KR102444458B1 - Slc30a8 돌연변이를 포함하는 비인간 동물 및 사용 방법 - Google Patents

Slc30a8 돌연변이를 포함하는 비인간 동물 및 사용 방법 Download PDF

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Abstract

돌연변이된 Slc30a8 유전자좌를 포함하는 비인간 동물 게놈, 비인간 동물 세포, 및 비인간 동물 및 이러한 비인간 동물 게놈, 비인간 동물 세포, 및 비인간 동물의 제조 방법이 제공된다. 비인간 동물은 증가된 인슐린 분비 능력을 가질 수 있다.

Description

SLC30A8 돌연변이를 포함하는 비인간 동물 및 사용 방법
관련 출원에 대한 상호 참조
본 출원은 2017년 11월 10일에 출원된 미국 출원 번호 62/584,228, 2018년 5월 3일에 출원된 미국 출원 번호 62/666,337, 및 2018년 6월 26일에 출원된 미국 출원 번호 62/689,945의 이익을 주장하며, 이들 출원은 각각 모든 목적에 대해 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.
EPS 웹을 통해 텍스트 파일로서 제출된 서열 목록에 대한 참조
파일 523060SEQLIST.txt로 쓰여진 서열 목록은 39.2 킬로바이트이고, 2018년 11월 5일에 생성되었으며, 본원에 참조로 포함된다.
당뇨병은 신체에서 적절한 혈당 수준을 유지하지 못하는 것을 초래하는 인슐린-반응 조직 및 인슐린-생성 췌장 베타 세포의 대사적 결함을 특징으로 하는 장애이다. 인간의 당뇨병은 75 g의 경구 글루코스 로드 섭취 후 2시간 후에 125 mg/dL 이상의 금식 혈장 글루코스 농도, 또는 199 mg/dL 이상의 혈장 글루코스 농도에 상응하는 장애로서 정의할 수 있다. 당뇨병의 2가지 주요 형태는 제1형 당뇨병 (T1D) 및 제2형 당뇨병 (T2D)이다. T1D는 베타 췌장 세포의 파괴 및 글루코스 이용을 조절하는 호르몬인 인슐린의 절대 결핍을 초래하는 자가면역 장애이다. 대조적으로, T2D는 인슐린에 대해 적절하게 반응하지 못하는 조직의 무능력으로부터 유발된 인슐린의 정상적인 또는 상승된 수준으로 발생할 수 있다. 대부분의 T2D 환자는 손상된 인슐린 민감성을 갖고 있다. 인슐린 분비는 인슐린에 대한 말초 조직의 저항성을 보상할 수 없다. 많은 T2D 환자가 비만이다. 제1.5형 당뇨병 (성인에서의 후기 자가면역 개시)은 T1D 및 T2D의 일부 특징을 보인다.
아연이 인슐린 생합성 및 프로세싱에 필요하다. 2개의 아연 이온이 프로인슐린의 헥사머 형태로 복합체를 형성하고, 궁극적으로 인슐린으로 처리된다.
SLC30A8은 주로 췌장샘에서 발현되는 아연 수송체이며, 췌장샘에서 그것은 아연을 인슐린-함유 분비 과립에 수송한다. SLC30A8에서 이형접합성 기능 상실 (LOF) 돌연변이는 인간에서 제2형 당뇨병으로부터 보호한다. 여러 Slc30a8 녹아웃 마우스 라인이 특성화되어 있지만, 그것들은 보호성 인간 표현형을 완전히 개괄하지는 못한다. 오히려, Slc30a8-결핍 마우스가 감소된 혈장 수준 및 손상된 글루코스 내성을 가지고 있다.
돌연변이된 Slc30a8 유전자좌를 포함하는 비인간 동물, 뿐만 아니라 이러한 비인간 동물의 제조 및 사용 방법이 제공된다. 돌연변이된 Slc30a8 유전자좌를 포함하는 비인간 동물 게놈 또는 세포 또한 제공된다.
한 측면으로, 돌연변이된 Slc30a8 유전자좌를 포함하는 비인간 동물 게놈, 비인간 동물 세포, 또는 비인간 동물이 제공된다. 이러한 비인간 동물 게놈, 비인간 동물 세포, 또는 비인간 동물은 돌연변이된 Slc30a8 유전자를 포함할 수 있고, 여기서 돌연변이된 Slc30a8 유전자는 단된 SLC30A8 단백질을 암호화하며 돌연변이가 없는 비인간 동물에 비교하여 증강된 인슐린 분비 능력을 가지는 비인간 동물을 초래한다.
한 측면으로, 그것의 게놈이 돌연변이된 Slc30a8 유전자를 포함하는 내인성 Slc30a8 유전자좌를 포함하는 비인간 동물이 제공되며, 여기서 돌연변이된 Slc30a8 유전자는 절단된 SLC30A8 단백질을 암호화하고 돌연변이가 없는 비인간 동물에 비교하여 증강된 인슐린 분비 능력을 가지는 비인간 동물을 초래한다.
일부 이러한 비인간 동물에서, 비인간 동물은 고혈당증에 대한 반응으로 인슐린 분비에 대해 증강된 능력을 나타낸다. 선택적으로, 비인간 동물은 돌연변이가 없는 비인간 동에 비교하여 인슐린 수용체 억제에 의해 유도된 고혈당증에 대한 반응으로 증가된 인슐린 분비를 가진다. 선택적으로, 인슐린 수용체 억제에 의해 유도된 고혈당증에 대한 반응으로 증가된 인슐린 분비는 돌연변이가 없는 비인간 동물에 비해 증가된 베타 세포 증식 또는 베타 세포 질량과는 관련이 없다.
일부 이러한 비인간 동물에서, 비인간 동물에게 고지방식이 공급될 때 증강된 인슐린 분비 능력이 관찰된다. 선택적으로, 비인간 동물은 고지방식이 공급될 때 돌연변이가 없는 비인간 동물에 비교하여 인슐린 분비가 증가되었고, 이때 증가된 인슐린 분비는 돌연변이가 없는 비인간 동물에 비해 증가된 베타 세포 증식 또는 베타 세포 질량과 관련이 있다. 선택적으로, 증가된 베타 세포 증식은 인슐린 수용체-의존적이다 (예컨대, 베타 세포에서 인슐린 수용체에 의존적임).
일부 이러한 비인간 동물, 비인간 동물 세포, 또는 비인간 동물 게놈에서, 돌연변이된 Slc30a8 유전자는 조기 종결 코돈을 가진다. 일부 이러한 비인간 동물, 비인간 동물 세포, 또는 비인간 동물 게놈에서, 돌연변이된 Slc30a8 유전자는 Slc30a8 유전자의 제3 엑손에 있는 돌연변이를 포함한다. 선택적으로, 돌연변이는 Slc30a8 유전자의 제3 엑손의 3' 단부에 있다.
일부 이러한 비인간 동물, 비인간 동물 세포, 또는 비인간 동물 게놈에서, 돌연변이된 Slc30a8 유전자는 넌센스 돌연변이를 포함한다. 선택적으로, 넌센스 돌연변이는 돌연변이된 Slc30a8 유전자에 의해 암호화된 SLC30A8 단백질이 SEQ ID NO: 14와 최적으로 정렬될 때 SEQ ID NO: 14에서 R138을 암호화하는 코돈에 상응하는 코돈에 있다. 선택적으로, 넌센스 돌연변이는 돌연변이된 Slc30a8 유전자의 코딩 서열이 SEQ ID NO: 21과 최적으로 정렬될 때 SEQ ID NO: 21에서 잔기 412에 상응하는 위치에 있다.
일부 이러한 비인간 동물, 비인간 동물 세포, 또는 비인간 동물 게놈에서, 돌연변이된 Slc30a8 유전자는 비인간 동물에 대해 내인성이다. 일부 이러한 비인간 동물, 비인간 동물 세포, 또는 비인간 동물 게놈에서, 비인간 동물은 비인간 포유류이다. 일부 이러한 비인간 동물, 비인간 동물 세포, 또는 비인간 동물 게놈에서, 비인간 동물은 래트 또는 마우스이다. 선택적으로, 비인간 동물은 마우스이다. 선택적으로, 돌연변이된 Slc30a8 유전자는 SEQ ID NO: 13에 제시된 서열을 포함하는 SLC30A8 단백질을 암호화한다. 선택적으로, 돌연변이된 Slc30a8 유전자는 SEQ ID NO: 22에 제시된 코딩 서열 또는 동일한 아미노산 서열을 암호화하는 그것의 축퇴물을 포함한다.
일부 이러한 비인간 동물은 돌연변이가 없는 비인간 동물에 비교하여 인슐린 수용체 억제에 의해 유도된 고혈당증에 대한 반응으로 인슐린 분비가 증가되었다. 일부 이러한 비인간 동물에서, 증가된 인슐린 분비는 돌연변이가 없는 비인간 동물에 비교하여 증가된 베타 세포 증식 또는 베타 세포 질량와 관련이 없다. 일부 이러한 비인간 동물은 돌연변이가 없는 비인간 동물에 비교하여 미토콘드리아 유전자 발현이 감소되었다. 일부 이러한 비인간 동물은 돌연변이가 없는 비인간 동물에 비교하여 Hvcn1 발현이 증가되었다. 일부 이러한 비인간 동물에서, 비인간 동물은 돌연변이가 없는 비인간 동물에 비교하여 대조군 차우 식단(chow diet)시 정상적인 글루코스 항상성 및 글루코스-유도된 인슐린 분비를 가진다. 일부 이러한 비인간 동물에서, 비인간 동물은 돌연변이가 없는 비인간 동물에 비교하여 대조군 차우 식단시 정상적인 대사 표현형을 가진다.
일부 이러한 비인간 동물은 돌연변이가 없는 비인간 동물에 비교하여 하나 이상의 다음의 특징을 가진다: (a) 고지방식이 공급될 때 증가된 글루코스-유도 인슐린 분비; (b) 고지방식이 공급될 때 증가된 췌장 베타 세포 증식; (c) 고지방식이 공급될 때 췌장 베타 세포의 증가된 수; 및 (d) 인슐린 수용체의 차단 후에 증가된 급식 혈장 인슐린 수준. 선택적으로, 비인간 동물은 돌연변이가 없는 비인간 동물에 비교하여 다음의 특징을 전부 가진다: (a) 고지방식이 공급될 때 증가된 글루코스-유도 인슐린 분비 ; (b) 고지방식이 공급될 때 증가된 췌장 베타 세포 증식; (c) 고지방식이 공급될 때 췌장 베타 세포의 증가된 수; 및 (d) 인슐린 수용체의 차단 후에 증가된 급식 혈장 인슐린 수준.
일부 이러한 비인간 동물은 돌연변이가 없는 비인간 동물에 비교하여 하나 이상의 다음의 특징을 가진다: (a) 20주 동안 고지방식이 공급된 후에 증가된 순환 인슐린 수준; (b) 20주 동안 고지방식이 공급된 후에 증가된 수의 췌장 베타 세포; (c) 고지방식이 공급될 때 감소된 프로인슐린-대-인슐린 비율; 및 (d) 인슐린 수용체의 차단 후에 증가된 급식 혈장 인슐린 수준. 선택적으로, 비인간 동물은 돌연변이가 없는 비인간 동물에 비교하여 다음의 특징을 전부 가진다: (a) 고지방식이 공급될 때 증가된 글루코스-유도 인슐린 분비 ; (b) 고지방식이 공급될 때 증가된 췌장 베타 세포 증식; (c) 고지방식이 공급될 때 췌장 베타 세포의 증가된 수; 및 (d) 인슐린 수용체의 차단 후에 증가된 급식 혈장 인슐린 수준.
일부 이러한 비인간 동물에서, 비인간 동물의 샘에서 Slc30a8 mRNA 발현 수준은 돌연변이가 없는 비인간 동물의 샘에서의 Slc30a8 mRNA 발현 수준의 적어도 25%이다.
일부 이러한 비인간 동물, 비인간 동물 세포, 또는 비인간 동물 게놈은 돌연변이에 대해 이형접합성이다. 일부 이러한 비인간 동물, 비인간 동물 세포, 또는 비인간 동물 게놈은 돌연변이에 대해 동형접합성이다. 일부 이러한 비인간 동물, 비인간 동물 세포, 또는 비인간 동물 게놈은 수컷이다. 일부 이러한 비인간 동물, 비인간 동물 세포, 또는 비인간 동물 게놈은 암컷이다.
다른 측면으로, 상기 비인간 동물 중 임의의 비인간 동물을 제조하는 방법이 제공된다. 일부 이러한 방법은: (a) 단세포 단계 배아가 아닌 비인간 동물 만능 세포의 게놈을: (i) Slc30a8 유전자좌에서 5' 표적 서열에 혼성화하는 5' 상동성 팔(homology arm) 및 Slc30a8 유전자좌에서 3' 표적 서열에 혼성화하는 3' 상동성 팔이 측면에 있는 삽입 핵산을 포함하는 외인성 수복 주형, 여기서 삽입 핵산은 돌연변이를 포함하고 있는 것인 외인성 수복 주형; 및 (ii) Cas9 단백질; 및 (iii) Slc30a8 유전자좌 내의 가이드 RNA 인식 서열에 혼성화하는 가이드 RNA, 여기서 Slc30a8 유전자는 돌연변이를 포함하도록 변형되는 것인 가이드 RNA와 접촉시키는 단계; 및 (b) 변형된 비인간 동물 만능 세포를 숙주 배아에 도입하는 단계; 및 (c) 숙주 배아를 대리 모체(surrogate mother)에 이식하여 Slc30a8 유전자가 돌연변이를 포함하도록 변형된 유전자 변형된 F0 세대 비인간 동물을 생성하는 단계, 여기서 돌연변이는 고지방식이 공급될 때 돌연변이가 없는 비인간 동물에 비교하여 증강된 인슐린 분비 능력을 가지는 F0 세대 비인간 동물을 초래하는 것인 단계를 포함한다. 일부 이러한 방법은: (a) 단세포 단계 배아가 아닌 비인간 동물 만능 세포의 게놈을: (i) Slc30a8 유전자좌에서 5' 표적 서열에 혼성화하는 5' 상동성 팔 및 Slc30a8 유전자좌에서 3' 표적 서열에 혼성화하는 3' 상동성 팔이 측면에 있는 삽입 핵산을 포함하는 외인성 수복 주형, 여기서 삽입 핵산은 돌연변이를 포함하고 있는 외인성 수복 주형; 및 (ii) Cas9 단백질; 및 (iii) Slc30a8 유전자좌 내의 가이드 RNA 인식 서열에 혼성화하는 가이드 RNA, 여기서 Slc30a8 유전자는 돌연변이를 포함하도록 변형되는 가이드 RNA와 접촉시키는 단계; 및 (b) 변형된 비인간 동물 만능 세포를 숙주 배아에 도입하는 단계; 및 (c) 숙주 배아를 대리 모체에 잉태시켜서 Slc30a8 유전자가 돌연변이를 포함하도록 변형된 유전자 변형된 F0 세대 비인간 동물을 생성하는 단계, 여기서 돌연변이는 고지방식이 공급될 때 돌연변이가 없는 비인간 동물에 비교하여 증강된 인슐린 분비 능력을 가지는 F0 세대 비인간 동물을 초래하는 단계를 포함한다. 선택적으로, 만능 세포는 배아 줄기 세포이다. 선택적으로, 외인성 수복 주형은 길이가 적어도 10 kb인 큰 표적화 벡터이거나, 또는 외인성 수복 주형은 5' 상동성 팔과 3' 상동성 팔의 총 합이 적어도 10 kb의 길이인 큰 표적화 벡터이다.
일부 이러한 방법은: (a) 비인간 동물 단세포 단계 배아의 게놈을: (i) Slc30a8 유전자좌에서 5' 표적 서열에 혼성화하는 5' 상동성 팔 및 Slc30a8 유전자좌에서 3' 표적 서열에 혼성화하는 3' 상동성 팔이 측면에 있는 삽입 핵산을 포함하는 외인성 수복 주형, 여기서 삽입 핵산은 돌연변이를 포함하고 있는 것인 외인성 수복 주형; (ii) Cas9 단백질; 및 (iii) Slc30a8 유전자좌 내의 가이드 RNA 인식 서열에 혼성화하는 가이드 RNA, 여기서 Slc30a8 유전자는 돌연변이를 포함하도록 변형되는 것인 가이드 RNA와 접촉시키는 단계; 및 (b) 변형된 비인간 동물 단세포 단계 배아를 대리 모체에 이식하여 Slc30a8 유전자가 돌연변이를 포함하도록 변형된 유전자 변형된 F0 세대 비인간 동물을 생성하는 단계, 여기서 돌연변이는 고지방식이 공급될 때 돌연변이가 없는 비인간 동물에 비교하여 증강된 인슐린 분비 능력을 가지는 F0 세대 비인간 동물을 초래하는 것인 단계를 포함한다. 일부 이러한 방법은: (a) Slc30a8 유전자좌에서 5' 표적 서열에 혼성화하는 5' 상동성 팔 및 Slc30a8 유전자좌에서 3' 표적 서열에 혼성화하는 3' 상동성 팔이 측면에 있는 삽입 핵산을 포함하는 외인성 수복 주형, 여기서 삽입 핵산은 돌연변이를 포함하고 있는 것인 외인성 수복 주형; (ii) Cas9 단백질; 및 (iii) Slc30a8 유전자좌 내의 가이드 RNA 인식 서열에 혼성화하는 가이드 RNA, 여기서 Slc30a8 유전자는 돌연변이를 포함하도록 변형되는 것인 가이드 RNA와 접촉시키는 단계; 및 (b) 변형된 비인간 동물 단세포 단계 배아를 대리 모체에서 잉태시켜서 Slc30a8 유전자가 돌연변이를 포함하도록 변형된 유전자 변형된 F0 세대 비인간 동물을 생성하는 단계, 여기서 돌연변이는 고지방식이 공급될 때 돌연변이가 없는 비인간 동물에 비교하여 증강된 인슐린 분비 능력을 가지는 F0 세대 비인간 동물을 초래하는 것인 단계를 포함한다.
일부 이러한 방법에서, 단계 (a)는 비인간 동물 만능 세포 또는 비인간 단세포 단계 배아의 게놈을 Slc30a8 유전자좌 내의 제2 가이드 RNA 인식 서열에 혼성화하는 제2 가이드 RNA와 접촉시키는 단계를 추가로 포함한다.
일부 이러한 방법에서, 외인성 수복 주형은 단일 가닥 올리고데옥시뉴클레오타이드이다. 선택적으로, 외인성 수복 주형의 길이는 약 80 뉴클레오타이드 내지 약 200 뉴클레오타이드이다.
또 다른 측면으로, 제2형 당뇨병을 개선 또는 악화시키는 활성에 대해 화합물을 스크리닝하는 방법이 제공된다. 일부 이러한 방법은: (a) 상기 임의의 대상 비인간 동물을 화합물과 접촉시키는 단계; 및 (b) 화합물과 접촉되지 않은 대조군 비인간 동물에 비교하여 대상 비인간 동물에서 다음: (1) 고지방식이 공급될 때 글루코스-유도 인슐린 분비; (2) 고지방식이 공급될 때 췌장 베타 세포 증식 수준; (3) 고지방식이 공급될 때 췌장 베타 세포의 수; 및 (4) 인슐린 수용체의 차단 후 급식 혈장 인슐린 수준 중 하나 이상을 측정하고, 여기서 대조군 비인간 동물은 대상 비인간 동물과 동일한 Slc30a8 돌연변이를 포함하며, 이로 인해 제2형 당뇨병을 개선하는 활성이 대조군 비인간 동물과 비교된 대상 비인간 동물에서 다음: (1) 고지방식이 공급될 때 증가된 글루코스-유도 인슐린 분비; (2) 고지방식이 공급될 때 증가된 췌장 베타 세포 증식; (3) 고지방식이 공급될 때 증가된 췌장 베타 세포의 수; 및 (4) 인슐린 수용체의 차단 후 증가된 급식 혈장 인슐린 수준 중 하나 이상에 의해 확인되며, 그로써 제2형 당뇨병을 악화시키는 활성이 대조군 비인간 동물과 비교된 대상 비인간 동물에서 다음: (1) 고지방식이 공급될 때 감소된 글루코스-유도 인슐린 분비; (2) 고지방식이 공급될 때 감소된 췌장 베타 세포 증식; (3) 고지방식이 공급될 때 감소된 췌장 베타 세포 수; 및 (4) 인슐린 수용체의 차단 후 감소된 급식 혈장 인슐린 수준 중 하나 이상에 의해 확인되는 단계를 포함한다.
일부 이러한 방법은: (a) 상기 임의의 대상 비인간 동물을 화합물과 접촉시키는 단계; 및 (b) 화합물과 접촉되지 않은 대조군 비인간 동물에 비교하여 대상 비인간 동물에서 다음: (1) 고혈당증에 대한 반응으로 인슐린을 분비하는 능력; (2) 인슐린 제거율(insulin clearance); (3) 미토콘드리아 유전자 발현; 및 (4) Hvcn1 발현 중 하나 이상을 측정하며, 여기서 대조군 비인간 동물은 대상 비인간 동물과 동일한 Slc30a8 돌연변이를 포함하고, 이로 인해 제2형 당뇨병을 개선하는 활성이 대조군 비인간 동물과 비교된 대상 비인간 동물에서 다음: (1) 고혈당증에 대한 반응으로 증가된 인슐린 분비 능력; (2) 증가된 인슐린 제거율; (3) 감소된 미토콘드리아 유전자 발현; 및 (4) 증가된 Hvcn1 발현 중 하나 이상에 의해 확인되고, 그로써 제2형 당뇨병을 악화시키는 활성이 대조군 비인간 동물과 비교된 대상 비인간 동물에서 다음: (1) 고혈당증에 대한 반응으로 감소된 인슐린 분비 능력; (2) 감소된 인슐린 제거율; (3) 증가된 미토콘드리아 유전자 발현; 및 (4) 감소된 Hvcn1 발현 중 하나 이상에 의해 확인되는 단계를 포함한다.
또 다른 측면으로, 그것의 게놈이 돌연변이된 Slc30a8 유전자를 포함하는 내인성 Slc30a8 유전자좌를 포함하는 비인간 동물 세포가 제공되며, 여기서 돌연변이된 Slc30a8 유전자는 절단된 SLC30A8 단백질을 암호화하고, 돌연변이된 Slc30a8 유전자를 포함하는 비인간 동물은 돌연변이가 없는 비인간 동물에 비해 증강된 인슐린 분비 능력을 가진다.
또 다른 측면으로, 돌연변이된 Slc30a8 유전자를 포함하는 내인성 Slc30a8 유전자좌를 포함하는 비인간 동물 게놈이 제공되며, 여기서 돌연변이된 Slc30a8 유전자는 절단된 SLC30A8 단백질을 암호화하고, 돌연변이된 Slc30a8 유전자를 포함하는 비인간 동물은 돌연변이가 없는 비인간 동물에 비해 증강된 인슐린 분비 능력을 가진다.
또 다른 측면으로, 비인간 동물의 내인성 Slc30a8 유전자좌에서 돌연변이된 Slc30a8 유전자를 생성하기 위한 표적화 벡터가 제공되며, 여기서 표적화 벡터는 내인성 Slc30a8 유전자좌에서 5' 표적 서열을 표적화하는 5' 상동성 팔 및 내인성 Slc30a8 유전자좌에서 3' 표적 서열을 표적화하는 3' 상동성 팔을 포함하고, 표적화 벡터는 Slc30a8 유전자에 돌연변이를 포함하며, 돌연변이된 Slc30a8 유전자는 절단된 SLC30A8 단백질을 암호화하고, 돌연변이된 Slc30a8 유전자를 포함하는 비인간 동물은 돌연변이가 없는 비인간 동물에 비해 증강된 인슐린 분비 능력을 가진다.
도 1A-1D는 차우 식단시 수컷 R138X 마우스로부터의 샘에서의 Slc30a8 RNA 및 단백질의 분석을 도시한다. 도 1A는 야생형 (WT), 동형접합성 녹아웃 (KO), 및 동형접합성 R138X 마우스로부터 분리된 췌장샘의 Slc30a8 RNA 제자리 혼성화를 보여준다. KO 샘은 음성 대조군으로서 사용되었다. 적색: 글루카곤 RNA, 녹색: 인슐린 RNA, 백색: Slc30a8 RNA. 도 1B는 TAQMAN® 분석을 사용하는 샘 Slc30a8 RNA 수준의 정량화를 보여준다. 도 1C는 차우 식단 급식 WT, KO 및 R138X 마우스로부터 분리된 샘의 웨스턴 블롯을 보여준다. KO 샘은 음성 대조군으로서 사용되었다. 화살표: SLC30A8 단백질; *는 비특이적 밴드를 나타낸다. 도 1D는 WT, KO, 및 R138X 마우스로부터 분리된 췌장샘의 다이티존 염색을 보여준다.
도 2A-2P는 차우 식단시 수컷 동형접합성 R138X 마우스의 대사 표현형을 도시한다. 도 2A-2D 및 2L은 급식 및 금식 WT 및 R138X 마우스에서의 체중 (도 2L), 혈당 (도 2A), 혈장 인슐린 (도 2B), 프로인슐린 (도 2C), 및 C-펩타이드 (도 2D) 수준을 보여준다. 도 2E-2F는 급식 및 금식 WT 및 R138X 마우스에서의 프로인슐린/인슐린 비율 (도 2E) 및 C-펩타이드/인슐린 비율 (도 2F)을 보여준다. 도 2G는 WT 및 R138X 마우스에서의 경구 글루코스 내성 테스트를 보여준다. 데이터는 시간 경과에 따른 혈당 수준으로서 표시된다. 도 2H는 밤새 금식 후 (시간 0) 및 글루코스의 복강내 주사 후 표시된 시간에서 WT 또는 R138X 마우스에서의 혈장 인슐린 수준을 보여준다. 데이터는 시간 경과에 따른 혈당 수준으로서 표시된다. 도 2I는 WT 및 R138X 마우스로부터 분리된 췌장에서 인슐린에 대한 조직학을 보여준다. 도 2J는 췌장 인슐린 염색의 정량화를 보여준다. 도 2K는 샘 수의 정량화를 보여준다. 값은 평균 ± SEM으로서 표시된다 (유전자형당 n=6 내지 20마리 마우스). 도 2M은 4시간 금식 WT 및 R138X 마우스에서의 인슐린 내성 테스트의 결과를 보여준다. 데이터는 시간 경과에 따른 혈당 수준으로서 표시된다 (n=6마리/유전자형). 도 2N은 췌장 인슐린 염색의 추가의 정량화를 보여준다 (샘 질량; n=6마리/유전자형). 값은 평균 ± SEM으로서 표시된다. 도 2O-2P는 차우 식단시 급식 및 금식 WT 및 R138X 마우스에서의 프로인슐린/C-펩타이드 비율 (도 2O) 및 인슐린/C-펩타이드 비율 (도 2P)을 보여준다. 유전자형당 N=18 내지 20마리 마우스.
도 3A-3M은 HFD 식단시 수컷 동형접합성 R138X 마우스의 대사 표현형을 도시한다. 도 3A-3F는 급식 및 금식 WT 및 R138X 마우스에서의 혈당 (도 3A), 혈장 인슐린 (도 3B), 프로인슐린 (도 3C), 및 C-펩타이드 (도 3D) 수준을 보여준다. 도 3E-3F는 급식 및 금식 WT 및 R138X 마우스에서의 프로인슐린/인슐린 비율 (도 3E) 및 C-펩타이드/인슐린 비율 (도 3F)을 보여준다. 도 3G는 WT 및 R138X 마우스에서의 경구 글루코스 내성 테스트를 보여준다. 데이터는 시간 경과에 따른 혈당으로서 표시된다. 곡선 아래의 면적은 우측에 나타낸다. 도 3H는 밤새 금식 후 (시간 0) 및 글루코스의 복강내 주사 후 표시된 시간에서 WT 또는 R138X 마우스에서의 혈액 인슐린 수준을 보여준다. 데이터는 시간 경과에 따른 혈당 수준으로서 표시된다. 도 3I는 WT 및 R138X 마우스로부터 분리된 췌장에서의 인슐리에 대한 조직학을 보여준다. 도 3J는 췌장 인슐린 염색의 정량화를 보여준다. 도 3K는 샘 수의 정량화를 보여준다. 도 3L은 Ki67 (녹색) 및 인슐린 (적색)에 대한 면역조직화학을 보여준다. 도 3M은 Ki67 및 인슐린 이중 양성 세포의 정량화를 보여준다. 값은 ㅍ펴평균 ± SEM을 나타낸다 (유전자형당 n=4 내지 17마리 마우스).
도 4A-4K는 HFD를 받은 수컷 동형접합성 Slc30a8 KO 마우스의 대사 표현형을 도시한다. 도 4A-4D는 급식 및 금식 WT 및 Slc30a8 KO 마우스에서의 혈당 (도 4A), 혈장 인슐린 (도 4B), 프로인슐린 (도 4C), 및 C-펩타이드 (도 4D) 수준을 보여준다. 도 4E-4F는 급식 및 금식 WT 및 Slc30a8 KO 마우스에서의 프로인슐린/인슐린 비율 (도 4E) 및 C-펩타이드/인슐린 비율 (도 4F)을 보여준다. 도 4G는 WT 및 Slc30a8 KO 마우스에서의 경구 글루코스 내성 테스트를 보여준다. 데이터는 시간 경과에 따른 혈당 수준으로서 표시된다. 도 4H는 밤새 금식 후 (시간 0) 및 글루코스의 복강내 주사 후 표시된 시간에서 WT 또는 Slc30a8 KO 마우스에서의 혈액 인슐린 수준을 보여준다. 데이터는 시간 경과에 따른 글루코스 수준으로서 표시된다. 도 4I는 WT 및 Slc30a8 KO 마우스로부터 분리된 췌장에서 인슐린에 대한 조직학을 보여준다. 도 4J는 췌장 인슐린 염색의 정량화를 보여준다. 도 4K는 샘 수의 정량화를 보여준다. 값은 평균 ± SEM을 나타낸다 (유전자형당 n=6 내지 17마리 마우스).
