 5' no locus genômico de interesse e um braço de homologia 3' que é homólogo a uma sequência alvo 3' no locus genômico de interesse, no qual o primeiro ácido nucleico é pelo menos de 30 kb e/ou a seqüência alvo 5' e a sequência alvo 3' são separadas por, pelo menos, 30 kb , em que após entrar em contato com a proteína de Cas, o RNA CRISPR e o tracrRNA na presença do LTVEC, o genoma é modificado para incluir uma modificação genética alvejada que compreende a inserção do primeiro ácido nucleico no locus genômico de interesse.
[0049] Qualquer um dos métodos acima pode ainda compreender a introdução da proteína Cas, do RNA CRISPR, do tracrRNA e do LTVEC na célula eucariótica, célula de camundongo ou célula humana. Qualquer dos métodos acima pode ainda compreender a identificação da célula eucariótica modificada, célula de camundongo modificada ou célula humana modificada que compreende a modificação genética alvejada no locus genômico de interesse.
[0050] Em alguns dos métodos acima, o CRISPR RNA e o tracrRNA são introduzidos em conjunto na forma de um único transcrito. Em alguns dos métodos acima, o CRISPR de RNA e o tracrRNA são introduzidos separadamente.
[0051] Em algumas dos métodos acima, (a) a proteína Cas é introduzida na célula eucariótica, célula de camundongo ou célula humana sob a forma de uma proteína, um RNA mensageiro (mRNA) que codifica a proteína Cas ou um DNA que codifica a proteína Cas; (B) o RNA CRISPR é introduzido na célula eucariótica, célula de camundongo ou célula humana sob a forma de um RNA ou um DNA que codifica o RNA CRISPR; e (c) o tracrRNA é introduzido na célula eucariótica, célula de camundongo ou célula humana sob a forma de um RNA ou um DNA que codifica o tracrRNA. Em alguns dos métodos acima, a proteína Cas, o RNA CRISPR e o tracrRNA são introduzidos na célula eucariótica, célula de camundongo ou a célula humana como um complexo RNA-proteína.
[0052] Em alguns dos métodos acima (a) o DNA que codifica a proteína CAS está na forma de uma construção de expressão que compreende um primeiro promotor ligado operativamente a um segundo ácido nucleico que codifica a proteína Cas; (b) o DNA que codifica o RNA CRISPR tem a forma de uma segunda construção de expressão que compreende um segundo promotor ligado operativamente a um terceiro ácido nucleico que codifica o RNA CRISPR; e (c) o DNA que codifica o tracrRNA está na forma de uma construção de expressão que compreende um terceiro promotor ligado operativamente a um quarto ácido nucleico que codifica o tracrRNA, em que o primeiro, segundo e terceiro promotores estão activos na célula eucariótica, célula de camundongo, célula humana. Em alguns dos métodos acima, a primeira, segunda e/ou terceira construções de expressão estão em uma única molécula de ácido nucleico.
[0053] Em alguns destes tais métodos (a) o DNA que codifica a proteína CAS está na forma de uma construção de expressão que compreende em primeiro lugar um primeiro promotor ligado operativamente a um segundo ácido nucleico que codifica a proteína Cas; e (b) o DNA que codifica o RNA CRISPR e o DNA que codifica o tracrRNA estão sob a forma de uma segunda construção de expressão que compreende um segundo promotor ligado operativamente a um terceiro ácido nucleico que codifica um RNA que compreende o gRNA CRISPR e o tracrRNA em uma única transcrição; em que os primeiro e segundo promotores estão activos na célula eucariótica, célula de camundongo e célula humana. Em alguns dos métodos acima, a primeira, segunda e/ou terceira construções de expressão estão em uma única molécula de ácido nucleico.
[0054] Em alguns métodos acima, o LTVEC é pelo menos 15 kb, pelo menos 20 kb, pelo menos 30 kb, pelo menos 40 kb, pelo menos 50 kb, pelo menos 60 kb, pelo menos 70 kb, pelo menos 80 kb ou pelo menos 90 kb. Em alguns dos métodos acima, o LTVEC é pelo menos 100 kb, pelo menos 150 kb, ou pelo menos 200 kb.
[0055] Em alguns métodos acima, o primeiro ácido nucleico é de pelo menos 20 kb, pelo menos, 30 kb, pelo menos, 40 kb, pelo menos, 50 kb, pelo menos, 60 kb, pelo menos, 70 kb, pelo menos, 80 kb, pelo menos, 90 kb, em pelo menos 100 kb, pelo menos 150 kb, pelo menos 200 kb, pelo menos 250 kb, ou pelo menos 300 kb. Em alguns métodos acima, o primeiro ácido nucleico é de cerca de 40 kb até cerca de 140 kb.
[0056] Em alguns métodos acima, a soma total das porções de homologia 5 'e 3' é de cerca de 10 kb até cerca de 150 kb. Em alguns métodos acima, a soma total das porções de homologia 5’ e 3’ do LTVEC é de a partir de cerca de 10 kb a cerca de 20 kb, de a partir de cerca de 20 kb a cerca de 40 kb, de a partir de cerca de 40 kb a cerca de 60 kb, de a partir de cerca de 60 kb a cerca de 80 kb, de a partir de cerca de 80 kb a cerca de 100 kb, de a partir de cerca de 100 kb a cerca de 120 kb, ou de a partir de cerca de 120 kb to 150 kb.
[0057] Em alguns dos métodos acima, a sequência alvo 5' e sequência alvo 3' são separadas por, pelo menos, 5 kb, mas menos do que 3 MB. Em alguns dos métodos acima, a sequência alvo 5' e a sequência alvo 3' são separadas por pelo menos 5 kb, mas menos do que 10 kb, pelo menos 10 kb, mas menos do que 20 kb, pelo menos 20 kb, mas menos do que 40 kb, pelo menos 40 kb, mas menos de 60 kb, pelo menos 60 kb, mas menos de 80 kb, pelo menos cerca de 80 kb, mas menos de 100 kb, pelo menos 100 kb, mas menos de 150 kb ou, pelo menos, 150 kb, mas menos de 200 KB, pelo menos cerca de 200 kb, mas em menos do que cerca de 300 kb, pelo menos cerca de 300 kb, mas menos do que cerca de 400 kb, pelo menos cerca de 400 kb, mas menos do que cerca de 500 kb, pelo menos cerca de 500 kb, mas menos do que cerca de 1 Mb, pelo menos cerca de 1 MB, mas menos do que cerca de 1,5 Mb, pelo menos cerca de 1.5 MB, mas menos do que cerca de 2 Mb, pelo menos cerca de 2 MB, mas menos do que cerca de 2.5 MB, ou pelo menos cerca de 2.5 MB, mas menos do que cerca de 3 MB. Em alguns dos métodos acima, a sequência alvo 5’ e a sequência alvo 3’ são separadas por pelo menos 20 kb, pelo menos 30 kb, pelo menos 40 kb, pelo menos 50 kb, pelo menos 60 kb, pelo menos 70 kb, pelo menos 80 kb, pelo menos 90 kb, pelo menos 100 kb, pelo menos 110 kb, pelo menos 120 kb, pelo menos 130 kb, pelo menos 140 kb, pelo menos 150 kb, pelo menos 160 kb, pelo menos 170 kb, pelo menos 180 kb, pelo menos 190 kb, ou pelo menos 200 kb. Em alguns dos métodos acima, a sequência alvo 5' e sequência alvo 3'são separadas por de cerca de 30 kb até cerca de 110 kb.
[0058] Em alguns dos métodos acima, a célula eucariótica não é uma célula de rato. Em alguns dos métodos acima, a célula eucariótica é uma célula pluripotente, uma célula não-pluripotente, uma célula de mamífero, uma célula humana, uma célula de mamífero não humana, uma célula de roedores, uma célula de camundongo, uma célula de hamster, uma célula que não é humana pluripotente, uma célula pluripotente humana, uma célula de roedor pluripotente ou um fibroblasto. Em alguns dos métodos acima, a célula eucariótica é uma célula primária ou uma célula imortalizada. Em alguns dos métodos acima, a célula pluripotente de roedor é uma célula tronco embrionária de camundongo ou rato (ES).
[0059] Em alguns dos métodos acima, a célula de camundongo ou a célula humana são uma célula primária ou uma célula imortalizada. Em alguns dos métodos acima, a célula de camundongo ou a célula humana é uma célula pluripotente. Em alguns dos métodos acima, a célula pluripotente de camundongo é uma célula tronco embrionária (ES) de camundongo. Em alguns dos métodos acima, a célula de humano pluripotente é uma célula- tronco embrionária (ES) de humano, uma célula-tronco de adulto humano, uma célula de progenitor humano de desenvolvimento restrito, ou uma célula- tronco (iPS) pluripotente induzida de humano. Em alguns dos métodos acima, a célula iPS de humana é mantida em um meio que compreende um meio de base e suplementos, caracterizado pelo fato de que o meio compreende: (a) um polipeptídeo de fator inibidor da leucemia (LIF); (b) um inibidor de quinase sintase de glicogênio (GSK3); e (c) um inibidor da MEK; em que o meio tem uma osmolalidade de cerca de 175 mOsm/kg a cerca de 280 mOsm/kg.
[0060] Em alguns dos métodos acima, a proteína Cas é Cas9. Em alguns dos métodos acima, a sequência alvo é imediatamente flanqueada por uma sequência de Motivo Adjacente ao Protoespaçador (PAM).
[0061] Em alguns métodos acima, a modificação genética alvejada compreende eliminação simultânea de uma sequência de ácido nucleico endógeno no locus genômico de interesse e inserção do primeiro ácido nucleico no locus genômico de interesse em uma única etapa. Em alguns dos métodos acima, a sequência de ácido nucleico endógena é suprimida cerca de 30 kb até cerca de 110 kb e o primeiro ácido nucleico introduzido é de cerca de 40 kb até cerca de 140 kb.
[0062] Em alguns dos métodos acima, a modificação genética alvo é uma modificação genética bialélica. Em alguns dos métodos acima, a modificação genética bialélica compreende supressão de uma sequência de ácido nucleico endógena e inserção do primeiro ácido nucleico no locus genômico de interesse em dois cromossomos homólogos. Em alguns dos métodos acima, a célula eucariótica modificada, a célula de camundongo modificada ou a célula humana modificada é heterozigoto composto no locus genômico de interesse. Em alguns dos métodos acima, a célula eucariótica modificada, a célula de camundongo modificada ou a célula humana modificada é hemizigótica no locus genômico de interesse. Em alguns dos métodos acima, a modificação genética alvejada no locus genômico de interesse em um cromossomo compreende deleção de uma sequência de ácido nucleico endógena e inserção do primeiro ácido nucleico. Em alguns dos métodos acima, a modificação genética alvo compreende: (1) deleção de uma sequência de ácido nucleico endógena no locus genômico de interesse no primeiro e segundo cromossomos homólogos; e (2) inserção do primeiro ácido nucleico no locus genômico de interesse no primeiro cromossomo homólogo e rompimento do locus genômico de interesse no segundo cromossomo homólogo.
[0063] Em alguns dos métodos acima, a modificação genética alvo compreende: (a) substituição de uma sequência endógena de ácidos nucleicos por uma seqüência de ácidos nucléicos homólogas ou ortólogas; (b) delção de uma seqüência endógena de ácidos nucleicos; (c) deleção de uma seqüência endógena de ácidos nucleicos, em que a deleção varia de cerca de 5 kb a cerca de 10 kb, de cerca de 10 kb a cerca de 20 kb, de cerca de 20 kb a cerca de 40 kb, de cerca de 40 kb a cerca de 60 kb, de cerca de 60 kb a cerca de 80 kb, de cerca de 80 kb a cerca de 100 kb , de cerca de 100 kb a cerca de 150 kb ou de cerca de 150 kb a cerca de 200 kb, de cerca de 200 kb a cerca de 300 kb, de cerca de 300 kb a cerca de 400 kb, de cerca de 400 kb a cerca de 500 kb, de cerca de 500 kb a cerca de 1 Mb, de cerca de 1 Mb a cerca de 1,5 Mb, de cerca de 1,5 Mb a cerca de 2 Mb , de cerca de 2 Mb a cerca de 2,5 Mb, ou de cerca de 2,5 Mb a cerca de 3 Mb; (d) a inserção de uma sequência do ácido nucleico exógena; (e) inserção de uma sequência de ácido nucleico exógena que varia de cerca de 5 kb a cerca de 10 kb, de cerca de 10 kb a cerca de 20 kb, de cerca de 20 kb a cerca de 40 kb, de cerca de 40 kb a cerca de 60 kb, de cerca de 60 kb a cerca de 80 kb, de cerca de 80 kb a cerca de 100 kb, de cerca de 100 kb a cerca de 150 kb , de cerca de 150 kb a cerca de 200 kb, de cerca de 200 kb a cerca de 250 kb, de cerca de 250 kb a cerca de 300 kb, de cerca de 300 kb a cerca de 350 kb, ou de cerca de 350 kb a cerca de 400 kb; (f) a inserção de uma seqüência de exógena de ácido nucleico que compreende uma seqüência de ácido nucléico homóloga ou ortóloga; (g) a inserção de uma seqüência de ácido nucleico quimérica que compreende uma sequência de ácido nucleico humana e uma não humana; (h) inserção de um alelo condicional flanqueado por sequências alvo de recombinase de locus específico; (i) inserção de um marcador selecionável ou um gene repórter ligado operacionalmente a um promotor ativo na célula pluripotente; ou (j) uma combinação dos mesmos.
[0064] Em alguns dos métodos acima, o locus genômico de interesse compreende o locus (da subunidade) gama do receptor da interleucina-2, o locus ApoE , locus Rag1 , locus Rag2 , tanto o locus Rag1 e o Rag2 , o locus Adamts5, o locus TRPA1 , o locus Folh1 ,o locus ErbB4 , o locus Lrp5 o locus C5 (Hc) , o locus Ror1 ou o locus DPP4 . Em alguns dos métodos acima, o locus genômico de interesse compreende DNA extracromossômico.
[0065] Fornece-se também métodos para produção de um animal não- humano de geração F0 ou camundongo que compreende uma modificação genômica alvejada em um locus genômico de interesse, compreendem: (A) modificação de uma célula ES não humana ou de camundongo utilizando qualquer um dos métodos acima; (B) a identificação da célula ES não humana ou de camundongo modificada que compreende a modificação genética alvejada no locus genômico de interesse; (C) introduzir a célula ES não humana ou de camundongo modificada num embrião não humano ou de camundongo hospedeira; e (d) gestar o embrião hospedeiro não-humano ou de camundongo em uma mãe substituta, em que a mãe substituta produz o animal ou camundongo não humano geração F0 que compreende a modificação genética alvejada no locus genômico de interesse.
BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS
[0066] 1 representa ESCs de rato que crescem como colônias esféricas compactas que normalmente se desprendem e flutuam no prato.
[0067] Figura 2A através de D retrata vários marcadores de pluripotência expressas pelo CES de rato: A representa Oct-4 (verde); B representa Sox-2 (vermelho); C representa DAPI (azul); D representa uma sobreposição de marcadores de pluripotência expressos por rESCs.
[0068] Figura 3 mostra que os ratos CES expressam níveis de luz de fosfatase alcalina (um marcador de pluripotência).
[0069] A Figura 4 representa o cariótipo para linha DA.2B, que é 42X, Y. A cariotipagem foi feita porque ratos ESCs, muitas vezes, se tornam tetraploides; as linhagens foram, então, pré-selecionadas pela contagem de spreads de cromossomos da metáfase e as linhagens com contagens, em sua maioria, foram, então, formalmente cariotipadas.
[0070] As Figuras 5A-B apresentam fotografias que mostram a análise do número de cromossomo da linhagem de células ES de rato ACI.G1.
[0071] Figuras 6A-B apresentam fotografias que mostram a análise do número de cromossomos da linhagem de células ES de rato DA.2B.
[0072] Figuras 7A-B apresentam fotografias que mostram a análise do número de cromossomos da linhagem de células ES de rato DA.2C.
[0073] A Figura 8 representa uma visão mais próxima do ESC de rato da Figura 1.
[0074] A Figura 9 apresenta a produção de quimeras por injeção de blastocistos e a transmissão do genoma ESC de rato através da linha germinativa. Quimeras foram produzidas por injeção de blastocisto usando ESC de rato ACI.G1 parental. Quimeras de elevada percentagem geralmente têm focinhos albinos.
[0075] Figura 10 representa filhotes de cutia F1 com filhotes da mesma ninhada albinos, descendentes da quimera ACI/SD identificados com um asterisco (*) na Figura 9.
[0076] A Figura 11 proporciona um esquema do locus ApoE de rato e denota com barras cinzentas o locus de corte para nucleases de dedo de zinco (ZFN1 e ZFN2). As regiões genômicas correspondentes às porções de homologia 5 'e 3' (5 kb e 5,4 kb, respectivamente) são indicados por caixas cinza escuro. Éxon 1 do gene ApoE não realiza codificação e é mostrado como uma caixa aberta mais próxima à porção 5 'de homologia. Os três intrões do gene ApoE são indicados como linhas. Os éxons 2 e 3 compreendem regiões de codificação e são mostrados como caixas cinzentas listradas. Éxon 4 contém ambas sequências de codificação e de não codificação, como é indicado pelo sombreado cinza pontilhado e a caixa aberta.
[0077] A Figura 12 representa a segmentação do locus de rato Rosa26 , o qual se situa entre os genes Setd5 e Thumpd3 como no camundongo, com o mesmo espaçamento. O Painel A mostra a estrutura do locus Rosa 26 do camundongo. Transcrições do Rosa26 de camundongo consistem em 2 ou 3 éxons. O Painel B retrata a estrutura do locus de raro Rosa26 ; o locus do rato contém um segundo éxon 1 (Ex1b) além do éxon homólogo do éxon 1 do camundongo (Ex1a); não foi identificado um terceiro éxon no rato. Painel C mostra um alelo de rato Rosa26 alvejado; braços de homologia de 5 kb cada foram clonados por PCR utilizando DNA genômico de Da rESC; o alelo alvejado contém um cassete (SA)--lacZ-hUB-neo Doador de Splicing que substitui uma deleção 117 bp no íntron de rato Rosa26 .
[0078] A Figura 13A representa um cérebro de controle de rato de tipo selvagem de 14 semanas de idade, o qual foi tingido com X-gal. O cérebro de controle mostrou um baixo nível de coloração de fundo para LacZ (vista dorsal).
[0079] Figura 13B mostra a expressão de LacZ no cérebro de um rato heterozigoto rRosa26 (14 semanas). O repórter de lacZ foi expresso ubiquamente em todo o cérebro do rRosa26 heterozigoto.
[0080] Figura 13C mostra um coração de controle e timo (inserção) de um rato de tipo selvagem de 14 semanas de idade, que foi tratado com X- gal. O coração de controle e timo mostraram um baixo nível de tingimento de fundo para LacZ.
[0081] Figura 13D mostra expressão de LacZ no coração e timo (inserção) de um rato heterozigoto rRosa26 de 14 semanas. O repórter lacZ foi expresso ubiquamente em todo o coração e timo do rROSA26 heterozigoto.
[0082] A Figura 13E mostra um pulmão de controle de um rato de tipo selvagem de 14 semanas de idade, o qual foi tratado com X-gal. O pulmão de controle apresentou um baixo nível de coloração de fundo para LacZ.
[0083] Figura 13F retrata expressão LacZ no pulmão de um rato heterozigoto rRosa26 de 14 semanas. O repórter lacZ foi expresso ubiquamente em todo o pulmão do heterozigoto rRosa26.
[0084] A Figura 13G e H representam a expressão de LacZ em embriões E12.5 de rato. Em contraste com o embrião de controle de tipo selvagem (H), que mostra um nível baixo de coloração de fundo de LacZ, o embrião heterozigoto rRosa26 apresentou uma expressão ubíqua do repórter LacZ por todo o embrião.
[0085] A figura 13I e J representam expressão de LacZ em embriões E14.5 de rato. Em contraste com o embrião de controle de tipo selvagem (J), que mostra um nível baixo de coloração de fundo de LacZ, o embrião de rato heterozigoto rRosa26 apresentou uma expressão ubíqua do repórter LacZ por todo o embrião.
[0086] A Figura 14 ilustra um evento de recombinação homólogo ou não homóloga que ocorre dentro de uma célula ES de rato após uma eletroporação de um vetor de alvejamento que compreende uma cassete de selecção (cassete de lacZ-Neo).
[0087] A Figura 15 ilustra o mecanismo pelo qual as endonucleases de edição de genoma (por exemplo, ZFNs e TALENS) introduzem uma ruptura na fita dupla (DSB) em uma sequência genômica alvo e ativam a junção de extremidades não-homólogas (NHEJ) em uma célula ES.
[0088] A Figura 16 ilustra uma técnica de alvejamento de genes que utiliza ZFN/TALENS para melhorar a eficiência de recombinação homóloga de um vetor de alvejamento. DSB representa ruptura de cadeia dupla.
[0089] A Figura 17 mostra quimeras ApoE-ZFN-AB5 produzidos pela produção de quimera e transmissão germinal de locus de rato modificado ApoE . A modificação alvejada foi assistida por nucleases de dedos de zinco.
[0090] A Figura 18 proporciona um esquema do evento de alvejamento de IL2R-Y em combinação com nucleases de dedos de zinco que têm como alvo ZFN L e D. ZFN A região do locus de rato IL2R-Y que é alvo de ZFN L e ZFN D é mostrada (SEQ ID NO: 93. loci de corte ZFN são anotados na figura.
[0091] A Figura 19 proporciona um esquema do evento de alvejamento de IL2R-Y em combinação com nucleases de dedos de zinco que têm como alvo ZFN L e D ZFN ou em combinação com gRNAs (gRNA1, gRNA2, gRNA3, gRNA4). As regiões do locus do rato IL2R-Y alvo de ZFN L e D ou ZFN gRNAs1-4 são mostradas e os loci de corte ZFN são anotados.
[0092] A Figura 20 proporciona um esquema do locus de rato ApoE e um plasmídeo de alvejamento. A esquemática superior mostra a estrutura genômica do locus de rato ApoE e as regiões genômicas correspondentes às porções de homologia 5 'e 3' (5 kb e 5,4 kb, respectivamente, caixas cinza escuro). Éxon 1 do gene ApoE não realiza codificação e é mostrado como uma caixa aberta mais próxima à porção 5 'de homologia. Os três íntrons do gene ApoE são indicados como linhas. Os éxons 2 e 3 compreendem regiões de codificação e são mostrados como caixas cinzentas listradas. Éxon 4 contém ambas sequências de codificação e de não codificação, como é indicado pelo sombreado cinza pontilhado e a caixa aberta. O painel inferior mostra o plasmídeo alvo. As porções de homologia 5 'e 3' (5 kb e 5,4 kb, respectivamente) são indicadas por caixas cinza escuro. O vetor de alvejamento compreende um gene repórter (lacZ) e uma cassete de auto- exclusão flanqueada por loci loxP (setas abertas). A cassete de auto-exclusão compreende um promotor PRM1 de camundongo operacionalmente ligado ao gene Crei e uma cassete de seleção de fármaco que compreende um promotor de ubiquitina humana operativamente ligado a um gene de resistência à neomicina.
[0093] A Figura 21A proporciona um esquema para alvejat o locus ApoE em células ES de rato usando nucleases de dedos de zinco e um vetor de alvejamento que compreende um gene repórter (lacZ) e uma cassete de auto-deleção que compreende um promotor PRM1 de rato operacionalmente ligado ao gene Crei e uma cassete de seleção de fármaco que compreende um promotor de ubiquitina humana operativamente ligado a um gene de resistência à neomicina. A Figura 21B ilustra um locus ApoE homozigótico alvo.
[0094] A Figura 22 proporciona um esquema do locus ApoE de rato e um vetor de alvejamento grande (LTVEC). O painel superior mostra a organização genômica do locus ApoE de rato e as regiões genômicas correspondentes às porções de homologia 5 'e 3' (45 kb e 23 kb, respectivamente; as caixas cinza escuro). Éxon 1 do ApoE não realiza codificação e é mostrado como uma caixa aberta mais próxima à porção 5 'de homologia. Os três íntrons do gene ApoE são indicados como linhas e os éxons 2 e 3 compreendem regiões de codificação e são mostrados como caixas cinza listradas. Éxon 4 contém ambas sequências de codificação e de não codificação, como é indicado pelo sombreado cinza pontilhado e a caixa aberta. O painel inferior mostra o LTVEC para modificar o locus ApoE de rato. As porções de homologia 5 'e 3' (45 kb e 23 kb, respectivamente) são indicadas por caixas cinza escuro. O LTVEC compreende um gene repórter (lacZ) e uma cassete de auto-deleção flanqueado por loci loxP (setas abertas),que compreendem um promotor PRM1 de rato operacionalmente ligado ao gene Crei e uma cassete de seleção de fármaco que compreende um promotor de ubiquitina humana operativamente ligado a um gene de resistência à neomicina.
[0095] A Figura 23 proporciona um esquema do locus ApoE de rato e denota com barras cinza os loci de corte para nucleases de dedo de zinco (ZFN1 e ZFN2) utilizados em conjunto com o vetor de alvejamento grande (LTVEC) para melhorar a recombinação homóloga entre o vetor de alvejamento e região cromossômica cognata alvo.
[0096] A Figura 24 representa o locus de rato IL2R-Y que foi interrompido por uma deleção de 3,2 kb e inserção de um gene repórter (eGFP) e uma cassete de auto-deleção que compreende uma cassete de seleção de fármacos (Hub-neo) e o gene Crei operativamente ligado a um promotor de PRM1 de rato.
[0097] A Figura 25 fornece uma outra representação do locus de rato IL2R-Y que tenha sido interrompida por uma deleção de 3,2 kb e da inserção de um gene repórter (eGFP) e uma cassete de auto-exclusão que compreende o gene Crei operacionalmente ligada a um rato PRM1 promotor e uma cassete de selecção de fármacos (HUB-Neo).
[0098] A Figura 26 proporciona um esquema do locus Rag2 de rato e um vetor de alvejamento grande (LTVEC) para modificar o locus Rag2. O painel superior mostra a organização genômica do locus Rag2 de rato e as regiões genômicas cognatas correspondentes às porções de homologia 5 'e 3' (48 kb e 84 kb, respectivamente; caixas cinza escuro). Rag2 compreende éxon único representado pelo sombreamento cinza pontilhado. O painel inferior é o LTVEC. As porções de homologia 5 'e 3' (48 kb e 84 kb, respectivamente) são indicadas por caixas cinza escuro. O LTVEC compreende um gene repórter (lacZ) e uma cassete de auto-deleção flanqueada por loci loxP (setas abertas) que contém um promotor PRM1 de rato operacionalmente ligado ao gene Crei e uma cassete de seleção de fármaco que contém um promotor de ubiquitina humana operativamente ligado a um gene de resistência à neomicina.
[0099] A Figura 27 fornece a estrutura genômica do locus Rag1/Rag2do rato e as regiões genômicas excluídas por qualquer alvejador deRag2 (deleção deRag2 supressão) ou alvejador duplo de Rag2/Rag1 (deleção de Rag2/Rag1).
[00100] A Figura 28 proporciona um esquema dos loci Rag2 e Rag1 e um vetor de alvejamento grande (LTVEC) utilizado para modificar os loci. O painel superior mostra a organização genômica do loci Rag1 e Rag2 de rato e as regiões genômicas cognatas correspondentes às porções de homologia 5 'e 3' (48 kb e 84 kb, respectivamente; caixas cinza escuro). Rag2 e Rag1 compreendem, cada um, um único éxon indicado por sombreado cinza pontilhado. O painel inferior é o LTVEC. As porções de homologia 5 'e 3' (48 kb e 15 kb, respectivamente) são indicadas por caixas cinza escuro. O LTVEC compreende um gene repórter (lacZ) e uma cassete de auto-deleção flanqueado por locais loxP (setas abertas),que compreendem um promotor PRM1 de rato operacionalmente ligado ao gene Crei e uma cassete de seleção de fármaco que compreende um promotor de ubiquitina humana operativamente ligado a um gene de resistência à neomicina.
[00101] Figura 29 mostra a análise de citometria de fluxo para a expressão de GFP e de marcador CD3 de células T (painéis A e D), marcador B220 de B-célula (painéis B e E) e marcador NK de células CD161a (painéis C e F) nas células mononucleares do sangue periférico (PBMC) de um rato quimérico II2rg-/y (painéis A-C) e um rato WT DA (painéis D-F). Células duplamente positiva são mostradas no quadrante R8. A Figura 29 mostra que II2rg-/y de PBMC não expressam marcadores de linfócitos maduros.
[00102] Figura 30 mostra que linfócitos GFP-positivos foram detectados no sangue periférico em 2 das 3 quimeras II2rg-/y.
[00103] Figura 31 proporciona um esquema do locus IL2RG de rato de um plasmídeo de direccionamento para a humanização completa do locus IL2RG de rato. O painel superior mostra a organização genômica do locus Il2rg de rato e as regiões genômicas cognatas correspondentes às porções de homologia 5 'e 3' (4,3 kb e 4,0 kb, respectivamente; caixas cinza). O painel inferior mostra o plasmídeo alvo. As porções de homologia 5 'e 3' (4,3 kb e 4,0 kb, respectivamente) são indicadas por caixas cinza escuro. O plasmídeo de alvejamento compreende a região genômica IL-2RG humana e um cassete de deleção flanqueado pelos locais loxP (setas abertas) que contém uma cassete de seleção de fármaco que contém um promotor de ubiquitina humana operativamente ligado a um gene de resistência à neomicina.
[00104] Figura 32 proporciona um esquema do locus IL2RG de rato de um plasmídeo de direccionamento para a humanização ecto-domínio do locus IL2rg de rato. O painel superior mostra a organização genômica do locus Il2rg de rato e as regiões genômicas cognatas correspondentes às porções de homologia 5 'e 3' (4,3 kb e 4,0 kb, respectivamente; caixas cinza). O painel inferior mostra o plasmídeo alvo. As porções de homologia 5 'e 3' (4,3 kb e 4,0 kb, respectivamente) são indicadas por caixas cinza escuro. Oplasmídeo de direccionamento compreende região genômica humana de IL-2RG e uma cassete de auto-deleção flanqueada por locais loxP (setas abertas) que contém um promotor Prm1 de rato operacionalmente ligado ao gene Crei e uma cassete de seleção de fármaco que contém um promotor de ubiquitina humana operativamente ligado a um gene de resistência à neomicina.
[00105] A Figura 33 proporciona um alinhamento de sequências da proteína IL-2ag humana (SEQ ID NO: 20; NP_000197.1); a proteína de rato IL-2ag (SEQ ID NO: 21; NP_543165.1); e a proteína quimérica IL-2ag (SEQ ID NO: 22) que compreende o ecto-domínio humano de IL-2ag fundido com o restante da proteína de rato IL-2ag. A junção entre a IL-2ag humana e de rato é indicada pela linha vertical.
[00106] Figura 34 proporciona um esquema de CRISPR/humanização assistida de Cas9 do geneLrp5 de camundongo ; o LTVEC é mostrado no painel superior e o locus Lrp5 de camundongo é mostrado no painel inferior. A região humanizada é o ectodomínio. As setas indicam locais-alvo para cada gRNA (gA, gB, gB2, gC, gD, gE2, gE, gF) e ZFN (a-d).
[00107] Figura 35 representa a percentagem que direciona eficiência do LTVEC que tem como alvo genes de tamanho crescente para deleção (Figura 35A) e LTVEC com inserções de genes humanos de tamanho crescente (Figura 35B). Os LTVECs foram usados isoladamente (quadrados cinza ou triângulos) ou em combinação com ZFNs (quadrados pretos ou triângulos).
[00108] Figura 36 proporciona um esquema de CRISPR/humanização assitida por Cas9 de toda a região codificante do gene TRPA1 de rato; o LTVEC é mostrado no painel superior e o locus TRPA1 de rato é mostrado no painel inferior. As setas indicam locais-alvo para cada gRNA(gA, gA2, gB, gC, gD, gE2, gE, gF).
[00109] Figura 37 proporciona um esquema de CRISPR/humanização assistida por Cas9 do ectodomínio (éxon 2 para parar codão) do gene Folh1 do camundongo; o LTVEC é mostrado no painel superior e o locus Folh1 do gene é mostrado no painel inferior. As setas indicam locais-alvo para cada gRNA (gA, gA2, gB, gC, gD, gE, gE2, gF).
[00110] Figura 38 proporciona um esquema de CRISPR/humanização assistida por Cas9 da região do éxon 2 até o codão de pausa do gene C5 (Hc) de rato; o LVTEC é mostrado no painel de topo e o locus C5 (Hc) de gene é mostrado no painel inferior. As setas indicam locais-alvo para cada gRNA (gA, gA2, gB, gC, gD, gE2, gE, gF).
[00111] Figura 39 proporciona um esquema de CRISPR/humanização assitida por Cas9 de toda a região codificante do gene Adamts5 de rato; o LTVEC é mostrado no painel superior e o locus Adamts5 de rato é mostrado no painel inferior. As setas indicam locais-alvo para cada gRNA(gA, gA2, gB, gC, gD, gE2, gE, gF).
[00112] Figura 40 proporciona um esquema de CRISPR/humanização assistida de Cas9 dos eixões 4-15Erbb4 de camundongo ; o LTVEC é mostrado no painel superior e o locus Erbb4 de camundongo é mostrado no painel inferior. As setas indicam locais-alvo para cada gRNA (gA, gA2, gB, gC, gD, gE2, gE, gF).
[00113] Figura 41 proporciona um esquema de CRISPR/humanização assistida de Cas9 dos eixões 2-7Ror1 de camundongo ; o LTVEC é mostrado no painel superior e o locus Ror1 de camundongo é mostrado no painel inferior. As setas indicam locais-alvo para cada gRNA(gA, gA2, gB, gC, gD, gE2, gE, gF).
[00114] Figura 42 proporciona um esquema de CRISPR/humanização assistida por Cas9 da região do éxon 2 até ao codão de paragem do gene Dpp4 do camundongo; o LTVEC é mostrado no painel superior e o locus Dpp4 do gene é mostrado no painel inferior. As setas indicam locais-alvo para cada gRNA (gA, gA2, gB, gC, gD, gE2, gE, gF).
[00115] A Figura 43 mostra cérebros de ratos do sexo feminino de 12 semanas de idade, tingidos com X-gal. Figura 43A-C mostram um cérebro de um tipo de rato selvagem e Figura 43D-F mostra um cérebro de um rato ApoE +/-. Figura 43A e D mostram vistas dorsais, Figura 43B e E mostram vistas ventrais e Figura 43C e F mostram vistas de perto.
[00116] Figura 44 mostra corações de ratos fêmeas de 12 semanas de idade (A e C) e vistas de perto correspondentes de vasos sanguíneos (B e D) tingidos com X-gal. Figura 44A e B mostram um coração e vasos sanguíneos, respectivamente, de um tipo de rato selvagem e as Figuras 44C e D mostram um coração e vasos sanguíneos, respectivamente, de um rato ApoE +/- . A coloração estava presente nas aurículas do coração e em alguns vasos (por exemplo, veia cava).
[00117] A Figura 45 mostra os fígados de ratos fêmeas de 12 semanas de idade, tingidas com X-gal. Figura 45A e B mostram um fígado de um rato tipo selvagem e as Figuras 45C e D mostram um fígado de um rato ApoE /- . Figura 45B e D são vistas aproximadas dos fígados.
[00118] A Figura 46 mostra a detecção de níveis de colesterol, LDL, HDL e triglicéridos (Figura 46A-D, respectivamente) em ratos alvos ApoEhomozigotos, ratos alvos ApoEheterozigotos e ratos do tipo selvagem de 6 semanas, 9 semanas, 12 semanas e 15 semanas.
[00119] A Figura 47 mostra um esquema de locus ApoE de rato (painel superior) e um vetor de alvejamento grande (LTVEC) que tem como alvo o locus ApoE de rato (painel inferior). O painel superior mostra a organização genômica do locus ApoE de rato e as regiões genômicas correspondentes às porções de homologia 5 'e 3' (45 kb e 23 kb, respectivamente; as caixas cinza escuro). Éxon 1 do ApoE não realiza codificação e é mostrado como uma caixa aberta mais próxima à porção 5 'de homologia. Os três íntrons do gene ApoE são indicados como linhas e os éxons 2 e 3 compreendem regiões de codificação e são mostrados como caixas cinza listradas. Éxon 4 contém ambas sequências de codificação e de não codificação, como é indicado pelo sombreado cinza pontilhado e a caixa aberta. Locais alvo para ApoE gRNA2 (SEQ ID NO: 87) e gRNA3 (SEQ ID NO: 88) estão indicados. O painel inferior mostra o LTVEC para modificar o locus ApoE de rato. As porções de homologia 5 'e 3' (45 kb e 23 kb, respectivamente) são indicadas por caixas cinza escuro. O LTVEC compreende um gene repórter (lacZ) e uma cassete de auto-deleção flanqueado por locais loxP (setas abertas),que compreendem um promotor Prm1 decamundongo operacionalmente ligado ao gene Crei e uma cassete de seleção de fármaco que compreende um promotor de ubiquitina humana operativamente ligado a um gene de resistência à neomicina.
[00120] A Figura 48 mostra um esquema de locus Rag2 de rato (painel superior) e um vetor de alvejamento grande (LTVEC) que tem como alvo o locus Rag2 de rato (painel inferior). O painel superior mostra a organização genômica do locus Rag2 de rato e as regiões genômicas cognatas correspondentes às porções de homologia 5 'e 3' (48 kb e 84 kb, respectivamente; caixas cinza escuro). Rag2 compreende éxon único representado pelo sombreamento cinza pontilhado. Locais alvo para RAG2 gRNA1 (SEQ ID NO: 89) e gRNA4 (SEQ ID NO: 90) estão indicados. O painel inferior é o LTVEC. As porções de homologia 5 'e 3' (48 kb e 84 kb, respectivamente) são indicadas por caixas cinza escuro. O LTVEC compreende um gene repórter (lacZ) e uma cassete de auto-deleção flanqueada por locais loxP (setas abertas) que contém um promotor Prm1 de rato operacionalmente ligado ao gene Crei e uma cassete de seleção de fármaco que contém um promotor de ubiquitina humana operativamente ligado a um gene de resistência à higromicina.
[00121] A Figura 49 mostra um esquema do locus IL2RG de rato (painel superior) e um plasmídeo de direccionamento para a humanização ectodomínio do locus IL2RG de rato (painel inferior). O painel superior mostra a organização genômica do locus Il2rg de rato e as regiões genômicas cognatas correspondentes às porções de homologia 5 'e 3' (4,3 kb e 4,0 kb, respectivamente; caixas cinza). Locais alvo para IL2RG gRNA2 (SEQ ID NO: 89) e gRNA4 (SEQ ID NO: 92) estão indicados. O painel inferior mostra o plasmídeo alvo. As porções de homologia 5 'e 3' (4,3 kb e 4,0 kb, respectivamente) são indicadas por caixas cinza escuro. O plasmídeo de alvejamento compreende o ecto-domínio humano da região genômica humana IL-2RG e uma cassete de auto-deleção flanqueada por locais loxP (setas abertas) que contém um promotor Prm1 de rato operacionalmente ligado ao gene Crei e uma cassete de seleção de fármaco que contém um promotor de ubiquitina humana operativamente ligado a um gene de resistência à neomicina.
[00122] Figura 50 mostra um esquema dos lociRAG2 e RAG1de rato e um vetor de alvejamento grande (LTVEC) utilizado para modificar o loci em IL2RGcélulas ES de rato alvo (clone Il2rg-CG12). O painel superior mostra a organização genômica do loci Rag1 e Rag2 de rato e as regiões genômicas cognatas correspondentes às porções de homologia 5 'e 3' (48 kb e 15 kb, respectivamente; caixas cinza). Rag2 e Rag1 compreendem, cada um, um único éxon indicado pelas setas não sombreadas. O painel inferior é o LTVEC. As porções de homologia 5 'e 3' (48 kb e 15 kb, respectivamente) são indicadas por caixas cinza. O LTVEC compreende um gene repórter (eGFP) e um gene de resistência à puromicina separados por um local de entrada de ribossoma interno (IRES) e operacionalmente ligado a um promotor de actina. O LTVEC compreende ainda um gene repórter (lacZ) e uma cassete de auto-deleção flanqueado por locais loxP (setas abertas),que compreendem um promotor Prm1 de rato operacionalmente ligado ao gene Crei e uma cassete de seleção de droga que compreende um promotor de ubiquitina humana operativamente ligado a um gene de resistência à neomicina.
[00123] A Figura 51 ilustra um esquema para a substituição de uma porção do locus humano ADAM6 com um ácido nucleico que compreende os loci de camundongo Adam6a e Adam6b utilizando um LTVEC e um guia de RNA em células iPS humanas. O local alvo para o RNA guia é indicado pela seta.
[00124] Figura 52A ilustra a morfologia apresentada pelas células iPS humanas cultivadas durante 8 dias em meio 2i. A Figura 52B ilustra a morfologia apresentada pelas células iPS humanas cultivadas por 12 dias em meio 2i.
[00125] Figuras 53A-53D mostram a morfologia das células iPS humanas cultivadas em meio VG21 de osmolalidade média ou baixa mTeSR ™ -hLIF por 6 dias. As Figuras 53A e 53B mostram a morfologia de células iPS humanas cultivadas em meio -hLIF mTeSR ™ (Figura 53A) ou meio VG2i (Figura 53B) por 6 dias. Figuras 53C e 53D mostram a morfologia das células iPS humanas cultivadas em células de alimentação de fibroblasto de prepúcio humano de recém-nascido (NUFF) em meio mTeSR ™ -hLIF (Figura 53C) ou meio VG2i (Figura 53D) por 6 dias.
[00126] A Figura 54A retrata células iPS humanas reprogramadas cultivadas em meio VG2i que foram tingidas para a fosfatase alcalina. As Figuras 54B e 54C ilustram células iPS humanas reprogramadas cultivadas em meio VG2i que foram imunotingidas para a expressão de NANOG.
[00127] Figuras 55A-55C ilustram dissociação enzimática e subcultura das células iPS humanas reprogramadas cultivadas em meio VG2i. A Figura 55A apresenta as células iPS humanas reprogramadas cultivadas em meio VG2i antes da dissociação enzimática com tripsina na ausência de um inibidor de ROCK. Figura 55B apresenta as células iPS humanas cultivadas em meio VG2i por 1 dia após a subcultura. Figura 55B apresenta as células iPS humanas cultivadas em meio VG2i por 4 dias após a subcultura.
DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO
[00128] As composições e os métodos são fornecidos para modificar um locus genômico de interesse de rato, eucariótico, eucariótico que não é derato, de mamíferos, de mamíferos que não são humanos, humanos, roedores, roedores que não são rato, camundongos ou hamster, através recombinação homóloga bacteriana (BHR) numa célula procariótica. As composições e os métodos também são fornecidos para modificar geneticamente o locus genômico de interesse, por exemplo, locus genômico de interesse de um rato, de um eucariótico, eucariótico que não é rato, de mamíferos, de mamíferos que não são humanos, humanos, roedores, roedores que não são rato ou de camundongos utilizando um vetor de alvejamento grande (LVTEC) em combinação com endonucleases. As composições e os métodos também são fornecidos para a produção de um animal não humano geneticamente modificado, por exemplo, um rato, camundongo, roedores, ou de roedores que não são ratos, que compreende uma ou mais modificações genéticas orientadas. Também são fornecidas células tronco humanas e não humanas isoladas totipotentes ou pluripotentes, em particular, células tronco embrionárias de ratos, que são capazes de sustentar pluripotência após uma ou mais modificações genéticas em série in vitro, e que são capazes de transmitir as modificações genéticas específicas para as gerações seguintes através da linha germinativa. Glossário
[00129] O termo "célula tronco embrionária" ou "células ES", tal como utilizado neste documento, inclui uma célula pluripotente ou totipotente derivada de embrião que é capaz de contribuir para todos os tecidos do embrião em desenvolvimento, dada a introdução em um embrião. O termo "célula pluripotente", tal como aqui utilizado, inclui uma célula indiferenciada que possui a capacidade de se desenvolver em mais de um tipo de células diferenciadas. O termo "células não-pluripotentes" inclui células que não são células pluripotentes.
[00130] O termo "ácido nucleico homólogo", tal como utilizado neste documento, inclui uma sequência de ácido nucleico que é idêntica ou substancialmente semelhante a uma sequência de referência conhecida. Numa modalidade, o termo "ácido nucleico homólogo" é usado para caracterizar uma sequência que possui sequência de aminoácidos que é pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou mesmo 100% idêntica a uma sequência de referência conhecida.
[00131] O termo "ácido nucleico ortólogo", tal como utilizado neste documento, inclui uma sequência de ácido nucleico de uma espécie que é funcionalmente equivalente a uma sequência de referência conhecida em outras espécies.
[00132] O termo "vetor de alvejamento grande" ou "LTVEC", tal como utilizado neste documento, inclui grandes vetores de alvejamento para células eucarióticas, que são derivados a partir de fragmentos de DNA genômico clonado maiores do que os tipicamente utilizados por outras abordagens destinadas a executar alvejamento de genes homólogos em células eucarióticas. Exemplos de LVTEC incluem, mas não estão limitados a, cromossoma bacteriano homólogo (BAC) e cromossomas artificiais de levedura (YAC).
[00133] O termo "modificação do alelo" (MOA), tal como utilizado neste documento inclui a modificação da sequência de DNA exata de um alelo de gene(s) ou locus cromossômicos (loci) em um genoma. Exemplos de "modificação do alelo (MOA)", tal como descrito neste documento incluem, mas não estão limitados a, deleções, substituições ou inserções de tão pouco como um único nucleotídeo ou deleções de gene(s) que abarca(m) muitas quilobases ou locus (loci) cromossômico(s) de interesse, bem como quaisquer e todas as modificações possíveis entre estes dois extremos.
[00134] O termo "local de recombinação", tal como utilizado neste documento, inclui uma sequência de nucleotídeos que é reconhecida por uma recombinase específica de local e que pode servir como um substrato para um evento de recombinação.
[00135] Modificações genéticas "em série" incluem duas ou mais modificações realizadas independentemente em uma célula (por exemplo, uma célula eucariótica, um célula eucariótica que não é de rato, uma célula de mamífero, uma célula humana, uma célula de mamífero que não é humana, uma célula pluripotente, uma célula não-pluripotente, uma célula pluripotente não humana, uma célula pluripotente humana, uma célula ES humana, uma célula tronco humana adulta, uma célula progenitora de desenvolvimento restrito, uma célula iPS humana, uma célula humana, uma célula de roedores, uma célula de roedor que não é de rato, uma célula de rato, uma célula de camundongo, uma célula de hamster, um fibroblasto, ou uma célula de ovário de hamster chinês (CHO) ). A primeira modificação pode ser conseguida por eletroporação ou qualquer outro método conhecido na técnica. Em seguida, uma segunda modificação é feita no mesmo genoma da célula empregando uma segunda construção de ácido nucleico apropriada. A segunda modificação pode ser conseguida por uma segunda eletroporação ou qualquer outro método conhecido na técnica. Em várias modalidades, após a primeira e a segunda modificações genéticas da mesma célula, uma terceira, uma quarta, uma quinta, uma sexta, e assim por diante, modificações genéticas em série (uma seguida de outra) podem ser conseguidas utilizando, por exemplo, eletroporação em série ou qualquer outro método adequado (em série) conhecido na técnica.
[00136] O termo "recombinase específica de local", tal como utilizado neste documento inclui um grupo de enzimas que pode facilitar a recombinação entre os "locais de recombinação", onde os dois locais de recombinação são fisicamente separados dentro de uma única molécula de ácido nucleico ou de moléculas de ácido nucleico separadas. Exemplos de "recombinase específica de local" incluem, mas não estão limitados a, recombinases Cre, FLP e Dre.
[00137] O termo "linha germinativa" em referência a uma sequência de ácido nucleicos inclui uma sequência de ácido nucleico que pode ser transmitida à progenitura.
[00138] A expressão "cadeia pesada", ou "cadeia pesada de imunoglobulina" inclui uma sequência de cadeia pesada de imunoglobulina, incluindo a sequência da região constante de cadeia pesada de imunoglobulina, de qualquer organismo. Domínios variáveis de cadeia pesada incluem três CDR de cadeia pesada e quatro regiões FR, a menos que especificado de outra forma. Os fragmentos de cadeias pesadas incluem CDR, CDR e FR e suas combinações. Uma cadeia pesada típica tem, após o domínio variável (de N-terminal a C-terminal), um domínio CH1 , uma dobradiça, um domínio CH2 , e um domínio CH3 . Um fragmento funcional de uma cadeia pesada inclui um fragmento que é capaz de reconhecer especificamente um epitopo (por exemplo, Que reconhece o epitopo com um KD no micromolar, nanomolar ou picomolar), que é capaz de expressar e secretar a partir de uma célula e que compreende pelo menos uma CDR. Domínios variáveis de cadeia pesada são codificados pela sequência da região variável de nucleotídeos que compreende geralmente segmentos VH, DH e JH derivados de um repertório de segmentos VH, DHe JH presentes na linha germinativa. Sequências, locais e nomenclatura para segmentos da cadeia pesada V, D e J para vários organismos podem ser encontrados na base de dados IMGT, que é acessível através da internet na world wide web (www) na URL "imgt.org."
[00139] A expressão "cadeia leve" inclui uma sequência de cadeia leve de imunoglobulina de qualquer organismo e, a menos que especificado de outro modo, inclui kappa humana (K) e cadeias leves lambda (X) e um VpreB, bem como cadeias leves substitutas. Domínios variáveis de cadeia leve incluem, normalmente, três CDR de cadeia leve e quatro regiões estruturais FR, a menos que especificado de outra forma. Geralmente, uma cadeia leve de comprimento total inclui, de terminal amino a terminal carboxilo, um domínio variável que inclui FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4 e uma sequência de aminoácidos da região constante de cadeia leve. Domínios variáveis da cadeia leve são codificados pela sequência de nucleotídeos região variável de cadeia leve, que compreende, geralmente, segmentos de genes V L de cadeia leve e JL cadeia leve, derivados de um repertório de segmentos de gene V e L de cadeia leve presentes na linha germinativa. Sequências, locais e nomenclatura para segmentos de gene V e L cadeia leve para vários organismos podem ser encontrados na base de dados IMGT, que é acessível através da internet na world wide web (www) na URL "imgt.org." As cadeias leves incluem aqueles , por exemplo, que não se ligam seletivamente quer a um primeiro ou a um segundo epitopo ligado seletivamente pela proteína de ligação ao epitopo em que aparecem. As cadeias leves também incluem aqueles que se ligam e reconhecem ou ajudam a cadeia pesada com a ligação e reconhecimento, um ou mais epitopos ligados seletivamente pela proteína de ligação ao epitopo em que aparecem.
[00140] A frase "operacionalmente ligado" compreende uma relação em que os componentes operacionalmente ligados funcionam na sua forma pretendida. Em uma instância, uma sequência de ácido nucleico que codifica uma proteína pode ser ligada operavelmente a sequências reguladoras (por exemplo, promotor, potenciador, sequência silenciadora, etc.) de modo a reter a regulação de transcrição adequada. Em uma instância, uma sequência de ácido nucleico de uma região variável de imunoglobulina (ou segmentos V(D)J) pode ser operativamente ligada a uma sequência de ácidos nucleicos de uma região constante de imunoglobulina, de modo a permitir a recombinação adequada entre as sequências em uma sequência de imunoglobulina pesada ou de cadeia leve.
1. Locus alvo que compreende um Ácido Nucleico
[00141] Vários métodos e composições são fornecidas, que permitem a integração de pelo menos um ácido nucleico inserido em um locus alvo. Tal como utilizado neste documento, um "local genômico de interesse" compreende qualquer segmento ou região de DNA dentro do genoma que se deseja integrar um ácido nucleico de inserção. Os termos "local genômico de interesse" e "local genômico alvo de interesse" podem ser utilizado intercambiavelmente. O locus genômico de interesse pode ser nativo para a célula ou, alternativamente, pode compreender um segmento heterólogo ou exógeno de DNA que foi integrado no genoma da célula. Tais segmentos heterólogos ou exógenos de DNA podem incluir transgenes, cassetes de expressão, fabricantes de seleção de codificação de polinucleotídeos ou regiões heterólogas ou exógenas de DNA genômico. O termo "locus" é definido neste documento como um segmento de DNA dentro do DNA genômico. As modificações genéticas, tal como descritas neste documento podem incluir uma ou mais deleções a partir de um local de interesse, adições a um local de interesse, a substituição de um local de interesse e/ou qualquer combinação dos mesmos. O locus de interesse pode compreender regiões codificadoras ou regiões reguladoras que não codificam.
[00142] O locus genômico de interesse pode ainda compreender qualquer componente de um sistema de integração alvo que inclui, por exemplo, um local de reconhecimento, um marcador de seleção, uma inserção de ácido nucleico previamente integrado, polinucleotídeos que codificam agentes de nuclease, promotores, etc. Alternativamente, o locus genômico de interesse pode ser localizado dentro de um DNA extracromossômico no interior da célula, tal como um cromossomo de levedura artificial (YAC), um cromossomo bacteriano artificial (BAC), um cromossomo artificial humano ou qualquer outra região genômica fruto de engenharia que é contida numa célula hospedeira apropriada. Em várias modalidades, o locus alvo pode compreender uma sequência de ácidos nucleicos nativa, heteróloga ou exógena de um procariota, um eucariota, um eucariota que não é um rato, leveduras, bactérias, um mamífero não humano, uma célula não humana, um roedor, um roedor que não é um rato, um ser humano, um rato, um camundongo, um hamster, um coelho, um porco, um bovino, um veado, uma ovelha, uma cabra, uma galinha, um gato, um cão, um furão, um primata (por exemplo, saguim, macacos rhesus), mamífero domesticado ou um mamífero agrícola ou qualquer outro organismo de interesse ou uma combinação. Em algumas modalidades, o locus genômico de interesse compreende uma sequência de ácido nucleico de um humano, um rato ou uma combinação dos mesmos.
[00143] Em modalidades específicas, uma célula eucariótica, uma célula eucariótica de não rato, uma célula de mamífero, uma célula de mamífero não humano, uma célula pluripotente, uma célula não pluripotente, uma célula pluripotente não humana, uma célula pluripotente humana, uma célula ES humana, uma célula-tronco adulta humana, uma célula progenitora humana de desenvolvimento restrito, uma célula iPS humana, uma célula humana, uma célula de roedor, uma célula de roedor que não rato, uma célula de rato, uma célula de camundongo, uma célula de hamster, um fibroblasto, ou uma célula CHO.
[00144] Em modalidades específicas, o locus genômico de interesse compreende um locus alvo de um "ácido nucleico de rato". Tal região compreende um ácido nucleico de um rato que é integrado no genoma de uma célula. Exemplos não limitativos do locus alvo incluem um local genômico que codifica uma proteína expressa numa célula B, um local genômico que expressa um polipeptídeo de uma célula B imatura, um local genômico que expressa um polipeptídeo de uma célula B madura, loci de imunoglobulina (Ig), ou loci do de receptor de células T, incluindo, por exemplo, um locus alfa de receptor de célula T. Exemplos adicionais de local genômico alvo incluem um locus Fcer1a , locus Tlr4 , locus Prlr , locus Notch4 , locus Accn2 , locus Adamts5 , locus Trpa1 , locus Folh1 , locus Lrp5 , locus de receptor IL2 , que inclui, por exemplo, um locus de receptor gamma de IL2 (Il2rg) , locus ApoE , locus Rag1 , locus Rag2 , locus Rag1/Rag2 e locus Erbb4 . Qualquer locus alvo pode ser a partir de um rato ou pode ser de uma célula eucariótica, um célula eucariótica que não é de rato, uma célula de mamífero, uma célula humana ou uma célula de mamífero não-humano.
[00145] Numa modalidade, o locus alvo codifica uma sequência de aminoácidos da região variável de cadeia pesada de imunoglobulina de mamífero. Numa modalidade, o locus alvo codifica uma sequência de aminoácidos da região variável de cadeia pesada de imunoglobulina de rato. Numa modalidade, o locus alvo compreende uma sequência de DNA genômico que compreende uma sequência de ácidos nucleicos de região variável de cadeia pesada de imunoglobulina de rato, camundongo ou humana não rearranjada operativamente ligada a uma sequência de ácido nucleico de região constante de cadeia pesada de imunoglobulina. Em uma modalidade, sequência de ácido nucleico de região constante de cadeia pesada de imunoglobulina é uma sequência de ácido nucleico de região constante de cadeia pesada de imunoglobulina de um rato, camundongo ou humana selecionada a partir de um CH1, dobradiça, CH2, CH3 e uma combinação destes. Numa modalidade, a região constante da sequência de ácidos nucleicos de cadeia pesada compreende um CH1-dobradiça-CH2-CH3. Numa modalidade, o locus alvo compreende uma sequência de ácidos nucleicos de região variável de cadeia pesada de imunoglobulina de rato, camundongo ou humana não rearranjada operativamente ligada a uma sequência de ácido nucleico de região constante de cadeia pesada de imunoglobulina. Em uma modalidade, sequência de ácido nucleico de região constante de cadeia pesada de imunoglobulina é uma sequência de ácido nucleico de região constante de cadeia pesada de imunoglobulina de um rato, camundongo ou humana selecionada a partir de um CH1, dobradiça, CH2, CH3 e uma combinação destes. Numa modalidade, a região constante da sequência de ácidos nucleicos de cadeia pesada compreende um CH1-dobradiça-CH2-CH3.
[00146] Numa modalidade, o locus alvo compreende uma sequência de DNA genômico que codifica uma sequência de aminoácidos da região variável de cadeia leve de imunoglobulina de mamífero. Numa modalidade, a sequência de DNA genômico compreende uma sequência de ácido nucleico de região variável de cadeia leve X e/ou K de mamífero não rearranjada.
[00147] Numa modalidade, a sequência de DNA genômico compreende uma sequência de ácido nucleico de região variável de cadeia leve X e/ou k de mamífero rearranjada. Numa forma de realização, sequência de ácidos nucleicos de região variável de cadeia leve X e/ou k não rearranjada está operacionalmente ligada a uma sequência de aminoácidos da região variável de cadeia leve de imunoglobulina de mamífero selecionada a partir de uma sequência de ácidos nucleicos de região variável de cadeia leve X e sequência de ácidos nucleicos de região variável de cadeia leve k. Em uma modalidade, sequência de ácido nucleico de região constante de cadeia leve de imunoglobulina de mamífero é uma sequência de ácido nucleico de região constante de cadeia leve de imunoglobulina de um rato. Em uma modalidade, sequência de ácido nucleico de região constante de cadeia leve de imunoglobulina de mamífero é uma sequência de ácido nucleico de região constante de cadeia leve de imunoglobulina de camundongo. Em uma modalidade, sequência de ácido nucleico de região constante de cadeia leve de imunoglobulina de mamífero é uma sequência de ácido nucleico de região constante de cadeia leve de imunoglobulina humana.
[00148] Tal como aqui utilizado, um locus ApoE , um locus (da subunidade) gama do receptor da interleucina-2 (IL2RG) , um locusRag1 , um locus Rag2 e/ou um locus Rag1/Rag2 compreendem as respectivas regiões do genoma (ou seja, um genoma de mamífero, genoma de um humano ou de um genoma de mamífero não-humano) em que cada um desses genes ou combinações de genes estão localizados. A modificação de qualquer um dos locus ApoE , locus (da subunidade) gama do receptor da interleucina-2 (IL2RG) , locus Rag2 , locus Rag1 e/ou locus Rag2/Rag1 (isto é, um locus ApoE de mamífero, ser humano ou um mamífero não-humano, o locus (da subunidade) gama do receptor da interleucina-2 , o locus Rag2 , o locus Rag1 e/ou o locus combinado Rag2/Rag1 ) podem compreender qualquer alteração desejada para o locus dado. Exemplos, não limitativos, de modificação ao locus dado (isto é, um locus de mamífero, humano ou um locus de mamífero não-humano) serão discutidas em mais detalhe neste documento.
[00149] Por exemplo, em formas de realização específicas, um ou mais de locus ApoE , locus (da subunidade) gama do receptor da interleucina-2 (IL2RG) , locusRag1 , locus Rag2 e/ou locus Rag1/Rag2 (isto é, um locus ApoE de mamífero, ser humano ou mamífero não-humano, um locus de receptor gamma de interleucina 2 de mamífero, ser humano ou mamífero não- humano , locus Rag2 de um mamífero, um ser humano ou um mamífero não- humano e/ou locus Rag2/Rag1 ) é modificado de tal modo que a actividade e/ou nível da proteína ApoE codificada ou a proteína de receptor gamma de interleucina 2 ou a proteína de Rad1 ou aproteína de RAG2 ou uma combinação de proteínas e Rag1 Rag2 são diminuídos. Em outras modalidades, a atividade da proteína ApoE, da proteína receptor gamma de interleucina 2 ,proteína Rag1 ou proteína RAG2, ou uma combinação de proteínas e Rag1 Rag2 está ausente.
[00150] Por "diminuída" entende-se qualquer redução no nível ou na atividade do gene/proteína codificada no locus de interesse. Por exemplo, uma diminuição na atividade pode compreender quer (1) uma diminuição estatisticamente significativa do nível global ou atividade de uma dada proteína (isto é, ApoE, receptor gama de interleucina 2, Rag2, Rad2 ou uma combinação de Rag1 e Rag2) incluindo, por exemplo, um nível ou atividade de 0,5%, 1%, 5%, 10%, 20%, 30% de diminuição, 40% , 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 120% ou mais quando comparado com um controle adequado. Os métodos analisar uma diminuição da concentração e/ou a atividade de qualquer um de ApoE, subunidade gama do receptor da interleucina-2, RAG1 e RAG2 são conhecidos na técnica.
[00151] Em outras modalidades, um ou mais de locus ApoE de mamífero, ser humano ou mamífero não-humano, um locus de receptor gama de interleucina 2 de mamífero, ser humano ou mamífero não-humano, um locusRAG2 de mamífero, ser humano ou mamífero não-humano, um locus RAG1 de mamífero, ser humano ou mamífero não-humano e/ou locus de RAG2/RAG1 de mamífero, ser humano ou mamífero não-humano compreendem uma modificação de tal modo que a atividade e/ou nível do polipeptídeo ApoE codificado, o polipetídeo de receptor gama de interleucina 2 , o polipeptídeo de RAG2, o polipeptídeo RAG1 ou o polipeptídeo de ambos RAG1 RAG2 são aumentados. Por "aumento" entende-se qualquer aumento do nível ou atividade do gene/polipeptídeo codificado no locus de interesse. Por exemplo, uma aumento na atividade pode compreender quer (1) uma diminuição estatisticamente significativa do nível global ou atividade de uma dada proteína (isto é, ApoE, receptor gama de interleucina 2, Rag2, Rad2 ou de Rag1 e Rag2) incluindo, por exemplo, um nível ou atividade de 0,5%, 1%, 5%, 10%, 20%, 30% de diminuição, 40% , 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 120% ou mais quando comparado com um controle adequado. Métodos para analisar um aumento na concentração e/ou atividade de proteínas de qualquer entre ApoE, RAG1, RAG2 e subunidade gama do receptor da interleucina-2 são conhecidos na técnica.
[00152] A modificação genética para o um mamífero, um ser humano ou um mamífero não-humano ApoE locus, um mamífero, um ser humano ou um mamífero não-humano gama-receptor de interleucina 2 locus, um mamífero, um ser humano ou um mamífero não-humano RAG2 locus, um mamífero, um ser humano ou um mamífero não-humano RAG1 local e/ou de um mamífero, um ser humano ou um mamífero não-humano RAG2/RAG1 locus pode compreender uma deleção de uma sequência de ácido nucleico endógeno no locus genómico, uma inserção de um ácido nucleico exógeno no locus genómico, ou uma combinação dos mesmos. A deleção e/ou inserção pode ocorrer em qualquer lugar dentro do locus dado, como discutido noutras partes deste documento.
[00153] Outras modalidades aqui proporcionadas compreendem a modificação de um ou mais locus ApoE de mamífero, humano ou de mamífero não humano, locus receptor gama de interleucina 2 de mamífero, humano ou de mamífero não humano, locus Rag2, locus Rag1 e/ou locus Rag2/Rag1 através da substituição de uma parte do locus ApoE , subunidade gama do receptor da interleucina-2,(IL2RG), locusRAG2, locus Rag1 e/ou locus RAG2/RAG1 pela parte homóloga ou ortóloga correspondente de um locus ApoE , um locus receptor gama de interleucina 2 , locusRAG2 , locus Rag1 e/ou locus Rag2/Rag1 de outro organismo.
[00154] Em ainda outras modalidades, a modificação de um ou mais locus ApoE de mamífero, humano ou de mamífero não humano, locus subunidade gama do receptor da interleucina-2, locus RAG2 , locus RAG1 e/ou locus RAG2/RAG1 é realizada através da substituição de uma parte do locus ApoE, locus (da subunidade) gama do receptor da interleucina-2 (IL2RG), locus RAG2 , locus RAG1 e/ou locus RAG2/RAG1 por uma partilha de polinucleotídeo de inserção através de todo o seu comprimento, pelo menos 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% a de uma parte de locus ApoE , locus receptor gama de interleucina 2 , locus RAG2 , locus RAG1 e/ou locus RAG2/RAG1 que ele está substituindo.
[00155] O dado polinucleotídeo inserido e/ou região correspondente do locus que está sendo eliminado, pode ser uma região de codificação, um íntron, um éxon, uma região não traduzida, uma região reguladora, um promotor ou um potencializador ou qualquer combinação dos mesmos ou qualquer parte dos mesmos. Além disso, dado o inserto de polinucleotídeo e/ou a região do locus, por exemplo, sendo excluído pode ser de qualquer comprimento desejado, incluindo, por exemplo, entre 10-100 nucleotídeos de comprimento, 100-500 nucleotídeos de comprimento, 500-1 kb nucleotídeos de comprimento, 1 Kb a 1,5 nucleotídeos kb em comprimento, de 1,5 kb a 2 nucleotídeos kb de comprimento, 2 kb e 2,5 nucleotídeos kb de comprimento, 2,5 kb a 3 nucleotídeos kb de comprimento, 3 kb a 5 nucleotídeos kb de comprimento, 5 kb a 8 nucleotídeos kb de comprimento, 8 kb a 10 kb nucleotídeos de comprimento ou mais. Em outros casos, o tamanho do inserto ou de substituição é de cerca de 5 Kb a cerca de 10 kb, a partir de cerca de 10 kb até cerca de 20 kb, a partir de cerca de 20 kb até cerca de 40 kb, a partir de cerca de 40 kb até cerca de 60 kb, desde cerca de 60 kb até cerca de 80 kb, a partir de cerca de 80 kb até cerca de 100 kb, de cerca de 100 kb até cerca de 150 kb, de cerca de 150 kb até cerca de 200 kb, de cerca de 200 kb até cerca de 250 kb, de cerca de 250 kb até cerca de 300 kb, a partir de cerca de 300 kb e 350 kb, de cerca de 350 kb até cerca de 400 kb, de cerca de 400 kb e cerca de 800 kb, de cerca de 800 kb até 1 Mb, desde cerca 300 kb até cerca 400 kb, desde cerca 400 kb até cerca 500 kb, desde cerca 500 kb até 1 Mb, desde cerca de 1 Mb a cerca de 1,5 Mb, desde cerca de 1,5 Mb a cerca de 2 Mb, de cerca de 2 Mb, a cerca de 2,5 Mb, de cerca de 2,5 Mb de cerca de 2,8 Mb, de cerca de 2,8 Mb a cerca de 3 Mb. Em outras modalidades, o dado polinucleotídeo de inserção e/ou a região do locus a ser eliminada é DE, pelo menos, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800 ou 900 nucleotídeos ou pelo menos de 1 kb, 2 kb, 3 kb, 4 kb, 5 kb, 6 kb, 7 KB, 8 KB, 9 kb, 10 kb, 11 kb, 12 kb, 13 kb, 14 kb, 15 kb, 16 kb ou maiores. Em outras modalidades, o dado de inserção de polinucleotídeo e/ou a região do locus a ser eliminada é, pelo menos, 10 kb, pelo menos 20 kb, pelo menos 30 kb, pelo menos 40 kb, pelo menos 50 kb, pelo menos 60 kb, em menos 70 kb, pelo menos 80 kb, pelo menos 90 kb, pelo menos 100 kb, pelo menos 150 kb, pelo menos 200 kb, pelo menos 250 kb, ou pelo menos 300 KB ou maior.
[00156] O dado polinucleotídeo de inserção pode ser de qualquer organismo, incluindo, por exemplo, um roedor, um roedor não-rato, uma ratazana, um camundongo, um hamster, um mamífero, um mamífero não- humano, um eucariota, um eucariota não-rato , um ser humano, um animal agrícola ou de um animal doméstico.
[00157] Como discutido em mais detalhes neste documento, vários métodos são fornecidos para gerar alterações específicas de qualquer local de interesse, incluindo, por exemplo, modificações alvejadas no locus ApoE , locus (da subunidade) gama do recepetor da interleucina-2 (IL2RG) , locus RagG2 , locus Rag1 , e/ou locus Rag2/Rag1 . São ainda proporcionados animais não-humanos geneticamente modificada , mamíferos não-humanos geneticamente modificados , eucariotas que não são de ratos geneticamente modificadas, células não-pluripotentes geneticamente modificadas, ou células pluripotentes geneticamente modificadas (por exemplo, uma célula pluripotente, uma célula pluripotente não-humana, um célula pluripotentes humana, uma célula ES humana, uma célula tronco adulta humana, uma célula progenitora humana de desenvolvimento restrito ou uma célula iPS humano), as quais compreendem uma deleção, uma inserção, uma substituição e/ou qualquer combinação dos mesmos no locus (da subunidade) gama do receptor da interleucina-2 , no locua ApoE , no locus Rag2 , no locus Rag1 e/ ou no locusRag2/Rag1. Tais modificações genéticas (incluindo aquelas que resultam na ausência de um, um decréscimo, um aumento ou uma modulação da atividade do locus alvo) são também capazes de ser transmitidas através da linha germinativa. Em modalidades específicas, as modificações genéticas resultam em um nocaute do locus alvo desejado. Esses animais não-humanos, por exemplo, encontram o uso em em uma variedade de sistemas experimentais, como discutido neste documento.
[00158] Por exemplo, nocautes de ApoE (Apolipoproteína E) oferecem um modelo animal para estudar a função endotelial, incluindo mas não limitado a, formação de placas, as mudanças de transcrição (Whole transcriptoma Shotgun Sequencing (RNA-Seq) e função ex vivo . ApoE é uma molécula de transporte importante e pode transportar lípidos, tais como colesterol, através da corrente sanguínea. ApoE também pode funcionar no sistema nervoso, por exemplo, para limpar β-amiloide do cérebro. Modificações em ApoE foram implicadas em diversas condições, incluindo, por exemplo, aterosclerose, hiperlipidemia e doença de Alzheimer. Animais com nocaute de ApoE exibem compensação prejudicada de lipoproteínas do sangue e desenvolvem aterosclerose. Assim, animais com nocaute de ApoE fornecem um modelo para estudar as condições e/ou processos, tais como, por exemplo, a função do endotélio, a formação de placas, alterações de transcrição (RNA-SEQ), hiperlipidemia, aterosclerose e doença de Alzheimer. Os ensaios para medir a atividade da ApoE são conhecidos na arte. Por exemplo, uma diminuição na atividade da ApoE pode ser medido através de ensaio para uma diminuição dos níveis da ApoE em uma amostra de sangue obtida de um sujeito por imunoensaios, tais como, por ELISA ou por técnicas de Immunoblotting. Além disso, o grande tamanho dos ratos facilita todos estes ensaios e melhora a qualidade dos dados.
[00159] RAG1 (Recombinação-Ativação de Gene 1) e RAG2 (Recombinação-Ativação de Gene 2) são as enzimas que são parte de um complexo de multi-subunidades com atividade de recombinação VDJ e desempenham um papel importante no rearranjo e recombinação de imunoglobulina e genes de receptores de células T em linfócitos. RAG1 e RAG2 induzem uma clivagem de DNA de cadeia dupla para facilitar a recombinação e junção de segmentos dos genes do receptor de células T e receptor de células B (isto é, imunoglobulina). Nocaute de de RAG1 e/ou RAG2 provoca uma perda de células B e células T no animal, resultando em imunodeficiência severa. Encontra-se uso para animais com nocaute de RAG1 e/ou RAG2, por exemplo, em estudos de xenoenxertos (isto é, xenoenxertos de células humanas em ratos), câncer, desenvolvimento de vacinas, doenças autoimune, doença infecciosa e doença de enxerto versus hospedeiro (GVHD). Vários ensaios para medir RAG1 e/ou actividade RAG2 são conhecidos na técnica e incluem, por exemplo, a medição da eficiência de recombinação ou ensaio para a presença ou ausência de células B e/ou células T num sujeito.
[00160] O receptor de IL-2 (IL-2R) é expressa na superfície de certas células do sistema imunológico e liga-se a citocina interleucina-2 (IL-2). A IL-2R é uma proteína da membrana integral, que compreende pelo menos três cadeias de subunidades distintas, incluindo, uma cadeia alfa (IL-2RA, CD25), uma cadeia beta (IL-2RB, CD122) e uma cadeia gama (IL2-Rg, CD132 ). A cadeia do receptor gama de IL-2 (também referido como IL2R—Y ou IL2Rg)é uma cadeia gama comum que é compartilhado por vários receptores de citocinas, incluindo, por exemplo, os receptores para IL-2, IL-4, IL-7, IL-9, IL-15 e IL-21. IL-2RG compreende um ectodomínio na superfície extracelular da célula, o que contribui para a ligação do ligante, um domínio transmembranar e um domínio intracelular, que pode interagir com várias moléculas para induzir vias de transdução de sinal intracelulares. o gene IL2RG é encontrado no cromossomo X em mamíferos e certas mutações no gene da cadeia gama em humanos pode causar grave imunodeficiência combinada humana ligada ao X (XSCID) caracterizada por um defeito de células T profundo. Além disso, o ecto-domínio de cadeia gama pode ser vertido para fora do receptor transmembranar e liberados como um receptor solúvel da cadeia gama. O receptor solúvel da cadeia gama pode ser detectado no sangue de um indivíduo e pode funcionar para regular a sinalização de citocina.
[00161] Em algumas modalidades, a cadeia IL-2RG não-humana é substituído pela cadeia de IL2-RG humana tal que o animal geneticamente modificado expressa uma cadeia IL-2RG totalmente humana. Em outros casos, pode ser útil para substituir apenas o ectodomínio de uma cadeia IL- 2RG não-humana com o ectodomínio da cadeia IL-2RG humana. Em tais casos, a cadeia humanizada IL-2RG resultante expressa em um não-humano compreende um ectodomínio humano, com o restante da molécula sendo do organismo nativo.
[00162] A humanização de tamanho completo de IL-2RG é útil porque os mamíferos não humanos que têm esse locus modificado irão produzir IL- 2RG humano. Isto irá permitir a detecção de IL-2RG em mamíferos não- humanos com anticorpos específicos para a IL-2RG. A ecto-humanização (isto é, substituição do ecto-domínio IL-2RG de um mamífero não humano pelo o ecto-domínio humano IL-2RG) irá resultar num polipeptídeo IL-2RG que vai ligar os ligantes humanos para IL2-RG , mas porque o domínio citoplasmático é ainda do mamífero não-humano, a forma ecto-humanizada de IL-2RG irá também interagir com o maquinário de sinalização do mamífero não-humano.
2. Modificando um Locus Alvo A. Alvejar Vetores e Inserir Ácidos Nucleicos I. Inserção de ácido nucleico
[00163] Tal como utilizado neste documento, "inserção de ácido nucleico" compreende um segmento de DNA que se deseja integrar no locus alvo. Numa modalidade, o ácido nucleico inserido compreende um ou mais polinucleotídeos de interesse. Em outras modalidades, o ácido nucleico de inserção pode compreender uma ou mais cassetes de expressão. Uma dada cassete de expressão pode compreender um polinucleotídeo de interesse, um polinucleotídeo que codifica um marcador de seleção e/ou um gene repórter, juntamente com os vários componentes de regulação que influenciam a expressão. Os exemplos não limitativos de polinucleotídeos de interesse, marcadores de seleção e genes repórter que podem ser incluídos dentro do ácido nucleico de inserção são discutidos em detalhe em outro lugar deste documento.
[00164] Em modalidades específicas, o ácido nucleico de inserção pode compreender um ácido nucleico de rato, que pode incluir um segmento de DNA genômico, um DNAc, uma região reguladora ou qualquer parte ou sua combinação. Em outras modalidades o ácido nucleico de inserção pode compreender um ácido nucleico de um eucariota, um eucariota não rato, um mamífero, um humano, um mamífero não humano, um roedor, um roedor não rato, um ser humano, um rato, um camundongo, um hamster, um coelho, um porco, um bovino, um veado, uma ovelha, uma cabra, uma galinha, um gato, um cão, um furão, um primata (por exemplo, sagui, macaco rhesus), um mamífero domesticado ou um mamífero agrícola ou qualquer outro organismo de interesse. Conforme descrito em mais pormenor neste documento, a inserção de ácido nucleico empregue nos vários métodos e composições pode resultar na "humanização" do locus alvo de interesse.
[00165] Numa modalidade, o ácido nucleico compreende uma inserção de um alelo de knock-in de, pelo menos, um éxon de um gene endógeno. Numa modalidade, o ácido nucleico compreende uma inserção de alelo de knock-in de todo o gene endógeno (isto é, "Gene-swap knock-in").
[00166] Numa modalidade, o ácido nucleico de inserção compreende um elemento regulador que inclui, por exemplo, um promotor, um potencializador ou um elemento de ligação ao repressor transcricional.
[00167] Noutras modalidades, o ácido nucleico de inserção compreende um alelo condicional. Numa modalidade, o alelo é um alelo condicional multifuncional, tal como descrito no documento US 2011/0104799, que é aqui incorporado por referência em sua totalidade. Em modalidades específicas, o alelo condicional compreende: (a) uma sequência de atuação na orientação de sentido em relação à transcrição de um gene alvo e uma cassete de seleção de fármacos em orientação anti-sentido ou sentido; (b) em orientação anti-sentido, uma sequência de nucleotídeos de interesse (NSI) e um módulo condicional por inversão (COIN, que utiliza um íntron de fraccionamento de éxon e um módulo semelhante à captura genética invertível; ver, por exemplo, US 2011/0104799, que é incorporado por referência em sua totalidade); e (c) unidades recombináveis que se recombinam após a exposição a uma primeira recombinase para formar um alelo condicional que (i) não possui a sequência de atuação e a DSC, e (ii) contém o NSI em orientação sentido e COIN em orientação anti-sentido.
[00168] O ácido nucleico de inserção possui um intervalo de a partir de cerca de 5 kb a cerca de 10 kb, de a partir de cerca de 10 kb a cerca de 20 kb, de a partir de cerca de 20 kb a cerca de 40 kb, de a partir de cerca de 40 kb a cerca de 60 kb, de a partir de cerca de 60 kb a cerca de 80 kb, de a partir de cerca de 80 kb a cerca de 100 kb, de a partir de cerca de 100 kb a cerca de 150 kb, de a partir de cerca de 150 kb a cerca de 200 kb, de a partir de cerca de 200 kb a cerca de 250 kb, de a partir de cerca de 250 kb a cerca de 300 kb, de a partir de cerca de 300 kb a cerca de 350 kb, ou de a partir de cerca de 350 kb a cerca de 400 kb;
[00169] Numa modalidade, o ácido nucleico inserido compreende uma deleção de, por exemplo, uma sequência de DNA genômico de uma célula eucariótica, um célula eucariótica que não é de rato, uma célula de mamífero, uma célula humana ou uma célula de mamífero que não é humana que varia de cerca de 1 kb a cerca de 200 kb, a partir de cerca de 2 kb até cerca de 20 kb ou desde cerca de 0,5 kb a cerca de 3 Mb. Numa modalidade, a extensão da deleção da sequência de DNA genômico é maior do que o comprimento total da porção de homologia 5 ' e porção de homologia 3' . Em uma modalidade, a extensão da deleção da sequência de DNA genômico varia de cerca de 5 kb a cerca de 10 kb, de cerca de 10 kb até cerca de 20 kb, de cerca de 20 kb até cerca de 40 kb, de cerca de 40 kb até cerca de 60 kb, de cerca de 60 kb até cerca de 80 kb, de cerca de 80 kb até cerca de 100 kb , de cerca de 100 kb até cerca de 150 kb, de cerca de 150 kb até cerca de 200 kb, de cerca de 20 kb até cerca de 30 kb, de cerca de 30 kb até cerca de 40 kb, de cerca de 40 kb até cerca de 50 kb, de cerca de 50 kb até cerca de 60 kb, de cerca de 60 kb até cerca de 70 kb, de cerca de 70 kb até cerca de 80 kb , de cerca de 80 kb até cerca de 90 kb, de cerca de 90 kb até cerca de 100 kb, de cerca de 100 kb até cerca de 110 kb, de cerca de 110 kb até cerca de 120 kb, de cerca de 120 kb até cerca de 130 kb, de cerca de 130 kb até cerca de 140 kb, de cerca de 140 kb até cerca de 150 kb, de cerca de 150 kb até cerca de 160 kb , de cerca de 160 kb até cerca de 170 kb, de cerca de 170 kb até cerca de 180 kb, de cerca de 180 kb até cerca de 190 kb, de cerca de 190 kb até cerca de 200 kb, de cerca de 200 kb até cerca de 250 kb, de cerca de 250 kb até cerca de 300 kb, de cerca de 300 kb até cerca de 350 kb, de cerca de 350 kb até cerca de 400 kb , de cerca de 400 kb até cerca de 800 kb, de cerca de 800 kb a 1 Mb, de cerca de 1 Mb até cerca de 1,5 Mb, de cerca de 1,5 Mb até cerca de 2 Mb, de aproximadamente 2 Mb, até cerca de 2,5 Mb, de cerca de 2,5 Mb até cerca de 2,8 Mb, de cerca de 2,8 Mb até cerca de 3 Mb, de cerca de 200 kb até cerca de 300 kb , de cerca de 300 kb até cerca de 400 kb, de cerca de 400 kb até cerca de 500 kb, de cerca de 500 kb até cerca de 1 Mb, de cerca de 1 Mb até cerca 1.5 Mb, de cerca 1.5M até cerca de 2 Mb, de cerca 2 Mb até cerca de 2.5 Mb, ou de cerca 2.5 Mb até cerca de 3 Mb.
[00170] Numa modalidade, o ácido nucleico compreende uma inserção ou uma substituição de um eucariota, um eucariótica que não é rato, um mamífero, uma sequência de ácidos nucleicos de um mamífero não humano ou humano com uma sequência de ácido nucleico humana homóloga ou ortóloga. Numa modalidade, o ácido nucleico compreende uma inserção ou substituição de uma sequência de DNA por uma sequência de ácidos nucleicos humana homóloga ou ortóloga em um locus endógeno que compreende a sequência de DNA correspondente.
[00171] Numa modalidade, a modificação genética é uma adição de uma sequência de ácidos nucleicos. Numa modalidade, a sequência de nucleotídeos adicionado varia entre 5 kb e 200 kb.
[00172] Numa modalidade, o ácido nucleico de inserção compreende uma modificação genética de uma sequência de codificação. Numa modalidade, a modificação genética compreende uma mutação de deleção de uma sequência de codificação. Numa modalidade, modificação genética compreende uma fusão de duas sequências de codificação endógenas.
[00173] Numa modalidade, o ácido nucleico compreende uma inserção ou uma substituição de um eucariota, um eucariótica que não é rato, um mamífero, uma sequência de ácidos nucleicos de um mamífero não humano ou humano com uma sequência de ácido nucleico humana homóloga ou ortóloga. Numa modalidade, o ácido nucleico compreende uma inserção ou substituição de uma sequência de DNA de rato por uma sequência de ácidos nucleicos humana homóloga ou ortóloga em um locus de rato endógeno que compreende a sequência de DNA de rato correspondente.
[00174] Numa modalidade, a modificação genética compreende uma deleção de uma sequência que não codifica proteína, mas não compreende uma deleção de uma sequência de codificação da proteína. Numa modalidade, a deleção da sequência que não codifica proteína compreende uma deleção de um elemento regulador. Numa modalidade, a modificação genética compreende uma deleção de um promotor. Numa modalidade, a modificação genética compreende a adição de um promotor ou um elemento regulador. Numa modalidade, a modificação genética compreende a substituição de um promotor ou um elemento regulador.
[00175] Numa modalidade, a sequência de ácidos nucleicos do vetor de alvejamento pode compreender um polinucleotídeo que, quando integrado no genoma, produzirá uma modificação genética de uma região do locus de mamífero, humano, ou de um mamífero não-humano ApoE, em que a modificação genética no locus do ApoEresulta numa diminuição na atividade da ApoE, aumento da actividade da ApoE ou uma modulação da actividade do ApoE. Numa modalidade, um knockout de ApoE ( "alelo nulo) é gerado.
[00176] Numa modalidade, a sequência de ácido nucleico do vetor de de alvejamento pode compreender um polinucleotídeo que, quando integrado no genoma, produzirá uma modificação genética de uma região de células humanas de mamífero ou de mamífero não-humano locus do receptor de interleucina-2, em que a modificação genética no locus de recpetor de interleucina-2 resulta numa diminuição da atividade do receptor de interleucina-2. Numa modalidade, um knockout do receptor de interleucina-2 (alelo nulo) é gerado.
[00177] Noutras modalidades, a inserção de ácidos nucleicos resulta na substituição de uma parte do locus ApoE da célula de mamífero, humano ou de mamífero não humano, locus receptor gama de interleucina 2 e/ou locus Rag2 e/ou locus Rag1 e/ou locus Rag2/Rag1 por parte homóloga ou ortóloga correspondente de um locus ApoE locusreceptor gama de interleucina 2, locus Rag2, locusRag1 e/ou locus Rag2/Rag1 de outro organismo.
[00178] Em ainda outras modalidades, o inserto de ácido nucleico compreende uma partilha de polinucleotídeo através de seu comprimento total de pelo menos 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% , 99% a uma porção de um locus ApoE , um locus gama do receptor de interleucina 2 , um locus RAG2 , um locus RAG1 e/ou um locus RAG2/RAG1 ele está substituindo.
[00179] O dado polinucleotídeo inserido e a região correspondente do locus de célula de mamífero, humana ou não humana, que está sendo substituído, pode ser uma região de codificação, um íntron, um éxon, uma região não traduzida, uma região reguladora, um promotor ou um potencializador ou qualquer combinação dos mesmos . Além disso, o dado inserto de polinucleotídeo e/ou a região do locus de célula de mamífero, humana ou não humana, sendo excluído pode ser de qualquer comprimento desejado, incluindo, por exemplo, entre 10-100 nucleotídeos de comprimento, 100-500 nucleotídeos de comprimento, 500-1 kb nucleotídeos de comprimento, 1 Kb a 1,5 nucleotídeos kb em comprimento, de 1,5 kb a 2 nucleotídeos kb de comprimento, 2 kb e 2,5 nucleotídeos kb de comprimento, 2,5 kb a 3 nucleotídeos kb de comprimento, 3 kb a 5 nucleotídeos kb de comprimento, 5 kb a 8 nucleotídeos kb de comprimento, 8 kb a 10 kb nucleotídeos de comprimento ou mais. Em outros casos, o tamanho do inserto ou de substituição é de cerca de 5 Kb a cerca de 10 kb, a partir de cerca de 10 kb até cerca de 20 kb, a partir de cerca de 20 kb até cerca de 40 kb, a partir de cerca de 40 kb até cerca de 60 kb, desde cerca de 60 kb até cerca de 80 kb, a partir de cerca de 80 kb até cerca de 100 kb, de cerca de 100 kb até cerca de 150 kb, de cerca de 150 kb até cerca de 200 kb, de cerca de 200 kb até cerca de 250 kb, de cerca de 250 kb até cerca de 300 kb, a partir de cerca de 300 kb e 350 kb, de cerca de 350 kb até cerca de 400 kb, de cerca de 400 kb e cerca de 800 kb, de cerca de 800 kb até 1 Mb, desde cerca de 1 Mb a cerca de 1,5 Mb, desde cerca de 1,5 Mb a cerca de 2 Mb, de cerca de 2 Mb, a cerca de 2,5 Mb, de cerca de 2,5 Mb de cerca de 2,8 Mb, de cerca de 2,8 Mb a cerca de 3 Mb. Em outras modalidades, o dado polinucleotídeo de inserção e/ou a região do locus de célula de mamífero, humana ou não humana, a ser eliminado é de, pelo menos, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800 ou 900 nucleotídeos ou pelo menos de 1 kb, 2 kb, 3 kb, 4 kb, 5 kb, 6 kb, 7 KB, 8 KB, 9 kb, 10 kb, 11 kb, 12 kb, 13 kb, 14 kb, 15 kb, 16 kb ou maiores.
[00180] Numa modalidade, o promotor é promotor constitutivamente ativo.
[00181] Numa modalidade, o promotor é um promotor indutível. Numa modalidade, o promotor indutível é um promotor quimicamente regulado. Numa forma de realização, o promotor quimicamente regulado é um promotor regulado por álcool. Numa modalidade, o promotor regulado por álcool é um promotor de gene de álcool-desidrogenase (alcA). Numa modalidade, o promotor quimicamente regulado é um promotor regulado pela tetraciclina. Numa modalidade, o promotor regulado pela tetraciclina é um - promotor responsivo a tetraciclina. Numa modalidade, o promotor regulado pela tetraciclina é uma sequência do operador de tetraciclina (tetO). Numa modalidade, o promotor regulado pela tetraciclina é um promotor Tet-On. Numa modalidade, o promotor regulado pela tetraciclina é um promotor Tet- Off. Numa modalidade, o promotor quimicamente regulado é um promotor regulado por esteroide. Numa modalidade, o promotor regulado por esteroide é um promotor de um receptor de glucocorticoides de rato. Numa modalidade, o promotor regulado por esteroide é um promotor de um receptor de estrogênio. Numa modalidade, o promotor regulado por esteroides é um promotor de um receptor de ecdisona. Numa modalidade, o promotor quimicamente regulado é um promotor regulado por metal. Numa modalidade, o promotor regulado por metal é um promotor de metaloproteínas. Numa modalidade, o promotor indutível é um promotor fisicamente regulado. Numa modalidade, o promotor fisicamente regulado é um promotor regulado por temperatura. Numa modalidade, o promotor regulado por temperatura é um promotor de choque térmico. Numa modalidade, o promotor fisicamente regulado é um promotor regulado por luz. Numa modalidade, o promotor regulado por luz é um promotor indutível por luz. Numa modalidade, o promotor regulado por luz é um promotor reprimível por luz.
[00182] Numa modalidade, o promotor é um promotor específico de tecido. Numa modalidade, o promotor é um promotor específico de neurônios. Numa modalidade, o promotor é um promotor específico de glia. Numa modalidade, o promotor é um promotor específico de células do músculo. Numa modalidade, o promotor é um promotor específico de células do coração. Numa modalidade, o promotor é um promotor específico de células renais. Numa modalidade, o promotor é um promotor específico de células do ósseas. Numa modalidade, o promotor é um promotor específico de células do endoteliais. Numa concretização, o promotor é um promotor específico de células do sistema imunológico. Numa modalidade, o promotor da célula imunitárias é um promotor de célula B. Numa modalidade, o promotor da célula imunitárias é um promotor de célula T.
[00183] Numa modalidade, o promotor é um promotor de desenvolvimento regulado. Numa modalidade, o promotor de desenvolvimento regulado é ativo apenas durante um estágio embrionário de desenvolvimento. Numa modalidade, o promotor de desenvolvimento regulado é ativo apenas em uma célula adulta.
[00184] Em modalidades específicas, o promotor pode ser selecionado com base no tipo de célula. Assim, vários promotores podem ser utilzados em uma célula eucariótica, uma célula eucariótica de não rato, uma célula de mamífero, uma célula de mamífero não humano, uma célula pluripotente, uma célula não pluripotente, uma célula pluripotente não humana, uma célula pluripotente humana, uma célula ES humana, uma célula-tronco adulta humana, uma célula progenitora humana de desenvolvimento restrito, uma célula iPS humana, uma célula humana, uma célula de roedor, uma célula de roedor que não rato, uma célula de rato, uma célula de camundongo, uma célula de hamster, um fibroblasto, ou uma célula CHO.
[00185] Em algumas modalidades, o ácido nucleico de inserção compreende um ácido nucleico flanqueado por sequências alvo de recombinação específicas de local. Reconhece-se que embora todo o ácido nucleico de inserção possa ser flanqueado por tais sequências alvo de recombinação específica do local, qualquer região ou polinucleotídeo individual de interesse dentro do ácido nucleico inserção pode também ser flanqueado por esses locais. A recombinase de local específica pode ser introduzida na célula através de qualquer meio, incluindo a introdução so polipeptídeo da recombinase na célula ou através da introdução de um polinucleotídeo que codifica a recombinase de local específico na célula hospedeira. O polinucleotídeo que codifica a recombinase específica do local pode estar localizado dentro do ácido nucleico de inserção ou dentro de um polinucleotídeo separado. A recombinase de local específico pode ser operativamente ligada a um promotor ativo na célula incluindo, por exemplo, um promotor indutível, um promotor que é endógeno à célula, um promotor que é heterólogo à célula, um promotor específico da célula, uma promotor específico do tecido, ou um promotor específico de estado de desenvolvimento. Sequências alvo de recombinação específica do local, que podem flanquear o ácido nucleico de inserção ou qualquer polinucleotídeo de interesse no ácido nucleico de inserção, podem incluir, mas não estão limitadas a,loxP, lox511, lox2272, lox66, lox71, loxM2, lox5171, FRT, FRT11, FRT71, attp, att, FRT, rox e uma combinação destes.
[00186] Em algumas modalidades, os locais de recombinação de local específico flanqueiam um polinucleotídeo que codifica um marcador de seleção e/ou um gene repórter contido dentro do ácido nucleico de inserção. Em tais casos, após integração do ácido nucleico de inserção no locus alvo, as sequências entre os locais de recombinação de local específico podem ser removidas.
[00187] Numa modalidade, o ácido nucleico de inserção compreende um polinucleotídeo que codifica um marcador de seleção. O marcador de seleção pode ser contido numa cassete de seleção. Tais marcadores de seleção incluem, mas não estão limitados, neomicina fosfotransferase (neor), higromicina B fosfotransferase (hygr), puromicina-N-acetiltransferase (puror), blasticidina S deaminase (bsrr), xantina/guanina fosforibosil transferase (gpt) ou timidina cinase do vírus de herpes simplex (HSV-K) e/ou uma combinação dos mesmos. Numa modalidade, o polinucleotídeo que codifica o marcador de seleção é ligado operacionalmente a um promotor ativo na célula, células de rato, células pluripotentes de rato, a célula ES de rato, uma célula eucariótica, uma célula eucariótica que não é de rato, uma célula pluripotente, uma célula não-pluripotente, uma célula pluripotente não- humana, uma célula pluripotente humana, uma célula ES humana, uma célula-tronco adulta humana, uma célula progenitora humana de desenvolvimento restrito, uma célula iPS humana, uma célula de mamífero, uma célula de mamífero não humana, uma célula humana, uma célula de roedores, uma célula de roedor que não é de rato, uma célula de rato, uma célula de hamster, um fibroblasto ou uma célula CHO. Quando "tiling" em série os polinucleotídeos de interesse para um local alvo, o marcador de seleção pode compreender um local de reconhecimento para um agente de nuclease, tal como delineado acima. Numa modalidade, o polinucleotídeo que codifica o marcador de seleção é flanqueado por sequências alvo de recombinação de local específico.
[00188] O ácido nucleico de inserção pode, ainda, compreender um gene repórter operacionalmente ligado a um promotor, em que o gene repórter codifica uma proteína repórter selecionado a partir do grupo que consiste em, ou compreende LacZ, mPlum, mCherry, tdTomato, mStrawberry , J-Red, DsRed, mOrange, mKO, mCitrine, Vênus, YPet, proteína fluorescente amarela reforçada (EYFP), Esmeralda, proteína verde fluorescente reforçada (EGFP), CyPet, ciano proteína fluorescente (PCP), Cerulean, T-Safira, luciferase, fosfatase alcalina e/ou uma combinação dos mesmos. Tais genes repórteres podem ser operativamente ligados a um promotor ativo na célula. Tais promotores podem ser um promotor indutível, um promotor que é endógeno ao gene repórter ou à célula, um promotor que é heterólogo ao gene repórter ou à célula, um promotor específico de célula, um promotor específico de tecido ou um promotor específico de estágio de desenvolvimento.
[00189] Numa modalidade, ácido nucleico de inserção pode compreender um ácido nucleico de mamífero, compreende um locus genômico que codifica uma proteína expressa no sistema nervoso, o sistema esquelético, sistema digestivo, sistema circulatório, sistema muscular, sistema respiratório, sistema cardiovascular , sistema linfático, sistema endócrino, sistema urinário, sistema reprodutivo ou uma combinação dos mesmos. Numa modalidade, o ácido nucleico de mamífero compreende um local genômico que codifica uma proteína expressa num medula óssea ou uma célula derivada de medula óssea. Numa modalidade, o ácido nucleico compreende um local genômico que codifica uma proteína expressa numa célula de baço.
[00190] Numa modalidade, ácido nucleico de mamífero compreende um ácido nucleico de mamífero, compreende um locus genômico que codifica uma proteína expressa no sistema nervoso, o sistema esquelético, sistema digestivo, sistema circulatório, sistema muscular, sistema respiratório, sistema cardiovascular , sistema linfático, sistema endócrino, sistema urinário, sistema reprodutivo ou uma combinação dos mesmos. Numa modalidade, o ácido nucleico de mamífero compreende um local genômico que codifica uma proteína expressa num medula óssea ou uma célula derivada de medula óssea. Numa modalidade, o ácido nucleico compreende um local genômico que codifica uma proteína expressa numa célula de baço. Numa modalidade, o locus genômico compreende uma sequência genômica de DNA de camundongo, uma sequência de DNA genômico de rato, sequência de DNA genômico eucariótica, uma sequência de DNA genômico eucariótico que não é de rato, uma sequência de DNA genômico de mamífero, uma sequência de DNA genômico humano ou sequência de DNA de mamífero não-humano ou uma combinação dos mesmos. Numa modalidade, o locus genômico compreende, em qualquer ordem, sequências de DNA genômico humano e de rato. Numa modalidade, o locus genômico compreende, em qualquer ordem, sequências de DNA genômico humano e de rato. Numa modalidade, o locus genômico compreende, em qualquer ordem, sequências de DNA genômico humano e de rato. Numa modalidade, o locus genômico compreende, em qualquer ordem, sequências de DNA genômico humano, de camundongo e de rato.
[00191] Numa modalidade, o locus genômico compreende uma sequência genômica de DNA de camundongo, uma sequência de DNA genômico de rato, uma sequência de DNA genômico de hamster, uma sequência de DNA genômico humana, uma sequência de DNA genômico eucariótica, uma sequência de DNA genômico eucariótico que não é de rato, uma sequência de DNA genômico de mamífero, sequência de DNA de mamífero não-humano ou uma combinação dos mesmos. Numa modalidade, o locus genômico compreende, em qualquer ordem, sequências de DNA genômico humano e de rato. Numa modalidade, o locus genômico compreende, em qualquer ordem, sequências de DNA genômico humano e de rato. Numa modalidade, o locus genômico compreende, em qualquer ordem, sequências de DNA genômico humano e de rato. Numa modalidade, o locus genômico compreende, em qualquer ordem, sequências de DNA genômico humano, de camundongo e de rato.
[00192] Numa modalidade, a modificação genética compreende, pelo menos, um alelo de doença humana de um gene humano. Numa modalidade, a doença humana é uma doença neurológica. Numa modalidade, a doença humana é uma doença cardiovascular. Numa modalidade, a doença humana é uma doença renal. Numa modalidade, a doença humana é uma doença muscular. Numa modalidade, a doença humana é uma doença no sangue. Em uma modalidade, a doença humana é um câncer. Numa modalidade, a doença humana é uma doença do sistema imunológico.
[00193] Numa modalidade, o alelo da doença humana é um alelo dominante. Numa modalidade, o alelo da doença humana é um alelo recessivo. Numa modalidade, o alelo de uma doença humana compreende um alelo de polimorfismo de um único nucleotídeo (SNP).
[00194] Numa modalidade, a modificação genética produz uma forma mutante de uma proteína com uma característica de ligação alterada, localização alterada, expressão alterada e/ou padrão de expressão alterado.
[00195] Numa modalidade, o ácido nucleico de inserção compreende um cassete de seleção. Numa modalidade, o cassete de seleção compreende uma sequência de ácido nucleico que codifica um marcador seletivo, em que a sequência de ácido nucleico está operativamente ligada a um promotor ativo em células ES de rato. Numa modalidade, o marcador seletivo é selecionado a partir de ou compreende um gene de resistência à higromicina ou um gene de resistência à neomicina.
[00196] Numa modalidade, o ácido nucleico compreende um local genômico que codifica uma proteína expressa numa célula B. Numa modalidade, o ácido nucleico compreende um local genômico que codifica uma proteína expressa numa célula B imatura. Numa modalidade, o ácido nucleico compreende um local genômico que codifica uma proteína expressa numa célula B madura.
[00197] Numa modalidade, o ácido nucleico de inserção compreende um elemento regulador. Numa modalidade, o elemento regulador é um promotor. Numa modalidade, o elemento regulador é um potencializador. Numa modalidade, o elemento regulador é um elemento repressor de ligação transcricional.
[00198] Numa modalidade, a modificação genética compreende uma deleção de uma sequência que não codifica proteína, mas não compreende uma deleção de uma sequência de codificação da proteína. Numa modalidade, a deleção da sequência que não codifica proteína compreende uma deleção de um elemento regulador. Numa modalidade, a modificação genética compreende uma deleção de um elemento regulador. Numa modalidade, a modificação genética compreende a adição de um promotor ou um elemento regulador. Numa modalidade, a modificação genética compreende a substituição de um promotor ou um elemento regulador.
II. Cassetes de Expressão
[00199] São proporcionados neste documento polinucleotídeos ou moléculas de ácidos nucleicos que compreendem os vários componentes utilizados no sistema de integração genômico alvo fornecido neste documento (isto é,qualquer um dos ou qualquer combinação de agentes de nuclease, locais de reconhecimento, ácidos nucleicos de inserção, polinucleotídeos de interesse, vetores de alvejamento, marcadores de seleção e outros componentes).
[00200] Os termos "polinucleotídeo", "sequência polinucleotídica", "sequência de ácido nucleico" e "fragmento de ácido nucleico" são utilizados neste documento de forma intercambiável. Estes termos englobam sequências de nucleotídeos e semelhantes. Um polinucleotídeo pode ser um polímero de RNA ou de DNA que é simples ou de cadeia duplac que contém, opcionalmente, bases nucleotídicas sintéticas, não naturais ou alteradas. Um polinucleotídeo na forma de um polímero de DNA pode compreender um ou mais segmentos de cDNA, DNA genômico, DNA sintético ou suas misturas. Os polinucleotídeos podem conter desoxirribonucleotídeos e ribonucleotídeos, que incluem tanto moléculas que ocorrem naturalmente quanto seus análogos sintéticos e qualquer combinação destes. Os polinucleotídeos aqui proporcionados também abrangem todas as formas de sequências incluindo, mas não se limitando a, formas de fita única, formas de fita dupla, hairpins, estruturas de stem-and-loop e semelhantes.
[00201] São ainda proporcionados polinucleotídeos recombinantes que compreendem os vários componentes do sistema de integração genômico alvo. Os termos "polinucleotídeo recombinante" e "construção de DNA recombinante" são utilizados neste documento de forma intercambiável. Uma construção recombinante compreende uma combinação artificial ou heteróloga de sequências de ácidos nucleicos, por exemplo, sequências de regulação e de codificação que não são encontradas juntas na natureza. Em outras modalidades, uma construção recombinante pode compreender sequências reguladoras e sequências codificadoras que são derivadas de diferentes fontes, ou sequências reguladoras e sequências de codificação derivadas da mesma fonte, mas arranjadas de um modo diferente daquele encontrado na natureza. Tal construto pode ser usada por si só ou pode ser usado em conjunto com um vetor. Se um vetor é utilizado, então a escolha do vetor depende do método que é utilizado para transformar as células hospedeiras, como é bem conhecido por aqueles versados na técnica. Por exemplo, um vetor de plasmídeo pode ser utilizado. Os elementos genéticos necessários para transformar, selecionar e propagar células hospedeiras de forma bem-sucedida, e que compreendem qualquer um dos fragmentos de ácido nucleico isolados fornecidos neste documento, são também fornecidos. Triagem pode ser realizada por análise Southern de DNA, análise Northern da expressão de mRNA, análise de imunotransferência da expressão da proteína ou análise fenotípica, entre outros.
[00202] Em modalidades específicas, um ou mais dos componentes do sistema de integração genômico alvo aqui descritos podem ser fornecidos em um cassete de expressão para expressão numa célula procariota, uma célula eucariótica, um célula eucariótica que não é de rato, uma célula bacteriana, uma célula de levedura ou uma célula de mamífero ou outro organismo ou tipo celular de interesse. Cassete pode incluir sequências reguladoras 5' e 3' operavelmente ligadas a um polinucleotídio fornecido neste documento. A frase "operacionalmente ligado" compreende uma relação em que os componentes operacionalmente ligados funcionam na sua forma pretendida. Por exemplo, uma ligação operável entre um polinucleotídio de interesse e uma sequência reguladora (por exemplo, uma promotora) é a ligação funcional que permite a expressão do polinucleotídio de interesse. Elementos operacionalmente ligados podem ser contíguos ou não-contíguos. Quando utilizados para se referir à junção de duas regiões de codificação de proteína, operacionalmente ligado significa que as regiões de codificação estão no mesmo quadro de leitura. Em outra instância, uma sequência de ácido nucleico que codifica uma proteína pode ser ligada operavelmente a sequências reguladoras (por exemplo, promotor, potenciador, sequência silenciadora, etc.) de modo a reter a regulação de transcrição adequada. Em uma instância, uma sequência de ácido nucleico de uma região variável de imunoglobulina (ou segmentos V(D)J ) pode ser operativamente ligada a uma sequência de ácidos nucleicos de uma região constante de imunoglobulina, de modo a permitir a recombinação adequada entre as sequências em uma sequência de imunoglobulina pesada ou de cadeia leve.
[00203] A cassete pode conter, adicionalmente, pelo menos um polinucleotídeo de interesse adicional a ser co-introduzido no organismo. Alternativamente, o polinucleotídeo de interesse adicional pode ser fornecido em várias cassetes de expressão. Tal cassete de expressão é fornecido com uma pluralidade de locais de restrição e/ou de recombinação para a inserção de um polinucleotídeo recombinante de modo a estar sob a regulação transcricional das regiões reguladoras. A cassete de expressão pode ainda conter genes marcadores de seleção.
[00204] A cassete de expressão pode incluir na direção 5' - 3' da transcrição uma região de iniciação transcricional e translacional (ou seja, um promotor), um polinucleotídio recombinante fornecido neste documento e uma região de terminação transcricional e translacional (i.e., região de terminação) funcional em células de mamíferos ou uma célula hospedeira de interesse. As regiões de regulação (isto é, regiões promotoras, reguladoras da transcrição e as regiões de terminação translacionais) e/ou um polinucleotídeo fornecido neste documento podem ser nativos/análogos à célula hospedeira ou um para o outro. Alternativamente, as regiões de regulação e/ou um polinucleotídeo proporcionados neste documento podem ser heterólogos em relação à célula hospedeira ou um para o outro. Por exemplo, um promotor ligado operavelmente a um polinucleotídeo heterólogo é de uma espécie diferente da espécie a partir da qual o polinucleotídeo foi derivado, ou, se da mesma espécie/análogos, um ou ambos são substancialmente modificados da sua forma e/ou locus genômico original, ou o promotor não é o promotor nativo para o polinucleotídeo ligado operacionalmente. Alternativamente, as regiões de regulação e/ou um polinucleotídeo recombinante fornecido neste documento podem ser totalmente sintéticos.
[00205] A região de terminação pode ser nativa com a região de iniciação transcricional, pode ser nativa com o polinucleotídeo recombinante operativamente ligado, pode ser nativa com a célula hospedeira ou pode ser derivada de outra fonte (ou seja, estranha ou heteróloga) ao promotor, o polinucleotídeo recombinante, a célula hospedeira ou qualquer combinação dos mesmos.
[00206] Na preparação do cassete de expressão, os vários fragmentos de DNA podem ser manipulados, de modo a proporcionar para as sequências de DNA a orientação correta. Para este fim, os adaptadores ou ligantes podem ser utilizados para unir os fragmentos de DNA ou outras manipulações podem estar envolvidas para proporcionar locais de restrição convenientes, a remoção do DNA supérfluo, remoção de locais de restrição ou semelhantes. Para este efeito, mutagênese in vitro, reparação de iniciadores, restrição, anelamento, re-substituições, por exemplo, transições e transversões, podem estar envolvidos.
[00207] Uma série de promotores pode ser utilizada nas cassetes de expressão proporcionados neste documento. Os promotores podem ser selecionados com base no resultado desejado. É reconhecido que diferentes aplicações podem ser melhorados através da utilização de diferentes promotores nos cassetes de expressão para modular o tempo, localização e/ou o nível de expressão do polinucleotídeo de interesse. Tais construções de expressão podem também conter, se desejado, uma região reguladora do promotor (por exemplo, uma que confere expressão indutível, constitutiva, ambientalmente ou de desenvolvimento regulado, de expressão específica/seletiva de célula ou tecido), um local de iniciação da transcrição, um local de ligação de ribossoma, um sinal de processamento de RNA, um local de terminação da transcrição e/ou um sinal de poliadenilação.
[00208] O cassete de expressão que contém os polinucleotídeos proporcionados neste documento podem também compreender um gene marcador de seleção para a seleção de células transformadas. Os genes marcadores selecionáveis são utilizados para a seleção de células ou tecidos transformados.
[00209] Sempre que adequado, as sequências empregues nos métodos e nas composições (por exemplo, o polinucleotídeo de interesse, o agente da nuclease, etc.) podem ser otimizados para aumentar a expressão na célula. Ou seja, os genes podem ser sintetizados utilizando códons preferidos numa dada célula de interesse, incluindo, por exemplo, códons preferenciais para mamíferos, códons preferenciais para humanos, códons preferenciais para roedores , códons preferenciais para roedores que não ratos, códons preferenciais para rato , códons preferenciais para camundongos, códons preferenciais para hamster, etc. para melhorar a expressão.
[00210] Os vários métodos e composições proporcionados neste documento podem empregar marcadores de seleção. Vários marcadores de seleção podem ser usados nos métodos e composições divulgados neste documento. Tais marcadores de seleção, podem, por exemplo, conferir resistência a um antibiótico, tais como G418, higromicina, blasticidina, neomicina, ou puromicina. Tais marcadores de seleção incluem a neomicina- fosfotransferase (neor), Higromicina B-fosfotransferase (hygr), Puromicina- N-acetiltransferase (Puror) e blasticidina S deaminase (BSRr). Ainda em outras modalidades, o marcador de seleção é ligado operacionalmente a um promotor indutível e a expressão do marcador de seleção é tóxica para a célula. Exemplos não-limitantes desses marcadores de seleção incluem xantina/guanina fosforribosil-transferase (gpt), hipoxantina guanina- fosforribosil-transferase (HGPRT) ou timidina quinase do vírus do herpes simples (HSV-TK). O polinucleotídeo que codifica os marcadores de seleção são operativamente ligados a um promotor ativo na célula.
III. Vetores de Alvejamento
[00211] Vetores de alvejamento são empregues para introduzir o ácido nucleico de inserção no locus alvo do rato, do ácido nucleico eucariótico, eucariótico que não é de rato, de mamífero, de mamífero não humano, humano, de roedor, roedor que não é rato, camundongo ou hamster. O vetor de alvejamento compreende a inserção de ácido nucleico e compreende ainda uma porção de homologia 5' e uma 3' , que flanqueiam o ácido nucleico de inserção. As porções de homologia, que flanqueiam ácido nucleico de inserção, correspondem a regiões dentro do locus alvo do ácido nucleico de rato, eucariótico, eucariótico que não é de rato, de mamífero, de mamífero não humano, humano, de roedor, de roedor que não é de rato, camundongo ou hamster. Para facilitar a referência, refere-se às correspondentes regiões genômicas cognatas dentro do locus genômico alvo como "locais alvo". Por exemplo, um vetor de alvejamento pode compreender um primeiro ácido nucleico de inserção flanqueado por uma primeira e uma segunda porção de homologia complementar a um primeiro e um segundo local alvo. Como tal, o vetor de alvejamento desse modo auxilia na integração do ácido nucleico de inserção dentro do locus alvo do ácido nucleico de rato, eucariótico, eucariótico que não é de rato, de mamíferos, de mamíferos que não humanos, de humanos, de roedores, roedores que não são ratos, de camundongos ou hamsters através de um evento de recombinação homóloga que ocorre entre as porções de homologia e os locais alvo complementares dentro do genoma da célula.
[00212] Numa modalidade, o locus alvo do ácido nucleico de rato, eucariótico, eucariótico não-rato, de mamíferos, de mamíferos que não são humanos, de humanos, de roedores, roedor que não são rato, camundongos compreende uma primeira sequência de ácido nucleico que é complementar à porção de homologia 5' e uma segunda sequência de ácido nucleico que é complementar à porção de homologia 3'. Numa modalidade, a primeira e a segunda sequências de ácido nucleico são separadas por, pelo menos, 5 kb. Numa outra modalidade, a primeira e a segunda sequências de ácido nucleico são separadas por, pelo menos, 5 kb, mas menos do que 200 kb. Numa modalidade, a primeira e a segunda sequências de ácido nucleico são separadas por pelo menos 10 kb. Numa modalidade, a primeira e a segunda sequências de ácidos nucleicos são separadas por, pelo menos, 20 kb, pelo menos, 30 kb, pelo menos, 40 kb, pelo menos, 50 kb, pelo menos, 60 kb, pelo menos, 70 kb, pelo menos, 80 kb, pelo menos 90 kb, pelo menos 100 kb, pelo menos 110 kb, pelo menos 120 kb, pelo menos 130 kb, pelo menos 140 kb, pelo menos 150 kb, pelo menos 160 kb, pelo menos 170 kb, pelo menos 180 kb, pelo menos 190 kb, ou pelo menos 200 kb. Em ainda outras modalidades, a primeira e a segunda sequências de ácido nucleico são separadas por, pelo menos, 5 kb, mas menos do que 10 kb, pelo menos 5 kb, mas menos do que 3 MB, pelo menos 10 kb, mas menos do que 20 kb, pelo menos 20 kb mas menos do que 40 kb, pelo menos 40 kb, mas menos do que 60 kb, pelo menos 60 kb, mas menos do que 80 kb, pelo menos cerca de 80 kb, mas menos do que 100 kb, pelo menos 100 kb, mas menos do que 150 kb, ou pelo menos 150 kb, mas menos do que 200 kb, pelo menos cerca de 200 kb, mas menos do que cerca de 300 kb, pelo menos cerca de 300 kb, mas menos do que cerca de 400 kb, pelo menos cerca de 400 kb, mas menos do que cerca de 500 kb, pelo menos cerca de 500 kb mas menos do que cerca de 1 Mb, pelo menos cerca de 1.5 MB, mas menos do que cerca de 2 Mb, pelo menos cerca de 1 MB, mas menos do que cerca de 1,5 Mb, pelo menos cerca de 2 MB, mas menos de 2,5 Mb, pelo menos cerca de 2,5 MB, mas menos do que 3 Mb ou pelo menos cerca de 2 MB, mas menos do que cerca de 3 Mb.
[00213] Uma porção de homologia do vetor de alvejamento seletivo pode ser de qualquer comprimento que seja suficiente para promover um evento de recombinação homóloga com um local alvo correspondente, incluindo, por exemplo, pelo menos 5-10 kb, 5-15 kb, 10-20 kb, 20- 30 kb, 30-40 kb, 40-50 kb, 50-60 kb, 60-70 kb, 70-80 kb, 80-90 kb, 90-100 kb, 100110 kb, 110-120 kb, 120- 130 kb, 130-140 kb, 140-150 kb, 150-160 kb, 160170 kb, 170-180 kb, 180-190 kb, 190-200 kb de comprimento ou mais. Tal como descrito em maior detalhe abaixo, vetores de alvejamento grandes podem empregar porções de alvejamento de maior comprimento. Numa modalidade específica, a soma total da porção de homologia 5' e porção de homologia 3' é de pelo menos 10 kb ou a soma total da porção de homologia 5 ' e da porção de homologia 3' é de pelo menos cerca de 16 kb até cerca de 100 kb ou cerca de 30 kb até cerca de 100 kb. Em outras modalidades, o tamanho da soma total de de porções de homologia 5 'e 3' do LTVEC é de cerca de 10 kb a cerca de 150 kb, de cerca de 10 kb a cerca de 100 kb, de cerca de 10 kb a cerca de 75 kb, cerca de 20 kb a cerca de 150 kb, de cerca de 20 kb a cerca de 100 kb, de cerca de 20 kb a cerca de 75 kb, cerca de 30 kb a cerca de 150 kb, de cerca de 30 kb a cerca de 100 kb, de cerca de 30 kb a cerca de 75 kb, cerca de 40 kb a cerca de 150 kb, de cerca de 40 kb a cerca de 100 kb, de cerca de 40 kb a cerca de 75 kb, cerca de 50 kb a cerca de 150 kb, de cerca de 50 kb a cerca de 100 kb ou cerca de 50 kb a cerca de 75 kb, cerca de 10 kb a cerca de 30 kb, cerca de 20 kb a cerca de 40 kb, cerca de 40 kb a cerca de 60 kb, cerca de 60 kb a cerca de 80 kb, cerca de 80 kb a cerca de 100 kb, de cerca de 100 kb a cerca de 120 kb, ou de cerca de 120 kb a cerca de 150 kb. Numa modalidade, o tamanho da deleção é o mesmo ou semelhante ao tamanho da soma total de porções de homologia de 5 'e 3' do LTVEC.
[00214] Numa modalidade, o locus genômico de interesse compreende (i) uma sequência alvo que é homóloga à porção de homologia 5'; e (ii) uma sequência alvo 3' que é homóloga à porção de homologia 3'. Em uma modalidade, a sequência alvo 5'e a sequência alvo 3' são separadas por pelo menos 5kb, mas menos do que 3 Mb. Em ainda outras modalidades, a sequência alvo 5' e a sequência alvo 3' são separadas por, pelo menos, 5 kb, mas menos do que 10 kb, pelo menos 5 kb, mas menos do que 3 MB, pelo menos 10 kb, mas menos do que 20 kb, pelo menos 20 kb mas menos do que 40 kb, pelo menos 40 kb, mas menos do que 60 kb, pelo menos 60 kb, mas menos do que 80 kb, pelo menos cerca de 80 kb, mas menos do que 100 kb, pelo menos 100 kb, mas menos do que 150 kb, ou pelo menos 150 kb, mas menos do que 200 kb, pelo menos cerca de 200 kb, mas menos do que cerca de 300 kb, pelo menos cerca de 300 kb, mas menos do que cerca de 400 kb, pelo menos cerca de 400 kb, mas menos do que cerca de 500 kb, pelo menos cerca de 500 kb mas menos do que cerca de 1 Mb, pelo menos cerca de 1.5 MB, mas menos do que cerca de 2 Mb, pelo menos cerca de 1 MB, mas menos do que cerca de 1,5 Mb, pelo menos cerca de 2 MB, mas menos de 2,5 Mb, pelo menos cerca de 2,5 MB, mas menos do que cerca de 3 Mb ou pelo menos cerca de 2 MB, mas menos do que cerca de 3 Mb.
[00215] Quando os agentes de nucleases são empregues, as regiões genômicas cognatas correspondentes às porções de homologia 5 'e 3' de um vetor de alvejamento são "localizadas em proximidade suficiente" a locais alvo de nucleases, de modo a promover a ocorrência de um evento de recombinação homóloga entre as regiões genômicas cognatas e as porções de homologia, dada uma ruptura de uma ruptura de fita única ou dupla no local de reconhecimento. Por exemplo, os locais alvo de nuclease podem ser localizados em qualquer lugar entre as regiões genômicas cognatas correspondentes às porções de homologia 5 'e 3'. Em modalidade específicas, o local de reconhecimento é imediatamente adjacente a, pelo menos, uma ou ambas as regiões genômicas cognatas.
[00216] Tal como utilizado neste documento, uma porção de homologia e um local alvo (isto é, a região genômica cognata) "complementam" ou são "complementares" a uma outra quando as duas regiões partilham de um nível suficiente de identidade de sequência com uma outra para atuar como substratos para uma reação de recombinação homóloga. O termo "homologia" se refere à sequências de DNA que são idênticas ou que compartilham identidade de sequência em relação a uma sequência correspondente ou "complementar". A identidade de sequência entre um determinado sítio alvo e o braço de homologia correspondente encontrado no vetor de alvejamento pode ser ter qualquer grau de identidade de sequência que permita que a recombinação homóloga ocorra. Por exemplo, a quantidade de identidade de sequência compartilhada pelo o braço de homologia do vetor de alvejamento (ou seu fragmento) e o local alvo (ou seu fragmento) pode ser, pelo menos, 50%, 55%, 60%, 65%, 70 %, 75%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade de sequência, de modo que as sequências sofram recombinação homóloga. Além disso, uma região complementar de homologia entre o braço de homologia e o local alvo complementar pode ter qualquer comprimento que seja suficiente para promover a recombinação homóloga no local de reconhecimento clivado. Por exemplo, uma determinada porção de homologia e/ou local alvo complementar pode compreender regiões complementares de homologia que são, pelo menos, 510 kb, 5-15 kb, 10-20 kb, 20-30 kb, 30-40 kb, 40- 50 kb, 50-60 kb, 60-70 kb, 70-80 kb, 80-90 kb, 90-100 kb, 100-110 kb, 110-120 kb, 120-130 kb, 130-140 kb, 140- 150 kb, 150-160 kb, 160-170 kb, 170-180 kb, 180-190 kb, 190-200 kb, 200 kb até 300 kb de comprimento ou maior (tal como descritas nos vetores LTVEC descritas em outro local neste documento), de tal forma que o braço de homologia tem homologia suficiente para sofrer recombinação homóloga com os locais alvo correspondentes dentro do genoma da célula. Para facilidade de referência, refere-se às porções de homologia neste documento como uma porção de homologia 5 'e 3'. Esta terminologia refere- se à posição relativa das porções de homologia com o ácido nucleico de inserção dentro do vetor de alvejamento.
[00217] As porções de homologia do vetor de alvejamento são, por conseguinte, concebidas para serem complementares a um local alvo com o locus alvo. Assim, as porções de homologia podem ser complementares a um local que é nativo à célula ou, alternativamente, podem ser complementares a uma região de um segmento heterólogo ou exógeno de DNA que foi integrado no genoma da célula, incluindo, mas não se limitando a, transgenes, cassetes de expressão ou regiões heterólogas ou exógenas de DNA genômico. Alternativamente, as porções de homologia do vetor de alvejamento seletivo podem ser complementares a uma região de um cromossomo artificial humano ou qualquer outra região genômica manipulada contida numa célula hospedeira apropriada. Ainda adicionalmente, as porções de homologia do vetor de alvejamento seletivo podem ser complementares ou serem derivados a partir de uma região de uma biblioteca BAC, uma biblioteca de cosmídeos, ou uma biblioteca de fago P1. Assim, em modalidades específicas, as porções de homologia do vetor de alvejamento são locus genômicos complementares a um rato, eucariótico, eucariótico de não rato, de mamífero, de mamífero não humano, humano, de roedor, roedor que não rato, rato ou hamster que é nativo, heterólogo ou exógeno de uma dada célula. Noutras modalidades, as porções de homologia são locus genômicos complementares a um rato, eucariótica, eucariótica de não rato, de mamífero, mamíferos não humanos, humano, roedor, roedor que não rato, rato ou hamster que não podem ser alvejados utilizando um método convencional ou podem ser alvejados apenas de forma incorreta ou apenas com eficiência significativamente baixa, na ausência de uma entalhe ou quebra de fita dupla induzida por um agente de nuclease. Numa modalidade, as porções de homologia são derivadas a partir de um DNA sintético.
[00218] Em ainda outras modalidades, as porções de homologia de 5 'e de 3' são complementares ao mesmo genoma que o genoma alvo. Numa modalidade, as porções de homologia são a partir de um genoma relacionado, por exemplo, o genoma alvejado é um genoma de rato de uma primeira estirpe, e as porções alvejadas são a partir de um genoma de rato de uma segunda estirpe, em que a primeira estirpe e a segunda estirpe são diferentes. Em outras modalidades, as porções de homologia são a partir do genoma do mesmo animal ou são a partir do genoma da mesma estirpe, por exemplo, o genoma alvejado é um genoma de rato de uma primeira estirpe, e as porções alvejadas são a partir de um genoma de rato a partir do mesmo rato ou a partir da mesma estirpe.
[00219] O vetor de alvejamento seletivo (tal como um vetor recombinante grande) pode também compreender um cassete de seleção ou um gene repórter tal como discutido aqui noutro sítio. O cassete de seleção pode compreender uma sequência de ácido nucleico que codifica um marcador de seleção, em que a sequência de ácido nucleico está operacionalmente ligada a um promotor. O promotor pode ser ativo numa célula procariótica de interesse e/ou ativo numa célula eucariótica de interesse. Tais promotores podem ser um promotor indutível, um promotor que é endógeno ao gene repórter ou à célula, um promotor que é heterólogo ao gene repórter ou à célula, um promotor específico de célula, um promotor específico de tecido ou um promotor específico de estágio de desenvolvimento. Numa modalidade, o marcador de seleção é selecionado a partir de ou compreende neomicina fosfotransferase (neor), higromicina B fosfotransferase (higr), puromicina-N-acetiltransferase (puror), blasticidina S deaminase (bsrr), xantina/guanina fosforibosil transferase (gpt), e o vírus herpes simplex timidina cinase (HSV-k), e/ou uma combinação dos mesmos. O marcador de seleção do vetor de alvejamento pode ser flanqueado pelas porções de homologia de 5' e 3' ou encontrar tanto porções de homologia de 5 'ou de 3'.
[00220] Numa modalidade, o vetor de alvejamento (tal como um vetor de alvejamento grande) compreende um gene repórter operacionalmente ligado a um promotor, em que o gene repórter codifica uma proteína repórter selecionada a partir do grupo que consiste em, ou compreende LacZ, mPlum, mCherry, tdTomato, mStrawberry , J-Red, DsRed, mOrange, mKO, mCitrine, Vênus, YPet, proteína fluorescente amarela reforçada (EYFP), Esmeralda, proteína verde fluorescente reforçada (EGFP), CyPet, ciano proteína fluorescente (PCP), Cerulean, T-Safira, luciferase, fosfatase alcalina, e/ou uma combinação dos mesmos. Tais genes repórteres podem ser operativamente ligados a um promotor ativo na célula. Tais promotores podem ser um promotor indutível, um promotor que é endógeno ao gene repórter ou à célula, um promotor que é heterólogo ao gene repórter ou à célula, um promotor específico de célula, um promotor específico de tecido ou um promotor específico de estágio de desenvolvimento.
[00221] Numa modalidade, a utilização combinada do vetor de alvejamento (incluindo, por exemplo, um vetor de alvejamento grande) com os resultados do agente de nuclease em uma maior eficiência de alvejamento em comparação com a utilização do vetor de alvejamento sozinho. Numa modalidade, quando o vetor de alvejamento é utilizado em conjunto com o agente de nuclease, eficiência de alvejamento do vetor de alvejamento é aumentada, pelo menos, por duas vezes, pelo menos, três vezes maior, ou pelo menos 4 vezes quando comparada com quando o vetor de alvejamento é usado sozinho.
[00222] Quando se emprega um vetor de alvejamento, o projeto do vetor tal que permita a inserção de uma dada sequência que é de cerca de 5 kb a cerca de 200 kb, tal como aqui descrito. Em uma modalidade, a inserção é de cerca de 5 kb, a cerca de 10 kb, de cerca de 10 kb a cerca de 20 kb, de cerca de 20 kb a cerca de 30 kb, de cerca de 30 kb a cerca de 40 kb, de cerca de 40 kb a cerca de 50 kb, de cerca de 50 kb a cerca de 60 kb, de cerca de 60 kb a cerca de 70 kb , de cerca de 80 kb a cerca de 90 kb, de cerca de 90 kb a cerca de 100 kb, de cerca de 100 kb a cerca de 110 kb, de cerca de 110 kb a cerca de 120 kb, de cerca de 120 kb a cerca de 130 kb, de cerca de 130 kb a cerca de 140 kb, de cerca de 140 kb a cerca de 150 kb, de cerca de 150 kb a cerca de 160 kb , de cerca de 160 kb a cerca de 170 kb, de cerca de 170 kb a cerca de 180 kb, de cerca de 180 kb a cerca de 190 kb ou de cerca de 190 kb a cerca de 200 kb, de cerca de 5 kb a cerca de 10 kb, de cerca de 10 kb a cerca de 20 kb, de cerca de 20 kb a cerca de 40 kb, de cerca de 40 kb a cerca de 60 kb , de cerca de 60 kb a cerca de 80 kb, de cerca de 80 kb a cerca de 100 kb, de cerca de 100 kb a cerca de 150 kb, de cerca de 150 kb a cerca de 200 kb, de cerca de 200 kb a cerca de 250 kb, de cerca de 250 kb a cerca de 300 kb, de cerca de 300 kb a cerca de 350 kb ou de cerca de 350 kb a cerca de 400 kb.
[00223] Quando se emprega um vetor de alvejamento, o projeto do vetor pode ser tal que permita a substituição de uma dada sequência que é de cerca de 5 kb a cerca de 200 kb ou desde cerca de 5 Kb a cerca de 3.0 MB, tal como aqui descrito. Em uma modalidade, a substituição é de cerca de 5 kb, a cerca de 10 kb, de cerca de 10 kb a cerca de 20 kb, de cerca de 20 kb a cerca de 30 kb, de cerca de 30 kb a cerca de 40 kb, de cerca de 40 kb a cerca de 50 kb, de cerca de 50 kb a cerca de 60 kb, de cerca de 60 kb a cerca de 70 kb , de cerca de 80 kb a cerca de 90 kb, de cerca de 90 kb a cerca de 100 kb, de cerca de 100 kb a cerca de 110 kb, de cerca de 110 kb a cerca de 120 kb, de cerca de 120 kb a cerca de 130 kb, de cerca de 130 kb a cerca de 140 kb, de cerca de 140 kb a cerca de 150 kb, de cerca de 150 kb a cerca de 160 kb , de cerca de 160 kb a cerca de 170 kb, de cerca de 170 kb a cerca de 180 kb, de cerca de 180 kb a cerca de 190 kb, de cerca de 190 kb a cerca de 200 kb, de cerca de 5 kb a cerca de 10 kb, de cerca de 10 kb a cerca de 20 kb, de cerca de 20 kb a cerca de 40 kb, de cerca de 40 kb a cerca de 60 kb , de cerca de 60 kb a cerca de 80 kb, de cerca de 80 kb a cerca de 100 kb, de cerca de 100 kb a cerca de 150 kb ou de cerca de 150 kb a cerca de 200 kb, de cerca de 200 kb a cerca de 300 kb, de cerca de 300 kb a cerca de 400 kb, de cerca de 400 kb a cerca de 500 kb, de cerca de 500 kb a cerca de 1 Mb , de aproximadamente 1 Mb a cerca de 1,5 Mb, de cerca de 1,5 Mb a cerca de 2 Mb, de cerca de 2 Mb a cerca de 2,5 Mb, ou de cerca de 2,5 Mb a cerca de 3 Mb.
[00224] Numa modalidade, o vetor de alvejamento compreende um gene de recombinase específica de sítio. Numa modalidade, o gene da recombinase específica de sítio codifica uma recombinase Cre. Numa modalidade, o gene da recombinase Cre é Crei, em que dois exons que codificam a recombinase Cre são separados por um intron para impedir a sua expressão numa célula procariótica.
[00225] Numa modalidade, o gene da recombinase Cre compreende ainda um sinal de localização nuclear, para facilitar a localização de Cre (ou qualquer recombinase ou agente de nuclease) para o núcleo (por exemplo, o gene é um gene de NL-Cre). Numa modalidade específica, o gene da recombinase Cre compreende ainda um sinal de localização nuclear e um intron (por exemplo, NL-Crei).
[00226] Em várias modalidades, um promotor adequado para a expressão do agente de nuclease (incluindo a recombinase Cre ou Crei discutida acima) é selecionado a partir de ou compreende um Prm1, Blimp1, Gata6, Gata4, Igf2, Lhx2, Lhx5, e/ou Pax3. Numa modalidade específica, o promotor é o promotor Gata6 ou Gata4 . Os diferentes promotores podem ser de qualquer organismo, incluindo, por exemplo, um roedor tal como um camundongo ou um rato, um roedor que não rato, um eucariota, um eucariota de não rato, um mamífero não humano, um mamífero, um ser humano ou um hamster. Numa outra modalidade específica, o promotor é um promotor Prm1 . Numa outra modalidade específica, o promotor é um promotor Prm1 de rato. Numa outra modalidade específica, o promotor é um promotor Prm1 de camundongo. Numa outra modalidade específica, o promotor é um promotor Blimp1 ou um fragmento do mesmo, por exemplo, um fragmento de 1 kb ou de 2 kb de promotor Blimp1 . Ver, por exemplo, US Patente 8.697.851 e US Publicação do Pedido de 2013-0312129, ambas as quais são aqui incorporadas por referência na sua totalidade.
IV. Vetores de Recombinação Grandes
[00227] O termo "vetor de alvejamento grande" ou "LTVEC", tal como aqui utilizado compreende grandes vetores de alvejamento que compreendem porções de homologia que correspondem e são derivadas a partir de sequências de ácidos nucleicos maiores do que os tipicamente utilizados por outras abordagens destinadas a executar alvejamento homólogo nas células e/ou compreendendo inserir ácidos nucleicos que compreendem sequências de ácidos nucleicos maiores do que os tipicamente utilizados por outras abordagens destinadas a realizar a alvejamento de recombinação homóloga em células. Por exemplo, o LTVEC torna possível a modificação de grandes loci que não podem ser acomodados por vetores tradicionais de alvejamento baseados em plasmídeo devido às limitações de tamanho. Em modalidades específicas, as porções de homologia e/ou o inserto de ácido nucleico do LTVEC compreende sequência genômica de uma célula eucariótica, ou uma célula eucarióticade não rato. O tamanho do LTVEC é grande demais para permitir o rastreio de eventos de alvejamento por ensaios convencionais, por exemplo., blotting de Southern e PCR de longo alcance (por exemplo., 1 kb-5 kb). Exemplos do LTVEC, incluem, mas não estão limitados a, vetores derivados a partir de um cromossomo bacteriano artificial (BAC), um cromossomo artificial humano ou um cromossomo artificial de levedura (YAC). Exemplos não limitativos de LTVEC e métodos para a sua produção estão descritos, por exemplo, na Patente US. No. 6,586,251, 6,596,541, 7,105,348, e WO 2002/036789 (PCT/US01/45375), e US 2013/0137101, cada uma das quais é aqui incorporada por referência.
[00228] O LTVEC pode ser de qualquer comprimento, incluindo, mas não limitado a, de cerca de 20 kb a cerca de 400 kb, de cerca de 20 kb a cerca de 30 kb, a partir de cerca de 30 kb a 40 kb, a partir de cerca de 40 kb a cerca de 50 kb, a partir de cerca de 50 kb a cerca de 75 kb, a partir de cerca de 75 kb a cerca de 100 kb, de cerca de 100 kb e 125 kb, de cerca de 125 kb a cerca de 150 kb, de cerca de 150 kb a cerca de 175 kb, de cerca de 175 kb a cerca de 200 kb, a partir de cerca de 200 kb a cerca de 225 kb, de cerca de 225 kb a cerca de 250 kb, de cerca de 250 kb a cerca de 275 kb ou desde cerca de 275 kb a cerca de 300 kb, de cerca de 200 kb a cerca de 300 kb, de cerca de 300 kb a cerca de 350 kb, de cerca de 350 kb a cerca de 400 kb, de cerca de 350 kb a cerca de 550 kb. Numa modalidade, o LTVEC é de cerca de 100 kb.