도 5는 프로테아좀 억제에 의한 인간 R138X 단백질의 시험관내 발현 및 안정화를 도시한다. myc-태그가 달린 SLC30A8 WT 또는 R138X 단백질 단독 또는 이것들의 함께의 과다발현 후의 HEK293 용해물의 웨스턴 블롯 분석이 도시된다. 세포는 표시된 화합물로 6시간 동안 처리되었고 각각의 항체로 프로빙되었다..
도 6A-6E는 수컷 동형접합성 R138X 마우스에서 차우 및 HFD 조건에서 변하지 않는 글루카곤 조직학을 도시한다. 도 6A는 차우 급식 WT 및 R138X 마우스로부터 분리된 췌장에서의 글루카곤에 대한 조직학을 보여준다. 도 6B 및 6E는 도 6A에서 보여준 췌장 글루카곤 염색의 정량화를 보여준다. 값은 평균 ± SEM을 나타낸다 (유전자형당 n= 6마리). 도 6C는 HFD-급식 WT 및 R138X 마우스로부터 분리된 췌장에서의 글루카곤에 대한 조직학을 보여준다. 도 6D는 도 6C에서 보여준 췌장 글루카곤 염색의 정량화를 보여준다 (유전자형당 n=4 내지 17마리 마우스).
도 7A-7K는 차우 식단시 수컷 동형접합성 Slc30a8 KO 마우스의 대사 표현형을 도시한다. 도 7A-7D는 급식 및 금식 WT 및 Slc30a8 KO 마우스에서의 혈당 (도 7A), 혈장 인슐린 (도 7B), 프로인슐린 (도 7C), 및 C-펩타이드 (도 7D) 수준을 보여준다. 도 7E-7F는 급식 및 금식 WT 및 Slc30a8 KO 마우스에서의 프로인슐린/인슐린 비율 (도 7E) 및 C-펩타이드/인슐린 비율 (도 7F)을 보여준다. 도 7G는 WT 및 Slc30a8 KO 마우스에서의 경구 글루코스 내성 테스트를 보여준다. 데이터는 시간 경과에 따른 혈당 수준으로서 표시된다. 도 7H는 밤새 금식 후 (시간 0) 및 글루코스의 복강내 주사 후 표시된 시간에서 WT 또는 Slc30a8 KO 마우스에서의 혈장 인슐린 수준을 보여준다. 데이터는 시간 경과에 따른 혈당 수준으로서 표시된다. 도 7I는 WT 및 Slc30a8 KO 마우스로부터 분리된 췌장에서의 인슐린에 대한 조직학을 보여준다. 도 7J는 췌장 인슐린 염색의 정량화를 보여준다. 도 7K는 샘 수의 정량화를 보여준다. 값은 평균 ± SEM을 나타낸다 (유전자형당 n=6 내지 10마리 마우스).
도 8A-8K는 HFD을 받은 암컷 동형접합성 R138X 마우스의 대사 표현형을 도시한다. 도 8A-8D는 급식 및 금식 WT 및 R138X 마우스에서의 혈당 (도 8A), 혈장 인슐린 (도 8B), 프로인슐린 (도 8C), 및 C-펩타이드 (도 8D) 수준을 보여준다. 도 8E-8F는 급식 및 금식 WT 및 R138X 마우스에서의 프로인슐린/인슐린 비율 (도 8E) 및 C-펩타이드/인슐린 비율 (도 8F)을 보여준다. 도 8G는 WT 및 R138X 마우스에서의 경구 글루코스 내성 테스트를 보여준다. 데이터는 시간 경과에 따른 글루코스 수준으로서 표시된다. 도 8H는 밤새 금식 후 (시간 0) 및 글루코스의 복강내 주사 후 표시된 시간에서 WT 또는 R138X 마우스에서의 혈장 인슐린 수준을 보여준다. 데이터는 시간 경과에 따른 글루코스 수준으로서 표시된다. 도 8I는 WT 및 R138X 마우스로부터 분리된 췌장에서의 인슐린에 대한 조직학을 보여준다. 도 8J는 췌장 인슐린 염색의 정량화를 보여준다. 도 8K는 샘 수의 정량화를 보여준다. 값은 평균 ± SEM을 나타낸다 (유전자형당 n=6 내지 9마리 마우스).
도 9A-9M은 HFD를 받은 이형접합성 R138X (HET) 마우스가 고글루코스-자극 인슐린 수준을 가지는 것을 도시한다. 도 9A는 차우-급식 WT, 이형접합성 R138X 마우스로부터 분리된 샘의 웨스턴 블롯을 보여준다. 화살표: SLC30A8 단백질; *는 비특이적 밴드를 나타낸다. 도 9B는 MWT 및 이형접합성 R138X 마우스로부터 분리된 췌장샘의 다이티존 염색을 보여준다. 도 9C-9F는 급식 및 금식 WT 및 R138X HET 마우스에서의 혈당 (도 9C), 혈장 인슐린 (도 9D), 프로인슐린 (도 9E), 및 C-펩타이드 (도 9F) 수준을 보여준다. 도 9G-9H는 급식 및 금식 WT 및 HET 마우스에서의 프로인슐린/인슐린 비율 (도 9G) 및 C-펩타이드/인슐린 비율 (도 9H)을 보여준다. 도 9I는 WT 및 R138X HET 마우스에서의 경구 글루코스 내성 테스트를 보여준다. 데이터는 시간 경과에 따른 혈당 수준으로서 표시된다. 도 9J는 밤새 금식 후 (시간 0) 및 글루코스의 복강내 주사 후 표시된 시간에서 WT 또는 R138X HET 마우스에서의 혈장 인슐린 수준을 보여준다. 데이터는 시간 경과에 따른 글루코스 수준으로서 표시된다. 도 9K는 WT 및 R138X HET 마우스로부터 분리된 췌장에서의 인슐린에 대한 조직학을 보여준다. 도 9L은 췌장 인슐린 염색의 정량화를 보여준다. 도 9M은 샘 수의 정량화를 보여준다. 값은 평균 ± SEM을 나타낸다 (유전자형당 n=6 내지 9마리 마우스).
도 10A-10C는 R138X 마우스를 생성하기 위하여 마우스 Slc30a8 유전자좌를 표적화하기 위한 도식을 도시한다. 도 10A는 야생형 마우스 유전자좌를 보여주고 표적화를 통해 생성된 pArg137* C>T 점 돌연변이 및 29 bp 삭제의 위치를 나타낸다. 대립유전자-특이적 스크리닝 검정 (8084 AS) 및 TAQMAN® 하류 스크리닝 검정 (8084 TD)이 도시된다. 도 10B는 표적화된 유전자좌의 도식을 보여준다. 도 10C는 자가-삭제(self-excising) 약물 선택 카세트의 자가 삭제 후 표적화된 유전자좌의 도식을 보여준다.
도 11은 야생형 마우스 SLC30A8 단백질의 단백질 정렬 (SEQ ID NO: 12), R138X 마우스에서 예상된 절단된 SLC30A8 Arg137* 단백질 (SEQ ID NO: 13), 및 야생형 인간 SLC30A8 단백질 (SEQ ID NO: 14)을 도시한다.
도 12는 일정한 미니펌프 주입을 사용하여 S961 (점선) 또는 PBS (실선)로 처리된 WT (닫힌 기호) 및 동형접합성 R138X 마우스 (개방 기호)에서의 급식 혈장 글루코스 수준 및 급식 혈장 인슐린 수준을 도시한다. 급식 혈장 글루코스 수준 및 인슐린 수준은 실험 (21일) 내내 표시된 시간에서 측정되었다.
도 13A-13I는 R138X 마우스가 인슐린 수용체 길항물질 S961에 의해 유발된 만성 고혈당증 하에 더 많은 인슐린을 분비하는 것을 도시한다. 도 13A는 인슐린 수용체 길항물질 S961 (20 nMol/주) 또는 PBS로 22일 동안 연속적으로 치료된 R138X 및 WT 마우스에서 비금식 혈장 글루코스 수준을 보여준다. 도 13B는 S961 (20 nMol/주) 또는 PBS로 처리된 R138X 및 WT 마우스에서 제 0, 4, 19 및 22일에 비금식 혈장 인슐린을 보여준다. 도 13C는 처리 22일 후 WT 및 R138X 마우스에서의 혈장 활성 GLP-1 수준을 보여준다. 도 13D 및 13E는 처리 개시 후 제 19일 및 20일에 측정된 급식 및 금식 글루코스 (도 13D) 및 인슐린 (도 13E) 수준을 보여준다. 도 13F는 KI-67 (백색), 인슐린 (녹색), 및 글루카곤 (적색)에 대한 면역조직화학을 보여준다. 도 13G는 KI-67 및 인슐린 이중-양성 세포의 정량화를 보여준다. 도 13H는 (도 13I)에 나타낸 췌장 인슐린 염색의 정량화를 보여준다. 도 13I는 처리 22일 후 WT 및 R138X 마우스로부터 분리된 췌장에서의 인슐린에 대한 조직학을 보여준다. 값은 평균 ± SEM을 나타낸다 (처리 및 유전자형당 n=5 내지 7마리 마우스).
도 14A-14G는 인슐린 수용체 길항물질 S961 (20 nMol/주) 또는 PBS S961 처리 22일 후 호르몬 수준 및 글루카곤 조직학을 도시한다. 급식 및 금식 WT 및 R138X 마우스에서 처리 22일 후 인슐린 (도 14A), 프로인슐린 (도 14B), C-펩타이드 (도 14C), 프로인슐린 / C-펩타이드 비율 (도 14D), 인슐린 / C-펩타이드 비율 (도 14E). 도 14F는 도 14G에 나타낸 췌장 글루카곤 염색의 정량화를 보여준다. 도 14G는 처리 22일 후 WT 및 R138X 마우스로부터 분리된 췌장에서의 글루카곤에 대한 조직학을 보여준다. 값은 평균 ± SEM을 나타낸다 (유전자형당 n=5 내지 7마리 마우스).
도 15는 RPKM (킬러염기 백만개당 판독)으로 표시된, Slc30a8의 유전자 발현을 도시한다.
도 16A-16C는 WT 대비 R138X 마우스에서의 유전자 발현 변화를 도시한다. 도 16A는 인슐린 2 (Ins2) 및 인슐린 1 (Ins1)에 대한 RPKM 값을 보여준다. 도 16B는 베타-세포 조절자에 대한 RPKM 값을 보여준다. 도 16C는 Hvcn1에 대한 RPKM 값을 보여준다.
도 17은 고지방식 (HFD)을 받은 20주 후에 급식 및 금식 수컷 WT 및 동형접합성 R138X 마우스에서의 순환 아연 수준을 도시한다. 마우스는 대략 생후 29주였다. 12마리의 WT 마우스가 평가되었고, 13마리의 R138X 마우스가 평가되었다.
정의
본원에서 상호교환적으로 사용된 용어 "단백질", "폴리펩타이드", 및 "펩타이드"는 코딩된 및 비코딩된 아미노산 및 화학적으로 또는 생화학적으로 변형된 또는 유도체화된 아미노산을 포함하여, 임의의 길이의 아미노산의 중합체 형태를 포함한다. 용어는 또한 변형된 중합체, 예컨대 변형된 펩타이드 골격을 가지는 폴리펩타이드를 포함한다. 용어 "도메인"은 특정 기능 또는 구조를 가지는 단백질 또는 폴리펩타이드의 임의의 부분을 나타낸다.
단백질은 "N-말단" 및 "C-말단"을 가진다고 말한다. 용어 "N-말단"은 유리 아민기 (-NH2)를 가진 아미노산에 의해 종결되는 단백질 또는 폴리펩타이드의 시작에 관한 것이다. 용어 "C-말단"은 유리 카르복실기 (-COOH)에 의해 종결되는 아미노산 사슬 (단백질 또는 폴리펩타이드)의 단부에 관한 것이다.
본원에서 상호교환적으로 사용된 용어 "핵산" 및 "폴리뉴클레오타이드"는 리보뉴클레오타이드, 데옥시리보뉴클레오타이드, 또는 그것의 유사체 또는 변형된 버전을 포함하여, 임의의 길이의 뉴클레오타이드의 중합체 형태를 포함한다. 이것은 퓨린 염기, 피리미딘 염기, 또는 다른 자연적인, 화학적으로 변형된, 생화학적으로 변형된, 비자연적인, 또는 유도체화된 뉴클레오타이드 염기를 포함하는 단일-, 이중-, 및 다중 가닥의 DNA 또는 RNA, 게놈 DNA, cDNA, DNA-RNA 하이브리드, 및 중합체를 포함한다.
핵산은 한 모노뉴클레오타이드 펜토스 고리의 5' 포스페이트가 포스포다이에스테르 결합을 통해 한 방향으로 그것의 이웃하고 있는 3' 산소에 부착되는 방식으로 올리고뉴클레오타이드를 만들기 위해 모노뉴클레오타이드가 반응하기 때문에 "5' 단부" 및 "3' 단부"를 가진다고 말한다. 올리고뉴클레오타이드의 단부는 그것의 5' 포스페이트가 모노뉴클레오타이드 펜토스 고리의 3' 산소에 연결되지 않으면 "5' 단부"로서 언급된다. 올리고뉴클레오타이드의 단부는 그것의 3' 산소가 또 다른 모노뉴클레오타이드 펜토스 고리의 5' 포스페이트에 연결되지 않으면 "3' 단부"로서 언급된다. 핵산 서열은 더 큰 올리고뉴클레오타이드의 내부에 있어도, 또한 5' 및 3' 단부를 가진다고 말할 수 있다. 선형 또는 원형 DNA 분자에서, 별개의 요소가 "상류" 또는 "하류"의 5' 또는 3' 요소인 것으로 언급된다.
용어 "게놈상으로 통합된"은 뉴클레오타이드 서열이 세포의 게놈에 통합되도록 세포에 도입된 핵산을 나타낸다. 세포의 게놈에 핵산의 안전적인 통합을 위해 임의의 프로토콜이 사용될 수 있다.
용어 "표적화 벡터"는 상동 재조합, 비상동성-단부-연결-매개된 결찰, 또는 세포의 게놈의 위치를 표적화하기 위한 재조합의 임의의 다른 수단에 의해 도입될 수 있는 재조합 핵산을 나타낸다.
용어 "야생형"은 정상적인 (돌연변이, 질환에 걸린, 변경된, 등등과 대비되는) 상태 또는 맥락에서 발견되는 것과 같은 구조 및/또는 활성을 가진 실체를 포함한다. 야생형 유전자 및 폴리펩타이드는 종종 다의 상이한 형태 (예컨대, 대립유전자)로 존재한다.
용어 "내인성 서열"은 세포 또는 비인간 동물 내에서 자연적으로 발생하는 핵산 서열을 나타낸다. 예를 들어, 비인간 동물의 내인성 Slc30a8 서열은 비인간 동물의 Slc30a8 유전자좌에서 자연적으로 발생하는 천연 Slc30a8 서열을 나타낸다. 용어 "내인성 유전자좌"는 특정 유전자 요소가 자연적으로 발견되는 염색체 상의 위치를 나타낸다. 예를 들어, 비인간 동물의 내인성 Slc30a8 유전자좌는 비인간 동물에서 자연적으로 발생하는 Slc30a8 유전자좌를 나타낸다 (즉, Slc30a8 유전자가 자연적으로 발견되는 비인간 동물 게놈의 영역). 실례로서, 내인성 마우스 Slc30a8 유전자좌는 염색체 15로 지도화된다 (NCBI RefSeq GeneID 239436; Assembly GRCm38.p4; location NC_000081.6 (52295553-52335733)). 용어 비인간 동물의 "내인성 Slc30a8 유전자좌"는 비인간 동물의 게놈에 무작위로 삽입된 또는 Slc30a8 유전자가 자연적으로 발견되는 비인간 동물 게놈의 영역 이외의 영역에서 삽입된 Slc30a8 유전자를 나타내지 않는다. 마찬가지로, 용어 비인간 동물의 "내인성 Slc30a8 유전자좌"는 예를 들어, 비인간 동물에 그라프팅된 세포 (예컨대, 인간 베타 세포)에 위치한 Slc30a8 유전자를 나타내지 않는다.
"외인성" 분자 또는 서열은 세포에서 그 형태로 정상적으로 존재하지 않는 분자 또는 서열을 포함한다. 정상적인 존재는 세포의 특정 발달 단계 및 환경 조건과 관련된 존재를 포함한다. 외인성 분자 또는 서열은, 예를 들어, 세포 내에서 상응하는 내인성 서열의 돌연벼니된 버전을 포함하거나 또는 세포 내에 있지만 상이한 형태로 존재하는 (즉, 염색체내에 없는) 내인성 서열에 상응하는 서열을 포함할 수 있다. 대조적으로, 내인성 분자 또는 서열은 특정 환경 조건 하에서 특정 발달 단계에 있는 특정 세포에 그 형태로 정상적으로 존재하는 분자 또는 서열을 포함한다.
용어 "이종성"은 핵산 또는 단백질의 맥락에서 사용될 때 핵산 또는 단백질이 동일한 분자에서 함께 자연적으로 발생하지 않는 적어도 두 분절을 포함하는 것을 가리킨다. 예를 들어, 용어 "이종성"은, 핵산 분절 또는 단백질 분절과 관련하여 사용될 때, 핵산 또는 단백질이 자연에서 서로 동일한 관계로 (예컨대 함께 연결됨) 발견되지 않는 둘 이상의 하위 서열을 포함하는 것을 가리킨다. 한 실례로서, 핵산 벡터의 "이종성" 영역은 자연에서 다른 분자와 함께 발견되지 않는 또 다른 핵산 분자 내의 또는 그것에 부착된 핵산의 분절이다. 예를 들어, 핵산 벡터의 이종성 영역은 자연에서 코딩 서열과 함께 발견되지 않는 서열이 측면에 있는 코딩 서열을 포함할 수 있을 것이다. 마찬가지로, 단백질의 "이종성" 영역은 자연에서 다른 펩타이드 분자와 함께 발견되지 않는 또 다른 펩타이드 분자 내에 또는 그것에 부착된 아미노산의 분절이다 (예컨대, 융합 단백질, 또는 태그가 달린 단백질). 유사하게, 핵산 또는 단백질은 이종성 표지 또는 이종성 분비 또는 국지화 서열을 포함할 수 있다.
"코돈 최적화"는 아미노산을 명시하는 3-염기싹 코돈 조합의 다중성에 의해 나타나는 바와 같이 코돈의 축퇴성이란 장점이 있고, 일반적으로 천연 서열의 적어도 한 코돈을, 천연 아미노산 서열을 유지하면서 숙주 세포의 유전자에서 더 빈번하게 또는 가장 빈번하게 사용되는 코돈으로 대체함으로써 특정 숙주 세포에서 증강된 발현에 대한 핵산 서열을 변형시키는 과정을 포함한다. 예를 들어, Cas9 단백질을 암호화하는 핵산은 자연적으로 발생하는 핵산 서열과 비교하여, 박테리아 세포, 효모 세포, 인간 세포, 비인간 세포, 포유류 세포, 설치류 세포, 마우스 세포, 래트 세포, 햄스터 세포, 또는 임의의 다른 숙주 세포를 포함하는, 주어진 원핵 또는 진핵 세포에서 더 높은 빈도의 용법을 가지는 코돈을 치환하기 위해 변형될 수 있다. 코돈 용법 표는, 예를 들어, "코돈 용법 데이터베이스"에서 쉽게 이용할 수 있다. 이들 표는 다양한 방법으로 적응될 수 있다. Nakamura et al. (2000) Nucleic Acids Research 28:292 (모든 목적에 대해 그 전문이 본원에 참조로 포함됨)를 참조한다. 특정 숙주에서의 발현을 위한 특정 서열의 코돈 최적화를 위한 컴퓨터 알고리즘 또한 이용할 수 있다 (예컨대, Gene Forge 참조).
용어 "유전자좌"는 유전자 (또는 중요한 서열), DNA 서열, 폴리펩타이드-암호화 서열의 특정 위치, 또는 유기체의 게놈의 염색체 상의 위치를 나타낸다. 예를 들어, "Slc30a8 유전자좌"는 Slc30a8 유전자, Slc30a8 DNA 서열, SLC30a8-암호화 서열의 위치, 또는 이러한 서열이 거주하는 곳으로서 확인된 유기체의 게놈의 염색체 상의 Slc30a8 위치를 나타낼 수 있다. "Slc30a8 유전자좌"는 , 예를 들어, an 인핸서, a 프로모터, 5' 및/또는 3' 미번역 영역 (UTR), 또는 이것들의 조합을 포함한, Slc30a8 유전자의 조절 요소를 포함할 수 있다.
용어 "유전자"는 생성물 (예컨대, RNA 생성물 및/또는 폴리펩타이드 생성물)을 코딩하고 그 유전자가 전장(전장) mRNA (5' 및 3' 미번역 서열을 포함함)에 상응하도록 비코딩 인트론으로 차단된 코딩 영역 및 5' 및 3' 단부 상의 코딩 영역에 인접하여 위치한 서열을 포함하는 염색체의 DNA 서열을 나타낸다. 용어 "유전자"는 또한 조절 서열 (예컨대, 프로모터, 인핸서, 및 전사 인자 결합 부위), 폴리아데닐화 신호, 내부 리보솜 유입 부위, 사일런서(silencer), 절연 서열, 및 기질 부착 영역을 포함한 다른 비코딩 서열을 포함한다. 이들 서열은 유전자의 코딩 영역 가까이에 (예컨대, 10 kb 이내에) 또는 먼 부위에 있을 수 있고, 이것들은 유전자의 전사 및 번역의 수준 또는 속도에 영향을 미친다.
용어 "대립유전자"는 유전자의 변이체 형태를 나타낸다. 일부 유전자는 다양한 상이한 형태를 가지며, 이것들은 염색체 상의 동일한 위치, 또는 유전자 유전자좌에 위치한다. 이배체 유기체는 각각의 유전자 유전자좌에 2개의 대립유전자를 가진다. 각 쌍의 대립유전자는 특정 유전자 유전자좌의 유전자형을 나타낸다. 유전자형은 특정 유전자좌에 2개의 동일한 대립유전자가 있다면 동형접합성으로서 기술되고 2개의 대립유전자가 상이하면 이형접합성으로 기술된다.
유전자의 "코딩 영역" 또는 "코딩 서열"은 유전자의 DNA 또는 RNA의 일부로 이루어지거나, 단백질을 코딩하는 엑손으로 구성된다. 영역은 5' 단부 상의 출발 코돈에서 시작하고 3' 단부 상의 중단 코돈에서 종결된다.
"프로모터"는 보통 RNA 중합효소 II가 특정 폴리뉴클레오타이드 서열에 대한 적절한 전사 개시 부위에서 RNA 합성을 개시하도록 지시할 수 있는 TATA 박스를 포함하는 DNA의 조절 영역이다. 프로모터는 전사 개시 속도에 영향을 주는 다른 영역을 추가적으로 포함할 수 있다. 본원에서 기술되는 프로모터 서열은 작동 가능하게 연결된 폴리뉴클레오타이드의 전사를 조절한다. 프로모터는 본원에서 개시된 세포 유형 (예컨대, 진핵 세포, 비인간 포유류 세포, 인간 세포, 설치류 세포, 만능 세포, 단세포 단계 배아, 분화된 세포, 또는 이것들의 조합) 중 하나 이상에서 활성일 수 있다. 프로모터는, 예를 들어, 구성적으로 활성인 프로모터, 조건부 프로모터, 유도성 프로모터, 일히적으로 제한된 프로모터 (예컨대, 발달적으로 조절된 프로모터), 또는 공간적으로 제한된 프로모터 (예컨대, 세포-특이적 또는 조직-특이적 프로모터)일 수 있다. 프로모터의 실례는, 예를 들어, WO 2013/176772 (모든 목적에 대해 그 전문이 본원에 참조로 포함됨)에서 찾을 수 있다.
"작동 가능한 연결" 또는 "작동 가능하게 연결되는"은 두 구성요소가 정상적으로 기능하고 구성요소들 중 적어도 하나가 다른 구성요소들 중 적어도 하나에 대해 발휘되는 기능을 매개할 수 있는 가능성을 허용하도록 하는 둘 이상의 구성요소 (예컨대, 프로모터 및 또 다른 서열 요소)의 병렬배치를 포함한다. 예를 들어, 프로모터는 프로모터가 하나 이상의 조절 인자의 존재 또는 부재에 대한 반응으로 코딩 서열의 전사 수준을 제어한다면 코딩 서열에 작동 가능하게 연결된 것일 수 있다. 작동 가능한 연결은 서로 연속적인 또는 트랜스로 작용하는 이러한 서열을 포함할 수 있다 (예컨대, 조절 서열은 코딩 서열의 전사를 제어하기 위해 원거리에서 작용할 수 있다).
용어 "변이체"는 집단에서 가장 만연한 서열과 상이한 (예컨대, 한 뉴클레오타이드가 상이한) 뉴클레오타이드 서열 또는 집단에서 가장 만연한 서열과 상이한 (예컨대, 한 아미노산이 상이한) 단백질 서열을 나타낸다.
두 폴리뉴클레오타이드 또는 폴리펩타이드 서열의 맥락에서 "서열 동일성" 또는 "동일성"은 명시된 비교 창에 걸쳐 최대 상응성에 대해 정렬될 때 동일한 두 서열의 잔기를 참조한다. 서열 동일성의 백분율이 단백질을 언급하여 사용될 때, 동일하지 않은 잔기 위치는 종종 보존성 아미노산 치환에 의해 상이하며, 이때 아미노산 잔기는 유사한 화학적 특성 (예컨대, 전하 또는 소수성)을 가지는 다른 아미노산 잔기에 대해 치환되고 따라서 분자의 기능적 특성이 변경되지는 않는다. 서열이 보존성 치환으로 상이할 때, 퍼센트 서열 동일성은 치환의 보존성 성질을 교정하기 위해 상향 조정될 수 있다. 이러한 보존성 치환에 의해 상이한 서열은 "서열 유사성" 또는 "유사성"을 가진다고 말한다. 이런 조정을 만들기 위한 수단은 잘 알려져 있다. 전형적으로, 이것은 전체적인 미스매치보다는 부분적인 미스매치로서 보존성 치환을 채점하고, 그로써 백분율 서열 동일성을 증가시키는 것을 포함한다. 그러므로, 예를 들어, 동일한 아미노산에 1의 점수가 주어지고 비보존성 치환에 0의 점수가 주어지면, 보존성 치환에는 0과 1 사이의 점수가 주어진다. 보존성 치환의 채점은, 예컨대, 프로그램 PC/GENE (Intelligenetics, Mountain View, California)에서 실행된 것과 같이 계산된다.
"서열 동일성의 백분율"은 비교 창에 걸쳐 2개의 최적으로 정렬된 서열을 비교함으로써 결정된 값을 포함하며 (완벽하게 매치된 잔기의 가장 큰 수), 여기서 비교 창의 폴리뉴클레오타이드 서열의 부분은 두 서열의 최적 정렬을 위한 참조 서열 (첨가나 삭제를 포함하지 않음)과 비교하여 첨가 또는 삭제 (즉, 갭)을 포함할 수 있다. 백분율은 두 서열에서 동일한 핵산 염기 또는 아미노산 잔기가 발생하는 위치의 수를 측정하여 매치된 위치의 수를 산출하고, 매치된 위치의 수를 비교 창에서의 위치의 총 수로 나누고, 그 결과에 100을 곱하여 서열 동일성의 백분율을 구함으로써 계산된다. 다르게 명시되지 않는 한 (예컨대, 더 짧은 서열이 연결된 이종성 서열을 포함함_, 비교 창은 비교되는 두 서열 중 더 짧은 서열의 전체 길이이다.
다르게 진술되지 않는 한,
[0065] Unless otherwise stated, 서열 동일성/유사성 값은 다음의 파라미터를 사용하여 GAP 버전 10을 사용하여 얻어진 값을 포함한다: 50의 GAP 중량 및 3의 길이 중량, 및 nwsgapdna.cmp 채점 매트릭스를 사용하는 뉴클레오타이드에 대한 % 동일성 및 % 유사성; 8의 GAP 중량 및 2의 길이 중량, 및 BLOSUM62 채점 매트릭스를 사용하는 아미노산 서열에 대한 % 동일성 및 % 유사성; 또는 이것들의 임의의 동등한 프로그램. "동등한 프로그램"은 문제의 임의의 두 서열에 대해, GAP 버전 10에 의해 생성된 상응하는 정렬과 비교할 때 동일한 뉴클레오타이드 또는 아미노산 잔기 매치 및 동일한 퍼센트 서열을 가진 정렬을 생성하는 임의의 비교 프로그램을 포함한다.
용어 "보존성 아미노산 치환"은 유사한 크기, 전하, 또는 그것의 상이한 아미노산으로 서열에 정상적으로 존재하는 아미노산의 치환을 나타낸다. 보존성 치환의 실례로 아이소류신, 발린, 또는 류신과 같은 비극성 (소수성) 잔기의 다른 비극성 잔기에 대한 치환을 들 수 있다. 마찬가지로, 보존성 치환의 실례로 아르기닌과 리신 사이, 글루타민과 아스파라긴 사이, 또는 글리신과 세린과 같이 한 극성 (친수성) 잔기의 또 다른 극성 잔기의 치환을 들 수 있다. 추가적으로, 리신, 아르기닌, 또는 히스티딘과 같은 염기성 잔기의 다른 염기성 잔기에 대한 치환, 또는 아스파르트산 또는 글루탐산과 같은 한 산성 잔기의 다른 산성 잔기에 대한 치환이 보존성 치환의 추가적인 실례이다. 비보존성 치환의 실례로는 아이소류신, 발린, 류신, 알라닌, 또는 메티오닌과 같은 비극성 (소수성) 아미노산 잔기의 시스테인, 글루타민, 글루탐산 또는 리신과 같은 극성 (친수성) 잔기에 대한 치환 및/또는 비극성 잔기에 대한 극선 잔기의 치환을 들 수 있다. 전형적인 아미노산 분류가 하기에 요약된다.
아미노산 분류.
알라닌 Ala A 비극성 중성 1.8
아르기닌 Arg R 극성 양성 -4.5
아스파라긴 Asn N 극성 중성 -3.5
아스파르트산 Asp D 극성 음성 -3.5
시스테인 Cys C 비극성 중성 2.5
글루탐산 Glu E 극성 음성 -3.5
글루타민 Gln Q 극성 중성 -3.5
글리신 Gly G 비극성 중성 -0.4
히스티딘 His H 극성 양성 -3.2
아이소류신 Ile I 비극성 중성 4.5
류신 Leu L 비극성 중성 3.8
리신 Lys K 극성 양성 -3.9
메티오닌 Met M 비극성 중성 1.9
페닐알라닌 Phe F 비극성 중성 2.8
프롤린 Pro P 비극성 중성 -1.6
세린 Ser S 극성 중성 -0.8
트레오닌 Thr T 극성 중성 -0.7
트립토판 Trp W 비극성 중성 -0.9
티로신 Tyr Y 극성 중성 -1.3
발린 Val V 비극성 중성 4.2
"상동성" 서열 (예컨대, 핵산 서열)은, 예를 들어, 공지의 참조 서열에 대해 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100% 동일하도록, 공지의 참조 서열에 동일하거나 실질적으로 유사한 서열을 포함한다. 상동성 서열은, 예를 들어, 병렬상동(orthologous) 서열 및 직렬상동(paralogous) 서열을 포함할 수 있다. 상동성 유전자는, 예를 들어, 전형적으로 공통 조상 DNA 서열로부터, 종분화 사건(speciation event)을 통해서 (병렬상동 유전자) 또는 유전자 중복 사건을 통해서 (직렬상동 유전자) 내려온다. "병렬상동" 유전자는 종분화에 의해 공통 조상 유전자로부터 진화된 상이한 종의 유전자를 포함한다. 병렬상동체는 전형저긍로 진화 과정에서 동일한 기능을 보유한다. "직렬상동" 유전자는 게놈 내에서의 중복에 의해 관련된 유전자를 포함한다. 직렬상동체는 진화 과정에서 새로운 기능으로 진화할 수 있다.
용어 "시험관내"는 인공 환경을 포함하고 인공 환경 (예컨대, 시험관)에서 발생하는 과정 또는 반응을 나타낸다. 용어 "생체내"는 자연적인 환경 (예컨대, 세포 또는 유기체 또는 신체)을 포함하고 자연적인 환경 내에서 발생하는 과정 또는 반응을 나타낸다. 용어 "생체외"는 개체의 신체로부터 제거된 세포를 포함하고 그러한 세포 내에서 발생하는 과정 또는 반응을 나타낸다.
용어 "리포터 유전자"는 내인성 또는 이종성 프로모터 및/또는 인핸서 요소에 작동 가능하게 연결된 리포터 유전자 서열을 포함하는 구성물이 그 프로모터 및/또는 인핸서 요소의 활성화에 필요한 인자를 함유한 (또는 함유하도록 만들어질 수 있는) 세포에 도입될 때 쉽게 그리고 정량화가 가능하게 검정되는 유전자 생성물 (전형적으로 효소)을 암호화하는 서열을 가지는 핵산을 말한다. 리포터 유전자의 실레로는, 한정하는 것은 아니지만, 베타-갈락토시다제 (lacZ)를 암호화하는 유전자, 박테리아 클로람페니콜 아세틸트랜스퍼라제 (cat) 유전자, 반딧불이 루시퍼라제 유전자, 베타-글루쿠로니다제 (GUS)를 암호화하는 유전자, 및 형광 단백질을 암화하는 유전자를 들 수 있다. "리포터 단백질"은 리포터 유전자에 의해 암호화된 단백질을 나타낸다.
본원에서 사용되는 바 용어 "형광 리포터 단백질"은 형광이 리포터 단백질로부터 직접적으로, 형광성 기질 상의 리포터 단백질의 활성으로부터, 또는 형광 태그가 달린 화합물에 대한 결합 친화성을 가진 단백질로부터 유래할 수 있는 형광을 기반으로 검출 가능한 리포터 단백질을 의미한다. 형광 단백질의 실례로 녹색 형광 단백질 (예컨대, GFP, GFP-2, tagGFP, turboGFP, eGFP, 에메랄드, 아자미 그린(Azami Green), 단량체 아자미 그린, CopGFP, AceGFP, 및 ZsGreenl), 황색 형광 단백질 (예컨대, YFP, eYFP, 시트린(Citrine), 비너스(Venus), YPet, PhiYFP, 및 ZsYellowl), 청색 형광 단백질 (예컨대, BFP, eBFP, eBFP2, 아즈라이트(Azurite), mKalamal, GFPuv, 사파이어, 및 T-사파이어), 청록색 형광 단백질 (예컨대, CFP, eCFP, 진청색(Cerulean), CyPet, AmCyanl, 및 Midoriishi-Cyan), 적색 형광 단백질 (예컨대, RFP, mKate, mKate2, mPlum, DsRed 단량체, mCherry, mRFP1, DsRed-Express, DsRed2, DsRed-단량체, HcRed-Tandem, HcRedl, AsRed2, eqFP611, mRaspberry, mStrawberry, 및 Jred), 오렌지색 형광 단백질 (예컨대, mOrange, mKO, Kusabira-Orange, 단량체 Kusabira-Orange, mTangerine, 및 tdTomato), 및 세포에서의 존재가 유동 세포분석법에 의해 검출될 수 있는 임의의 다른 적합한 형광 단백질을 들 수 있다.
이중 가닥 절단 (DSB)에 대한 반응으로의 수복은 주로 2가지 보존된 DNA 수복 경로: 상동성 재조합 (HR) 및 비상동성 말단 연결 (NHEJ)에 의해 일어난다. Kasparek & Humphrey (2011) Seminars in Cell & Dev. Biol. 22:886-897 (모든 목적에 대해 그 전문이 본원에 참조로 포함됨)을 참조한다. 마찬가지로, 외인성 도너 핵산에 의해 매개된 표적 핵산의 수복은 두 폴리뉴클레오타이드 사이의 유전자 정보 교환의 임의 과정을 포함할 수 있다.
용어 "재조합"은 두 폴리뉴클레오타이드 사이의 유전자 정보 교환의 임의 과정을 포함하고 임의의 메커니즘에 의해 일어날 수 있다. 재조합은 상동성 인도 수복 (HDR) 또는 상동성 재조합 (HR)을 통해 일어날 수 있다. HDR 또는 HR은 뉴클레오타이드 서열 상동성을 필요로 할 수 있는 핵산 수복의 형태를 포함하며, "표적" 분자 (즉, 이중 가닥 절단을 겪은 분자)의 수복을 위한 주형으로서 "도너" 분자를 사용하고, 도너로부터 표적으로의 유전자 정보의 전달로 이어진다. 임의의 특정 이론에 얽매이기를 바라지 않지만, 이러한 전달은 절단된 표적 및 도너 사이에서 형성되는 이종듀플렉스 DNA의 미스매치 교정, 및/또는 도너가 표적의 일부가 될 유전자 정보를 재합성하기 위해 사용되는 합성-의존성 가닥 어닐링, 및/또는 관련된 과정을 포함할 수 있다. 일부 경우에, 도너 폴리뉴클레오타이드, 도너 폴리뉴클레오타이드의 일부분, 도너 폴리뉴클레오타이드의 복사물, 또는 도너 폴리뉴클레오타이드의 복사물의 일부분은 표적 DNA에 통합된다. Wang et al. (2013) Cell 153:910-918; Mandalos et al. (2012) PLOS ONE 7:e45768:1-9; 및 Wang et al. (2013) Nat Biotechnol. 31:530-532 (이들은 각각 모든 목적에 대해 그 전문이 본원에 참조로 포함됨)를 참조한다.
NHEJ는 상동성 주형을 필요로 하지 않으면서 절단 단부의 또 다른 절단 단부에의 또는 외인성 서열에의 직접적인 결찰에 의한 핵산의 이중 가닥 절단의 수복을 포함한다. NHEJ에 의한 비연속 서열의 결찰은 자주 이중 가닥 절단 부위 가까이에서 삭제, 삽입, 또는 전위를 초래할 수 있다. 예를 들어, NHEJ는 또한 절단 단부의 외인성 도너 핵산 단부와의 직접 결찰을 통해 외인성 도너 핵산의 표적화된 통합 (즉, NHEJ-기반 포획)을 초래한다. 이러한 NHEJ-매개된 표적화된 통합은 상동성 인도 수복 (HDR) 경로가 쉽게 사용 가능하지 않을 때 (예컨대, 비분할 세포, 일차 세포, 및 상동성-기반 DNA 수복이 빈약하게 수행되는 세포에서) 외인성 도너 핵산의 삽입에 바람직할 수 있다. 이에 더불어, 상동성 인도 수복과 대조적으로, 절단 부위의 측면의 서열 동일성의 큰 영역과 관련된 지식은 필요하지 않으며, 이것은 그것에 대한 게놈 서열의 지식이 한정된 게놈을 가진 유기체 안에 표적화된 삽입을 시도할 때에 유익할 수 있다. 통합은 외인성 도너 핵산과 절단된 게놈 서열 사이의 블런트 단부의 결찰을 통해, 또는 절단된 게놈 서열에서 뉴클레아제 작용제에 의해 생성된 오버행과 부합하는 오버행이 측면에 있는 외인성 도너 핵산을 사용하여 스티키 단부 (즉, 5' 또는 3' 오버행을 가지는 단부)의 결찰을 통해 진행될 수 있다. 예컨대, US 2011/020722, WO 2014/033644, WO 2014/089290, 및 Maresca et al. (2013) Genome Res. 23(3):539-546 (이들의 각각은 모든 목적에 대해 그 전문이 본원에 참조로 포함됨)을 참조한다. 만약 블런트 단부가 결찰되면, 단편 연결을 위해 필요한 미세상동성 영역을 생성하기 위해 표적 및/또는 도너 절제가 필요할 수 있고, 이것은 표적 서열에서 원치 않는 변경을 생성할 수 있다.
용어 "R138X 마우스"는 인간 SLC30A8 추정 LOF 돌연변이, R138X에 상응하는 마우스 Slc30a8 유전자좌에 돌연변이를 갖는 마우스를 나타낸다. 마우스 Slc30a8 유전자좌의 돌연변이는 c.409C>T (전사물 등록 번호 NM_172816.3), p.Arg137X로, 코딩 서열의 뉴클레오타이드 409에서 C가 T로 치환되어 아르기닌 잔기를 암호화하는 코돈으로부터 중단 코돈으로 돌연변이된 아미노산 잔기 137 (R137*중단)을 암호화하는 코돈이 유발된 것을 의미한다. 상응하는 인간 SLC30A8 돌연변이는 c.412 C>T (전사물 등록 번호 NM_173851), p.Arg138X로, 코딩 서열의 뉴클레오타이드 412에서 C가 T로 치환되어 아르기닌 잔기를 암호화하는 코돈으로부터 중단 코돈으로 돌연변이된 아미노산 잔기 138 (R138*중단)을 암호화하는 코돈이 유발된 것을 의미한다. 마우스 SLC30A8 단백질의 아미노산 잔기 137은 인간 SLC30A8 단백질의 아미노산 잔기 138과, 두 단백질이 최적으로 정렬될 때, 상응한다. 도 11을 참조한다. 비록 마우스 Slc30a8 유전자의 돌연변이가 마우스 SLC30A8 단백질의 아미노산 잔기 137을 암호화하는 코돈에 있을지라도, 이들 마우스는 상응하는 인간 SLC30A8 돌연변이와 관련하여 "R138X 마우스"로서 본원에서 언급된다.
하나 이상의 인용된 요소를 "포함하는" 조성물 또는 방법은 구체적으로 인용되지 않은 다른 요소를 포함할 수 있다. 예를 들어, 단백질을 "포함하는" 조성물은 단백질을 단독으로 또는 다른 성분과 함께 함유할 수 있다. 전환 문구 "본질적으로 ~으로 이루어지는"은 청구범위의 범주가 청구범위에서 인용된 명시된 요소 및 청구된 발명의 기본적이고 신규한 특징(들)에데 실질적으로 영향을 주지 않는 요소를 포함하는 것으로 해석되어햐 하는 것을 의미한다. 그러므로, 본 발명의 청구범위에서 사용될 때 용어 "본질적으로 ~으로 이루어지는"은 "포함하는"과 동등한 것으로 해석되는 것으로 의도되지 않는다.
"선택적인" 또는 "선택적으로"는 후속적으로 기술된 사건 또는 상황이 일어날 수도 있거나 일어나지 않을 수 있고 그 기술이 사건 또는 상황이 일어나는 상황 및 일어나지 않는 상황을 포함하는 것을 의미한다.
값의 범위의 기술은 그 범위 내의 또는 그 범위를 규정하는 모든 정수, 및 그 범위 내의 정수에 의해 규정된 모든 하위범위를 포함한다.
맥락으로부터 다르게 나타나지 않는 한, 용어 "약"은 표준 값의 측정의 표준 오차 범위 (예컨대, SEM) 내의 값을 포함한다.
용어 "및/또는"은 관련된 열거된 항목 중 하나 이상의 임의의 및 모든 가능한 조합, 뿐만 아니라 대안으로 해석될 때 조합의 부족 ("또는")을 나타내며 포함한다.
용어 "또는"은 특정 목록의 임의의 한 구성원을 나타내며 또한 그 목록의 구성원의 임의의 조합을 포함한다.
물품의 단수의 형태를 나타내는 용어는 맥락이 분명하게 다르게 명시하지 않는 한 복수의 대상을 포함한다. 예를 들어, 용어 "단백질" 또는 "적어도 하나 단백질"은 그것의 혼합물을 포함한, 복수의 단백질을 포함할 수 있다.
통계학적으로 유의미한 것은 p≤0.05를 의미한다.
상세한 설명
I. 개요
본원에는 그것의 게놈에 돌연변이된 Slc30a8 유전자좌를 포함하는 비인간 동물 게놈, 비인간 동물 세포, 및 비인간 동물 및 그러한 비인간 동물 세포 및 비인간 동물을 사용하는 방법이 개시된다. 아연 수송체 SLC30A8은 주로 내분비 췌장 샘에서 발현된다. SLC30A8은 지금까지 그것에 대한 추정되는 기능 상실 돌연변이가 제2형 당뇨병의 발생으로부터 보호하는 것으로 밝혀진 3가지 유전자 중 유일한 것이다. 이것은 Slc30a8이 결핍된 마우스 모델이 가볍게 손상된 글루코스 항상성을 가지기 때문에 흥미롭지만 또한 당황스러운 관찰이다. 본 발명자들은 보호성 인간 SLC30A8 대립유전자를 모방하는 돌연변이된 Slc30a8 유전자좌를 포함하는 마우스 모델을 생성하였다. 이 마우스 모델은 인간이 제2형 당뇨병으로부터 왜 보호되는지를 첫 번째로 설명해줄 수 있다. 마우스는 증가된 인슐린 분비 능력을 가진다. 특히, 마우스는 더 높은 글루코스-유도 인슐린 분비를 가지며, 이것은 췌장 베타 세포의 증가된 수에 의해 부분적으로 매개될 수 있다. 이들 SLC30A8 돌연변이 데이터는 베타 세포 팽창이 제2형 당뇨병을 관리하기 위한 타당한 치료적 전략이라는 개념을 지지한다.
본원에서 개시된 세포 및 비인간 동물 모델은 T2D의 메커니즘 (예컨대, SLC30A8이 인슐린 가공 및 당뇨병에 기여하게 되는 메커니즘)에 대한 통찰을 제공하고 잠재적으로 새로운 치료적 및 진단적 표적을 제공하기 위해서뿐만 아니라 약물 스크리닝에 대해 사용될 수 있다.
II. 돌연변이된 Slc30a8 유전자좌를 포함하는 비인간 동물
본원에 개시된 세포 및 비인간 동물은 (예컨대, 그것의 게놈에) Slc30a8 유전자좌에 돌연변이 (예컨대, 비인간 동물에서 자연적으로 발생하지 않는 돌연변이)를 포함한다. 돌연변이된 Slc30a8 유전자좌는 조기 종결 코돈을 가질 수 있고 및/또는 절단된 SLC30A8 단백질을 암호화할 수 있다. 돌연변이된 Slc30a8 유전자좌를 포함하는 비인간 동물은 고지방식이 공급될 때 동일한 식단이 공급된 돌연변이가 없는 비인간 동물과 비교하여 증강된 인슐린 분비 능력을 가진다.
A. Slc30a8
본원에 기술된 세포 및 비인간 동물은 돌연변이된 Slc30a8 (가용성 담체 패밀리 30 구성원 8) 유전자좌를 포함한다. SLC30A8에 대한 다른 이름은 아연 수송체 8, ZnT-8, 및 Znt8을 포함한다. Slc30a8에 의해 암호화된 단백질은 세포내 소포체에서 아연의 축적에 관여하는 아연 수송체이다. Slc30a8은 췌장에서, 특히 랑게르한스샘에서 고수준으로 발현된다. 암호화된 단백질은 인슐린-분비 INS-1 세포의 분비 경로 과립에서 인슐린과 공동 국지화된다.
인간 SLC30A8은 염색체 8에서 인간 8q24.11로 지도화된다 (NCBI RefSeq GeneID 169026; 어셈블리 GRCh38.p7; 위치 116950273-117176714). 유전자는 8개의 엑손 및 7개의 인트론을 가지는 것으로 보고되었다. 그러나, 8개 이상의 엑손 (비코딩 엑손을 포함함)을 가지는 이소형태 또한 가능하다. 야생형 인간 SLC30A8 단백질은 UniProt 등록 번호 Q8IWU4로 배정되었다. 2개의 이소형태, Q8IWU4 이소형태 1 (SEQ ID NO: 14) 및 Q8IWU4 이소형태 2가 알려져 있다. 이소형태 1을 암호화하는 mRNA는 NCBI RefSeq NM_173851.2 (SEQ ID NO: 17)로 배정된다. 전장 인간 단백질은 6개의 경막 영역, 4개의 세포내 위상학적 도메인, 및 3개의 세포외 위상학적 도메인을 포함한 369개 아미노산을 가진다. 이들 도메인 사이의 설명은 UniProt에 표시된다. 인간 SCL30A8에 대한 언급은 개과 (야생형) 형태뿐만 아니라 모든 대립유전자 형태 및 이소형태를 포함한다. 인간 SCL30A8의 임의의 다른 형태는 야생형 형태와의 최대 정렬을 위해 넘버링된 아미노산을 가지며, 정렬된 아미노산은 동일한 번호로 지정된다.
마우스 Slc30a8은 염색체 15로 지도화된다 (NCBI RefSeq GeneID 239436; 어셈블리 GRCm38.p4; 위치 NC_000081.6 (52295553-52335733)). 유전자는 8개의 엑손과 7개의 인트론을 가지는 것으로 보고되었다. 야생형 마우스 SLC30A8 단백질은 UniProt 등록 번호 q8bgg0 (SEQ ID NO: 12)으로 배정되었다. 마우스 SLC30A8을 암호화하는 mRNA는 NCBI RefSeq NM_172816.3 (SEQ ID NO: 16)으로 배정된다. 전장 마우스 단백질은 6개의 경막 영역, 4개의 세포내 위상학적 도메인, 및 3개의 세포외 위상학적 도메인을 포함한 367개 아미노산을 가진다. 이들 도메인 사이의 설명은 UniProt에 표시된다. 마우스 SCL30A8에 대한 언급은 개과 (야생형) 도메인, 뿐만 아니라 모든 대립유전자 형태 및 이소형태를 포함한다. 마우스 SLC30A8의 임의의 다른 형태는 야생형 형태와의 최적의 정렬을 위해 넘버링된 아미노산을 가지며, 정렬된 아미노산은 동일한 번호로 지정된다.
예시의 래트 SLC30A8 단백질은 UniProt 등록 번호 P0CE46으로 표시된다.
인간 SLC30A8 유전자에서의 다형성은 제2형 당뇨병 (T2D)의 변경된 위험과 관련된다. 예컨대, Sladek et al. (2007) Nature 445(7130):881-885 및 Davidson et al. (2014) Trends Endocrinol. Metab. 25(8):415-424 (이들은 각각 모든 목적에 대해 그 전문이 본원에 참조로 포함됨)를 참조한다. 인간에서의 일부 이러한 다형성 또는 돌연변이는 T2D의 위험을 감소시킬 수 있거나 인간에서 T2D에 대해 보호적이다. T2D의 위험을 감소시키는 SLC30A8 유전자에서의 다형성 또는 돌연변이는 T2D에 대한 보호를 제공하거나, T2D에 대한 내성을 제공하거나, 또는 T2D에 대한 보호 또는 내성과 관련된 다형성 또는 돌연변이를 포함한다. 예를 들어, 다양한 중단 코돈 돌연변이, 프레임시프트 돌연변이, 스플라이스 부위 돌연변이, 또는 인간 SLC30A8에서 단백질 절단을 유발하는 개시자 코돈 변이는 이형접합성일 때 T2D에 대해 보호적이다. 이들 중 하나가 코딩 서열의 뉴클레오타이드 412에서 C가 T로 치환되어 아르기닌 잔기를 암호화하는 코돈으로부터 중단 코돈으로 돌연변이된 아미노산 잔기 138 (R138*중단)을 암호화하는 코돈을 유발하는 것을 의미하는 c.412 C>T (전사물 등록 번호 NM_173851), p.Arg138X로 지정된다. 예컨대, Flannick et al. (2014) Nat. Genet. 46(4):357-363 (모든 목적에 대해 그 전문이 본원에 참조로 포함됨)을 참조한다. 이들 표현형은 이전의 동물 모델에서는 복제되지 않았지만 본원에서 개시된 비인간 동물에서는 복제된다.
B. 돌연변이된 Slc30a8 유전자좌
본원에서 개시된 돌연변이된 Slc30a8 유전자좌는 고지방식이 공급될 때 동일한 식단이 공급될 때의 돌연변이가 없는 비인간 동물에 비교하여 증강된 인슐린 분비 능력을 가진 비인간 동물을 초래한다. 돌연변이된 Slc30a8 유전자좌는 T2D 위험을 감소시킬 수 있다. 돌연변이된 Slc30a8 유전자좌를 포함하는 비인간 동물은 돌연변이가 없는 비인간 동물 (예컨대, 야생형 비인간 동물)에 비교하여 다음의 특징 중 하나 이상 또는 전부를 가질 수 있다: (1) 고지방식이 공급될 때 증가된 글루코스-유도 인슐린 분비; (2) 고지방식이 공급될 때 증가된 췌장 베타 세포 증식; (3) 고지방식이 공급될 때 증가된 췌장 베타 세포 수; 및 (4) 인슐린 수용체의 차단 후 (예컨대, S961로의) 증가된 급식 혈장 인슐린 수준. 추가적으로 또는 대안적으로, 돌연변이된 Slc30a8 유전자좌를 포함하는 비인간 동물은 돌연변이가 없는 비인간 동물 (예컨대, 야생형 비인간 동물)에 비교하여 다음의 특징 중 하나 이상 또는 전부를 가질 수 있다: (1) 고지방식이 공급되는 20, 25, 30, 35, 40, 45, 또는 50주 후 (예컨대, 20 또는 30주 후) 증가된 순환 인슐린 수준; (2) 고지방식이 공급되는 20, 25, 30, 35, 40, 45, 또는 50주 후 (예컨대, 20 또는 30주 후) 증가된 췌장 베타 세포 수; (3) 고지방식이 공급될 때 프로인슐린-대-인슐린 비율의 감소; (4) 인슐린 수용체의 차단 후 (예컨대, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 또는 25일 후) 증가된 급식 혈장 인슐린 수준; 및 (5) 개선된 인슐린 프로세싱 및 더 나은 건상상태를 가진 췌장 베타 세포 (예컨대, 고지방식이 공급될 때 프로인슐린-대-인슐린의 비율의 감소에 의해 증명되는 바와 같음). 추가적으로 또는 대안적으로, 돌연변이된 Slc30a8 유전자좌를 포함하는 비인간 동물은 샘에서 유의미한 Slc30a8 mRNA 발현을 가질 수 있다 (예컨대, 야생형 수준의 적어도 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 또는 100%, 예컨대 야생형 수준의 적어도 25% 또는 30%).
돌연변이가 없는 비인간 동물 (예컨대, 야생형 비인간 동물)과 비교하여, 돌연변이된 Slc30a8 유전자좌를 가진 비인간 동물은 대조군 차우 식단이 공급될 때 정상적인 대사 표현형을 가질 수 있다. 돌연변이가 없는 비인간 동물 (예컨대, 야생형 비인간 동물)과 비교하여, 돌연변이된 Slc30a8 유전자좌를 가진 비인간 동물은 대조군 차우 식단이 공급될 때 정상적인 글루코스 항상성 및/또는 정상적인 글루코스-유도 인슐린 분비를 가질 수 있다. 돌연변이가 없는 비인간 동물 (예컨대, 야생형 비인간 동물)과 비교하여, 돌연변이된 Slc30a8 유전자좌를 가진 비인간 동물은 또한 대조군 차우 식단이 공급될 때 다음의 특징 중 하나 이상 또는 전부를 가질 수 있다: 체중이 유의미하게 달라지지 않고, 순환 혈당 수준이 유의미하게 달라지지 않으며, 순환 인슐린 수준이 유의미하게 달라지지 않고, 순환 프로인슐린 수준이 유의미하게 달라지지 않으며, 순환 C-펩타이드 수준이 유의미하게 달라지지 않고, 프로인슐린/C-펩타이드의 비율이 유의미하게 달라지지 않으며, 글루코스 내성이 유의미하게 달라지지 않고, 인슐린 민감성이 유의미하게 달라지지 않으며, 글루코스-유도 인슐린 분비가 유의미하게 달라지지 않고, 베타 세포 질량이 유의미하게 달라지지 않으며, 그리고 알파-세포 질량이 유의미하게 달라지지 않는다. 돌연변이가 없는 비인간 동물 (예컨대, 야생형 비인간 동물)과 비교하여, 돌연변이된 Slc30a8 유전자좌를 가진 비인간 동물은 대조군 차우 식단이 공급될 때 인슐린/C-펩타이드 비율이 감소할 수 있다. 이것은 더 높은 인슐린 제거율을 나타낼 수 있다.
돌연변이가 없는 비인간 동물 (예컨대, 야생형 비인간 동물)과 비교하여, 돌연변이된 Slc30a8 유전자좌를 가진 비인간 동물은 증가된 인슐린 분비 능력을 가진다. 한 실례로서, 비인간 동물은 고지방식이 공급될 때 증강된 인슐린 분비 능력을 가질 수 있다. 이러한 비인간 동물은 고지방식이 공급될 때 돌연변이가 없는 비인간 동물에 비교하여 증가된 인슐린 분비를 가질 수 있고, 여기서 증가된 인슐린 분비는 돌연변이가 없는 비인간 동물에 비교하여 증가된 베타 세포 증식 또는 베타 세포 질량과 관련된다. 증가된 베타 세포 증식은 인슐린 수용체-의존성 (예컨대, 베타 세포에서 인슐린 수용체에 의존성)일 수 있다. 다른 실례로서, 비인간 동물은 고혈당증, 예컨대 중증의 고혈당증에 대한 반응으로 증강된 인슐린 분비 능력을 가질 수 있다. 이러한 비인간 동물은 돌연변이가 없는 비인간 동물에 비교하여 증가된 인슐린 분비를 가질 수 있다. 예를 들어, 이러한 비인간 동물은 인슐린 수용체 억제에 의해 유도된 고혈당증에 대한 반응으로, 돌연변이가 없는 비인간 동물에 비교하여 증가된 인슐린 분비를 가질 수 있고, 여기서 증가된 인슐린 분비는 돌연변이가 없는 비인간 동물에 비교하여 증가된 베타 세포 증식 또는 베타 세포 질량과 관련이 없다. 돌연변이가 없는 비인간 동물과 비교하여 증가된 인슐린 분비는 적어도 약 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 또는 50%일 수 있다. 예를 들어, 비인간 동물은 인슐린 수용체 억제에 의해 유도된 고혈당증, 예컨대 인슐린 수용체 길항물질 S961에 의해 유발된 고혈당증에 대한 반응으로 증가된 인슐린 분비를 가질 수 있다. 일부 비인간 동물에서, 이 효과는 증강된 베타 세포 증식 또는 증가된 베타 세포 질량과 관련되지 않는다. 일부 비인간 동물에서, 혈장 인슐린의 증가는 다음 중 하나 이상 또는 전부의 결과가 아니다: 개선된 프로인슐린 프로세싱, 감소된 인슐린 제거율, 증가된 베타 세포 증식, 증가된 샘 질량, 증가된 베타 세포 질량, 증가된 알파-세포 질량, 또는 베타 세포에서의 인슐린 고갈.