[00229] Em algumas modalidades, o LTVEC é, pelo menos, 10 kb, pelo menos, 15 kb, pelo menos, 20 kb, pelo menos, 30 kb, pelo menos, 40 kb, pelo menos, 50 kb, pelo menos, 60 kb, pelo menos, 70 kb, pelo menos 80 KB, pelo menos, 90 kb, pelo menos 100 kb, 150 kb, pelo menos, ou pelo menos 200 kb.
[00230] Em algumas modalidades, o LTVEC compreende uma sequência de ácido nucleico de pelo menos 20 kb, pelo menos, 30 kb, pelo menos, 40 kb, pelo menos, 50 kb, pelo menos, 60 kb, pelo menos, 70 kb, pelo menos, 80 kb, pelo menos 90 kb, pelo menos 100 kb, pelo menos 150 kb ou pelo menos 200 kb.
[00231] Em uma modalidade, o LTVEC é composto por um inserto de ácido nucleico que varia de cerca de 5 kb a cerca de 200 kb, de cerca de 5 kb a cerca de 10 kb, de cerca de 10 kb a cerca de 20 kb, de cerca de 20 kb a cerca de 30 kb, de cerca de 0,5 kb a cerca de 30 kb, de cerca de 0,5 kb a cerca de 40 kb, de cerca de 30 kb a cerca de 150 kb , de cerca de 0,5 kb a cerca de 150 kb, de cerca de 30 kb a cerca de 40 kb, de cerca de 40 kb a cerca de 50 kb, de cerca de 60 kb a cerca de 70 kb, de cerca de 80 kb a cerca de 90 kb, de cerca de 90 kb a cerca de 100 kb, de cerca de 100 kb a cerca de 110 kb, de cerca de 120 kb a cerca de 130 kb , de cerca de 130 kb a cerca de 140 kb, de cerca de 140 kb a cerca de 150 kb, de cerca de 150 kb a cerca de 160 kb, de cerca de 160 kb a cerca de 170 kb, de cerca de 170 kb a cerca de 180 kb, de cerca de 180 kb a cerca de 190 kb ou de cerca de 190 kb a cerca de 200 kb, de cerca de 5 kb a cerca de 10 kb , de cerca de 10 kb a cerca de 20 kb, de cerca de 20 kb a cerca de 40 kb, de cerca de 40 kb a cerca de 60 kb, de cerca de 60 kb a cerca de 80 kb, de cerca de 80 kb a cerca de 100 kb, de cerca de 100 kb a cerca de 150 kb, de cerca de 150 kb a cerca de 200 kb, de cerca de 200 kb a cerca de 250 kb , de cerca de 250 kb a cerca de 300 kb, de cerca de 300 kb a cerca de 350 kb ou de cerca de 350 kb a cerca de 400 kb.
[00232] Numa modalidade, o LTVEC compreende uma sequência de ácidos nucleicos de pelo menos 100 kb, pelo menos 150 kb ou pelo menos 200 kb.
[00233] Quando se emprega um LTVEC, o projeto do vetor pode ser tal que permita a substituição de uma dada sequência que é de cerca de 5 kb a cerca de 200 kb ou desde cerca de 5 Kb a cerca de 3 MB, tal como aqui descrito. Em uma modalidade, a substituição é de cerca de 5 kb, a cerca de 10 kb, de cerca de 10 kb a cerca de 20 kb, de cerca de 20 kb a cerca de 30 kb, de cerca de 30 kb a cerca de 40 kb, de cerca de 40 kb a cerca de 50 kb, de cerca de 50 kb a cerca de 60 kb, de cerca de 60 kb a cerca de 70 kb , de cerca de 80 kb a cerca de 90 kb, de cerca de 90 kb a cerca de 100 kb, de cerca de 100 kb a cerca de 110 kb, de cerca de 110 kb a cerca de 120 kb, de cerca de 120 kb a cerca de 130 kb, de cerca de 130 kb a cerca de 140 kb, de cerca de 140 kb a cerca de 150 kb, de cerca de 150 kb a cerca de 160 kb , de cerca de 160 kb a cerca de 170 kb, de cerca de 170 kb a cerca de 180 kb, de cerca de 180 kb a cerca de 190 kb, de cerca de 190 kb a cerca de 200 kb, de cerca de 5 kb a cerca de 10 kb, de cerca de 10 kb a cerca de 20 kb, de cerca de 20 kb a cerca de 40 kb, de cerca de 40 kb a cerca de 60 kb , de cerca de 60 kb a cerca de 80 kb, de cerca de 80 kb a cerca de 100 kb, de cerca de 100 kb a cerca de 150 kb ou de cerca de 150 kb a cerca de 200 kb, de cerca de 200 kb a cerca de 300 kb, de cerca de 300 kb a cerca de 400 kb, de cerca de 400 kb a cerca de 500 kb, de cerca de 500 kb a cerca de 1 Mb , de aproximadamente 1 Mb a cerca de 1,5 Mb, de cerca de 1,5 Mb a cerca de 2 Mb, de cerca de 2 Mb a cerca de 2,5 Mb, ou de cerca de 2,5 Mb a cerca de 3 Mb.
[00234] Numa modalidade, as porções de homologia do LTVEC são derivadas a partir de uma biblioteca de BAC, uma biblioteca de cosmídeos, ou uma biblioteca de fago P1. Em outras modalidades, as porções de homologia são derivados a partir do locus genômico alvejado da célula e, em alguns casos, o locus genômico alvo, o qual o LTVEC está concebido para alvejar não pode ser alvejado usando um método convencional. Em ainda outras modalidades, as porções de homologia são derivadas a partir de um DNA sintético.
[00235] Numa modalidade, uma soma total de porção de homologia de 5 'e de porção de homologia de 3' no LTVEC é de pelo menos 10 kb. Em outras modalidades a soma total de porções de homologia de 5 'e 3' do LTVEC é de cerca de 10 kb a cerca de 30 kb, a partir de cerca de 20 kb a cerca de 40 kb, a partir de cerca de 40 kb a cerca de 60 kb, desde cerca de 60 kb a cerca de 80 kb, a partir de cerca de 80 kb a cerca de 100 kb, desde 100 kb a cerca de 120 kb, de cerca de 120 kb a cerca de 140 kb, de cerca de 140 kb a cerca de 160 kb, de cerca de 160 kb a cerca de 180 kb , a partir de cerca de 180 kb a cerca de 200 kb. Numa modalidade a soma total de porções de homologia de 5 'e 3' do LTVEC é de cerca de 30 kb a cerca de 100 kb. Em outras modalidades, o tamanho da soma total de de porções de homologia 5 'e 3' do LTVEC é de cerca de 10 kb a cerca de 150 kb, de cerca de 10 kb a cerca de 100 kb, de cerca de 10 kb a cerca de 75 kb, cerca de 20 kb a cerca de 150 kb, de cerca de 20 kb a cerca de 100 kb, de cerca de 20 kb a cerca de 75 kb, cerca de 30 kb a cerca de 150 kb, de cerca de 30 kb a cerca de 100 kb, de cerca de 30 kb a cerca de 75 kb, cerca de 40 kb a cerca de 150 kb, de cerca de 40 kb a cerca de 100 kb, de cerca de 40 kb a cerca de 75 kb, cerca de 50 kb a cerca de 150 kb, de cerca de 50 kb a cerca de 100 kb ou cerca de 50 kb a cerca de 75 kb, cerca de 10 kb a cerca de 30 kb, cerca de 20 kb a cerca de 40 kb, cerca de 40 kb a cerca de 60 kb, cerca de 60 kb a cerca de 80 kb, cerca de 80 kb a cerca de 100 kb, de cerca de 100 kb a cerca de 120 kb, ou de cerca de 120 kb a cerca de 150 kb. Numa modalidade, o tamanho da deleção é o mesmo ou semelhante ao tamanho da soma total de porções de homologia de 5 'e 3' do LTVEC.
[00236] Em outras modalidades, a porção de homologia de 5' varia de cerca de 5 kb a cerca de 100 kb. Numa modalidade, a porção de homologia de 3' varia de cerca de 5 kb a cerca de 100 kb. Em outras modalidades, a soma total de porções de homologia de 5' e 3' são de cerca de 5 kb, a cerca de 10 kb, de cerca de 10 kb a cerca de 20 kb, de cerca de 20 kb a cerca de 30 kb, de cerca de 30 kb a cerca de 40 kb, de cerca de 40 kb a cerca de 50 kb, de cerca de 50 kb a cerca de 60 kb , de cerca de 60 kb a cerca de 70 kb, de cerca de 70 kb a cerca de 80 kb, de cerca de 80 kb a cerca de 90 kb, de cerca de 90 kb a cerca de 100 kb, de cerca de 100 kb a cerca de 110 kb, de cerca de 110 kb a cerca de 120 kb, de cerca de 120 kb a cerca de 130 kb, de cerca de 130 kb a cerca de 140 kb , de cerca de 140 kb a cerca de 150 kb, de cerca de 150 kb a cerca de 160 kb, de cerca de 160 kb a cerca de 170 kb, de cerca de 170 kb a cerca de 180 kb, de cerca de 180 kb a cerca de 190 kb, de cerca de 190 kb a cerca de 200 kb ou de cerca de 30 kb a cerca de 100 kb, cerca de 10 kb a cerca de 30 kb , cerca de 20 kb a cerca de 40 kb, cerca de 40 kb a cerca de 60 kb, cerca de 60 kb a cerca de 80 kb, cerca de 80 kb a cerca de 100 kb, cerca de 100 kb a cerca de 120 kb, ou de cerca de 120 kb a cerca de 150 kb.
[00237] Numa modalidade, o LTVEC compreende um inserto de ácido nucleico de que é homólogo ou ortólogo de uma sequência de ácido nucleico de rato flanqueado pelas porções de homologia LTVEC. Numa modalidade, o inserto da sequência de ácido nucleico é de uma espécie diferente de um rato. Numa modalidade, o inserto da sequência de ácido nucleico é um eucariota. Numa modalidade, o inserto de ácido nucleico que é homólogo ou ortólogo para a sequência de ácido nucleico de rato é um ácido nucleico de mamífero. Numa modalidade, o inserto de ácido nucleico que é homólogo ou ortólogo para a sequência de ácido nucleico de rato é um ácido nucleico de mamífero não humano. Numa modalidade, o ácido nucleico de mamífero é um ácido nucleico de rato. Numa modalidade, o ácido nucleico de mamífero é um ácido nucleico humano. Numa modalidade, o ácido nucleico de mamífero é um ácido nucleico de hamster. Numa modalidade, o ácido nucleico é um inserto de DNA genômico. Numa modalidade, o inserto é de 5 kb e 200 kb, tal como descrito acima.
[00238] Numa modalidade, o LTVEC compreende um cassete de seleção ou um gene repórter. Várias formas do cassete de selecão e do gene repórter que podem ser empregues são discutidos aqui noutro sítio.
[00239] Como descrito aqui noutro sítio, o LTVEC também pode ser utilizado nos métodos aqui fornecidos em combinação com um agente que promove a nuclease de uma recombinação homóloga entre o vetor de alvejamento seletivo e o locus alvo de ácido nucleico de um rato, eucariótico, eucariótico que não rato, mamíferos, mamíferos não humanos, humanos, roedores, roedores que não ratos, camundongo ou hamster em uma célula pluripotente ou não pluripotente, eucariótica, eucariótica que não rato, de mamífero, de mamífero não humano, humano, roedor, roedor que não rato, camundongo ou hamster.
[00240] Numa modalidade, o vetor de alvejamento compreende um gene de recombinase específica de sítio. Numa modalidade, o gene da recombinase específica de sítio codifica uma recombinase Cre. Numa modalidade, o gene da recombinase Cre é Crei, em que dois exons que codificam a recombinase Cre são separados por um intron para impedir a sua expressão numa célula procariótica. Numa modalidade, o gene da recombinase Cre compreende ainda um sinal de localização nuclear, para facilitar a localização de Cre (ou qualquer recombinase ou agente de nuclease) para o núcleo (por exemplo, o gene é um gene de NL-Cre). Numa modalidade específica, o gene da recombinase Cre compreende ainda um sinal de localização nuclear e um intron (por exemplo, NL-Crei)
[00241] Em várias modalidades, um promotor adequado para a expressão do agente de nuclease (incluindo a recombinase Cre ou Crei discutida acima) é selecionado a partir de ou compreende um Prm1, Blimp1, Gata6, Gata4, Igf2, Lhx2, Lhx5, e/ou Pax3. Numa modalidade específica, o promotor é o promotor Gata6 ou Gata4 . Os diferentes promotores podem ser de qualquer organismo, incluindo, por exemplo, um roedor tal como um camundongo ou um rato, um roedor que não rato, um eucariota, um eucariota de não rato, um mamífero não humano, um mamífero, um humano ou um hamster. Numa outra modalidade específica, o promotor é um promotor Prm1 . Numa outra modalidade específica, o promotor é um promotor Prm1 de rato. Numa outra modalidade específica, o promotor é um promotor Prm1 de rato. Numa outra modalidade específica, o promotor é um promotor Blimp1 ou um fragmento do mesmo, por exemplo, um fragmento de 1 kb ou de 2 kb de promotor Blimp1 . Ver, por exemplo, US Patente 8.697.851 e US Publicação do Pedido de 2013-0312129, ambas as quais são aqui incorporadas por referência na sua totalidade.
[00242] Numa modalidade, o LTVEC compreende um inserto de ácido nucleico que pode produzir uma deleção, adição, substituição ou uma combinação dos mesmos de uma região do rato, um eucariota, um eucariota de não rato, um mamífero, de mamífero não humano, um humano, um roedor, um roedor que não rato, um camundongo ou um hamster ApoE o locus Il2rg o locus Rag2 o locus Rag1 locus e/ou o Rag2/Rag1 locus como discutido em detalhe aqui noutro local. Em modalidades específicas, a modificação genética no locus ApoE resulta numa diminuição, um aumento ou uma modulação da atividade de ApoE, a atividade de IL-2Rg, atividade Rag2, atividade Rag1 e/ou a atividade Rag2 e Rag1. Numa modalidade, um ApoE knockout, e Il2rg knockout, um Rag2 knockout, um Rag1 knockout, um Rag2/Rag1 knockout é gerado. Como discutido abaixo, os agentes de nuclease podem ser empregues com qualquer dos sistemas de alvejamento de LTVEC para atingir qualquer locus genômico de interesse.
[00243] Numa outra modalidade, o genoma é exposto a uma proteína Cas e um RNA CRISPR na presença de um vetor de alvejamento grande (LTVEC) compreendendo uma sequência de ácido nucleico de pelo menos 10 kb. Em tais casos, após a exposição à proteína Cas, o RNA CRISPR, e o LTVEC, o genoma é modificado para conter, pelo menos, 10 kb de sequência de ácido nucleico. Em modalidades específicas, o LTVEC compreende uma sequência de ácido nucleico de pelo menos 20 kb, pelo menos, 30 kb, pelo menos, 40 kb, pelo menos, 50 kb, pelo menos, 60 kb, pelo menos, 70 kb, pelo menos, 80 kb, pelo menos 90 kb, pelo menos 100 kb, pelo menos 150 kb ou pelo menos 200 kb.
[00244] Agentes de Nuclease e Locais de Reconhecimento para
Nuclease Agentes
[00245] Tal como descrito mais acima, os agentes de nucleases podem ser utilizados nos métodos e composições aqui divulgados para auxiliar na modificação do locus alvo tanto numa célula procariótica ou dentro de uma célula pluripotente ou não pluripotente de rato, eucariótica, eucariótica de não rato, de mamífero, de mamífero não humano, humano, de roedor, roedor que não rato, camundongo ou hamster. Um tal agente de nuclease pode promover a recombinação homóloga entre o vetor de alvejamento seletiva e o locus alvo. Numa modalidade, o agente compreende um agente de nuclease de endonuclease.
[00246] Tal como aqui utilizado, o termo "local de reconhecimento para um agente de nuclease" compreende uma sequência de DNA no qual uma entalhe ou quebra de fita dupla é induzida por um agente de nuclease. O local de reconhecimento para um agente de nuclease pode ser endógeno (ou nativo) à célula ou o local de reconhecimento pode ser exógeno à célula. Em modalidades específicas, o local de reconhecimento é exógeno à célula e, assim, não é de ocorrência natural no genoma da célula. Em ainda outras modalidades, o local de reconhecimento é exógeno à célula e aos polinucleotídeos de interesse que se deseje para posicionar no locus genômico alvo. Noutras modalidades, o local de reconhecimento exógeno ou endógeno está presente apenas uma vez no genoma da célula hospedeira. Em modalidades específicas, um local endógeno nativo ou que ocorre apenas uma vez no genoma é identificado. Tal local pode então ser usado para projetar agentes de nuclease que irá produzir uma entalhe ou quebra de fita dupla no local de reconhecimento endógeno.
[00247] O comprimento do local de reconhecimento pode variar, e inclui, por exemplo, locais de reconhecimento que tem, pelo menos, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25 , 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50 , 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70 ou mais nucleotídeos de comprimento. Numa modalidade cada monômero do agente de nuclease reconhece um local de reconhecimento de pelo menos 9 nucleotídeos. Em outras modalidades, o local de reconhecimento é de cerca de 9 a cerca de 12 nucleotídeos de comprimento, cerca de 12 a cerca de 15 nucleotídeos de comprimento, cerca de 15 a cerca de 18 nucleotídeos de comprimento, ou entre cerca de 18 a cerca de 21 nucleotídeos de comprimento, e qualquer combinação de tais sub intervalos (por exemplo, 918 nucleotídeos). O local de reconhecimento pode ser palindrômico, isto é, a sequência de uma fita lê o mesmo no sentido oposto na fita complementar. Reconhece-se que um determinado agente de nuclease pode ligar o local de reconhecimento e clivar esse local de ligação ou, em alternativa, o agente de nuclease pode ligar-se a uma sequência que é diferente da do local de reconhecimento. Além disso, o termo local de reconhecimento compreende tanto o local de ligação do agente de nuclease e do local de quebra/clivagem independentemente do fato de o local de quebra/clivagem está dentro ou fora do local de ligação ao agente de nuclease. Numa outra variação, a clivagem pelo agente de nuclease pode ocorrer nas posições de nucleotídeo imediatamente em frente uns dos outros para produzir um corte de extremidade embotada ou, em outros casos, as incisões podem ser escalonadas para produzir saliências "overhang" em cadeia simples, também chamado de "extremidades coesivas", que podem ser saliências "overhang" de 5', ou saliência "overhang" de 3'.
[00248] Qualquer agente de nuclease que induz uma entalhe ou quebra de fita dupla em um local de reconhecimento desejado pode ser usado nos métodos e composições aqui divulgados. Um agente de nuclease de ocorrência natural ou nativa pode ser empregue, desde que o agente de nuclease induza um entalhe ou quebra de fita dupla em um local de reconhecimento desejado. Alternativamente, um agente de nuclease modificado ou manipulado pode ser empregue Um "agente de nuclease manipulado" compreende uma nuclease que é manipulada (modificada ou derivada) a partir de sua forma nativa para reconhecer especificamente e induzir um entalhe ou quebra de fita dupla no local de reconhecimento desejado. Assim, um agente de nuclease manipulado pode ser derivado a partir de um agente de ocorrência natural nativa, nucleases, ou pode ser criado artificialmente ou sintetizado. A modificação do agente de nuclease pode ser tão pequeno quanto um aminoácido em um agente de clivagem da proteína ou um nucleotídeo em um agente de clivagem de ácido nucleico. Em algumas modalidades, a nuclease manipulada induz um entalhe ou quebra de fita dupla em um local de reconhecimento, em que o local de reconhecimento não foi uma sequência que teria sido reconhecida por um agente de nuclease nativo (não manipulado ou não modificado). Produzindo um entalhe ou quebra de fita dupla em um local de reconhecimento ou outro DNA pode ser aqui referido como "corte" ou "clivagem" do local de reconhecimento ou outro DNA.
[00249] Variantes e fragmentos ativos dos locais de reconhecimento exemplificados também são fornecidas. Tais variantes ativas podem compreender pelo menos 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99 % ou mais de identidade de sequência para o local de reconhecimento dado, em que as variantes ativas retêm atividade biológica e são, por conseguinte, capazes de serem reconhecidas e clivadas por um agente de nuclease de uma maneira específica da sequência. Os ensaios para medir a quebra de fita dupla de um local de reconhecimento por um agente de nuclease conhecido na técnica e, geralmente, medir a capacidade de uma nuclease para cortar o local de reconhecimento.
[00250] O local de reconhecimento do agente de nuclease pode ser posicionado em qualquer lugar dentro ou perto do locus alvo. O local de reconhecimento pode ser localizado dentro de uma região codificante de um gene, ou em regiões reguladoras, os quais influenciam a expressão do gene. Assim, um local de reconhecimento do agente de nuclease pode estar localizado em um intron, um exon, um promotor, um potencializador, uma região reguladora, ou qualquer região codificante de não proteína.
[00251] Numa modalidade, o agente de nuclease é uma Nuclease Efetora como Ativador de Transcrição (TALEN). Nucleases efetoras TAL são uma classe de nucleases específicas de sequências que podem ser usadas para fazer quebras de fita dupla em sequências alvo específicas no genoma de um organismo procariota ou eucariota. Nucleases efetoras TAL são criadas por fusão de uma parte nativa ou manipulada de efetor pseudo ativador de transcrição (TAL), ou funcional dos mesmos, para o domínio catalítico de uma endonuclease, tal como, por exemplo, FokI. O domínio único de ligação ao DNA modulador de efetor TAL permite a criação de proteínas potencialmente com qualquer especificidade de reconhecimento de DNA. Assim, os domínios de ligação ao DNA de nucleases efetoras TAL podem ser manipulados para reconhecer locais alvo de DNA específicos e, assim, usados para fazer quebras de fita dupla em sequências alvo desejadas. Ver, WO 2010/079430; Morbitzer et al. (2010) PNAS 10.1073/pnas.1013133107; Scholze & Boch (2010) Virulence 1:428-432; Christian et al. Genetics (2010) 186:757-761; Li et al. (2010) Nuc. Acids Res. (2010) doi:10.1093/nar/gkq704; e Miller et al. (2011) Nature Biotechnology 29: 143148; todos os quais são aqui incorporados por referência.
[00252] Os exemplos de nucleases TAL adequados, e métodos para a preparação de nucleases TAL adequados, são revelados, por exemplo, no Pedido de Patente US No. 2011/0239315 A1, 2011/0269234 A1, 2011/0145940 A1, 2003/0232410 A1, 2005/0208489 A1, 2005/0026157 A1, 2005/0064474 A1, 2006/0188987 A1, e 2006/0063231 A1 (cada um aqui incorporado por referência). Em várias modalidades, as nucleases efetoras TAL são manipuladas para que cortem dentro ou próximo de uma sequência de ácido nucleico alvo, por exemplo, num locus genômico de interesse, em que a sequência de ácido nucleico alvo é em ou perto de uma sequência a ser modificada por um vetor de alvejamento. As nucleases TAL adequadas para utilização com os vários métodos e composições aqui fornecidos incluem aqueles que são especificamente concebidos para se ligarem a ou perto de sequências de ácido nucleico alvo a serem modificadas por vetores de alvejamento, tal como aqui descrito.
[00253] Numa modalidade, cada monômero de TALEN compreende 12-25 repetições TAL, em que cada repetição TAL se liga a um subsítio 1 bp. Numa modalidade, o agente de nuclease é uma proteína quimérica compreendendo um domínio de ligação de DNA com base em repetição TAL ligado operativamente a uma nuclease independente. Numa modalidade, a nuclease independente é uma endonuclease FokI. Numa modalidade, o agente de nuclease compreende um primeiro domínio de ligação ao DNA baseado em repetição TAL e um segundo domínio de ligação ao DNA baseado em repetição TAL, em que cada um do primeiro e o segundo domínio de ligação ao DNA baseado em repetição TAL está operativamente ligado a uma nuclease FokI, em que o primeiro e o segundo domínio de ligação ao DNA baseado em repetição TAL reconhece duas sequências de DNA alvo contíguas em cada cadeia da sequência de DNA alvo separadas por local de clivagem de cerca de 6 bp a 40 bp, e em que as nucleases FokI dimerizam e fazem uma quebra de fita dupla numa sequência alvo.
[00254] Numa modalidade, o agente de nuclease compreende um primeiro domínio de ligação ao DNA baseado em repetição TAL, em que cada um do primeiro e do segundo domínio de ligação ao DNA baseado em repetição TAL está operativamente ligado a uma nuclease FokI, em que o primeiro e o segundo domínio de ligação ao DNA baseado em repetição TAL reconhece duas sequências de DNA alvo contíguas em cada cadeia da sequência de DNA alvo separadas por um local de clivagem 5 bp ou 6 bp, e em que as nucleases FokI dimerizam e fazem uma quebra de fita dupla.
[00255] O agente de nuclease empregue nos vários métodos e composições aqui descritos pode ainda compreender uma nuclease dedo de zinco (ZFN). Numa modalidade, cada monômero da ZFN compreende 3 ou mais domínios de ligação ao DNA com base em dedo de zinco, em que cada um domínio de ligação ao DNA com base em dedo de zinco se liga a um subsítio 3 bp. Em outras modalidades, o ZFN é uma proteína quimérica compreendendo um domínio de ligação ao DNA com base em dedo de zinco ligado operativamente a uma nuclease independente. Numa modalidade, a endonuclease independente é uma endonuclease FokI. Numa modalidade, o agente de nuclease compreende uma primeira ZFN e uma segunda ZFN, em que cada uma da primeira ZFN e da segunda ZFN está operativamente ligada a uma nuclease FokI, em que a primeira e a segunda ZFN reconhecem duas sequências de DNA alvo contíguas em cada fita da sequência de DNA alvo separadas por um local de clivagem de cerca de 6 bp a cerca de 40 bp ou local de clivagem de cerca de 5 bp a cerca de 6 bp, e em que as nucleases FokI dimerizam e fazem uma quebra de fita dupla. Veja, por exemplo, US20060246567; US20080182332; US20020081614; US20030021776; WO/2002/057308A2; US20130123484; US20100291048; e, WO/2011/017293A2, cada uma das quais é aqui incorporada por referência.
[00256] Em uma modalidade dos métodos aqui fornecidos, o agente de nuclease compreende (a) uma proteína quimérica compreendendo um domínio de ligação ao DNA baseado em dedo de zinco fundido com uma endonuclease de FokI; ou (b) uma proteína quimérica compreendendo uma nuclease efetora como ativador de transcrição (TALEN) fundida a uma endonuclease FokI.
[00257] Em ainda outra modalidade, o agente de nuclease é uma meganuclease. Meganucleases foram classificadas em quatro famílias com base em motivos de sequência conservados, as famílias são as LAGLIDADG (SEQ ID NO: 16), GIY-YIG, HNH, e famílias de caixa His-Cys. Estes motivos participam na coordenação de íons metálicos e hidrólise das ligações fosfodiéster. HEases são notáveis pelos seus locais de reconhecimento longos, e por tolerar alguns polimorfismos de sequência nos seus substratos de DNA. Domínios meganuclease, estrutura e função são conhecidos, ver, por exemplo, Guhan e Muniyappa (2003) Crit Rev Biochem Mol Biol 38: 199-248; Lucas et al., (2001) Nucleic Acids Res 29: 960-9; Jurica e Stoddard, (1999) Cell Mol Life Sci 55: 1304-1326; Stoddard, (2006) Q Rev Biophys 38: 49-95; e Moure et al., (2002) Nat Struct Biol 9:764. Em alguns exemplos é utilizada uma variante de ocorrência natural e/ou derivativo manipulado de meganuclease. Os métodos para modificar a cinética, interações cofator, expressão, condições ótimas, e/ou especificidade de local de reconhecimento, e rastreio para a atividade são conhecidas, ver, por exemplo, Epinat et al., (2003) Nucleic Acids Res 31:2952-62; Chevalier et al., (2002) Mol Cell 10:895-905; Gimble et al., (2003) Mol Biol 334:993-1008; Seligman et al., (2002) Nucleic Acids Res 30:3870-9; Sussman et al., (2004) J Mol Biol 342:31-41; Rosen et al., (2006) Nucleic Acids Res 34:4791-800; Chames et al., (2005) Nucleic Acids Res 33:e178; Smith et al., (2006) Nucleic Acids Res 34:e149; Gruen et al., (2002) Nucleic Acids Res 30:e29; Chen e Zhao, (2005) Nucleic Acids Res 33:e154; WO2005105989; WO2003078619; WO2006097854; WO2006097853; WO2006097784; e WO2004031346.
[00258] Qualquer meganuclease pode ser usado neste documento, incluindo, mas não limitado a, I-SceI, I-SceII, SceIII-eu, I-SceIV, I-SceV, I- SceVI, I-SceVII, I-CeuI, I-CeuAIIP, I-Crel, I-CrepsbIP, I-CrepsbIIP, I- CrepsbIIIP, I-CrepsbIVP, I-TliI, PpoI, PI-PspI, F-SceI, F-SceII, SuvI-F, F- TevI, F-TevII, I-AmaI, I-AniI, I-Chul, I-CmoeI, I-CpaI, I-CpaII, I-CsmI, I- CvuI, I-CvuAIP, I-DdiI, I-DdiII, I-DirI, I-DmoI, I-HmuI, I-HmuII, I-HsNIP, I-LlaI, I-MsoI, I-NaaI, I-Nanl, I-NcIIP, I-NgrIP, I-NitI, I-Njal, I-Nsp236IP, I- PakI, I-PboIP, I-PcuIP , I-PcuAI, I-PcuVI, I-PgrIP, I-PobIP, I-PorI, I-PorIIP, I-PbpIP, I-SpBetaIP, I-ScaI, I-SexIP, I-SneIP, I-SpomI, I-SpomCP, I-SpomIP, I-SpomIIP, I-SquIP, I-Ssp6803I, I-SthPhiJP, I-SthPhiST3P, I-SthPhiSTe3bP, I-TdeIP, I-TevI, I-TevII, I-TevIII, I-UarAP, I-UarHGPAIP, I-UarHGPA13P, I-VinIP, I-ZbiIP, PI-MtuI, PI-MtuHIP PI-MtuHIIP, PI-PfuI, PI-PfuII, PIPkoI, PI-PkoII, PI-Rma43812IP, PI-SpBetaIP, PI-SceI, PI-TfuI, PI-TfuII, PI- ThyI, PI-TliI, PI-TliII, ou quaisquer variantes ativas ou fragmentos das mesmas.
[00259] Numa modalidade, a meganuclease reconhece sequências de DNA de fita dupla de 12 a 40 pares de bases. Numa modalidade, a meganuclease reconhece uma sequência alvo perfeitamente correspondente no genoma. Numa modalidade, a meganuclease é uma nuclease de "endereçamento" homing. Numa modalidade, a nuclease de "endereçamento" homing é uma família LAGLIDADG (SEQ ID NO: 16) de nuclease de "endereçamento" homing. Numa modalidade, a família LAGLIDADG (SEQ ID NO: 16) de nuclease de "endereçamento" homing é selecionada a partir de I-Scel, I-Crel, e I-Dmol.
[00260] Agentes de nuclease podem ainda compreender endonucleases de restrição, as quais incluem endonucleases Tipo I, Tipo II, Tipo III, Tipo IV. Endonucleases de restrição Tipo I e Tipo III reconhecem locais de reconhecimento específicos, mas tipicamente clivam numa posição variável do local de ligação de nucleases, o que pode ser centenas de pares de bases de distância a partir do local de clivagem (local de reconhecimento). Em sistemas de Tipo II a atividade de restrição é independente de qualquer atividade de metilase, e clivagem normalmente ocorre em locais específicos dentro ou perto do local de ligação. A maioria das enzimas do Tipo II cortam sequências palindrômicas, contudo enzimas Tipo IIa reconhecem locais de reconhecimento não palindrômicos e clivam fora do local de reconhecimento, enzimas do Tipo IIb cortam sequências duas vezes com ambos os locais fora do local de reconhecimento, e enzimas Tipo II reconhecem um local de reconhecimento assimétrico e clivam de um lado e a uma distância definida de cerca de 1-20 nucleotídeos a partir do local de reconhecimento. Enzimas de restrição Tipo IV de DNA metilado alvo. As enzimas de restrição são ainda descritas e classificadas, por exemplo no banco de dados REBASE (página da web em rebase.neb.com; Roberts et al., (2003) Nucleic Acids Res 31:418-20), Roberts et al., (2003) Nucleic Acids Res 31: 1805-12, e Belfort et al., (2002) em Mobile DNA II, pp. 761-783, Eds. Craigie et al., (ASM Press, Washington, DC).
[00261] O agente de nuclease empregue nos vários métodos e composições podem também compreender um sistema de CRISPR/Cas. Tais sistemas podem ser empregues, por exemplo, uma nuclease Cas9, que em alguns casos, tem códons otimizados para o tipo de célula desejada, no qual é para ser expresso. Tais sistemas podem também empregar uma guia de RNA (gRNA) que compreende duas moléculas separadas. Um exemplar de duas molécula gRNA compreende uma molécula semelhante a crRNA ( "RNA CRISPR" ou "alvejador-RNA" ou "crRNA" ou "repetição crRNA") e uma molécula semelhante a tracrRNA correspondente ( "trans-acting RNA CRISPR" ou "ativadora RNA "ou" molécula tracrRNA"ou "scaffold"). Um crRNA compreende tanto o segmento de alvejamento de DNA (cadeia simples) do gRNA e um trecho de nucleotídeos que formam uma metade de um duplex de fita dupla de RNA (dsRNA) do segmento de ligação a proteína do gRNA. Um tracrRNA correspondente (ativador-RNA) compreende um segmento de nucleotídeos que forma a outra metade o duplex de dsRNA do segmento de ligação a proteína do gRNA. Assim, um trecho de nucleotídeos de um crRNA são complementares e hibridizam com um trecho de nucleotídeos de um tracrRNA para formar o duplex de dsRNA do domínio de ligação a proteína do gRNA. Como tal, cada crRNA pode-se dizer que tem um tracrRNA correspondente. O crRNA adicionalmente fornece o segmento de alvejamento de DNA de cadeia simples. Por conseguinte, um gRNA compreende uma sequência que hibrida com uma sequência alvo, e um tracrRNA. Assim, um crRNA e um tracrRNA (como um par correspondente) hibrida para formar um gRNA. Se for utilizado para a modificação no interior de uma célula, a sequência exata e/ou o comprimento de uma dada molécula crRNA ou tracrRNA ou pode ser concebido para ser específico para as espécies em que será usada as moléculas de RNA.
[00262] Genes que ocorrem naturalmente, que codificam para os três elementos (Cas9, tracrRNA e crRNA) são normalmente organizados em operon (s). RNAs CRISPR que ocorrem naturalmente diferem de acordo com o sistema Cas9 e organismo, mas geralmente contêm um segmento alvo de entre 21 a 72 nucleotídeos de comprimento, flanqueada por duas repetições diretas (DR) de um comprimento de entre 21 a 46 nucleotídeos (ver, por exemplo, WO2014/131833). No caso de S. pyogenes, os DRs são 36 nucleotídeos de comprimento e o segmento alvo é de 30 nucleotídeos de comprimento. O DR 3 'localizado é complementar a e hibrida com o tracrRNA correspondente, que por sua vez se liga à proteína Cas9.
[00263] Em alternativa, o sistema ainda emprega um construto crRNA- tracrRNA fundido (isto é, um único transcrito) que funciona com a Cas9 com códons otimizados. Este RNA é muitas vezes referido como uma guia de RNA ou gRNA. Dentro de um gRNA, a porção crRNA é identificada como a "sequência alvo" para um dado local de reconhecimento e o tracrRNA é muitas vezes referido como o "andaime". Resumidamente, um fragmento de DNA curto que contém a sequência alvo é inserida num plasmídeo de expressão de RNA guia. O plasmídeo de expressão gRNA compreende a sequência alvo (em algumas modalidades de cerca de 20 nucleotídeos), uma forma da sequência de tracrRNA ("scaffold"), assim como um promotor adequado que é ativo na célula e os elementos necessários para o processamento adequado em células eucarióticas. Muitos dos sistemas dependem de mercadorias, os oligos complementares que são recozidos para formar um DNA de fita dupla e então clonado no plasmídeo de expressão gRNA. O cassete de expressão gRNA e o cassete de expressão Cas9 são, então, introduzidos na célula. Ver, por exemplo, Mali P et al. (2013) Science 15 Fevereiro de 2013;339(6121):823-6; Jinek M et al. Science 17 de Agosto de2012;337(6096):816-21; Hwang WY et al. Nat Biotechnol 31 de Março de 2013(3):227-9; Jiang W et al. Nat Biotechnol 31 de Março de 2013(3):233-9; and Cong L et al. Science 15 de Fevereiro de 2013;339(6121):819-23, sendo que cada um deles é incorporado a este instrumento por referência). Ver também, por exemplo, WO/2013/176772A1, WO/2014/065596A1, WO/2014/089290A1, WO/2014/093622A2, WO/2014/099750A2 e WO/2013142578A1, cada uma das quais é aqui incorporada por referência.
[00264] Em algumas modalidades, a nuclease Cas9 pode ser fornecida sob a forma de uma proteína. Em algumas modalidades, a proteína Cas9 pode ser fornecida na forma de um complexo com o gRNA. Em outras modalidades, a nuclease Cas9 pode ser fornecida sob a forma de um ácido nucleico que codifica a proteína. O ácido nucleico que codifica a nuclease Cas9 pode ser RNA (por exemplo, RNA mensageiro (mRNA)) ou DNA.
[00265] Em algumas modalidades, o gRNA pode ser fornecido sob a forma de RNA. Em outras modalidades, o gRNA pode ser fornecido sob a forma de DNA que codifica o RNA. Em algumas modalidades, o gRNA pode ser fornecido sob a forma de moléculas crRNA e tracrRNA separadas, ou moléculas de DNA separadas que codificam o crRNA e tracrRNA, respectivamente.
[00266] Numa modalidade, o método para a modificação de um local genômico de interesse numa célula compreende ainda a introdução na célula de: (a) um primeiro construto de expressão que compreende um primeiro promotor ligado operativamente a uma primeira sequência de ácido nucleico que codifica uma proteína (Cas) associada a Repetições Palindrômicas Curtas Agregadas e Regularmente Interespaçadas (CRISPR); (b) um segundo construto de expressão que compreende um segundo promotor ligado operativamente a uma sequência alvo genômica ligada a um RNA guia (gRNA), em que a sequência alvo genômica é flanqueada por um Motivo Adjacente Protoespaçador. Opcionalmente, a sequência alvo genômica é flanqueada no extremo 3’ por uma sequência do Motivo Adjacente Protoespaçador (PAM). Numa modalidade, a célula compreende uma célula eucariótica, uma célula eucariótica de não rato, uma célula de mamífero, uma célula humana, uma célula de mamífero que não humano, uma célula pluripotente, uma célula não pluripotente, uma célula pluripotente não humana, uma célula pluripotente humana, uma célula ES humana, uma célula-tronco adulta humana, uma célula progenitora humana de desenvolvimento restrito, uma célula iPS humana, uma célula humana, uma célula de roedor, uma célula de roedor que não rato, uma célula de rato, uma célula de camundongo, uma célula de hamster, um fibroblasto, ou uma célula CHO.
[00267] Numa modalidade, a sequência alvo genômica compreende a sequência de nucleotídeos de GNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNGG (GN1- 20 GG; SEQ ID NO: 1). Numa modalidade, a sequência alvo genômica compreende a SEQ ID NO: 23, em que n está entre 1 e 20 nucleotídeos de comprimento. Numa outra modalidade, a sequência alvo genômica compreende entre 14 e 20 nucleotídeos de comprimento de SEQ ID NO: 1.
[00268] Numa modalidade, o gRNA compreende uma terceira sequência de ácido nucleico que codifica um RNA (crRNA) de Repetições Palindrômicas Curtas Agregadas e Regularmente Interespaçadas (CRISPR) e um CRISPR de RNA de trans-ativação (tracrRNA). Em modalidades específicas, a proteína Cas é Cas9.
[00269] Em algumas modalidades, o gRNA compreende (a) o RNA quimérico da sequência de ácido nucleico 5'- GUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAU AAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGU GCUUUU-3 '(SEQ ID NO: 2); ou (b) o RNA quimérico da sequência de ácido nucleico 5'- GUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCG-3 '(SEQ ID NO: 3).
[00270] Numa outra modalidade, o crRNA compreende 5'- GUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAU-3 '(SEQ ID NO: 4); 5'- GUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAG (SEQ ID NO: 5); ou 5'-GAGUCCGAGCAGAAGAAGAAGUUUUA-3 '(SEQ ID NO: 6).
[00271] Em ainda outras modalidades, o tracrRNA compreende, 5'- AAGGCUAGUCCG-3 '(SEQ ID NO: 7) ou 5'-AAGGCUAGUCCGU UAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUU-3 '(SEQ ID NO: 8).
[00272] Numa modalidade, a proteína Cas é uma proteína Cas tipo I. Numa modalidade, a proteína Cas é uma proteína Cas tipo II. Numa modalidade, a proteína Cas tipo II é Cas9. Numa modalidade, a primeira sequência de ácido nucleico codifica uma proteína humana códon otimizada Cas.
[00273] Em certas modalidades, a proteína Cas é uma "nickase" que pode criar quebras de fita simples (isto é, "entalhes") no local de destino sem cortar ambas as fitas de DNA de fita dupla (dsDNA). Cas9, por exemplo, compreende dois domínios de nuclease- um domínio de nuclease semelhante a RuvC e um domínio de nuclease semelhante a HNH- que são responsáveis pela clivagem de fitas de DNA opostas. Mutação em qualquer um destes domínios pode criar uma nickase. Exemplos de mutações criando nickases podem ser encontrados, por exemplo, WO/2013/176772A1 e WO/2013/142578A1, cada uma das quais é aqui incorporada por referência.
[00274] Em certas modalidades, duas proteínas Cas separadas (por exemplo, nickases) específicas para um local alvo em cada fita de dsDNA pode criar sequências de saliências "overhang" complementares a sequências de saliências "overhang" sobre um outro ácido nucleico, ou de uma região separada no mesmo ácido nucleico. As extremidades de saliências "overhang" criadas por entrar em contato com um ácido nucleico com duas nickases específicas para locais alvo em ambas as fitas de dsDNA podem ser extremidades de saliências "overhang" de tanto 5 'ou 3'. Por exemplo, uma primeira nickase pode criar uma única quebra de fita na primeira fita de dsDNA, enquanto uma segunda nickase pode criar uma única quebra de fita na segunda fita de dsDNA de tal forma que as sequências de saliências "overhang" são criadas. Os locais alvo de cada nickase criando a quebra de fita única podem ser selecionados de tal modo que as sequências de extremidade de saliências "overhang" são complementares criadas a sequências de extremidade de saliências "overhang" numa molécula de ácido nucleico diferente. As extremidades de saliências "overhang" complementares das duas moléculas de ácidos nucleicos diferentes podem ser recozidas pelos métodos aqui divulgados. Em algumas modalidades, o local alvo da nickase na primeira fita é diferente do local alvo da nickase na segunda fita.
[00275] Numa modalidade, o primeiro ácido nucleico compreende uma mutação que interrompe pelo menos um resíduo de aminoácido de locais ativos de nuclease na proteína Cas, em que a proteína Cas mutante gera uma quebra em apenas uma cadeia da região do DNA alvo, e em que a mutação diminui a recombinação não homóloga na região do DNA alvo.
[00276] Numa modalidade, o primeiro ácido nucleico que codifica a proteína Cas compreende ainda um sinal de localização nuclear (NLS). Numa modalidade, o sinal de localização nuclear é um sinal de localização nuclear de SV40.
[00277] Numa modalidade, o segundo promotor que dirige a expressão da sequência alvo do RNA genômico e o RNA guia (gRNA) é um promotor da RNA polimerase III. Numa modalidade, o promotor da RNA polimerase III é um promotor de U6 humano. Numa modalidade, o promotor da RNA polimerase III é um promotor U6 de rato polimerase III. Numa modalidade, o promotor da RNA polimerase III, é um promotor U6 de camundongo polimerase III.
[00278] Numa modalidade, as sequências de ácidos nucleicos que codificam a tracrRNA e a crRNA estão ligadas através de um circuito de síntese, em que, aquando da expressão, a crRNA e a tracrRNA formam uma crRNA: dúplex tracrRNA.
[00279] O sistema CRISPR/Cas, tal como descrito acima pode ser utilizado em combinação com vetores de alvejamento grandes com qualquer um dos seguintes tipos de células: uma célula eucariótica, uma célula eucariótica de não rato, uma célula de mamífero, uma célula de mamífero não humano, uma célula pluripotente, uma célula não pluripotente, uma célula pluripotente não humana, uma célula pluripotente humana, uma célula ES humana, uma célula tronco adulta humana, uma célula progenitora humana de desenvolvimento restrito, uma célula iPS humana, uma célula humana, uma célula de roedor, uma célula de roedor que não rato, uma célula de rato, uma célula de camundongo, uma célula de hamster, um fibroblasto, ou uma célula CHO.
[00280] Numa modalidade, a primeira construção de expressão e a segunda construção de expressão são expressas a partir de um mesmo plasmídeo.
[00281] Numa modalidade, o primeiro e o segundo construtos de expressão são introduzidos em conjunto com o LTVEC. Numa modalidade, o primeiro e o segundo construtos de expressão são introduzidos separadamente do LTVEC ao longo de um período de tempo.
[00282] Numa modalidade, o método compreende a introdução de uma pluralidade do segundo construto e uma pluralidade do LTVEC para edição multiplex de loci alvo distinto, tal como aqui descrito.
[00283] Variantes e fragmentos ativos de agentes de nuclease (isto é, um agente de nuclease manipulado) também são fornecidos. Tais variantes ativas podem compreender pelo menos 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99 % ou mais identidade de sequência com o agente de nuclease nativo, em que as variantes ativas retêm a capacidade de cortar em um local de reconhecimento desejado e, portanto, reter entalhe ou atividade de indução de quebra de fita dupla. Por exemplo, qualquer um dos agentes de nuclease aqui descritos podem ser modificados a partir de uma sequência nativa de endonuclease e concebidos para reconhecer e provocar um entalhe ou quebra de fita dupla com um local de reconhecimento que não foi reconhecido pelo agente de nuclease nativa. Assim, em algumas modalidades, a nuclease manipulada tem uma especificidade para induzir um entalhe ou quebra de fita dupla a um local de reconhecimento que é diferente do local de reconhecimento do agente de nuclease nativo correspondente. Os ensaios para atividade de indução de entalhe ou quebra de fita dupla são conhecidos e geralmente medem a atividade global e especificidade da endonuclease em substratos de DNA contendo o local de reconhecimento.
[00284] O agente de nuclease pode ser introduzido na célula por quaisquer meios conhecidos na técnica. O polipeptídeo que codifica o agente de nuclease pode ser introduzido diretamente dentro da célula. Alternativamente, um polinucleotídeo que codifica para o agente de nuclease pode ser introduzido na célula. Quando um polinucleotídeo que codifica o agente de nuclease é introduzido dentro da célula, o agente de nuclease pode ser transientemente, condicionalmente ou constitutivamente expresso dentro da célula. Assim, o polinucleotídeo que codifica o agente de nuclease pode estar contido num cassete de expressão e ser operacionalmente ligado a um promotor condicional, um promotor indutível, um promotor constitutivo, ou um promotor específico do tecido. Tais promotores de interesse são discutidos em mais pormenor noutra parte deste documento. Alternativamente, o agente de nuclease é introduzido na célula como um mRNA que codifica ou compreende um agente de nuclease.
[00285] Numa modalidade, o crRNA e o tracrRNA são expressos como transcritos de RNA separados.
[00286] Em modalidades específicas, o polinucleotídeo que codifica para o agente de nuclease é estavelmente integrado no genoma da célula e ligado operacionalmente a um promotor ativo na célula. Em outras modalidades, o polinucleotídeo que codifica o agente de nuclease está no mesmo vetor de alvejamento compreendendo o inserto de ácido nucleico, enquanto que em outros casos, o polinucleotídeo que codifica o agente de nuclease é um vetor ou um plasmídeo que é separado a partir do vetor de alvejamento compreendendo o inserto de ácido nucleico.
[00287] Quando o agente de nuclease é fornecido para a célula, através da introdução de um polinucleotídeo que codifica o agente de nuclease, de tal polinucleotídeo que codifica um agente de nuclease pode ser modificado para se substituir códons tendo uma frequência mais elevada de utilização, à célula de interesse, em comparação com a sequência polinucleotídica que codifica o agente de nuclease. Por exemplo, o polinucleotídeo que codifica o agente de nuclease pode ser modificado para se substituir códons tendo uma frequência mais elevada de utilização de uma dada célula procariótica ou eucariótica de interesse, incluindo uma célula bacteriana, uma célula de levedura, uma célula humana, uma célula não humana, uma célula eucariótica de não rato, uma célula de mamífero, uma célula de roedor, uma célula de roedor que não rato, uma célula de camundongo, uma célula de rato, uma célula de hamster ou qualquer outra célula hospedeira de interesse, em comparação com a sequência polinucleotídica de ocorrência natural.
[00288] Numa modalidade, o agente de endonuclease é introduzido em conjunto com o LTVEC. Numa modalidade, o agente de endonuclease é introduzido separadamente a partir do LTVEC ao longo de um período de tempo. Numa modalidade, o agente de endonuclease é introduzido antes da introdução do LTVEC. Numa modalidade, o agente de endonuclease é introduzido em células ES de rato, eucariótica, eucariótica de não rato, mamíferos, de mamíferos não humanos, humanos, roedores, roedor que não rato, camundongo ou hamster após a introdução do LTVEC.
[00289] Numa modalidade, o agente de endonuclease é um construto de expressão que compreende uma sequência de ácido nucleico que codifica uma endonuclease, em que a sequência de ácido nucleico está operacionalmente ligada a um promotor. Numa modalidade, o promotor é um promotor constitutivamente ativo. Numa modalidade, o promotor é um promotor indutível. Numa modalidade, o promotor é ativo na célula pluripotente ou não-pluripotente de rato, eucariótica, eucariótica de não rato, de mamífero, de mamífero não humano, humano, de roedor, roedor que não rato, camundongo ou de hamster. Numa modalidade, o agente é uma endonuclease de mRNA que codifica uma endonuclease. B. Métodos para a Integração de um Polinucleotídeo de Interesse em um Locus Alvo
[00290] Métodos para a modificação de um locus alvo de interesse são fornecidos. Numa modalidade, um locus alvo em uma célula pluripotente ou não pluripotente de rato, eucariótica, eucariótica de não rato, de mamíferos, de mamífero não humano, humano, roedor, roedor que não rato, camundongo ou hamster está orientado para modificação genética. Tal método compreende: (A) introduzir na célula pluripotente ou não pluripotentes de rato, eucariótica, eucariótica de não rato, de mamífero, de mamífero não humano, humano, roedor, roedor que não rato, camundongo ou hamster um vetor de alvejamento compreendendo um inserto de ácido nucleico flanqueado com uma porção de homologia de rato de 5’, eucariótica, eucariótica de não rato, de mamífero, de mamífero não humano, humano, roedor, roedor que não rato, camundongo ou hamster e uma porção de homologia de 3’ de rato, eucariótica, eucariótica de não rato, de mamífero, de mamífero não humano, humano, roedor, de roedor que não rato, camundongo ou hamster; e (b) identificar uma célula pluripotente ou não pluripotente geneticamente modificada de rato, eucariótica, eucariótica de não rato, de mamífero, de mamífero não humano, humano, roedor, roedor que não rato, camundongo ou de hamster que compreende a modificação genética orientada para o locus alvo, em que a modificação genética segmentada é capaz de ser transmitida através da linha germinativa. Em modalidades específicas, a soma total da porção de homologia de 5'e da porção de homologia de 3' é de pelo menos 10 kb e/ou um vetor de alvejamento é empregue.
[00291] Em outras modalidades, o tamanho da soma total de de porções de homologia 5 'e 3' do LTVEC é de cerca de 10 kb a cerca de 150 kb, de cerca de 10 kb a cerca de 100 kb, de cerca de 10 kb a cerca de 75 kb, cerca de 20 kb a cerca de 150 kb, de cerca de 20 kb a cerca de 100 kb, de cerca de 20 kb a cerca de 75 kb, cerca de 30 kb a cerca de 150 kb, de cerca de 30 kb a cerca de 100 kb, de cerca de 30 kb a cerca de 75 kb, cerca de 40 kb a cerca de 150 kb, de cerca de 40 kb a cerca de 100 kb, de cerca de 40 kb a cerca de 75 kb, cerca de 50 kb a cerca de 150 kb, de cerca de 50 kb a cerca de 100 kb ou cerca de 50 kb a cerca de 75 kb, cerca de 10 kb a cerca de 30 kb, cerca de 20 kb a cerca de 40 kb, cerca de 40 kb a cerca de 60 kb, cerca de 60 kb a cerca de 80 kb, cerca de 80 kb a cerca de 100 kb, de cerca de 100 kb a cerca de 120 kb, ou de cerca de 120 kb a cerca de 150 kb. Numa modalidade, o tamanho da deleção é o mesmo ou semelhante ao tamanho da soma total de porções de homologia de 5 'e 3' do LTVEC.
[00292] A célula pluripotente, por exemplo, uma célula de rato, pode ser uma célula tronco embrionária, por exemplo, uma célula tronco embrionária de rato. Numa modalidade específica, (a) a célula ES de rato é derivada de uma estirpe de DA ou uma estirpe ACI; ou (b) a célula ES de rato é caracterizada pela expressão de um marcador de pluripotência que compreende Oct-4, Sox-2, fosfatase alcalina, ou uma combinação dos mesmos. Em outros casos, as células tronco embrionárias de rato utilizadas compreendem uma célula ES de rato como descrito em US Pedido de Patente No. 14/185,103, depositado em 20 de Fevereiro, 2014, aqui incorporada por referência na sua totalidade.
[00293] Qualquer célula pluripotente ou não pluripotente não pode ser utilizado nos métodos aqui fornecidos. Por exemplo, a célula pluripotente ou não-pluripotente pode ser de um eucariota, um eucariota que não rato, um mamífero não humano, um mamífero, um roedor, um roedor que não rato, um rato, um camundongo, um humano ou um hamster.
[00294] Como descrito aqui noutro local, o inserto de ácido nucleico pode ser qualquer sequência de ácido nucleico. Em modalidades não limitantes, (a) o inserto de ácido nucleico é composto por uma substituição de uma sequência de ácido nucleico de um rato endógeno, eucariótica, eucariótica de não rato, mamífero, humana, roedor, roedor que não rato, camundongo ou hamster com uma sequência de ácido nucleico homóloga ou ortóloga de sequência de ácidos nucleicos de mamífero; (b) o inserto de ácido nucleico é composto por uma deleção de sequência de ácido nucleico endógena de rato, eucariótica, eucariótica de não rato, mamífero, humano, roedor, roedor que não rato, camundongo ou hamster; (c) o inserto de ácido nucleico é composto por uma deleção de sequência de ácido nucleico endógena de rato, eucariótica, eucariótica de não rato, mamífero, mamífero que não humano, humano, roedor, roedor que não rato, camundongo ou hamster, em que os intervalos de deleção varia de 5 kb a 200 kb ou de 5 kb de 3 Mb (como discutido em detalhe em outro lugar neste documento); (d) o inserto de ácido nucleico é composto por uma adição de uma sequência de ácido nucleico exógena (incluindo, por exemplo, uma sequência do ácido nucleico exógena variando de cerca de 5 kb a cerca de 10 kb, de cerca de 10 kb a cerca de 20 kb, de cerca de 20 kb a cerca de 40 kb, de cerca de 40 kb a cerca de 60 kb, de cerca de 60 kb a cerca de 80 kb de cerca de 80 kb a cerca de 100 kb, de cerca de 100 kb a cerca de 150 kb, de cerca de 150 kb a cerca de 200 kb, de cerca de 200 kb a cerca de 250 kb, de cerca de 250 kb a cerca de 300 kb, de cerca de 300 kb a cerca de 350 kb ou de cerca de 350 kb a cerca de 400 kb); (e) o inserto de ácido nucleico é composto por uma seqüência exógena de ácido nucleico, compreendendo uma sequência de ácido nucleico homóloga ou ortóloga; (f) a sequência de ácido nucleico homóloga ou ortóloga de (a) em que a sequência de ácido nucleica é uma sequência de ácido nucleico humana; (g) o inserto de ácido nucleico compreende a sequência de ácido nucleico homóloga ou ortóloga (a) em que a sequência de ácido nucleico é uma sequência de ácido nucleico quimérica compreendendo uma sequência de ácido nucleico humana ou de rato; (h) o inserto de ácido nucleico compreende uma sequência de ácido nucleico exógena de (e), em que o inserto de ácido nucleico varia de cerca de 5 kb a cerca de 200kb; (i) o inserto de ácido nucleico compreende um alelo condicional flanqueado com uma sequência de recombinase de local específico alvo; (j) o inserto de ácido nucleico compreende um gene repórter ligado operativamente a um promotor; (k) o inserto de ácido nucleico compreende um ou mais segmentos de genes de cadeias pesadas de imunoglobulina humana não rearranjada VH , um ou mais segmentos de genes D de cadeia pesada de imunoglobulina humana não rerarranjada JH que são ligadas operativamente a uma sequência de ácido nucleico de região de cadeia pesada constante de roedor; (l) o inserto de ácido nucleico compreende uma sequência de ácido nucleico de região de cadeia pesada variável ligada operativamente a uma região de cadeia pesada constante de roedor; (m) o inserto de ácido nucleico compreende um ou mais segmentos de genes de imunoglobulina humana não rearranjada VK or VX e um ou mais segmentos de genes de imunoglobulina humana não rearranjada Jk or JX , em que são operativamente ligados a uma sequência de ácido nucleico de região constante de cadeia leve de imunoglobulina mamífera X ou K; (n) o inserto de ácido nucleico compreende uma sequência de ácido nucleico de região variável de cadeia leve de imunoglobulina humana rearranjada X or k operativamente ligada a uma sequência de ácido nucleico de região constante de cadeia leve de imunoglobulina mamífera X ou k; (o) a sequência de ácido nucleico de região constante de cadeia pesada mamífera de (k) e/ou (l) compreende uma sequência de ácido nucleico de região constante de rato, uma sequência de ácido nucleico de região constante humana, ou uma combinação das mesmas; ou (p) o ácido nucleico de região leve constante de imunoglobulina mamífera X ou k de (m) e/ou (n) compreende uma sequência de ácido nucleico de região constante de rato, uma sequência de ácido nucleico de região constante humana, ou uma combinação das mesmas.
[00295] Em uma modalidade, o inserto de ácido nucleico compreende um ou mais segmentos de gene funcional humano VH compreendendo VH1- 2, VH1-3, VH1-8, VH1-18, VH1-24, VH1-45, VH1-46, VH1-58, VH1-69, VH2-5, VH2-26, VH2-70, VH3-7, VH3-9, VH3-11 , VH3-13, VH3-15, VH3- 16, VH3-20, VH3-21, VH3-23, VH3-30, VH3-30-3, VH 3-30-5, VH3-33, VH3-35, VH3-38, VH3-43, VH3-48, VH3-49, VH3-53, VH3-64, VH3-66, VH3-72, VH3-73, VH3-74 , VH4-4, 4-28, VHVH4-30-1, VH4-30-2, VH4- 30-4, VH4-31, VH4-34, VH4-39, VH4-59, VH4-61, VH5-51, VH6-1, VH7-4-1, VH7-81, ou uma combinação dos mesmos.
[00296] Numa modalidade, o inserto de ácido nucleico compreende um ou mais segmentos de gene D funcionais humano compreendendo D1-1, D17, D1-14, D1-20, D1-26, D2-2, D2-8, D2-15, D2-21, D3-3, D3-9, D3-10, D316, D3-22, D4-4, D4-11, D4-17, D4-23, D5-12, D5-5, D5- 18, D5-24, D6-6, D6-13, D6-19, D6-25, D7-27, ou uma combinação dos mesmos.
[00297] Numa modalidade, o inserto de ácido nucleico compreende um ou mais segmentos de gene mais funcional JH compreendendo JH1, JH2, JH3, JH4, JH5, JH6, ou uma combinação dos mesmos. Numa modalidade, o inserto ácido nucleico compreende um ou mais segmentos de genes humanos que compreendem a sequência Vk VK4-1, VK5-2, VK 7-3, VK 2-4, VK1-5, VK1-6, VK3-7, VK1-8 , VK1-9, VK2-10, VK3-11, VK1-12, VK1-13, VK2-14, VK3-15, VK1-16, VK1-17, VK2-18, VK2-19, VK3-20, VK6 -21, VK1-22, VK1- 23, Vk2-24, Vk3-25, Vk2-26, Vk1-27, Vk2-28, Vk2-29, Vk2-30, Vk3-31, Vk1-32, Vk1-33 , Vk3-34, Vk1-35, Vk2-36, Vk1-37, Vk2-38, Vk1-39, Vk2- 40, ou uma combinação dos mesmos.
[00298] Numa modalidade, o inserto ácido nucleico compreende um ou mais segmentos de genes humanos que compreendem VX VX3-1, VX4-3, VX28, VX3-9, VX3-10, VX2-11, VX3-12, VX2-14, VX3 -16, VX2-18, VX3-19, VX321, VX3-22, VX2-23, VX3-25, VX3-27, ou uma combinação dos mesmos.
[00299] Numa modalidade, o inserto de ácido nucleico compreende um ou mais segmentos de genes humanos que compreendem Jk1, Jk2, Jk3, Jk4, Jk5, ou uma combinação dos mesmos.
[00300] Em modalidades específicas, após modificação do locus alvo numa célula pluripotente ou não pluripotentes de rato, eucariótica, eucariótica de não rato, de mamífero, de mamífero não humano, humano, de roedor, roedor que não rato, camundongo ou hamster, a modificação genética é transmitida através da linha germinativa.
[00301] Numa modalidade, o inserto da sequência de ácido nucleico de compreende um polinucleotídeo que, quando integrado no genoma produzirá uma modificação genética de uma região do locus ApoE do rato, eucariótica, eucariótica de não rato, de mamífero, de mamífero não humano, humano, de roedor, de roedor não roedor, camundongo ou hamster , em que a modificação genética no locus ApoE resulta numa diminuição na atividade de ApoE, um aumento na atividade da ApoE, ou uma modulação da atividade da ApoE. Numa modalidade, um knockout ApoE é gerado.
[00302] Numa modalidade, o inserto da sequência de ácido nucleico compreende um polinucleotídeo que, quando integrado no genoma produzirá uma modificação genética de uma região do locus (da subunidade) gama do receptor da interleucina-2 de rato, eucariótica, eucariótica de não rato, mamífero, humano, mamífero não humano, de roedor, roedor que não rato, camundongo ou hamster, em que a modificação genética no locus (da subunidade) gama do receptor da interleucina-2 resulta numa diminuição na atividade do receptor de interleucina-2, o aumento da atividade gama do receptor da interleucina-2, ou uma modulação da atividade do receptor de interleucina-2. Numa modalidade, um knockout do receptor de interleucina-2 é gerado.
[00303] Em ainda outra modalidade, o inserto da sequência do ácido nucleico compreende um polinucleotídeo que quando integrado ao genoma irá produzir uma modificação genética de uma região do locus Rag1 de rato, eucariótica, eucariótica de não rato, mamífero, mamífero não humano, humano, roedor, roedor que não rato, camundongo ou hamster, o locus Rag2 de rato, eucariótico, eucariótico de não rato, mamífero não humano, mamífero, humano, roedor, roedor que não rato, camundongo ou hamster e/ou o locus Rag2/Rag1 de rato , eucariótico, eucariótico não rato, mamífero, mamífero que não humano, humano, roedor, roedor não rato, camundongo ou hamster, onde a modificação genética do locus Rag1, Rag2 e/ou Rag2/Rag1 de rato, eucariótico, eucariótico não rato, mamífero, mamífero que não humano, humano, roedor, roedor que não rato, camundongo ou hamster resulta em uma diminuição na atividade de proteína Rag1, Rag2 ou Rag1 e Rag2, aumento na atividade de proteína Rag1 , Rag2 ou Rag1 e Rag2, ou uma modulação na atividade de proteína Rag1, Rag 2 ou Rag1 e Rag2. Numa modalidade, um knockout Rag1, Rag2 ou Rag2/Rag1 é gerado.
[00304] Noutras modalidades, os resultados do inserto de ácido nucleico na substituição de uma porção de rato, eucariótica, eucariótica de não rato, de mamífero, mamífero que não humano, humano, roedor, de roedor que não rato, camundongo ou hamster do locus ApoE , o locus gama do receptor de interleucina 2 e/ou o locus Rag2 , e/ou o locus Rag1 e/ou o locus Rag2/Rag1 com a porção correspondente de um locus ortólogo ApoE , um locus gama do receptor de interleucina 2 , um locus Rag2 , um locus Rag1 e/ou um locus Rag2/Rag1 de outro organismo.
[00305] Em ainda outras modalidades, o inserto de ácido nucleico compreende uma partilha de polinucleotídeo através de seu comprimento total de pelo menos 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% , 99% a uma porção de um locus ApoE , um locus gama do receptor de interleucina 2 , um locus Rag2 , um locus Rag1 e/ou um locus Rag2/Rag1 ele está substituindo.
[00306] O dado inserto de polinucleotídeo e a correspondente região do locus de rato, eucariótica, eucariótica de não rato, mamífero, mamífero que não humano, humano, roedor, roedor que não rato, camundongo ou hamster sendo substituído pode ser uma região codificante, um intron, um exon, uma região não traduzida, uma região reguladora, um promotor ou um potencializador ou qualquer combinação dos mesmos. Além disso, dado o inserto de polinucleotídeo e/ou a região do locus de rato, eucariótica, eucariótica de não rato, de mamífero, humano, mamífero que não humano, roedor, roedor que não rato, camundongo ou hamster sendo substituído podem ser de qualquer comprimento desejado, incluindo, por exemplo, entre 10 à 100 nucleotídeos de comprimento, 100 à 500 nucleotídeos de comprimento, 500 à 1 kb de nucleotídeos de comprimento, 1 kb a 1,5 kb de nucleotídeos de comprimento, de 1,5 kb a 2 kb nucleotídeos de comprimento, 2 kb e 2,5 kb de nucleotídeos de comprimento, 2,5 kb a 3 kb de nucleotídeos de comprimento, 3 kb a 5 kb de nucleotídeos de comprimento, 5 kb a 8 kb de nucleotídeos de comprimento, 8 kb a 10 kb de nucleotídeos de comprimento ou mais. Em outros casos, o tamanho do inserto ou de substituição é de cerca de 5 Kb a cerca de 10 kb, a partir de cerca de 10 kb a cerca de 20 kb, a partir de cerca de 20 kb a cerca de 40 kb, a partir de cerca de 40 kb a cerca de 60 kb, desde cerca de 60 kb a cerca de 80 kb, a partir de cerca de 80 kb a cerca de 100 kb, de cerca de 100 kb a cerca de 150 kb, de cerca de 150 kb a cerca de 200 kb, de cerca de 200 kb a cerca de 250 kb, de cerca de 250 kb a cerca de 300 kb, a partir de cerca de 300 kb e 350 kb, de cerca de 350 kb a cerca de 400 kb, de cerca de 400 kb e cerca de 800 kb, de cerca de 800 kb até 1 Mb, desde cerca de 1 Mb a cerca de 1,5 Mb, desde cerca de 1,5 Mb a cerca de 2 Mb, de cerca de 2 Mb, a cerca de 2,5 Mb, de cerca de 2,5 Mb de cerca de 2,8 Mb, de cerca de 2,8 Mb a cerca de 3 Mb. Em outras modalidades, o dado inserto do polinucleotídeo de inserção e/ou a região do locus de rato, eucariótica, eucariótica de não rato, mamífero que não humano, mamífero, humana, de roedor, roedor que não rato, camundongo ou hamster sendo substituído é de, pelo menos, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800 ou 900 nucleotídeos ou pelo menos de 1 kb, 2 kb, 3 kb, 4 kb, 5 kb, 6 kb, 7 KB, 8 KB, 9 kb, 10 kb, 11 kb, 12 kb, 13 kb, 14 kb, 15 kb, 16 kb ou maiores. i. Métodos para a Modificar um Locus Alvo de um Ácido Nucleico via Recombinação Bacteriana Homóloga (BHR)
[00307] Os métodos e as composições são fornecidos para modificação de um locus alvo de um ácido nucleico de eucariota, eucariótica de não rato, um mamífero, um humano ou de um mamífero que não humano, através de recombinação homóloga bacteriana (BHR) numa célula procariótica. Tais métodos encontram utilização na utilização de recombinação homóloga bacteriana numa célula procariótica para modificar geneticamente um locus alvo de um ácido nucleico de eucariota, eucariótica de não rato, um mamífero, um humano ou de um mamífero que não humano, a fim de criar um vetor de alvejamento. Tal vetor de alvejamento, compreendendo o locus alvo geneticamente modificado pode ser introduzido numa célula eucariótica, por exemplo, uma célula eucariótica, célula eucariótica de não rato, uma célula de mamífero, uma célula de mamífero que não humano, uma célula pluripotente, uma célula não pluripotente, uma célula pluripotente não humana, uma célula pluripotente humana, uma célula ES humana, uma célula tronco adulta humana, uma célula progenitora humana de desenvolvimento restrito, uma célula iPS humana, uma célula humana, uma célula de roedor, uma célula de roedor que não rato, uma célula de rato, uma célula de camundongo, uma célula de hamster, um fibroblasto, ou uma célula CHO. "Recombinação homóloga", inclui a troca de fragmentos de DNA entre duas moléculas de DNA nos locais de cruzamento dentro das regiões de homologia. Assim, "recombinação homóloga bacteriana" ou "BHR" inclui recombinação homóloga que ocorre em bactérias.