돌연변이가 없는 비인간 동물 (예컨대, 야생형 비인간 동물)과 비교하여, 돌연변이된 Slc30a8 유전자좌를 가진 비인간 동물은 감소된 미토콘드리아 유전자 발현 (예컨대, 미토콘드리아 산화성 인산화 (OXPHOS) 시스템에서 유전자의 발현의 감소)을 가질 수 있다. 이러한 유전자의 실례는 실시예 2 및 표 7 내지 9에서 보다 상세하게 기술된다. 돌연변이가 없는 비인간 동물 (예컨대, 야생형 비인간 동물)과 비교하여, 돌연변이된 Slc30a8 유전자좌를 가진 비인간 동물은 증가된 Hvcn1 (수소 전압-개폐 채널 1, 또는 전압-개폐 수소 채널 1) 발현을 가질 수 있다.
돌연변이가 없는 비인간 동물 (예컨대, 야생형 비인간 동물)과 비교하여, 돌연변이된 Slc30a8 유전자좌를 가진 비인간 동물은 샘 아연 축적의 손실을 가질 수 있다.
돌연변이가 없는 비인간 동물 (예컨대, 야생형 비인간 동물)과 비교하여, 돌연변이된 Slc30a8 유전자좌를 가진 비인간 동물은 또한 대조군 차우 식단이 공급될 때 다음 특징 중 하나 이상 또는 전부를 가질 수 있다: 체중, 혈당, 인슐린, 또는 C-펩타이드 수준 (급식 또는 금식)이 달라지지 않고; 급식 프로인슐린 수준에 변화가 없으며; 감소된 금식 프로인슐린 수준을 가질 것이고; 프로인슐린 대 인슐린 (급식 또는 금식)의 비율에 변화가 없으며; C-펩타이드 대 인슐린의 증가된 급식 비율을 가지고; C-펩타이드 대 인슐린의 금식 비율에 변화가 없고; 그리고 글루코스 내성 또는 글루코스-유도 인슐린 분비에 변화가 없다.
돌연변이가 없는 비인간 동물 (예컨대, 야생형 비인간 동물)과 비교하여, 돌연변이된 Slc30a8 유전자좌를 가진 비인간 동물은 또한 고지방식이 공급될 때 다음 특징 중 하나 이상 또는 전부를 가질 수 있다: 급식 또는 금식 혈당에 변화가 없고; 증가된 급식 순환 인슐린 수준을 가지며; 금식시 순환 인슐린 수준에 변화가 없고; 급식 프로인슐린 수준에 변화가 없으며; 감소된 금식 프로인슐린 수준을 가지고; 증가된 급식 순환 C-펩타이드 수준을 가지며; 금식 순환 C-펩타이드 수준에 변화가 없고; 프로인슐린 대 인슐린 (급식 및 금식)의 감소된 비율을 가지며; C-펩타이드 대 인슐린의 비율에 변화가 없고; 췌장에서 증가된 인슐린-양성 영역을 가지며; 췌장 영역당 증가된 샘 수를 가지고; 증가된 베타 세포 증식을 가지며; 그리고 증가된 수의 인슐린-생성 베타 세포를 가진다. 이에 더불어, 돌연변이가 없는 비인간 동물과 비교하여, 돌연변이된 Slc30a8 유전자좌를 가진 비인간 동물은 인슐린 수용체의 차단 후 (예컨대, S961을 사용하여) 증가된 급식 혈장 인슐린 수준을 가진다.
본원에 개시된 돌연변이된 Slc30a8 유전자좌는 절단된 SLC30A8 단백질 (즉, 단백질-절단 변이체)을 암호화하는 Slc30a8 유전자좌일 수 있다. 절단을 유발하는 돌연변이는, 예를 들어, 프레임시프트 돌연변이, 넌센스 돌연변이, 스플라이스 부위 돌연변이, 또는 개시자 코돈 SNV일 수 있다. 예컨대, Flannick et al. (2014) Nat. Genet. 46(4):357-363 (모든 목적에 대해 그 전문이 본원에 참조로 포함됨)을 참조한다. 넌센스 돌연변이는 유전자 코드에 의해 특정된 20개의 아미노산 중 하나에 상응하는 센스 코돈이 사슬 종결 코돈 (즉, 종결 코돈 또는 중단 코돈)으로 바뀌는 돌연변이이다. 프레임시프트 돌연변이는 코돈의 정상적인 서열이 하나 이상의 뉴클레오타이드의 삽입 또는 삭제에 의해 파괴될 때 발생하며, 단 이때 첨가되거나 제거되는 뉴클레오타이드의 수는 3의 배수가 아니다. 프레임시프트 돌연변이는 참조 서열과 비교하여, 번역이 다른 프레임으로 시프트되는, 번역 개시 코돈 (출발 코돈)과 종결 코돈 (중단 코돈) 사이의 서열 변화이이다. 예를 들어, 리딩 프레임은 5' 방향으로 한 개의 뉴클레오타이드가 시프트되거나 (-1 프레임시프트) 또는 3' 방향으로 한 개의 뉴클레오타이드가 시프트될 수 있다 (+1 프레임시프트). 프레임시프트 돌연변이가 있는 유전자에 의해 암호화된 단백질은 N-말단으로부터 프레임시프트 돌연변이까지의 야생형 유전자에 의해 암호화된 단백질과 동일하겠지만, 그 지점을 넘어가면 상이하다. 이러한 프레임시프트는 조기 종결 코돈을 초래할 수 있다. 스플라이스 부위 돌연변이는, 예를 들어, 엑손의 스키핑 및 잠재적으로 조기 종결 코돈을 초래하는 후속 프레임시프트를 초래할 수 있다. 한 실례에서, 본원에 개시된 돌연변이된 Slc30a8 유전자좌는 Slc30a8 유전자가 조기 종결 코돈 (즉, 중단 코돈)을 가지는 Slc30a8 유전자좌일 수 있다. 특정 실례에서, 돌연변이는 넌센스 돌연변이를 포함하거나, 본질적으로 그것으로 이루어지거나, 또는 그것으로 이루어진다.
돌연변이는 Slc30a8 유전자좌 내의 어디에든지 있을 수 있다. 예를 들어, 돌연변이는 Slc30a8 유전자의 제1 엑손, 제2 엑손, 제3 엑손, 제4 엑손, 제5 엑손, 제6 엑손, 제7 엑손, 또는 제8 엑손에 있을 수 있다. 유사하게, 돌연변이는 인간 SLC30A8 유전자와 최적으로 정렬될 때 인간 SLC30A8 유전자의 제1, 제2, 제3, 제4, 제5, 제6, 제7, 또는 제8 엑손에 상응하는 Slc30a8 유전자의 영역에 있을 수 있다. 특정 실례에서, 돌연변이는 Slc30a8 유전자의 제3 엑손에 또는 인간 SLC30A8 유전자와 최적으로 정렬될 때 인간 SLC30A8 유전자의 제3 엑손에 상응하는 Slc30a8 유전자의 영역에 있을 수 있다. 보다 구체적인 실례에서, 돌연변이는 Slc30a8 유전자의 제3 엑손에 또는 인간 SLC30A8 유전자와 최적으로 정렬될 때 인간 SLC30A8 유전자의 제3 엑손에 상응하는 Slc30a8 유전자의 영역에 있다.
한 실례에서, 돌연변이는 돌연변이된 Slc30a8 유전자의 코딩 서열이 SEQ ID NO: 21과 최적으로 정렬될 때 SEQ ID NO: 21에 제시된 인간 SLC30A8 코딩 서열의 잔기 412에 상응하는 잔기에 있다 (즉, 잔기 c.412, 전사물 등록 번호 NM_173851). 대안적으로, 돌연변이는 돌연변이된 Slc30a8 유전자의 코딩 서열이 SEQ ID NO: 21과 최적으로 정렬될 때 SEQ ID NO: 21에 제시된 인간 SLC30A8 코딩 서열의 잔기 412 (즉, 잔기 c.412, 전사물 등록 번호 NM_173851)에서 1, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 40, 50, 100, 200, 300, 400, 또는 500개 뉴클레오타이드 내에 있는 잔기에 있다.
다른 실례에서, 돌연변이는 돌연변이된 Slc30a8 유전자의 코딩 서열이 SEQ ID NO: 20과 최적으로 정렬될 때 SEQ ID NO: 20에 제시된 마우스 Slc30a8 코딩 서열 (CDS)의 잔기 409에 상응하는 잔기에 있다 (즉, 잔기 c.409, 전사물 등록 번호 NM_173851.2). 대안적으로, 돌연변이는 돌연변이된 Slc30a8 유전자의 코딩 서열이 SEQ ID NO: 20과 최적으로 정렬될 때 SEQ ID NO: 20에 제시된 마우스 Slc30a8 코딩 서열의 잔기 409 (즉, 잔기 c.409, 전사물 등록 번호 NM_173851.2)에서 1, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 40, 50, 100, 200, 300, 400, 또는 500개 뉴클레오타이드 내에 있는 잔기에 있다.
또 다른 실례에서, 돌연변이는 SEQ ID NO: 14와 최적으로 정렬될 때 SEQ ID NO: 14에 제시된 인간 SLC30A8 단백질의 잔기 138 (즉, UniProt 등록 번호 Q8IWU4.2의 아미노산 138)에 상응하는 코돈에서 중단 코돈을 초래한다. 대안적으로, 중단 코돈은 SEQ ID NO: 14와 최적으로 정렬될 때 SEQ ID NO: 14에 제시된 인간 SLC30A8 단백질의 잔기 138 (즉, UniProt 등록 번호 Q8IWU4.2의 아미노산 138)에서 1, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 또는 250개 아미노산 내에 있는 코돈에 상응한다.
또 다른 실례에서, 돌연변이는 SEQ ID NO: 12와 최적으로 정렬될 때 SEQ ID NO: 12에 제시된 마우스 SLC30A8 단백질의 잔기 137 (즉, UniProt 등록 번호 Q8BGG0.1의 아미노산 137)에 상응하는 코돈에서 중단 코돈을 초래한다. 대안적으로, 중단 코돈은 SEQ ID NO: 12와 최적으로 정렬될 때 SEQ ID NO: 12에 제시된 인간 SLC30A8 단백질의 잔기 137 (즉, UniProt 등록 번호 Q8BGG0.1의 아미노산 137)에서 1, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 또는 250개 아미노산 내에 있는 코돈에 상응한다.
돌연변이된 Slc30a8 유전자좌는 비인간 동물에 대해 내인성일 수 있다. 특정 실례에서, 돌연변이된 Slc30a8 유전자좌는 SEQ ID NO: 18에 대해 적어도 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 서열을 포함하거나, 본질적으로 그것으로 이루어지거나, 또는 그것으로 이루어지는 mRNA (cDNA)를 암호화한다. 돌연변이된 SLC30A8 유전자좌의 코딩 서열은 SEQ ID NO: 22 또는 동일한 아미노산 서열을 암호화하는 그것의 축퇴물에 대해 적어도 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 서열을 포함하거나, 본질적으로 그것으로 이루어지거나, 또는 그것으로 이루어질 수 있다. 그 결과로 얻어지는, 돌연변이된 SLC30A8 유전자좌에 의해 암호화된 SLC30A8 단백질은 SEQ ID NO: 13에 대해 적어도 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 서열을 포함하거나, 본질적으로 그것으로 이루어지거나, 또는 그것으로 이루어질 수 있다.
선택적으로, 돌연변이된 SLC30A8 유전자좌는 다른 외인성 또는 이종성 요소를 포함할 수 있다. 그러한 요소의 실례로는 선택 카세트, 리포터 유전자, 재조합효소 인식 부위, 또는 다른 요소를 들 수 있다. 한 실례로서, 돌연변이된 SLC30A8 유전자좌는 재조합효소 인식 서열 (예컨대, loxP 부위)이 측면에 있는 제거 가능한 선택 카세트 (예컨대, 자기 삭제 선택 카세트)를 포함할 수 있다. 대안적으로, 돌연변이된 SLC30A8 유전자좌는 다른 요소가 없을 수 있다 (예컨대, 선택 카세트가 없거나 및/또는 리포터 유전자가 없을 수 있다). 적합한 리포터 유전자 및 리포터 단백질의 실례는 본원의 다른 곳에서 개시된다. 적합한 선택 마커의 실례로는 네오마이신 포스포트랜스퍼라제 (neor), 하이드로마이신 B 포스포트랜스퍼라제 (hygr), 퓨로마이신-N-아세틸트랜스퍼라제 (puror), 블라스티시딘 S 탈아민효소 (bsrr), 크산틴/구아닌 포스포리보실 트랜스퍼라제 (gpt), 및 단순 포진 바이러스 티미딘 키나아제 (HSV-k)를 들 수 있다. 재조합효소의 실례로는 Cre, Flp, 및 Dre 재조합효소를 들 수 있다. Cre 재조합효소 유전자의 한 실례는 Crei이며, 여기에서 Cre 재조합효소를 암호화하는 2개의 엑손이 원핵 세포에서의 그것의 발현을 방지하기 위해 인트론에 의해 분리된다. 이러한 재조합효소는 핵에의 국지화를 용이하게 하기 위한 핵 국지화 신호 (예컨대, NLS-Crei)를 추가로 포함할 수 있다. 재조합효소 인식 부위는 부위-특이적 재조합효소에 의해 인식되고 재조합 사건에 대한 기질로서 작용할 수 있는 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 재조합효소 인식 부위의 실례로는 FRT, FRT11, FRT71, attp, att, rox, 및 loxP, lox511, lox2272, lox66, lox71, loxM2, 및 lox5171과 같은 lox 부위를 들 수 있다.
리포터 유전자 또는 선택 카세트와 같은 다른 요소는 재조합효소 인식 부위가 측면에 있는 자기 삭제 카세트일 수 있다. 예컨대, US 8,697,851 및 US 2013/0312129 (이들은 각각 모든 목적에 대해 그 전문이 본원에 참조로 포함됨)를 참조한다. 실례로서, 자기 삭제 카세트는 마우스 Prm1 프로모터에 작동 가능하게 연결된 Crei 유전자 (인트론에 의해 분리된, Cre 재조합효소를 암호화하는 2개의 엑손을 포함함) 및 인간 유비퀴틴 프로모터에 작동 가능하게 연결된 네오마이신 내성 유전자를 포함한다. Prm1 프로모터를 사용함으로써, 자기 삭제 카세트는 FO 동물의 수컷 생식 세포에서 특이적으로 삭제될 수 있다. 선택 마커를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드는 표적화되는 세포에서 활성인 프로모터에 작동 가능하게 연결될 수 있다. 프로모터의 실례는 본원의 다른 곳에서 기술된다. 또 다른 특정 실례로서, 자기 삭제 선택 카세트는 하나 이상의 프로모터 (예컨대, 인간 유비퀴틴 및 EM7 프로모터 둘 다)에 작동 가능하게 연결된 하이드로마이신 내성 유전자 코딩 서열, 이어서 폴리아데닐화 신호, 이어서 하나 이상의 프로모터 (예컨대, mPrm1 프로모터)에 작동 가능하게 연결된 Crei 코딩 서열, 이어서 또 다른 폴리아데닐화 신호를 포함할 수 있고, 여기서 전체 카세트는 loxP 부위가 측면에 있다.
돌연변이된 SLC30A8 유전자좌는 또한 조건부 대립유전자일 수 있다. 예를 들어, 조건부 대립유전자는, US 2011/0104799 (모든 목적에 대해 그 전문이 본원에 참조로 포함됨)에 기술된 것과 같은 다중기능성 대립유전자이다. 예를 들어, 조건부 대립유전자는: (a) 표적 유전자의 전사와 관련하여 센스 방향의 작동 서열; (b) 센스 또는 안티센스 방향의 약물 선택 카세트 (DSC); (c) 안티센스 방향의 관심의 뉴클레오타이드 서열 (NSI); 및 (d) 역 방향의 반전 모듈에 의한 조건부 (COIN, 엑손-스플릿팅 인트론 및 반전 가능한 유전자-트랩-유사 모듈을 활용함)를 포함할 수 있다. 예컨대, US 2011/0104799를 참조한다. 조건부 대립유전자는 제1 재조합효소에 노출될 때 재조합하여 (i) 작동 서열 및 DSC가 없고; 그리고 (ii) 센스 방향으로 NSI 및 안티센스 방향으로 COIN을 함유하는 조건부 대립유전자를 형성하는 재조합 가능한 유닛을 추가로 포함할 수 있다. 예컨대, US 2011/0104799를 참조한다.
C. 돌연변이된 Slc30a8 유전자좌를 포함하는 비인간 동물 게놈, 비인간 동물 세포, 및 비인간 동물
본원의 다른 곳에서 기술되는 것과 같은 돌연변이된 Slc30a8 유전자좌를 포함하는 비인간 동물 게놈, 비인간 동물 세포, 및 비인간 동물이 제공된다. 게놈, 세포, 또는 비인간 동물은 수컷 또는 암컷일 수 있다. 게놈, 세포, 또는 비인간 동물은 돌연변이된 Slc30a8 유전자좌에 대해 이형접합성 또는 동형접합성일 수 있다. 이배체 유기체는 또한 각 유전자 유전자좌에서 2개의 대립유전자를 가진다. 대립유전자의 각 쌍은 특정 유전자 유전자좌의 유전자형을 나타낸다. 유전자형은 만약 특정 유전자좌에 2개의 동일한 대립유전자가 있다면 동형접합성으로 기술되고 두 대립유전자가 상이하다면 이형접합성으로 기술된다.
본원에 제공된 비인간 동물 게놈 또는 세포는, 예를 들어, Slc30a8 유전자좌 또는 인간 SLC30A8 유전자좌에 대해 상동하는 또는 병렬상동하는 게놈 유전자좌를 포함하는 임의의 비인간 동물 게놈 또는 세포일 수 있다. 게놈은 세포로부터 유래되거나 또는 세포, 예를 들어, 동물 세포, 포유류 세포, 비인간 포유류 세포, 및 인간 세포를 포함하는 진핵세포일 수 있다. 용어 "동물"은 포유류, 어류, 파충류, 양서류, 조류, 및 벌레를 포함한, 동물계의 임의의 구성원을 포함한다. 포유류 세포는, 예를 들어, 비인간 포유류 세포, 설치류 세포, 래트 세포, 마우스 세포, 또는 햄스터 세포를 포함한다. 다른 비인간 포유류로는, 예를 들어, 비인간 영장류, 원숭이, 유인원, 오랑우탄, 고양이, 개, 토끼, 말, 가축 (예컨대, 암소, 숫소 등과 같은 소 종; 양, 염소 등과 같은 양 종; 및 돼지 및 야생돼지와 같은 돼지 종)을 들 수 있다. 가축화된 동물 및 경작용 동물 또한 포함된다. 용어 "비인간"은 인간을 배제한다.
세포는 또한 미분화 또는 분화된 상태의 임의의 유형일 수 있다. 예를 들어, 세포는 전능성(totipotent) 세포, 만능 세포 (예컨대, 인간 만능 세포 또는 마우스 배아 줄기 (ES) 세포 또는 래트 ES 세포와 같은 비인간 만능 세포), 또는 비만능 세포일 수 있다. 전능성 세포는 임의의 세포 유형에 대해 발생할 수 있는 미분화 세포를 포함하며, 만능 세포는 하나 이상의 분화 세포 유형으로 발달하는 능력을 가진 미분화 세포를 포함한다. 이러한 만능 및/또는 전능성 세포는, 예를 들어, ES 세포 또는 ES-유사 세포, 예컨대 유도된 만능 줄기 (iPS) 세포일 수 있다. ES 세포는 배아에 도입될 때 배아로 발달하는 임의의 조직에 기여할 수 있는 배아-유래 전능성 또는 만능 세포를 포함한다. ES 세포는 배반포의 내세포 집단으로부터 유래될 수 있고 3개의 척추동물 배엽층 (내배엽, 외배엽 및 중배엽) 중 임의의 것의 세포로 분화될 수 있다.
본원에서 제공된 세포는 또한 생식 세포 (예컨대, 정자 또는 난모세포)일 수 있다. 세포는 유사분열적으로 유능한 세포 또는 유사분열적으로 비활성인 세포, 감수분열적으로 유능한 세포 또는 감수분열적으로 비활성인 세포일 수 있다. 유사하게, 세포는 또한 일차 체세포성 세포 또는 일차 체세포성 세포가 아닌 세포일 수 있다. 체세포성 세포는 배우자(gamete), 생식 세포, 생식세포, 또는 미분화 줄기 세포가 아닌 임의의 세포를 포함한다. 예를 들어, 세포는 베타 세포, 췌장샘 세포, 또는 췌장 세포일 수 있다.
본원에 제공된 적합한 세포는 또한 일차 세포를 포함한다. 일차 세포는 유기체, 장기, 또는 조직으로부터 직접 분리된 세포 또는 세포 배양물을 포함한다. 일차 세포는 형질전환되지도 않고 불멸의 것도 아닌 세포를 포함한다. 그것은 이전에 조직 배양으로 계대되지 않았거나 이전에 조직 배양으로 계대되었지만 조직 배양으로 무한하게 계대될 수 없는 유기체, 장기, 또는 조직으로부터의 임의의 세포를 포함한다. 이러한 세포는 종래 기법에 의해 분리될 수 있고, 예를 들어, 베타 세포를 들 수 있다.
본원에 제공된 다른 적합한 세포는 불멸화된 세포를 들 수 있다. 불멸화된 세포는 정상적으로는 무한하게 증식할 수 없겠지만, 돌연변이 또는 변경으로 인해, 정상적인 세포 노화를 피하고 대신 분할을 유지할 수 있는 다세포 유기체로부터의 세포를 포함한다. 이러한 돌연변이 또는 변경은 자연적으로 일어나거나 또는 의도적으로 유도될 수 있다. 불멸화된 세포주의 특정 실례는 EndoC-βH2, 1.1B4, 1.4E7, 1.1E7, RIN, HIT, MIN, INS-1, 및 βTC 세포주이다. 예컨대, Scharfmann et al. (2014) J. Clin. Invest. 124(5):2087-2098 및 McCluskey et al. (2011) J. Biol. Chem. 286(25):21982-21992 (이들은 각각 모든 목적에 대해 그 전문이 본원에 참조로 포함됨)를 참조한다. 수많은 유형의 불멸화된 세포가 잘 알려져 있다. 불멸화된 또는 일차 세포는 재조합 유전자 또는 단백질의 배양 또는 발현에 전형적으로 사용되는 세포를 포함한다.
본원에 제공된 세포는 또한 1세포기 배아 (즉, 수정된 난모세포 또는 접합체)를 포함한다. 이러한 1세포기 배아는 임의의 유전자 배경으로부터 유래될 수 있고 (예컨대, 마우스의 경우 BALB/c, C57BL/6, 129, 또는 이것들의 조합), 새로운 것이거나 냉동될 수 있으며, 자연적인 사육 또는 시험관내 수정으로부터 유래될 수 있다.
본원에 제공된 세포는 정상적이거나, 건강한 세포이거나, 또는 병에 걸린 또는 돌연변이-포함 세포일 수 있다.
본원에서 기술되는 것과 같이 돌연변이된 Slc30a8 유전자좌를 포함하는 비인간 동물은 본원의 다른 곳에서 기술되는 방법에 의해 만들어질 수 있다. 용어 "동물"은 예를 들어, 포유류, 어류, 파충류, 양서류, 조류, 벌레를 포함한, 동물계의 임의의 구성원을 포함한다. 특정 실례에서, 비인간 동물은 비인간 포유류이다. 비인간 포유류는, 예를 들어, 비인간 영장류, 원숭이, 유인원, 오랑우탄, 고양이, 개, 말, 토끼, 설치류 (예컨대, 마우스, 래트, 햄스터, 및 기니아 피그), 및 가축 (예컨대, 암소, 숫소 등과 같은 소 종; 양, 염소 등과 같은 양 종; 및 돼지 및 야생돼지와 같은 돼지 종)을 들 수 있다. 가축화된 동물 및 경작용 동물 또한 포함된다. 용어 "비인간 동물"은 인간을 배제한다. 바람직한 비인간 동물은, 예를 들어, 설치류, 예컨대 마우스 및 래트를 들 수 있다.
비인간 동물은 임의의 유전자 배경으로부터 유래될 수 있다. 예를 들어, 적합한 마우스는 129 스트레인, C57BL/6 스트레인, 129와 C57BL/6의 혼합, BALB/c 스트레인, 또는 Swiss Webster 스트레인으로부터 유래될 수 있다. 129 스트레인의 실례로는 129P1, 129P2, 129P3, 129X1, 129S1 (예컨대, 129S1/SV, 129S1/Svlm), 129S2, 129S4, 129S5, 129S9/SvEvH, 129S6 (129/SvEvTac), 129S7, 129S8, 129T1, 및 129T2를 들 수 있다. 예컨대, Festing et al. (1999) Mammalian Genome 10:836 (모든 목적에 대해 그 전문이 본원에 참조로 포함됨)을 참조한다. C57BL 스트레인의 실례로는 C57BL/A, C57BL/An, C57BL/GrFa, C57BL/Kal_wN, C57BL/6, C57BL/6J, C57BL/6ByJ, C57BL/6NJ, C57BL/10, C57BL/10ScSn, C57BL/10Cr, 및 C57BL/Ola를 들 수 있다. 적합한 마우스는 또한 상기 언급한 129 스트레인과 상기 언급한 C57BL/6 스트레인의 혼합 (예컨대, 50% 129 및 50% C57BL/6)으로부터 유래될 수 있다. 마찬가지로, 적합한 마우스는 상기 언급한 129 스트레인의 혼합 또는 상기 언급한 BL/6 스트레인의 혼합 (예컨대, 129S6 (129/SvEvTac) 스트레인)으로부터 유래될 수 있다.
유사하게, 래트는, 예를 들어, ACI 래트 스트레인, 다크 아구티 (Dark Agouti, DA) 래트 스트레인, Wistar 래트 스트레인, LEA 래트 스트레인, 스프라그 다울리 (Sprague Dawley, SD) 래트 스트레인, 또는 Fisher F344 또는 Fisher F6과 같은 Fischer 래트 스트레인을 포함한 임의의 래트 스트레인으로부터 유래될 수 있다. 래트는 또한 상기 열거한 둘 이상의 스트레인의 혼합으로부터 유도된 스트레인으로부터 얻어질 수 있다. 예를 들어, 적합한 래트는 DA 스트레인 또는 ACI 스트레인으로부터 유래될 수 있다. ACI 래트 스트레인은 블랙 아구티를 가지는 것으로 특성화되며, 흰색 배 및 발과 RT1 av1 할로타입을 가진다. 이러한 스트레인은 Harlan Laboratories를 포함한 다양한 공급처로부터 이용 가능하다. 다크 아구티 (DA) 래트 스트레인은 아구티 외피 및 RT1 av1 할로타입을 가지는 것으로 특성화된다. 이러한 래트는 Charles River 및 Harlan Laboratories를 포함한 다양한 공급처로부터 이용 가능하다. 일부 적합한 래트는 사육된 래트 스트레인으로부터 유래될 수 있다. 예컨대, US 2014/0235933 (모든 목적에 대해 그 전문이 본원에 참조로 포함됨)을 참조한다.
III. 돌연변이된 Slc30a8 유전자좌를 포함하는 비인간 동물의 제조 방법
본원의 다른 곳에서 개시된 것과 같이 돌연변이된 Slc30a8 유전자좌를 포함하는 비인간 동물 게놈, 비인간 동물 세포, 또는 비인간 동물을 제조하는 다양한 방법이 제공된다. 유전자 변형된 유기체를 제조하기 위한 임의의 편리한 방법 또는 프로토콜은 이러한 유전자 변형된 비인간 동물을 제조하는 데 적합하다. 예컨대, Cho et al. (2009) Current Protocols in Cell Biology 42:19.11:19.11.1-19.11.22 및 Gama Sosa et al. (2010) Brain Struct. Funct. 214(2-3):91-109 (이들은 각각 모든 목적에 대해 그 전문이 본원에 참조로 포함됨)를 참조한다. 이러한 유전자 변형된 비인간 동물은, 예를 들어, 표적화된 Slc30a8 유전자좌에서 유전자 녹-인을 통해 생성될 수 있다.
예를 들어, 돌연변이된 Slc30a8 유전자좌를 포함하는 비인간 동물의 제조 방법은: (1) 만능 세포의 게놈을 돌연변이된 Slc30a8 유전자좌를 포함하도록 변형시키는 단계; (2) 돌연변이된 Slc30a8 유전자좌를 포함하는 유전자 변형된 만능 세포를 확인 또는 선택하는 단계; (3) 유전자 변형된 만능 세포를 비인간 동물 숙주 배아에 도입하는 단계; 및 (4) 숙주 배아를 대리 모체에 이식하고 잉태시키는 단계를 포함할 수 있다. 예를 들어, 돌연변이된 Slc30a8 유전자좌를 포함하는 비인간 동물의 제조 방법은: (1) 만능 세포의 게놈을 돌연변이된 Slc30a8 유전자좌를 포함하도록 변형시키는 단계; (2) 돌연변이된 Slc30a8 유전자좌를 포함하는 유전자 변형된 만능 세포를 확인 또는 선택하는 단계; (3) 유전자 변형된 만능 세포를 비인간 동물 숙주 배아에 도입하는 단계; 및 (4) 숙주 배아를 대리 모체에 잉태시키는 단계를 포함할 수 있다. 선택적으로, 변형된 만능 세포 (예컨대, 비인간 ES 세포)를 포함하는 숙주 배아는 F0 비인간 동물을 생성하기 위해 대리 모체에 이식되고 잉태되기 전 배반포 단계까지 인큐베이션될 수 있다. 그런 후 대리 모체는 돌연변이된 Slc30a8 유전자좌를 포함하는 F0 세대 비인간 동물을 생산할 수 있다.
방법은 변형된 표적 게놈 유전자좌 (즉, 돌연변이된 Slc30a8 유전자좌)를 가지는 세포 또는 동물을 확인하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 표적화된 유전자 변형을 가지는 세포 및 동물을 확인하기 위해 다양한 방법이 사용될 수 있다.
게놈을 변형시키는 단계는, 예를 들어, Slc30a8 유전자좌가 본원에 개시된 Slc30a8 돌연변이를 포함하도록 변형시키기 위해 외인성 수복 주형 (예컨대, 표적화 벡터)을 이용할 수 있다. 한 실례로서, 표적화 벡터는 내인성 Slc30a8 유전자좌 (예컨대, 내인성 비인간 동물 Slc30a8 유전자좌)에서 돌연변이된 Slc30a8 유전자를 생성하기 위한 것일 수 있으며, 여기서 표적화 벡터는 내인성 Slc30a8 유전자좌에서 5' 표적 서열을 표적화하는 5' 상동성 팔 및 내인성 Slc30a8 유전자좌에서 3' 표적 서열을 표적화하는 3' 상동성 팔을 포함하고, 표적화 벡터는 Slc30a8 유전자의 돌연변이를 포함하며, 돌연변이된 Slc30a8 유전자는 절단된 SLC30A8 단백질을 암호화한다. 특정 실례로서, 돌연변이는 인간 SLC30A8 단백질에서 잔기 138에 상응하는 코돈에서 중단 코돈을 초래할 수 있다.
외인성 수복 주형은 비-상동성-단부-연결-매개된 삽입 또는 상동 재조합일 수 있다. 외인성 수복 주형은 데옥시리보핵산 (DNA) 또는 리보핵산 (RNA)을 포함할 수 있고, 그것들은 단일 가닥 또는 이중 가다일 수 있으며, 선형 또는 원형 형태일 수 있다. 예를 들어, 수복 주형은 단일 가닥 올리고데옥시뉴클레오타이드 (ssODN)일 수 있다.
외인성 수복 주형은 또한 Slc30a8 유전자좌에 통합될 DNA의 분절을 포함하는 핵산 삽입물을 포함할 수 있다. 핵산 삽입물의 Slc30a8 유전자좌에의 통합은 관심의 핵산 서열의 Slc30a8 유전자좌에의 첨가, 관심의 핵산 서열의 Slc30a8 유전자좌에서의 삭제, 또는 관심의 핵산 서열의 Slc30a8 유전자좌에서의 대체 (즉, 삭제 및 삽입)를 초래할 수 있다.
외인성 수복 주형은 또한 비표적화된 내인성 Slc30a8 유전자좌에서 존재하지 않는 이종성 서열을 포함할 수 있다. 예를 들어, 외인성 수복 주형은 선택 카세트, 예컨대 재조합 인식 부위가 측면에 있는 선택 카세트를 포함할 수 있다.
일부 외인성 수복 주형은 상동성 팔을 포함한다. 만약 외인성 수복 주형 산이 또한 핵산 삽입물을 포함한다면, 상동성 팔은 그 핵산 삽입물의 측면에 있을 수 있다. 쉬운 참조를 위해, 상동성 팔은 본원에서 5' 및 3' (즉, 상류 및 하류) 상동성 팔로 언급된다. 이런 명명법은 외인성 수복 주형 내에서의 핵산 삽입물에 대한 상동성 팔의 상대적인 위치와 관련된다. 5' 및 3' 상동성 팔은 각각 "5' 표적 서열" 및 "3' 표적 서열"로서 본원에서 언급되는, Slc30a8 유전자좌 내의 영역들에 상응한다.
상동성 팔 및 표적 서열은 두 영역이 상동 재조합 반응에 대한 기질로서 작용하기 위해 서로에 대해 충분한 수준의 서열 동일성을 공유할 때 서로에 대해 "상응한다" 또는 "상응하는"이다. 용어 "상동성"은 상응하는 서열에 대해 동일하거나 서열 동일성을 공유하는 DNA 서열을 포함한다. 주어진 표적 서열과, 외인성 수복 주형에서 발견되는 상응하는 상동성 팔 사이의 서열 동일성은 상동 재조합이 일어나는 것을 허용하는 임의의 정도의 서열 동일성일 수 있다. 예를 들어, 외인성 수복 주형 (또는 그것의 단편)의 상동성 팔과 표적 서열 (또는 그것의 단편)에 의해 공유된 서열 동일성의 양은 적어도 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성이어서, 서열들이 상동 재조합을 진행할 수 있게 된다. 더욱이, 상동성 팔과 상응하는 표적 서열 사이의 상동성의 상응하는 영역은 상동 재조합을 촉진하기에 충분한 임의의 길이를 가질 수 있다. 일부 표적화 벡터에서, Slc30a8 유전자좌의 의도된 돌연변이는 상동성 팔 중 하나에 포함된다. 다른 표적화 벡터에서, Slc30a8 유전자좌의 의도된 돌연변이는 상동성 팔이 측면에 있는 삽입 핵산에 포함된다.
단세포 단계 배아 이외의 세포에서, 외인성 수복 주형은 세포에서 상동 재조합을 수행하기 위해 의도된 다른 접근법에 의해 전형적으로 사용되는 것보다 더 큰 핵산 서열에 상응하고 그것으로부터 유래된 상동성 팔을 포함하는 표적화 벡터를 포함하는 "큰 표적화 벡터" 또는 "LTVEC"일 수 있다. LTVEC는 또한 세포에서 상동 재조합을 수행하기 위해 의도된 다른 접근법에 의해 전형적으로 사용되는 것보다 큰 핵산 서열을 가지는 핵산 삽입물을 포함하는 표적화 벡터를 포함한다. 예를 들어, LTVEC은 크기 제한으로 인해 전통적인 플라스미드-기반 표적화 벡터에 의해 수용될 수 없는 큰 유전자좌의 변형을 가능하게 만든다. 예를 들어, 표적화된 유전자좌는 종래 방법을 사용하여 표적화될 수 없는 또는 부정확하게만 또는 뉴클레아제 작용제 (예컨대, Cas 단백질)에 의해 유도된 닉 또는 이중 가닥 파괴의 부재하에 단지 유의하게 낮은 효율로만 표적화될 수 있는 세포의 유전자좌일 수 있다 (즉, 5' 및 3' 상동성 팔은 그것에 상응할 수 있다). LTVEC는 임의의 길이를 가질 수 있고 전형적으로는 적어도 10 kb의 길이이다. LTVEC에서 5' 상동성 팔과 3' 상동성 팔의 총 합은 전형적으로 적어도 10 kb이다.
스크리닝 단계는, 예를 들어, 모 염색체의 대립유전자의 변형 (MOA)을 평가하기 위한 정량적 검정을 포함할 수 있다. 예를 들어, 정량적 검정은 정량적 PCR, 예컨대 실시간 PCR (qPCR)을 통해 수행될 수 있다. 실시간 PCR은 표적 유전자좌를 인식하는 제1 프라이머 세트 및 비표적화된 참조 유전자좌를 인식하는 제2 프라이머 세트를 이용할 수 있다. 프라이머 세트는 증폭된 서열을 인식하는 형광 프로브를 포함할 수 있다. 대립유전자 손실 (LOA) 및 대립유전자 획득 (GOA) 검정을 포함하는 대립유전자의 변형 (MOA) 검정은, 예컨대, US 2014/0178879 및 Frendewey et al. (2010) Methods Enzymol. 476:295-307 (이들은 각각 모든 목적에 대해 그 전문이 본원에 참조로 포함됨)에서 기술된다. US 2016/0145646 및 WO 2016/081923 (이들은 각각 모든 목적에 대해 그 전문이 본원에 참조로 포함됨)에 기술된 보유 검정 또한 사용될 수 있다.
적합한 정량적 검정의 다른 실례로는 형광-매개 제자리 혼성화 (FISH), 비교 게놈 혼성화, 등온 DNA 증폭, 고정된 프로브(들)에 대한 정량적 혼성화, INVADER® 프로브, TAQMAN® 분자 비콘(Beacone) 프로브, 또는 ECLIPSETM 프로브 기술을 들 수 있다 (예컨대, US 2005/0144655 (모든 목적에 대해 그 전문이 본원에 참조로 포함됨)참조).
적합한 만능 세포의 실례는 배아 줄기 (ES) 세포 (예컨대, 마우스 ES 세포 또는 래트 ES 세포)이다. 변형된 만능 세포는, 예를 들어, (a) 세포에, 예를 들어 5' 및 3' 표적 부위에 상응하는 5' 및 3' 상동성 팔이 측면에 있는 선택적 삽입 핵산을 포함하는 하나 이상의 외인성 도너 핵산 (예컨대, 표적화 벡터)을 도입하는 단계, 여기서 삽입 핵산 또는 상동성 팔 중 하나는 돌연변이된 Slc30a8 유전자좌 또는 Slc30a8 유전자좌에서 만들어질 돌연변이를 포함하고 있는 것인 단계; 및 (b) 그것의 게놈에 내인성 Slc30a8 유전자좌에서 통합된 삽입 핵산을 포함하고 있는 적어도 하나의 세포를 확인하는 단계에 의한 재조합을 통해 생성될 수 있다. 변형된 만능 세포는, 예를 들어, (a) 세포에, 5' 및 3' 표적 부위에 상응하는 5' 및 3' 상동성 팔이 측면에 있는 삽입 핵산을 포함하는 하나 이상의 표적화 벡터를 도입하는 단계, 여기서 삽입 핵산은 돌연변이된 Slc30a8 유전자좌 또는 Slc30a8 유전자좌에서 만들어질 돌연변이를 포함하고 있는 것인 단계; 및 (b) 그것의 게놈에 내인성 Slc30a8 유전자좌에서 통합된 삽입 핵산을 포함하고 있는 적어도 하나의 세포를 확인하는 단계에 의한 재조합을 통해 생성될 수 있다. 임의의 표적화 벡터가 사용될 수 있다. 한 실례에서, 큰 표적화 벡터 (LTVEC)가 사용된다. LTVEC는, 예를 들어, 적어도 10 kb의 길이이거나 5' 및 3' 상동성 팔을 가질 수 있고, 이것들의 총 합은 적어도 10 kb의 길이이다. 다른 실례로서, 표적화 벡터는 단일 가닥 올리고데옥시뉴클레오타이드 (ssODN)일 수 있다. ssODN은, 예를 들어, 약 80 내지 약 200 뉴클레오타이드 길이를 가질 수 있다.
대안적으로, 변형된 만능 세포는 (a) 세포에 (i) 내인성 Slc30a8 유전자좌 내의 인식 부위에서 닉 또는 이중 가닥 파괴를 유도하는 뉴클레아제 작용제; 및 (ii) 예를 들어, 인식 부위에 충분히 가까운 곳에 위치한 5' 및 3' 표적 부위에 상응하는 5' 및 3' 상동성 팔이 측면에 있는 삽입 핵산을 선택적으로 포함하는 하나 이상의 외인성 도너 핵산 (예컨대, 표적화 벡터)을 도입하는 단계, 여기서 삽입 핵산 또는 상동성 팔 중 하나는 돌연변이된 Slc30a8 유전자좌 또는 Slc30a8 유전자좌에서 만들어질 돌연변이를 포함하고 있는 것인 단계; 및 (c) 내인성 Slc30a8 유전자좌에 변형 (예컨대, 삽입 핵산의 통합)을 포함하고 있는 적어도 한 세포를 확인하는 단계에 의해 생성될 수 있다. 대안적으로, 변형된 만능 세포는 (a) 세포에 (i) 내인성 Slc30a8 유전자좌 내의 인식 부위에서 닉 또는 이중 가닥 파괴를 유도하는 뉴클레아제 작용제; 및 (ii) 예를 들어, 인식 부위에 충분히 가까운 곳에 위치한 5' 및 3' 표적 부위에 상응하는 5' 및 3' 상동성 팔이 측면에 있는 삽입 핵산을 포함하는 하나 이상의 표적화 벡터를 도입하는 단계, 여기서 삽입 핵산은 돌연변이된 Slc30a8 유전자좌 또는 Slc30a8 유전자좌에서 만들어질 돌연변이를 포함하고 있는 것인 단계; 및 (c) 내인성 Slc30a8 유전자좌에 변형 (예컨대, 삽입 핵산의 통합)을 포함하고 있는 적어도 한 세포를 확인하는 단계에 의해 생성될 수 있다. 원하는 인식 부위에 닉 또는 이중 가닥 파괴를 유도하는 임의의 뉴클레아제 작용제가 사용될 수 있다. 적합한 뉴클레아제의 실례로는 전사 활성화제-유사 이펙터 뉴클레아제 (TALEN), 아연 핑거 뉴클레아제 (ZFN), 메가뉴클레아제, 및 주기적으로 간격을 두고 분포하는 짧은 회문구조 반복서열 (CRISPR)/CRISPR-결합 (Cas) 시스템 (예컨대, CRISPR/Cas9 시스템) 또는 이러한 시스템의 구성요소 (예컨대, CRISPR/Cas9)를 들 수 있다. 예컨대, US 2013/0309670 및 US 2015/0159175 (이들은 각각 모든 목적에 대해 그 전문이 본원에 참조로 포함됨)를 참조한다. 표적화된 변형을 제조하는 적합한 방법의 실례는, 예컨대, US 2016/0145646 및 WO 2016/081923 (이들은 각각 모든 목적에 대해 그 전문이 본원에 참조로 포함됨)에서 기술된다.
도너 세포는 숙주 배아에 임의의 단계에서, 예컨대 배반포 단계 또는 전상실기 (즉, 4-세포 단계 또는 8-세포 단계)에서 도입될 수 있다. 생식선을 통해 유전자 변형을 전달할 수 있는 자손이 생성된다. 예컨대, 미국 특허 제 7,294,754호 (모든 목적에 대해 그 전문이 본원에 참조로 포함됨)를 참조한다.
대안적으로, 본원의 다른 곳에서 기술된 비인간 동물의 제조 방법은: (1) 전능 세포를 변형시키기 위해 상기 기술된 방법을 사용하여 단세포 단계 배아의 게놈을 돌연변이된 Slc30a8 유전자좌를 포함하도록 변형시키는 단계; (2) 유전자 변형된 배아를 선택하는 단계; 및 (3) 유전자 변형된 배아를 대리 모체에 이식하고 잉태시키는 단계를 포함할 수 있다. 대안적으로, 본원의 다른 곳에서 기술된 비인간 동물의 제조 방법은: (1) 전능 세포를 변형시키기 위해 상기 기술된 방법을 사용하여 단세포 단계 배아의 게놈을 돌연변이된 Slc30a8 유전자좌를 포함하도록 변형시키는 단계; (2) 유전자 변형된 배아를 선택하는 단계; 및 (3) 유전자 변형된 배아를 대리 모체에서 잉태시키는 단계를 포함할 수 있다. 생식선을 통해 유전자 변형을 전달할 수 있는 자손이 생성된다.
핵 전달 기법 또한 비인간 동물을 생성하기 위해 사용될 수 있다. 간단히 설명하면, 핵 전달 방법은 (1) 난모세포를 탈핵화하거나 탈핵화된 난모세포를 제공하는 단계; (2) 탈핵화된 난모세포와 조합될 도너 세포 또는 핵을 분리 또는 제공하는 단계; (3) 세포 또는 핵을 탈핵화된 난모세포에 삽입하여 복원된 세포를 형성하는 단계; (4) 복원된 세포를 동물의 자궁에 이식하여 배아를 형성하는 단계; 및 (5) 배아가 발달하도록 하는 단계를 포함할 수 있다. 이러한 방법에서, 난모세포는 일반적으로 죽은 동물로부터 회수하지만, 또한 살아있는 동물의 난관 및/또는 난소로부터 분리될 수 있다. 난모세포는 탈핵화 전에 다양한 잘 알려져 있는 배지에서 성숙될 수 있다. 난모세포의 탈핵화는 다양한 잘 알려져 있는 방식으로 수행될 수 있다. 복원된 세포를 형성하기 위한 도너 세포 또는 핵의 탈핵화된 난모세포로의 삽입은 융합 전 투명대 아래에서 도너 세포의 미세주입에 의한 것일 수 있다. 융합은 접촉/융합 평면을 가로지르는 DC 전기적 펄스의 적용에 의해 (전기융합), 세포의 융합-촉직 화학물질, 예컨대 폴리에틸렌 글리콜에의 노출에 의해, 또는 비활성화된 바이러스, 예컨대 센다이 바이러스에 의해 유도될 수 있다. 복원된 세포는 핵 도너 및 수령체 난모세포의 융합 전에, 중에, 및/또는 후에 전기적 및/또는 비전기적 수단에 의해 활성화될 수 있다. 활성화 방법으로는 전기적 펄스, 화학적으로 유도된 충격, 정자에 의한 침투, 난모세포에서 이가 양이온의 수준의 증가, 및 난모세포에서 세포 단백질의 환원 인산화 (예컨대 키나아제 억제제에 의한)를 들 수 있다. 활성화된 복원된 세포, 또는 배아는 잘 알려진 배지에서 배양된 후 동물의 자궁으로 전달될 수 있다. 예컨대, US 2008/0092249, WO 1999/005266, US 2004/0177390, WO 2008/017234, 및 미국 특허 제 7,612,250호 (이들은 각각 모든 목적에 대해 그 전문이 본원에 참조로 포함됨)를 참조한다.
본원에서 제공된 다양한 방법은 유전자 변형된 F0 동물의 세포가 돌연변이된 Slc30a8 유전자좌를 포함하는 유전자 변형된 비인간 F0 동물의 생성을 허용한다. F0 동물을 생성하기 위해 사용된 방법에 따라, 돌연변이된 Slc30a8 유전자좌를 가지는 F0 동물 내의 세포 수는 달라질 것이다. 예를 들어, VE유전자좌마우스® 방법을 통한, 상응하는 유기체로부터의 전상실기 배아 (예컨대, 8-세포 단계 마우스 배아)에의 도너 ES 세포의 도입은 표적화된 유전자 변형을 포함하는 관심의 뉴클레오타이드 서열을 가지는 세포를 포함하는 F0 동물의 세포 집단의 백분율을 더 크게 한다. 예를 들어, 비인간 F0 동물의 세포 기여의 적어도 50%, 60%, 65%, 70%, 75%, 85%, 86%, 87%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%가 표적화된 변형을 가지는 세포 집단을 포함할 수 있다.
유전자 변형된 F0 동물의 세포는 돌연변이된 Slc30a8 유전자좌에 대해 이형접합성이거나 돌연변이된 Slc30a8 유전자좌에 대해 동형접합성일 수 있다.
IV. 화합물의 스크리닝 방법
본원에서 기술된 돌연변이된 Slc30a8 유전자좌를 가지는 비인간 동물은 제2형 당뇨병을 억제, 개선, 또는 감소시키거나 제2형 당뇨병-유사 증상을 개선하는 데 잠재적으로 유용한 활성에 대해 화합물을 스크리닝하기 위해 또는 제2형 당뇨병 또는 제2형 당뇨병-유사 증상을 촉진하거나 악화시키는 데 잠재적으로 해로운 활성에 대해 화합물을 스크리닝하기 위해 사용될 수 있다. 야생형 비인간 동물 또는 본원에서 기술된 돌연변이된 Slc30a8 유전자좌를 갖지 않는 비인간 동물은 또한 제2형 당뇨병을 억제, 개선, 또는 감소시키거나 제2형 당뇨병-유사 증상을 개선하는 데 잠재적으로 유용한 활성에 대해 화합물을 스크리닝하기 위해 또는 제2형 당뇨병 또는 제2형 당뇨병-유사 증상을 촉진하거나 악화시키는 데 잠재적으로 해로운 활성에 대해 화합물을 스크리닝하기 위해 본원에서 기술된 보호성 돌연변이된 Slc30a8 유전자좌와 관련된 표현형 측면을 모니터링함으로써 사용될 수 있다. 제2형 당뇨병을 억제, 개선, 또는 감소시키거나, 또는 제2형 당뇨병-유사 증상을 개선하는 활성을 가지는 화합물은 잠재적으로 제2형 당뇨병에 대한 치료제 또는 예방제로서 유용하다. 제2형 당뇨병 또는 제2형 당뇨병-유사 증상을 촉진하거나 악화시키는 활성을 가지는 화합물은 독성으로서 확인되며 치료제로서 또는 인간과 접촉하게 될 수 있는 다른 상황에서 (예컨대, 식품, 농업, 제조, 또는 식수 공급에서) 피해야만 하는 것이다.
스크리닝될 수 있는 화합물의 실례로는 항체, 항원 결합 단백질, 부위-특이적 DNA 결합 단백질 (예컨대, CRISPR-Cas 복합체), 폴리펩타이드, 베타-회전 모방물, 다당류, 인지질, 호르몬, 프로스타글란딘, 스테로이드, 방향족 화합물, 헤테로고리형 화합물, 벤조디아제핀, 올리고머 N-치환된 글리신, 및 올리고카바메이트를 들 수 있다. 화합물의 대형 조합 라이브러리가 WO 1995/012608, WO 1993/006121, WO 1994/008051, WO 1995/035503, 및 WO 1995/030642 (이들은 각각 모든 목적에 대해 그 전문이 본원에 참조로 포함됨)에서 기술된 암호화된 합성 라이브러리 (ESL) 방법에 의해 구성될 수 있다. 펩타이드 라이브러리는 또한 파지 디스플레이 방법에 의해 생성될 수 있다. 예컨대, US 5,432,018 (모든 목적에 대해 그 전문이 본원에 참조로 포함됨)을 참조한다. 상이한 유전자에 대해 CRISPR-Cas 시스템을 표적화하기 위한 가이드 RNA의 라이브러리의 사용은, 예컨대, WO 2014/204727, WO 2014/093701, WO 2015/065964, 및 WO 2016/011080 (이들은 각각 모든 목적에 대해 그 전문이 본원에 참조로 포함됨)에서 개시된다.
동물-기반 검정은 일반적으로 화합물을 돌연변이된 Slc30a8 유전자좌를 포함하고 있는 비인간 동물에게 투여하는 단계 및 제2형 당뇨병의 신호 또는 증상과 밀접하게 닮은 신호 또는 증상, 제2형 당뇨병과 관련된 신호 또는 증상, 또는 글루코스, 인슐린, 글루코스 대사와 관련된 표현형 측면, 또는 제2형 당뇨병을 인간에서 반응의 변화에 대해 평가하는 단계를 포함한다. 변화는 비인간 동물을 화합물과 접촉시키기 전과 후에 또는 화합물 없이 동일한 Slc30a8 돌연변이를 가진 대조군 동물 (예컨대, 야생형 집단 동기)을 사용한 대조군 실험을 수행함으로써 평가될 수 있다.
모니터링될 수 있는 적합한 표현형 측면으로는, 예를 들어, 인슐린 분비 능력을 들 수 있다. 예를 들어, 고지방식이 공급될 때 인슐린 분비 능력이 모니터링될 수 있다. 대안적으로, 고혈당증, 예컨대 중증 고혈당증에 대한 반응으로 인슐린 분비 능력이 모니터링될 수 있다. 예를 들어, 인슐린 분비는 인슐린 수용체 억제에 의해 유도된 고혈당증, 예컨대 인슐린 수용체 길항물질 S961에 의해 유발된 고혈당증에 대한 반응으로 일어날 수 있다.
모니터링될 수 있는 다른 적합한 표현형 측면은 미토콘드리아 유전자 발현 (예컨대, 미토콘드리아 산화성 인산화 (OXPHOS) 시스템에서의 유전자의 발현) 또는 Hvcn1의 발현을 포함한다. 이러한 미토콘드리아 유전자의 실례는 실시예 2 및 표 6 내지 8에서 보다 상세하게 기술된다. 모니터링될 수 있는 또 다른 적합한 표현형 측면은 대조군 차우 식단이 공급될 때 인슐린/C-펩타이드 비율 또는 인슐린 제거율을 포함한다. 모니터링될 수 있는 또 다른 적합한 표현형 측면은 샘 아연 축적을 포함한다.
모니터링될 수 있는 또 다른 적합한 표현형 측면은, 예를 들어, (1) 고지방식이 공급될 때 글루코스-유도 인슐린 분비 (예컨대, 고지방식이 공급되고 20주 후의 순환 인슐린 수준); (2) 고지방식이 공급될 때 췌장 베타 세포 증식 수준 (예컨대, 고지방식이 공급되고 20주 후의); (3) 고지방식이 공급될 때 췌장 베타 세포의 수 (예컨대, 고지방식이 공급되고 20주 후의); 및 (4) 인슐린 수용체의 차단 후 (예컨대, S961을 사용한) 급식 혈장 인슐린 수준을 포함한다. 대안적으로 또는 추가적으로, 모니터링될 수 있는 적합한 표현형 측면은, 예를 들어, 고지방식이 공급될 때 프로인슐린-대-인슐린 비율 또는 췌장 베타 세포의 인슐린 프로세싱 및 건강상태를 포함한다.
예를 들어, 제2형 당뇨병을 악화시키는 활성은: (1) 감소된 인슐린 분비 능력 (예컨대, 고지방식이 공급될 때 또는 고혈당증에 대한 반응으로) 또는 (2) 감소된 인슐린 제거율 (예컨대, 대조군 차우 식단이 공급될 때 인슐린/C-펩타이드의 증가된 비율) 중 하나 또는 둘 다에 의해 확인될 수 있다. 제2형 당뇨병을 악화시키는 활성은 또한 (1) 증가된 미토콘드리아 유전자 발현 (예컨대, 미토콘드리아 산화성 인산화 (OXPHOS) 시스템에서의 유전자 발현) 또는 (2) Hvcn1의 감소된 발현 중 하나 또는 둘 다에 의해 확인될 수 있다.
제2형 당뇨병을 악화시키는 활성은 또한: (1) 고지방식이 공급될 때 감소된 글루코스-유도 인슐린 분비 (예컨대, 고지방식이 공급되고 20주 후의 감소된 순환 인슐린 수준); (2) 고지방식이 공급될 때 감소된 췌장 베타 세포 증식 (예컨대, 고지방식이 공급되고 20주 후의); (3) 고지방식이 공급될 때 감소된 수의 췌장 베타 세포 (예컨대, 고지방식이 공급되고 20주 후의); 및 (4) 인슐린 수용체의 차단 후 감소된 급식 혈장 인슐린 수준 중 하나 이상 또는 전부에 의해 확인될 수 있다. 대안적으로 또는 추가적으로, 제2형 당뇨병을 악화시키는 활성은 프로인슐린-대-인슐린의 증가된 비율 및 췌장 베타 세포의 악화된 인슐린 프로세싱 및 건강상태 (예컨대, 고지방식이 공급될 때 프로인슐린-대-인슐린의 증가된 비율에 의해 증명되는 것과 같이) 중 하나 이상 또는 전부에 의해 확인될 수 있다.
대안적으로, 제2형 당뇨병을 개선시키는 활성은: (1) 증가된 인슐린 분비 능력 (예컨대, 고지방식이 공급될 때 또는 고혈당증에 대한 반응으로) 또는 (2) 증가된 인슐린 제거율 (예컨대, 대조군 차우 식단이 공급될 때 인슐린/C-펩타이드의 증가된 비율). 제2형 당뇨병을 악화시키는 활성은: (1) 감소된 미토콘드리아 유전자 발현 (예컨대, 미토콘드리아 산화성 인산화 (OXPHOS) 시스템에서의 유전자 발현) 또는 (2) Hvcn1의 증가된 발현 중 하나 또는 둘 다에 의해 확인될 수 있다.
제2형 당뇨병을 개선시키는 활성은 또한 (1) 고지방식이 공급될 때 증가된 글루코스-유도 인슐린 분비 (예컨대, 고지방식이 공급되고 20주 후의 증가된 순환 인슐린 수준); (2) 고지방식이 공급될 때 증가된 췌장 베타 세포 증식 (예컨대, 고지방식이 공급되고 20주 후의); (3) 고지방식이 공급될 때 증가된 수의 췌장 베타 세포 (예컨대, 고지방식이 공급되고 20주 후의); 및 (4) 인슐린 수용체의 차단 후의 증가된 급식 혈장 인슐린 수준 중 하나 이상 또는 전부에 의해 확인될 수 있다. 대안적으로 또는 추가적으로, 제2형 당뇨병을 개선시키는 활성은 프로인슐린-대-인슐린의 감소된 비율 및 췌장 베타 세포의 증가된 프로세싱 및 건강상태 (예컨대, 고지방식이 공급될 때 프로인슐린-대-인슐린의 감소된 비율에 의해 증명되는 것과 같이). 중 하나 이상 또는 전부에 의해 확인될 수 있다.
이러한 표현형 측면은 하기에서 제공되는 실시예에서 기술되는 것과 같이 검정될 수 있다. 감소 또는 증가는 통계학적으로 유의미할 수 있다. 예를 들어, 감소 또는 증가는 적어도 약 1%, 적어도 약 2%, 적어도 약 3%, 적어도 약 4%, 적어도 약 5%, 적어도 약 10%, 적어도 약 15%, 적어도 약 20%, 적어도 약 30%, 적어도 약 40%, 적어도 약 50%, 적어도 약 60%, 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 적어도 약 90%, 또는 100% 만큼일 수 있다.
상기 또는 하기에서 인용된 모든 특허 출원, 웹사이트, 다른 출판물, 등록 번호 등은 각각의 별개의 항목이 구체적으로 및 개별적으로 참조로 포함된 것으로 표시된 것과 같은 정도로 모든 목적에 대해 그 전문이 참조로 포함된다. 만약 상이한 버전의 서열이 상이한 시점의 등록 번호와 관련된다면, 본 출원의 유효 출원일의 등록 번호와 관련된 버전을 의미한다. 유효 출원일은 실제 출원일 또는 적용된다면 등록 번호를 언급하는 우선권 출원의 출원일보다 앞선 것을 의미한다. 마찬가지로, 만약 상이한 버전의 출판물, 웹사이트 등이 상이한 시점에 공개된다면, 다르게 표시되지 않는 한, 출원의 유효 출원일에 가장 최근에 공개된 버전을 의미한다. 발명의 임의의 특징, 단계, 요소, 구체예, 또는 측면은 구체적으로 다르게 표시되지 않는 한 임의의 다른 것과 함께 사용될 수 있다. 비록 본 발명이 명료성과 이해를 목적으로 예시 및 실례에 의해 어느 정도 상세하게 기술되었지만, 특정 수정 및 변형이 첨부된 청구범위의 범주 내에서 실시될 수 있다는 것이 명백할 것이다.