[00308] Métodos para para modificar uma célula eucariótica,uma célula eucariótica de não rato, uma célula de mamífero, uma célula humana, uma célula de mamífero que não humano, uma célula pluripotente, uma célula não pluripotente, uma célula pluripotente não humana, uma célula pluripotente humana, uma célula ES humana, uma célula tronco adulta humana, uma célula progenitora humana de desenvolvimento restrito, uma célula iPS humana, uma célula humana, uma célula de roedor, uma célula de roedor que não rato, uma célula de rato, uma célula de camundongo, uma célula de hamster, um fibroblasto, ou uma célula CHO através de recombinação homóloga bacteriana (BHR) são fornecidos. Os métodos compreendem introduzir numa célula procariota um vetor de alvejamento compreendendo um inserto de ácido nucleico flanqueado com uma porção de homologia de 5’ e uma porção de 3', em que a célula procariótica compreende um locus alvo de um ácido nucleico e é capaz de expressar uma recombinase que medeia a BHR no locus alvo. Tais vetores de alvejamento podem incluir qualquer um dos grandes vetores de alvejamento aqui descritos.
[00309] Numa modalidade, o método compreende a introdução numa célula procariótica: (i) um primeiro construto compreendendo um ácido nucleico possuindo uma sequência de DNA de interesse; (ii) um segundo construto de alvejamento compreendendo um inserto de ácido nucleico flanqueado com uma porção de homologia de 5’ e uma porção de homologia de 3’, e (iii) um terceiro construto que codifica uma recombinase que medeia a recombinação homóloga bacteriana. Numa modalidade, o primeiro, o segundo, e o terceiro construtos são introduzidos na célula procariótica separadamente ao longo de um período de tempo. Numa modalidade, a célula procariótica compreende um ácido nucleico que codifica a recombinase, e o método não exige a introdução do terceiro construto. Numa modalidade, a recombinase é expressa sob o controle de um promotor indutível.
[00310] Numa modalidade o primeiro construto compreendendo o ácido nucleico, é derivado de um cromossomo bacteriano artificial (BAC) ou cromossomo artificial de levedura (YAC). Uma célula procariótica que compreende o inserto de ácido nucleico no locus genômico alvo pode ser selecionada. Este método pode ser repetido em série, tal como aqui divulgado para permitir a introdução de vários insertos de ácidos nucleicos no locus orientado na célula procariota. Uma vez que o locus alvo de ácido nucleico é "construído" dentro da célula procariota, um vetor de alvejamento compreendendo o locus alvo modificado pode ser isolado a partir da célula procariótica e introduzido num local genômico alvo dentro de uma célula eucariótica, célula eucariótica de não rato, uma célula de mamífero, uma célula humana, uma célula de mamífero não humana, uma célula pluripotente, uma célula não pluripotente, uma célula pluripotente não humana, uma célula pluripotente humana, uma célula ES humana, uma célula tronco adulta humana, uma célula humana progenitora de desenvolvimento restrito, uma célula iPS humana, uma célula humana, uma célula de roedor, uma célula de roedor que não rato, uma célula de rato, uma célula de camundongo, uma célula de hamster, um fibroblasto, ou uma célula CHO.
[00311] Células de rato preferidas para a recepção de vetores de alvejamento estão descritas na US Pedido 14/185,703, depositado em 20 de fevereiro de 2014, cujos conteúdos estão aqui resumidos. Estas células de rato são células de ratos pluripotentes capazes de sustentar a sua pluripotência seguindo uma ou mais modificações genéticas direcionadas in vitro, e são capazes de transmitir as modificações genéticas específicas, através da linha germinativa.
[00312] Células pluripotentes eletroporadas, por exemplo, são colocadas em placas a uma densidade elevada para a seleção de células resistentes aos medicamentos que compreendem o vetor de alvejamento. O processo de seleção de drogas elimina a maioria das células plaqueadas (~ 99%), deixando para trás as colônias individuais, cada um dos quais é um clone derivado de uma única célula. Das células restantes, a maioria das células (~ 80-100%) contêm o vetor de alvejamento (compreendendo um cassete de seleção de drogas) integrado numa localização aleatória no genoma. Por conseguinte, as colônias são colhidas individualmente e genotipadas para identificar células ES portadoras do vetor de alvejamento seletiva no local genômico correto (por exemplo, utilizando a modificação de ensaio de alelo descrito abaixo).
[00313] Um ensaio quantitativo de alto rendimento, a saber, ensaio de modificação de alelo (MOA), pode ser utilizado para a genotipagem. Um tal ensaio permite um rastreio em grande escala de um alelo (s) modificado num cromossomo parental na sequência de uma modificação genética. O ensaio MOA pode ser realizado através de várias técnicas analíticas, incluindo, mas não limitado a, um PCR quantitativo, por exemplo, um PCR em tempo real (qPCR). Por exemplo, a PCR em tempo real compreende um primeiro conjunto de iniciadores que reconhece o locus alvo e um segundo conjunto de iniciadores que reconhece um locus de não alvejado de referência. Além disso, o conjunto de iniciadores compreende uma sonda fluorescente que reconhece a sequência amplificada. Numa modalidade, o ensaio quantitativo é realizado por meio de Invader Probes®. Numa modalidade, o ensaio quantitativo é realizado por meio de MMP assays®. Numa modalidade, o ensaio quantitativo é realizado por meio de TaqMan® Molecular Beacon. Numa modalidade, o ensaio quantitativo é realizado por meio de tecnologia de sondas Eclipse™. (Ver, por exemplo, US2005/0144655, que é aqui incorporada por referência na sua totalidade).
[00314] A célula pluripotente selecionada (isto é, uma célula pluripotente não humana, uma célula ES não humana) compreendendo a modificação genética alvo pode então ser introduzida num embrião hospedeiro, por exemplo, uma fase ou fase de blastocisto do embrião pré- mórula e implantado no útero de uma mãe substituta para gerar um animal fundador não humano (animal F0). Subsequentemente, o animal fundador, por exemplo, pode ser criado a um tipo selvagem de animal para criar prole heterozigótica F1 para a modificação genética. Cruzamento do animal heterozigoto F1 pode produzir prole homozigótica para a modificação genética. Cruzamento do animal heterozigoto F1 pode produzir prole homozigótica para a modificação genética. Em algumas modalidades, várias modificações genéticas dos loci alvo aqui descrito podem ser levadas a cabo usando um vetor de alvejamento (LTVEC) tal como descrito em pormenor noutra parte deste documento. Por exemplo, um LTVEC pode ser derivado a partir de DNA de Cromossoma Artificial Bacteriano (BAC) usando tecnologia de engenharia genética VELOCIGENE® (ver, por exemplo, US Pat. No. 6.586.251 e Valenzuela, D. M., et al., (2003), High-throughput engineering of the mouse genome coupled with high-resolution expression analysis, Nature Biotechnology 21(6): 652-659, que é aqui incorporado por referência na sua totalidade).
[00315] A utilização de recombinação homóloga bacteriana (BHR) para gerar um vetor de alvejamento grande (LTVEC) contorna as limitações de plasmídeos em acomodar um grande fragmento de DNA genômico e a consequente baixa eficiência da introdução de uma modificação alvejada para um locus endógeno em células pluripotentes ou células não pluripotentes. Uma ou mais modificações genéticas específicas podem ser realizadas para gerar um LTVEC. Um LTVEC exemplar produzido na célula procariótica pode compreender um inserto de ácido nucleico que transporta uma sequência genômica com uma ou mais modificações genéticas ou um ácido nucleico exógeno (por exemplo, um homólogo ou ortólogo de um ácido nucleico de rato), que é flanqueado pelas porções de homologia , complementares a regiões genômicas específicas.
[00316] As células hospedeiras procarióticas compreendendo os vários vetores de alvejamento aqui descritos são também fornecidas. Tais células procarióticas incluem, mas não estão limitadas a, bactérias, tais como E. coli. Numa modalidade, uma célula procariota hospedeira compreende um vetor de alvejamento compreendendo um inserto de ácido nucleico flanqueado com uma 5' porção de homologia e 3' porção de homologia, em que o inserto de ácido nucleico varia de cerca de 5 kb a cerca de 200 kb.
[00317] A célula procariota hospedeira pode compreender ainda um ácido nucleico que codifica um polipeptídeo de recombinase ou o ácido nucleico que codifica o polipeptídeo da recombinase é ligado operacionalmente a um promotor indutível.
[00318] São ainda fornecidos vários métodos e composições, que utilizam o LTVEC tal como aqui descrito em combinação com uma célula procariótica, a fim de produzir modificações genéticas alvejadas. Tais composições e métodos são discutidos aqui noutro sítio.
[00319] Os métodos para a modificação de um locus alvo de um ácido nucleico através de recombinação homóloga bacteriana (BHR) são fornecidos que compreendem a introdução numa célula procariota um vetor de alvejamento compreendendo um inserto de ácido nucleico flanqueado com uma porção de homologia de 3’ e uma porção de homologia de 5’, em que a célula procariótica compreende ácidos nucleicos correspondentes às porções de homologia de 5 'e 3' e a célula procariótica é capaz de expressar uma recombinase que medeia a BHR no locus alvo. Tais vetores de alvejamento podem incluir qualquer um dos grandes vetores de alvejamento aqui descritos. Tais métodos podem empregar um LTVEC como discutido em detalhe aqui e empregar ainda mais o sistema Cas/CRISPR como discutido noutras partes deste documento.
[00320] Numa modalidade, o sistema CRISPR/Cas pode ser controlado por um promotor ativo numa célula procariótica, tal como, por exemplo, E.coli. ii. Métodos para Modificar um Locus Alvo de Interesse em uma Célula Pluripotente ou Células Não Pluripotente.
[00321] É ainda fornecido um método para a modificação de um locus alvo de interesse numa célula pluripotente ou célula não pluripotente através de modificação genética alvo, que compreende (a) introdução na célula pluripotente ou célula não pluripotente de um vetor de alvejamento compreendendo um inserto de ácido nucleico flanqueado com uma porção de homologia de 5’ e uma porção de homologia de 3’, em que a soma total de porção de homologia de 5' e a porção de homologia de 3’ seja de pelo menos 10 kb; e (b) identificar uma célula pluripotente ou não pluripotente geneticamente modificada que compreende a modificação genética alvo no locus alvo de interesse. Numa modalidade, a soma total de porção de homologia de 5’ e a porção de homologia de 3' seja de pelo menos cerca de 16 kb a cerca de 30 kb. Em modalidades específicas, a modificação genética alvo é capaz de ser transmitida através da linha germinativa. Tais vetores de alvejamento podem incluir qualquer um dos grandes vetores de alvejamento aqui descritos.
[00322] Várias células também podem ser utilizadas nos métodos para a modificação de um locus alvo de interesse aqui fornecido. Em modalidades específicas, a célula é uma célula eucariótica, célula eucariótica de não rato, uma célula pluripotente, uma célula não pluripotente, uma célula não humana pluripotente, uma célula pluripotente humana, uma célula ES humana, uma célula tronco humana adultas, uma célula progenitora humana de desenvolvimento restrito, uma célula humana induzida por células pluripotentes (IPS), uma célula de mamífero, uma célula humana, um fibroblasto , uma célula de roedores, uma célula de roedor não rato, uma célula de rato, uma célula de hamster ou uma célula CHO.
[00323] Em um aspecto, um método para modificar o locus genômico de interesse numa célula pluripotente através de modificação genética alvo é fornecido, compreendendo: (a) fornecer uma célula pluripotente que é capaz de sustentar a sua pluripotencialidade seguindo, pelo menos, uma modificação genética direcionada do seu genoma e é capaz de transmitir a modificação direcionada para uma linha germinativa de uma geração F1; (b) introdução de um vetor de alvejamento grande (LTVEC) para dentro da célula pluripotente, em que o LTVEC compreende um inserto de ácido nucleico flanqueado com uma porção de homologia de 5’ e uma porção de homologia de 3’, em que a porção de homologia de 5’ e a porção de homologia de 3’ compreendem um fragmento de DNA genômico; e (c) a identificação de uma célula pluripotente geneticamente modificada que compreende a modificação genética alvo.
[00324] Vários métodos podem ser utilizados para identificar células que possuem o inserto de ácido nucleico integrado no locus alvo de interesse. Inserção do inserto de ácido nucleico no locus alvo de interesse resulta em uma "modificação do alelo". O termo "modificação do alelo" e métodos para a detecção do alelo modificados são discutidos em mais pormenor noutra parte deste documento.
[00325] Em um aspecto, um método para modificar o locus genômico de interesse numa célula pluripotente ou uma célula não pluripotente através de genes mediada por endonuclease de alvejamento é fornecido, o método compreendendo: (a) fornecer uma célula não pluripotente isolada ou uma célula pluripotente isolada que é capaz de transmitir o genoma geneticamente modificado para uma linha germinativa de uma geração F1; (b) introduzir na célula pluripotente ou na célula não pluripotente um agente de endonuclease; em que o agente de endonuclease faz um entalhe ou uma quebra de fita dupla numa sequência de DNA alvo localizada no locus genômico de interesse, e em que o entalhe ou a quebra de fita dupla na sequência de DNA alvo na célula não-pluripotente ou nas células pluripotentes induz : (i) reparo de DNA de entalhe ou quebra de fita dupla mediada por união de extremidades não homólogas (NHEJ), em que o reparo de DNA mediado por NHEJ gera um alelo mutante que compreende uma inserção ou uma deleção de uma sequência de ácido nucleico na sequência alvo de DNA; ou (ii) reparo de DNA mediado por recombinação homóloga que resulta na recuperação de uma sequência de ácido nucleico do tipo selvagem; e (c) identificar o locus genômico modificado de interesse.
[00326] Em um aspecto, um método para modificar o locus genômico de interesse numa célula tronco embrionária isolada (ES) por meio de um agente de nuclease é fornecido, compreendendo: (a) fornecer uma célula ES isolada que é capaz de transmitir a modificação genética direcionada para uma linha germinativa de uma geração F1; (b) introduzir na célula ES: (i) um vetor de alvejamento grande (LTVEC) compreendendo uma inserto de ácido nucleico flanqueado com uma porção de homologia de 5’ e uma porção de homologia de 3’, em que o inserto é uma sequência de ácido nucleico que é pelo menos de 5 kb; e (ii) um agente de endonuclease, em que o agente de endonuclease faz um entalhe ou uma quebra de fita dupla numa sequência de DNA alvo localizada no locus genômico de interesse, e em que a sequência alvo não está presente no inserto de ácido nucleico; e (c) identificar a modificação genética alvo na célula tronco embrionária (ES).
[00327] Em um aspecto, um método para modificar o locus genômico de interesse numa célula pluripotente ou numa célula não pluripotente através de engenharia genômica guiada de RNA é fornecido, o método compreendendo: (a) fornecer uma célula pluripotente ou uma célula não pluripotente que é capaz de transmitir o genoma geneticamente modificado para uma linha germinativa de uma geração F1; (b) introduzir na célula pluripotente ou na célula não pluripotente: (i) um primeiro construto de expressão que compreende um primeiro promotor ligado operativamente a uma primeira sequência de ácido nucleico que codifica uma proteína (CAS) associada a Repetições Palindrômicas Curtas Agregadas e Regularmente Interespaçadas (CRISPR); (ii) um segundo construto de expressão que compreende um segundo promotor ligado operativamente a uma sequência alvo genômica ligada a um RNA guia (gRNA), em que a sequência alvo genômica é flanqueada por um Motivo Adjacente Protoespaçador (PAM). Opcionalmente, a sequência alvo genômica é flanqueada na extremidade 3’ por uma sequência do Motivo Adjacente Protoespaçador (PAM). Numa modalidade, a proteína Cas e a RNA CRISPR e/ou o tracrRNA não ocorrem naturalmente em conjunto (por exemplo, a proteína e Cas e a RNA CRISPR não ocorrem naturalmente em conjunto). Numa modalidade, a sequência alvo genômica compreende a sequência de nucleotídeos de GNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNGG (GN1-20GG; SEQ ID NO: 1). Numa modalidade, a sequência alvo genômica compreende a SEQ ID NO: 1, em que N está entre 14 e 20 nucleotídeos de comprimento. Numa modalidade, o gRNA compreende uma terceira sequência de ácido nucleico que codifica uma RNA (crRNA) de Repetições Palindrômicas Curtas Agregadas e Regularmente Interespaçadas (CRISPR) e uma quarta sequência de ácido nucleico codificando uma RNA de CRISPR de trans-ativação (tracrRNA). Numa modalidade, após expressão, a proteína Cas forma um complexo CRISPR-Cas compreendendo o crRNA e o tracrRNA, e o complexo CRISPR- Cas faz um entalhe ou uma quebra de fita dupla numa sequência de DNA alvo localizado no locus genômico de interesse, e em que o entalhe ou a quebra de fita dupla na sequência de DNA alvo na célula pluripotente ou na célula não pluripotente induz: (i) reparo de DNA mediado por união de extremidades não homólogas (NHEJ) de entalhe ou quebra de fita dupla criado pelo complexo de CRISPR-Cas, em que o NHEJ gera um alelo mutante que compreende uma inserção ou uma deleção de uma sequência de ácido nucleico na sequência alvo de DNA; ou (ii) reparo de DNA mediado por recombinação homóloga que resulta na recuperação de uma sequência de ácido nucleico do tipo selvagem; e (c) identificar o locus genômico modificado de interesse.
[00328] Em um aspecto, um método para modificar o locus genômico de interesse numa célula não pluripotente ou numa célula pluripotente através de engenharia de genoma guiada por RNA é fornecido, o método compreendendo a introdução na célula não pluripotente ou na célula pluripotente que é capaz de transmitir o genoma modificado através da linha germinativa: (I) Proteína (CAS) associada a Repetições Palindrômicas Curtas Agregadas e Regularmente Interespaçadas (CRISPR) ou um ácido nucleico que codifica a proteína Cas; e (ii) um gRNA ou um DNA que codifica o gRNA, em que o gRNA compreende uma sequência de nucleotídeos que hibrida com uma sequência alvo genômica e um CRISPR RNA (tracrRNA) de trans-ativação; em que a sequência alvo genômica é flanqueada por uma sequência do Motivo Adjacente Protoespaçador (PAM).
[00329] Em algumas modalidades, a proteína Cas pode ser introduzida na célula pluripotente ou na célula não pluripotente como uma proteína isolada. Em algumas modalidades, a proteína Cas pode ainda compreender um domínio de penetração celular que facilita a incorporação celular da proteína. Em outras modalidades, a proteína Cas pode ser introduzida na célula como uma molécula de RNA mensageiro (mRNA) que codifica a proteína Cas. Em outras modalidades, a proteína Cas pode ser introduzida na célula como uma molécula de DNA que codifica a proteína Cas. Por exemplo, a molécula de DNA que codifica a proteína Cas pode ser fornecida num construto e estar operativamente ligada a um promotor capaz de expressar nas células não pluripotentes ou nas células pluripotentes. Em certas modalidades, o ácido nucleico que codifica a proteína Cas tem códons otimizados para expressão na célula não pluripotente ou na célula pluripotente.
[00330] Em algumas modalidades, o gRNA pode ser introduzido na célula não pluripotente ou na célula pluripotente como uma molécula de RNA. Por exemplo, a molécula de gRNA pode ser transcrita in vitro. Em outras modalidades, o gRNA pode ser introduzido na célula pluripotente ou na célula não pluripotente como uma molécula de DNA que codifica o gRNA. Por exemplo, a molécula de DNA que codifica o gRNA pode ser fornecida num construto e estar operativamente ligada a um promotor capaz de expressar o gRNA nas células não pluripotentes ou nas células pluripotentes. Em outras modalidades, o gRNA podem ser quimicamente sintetizado.
[00331] Em algumas modalidades, o gRNA pode ser introduzido na célula pluripotente ou na célula não pluripotente como uma molécula fundida crRNA-tracrRNA (isto é, um único transcrito). Em outras modalidades, o gRNA pode ser introduzido na célula pluripotente ou na célula não pluripotente como moléculas crRNA e tracrRNA separadas (isto é, transcrições separadas). Em outras modalidades, o gRNA pode ser introduzido na célula pluripotente ou na célula não pluripotente como moléculas de DNA separadas que codificam para o crRNA e tracrRNA, respectivamente. Por exemplo, as moléculas de DNA separadas que codificam o crRNA tracrRNA podem estar em construtos separados e serem ligados operativamente a promotores capazes de expressar na célula pluripotente ou na célula não pluripotente. Em qualquer das modalidadeds acima, qualquer combinação dos construtos podem estar em moléculas de ácido nucleico separadas ou em conjunto numa única molécula de ácido nucleico
[00332] Em algumas modalidades, a proteína Cas e o gRNA podem ser introduzidos na célula pluripotente ou na célula não pluripotente simultaneamente ou sequencialmente. Da mesma forma, o crRNA e o tracrRNA do gRNA podem ser introduzidos na célula não pluripotente ou na célula pluripotente simultaneamente ou sequencialmente. A relação da proteína Cas (ou ácido nucleico que codifica) ao gRNA (ou DNA que codifica) e/ou a razão do crRNA ao tracrRNA pode ser de cerca estequiométrica de tal modo que eles podem formar um complexo RNA- proteína.
[00333] Em certas modalidades, a proteína Cas pode ser introduzida na célula não pluripotente ou na célula pluripotente, sob a forma de um complexo com o gRNA.
[00334] Numa modalidade, a célula pluripotente é uma célula tronco pluripotente induzida (iPS). Numa modalidade, a célula pluripotente é uma célula progenitora de desenvolvimento restrito.
[00335] A presença de um entalhe ou de uma quebra de fita dupla no local de reconhecimento dentro do marcador de seleção, em várias modalidades aumenta a eficiência e/ou a frequência de recombinação entre um vetor de alvejamento seletivo (tal como um LTVEC) e o locus de interesse alvo. Numa modalidade, a recombinação é recombinação homóloga. Numa outra modalidade, a recombinação é uma inserção por união de extremidades não homólogas. Em várias modalidades, na presença do entalhe ou quebra da fita dupla, tendo como alvo a eficiência de um vetor de alvejamento seletivo (tal como um LTVEC) no locus genômico alvo é pelo menos cerca de duas vezes maior, pelo menos, cerca de 3 vezes maior, pelo menos cerca de 4 vezes maior elevada do que na ausência do entalhe ou da quebra da fita dupla (usando, por exemplo, o mesmo vetor de alvejamento seletivo e as mesmas porções de homologia e locais alvo correspondentes no locus genômico de interesse, mas na ausência de um agente de nuclease adicionado que faz entalhe ou quebra de fita dupla).
[00336] Numa modalidade, a modificação genética alvo no locus alvo é bialélica. Por "bialélico" entende-se que ambos os alelos de um gene compreendem a modificação genética alvo. A modificação genética alvo pode ser a mesma ou diferente em cada alelo. Por exemplo, uma modificação bialélica pode resultar da mesma modificação sendo feita em alelos correspondentes nos cromossomos homólogos correspondentes, ou a partir de diferentes modificações sendo feitas em alelos correspondentes em cromossomos homólogos correspondentes. Assim, uma modificação bialélica pode resultar, por exemplo, em homozigotia para uma modificação específica num locus genômico de interesse (ou seja, a modificação específica em ambos os alelos), heterozigotia composta num locus genômico de interesse (por exemplo, a modificação específica em um alelo e a inativação ou a interrupção do outro alelo), ou hemizigotia num locus genômico de interesse (por exemplo, a modificação específica de um alelo e perda do outro alelo). Em certas modalidades, o uso combinado de um vetor de alvejamento seletivo (incluindo, por exemplo, um LTVEC) com um agente de nuclease resultado em modificação genética bialélica alvo do locus genômico de interesse numa célula, em comparação com a utilização do vetor de alvejamento sozinho. Quando o vetor de alvejamento é utilizado em conjunto com um agente de nuclease, eficiência de alvejamento bialélico é aumentada em, pelo menos, duas vezes, pelo menos três vezes, pelo menos quatro vezes ou mais, em comparação a quando o vetor de alvejamento é utilizado sozinho. Noutras modalidades, a eficiência de alvejamento bialélico é de, pelo menos, 0,2%, 0,3%, 0,4%, 0,5%, 0,6%, 0,7%, 0,8%, 0,9%, 1%, 2%, 3%, 4% ou 5% ou superior.
[00337] A modificação genética bialélica alvo no locus alvo pode resultar numa célula homozigótica geneticamente modificada. Por "homozigótica" entende-se que ambos os alelos do locus alvo (isto é, os alelos em ambos os cromossomos homólogos) foram modificados da mesma maneira. Em certas modalidades, o uso combinado de um vetor de alvejamento seletivo (incluindo, por exemplo, um LTVEC) com um agente de nuclease resulta em modificação genética bialélica homozigótica alvo do locus genômico de interesse numa célula. Numa modalidade, a modificação genética bialélica compreende a deleção de uma sequência de ácido nucleico endógeno no locus genômico de interesse em dois cromossomos homólogos (ou seja, um par de primeiro e segundo cromossomos homólogos) e inserção do inserto de ácido nucleico no locus genômico de interesse em dois cromossomos homólogos (ou seja, o par de primeiro e segundo cromossomos homólogos). Em algumas modalidades, o inserto de ácido nucleico substitui a sequência de ácido nucleico endógeno no locus genômico de interesse em ambos os cromossomos homólogos. Numa modalidade, o inserto de ácido nucleico é homólogo ou ortólogo com a sequência de ácido nucleico endógena deletada.
[00338] Numa modalidade, a modificação genética direcionada para os resultados do locus alvo em uma célula geneticamente modificada hemizigótica. Por "hemizigótico" entende-se que apenas um alelo (ou seja, o alelo em um de dois cromossomos homólogos) do locus alvo está presente ou apenas um alelo é capaz de ser expresso e funcional. Em outras modalidades, a modificação genética alvo resulta mais geralmente no composto de heterozigotia. Composto de heterozigotia inclui situações em que ambos os alelos do locus alvo (isto é, os alelos em ambos os cromossomos homólogos) foram modificados, mas que tenham sido modificados de maneiras diferentes (por exemplo, uma inserção em um alelo e a inativação ou a interrupção de outro alelo ). Em certas modalidades, o uso combinado de um vetor de alvejamento seletivo (incluindo, por exemplo, um LTVEC) com um agente de nuclease resulta em uma modificação genética hemizigótica alvo do locus genômico de interesse numa célula. Em certas modalidades, o uso combinado de um vetor de alvejamento seletivo (incluindo, por exemplo, um LTVEC) com um agente de nuclease resulta em alterações genéticas específicas, que criam um composto de heterozigotia num locus genômico de interesse numa célula. Opcionalmente, a modificação genética direcionada no locus genômico de interesse em um cromossomo compreende deleção de uma sequência de ácido nucleico endógena e inserção do inserto de ácido nucleico. Em outras modalidades, a modificação genética direcionada compreende: (1) a deleção de uma sequência de ácido nucleico endógena no locus genômico de interesse em dois cromossomos homólogos; e (2) a inserção do inserto de ácido nucleico no locus genômico de interesse em um primeiro cromossomo e rompimento do locus genômico de interesse no segundo cromossomo. O primeiro cromossomo pode ser o primeiro dos dois cromossomos homólogos, e o segundo cromossomo pode ser o segundo dos dois cromossomos homólogos. Em outras modalidades, a modificação direcionada compreende: (1) a deleção de uma sequência de ácido nucleico endógena no locus genômico de interesse e inserção do inserto de ácido nucleico no locus genômico de interesse no primeiro cromossomo homólogo; e (2) rompimento do locus genômico de interesse no segundo cromossomo homólogo. A interrupção da sequência de ácido nucleico endógena pode resultar, por exemplo, quando uma ruptura de fita dupla no locus genômico de interesse criado pelo agente de nuclease é reparado pela reparação de DNA mediada por união de extremidades não homólogas (NHEJ), o qual gera um alelo mutante compreendendo uma inserção ou uma deleção de uma sequência de ácido nucleico no locus genômico de interesse e, consequentemente, provoca a interrupção do locus genômico de interesse. Exemplos de rompimentos incluem alterações de um elemento de regulação (por exemplo, promotor ou um potencializador) no locus genômico de interesse, uma mutação missense, uma mutação de truncamento, uma mutação nula, ou uma inserção ou deleção de pequeno número de nucleotídeos (por exemplo, causando um mutação frameshift). Outro exemplo de rompimento é uma mutação nonsense. Rompimento pode resultar na inativação (ou seja, perda de função) ou perda do alelo.
[00339] Modificações genéticas homozigóticas e hemizigóticas direcionadas são vantajosas porque, quando as células geneticamente modificadas contendo estas mutações são usadas para gerar animais geneticamente modificados, como discutido abaixo, o processo para a geração de animais geneticamente modificados que são não heterozigóticos (ou seja, homozigóticos ou hemizigóticos) para a modificação genética pretendida direcionada é mais eficiente e menos demorada porque menos etapas de cruzamento são necessárias. Modificações genéticas direcionadas resultando no composto de heterozigotia ou hemizigotia (por exemplo, uma inserção em um alelo e inativação, rompimento, ou perda do outro alelo) podem ser vantajosas pelo mesmo motivo.
[00340] Vários tipos de células também podem ser usados em qualquer um dos vários métodos descritos aqui acima para modificação de um locus genômico por meio de um agente de nuclease. Em modalidades específicas, a célula é uma célula eucariótica, célula eucariótica de não rato, uma célula pluripotente, uma célula não pluripotente, uma célula não humana pluripotente, uma célula pluripotente humana, uma célula ES humana, uma célula tronco humana adulta, uma célula progenitora humana de desenvolvimento restrito, uma célula humana induzida por células pluripotentes (IPS), uma célula de mamífero, uma célula humana, um fibroblasto , uma célula de roedores, uma célula de roedor que não rato, uma célula de rato, uma célula de hamster ou uma célula CHO.
[00341] São fornecidas composições que compreendem um animal não humano geneticamente modificado, tendo uma modificação genética direcionada no locus (da subunidade) gama do receptor de interleucina-2 ou no locus ApoE . Os vários métodos e composições aqui fornecidos permitem a estes loci modificados serem transmitidos através da linha germinativa.
[00342] Em modalidades específicas, um animal não humano geneticamente modificado, ou uma célula pluripotente ou não-pluripotente geneticamente modificada compreende um locus genômicos com uma modificação genética alvo no locus (da subunidade) gama do receptor de interleucina-2 ou com uma modificação genética no locus ApoE alvo, em que o locus genômico (da subunidade) gama do receptor de interleucina-2 ou o locus ApoE compreende: (i) uma deleção de pelo menos uma porção do locus (da subunidade) gama do receptor de interleucina-2 ou, pelo menos, uma porção do locus ApoE ; (ii) uma inserção de uma sequência de ácido nucleico heteróloga no locus ApoE ou no locus (da subunidade) gama do receptor de interleucina-2 ; ou (iii) uma combinação dos mesmos, em que o locus genômico geneticamente modificado é capaz de ser transmitido através da linha germinativa.
[00343] Os métodos são ainda fornecidos que permitem a tais animais não humanos geneticamente modificados, e para tais células pluripotentes geneticamente modificadas serem feitas. Tais métodos incluem um método para modificar um locus genômico ApoE ou um locus (da subunidade) gama do receptor de interleucina-2 em uma célula pluripotente através de modificação genética direcionada. O método compreende (a) introdução na célula pluripotente um vetor de alvejamento compreendendo um inserto de ácido nucleico flanqueado com uma porção de homologia de 5’, ao locus ApoE e uma porção de homologia 3’, ao locus ApoE , (b) a identificação de uma célula pluripotente geneticamente modificada que compreende a modificação genética direcionada no locus genômico ApoE de interesse, em que a modificação genética direcionada é capaz de ser transmitida através da linha germinativa.
[00344] Métodos adicionais incluem (a) introduzir na célula pluripotente um vetor de alvejamento compreendendo um inserto de ácido nucleico flanqueado com uma porção de homologia de 5’ com um locus (da subunidade) gama do receptor de interleucina-2 e uma porção de homologia de 3’ com o locus (da subunidade) gama do receptor de interleucina-2, ( b) a identificação de uma célula pluripotente geneticamente modificada que compreende a modificação genética alvo no locus (da subunidade) gama do receptor de interleucina-2, em que a modificação genética alvo é capaz de ser transmitida através da linha germinativa. iii. Métodos de Integração de Múltiplos Polinucleotídeos de Interesse no Locus Alvo
[00345] Os vários métodos e composições aqui fornecidos permitem a integração dirigida de múltiplos polinucleotídeos de interesse com um determinado locus alvo. Os vários métodos apresentados acima podem ser repetidos sequencialmente, para permitir a integração dirigida de qualquer número de insertos de ácidos nucleicos para um determinado locus alvo. Assim, os vários métodos fornecem para a inserção de, pelo menos, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 ou mais insertos de ácidos nucleicos no locus alvo. Em modalidades particulares, tais métodos sequenciais "tiling" permitem a reconstrução de grandes regiões genômicas a partir de uma célula eucariótica, por exemplo, célula eucariótica de não rato, uma célula de mamífero (por exemplo, um ser humano, um não humano, um roedor, um roedor que não rato, um camundongo, um macaco, um rato, um hamster, um mamífero domesticado ou um animal agrícola) em um locus alvo. Em tais casos, a transferência e reconstrução das regiões genômicas que incluem tanto regiões de codificação e de não codificação permitem a complexidade de uma dada região a ser preservada, retendo, pelo menos em parte, as regiões de codificação, as regiões não codificantes e o número de variações de cópias encontrada dentro da região genômica nativa. Assim, os vários métodos fornecem, por exemplo, métodos para gerar as regiões genômicas "heterólogas" ou "exógenas" dentro de qualquer célula eucariota, qualquer célula eucariótica de não rato, qualquer célula de mamífero ou animal de interesse, em particular dentro de uma célula procariótica hospedeira ou dentro de uma célula não pluripotente, uma célula pluripotente ou uma célula ES. Num exemplo não limitativo, uma região genômica "humanizada" dentro de um animal não humano (por exemplo, dentro de um rato) é gerada. Métodos para gerar regiões genômicas dentro de qualquer célula são aqui fornecidos. Em modalidades específicas, a célula é uma célula eucariótica uma célula eucariótica de não rato, uma célula pluripotente, uma célula não pluripotente, uma célula não humana pluripotente, uma célula pluripotente humana, uma célula ES humana, uma célula tronco humana adulta, uma célula progenitora humana de desenvolvimento restrito, uma célula humana induzida por células pluripotentes (IPS), uma célula de mamífero, uma célula humana, um fibroblasto , uma célula de roedores, uma célula de roedor que não rato, uma célula de rato, uma célula de hamster ou uma célula CHO.
3. Locus Genômico Humanizado
[00346] Aqui fornecidos vários métodos e composições que compreendem um locus genômico humanizado. Tal como aqui utilizado, por locus genômico "humanizado" entende-se uma região de um genoma não humano que compreende pelo menos uma sequência de ácido nucleico humana. O locus genômico humanizado pode compreender uma região de DNA a partir de qualquer organismo que tenha uma sequência de DNA humano inserido no mesmo. Em modalidades específicas, o organismo é um eucariota, um eucariota que não rato, um mamífero que não humano, um mamífero, um humano, um roedor, um roedor que não rato, um rato, um camundongo ou um hamster. Por exemplo, um "locus de rato humanizado" compreende uma região de DNA de rato que tem uma sequência de DNA humano inserido no mesmo.
[00347] A sequência de DNA humano pode ser uma sequência de DNA humana de ocorrência natural ou pode ser modificado a partir da sua forma nativa. Em modalidades específicas, as partes de DNA humano, pelo menos, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, ou 99% de identidade de sequência com uma sequência humana nativa . Se uma sequência humana não é uma sequência humana nativa esta tem, pelo menos, uma maior identidade de sequência com uma sequência nativa humana do que para uma sequência ortóloga não humana. Além disso, a sequência de DNA humano pode compreender um cDNA, uma região de DNA genômico humano, uma região reguladora não codificante, ou qualquer parte de uma região codificante, genômica, ou reguladora de DNA humano. A sequência de DNA humano inserida no locus não humano pode compreender qualquer um dos insertos de polinucleotídeos tal como descrito aqui noutro local. Em modalidades específicas, a sequência de DNA humana é o ortóloga ao locus alvo não humano, enquanto noutros casos, a sequência de DNA humana é homóloga ao locus alvo não humano.
[00348] Numa modalidade, a modificação genética alvo é uma inserção ou substituição de uma sequência de ácido nucleico endógena, com uma sequência de ácido nucleico humano homólogo ou ortólogo. Numa modalidade, a modificação genética alvo compreende uma inserção ou substituição de uma sequência de ácido nucleico endógena com uma sequência de ácido nucleico humana homóloga ou ortóloga em um locus endógeno que compreende a sequência de ácido nucleico não humana correspondente.
[00349] Os métodos para produzir um locus humanizado compreendem introduzir no locus alvo compreendendo um ácido nucleico uma sequência de ácido nucleico humana. Numa modalidade, um método de fabricação de um animal não humano humanizado fornecido. Um tal método compreende (a) a modificação de um genoma de uma célula pluripotente ou não pluripotente não humana com um vetor de alvejamento compreendendo um inserto de ácido nucleico que compreende uma sequência de ácido nucleico humana para formar uma célula doadora; (b) introduzir na célula doadora em um embrião hospedeiro; e (c) gestação do embrião hospedeiro em uma mãe substituta; em que a mãe substituta produz uma prole que compreende a sequência de ácido nucleico humana. Em modalidades específicas, o locus humanizado é capaz de ser transmitido através da linha germinativa. Numa outra modalidade, o vetor de alvejamento compreende um vetor de alvejamento grande (LTVEC) e o inserto de ácido nucleico que compreende uma sequência de ácido nucleico humana é de pelo menos 5 kb.
[00350] Em outros métodos, o locus genômico humanizado é feito por modificação de um locus alvo de um ácido nucleico através de recombinação bacteriana homóloga (BHR). O método compreende a introdução numa célula procariota um vetor de alvejamento compreendendo um inserto de ácido nucleico flanqueado com uma porção de homologia de 5’ e uma porção de homologia de 3’, em que o inserto de ácido nucleico compreende uma sequência de ácido nucleico humana, e em que a célula procariótica compreende um nucleico ácido e é capaz de expressar uma recombinase que medeia a BHR no locus alvo.
[00351] O locus genômico humanizado pode compreender (a) uma inserção de uma sequência de ácido nucleico humana homóloga ou ortóloga; (B) uma substituição de uma sequência de ácido nucleico endógena homóloga por uma sequência de ácido nucleico humana homóloga ou ortóloga; ou (c) uma combinação dos mesmos. Em modalidades específicas, o locus genômico humanizado é capaz de ser transmitido através da linha germinativa. Em ainda outras modalidades, a sequência humana ortóloga substitui a sequência correspondente encontrada no locus não humano.
[00352] Qualquer sequência de ácido nucleico humana pode ser usada nos métodos e composições aqui fornecidos. Exemplos não limitantes de sequências de ácidos nucleicos humanas que podem ser usados nos métodos e composições são discutidos em detalhe noutro sítio neste documento.
[00353] A sequência de ácido nucleico humana para inserção num locus de interesse pode ser de qualquer tamanho. Numa forma de realização, a sequência de ácido nucleico humana pode ser de cerca de 500 nucleotídeos de cerca de 200 kb, de cerca de 500 nucleotídeos a cerca de 5 kb, de cerca de 5 kb a cerca de 200 kb, de cerca de 5 Kb a cerca de 10 kb, de cerca de 10 kb a cerca de 20 kb, de cerca de 20 kb a cerca de 30 kb, de cerca de 30 kb a cerca de 40 kb, de cerca de 40 kb a cerca de 50 kb, de cerca de 60 kb a cerca de 70 kb, de cerca de 80 kb a cerca de 90 kb , de cerca de 90 kb a cerca de 100 kb, de cerca de 100 kb a cerca de 110 kb, de cerca de 120 kb a cerca de 130 kb, de cerca de 130 kb a cerca de 140 kb, de cerca de 140 kb a cerca de 150 kb, de cerca de 150 kb a cerca de 160 kb, de cerca de 160 kb a cerca de 170 kb, de cerca de 170 kb a cerca de 180 kb, de cerca de 180 kb a cerca de 190 kb, ou de cerca de 190 kb a cerca de 200 kb. Numa modalidade específica, a sequência de ácido nucleico humana é de pelo menos 5 kb.
[00354] Numa modalidade, o locus genômico é fornecido, em que a sequência de ácido nucleico humana homóloga ou ortóloga compreende (a) um ou mais segmentos de gene não rearranjados da cadeia pesada de imunoglobulina humana VH , um ou mais segmentos do gene D não rearranjados de imunoglobulina humana de cadeia pesada e um ou mais segmentos de gene não rearranjados de imunoglobulina humana de cadeia pesada JH , que são operativamente ligados a uma sequência de acido nucleico de região constante de cadeia pesada; (b) uma sequência de ácido nucleico de região variável de cadeia pesada de imunoglobulina humana rearranjada operativamente ligada a uma sequência de ácido nucleico de região constante de cadeia pesada de imunoglobulina de mamífero; (c) um ou mais segmentos de gene não rearranjados de imunoglobulina humana VK ou VX e um ou mais segmentos de gene não rearranjados de imunoglobulina humana JK ou JX , os quais estão ligados operacionalmente a, uma sequência de ácido nucleico de região de cadeia constante de cadeia leve de imunoglobulina de mamífero X ou K; ou (d) uma sequência de ácido nucleico de região variável de cadeia leve de imunoglobulina humana rearranjada X ou k operativamente ligada a uma sequência de ácido nucleico de região constante de cadeia leve de imunoglobulina de mamífero X ou k.
[00355] Numa outra modalidade, o locus genômico é fornecido em que (a) a sequência de ácido nucleico de região constante de cadeia pesada de imunoglobulina de mamífero é uma sequência de ácido nucleico de região constante, uma sequência de ácido nucleico humana de região constante, ou uma combinação dos mesmas; ou (b) a sequência de ácido nucleico de região constante de cadeia leve X or k é uma sequência de ácido nucleico de região constante de rato, uma sequência de ácido nucleico de região constante humana, ou uma combinação das mesmas.
[00356] Numa modalidade específica, um local genômico é fornecido, em que a sequência de ácido nucleico da região constante de cadeia pesada de imunoglobulina é selecionada a partir de ou compreende CH1, uma dobradiça, CH2, CH3, e/ou uma combinação dos mesmos.
[00357] Em uma modalidade, o locus genômico compreende um ou mais segmentos de gene funcional humanos VH compreendendo VH1-2, VH1-3, VH1-8, VH1-18, VH1-24, VH1-45, VH1-46, VH1-58, VH1-69, VH2-5, VH2-26, VH2-70, VH3-7, VH3-9, VH3-11 , VH3-13, VH3-15, VH3- 16, VH3-20, VH3-21, VH3-23, VH3-30, VH3-30-3, VH 3-30-5, VH3-33, VH3-35, VH3-38, VH3-43, VH3-48, VH3-49, VH3-53, VH3-64, VH3-66, VH3-72, VH3-73, VH3-74 , VH4-4, VH 4-28, VH4-30-1, VH4-30-2, VH4- 30-4, VH4-31, VH4-34, VH4-39, VH4-59, VH4-61, VH 5-51, VH 6-1 VH7- 4-1, VH7-81, ou uma combinação dos mesmos.
[00358] Numa modalidade, o locus genômico compreende um ou mais segmentos de gene funcional humano D compreendendo D1-1, D1-7, D1-14, D1-20, D1-26, D2-2, D2-8, D2-15, D2-21, D3-3, D3-9, D3-10, D3-16, D3-22, D4-4, D4-11, D4-17, D4-23, D5-12, D5-5, D5- 18, D5-24, D6-6, D6-13, D619, D6-25, D7-27, ou uma combinação dos mesmos.
[00359] Numa modalidade, o locus genômico compreende um ou mais segmentos de gene JH compreendendo JH1, JH2, JH3, JH4, JH5, JH6, e/ou uma combinação dos mesmos. Numa modalidade, o inserto de ácido nucleico compreende um ou mais segmentos de genes humanos VK que compreendem VK4-1, VK5-2, VK 7-3, VK 2-4, VK1-5, VK1-6, VK3-7, VK1-8 , VK1-9, VK2- 10, Vk3-11, Vk1-12, Vk1-13, Vk2-14, Vk3-15, Vk1-16, Vk1-17, Vk2-18, Vk2-19, Vk3-20, Vk6 -21, Vk1-22, Vk1-23, Vk2-24, Vk3-25, Vk2-26, Vk1- 27, Vk2-28, Vk2-29, Vk2-30, Vk3-31, Vk1-32, Vk1-33 , Vk3-34, Vk1-35, Vk2-36, Vk1-37, Vk2-38, Vk1-39, Vk2-40, ou uma combinação dos mesmos.
[00360] Numa modalidade, o locus genômico compreende um ou mais segmentos de genes humanos Vλ que compreendem Vλ3-1, Vλ4-3, Vλ2-8, Vλ3-9, Vλ3-10, Vλ2-11, Vλ3-12, Vλ2-14, Vλ3 -16, Vλ2-18, Vλ3-19, Vλ3-21, Vλ3-22, Vλ2-23, Vλ3-25, Vλ3-27, ou uma combinação dos mesmos.
[00361] Numa modalidade, o locus genômico compreende um ou mais segmentos de gene humano Jκ que compreendem Jκ1, Jκ2, Jκ3, Jκ4, Jκ5, ou uma combinação dos mesmos.
[00362] Em ainda outra modalidade, o locus genômico, compreende um local genômico humanizado compreendendo uma sequência de ácido nucleico de receptor de interleucina-2 humana (IL2R) ou de variante ou um fragmento do mesmo é fornecido. Em modalidades específicas, a sequência de ácido nucleico IL2R compreende uma sequência de ácido nucleico (da subunidade) do receptor alfa de interleucina-2, (subunidade) beta do receptor de interleucina-2, ou (subunidade) gama do receptor de interleucina-2 ou suas variantes ou seus fragmentos.
[00363] Noutras modalidades, o locus genômico, compreende um locus genômico humanizado compreendendo uma porção do locus ApoE humano, o locus de (subunidade) gama do receptor de interleucina 2 humano, o locus Rag2 humano, o locus Rag1 humano e/ou o locus Rag2/Rag1 humano substituindo a porção homóloga ou ortóloga correspondente do locus ApoE não humano, locus de receptor gama de interleucina 2 , locus Rag2 , locus Rag1 e/ou locus Rag2/Rag1 . Numa modalidade, o ecto-domínio de IL-2Rg não humano é substituído com o ecto-domínio de IL-2Rg humano, com o restante da molécula sendo do não humano.
[00364] Numa outra modalidade, um animal não humano geneticamente modificado, que compreende um local genômico humanizado é fornecido. Esses animais não humanos geneticamente modificados compreendem (a) uma inserção de uma sequência de ácido nucleico humana homóloga ou ortóloga; (b) uma substituição da sequência de ácido nucleico com uma sequência de ácido nucleico homóloga ou ortóloga em um locus genômico endógeno; ou (c) uma combinação destes, em que o locus genômico humanizado é capaz de ser transmitido através da linha germinativa.
[00365] Animais geneticamente modificados, incluindo animais não humanos compreendendo qualquer um dos vários loci genômicos humanizados aqui fornecidos e descritos acima também são fornecidos.
4. Polinucleotídeos de Interesse
[00366] Qualquer polinucleotídeo de interesse pode estar contido nos vários insertos ácidos nucleicos e assim integrados no locus alvo. Os métodos aqui revelados, fornecem pelo menos 1, 2, 3, 4, 5, 6 ou mais polinucleotídeos de interesse a serem integrados dentro do locus genômico alvo.
[00367] O polinucleotídeo de interesse dentro do inserto de ácido nucleico, quando integrado no locus genômico alvo pode introduzir uma ou mais modificações genéticas dentro da célula. A modificação genética pode compreender uma deleção de uma sequência de ácido nucleico endógena e/ou a adição de um polinucleotídeo exógeno ou heterólogo ou ortólogo no locus genômico alvo. Numa modalidade, a modificação genética compreende uma substituição de uma sequência de ácido nucleico endógena com um polinucleotídeo exógeno de interesse no locus genômico alvo. Assim, os métodos aqui fornecidos permitem a geração de uma modificação genética que compreende um knockout, uma deleção, uma inserção, uma substituição ( "knock-in"), um ponto de mutação, uma permuta de domínio, uma permuta de exon, uma permuta de intron, uma permuta de sequência reguladora, uma permuta de gene, ou uma combinação dos mesmos. Tais modificações podem ocorrer após a integração do primeiro, segundo, terceiro, quarto, quinto, sexto, sétimo, ou quaisquer subsequentes insertos de ácido nucleico no locus genômico alvo.
[00368] O polinucleotídeo de interesse dentro do inserto de ácido nucleico e/ou integrado no locus alvo pode compreender uma sequência que é nativa à célula na qual é introduzida; o polinucleotídeo de interesse pode ser heterólogo à célula em que é introduzido; o polinucleotídeo de interesse pode ser exógeno à célula em que é introduzido; o polinucleotídeo de interesse pode ser ortólogo à célula em que é introduzido; ou o polinucleotídeo de interesse pode ser de uma espécie diferente da célula em que é introduzido. Como aqui utilizado, "nativo", em referência a uma sequência inserida no locus alvo é uma sequência que é nativa à célula possuindo o locus alvo ou nativo à célula a partir da qual o locus alvo foi derivado (ou seja, a partir de um rato). Como usado neste documento, o termo "heterólogo", em referência a uma sequência inclui uma sequência originária de uma espécie estranha ou se da mesma espécie, é substancialmente diferente ou modificada de sua forma nativa na composição e/ou no locus genômico por intervenção humana deliberada. Tal como aqui utilizado, "exógena", em referência a uma sequência é uma sequência que se origina a partir de uma espécie estranha. O polinucleotídeo de interesse pode ser proveniente de qualquer organismo de interesse incluindo, mas não se limitando a, não humano, um roedor, um roedor que não rato, um hamster, um camundongo, um rato, um humano, um macaco, um mamífero agrícola ou um mamífero não agrícola. O polinucleotídeo de interesse pode ainda compreender uma região codificante, uma região não codificante, uma região reguladora, ou um DNA genômico. Assim, o 1°, 2°, 3°, 4°, 5°, 6°, 7°, e/ou qualquer um dos insertos de ácido nucleico subsequentes podem compreender tais sequências.
[00369] Numa modalidade, o polinucleotídeo de interesse dentro do inserto de ácido nucleico e/ou integrado no locus alvo é nativo a uma sequência de ácido nucleico de camundongo, uma sequência de ácido nucleico humana, uma sequência de ácido nucleico não humana, um ácido nucleico eucariótico, um ácido nucleico eucariótico de não rato, um ácido nucleico de mamífero não humano, um ácido nucleico de mamífero, um ácido nucleico de roedor, um ácido nucleico de roedor que não rato, um ácido nucleico de rato, um ácido nucleico de hamster, um ácido nucleico de macaco, um ácido nucleico de mamífero agrícola, ou um ácido nucleico de mamífero não agrícola. Em ainda outras modalidades, o polinucleotídeo de interesse integrado no locus alvo é um fragmento de um ácido nucleico genômico. Numa modalidade, o ácido nucleico genômico é um ácido nucleico genômico de camundongo, um ácido nucleico genômico humano, um ácido nucleico não humano, um ácido nucleico eucariótico, um ácido nucleico eucariótico de não rato, um ácido nucleico de mamífero não humano, um ácido nucleico de mamífero, um ácido nucleico de roedor, um ácido nucleico de roedor que não rato, um ácido nucleico de rato, um ácido nucleico de hamster, um ácido nucleico de macaco, um ácido nucleico de mamífero agrícola ou um ácido nucleico de mamífero não agrícola ou uma combinação dos mesmos.
[00370] Numa modalidade, o polinucleotídeo de interesse pode variar de cerca de 500 nucleotídeos a cerca de 200 kb, tal como descrito acima. Os polinucleotídeos de interesse podem ser de cerca de 500 nucleotídeos a cerca de 5 kb, de cerca de 5 kb a cerca de 200 kb, de cerca de 5 kb a cerca de 10 kb, de cerca de 10 kb a cerca de 20 kb, de cerca de 20 kb a cerca de 30 kb, de cerca de 30 kb a cerca de 40 kb, de cerca de 40 kb a cerca de 50 kb , de cerca de 60 kb a cerca de 70 kb, de cerca de 80 kb a cerca de 90 kb, de cerca de 90 kb a cerca de 100 kb, de cerca de 100 kb a cerca de 110 kb, de cerca de 120 kb a cerca de 130 kb, de cerca de 130 kb a cerca de 140 kb, de cerca de 140 kb a cerca de 150 kb, de cerca de 150 kb a cerca de 160 kb , de cerca de 160 kb a cerca de 170 kb, de cerca de 170 kb a cerca de 180 kb, de cerca de 180 kb a cerca de 190 kb ou de cerca de 190 kb a cerca de 200 kb, de cerca de 5 kb a cerca de 10 kb, de cerca de 10 kb a cerca de 20 kb, de cerca de 20 kb a cerca de 40 kb, de cerca de 40 kb a cerca de 60 kb , de cerca de 60 kb a cerca de 80 kb, de cerca de 80 kb a cerca de 100 kb, de cerca de 100 kb a cerca de 150 kb, de cerca de 150 kb a cerca de 200 kb, de cerca de 200 kb a cerca de 250 kb, de cerca de 250 kb a cerca de 300 kb, de cerca de 300 kb a cerca de 350 kb ou de cerca de 350 kb a cerca de 400 kb.
[00371] O polinucleotídeo de interesse dentro do inserto de ácido nucleico e/ou inserido no locus genômico alvo pode codificar um polipeptídeo, pode codificar um miRNA, ou pode compreender quaisquer regiões reguladoras ou regiões não codificantes de interesse, incluindo, por exemplo, uma sequência reguladora , uma sequência promotora, uma sequência de potencializadora, uma sequência de ligação ao repressor de transcrição, ou uma deleção de uma sequência codificante de não proteína, mas não compreendem uma deleção de uma sequência de codificação de proteína. Além disso, o polinucleotídeo de interesse dentro do inserto de ácido nucleico e/ou inserido no locus genômico alvo pode codificar uma proteína expressa no sistema nervoso, o sistema esquelético, o sistema digestivo, o sistema circulatório, o sistema muscular, o sistema respiratório, o sistema cardiovascular, o sistema linfático, o sistema endócrino, o sistema urinário, o sistema reprodutivo, ou uma combinação dos mesmos. Numa modalidade, o polinucleotídeo de interesse dentro do inserto de ácido nucleico e/ou inserido no locus genômico alvo codifica uma proteína expressa numa medula óssea ou numa célula derivada da medula óssea. Numa modalidade, o polinucleotídeo de interesse dentro do inserto de ácido nucleico e/ou integrado no locus alvo codifica uma proteína expressa numa célula de baço. Em ainda outras modalidades, o polinucleotídeo de interesse dentro do inserto de ácido nucleico e/ou inserido no locus alvo codifica uma proteína expressa numa célula B, codifica uma proteína expressa numa célula B imatura ou codifica uma proteína expressa numa célula B madura .
[00372] O polinucleotídeo de interesse dentro do inserto de polinucleotídeo pode compreender uma porção de um locus ApoE , um locus Il2rg , um locus Rag1 , um locus Rag2 e/ou um locus Rag2/Rag1 . Tais porções destes loci dados são discutidos noutros sítios deste documento, assim como as várias regiões homólogas e ortólogas de qualquer organismo de interesse que pode ser empregue.
[00373] Numa modalidade, polinucleotídeo de interesse dentro do inserto de ácido nucleico e/ou inserido no locus alvo compreende uma sequência de ácido nucleico genômico que codifica uma sequencia de aminoácidos da região variável da cadeia pesada de imunoglobulina. A expressão "cadeia pesada", ou "cadeia pesada de imunoglobulina" são aqui descritas noutro sítio.
[00374] Numa modalidade, o polinucleotídeo de interesse dentro do inserto de ácido nucleico e/ou integrado no locus alvo compreende uma sequência de ácido nucleico genômico que codifica uma sequência de aminoácidos da região variável de cadeia pesada de imunoglobulina humana.
[00375] Numa modalidade, a sequência de ácido nucleico genômico compreende um ou mais segmentos de genes não rearranjados de imunoglobulina humana de cadeia pesada VH , um ou mais segmentos de gene D não rearranjados de imunoglobulina humana de cadeia pesada e um ou mais segmentos de genes não rearranjados de imunoglobulina humana de cadeia pesada JH , que são operativamente ligados a uma sequência de ácido nucleico de mamífero de região constante da cadeia pesada. Numa modalidade, a sequência de ácido nucleico genômico compreende uma sequência de ácido nucleico de região variável de cadeia pesada de imunoglobulina humana não rearranjada operativamente ligada a uma sequência de ácido nucleico de região constate de cadeia pesada de mamífero. Numa modalidade, a sequência de ácido nucleico genômico compreende um ou mais segmentos de gene não rearranjados de imunoglobulina humana VK ou VX e um ou mais segmentos de gene não rearranjados de imunoglobulina humana JK ou JX , que são operativamente ligados a uma sequência de ácido nucleico da região constante de cadeia leve de imunoglobulina de mamífero X ou k. Numa modalidade, a sequência de ácido nucleico genômico compreende uma sequência de ácido nucleico de região variável de cadeia leve de imunoglobulina humana imunoglobulina humana X ou k operativamente ligada a uma sequência de ácido nucleico de região constante de cadeia leve de imunoglobulina humana X ou k. Numa modalidade, a sequência de ácido nucleico da região constante de cadeia pesada compreende uma sequência de ácido nucleico de rato de região constante, uma sequência de ácido nucleico humana de região contante ou uma combinação das mesmas. Numa modalidade, o ácido nucleico da região constante de imunoglobulina X ou k de cadeia leve compreende uma sequência de ácido nucleico de rato de região constante, uma sequência de ácido nucleico humana da região constante, ou uma combinação dos mesmos.
[00376] Numa modalidade, a sequência de ácido nucleico de imunoglobulina da região constante de cadeia pesada é selecionada a partir de ou compreende CH1, uma dobradiça, CH2, CH3, e/ou uma combinação dos mesmos. Numa modalidade, a região constante da sequência de ácido nucleico de cadeia pesada compreende um CH1-dobradiça-CH2-CH3.
[00377] Numa modalidade, o polinucleotídeo de interesse dentro do inserto de ácido nucleico e/ou integrado no locus alvo compreende uma sequência de ácido nucleico genômico que codifica uma sequência de aminoácidos da região variável de cadeia leve de imunoglobulina. A expressão "cadeia leve" inclui uma sequência de imunoglobulina de cadeia leve a partir de qualquer organismo, e é descrito aqui noutro local.
[00378] Numa modalidade, o polinucleotídeo de interesse dentro do inserto de ácido nucleico e/ou integrado no locus genômico alvo compreende uma sequência de ácido nucleico genômico que codifica uma sequência de aminoácidos da região variável de cadeia leve de imunoglobulina humana.
[00379] Numa modalidade, a sequência de ácido nucleico genômico compreende um ou mais segmentos de gene não rearranjados de imunoglobulina humana VK or VX e um ou mais segmentos de gene não rearranjados de imunoglobulina humana JK or JX , que são operativamente ligados a uma sequência de ácido nucleico da região constante de cadeia leve de imunoglobulina de roedor X ou k. Numa modalidade, a sequência de ácido nucleico genômico compreende uma sequência de ácido nucleico de região variável de cadeia leve de imunoglobulina humana rearranjada X ou k operativamente ligada a uma sequência de ácido nucleico de região constante de cadeia leve de imunoglobulina de roedor X ou k. Numa modalidade, a sequência de ácido nucleico da região constante de cadeia leve compreende uma sequência de ácido nucleico de rato de região constante, uma sequência de ácido nucleico humana de região contante ou uma combinação das mesmas. Numa modalidade, o ácido nucleico da região constante de imunoglobulina X ou k de cadeia leve compreende uma sequência de ácido nucleico de rato de região constante, uma sequência de ácido nucleico humana da região constante, ou uma combinação dos mesmos.
[00380] O polinucleotídeo de interesse dentro do inserto de ácido nucleico e/ou integrado no locus alvo pode codificar para uma proteína extracelular ou um ligando para um receptor. Em modalidades específicas, o ligando codificado é uma citocina. Citocinas de interesse incluem uma quimiocina selecionada a partir de ou compreendendo CCL, CXCL, CX3CL, e/ou XCL. A citocina pode também compreender um fator de necrose tumoral (TNF). Em ainda outras modalidades, a citocina é uma interleucina (IL). Numa modalidade, a interleucina é selecionada a partir de ou compreende IL- 1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10 , IL-11, IL-12, IL-13, IL-14, IL-15, IL-16, IL-17, IL-18, IL-19, IL-20, IL-21, IL-22, IL -23, IL-24, IL-25, IL-26, IL-27, IL-28, IL-29, IL-30, IL-31, IL-32, IL-33, IL-34, IL-35 , e/ou IL-36. Numa modalidade, a interleucina é IL-2. Em modalidades específicas, tais polinucletídeos de interesse no inserto de ácido nucleico e/ou integrado no locus genômico alvo são de um humano e, em modalidades mais específicas, pode compreender sequência genômica humana.
[00381] O polinucleotídeo de interesse dentro da inserção de ácido nucleico e/ou integrado no locus genômico alvo pode codificar apolipoproteína E (ApoE).
[00382] O polinucleotídeo de interesse dentro da inserção de ácido nucleico e/ou integrado no locus alvo pode codificar uma proteína citoplasmática ou uma proteína de membrana. Numa modalidade, a proteína de membrana é um receptor, tal como, um receptor de citocina, um receptor de interleucina, um receptor de interleucina-2 alfa, um receptor beta da interleucina-2, uma interleucina-2 ou receptor gama do receptor de tirosina quinase. Em outros casos, o polinucleotídeo de interesse dentro do ácido nucleico de inserção e/ou integrado no locus alvo pode compreender uma região homóloga ou ortóloga do locus alvo.
[00383] O polinucleotídeo de interesse dentro do ácido nucleico de inserção e/ou integrado no locus alvo pode compreender um polinucleotídeo que codifica, pelo menos, uma região de um receptor de células T, incluindo o receptor da célula T alfa. Em métodos específicos cada um dos ácidos de inserção nucleicos compreende uma região genômica do locus do receptor de células T (isto é, o locus de receptor de células alfa de T) de tal modo que após a conclusão da integração de série uma porção ou a totalidade dos loci do receptor de células T genômico foi integrada no locus alvo. Tais ácidos nucleicos de inserção podem compreender, pelo menos, um ou mais de um segmento variável ou um segmento de união de um locus do receptor de células T (isto é, o locus alfa de receptor de célula T). Em ainda outras modalidades, o polinucleotídeo de interesse que codifica a região do receptor de células T pode ser, por exemplo, um polinucleotídeo de um eucariota, um eucariota não-rato, um mamífero, um mamífero não-humano, de roedor, roedor não-rato, camundongo, rato, um humano, um macaco, um hamster, um mamífero agrícola ou um mamífero doméstico que codifica uma proteína mutante.
[00384] Em outras modalidades, o polinucleotídeo de interesse integrado no locus alvo codifica uma proteína nuclear. Numa modalidade, a proteína nuclear é um receptor nuclear. Em modalidades específicas, tais polinucleotídeos de interesse no inserto de ácido nucleico e/ou integrado no locus alvo são de um humano e, em modalidades mais específicas, pode compreender sequência genômica humana.
[00385] O polinucleotídeo de interesse dentro do ácido nucleico de inserção e/ou integrado no locus genômico alvo pode compreender uma modificação genética de uma sequência de codificação. Estas modificações genéticas incluem, mas não estão limitados a uma mutação de deleção de uma sequência codificadora ou fusão de duas sequências de codificação.
[00386] O polinucleotídeo de interesse dentro do ácido nucleico de inserção e/ou integrado no locus alvo pode compreender um polinucleotídeo que codifica uma proteína mutante, incluindo, por exemplo, uma proteína mutante humana. Numa modalidade, a proteína mutante é caracterizada por uma característica de ligação alterada, localização alterada, expressão alterada, e/ou padrão alterado de expressão. Numa modalidade, o polinucleotídeo de interesse dentro do ácido de inserção nucleico e/ou integrado no locus alvo compreende, pelo menos, um alelo da doença, incluindo, por exemplo, um alelo de uma doença neurológica, um alelo de uma doença cardiovascular, um alelo de uma doença renal, um alelo de uma doença muscular, um alelo de uma doença do sangue, um alelo de um gene causador de câncer, ou um alelo de uma doença do sistema imunológico. Em tais casos, o alelo de uma doença pode ser um alelo dominante ou o alelo da doença é um alelo recessivo. Além disso, o alelo doença pode compreende um alelo de polimorfismo de um único nucleotídeo (SNP). O polinucleotídeo de interesse que codifica a proteína mutante pode ser de qualquer organismo, incluindo, mas não limitado a polinucleotídeo de um eucariota, um eucariota não-rato, um mamífero, um mamífero não-humano, de roedor, roedor não- rato, de camundongo, rato, um ser humano, um hamster, um macaco, um mamífero agrícola ou um mamífero doméstico que codifica uma proteína mutante.
[00387] Numa modalidade, a modificação genética produz uma forma mutante de uma proteína com uma característica de ligação alterada, localização alterada, expressão alterada e/ou padrão de expressão alterado.
[00388] Numa modalidade, a modificação genética produz uma deleção, adição, substituição ou uma sua combinação respectiva de uma região do locus ApoE, por exemplo, o locus de rato ApoE, em que a modificação genética no locus ApoE resulta numa diminuição na atividade de ApoE. Numa modalidade, um nocaute ApoE é gerado.
[00389] Numa modalidade, a modificação genética produz uma deleção, adição, substituição ou uma sua combinação de uma região do locusRag1, por exemplo, o locus de rato Rag1, em que a modificação genética no locus Rag1 resulta numa diminuição na atividade de Rag1. Numa modalidade, um nocaute Rag1 é gerado. Numa modalidade, a modificação genética produz uma deleção, adição, substituição ou uma sua combinação de uma região do locus Rag2, por exemplo, o locus de rato Rag2, em que a modificação genética no locus Rag2 resulta numa diminuição na atividade de Rag2. Numa modalidade, um nocaute Rag2 é gerado. Numa modalidade, a modificação genética produz uma deleção, adição, substituição ou uma sua combinação de uma região do locus Rag1/Rag2, por exemplo, o locus de rato Rag1/Rag2, em que a modificação genética no locus Rag1/Rag2 resulta numa diminuição na atividade de Rag1 e uma diminuição na atividade de Rag2. Numa modalidade, um nocaute Rag1/Rag2 é gerado.
[00390] Numa modalidade, a modificação genética produz uma deleção, adição, substituição ou uma combinação dos mesmos de uma região do locus do receptor gama de interleucina-2, por exemplo, o locus de receptor gama de interleucina-2 de rato, em que a modificação genética no locus do receptor gama de interleucina 2 resulta em uma diminuição em receptor gama de interleucina-2. Numa modalidade, um nocaute do receptor gama de interleucina-2 é gerado.