서열의 간단한 설명
첨부되는 서열 목록에 열거된 뉴클레오타이드 및 아미노산 서열은 뉴클레오타이드 염기에 대한 표준 문자 약어, 및 아미노산에 대한 3-문자 코드를 사용하여 제시된다. 뉴클레오타이드 서열은 서열의 5' 단부에서 시작하여 3' 단부를 향해 (즉, 각 라인의 좌측에서 우측으로) 진행되는 표준 관례를 따른다. 각 뉴클레오타이드 서열의 한 가닥만이 제시되지만, 상보하는 가닥이 표시된 가닥에 대한 임의의 참조에 의해 포함되는 것으로 이해된다. 아미노산 서열을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열이 제공될 때, 동일한 아미노산 서열을 암호화하는 그것의 코돈 축퇴성 변이체가 또한 제공되는 것으로 이해된다. 아미노산 서열은 서열의 아미노 말단에서 시작하여 카르복시 말단을 향해 (즉, 각 라인의 좌측에서 우측으로) 진행되는 표준 관례를 따른다.
서열의 설명.
SEQ ID NO 유형 설명
1 DNA 8084 AS 전방향 프라이머
2 DNA 8084 AS WT 프로브
3 DNA 8084 AS 역방향 프라이머
4 DNA 8084 AS Mut 프로브
5 DNA 8084 TD 전방향 프라이머
6 DNA 8084 TD 프로브
7 DNA 8084 TD 역방향 프라이머
8 DNA Slc30a8 인트론 2 / Slc30a8 엑손 3 pArg137* / Slc30a8 인트론 3
9 DNA Slc30a8 인트론 3 / XhoI / (loxP) 자기 삭제 네오마이신 선택 카세트
10 DNA 자기 삭제 네오마이신 선택 카세트 (loxP) / ICEUI / NheI / Slc30a8 인트론 3
11 DNA Slc30a8 인트론 3 / XhoI / loxP / ICEUI / NheI / Slc30a8 인트론 3
12 단백질 마우스 SLC30A8 WT (UniProt Q8BGG0.1)
13 단백질 마우스 SLC30A8 p.Arg137X
14 단백질 인간 SLC30A8 WT (UniProt Q8IWU4.2)
15 단백질 인간 SLC30A8 p.Arg138X
16 DNA 마우스 Slc30a8 cDNA WT (NM_172816.3)
17 DNA 인간 SLC30A8 cDNA WT (NM_173851.2)
18 DNA 마우스 Slc30a8 cDNA c.409C>T
19 DNA 인간 SLC30A8 cDNA c.412C>T
20 DNA 마우스 Slc30a8 CDS WT
21 DNA 인간 SLC30A8 CDS WT
22 DNA 마우스 Slc30a8 CDS c.409C>T
23 DNA 인간 SLC30A8 CDS c.412C>T
24 DNA p.Arg137X 대립유전자의 마우스 Slc30a8에서 삭제된 서열 (MAID 8084)
25 DNA 프로브
26 DNA F 프라이머
27 DNA R 프라이머
실시예
실시예 1. 돌연변이된 Slc30a8 유전자좌를 포함하는 마우스의 생성
추정되는 인간 SLC30A8 LOF 대립유전자 (c.412C>T (전사물 등록 번호 NM_173851.2), p.Arg138X)에 상응하는 대립유전자를 포함한 마우스 모델을 생성하기 위하여, 돌연변이된 마우스 Slc30a8 대립유전자를 생성하였다 (c.409C>T (전사물 등록 번호 NM_172816.3), p.Arg137X). 마우스 Slc30a8 및 인간 SLC30A8 유전자에 대한 정보는 표 3에 제공한다. 인간 SLC30A8 및 the 마우스 SLC30A8 단백질의 정렬을 도 11에 나타낸다. 돌연변이된 대립유전자는 엑손 3의 R137을 암호화하는 마우스 Slc30a8 코돈에서 dT에 대한 dC의 대체 (c.409C>T)를 가짐으로써, CGA로부터 TGA로 코돈이 변경되어 (p.Arg137X), 절단된 단백질을 생성할 것으로 예상되는 중단 코돈이 만들어진다. 돌연변이된 대립유전자는 또한 인트론 3에서 삽입되어 내인성 인트론 3 서열의 29 bp가 삭제된, loxP 부위가 측면에 있는 자기 삭제 네오마이신 선택 카세트 (loxP- mPrm1-Crei-hUb1-em7-Neo-pA-loxP 카세트 (4,810 bp))를 가진다. 내인성 Slc30a8 유전자좌를 도 10A에 나타내고, 표적화된 Slc30a8 유전자좌를 도 10B에 나타낸다. Slc30a8 인트론 2 / Slc30a8 엑손 3 pArg137* / Slc30a8 인트론 3 (도 10B에서 수평선 "A"에 의해 표시됨)의 경계를 포함하는 영역에 대한 예상 서열을 SEQ ID NO: 8에 제시한다. Slc30a8 인트론 3 / XhoI / (loxP) 자기 삭제 카세트 (도 10B에서 수평선 "B"에 의해 표시됨)의 경계를 포함하는 영역에 대한 예상 서열을 SEQ ID NO: 9에 재시한다. 자기 삭제 카세트 (loxP) / ICEUI / NheI / Slc30a8 인트론 3 (도 10B에서 수평선 "C"에 의해 표시됨)의 경계를 포함하는 영역에 대한 예상 서열을 SEQ ID NO: 10에 제시한다.
마우스 Slc30a8 및 인간 SLC30A8 .
마우스 인간
공식 기호 Slc30a8 SLC30A8
NCBI GeneID 239436 169026
주요 공급원 MGI:2442682 HGNC:20303
RefSeq mRNA ID NM_172816.3 NM_173851.2
UniProt ID Q8BGG0 Q8IWU4
게놈 어셈블리 GRCm38.p4 GRCh38.p7
위치 Chr 15: 52295553-52335733 (+) Chr 8: 116950273-117176714 (+)
자기 삭제 loxP-mPrm1-Crei-hUb1-em7-Neo-pA-loxP 카세트의 삭제 후 표적화된 Slc30a8 유전자좌를 도 10C에 나타낸다. 카세트 삭제 후에, loxP 및 클로닝 부위 (77 bp)는 Slc30a8 인트론 3에 남아 있다. Slc30a8 인트론 2 / Slc30a8 엑손 3 pArg137* / Slc30a8 인트론 3 (도 10C에서 수평선 "A"에 의해 표시됨)의 경계를 포함하는 영역에 대한 예상 서열을 SEQ ID NO: 8에 제시한다. Slc30a8 인트론 3 / XhoI / loxP / ICEUI / NheI / Slc30a8 인트론 3 (도 10C에서 수평선 "B"에 의해 표시됨)의 경계를 포함하는 영역에 대한 예상 서열을 SEQ ID NO: 11에 제시한다.
삭제에 대해 표적화된 Slc30a8의 영역으로부터 상류로 62 kb의 서열 (그러나 R137을 암호화하는 마우스 Slc30a8 코돈에 점 돌연변이를 가짐) 및 삭제에 대해 표적화된 Slc30a8의 영역으로부터 하류로 136 kb의 서열을 포함하는 큰 표적화 벡터를 생성하였다. R137을 암호화하는 엑손 3에서의 마우스 Slc30a8 코돈에 점 돌연변이를 도입하고 인트론 3의 29 bp 영역을 4,810 bp의 자기 삭제 네오마이신 선택 카세트로 대체하도록 큰 표적화 벡터를 설계하였다. 도 10B를 참조한다. 자기 삭제 네오마이신 선택 카세트는 5'에서 3' 방향으로 다음 구성요소를 포함하였다: loxP 부위, 마우스 프로타민 (Prm1) 프로모터, Crei (인트론을 포함하도록 최적화된 Cre 코딩 서열), 인간 유비퀴틴 프로모터, EM7 프로모터, 네오마이신 포스포트랜스퍼라제 (neor) 코딩 서열, 폴리A, 및 loxP 부위. 표적화된 대립유전자를 생성하기 위하여, CRISPR/Cas9 구성요소를 F1H4 마우스 배아 줄기 세포에 큰 표적화 벡터와 함께 도입하였다. 표 4에 제시한 프라이머 및 프로브를 사용한 대립유전자 손실 검정 및 대립유전자-특이적 TAQMAN® 검정을 수행하여 Slc30a8 대립유전자의 정확한 변형을 확인하였다. 도 10A에서 대립유전자 손실 검정을 "8084 TD" (TAQMAN® Downstream 검정)로서 표시하고 대립유전자-특이적 검정을 "8084 AS" (대립유전자-특이적 검정)로서 표시한다. 이러한 검정은, 예를 들어, US 2014/0178879; US 2016/0145646; WO 2016/081923; 및 Frendewey et al. (2010) Methods Enzymol. 476:295-307 (이들은 각각 모든 목적에 대해 그 전문이 본원에 참조로 포함됨)에서 기술된다.
표적화된 Slc30a8 유전자좌의 검출을 위한 검정.
검정 프라이머 또는 프로브 서열
8084 AS WT 전방향 CGAGGCCCCCTTCCAA
(SEQ ID NO: 1)
프로브 (FAM-MGB) CATTTGGGTGGTATCGA
(SEQ ID NO: 2)
역방향 TGCGCAATCAGAGAATGTTACC(SEQ ID NO: 3)
8084 AS Mut 전방향 CGAGGCCCCCTTCCAA
(SEQ ID NO: 1)
프로브 (VIC-MGB) CATTTGGGTGGTATTGA
(SEQ ID NO: 4)
역방향 TGCGCAATCAGAGAATGTTACC(SEQ ID NO: 3)
8084 TD 전방향 TGTGGGAATGTGAGCTCTCAAC
(SEQ ID NO: 5)
프로브 (Cal O-BHQ1) CAGCTGACAGCAAGATTAATGGAAGTACC
(SEQ ID NO: 6)
역방향 GACCCTGGAGACAGAAATGTC(SEQ ID NO: 7)
그런 후 F0 마우스를 표적화된 ES 세포 클론으로부터 VELOCIMOUSE® 방법을 사용하여 생성하였다. 예컨대, US 7,576,259; US 7,659,442; US 7,294,754; US 2008/007800; 및 Poueymirou et al. (2007) Nature Biotech. 25(1):91-99 (이들은 각각 모든 목적에 대해 그 전문이 본원에 참조로 포함됨)를 참조한다.
야생형 마우스 유전자좌로부터 발현된 예상 SLC30A8 단백질의 서열을 SEQ ID NO: 12에 제시한다. 표적화된 마우스 유전자좌 (SLC30A8 Arg137*)로부터 발현된 예상 절단된 SLC30A8 단백질의 서열을 SEQ ID NO: 13에 제시한다. 두 서열의 정렬을 도 11에 나타낸다.
실시예 2. SLC30A8 R138X 마우스의 특성화.
요약
SLC30A8은 랑게르한스 췌장샘에서 주로 발현되는 아연 수송체를 암호화한다. 베타 세포에서, 그것은 아연을 인슐린-함유 분비 과립으로 운반한다. SLC30A8에서의 기능 상실 (LOF) 돌연변이는 인간에서 제2형 당뇨병에 대해 보호한다. 몇몇 Slc30a8 녹아웃 마우스 계통은 특성화되었지만 인간 표현형을 완전히 개괄하지는 못한다. 실제로, Slc30a8 결핍 마우스는 본 발명자들이 여기서 대조군 Slc30a8-결핍 마우스에서 복제한 표현형인, 감소된 혈장 인슐린 수준 및 손상된 글루코스 내성을 가진다. 본 발명자들은 인간 SLC30A8 추정 LOF 돌연변이, R138X에 상응하는 마우스 Slc30a8 유전자좌 (c.409C>T (전사물 등록 번호 NM_172816.3), p.Arg137X)에서 돌연변이를 가진 녹 인 마우스 모델을 생성하였다. 비록 마우스 Slc30a8 유전자에서의 돌연변이가 마우스 SLC30A8 단백질의 아미노산 잔기 137을 암호화하는 코돈에서 일어나지만, 이들 마우스를 본원에서 상응하는 인간 돌연변이와 관련하여 "R138X 마우스"로서 언급한다. 흥미롭게도, R138X 마우스는 고지방식이 공급될 때 증가된 글루코스-유도 인슐린 분비를 가졌다. 이것은 증가된 베타 세포 증식 및 베타 세포 영역의 확대와 관련이 있었다. 중요하게도, 이형접합성 R138X 마우스는 글루코스-유도 인슐린 분비에서 유사한 증가를 보였다. 대조적으로, 차우 급식 R138X 마우스는 정상적인 체중, 글루코스 내성, 및 췌장 베타 세포 질량을 가졌다. 흥미롭게도, 인슐린 수용체 길항물질 S961에 의해 유도된 고혈당 상태에서, R138X 마우스는 인슐린 분비에서 50% 증가를 보였다. 이 효과는 증강된 베타 세포 증식 또는 베타 세포 질량과 관련되지 않았다. 이들 데이터는 인간에서 SLC30A8 R138X 돌연변이가 인슐린을 분비하는 베타 세포의 능력의 증가에 의해 부분적으로 제2형 당뇨병에 대해 보호하는 것을 시사한다. 이것은 부분적으로는 췌장 베타 세포의 증가된 수에 의해 매개될 수 있다.
서론
SLC30A8은 내분비 췌장의 샘세포에 위치한 아연 수송체 (ZnT8)이다. 베타 세포에서, SLC30A8은 아연을 인슐린 함유 과립에 운반한다. 2개의 아연 이온이 힌슐린의 헥사머 형태와 결합하여 안정화시켜서 인슐린 결정화를 촉발한다. 예컨대, Dodson and Steiner (1998) Curr. Opin. Struct. Biol. 8(2):189-194 (모든 목적에 대해 그 전문이 본원에 참조로 포함됨)를 참조한다. 샘 SLC30A8의 상실이 실질적으로 샘 아연 함량 및 인슐린 결정화를 감소시키는 한편, 프로인슐린 프로세싱, 분비 및 글루코스 대사의 조절에 미치는 그것의 영향은 아직 분명하지 않다. 예컨대, Lemaire et al. (2009) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106(35):14872-14877 및 Nicolson et al. (2009) Diabetes 58(9):2070-2083 (이들은 각각 모든 목적에 대해 그 전문이 본원에 참조로 포함됨)을 참조한다. 여러 그룹이 전체적으로 또는 췌장 베타 세포에 제한된 Slc30a8 녹아웃 (KO) 마우스 모델을 생성하였다. 이들 모델의 관찰된 대사 표현형은 약하고, 비록 연구 그룹간 차이가 있어도, 대부분의 모델은 감소된 또는 변화없는 혈장 인슐린 수준과 관련된 글루코스 내성에 변화가 없거나 약간의 손상을 보인다. 예컨대, Rutter et al. (2016) Proc. Nutr. Soc. 75(1):61-72 (모든 목적에 대해 그 전문이 본원에 참조로 포함됨)를 참조한다. 가장 중요하게도, 연구 중 어느 것도 Slc30a8 결핍과 관련된 유익한 효과를 보고하지 않았다. 그러므로, Flannick과 동료들이 SLC30A8의 반가불충분성(haploinsufficiency)이 인간에서 제2형 당뇨병 (T2D)의 발생에 대해 보호성인것을 보고하였을 때 놀라운 것이었다. 예컨대, Flannick et al. (2014) Nat. Genet. 46(4):357-363 (모든 목적에 대해 그 전문이 본원에 참조로 포함됨)을 참조한다. 그들의 연구는 T2D에 대한 위험을 종합적으로 65% 감소시킨 12개의 추정되는 기능 상실 (LOF) 변이체를 확인하였다. 가장 풍부한 변이체 중 하나인, 조기 중단 코돈을 유발하는 p.Arg138* (본원에서 R138X로 언급함)가 T2D로부터의 보호와 개별적으로 연관이 있었고 불안정한 ZnT8 단백질을 암호화하는 것으로 보고되었다. 예컨대, Flannick et al. (2014) Nat. Genet. 46(4):357-363 (모든 목적에 대해 그 전문이 본원에 참조로 포함됨)을 참조한다. 그러므로, 마우스 및 인간 데이터는 서로 모순되는 것으로 보이고, 현재 드문 추정되는 LOF 변이체가 T2D의 위험을 어떻게 감소시키는지는 분명하지 않다.
인간 SLC30A8 추정 LOF 변이체의 효과와 Slc30a8 KO 마우스 모델 사이의 이런 불일치를 조사하는 것뿐만 아니라 s as well as gain insight as to why SLC30A8 추정 LOF 변이체가 인간에서 왜 보호성인지에 대한 통찰을 얻기 위하여, 본 발명자들은 대표적인 인간 추정 LOF 변이체로서 R138X 돌연변이를 포함한 새로운 Slc30a8 마우스 모델을 생성하고 표현하였다. 흥미롭게도, 본 발명자들은 R138X 마우스에서 베타 세포가 중증 고혈당증에 대한 반응으로 대단한 인슐린 분비 능력을 가지는 것을 발견하였다.
결과
R138X 샘은 넌센스-매개된 쇠퇴로부터 R138X 전사물의 부분적인 보호에도 불구하고 SLC30A8 기능의 상실을 보이는 것으로 여겨진다. 인간 SLC30A8 추정 LOF 변이체가 T2D의 위험에 어떻게 영향을 미치는지를 조사하기 위하여, 본 발명자들은 아미노산 잔기 137을 암호화하는 마우스 게놈에서 Slc30a8의 코돈 (코돈 137, 인간에서 코돈 138에 동등함)을 CGA로부터 TGA로 변경하여 실시예 1에서 설명한 것과 같이 아르기닌을 중단 코돈 (R138X)으로 변경하였다. R138X 마우스는 에상된 멘델 비율로 태어났고 명백한 성장 이상은 없었다. RNA 제자리 혼성화는 야생형 (WT) 마우스로부터의 췌장샘에서 강력한 Slc30a8 mRNA 염색을 보였지만 동형접합성 Slc30a8 KO 마우스로부터의 샘에서는 염색을 보이지 않아서, 프로브의 특이성을 확인해주었다 (도 1A). Slc30a8 KO 마우스로부터의 샘과는 대조적으로, R138X 마우스로부터의 샘은 실질적인 양의 Slc30a8 RNA 염색을 보였다 (도 1A). 실시간 PCR을 사용한 Slc30a8 mRNA의 정량화는 R138X 샘에서 70% 감소를 나타냈지만, R138X 샘에서 절대적인 Slc30a8 전사물 수준 (CT 값: 22.2)은 여전히 높았고 하우스키핑 유전자 Gapdh의 발현 수준 (CT 값: 22.1)과 비슷하였다 (도 1B). R138X 마우스에서의 이런 높은 수준의 Slc30a8 RNA의 존재는 R138X 전사물이 조기 번역 종결 코돈을 포함한 mRNA를 분해하는 과정인 넌센스-매개된 mRNA 쇠퇴에 의해 효과적으로 분해될 수 없음을 시사한다. 예컨대, Holbrook et al. (2004) Nat. Genet. 36(8):801-808 (모든 목적에 대해 그 전문이 본원에 참조로 포함됨)을 참조한다.
R138X 마우스에서 검출된 RNA가 절단된 단백질로 번역되는지의 여부를 결정하기 위하여, 본 발명자들은 마우스 단백질의 N-말단 펩타이드에 대해 발생된 항체를 사용하여 SLC30A8 단백질에 대한 웨스턴 (면역-) 블롯팅을 수행하였다. 본 발명자들은, HEK293 세포에서 과다발현되었을 때 R138X 단백질을 검출하고 그것을 프로테아좀 억제에 의해 안정화할 수 있었음에도 불구하고 (도 5), 현재 조건 하에서 분리된 샘으로부터의 용해물에서 예상된 분자량 (단량체에 대해 약 16 kDa)에서 절단된 단백질을 확인할 수 없었다 (도 1C). 유사하게, WT 및 R138X 샘으로부터의 전체 세포 용해물 또는 면역침전물의 질량 세포분석에 의한 분석은 R138X 샘에서 SLC30A8 펩타이드를 확인하지 못하였다 (데이터 미도시). 이에 더불어, 다이티존을 사용한 아연 염색은 KO 및 R138X 마우스로부터의 샘이 아연 고갈되었고 두 마우스 계통에서 기능성 SLC30A8 단백질의 부재를 증명하는 것임을 나타냈다 (도 1D). 그러나, 순환 아연 수준에서 유의할만한 변화는 관찰되지 않았다 (도 17). 요약하면, 인간 R138X 추정 LOF 변이체의 마우스 Slc30a8 유전자로의 도입은 SLC30A8 기능의 상실을 초래하는 것으로 나타난다.
차우 식단을 받은 R138X 마우스는 정상적인 대사 표현형을 가진다. 본 발명자들은 먼저 R138X 중단 코돈의 도입이 차우-급식 마우스에서 대사 파라미터를 변경시켰는지를 조사하였다. WT 및 R138X 마우스는 그들의 체중 및 순환 혈당 및 인슐린 수준에서 다르지 않았다 (도 2A-2C, 2L; 표 5). 아연이 인슐린 프로세싱 및 제거율에서 연루되었기 때문에, 본 발명자들은 또한 순환 프로인슐린 및 C-펩타이드 수준을 측정하였고 이들 호르몬의 인슐린에 대한 비율을 게산하였다 (도 2C-2F). 순환 C-펩타이드에 차이가 없었던 한편, 금식 프로인슐린 수준은 R138X 마우스에서 약간 감소하였다 (도 2C). 프로인슐린 대 인슐린의 비율은 WT와 R138X 마우스 사이에서 다르지 않았지만, 급식 상태에서 C-펩타이드 대 인슐린의 비율은 약간 상승하였고 감소된 인슐린 제거율을 시사하였다 (도 2E-2F). 순환 프로인슐린 및 C-펩타이드 수준은 WT와 R138X 마우스 사이에서 유사하였다 (도 2C-2D). 프로인슐린/C-펩타이드 비율이 변하지 않은 한편, 본 발명자들은 인슐린/C-펩타이드 비율의 약간의 감소를 관찰하였고, 이것은 Slc30a8 KO 마우스에서 관찰되었던 것과 유사한 R138X 마우스에서의 더 높은 인슐린 제거율을 시사한다 (도 2P). 예컨대, Tamaki et al. (2013) J. Clin. Invest. 123(10):4513-4524 (모든 목적에 대해 그 전문이 본원에 참조로 포함됨)를 참조한다. 감소된 글루코스 내성은 R138X 마우스에서 분명하지 않았고, 본 발명자들은 글루코스-유도 인슐린 분비에서 변화를 관찰하지 못하였다 (도 2G-2H). 글루코스 내성 및 인슐린 민감성은 R138X 및 대조군 마우스에서 유사하였고, 본 발명자들은 글루코스-유도 인슐린 분비에서 변화를 관찰하지 못하였다 (도 2G, 2H, 및 2M). 이에 더불어, 샘 아연의 부재는 인슐린과 글루카곤 염색이 변하지 않았기 때문에 샘 형태에 영향을 주지 않았다 (도 2I-2K; 도 6A-6B). 이에 더불어, 샘 아연의 부재는 베타-세포 및 알파-세포 질량이 변하지 않았기 때문에 샘 형태에 영향을 주지 않았다 (도 2I, 2N, 6A, 및 6E). 이들 데이터를 함께 취하면, R138X 변이체가 차우-급식 마우스에서 글루코스 항상성 또는 글루코스-유도 인슐린 분비에 영향을 주지 않는 것을 보여준다.
SLC30A8 KO 및 R138X 마우스의 체중.
유전자형 성별 식단 BW (g)
WT 수컷 차우 26 ± 0.4
R138K 수컷 차우 27 ± 0.4
WT 수컷 차우 29 ± 1.1
KO 수컷 차우 27 ± 0.6
WT 수컷 HFD 55 ± 1.9
R138X 수컷 HFD 57 ± 0.9
WT 수컷 HFD 53 ± 1.4
KO 수컷 HFD 54 ± 1.2
WT 수컷 HFD 51 ± 0.9
R138 HET 수컷 HFD 48 ± 0.8
WT 암컷 HFD 54 ± 4.2
R138X 암컷 HFD 54 ± 2.1
차우-급식 SLC30A8 KO 및 R138X 마우스의 신체 비교.
유전자형 성별 린 부피 (cm 3 ) 지방 부피 (cm 3 ) 뼈 부피 (cm 3 ) 골밀도 (mgHA/cm 3 ) 뼈 미네랄 함량 (mgHA)
WT 수컷 13.5 ± 0.4 2.6 ± 0.2 1.1 ± 0.03 283 ± 3.3 320 ± 12.4
R138X 수컷 13.4 ± 0.3 3.1 ± 0.2 1.1 ± 0.11 281 ± 2.8 311 ± 6.6
WT 암컷 13.7 ± 0.3 4.4 ± 0.5 1.2 ± 0.02 443 ± 3.4 525 ± 5.4
R138X 암컷 13.8 ± 0.4 5.5 ± 0.5 1.2 ± 0.02 439 ± 5.2 519 ± 15.8
WT 수컷 14.1 ± 0.3 4.4 ± 0.3 1.2 ± 0.01 294 ± 2.9 339 ± 6.3
KO 수컷 13.9 ± 0.2 4.2 ± 0.4 1.2 ± 0.01 297 ± 2.9 343 ± 5.9
본 발명자들은 또한 Slc30a8 출발 코돈으로부터 Slc30a8 중단 코돈까지의 코딩 서열 (즉, 전체 코딩 서열)이 삭제된 Slc30a8 KO 마우스를 생성하였다. 그런 후 본 발명자들은 차우 식단을 받은 Slc30a8 KO 마우스를 표현하였다 (도 7A-7K). 공개된 결과와 일치하게, Slc30a8 KO 마우스는 경미하게 손상된 글루코스 내성 및 감소된 글루코스-유도 혈장 인슐린 수준을 보였다 (도 7B, 7G, 7H). 예컨대, Lemaire et al. (2009) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106(35):14872-14877; Nicolson et al. (2009) Diabetes 58(9):2070-2083; 및 Rutter et al. (2016) Proc. Nutr. Soc. 75(1):61-72 (이들은 각각 모든 목적에 대해 그 전문이 본원에 참조로 포함됨)를 참조한다. 이에 더불어, Slc30a8 KO 마우스는 C-펩타이드 대 인슐린의 더 높은 비율을 가졌고, 이것은 최근 보고와 유사한 증가된 인슐린 제거율을 시사하며 아마도 Slc30a8 KO 샘으로부터의 손상된 아연 분비를 반영한다. 예컨대, Tamaki et al. (2013) J. Clin. Invest. 123(10):4513-4524 및 Mitchell et al. (2016) Mol. Endocrinol. 30(1):77-91 (이들은 각각 모든 목적에 대해 그 전문이 본원에 참조로 포함됨)을 참조한다.
이들 데이터를 함께 취하면, R138X 추정 LOF 변이체의 도입이 정규 차우 식단을 유지한 마우스에서 프로인슐린 프로세싱에 미미한 영향을 나타내며 글루코스 항상성 또는 글루코스-유도 인슐린 분비를 변화시키지 않는 것을 보여준다. 그러므로 이런 R138X 표현형은 정규 차우 식단이 유지될 때 손상된 글루코스 내성 및 감소된 글루코스-유도 혈장 인슐린 수준을 가진 Slc30a8 KO 마우스에서 관찰된 것과 상이하다.
고지방식을 받은 R138X 마우스는 증가된 인슐린 분비 및 베타-세포 수를 가진다. 인간 R138X의 담체가 T2D의 발생으로부터 보호되기 때문에, 본 발명자들은 마우스를 고지방식 (HFD)으로 도전하였다. 체중 및 급식 글루코스 수준은 WT와 R138X 마우스에서 다르지 않았다 (표 5, 도 3A). 그러나, HFD를 받은 20주 후에 본 발명자들은 WT 마우스와 비교하여 급식 R138X 마우스에서 더 높은 순환 인슐린 수준을 관찰하였다 (도 3B). 순환 C-펩타이드 수준은 인슐린 수준을 모방한 한편, 금식 프로인슐린 수준은 R138X 마우스에서 더 낮았고, 감소된 프로인슐린 대 인슐린 비율을 초래하였다 (도 3C-3F). 급식 인슐린의 증가에도 불구하고, 글루코스 내성은 R138X 마우스에서 유의미하게 개선되지 않았다 (도 3G). 인슐린 분비를 보다 상세하게 조사하기 위하여, 본 발명자들은 경구 글루코스 내성 테스트 (oGTT) 후에 순환 인슐린을 측정하였다. R138X 마우스에서, 경구 글루코스 대용량은 WT 마우스와 비교하여 15분에 순환 인슐린의 양을 배가시켰다 (도 3H). 놀랍게도, 이것은 증가된 수의 인슐린-생성 베타 세포와 관련이 있었다 (도 3I). 인슐린 염색의 정량화는 인슐린-양성 영역의 배가, 뿐만 아니라 샘 수의 배가를 보였다 (도 3J-3K). 대조적으로, 본 발명자들은 글루카곤 염색을 사용하여 알파 세포 수의 변화를 검출하지 못하였다 (도 6C-6D). Ki67 염색은 베타-세포 영역의 증가가 증강된 베타 세포 증식에 부수적이었음을 보여주었다. 인슐린- 및 Ki67-이중 양성 세포의 수는 WT 마우스와 비교하여 R138X 마우스의 췌장에서 2배로 증가하였다. 비록 덜 뚜렷하지만 유사한 대사 표현형이 암컷 R138X 마우스에서 관찰되었다 (도 8A-8K). HFD를 받고 20주 이상 후에, 암컷 R138X 마우스는 금식시에 감소된 프로인슐린 대 인슐린 비율을 보였고, 더 높은 수의 샘과 관련된 순환 인슐린 수준의 증가를 보였다 (도 8B-8K).
R138X 변이체의 보호성 표현형이 이형접합성 담체에서 관찰되었기 때문에, 본 발명자들은 또한 HFD를 받은 이형접합성 R138X 마우스를 분석하였다 (도 9A-9M). 웨스턴 블롯 분석은 이형접합성 R138X 마우스로부터의 샘에서 SLC30A8 단백질의 강력한 감소를 보인 한편 (도 9A), 샘 아연 수준은 다이티존 염색에 의해 조사했을 때 WT 마우스와 비슷하였다 (도 9B). 비록 표현형이 동형접합성 R138X 마우스와 비교하여 더 약했지만, 이형접합성 R138X 마우스는 HFD를 받고 20주 이상 후에 베타-세포 영역의 확대 (도 9K-9M)와 관련된 글루코스-유도 인슐린 분비의 증가를 보였다 (도 9J). 이들 데이터를 함께 취하면, 인간 R138X 돌연변이를 포함한 HFD 마우스가 부분적으로 베타 세포의 증가된 수로부터 유발된 더 큰 인슐린 분비 능력을 가지는 것을 시사한다.
인슐린 저항성을 유도하고 베타-세포 인슐린 분비를 증가시키기 위한 대체 방법으로서, 본 발명자들은 R138X 마우스 및 WT 마우스에서 인슐린 수용체를 차단하기 위하여 인슐린 수용체 길항물질 S961을 사용하였다. 인슐린 수용체의 차단은 R138X 마우스 및 WT 마우스 둘 다에서 예상된 것과 같이 순환 글루코스 및 인슐린 수준을 증가시켰다. 그러나, 본 발명자들은 WT 마우스와 비교하여 R138X 마우스에서 순환 인슐린의 배가를 관찰하였다. 도 12를 참조한다. SLC30A8 KO 마우스는 WT 마우스를 능가하는 이런 인슐린 분비 증가를 보이지 않는다 (데이터 미도시). 이들 데이터는 인간 R138X 돌연변이를 포함한 HFD 마우스가 더 큰 인슐린 분비 능력을 가지는 것을 시사하는 데이터와 일치한다.
고지방식을 받은 Slc30a8 KO 마우스는 증가된 순환 인슐린 수준 또는 베타-세포 수를 갖지 않는다. 본 발명자들은 또한 HFD를 받고 20주 후에 본 발명자들의 Slc30a8 KO 마우스를 조사하였다 (도 4A-4K). 이들 마우스는 급식 순환 인슐린 수준의 증가를 보이지 않았지만, 감소된 금식 인슐린, 프로인슐린 및 C-펩타이드 수준을 가졌다 (도 4B-4D). R138X 마우스와 유사하게, 프로인슐린 대 인슐린 비율은 Slc30a8 KO 마우스에서 더 낮았다 (도 4E). 그러나, C-펩타이드 대 인슐린 비율은 차우 식단을 받았을 때 관찰된 것과 유사하게 Slc30a8 KO 마우스에서 상승하였다.글루코스 내성은 변하지 않은 한편, Slc30a8 KO 마우스는 더 낮은 글루코스-유도 순환 인슐린 수준을 보였다. 본 발명자들이 R138X 마우스에서 관찰한 것과 대조적으로, 베타-세포 수는 Slc30a8 KO 마우스에서 변하지 않았다 (도 4I-4K).
R138X 마우스는 인슐린 수용체 억제-유도 고혈당증에 대한 반응으로 인슐린 분비가 증가하였다. 다음에, 본 발명자들은 대사적으로 도전받은 마우스에서 R138X 돌연변이의 잠재적 영향을 조사하고자 하였다. 본 발명자들은 중증의 인슐린 저항성 및 고혈당증을 유도하기 위하여 인슐린 수용체 길항물질 S961을 사용하였다. 예컨대, Schaffer et al. (2008) Biochem. Biophys. Res. Commun. 376(2):380-383 (모든 목적에 대해 그 전문이 본원에 참조로 포함됨)을 참조한다. 예상과 같이, S961은 모든 처리된 동물에서 고혈당증 (대략 600 mg/dl)을 유발한 한편, 대조군 동물은 정상적인 급식 글루코스 수준 (대략 200 mg/dl)을 유지하였다 (도 13A). 순환 인슐린 수준은 모든 처리된 마우스에서 S961에 대한 반응으로 상승하였다. 놀랍게도, R138X 마우스는 S961-처리된 WT 마우스에 비교하여 S961-유도 고혈당증에 대하여 50% 이상의 (WT: 42.33 ± 5.03 ng/ml; R138X: 67.75 ± 19.16 ng/ml) 더 높은 순환 인슐린 수준을 가졌다 (도 13B). 혈장 인슐린의 증거는 개선된 프로인슐린 프로세싱 또는 감소된 인슐린 제거율의 결과가 아니었고 (도 14A-14E), 또는 R138X과 WT 마우스 사이의 순환 GLP-1 수준의 변화의 결과가 아니었다 (도 13C). 순환 인슐린은 S961로 처리된 R138X 마우스에서 급식 및 금식 조건에서 더 높았지만, 혈당 수준은 S691에 의한 인슐린 수용체에 대한 인슐린 작용의 억제로 인해 유전자형 사이에서 다르지 않았다 (도 13D-13E). 중요하게, 금식 인슐린 수준은 정상적인 금식 혈당 수준에도 불구하고 PBS-처리된 마우스와 비교할 때 WT 및 R138X 마우스에서 S961 처리로 실질적으로 상승하였다.
돌연변이 마우스에서 더 높은 인슐린 수준이 증가된 베타 세포 증식의 결과였는지를 조사하기 위하여, 본 발명자들은 Ki-67 / 인슐린 양성 베타 세포를 측정하였다. 베타 세포 증식이 분명히 S961 처리로 증가한 한편, R138X 및 WT 마우스 사이에서 베타 세포 증식의 차이는 없었다 (도 13F-13G). 증식 데이터와 일치하게, S961-처리된 WT 및 R138X 마우스에서 샘 또는 알파 세포 질량의 차이는 없었다 (도 13F 및 13H, 도 14F-14G). 혈액 인슐린의 큰 증가에도 불구하고, S961-처리된 R138X 마우스로부터의 베타 세포는 S961-처리된 WT 마우스로부터의 베타 세포보다 더 인슐린이 고갈된 것으로 나타나지는 않았다 (도 13F). 요약하면, 이들 데이터는 R138X 마우스로부터의 샘이 고혈당증으로 도전받았을 때 더 높은 인슐린 분비 능력을 가지는 것을 시사한다.
R138X 마우스로부의 샘은 감소된 미토콘드리아 유전자 발현 및 증가된 Hvcn1 발현을 가진다. WT 및 R138X 샘 사이의 차이를 보다 상세하게 이해하기 위하여, 본 발명자들은 차우 급식 마우스로부터 분리된 샘에 대해 RNA 서열분석을 수행하였다. 본 발명자들의 RNAscope 및 TAQMAN® 데이터로 확인되듯이 (도 1A-1B), Slc30a8 mRNA의 양은 강력하게 감소하였지만 (WT에서 대략 500 RPKM으로부터 R138X에서 대략 100 RKPM으로), 부재하는 것은 아니었다 (도 15). 본 발명자들은 61개의 유전자 (19개 유전자는 증가하였고, 43개 유전자는 감소하였음)가 R138X 샘에서 차등적으로 조절된 것을 발견하였다 (표 7). 흥미롭게도, 이 유전자 목록은 아연 대사 또는 인슐린 생합성에 관여하는 유전자들을 함유하지 않는다. 그러나, 인슐린 2 (Ins2)의 발현은 상당히 하향 조절되었고 인슐린 1 (Ins1)의 발현은 너무 낮은 경향이 있었다 (도 16A). 이것은 본 발명자들이 인슐린의 전사 인자를 포함한, 베타-세포 조절자의 발현 수준을 더욱 세심하게 살펴볼 것을 촉진하였다. 도 16B에서 나타낸 것과 같이, Mafa는 R138X 마우스의 샘에서 상당히 상향조절되었지만 본 발명자들의 1.5-배 컷 오프를 지나쳤다. Mafa가 인슐린 전사를 분명히 조절하고 그것의 발현이 보통 호르몬의 발현과 분명히 관련되기 때문에, 그것은 Ins2 유전자 발현의 감소를 설명하지 못한다. 43개의 하향조절된 유전자 중에서, 12개 유전자는 미토콘드리아 단백질이었고 7개는 Oxphos 유전자 그룹에 속하였다 (표 7). 그러므로 본 발명자들은 모든 Oxphos 유전자의 발현 수준을 조사하였고 이들 유전자의 대부분의 발현이 감소한 것에 주지하였다 (표 8, 표 9). 복합체 I, III, 및 V가 주로 유전자 발현의 약 40%의 감소로 영향을 받았고, 이것은 감소된 ATP 생성 능력을 시사하였다.
Figure 112020042500085-pct00001
WT 및 R138X 마우스의 샘에서 Oxphos 유전자 발현 변화의 요약.
복합체 총 유의미하게 조절됨 (p<0.05) % 조절
복합체 I 43 19 44.19
복합체 II 4 1 25.00
복합체 III 10 4 40.00
복합체 IV 19 5 26.32
복합체 V 20 9 45.00
Figure 112020042500085-pct00002
Figure 112020042500085-pct00003
중요하게, 전압-개폐 양자 채널 Hv1 (Hvcn1, 다른 이름 VSOP, HV1)의 발현은 R138X 마우스로부터의 샘에서 상향조절되었다. 이 채널이 Zn2+-조절되고 인슐린 분비 과립에 존재하고, Hvcn1 발현의 상실이 생체내 및 시험관내에서 인슐린 분비를 손상시키기 때문에, 이것은 R138X 마우스에서 관찰된 표현형에는 중요한 것이었다. 예컨대, Zhao et al. (2015) Biochem. Biophys. Res. Commun. 468(4):746-751; Wang et al. (2017) "The Voltage-gated Proton Channel Hv1 Is Required for Insulin Secretion in Pancreatic β cells", bioRxiv 097816, doi.org/10.1101/097816; 및 Qiu et al. (2016) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 113(40):E5962-E5971 (이들은 각각 모든 목적에 대해 그 전문이 본원에 참조로 포함됨)을 참조한다.
토론
이 연구에서, 본 발명자들은 2가지 가장 공통되는 인간 SLC30A8 추정 LOF (p.Arg138*) 중 하나를 모방하는 새로운 Slc30a8 추정 LOF 마우스 모델 (R138X 마우스)을 생성하였다. 예컨대, Flannick et al. (2014) Nat. Genet. 46(4):357-363 (모든 목적에 대해 그 전문이 본원에 참조로 포함됨)을 참조한다. 이들 마우스로부터 얻어진 데이터는 첫 번째로 SLC30A8 추정 LOF 돌연변이가 왜 인간에서 T2D의 발생에 대해 보호성인지를 설명할 수 있다. R138X 돌연변이의 도입은 인슐린 저항성 상태에서 더 높은 인슐린 분비를 허용하는 베타 세포의 수의 증가를 초래하였다. 이들 데이터는 R138X 베타 세포가 그러므로 베타 세포의 실패 및 T2D의 개시를 방지 및/또는 지연시키는 증가된 인슐린 수요를 더 낫게 보상할 수 있음을 나타낸다. 이 모델을 사용하여, 본 발명자들은 R138X 돌연변이의 도입이 고혈당증에 대한 반응으로 50% 더 많은 인슐린의 분비를 초래하는 것을 보여준다. 이들 데이터는 인간에서 T2D로부터의 보호가, 적어도 부분적으로는, 베타 세포가 증강된 인슐린 수요를 보상함으로써 이들 세포의 실패 및 T2D의 개시를 방지 또는 지연시키는 것을 허용하는 인슐린 분비 능력의 증가에 의해 매개되는 것을 시사한다. 그러므로 본 접근법은 인간 T2D 위험을 확인하는 방법 또는 보호성 유전자가 작용하는 메커니즘을 탐색하기 위하여 마우스 유전학을 사용하는 타당성을 입증한다. 본 접근법은 또한 인간에서 T2D의 위험에 영향을 미치는 유전자 변이체의 메커니즘을 탐색하기 위하여 마우스 유전학의 유용성을 강조한다.
8개 이상의 상이한 Slc30a8 녹아웃 마우스 모델이 보고되었다. 예컨대, Lemaire et al. (2009) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106(35):14872-14877; Nicolson et al. (2009) Diabetes 58(9):2070-2083; Tamaki et al. (2013) J. Clin. Invest. 123(10):4513-4524; Pound et al. (2009) Biochem. J. 421(3):371-376; Pound et al. (2012) PLoS One 7(7):e40972; Wijesekara et al. (2010) Diabetologia 53(8):1656-1668; 및 Hardy et al. (2012) Am. J. Physiol. Endocrinol. Metab. 302(9):E1084-E1096 (이들은 각각 모든 목적에 대해 그 전문이 본원에 참조로 포함됨)을 참조한다. 이들 모델은 s vary in 유전자 배경, Slc30a8 표적화 전략, 및 베타-세포-특이적 삭제를 포함한 마우스가 생성될 때 사용된 특이적 Cre-계통에서 다르다. 이들 마우스의 대사 표현형 역시 다르다. 차우 및 고지방식 (HFD)을 받을 때 체중 증가, 글루코스 내성 및 인슐린 분비의 차이가 보고되었다. 예컨대, Rutter et al. (2016) Proc. Nutr. Soc. 75(1):61-72 (모든 목적에 대해 그 전문이 본원에 참조로 포함됨)를 참조한다. 그러나, 모든 공개된 Slc30a8 녹아웃 표현형은 적어도 6개의 출판물에서 관찰된 손상된 글루코스 내성을 포함한 글루코스 제어의 악화를 지적한다. 비슷한 이유로, 본 발명자들은 또한 R138X와 같이, 100% C57BL/6을 배경으로 한 Slc30a8 KO 마우스 계통을 생성하였다. 이 녹아웃 마우스는 손상된 글루코스 내성 (차우 식단의 경우), 더 낮은 글루코스-유도 인슐린 분비 (차우 및 HFD의 경우), 및 손상된 인슐린 제거율 (차우 및 HFD의 경우)을 보여주는 공개된 데이터를 크게 확장하여 표현하였다. 이와 대조적으로, 본 발명자들은 차우 식단을 받은 R138X 마우스에서 글루코스 제어의 악화를 포함하여, 주요 대사 표현형을 관찰하지 못하였다. 녹아웃과 R138X 마우스 계통 사이의 차이는 HFD를 받고 20주 이상 후에 보다 더 분명해졌다. 인슐린 분비 및 베타 세포의 양은 R138X 마우스에서 증가하였지만, Slc30a8 KO 마우스에서는 그렇지 못하였다. 관찰된 표현형의 후기 외관은 베타 세포 증식 및 수의 보상적인 증가는 오히려 HFD 급식의 후기에 일어났다. 그러나, 본 발명자들은 베타 세포의 수가 인슐릴 분비에 변화가 관찰되지 않았을 때 HFD를 받고 10주 후에 이미 달라졌던 가능성을 배제할 수 없다. Hardy 등은 그들의 전체적인 Slc30a8 KO 마우스에서 16주의 HFD 처리 후 베타 세포의 수 및 순환 인슐린의 증가를 관찰하였다. 예컨대, Hardy et al. (2012) Am. J. Physiol. Endocrinol. Metab. 302(9):E1084-E1096 (모든 목적에 대해 그 전문이 본원에 참조로 포함됨)을 참조한다. 그러나, 이것은 야생형 마우스와 비교하여 그들의 KO 마우스에서 뚜렷한 비만, 고혈당증, 및 증강된 인슐린 저항성으로 악화된 글루코스 제어의 결과일 가능성이 가장 높았고, 그 효과는 본 연구에서는 관찰되지 않는다. 중요하게도, Hardy 등이 Slc30a8 KO 마우스에서 프로인슐린 대 인슐린 비율의 증가를 관찰한 한편으로, 본 발명자들은 HFD를 받은 R138X 마우스에서 이 비율의 감소를 관찰하였고, 이것은 베타 세포가 WT 베타 세포보다 개선된 인슐린 프로세싱 및 더 나은 건강상태를 가지는 것을 시사한다. 예컨대, Hardy et al. (2012) Am. J. Physiol. Endocrinol. Metab. 302(9):E1084-E1096 (모든 목적에 대해 그 전문이 본원에 참조로 포함됨)을 참조한다. 흥미롭게도, 프로인슐린 대 인슐린 비율의 개선이 또한 본 발명자들의 Slc30a8 KO 마우스에서 관찰되었고, 이것은 녹아웃 및 R138X 마우스가 모든 대사 측면에서 다르지 않은 것을 시사한다. 높은 프로인슐린 대 인슐린 비율이 인간에서 T2D로의 진전과 관련되기 때문에, 이것은 또한 T2D로부터의 SLC30A8 LOF-매개된 보호에 기여할 수 있다. 예컨대, Kirchhoff et al. (2008) Diabetologia 51(4):597-601; Loopstra-Masters et al. (2011) Diabetologia 54(12):3047-3054; 및 Saad et al. (1990) J. Clin. 단부ocrinol. Metab. 70(5):1247-1253 (이들은 각각 모든 목적에 대해 그 전문이 본원에 참조로 포함됨)을 참조한다.
모든 Slc30a8 KO 표현형이 순환 인슐린에서 변화 또는 감소를 보지 않으며, 이것은 일부 상황에서는 글루코스 내성의 악화와 관련이 있다. 예컨대, Nicolson et al., (2009) Diabetes 58(9):2070-2083; Pound et al. (2009) Biochem. J. 421(3):371-376; 및 Mitchell et al. (2016) Mol. Endocrinol. 30(1):77-91 (이들은 각각 모든 목적에 대해 그 전문이 본원에 참조로 포함됨)을 참조한다. 대조적으로, 시험관내 인슐린 분비의 증가는 3개의 KO 모델로부터의 샘에서 관찰되었다. 예컨대, Nicolson et al., (2009) Diabetes 58(9):2070-2083; Tamaki et al. (2013) J. Clin. Invest. 123(10):4513-4524; 및 Hardy et al. (2012) Am. J. Physiol. Endocrinol. Metab. 302(9):E1084-E1096 (이들은 각각 모든 목적에 대해 그 전문이 본원에 참조로 포함됨)을 참조한다. 본 발명자들은 차우 급식 R138X 마우스에서 글루코스-유도 인슐린 분비를 포함하여, 주요 대사 표현형을 관찰하지 못하였다. 그러나, S961로 도전받았을 때, 이들 마우스는 그들의 WT 대응 마우스보다 훨씬 더 많은 인슐린을 분비할 수 있었다. 이런 인슐린 분비의 증가는 베타 세포 질량의 증가에 부수적인 것이 아니었고 임의의 Slc30a8 KO 모델에서 보고된 적이 없었다.
R138X 마우스의 대사 표현형이 Slc30a8 KO 마우스와 그렇게 많이 다른 이유는 분명하지 않지만, 데이터는 R138X 대립유전자에 대한 잠재적 기능 획득을 시사한다. 현재, 본 발명자들은 남아 있는 mRNA가 절단된 단백질로 번역되는 것을 배제할 수 없기 때문에, R138X 마우스가 Slc30a8 KO 마우스와 유사한지는 분명하지 않다. 본 발명자들은 R138X 마우스의 샘에서 표현형 차이를 쉽게 설명해줄 수 있을 SLC30A8 단백질의 절단된 버전을 검출할 수 없었다. 그러나, RNA는 분명하게 존재하며, 과다발현된 R138X 단백질은 HEK293 세포에서 검출되었고 프로테아좀 억제에 의해 축적되었으며 (도 5), 이것은 앞서 HeLa 세포에서 관찰된 것과는 대조적이다. 예컨대, Flannick et al. (2014) Nat. Genet. 46(4):357-363 (모든 목적에 대해 그 전문이 본원에 참조로 포함됨)을 참조한다. 그러므로, 본 발명자들은 아마도 R138X 마우스로부터의 샘 세포의 하위세트에서 저수준의 단백질의 존재를 배제할 수 없다. R138X 마우스에서 SLC30A8 단백질의 잠재적인 발현과는 무관하게, 다이티존 염색은 R138X 추정 LOF 돌연변이의 도입이 Slc30a8 KO 마우스에서 그것과 일관되게 기술되는 샘 아연 축적의 상실을 초래하였음을 분명하게 나타냈다. 또 다른 가능성은 절단된 Slc30a8 mRNA가, 펩타이드에 대해 더 이상 코딩하지 않는 한편으로, 이제 긴 비코딩 RNA로서 역할을 수행하여 관련된 유전자 (아마도 다른 Slc30a 패밀리 구성원을 포함함)의 전사에 트랜스로 영향을 미친다는 것이다. 예컨대, Batista and Chang (2013) Cell 152(6):1298-1307 (모든 목적에 대해 그 전문이 본원에 참조로 포함됨)을 참조한다.
세포내 유리 Zn2+의 변화는 다양한 이유로 증가된 증식 및/또는 인슐린 분비로 이어질 수 있다. 과잉의 세포내 신호전달 시스템은 포유류 세포에서 유리 Zn2+에 의해 영향을 받으며 이때 세포내 프로테옴의 거의 10%가 이들 이온에 결합할 수 있다. 예컨대, Rutter et al. (2016) Proc. Nutr. Soc. 75(1):61-72 (모든 목적에 대해 그 전문이 본원에 참조로 포함됨)를 참조한다. 비록 유리 Zn2+ 농도가 베타 세포에서 Slc30a8 비활성화에 의해 시토졸에서 전체적으로 저하되는 것으로 보이지만, R138X 베타 세포에서 혈장 막에 가까운 유리 Zn2+의 고도로 국지화된 증가가 수용체 티로신 키나아제 (예컨대 인슐린 또는 IGF1 수용체)에 의한 신호전달을 단백질 티로신 포스파타제를 억제함으로써 증강시킬 것이고, 그로써 세포 성장을 촉진시킨다. 예컨대, Gerber et al. (2014) Diabetologia 57(8):1635-1644 및 Bellomo et al. (2014) Metallomics 6(7):1229-1239 (이들은 각각 모든 목적에 대해 그 전문이 본원에 참조로 포함됨)를 참조한다. 다른 한편으로, 전체적으로 저하된 시토졸 Zn2+ 수준이 세포자멸 속도를, 예를 들어 카스파제와의 상호작용에 의해 감소시키는 것으로 예상된다. 예컨대, Fukamachi et al. (1998) Biochem. Biophys. Res. Commun. 246(2):364-369 (모든 목적에 대해 그 전문이 본원에 참조로 포함됨)를 참조한다.
인슐린 분비는 R138X 마우스에서 전압-개폐 양자 채널 Hvcn1의 상향조절을 통해 상향조절될 수 있다. Hvcn1은 분비 과립에 존재하고 아연 이온에 의해 억제된다. 예컨대, Qiu et al. (2016) Proc. Nat. Acad. Sci. U.S.A. 113(40):E5962-E5971 (모든 목적에 대해 그 전문이 본원에 참조로 포함됨)을 참조한다. 이에 더불어, Hvcn1 KO 마우스는 감소된 인슐린 분비 및 손상된 글루코스 제어를 가진다. Wang et al. (2017) "The Voltage-gated Proton Channel Hv1 Is Required for Insulin Secretion in Pancreatic β Cells", bioRxiv 097816, doi.org/10.1101/097816 (모든 목적에 대해 그 전문이 본원에 참조로 포함됨). R138X 마우스로부터의 샘이 아연 고갈된 것이기 때문에, 당업자는 이 채널의 활성의 증가를 예상할 것이다. 그 외에, 본 발명자들은 R138X 마우스로부터의 샘에서 Hvcn1 전사물의 3배 상향조절을 알 수 있다. 이들 데이터가 인슐린 분비의 증가가 적어도 부분적으로는 Hvcn1에 의해 매개되는 것을 시사하는 한편으로, 추가의 실험은 이런 가설을 증명해야 한다. 또 다른 흥미로운 발견은 R138X 마우스에서 미토콘드리아 유전자 발현의 감소이다. 이것은 ATP 합성이 적절한 인슐린 분비에 필요하기 때문에, 오히려 직관에 어긋난 것으로 보인다. 예컨대, Wiederkehr and Wollheim (2012) Mol. Cell. Endocrinol. 353(1-2):128-137 (모든 목적에 대해 그 전문이 본원에 참조로 포함됨)을 참조한다. 그러나, 최근의 연구는 베타 세포에서 인슐린 분비를 활성화하는 대체 경로를 기술하였다. 예컨대, De Marchi et al. (2017) J. Cell. Sci. 130(11):1929-1939 (모든 목적에 대해 그 전문이 본원에 참조로 포함됨)를 참조한다. 이 경로는 ATP 합성에 무관하고 (올리고마이신-내성), 허용되는 시토졸 Ca2+에 따라 더 작은 미토콘드리아 글루타티온 감소가 수반되며, 미토콘드리아 복합체 II를 활성화함으로써 달성된다. 이것은 Gpx2 발현 (글루타티온 과산화효소 2) (표 7) 및 Oxphos 복합체 II로부터의 한 유전자만이 R138X 마우스에서 감소된 것을 고려하면 흥미로운 과제이다. 따라서, 단백질 키나아제 간 키나아제 B1 (LKB1)의 삭제는 선택적으로 베타 세포에서 뚜렷한 미토콘드리아 결함 및 손상된 Ca2+ 동역학으로 이어지는 한편, 글루코스-자극된 인슐린 분비는 후자의 경로의 상향 조절로 인해 가장 잘 증강되는 것으로 보인다. 예컨대, Swisa et al. (2015) J. Biol. Chem. 290(34):20934-20946 (모든 목적에 대해 그 전문이 본원에 참조로 포함됨)을 참조한다. 호흡 및 인슐린 분비를 조사하는 추가의 실험을 이런 대체 경로가 R138X 마우스로부터의 베타 세포에서 지배적으로 사용되는지의 여부를 조사하기 위해 진행할 수 있다.
베타 세포 수의 복원은 신규한 T2D 약물의 개발을 위한 핵심 전략이다. 이 접근법에 대한 가장 큰 도전 중 하나는 설치류에서 베타 세포 복제를 촉진하는 인자가 종종 인간 베타 세포에서는 그렇게 하는데 실패한다는 것이다. 그러나, 인간 SLC30A8 R138X 돌연변이를 모델화하는 마우스에서의 본 발명자들의 데이터는 베타 세포 수의 증가가 인간에서 일부 SLC30A8 돌연변이의 T2D 보호 효과의 기저에 있는 메커니즘 중 하나라는 것을 시사한다. 그러므로, R138X 마우스에서 베타 세포 영역의 관찰된 확대의 기저에 있는 메커니즘을 이해하는 것이 인간으로 번역될 더 높은 기회를 가진 신규한 치료 표적의 확인으로 이어질 수 있었다.
결론적으로, R138X 마우스로부터의 본 발명자들의 데이터는 첫 번째로 R138X 돌연변이를 포함한 인간이 왜 T2D에 대해 보호되는지에 대한 설명을 제공한다.
예컨대, Flannick et al. (2014) Nat. Genet. 46(4):357-363 (모든 목적에 대해 그 전문이 본원에 참조로 포함됨)을 참조한다. 그러므로 그것은 이런 보호의 기저에 있는 메커니즘을 연구하기 위한 관련 모델이다. 이것은 특히 인슐린 분비의 증가가 T2D에 대항하는 중요한 치료 전략인 점에서 중요하다. 그러므로, R138X 마우스에서 증가된 인슐린 분비의 기저에 있는 메커니즘을 이해하는 것이 신규한 치료 표적의 확인으로 이어질 수 있었다.
작용 메커니즘
본 발명자들은 제2형 당뇨병의 발생으로부터 인간을 보호하는 인간 SLC30A8 LoF 돌연변이 p.Arg138*를 모방하는 새로운 마우스 모델 (R138X)을 생성하였다. 고지방식의 R138X 마우스는 증가된 베타 세포 질량 및 증식과 관련된 증가된 인슐린 분비를 가진다. 대안적으로, 본 발명자들이 S961 (인슐린 수용체 억제제)을 사용하여 고혈당증을 유도할 때, R138X 마우스는 WT 마우스와 비교하여 베타 세포 질량 및 증식 변화와 무관하에 50% 증가된 인슐린 분비를 가진다. 이것은 인슐린 수용체가 R138X 마우스에서의 증식의 증가에 필요한 것을 시사한다. 이에 더불어, 베타 세포에서의 인슐린 수용체는 고지방식을 받은 마우스에서 베타 세포의 증가에 필요한 것으로 나타났다. R138X 마우스가 증가된 인슐린 분비 능력을 가지기 때문에, 더 높은 인슐린이 베타 세포에서 인슐린 수용체에 작용하여 WT 마우스에서보다 더 큰 정도로 증식을 유도할 수 있다. 이것을 조사하기 위하여, 인슐린 경로의 활성화를 고지방식 또는 S961로 처리된 WT 및 R138X 마우스로부터의 췌장에서 p-Akt, p-S6, 및 p-Erk에 대한 조직학을 조사함으로써 조사한다. 이에 더불어, 분리된 샘을 조사하여 그것이 더 높은 p-AKT 및 p-Erk 수준을 가지는지, 그리고 그것이 시험관내에서 더 많이 증식하는지를 결정한다.