[00391] Conforme discutido em outro lugar neste documento, outras modalidades aqui previstas compreendem que um ou mais do locus de ApoE, o locus de receptor gama de interleucina-2, o locus Rag2, o locus Rag1 e/ou o locus Rag2/Rag1, por exemplo, o locus de ApoE do rato, o locus de receptor gama de interleucina-2 de rato, o locus de Rag2, o locus de Rag1 e/ou Rag2 ou deRag1 são modificados através da substituição de uma parte do locus de ApoE de rato, o locus de receptor gama de interleucina-2, o locus de Rag2, o locus de Rag1 ou de Rag2/Rag1 com a parte correspondente ortóloga de um locus de ApoE, um locus de receptor gama de interleucina-2, um locus de Rag2, um locus de Rag1 e/ou um locus de Rag2/Rag1 de outro organismo.
[00392] Numa modalidade, várias modificações genéticas são geradas. Numa modalidade, uma modificação genética produz uma deleção, adição, substituição ou uma combinação dos mesmos de uma região do locus de receptor gama de interleucina-2, por exemplo, o locus de receptor gama de interleucina-2 de rato, em que a modificação genética no locus do receptor gama de interleucina-2 resulta em uma diminuição no receptor gama de interleucina-2 e uma segunda modificação genética produz uma deleção, adição, substituição ou uma combinação dos mesmos de uma região do locus de Rag2 de rato, em que a modificação genética no locus de Rag2 resulta numa diminuição na atividade de Rag2. Numa modalidade, um nocaute do receptor gama de interleucina-2/Rag2 é gerado. Tal rato tem um fenótipo SCID.
[00393] Numa modalidade, o ácido nucleico de mamífero compreende um ácido nucleico de mamífero, compreende um locus genômico que codifica uma proteína expressa no sistema nervoso, o sistema esquelético, sistema digestivo, sistema circulatório, sistema muscular, sistema respiratório, sistema cardiovascular, sistema linfático, sistema endócrino, sistema urinário, sistema reprodutivo ou uma combinação dos mesmos. Numa modalidade, o ácido nucleico de mamífero compreende um local genômico que codifica uma proteína expressa numa medula óssea ou uma célula derivada de medula óssea. Numa modalidade, o ácido nucleico compreende um local genômico que codifica uma proteína expressa numa célula de baço. Numa modalidade, o locus genômico compreende uma sequência de DNA genômico de rato, uma sequência de DNA genômico de rato, uma sequência de DNA genômico humano, ou uma combinação dos mesmos. Numa modalidade, o locus genômico compreende, em qualquer ordem, sequências de DNA genômico humano e de rato. Numa modalidade, o locus genômico compreende, em qualquer ordem, sequências de DNA genômico humano e de rato. Numa modalidade, o locus genômico compreende, em qualquer ordem, sequências de DNA genômico humano e de rato. Numa modalidade, o locus genômico compreende, em qualquer ordem, sequências de DNA genômico humano, de camundongo e de rato.
[00394] Numa modalidade, o ácido nucleico de inserção compreende uma modificação genética de uma sequência de codificação de um gene. Numa modalidade, a modificação genética compreende uma mutação de deleção na sequência de codificação. Numa modalidade, modificação genética compreende uma fusão de duas sequências de codificação endógenas.
[00395] Numa modalidade, a modificação genética compreende uma deleção de uma sequência que não codifica proteína, mas não compreende uma deleção de uma sequência de codificação da proteína. Numa modalidade, a deleção da sequência que não codifica proteína compreende uma deleção de um elemento regulador. Numa modalidade, a modificação genética compreende a adição de um promotor ou um elemento regulador. Numa modalidade, a modificação genética compreende a substituição de um promotor ou um elemento regulador. Numa modalidade, o elemento regulador é um potencializador. Numa modalidade, o elemento regulador é um elemento repressor de ligação transcricional.
[00396] Numa modalidade, a modificação genética compreende a colocação de uma sequência de ácido nucleico humano que codifica uma proteína mutante humana. Numa modalidade, a modificação genética compreende, pelo menos, um alelo de doença humana de um gene humano. Numa modalidade, a doença humana é uma doença neurológica. Numa modalidade, a doença humana é uma doença cardiovascular. Numa modalidade, a doença humana é uma doença renal. Numa modalidade, a doença humana é uma doença muscular. Numa modalidade, a doença humana é uma doença no sangue. Em uma modalidade, a doença humana é um câncer. Numa modalidade, a doença humana é uma doença do sistema imunológico. Numa modalidade, o alelo da doença humana é um alelo dominante. Numa modalidade, o alelo da doença humana é um alelo recessivo. Numa modalidade, o alelo de uma doença humana compreende um alelo de polimorfismo de um único nucleotídeo (SNP).
[00397] O polinucleotídeo de interesse dentro do ácido nucleico de inserção e/ou integrado no locus alvo também pode compreender uma sequência reguladora, incluindo, por exemplo, uma sequência promotora, uma sequência potenciadora, ou uma sequência de ligação ao repressor transcricional. Em modalidades específicas, o polinucleotídeo de interesse dentro do ácido nucleico de inserção e/ou integrado no locus alvo genômico compreende um polinucleotídeo que tem uma deleção de uma sequência de codificação de não-proteína, mas não compreende uma deleção de uma sequência de codificação da proteína. Numa modalidade, a deleção da sequência que não codifica proteína compreende uma deleção de uma sequência reguladora. Numa outra modalidade, a deleção do elemento regulador compreende uma deleção de uma sequência promotora. Numa modalidade, a deleção do elemento regulador compreende uma deleção de uma sequência potenciadora. Um tal polinucleotídeo de interesse pode ser de qualquer organismo, incluindo, mas não limitado a polinucleotídeo de um eucariota, um eucariota não-rato, um mamífero, um mamífero não-humano, de roedor, roedor não-rato, de camundongo, rato, um ser humano, um macaco, um mamífero agrícola ou um mamífero doméstico que codifica uma proteína mutante.
5. Métodos de Introdução de Sequências e Geração de Animais Transgênicos
[00398] Tal como referido acima, os métodos e composições são aqui proporcionados para permitir a integração direcionada de um ou mais polinucleotídeos de interesse num locus alvo. Tais sistemas empregam uma variedade de componentes e para facilidade de referência, neste documento, o termo "sistema de integração direcionada" compreende genericamente todos os componentes necessários para um evento de integração (isto é, em exemplos não limitativos, os vários agentes de nuclease, os locais de reconhecimento, polinucleotídeos de DNA de inserção, vetores de direcionamento, locus genômico alvo, e/ou polinucleotídeos de interesse).
[00399] Os métodos apresentados neste documento compreendem a introdução em uma célula com um ou mais polinucleotídeos ou construtos de polipeptídio que compreendem vários componentes do sistema de integração genômica direcionada. O termo "introdução" se refere à apresentação para a célula da sequência (polipeptídio ou polinucleotídeo) de forma que a sequência tenha acesso ao interior da célula. Os métodos aqui apresentados não dependem de um método particular para a introdução de qualquer componente do sistema de integração genômico direcionado na célula, apenas se o polinucleotídeo tiver acesso ao interior de pelo menos uma célula. Métodos para a introdução de polinucleotídeos em vários tipos de célula são conhecidos na técnica e incluem, entre outros, métodos de transfecção estável, métodos de transfecção transitória e métodos mediados por vírus.
[00400] Quaisquer células de qualquer organismo podem ser utilizadas nos métodos aqui proporcionados. Em modalidades específicas, o organismo é um eucariota, um eucariota que não rato, um mamífero não humano, um mamífero, um humano, um roedor, um roedor que não rato, um rato, um camundongo ou um hamster. Em modalidades específicas, a célula é uma célula eucariótica, célula eucariótica de não rato, uma célula pluripotente, uma célula não pluripotente, uma célula não humana pluripotente, uma célula mamífera não humana uma célula pluripotente humana, uma célula ES humana, uma célula tronco humana adulta, uma célula progenitora humana de desenvolvimento restrito, uma célula humana induzida por células pluripotentes (IPS), uma célula de mamífero, uma célula humana, um fibroblasto, uma célula de roedores, uma célula de roedor não rato, uma célula de rato, uma célula de camundongo, uma célula de hamster ou uma célula CHO.
[00401] Em algumas modalidades, as células utilizadas nos métodos e composições têm um construto de DNA estavelmente incorporado ao seu genoma. Os termos "estavelmente incorporado" ou "estavelmente introduzido" se referem à introdução de um polinucleotídeo na célula de modo que a sequência de nucleotídeo se integre ao genoma da célula e seja capaz de ser herdada pela sua progênie. Qualquer protocolo pode ser utilizado para a incorporação estável dos construtos de DNA ou os vários componentes do sistema de integração genômica direcionada.
[00402] Os protocolos de transfecção, bem como os protocolos para a introdução de sequências de polipeptídios e de polinucleotídeos em células podem variar. Os métodos de transfecção não-limitantes incluem métodos de transfecção à base de substâncias químicas incluem o uso de lipossomas; nanopartículas; fosfato de cálcio (Graham et al. (1973). Virology 52 (2): 45667, Bacchetti et al. (1977) Proc Natl Acad Sci USA 74 (4): 1590-4 e Kriegler, M (1991). Transfer and Expression: A Laboratory Manual. Nova York: W. H. Freeman and Company. pp. 96-97); dendrímeros; ou polímeros catiônicos, tais como DEAE-dextrano ou polietilenimina. Métodos não químicos incluem eletroporação; Sono-poração; e a ótica. Transfecção à base de partículas inclui a utilização de uma pistola de genes, transfecção assistida por ímã (Bertram, J. (2006) Current Pharmaceutical Biotechnology 7, 277-28). Métodos virais também podem ser usados para a transfecção.
[00403] Numa modalidade, a introdução de um ou mais dos polinucleotídeos numa célula é mediada por eletroporação, por injeção intracitoplasmática, por uma infecção viral, por um adenovírus, por lentivírus, por retrovírus, por transfecção, por transfecção mediada por lipídios ou é mediada através de Nucleofection™.
[00404] Numa modalidade, a introdução de um ou mais dos polinucleotídeos numa célula compreende ainda: introdução de um construto de expressão que compreende uma sequência de ácido nucleico de interesse operativamente ligada a um promotor. Numa modalidade, o promotor é um promotor constitutivamente ativo. Numa modalidade, o promotor é um promotor induzível. Numa modalidade, o promotor é ativo em células-tronco, por exemplo, uma célula-tronco embrionária.
[00405] Numa modalidade, o construto de expressão é introduzido em conjunto com o LTVEC. Numa modalidade, o construto de expressão é introduzido separadamente a partir do LTVEC ao longo de um período de tempo.
[00406] Numa modalidade, a introdução de um ou mais polinucleotídeos na célula pode ser efetuada várias vezes ao longo de um período de tempo. Numa modalidade, a introdução de um ou mais polinucleotídeos na célula é realizada pelo menos duas vezes ao longo de um período de tempo, pelo menos três vezes ao longo de um período de tempo, pelo menos quatro vezes durante um período de tempo, pelo menos cinco vezes durante um período de tempo, pelo menos seis vezes durante um período de tempo, pelo menos sete vezes ao longo de um período de tempo, pelo menos oito vezes durante um período de tempo, pelo menos nove vezes durante um período de tempo, pelo menos dez vezes durante um período de tempo, pelo menos onze vezes, pelo menos doze vezes durante um período de tempo, pelo menos treze vezes durante um período de tempo, pelo menos catorze vezes durante um período de tempo, pelo menos quinze vezes durante um período de tempo, pelo menos dezesseis vezes ao longo de um período de tempo, pelo menos dezessete vezes ao longo de um período de tempo, pelo menos dezoito vezes ao longo de um período de tempo, pelo menos dezenove vezes ao longo de um período de tempo, ou pelo menos vinte vezes ao longo de um período de tempo.
[00407] Numa modalidade, o agente de nuclease é introduzido na célula ao mesmo tempo com o vetor de direcionamento ou o grande vetor de direcionamento (LTVEC). Alternativamente, o agente de nuclease é introduzido separadamente a partir do vetor de direcionamento ou o LTVEC ao longo de um período de tempo. Numa modalidade, o agente de nuclease é introduzido antes da introdução do vetor de direcionamento ou o LTVEC, enquanto em outras modalidades o agente de nuclease é introduzido após a introdução do vetor de direcionamento ou o LTVEC.
[00408] Numa modalidade, a etapa de triagem compreende um ensaio quantitativo para avaliar a modificação do alelo (MOA) de um cromossomo parental. Numa modalidade, o ensaio quantitativo é realizado por meio de uma PCR quantitativa. Numa modalidade, a PCR quantitativa é uma PCR em tempo real (qPCR). Numa modalidade, a PCR em tempo real compreende um primeiro conjunto de iniciadores que reconhece o locus alvo e um segundo conjunto de iniciadores que reconhece um locus de não alvejado de referência. Numa modalidade, o conjunto de iniciadores compreende uma sonda fluorescente que reconhece a sequência amplificada. Numa modalidade, o ensaio quantitativo é realizado por meio de fluorescência mediada por hibridação in situ (FISH). Numa modalidade, o ensaio quantitativo é realizado através de hibridação genômica comparativa. Numa modalidade, o ensaio quantitativo é realizado através de amplificação isotérmica de DNA. Numa modalidade, o ensaio quantitativo é realizado através de amplificação isotérmica de DNA. Numa modalidade, o ensaio quantitativo é realizado por meio de hibridização quantitativa de uma sonda(s) imobilizada. Numa modalidade, o ensaio quantitativo é realizado por meio de Invader Probes®. Numa modalidade, o ensaio quantitativo é realizado por meio de MMP assays®. Numa modalidade, o ensaio quantitativo é realizado por meio de TaqMan ® Molecular Beacon. Numa modalidade, o ensaio quantitativo é realizado por meio de tecnologia de sondas Eclipse™. (Ver, por exemplo, US2005/0144655, que é aqui incorporada por referência na sua totalidade).
[00409] É ainda proporcionado um método para fazer um animal não- humano humanizado, compreendendo: (a) a modificação de um genoma de uma célula pluripotente com um vetor de direcionamento compreendendo um inserto de ácido nucleico que compreende uma sequência de ácido nucleico humana para formar uma célula dadora; (b) introduzir na célula doadora em um embrião hospedeiro; e (c) gestação do embrião hospedeiro em uma mãe substituta; em que a mãe substituta produz uma progênie que compreende a sequência de ácido nucleico humana. Numa modalidade, é introduzida célula doadora em um embrião hospedeiro que está na fase de blastocisto ou numa fase de pré-mórula (isto é, uma fase de 4 células ou numa fase de 8 células). Além disso, a etapa (a) pode também ser realizada com um grande vetor de direcionamento (LTVEC) e/ou uma sequência de ácido nucleico humana de pelo menos 5 kb de comprimento. Em ainda outras modalidades, a modificação genética é capaz de ser transmitida através da linha germinativa.
[00410] Animais geneticamente modificados não-humanos podem ser gerados utilizando os vários métodos aqui descritos. Tais métodos compreendem: (1) integrar um ou mais polinucleotídeo de interesse no locus alvo de uma célula pluripotente para gerar uma célula pluripotente geneticamente modificada compreendendo o ácido nucleico de inserção no locus genômico alvo empregando os métodos aqui descritos; (2) selecionar a célula pluripotente geneticamente modificada possuindo um ou mais polinucleotídeos de interesse no locus alvo genômico; (3) introduzir esta célula geneticamente modificada pluripotente num embrião hospedeiro; e (4) a implantação do embrião hospedeiro compreendendo a célula pluripotente geneticamente modificada para numa mãe de aluguel. A progênie da célula pluripotente geneticamente modificada é gerada. Numa modalidade, é introduzida célula doadora em um embrião hospedeiro na fase de blastocisto ou na fase de pré-mórula (isto é, a fase de 4 células ou a fase de 8 células). As progênies que são capazes de transmitir a modificação genética através da linha germinativa são geradas. A célula pluripotente pode ser uma célula ES, como discutido noutras partes deste documento.
[00411] Técnicas de transferência nuclear podem também ser utilizadas para gerar animais não humanos geneticamente modificados. Resumidamente, os métodos para transferência nuclear incluem as etapas de: (1) enucleação de um oócito; (2) isolamento de uma célula doadora ou do núcleo para ser combinada com o oócito enucleado; (3) inserção da célula ou do núcleo do oócito enucleado para formar uma célula reconstituída; (4) implantar a célula reconstituída no útero de um animal para formar um embrião; e (5) permitir que o embrião se desenvolva. Em tais métodos oócitos são geralmente recuperados de animais falecidos, embora possam ser também isolados a partir de qualquer dos ovidutos e/ou ovários dos animais vivos. Os oócitos podem ser amadurecidos de uma variedade de formas conhecidas para aqueles versados na técnica antes da enucleação. Enucleação do oócito pode ser realizada em um número de maneiras bem conhecidas daqueles versados na técnica. A inserção da célula doadora ou do núcleo do oócito enucleado para formar uma célula reconstituída é normalmente por microinjeção de uma célula doadora no âmbito da zona pelúcida antes da fusão. Fusão pode ser induzida pela aplicação de um pulso eléctrico DC através do plano de contato/fusão (eletrofusão), por exposição das células aos produtos químicos que promovem a fusão, tais como o polietileno-glicol, ou por meio de um vírus inativado, tal como o vírus Sendai. Uma célula reconstituída é normalmente ativada por meios eléctricos e/ou não-eléctricos antes, durante e/ou após a fusão do doador nuclear e do oócito receptor. Métodos de ativação incluem pulsos eléctricos, o choque induzido quimicamente, por penetração do esperma, aumentando os níveis de cátions divalentes no oócito e reduzindo a fosforilação de proteínas celulares (como por meio de inibidores de cinase) no oócito. As células ativadas reconstituídas, ou embriões, são normalmente cultivadas em meio bem conhecido daqueles versados na técnica e, em seguida, transferidas para o útero de um animal. Ver, por exemplo, US20080092249, WO/1999/005266A2, US20040177390, WO/2008/017234A1, e Patente U.S. No. 7.612.250, cada uma das quais é aqui incorporada por referência.
[00412] Em um aspecto, um método para fazer um animal não humano geneticamente modificado é fornecido, que compreende a modificação de um local genômico de interesse numa célula pluripotente empregando genes mediados por endonuclease de direcionamento para introduzir uma modificação num locus genômico de interesse para formar uma célula pluripotente modificada, mantendo a célula pluripotente modificada sob condições suficientes para manter a pluripotência, empregando a célula pluripotente modificada como uma célula doadora num embrião hospedeiro, e gestando o embrião hospedeiro compreendendo a célula pluripotente modificada em uma mãe de aluguel, em que o embrião hospedeiro é gestado pela mãe de aluguel e uma progênie geneticamente modificada nasce.
[00413] Numa modalidade, a sequência-alvo está localizado num íntron. Numa modalidade, a sequência-alvo está localizada num éxon. Numa modalidade, a sequência-alvo está localizada em um promotor. Numa modalidade, a sequência-alvo está localizada numa região reguladora do promotor. Numa modalidade, a sequência-alvo está localizada numa região potenciadora.
[00414] Numa modalidade, a etapa de introdução é executada várias vezes durante um período de tempo utilizando uma pluralidade de endonucleases que reconhecem sequências alvo distintas. Em uma modalidade, a etapa é executada pelo menos duas vezes durante um período de tempo usando uma pluralidade de endonucleases que reconhecem sequências alvo distintas, pelo menos três vezes durante um período de tempo usando uma pluralidade de endonucleases que reconhecem sequências alvo distintas, pelo menos quatro vezes durante um período de tempo usando uma pluralidade de endonucleases que reconhecem sequências alvo distintas, pelo menos cinco vezes ao longo de um período de tempo usando uma pluralidade de endonucleases que reconhecem sequências alvo distintas, pelo menos seis vezes durante um período de tempo usando uma pluralidade de endonucleases que reconhecem sequências alvo distintas, pelo menos sete vezes durante um período de tempo usando uma pluralidade de endonucleases que reconhecem sequências alvo distintas, pelo menos oito vezes durante um período de tempo usando uma pluralidade de endonucleases que reconhecem sequências alvo distintas, pelo menos nove vezes durante um período de tempo usando uma pluralidade de endonucleases que reconhecem sequências alvo distintas, pelo menos dez vezes durante um período de tempo usando uma pluralidade de endonucleases que reconhecem sequências alvo distintas, pelo menos onze vezes durante um período de tempo usando uma pluralidade de endonucleases que reconhecem sequências alvo distintas, pelo menos doze vezes durante um período de tempo usando uma pluralidade de endonucleases que reconhecem sequências alvo distintas, pelo menos treze vezes durante um período de tempo usando uma pluralidade de endonucleases que reconhecem sequências alvo distintas, pelo menos catorze vezes durante um período de tempo usando uma pluralidade de endonucleases que reconhecem sequências alvo distintas, pelo menos quinze vezes durante um período de tempo usando uma pluralidade de endonucleases que reconhecem sequências alvo distintas, pelo menos dezesseis vezes durante um período de tempo usando uma pluralidade de endonucleases que reconhecem sequências alvo distintas, pelo menos dezessete vezes durante um período de tempo usando uma pluralidade de endonucleases que reconhecem sequências alvo distintas, pelo menos dezoito vezes durante um período de tempo usando uma pluralidade de endonucleases que reconhecem sequências alvo distintas, pelo menos dezenove vezes durante um período de tempo usando uma pluralidade de endonucleases que reconhecem sequências alvo distintas ou pelo menos vinte vezes durante um período de tempo usando uma pluralidade de endonucleases que reconhecem sequências alvo distintas.
[00415] Numa modalidade, a etapa de introdução é mediada por eletroporação, por injeção intracitoplasmática, por um adenovírus, por lentivírus, por retrovírus, por transfecção, por transfecção mediada por lipídios ou é mediada através de Nucleofection™.
[00416] Numa modalidade, o método compreende ainda a introdução de um ácido nucleico exógeno na célula pluripotente geneticamente modificada. Numa modalidade, o ácido nucleico exógeno é um transgene. Numa modalidade, o ácido nucleico exógeno é introduzido num locus endógeno. Numa modalidade, o ácido nucleico exógeno é introduzido ectopicamente (por exemplo, num locus diferente do seu locus endógeno).
[00417] Em um aspecto, um método para fazer um animal não humano geneticamente modificado é fornecido, que compreende a modificação de um local genômico de interesse numa célula pluripotente empregando engenharia de genoma RNA-guiada para introduzir uma modificação num locus genômico de interesse para formar uma célula pluripotente modificada, mantendo a célula pluripotente modificada sob condições suficientes para manter a pluripotência, empregando a célula pluripotente modificada como uma célula doadora num embrião hospedeiro, e gestando o embrião hospedeiro compreendendo a célula pluripotente modificada em uma mãe de aluguel, em que o embrião hospedeiro é gestado pela mãe de aluguel e uma progênie geneticamente modificada nasce.
[00418] Numa modalidade, o método tem uma taxa de segmentação que varia desde cerca de 2% a cerca de 80%.
[00419] Numa modalidade, o método compreende a co-introdução de uma pluralidade do segundo construto de expressão que compreende sequências alvo genômicas distintas para edição multiplex de loci genômicos distintos. Numa modalidade, o método compreende a introdução de uma pluralidade do segundo construto de expressão que compreende sequências alvo genômicas distintas para edição multiplex de loci genômicos distintos ao longo de um período de tempo.
[00420] Numa modalidade, a etapa de introdução é executada várias vezes durante um período de tempo. Numa modalidade, a etapa de introdução (b) é realizada pelo menos duas vezes ao longo de um período de tempo, pelo menos três vezes ao longo de um período de tempo, pelo menos quatro vezes durante um período de tempo, pelo menos cinco vezes durante um período de tempo, pelo menos seis vezes durante um período de tempo, pelo menos sete vezes ao longo de um período de tempo, pelo menos oito vezes durante um período de tempo, pelo menos nove vezes durante um período de tempo, pelo menos dez vezes durante um período de tempo, pelo menos onze vezes ao longo de um período de tempo, pelo menos doze vezes durante um período de tempo, pelo menos treze vezes durante um período de tempo, pelo menos catorze vezes durante um período de tempo, pelo menos quinze vezes durante um período de tempo, pelo menos dezesseis vezes ao longo de um período de tempo, pelo menos dezessete vezes ao longo de um período de tempo, pelo menos dezoito vezes ao longo de um período de tempo, pelo menos dezenove vezes ao longo de um período de tempo, pelo menos vinte vezes ao longo de um período de tempo.
[00421] Numa modalidade, a primeira construção de expressão e a segunda construção de expressão são expressas a partir de um mesmo plasmídeo.
[00422] Numa modalidade, a etapa de introdução é mediada por eletroporação, por injeção intracitoplasmática, por um adenovírus, por lentivírus, por retrovírus, por transfecção, por transfecção mediada por lipídios ou é mediada através de Nucleofection™.
[00423] Numa modalidade, o método compreende ainda a introdução de um ácido nucleico exógeno na célula pluripotente que compreende o alelo mutante.
[00424] Numa modalidade, o ácido nucleico exógeno é um transgene. Numa modalidade, o ácido nucleico exógeno é introduzido num locus endógeno. Numa modalidade, o ácido nucleico exógeno é colocado ectopicamente (por exemplo, num locus diferente do seu locus endógeno).
[00425] Numa modalidade, o método compreende ainda a introdução de um ácido nucleico exógeno na célula pluripotente geneticamente modificada. Numa modalidade, o ácido nucleico exógeno é um transgene. Numa modalidade, o ácido nucleico exógeno é introduzido num locus endógeno. Numa modalidade, o ácido nucleico exógeno é introduzido ectopicamente (por exemplo, num locus diferente do seu locus endógeno).
[00426] Em um aspecto, um método para fazer um animal não-humano humanizado é fornecido, que compreende a modificação de um genoma de uma célula pluripotente com um LTVEC compreendendo uma inserção que compreende uma sequência humana de pelo menos 5 kb, e empregando a célula pluripotente como um doador celular, introduzindo a célula doadora em um embrião hospedeiro, e gestação do embrião hospedeiro de uma mãe de aluguel, em que a mãe de aluguel nascimentos uma descendência que compreende a humanização.
[00427] Outros métodos para a feitura de um animal não humano geneticamente modificado compreendendo na sua linha germinativa uma ou mais modificações genéticas, tal como aqui descrito, são proporcionados, compreendendo: (a) a modificação de um locus direcionado contido numa célula procariótica empregando os vários métodos aqui descritos; (b) selecionar uma célula procariótica modificada que compreende a modificação genética no locus alvo; (c) isolamento do vetor de direcionamento geneticamente modificado a partir do genoma da célula procariótica modificada; (d) introduzir o vetor de direcionamento geneticamente modificado numa célula pluripotente para gerar uma célula pluripotente geneticamente modificada compreendendo o ácido nucleico de inserção no locus genômico alvo; (e) selecionar a célula pluripotente geneticamente modificada; (f) a introdução da célula pluripotente geneticamente modificada num embrião hospedeiro em uma fase de pré-mórula; e (g) implantação do embrião hospedeiro compreendendo a célula pluripotente geneticamente modificada numa mãe de aluguel para gerar uma geração F0 derivada da célula pluripotente geneticamente modificada. Em tais métodos o vetor de direcionamento pode compreender um grande vetor de direcionamento. A célula pluripotente pode ser uma célula ES. Noutros métodos, a etapa de isolamento (c) compreende ainda (c1) linearizar o vetor de direcionamento geneticamente modificado (isto é, o LTVEC geneticamente modificado). Em ainda outras modalidades, a etapa de introdução (d) compreende ainda (d1) introdução de um agente de nuclease, tal como aqui descrito, para a célula pluripotente. Numa modalidade, a seleção de etapas (b) e/ou (e) é realizada por aplicação de um agente de seleção, tal como aqui descrito, para a célula procariótica ou a célula pluripotente. Numa modalidade, a seleção de etapas (b) e/ou (e) é realizada por meio de uma modificação do ensaio de alelo (MOA), tal como aqui descrito.
[00428] Outros métodos para a modificação de um locus genômico alvo de uma célula de mamífero através de recombinação homóloga bacteriana (BHR) numa célula procariótica são fornecidos e compreendem: (a) proporcionar uma célula procariótica que compreende um locus alvo compreendendo um ácido nucleico, (b) introdução na célula procariótica de um vetor de direcionamento compreendendo uma inserção de ácido nucleico flanqueada com um braço de homologia 5' e um braço de homologia 3', em que o ácido nucleico de inserção compreende uma região de mamífero (incluindo, por exemplo, uma inserção de DNA de um humano), e (c) selecionar uma célula procariótica alvo compreendendo o ácido de inserção nucleico no locus alvo, em que a célula procariótica é capaz de expressar uma recombinase que medeia a BHR. A etapa (a1) pode compreender o fornecimento de uma célula procariótica que compreende um locus alvo compreendendo um ácido nucleico compreendendo um primeiro polinucleotídeo que compreende um primeiro sítio de reconhecimento para um primeiro agente de nuclease, e o passo (b1) pode ainda compreender expressar na procariótica célula um agente de nuclease que faz uma quebra de dupla fita ou corte em ou perto do primeiro sítio de reconhecimento. As etapas (a)-(c) podem ser repetidas em série, tal como aqui divulgado, para permitir a introdução de vários ácidos nucleicos de inserção no locus alvo na célula procariota. Uma vez que o locus genômico alvo é "construído" com a célula procariota, um vetor de direcionamento compreendendo o locus alvo modificado pode ser isolado a partir da célula procariótica e introduzido num local genômico alvo dentro de uma célula pluripotente. Células pluripotentes (isto é, células ES) compreendendo o locus genômico modificado podem então ser transformadas em animais não humanos geneticamente modificados.
[00429] Em algumas modalidades, várias modificações genéticas dos loci genômicos alvo aqui descritos podem ser levadas a cabo por uma série de reações de recombinação homóloga (BHR) em células bacterianas, utilizando um derivado de LTVEC bacteriano de DNA de Cromossomo Artificial Bacteriano (BAC) usando tecnologia de engenharia genética VELOCIGENE® (ver, por exemplo, US Pat. No. 6,586,251 e Valenzuela, D. M., et al., (2003), High-throughput engineering of the mouse genome coupled with high-resolution expression analysis, Nature Biotechnology 21(6): 652659, que é aqui incorporado por referência na sua totalidade).
[00430] Em algumas modalidades, as células ES alvo compreendendo várias modificações genéticas tal como aqui descritas são utilizadas como as células ES de inserção e introduzidas num embrião em fase de pré-mórula a partir de um organismo correspondente, por exemplo, embrião de fase de 8- células de camundongo, por meio do método VELOCIMOUSE® (ver, por exemplo, US 7.576.259, US 7.659.442, US 7.294.754, e US 2008-0078000 A1, todos os quais são aqui incorporados por referência na sua totalidade. Os embriões compreendendo as células ES geneticamente modificadas são incubados até o estágio de blastocisto e depois implantados em uma mãe de aluguel para produzir um F0. Animais portadores do locus genômico geneticamente modificado podem ser identificados por meio de ensaio de modificação do alelo (MOA) tal como aqui descrito. O animal não-humano resultante de geração F0 derivado de células ES geneticamente modificadas é cruzado com um animal não-humano do tipo selvagem para se obter descendência de geração F1. Seguindo genotipagem com iniciadores específicos e/ou sondas, animais não humanos F1 que são heterozigóticos para o locus genômico geneticamente modificado são cruzados uns com os outros para produzir animais que são homozigóticos para o locus genômico geneticamente modificado. Alternativamente, uma fêmea F0 de animal não humano e um macho F0 de animal não humano tendo cada um a modificação genética podem ser cruzados para se obter um homozigoto de animal não humano F1 para a modificação genética.
[00431] Num aspecto, um genoma de rato geneticamente modificado, por exemplo, é fornecido, que compreende uma modificação direcionada de uma sequência de ácido nucleico endógena com uma sequência de ácido nucleico homóloga ou ortóloga de outro organismo.
[00432] Numa modalidade, a sequência de ácido nucleico homóloga ou ortóloga é de um comprimento de cerca de 5 kb e cerca de 200 kb. Numa modalidade, a sequência de ácido nucleico não-rato homóloga ou ortóloga varia de cerca de 5 kb e cerca de 10 kb. Numa modalidade, a sequência de ácido nucleico não-rato homóloga ou ortóloga varia de cerca de 10 kb até cerca de 20 kb. Numa modalidade, a sequência de ácido nucleico não-rato homóloga ou ortóloga varia de cerca de 20 kb até cerca de 30 kb. Numa modalidade, a sequência de ácido nucleico não-rato homóloga ou ortóloga varia de cerca de 30 kb e cerca de 40 kb. Numa modalidade, a sequência de ácido nucleico não-rato homóloga ou ortóloga varia de cerca de 40 kb até cerca de 50 kb. Numa modalidade, a sequência de ácido nucleico não-rato homóloga ou ortóloga varia de cerca de 50 kb até cerca de 60 kb. Numa modalidade, a sequência de ácido nucleico não-rato homóloga ou ortóloga varia de cerca de 60 kb e cerca de 70 kb. Numa modalidade, a sequência de ácido nucleico não-rato homóloga ou ortóloga varia de cerca de 70 kb até cerca de 80 kb. Numa modalidade, a sequência de ácido nucleico não-rato homóloga ou ortóloga varia de cerca de 80 kb até cerca de 90 kb. Numa modalidade, a sequência de ácido nucleico não-rato homóloga ou ortóloga varia de cerca de 90 kb até cerca de 100 kb. Numa modalidade, a sequência de ácido nucleico não-rato homóloga ou ortóloga varia de cerca de 100 kb até cerca de 110 kb. Numa modalidade, a sequência de ácido nucleico não-rato homóloga ou ortóloga varia de cerca de 110 kb até cerca de 120 kb. Numa modalidade, a sequência de ácido nucleico não-rato homóloga ou ortóloga varia de cerca de 120 kb até cerca de 130 kb. Numa modalidade, a sequência de ácido nucleico não-rato homóloga ou ortóloga varia de cerca de 140 kb até cerca de 150 kb. Numa modalidade, a sequência de ácido nucleico não-rato homóloga ou ortóloga varia de cerca de 150 kb até cerca de 160 kb. Numa modalidade, a sequência de ácido nucleico não-rato homóloga ou ortóloga varia de cerca de 160 kb até cerca de 170 kb. Numa modalidade, a sequência de ácido nucleico não-rato homóloga ou ortóloga varia de cerca de 170 kb até cerca de 180 kb. Numa modalidade, a sequência de ácido nucleico não-rato homóloga ou ortóloga varia de cerca de 180 kb até cerca de 190 kb. Numa modalidade, a sequência de ácido nucleico não-rato homóloga ou ortóloga varia de cerca de 190 kb até cerca de 200 kb. Vários polinucleotídeos de interesse que podem ser empregues no ácido nucleico de inserção são aqui descritos noutro local.
[00433] Outros métodos para a modificação do genoma direcionada de um animal não-humano são fornecidos. Tais métodos podem compreender (a) a modificação de um local genômico de interesse numa célula pluripotente não humana de acordo com qualquer um dos vários métodos aqui proporcionados para modificação de um locus do genoma de interesse, produzindo assim uma célula pluripotente não humana geneticamente modificada compreendendo uma modificação do genoma direcionada; (b) introduzir a célula pluripotente não-humana modificada da etapa (a) em um embrião hospedeiro não humano; e (c) gestar o embrião hospedeiro não- humano compreendendo a célula pluripotente modificada em uma mãe de aluguel, em que a mãe de aluguel produz progênie F0 compreendendo a modificação de genoma direcionada, e em que a modificação de genoma direcionada é capaz de ser transmitida através da linha germinativa.
[00434] Em algumas modalidades, a modificação do genoma segmentado compreende deleção simultânea de uma sequência de ácido nucleico endógeno no locus genômico de interesse e a inserção de um ácido nucleico exógeno no locus genômico de interesse (isto é, deleção e inserção numa única etapa). Em algumas modalidades, a modificação do genoma direcionada compreende uma modificação genética bialélica. A modificação genética bialélica pode compreender a eliminação de uma sequência de ácido nucleico endógeno e a inserção de um ácido nucleico exógeno no locus genômico de interesse em dois cromossomos homólogos (ou seja, um par de primeiro e segundo cromossomos homólogos).
[00435] Em outras modalidades, a modificação do genoma direcionada cria uma célula pluripotente modificada que é heterozigoto composto no locus genômico de interesse. Em outras modalidades, a modificação do genoma direcionada cria uma célula pluripotente que é homozigoto modificado no locus genômico de interesse. Em algumas modalidades a modificação genética direcionada no locus genômico de interesse em um cromossomo compreende deleção de uma sequência de ácido nucleico endógena e inserção e um de ácido nucleico exógeno. Por exemplo, a modificação genética direcionada pode compreender: (1) a deleção de uma sequência de ácido nucleico endógena no locus genômico de interesse em dois cromossomos homólogos; e (2) a inserção de um ácido nucleico exógeno no locus genômico de interesse em um primeiro cromossomo e rompimento do locus genômico de interesse no segundo cromossomo. O primeiro cromossomo pode ser o primeiro dos dois cromossomos homólogos, e o segundo cromossomo pode ser o segundo dos dois cromossomos homólogos.
6. Células
[00436] Os vários métodos e composições aqui descritos empregam um sistema de direcionamento de locus genômico em uma célula. Em uma modalidade, a célula é uma célula pluripotente. Em uma modalidade, a célula é uma célula não-pluripotente. Numa modalidade, a célula pluripotente é uma célula pluripotente não humana. Numa modalidade, a célula pluripotente não humana é uma célula de mamífero pluripotente. Numa modalidade, a célula pluripotente é uma célula tronco pluripotente de indução humana (iPS).
[00437] Em outras modalidades, a célula é uma célula eucariótica, uma célula eucariótica não-rato, uma célula humana pluripotente, uma célula ES humana, uma célula-tronco adulta humana, uma célula progenitora humana de desenvolvimento restrito, uma célula de mamífero não humana, uma célula de mamífero, uma célula humana, um fibroblasto, uma célula de roedor, uma célula de roedor não-rato, uma célula de rato, uma célula de camundongo, uma célula de hamster ou uma célula de CHO.
[00438] Numa modalidade, uma célula eucariótica é uma célula primária. As células primárias incluem células ou culturas de células que foram isoladas diretamente de um organismo, órgão ou tecido. As células primárias incluem células que não são transformadas nem imortais. Elas incluem qualquer célula obtida a partir de um organismo, órgão ou tecido que não foi previamente passado em cultura de tecidos ou que tenha sido previamente passado em cultura de tecidos, mas é incapaz de ser indefinidamente passado em cultura de tecidos. Tais células podem ser isoladas por técnicas convencionais e incluem, por exemplo, células hematopoiéticas, células endoteliais, células epiteliais, fibroblastos, células mesenquimais, queratinócitos, melanócitos, monócitos, células mononucleares, adipócitos, pré-adipócitos, neurônios, células gliais, hepatócitos, mioblastos esqueléticos e células do músculo liso. Em algumas modalidades, as células primárias são derivadas de tecidos conjuntivos, tecidos musculares, tecidos do sistema nervoso ou tecidos epiteliais.
[00439] Numa outra modalidade, uma célula eucariótica é uma célula imortalizada. Células imortalizadas incluem células de um organismo multicelular que normalmente não proliferam indefinidamente, mas, devido a uma mutação ou alteração, evitaram a senescência celular normal e em vez disso podem seguir sofrendo divisão. Tais mutações ou alterações podem ocorrer naturalmente ou ser induzidas intencionalmente. Exemplos de células imortalizadas incluem células de ovário de hamster chinês (CHO), células de rim embrionário humano (por exemplo, Células HEK 293), e as células de fibroblasto embrionário de camundongo (por exemplo, células 3T3). Numerosos tipos de células imortalizadas são bem conhecidos na técnica.
[00440] Em algumas modalidades, as células imortalizadas são derivadas de células de câncer. Numa outra modalidade, uma célula primária ou imortalizada é aquela que é normalmente utilizado para a cultura ou para a expressão de genes ou proteínas recombinantes.
[00441] Em outras modalidades, a célula pluripotente é capaz de sustentar a sua pluripotencialidade após a pelo menos uma modificação genética direcionada do seu genoma e é capaz de transmitir a modificação direcionada para uma linha germinativa de uma geração F1.
[00442] Numa modalidade, a célula pluripotente é um ovo fertilizado não-humano na fase de célula única. Numa modalidade, o óvulo fertilizado não humano é um óvulo fertilizado de mamífero. Numa modalidade, o óvulo fertilizado de mamífero é um óvulo de roedor fertilizado na fase de célula única. Numa modalidade, o óvulo fertilizado de mamífero é um óvulo fertilizado de rato ou camundongo na fase de célula única.
[00443] As várias células empregadas no método e composições aqui revelados podem também compreender células procarióticas, tal como uma célula bacteriana, incluindo E. coli. Em modalidades específicas, a célula procariótica é uma cepa competente de recombinação de E. coli. Numa modalidade, a célula procariótica compreende um ácido nucleico que codifica a recombinase, enquanto que em outros casos, a célula procariótica não compreende o ácido nucleico que codifica a recombinase, e o ácido nucleico que codifica a recombinase é introduzido na célula procariota. Numa modalidade, o ácido nucleico que codifica a recombinase compreende um DNA ou um mRNA. Em algumas modalidades, o ácido nucleico que codifica a recombinase é pABG. Numa modalidade, a recombinase é expressa sob o controle de um promotor induzível. Numa modalidade, a expressão da recombinase é controlada por arabinose.
A. Meio Osmolaridade Baixa Para Fazer e Manter Células- Tronco Humanas Pluripotentes Induzidas
[00444] Um meio de cultura celular é fornecido para utilização nos métodos e composições da invenção. Numa modalidade, o meio é apropriado para fazer uma população de células iPS humanas. Numa outra modalidade, o meio é adequado para a manutenção de células iPS humanas em cultura. Em algumas modalidades, as células iPS humanas são virgens ou parecem virgens.
[00445] O meio aqui proporcionado compreende pelo menos um meio de base, suplementos, um polipeptídio de fator de inibição de leucemia (LIF), um (GSK3) inibidor de glicogénio-sintase-quinase 3 e um inibidor de MEK.
[00446] O presente meio é um meio de baixa osmolaridade. Em um exemplo, a osmolaridade situa-se entre cerca de 175-280 mOsm/kg. Em outros exemplos, a osmolaridade do meio é de cerca de 180-270 mOsm/kg, cerca de 200-250 mOsm/kg, cerca de 220-240 mOsm/kg, ou cerca de 225-235 mOsm. Numa modalidade particular, a osmolaridade do meio é de cerca de 233 mOsm/kg.
[00447] O meio de base fornecido pela invenção é um meio de base de baixa osmolaridade ao qual suplementos são adicionados. O meio de base presente difere de meios de bases tipicamente utilizados para manter células iPS humanas em cultura, que incluem Meio Eagle Modificado por Dulbecco (DMEM), em diversas formas (por exemplo, Invitrogen DMEM, Cat. No. 1 1971 -025), e um DMEM de baixo sal disponível comercialmente como KO- DMEM™ (Cat Invitrogen. No. 10829-018).
[00448] O meio de base aqui proporcionado é um meio de baixa osmolaridade mas exibe características que não estão limitadas a baixa osmolaridade. Por exemplo, a formulação de DMEM mostrada na Tabela A pode ser feita adequada para os fins da presente invenção alterando concentrações de cloreto de sódio e/ou de bicarbonato de sódio, como aqui proporcionados, o que resultará numa pressão osmótica diferente, em comparação com o meio de base de DMEM padrão ou meio de base de DMEM de baixo sal (KO-DMEM) mostrado na Tabela A. Tabela A: Formulação de meio de base de DMEM.
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[00449] O meio de base presente pode incluir um sal de um metal alcalino e um halogeneto, tal como cloreto de sódio (NaCl). Exemplos de concentrações de NaCl no meio de base incluem 50 ± 5 mM ou cerca de 3 mg/mL.
[00450] Numa outra modalidade, o meio de base apresenta uma concentração de um sal de ácido carbônico. O sal de ácido carbônico pode ser um sal de sódio. Em tal exemplo, o sal de sódio pode ser bicarbonato de sódio. Numa modalidade particular, bicarbonato de sódio está presente na forma de base a uma concentração de cerca de 26 ± 5 mM ou cerca de 2,2 mg/mL.
[00451] Em ainda outra modalidade, o meio de base é um meio de base de osmolaridade baixa. A osmolaridade do meio de base pode estar dentro de uma gama de cerca de 175-280 mOsm/kg, cerca de 180-250 mOsm/kg, cerca de 190-225 mOsm/kg, ou cerca de 195-205 mOsm/kg. Uma osmolaridade exemplar do meio de base pode ser de 200, 214, 216, ou 218 mOsm/kg. Num exemplo particular, a osmolaridade do meio de base é de 200 mOsm/kg. A osmolaridade pode ser determinada quando as células são cultivadas em diferentes concentrações de CO2. Em alguns exemplos, as células são cultivadas a 3% de CO2 ou 5% de CO2.
[00452] Numa modalidade preferencial, a forma de base compreende NaCl a uma concentração de 3,0 mg/ml, bicarbonato de sódio a uma concentração de cerca de 2,2 mg/ml, e tem uma osmolaridade de 200 mOsm/kg.
[00453] Suplementos formulados com a forma de base da invenção são adequados para fazer, manter ou enriquecer as populações de células iPS humanas aqui reveladas. Tais suplementos são indicados como "suplementos" ou "+ suplementos" na presente memória descritiva. O termo "complementos" ou a frase "+ suplementos" inclui um ou mais elementos adicionais acrescentados aos componentes do meio de base descrito na Tabela A. Por exemplo, os suplementos podem incluir, sem limitação, meio F-12® (Gibco), suplemento N2® (Gibco; solução 100X), meio NEUROBASAL® (Gibco), suplemento B-27® (Gibco; solução 50X), L- glutamina, glicose, 2- mercaptoetanol, um polipeptídio de fator inibidor da leucemia (LIF), um inibidor de glicogénio sintase quinase 3, um inibidor de MEK, ou qualquer combinação dos mesmos.
[00454] Numa modalidade particular, o polipeptídio de LIF é um polipeptídio de LIF humano (hLIF). Em alguns exemplos, um polipeptídeo de hLIF é utilizado a uma concentração de cerca de 1-1000 unidades/ml, cerca de 20-800 unidades/ml, cerca de 50-500 unidades/ml, cerca de 75-250 unidades/ml, ou cerca de 100 unidades/mL.
[00455] Numa outra modalidade particular, o inibidor de GSK3 compreende CHIR99021. Em alguns exemplos, CHIR99021 é utilizado a uma concentração de cerca de 0,1 a 10 μM, cerca de 1-5 μM, cerca de 2-4 μM, ou cerca de 3 μM.
[00456] Numa outra modalidade particular, o inibidor de MEK compreende PD0325901. Em alguns exemplos, PD0325901 é utilizado a uma concentração de cerca de 0,1-5 μM, cerca de 0,2-1 μM, cerca de 0,3-0,7 μM, ou cerca de 0,5 μM.
[00457] Um meio exemplar compreende um meio de base de baixa osmolaridade aqui descrito a cerca de 24,75% (v/v), meio F-12 a cerca de 24,75% (v/v), suplemento N2 a cerca de 0,5% (v/v), meio Neurobasal a cerca de 49% (v/v), suplementoB-27 a cerca de 1% (v/v), L-glutamina a cerca de 2 mM, 2-mercaptoetanol a cerca de 0,1 mM, hLIF a cerca de 100 unidades/mL, CHIR99021 a cerca de 3 μM e PD0325901 a cerca de 0,5 μM.
[00458] Numa outra modalidade particular, o meio pode ou não compreender fator de crescimento de fibroblastos básico (bFGF, também conhecido como FGF2 ou FGF-β). Preferencialmente, a presente forma não compreende bFGF.
B. Células-tronco pluripotentes induzidas humanas
[00459] Os métodos e composições são aqui proporcionados para fazer uma população de células iPS humanas. Os métodos e composições são ainda proporcionados para manutenção de células iPS humanas em cultura. Células iPS humanas que são produzidas ou mantidas em cultura também são fornecidas.
[00460] O termo "célula pluripotente" ou "células-tronco pluripotentes" inclui uma célula indiferenciada que possui a capacidade de se desenvolver em mais do que um tipo de célula diferenciada. Tais células pluripotentes podem ser, por exemplo, uma célula-tronco embrionária de mamífero (células ES) ou uma célula-tronco pluripotente de mamífero induzida (células iPS). Exemplos de células pluripotentes incluem células iPS humanas.
[00461] O termo "célula-tronco embrionária" ou "célula ES" significa uma célula-tronco derivada de embrião totipotentes ou pluripotentes, derivada da massa celular interna do blastocisto, que pode ser mantida numa cultura in vitro sob condições adequadas. As células ES são capazes de se diferenciarem em células de qualquer uma das três camadas germinais de vertebrados, por exemplo, a endoderme, ectoderme ou a mesoderme. Células ES são também caracterizadas pela sua capacidade propagar indefinidamente sob adequadas condições de cultura in vitro. Ver, por exemplo, Thomson et al. (Science (1998) Vol. 282 (5391), pp. 1145-1147).
[00462] O termo "células-tronco pluripotentes induzidas" ou "células iPS" inclui uma célula-tronco pluripotente que pode ser derivada diretamente de uma célula adulta diferenciada. Células iPS humanas podem ser geradas através da introdução de conjuntos específicos de fatores de reprogramação em uma célula não-pluripotente, que pode incluir, por exemplo, OCT3/4, fatores de transcrição da família Sox (por exemplo, Sox1, Sox2, SOX3, Sox15), fatores de transcrição da família Myc (por exemplo, c-myc, L-myc, N-myc), (fatores de transcrição da família semelhante a Krüppel (KLF) (por exemplo, KLF1, KLF2, KLF4, KLF5), e/ou fatores de transcrição relacionados, tais como NANOG, LIN28, e/ou Glis1. Células iPS humanas podem também ser geradas, por exemplo, pelo uso de miRNAs, pequenas moléculas que imitam as ações de fatores de transcrição, ou especificadores de linhagem. Células iPS humanas são caracterizadas pela sua capacidade de se diferenciar em qualquer célula das três camadas germinais de vertebrados, por exemplo, a endoderme, ectoderme, ou a mesoderme. Células humanas iPS são também caracterizadas pela sua capacidade propagar indefinidamente sob adequadas condições de cultura in vitro. Ver, por exemplo, Takahashi e Yamanaka (Cell (2006) Vol. 126(4), pp. 663-676).
[00463] Os termos "virgem" e "primed" identificam diferentes estados de pluripotência das células iPS humanas. O termo "que parece virgem" identifica uma célula que expressa um estado pluripotente que exibe uma ou mais características de uma célula pluripotente virgem. Células iPS humanas que parecem virgens também podem ser referidas como células humanas "semelhantes a virgens" iPS. Em algumas modalidades, as células que parecem virgens iPS humanas exibem uma ou mais características morfológicas de células iPS humanas virgens, tais como uma morfologia caracterizada por colônias em forma de cúpulas compactas. Em algumas modalidades, as células iPS humanas que parecem virgens expressam um ou mais dos marcadores de pluripotência aqui descritos. Em algumas modalidades, células iPS humanas que parecem virgens ou virgens são células iPS humanas virgens. Em outras modalidades, células iPS humanas virgens ou que parecem virgens são células iPS que parecem virgens.
[00464] Características das células iPS virgens e primed encontram-se descritas na técnica. Veja, por exemplo, Nichols e Smith (Cell Stem Cell (2009) Vol. 4 (6), pp. 487-492). Células iPS humanas virgens apresentam um estado de pluripotência semelhante àquele das células ES da massa de células interna de um embrião pré-implantação. Tais células virgens não estão preparadas para a especificação das linhagens e compromisso. Células iPS virgens fêmeas são caracterizadas por dois cromossomos X ativos. Em cultura, a autorrenovação das células humanas iPS virgens está dependente de fator inibidor da leucemia (LIF) e outros inibidores. Células iPS humanas virgens cultivadas exibem uma morfologia clonal caracterizada por colônias em forma de cúpula arredondada e uma falta de polaridade apico-basal. Células virgens cultivadas podem adicionalmente exibir um ou mais marcadores de pluripotência como aqui descritos noutro local. Sob condições apropriadas, o tempo de duplicação de células iPS humanas virgens na cultura pode ser entre 16 e 24 horas.
[00465] Células iPS humanas primed expressam um estado de pluripotência semelhante ao das células de epiblasto pós-implantação. Tais células sofrem priming para especificação de linhagem e compromisso. Células iPS primed fêmeas são caracterizadas por um cromossomo X ativo e um inativo cromossomo X. Em cultura, a autorrenovação das células humanas primed iPS é dependente de fator de crescimento de fibroblastos (FGF) e activina. Células iPS humanas primed cultivadas exibem uma morfologia clonal caracterizada por uma monocamada e exibição de polaridade apico- basal epitelial. Sob condições apropriadas, o tempo de duplicação de células iPS humanas primed em cultura pode ser de 24 horas ou mais.
[00466] Numa modalidade, as células iPS humanas podem ser derivados de células não-pluripotentes transformadas para expressar um estado pluripotente. Tais células transformadas incluem, por exemplo, as células que foram transformadas para expressar genes de reprogramação que induzem pluripotência. Um estado pluripotente pode incluir, por exemplo, expressão de um ou mais dos marcadores de pluripotência aqui descritos. Tais células (tais como fibroblastos de prepúcio humano) podem ser transformadas para expressar genes de reprogramação, ou quaisquer outros genes de interesse, por quaisquer meios conhecidos na técnica. Ver, por exemplo, Takahashi e Yamanaka (Cell (2006) Vol. 126(4), pp. 663-676). Por exemplo, elas podem ser introduzidas nas células utilizando um ou mais plasmídeos, vetores lentivirais ou vetores retrovirais. Em alguns casos, os vetores se integram no genoma e podem ser removidos depois que a reprogramação está completa. Em modalidades particulares, as células pluripotentes não são transformadas com genes de reprogramação que compreendem Oct4, Sox2, KLF4, Myc, ou qualquer combinação dos mesmos. Em alguns exemplos, as células transformadas compreendem células iPS humanas primed.
[00467] Em algumas modalidades, as células iPS humanas cultivadas no meio de baixa osmolaridade aqui descrito expressam um ou mais fenótipos, perfis de expressão de gene, ou marcadores característicos de um estado virgem. Num exemplo, as células iPS humanas expressam um ou mais marcadores de pluripotência cuja expressão é indicativa de um estado virgem. Tais marcadores de pluripotência podem incluir fosfatase alcalina, NANOG, 5T4, ABCG2, Activina RIB/ALK-4, Activina RIIB, E-Caderina, Cbx2, CD9, CD30/TNFRSF8, CD117/c-kit, CDX2, CHD1, Cripto, DNMT3B, DPPA2, DPPA4, DPPA5/ESG1, EpCAM/TROP1, ERR beta/NR3B2, ESGP, proteína F-box 15/FBXO15, FGF-4, FGF-5, FoxD3, GBX2, GCNF/NR6A1, GDF-3, Gi24/VISTA/B7-H5, integrina alfa 6/CD49f, integrina alfa 6 beta 1, integrina alfa 6 beta 4, integrina beta 1/CD29, KLF4, KLF5, L1TD1, Lefty, Lefty-1, Lefty-A, LIN-28A, LIN-28B, LIN-41, cMaf, cMyc, Oct-3/4, Oct-4A, Podocalixina, Rex-1/ZFP42, Smad2, Smad2/3, SOX2, SSEA-1, SSEA-3, SSEA-4, STAT3, Stella/Dppa3, SUZ12, TBX2, TBX3, TBX5, TERT, TEX19, TEX19.1, THAP11, TRA-1-60(R), TROP-2, UTF1 e/ou ZIC3. Num exemplo específico, o marcador de pluripotência expresso é fosfatase alcalina, NANOG ou ambos.
[00468] Numa outra modalidade, as células iPS humanas cultivadas no meio de baixa osmolaridade aqui descrito exibem características morfológicas indicativas de um estado virgem. Uma morfologia exemplar é caracterizada por células possuindo colônias em forma de cúpulas compactas em cultura.
[00469] Numa outra modalidade, as células iPS humanas cultivadas no meio de baixa osmolaridade aqui descrito pode ser mecanicamente ou enzimaticamente dissociadas em uma suspensão de uma única célula, passadas e/ou subcultivadas. Em um exemplo, a dissociação enzimática pode ser realizada utilizando tripsina. Quando cultivadas na presente forma de baixa osmolaridade, células iPS humanas podem proporcionar uma maior eficiência de transformação devido à dissociação aumentada em uma suspensão de célula única. Com outros tipos de meio (por exemplo, meio mTeSR™ ou meio 2i) tipicamente usados para manter as células iPS humanas em cultura, dissociação de células iPS humanas deve ser realizada mecanicamente ou com enzimas tais como a colagenase que são menos severas do que a tripsina. Por conseguinte, as células não são dissociadas de forma tão eficaz ou tão completamente. Em contraste, com o presente meio de baixa osmolaridade, a tripsina pode ser utilizada para dissociar as células, e a dissociação potenciada resulta no aumento da eficiência de transformação. Além disso, ao contrário de outros tipos de meio normalmente usados para manter as células iPS humanas em cultura (por exemplo, meio mTeSR™ ou 2i), dissociação enzimática de células iPS humanas cultivadas com o presente meio de baixa osmolaridade (de preferência um meio de baixa osmolaridade não compreendendo bFGF) pode ser realizada na ausência de um ou mais inibidores que são geralmente necessários para a passagem de tais células. Um inibidor exemplar que pode ser omitido é um inibidor de proteína cinase Rho-associada (ROCK). Um inibidor ROCK é geralmente necessário quando da passagem de células iPS humanas para inibir a ativação de vias pró- apoptóticas.
[00470] Numa outra modalidade, células iPS humanas subcultivadas cultivadas no meio de baixa osmolaridade aqui descrito podem manter um estado virgem ou que parece virgem seguinte a dissociação enzimática e subcultura. Em alguns exemplos, as células iPS humanas subcultivadas podem continuar a exibir uma morfologia caracterizada por colônias em forma de cúpulas compactas. Células iPS humanas de subcultura também podem continuar a expressar um ou mais marcadores de pluripotência como descritos aqui.
C. Os métodos para fazer e manter uma população de células- tronco pluripotentes induzidas humanas
[00471] Métodos e composições são fornecidos para fazer células iPS humanas em uma cultura in vitro. Os métodos e composições são ainda proporcionados para manutenção de células iPS humanas em cultura in vitro.
[00472] O termo "produzir" inclui a cultura de células não- pluripotentes transformadas para expressar um ou mais fatores de reprogramação, tal como aqui descritos, sob condições adequadas para induzir uma alteração no fenótipo celular, a expressão do gene, ou ambos, de tal modo que as células apresentam um estado virgem ou que parece virgem, isto é, expressam uma ou mais características de células iPS humanas virgens. Um estado virgem ou que parece virgem pode ser expresso em resposta a determinadas condições de cultura, por exemplo, a cultura num meio de baixa osmolaridade, tal como aqui descrito. Em alguns exemplos, a proporção de células que expressam um estado virgem ou que parece virgem é pelo menos cerca de 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, e até 100% das células em cultura.
[00473] Numa modalidade, o método enriquece uma cultura in vitro para uma população de células iPS humanas virgens ou que parecem virgens. Numa modalidade tal, células iPS humanas virgens ou que parecem virgens podem ser propagadas em cultura preferencialmente às células que não expressam um estado virgem ou que parece virgem. Em outra modalidade, as células iPS humanas virgens ou que parecem virgens podem ser selecionados a partir de uma cultura, ser enzimaticamente dissociadas e subcultivadas para produzir uma população enriquecida de células iPS humanas virgens ou que parecem virgens.
[00474] Numa modalidade, as células não-pluripotentes transformadas para expressar um estado pluripotente são cultivadas in vitro num meio aqui proporcionado que é adequado para induzir a expressão de um estado virgem ou que parece virgem durante um período de pelo menos 1, 2, 5, 7, 10, 14, 21, ou 28 dias, ou em qualquer período de tempo suficiente para induzir a expressão de um estado virgem ou que parecem virgens. As células transformadas podem ser cultivadas no meio presente por, pelo menos, 1, 2, 3, ou 4 semanas. Por vezes, as células transformadas são cultivadas durante 1-4 semanas. A expressão de um estado virgem ou que parece virgem pode ser determinada observando características morfológicas ou a expressão de marcadores de pluripotência, característicos de um estado virgem ou que parece virgem, que são descritos neste documento.
[00475] Numa modalidade, as células não-pluripotentes transformadas para expressar um estado pluripotente são cultivadas no presente meio de baixa osmolaridade até que expressam características de um estado virgem ou que parece virgem. As células podem então ser cultivadas na presente forma para manter um estado virgem ou que parece virgem. Numa outra modalidade, as células não-pluripotentes transformadas para expressar um estado pluripotente são primeiramente cultivadas num meio de alta osmolaridade antes da cultura no presente meio de baixa osmolaridade. Tal meio de alta pressão osmótica exibe uma pressão osmótica maior do que o atual meio de baixa osmolaridade e pode compreender bFGF. Alguns meios de alta osmolaridade compreendem um ou mais dentre albumina de soro bovino, bFGF, fator de crescimento transformante β (TGFβ), cloreto de lítio, ácido pipecólico, e ácido gama-aminobutírico (GABA). Exemplos de um meio de alta pressão osmótica incluem meio mTeSR™ (Stemcell Technologies).
[00476] Em algumas modalidades, as células não-pluripotentes transformadas para expressar um estado pluripotente podem primeiro ser cultivadas em meio de alta osmolaridade compreendendo bFGF até começarem a expressar características de um estado virgem ou que parece virgem, altura em que as células são cultivadas no presente meio de baixa osmolaridade. Num exemplo, as células podem ser cultivadas em meio de alta osmolaridade compreendendo bFGF por um período de pelo menos 1, 2, 5, 10, 30, 60, ou 90 dias, um período de 1, 2, 4, 8, ou 12 semanas ou um período entre 1 dia a 3 meses. Um período de tempo exemplar para a cultura num meio de alta pressão osmótica compreendendo bFGF é de 2 meses.
[00477] Em outras modalidades, as células não-pluripotentes transformadas para expressar um estado pluripotente podem primeiro ser cultivadas em meio de alta osmolaridade compreendendo bFGF até que começam a exibir uma morfologia caracterizada por aglomerados de células tridimensional, tempo no qual as células de são cultivadas no presente meio de baixa pressão osmótica. Em tais modalidades, células exibindo aglomerados tridimensionais podem ser selecionadas, dissociadas (por exemplo, com tripsina) e transferidas para uma nova cultura no meio de baixa osmolaridade aqui descrito.
[00478] Os termos "manter", "manutenção" e "de manutenção" incluem a preservação de pelo menos uma ou mais das características ou fenótipos de células iPS humanas aqui descritas. Tais características podem incluir a manutenção da pluripotência, a morfologia das células, os perfis de expressão de genes e/ou outras características funcionais das células virgens. Os termos "manter", "manutenção" e "de manutenção" podem englobar também a propagação de células e/ou um aumento no número de células virgens a serem cultivadas. Os termos incluem condições de cultura que impedem as células de se converterem a um estado primed ou não- pluripotente. Os termos incluem ainda as condições de cultura que permitem que as células permaneçam pluripotentes e/ou virgens, enquanto que as células podem ou não continuar a dividir-se e aumentar em número.
[00479] Numa modalidade, as células iPS humanas são cultivadas in vitro num meio aqui proporcionado que é adequado para a manutenção de tais células num estado virgem ou que parece virgem. Num exemplo particular, as células iPS humanas podem ser cultivadas num meio adequado, durante um período de 1, 2, 5, 7, 10, 14, 21, ou 28 dias, ou durante um período de cerca de 2 semanas, cerca de 3 semanas, cerca de 4 semanas, ou mais, desde que as células em cultura sejam mantidas num estado virgem ou que parece virgem. As células podem ser cultivadas durante, pelo menos, 1, 2, 3 ou 4 semanas. Por vezes, as células são cultivadas durante 1-4 semanas. Células iPS humanas podem ser mantidas, por exemplo, por qualquer período de tempo suficiente para a propagação de células em cultura, a modificação genética das células e/ou subcultura das células.
[00480] Numa outra modalidade, as células iPS humanas ou células não-pluripotentes transformadas para expressar um estado pluripotente podem ser cultivadas numa camada de células de alimentação ou substrato adequada para cultura in vitro. Num exemplo particular, as células são cultivadas em MATRIGEL™ (BD Biosciences). Em outro exemplo, as células são cultivadas em células de alimentação de fibroblastos humanos de prepúcio de recém-nascido (NUFF). Em outro exemplo, as células são cultivadas em GELTREX™ (Life Technologies).
[00481] Numa outra modalidade, o tempo de duplicação de células iPS humanas cultivadas no presente meio de baixa osmolaridade é reduzido em comparação com células iPS humanas primed ou células não-pluripotentes transformadas para expressar um estado pluripotente. Num exemplo particular, o tempo de duplicação das células presentes iPS humanas situa-se entre cerca de 16-24 horas.
7. Identidade de sequência
[00482] Os métodos e composições aqui proporcionados empregam uma variedade de diferentes componentes do sistema de integração genômica direcionada (ou seja, os agentes, sítios de reconhecimento de nuclease, ácidos nucleicos de inserção, polinucleotídeos de interesse, vetores de direcionamento, marcadores de seleção e outros componentes). É reconhecido em toda a descrição que alguns componentes do sistema de integração genômica direcionada podem ter variantes ativas e fragmentos. Tais componentes incluem, por exemplo, agentes de nuclease (por exemplo, agentes de nuclease projetados por engenharia), sítios de reconhecimento de agente de nuclease, polinucleotídeos de interesse, sítios alvo e braços de homologia correspondentes do vetor de direcionamento. A atividade biológica de cada um destes componentes é descrita noutras partes deste documento.
[00483] Como usado aqui, "identidade de sequência" ou "identidade" no contexto de duas sequências de polipeptídio ou polinucleotídeos faz referência aos resíduos nas duas sequências que são iguais quando alinhados para a máxima correspondência sobre uma janela de comparação especificada. Quando o percentual de identidade de sequência é usado em referência a proteínas, reconhece-se que as posições do resíduo que não são idênticas frequentemente diferem por substituições conservativas de aminoácidos, onde os resíduos de aminoácidos são substituídos por outros resíduos de aminoácidos com propriedades químicas similares (por exemplo, carga ou hidrofobia) e, portanto, não alteram as propriedades funcionais da molécula. Onde as sequências diferem em substituições conservativas, o percentual de identidade de sequência pode ser ajustado de forma ascendente para corrigir a natureza conservativa da substituição. Sequências que diferem por tais substituições conservadoras, diz-se, têm "similaridade de sequência" ou "similaridade". Meios para realizar este ajuste são bem conhecidos para aqueles versados na técnica. Normalmente, isso envolve a pontuação de uma substituição conservativa como uma incompatibilidade parcial ao invés de total, assim aumentando o percentual de identidade de sequência. Assim, por exemplo, onde uma pontuação de 1 é atribuída a um aminoácido idêntico e uma pontuação de zero é atribuída a uma substituição não-conservativa, uma pontuação entre zero e 1 é atribuída a uma substituição conservativa. A pontuação das substituições conservadoras é calculada, por exemplo, como implementado no programa PC/GENE (Intelligenetics, Mountain View, Califórnia).
[00484] Como usado aqui, "porcentagem de identidade de sequência" significa o valor determinado comparando duas sequências otimamente alinhadas numa janela de comparação, no qual a parte da sequência polinucleotídica na janela de comparação pode incluir adições ou deleções (ou seja, lacunas) em comparação com a sequência de referência (que não compreende adições ou exclusões) para alinhamento ideal das duas sequências. A porcentagem é calculada determinando o número de posições nas quais a base de ácido nucleico idêntica ou resíduo de aminoácido ocorre em ambas as sequências para produzir o número de posições correspondentes, dividindo o número de posições correspondentes pelo número total de posições na janela de comparação e multiplicar o resultado por 100 para render a porcentagem de identidade de sequência.
[00485] A menos que indicado de outra forma, os valores de identidade de sequência/similaridade aqui proporcionados referem-se ao valor obtido usando GAP versão 10 utilizando os seguintes parâmetros: % de identidade e % de similaridade para uma sequência de nucleotídeos utilizando Peso GAP de 50 e Peso de Extensão de 3, e a matriz de pontuação nwsgapdna.cmp; % de identidade e % de similaridade para uma sequência de aminoácidos utilizando Peso GAP de 8 e Peso de Extensão de 2, e a matriz de pontuação BLOSUM62; ou qualquer programa equivalente. "Programa equivalente" significa qualquer programa de comparação de sequência que, para as duas sequências em questão, gera um alinhamento com combinações de resíduo de nucleotídeos ou aminoácidos idênticas e uma identidade de sequência idêntica por cento quando comparado com o alinhamento correspondente gerado pelo GAP versão 10.
[00486] A menos que definido de outra forma, todos os termos técnicos e científicos usados neste documento têm o mesmo significado conforme comumente entendido por alguém ordinariamente versado na técnica ao qual esta invenção pertença. Embora quaisquer métodos e materiais similares ou equivalentes àqueles descritos neste documento também possam ser usados na prática ou teste da invenção descrita, os métodos e materiais preferenciais são agora descritos. Todas as publicações mencionadas neste documento são incorporadas neste documento por referência a divulgar e descrever os métodos e/ou materiais em conexão aos quais as publicações são citadas.
[00487] Deve-se notar que como usado neste documento e nas reivindicações anexas, as formas singulares "um", "uma" e "o(a)" incluem referências plurais, a menos que o contexto dite claramente o contrário. Todos os termos técnicos e científicos aqui utilizados têm o mesmo significado.
[00488] As publicações discutidas neste documento são providas unicamente para sua divulgação antes da data de depósito do presente pedido. Nada neste documento deve ser interpretado como uma admissão de que a invenção descrita não é intitulada para antecipar tal publicação em virtude da invenção anterior. Além disso, as datas de publicação fornecidas podem ser diferentes das datas de publicação reais as quais podem precisar ser confirmadas de forma independente.
[00489] A invenção descrita pode ser concretizada noutras formas específicas sem se afastar do espírito ou atributos essenciais da mesma e, em conformidade, deve ser feita referência às reivindicações anexas, em vez de à especificação anterior, como indicando o âmbito da invenção.
[00490] Modalidades não limitantes incluem: 1. Um método para a modificação específica de um locus genômico de interesse numa célula de rato pluripotente, que compreende (a) introduzir na célula de rato pluripotente um grande vetor de direcionamento (LTVEC) que compreende um ácido nucleico de inserção flanqueado com um braço de homologia do rato a 5' e um braço de homologia do rato a 3', em que a soma total de braços de homologia 5 'e 3' é de pelo menos 10 kb, mas menos do que 150 kb; e (b) a identificação de uma célula pluripotente de rato geneticamente modificada que compreende a modificação genética direcionada no locus genômico de interesse, em que a modificação genética direcionada é capaz de ser transmitida através da linha germinativa. 2. O método da modalidade 1, em que a modificação genética direcionada é bialélica. 3. O método da modalidade 1 ou 2, em que a célula pluripotente de rato é uma célula-tronco embrionária de rato (ES). 4. O método da modalidade 1, 2 ou 3, em que a célula pluripotente de rato é derivada de uma cepa DA ou uma cepa ACI. 5. O método de qualquer uma das modalidades 1-4, em que a célula pluripotente de rato é caracterizada pela expressão de pelo menos um marcador de pluripotência que compreende Dnmt3L, Eras, Err-beta, Fbxo15, FGF4, Gdf3, KLF4, LEF1, receptor LIF, Lin28, nanog, Oct4, Sox15, Sox2, Utf1, ou uma combinação dos mesmos. 6. O método de qualquer uma das modalidades 1-4, em que a célula pluripotente de rato é caracterizado por um ou mais das seguintes características: (a) falta de expressão de um ou mais marcadores de pluripotência que compreendem c-Myc, Ecat1, e/ou Rexo1; (b) a ausência de expressão de marcadores mesodermais compreendendo Brachyury e/ou BMPR2; (c) a falta de expressão de um ou mais marcadores da endoderme compreendendo Gata6, Sox17 e/ou Sox7; ou (d) a falta de expressão de um ou mais marcadores neuronais compreendendo nestina e/ou Pax6. 7. O método de qualquer uma das modalidades 1-6, em que a soma total dos braços de homologia 5’ e 3’ do LTVEC é de a partir de cerca de 10 kb a cerca de 30 kb, de a partir de cerca de 20 kb a cerca de 40 kb, de a partir de cerca de 40 kb a cerca de 60 kb, de a partir de cerca de 60 kb a cerca de 80 kb, de a partir de cerca de 80 kb a cerca de 100 kb, de a partir de cerca de 100 kb a cerca de 120 kb, ou de a partir de cerca de 120 kb a 150 kb. 8. O método de qualquer uma das modalidades 1-6, em que a soma total de braços de homologia 5' e 3' do LTVEC é de cerca de 16 kb até cerca de 150 kb. 9. O método de qualquer uma das modalidades 1-8, em que a modificação genética direcionada compreende: (a) a substituição de uma sequência de ácidos nucleicos endógenos de rato com uma sequência de ácido nucléico ortóloga ou homóloga; (b) uma deleção de uma sequência de ácido nucléico de rato endógeno; (c) uma exclusão de uma sequência de ácido nucleico de rato endógeno, em que a exclusão varia de cerca de 5 kb de cerca de 10 kb, de cerca de 10 kb para cerca de 20 kb, de cerca de 20 kb para cerca de 40 kb, de cerca de 40 kb para cerca de 60 kb, de cerca de 60 kb para cerca de 80 kb, de cerca de 80 kb para cerca de 100 kb , de cerca de 100 kb para cerca de 150 kb, ou de cerca de 150 kb para cerca de 200 kb, de cerca de 200 kb para cerca de 300 kb, de cerca de 300 kb para cerca de 400 kb, de cerca de 400 kb para cerca de 500 kb, de cerca de 500 kb para cerca de 1 Mb, de cerca de 1 Mb para cerca de 1,5 Mb, de cerca de 1,5 Mb para cerca de 2 Mb , de cerca de 2 Mb para cerca de 2,5 Mb, ou de cerca de 2,5 Mb para cerca de 3 Mb; (d) uma sequência exógena de ácido nucleico que variam de cerca de 5 kb para cerca de 10 kb, de cerca de 10 kb para cerca de 20 kb, de cerca de 20 kb para cerca de 40 kb, de cerca de 40 kb para cerca de 60 kb, de cerca de 60 kb para cerca de 80 kb, de cerca de 80 kb para cerca de 100 kb, de cerca de 100 kb para cerca de 150 kb , de cerca de 150 kb para cerca de 200 kb, de cerca de 200 kb para cerca de 250 kb, de aproximadamente 250 kb para cerca de 300 kb, de cerca de 300 kb para cerca de 350 kb, ou de cerca de 350 kb para cerca de 400 kb; (e) uma sequência de ácido nucleico exógeno, compreendendo uma sequência de ácido nucléico ortóloga ou homóloga; (f) uma sequência de ácido nucleico quimérico constituída por uma sequência de ácido nucléico do rato e humana; (g) um alelo condicional flanqueado por sequências alvo de recombinase sítio-específicas; ou (h) um gene repórter operavelmente ligado a um promotor ativo na célula de rato. 10. O método de qualquer uma das modalidades 1-9, em que o locus genômico de interesse compreende (i) uma primeira sequência de ácido nucleico que é complementar ao braço de homologia 5' do rato; e (ii) uma segunda sequência de ácido nucleico que é complementar ao braço de homologia 3' do rato. 11. O método da modalidade 10, em que a primeira e a segunda sequência de ácido nucleico são separadas por, pelo menos, 5 kb, mas menos do que 3 MB. 12. O método da modalidade 10, em que a primeira e a segunda sequências de ácido nucleico são separadas por, pelo menos, 5 kb, mas menos do que 10 kb, pelo menos, 10 kb, mas menos do que 20 kb, pelo menos, 20 kb, mas menos do que 40 kb, pelo menos 40 kb, mas menos de 60 kb, pelo menos 60 kb, mas menos de 80 kb, pelo menos cerca de 80 kb, mas menos de 100 kb, pelo menos 100 kb, mas menos de 150 kb, ou, pelo menos, 150 kb, mas menos de 200 KB, pelo menos cerca de 200 kb, mas em menos do que cerca de 300 kb, pelo menos cerca de 300 kb, mas menos do que cerca de 400 kb, pelo menos cerca de 400 kb, mas menos do que cerca de 500 kb, pelo menos cerca de 500 kb, mas menos do que cerca de 1 Mb, pelo menos cerca de 1 MB, mas menos do que cerca de 1,5 Mb, pelo menos cerca de 1,5 MB, mas menos do que cerca de 2 Mb, pelo menos cerca de 2 MB, mas menos do que cerca de 2.5 MB, ou pelo menos cerca de 2,5 MB, mas menos do que cerca de 3 MB. 13. O método de qualquer uma das modalidades 1-12, em que a etapa de introdução (a) compreende ainda a introdução de um segundo ácido nucleico que codifica um agente de nuclease que promove uma recombinação homóloga entre o construto de direcionamento e o locus genômico de interesse na célula pluripotente de rato. 14. O método da modalidade 13, em que o agente de nuclease compreende (a) uma proteína quimérica compreendendo um domínio de ligação ao DNA baseado em dedo de zinco fundido com uma endonuclease de FokI; ou (b) uma proteína quimérica compreendendo uma nuclease efetora como ativador de transcrição (TALEN) fundida a uma endonuclease FokI. 15. O método de qualquer uma das modalidades 1-12, em que a etapa de introdução (a) compreende ainda a introdução na célula pluripotente de rato: (i) um primeiro construto de expressão que compreende um primeiro promotor ligado operativamente a uma primeira sequência de ácido nucleico que codifica uma proteína (CAS) associada a Repetições Palindrômicas Curtas Agregadas e Regularmente Interespaçadas (CRISPR); (ii) um segundo construto de expressão que compreende um segundo promotor ligado operativamente a uma sequência alvo genômica ligada a um RNA guia (gRNA), em que a sequência alvo genômica é imediatamente flanqueada em 3' por uma sequência de Motivo Adjacente Protoespaçador (PAM). 16. O método da modalidade 15, em que o locus genômico de interesse compreende a sequência de nucleotídeo de SEQ ID NO: 1. 17. O método da modalidade 15 ou 16, em que o gRNA compreende uma terceira sequência de ácido nucleico que codifica um RNA (crRNA) de Repetições Palindrômicas Curtas Agregadas e Regularmente Interespaçadas (CRISPR) e um RNA de CRISPR de transativação (tracrRNA). 18. O método da modalidade 15, 16 ou 17, em que a proteína Cas é Cas9. 19. O método da modalidade 15, 16, 17, ou 18, em que o gRNA compreende: (a) o RNA quimérico da sequência de ácido nucleico de SEQ ID NO: 2; ou (b) o RNA quimérico da sequência de ácido nucleico de SEQ ID NO: 3. 20. O método da modalidade 17, em que o crRNA compreende a SEQ ID NO: 4; SEQ ID NO: 5; ou SEQ ID NO: 6. 21. O método da modalidade 17, em que o tracrRNA compreende a SEQ ID NO: 7 ou SEQ ID NO: 8. 22. Um locus genômico de rato modificado compreendendo: (i) uma inserção de uma sequência de ácido nucleico humana ortóloga ou homóloga; (ii) a substituição de uma sequência de ácido nucleico endógeno de rato com a sequência de ácido nucleico humana ortóloga ou homóloga; ou (iii) uma combinação destes, em que o locus genômico de rato modificado é capaz de ser transmitido através da linha germinativa. 23. O locus genômico de rato modificado da modalidade 22, em que o tamanho da inserção ou substituição é de cerca de 5 Kb e cerca de 400 kb. 24. O locus genômico de rato da modalidade 22, em que o tamanho da inserção ou substituição é de cerca de 5 Kb e cerca de 10 kb, a partir de cerca de 10 kb até cerca de 20 kb, a partir de cerca de 20 kb até cerca de 40 kb, a partir de cerca de 40 kb até cerca de 60 kb, a partir de cerca de 60 kb até cerca de 80 kb, a partir de cerca de 80 kb até cerca de 100 kb, de cerca de 100 kb até cerca de 150 kb, de cerca de 150 kb até cerca de 200 kb, de cerca de 200 kb até cerca de 250 kb, de cerca de 250 kb até cerca de 300 kb, de cerca de 300 kb e 350 kb, ou de cerca de 350 kb até cerca de 400 kb. 25. Um método para fazer um rato humanizado, compreendendo: (a) direcionamento a um locus genômico de interesse numa célula pluripotente de rato com um construto de direcionamento compreendendo um ácido nucleico humano, para formar uma célula pluripotente de rato geneticamente modificada; (b) a introdução da célula de rato pluripotente geneticamente modificada em um embrião de rato hospedeiro; e (c) gestação do embrião de rato hospedeiro em uma mãe de aluguel; em que a mãe de aluguel produz progênie de rato compreendendo um locus genômico modificado que compreende: (i) uma inserção de uma sequência de ácido nucleico humana; (ii) a substituição da sequência de ácido nucleico de rato no locus genômico de interesse com uma sequência de ácido nucleico humana ortóloga ou homóloga; (iii) uma sequência de ácido nucleico quimérico que compreende uma sequência de ácido nucleico de rato e humana; ou (iv) uma combinação destes, em que o locus genômico modificado é capaz de ser transmitido através da linha germinativa. 26. O método da modalidade 25, em que o construto de direcionamento é um grande vetor de direcionamento (LTVEC), e a soma total de braços de homologia 5 'e 3' do LTVEC é, pelo menos, 10 kb, mas menos do que 150 kb. 27. Método da modalidade 26, em que a soma total dos braços de homologia 5’ e 3’ do construto de direcionamento é de a partir de cerca de 10 kb a cerca de 30 kb, de a partir de cerca de 20 kb a cerca de 40 kb, de a partir de cerca de 40 kb a cerca de 60 kb, de a partir de cerca de 60 kb a cerca de 80 kb, de a partir de cerca de 80 kb a cerca de 100 kb, de a partir de cerca de 100 kb a cerca de 120 kb, ou de a partir de cerca de 120 kb a cerca de 150 kb. 28. O método da modalidade 25, 26 ou 27, em que a sequência de ácido nucleico humana é de pelo menos 5 kb, mas menos do que 400 kb. 29. O método da modalidade 25, 26, ou 27, em que a sequência de ácido nucleico humana é de pelo menos 5 kb, mas menos do que 10 kb, pelo menos, 10 kb, mas menos do que 20 kb, pelo menos, 20 kb, mas menos do que 40 kb, pelo menos 40 kb, mas menos de 60 kb, pelo menos 60 kb, mas menos de 80 kb, pelo menos cerca de 80 kb, mas menos de 100 kb, pelo menos 100 kb, mas menos de 150 kb, pelo menos 150 kb, mas menos de 200 KB, em menos 200 kb, mas menos de 250 kb, pelo menos 250 kb, mas menos de 300 kb, pelo menos 300 kb, mas menos de 350 kb, ou, pelo menos, 350 kb, mas menos de 400 kb. 30. O método de qualquer uma das modalidades 25-29, em que a célula pluripotente de rato é uma célula-tronco embrionária de rato (ES). 31. O método de qualquer uma das modalidades 25-30, em que a célula pluripotente de rato é derivada de uma cepa DA ou uma cepa ACI. 32. O método de qualquer uma das modalidades 25-31, em que a célula pluripotente de rato é caracterizada pela expressão de pelo menos um marcador de pluripotência que compreende Dnmt3L, Eras, Err-beta, Fbxo15, FGF4, Gdf3, KLF4, LEF1, receptor LIF, Lin28, nanog, Oct4, Sox15, Sox2, Utf1, ou uma combinação dos mesmos. 33. O método de qualquer uma das modalidade 25-31, em que a célula pluripotente de rato é caracterizada por uma ou mais das características seguintes: (a) falta de expressão de um ou mais marcadores de pluripotência que compreendem c-Myc, Ecat1, e/ou Rexo1; (b) a ausência de expressão de um ou mais marcadores mesodermais compreendendo Brachyury e/ou BMPR2; (c) a falta de expressão de um ou mais marcadores da endoderme compreendendo Gata6, Sox17 e/ou Sox7; ou (d) a falta de expressão de um ou mais marcadores neuronais compreendendo nestina e/ou Pax6. 34. Um rato modificado compreendendo o locus genômico humanizado, em que o locus genômico humanizado compreende: (i) uma inserção de uma sequência de ácido nucleico humana homóloga ou ortóloga; (ii) uma substituição de uma sequência de ácido nucleico de rato no locus genômico endógeno com uma sequência de ácido nucleico humana ortóloga ou homóloga; (iii) uma sequência de ácido nucleico quimérico que compreende uma sequência de ácido nucleico de rato e humana; ou (iv) uma combinação destes, em que o locus genômico humanizado é capaz de ser transmitido através da linha germinativa. 35. Um rato ou célula de rato, compreendendo uma modificação genética direcionada no seu locus genômico, em que o locus genômico é um locus de receptor gama de interleucina-2, um locus de ApoE, um locus de Rag1, um locus de Rag2, ou um locus de Rag2/Rag1, em que a modificação genética direcionada compreende: (a) uma deleção de uma sequência de ácido nucleico endógeno de rato no locus genômico; (b) uma inserção de um ácido nucleico homólogo, um ácido nucleico ortólogo ou um ácido nucleico quimérico que compreende uma sequência de ácido nucleico de rato e humana, ou (c) uma combinação destes, em que a modificação genética direcionada é transmissível através da linha germinativa do rato ou um rato propagada a partir da célula de rato. 36. O rato ou célula de rato da modalidade 35, onde (a) a deleção do ácido nucleico endógeno do rato no locus genômico é pelo menos cerca de 10 kb; ou (b) a deleção do ácido nucleico endógeno de rato de no locus genômico é de cerca de 5 kb a cerca de 10 kb, de cerca de 10 kb para cerca de 20 kb, de cerca de 20 kb para cerca de 40 kb, de cerca de 40 kb para cerca de 60 kb, de cerca de 60 kb para cerca de 80 kb, de cerca de 80 kb para cerca de 100 kb , de cerca de 100 kb para cerca de 150 kb, ou de cerca de 150 kb para cerca de 200 kb, de cerca de 200 kb para cerca de 300 kb, de cerca de 300 kb para cerca de 400 kb, de cerca de 400 kb para cerca de 500 kb, de cerca de 500 kb para cerca de 1 Mb, de cerca de 1 Mb para cerca de 1,5 Mb, de cerca de 1,5 Mb para cerca de 2 Mb , de cerca de 2 Mb para cerca de 2,5 Mb, ou de cerca de 2,5 Mb para cerca de 3 Mb; (c) a inserção da sequência do ácido nucleico exógeno no locus genômico é pelo menos cerca de 5 kb; ou(d) a inserção da sequência do ácido nucleico exógeno no locus genômico é de cerca de 5 kb a cerca de 10 kb, de cerca de 10 kb para cerca de 20 kb, de cerca de 20 kb para cerca de 40 kb, de cerca de 40 kb para cerca de 60 kb , de cerca de 60 kb para cerca de 80 kb, de cerca de 80 kb para cerca de 100 kb, de cerca de 100 kb para cerca de 150 kb, de cerca de 150 kb para cerca de 200 kb, de cerca de 200 kb para cerca de 250 kb, de cerca de 250 kb para cerca de 300 kb, de cerca de 300 kb para cerca de 350 kb ou de cerca de 350 kb para cerca de 400 kb. 37. A célula de rato ou rato da modalidade 35 ou 36, em que (a) a modificação genética direcionada no locus de receptor gama de interleucina 2 resulta numa diminuição ou ausência da atividade da proteína do receptor gama de interleucina-2; (b) a modificação genética direcionada no locus de ApoE resulta numa diminuição ou ausência de atividade da proteína ApoE; (c) a modificação genética alvo direcionada no locus deRag1 resulta numa diminuição ou ausência de atividade de proteína Rag1; (d) a modificação genética direcionada no locus de Rag2 resulta numa diminuição ou ausência de atividade de proteína Rag2; ou (e) a modificação genética direcionada no locus de Rag2/Rag1 resulta numa diminuição ou ausência de atividade de proteína de Rag2 e atividade de Rag1. 38. A célula de rato ou rato de modalidade 35, 36, ou 37, em que a modificação genética direcionada do locus do receptor gama de Interleucina-2 compreende: (a) uma deleção da região de codificação do receptor gama de interleucina-2 de rato completa ou uma sua porção; (b) uma substituição da região de codificação do receptor gama de interleucina-2 de rato completa ou uma sua porção com uma região de codificação de receptor gama de interleucina-2 humana região ou uma sua porção; (c) uma substituição de um ecto-domínio da região de codificação do receptor gama de interleucina-2 de rato com o ecto-domínio de um receptor gama da interleucina-2 humana; ou (d) pelo menos uma deleção de 3 kb do locus do receptor gama de Interleucina-2. 39. A célula de rato ou rato de qualquer uma das modalidades 35-37, em que a modificação genética direcionada do locus de ApoE compreende: (a) uma deleção da totalidade da região de codificação de ApoE ou uma sua porção; ou (b) pelo menos uma deleção de 1,8 kb do locus de ApoE compreendendo a região codificadora de ApoE. 40. A célula de rato ou rato de qualquer uma das modalidades 35-37, em que a modificação genética direcionada do locus de Rag2 compreende: (A) uma deleção da totalidade da região codificadora de Rag2 ou uma sua porção; (B) pelo menos uma deleção de 5,7 kb do locus de Rag2 compreendendo a região codificadora deRag2. 41. A célula de rato ou rato de qualquer uma das modalidades 35-37, em que a modificação genética direcionada do locus de Rag2/Rag1 compreende: (A) uma deleção da totalidade da região codificadora deRag2 região ou uma porção da mesma e uma deleção de toda a região codificadora deRag1 ou uma sua porção; ou (b) uma deleção de pelo menos 16 kb do locus de Rag2/Rag1 compreendendo a região codificadora deRag2. 42. A célula de rato ou rato de qualquer uma das modalidades 35-41, em que a modificação genética direcionada compreende uma inserção de um cassete de expressão compreendendo um marcador seletivo no locus do receptor gama de interleucina-2, locus de ApoE locus de Rag1, locus de Rag2 ou locus de Rag2/Rag1. 43. A célula de rato ou rato de qualquer uma das modalidades 42, em que o cassete de expressão compreende um gene lacZ operativamente ligado ao promotor endógeno no locus genômico e um promotor de ubiquitina humana operacionalmente ligado a um marcador seletivo. 44. A célula de rato ou rato de qualquer uma das modalidades 35-43, em que a modificação genética direcionada no locus do receptor gama de interleucina-2, o locus de ApoE, o locus de Rag1, o locus de Rag2 ou o locus de Rag2/Rag1 compreende a inserção de um cassete de seleção de autodeleção. 45. O rato ou célula de rato da modalidade 44, em que o cassete de seleção de autodeleção compreende um gene marcador seletivo operativamente ligado a um promotor ativo na célula de rato e um gene de recombinase ligado operacionalmente a um promotor específico de células germinativas do sexo masculino, em que o cassete de autodeleção é flanqueado por locais de reconhecimento de recombinação reconhecidos pela recombinase. 46. A célula de rato ou rato da modalidade 45, em que (a) o promotor específico de células germinativas masculinas é um promotor de protamina-1; ou (b) o gene de recombinase codifica Cre, e os sítios de reconhecimento de recombinação são sítios loxP. 47. A célula de rato ou rato de qualquer uma das modalidades 35-46, em que a inserção da sequência de ácido nucleico exógeno no locus genômico compreende um ácido nucleico repórter operativamente ligado a um promotor do receptor gama de interleucina-2 endógeno, um promotor endógeno de ApoE, um promotor endógeno de Rag1, ou um promotor endógeno de Rag2. 48. A célula de rato ou rato da realização 47, em que o ácido nucleico repórter codifica um repórter compreendendo β-galactosidase, mPlum, mCherry, tdTomato, mStrawberry, J-Red, DsRed, Morange, MKO, mCitrine, Venus, YPet, proteína fluorescente amarela potenciada (EYFP), Emerald, proteína verde fluorescente potenciada (EGFP), CyPet, proteína fluorescente ciano potenciada (PCP), Cerulean, T-Sapphire, luciferase, fosfatase alcalina, ou uma combinação dos mesmos. 49. A célula de rato de qualquer uma das modalidades 35-48, em que a célula de rato é uma célula de rato pluripotente ou uma célula-tronco de rato embrionária (ES). 50. A célula de rato da modalidade 49, em que a célula de rato pluripotente ou célula-tronco embrionária (ES) de rato (a) é derivada de uma cepa DA ou uma cepa ACI; (b) é caracterizado pela expressão de pelo menos um marcador de pluripotência compreendendo Dnmt3L, Eras, Err-beta, Fbxo15, FGF4, Gdf3, KLF4, LEF1, receptor LIF, Lin28, Nanog, Oct4, Sox15, Sox2, Utf1, ou uma combinação dos mesmos; ou (c), é caracterizada por uma ou mais das seguintes características: (i) falta de expressão de um ou mais marcadores de pluripotência que compreendem c-Myc, Ecat1, e/ou Rexo1; (ii) a ausência de expressão de marcadores mesodermais compreendendo Brachyury e/ou BMPR2; (iii) a falta de expressão de um ou mais marcadores da endoderme compreendendo Gata6, Sox17 e/ou Sox7; ou (iv) a falta de expressão de um ou mais marcadores neuronais compreendendo nestina e/ou Pax6. 51. Um método para a modificação de um locus genômico alvo em um locus do receptor gama de interleucina-2, um locus de ApoE , um locus de Rag1, um locus deRag2 ou um locus de Rag2/Rag1 numa célula de rato pluripotente, o método compreendendo: (a) introduzir na célula de rato pluripotente um vetor de direcionamento compreendendo um ácido nucleico de inserção flanqueado com braços de homologia 5' e 3' de rato homólogos ao locus genômico alvo, (b) a identificação de uma célula pluripotente de rato geneticamente modificada compreendendo uma modificação genética direcionada ao locus genômico alvo, em que a modificação genética alvo é capaz de ser transmitida através de linha germinativa de um rato propagada a partir da célula de rato pluripotente. 52. O método da modalidade 51, em que o vetor de direcionamento é um grande vetor de direcionamento (LTVEC) em que a soma total dos braços de homologia 5' e 3' de rato é pelo menos cerca de 10 kb, mas menos do que cerca de 150 kb. 53. O método da modalidade 51 ou 52, em que a introdução do vetor de direcionamento na célula pluripotente de rato leva a: (i) uma deleção de uma sequência de ácido nucleico endógeno de rato no locus genômico alvo; (ii) uma inserção de uma sequência de ácido nucleico exógeno no locus alvo genômico; ou (iii) uma combinação dos mesmos. 54. O método da modalidade 53, em que (a) a deleção do ácido nucleico endógeno de rato no locus genômico é de, pelo menos, cerca de 10 kb; ou (b) a deleção do ácido nucleico endógeno de rato no locus genômico é de cerca de 5 kb até cerca de 10 kb, a partir de cerca de 10 kb até cerca de 20 kb, a partir de cerca de 20 kb até cerca de 40 kb, a partir de cerca de 40 kb até cerca de 60 kb, a partir de cerca de 60 kb até cerca de 80 kb, a partir de cerca de 80 kb de cerca de 100 kb, de cerca de 100 kb até cerca de 150 kb, ou de cerca de 150 kb até cerca de 200 kb, de cerca de 200 kb até cerca de 300 kb, de cerca de 300 kb até cerca de 400 kb, de cerca de 400 kb até cerca de 500 kb, a partir de cerca de 500 kb e cerca de 1 Mb, desde cerca de 1 Mb a cerca de 1,5 Mb, desde cerca de 1,5 a cerca de 2 Mb, desde cerca de 2 Mb a cerca de 2.5 MB, ou de cerca de 2.5 MB a cerca de 3 Mb; (c) a inserção da sequência de ácido nucleico exógeno no locus genômico é de, pelo menos, cerca de 5 kb; ou (d) a inserção da sequência de ácido nucleico exógeno no locus genômico é a partir de cerca de 5 kb até cerca de 10 kb, a partir de cerca de 10 kb até cerca de 20 kb, a partir de cerca de 20 kb até cerca de 40 kb, a partir de cerca de 40 kb até cerca de 60 kb, a partir de cerca de 60 kb até cerca de 80 kb, a partir de cerca de 80 kb de cerca de 100 kb, de cerca de 100 kb até cerca de 150 kb, de cerca de 150 kb até cerca de 200 kb, de cerca de 200 kb até cerca de 250 kb, de cerca de 250 kb até cerca de 300 kb, de cerca de 300 kb e 350 kb, ou a partir de cerca de 350 kb até cerca de 400 kb. 55. O método de qualquer uma das modalidade 51-54, em que (a) a modificação genética direcionada no locus do receptor gama de Interleucina-2 resulta em uma diminuição ou ausência de atividade de proteína de receptor gama de interleucina-2; (b) a modificação genética direcionada no locus de ApoE resulta numa diminuição ou ausência de atividade da proteína ApoE; (c) a modificação genética direcionada no locus de Rag1 resulta numa diminuição ou ausência de atividade de proteína Rag1; (d) a modificação genética direcionada no locus Rag2 resulta numa diminuição ou ausência de atividade de proteína Rag2; ou (e), a modificação genética no locus deRag2/Rag1 resulta numa diminuição ou ausência de atividade de proteína Rag2 e atividade da proteína Rag1. 56. O método de qualquer uma das modalidade 51-54, em que a modificação genética direcionada do locus do receptor gama de Interleucina-2 compreende (a) uma deleção da região codificadora de receptor gama de interleucina 2 de rato inteira ou uma parte da mesma; (b) uma substituição de deleção da região codificadora de receptor gama de interleucina 2 de rato inteira ou uma parte da mesma com uma região codificadora de receptor gama de interleucina-2 humana ou uma sua porção; (c) uma substituição de um ecto-domínio da região codificadora de receptor gama de Interleucina-2 de rato com o ecto-domínio de um receptor gama de interleucina-2 humana; ou (d) pelo menos uma deleção de 3 kb do locus do receptor gama de interleucina-2 que compreende a região de codificação do receptor gama de Interleucina-2. 57. O Método de qualquer uma das modalidades 51-55, em que a modificação genética direcionada do locus de ApoE compreende: (a) uma deleção da totalidade da região de codificação de ApoE ou uma sua porção; ou (b) pelo menos uma deleção de 1,8 kb do locus de ApoE compreendendo a região codificadora de ApoE. 58. O método de qualquer uma das modalidades 51-55, em que a modificação genética direcionada do locus de Rag2 compreende: (a) uma deleção da totalidade da região codificadora deRag2 ou uma sua porção; (b) pelo menos uma deleção de 5,7 kb do locus de Rag2 compreendendo a região codificadora de Rag2. 59. O método de qualquer uma das modalidades 51-55, em que a modificação genética direcionada do locus de Rag1/Rag2 compreende: (a) uma deleção da totalidade da região codificadora de Rag2 ou uma porção da mesma e uma deleção de toda a região codificadora de Rag1 ou uma sua porção; ou (b) uma deleção de pelo menos 16 kb do locus de Rag2/Rag1 compreendendo as regiões codificadoras de Rag2 e Rag1. 60. O método de qualquer uma das modalidades 51-59, em que o ácido nucleico de inserção compreende um cassete de expressão compreendendo um polinucleotídeo que codifica um marcador seletivo. 61. O método da modalidade 60, em que o cassete de expressão compreende um gene lacZ operativamente ligado a um promotor endógeno no locus genômico e um promotor de ubiquitina humana operativamente ligado a um gene de marcador seletivo. 62. O método de qualquer uma das modalidades 51-60, em que o ácido nucleico de inserção compreende um cassete de seleção de autodeleção. 63. O método da modalidade 62, em que o cassete de seleção de autodeleção compreende um marcador seletivo operativamente ligado a um promotor ativo na célula de rato pluripotente um polinucleotídeo codificando uma recombinase ligada operacionalmente a um promotor específico de células germinativas masculinas, em que o cassete de autodeleção é flanqueado por sítios de reconhecimento de recombinação reconhecidos pela recombinase. 64. O método da modalidade 63, em que (a) o promotor específico de células germinativas masculinas é um promotor de protamina-1; ou (b) o gene de recombinase codifica Cre, e os sítios de reconhecimento de recombinação são sítios loxP. 65. O método da modalidade 53, em que em que a inserção da sequência de ácido nucleico exógeno no locus genômico compreende uma sequência de ácido nucleico repórter operativamente ligado a um promotor do receptor gama de interleucina-2 endógeno, um promotor endógeno de ApoE, um promotor endógeno de Rag1, ou um promotor endógeno de Rag2. 66. O método da modalidade 65, em que a sequência de ácido nucleico repórter codifica um repórter compreendendo β-galactosidase, mPlum, mCherry, tdTomato, mStrawberry, J-Red, DsRed, Morange, MKO, mCitrine, Venus, YPet, proteína fluorescente amarela potenciada (EYFP), Emerald, proteína verde fluorescente potenciada (EGFP), CyPet, proteína fluorescente ciano potenciada (PCP), Cerulean, T-Sapphire, luciferase, fosfatase alcalina, ou uma combinação dos mesmos. 67. O método de qualquer uma das modalidades 51-66, em que a célula de rato pluripotente é uma célula-tronco embrionária (ES) de rato. 68. O método de qualquer uma das modalidade 51-67, em que a célula pluripotente de rato (a) é derivada de uma cepa DA ou uma cepa ACI; ou (b) é caracterizada pela expressão de um marcador de pluripotência que compreende Oct-4, Sox-2, fosfatase alcalina, ou uma combinação destes; ou (c) é caracterizada por uma ou mais das seguintes características: (i) falta de expressão de um ou mais marcadores de pluripotência que compreendem c-Myc, Ecat1, e/ou Rexo1; (ii) a ausência de expressão de marcadores mesodermais compreendendo Brachyury e/ou BMPR2; (iii) a falta de expressão de um ou mais marcadores da endoderme compreendendo Gata6, Sox17 e/ou Sox7; ou (iv) a falta de expressão de um ou mais marcadores neuronais compreendendo nestina e/ou Pax6. 69. O método de qualquer uma das modalidades 51-68, compreendendo ainda a identificação da modificação genética direcionada no locus genômico alvo, em que a etapa de identificação emprega um ensaio quantitativo para avaliar uma modificação do alelo (MOA) no locus genômico alvo. 70. O método de qualquer uma das modalidades 51-69, em que a etapa de introdução (a) compreende ainda a introdução de um segundo ácido nucleico que codifica um agente de nuclease que promove uma recombinação homóloga entre o vetor de direcionamento e o locus genômico alvo na célula pluripotente de rato. 71. O método da modalidade 70, em que o agente de nuclease compreende uma proteína quimérica compreendendo um domínio de ligação de DNA com base em dedo de zinco fundido a uma endonuclease de FokI. 72. O método da modalidade 71, em que o processo resulta na modificação bialélica do locus genômico alvo. 73. O método de qualquer uma das modalidade 51-70, em que a etapa de introdução (a) ainda compreende introduzir na célula de rato pluripotente: (i) um primeiro construto de expressão que compreende um primeiro promotor ligado operativamente a uma primeira sequência de ácido nucleico que codifica uma proteína (CAS) associada a Repetições Palindrômicas Curtas Agregadas e Regularmente Interespaçadas (CRISPR); (ii) um segundo construto de expressão que compreende um segundo promotor ligado operativamente a uma sequência alvo genômica ligada a um RNA guia (gRNA), em que a sequência alvo genômica é imediatamente flanqueada em 3' por uma sequência de Motivo Adjacente Protoespaçador (PAM). 74. O método da modalidade 73, em que o locus genômico de interesse compreende a sequência de nucleotídeo de SEQ ID NO: 1. 75. O método da modalidade 73 ou 74, em que o gRNA compreende uma terceira sequência de ácido nucleico que codifica um RNA (crRNA) de Repetições Palindrômicas Curtas Agregadas e Regularmente Interespaçadas (CRISPR) e um CRISPR de RNA de transativação (tracrRNA). 76. O método da modalidade 73, em que a proteína Cas é Cas9. 77. O método da modalidade 73, 74, ou 75, em que o gRNA compreende: (a) o RNA quimérico da sequência de ácido nucleico de SEQ ID NO: 2; ou (b) o RNA quimérico da sequência de ácido nucleico de SEQ ID NO: 3. 78. O método da modalidade 75, em que o crRNA compreende a SEQ ID NO: 4; SEQ ID NO: 5; ou SEQ ID NO: 6. 79. O método da modalidade 75, em que o tracrRNA compreende a SEQ ID NO: 7 ou SEQ ID NO: 8. 80. A célula de rato ou rato de qualquer uma das modalidades 35-50, em que a célula de rato ou rato compreende modificações genéticas direcionadas no locus do receptor gama de interleucina-2, locus de ApoE, locus de Rag1, locus de Rag2 e/ou locus de Rag2/Rag1. 81. A célula de rato ou rato de modalidade 80, em que a célula de rato ou rato compreende modificações genéticas direcionadas no locus do receptor gama de interleucina-2 e o locus de Rag2/Rag1.
[00491] Modalidades não limitantes adicionais incluem: 1. Um método para a modificação de um locus genômico de interesse numa célula eucariótica, compreendendo: (a) introduzir na célula eucariótica: (i) um vetor de direcionamento grande (LTVEC) que compreende um primeiro ácido nucleico flanqueado por um braço de homologia 5' e um braço de homologia 3', em que o LTVEC é de, pelo menos, 10 kb; (ii) um construto de primeira expressão que compreende um primeiro promotor ligado operativamente a um segundo ácido nucleico que codifica uma proteína Cas, (iii) um segundo construto de expressão que compreende um segundo promotor ligado operativamente a um terceiro ácido nucleico que codifica um RNA guia (gRNA), que compreende um sequência de nucleotídeos que hibridiza uma sequência alvo e um RNA de CRISPR (tracrRNA) de transativação, em que o primeiro e o segundo promotores são ativos na célula eucariótica; e (b) a identificação de uma célula eucariótica modificada que compreende uma modificação genética direcionada no locus genômico de interesse. 2. O método da modalidade 1, em que a modificação genética direcionada é uma modificação genética bialélica. 3. O método da modalidade 1, em que o LTVEC é pelo menos 15 kb, pelo menos 20 kb, pelo menos 30 kb, pelo menos 40 kb, pelo menos 50 kb, pelo menos 60 kb, pelo menos 70 kb, pelo menos 80 kb, ou pelo menos 90 kb. 4. O método da modalidade 1, em que o LTVEC é pelo menos 100 kb, pelo menos 150 kb, ou pelo menos 200 kb. 5. O método da modalidade 1, em que a célula eucariótica é uma célula de mamífero. 6. O método da modalidade 5, em que a célula de mamífero é um fibroblasto. 7. O método da modalidade 1, em que a célula eucariótica é uma célula pluripotente. 8. O método da modalidade 7, em que a célula pluripotente é uma célula pluripotente humana. 9. O método da modalidade 8, em que a célula pluripotente humana é uma célula-tronco embrionária humana (ES) ou uma célula-tronco adulta humana. 10. O método da modalidade 8, em que a célula pluripotente humana é uma célula progenitora humana de desenvolvimento restrito. 11. O método da modalidade 8, em que a célula pluripotente humana é uma célula-tronco humana induzida pluripotente (iPS). 12. O método da modalidade 1, em que a proteína Cas é Cas9. 13. O método da modalidade 1, em que a sequência alvo está imediatamente flanqueada na extremidade 3 'por uma sequência do motivo adjacente ao protoespaçador (PAM). 14. O método da modalidade 1, em que a soma total de braços de homologia 5' e 3' é de cerca de 10 kb até cerca de 150 kb. 15. O método da modalidade 1, em que a soma total dos braços de homologia 5’ e 3’ do LTVEC é de a partir de cerca de 10 kb a cerca de 20 kb, de a partir de cerca de 20 kb a cerca de 40 kb, de a partir de cerca de 40 kb a cerca de 60 kb, de a partir de cerca de 60 kb a cerca de 80 kb, de a partir de cerca de 80 kb a cerca de 100 kb, de a partir de cerca de 100 kb a cerca de 120 kb, ou de a partir de cerca de 120 kb a 150 kb. 16. O método da modalidade 1, onde a modificação genética direcionada compreende: (a) uma substituição de uma sequência de ácido nucleico endógeno com uma sequência de ácido nucléico ortóloga ou homóloga; (b) uma deleção de uma sequência de ácido nucleico endógeno; (c) uma deleção de uma sequência de ácido nucleico endógeno, em que a deleção varia de cerca de 5 kb de cerca de 10 kb, de cerca de 10 kb para cerca de 20 kb, de cerca de 20 kb para cerca de 40 kb, de cerca de 40 kb para cerca de 60 kb, de cerca de 60 kb para cerca de 80 kb, de cerca de 80 kb para cerca de 100 kb , de cerca de 100 kb para cerca de 150 kb, ou de cerca de 150 kb para cerca de 200 kb, de cerca de 200 kb para cerca de 300 kb, de cerca de 300 kb para cerca de 400 kb, de cerca de 400 kb para cerca de 500 kb, de cerca de 500 kb para cerca de 1 Mb, de cerca de 1 Mb para cerca de 1,5 Mb, de cerca de 1,5 Mb para cerca de 2 Mb , de cerca de 2 Mb para cerca de 2,5 Mb, ou de cerca de 2,5 Mb para cerca de 3 Mb; (d) a inserção de uma sequência do ácido nucleico exógeno; (e) a inserção de uma sequência do ácido nucleico exógeno variando de cerca de 5 kb a cerca de 10 kb, de cerca de 10 kb para cerca de 20 kb, de cerca de 20 kb para cerca de 40 kb, de cerca de 40 kb para cerca de 60 kb, de cerca de 60 kb para cerca de 80 kb, de cerca de 80 kb para cerca de 100 kb, de cerca de 100 kb para cerca de 150 kb , de cerca de 150 kb para cerca de 200 kb, de cerca de 200 kb para cerca de 250 kb, de aproximadamente 250 kb para cerca de 300 kb, de cerca de 300 kb para cerca de 350 kb, ou de cerca de 350 kb para cerca de 400 kb; (f) a inserção de uma sequência do ácido nucleico exógeno compreendendo uma sequência de ácido nucleico ortólogo ou homólogo; (g) a inserção de uma sequência de ácido nucleico quimérico que compreende uma sequência de ácido nucleico não-humano e humano; (h) a inserção de um alelo condicional flanqueado com sequências alvo de recombinase sítio-específicas; (i) a inserção de um marcador selecionável ou um gene repórter operacionalmente ligado a um terceiro promotor ativo na célula pluripotente; ou (j) uma combinação dos mesmos. 17. O método da modalidade 1, em que o locus genômico de interesse compreende (i) uma sequência alvo 5' que é homóloga à porção de homologia 5'; e (ii) uma sequência alvo 3' que é homóloga à porção de homologia 3'. 18. O método da modalidade 17, em que de que a sequência direcionada 5’ e a sequência direcionada 3’ são separadas por pelo menos 5 kb, mas menos do que 3 Mb. 19. O método da modalidade 17, em que a sequência direcionada 5’ e a sequência direcionada 3’ são separadas por pelo menos 5 kb mas menos do que 10 kb, pelo menos 10 kb mas menos do que 20 kb, pelo menos 20 kb mas menos do que 40 kb, pelo menos 40 kb mas menos do que 60 kb, pelo menos 60 kb mas menos do que 80 kb, pelo menos cerca de 80 kb mas menos do que 100 kb, pelo menos 100 kb mas menos do que 150 kb, ou pelo menos 150 kb mas menos do que 200 kb, pelo menos cerca de 200 kb mas menos do que cerca de 300 kb, pelo menos cerca de 300 kb mas menos do que cerca de 400 kb, pelo menos cerca de 400 kb mas menos do que cerca de 500 kb, pelo menos cerca de 500 kb mas menos do que cerca de 1Mb, pelo menos cerca de 1 Mb mas menos do que cerca de 1.5 Mb, pelo menos cerca de 1.5 Mb mas menos do que cerca de 2 Mb, pelo menos cerca de 2 Mb mas menos do que cerca de 2.5 Mb, ou pelo menos cerca de 2.5 Mb mas menos do que cerca de 3 Mb. 20. O método da modalidade 1, em que o locus genômico de interesse compreende o local do receptor gama de interleucina-2, o local ApoE, o local Rag1, o local Rag2 ou ambos locais Rag1 e Rag2. 21. O método, de acordo com a modalidade 1, onde o primeiro e o segundo construto de expressão são em uma molécula de ácido nucleico simples. 22. Um método para modificar um genoma, que compreende a exposição do genoma a uma proteína Cas e um RNA de CRISPR na presença de um vetor de direcionamento grande (LTVEC) que compreende uma sequência de ácido nucleico de pelo menos 10 kb, em que, após a exposição à CAS proteína, ao RNA de CRISPR e ao LTVEC, o genoma é modificado para conter, pelo menos, 10 kb de sequência de ácido nucleico. 23. O método da modalidade 22, em que o LTVEC compreende uma sequência de ácido nucleico de pelo menos 20 kb, pelo menos, 30 kb, pelo menos 40 kb, pelo menos 50 kb, pelo menos 60 kb, pelo menos 70 kb, pelo menos 80 kb ou pelo menos 90 kb. 24. O método da modalidade 22, em que o LTVEC compreende uma sequência de ácidos nucleicos de pelo menos 100 kb, pelo menos 150 kb ou pelo menos 200 kb. 25. Um método para modificar um genoma, que compreende o contato do genoma com uma proteína Cas, um RNA de CRISPR que hibridiza com uma sequência alvo, e um tracrRNA na presença de um vetor de direcionamento grande (LVTEC), em que o LVTEC tem pelo menos 10 kb e compreende um primeiro ácido nucleico flanqueado com um braço de homologia 5' e um braço de homologia 3', em que após o contato com a proteína Cas, RNA de CRISPR e tracrRNA na presença do LTVEC, o genoma é modificado num local genômico de interesse para conter o primeiro ácido nucleico. 26. O método da modalidade 25, em que o genoma está numa célula eucariótica, e a proteína Cas, o RNA CRISPR, o tracrRNA, e o LTVEC são introduzidos na célula eucariótica. 27. O método da modalidade 26, compreendendo ainda a identificação de uma célula eucariótica modificada compreendendo uma modificação genética direcionada no locus genômico de interesse. 28. O método da modalidade 26 ou 27, em que o RNA CRISPR e o tracrRNA são introduzidos em conjunto na forma de um único RNA guia (gRNA). 29. Um método, de acordo com a modalidade 26 ou 27, onde o RNA CRISPR e o tracrRNA são introduzidos separadamente. 30. O método de qualquer uma das modalidades 26-29, em que: (a) a proteína Cas é introduzida na célula eucariótica sob a forma de uma proteína, um RNA mensageiro (mRNA) que codifica a proteína Cas ou um DNA que codifica a proteína Cas; (b) o RNA CRISPR é introduzido na célula eucariótica sob a forma de um RNA ou um DNA que codifica o RNA CRISPR; e (c) o tracrRNA é introduzido na célula eucariótica sob a forma de um RNA ou um DNA que codifica o tracrRNA. 31. O método de acordo com a modalidade 30, onde a proteína Cas, o RNA de CRISPR, e o tracrRNA são introduzidos na célula eucariótica como um complexo proteína-RNA. 32. O método da modalidade 30, onde: (a) o DNA que codifica a proteína CAS está na forma de uma construção de expressão que compreende um primeiro promotor ligado operativamente a um segundo ácido nucleico que codifica a proteína Cas; (b) o DNA que codifica o RNA de CRISPR tem a forma de uma segunda construção de expressão que compreende um segundo promotor ligado operativamente a um terceiro ácido nucleico que codifica o RNA CRISPR; e (c) o DNA que codifica o tracrRNA está na forma de uma construção de expressão que compreende um terceiro promotor ligado operativamente a um quarto ácido nucleico que codifica o tracrRNA, em que o primeiro, segundo e terceiro promotores estão ativos na célula eucariótica. 33. O método, de acordo com a reivindicação 32, onde o primeiro, segundo e/ou o terceiro construtos de expressão são em uma molécula de ácido nucleico simples. 34. O método da modalidade 30, onde: (a) o DNA que codifica a proteína CAS está na forma de uma construção de expressão que compreende em primeiro lugar um primeiro promotor ligado operativamente a um segundo ácido nucleico que codifica a proteína Cas; e (b) o DNA que codifica o RNA de CRISPR e o DNA que codifica o tracrRNA estão sob a forma de uma segunda construção de expressão que compreende um segundo promotor ligado operativamente a um terceiro ácido nucleico que codifica um RNA que compreende o gRNA CRISPR e o tracrRNA; em que os primeiro e segundo promotores estão ativos na célula eucariótica. 35. O método, de acordo com a modalidade 34, onde o primeiro e o segundo construto de expressão são em uma molécula de ácido nucleico simples. 36. O método, de acordo com qualquer uma das modalidades 27-35, onde a modificação genética direcionada compreende supressão simultânea de uma sequência de ácido nucleico endógena no locus genômico de interesse e inserção do primeiro ácido nucleico no locus genômico de interesse. 37. O método de acordo com uma das modalidades 27-36, onde a modificação genética alvejada é uma modificação genética bialélica. 38. O método, de acordo com a modalidade 37, onde a modificação genética bialélica compreende supressão de uma sequência de ácido nucleico endógena e inserção do primeiro ácido nucleico no locus genômico de interesse em dois cromossomos homólogos. 39. O método de qualquer uma das modalidades 27-36, em que a célula eucariótica modificada é homozigótica no locus genômico de interesse. 40. O método da modalidade 39, em que a modificação genética direcionada no locus genômico de interesse em um cromossomo compreende supressão de uma sequência de ácido nucleico endógena e inserção do primeiro ácido nucleico. 41. O método da modalidade 39, onde a modificação genética direcionada compreende: (1) a exclusão de uma sequência de ácido nucleico endógena no locus genômico de interesse em dois cromossomos homólogos; e (2) a inserção do primeiro ácido nucleico no locus genômico de interesse no primeiro cromossomo e rompimento do locus genômico de interesse no segundo cromossomo. 42. O método de qualquer modalidade 25-41, em que o LTVEC é pelo menos 15 kb, pelo menos 20 kb, pelo menos 30 kb, pelo menos 40 kb, pelo menos 50 kb, pelo menos 60 kb, pelo menos 70 kb, pelo menos 80 kb, ou pelo menos 90 kb. 43. O método de qualquer uma das modalidades 25-42, em que o LTVEC é pelo menos 100 kb, pelo menos 150 kb, ou pelo menos 200 kb. 44. O método de qualquer uma das modalidades 25-43, em que o primeiro ácido nucleico é de pelo menos 20 kb, pelo menos 30 kb, pelo menos, 40 kb, pelo menos 50 kb, pelo menos 60 kb, pelo menos 70 kb, pelo menos 80 kb, pelo menos 90 kb, pelo menos 100 kb, pelo menos 150 kb, pelo menos 200 kb, pelo menos 250 kb, ou pelo menos 300 kb. 45. O método de qualquer uma das modalidades 26-44, em que a célula eucariótica é uma célula de mamífero. 46. O método da modalidade 45, em que a célula de mamífero é um fibroblasto. 47. O método de qualquer uma das modalidades 26-43, em que a célula eucariótica é uma célula pluripotente. 48. O método da modalidade 47, em que a célula pluripotente é uma célula pluripotente humana. 49. O método da modalidade 48, em que a célula pluripotente não humana é uma célula pluripotente de roedor. 50. O método da modalidade 49, em que a célula pluripotente de roedor é uma célula-tronco de camundongo ou rato embrionária (ES). 51. O método da modalidade 47, em que a célula pluripotente é uma célula pluripotente humana. 52. O método da modalidade 51, em que a célula pluripotente humana é uma célula-tronco embrionária humana (ES) ou uma célula-tronco adulta humana. 53. O método da modalidade 51, em que a célula pluripotente humana é uma célula progenitora humana de desenvolvimento restrito. 54. O método da modalidade 51, em que a célula pluripotente humana é uma célula-tronco humana induzida pluripotente (iPS). 55. O método de qualquer uma das modalidades 25-54, em que a proteína Cas é Cas9. 56. O método de qualquer uma das modalidades 25-55, em que a sequência alvo está imediatamente flanqueada por uma sequência do Motivo Adjacente de Protoespaçador (PAM). 57. O método de qualquer uma das modalidades 25-56, em que a soma total de braços de homologia 5' e 3' do LTVEC é de cerca de 10 kb até cerca de 150 kb. 58. O método de qualquer uma das modalidades 25-57, em que a soma total dos braços de homologia 5’ e 3’ do LTVEC é de a partir de cerca de 10 kb a cerca de 20 kb, de a partir de cerca de 20 kb a cerca de 40 kb, de a partir de cerca de 40 kb a cerca de 60 kb, de a partir de cerca de 60 kb a cerca de 80 kb, de a partir de cerca de 80 kb a cerca de 100 kb, de a partir de cerca de 100 kb a cerca de 120 kb, ou de a partir de cerca de 120 kb a 150 kb. 59. O método de qualquer uma das modalidades 27-58, em que a modificação genética direcionada compreende: (a) uma substituição de uma sequência de ácido nucleico endógeno com uma sequência de ácido nucléico ortóloga ou homóloga; (b) uma deleção de uma sequência de ácidos nucleicos endógenos; (c) uma deleção de uma sequência de ácidos nucleicos endógenos, em que a deleção varia de cerca de 5 kb a cerca de 10 kb, de cerca de 10 kb para cerca de 20 kb, de cerca de 20 kb para cerca de 40 kb, de cerca de 40 kb para cerca de 60 kb, de cerca de 60 kb para cerca de 80 kb, de cerca de 80 kb para cerca de 100 kb , de cerca de 100 kb para cerca de 150 kb, ou de cerca de 150 kb para cerca de 200 kb, de cerca de 200 kb para cerca de 300 kb, de cerca de 300 kb para cerca de 400 kb, de cerca de 400 kb para cerca de 500 kb, de cerca de 500 kb para cerca de 1 Mb, de cerca de 1 Mb para cerca de 1,5 Mb, de cerca de 1,5 Mb para cerca de 2 Mb, de cerca de 2 Mb para cerca de 2,5 Mb, ou de cerca de 2,5 Mb para cerca de 3 Mb; (d) a inserção de uma sequência do ácido nucleico exógeno; (e) a inserção de uma sequência do ácido nucleico exógeno variando de cerca de 5kb a cerca de 10 kb, de cerca de 10 kb para cerca de 20 kb, de cerca de 20 kb para cerca de 40 kb, de cerca de 40 kb para cerca de 60 kb, de cerca de 60 kb para cerca de 80 kb, de cerca de 80 kb para cerca de 100 kb, de cerca de 100 kb para cerca de 150 kb , de cerca de 150 kb para cerca de 200 kb, de cerca de 200 kb para cerca de 250 kb, de cerca de 250 kb para cerca de 300 kb, de cerca de 300 kb para cerca de 350 kb, ou de cerca de 350 kb para cerca de 400 kb; (f) a inserção de uma sequência de ácido nucleico exógeno, compreendendo uma sequência de ácido nucléico ortóloga ou homóloga; (g) a inserção de uma sequência de ácido nucleico quimérico compreendendo uma sequência de ácido nucleico não humana e humana; (h) a inserção de um alelo condicional flanqueado com sequências alvo de recombinase sítio-específicas; (i) a inserção de um marcador de seleção ou um gene repórter operacionalmente ligado a um terceiro promotor ativo na célula pluripotente; ou (j) uma combinação dos mesmos. 60. O método de acordo com qualquer modalidade 25-59, em que o locus genômico de interesse compreende (i) uma sequência alvo 5' que é homóloga à porção de homologia 5'; e (ii) uma sequência alvo 3' que é homóloga à porção de homologia 3'. 61. O método da modalidade 60, em que de que a sequência direcionada 5’ e a sequência direcionada 3’ são separadas por pelo menos 5 kb, mas menos do que 3 Mb. 62. O método da modalidade 60, em que a sequência direcionada 5’ e a sequência direcionada 3’ são separadas por pelo menos 5 kb mas menos do que 10 kb, pelo menos 10 kb mas menos do que 20 kb, pelo menos 20 kb mas menos do que 40 kb, pelo menos 40 kb mas menos do que 60 kb, pelo menos 60 kb mas menos do que 80 kb, pelo menos cerca de 80 kb mas menos do que 100 kb, pelo menos 100 kb mas menos do que 150 kb, ou pelo menos 150 kb mas menos do que 200 kb, pelo menos cerca de 200 kb mas menos do que cerca de 300 kb, pelo menos cerca de 300 kb mas menos do que cerca de 400 kb, pelo menos cerca de 400 kb mas menos do que cerca de 500 kb, pelo menos cerca de 500 kb mas menos do que cerca de 1Mb, pelo menos cerca de 1 Mb mas menos do que cerca de 1.5 Mb, pelo menos cerca de 1.5 Mb mas menos do que cerca de 2 Mb, pelo menos cerca de 2 Mb mas menos do que cerca de 2,5 Mb, ou pelo menos cerca de 2,5 Mb mas menos do que cerca de 3 Mb. 63. O método da modalidade 60, em que a sequência alvo 5' e a sequência alvo 3' são separadas por, pelo menos, 20 kb, pelo menos 30 kb, pelo menos 40 kb, pelo menos 50 kb, pelo menos 60 kb, pelo menos 70 kb, pelo menos 80 kb, pelo menos 90 kb, pelo menos 100 kb, pelo menos 110 kb, pelo menos 120 kb, pelo menos 130 kb, pelo menos 140 kb, pelo menos 150 kb, pelo menos 160 kb, pelo menos 170 kb, pelo menos 180 kb, pelo menos 190 kb, ou pelo menos 200 kb. 64. O método de qualquer modalidade 25-63, em que o locus genômico de interesse compreende o local do receptor gama de interleucina- 2, o local ApoE, o local Rag1, o local Rag2 ou ambos locais Rag1 e Rag2. 65. O método de qualquer uma das modalidades 25-63, em que o locus genômico de interesse compreende o locus de Adamts5, o locus de TRPA1, o locus de Folh1, ou o locus de ErbB4. 66. O método de qualquer uma das modalidades 25-63, em que o locus genômico de interesse compreende o locus de Lrp5. 67. Um método para produção de um animal não-humano de geração F0 que compreende uma modificação genômica direcionada em um locus genômico de interesse, o método compreende: (a) contatar o genoma de uma célula ES não humana com uma proteína Cas, um RNA CRISPR e um tracrRNA na presença de um vetor de direcionamento grande (LTVEC) para formar uma célula ES não humana modificada, em que o LTVEC tem pelo menos 10 kb e compreende um primeiro ácido nucleico flanqueado por um braço de homologia 5' e um braço de homologia 3'; (b) identificar a célula ES não humana modificada que compreende a modificação genética direcionada no locus genômico de interesse; (c) a introdução da célula ES não humana modificada num embrião hospedeiro não humano; e (d) gestar o embrião hospedeiro não humano em uma mãe substituta, em que a mãe substituta produz o animal não-humano de geração F0 que compreende a modificação genética direcionada no locus genômico de interesse. 68. O método da modalidade 67, em que o RNA CRISPR e o tracrRNA são introduzidos em conjunto na forma de um único RNA guia (gRNA). 69. Um método, de acordo com a modalidade 67, onde o RNA CRISPR e o tracrRNA são introduzidos separadamente. 70. O método de acordo com alguma das modalidades 67-69, onde: (a) a proteína Cas é introduzida na célula ES não humana sob a forma de uma proteína, um RNA mensageiro (mRNA) que codifica a proteína Cas ou um DNA que codifica a proteína Cas; (B) o RNA CRISPR é introduzido na célula ES não humana sob a forma de um RNA ou um DNA que codifica o RNA CRISPR; e (c) o tracrRNA é introduzido na célula ES não humana sob a forma de um RNA ou um DNA que codifica o tracrRNA. 71. O método de acordo com a modalidade 70, onde a proteína Cas, o RNA CRISPR, e o tracrRNA são introduzidos na célula ES não humana como uma complexo proteína-RNA. 72. O método da modalidade 70, onde: (a) o DNA que codifica a proteína CAS está na forma de uma construção de expressão que compreende um primeiro promotor ligado operativamente a um segundo ácido nucleico que codifica a proteína Cas; (b) o DNA que codifica o RNA CRISPR tem a forma de uma segunda construção de expressão que compreende um segundo promotor ligado operativamente a um terceiro ácido nucleico que codifica o RNA CRISPR; e (c) o DNA que codifica o tracrRNA está na forma de uma construção de expressão que compreende um terceiro promotor ligado operativamente a um quarto ácido nucleico que codifica o tracrRNA, em que o primeiro, segundo e terceiro promotores estão ativos na célula ES não humana. 73. O método, de acordo com a reivindicação 72, onde o primeiro, segundo e o terceiro construto de expressão são em uma molécula de ácido nucleico simples. 74. O método da modalidade 70, onde: (a) o DNA que codifica a proteína CAS está na forma de uma construção de expressão que compreende em primeiro lugar um primeiro promotor ligado operativamente a um segundo ácido nucleico que codifica a proteína Cas; e (b) o DNA que codifica o RNA CRISPR e o DNA que codifica o tracrRNA estão sob a forma de uma segunda construção de expressão que compreende um segundo promotor ligado operativamente a um terceiro ácido nucleico que codifica um RNA que compreende o gRNA CRISPR e o tracrRNA; em que os primeiro e segundo promotores estão ativos na célula ES não humana. 75. O método, de acordo com a modalidade 74, onde o primeiro e o segundo construto de expressão são em uma molécula de ácido nucleico simples. 76. O método, de acordo com qualquer uma das modalidades 67-75, onde a modificação genética direcionada compreende supressão simultânea de uma sequência de ácido nucleico endógena no lócus genômico de interesse e inserção do primeiro ácido nucleico no lócus genômico de interesse. 77. O método de acordo com uma das modalidades 67-76, onde a modificação genética alvejada é uma modificação genética bialélica. 78. O método, de acordo com a modalidade 77, onde a modificação genética bialélica compreende supressão de uma sequência de ácido nucleico endógena e inserção do primeiro ácido nucleico no lócus genômico de interesse em dois cromossomos homólogos. 79. O método de qualquer uma das modalidades 67-76, onde a célula ES não humana modificada é hemizigótica no local genômico de interesse. 80. O método, de acordo com a modalidade 79, onde a modificação genética direcionada no lócus genômico de interesse em um cromossomo compreende supressão de uma sequência de ácido nucleico endógena e inserção do primeiro ácido nucleico. 81. O método de acordo com a modalidade 79, onde a modificação genética alvejada compreende: (1) a exclusão de uma sequência de ácido nucleico endógena no lócus genômico de interesse em dois cromossomos homólogos; e (2) a inserção do primeiro ácido nucleico no lócus genômico de interesse no primeiro cromossomo e rompimento do lócus genômico de interesse no segundo cromossomo. 82. O método de qualquer uma das modalidades 67-81, em que a proteína Cas é Cas9.
EXEMPLOS
[00492] Os exemplos seguintes são apresentados de modo a prover aqueles versados na técnica com uma divulgação e descrição completa de como fazer e usar a presente invenção e não se destinam a limitar o escopo do que os inventores consideram sua invenção nem pretendem representar que os experimentos abaixo são todos ou os únicos experimentos realizados. Esforços têm sido feitos para garantir a precisão com respeito a números usados (por exemplo, quantidades, temperatura, etc), mas alguns erros e desvios experimentais devem ser considerados. A menos que indicado de outra forma, as partes são partes em peso, peso molecular é o peso molecular médio, temperatura é em graus centígrados e pressão é atmosférica ou próxima à atmosférica.
Exemplo 1. Derivação e caracterização de células ES de ratos 1.1. Caracterização de células ES de rato
[00493] Conforme mostrado na Figura 1, as ESCs de rato crescem como colônias esféricas compactas que normalmente se desprendem e flutuam na placa (visão aproximada, Figura 8). ESCs rato expressam marcadores de pluripotência incluindo Oct-4 (Figura 2A) e Sox2 (Figura 2B) e expressam altos níveis de fosfatase alcalina (Figura 3). O cariótipo para a linha DA.2B é 42X, Y (Figura 4). As ESCs de rato frequentemente se tornam tetraploides; as linhagens foram, então, pré-selecionadas pela contagem das propagações de cromossomos da metáfase e as linhagens com contagens, em sua maioria, foram, então, formalmente cariotipadas.
[00494] Os blastocistos de ACI foram coletados a partir de fêmeas superovuladas obtidas comercialmente. Os blastocistos DA foram cultivados a partir de embriões congelados de 8 células obtidos comercialmente. Zonas pellucidae foram removidas com ácido Tyrodes e os blastocistos foram plaqueados em MEFs mitoticamente inativas. Os desenvolvimentos foram escolhidos e expandidos, utilizando métodos convencionais. Todos os blastocistos foram plaqueados, cultivados e expandidos usando um meio 2i (Li et al. (2008) Germline competent embryonic stem cells derived from rat blastocysts, Cell 135:1299-1310; aqui incorporado por referência em sua integralidade).
Figure img0003
1.2. : Produção dos ratos
[00495] Os ratos quiméricos foram produzidos por transmissão e injeção de blastocistos do genoma da ESC de rato. As quimeras produzidas por microinjeção de blastocistos utilizando ESCs de rato ACI.G1 são mostradas na Figura 9. Crias agouti F1 com crias da mesma ninhada albinos, provenientes quimera ACI/SD marcada com um asterisco (*) na Figura 9, são mostradas na Figura 10.
[00496] Transmissão de linha germinal da ESC de rato parental.
[00497] Três linhas de ESC de rato euploides foram avaliadas quanto à pluripotência por microinjeção em blastocistos de SD albino. As quimeras foram identificadas pela cor de pelagem agouti, que indica a contribuição da ESC de rato (ver Figura 10). Para cada linha, a maioria das quimeras transmitiu o genoma de rESC à descendência F1 (Tabela 2).
Figure img0004
1.3. : Derivação de Células-Tronco Embrionárias de Rato
[00498] Protocolo de superovulação, ratos
[00499] Dia 0: injetados com soro de égua grávida: IP, 20 L (0,4 mL).
[00500] Dia 1: nenhuma ação
[00501] Dia 2: (46 h depois): injetados com hCG, IP, 50 U (1 mL). - configurar acasalamentos individuais do sexo feminino.
[00502] Dia 3: plugues verificados. As fêmeas foram plugadas. Dia 0,5.
[00503] Dia 6 (e3.5): Fêmeas sacrificadas e embriões descartados.
[00504] Protocolo de derivação de célula ES (superovulação)
[00505] Dia 0: 1) Rato fêmea sacrificado com CO2. 2) Coletou-se de amostra mediante zaragatoa (swab) no abdômen ventral com etanol a 70%; usando uma tesoura, abriu-se a parede ventral para expor as vísceras. 3) Foram dissecados os ovidutos e cornos uterinos e colocouse-os em uma placa de cultura de tecidos contendo meios N2B27 quentes. Lavou-se o máximo de sangue possível e transferiu-se para uma nova placa com N2B27. 4) Utilizando-se uma seringa de 1 ml e uma agulha de 27g sem ponta, os meios foram lançados através dos cornos uterinos e tubas uterinas para ejetar blastocistos para os meios. 5) Os blastocistos foram coletados com uma pipeta de boca e transferidos para prato de cultivo de embriões contendo KSOM + 2i (1μMPD0325901, 3μM CHIR99021). KSOM é um meio de cultura produzido pela Millipore. Número de catálogo é MR-106-D 6) Cultivadas durante a noite a 37°; 7,5% de CO2.
[00506] Protocolo de derivação de célula ES (embriões congelados)
[00507] Dia 0: 1) Foram descongelados embriões de 8 células congelados (obtidos comercialmente) em um meio M2. Cultivados por 10 minutos à temperatura ambiente. 2) Transferidos para KSOM +2i e cultivados durante uma noite.
[00508] Protocolo de derivação de célula ES (mesmo para ambos)
[00509] Dia 1: 1) Transferência de embriões escavados até o meio 2i e cultivo durante a noite. 2) Cultivo continuado de embriões não escavados em KSOM + 2i
[00510] Dia 2: 1) Foram transferidos todos os embriões restantes para o meio 2i (caso eles tenham passado por cavitação ou não). 2) Foram cultivados durante a noite; cultivo continuado dos embriões inicias no meio 2i.
[00511] Dia 3: 1) Embriões transferidos por 30-60 segundos com ácido Tyrodes para remover a zona pellucida. 2) Embriões lavados 3x em meio 2i para remover o ácido Tyrodes. 3) Cada embrião foi depositado em um poço separado de uma placa de 96 poços alimentadora (o poço contém uma monocamada de fibroblastos embrionários de camundongo mitoticamente inativos (MEFs). 4) Cultivadas durante a noite em meio 2i.
[00512] Dia 4 - 5: 1) OS embriões plaqueados foram monitorados quanto à presença de um desenvolvimento (uma massa de células indiferenciadas amorfas). As excrescências estão prontas para a transferência quando elas são de aproximadamente duas vezes o tamanho do embrião plaqueado. 2) A cada dia: remover o meio gasto com uma micropipeta e substituir por um meio 2i novo. 3) Os desenvolvimentos foram transferidos para novos poços de alimentação: a. Removeram-se os meios gastos e o poço foi lavado cuidadosamente com PBS. b. O PBS foi removido e foram adicionados 30 μl 0,05% de tripsina; incubar por 10 minutos. c. Parou-se a reação de tripsina adicionando-se 30 μl 2i + 10% de FBS d. Cuidadosamente dissociaram-se as células com uma micropipeta e transferido todo o conteúdo do poço para um novo poço numa placa de 24 poços alimentadora. Esta foi a Passagem 1 (P1). e. Cultivado durante uma noite em um meio 2i.
[00513] Dia 5-8: (o tempo depende de quão rápido cada linha se expande) 1) Meio trocado diariamente (meio 2i) e monitorado quanto à presença de colônias com uma morfologia de ESC. 2) Quando colônias surgiram, o cultivo continuou até colônias se expandirem a ~ 50% de confluência. 3) As colônias foram tripsinadas as colônias e passadas como antes; plaqueadas em alimentadores, um poço por linha, em uma placa de 6 poços. Esta foi a passagem 2 (P2).
[00514] Contínuo: 1) Continuação de alimentação e monitoramento de cada linha até aproximadamente 50% confluentes. 2) Células tripsinizadas, como de costume. 3) parou a tripsina com 2i + 10% de FBS; as células sedimentadas por centrifugação (5', 1200 rpm, em centrífuga de mesa Beckman-Coulter). 4) Aspirou-se o sobrenadante e ressuspenderam-se as células suavemente em meio de congelação 400 μl de meio congelado (70% 2i, 20% de FBS, 10% de DMSO). 5) Distribuíram-se as células em 2 frascos e foram congeladas a -80°. Esta foi a passagem 3 (P3). 6) Para armazenamento a longo prazo, transferiram-se os frascos para armazenamento de N2 líquido.
[00515] Os meios de comunicação 2i foram preparados como se segue na Tabela 3.
Figure img0005
[00516] Materiais: Gonadotropina de Soro de Égua Grávida (PMSG)
[00517] Gonadotrofina coriônica de urina de gravidez humana (HCG)
[00518] Ratos do sexo feminino (5-12 semanas de idade)
[00519] Ratos do sexo masculino (12 semanas 8 meses de idade), um por gaiola
[00520] Seringas/agulhas
[00521] Quarto animal com luzes de 6: 00-18: 00 Procedimento:
[00522] Dia 1: 8: 00-10: 00 da manhã
[00523] Injectar fêmeas com 20 UI PMSG (0,4 ml), IP
[00524] Descartar PMSG não utilizado.
[00525] Dia 3: 8: 00-10: 00 da manhã (48 horas após a injecção de PMSG)
[00526] Injectar fêmeas com 50 UI de HCG (1 ml), IP
[00527] Colocar uma fêmea por macho na gaiola de acasalamento.
[00528] Descartar HCG não utilizado.
[00529] Dia 4 8: 00-10: 00 AM (24 horas após a injecção de HCG)
[00530] Verificar as fêmeas atrás de plugues. Fornecedores Hormonais
[00531] PMSG: Sigma #G-4877 (1000 IU). Ressuspender em PBS para uma [ ] final de 50 IU/ml. Armazenar a -20° em alíquotas de 1 mL.
[00532] HCG: Sigma #CG-5 (5000 IU). Ressuspender em PBS para uma [ ] final de 50 IU/ml. Armazenar a -20° em 1 ml de alíquotas 1.4.: Cariótipo de Linhas de Célula Tronco de Rato
[00533] As linhas de célula ES de rato aqui geradas foram cariotipadas e os resultados estão resumidos nas Tabelas 4-7.
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1.5.: Eletroporação de Vector em Célula Tronco Embrionária de Rato 1. Células ES de rato passadas 24-48 horas antes da eletroporação. 2. Meios alterados para RVG2i + Rocki (10μM de Y-27632) 24 h antes da eletroporação 3. Mídia modificada 30' antes de tripsinização. 4. DNA aliquotado para ser electroporado. 5. O DNA foi deixado a aquecer à temperatura ambiente durante> 10 min. 6. DNA aquecido durante 5 '@ 62°C. Colocar o DNA no gelo 7. Células tripsinizadas: a. Colónias flutuantes colhidas. Placa lavada para recolher o maior número possível de flotantes. b. Colónias peletizadas: 3 '@ 750 rpm. c. Grânulo lavado 1x com 5-10 ml PBS e re-spin/grânulo. d. Aspirou-se o sobrenadante; adicionar 500À, de tripsina, 0,05% + 1% de soro de galinha. i. Não reunir mais de uma placa de 110 cm de colónias por tubo. Se existem demasiadas colónias embaladas no fundo do tubo durante a tripsinização elas vão aglutinar-se e a maioria das células será perdida. e. 4' @ 37°, Colônias pipetadas várias vezes para minimizar a aglutinação. f. Passos repetidos 1-2 X: 4 '@ 37° g. Parou tripsina com 500À, de RVG2i + 10% de FBS. 8. As células peletadas: 5 '@ 1200 rpm. 9. Ressuspender as células em 10 ml de PBS. Contagem de duas alíquotas 20X para determinar o número total de células. 10. Células peletadas (5'/1200 rpm); calcular o número total de células e volume total de ressuspensão para atingir a concentração celular correta (alvo #/75 μl de tampão de EP). 11. Ressuspender em um volume mínimo de tampão EP; medir o volume total e ajustar para direcionar a volume com tampão EP. Tampão de electroporação é vendido pela Millipore. O # de catálogo é ES-003-D. Ver, Valenzuela et al. (2003) Nature Biotechnology 21: 652-659, que é incorporado aqui por referência. 12. Adicionar 75X células a 50X de DNA; transferir as 125À, células/solução de DNA para um poço de uma cuvete BTX de 48 poços. a. Encheram-se os poços vazios na mesma coluna com 125À, de Tampão EP. 13. A cuvete foi pulsava uma vez no eletroporador BTX: a. Configurações 400V; Q; 100 μF (as configurações podem variar) 14. Cuvete colocada em gelo durante 15' para recuperar. 15. Células removidas para 5 ml RVG2i + 10 μM de ROCKi. 16. Adicionado à placa de 15 centímetros com 20 ml RVG2i +10 μM ROCKi. Placa tem 2x neoR MEFs (ou outros MEFs dependendo do projeto). O marcador selecionável neoR é a neomicina-fosfotransferase (neo) do gene de Beck et al. (1982) Gene, 19:327-36 ou Patente US N° 7.205.148 ou 6.596.541, cada um incorporado a este instrumento por referência. 17. Incubadas @ 37°. A seleção se inicia 48 horas mais tarde. inibidor ROCK utilizado foi Y-27632. 1.6. Seleção de uma modificação genética direcionada em uma célula tronco embrionária de rato. 1. Células passadas 24-48 horas antes da eletroporação. 2. Meios alterados para RVG2i + ROCKi (10 μM Y-27632) 24 horas antes da eletroporação 3. Mídia modificada 30' antes de tripsinização. 4. DNA aliquotado para ser eletroporado. 5. DNA deixado a aquecer à temperatura ambiente durante> 10 min. 6. DNA aquecido durante 5 '@ 62 °C. Colocar DNA no gelo. 7. Células tripsinizadas: a. Colónias flutuantes colhidas. Placa lavada para recolher o maior número possível de flotantes. b. Colônias peletizadas: 3 '@ 750 rpm. c. Grânulo lavado 1x com 5-10 ml PBS e re-spin/grânulo d. Sobrenadante foi aspirado; adicionar 500À tripsina, 0,05% + 1% de soro de galinha. i. Não reunir mais de uma placa de 110 cm de colónias por tubo. Se existem demasiadas colônias embaladas no fundo do tubo durante a tripsinização elas vão aglutinar-se e a maioria das células será perdida. e. 4 '@ 37°. Colônias pipetadas várias vezes para minimizar a aglutinação. f. Repetida 1-2 X: 4 '@ 37 □□ g. Parou a tripsina com 500À RVG2i + 10% de FBS. 8. As células peletadas: 5 '@ 1200 rpm. 9. As células ressuspensas em 10 ml de PBS. Contagem de duas alíquotas 20À para determinar o número total de células. 10. Células peletadas (5'/1200 rpm); calcular o número total de células e volume total de ressuspensão para atingir a concentração celular correta (alvo #/75 μl de tampão EP). 11. Ressuspender em um volume mínimo de tampão PE; medir o volume total e ajustar para direcionar a volume com tampão EP. 12. Foram adicionadas 75À células a 50À de DNA; transferir as 125 À células/solução de DNA para um poço de uma cuvete BTX de 48 poços. a. Encheram-se os poços vazios na mesma coluna com 125À de Tampão EP. 13. A cuvete foi pulsava uma vez no eletroporador BTX: a. Configurações 400V; 100 μF (as configurações podem variar) 14. Cuvete colocada em gelo durante 15' para recuperar. 15. Células removidas para 5 ml de RVG2i + 10 μM ROCKi. 16. Adicionado à placa de 15 cm centímetros com 20 ml RVG2i +10 μM ROCKi. Placa tem 2x neoR MEFs (ou outros MEFs, dependendo da concepção). 17. Incubadas @ 37°. Começou 48 horas depois da seleção. 18. O protocolo de seleção com G418 foi como se segue: a. Dia 2 (2o dia após EP): células incubadas em meio 2i + G418, 75 μg/ml. b. Dia 3: células incubadas em meio 2i sem G418 c. Dia 4 células incubadas em meio 2i + G418, 75 μg/ml. d. Dia 5 células incubadas em meio 2i sem G418 e. Dia 6 células incubadas em meio 2i + G418, 75 μg/ml. f. Dia 7 células incubadas em meio 2i sem G418 g. Dia 8: células incubadas em meio 2i + G418, 75 μg/ml. h. Dia 9: células incubadas em meio 2i sem G418 i. Dia 10: células incubadas em meio 2i + G418, 75 μg/ml. j. Dia 11: células incubadas em meio 2i sem G418 k. Dia 12: escolhidas as colônias para expandir para a triagem. Cada colônia foi dissociada em tripsina a 0,05% + 1% de soro de galinha durante 10 minutos e, em seguida, plaqueada em um poço de uma placa de 96 poços de alimentação. 19. Colônias expandidas por 3 dias em meio 2i. 20. Clones passados em 1:1 para novas placas de 96 poços de alimentação. 21. Clones expandidos por 3 dias em meio 2i. 22. Para cada clone, as colônias foram dissociadas em tripsina. Congelados 2/3 de cada clone e armazenados a -80°; o restante foi plaqueado em placas de laminina (placas de 96 poços revestidas com 10 μg/ml de laminina). 23. Quando as placas de laminina foram confluentes, passadas para o laboratório de triagem para a genotipagem dos clones. 1.7. Assinatura molecular das células-tronco embrionárias de rato
[00534] Os genes listados na Tabela 8 foram expressas 20 vezes inferiores em células ES de rato do que os genes correspondentes em células ES de camundongo. Os genes listados na Tabela 9 foram expressos em níveis 20 vezes mais elevados em células ES de rato do que os genes correspondentes de células ES de camundongo.
[00535] Os dados de microarranjo nas Tabelas 8 e 9 foram geradas conforme se segue. Células ES de Rato (ACI.G2 e DA.2B) e células ES de camundongo (F1H4) foram cultivadas em meio 2i para 3 passagens até a confluência. As células F1H4 foram cultivadas em placas revestidas com gelatina na ausência de alimentadores. Células F1H4 ES de camundongo foram obtidas a partir de 129S6/SvEvTac e de embriões heterozigóticos C57BL/6NTac (ver, por exemplo, Pat. U.S. No. 7.294.754 e Poueymirou, WT, Auerbach, W., Frendewey, D., Hickey, JF, Escaravage, JM, Esau, L., Dore, A.T., Stevens, S., Adams, N.C., Dominguez, M.G., Gale, N.W., Yancopoulos, G.D., DeChiara, T.M., Valenzuela,D.M. (2007), aqui incorporado por referência na sua totalidade).
[00536] O protocolo seguinte foi utilizado para a preparação da amostra: Os tubos Eppendorf de 1,5 ml foram marcados com a ID de amostra. As células cultivadas sobre uma placa foram lavadas em 37 ° C de fosfato tamponado salino (PBS). O PBS foi removido e 300 ul de Trizol® foram adicionados. Um raspador foi usado para romper as células em Trizol® (Life Technology). As células lisadas foram colhidas em Trizol® em um tubo Eppendorf de 1,5 mL. Para células crescidas em suspensão, as células foram lavadas em 37 ° C de PBS e colhidas em um tubo de 1,5 mL. As células foram centrifugadas; o PBS foi removido; e 300 ul de Trizol® foram adicionados às células. As membranas celulares foram rompidas por pipetagem. As amostras foram classificadas por FACS com 10 a 105 células, o volume foi concentrado a menos de 100 uL. 4 volumes de tampão de lise de RNA foram adicionados e misturados por pipetagem. Por exemplo, tampão de lise de RNA de 320uL foram adicionados à amostra de 80uL. As amostras foram armazenadas a -20 ° C.
[00537] RNA-Seq foi utilizado para medir o nível dos genes de expressão de genes de camundongos e ratos. Leituras de sequenciamento foram mapeadas para genoma de ratos e camundongos de referência por Tophat e RPKM (fragmentos por kilobase de éxon por milhão de fragmentos mapeados) foi calculado para genes de ratos e camundongos. Os genes de homologia com base no símbolo do gene foram selecionados e então foi usado um teste tpara comparar o nível de expressão de cada gene entre ratos e camundongos. miR-32 estava entre os 10 mais expressos nas ESCs de ratos, mas não são expressos em células ES de camundongos. Embora não existam dados comparativos de miR-632, com base no nível da sua expressão em comparação com outros genes expressos nas ESCs de rato e na sua função conhecida no desenvolvimento embriônico, miR-632 foi selecionado como um marcador para células ES de rato. Tabela 8. Os genes listados foram expressos em níveis 20 vezes menores em células de ES de rato do que os genes correspondentes em células de ES de camundongo.
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Tabela 9. Os genes listados foram expressos em níveis 20 vezes maiores em células de ES de rato do que os genes correspondentes em células de ES de camundongo.
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Tabela 10. Um subconjunto de genes da Tabela 9, que são expressos em níveis 20 vezes mais elevados em células ES de rato do que os genes correspondentes em células ES de camundongo.
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[00538] Uma assinatura molecular adicional utilizando os marcadores de pluripotência/genes para as células de ES de rato também foi desenvolvida. A Tabela 11 fornece uma lista de genes e suas fileiras de expressão a partir dos dados de perfilagem de RNA. O mRNA foi isolado das células ES de rato e os níveis de expressão de vários marcadores foram comparados entre si. O termo "grau" DENOTA os níveis de expressão de genes individuais comparativos: Quanto maior o grau (1 é o mais elevado), maior é a expressão. Por exemplo, a fileira 13 de Oct4 significa que, de todos os genes analisados, foi expresso mais alto que todos exceto 12 genes. O fundamento nesta experiência foi qualquer expressão de valor inferior a 30; 6107 genes tinham valores de expressão de 30 ou superior. Tabela 11. Células de ES de rato assinatura molecular que emprega vários marcadores/genes de pluripotência, mesodérmicos, endodérmicos, neurais e de trofectoderma. Pluripotência Grau de pluripotência Mesodér- mico Grau Meso- dérmico Endodér- mico Grau endodérmi- co Neural Grau neural T rofectoder- ma Grau de trofecto- derma c-Myc 8248 Brachyury 7542 Gata6 11195 Nestina 7761 Cdx2 739 Dnmt3L 127 Flk1 Não testado Sox17 11418 Pax6 13570
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Exemplo 2: Desativação dos locais genômicos em ratos 2.1. Desativação dos locais genômicos endógenos usando um agente de endonuclease
[00539] Para introduzir-se um alelo mutante em um local genômico éndógeno de rato, as células ES de rato aqui descritas são eletroporadas com vetores de expressão (ou mRNA) que expressam ZFNs 1 e 2 (ou TALENs 1 e 2). Essas proteínas se ligam às suas sequências alvo em cadeias opostas, separadas por cerca de 6 bp a aproximadamente 40 bp. Uma quebra de cadeia dupla é formada dentro do local alvo, o qual a célula tenta reparar através da junção de extremidades não homólogas (NHEJ). Em muitos casos, a NHEJ resulta na criação de uma exclusão, que muitas vezes perturba a função do gene (na maioria das vezes, por meio da produção de uma mutação por deslocamento de quadro). A fim de identificar um clone positivo que compreende um alelo mutante, as células eletroporadas são plaqueadas a uma baixa densidade, visto que não é feita nenhuma seleção de droga. As colônias são recolhidas e avaliadas no local alvo para verificar se foi produzida alguma mutação (por exemplo, utilizando-se um ensaio de modificação de alelo (MOA) descrito acima). As células ES selecionadas compreendendo o alelo mutante são então introduzidas em um embrião de rato hospedeiro, por exemplo, um estágio pré-mórula ou um embrião de rato em estágio de blastocisto, e implantados no útero de uma mãe substituída para gerar um rato fundador (rato F0). Posteriormente, o rato fundador é criado como um rato de tipo selvagem para criar heterozigotos de progênie F1 para o alelo mutante. O pareamento do rato heterozigoto F1 pode produzir um homozigoto de progênie para o alelo mutante.
2.2. : Direcionamento da ESC de rato para a inativação do gene da apolipoproteína E de rato (ApoE) utilizando nucleases de dedo de zinco
[00540] As nucleases de dedo de zinco utilizam domínios de ligação ao DNA modular específico de sequência para direcionar a atividade de endonuclease a uma sequência alvo única no genoma. As ZFNs são manipulada como um par de monômeros. Cada monômero contém um domínio de clivagem não específico da endonuclease FokI fundida a 3 ou mais domínios de ligação a ao DNA do dedo de zinco. Cada dedo de zinco se liga a um sublocal de 3 bp e a especificidade é obtida pelos locais alvo combinados de ambos os monômeros. As ZFNs produzem quebras de cadeia dupla (DSBs) no DNA e as mutações (inserções ou exclusões) frequentemente ocorrem durante a junção de extremidades não homólogas (NHEJ). A Figura 15 ilustra o mecanismo pelo qual as endonucleases de edição de genoma, como ZFNs e TALENs, inserem quebras de cadeia dupla em uma sequência genômica alvo e ativam a NHEJ em uma célula. As DSBs também estimulam o reparo direcionado por homologia (HDR) por recombinação homóloga se uma sequência doadora for fornecida com a ZFN.
[00541] Tais ZFNs foram empregues em combinação com os vários métodos e composições descritos aqui para melhorar a eficiência de segmentação. O local da apolipoproteína E (ApoE) de rato foi direcionado conforme descrito no exemplo 3.2 (a) (i), exceto pelo fato de que os vetores de expressão que expressam as ZFNs 1 e 2 foram também introduzidos em células ES de rato. Ver Figura 11, que fornece uma representação esquemática do evento de direcionamento do ApoE em combinação com rTZFN1P e rTZFN2P. A eficiência de direcionamento foi determinada como discutido abaixo, no Exemplo 5, e os resultados estão apresentados na Tabela 12. Para a seleção do direcionamento de heterozigotos, do direcionamento de homozigotos e de duplas "mistas" (por exemplo, direcionamento de heterozigotos compostos), iniciadores e sondas específicos foram usados na determinação do genótipo. Surpreendentemente, a eficiência de direcionamento aumentou de 8 a 10 vezes. Tabela 12. ZFNs de ratos ApoE : Eficiência de direcionamento melhorada.
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[00542] Um vetor de direcionamento a um plasmídeo foi construído com uma cassete de seleção de drogas auto-exclusão e um gene lacZ como um gene repórter (ver Figura 14 para uma ilustração dos acontecimentos de recombinação homóloga e não homóloga que podem ocorrer após a eletroporação de um vetor de direcionamento compreendendo uma cassete de seleção). Foi obtida uma boa eficiência de direcionamento e uma elevada % de quimeras foi produzida. As nucleases de dedo de zinco (ZFNs) também foram testadas em combinação com vetores de direcionamento para examinar o seu efeito sobre a melhoria da eficiência de segmentação (ver Figura 16 para uma ilustração da técnica de direcionamento de gene que utiliza ZFNs ou TALENs para melhorar a eficiência da recombinação homóloga de um vetor de direcionamento). O vetor de direcionamento foi co-expresso com os vetores de expressão para 2 pares de ZFN que cortam o local de ApoE . Os clones da ESC de rato eletroporados com o vetor de direcionamento e uma série de ZFNs apresentaram uma eficiência de direcionamento 8-10 vezes superior à dos clones de ESC de rato apenas com um vetor de direcionamento. Além disso, foi detectado um direcionamento de homozigotos bialélicos em cerca de 2% de nossos clones. Uma % elevada de quimeras desses clones direcionados foi obtida.
[00543] Os clones de ESC de rato direcionados por ApoE(com ajuda da ZFN) foram microinjetados com SD blastocistos, os quais foram então transferidos para fêmeas receptoras de SD pseudográvidas, usando técnicas padrão. As quimeras foram identificadas pela cor da pelagem (ver Figura 17, mostrando quimeras ApoE-ZFN-AB5 (isto é, ApoE-/- quimeras); quimeras F0 do sexo masculino foram criadas para fêmeas SD. As crias F1 da linha germinal foram genotipadas quanto à presença do alelo ApoE alvo (Tabela 13). Foram obtidos elevados % de quimera a partir de duas dessas colônias direcionadas. Tabela 13. Resultados da microinjeção.
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[00544] Um rato de nocaute ApoE proporciona um meio de estudar vários tipos de distúrbios e doenças. Em humanos, a apolipoproteína é encontrada em quilomicron, HDL, LDL e VLDL. ApoE é essencial para o catabolismo normal dos constituintes de lipoproteínas ricas em triglicérides. Os defeitos em APOE resultam em inúmeros estados de doença, incluindo, por exemplo, hipercolesterolemia familiar, hiperlipidemia, betalipoproteinemia, disbetalipoproteinemia familiar, hiperlipoproteinemia tipo III (HLP III) e risco de doença da artéria coronária. Uma isoforma (ApoE4) está associada com a doença de início tardio familiar e esporádica de Alzheimer, possivelmente com MS também.
[00545] Em camundongos, a ApoE é encontrado principalmente no HDL; transporta o colesterol, como nos seres humanos. Os camundongos com deficiência de ApoE(2 KOs independentes) têm 5 vezes plasma normal de colesterol; desenvolveram deposições ricas em células espumosas em suas aortas proximais aos 3 meses (comparáveis à síndrome humana).
[00546] Os nocautes de ApoE em ratos proporcional um modelo animal para estudar a função endotelial, incluindo, mas não limitado a, formação de placas, alterações de transcrição (RNA-Seq), função ex vivo . Além disso, ratosde tamanhos maiores facilitariam todos esses ensaios e melhorariam potencialmente a qualidade dos dados de RNA-Seq.
2.3. Inativação do local gama do receptor de interleucina-2 de rato (IL2R-Y) utilizando nucleases de dedo de zinco
[00547] O local gama do receptor de interleucina-2 de rato (IL2R—Y ou IL2RG) foi direcionado tal como descrito no exemplo 3.3 (a), exceto pelo fato de que os vectores de expressão que expressam ZFN U (ZFN à montante) e ZFN D (ZFN à jusante) também foram introduzidos nas células ES de rato. A Figura 18 proporciona um esquema do evento de direcionamento de IL2R—Y em combinação com ZFN U e ZFN D. A sequência do local de IL2R-Y a que esses dedos de zinco se ligam é denotado na Figura 18 na SEQ ID NO: 93. A eficiência de direcionamento foi determinada como discutido abaixo, no Exemplo 3.3(a) e os resultados são apresentados na Tabela 14. Em resumo, os clones direcionados homozigoticamente foram confirmados por PCR. Para o par de ZFN1: 173 clones mutantes dos 192 selecionados (90%) e para o par de ZFN2: 162 clones dos 192 (84%) selecionados. Tabela 14. Direcionamento do local de IL2R-Y de rato.
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[00548] Os clones de ESC de rato direcionados por IL2r-Y (com ajuda da ZFN) foram microinjetados com SD blastocistos, os quais foram então transferidos para fêmeas receptoras de SD pseudográvidas, usando técnicas padrão. As quimeras foram identificadas pela cor da pelagem; quimeras F0 do sexo masculino foram criadas para fêmeas SD. As crias F1 da linha germinal foram genotipadas quanto à presença do alelo IL2R Y alvo.
2.4. : Inativação do receptor gama de interleucina 2 de rato (IL2R-Y) usando CRISPR/Cas9
[00549] O local IL2R-y de rato foi direcionado tal como descrito no Exemplo 3.3 (a), exceto pelo fato de que o sistema CRISPR/Cas9 também foi introduzida nas células ES de rato para ajudar na eficiência de direcionamento. SBI: Os vetores todos-em-um "SmartNuclease" System Biosciences Cas9 foram empregados e a expressão de Cas9 foi impulsionada pelo promotor CAG, EF1a, PGK ou CMV. O gRNA personalizado foi ligado em um vetor e expresso pelo promotor H1. Foram projetados 4 gRNAs contra IL2RG . As regiões do local IL2R-y de rato direcionado pelos gRNAs1-4 são mostradas na Figura 19. Para a seleção do direcionamento (por exemplo, direcionamento de heterozigotos e direcionamento de heterozigotos compostos), iniciadores e sondas específicos foram usados na determinação do genótipo. Os resultados de direcionamento ao se utilizar os vários RNAs de orientação são mostrados na Tabela 15. "Forte" e "fraco" referem-se à força das evidências com base na seleção que a colônia tem uma modificação direcionada. Tabela 15. Direcionamento do local Il2rg de rato com os RNAs de orientação.
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2.5. : A inativação do gene de transferase de fosforibossil de guanina de hipoxantina de camundongo (Hprt) utilizando CRISPR/Cas9
[00550] O local HPRT de camundongo foi direcionado em células ES de camundongo utilizando apenas LTVECs ou em combinação com CRISPR/Cas9. A sequência de codificação de Hprt completa de 32,9 kb foi direcionada para exclusão e substituição por um cassete de seleção de resistência a puromicina pCAGG-Puro, que também expressou eGFP. Os pontos de extremidade de exclusão foram os códons de início e interrupção. A sequência de RNA de orientação usada foi 5'- GACCCGCAGUCCCAGCGUCG-3' (SEQ ID NO: 84), que estava direcionado ao exon 1 do gene HPRT de camundongo. A posição de clivagem do local alvo previsto foi os 22 pares de base da extremidade 5' da exclusão. A eficiência de clivagem no alvo de Cas9/gRNA observada nas células ES foi > 93%. Um resumo é mostrado na Tabela 16. Uso de CRISPR/Cas9 para ajudar no direcionamento do local de Hprt completo de 32,9 kb resultou em um melhoramento de cinco vezes do direcionamento ao longo do uso do LTVEC isoladamente. Tabela 16. Resumo da exclusão assistida por CRISPR do gene Hprt
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Exemplo 3: Modificação direcionada dos locais genômicos de rato 3.1: Direcionamento da ESC de rato: O local Rosa26 de rato.
[00551] O local Rosa26 de rato se situa entre os genes Setd5 e Thumpd3 , como no camundongo, com o mesmo espaçamento. O locus Rosa26 de rato (Figura 12, esquema B) difere do local Rosa26 de camundongo (Figura 12, esquema A). As transcrições do Rosa26 de camundongo consistem em 2 ou 3 exons. O local do rato contém um segundo exon 1 (Ex1b) além do exon homólogo do exon 1 do camundongo (Ex1a). Nenhum terceiro éxon foi identificado no rato. O direcionamento de um alelo Rosa26 de rato é ilustrado na Figura 12C, onde os braços de homologia de 5 kb, cada, foram clonados por PCR utilizando o DNA genômico de uma ESC de rato DA. O alelo direcionado contém um cassete (splicing aceitador)-lacZ- Hub-neo SA que substitui uma exclusão de 117 bp no íntron Rosa26 de rato.
[00552] A eficiência de direcionamento no local Rosa26 de rato foi determinada (Tabela 17). Vector linearizado foi eletroporado em ESCs de rato DA ou ACI e as colônias transfectadas foram cultivadas em meios 2i + G418, usando técnicas padrão. As colônias individuais foram escolhidas e triadas pelo uso de um ensaio de perda de alelo (LOA) (Valenzuela, D. et al. (2003) High-throughput engineering of the mouse genome coupled with high- resolution expression analysis, Nature Biotech. 21: 652-660, aqui incorporada por referência).
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[00553] Produção de quimera e transmissão de linha germinal utilizando clones de ESC de rato direcionados com Rosa26. Clones reconfirmados de ESC de rato direcionada por Rosa26 foram microinjectados em blastocistos SD, que em seguida foram transferidos a fêmeas receptoras SD pseudográvidas, utilizando técnicas convencionais. As quimeras foram identificadas pela cor da pelagem; quimeras F0 do sexo masculino foram criadas para fêmeas SD. Filhotes F1 da linhagem germinativa (agouti) foram genotipados quanto à presença do alelo Rosa26 direcionado; nove de 22 filhotes agouti genotipados como heterozigóticos no local Rosa26 (Tabela 18).
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[00554] Para confirmar que o alelo geneticamente modificada no local Rosa26 foi transmitido através da linha germinal, a expressão de lacZ foi confirmada pela coloração X-gal nos ratos direcionados por Rosa26 heterozigotos. A coloração X-gal do cérebro, do coração e do timo e um rato direcionado por Rosa26 heterozigoto de 14 semanas apresentaram a expressão de lacZ (Figura 13B, D e F, respectivamente), enquanto que os controles de tipo selvagem da mesma idade apresentaram um baixo nível de coloração X- gal de fundo (Figura 13A, C e E, respectivamente). A coloração X-gal nos embriões de rato direcionados por Rosa26 heterozigotos E12.5 e E 14,5 apresentaram uma expressão ubíqua de lacZ (Figura 13G e I, respectivamente), enquanto que os embriões de rato de controle apresentaram baixos níveis de coloração X-gal de fundo (Figura 13H e J, respectivamente).
3.2.(a)(i) : Direcionamento do local da apolipoproteína E (ApoE) de rato.
[00555] O local da apolipoproteína E (ApoE) de rato foi direcionado de modo e romper a função da ApoE. O direcionamento do local da ApoE foi feito utilizando um vetor de direcionamento que compreende um cassete lacZ- HUB-neo flanqueado por um dos braços de homologia em 5' e 3' homólogo ao local da ApoE . A Figura 20 ilustra um local de ApoE de rato geneticamente modificado que foi rompido por uma exclusão de 1,8kb e a inserção de um cassete lacZ-HUB-neo, o qual inclui um cassete Cre de auto- exclusão que compreende um gene Crei impulsionado por um promotor de protamina. As condições de eletroporação foram as seguintes: 6 ug de DNA; 2,05 x 106 células; 400V; 200 uF: 342 V, 593 useg; placa em 15 cm 2x de densidade de neoR MEFs em 2i + 10 μM de ROCKi.
[00556] A eficiência de direcionamento no local da ApoE foi determinada e é apresentada na Tabela 19. O vetor linearizado foi eletroporado nas ESCs de rato DA.2B derivadas da cepa DA e as colônias transfectadas foram cultivadas utilizando-se técnicas convencionais. As colônias individuais foram escolhidas e triadas pelo uso de um ensaio de perda de alelo (LOA)
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[00557] Foi realizada a produção de quimera e transmissão de linha germinal utilizando clones de ESC de rato direcionados com ApoE. Clones de ESC de rato direcionada por ApoE foram microinjetados em blastocistos SD, que em seguida foram transferidos a fêmeas receptoras SD pseudográvidas, utilizando técnicas convencionais. As quimeras foram identificadas pela cor da pelagem; quimeras F0 do sexo masculino foram criadas para fêmeas SD. A transmissão da linha germinal foi obtida. A prole F1 foi genotipada quanto à presença do alelo da ApoE direcionado (Tabela 20). Tabela 20 Resultados da microinjeção
Figure img0033
[00558] A expressão do LacZ acionado pelo promotor da ApoE endógena foi confirmada por coloração com X-gal em ratos fêmea com 12 semanas de idade ApoE +/- no cérebro, vasos sanguíneos e fígado (Figuras 43-45, respectivamente). As figuras 43-45 mostram um padrão de expressão de lacZ que reflete o padrão de expressão da ApoE endógena. Os controles de tipo selvagem de idades correspondentes apresentaram um baixo nível de coloração X-gel de fundo.
[00559] Os fenótipos dos ratos com exclusão de ApoE foram estudados adicionalmente. Foram realizados estudos químicos de soro longitudinal para medir o colesterol, LDL, HDL e os níveis de triglicerídeos em intervalos de três semanas. A Figura 46A-D mostra o colesterol de soro, LDL, HDL e níveis de triglicerídeos em um homozigoto direcionado, um heterozigoto direcionado e em ratos de tipo selvagem com 6, 9, 12 e 15 semanas. As hemorragias oculares foram realizadas em um grupo de idades correspondentes que consiste em 2 ratos de tipo selvagem, 7 heterozigotos e 8 homozigotos. Não foram observadas diferenças significativas entre machos e fêmeas. Os ratos homozigotos com exclusão de ApoE apresentaram colesterol e níveis de LDL elevados e níveis reduzidos de HDL. Diferentemente dos camundongos com ApoE -/- , nenhum aumento significativo de triglicerídeos foi observados nos ratos com exclusão de ApoE.
[00560] A análise fenotípica adicional que é executada inclui histologia/imagiologiaex vivo para formação da placa de arco aórtico, imageamento in vivo para a formação da placa de arco aórtico e mudanças de transcrição (sequenceamento shotgun de todo o transcriptoma (RNA-Seq)) do endotélio de arco aórtico. O tempo desses ensaios depende da linha do tempo da formação da placa. As placas são detectáveis em camundongos com ApoE -/- em 24 semanas.
[00561] Os dados de direcionamento adicionais para a ApoE também são fornecidos na Tabela 22.
3.2.(a)(ii). Direcionamento da ApoE em ratos com um vetor de direcionamento
[00562] A Figura 20 proporciona um esquema do lócus de rato ApoE e um plasmídeo de direcionamento. A esquemática superior da Figura 20 mostra a estrutura genômica do lócus da ApoE de rato e as regiões genômicas correspondentes às porções de homologia 5 'e 3' (5 kb e 5,4 kb, respectivamente, caixas cinza escuro). exon 1 do ApoE não realiza codificação e é mostrado como uma caixa aberta mais próxima à porção 5 'de homologia. Os três íntrons da ApoE são indicados como linhas e os exons 2 e 3 compreendem regiões de codificação e são mostrados como caixas cinza pontilhadas. exon 4 contém ambas sequências de codificação e de não codificação, como é indicado pelo sombreado cinza pontilhado e a caixa aberta.
[00563] O esquema inferior da Figura 20 é o vetor de direcionamento. Os braços de homologia 5' e 3' (5 kb e 5,4 kb, respectivamente) são indicadas por caixas cinza escuro. O vetor de direcionamento compreende um gene repórter (lacZ) e uma cassete de auto-exclusão flanqueada por locais loxP (setas abertas). O cassete de auto-exclusão compreende o gene Crei operacionalmente ligado a um promotor PRM1 de camundongo e um cassete de seleção que compreende um gene de resistência à neomicina operacionalmente ligado a um promotor de ubiquitina humana.
[00564] O gene Crei compreende dois exons que codificam uma recombinase Cre, que é separada por um íntron (Crei) para impedir sua expressão em uma célula procariótica. Ver, por exemplo, a Patente U.S. 8.697.851 e o Pedido de Publicação de Patente 2013-0312129, que descrevem o cassete de auto-exclusão em detalhe e são incorporados aqui por referência na sua totalidade. Através do uso do promotor PRM1 , o cassete de auto- exclusão pode ser excluído especificamente em células germinais macho de ratos F0. O vetor de direcionamento foi eletroporado em células ES de rato obtidas no Exemplo 1 e as células foram plaqueadas em 15 cm com 2x de densidade de neoR MEFs resistentes à neomicina em 2i + 10 μM de ROCKi. As células ES de rato transformadas foram cultivadas, selecionadas e mantidas como descrito no Exemplo 1.
[00565] Como mostrado na Tabela 44, 384 colônias foram selecionadas e obtiveram-se 23 clones direcionados. A eficiência de direcionamento foi de 5,99%. 3 clones foram injetados em blastocistos, tal como descreve-se aqui, no Exemplo 1. 3 clones que produzem quimeras foram obtidos e 1 dos clones transmitiram a modificação direcionada por meio da linha germinal.
3.2. (A) (iii). Direcioanemtno da ApoE em ratos com um vetor de direcionamento em combinação com nucleases de dedo de zinco
[00566] O vetor de direcionamento empregado no Exemplo 3.2(a)(ii) foi utilizado em combinação com nucleases de dedos de zinco para atingir o local da ApoE de rato. A Tabela 21 fornece um resumo da organização genômica do local da ApoE de rato. As posições mostradas na Tabela 21 foram obtidas a partir da construção 5.0 da sequência de referência do genoma de rato (ENSMBL). A ApoE está no cromossomo 1 na cadeia (-). Tabela 21. Resumo do local da ApoE de rato e as posições dos locais de ligação da nuclease de dedo de zindo e locais de corte.
Figure img0034
[00567] A Figura 11 proporciona um esquema do local da ApoE de rato e denota com barras cinzentas o local de corte para ZFN1 e ZFN2. O local de corte para ZFN1 é no exon 3 e o local de corte para ZNF2 é no íntron 3. A posição exata dos locais de ambos os ZFNs é apresentada na Tabela 21. As regiões genômicas correspondentes às porções de homologia 5 'e 3' (5 kb e 5,4 kb, respectivamente) são indicados por caixas cinza escuro. exon 1 do ApoE não realiza codificação e é mostrado como uma caixa aberta mais próxima à porção 5 'de homologia. Os três íntrons do gene ApoE são indicados como linhas e os exões 2 e 3 compreendem regiões de codificação e são mostrados como caixas cinza listradas. exon 4 contém ambas sequências de codificação e de não codificação, como é indicado pelo sombreado cinza pontilhado e a caixa aberta.
[00568] O vetor de direcionamento empregado foi o mesmo do Exemplo 3.2(a)(ii) e mostrado na Figura 20 e a Figura 21A proporciona um esquema para o direcionamento do local da ApoE em células ES de rato usando nucleases de dedo de zinco e o vetor de direcinamento ilustrado na Figura 20. Os ZFNs foram introduzidos como dois plasmídeos de expressão, um para cada metade do par de ZFNs. 20 μg do plasmídeo ZFN1 foram usados e 20 μg do plasmídeo para ZFN2 foram usados. Os ZFNs foram adquiridos com a Sigma. A expressão de cada ZFN foi impulsionada pelo promotor de CMV.
[00569] O vetor de direcionamento foi eletroporado em células ES de rato obtidas no Exemplo 1 e as células foram plaqueadas em 15 cm com 2x de densidade de neoR MEFs em 2i + 10 μM de ROCKi. As células ES de rato transformadas foram cultivadas, selecionadas e mantidas como descrito no Exemplo 1.
[00570] Como mostrado na Tabela 44 e na Tabela 22, 384 colônias foram selecionadas e obtiveram-se 290 clones direcionados. A eficiência de direcionamento foi de 75,52%. 2 clones foram injetados em blastocistos, tal como descreve-se aqui, no Exemplo 1. Dois clones que produzem quimeras foram obtidos e um dos clones transmitiram a modificação direcionada por meio da linha germinal.
[00571] Além disso, o uso de ZFN1 e ZFN2 gerou 8 clones bialélicos direcionados com uma eficiência igual a 2,08%. Tabela 22. Direcionamento do local da ApoE .
Figure img0035
3.2.(b)(i): Modificação direcionada do local da apolipoproteína E (ApoE) de rato usando um vetor de direcionamento grande (LTC).
[00572] O direcionamento do local da ApoE é realizado utilizando-se um vetor de direcionamento grande (LTVEC) que compreende um cassete de PRM1-Crei de lacZ-rato flanqueado por um braço de homologia em 5' para o local da ApoE de cerca de 45kb e um braço de homologia em 3' para o local da ApoE de cerca de 23 Kb. A Figura 22 ilustra o local da ApoE de rato em que o local da ApoE foi rompido por uma exclusão de 1,83kb e pela inserção do gene lacZ e um cassete de auto-exclusão que compreende um cassete de mPrm1-Crei e um cassete de seleção de hUb-neo. Os métodos utilizados no exemplo 3.2(a)(i) podem ser utilizados para introduzir esse vetor nas células ES de rato.
Exemplo 3.2.(b)(ii). Direcionamento do local da ApoE de rato com um vetor de direcionamento grande (LTVEC)
[00573] A Figure 22 proporciona um esquema do local da ApoE de rato e um vetor de direcionamento grande (LTVEC). O esquema superior mostra a organização genômica do local da ApoE de rato e as regiões genômicas correspondentes aos braços de homologia em 5' e 3' (45 kb e 23 kb, respectivamente; as caixas cinza escuro). O exon 1 do ApoE não realiza codificação e é mostrado como uma caixa aberta mais próxima ao braço de homologia em 5'. Os três íntrons da ApoE são indicados como linhas e os exons 2 e 3 compreendem regiões de codificação e são mostrados como caixas cinza listradas. exon 4 contém ambas sequências de codificação e de não codificação, como é indicado pelo sombreado cinza pontilhado e a caixa aberta.
[00574] O esquema inferior na Figura 22 é o LTVEC. As porções de homologia 5 'e 3' (45 kb e 23 kb, respectivamente) são indicadas por caixas cinza escuro. O vetor de direcionamento compreende um gene repórter (lacZ) e um cassete de auto-exclusão flanqueados por locais loxP (setas abertas), que compreendem o gene Crei ligado operacionalmente a um promotor de Prm1 de camundongo e um cassete de seleção de droga que compreende um gene de resistência à neomicina ligado operacionalmente a um promotor de ubiquitina humana. O Crei compreende dois exons que codificam a recombinase de Cre, que é separada por um íntron (Crei) para impedir sua expressão em uma célula procariótica. Ver, por exemplo, a Patente U.S. 8.697.851 e o Pedido de Publicação de Patente 2013-0312129, que descrevem o cassete de auto-exclusão em detalhe e são incorporados aqui por referência na sua totalidade. Através do uso do promotor Prm1 de camundongo, o cassete de auto-exclusão pode ser excluído especificamente em células germinais macho de ratos F0.
[00575] O LTVEC foi eletroporado em células ES de rato obtidas no Exemplo 1 e as células foram plaqueadas em 15 cm com 2x de densidade de neoR MEFs em 2i + 10 μM de ROCKi. As células ES de rato transformadas foram cultivadas, selecionadas e mantidas como descrito no Exemplo 1.
[00576] Como mostrado na Tabela 44, 288 colônias foram selecionadas e obtiveram-se 8 clones direcionados. A eficiência de direcionamento foi de 2,78%. 3 clones foram injetados em um embrião hospedeiro em um estágio de blastocisto conforme descrito aqui, no Exemplo 2, para produzir ratos quiméricos (F0). Além disso, um clone bialélico direcionado foi produzida, proporcionando uma eficiência bialélica de 0,35%.
3.2.(b)(iii). Direcionamento da ApoE em ratos com um vetor de direcionamento grande (LTVEC) em combinação com nucleases de dedo de zinco
[00577] O LTVEC usado no Exemplo 3.2.(b)(ii) foi usado em combinação com nucleases de dedos de zinco para ser direcionado ao local da ApoE de rato. A Tabela 21 proporciona um resumo da organização genômica do local do receptor gama da ApoE de rato e as posições exibidas foram retiradas da construção 5.0 da sequência de referência do genoma de rato (ENSMBL).
[00578] A Figura 23 proporciona um esquema do local da ApoE de rato e denota com barras cinzentas o local de corte para ZFN1 e ZFN2. O local de corte para ZFN1 é no exon 3 e o local de corte para ZNF2 é no íntron 3. A posição exata dos locais de ambos os ZFNs é apresentada na Tabela 21. As porções de homologia 5 'e 3' (45 kb e 23 kb, respectivamente) são indicadas por caixas cinza escuro. exon 1 do gene ApoE não realiza codificação e é mostrado como uma caixa aberta mais próxima à porção 5 'de homologia. Os três íntrons do gene ApoE são indicados como linhas. Os exons 2 e 3 compreendem regiões de codificação e são mostrados como caixas cinzentas listradas. exon 4 contém ambas sequências de codificação e de não codificação, como é indicado pelo sombreado cinza pontilhado e a caixa aberta.
[00579] O LTVEC utilizado foi o mesmo que o Exemplo 3.2(b)(ii) e é mostrado na Figura 22. Os ZFNs foram introduzidos como dois plasmídeos de expressão, um para cada metade do par de ZFNs. Foram usados 20 μg do plasmídeo do ZFN 1 e 20 μg do plasmídeo do ZFN2. Os ZFNs foram adquiridos com a Sigma. A expressão de cada ZFN foi impulsionada pelo promotor de CMV.
[00580] O vetor de direcionamento foi eletroporado em células ES de rato obtidas no Exemplo 1 e as células foram plaqueadas em 15 cm com 2x de densidade de neoR MEFs em 2i + 10 μM de ROCKi. As células ES de rato transformadas foram cultivadas, selecionadas e mantidas como descrito no Exemplo 1.
[00581] Como mostrado na Tabela 44, 288 colônias foram selecionadas e obtiveram-se 16 clones direcionados. A eficiência de direcionamento foi de 5,56%. Um clone foi injetado nos blastocistos, tal como descrito aqui, no Exemplo 2.
[00582] Além disso, o emprego de ZFN1 e ZFN2 produziu um clone bialélico direcionado, com um rendimento de 0,35%.
3.2.(b)(iv). Direcioanemtno da ApoE em ratos com um vetor de direcionamento grande (LTVEC) em combinação com CRISPR/Cas9
[00583] O LTVEC usado no Exemplo 3.2.(b)(ii) foi usado em combinação com CRISPR/Cas9 para ser direcionado ao local da ApoE de rato. A Tabela 23 mostra uma comparação dos resultados de experimentos em que o LTVEC da ApoE foi usado isoladamente para ser direcionado ao local da ApoE de rato ou usado em combinação com uma nuclease de CRISPR/Cas9 nuclease para ser direcionado ao local da ApoE de rato. Em cada experimento, as células eletroporadas foram plaqueadas a uma densidade elevada e submetidas a seleção com drogas para encontrar colônias que fossem resistentes aos medicamentos. As colônias resistentes a droga foram selecionadas e triadas quanto à modificação direcionada utilizando-se um ensaio de modificação de alelo (MOA), conforme descrito neste documento. Especificamente, 4 x 106 células foram eletroporadas com 2μg do LTVEC da ApoE a uma voltagem de 400 V, uma capacitância de 100 μF e uma resistência igual a 0. Neste último experimento, 6 ug de plasmídeo de expressão Cas9 e 3 ug de ApoE gRNA2 ou 3 ug de ApoE gRNA3 também foram electroporadas. A seleção foi feita utilizando 75 μg/mL de G418. O gRNA2 da ApoE tem uma sequência de GCAGGCCCTGAACCGCTTCTTGG (SEQ ID NO: 87) e tem como alvos uma região de 67 pb em 3' do início do exon 3 da ApoE de rato. O gRNA3 da ApoE tem uma sequência de CCTGCGCTGGGTGCAGACGCTTT (SEQ ID NO: 88) e tem como alvo uma região de 97 pb em 3' do início do exon 3 da ApoE de rato (ver Figura 47). Como mostrado na Tabela 23, quando Cas9 e qualquer um dos gRNAs foram introduzidos nas células juntamente com o LTVEC da ApoE , a eficiência de direcionamento aumentou (de 43% a 53% ou 47%). O direcionamento bialélico foi observado em cinco colônias direcionadas com o LTVEC da ApoE em combinação com o gRNA2 ou 3 ApoE , mas nenhum direcionamento bialélico foi observado apenas com o LTVEC da ApoE . Tabela 23. Comparação do direcionamento do LTVEC de Rag2 com e sem CRISPR/Cas9
Figure img0036
3.3(a): Direcionamento do local do receptor gama (I12R-Y) da interleucina-2 de rato
[00584] O local do receptor gama de interleucina 2 de rato (Il2r-Y ou Il2rg) foi direcionado para interromper a função de Il2r-Y. H2r-y desempenha um papel importante na sinalização por IL-2, IL-4, IL-7, IL-9, IL-15, IL-21 e as mutações em IL2R-Y estão associadas a defeitos graves no desenvolvimento de células T, B e NK.
[00585] O direcionamento do local de IL2r-Y foi feito usando um vetor de direcionamento compreendendo um cassete de eGFP-hUb-neo flanqueado com braços de homologia em 5' e 3'homólogos ao local de I12R-Y, como representado na Figura 24. A Figura 25 representa a estrutura genômica do local de I12R-Y de rato em que o local de I12R-Y foi interrompido por uma exclusão de 3,2kb. O local de Il2r-Y direcionado também compreendia um gene de eGFP e um cassete de auto-exclusão contendo um Crei ligado operacionalmente a um promotor de Protamina1 de camundongo e um cassete de seleção de droga compreendendo um promotor de hUb ligado operacionalmente a um gene de resistência à neomicina.
[00586] Eficiência de direcionamento no local de Il2r-Y foi determinada e é mostrada na Tabela 24. O vetor linearizado foi eletroporado em ESCs de rato de DA.2B e as colônias transferidas foram cultivadas usando técnicas convencionais. As colônias individuais foram escolhidas e triadas pelo uso de um ensaio de perda de alelo (LOA) Tabela 24. Eficiência de direcionamento da Il2r-Y de rato
Figure img0037
[00587] Foi realizada a produção de quimera ea transmissão de linha germinal utilizando clones de ESC de rato direcionados com Il2r-Y. Clones de ESC de rato direcionada por Il2r-Y foram microinjetados em blastocistos SD, que em seguida foram transferidos a fêmeas receptoras SD pseudográvidas, utilizando técnicas convencionais. As quimeras foram identificadas pela cor da pelagem; quimeras F0 do sexo masculino foram criadas para fêmeas SD. As crias F1 da linha germinal foram genotipadas quanto à presença do alelo Il2r-Y direcionado (Tabela 25). Em outro experimento de microinjeção com o clone de Il2rg-CG12, a transmissão da linha germinal também foi confirmada pelas cores da pelagem e pela genotipagem. Tabela 25. Resultados da microinjeção.
Figure img0038
[00588] O fenótipo da quimera Il2rg-/Y #3 foi estudado adicionalmente. As células mononucleares do sangue periférico (PBMCs) foram coradas com anticorpos que reconhecem antígenos em várias linhagens linfoides. PBMCs positivos para GFP foram detectados a partir de 2 das quimeras, conforme mostrado na Figura 30. Além disso, as células GFP + foram negativas para o marcador de célula T CD3 (Figura 29A) e em sua maioria negativas para o marcador de célula B B220 e para o marcador de célula NK CD161a (Figuras 29B e C, respectivamente). PBMCs de um tipo de rato selvagem foram usados como controles negativos para a expressão de GFP. Ver Figuras 29D- F. As pequenas populações duplo-positivas são consistentes com o fenótipo de nocaute de Il2rg publicados em camundongos. Esses dados foram obtidos de um rato quimérico, o qual contém células positivas para o receptor gama de IL2 e isso pode complicar a análise do fenótipo. A análise de citometria de fluxo também pode ser realizada em populações de células de medula óssea e baço para revelar diminuições correspondente no número de linfócitos. Ver Mashimo et al. (2010) PLoS One 5(1):e8870.
3.3(b): Modificação direcionada do local do receptor gama (I12R-Y) da interleucina 2 de rato
[00589] O local do receptor gama de interleucina 2 de rato (Il2r-Y) foi direcionado para interromper a função de Il2r-Y em ratos. A Figura 25 mostra a estrutura genômica do local da Il2rg de rato (painel superior da Figura 25) e o vetor de direcionamento inserido no local (painel inferior da Figura 25). O eGFP foi escolhido como um repórter, de maneira que o imunofenótipo dos ratos geneticamente modificados pudesse ser examinado utilizando FACS. O cassete de auto-exclusão (hUb-Neo; Prm1-Cre) foi usado para excluir o cassete de seção de droga e o gene Cre especificamente em células germinais macho do rato F0. Além disso, o vetor de direcionamento foi concebido para eliminar toda a região de codificação (cerca de 3,2 kb) do gene de Il2rg de rato.
[00590] O tamanho da excluão nas ESCs de rato foi confirmado por PCR usando ativadores específicos para o local de Il2rg de rato. Após a microinjeção dos clones direcionados nos embriões hospedeiros em um estágio de blastocisto, quimeras de alta porcentagem foram obtidas. Essas quimeras foram criadas para reprodução. Para determinar se o direcionamento funcionou conforme esperado, o sangue periférico das quimeras foi coletado antes da reprodução e o fenótipo das células imunológicas no sangue periférico foi analisado via FACS. Como mostrado na Figura 30, as células positivas para GFP foram detectadas no sangue periférico em 2 das 3 quimeras examinadase os ratos quiméricos continham menos de 1% de células T, menos de 1% de células B e menos de 1% de células NK, as quais são positivas para GFP (ou seja, células KO deIl2rg ) (Figura 29A-C).
[00591] 3.4(a)(i). Direcionamento do local de Rag2 em ratos com um vetor de direcionamento grande (LTVEC)
[00592] A Tabela 26 proporciona um resumo da organização genômica do local do receptor gama de Rag2 de rato e as posições exibidas foram retiradas da construção 5.0 da sequência de referência do genoma de rato (ENSMBL). Rag2 está no cromossomo 3 na cadeia (+). Tabela 26. Resumo da organização genômica do local de Rag2 de rato.
Figure img0039
[00593] A Figura 26 proporciona um esquema do local Rag2 de rato e um vetor grande de direcionamento (LTVEC). O LTVEC é de 140 kb e tem como alvo uma porção de aproximadamente 5,7 kb do rato RAG2 locus para exclusão. O esquema superior da Figura 26 mostra a organização genômica do local da ApoE de rato e as regiões genômicas correspondentes aos braços de homologia em 5' e 3' (48 kb e 84 kb, respectivamente; as caixas cinza escuro). Rag2 compreende exon único representado pelo sombreamento cinza pontilhado.
[00594] O esquema na Figura 26 é o LTVEC. As porções de homologia 5 'e 3' (48 kb e 84 kb, respectivamente) são indicadas por caixas cinza escuro. O LTVEC compreende um gene repórter (lacZ) e um cassete de auto-exclusão flanqueado por locais loxP (setas abertas). A cassete de auto- exclusão compreende um promotor PRM1 de camundongo operacionalmente ligado ao gene Crei e uma cassete de seleção de droga que compreende um promotor de ubiquitina humana operativamente ligado a um gene de resistência à neomicina. Uma outra versão do LTVEC foi gerada, em que o gene de resistência à neomicina foi substituído por um gene de resistência à higromicina para permitir o redirecionamento de células ES de rato direcionadas por Il2rg. O Crei compreende dois exons que codificam a recombinase Cre que são separados por um íntron (Crei) para impedir sua expressão em uma célula procariótica. Ver, por exemplo, a Patente U.S. 8.697.851 e o Pedido de Publicação de Patente 2013-0312129, que descrevem o cassete de auto-exclusão em detalhe e são incorporados aqui por referência na sua totalidade. Através do uso do promotor Prm1 de camundongo, o cassete de auto-exclusão pode ser excluído especificamente em células germinais macho de ratos F0.
[00595] O LTVEC foi eletroporado em células ES de rato obtidas no Exemplo 1 e as células foram plaqueadas em 15 cm com 2x de densidade de neoR MEFs em 2i + 10 μM de ROCKi. As células ES de rato transformadas foram cultivadas e mantidas como descrito no Exemplo 1.
[00596] As colônias foram selecionadas conforme descrito em outro ponto desde documento e os clones direcionados são obtidos. Os clones direcionados são então injetados no embrião hospedeiro, conforme descrito em outro ponto desde documento, a fim de produzir um rato F0.
3.4(a)(ii). Direcionamento do local de Rag2 em ratos com um vetor de direcionamento grande (LTVEC) e CRISPR/Cas9
[00597] A Tabela 23 mostra uma comparação dos resultados de experimentos em que o LTVEC daRag2 com um gene de resistência à higromicina (ver Figura 48) foi usado isoladamente para direcionar o local de Rag2 de rato ou usado em combinação com uma nuclease de CRISPR/Cas9 para direcionar o local de Rag2 de rato. Em cada experimento, as células eletroporadas foram plaqueadas a uma densidade elevada e submetidas a seleção com drogas para encontrar colônias que fossem resistentes aos medicamentos. As colônias resistentes a droga foram selecionadas e triadas quanto à modificação direcionada utilizando-se um ensaio de modificação de alelo (MOA), conforme descrito neste documento. Especificamente, 4 x 106 células foram eletroporadas com 2μg do LTVEC de Rag2 a uma voltagem de 400 V, uma capacitância de 100 μF e uma resistência igual a 0. Neste último experimento, 6 μg de plasmídeo de expressão Cas9 e 3 μg de gRNA1 de RAG2 ou 3 μg de gRNA4 de RAG2 também foram eletroporadas. A seleção foi feita utilizando 75 μg/mL de G418. O gRNA1 deRag2 tem uma sequência de CCAGCTACTTGCTCGTACAA (SEQ ID NO: 89) e tem como alvo uma região de 219 pb em 3' do códon inicial de Rag2 de rato (ATG). O gRNA4 deRag2 tem uma sequência de CCCCTCAGATTCACGTGCGT (SEQ ID NO: 90) e tem como alvo uma região de 12 pb em 3' do códon de interrupção de Rag2 de rato (TAG) (ver Figura 48). Como mostrado na Tabela 27, quando Cas9 e qualquer um dos gRNAs foram introduzidos nas células juntamente com o LTVEC de Rag2, a eficiência de direcionamento aumentou (de 0 a 10% ou 38%). Um direcionamento bialélico foi observado em uma colônia. Tabela 27. Comparação do direcionamento do LTVEC de Rag2 com e sem CRISPR/Cas9
Figure img0040
3.4.(b)(i): Direcionamento do local de Rag1 e Rag2 em ratos
[00598] A Figura 27 apresenta o local de Rag1/Rag2 de rato. CDS representa a sequência de codificação e as caixas cinzas representam exons. Rag2 está na cadeia "mais" com a transcrição à direita. Rag1 está na cadeia "menos" com a transcrição à esquerda. Mbp = pares de base de milhão
[00599] A Tabela 26 proporciona um resumo da organização genômica do local de Rag2 e Rag1 de rato e as posições exibidas foram retiradas da construção 5.0 da sequência de referência do genoma de rato (ENSMBL). Rag1 está no cromossomo 3 na cadeia (-). Tabela 28. Resumo da organização genômica do local de Rag1 de rato.
Figure img0041
[00600] A Figura 28 apresenta um esquema do local de Rag2 e Rag1 de rato e um vetor de direcionamento grande (LTVEC). O LTVEC tem cerca de 70 kb e se direciona a um local genômico de rato de aproximadamente 16,6kb que compreende os locais Rag1 e Rag2 para exclusão. O esquema superior da Figura 28 mostra a organização genômica dos locais Rag1 e Rag2 de rato e as regiões genômicas cognatas correspondentes aos braços de homologia em 5' e 3' (48 kb e 15 kb, respectivamente; caixas cinza escuro). Rag2 e Rag 1 compreendem, cada, um exon único representado pelo sombreamento cinza pontilhado. O esquema inferior na Figura 28 é o LTVEC. As porções de homologia 5 'e 3' (48 kb e 15 kb, respectivamente) são indicadas por caixas cinza escuro. O LTVEC compreende um gene repórter (lacZ) e um cassete de auto-exclusão flanqueado por locais loxP (setas abertas). O cassete de auto-exclusão compreende um promotor Prm1 de camundongo operacionalmente ligado ao gene Crei e um cassete de seleção de droga que compreende um promotor de ubiquitina humana operativamente ligado a um gene de resistência à neomicina. Uma outra versão do LTVEC foi gerado, em que o gene de resistência à neomicina foi substituído por um gene de resistência à higromicina para permitir o redirecionamento de células ES de rato direcionadas por IL2RG. O Crei compreende dois exons que codificam a recombinase Cre é separado por um íntron (Crei) para impedir sua expressão em uma célula procariótica. Ver, por exemplo, a Patente U.S. 8.697.851 e o Pedido de Publicação de Patente 2013-0312129, que descrevem o cassete de auto-exclusão em detalhe e são incorporados aqui por referência na sua totalidade. Ao empregar um promotor de PRM1 de rato que impulsiona a expressão de Crei especificamente em células germinais de macho, o cassete de auto-exclusão pode ser excluído das células germinais de macho dos ratos F0.
[00601] O LTVEC foi eletroporado em células ES de rato obtidas no Exemplo 1 e as células foram plaqueadas em 15 cm com 2x de densidade de neoR MEFs em 2i + 10 μM de ROCKi. As células ES de rato transformadas foram cultivadas e mantidas como descrito no Exemplo 1.
[00602] As colônias foram selecionadas conforme descrito em outro ponto desde documento e os clones direcionados são obtidos. Os clones direcionados são então injetados no embrião hospedeiro, conforme descrito em outro ponto desde documento, a fim de produzir um rato F0.
3.4.(b)(ii): O redirecionamento dos locais Rag1 e Rag2 nas células ES de ratos em que o local Il2RG já tinha sido direcionado.
[00603] Um LTVEC, conforme descrito na Figura 50, foi preparado para direcionar os locais Rag1 e Rag2 para exclusão. O comprimento total do LTVEC foi de 72 kb. O LTVEC foi eletroporado em células ES de rato que já haviam sido direcionadas para a exclusão do local de Il2RG , como no Exemplo 3.3. Especificamente, as células ES de rato foram clonados a partir do clone Il2RG-CG12, para o qual a transmissão de linha germinal foi confirmado no Exemplo 3.3(a). As células ES de rato transformadas foram cultivadas e mantidas como descrito no Exemplo 1. Os clones duas vezes direcionados foram selecionados conforme descrito em outro ponto deste documento e clones direcionados foram obtidos. As célulasIL2RG-CG12 foram redirecionadas com uma eficiência de 85% e as mutações de Il2RG ainda estavam presentes nos clones direcionados. A eletroporação foi efetuada conforme descrito em outro ponto deste documento e a seleção do antibiótico foi realizada utilizando 1,5 μg/ml de puromicina. Os clones direcionados então serão injetados no embrião hospedeiro, conforme descrito em outro ponto desde documento, a fim de produzir um rato F0. O redirecionamento é vantajoso porque é mais rápido do que o cruzamento de ratos direcionados com RAG1/RAG2com ratos direcionados com Il2RG.
Exemplo 4. Humanização 4.1. Humanização dos locais genômicos de rato
[00604] A humanização dos locais genômicos de rato é realizada empregando-se as células ES de rato aqui descritas, que são capazes de sustentar sua pluripotência após uma ou mais eletroporações in vitroe são capazes de transmitir as modificações genéticas direcionados para as gerações seguintes. Além disso, a fim de contornar as limitações de plasmídeos em acomodar um grande fragmento de DNA genômico, e para superar a baixa eficiência de introdução de uma modificação genética direcionada para um local endógeno em células ES de rato, uma ou mais modificações genéticas direcionadas são realizadas em bactérias, por exemplo, E. coli, utilizando-se uma recombinação homóloga bacteriana (BHR) e empregando-se um vetor de direcionamento grande (LTVEC). O LTVEC descrito aqui inclui, por exemplo, um fragmento grande de uma sequência genômica de rato endógena com uma ou mais modificações ou compreende um ácido nucleico exógeno (por exemplo, um ácido nucleico humano homólogo ou ortólogo) flanqueado pelos braços de homologia de rato complementares às regiões genômicas específicas.
4.2. Humanização de locais de imunoglobulina de rato
[00605] A humanização de um local de cadeia pesada de imunoglobulina de rato endógena é realizada removendo-se uma ou mais sequências de ácido nucleico de cadeia pesada de imunoglobulina de rato endógena (por exemplo, um ou mais segmentos de gene VH endógeno, um ou mais segmentos de gene D humano e um ou mais segmentos de gene JH humano); e introduzindo-se no local de imunoglobulina modificado um vetor de direcionamento, por exemplo: um vetor de direcionamento grande (LTVEC) compreendendo: (i) uma ou mais sequências humanas não rearranjadas de ácido nucleico de região variável (por exemplo, um ou mais segmentos de gene VH humano ou um ou mais segmentos de gene D humano e um ou mais segmentos de gene JH humano) ou uma ou mais sequências de ácido nucleico de região variável humana rearranjadas (por exemplo, um ou mais segmentos de gene V-D-J rearranjados); (ii) um cassete de seleção (por exemplo, gene de resistência à neomicina flanqueado com locais loxP); e (iii) os braços de homologia de rato em 5' e 3'.
[00606] Em resumo, os segmentos de gene de região variável de cadeia pesada de imunoglobulina de rato endógena (quais sejam, um ou mais segmentos de gene VH , um ou mais segmentos de gene D humano e um ou mais segmentos de gene JH humano) em um clone de BAC de rato são removidos ou desativados pelo direcionamento do local de cadeia pesada de imunoglobulina de rato endógena com um cassete de seleção flanqueado por braços de homologia de rato. Mais especificamente, um vetor de direcionamento é construído de modo a conter um cassete de seleção (por exemplo, um gene de resistência à neomicina flanqueado por locais de loxP) flanqueado por braços de homologia de rato em 5' e 3' que são complementares às sequências genômicas de rato alvo (por exemplo, sequências de DNA genômico de rato à montante ou à jusante englobando um ou mais segmentos de gene VH de rato, um ou mais segmentos de gene D humano e um ou mais segmentos de gene JH humano).
[00607] Em seguida, as células bacterianas que contêm um fragmento de DNA genômico grande de rato que engloba um local de cadeia pesada de imunoglobulina de rato são selecionados e inseridos com um plasmídeo (por exemplo, pABG) que codifica uma recombinase operacionalmente ligada a um promotor indutível de modo transiente. O vector de direcionamento construído acima é então introduzido nas células bacterianas competentes para recombinação. Após a eletroporação, as células bacterianas são tratadas com um indutor (por exemplo, arabinósido) para iniciar a recombinação homóloga entre o vetor de direcionamento e a sequência genômica de rato alvo no clone de BAC. As células transformadas são plaqueadas a uma densidade elevada e submetidas a seleção com drogas para encontrar colônias que sejam resistentes aos medicamentos. As colônias resistentes a droga são selecionadas e triadas para a modificação direcionada.
[00608] A fim de facilitar a identificação da modificação genética direcionada, um ensaio quantitativo de alto rendimento, isto é, um ensaio de modificação de alelo (MOA), é empregado, o que permite uma triagem de larga escala do(s) alelo(s) modificado(s) em um cromossomo parental após uma modificação genética. O ensaio MOA pode ser realizado através de várias técnicas analíticas, incluindo, mas não limitado a, um PCR quantitativo, por exemplo, um PCR em tempo real (qPCR). Por exemplo, a PCR em tempo real compreende um primeiro conjunto de iniciadores que reconhece o locus alvo e um segundo conjunto de iniciadores que reconhece um locus de não alvejado de referência. Além disso, o conjunto de iniciadores pode compreender uma sonda fluorescente que reconhece a sequência amplificada. Alternativamente, o ensaio quantitativo pode ser levada a cabo através de uma variedade de técnicas analíticas, incluindo, mas não se limitando a, hibridação in situ mediada por fluorescência (FISH), hibridização genômica comparativa, ampliação isotérmica de DNA, hibridização quantitativa para sonda(s) imobilizada(s), sondas Probes®, ensaios MMP®, TaqMan®, Molecular Beacon e tecnologia de sonda Eclipse™. (Ver, por exemplo, US2005/0144655, incorporada aqui por referência na sua totalidade).
[00609] As células bacterianas compreendendo o clone BAC de rato modificado, isto é, um clone de BAC que contém uma sequência de DNA genômico de rato onde um ou mais segmentos de gene de região variável de cadeia pesada endógena (segmentos de gene VH, D e/ou JH ) foram excluídos ou desativados, são então eletroporadas com um vetor de direcionamento grande (LTVEC) que compreende: (i) uma ou mais sequências de ácidos nucleicos não rearranjadas de região variável humana (por exemplo, um ou mais segmentos de gene VH humano não rearranjados, um ou mais segmentos de gene D humano, e um ou mais segmentos de gene JH humano) ou uma ou mais sequências de ácidos nucleicos de região variável humana rearranjada (por exemplo, um ou mais segmentos de gene V-D-J humano rearranjado).
[00610] A iniciação de recombinação homóloga nas células bacterianas e a seleção de clones positivos são realizadas como descrito acima. As sequências de ácidos nucleicos de região variável de cadeia pesada de imunoglobulina humana rearranjadas ou não rearranjadas, quando direcionadas no local de cadeia pesada de imunoglobulina endógena, tornam- se ligadas operacionalmente a uma sequência de ácido nucleico de região constante de cadeia pesada de imunoglobulina de rato endógena. Alternativamente, o local de região constante de cadeia pesada de rato endógena pode ser desativado, por exemplo, excluindo-se um ou mais segmentos de gene de região constante de cadeia pesada de rato (CH) do local de região constante de cadeia pesada endógena, e pode ser substituído por uma sequência de ácidos nucleicos de região constante de cadeia pesada humana.
[00611] Da mesma forma, a humanização de um local de cadeia leve K e X de imunoglobulina de rato endógena é realizada pela remoção de uma ou mais sequências de ácidos nucleicos de região variável de cadeia leve K e/ou X (por exemplo, um ou mais segmentos de gene VK de rato endógeno e um ou mais segmentos de gene Jk de rato endógeno); e o direcionamento do local de cadeia leve de imunoglobulina modificada com um vetor de direcionamento, por exemplo, um vetor de direcionamento grande (LTVEC), compreendendo: (i) uma ou mais sequências de ácidos nucleicos de região variável de cadeia leve de imunoglobulina humana rearranjadas ou não rearranjadas de ácido nucleico de região variável (por exemplo, um ou mais segmentos de gene Vk e um ou mais segmentos do gene Jk humano) ou uma ou mais sequências de ácidos nucleicos de região variável humana (por exemplo, um ou mais segmentos de gene Vk-Jk humano rearranjados); (ii) um cassete de seleção (por exemplo,gene de resistência à neomicina flanqueado com locais loxP); e (iii) os braços de homologia de rato em 5' e 3'.
[00612] As sequências de ácidos nucleicos de região variável de cadeia leve de imunoglobulina humana rearranjadas ou não rearranjadas, quando direcionadas no local de cadeia leve de imunoglobulina endógena, tornam-se ligadas operacionalmente a uma sequência de ácido nucleico de região constante de cadeia leve de imunoglobulina de rato endógena.
[00613] O LTVEC produzido dessa forma nas células bacterianas compreende, por exemplo, um ácido nucleico de inserção que contém um local de cadeia leve ou pesada de imunoglobulina de rato humanizada em que um ou mais segmentos de gene de região variável de cadeia leve ou pesada de rato endógena podem ser substituídos por um ou mais segmentos de gene de região variável de cadeia leve ou pesada humana; e braços homólogos de rato (por exemplo, variando entre 5 kb e 150 kb) complementares a sequências genômicas específicas alvo. O LTVEC que compreende a modificação genética descrita acima é então linearizado e eletroporado nas células ES de rato. As células ES de rato eletroporadas são plaqueadas a uma densidade elevada para selecionar as células ES resistentes a medicamentos que compreendem o vetor de direcionamento. O processo de seleção de drogas elimina a maioria das células plaqueadas (~ 99%), deixando para trás as colônias individuais, cada um dos quais é um clone derivado de uma única célula. Das células restantes, a maioria das células (~ 80-100%) contém o vetor de direcionamento integrado em uma localização aleatória no genoma. Por conseguinte, as colônias são selecionadas e genotipadas individualmente para identificar células ES de rato que compreendem o vetor de direcionamento no local genômico correto (por exemplo, utilizando o ensaio de modificação de alelo (MOA) descrito acima).
[00614] A fim de aumentar a eficácia da modificação genética direcionada, as células ES de rato são eletroporadas com vetores de expressão (ou mRNA) que expressam ZFNs 1 e 2 (ou TALENs 1 e 2) juntamente com o LTVEC. Os braços de homologia do vetor de direcionamento ficam do lado externo do local alvo de ZFN e, assim, o vetor de direcionamento não é clivado pelas ZFNs. A quebra de cadeia dupla pelas ZFNs estimula o reparo direcionado por homologia (HDR), que é responsável por uma porcentagem bastante pequena de reparos ocorridos normalmente em células de mamíferos (em comparação a uma junção de extremidades não homólogas; NHEJ).
[00615] Em alternativa, os vetores de expressão que contêm uma nuclease associada a CRISPR de tipo II (por exemplo, Cas9), um RNA de orientação (incluindo CRIPR-RNA (cr-RNA) e um RNA CRISPR de trans- ativação (tracrRNA), conforme descrito aqui, pode ser inserido nas células bacterianas juntamente com o LTVEC para aumentar a eficácia da recombinação homóloga no local genômico alvo. As células eletroporadas são plaqueadas a uma densidade elevada e submetidas a seleção com drogas para encontrar colônias que sejam resistentes aos medicamentos. As colônias resistentes a droga são selecionadas e triadas quanto à modificação direcionada utilizando-se um ensaio de modificação de alelo (MOA), conforme descrito neste documento. Seguindo esses procedimentos, pode ser obtida uma melhoria na eficiência de direcionamento. Por exemplo, a quantidade de melhoria pode ser pequena (por exemplo, melhorar de 10% a 15%) ou grande (por exemplo, melhorar de 10% a 80%).
[00616] As células ES de rato selecionadas compreendendo a modificação genética direcionada são então introduzidas em um embrião de rato hospedeiro, por exemplo, um estágio pré-mórula ou um embrião de rato em estágio de blastocisto, e implantados no útero de uma mãe substituída para gerar um rato fundador (rato F0). Posteriormente, o rato fundador é criado como um rato de tipo selvagem para criar heterozigotos de progênie F1 para a modificação genética. Cruzamento do rato heterozigoto F1 pode produzir prole homozigótica para a modificação genética. 4.3. a). Substituição de IL2RG de rato pelo receptor gama IL2 humano A Tabela 29 proporciona um resumo da organização genômica do local do receptor gama da interleucina 2 de rato e as posições exibidas foram retiradas da construção 5.0 da sequência de referência do genoma de rato (ENSMBL). Il2rg é um cromossomo X na cadeia (-). Tabela 29. Resumo da organização genômica do local Il2RG de rato
Figure img0042
[00617] O esquema inferior da Figura 25 é o vetor de direcionamento para o a eliminação da Il2RG de 3,2 kb. O vetor de direcionamento compreende um gene repórter (eGFP) operacionalmente ligado ao promotor endógeno e um cassete de auto-exclusão flanqueado por locais loxP (setas abertas). O cassete de auto-exclusão compreende o gene Crei operacionalmente ligado a um promotor PRM1 de camundongo e um cassete de seleção que compreende um gene de resistência à neomicina operacionalmente ligado a um promotor de ubiquitina humana.
[00618] O gene Crei compreende dois exons que codificam uma recombinase Cre, que é separada por um íntron (Crei) para impedir sua expressão em uma célula procariótica. Ver, por exemplo, a Patente U.S. 8.697.851 e o Pedido de Publicação de Patente 2013-0312129, que descrevem o cassete de auto-exclusão em detalhe e são incorporados aqui por referência na sua totalidade. Através do uso do promotor Prm1 de camundongo, o cassete de expressão de Cre e o cassete de seleção de droga podem ser excluídos especificamente nas células germinais macho dos ratos F0. O vetor de direcionamento foi eletroporado em células ES de rato obtidas no Exemplo 1 e as células foram plaqueadas em 15 cm com 2x de densidade de neoR MEFs resistentes à neomicina em 2i + 10 μM de ROCKi. As células ES de rato transformadas foram cultivadas, selecionadas e mantidas como descrito no Exemplo 1.
[00619] Um vetor de direccionamento de plasmídeo foi construído para substituir a região de codificação do receptor gama de interleucina 2 de rato com comprimento completo por uma região de codificação do receptor gama de interleucina 2 humana de comprimento total, conforme mostrado na Figura 31. O vetor de direcionamento foi eletroporado em células ES de rato obtidas no Exemplo 1 e as células foram plaqueadas em 15 cm com 2x de densidade de neoR MEFs resistentes à neomicina em 2i + 10 μM de ROCKi. Especificamente, 4 x 106 células foram eletroporadas com 2 μg de um vetor de humanização Il2RG de comprimento completo a uma voltagem de 400V, uma capacitância de 100 μF e uma resistência igual a 0. A seleção foi feita utilizando 75 μg/mL de G418. As células ES de rato transformadas foram cultivadas, selecionadas e mantidas como descrito no Exemplo 1.
[00620] Como mostrado na Tabela 44, 168 colônias foram selecionadas e obtiveram-se 6 clones direcionados. A eficiência de direcionamento foi de 3,57%. Um clone foi injetado em blastocistos como descrito no Exemplo 1, e um clone que produz quimeras foi obtido.
[00621] Os clones foram injetados em blastocistos, tal como descreve- se aqui, no Exemplo 1. Obtiveram-se clones produtores de ratos quiméricos F0. Os blastocistos foram transferidos para fêmeas pseudográvidas receptoras usando técnicas convencionais e ratos quiméricos F0 foram obtidos. São obtidos ratos F0 que direcionaram a modificação através da linha germinal. 4.3(b)(i). Substituição do ectodomínio de Il2RG de rato por ectodomínio de Il2RG de humano
[00622] A humanização de comprimento completo do receptor gama IL 2 é útil porque os ratos com este local modificado produzirão Il2rg de humano; isso permitiria a detecção de Il2rg humano em ratos com anticorpos específicos para Il2rg de humano.
[00623] A ecto-humanização (isto é, substituição do ectodomínio de rato de Il2rg por um ectodomínio humano de Il2rg) resultará em um polipeptídeo de Il2rg que se ligará aos ligantes humanos por Il2rg, mas, visto que o domínio citoplásmico ainda é o de rato, sua forma ecto-humanizada de Il2rg também interagirá com a maquinaria de sinalização de rato. A Figura 33 proporciona um alinhamento de sequências da proteína IL-2RG humana (SEQ ID NO: 20; NP_000197.1); a proteína de rato IL-2RG (SEQ ID NO: 21; NP_543165.1); e a proteína quimérica IL-2RG (SEQ ID NO: 22) que compreende o ecto-domínio humano de IL-2RG fundido com o restante da proteína de rato IL-2RG. A junção entre a IL-2RG humana e de rato é indicada pela linha vertical.
[00624] A Tabela 30 proporciona um resumo da organização genômica do local do receptor gama da interleucina 2 de rato e as posições exibidas foram retiradas da construção 5.0 da sequência de referência do genoma de rato (ENSMBL). Il2rg está no cromossomo X na fita (-). Observa-se ainda a posição do ectodomínio de Il2rg. Tabela 30. Resumo da organização genômica do lócus Il2rg do rato
Figure img0043
[00625] Um vetor de direcionamento do plasmídeo foi construído para substituir o ecto-domínio da região codificadora gama do receptor de interleucina 2 com o ecto-domínio humano como mostrado na Figura 32. O vetor de direcionamento foi eletroporado em células ES de rato obtidas no Exemplo 1 e as células foram plaqueadas em 15 cm com 2x de densidade de neoR MEFs resistentes à neomicina em 2i + 10 μM de ROCKi. As células ES de rato transformadas foram cultivadas, selecionadas e mantidas como descrito no Exemplo 1.
[00626] Como mostrado na Tabela 44, 192 colônias foram selecionadas e foram obtidos 13 clones direcionados. A eficiência de direcionamento foi 6,77%.
[00627] Dois clones foram injetados com blastocistos conforme descrito neste documento no Exemplo 1 e foram obtidas dois clones que produziam quimeras. Foram obtidos clones produtores de ratos F0. São obtidos ratos F0 que direcionaram a modificação através da linha germinal. 4.3(b)(ii). Substituição do Ectodomínio de Il2rg de rato por Ectodomínio de Il2rgHumano Usando Plasmídeo em Combinação com CIRSPR/Cas9
[00628] A Tabela 31 mostra uma comparação dos resultados dos experimentos em que uma versão do vetor de humanização do ectodomínio de Il2rg mostrado na Figura 32 foi usada sozinha para direcionar o lócus de Il2rg do rato ou foi usada em combinação com a nuclease de CRISPR/Cas9 para direcionar o lócus de Il2rg do rato. Em cada experimento, as células eletroporadas foram plaqueadas a uma densidade elevada e submetidas a seleção com drogas para encontrar colônias que fossem resistentes aos medicamentos. As colônias resistentes a droga foram selecionadas e triadas quanto à modificação direcionada utilizando-se um ensaio de modificação de alelo (MOA), conforme descrito neste documento. Especificamente, 4 x 106 células foram eletroporadas com 2 μg de um vetor de humanização de ectodomínio de Il2rg em uma voltagem de 400 V, uma capacitância de 100 μF e uma resistência igual a 0. Neste último experimento, 6 μg de plasmídeo de expressão Cas9 e 3 μg de Il2rg gRNA2 ou 3 μg de Il2rg gRNA4 também foram eletroporados. A seleção foi feita utilizando 75 μg/mL de G418. OgRNA2 de Il2rg tem uma sequência de GAAGCTCTTTCTATACAATCTGG (SEQ ID NO: 91) e direciona uma região de 190 bp 3' do éxon 1 de Il2rg do rato. O gRNA4 de Il2rg tem uma sequência de CCCCCGAAAGGAGGAGCCCTAGG (SEQ ID NO: 92) e direciona uma região 80 bp 5' do códon de terminação de Il2rg (TGA) (ver Figura 49). Tabela 31. Comparação do Direcionamento do Vetor de Humanização de Ectodomínio de Il2rg com e sem CRISPR/Cas9
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4.4(a). Aumento do Direcionamento por Endonucleases de CRISPR/Cas9 de Eliminações de Gene Animal Não-Humano Grande com Substituições Simultâneas de Gene Humano
[00629] Drogas recentemente desenvolvidas para condições de doença humana, como anticorpos completamente humanos, são muitas vezes altamente específicas para os seus alvos nas células e tecidos humanos e não reconhecem os alvos homólogos em roedores. Este nível de seletividade elevado torna impossível testar a eficácia e o mecanismo da ação das drogas em roedores antes do seu primeiro uso nos humanos.
[00630] Uma solução muito eficaz para este problema é criar um camundongo ou rato geneticamente modificado em que o gene humano que codifica o alvo da droga substitua o homólogo do roedor. Uma maneira de criar um alelo tal humanizado em um roedor é primeiro eliminar o gene do roedor em uma célula-tronco embrionária (ES) e, em seguida, em um segundo evento de modificação genética, inserir o gene humano precisamente no lócus eliminado. As células ES são então injetadas em um embrião de roedor e implantadas no útero de uma mãe de aluguel de roedor que, posteriormente, dá à luz a filhotes geneticamente modificados que carregam o alelo humanizado.
[00631] Um método mais eficiente de criação da modificação genética humanizada consiste em usar um vetor de direcionamento grande (LTVEC) que direciona a eliminação simultânea do gene do roedor e a substituição pela sua contraparte humana. Ao empregar métodos de engenharia genética da VELOCIGENE® , essas humanizações de etapa única podem ser conseguidas com eficiência relativamente alta quando a eliminação do gene do roedor e a inserção do gene humano são menores do que cerca de 20 pares de quilobases (kb). As humanizações de etapa única maiores que implicam eliminações e substituições de mais de 100 kb são possíveis com LTVECs e métodos de engenharia genética como métodos de engenharia da VELOCIGENE® , mas por causa de eficiências de direcionamento reduzidas por vezes encontradas com modificações muito grandes, o sucesso muitas vezes requer a seleção de centenas a milhares de clones de células ES para encontrar uma que carregue a modificação genética desejada.
[00632] Para melhorar a eficiência de humanizações grandes desenvolvemos métodos que combinam direcionamento do gene de LTVEC com endonucleases de Cas9 guiadas por RNA de repetição palíndromo curto regularmente interespaçado (CRISPR/Cas9). As nucleases de CRISPR/Cas9 são enzimas de ribonucleoproteína constituídas por uma endonuclease de DNA de Cas9 bacteriano ligadas a um RNA de CRISPR orienta Cas9 para clivar em uma sequência de DNA específica pelo emparelhamento de bases de Watson-Crick entre o RNA guia e uma fita do DNA alvo. Devido à simplicidade do mecanismo de direcionamento, é fácil designar as endonucleases de CRISPR/Cas9 que direcionam uma ruptura de fita dupla quase em qualquer lócus genômico. As rupturas de fita dupla induzem reparação genômica celular por vias de união terminal não-homóloga (NHEJ), que são propensas a erros e, muitas vezes, resultam em deleções ou inserções no sítio da ruptura de fita dupla. Um mecanismo alternativo de reparo da ruptura de fita dupla é o reparo direcionado por homologia (HDR) em que uma peça endógena ou exógena de DNA que compartilha identidade ou similaridade de sequência com o sítio rompido repara, de forma integrada, os terminais rompidos pela ação da maquinaria de recombinação homóloga celular. HDR pode resultar em um reparo perfeito que restaura a sequência original no sítio rompido ou ele pode ser usado para direcionar uma modificação concebida, como uma eliminação, inserção ou substituição da sequência no sítio do rompimento da fita dupla. As nucleases de CRISPR/Cas9 podem aumentar consideravelmente a taxa de eventos de HDR de engenharia pelo direcionamento de clivagens precisas de fita dupla nos sítios das modificações genéticas pretendidas.
[00633] Para efetuar uma eliminação precisa e de etapa única de todo ou de parte de um gene de roedor e substituição simultânea por todo ou parte do seu homólogo humano, introduzimos por eletroporação em células ES de roedor três moléculas de ácido nucleico: (1) um LTVEC ; (2) um plasmídeo ou mRNA que codifica uma endonuclease de Cas9; e (3) um plasmídeo que codifica um RNA guia único de CRISPR (sgRNA) ou o próprio sgRNA. LTVEC é constituído por todo ou parte de um gene humano que codifica o produto gênico (proteína ou RNA) flanqueado por braços de homologia do DNA de roedor designado para direcionar um evento de HR que elimina o gene do roedor e insere o gene humano. O LTVEC humanizante também carregou uma cassete de seleção de drogas que direciona a expressão de uma enzima (p.ex., neomicina fosfotransferase) que confere resistência a uma droga antibiótica (p.ex., G418). As células ES que assumiram o LTVEC e incorporaram-nas aos seus genomas foram capazes de crescer e formar colônias em uma placa de Petri em um meio de crescimento que contém droga antibiótica. Porque introduzimos 500 a 1000 vezes mais moléculas nucleicas que codificam CRISPR/Cas9 do que moléculas de LTVEC, a maior parte das colônias resistentes da droga contendo LTVEC também continham pelo menos transientemente componentes de CRISPR/Cas9. Escolhemos colônias resistentes a drogas e fizemos a triagem pelo método de perda de alelo (Valenzuela, D. et al. (2003) High-throughput engineering of the mouse genome coupled with high-resolution expression analysis, Nature Biotech. 21:652-660; Frendewey, D. et al. (2010) The loss-of-allele assay for ES cell screening and mouse genotyping, Methods Enzymol. 476:295-307; incorporados a este documento por referência na sua totalidade) para identificar clones que tinham alelo corretamente direcionado.
[00634] Em um experimento particular, LTVEC foi designado para criar uma eliminação de 68 kb do gene Lrp5 (proteína 5 relacionada ao receptor de lipoproteína de baixa densidade) do camundongo e uma substituição simultânea por um fragmento de 91 kb do gene LRP5 humano homólogo (Figura 34). O LTVEC é constituído do fragmento de 91 kb do gene LRP5 humano flanqueado por braços de homologia contendo 7 kb e 33 kb de DNA genômico derivado de partes do lócus de Lrp5 do camundongo que flanqueiam a sequência de 68 kb do gene Lrp5 do camundongo destinado à eliminação. Em experimentos separados, combinamos o LTVEC humanizante Lrp5 com um plasmídeo que codifica Cas9 e um segundo plasmídeo que codifica um dos oito sgRNAs (gA, gB, gB2, gC, gD, gE2, gE, gF) destinados a criar rupturas de fitas duplas na região do gene Lrp5 do camundongo que foi direcionado para eliminação. Os sgRNAs foram concebidos para evitar o reconhecimento de qualquer sequência na parte inserida do gene LRP5 humano.
[00635] Os resultados da humanização assistida por CRISPR/Cas9 do gene Lrp5 são mostrados na Tabela 32. Quando o LTVEC sozinho foi introduzido nas células-tronco, constatamos que 1,0% dos clones resistentes à droga triados carregaram um alelo humanizado heterozigoto monoalélico corretamente direcionado. Por outro lado, a combinação de LTVEC com endonucleases de Cas9 guiadas por sete dos oito sgRNAs testados (sgRNA- 5'A, sgRNA-5'B, sgRNA-5'B2, sgRNA-C, sgRNA-D, sgRNA-3'E2, and sgRNA-3'F; sequências apresentadas na Tabela 33) produziu mutações de heterozigoto monoalélico corretamente direcionado em eficiências que variaram de 2,1 a 7,3%, o que representa uma potencialização de 2 a 9 vezes do direcionamento do gene humanizado de etapa única em comparação com LTVEC não assistido. Para a clivagem guiada por Cas9 por sgRNA-5'B2, além do direcionamento monoalélico, detectamos humanização de homozigoto bialélico com uma frequência de 1%. As células ES humanizadas deLrp5 de homozigoto podem ser convertidas em método de engengaria genética de VELOCIMOUSE® (Poueymirou, W. T. et al. em camundongos de geração F0 (2207) totalmente derivados de células-tronco embrionárias direcionadas por gene que permitem análises fenotípicas imediatas, Nature Biotech. 25:91-99, incorporados a este instrumento por referência na sua totalidade) diretamente em camundongos derivados completamente de células-tronco estaminais para estudos de eficácia fenotípica e de droga. Tabela 32. Resultados da Triagem para Humanização Assistida por CRISPR/Cas9 do Gene Lrp5 .
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Tabela 33. Sequências das Partes Guia de Seis sgRNAs que Direcionam Gene Lrp5 do Camundongo.
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[00636] O direcionamento aprimorado da humanozação de Lrp5 grande por endonucleases de CRISPR/Cas9 é notável em comparação com experimentos equivalentes realizados com nucleases de dedo de zinco (ZFNs). Obtivemos quatro ZFNs concebidos para efetuar rupturas de fitas duplas em sítios dentro da região do gene Lrp5 do camundongo direcionado para eliminação (Figura 34). Um ZFN direcionou uma sequência próxima do terminal 5' da eliminação (a), direcionou uma sequência no meio da eliminação (b), e duas sequências direcionadas próximas ao terminal 3' da eliminação (c, d). Em experimentos separados, combinamos o LTVEC humanizante Lrp5 com um plasmídeo que codifica um dos quatro ZFNs (a-d) destinados a criar rupturas de fita dupla na região do gene Lrp5 do camundongo que foram direcionadas para eliminação. Determinamos que todos os ZFNs estavam ativos e capazes de induzir mutações em NHEJ no gene Lrp5 (dados não mostrados), mas quando combinados com LTVEC, nenhum direcionamento de gene mediado por HDR aprimorado em comparação com LTVEC apenas.
[00637] A eficiência do direcionamento aprimorada da humanização de Lrp5 grande por endonucleases de CRISPR/Cas9 também é notável em comparação com uma série de experimentos de humanização assistidos por ZFN. Nestes experimentos, foi realizada uma série de humanizações assistidas por ZFN que as eliminações do gene alvo do camundongo e as inserções do gene humano eram geralmente de tamanho crescente (Tabela 34; Figura 35). A Figura 35A representa a eficiência de direcionamento percentual dos LTVECs que direcionam genes de tamanho crescente para eliminação. Os LTVECs foram usados isoladamente (quadrados cinza) ou em combinação com ZFNs (quadrados pretos). A Figura 35B representa a eficiência de direcionamento percentual dos LTVECs com inserções de gene humano de tamanho crescente. Novamente, os LTVECs foram usados isoladamente (triângulos cinza) ou em combinação com ZFNs (triângulos pretos). Como mostrado na Tabela 34 e Figura 35, a capacidade da clivagem de DNA mediada por ZFN para aprimorar a eficiência de direcionado do LTVEC desapareceu quando o tamanho da eliminação do gene alvo do camundongo foi maior do que 24,7 kb e quando o tamanho da inserção do gene humano foi superior a 22,2 KB (Tabela 34; Figura 35A). Por outro lado, CRISPR/Cas9 foi capaz de aumentar a eficiência do direcionamento de LTVEC do gene Lrp5 , o que envolveu uma eliminação do gene do camundongo de 68,3 kb e uma inserção do gene humano de 91,0 kb (Tabela 32; Figura 34). Isso indica que as endonucleases CRISPR/Cas9 são capazes de aprimorar a eficiência do direcionamento de LTVEC em situações em que outras nucleases (por exemplo, nucleases de dedo de zinco) não podem. Tabela 34. Resumo das Humanizações Assistidas por ZFN.
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n.d. = não determinado n.a. = não aplicável ( ) = eficiência de direcionamento inferior com ZFN do que sem
[00638] Os experimentos comparáveis foram realizados para a humanização de outros genes do camundongo. Em outro experimento, o LTVEC foi designado para criar uma exclusão de 45 kb do gene Trpa1 (membro 1 da subfamília A do canal de cátion potencial do receptor transiente) do camundongo e uma substituição simultânea por um fragmento de 55 kb do gene TRPA1 humano homólogo (Figura 36). O LTVEC é constituído do fragmento de 55 kb do gene TRPA1 humano flanqueado por braços de homologia contendo 41 kb e 58 kb de DNA genômico derivado de partes do lócus de Trpa1 do camundongo que flanqueiam a sequência de 45 kb do gene Trpa1 do camundongo destinado à eliminação. Em experimentos separados, combinamos o LTVEC humanizante Trpa1 com um plasmídeo que codifica Cas9 e um segundo plasmídeo que codifica um dos oito sgRNAs (gA, gA2, gB, gC, gD, gE, gE2 e gF) destinados a criar rupturas de fitas duplas na região do gene Trpa1 do camundongo que foi direcionado para eliminação. Os sgRNAs foram concebidos para evitar o reconhecimento de qualquer sequência na parte inserida do gene TRPA1 humano.
[00639] Os resultados da humanização assistida por CRISPR/Cas9 do gene Trpa1 são mostrados na Tabela 35. Quando o LTVEC sozinho foi introduzido nas células-tronco, constatamos que 1,0% dos clones resistentes à droga triados carregaram um alelo humanizado heterozigoto monoalélico corretamente direcionado. Por outro lado, a combinação de LTVEC com endonuclease de Cas9 guiada por seis dos oito sgRNAs testadas (A, A2, B, C, D e F; sequências apresentadas na Tabela 43) produziu mutações de heterozigoto monoalélico corretamente direcionado ou composto bialélico heterozigoto ou mutações homozigóticas em eficiências que variam de 1,0 a 3,1%. Para clivagem guiada por Cas9 por gRNA A e gRNA F, detectamos também mutações heterozigotas do composto em uma frequência de 1,0%. Tabela 35. Resultados da Triagem para Humanização Assistida por CRISPR/Cas9 do Gene Trpa1.
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[00640] Em outro experimento, o LTVEC foi designado para criar uma exclusão de 55 kb do gene Folh1 (glutamato carboxipeptidase 2) do camundongo e uma substituição simultânea com um fragmento de 61 kb do gene FOLH1 humano homólogo (Figura 37). O LTVEC é constituído do fragmento de 61 kb do gene FOLH1 humano flanqueado por braços de homologia contendo 22 kb e 46 kb de DNA genômico derivado de partes do lócus de Folh1 do camundongo que flanqueiam a sequência de 55 kb do gene Folh1 do camundongo destinado à eliminação. Em experimentos separados, combinamos o LVTEC humanizante Folh1 com um plasmídeo que codifica Cas9 e um segundo plasmídeo que codifica um dos seis sgRNAs (gA, gA2, gC, gD, gE, e gE2) destinados a criar rupturas de fitas duplas na região do gene Folh1 do camundongo que foi direcionado para eliminação. Os sgRNAs foram concebidos para evitar o reconhecimento de qualquer sequência na parte inserida do gene FOLH1 humano.
[00641] Os resultados da humanização assistida por CRISPR/Cas9 do gene Folh1 são mostrados na Tabela 36. Quando o LTVEC sozinho foi introduzido nas células-tronco, constatamos que nenhum dos 96 clones resistentes à droga triados carregaram um alelo humanizado heterozigoto monoalélicos corretamente direcionado. Por outro lado, a combinação de LTVEC com endonuclease de Cas9 guiada por três dos seis sgRNAs testados (A, D, e E2; sequências apresentadas na Tabela 43) produziu mutações de heterozigoto monoalélico corretamente direcionado em eficiências que variam de 1,0 a 3,1%. Tabela 36. Resultados da Triagem para Humanização Assistida por CRISPR/Cas9 do Gene Folh1 .
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[00642] Em outro experimento, o LTVEC foi designado para criar uma exclusão de 76 kb do gene do camundongo para componente complementar 5 (C5 ou Hc) e uma substituição simultânea por um fragmento de 97 kb do gene C5 humano homólogo (Figura 38). O LTVEC é constituído do fragmento de 97 kb do gene C5 humano flanqueado por braços de homologia contendo 34,1 kb e 31,2 kb de DNA genômico derivado de partes do lócus C5 (Hc) que flanqueiam a sequência de 76 kb do gene C5 (Hc) destinados à eliminação. Em experimentos separados, combinamos o LVTEC humanizante C5 (Hc) com um plasmídeo que codifica Cas9 e um segundo plasmídeo que codifica um dos seis sgRNAs (gA, gB, gC, gD, gE, e gE2) destinados a criar rupturas de fitas duplas na região do gene C5 (Hc) do camundongo que foi direcionado para eliminação. Os sgRNAs foram concebidos para evitar o reconhecimento de qualquer sequência na parte inserida do gene C5 humano.
[00643] Os resultados da humanização assistida por CRISPR/Cas9 do gene C5 (Hc) são mostrados na Tabela 37. Quando o LTVEC sozinho foi introduzido nas células-tronco, constatamos que 1,0% dos clones resistentes à droga triados carregaram um alelo humanizado heterozigoto monoalélico corretamente direcionado. Por outro lado, a combinação de LTVEC com endonuclease de Cas9 guiada por todos os seis sgRNAs testados (A, B, C, D, E, e E2; sequências apresentadas na Tabela 43) produziu mutações de heterozigoto monoalélico corretamente direcionado ou composto heterozigoto bialélico ou mutações homozigóticas em eficiências que variam de 4,2 a 16,7%. Para clivagem guiada por Cas9 por gRNAs A e E, detectamos também mutações heterozigotas do composto em uma frequência de 5,2% a 4,2%, respectivamente. Tabela 37. Resultados da Triagem para Humanização Assistida por CRISPR/Cas9 do Gene C5 (Hc) .
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[00644] Em outro experimento, o LTVEC foi designado para criar uma exclusão de 38 kb do gene Adamts5 (disintegrina e metaloproteinase com motivos 5 de trombospondina) do camundongo e uma substituição simultânea por um fragmento de 43 kb do gene ADAMTS5 humano homólogo (Figura 39). O LTVEC é constituído do fragmento de 43 kb do gene ADAMTS5 humano flanqueado por braços de homologia contendo 22 kb e 46 kb de DNA genômico derivado de partes do lócus de Adamts5 do camundongo que flanqueiam a sequência de 38 kb do gene Adamts5 do camundongo destinado à eliminação. Em experimentos separados, combinamos o LTVEC humanizante Adamts5 com um plasmídeo que codifica Cas9 e um segundo plasmídeo que codifica um dos oito sgRNAs (gA, gA2, gB, gC, gD, gE, gE2, e gF) destinados a criar rupturas de fitas duplas na região do gene Adamts5 do camundongo que foi direcionado para eliminação. Os sgRNAs foram concebidos para evitar o reconhecimento de qualquer sequência na parte inserida do gene ADAMTS5 humano.
[00645] Os resultados da humanização assistida por CRISPR/Cas9 do gene Adamts5 são mostrados na Tabela 38. Quando o LTVEC sozinho foi introduzido nas células-tronco, constatamos que nenhum dos 96 clones resistentes à droga triados carregaram um alelo humanizado heterozigoto monoalélicos corretamente direcionado. Por outro lado, a combinação de LVTEC com endonuclease de Cas9 guiada por dois dos oito sgRNAs testados (B e F; sequências apresentadas na Tabela 43) produziu mutações de heterozigoto monoalélico corretamente direcionado ou mutações de heterozigoto de composto bialélico em eficiências de 1,0%. Para clivagem guiada por Cas9 por gRNA E2, detectamos também mutações heterozigotas do composto em uma frequência de 1,0%. Tabela 38. Resultados da Triagem para Humanização Assistida por CRISPR/Cas9 do Gene Adamts5 .
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[00646] Em outro experimento, LTVEC foi designado para criar uma deleção de 102 kb do gene Erbb4 (erbB-4 de quinase tirosina-proteína do receptor) do camundongo e uma substituição simultânea com um fragmento de 127 kb do gene ERBB4 humano homólogo (Figura 40). O LTVEC é constituído do fragmento de 127 kb do gene ERBB4 humano flanqueado por braços de homologia contendo 48 kb e 26 kb de DNA genômico derivado de partes do lócus de Erbb4 do camundongo que flanqueiam a sequência de 102 kb do gene Erbb4 do camundongo destinado à eliminação. Em experimentos separados, combinamos o LTVEC humanizante Erbb4 com um plasmídeo que codifica Cas9 e um segundo plasmídeo que codifica um dos oito sgRNAs (gA, gB, gB2, gC, gD, gE, gE2, e gF) destinados a criar rupturas de fitas duplas na região do gene Erbb4 do camundongo que foi direcionado para eliminação. Os sgRNAs foram concebidos para evitar o reconhecimento de qualquer sequência na parte inserida do gene ERBB4 humano.
[00647] Os resultados da humanização assistida por CRISPR/Cas9 do gene Erbb4 são mostrados na Tabela 39. Quando o LTVEC sozinho foi introduzido nas células-tronco, constatamos que nenhum dos 96 clones resistentes à droga triados carregaram um alelo humanizado heterozigoto monoalélicos corretamente direcionado. Por outro lado, a combinação de LVTEC com endonuclease de Cas9 guiada por um dos oito sgRNAs testados (D; sequências apresentadas na Tabela 43) produziu mutações de heterozigoto monoalélico corretamente direcionado ou mutações de heterozigoto de composto bialélico em eficiências de 1,0%. Para clivagem guiada por Cas9 por gRNA D, detectamos também mutações heterozigotas do composto em uma frequência de 1%. Tabela 39. Resultados da Triagem para Humanização Assistida por CRISPR/Cas9 do Gene Erbb4 .
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[00648] Em outro experimento, LTVEC foi designado para criar uma deleção de 110 kb do gene Ror1 (Receptor da cinase da tirosina transmembrana da proteína tirosina quinase ROR1) do camundongo e uma substituição simultânea com um fragmento de 134 kb do gene ROR1 humano homólogo (Figura 41). O LTVEC é constituído do fragmento de 134 kb do gene ROR1 humano flanqueado por braços de homologia contendo 41,8 kb e 96,4 kb de DNA genómico derivadas de partes do rato Ror1 lócus que ladeiam a sequência de 110 kb do mouse Ror1 gene destinados à eliminação. Em experimentos separados, combinamos o LVTEC humanizante Ror1 com um plasmídeo que codifica Cas9 e um segundo plasmídeo que codifica um dos seis sgRNAs (gA, gB, gC e gD, gE e gF) destinados a criar rupturas de fitas duplas na região do gene Ror1 do camundongo que foi direcionado para eliminação. Os sgRNAs foram concebidos para evitar o reconhecimento de qualquer sequência na parte inserida do gene ROR1 humano.
[00649] Os resultados da humanização assistida por CRISPR/Cas9 do gene Ror1 são mostrados na Tabela 40. Quando o LTVEC sozinho foi introduzido nas células-tronco, constatamos que nenhum dos 96 clones resistentes à droga triados carregaram um alelo humanizado heterozigoto monoalélicos corretamente direcionado. Por outro lado, a combinação de LVTEC com endonuclease de Cas9 guiada por dois dos seis sgRNAs testadas (D e F; sequências apresentadas na Tabela 43) produziu corretamente mutações bialélicas ou heterozigotas monoalélicas direcionadas em eficiências de 1,0%. Para clivagem guiada por Cas9 por gRNA F, detectamos também mutações heterozigotas do composto em uma frequência de 1%. Tabela 40. Resultados da Triagem para Humanização Assistida por CRISPR/Cas9 do Gene Ror1 .
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[00650] Em outro experimento, o LTVEC foi designado para criar uma exclusão de 79 kb do gene DPP4 (Dipeptidil peptidase 4) do camundongo e uma substituição simultânea com um fragmento de 82 kb do gene DPP4 humano homólogo (Figura 42). O LTVEC constituído pelo fragmento de 82 kb do gene DPP4 humano flanqueado por braços de homologia 5 'e 3', cada um contendo 46 kb de DNA genômico derivado das partes do lócus de DPP4 do camundongo que flanqueiam a sequência de 79 kb do geneDPP4 do camundongo destinado à exclusão. Em experimentos separados, combinamos o LTVEC humanizante Dpp4 com um plasmídeo que codifica Cas9 e um segundo plasmídeo que codifica um dos oito sgRNAs (gA, gB, gB2, gC, gD, gE2 e gF) destinados a criar rupturas de fitas duplas na região do gene Dpp4 do camundongo que foi direcionado para eliminação. Os sgRNAs foram concebidos para evitar o reconhecimento de qualquer sequência na parte inserida do gene DPP4 humano.
[00651] Os resultados da humanização assistida por CRISPR/Cas9 do gene Dpp4 são mostrados na Tabela 41. Quando o LTVEC sozinho foi introduzido nas células-tronco, constatamos que 2,1% dos clones resistentes à droga triados carregaram um alelo humanizado heterozigoto monoalélico corretamente direcionado. Por outro lado, a combinação de LTVEC com endonuclease de Cas9 guiada por dois dos seis sgRNAs testadas (A, B, B2, C, D, E, E2 e F; sequências apresentadas na Tabela 43) produziu corretamente mutações de heterozigoto monoalélico corretamente direcionado em eficiências que variam de 2,1 a 7,3%. Tabela 41. Resultados da Triagem para Humanização Assistida por CRISPR/Cas9 do Gene Dpp4 .
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[00652] A tabela que resume os resultados para humanização assistida por CRISPR/Cas9 dos vários genes do camundongo é a Tabela 42. A primeira linha indica o lócus do gene que está sendo direcionado. A segunda linha indica o tamanho da eliminação (Del) do lócus endógeno do camundongo e o tamanho da inserção (Ins) do lócus humano correspondente. O restante das linhas mostra o número de colônias (de 96) para cada condição que tinha mutações de heterozigoto monoalélico corretamente direcionado, mutações de heterozigoto de composto bialélico ou mutações de homozigoto bialélico. "Sem gRNA" representa LTVEC sozinho, enquanto que as outras linhas representam LTVEC mais gRNAs correspondentes (indicados pela posição relativa dentro do lócus de eliminação). Tabela 42. Resumo da Humanização Assistida por CRISPR/Cas9 dos Genes do Camundongo.
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Tabela 43. Sequências de RNA Guia Usadas para Humanização Assistida por CRISPR/Cas9 dos Genes do Camundongo.
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Exemplo 5. Resumo da Modificação Direcionada dos Loci Genômicos do Rato
[00653] Tabela 44. Resumo do direcionamento do rato com vários tipos de vetor e agentes de nuclease discutidos nos Exemplos 3 e 4. Tabela 44. Resumo do Direcionamento do Rato
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[00654] A Tabela 45 mostra um resumo do direcionado das células- tronco embrionárias de rato com plasmídeos ou LTVECs em combinação com CRISPR/Cas9. Dois gRNAs foram testados separadamente para cada lócus direcionado: Rag2, ApoEe Il2rg. A eficiência da clivagem CRISPR/Cas9 foi > 20% em todos os três loci. Observou-se aumento da eficiência de direcionamento e aumento do direcionamento bialélico quando CRISPR/Cas9 foi usado em combinação com os plasmídeos de direcionamento e LTVECs. Tabela 45. Resumo do Direcionamento da Célula-Tronco Embrionária do Rato com Plasmídeos ou LTVECs em Combinação com CRISPR/Cas9
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[00655] A Tabela 46 mostra um resumo dos dados de transmissão da linha germinativa para modificação direcionada dos loci genômicos. A transmissão da linha germinativa foi confirmada para ratos direcionados porApoE e ratos direcionados por Il2rg. As células-tronco embrionárias de ratos eram XY (masculino) e eram heterozigotas direcionadas. Portanto, quando as células-tronco embrionárias direcionadas contribuem para a linha germinativa, aproximadamente 50% do esperma derivado das células-tronco embrionárias transportarão o alelo mutante e produzirão crias F1 heterozigóticas. Tabela 46. Dados de Transmissão da Linha Germinativa para Modificação Direcionada dos Loci Genômicos do Rato
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Exemplo 6. Geração, Manutenção e Direcionamento das Células-Tronco Pluripotentes Induzidas por Humano 6.1 Geração de Células iPS Humanas
[00656] Este exemplo descreve a geração de células iPS humanas de células humanas não-pluripotentes. Os vetores PiggyBac (System Biosciences) (PB-600A_CAGGS Bst XI (0,64 μg/μL) e PB-200 (0,99 μg/μL) que compreendem os genes que codificam quatro fatores de reprogramação (hOct4, hSox2, hKLF-4, hMYC) operativamente ligados a um promotor CM7 humano foram introduzidos em fibroblastos de prepúcio humano neonatal usando reagentes de transfecção VERMELHO e AZUL GeneIn™ (GlobalStem). As células transfectadas foram incubadas em células alimentadoras NuFF1 em meio E7 para permitir a incorporação dos vetores e a expressão dos fatores de reprogramação. O meio E7 é constituído por DMEM/F-12, NaHCO3, ácido L-ascórbico, insulina, transferrina, selênio e FGF-2.
[00657] A seleção de puromicina começou 10 dias após a transfecção usando 2 μg/mL de puromicina em meio E7. No dia 21, as colônias foram selecionadas e cultivadas em meio mTeSR™, que é constituído por DMEM/F-12, NaHCO3, ácido L-ascórbico, insulina, transferrina, selênio, FGF-2, TGF-β1, glutationa, L-glutamina, lipídios definidos, tiamina, vistígios B e C, β-mercaptoetanol, albumina sérica bovina, ácido pipecólico, cloreto de lítio e GABA. Nos dias 29 a 57, as células foram propagadas e passaram pelo meio mTeSR™ até atingirem ~ 50% de confluência em placas de 6 poços. Nos dias 65 a 73, propagação e passagem continuaram usando o meio mTeSR™ e Reagente de Dissociação Celular Suave (Stem Cell Technologies). No dia 76, o meio foi alterado para meio VG2i de baixa osmolaridade para propagação adicional, passagem e manutenção das células que compreendem hiPSCs naive ou que parecem naive.
6.2. Direcionamento de LTVEC em Células iPS Humanas
[00658] Este exemplo descreve o uso do direcionamento de LTVEC em células iPS humanas. Como mostrado na Figura 51, introduzimos por eletroporação em células iPS humanas propagados em meio VG2i as seguintes moléculas de ácido nucleico: (1) um LTVEC (0,67 μg); (2) um plasmídeo que codifica uma endonuclease de Cas9 (5 μg); e (3) um plasmídeo que codifica um RNA guia único de CRISPR (gRNA) (10 μg). Em um conjunto de amostras, Cas9 e gRNA foram excluídos. Especificamente, 3 x 106 células foram eletroporadas em uma voltagem de 700 V, uma capacitância de 25 μF e uma resistência de 400 ohms. LTVEC é constituído por um ácido nucleico de 16,7 que compreende os genes Adam6a e Adam6b flanqueados por braços de homologia que contêm 34 kb e 105 kb de DNA genômico derivado de regiões genômicas que flanqueiam a sequência de 4,1 kb do lócus ADAM6 humano destinado para eliminação. O LTVEC também transportou uma cassete de seleção de drogas que direciona a expressão de uma enzima que confere resistência a uma droga antibiótica (higromicina). O gRNA de ADAM6 humano usado tinha a seguinte sequência: GTATAGCCCTGTTACACATT (SEQ ID NO: 94).
[00659] As células que assumiram o LTVEC e incorporaram-nas aos seus genomas foram capazes de crescer e formar colônias em uma placa de cultura de tecido revestido com GELTREX ™ em um meio de crescimento que contém droga antibiótica. Porque introduzimos 500 a 1000 vezes mais moléculas nucleicas que codificam CRISPR/Cas9 do que moléculas de LTVEC, a maior parte das colônias resistentes da droga contendo LTVEC também continham pelo menos transientemente componentes de CRISPR/Cas9. Escolhemos colônias resistentes a drogas e fizemos a triagem pelo método de perda de alelo (Valenzuela et al. (2003) Nat. Biotech. 21:652660; Frendewey et al. (2010) Methods Enzymol. 476:295-307; incorporado a este documento por referência na sua totalidade) para identificar clones que tinham alelo corretamente direcionado.
[00660] Os resultados do direcionado do LTVEC assistido por CRISPR/Cas9 do lócus de ADAM6 são mostrados na Tabela 47. Tabela 47. Direcionamento de LTVEC assistido por CRISPR/Cas9 Eficiência de Direcionamento
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[00661] Quando LTVEC sozinho foi introduzido nas células iPS humanas, observou-se uma eficiência de direcionamento de 3,1%. Por outro lado, a combinação de LTVEC com Cas9 guiado pelo gRNA de ADAM6 resultou em uma eficiência de direcionamento de 7,3%.
[00662] 6.3. Efeito do Meio de Baixa Osmolalidade na Morfologia Celular de iPS Humano
[00663] Este exemplo descreve o efeito da concentração de sal, força iônica e/ou osmolaridade no estado de pluripotência das células iPS humanas em cultura. As células iPS humanas foram cultivadas em um substrato MATRIGEL™ ou GELTREX™ em um meio descrito na Tabela 48 ou no meio mTeSR™ -hLIF. Tabela 48. Meio para cultura de célula iPS.
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[00664] Quando o meio de base usado foi DMEM, este meio foi referido como meio 2i. Quando o meio de base usado foi VG-DMEM, este meio de baixa osmolaridade foi referido como meio VG2i. A osmolalidade do meio VG2i (233 mOsm/kg) é menor do que a osmolalidade do meio de 2i tradicional (261 mOsm/kg).
[00665] Como mostrado na Figura 52, as células iPS humanas cultivadas em MATRIGEL™ em meio 2i por um período de 8 dias (Figura 52A) ou 12 dias (Figura 52B) exibiram uma morfologia característica de células iPS em estado preparado, particularmente crescimento em uma monocamada epitelial e o aparecimento de polaridade apical basal.
[00666] O meio mTeSR-hLIF e o meio VG2i foram avaliados ainda quanto aos seus efeitos sobre a morfologia e o estado de pluripotência das células iPS humanas. Neste estudo, as células iPS humanas foram cultivadas em células alimentadoras MATRIGEL™ ou NuFF em meio mTeSR™-hLIF meio (Figuras 53A e 53C) ou meio VG2i (Figuras 53B e 53D) por um período de 6 dias. Quando cultivadas em meio mTeSR ™ -hLIF em células alimentadoras MATRIGEL™ ou NuFF, as células iPS humanas exibiram uma morfologia característica de um estado de pluripotência preparadom particularmente crescimento em uma monocamada epitelial e o aparecimento de polaridade apical basal. Algumas células cultivadas em meio mTeSR™- hLIF começaram a exibir uma morfologia caracterizada por aglomeração tridimensional. Por outro lado, quando cultivadas em meio VG2i em células alimentadoras MATRIGEL™ ou NuFF, as células iPS humanas apresentaram uma morfologia característica de um estado de pluripotência naive, particularmente crescimento em colônias em forma de cúpula redondas e ausência de polaridade apical basal.
6.4. Efeito do Meio de Baixa Osmolalidade na Expressão de Marcadores de Pluripotência em Células iPS Humanas
[00667] Este exemplo descreve o efeito da concentração de sal, força iônica e/ou osmolaridade na expressão dos marcadores de pluripotência nas células iPS humanas que foram reprogramadas de um estado preparado para um estado naive. Após 24 dias de cultura em meio VG2i em um substrato MATRIGEL™, as células iPS humanas naive reprogramadas foram coradas para a expressão de fosfatase alcalina ou NANOG. Observou-se que as células reprogramadas expressaram fortemente fosfatase alcalina (Figura 54A) e NANOG (Figuras 54B e 54C), que são indicativas de um estado de pluripotência naive.
6.5. Efeito do Meio de Baixa Osmolalidade na Dissociação Enzimática e Subcultura das Células iPS Humanas
[00668] Neste exemplo, as células iPS humanas que foram reprogramadas para um estado naive usando meio VG2i de baixa osmolalidade foram enzimaticamente dissociados usando tripsina para criar uma suspensão de célula única (Figura 55A). A suspensão de células passou por novas placas revestidas com GELTREX ™ para subcultura em meio VG2i. Observou-se após 1 dia (Figura 55B) e 4 dias (Figura 55C) que as células subcultivadas continuaram a apresentar uma morfologia característica de células num estado de pluripotência naive. Particularmente, as células cresceram como colônias em forma de cúpula arredondadas e não apresentaram uma polaridade apical basal. Foi notável que a dissociação enzimática poderia ser realizada na ausência de um inibidor ROCK, que é tipicamente necessário para evitar a ativação de vias pró-apoptóticas. Isto sugere que as vias pró-apoptóticas não são tão fortemente ativadas durante a dissociação enzimática e a subcultura em células iPS humanas naive foi cultivada nas condições identificadas neste documento.
[00669] Todas as publicações e pedidos de patente mencionados no relatório descritivo são indicativos do nível dos versados na técnica ao qual esta invenção pertence. Todas as publicações e pedidos de patente são incorporados neste documento à guisa de referência na mesma medida como se cada publicação ou pedido de patente individual fosse indicado especificamente e individualmente para ser incorporado por referência. Salvo se aparente de outro modo no contexto de qualquer modalidade, aspecto, etapa ou recurso da invenção pode ser usado em combinação com qualquer outra. A referência a um intervalo inclui quaisquer números inteiros dentro do intervalo, subintervalo dentro do intervalo. A referência a múltiplos intervalos inclui múltiplos desses intervalos.

Claims (39)

1. Método in vitro para modificar um genoma em um lócus genômico de interesse em uma célula pluripotente, caracterizado pelo fato de que compreende: introduzir à célula pluripotente uma proteína Cas9, um RNA CRISPR que hibridiza a uma sequência alvo de CRISPR no lócus genômico de interesse, um tracrRNA, e um vetor de alvejamento grande (LTVEC) que é pelo menos 10 kb em tamanho e compreende um ácido nucleico inserido flanqueado por: (i) um braço de homologia 5’ que é homólogo a uma sequência alvo 5’ no lócus genômico de interesse; e (ii) um braço de homologia 3’ que é homólogo à uma sequência alvo 3’ no lócus genômico de interesse, em que a sequência alvo com a qual o RNA CRISPR hibridiza está localizada em qualquer lugar entre a sequência alvo 5 'e a sequência alvo 3', em que a célula pluripotente é uma célula pluripotente de mamífero não humano ou uma célula tronco pluripotente humana induzida, e em que após introduzir a célula pluripotente com a proteína Cas9, o RNA CRISPR, o tracrRNA e o LTVEC, o genoma da célula pluripotente é modificado para compreender uma modificação genética alvejada compreendendo a deleção de uma região do lócus genômico de interesse, em que a deleção é pelo menos 30 kb e/ou inserção do ácido nucleico inserido na região do lócus genômico de interesse, em que a inserção é pelo menos 30 kb.
2. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o RNA CRISPR e o tracrRNA são introduzidos como uma molécula de ácido nucleico única compreendendo o RNA CRISPR e o tracrRNA, opcionalmente em que a molécula de ácido nucleico única compreende o RNA CRISPR e o tracrRNA fusionados juntos na forma de um RNA guia único (sgRNA).
3. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o RNA CRISPR e o tracrRNA são introduzidos separadamente.
4. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3 caracterizado pelo fato de que: (a) a proteína Cas9 é introduzida na forma de uma proteína, um RNA mensageiro (RNAm) que codifica a proteína Cas9, ou um DNA que codifica a proteína Cas9; (b) o RNA CRISPR é introduzido na forma de um RNA ou um DNA que codifica o RNA CRISPR; e (c) o tracrRNA é introduzido na forma de um RNA ou um DNA que codifica o tracrRNA, opcionalmente em que a proteína Cas9, o RNA CRISPR, e o tracrRNA são introduzidos como um complexo proteína-RNA.
5. Método de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que: (a) o DNA que codifica a proteína Cas9 está na forma de um primeiro construto de expressão compreendendo um primeiro promotor ligado operacionalmente a um primeiro ácido nucleico que codifica a proteína Cas9; (b) (1) o DNA que codifica o RNA CRISPR está na forma de um segundo construto de expressão compreendendo um segundo promotor ligado operacionalmente a um segundo ácido nucleico que codifica o RNA CRISPR, e o DNA que codifica o tracrRNA está na forma de um terceiro construto de expressão compreendendo um terceiro promotor ligado operacionalmente a um terceiro ácido nucleico que codifica o tracrRNA; ou (2) o DNA que codifica o RNA CRISPR e o DNA que codifica o tracrRNA estão na forma de um segundo construto de expressão compreendendo um segundo promotor operacionalmente ligado a um segundo ácido nucleico que codifica um RNAg compreendendo o RNA CRISPR e o tracrRN; em que os promoters são ativos na célula pluripotente, e em que os construtos de expressão estão em uma única molécula de ácido nucleico ou em múltiplas moléculas de ácido nucleico.
6. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado pelo fato de que o ácido nucleico inserido é de cerca de 40kb a cerca de 140kb, ou em que a região do lócus genômico a ser deletada é de cerca de 30 kb a cerca de 110 kb.
7. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizado pelo fato de que a modificação genética alvejada compreende a deleção simultânea de uma sequência de ácido nucleico endógena no lócus genômico de interesse e a inserção do ácido nucleico inserido no lócus genômico de interesse, opcionalmente em que a sequência de ácido nucleico endógena deletada é de 30kb a cerca de 110kb e o ácido nucleico inserido é de cerca de 40kb a cerca de 140kb.
8. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizado pelo fato de que a modificação genética direcionada é uma modificação genética bialélica, opcionalmente em que a modificação genética bialélica compreende a deleção de uma sequência de ácido nucleico endógena e inserção do ácido nucleico inserido no lócus genômico de interesse em dois cromossomos homólogos, ou opcionalmente em que a célula pluripotente modificada é composta heterozigota ou hemizigota no lócus genômico de interesse, e opcionalmente em que a modificação genética alvejada no lócus genômico de interesse em um cromossomo compreende a deleção de uma sequência de ácido nucleico endógena e a inserção de um ácido nucleico inserido, e opcionalmente em que a modificação genética alvejada compreende: (1) a deleção de uma sequência de ácido nucleico endógena no lócus genômico de interesse no primeiro e segundo cromossomos homólogos; e (2) a inserção de um ácido nucleico inserido no lócus genômico de interesse no primeiro cromossomo homólogo e o rompimento do lócus genômico de interesse no segundo cromossomo homólogo.
9. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, caracterizado pelo fato de que o LTVEC é pelo menos 40kb; ou em que a modificação genética alvejada compreende a deleção de uma região do lócus genômico de interesse em que a deleção é pelo menos 30kb, e o LTVEC é pelo menos 15kb.
10. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 9, caracterizado pelo fato de que a modificação genética alvejada compreende a inserção de um ácido nucleico inserido, em que o ácido nucleico inserido é pelo menos 40kb; ou em que a modificação genética alvejada compreende a deleção de uma região do lócus genômico de interesse em que a deleção é pelo menos 30kb e a inserção do ácido nucleico, em que a inserção de ácido nucleico inserido é pelo menos 10kb.
11. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 10, caracterizado pelo fato de que o a sequência alvo de CRISPR é imediatamente flanqueada por uma sequência motivo adjacente ao protoespaçador (PAM).
12. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 11, caracterizado pelo fato de que o LTVEC é de 100kb a 300kb de comprimento.
13. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 12, caracterizado pelo fato de que a soma total dos braços de homologia 5’ e 3’ do LTVEC é de 10kb a 150kb, opcionalmente em que a soma total dos braços de homologia 5’ e 3’ do LTVEC é de 30kb a 150kb.
14. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 13, caracterizado pelo fato de que a modificação genética alvejada compreende: (a) uma reposição de uma sequência de ácido nucleico endógena com uma sequência de ácido nucleico homóloga ou ortóloga; (b) uma deleção de uma sequência de ácido nucleico endógena; (c) uma deleção de uma sequência de ácido nucleico endógena, em que a deleção varia de pelo menos cerca de 30kb a cerca de 3 Mb; (d) inserção de uma sequência de ácido nucleico exógena; (e) inserção de uma sequência de ácido nucleico exógena variando de pelo menos cerca de 30kb a cerca de 400 kb; (f) inserção de uma sequência de ácido nucleico exógena compreendendo uma sequência de ácido nucleico homóloga ou ortóloga; (g) inserção de uma sequência de ácido nucleico quimérica compreendendo uma sequência de ácido nucleico de humana e não humana; (h) inserção de um alelo condicional flanqueado com sequências alvo recombinase de sítio específico; (i) inserção de um marcador selecionável ou um gene repórter ligado operativamente a um promotor ativo na célula pluripotente; ou (j) uma combinação dos mesmos.
15. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 14, caracterizado pelo fato de que a modificação genética direcionada compreende a deleção de uma região do lócus genômico de interesse, em que a deleção é pelo menos 40kb; ou em que a modificação genética alvejada compreende ainda a inserção de uma sequência de ácido nucleico inserida no lócus genômico de interesse em que a inserção é pelo menos 30kb e deleção de uma região do lócus genômico de interesse em que a deleção é pelo menos 10kb.
16. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 15, caracterizado pelo fato de que a modificação genética alvejada compreende a deleção de uma região do lócus genômico de interesse em que a deleção é pelo menos 30kb e inserção do ácido nucleico inserido no lócus genômico de interesse em que a inserção é pelo menos 30kb.
17. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 16, caracterizado pelo fato de que LTVEC é de 100kb a 300kb, a soma total dos braços de homologia 5’ e 3’ é de 30kb a 150kb, e a modificação genética alvejada compreende a deleção de uma região do lócus genômico de interesse em que a deleção é de 30kb a 110kb e inserção do ácido nucleico inserido no lócus genômico de interesse em que a inserção é de 40kb a 140kb.
18. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 17, caracterizado pelo fato de que o lócus genômico de interesse é endógeno à célula pluripotente, opcionalmente em que o lócus genômico de interesse compreende um lócus do receptor interleucina-2 gama, um lócus ApoE, um lócus Rag1, um lócus Rag2, ambos Rag1 e Rag2 loci, um lócus Adamts5, um lócus Trpal, um lócus Folhl, um lócus Erbb4, um lócus Lrp54 um lócus C5 (Hc), um lócus Ror1, ou um lócus Dpp4.
19. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 17, caracterizado pelo fato de que o lócus genômico de interesse compreende um segmento de DNA heterólogo ou exógeno que foi integrado no genoma de uma célula pluripotente.
20. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 19, caracterizado pelo fato de que o lócus genômico de interesse é um lócus de imunoglobulina, opcionalmente em que o lócus de imunoglobulina codifica uma sequência de aminoácidos de região variável de cadeia pesada de imunoglobulina de mamífero, ou opcionalmente em que o lócus de imunoglobulina codifica uma sequência de aminoácidos de região variável de cadeia leve de imunoglobulina de mamífero, opcionalmente em que o lócus de imunoglobulina compreende uma sequência de ácido nucleico de região variável de cadeia leve À e/ou K não rearranjada ou uma sequência de ácido nucleico de região variável de cadeia leve À e/ou K rearranjada.
21. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 19, caracterizado pelo fato de que o lócus genômico de interesse é um lócus de receptor de célula T, opcionalmente em que o lócus de receptor de célula T é um lócus de receptor de célula T α.
22. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 21, caracterizado pelo fato de que o ácido nucleico inserido compreende uma sequência de ácido nucleico genômica que codifica uma sequência de aminoácidos de região variável de cadeia pesada de imunoglobulina de humano, opcionalmente em que o ácido nucleico inserido compreende um ou mais segmentos funcionais do gene VH humano compreendendo VH1- 2, VH1-3, VH1-8, VH1-18, VH1-24, VH1-45, VH1-46, VH1-58, VH1-69, VH2-5, VH2-26, VH2-70, VH3-7, VH3-9, VH3-11, VH3-13, VH3-15, VH3-16, VH3-20, VH3-21, VH3-23, VH3-30, VH3-30-3, VH3-30-5, VH3-33, VH3-35, VH3-38, VH3-43, VH3-48, VH3-49, VH3-53, VH3-64, VH3-66, VH3-72, VH3-73, VH3- 74, VH4-4, VH4-28, VH4-30-1, VH4-30-2, VH4-30-4, VH4-31, VH4-34, VH4- 39, VH4-59, VH4-61, VH5-51, VH6-1, VH7-4-1, VH7-81, ou uma combinação dos mesmos, ou opcionalmente em que o ácido nucleico inserido compreende um ou mais segmentos funcionais do gene D humano compreendendo D1-1, D1-7, D1-14, D1-20, D1-26, D2-2, D2-8, D2-15, D2-21, D3-3, D3-9, D3-10, D3-16, D3-22, D4-4, D4-11, D4-17, D4-23, D5-12, D5-5, D5-18, D5-24, D66, D6-13, D6-19, D6-25, D7-27, ou uma combinação dos mesmos, ou opcionalmente em que o ácido nucleico inserido compreende um ou mais segmentos funcionais do gene JH compreendendo JH1, JH2, JH3, JH4, JH5, JH6, ou uma combinação dos mesmos.
23. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 21, caracterizado pelo fato de que o ácido nucleico inserido compreende uma sequência de ácido nucleico genômica que codifica uma sequência variável de ácido nucleico de cadeia leve de imunoglobulina humana, opcionalmente em que o ácido nucleico inserido compreende um ou mais segmentos do gene VK humano compreendendo VK4-1, VK5-2, VK 7-3, VK 2-4, VK1-5, VK1-6, VK3-7, VK1-8, VK1-9, VK2-10, VK3-11, VK1- 12, Vk1-13, Vk2-14, Vk3-15, Vk1-16, Vk1-17, Vk2-18, Vk2-19, Vk3-20, Vk6-21, Vk1-22, Vk1-23, Vk2-24, Vk3-25, Vk2-26, Vk1-27, Vk2-28, Vk2- 29, Vk2-30, Vk3-31, Vk1-32, Vk1-33, Vk3-34, Vk1-35, Vk2-36, Vk1-37, Vk2-38, Vk1-39, Vk2-40, ou uma combinação dos mesmos, ou opcionalmente em que o ácido nucleico inserido compreende um ou mais segmentos do gene VA humano compreendendo V3-1, VA4-3, VX2-8, VÀ3-9, V3-10, V2-11, V3-12, V2-14, V3-16, V2-18, V3-19, V 3 21, VX3-22, VX2-23, V3-25, V3-27, ou uma combinação dos mesmos, ou opcionalmente em que o ácido nucleico inserido compreende um ou mais segmentos do gene Jk humano compreendendo Jk1, Jk2, Jk3, Jk4, Jk5, ou uma combinação dos mesmos.
24. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 21, caracterizado pelo fato de que o ácido nucleico inserido compreende um polinucleotídeo que codifica pelo menos uma região do receptor de célula T humano, opcionalmente em que o receptor de célula T é um receptor de célula T α.
25. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 21, caracterizado pelo fato de que o ácido nucleico inserido compreende pelo menos um alelo de doença, opcionalmente em que o ácido nucleico inserido compreende pelo menos um alelo de doença de um gene humano.
26. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 25, caracterizado pelo fato de que a célula pluripotente é uma célula pluripotente de mamífero não humano, e em que modificação genética direcionada resulta em um lócus genômico humanizado compreendendo: (a) uma inserção de uma sequência de ácido nucleico humana homóloga ou ortóloga; (b) uma substituição de uma sequência de ácido nucleico no lócus genômico endógeno com uma sequência de ácido nucleico ortóloga ou homóloga; (c) uma combinação dos mesmos
27. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 26, caracterizado pelo fato de que a célula pluripotente de mamífero é uma célula tronco pluripotente humana induzida, opcionalmente em que a célula tronco pluripotente humana induzida é mantida em um meio compreendendo um meio de base e suplementos, em que o meio compreende: (a) um polipeptídeo de fator inibidor de leucemia (LIF): (b) um inibidor de glicogênio sintase quinase (GSK3); e (c) um inibidor de MEK; em que o meio base tem uma osmolalidade de cerca de 180 mOsm/kg a cerca de 250 mOsm/kg.
28. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 26, caracterizado pelo fato de que a célula pluripotente é uma célula eucariótica que não é de rato.
29. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 26, caracterizado pelo fato de que a célula pluripotente de mamífero é uma célula pluripotente de roedor, opcionalmente em que a célula pluripotente de roedor é uma célula tronco embriônica de rato (ES) ou uma célula ES de camundongo.
30. Método de acordo com a reivindicação 29, caracterizado pelo fato de que a célula pluripotente é uma célula ES de rato, opcionalmente em que a célula ES de rato pode ser obtida pela cultura de blastocistos em uma camada celular alimentadora de fibroblastos embrionários de camundongos inativados mitoticamente com o meio 2i apresentado na Tabela 3.
31. Método de acordo com a reivindicação 29, caracterizado pelo fato de que a célula pluripotente de roedor é uma célula ES de camundongo.
32. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 31, caracterizado pelo fato de que a proteína Cas9 compreende um sinal de localização nuclear.
33. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 32, caracterizado pelo fato de que a soma total dos braços de homologia 5 'e 3' do LTVEC é de pelo menos 10 kb.
34. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 33, caracterizado pelo fato de que a sequência alvo CRISPR é uma sequência nativa que é endógena à célula.
35. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 34, caracterizado pelo fato de que o locus genômico de interesse é nativo da célula.
36. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 35, caracterizado pelo fato de que a soma total dos braços de homologia 5 'e 3' do LTVEC é de pelo menos 10 kb, e em que a sequência alvo CRISPR é uma sequência nativa que é endógena à célula.
37. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 36, caracterizado pelo fato de que a soma total dos braços de homologia 5 'e 3' do LTVEC é de pelo menos 10 kb, e em que o locus genômico de interesse é nativo da célula.
38. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 37, caracterizado pelo fato de que a modificação genética direcionada compreende a inserção do ácido nucleico de inserção no locus genômico de interesse ou em que a modificação genética direcionada compreende a deleção da região do locus genômico de interesse e a inserção do ácido nucleico no locus genômico de interesse.
39. Método de acordo com a reivindicação 38, caracterizado pelo fato de que a sequência alvo CRISPR é uma sequência nativa que é endógena à célula e em que a soma total dos braços de homologia 5 'e 3' do LTVEC é de 10 kb a 150 kb.
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