방법
동물. 모든 과정을 리제너론 파마슈티칼스 연구소 동물 보호윤리위원회에 의해 승인된 프로토콜에 따라 수행하였다. Slc30a8 R138X 및 녹아웃 마우스 계통을 순수한 C57BL/6NTac 배경에서 VELOCIGENE 기술을 사용하여 만들었다. 예컨대, Valenzuela et al. (2003) Nat. Biotechnol. 21(6):652-659 (모든 목적에 대해 그 전문이 본원에 참조로 포함됨)를 참조한다. 녹아웃 마우스 계통의 생성을 위해, 전체 Slc30a8 코딩 영역을 삭제하고 LacZ 유전자로 대체하였다. 네오마이신 유전자를 자기 삭제 네오마이신 선택 카세트의 사용을 통해 제거하였다. R138X 마우스의 생성을 위해, 엑손 3의 뉴클레오타이드 409를 T로부터 C로 변경하였고, 이것은 아르기닌을 중단 코돈으로 변경시켰다. 돌연변이된 대립유전자는 인트론 3에 삽입된 loxP 부위가 측면에 있는 자기 삭제 네오마이신 선택 카세트를 가져서, 29 bp의 내인성 인트론 3 서열이 삭제된다 (CAGCTGACAGCAAGATTAATGGAAGTACC (SEQ ID NO: 24)). 마우스를 제어된 환경 (12-시간 명/암 사이클, 22±1℃, 60 내지 70% 습도)에서 하우징하고 (케이지당 최대 5마리 마우스) 12 내지 18주령에서 시작하여 차우 식단 (Purina Laboratory 23 설치류 다이어트 5001, LabDiet) 또는 고지방식 (Research Diets, D12492; 칼로리 기준으로 60% 지방)으로 임의대로 급식하였다. 제시된 모든 데이터는 WT 한배새끼와 비교한 것이다.
글루코스 내성 테스트. 마우스를 밤새 (16시간) 금식시킨 후 글루코스 (Sigma)를 2 g/kg 체중으로 구강 위관 영양을 실시하였다. 혈액 샘플을 표시한 시간에 꼬리 정맥으로부터 얻었고 글루코스 수준을 알파Trak2 혈당계 (Abbott)를 사용하여 측정하였다. 인슐린에 대해 턱밑 하 출혈을 글루코스 측정을 간섭하지 않기 위하여 별도의 실험으로 주사 후 0, 15, 및 30분에 실시하였다.
인슐린 내성 테스트. 마우스를 4시간 동안 금식시킨 후 0.75 U/kg (차우 급식) 또는 1.5 U/kg (고지방 급식)의 인간 인슐린 (Eli Lilly)을 복강내 주사하였다. 혈액 샘플을 표시된 시간에 꼬리 정맥으로부터 얻었고 글루코스를 알파Trak2 혈당계 (Abbott)를 사용하여 측정하였다.
혈장 인슐린, 프로인슐린 및 C-펩타이드 측정. 밤새 금식시킨 또는 급식한 동물의 턱밑 하 출혈을 아침에 또는 oGTT 후에 실시하였다. 인슐린을 마우스 인슐린 ELISA (Mercodia)로 분석하였다. 프로인슐린을 마우스 프로인슐린 ELISA (Mercodia)로 분석하였다. C-펩타이드를 마우스 C-펩타이드 ELISA (ALPCO)로 분석하였다. 모든 ELISA를 제조사의 설명서를 따라 수행하였다.
조직학. 췌장을 10% 중성 완충 포르말린 용액에 48시간 동안 고정한 후 파라핀에 삽입하였다. 각 동물로부터의 췌장의 2개 섹션을 α-글루카곤 (REGN745, 사내에서 생성된 α-글루카곤 단클론성 항체) 또는 α-인슐린 (Dako) 항체로 염색하고, 글루카곤 및 인슐린 양성 세포 영역을 Halo 디지털 영상 분석 소프트웨어 (Indica Labs)를 사용하여 측정하였다. 전체 췌장에 대한 비례하는 글루카곤 및 인슐린 양성 영역의 퍼센트를 계산하였다. 슬라이드당 샘 수를 계수하고 전체 췌장 영역에 대해 표준화하였다. 분석을 인슐린-양성 세포의 모든 클러스터를 단일 세포 분해까지 포착하도록 설정하였다. 본 발명자들은 한 단일 세포보다 작은 (<150 μm2; area calculated using a diameter of 약 14 μm의 직경을 사용하여 계산한 영역) 인공물 (예컨대, 파편)을 배제하였다. 형광 염색을 위해, 췌장 섹션을 α-인슐린 (Dako, A0564) 항체와 α-KI67 항체 (R&D)의 조합으로 염색한 후 적절한 2차 항체로 염색하였다. 형광 신호를 현미경 슬라이드 스캐너 (Zeiss Axio Scan.Z1)를 사용하여 검출하였다. 샘 세포 유형을 HALO 이미지 분석을 사용하여 세포핵 형광 모듈 (Indica Labs)을 사용하여 정량화하였다. 전체 췌장과 관련하여 글루카곤- 및 인슐린-양성 영역의 퍼센트를 계산하였다. 이 영역을 기초로 하여, α-세포 질량을 각 동물에 대한 α-세포 영역에 동물의 췌장의 무게를 곱함으로써 계산하였다. 샘 질량을 정량화하기 위하여, 샘 수 및 크기를 섹션상의 인슐린-양성 샘의 수를 계수함으로써 측정하였다. 150 μm보다 큰 모든 염색된 영역을 샘으로서 계수하였다. 샘 수를 샘 질량을 구하기 위해 개별적인 췌장 무게에 의해 곱해진 전체 췌장 영역에 대해 표준화하였다.
RNA 제자리 혼성화. RNA 분석을 위하여, 췌장 조직을 투과하고 마우스 Gcg, Ins2, 및 Slc30A8에 대한 mRNA 프로브의 조합과 제조사의 설명서 (Advanced Cell Diagnostics)를 따라 혼성화하였다. 형광 키트를 사용하여 mRNA 신호를 증폭시켰다. 형광 신호를 현미경 슬라이드 스캐너 (Zeiss Axio Scan.Z1)를 사용하여 검출하였다.
샘 분리 및 다이티존 염색. 마우스 샘은 췌장에 리버라제 TL (Roche, #05401020001)을 사용하여 일반적인 담도를 통해 관류한 후 밀도 구배 분리에 의해 분리하였다. 13분 동안 37℃에서 소화시킨 후, 췌장 용액을 세척하고 400-μm 와아어 메시 스트레이너를 통해 여과하고 샘을 히스토파크 구배 원심분리 (Sigma-Aldrich, #H 1077)에 의해 또는 해부 현미경 하에서 손으로 선택함으로써 분리하였다. 분리한 샘을 10% (v/v) FBS, 10 mM HEPES, 50 μM β-머캡토에탄올, 1.0 mM 피루브산 나트륨, 100 U/mL 페니실린 및 100 μg/mL 스트렙토마이신이 보충된 RPMI-1640 배지 (Gibco)에서 37℃에서 대기 분위기 중의 5% CO2에서 밤새 배양하였다. 최대 50개의 샘을 손으로 선택하여 100 μg/ml 다이티존 용액을 함유하고 있는 새로운 접시에 옮겼다. 샘을 최대 10분 동안 염색하고 다시 현미경 (Zeiss 공초점 현미경)을 위해 PBS 용액으로 옮겼다.
웨스턴 (면역-) 블롯 분석. 샘을 RIPA 용해 완충액에 용해시키고 단백질 농도를 측정하였다. 20 μg의 총 세포 용해물을 SDS/PAGE에 의해 Criterion TGX 4-20% 프리캐스트 겔 (Bio-Rad)을 사용하여 환원 조건 하에서 분해하고 니트로셀룰로오스 막에 옮겼다. 막을 다클론성 α-마우스-SLC30A8 토끼 Ab (Thermo Fisher 주문 제조)로 프로빙하고 향상된 화학발광 검출 시스템을 사용하여 검출하였다. SLC30A8 다클론성 Ab가 마우스 SLC30A8 단백질의 아미노산 29 내지 43에 걸쳐있는 펩타이드에 대해 발생하였다.
R138X 과다발현 및 프로테아좀 억제. 인간 SLC30A8 WT 및 중단 코돈 후 처음 137개 아미노산을 C-말단 myc 태그를 사용하여 클로닝하였다. HEK293 세포 (0.4 x 106 세포/웰)를 6-웰 플레이트에 시딩하였다. 다음날, 세포를 0.1 μg DNA/웰로 Mirus TransIT-TL1을 사용하여 제조사의 설명서를 따라 트랜스펙션하였다. 트랜스펙션 후 2일 후에, DMSO, 프로테아좀 (10 μM MG-132 또는 1 μM 에폭소미신) 또는 리소좀 억제제 (10 μg/ml 클로로퀸 염)을 스파이킹하였다. 세포를 RIPA 완충액에서 6시간 처리 후에 수득하였다. 30 μg의 세포 용해물을 웨스턴 블롯팅에 의해 분석하였다.
qPCR 분석. RT-qPCR 검정당 작동시킬 37.5 나노그램 내지 375 나노그램의 RNA를 SuperScript® VILOTM 마스터 믹스 (ThermoFisher, Cat# 11755500)와 혼합하고 제조사의 설명서에 따라 사이클링하였다. cDNA를 뉴클레아제 유리 물로 마이크로리터당 0.5 나노그램 내지 마이크로리터당 5 나노그램으로 희석하였다. RT-qPCR 검정을 물, 마스터 믹스 (ThermoFisher, Cat #4370074 또는 Bioline, Cat #CSA-01113), 및 20X 검정 믹스를 조합함으로써 제조하였다. 검정 믹스는 형광 표지되고 퀀칭된 프로브 서열 (ThermoFisher, Cat# 351372 또는 LGC BioSearch, Cat# DLO-RFBL-MIX)과 조합된 전방향 및 역방향 프라이머의 상업적으로 이용 가능한 혼합물이었다. 샘플을 3개 한벌로 384-웰 플레이트 (ThermoFisher, Cat# 4343370) 상에서 5 마이크로리터의 희석된 cDNA 및 10 마이크로리터의 적절한 RT-PCR 검정을 각 웰에 피펫팅함으로써 이동하게 하였다. 384-웰 플레이트를 광학적으로 투명한 씰 (Agilent, Cat# 16985-001)로 덮고, 회전시키고, 384-웰 차단 모듈 및 자동화 악세사리 (ThermoFisher, Cat# 4329002)가 달린 ABI 7900HT Fast 실시간 PCR 시스템 상에서 사용된 마스터 믹스의 명세에 따라 40 사이클 동안 판독하였다. Slc30a8 프로브 및 프라이머의 서열은 다음과 같다: 프로브: TCCAAAACTGGGCAGTGAGTTCAACA (SEQ ID NO: 25), 전방향 프라이머: AATTGCAGTGCTGCTTTGC (SEQ ID NO: 26), 역방향 프라이머: AGCTGCGGCTGTTGTTGTC (SEQ ID NO: 27).
RNA 제조. 샘을 상기 기술한 것과 같이 분리하고 37℃에서 밤새 인큐베이션하였다. 다음날, 유전자형당 500개의 샘을 Trizol (Invitrogen)에 한 샘플로서 선택하고 RNA 추출 및 서열분석을 할 때까지 -80℃에서 유지하였다. 5개의 상이한 WT 샘플 및 4개의 상이한 R138X 샘플을 분석하였다. 총 RNA를 모든 샘플로부터 마이크로어레이 총 RNA 분리 키트 (Life Technologies사 제조 Ambion)에 대해 MagMAXTM-96을 사용하여 제조사의 명세를 따라 정제하였다. 게놈 DNA를 상기 열거된 MagMAX 키트 (Life Technologies사 제조 Ambion)로부터 MagMAXTMTurboTMDNase 완충액 및 TURBO DNase를 사용하여 제거하였다. mRNA를 총 RNA로부터 Dynabeads® mRNA 정제 키트 (Invitrogen)를 사용하여 정제하였다. 가닥-특이적 RNA-seq 라이브러리를 KAPA mRNA-Seq 라이브러리 제조 키트 (Kapa Biosystems)를 사용하여 제조하였다. 12-사이클 PCR을 수행하여 라이브러리를 증폭시켰다. 서열분석을 Illumina HiSeq®2500 (Illumina) 상에서 33 사이클로 다중화된 단일-판독 작동에 의해 수행하였다.
RNAseq 판독 지도화 및 차등 발현된 RNA의 통계학적 분석. 미가공 서열 데이터 (BCL 파일)를 Illumina bcl2fastq v2.17을 통해 FASTQ 포맷으로 전환시켰다. 판독을 그것의 바코드를 토대로 암호를 풀었고 판독 품질을 FastQC로 평가하였다. 판독을 마우스 게놈 (NCBI GRCm38)에 대해 두 개의 미스매치를 허용하는 ArrayStudio® 소프트웨어 (OmicSoft®)를 사용하여 지도화하였다. 유전자의 엑손에 대해 지도화된 판독을 유전자 수준에서 합하였다. 차등 발현된 유전자를 DESeq2 포장에 의해 확인하였고 상당히 동요된 유전자를 상향 또는 하향 방향으로 적어도 0.01의 p-값을 가진 1.5 이상의 배수 변화로 정의하였다.
데이터 분석. 데이터를 평균 ± SEM으로서 기록한다. 통계학적 분석을 Prism 6.0 (GraphPad Software)을 사용하여 수행하였다. 모든 파라미터를 언제나 처리가 없는 유전자형과 비교하여 표시된 것과 같이 이원변량분석 (*p) 및 학생 T테스트 (#p)에 의하여 분석하였다; P<0.05의 한계값을 통계학적으로 유의미한 것으로 간주하였다. 이원변량분석에 의한 유전자형간의 상당한 차이를 그래프의 상부에 표시한다. 특정 데이터 지점의 유의미한 차이를 지점 / 그래프의 상부에 표시한다. *p / #p<0.5, **p / ##p<0.01, ***p / ###p<0.001, ****p / ####p<0.0001.
SEQUENCE LISTING <110> Regeneron Pharmaceuticals, Inc. <120> NON-HUMAN ANIMALS COMPRISING SLC30A8 MUTATION AND METHODS OF USE <130> 57766-523060 <150> US 62/584,228 <151> 2017-11-10 <150> US 62/666,337 <151> 2018-05-03 <150> US 62/689,945 <151> 2018-06-26 <160> 27 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 1 cgaggccccc ttccaa 16 <210> 2 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 2 catttgggtg gtatcga 17 <210> 3 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 3 tgcgcaatca gagaatgtta cc 22 <210> 4 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 4 catttgggtg gtattga 17 <210> 5 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 5 tgtgggaatg tgagctctca ac 22 <210> 6 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 6 cagctgacag caagattaat ggaagtacc 29 <210> 7 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence 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aggaggcatg taccactgcc acagtggctc caagcccaca 180 gaaaaggggg cgaatgagta cgcctatgcc aagtggaaac tctgttctgc ttcagcaata 240 tgcttcattt tcatgattgc agaggtcgtg ggtgggcaca ttgctgggag tcttgctgtt 300 gtcacagatg ctgcccacct cttaattgac ctgaccagtt tcctgctcag tctcttctcc 360 ctgtggttgt catcgaagcc tccctctaag cggctgacat ttggatggca ccgagcagag 420 atccttggtg ccctgctctc catcctgtgc atctgggtgg tgactggcgt gctagtgtac 480 ctggcatgtg agcgcctgct gtatcctgat taccagatcc aggcgactgt gatgatcatc 540 gtttccagct gcgcagtggc ggccaacatt gtactaactg tggttttgca ccagagatgc 600 cttggccaca atcacaagga agtacaagcc aatgccagcg tcagagctgc ttttgtgcat 660 gcccttggag atctatttca gagtatcagt gtgctaatta gtgcacttat tatctacttt 720 aagccagagt ataaaatagc cgacccaatc tgcacattca tcttttccat cctggtcttg 780 gccagcacca tcactatctt aaaggacttc tccatcttac tcatggaagg tgtgccaaag 840 agcctgaatt acagtggtgt gaaagagctt attttagcag tcgacggggt gctgtctgtg 900 cacagcctgc acatctggtc tctaacaatg aatcaagtaa ttctctcagc tcatgttgct 960 acagcagcca gccgggacag ccaagtggtt cggagagaaa ttgctaaagc ccttagcaaa 1020 agctttacga tgcactcact caccattcag atggaatctc cagttgacca ggaccccgac 1080 tgccttttct gtgaagaccc ctgtgactag 1110 <210> 22 <211> 1104 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 22 atggagtttc ttgagagaac ttatcttgtg aatgatcaag ccaccaagat gtacgccttc 60 cctctagaca gagaacttcg acagaagcct gtgaataaag atcagtgtcc tggagacagg 120 ccagagcatc cagaggcagg aggcatctat cactgccaca acagcgccaa ggccacaggg 180 aacaggtcga gcaagcaagc gcatgccaag tggagactct gtgctgcttc agcaatatgc 240 ttcatcttta tggtggcaga ggtggtgggt ggacacgttg ctgggagtct ggctatcctc 300 actgatgcgg ctcatctctt aattgacctg actagtttcc tgctcagtct cttttctttg 360 tggttgtcat cgaggccccc ttccaagcgg ctgacatttg ggtggtattg agcagagatc 420 ctcggtgccc tgctgtctgt cctttgcatc tgggtggtga ctggtgtgct gctgtacctt 480 gcctgtgagc gccttttgta tcctgattac cagatccaag caggtatcat gatcactgtt 540 tcaggctgtg cagtggcagc caacattgta ctaactatga ttttgcacca acggaacttt 600 ggctacaacc acaaggatgt acaagctaat gccagtgtcc gagcagcctt tgtgcatgcc 660 ctgggggatg tatttcagag catcagtgtg ctaattagtg ctctcattat ctactttaag 720 cctgactaca aaattgctga tccagtgtgc acatttatct tttccatcct ggttttggcc 780 agcaccgtca tgatcttaaa agacttctcc atcttactca tggaaggtgt tccaaagggc 840 ctgagttaca acagtgtgaa agagatcatc ctcgcagttg atggcgtgat ctccgtgcac 900 agtctacaca tctggtcact gactgtgaac caagtgattc tctctgttca tgttgctaca 960 gctgccagcc aggacagcca gtctgtgcgg acaggaattg ctcaagccct cagcagcttt 1020 gatcttcact ctcttaccat tcagatagaa tctgcagcag accaggaccc cagctgcctt 1080 ctctgcgaag accctcagga ctag 1104 <210> 23 <211> 1110 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 23 atggagtttc ttgaaagaac gtatcttgtg aatgataaag ctgccaagat gtatgctttc 60 acactagaaa gtgtggaact ccaacagaaa ccggtgaata aagatcagtg tcccagagag 120 agaccagagg agctggagtc aggaggcatg taccactgcc acagtggctc caagcccaca 180 gaaaaggggg cgaatgagta cgcctatgcc aagtggaaac tctgttctgc ttcagcaata 240 tgcttcattt tcatgattgc agaggtcgtg ggtgggcaca ttgctgggag tcttgctgtt 300 gtcacagatg ctgcccacct cttaattgac ctgaccagtt tcctgctcag tctcttctcc 360 ctgtggttgt catcgaagcc tccctctaag cggctgacat ttggatggca ctgagcagag 420 atccttggtg ccctgctctc catcctgtgc atctgggtgg tgactggcgt gctagtgtac 480 ctggcatgtg agcgcctgct gtatcctgat taccagatcc aggcgactgt gatgatcatc 540 gtttccagct gcgcagtggc ggccaacatt gtactaactg tggttttgca ccagagatgc 600 cttggccaca atcacaagga agtacaagcc aatgccagcg tcagagctgc ttttgtgcat 660 gcccttggag atctatttca gagtatcagt gtgctaatta gtgcacttat tatctacttt 720 aagccagagt ataaaatagc cgacccaatc tgcacattca tcttttccat cctggtcttg 780 gccagcacca tcactatctt aaaggacttc tccatcttac tcatggaagg tgtgccaaag 840 agcctgaatt acagtggtgt gaaagagctt attttagcag tcgacggggt gctgtctgtg 900 cacagcctgc acatctggtc tctaacaatg aatcaagtaa ttctctcagc tcatgttgct 960 acagcagcca gccgggacag ccaagtggtt cggagagaaa ttgctaaagc ccttagcaaa 1020 agctttacga tgcactcact caccattcag atggaatctc cagttgacca ggaccccgac 1080 tgccttttct gtgaagaccc ctgtgactag 1110 <210> 24 <211> 29 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 24 cagctgacag caagattaat ggaagtacc 29 <210> 25 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 25 tccaaaactg ggcagtgagt tcaaca 26 <210> 26 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 26 aattgcagtg ctgctttgc 19 <210> 27 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 27 agctgcggct gttgttgtc 19

Claims (43)

  1. 게놈이 돌연변이된 Slc30a8 유전자를 포함하는 내인성 Slc30a8 유전자좌를 포함하는 설치류로서, 돌연변이된 Slc30a8 유전자는 Slc30a8 유전자의 제3 엑손의 3' 단부에서 넌센스 돌연변이를 포함하고 돌연변이가 없는 설치류에 비교하여 증강된 인슐린 분비 능력을 가지는 설치류를 초래하고, 상기 설치류는 래트 또는 마우스인, 설치류.
  2. 제1항에 있어서, 증강된 인슐린 분비 능력은 고혈당증에 대한 반응으로 일어나고,
    선택적으로 설치류는 돌연변이가 없는 설치류에 비교하여 인슐린 수용체 억제에 의해 유도된 고혈당증에 대한 반응으로 증가된 인슐린 분비를 가지며, 그리고
    선택적으로 인슐린 수용체 억제에 의해 유도된 고혈당증에 대한 반응으로 증가된 인슐린 분비는 돌연변이가 없는 설치류에 비교하여 증가된 베타 세포 증식 또는 베타 세포 질량과 관련되지 않은 것을 특징으로 하는 설치류.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 증강된 인슐린 분비 능력은 고지방식이 공급될 때에 일어나며,
    선택적으로 설치류는 고지방식이 공급될 때 돌연변이가 없는 설치류에 비교하여 증가된 인슐린 분비를 가지고, 증가된 인슐린 분비는 돌연변이가 없는 설치류에 비교하여 증가된 베타 세포 증식 또는 베타 세포 질량과 관련되며, 그리고
    선택적으로 증가된 베타 세포 증식은 인슐린 수용체-의존성인 것을 특징으로 하는 설치류.
  4. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    (I) 넌센스 돌연변이는 돌연변이된 Slc30a8 유전자에 의해 암호화된 SLC30A8 단백질이 SEQ ID NO: 14와 최적으로 정렬될 때 SEQ ID NO: 14의 R138을 암호화하는 코돈에 상응하는 코돈에 있거나; 및/또는
    (II) 넌센스 돌연변이는 돌연변이된 Slc30a8 유전자의 코딩 서열이 SEQ ID NO: 21과 최적으로 정렬될 때 SEQ ID NO: 21의 잔기 412에 상응하는 위치에 있는
    것을 특징으로 하는 설치류.
  5. 제1항 또는 제2항에 있어서, 돌연변이된 Slc30a8 유전자는 설치류에 대해 내인성인 것을 특징으로 하는 설치류.
  6. 제1항 또는 제2항에 있어서, 설치류는 마우스인 것을 특징으로 하는 설치류.
  7. 제1항 또는 제2항에 있어서, 돌연변이된 Slc30a8 유전자는 SEQ ID NO: 13에 제시된 서열을 포함하는 SLC30A8 단백질을 암호화하거나; 및/또는 돌연변이된 Slc30a8 유전자는 SEQ ID NO: 22에 제시된 코딩 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 설치류.
  8. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    (I) 설치류는 돌연변이가 없는 설치류에 비교하여 감소된 미토콘드리아 유전자 발현을 갖거나; 및/또는
    (II) 설치류는 돌연변이가 없는 설치류에 비교하여 증가된 Hvcn1 발현을 갖거나; 및/또는
    (III) 설치류는 돌연변이가 없는 설치류에 비교하여 고지방식이 아닌 대조군 차우 식단(chow diet)에서 정상적인 글루코스 항상성 및 글루코스-유도 인슐린 분비를 갖거나; 및/또는
    (IV) 설치류는 돌연변이가 없는 설치류에 비교하여 고지방식이 아닌 대조군 차우 식단(chow diet)에서 정상적인 대사 표현형을 갖거나; 및/또는
    (V) 설치류의 샘에서의 Slc30a8 mRNA 발현 수준은 돌연변이가 없는 설치류의 샘에서의 Slc30a8 mRNA 발현 수준의 적어도 25%인
    것을 특징으로 하는 설치류.
  9. 제1항 또는 제2항에 있어서, 설치류는 돌연변이가 없는 설치류에 비교하여 다음의 특징:
    (a) 고지방식이 공급될 때 증가된 글루코스-유도 인슐린 분비;
    (b) 고지방식이 공급될 때 증가된 췌장 베타 세포 증식;
    (c) 고지방식이 공급될 때 증가된 췌장 베타 세포의 수; 및
    (d) 인슐린 수용체의 차단 후 증가된 급식 혈장 인슐린 수준
    중 하나 이상 또는 전부를 갖는 것을 특징으로 하는 설치류.
  10. 제1항 또는 제2항에 있어서, 설치류는 돌연변이가 없는 설치류에 비교하여 다음의 특징:
    (a) 20주 동안 고지방식을 공급받은 후 증가된 순환 인슐린 수준;
    (b) 20주 동안 고지방식을 공급받은 후 증가된 췌장 베타 세포의 수;
    (c) 고지방식이 공급될 때 감소된 프로인슐린-대-인슐린 비율; 및
    (d) 인슐린 수용체의 차단 후 증가된 급식 혈장 인슐린 수준
    중 하나 이상 또는 전부를 갖는 것을 특징으로 하는 설치류.
  11. 제1항 또는 제2항에 있어서, 설치류는 돌연변이에 대하여 이형접합성인 것을 특징으로 하는 설치류.
  12. 제1항 또는 제2항에 있어서, 설치류는 돌연변이에 대하여 동형접합성인 것을 특징으로 하는 설치류.
  13. 제1항 또는 제2항에 있어서, 설치류는 수컷인 것을 특징으로 하는 설치류.
  14. 제1항 또는 제2항에 있어서, 설치류는 암컷인 것을 특징으로 하는 설치류.
  15. 제2형 당뇨병을 개선하거나 악화시키는 활성에 대해 화합물을 스크리닝하는 방법으로서:
    (a) 제1항 또는 제2항의 대상 설치류를 화합물과 접촉시키는 단계; 및
    (b) (I) 화합물과 접촉되지 않은 대조군 설치류와 비교하여 대상 설치류에서 다음: (1) 고지방식이 공급될 때 글루코스-유도 인슐린 분비; (2) 고지방식이 공급될 때 췌장 베타 세포 증식 수준; (3) 고지방식이 공급될 때 췌장 베타 세포의 수; 및 (4) 인슐린 수용체의 차단 후 급식 혈장 인슐린 수준 중 하나 이상을 측정하고, 여기서 대조군 설치류는 대상 설치류와 동일한 Slc30a8 돌연변이를 포함하며,
    이로 인해 제2형 당뇨병을 개선하는 활성이 대조군 설치류와 비교된 대상 설치류에서 다음: (1) 고지방식이 공급될 때 증가된 글루코스-유도 인슐린 분비; (2) 고지방식이 공급될 때 증가된 췌장 베타 세포 증식; (3) 고지방식이 공급될 때 증가된 췌장 베타 세포의 수; 및 (4) 인슐린 수용체의 차단 후 증가된 급식 혈장 인슐린 수준 중 하나 이상에 의해 확인되고, 및
    그로써 제2형 당뇨병을 악화시키는 활성이 대조군 설치류와 비교된 대상 설치류에서 다음: (1) 고지방식이 공급될 때 감소된 글루코스-유도 인슐린 분비; (2) 고지방식이 공급될 때 감소된 췌장 베타 세포 증식; (3) 고지방식이 공급될 때 감소된 췌장 베타 세포의 수; 및 (4) 인슐린 수용체의 차단 후 감소된 급식 혈장 인슐린 수준 중 하나 이상에 의해 확인되는 단계; 또는
    (II) 화합물과 접촉되지 않은 대조군 설치류에 비교하여 대상 설치류에서 다음: (1) 고혈당증에 대한 반응으로 인슐린을 분비하는 능력; (2) 인슐린 제거율; (3) 미토콘드리아 유전자 발현; 및 (4) Hvcn1 발현 중 하나 이상을 측정하고, 여기서 대조군 설치류는 대상 설치류와 동일한 Slc30a8 돌연변이를 포함하며,
    이로 인해 제2형 당뇨병을 개선하는 활성이 대조군 설치류와 비교된 대상 설치류에서 다음: (1) 고혈당증에 대한 반응으로 증가된 인슐린 분비 능력; (2) 증가된 인슐린 제거율; (3) 감소된 미토콘드리아 유전자 발현; 및 (4) 증가된 Hvcn1 발현 중 하나 이상에 의해 확인되고, 및
    그로써 제2형 당뇨병을 악화시키는 활성이 대조군 설치류와 비교된 대상 설치류에서 다음: (1) 고혈당증에 대한 반응으로 감소된 인슐린 분비 능력; (2) 감소된 인슐린 제거율; (3) 증가된 미토콘드리아 유전자 발현; 및 (4) 감소된 Hvcn1 발현 중 하나 이상에 의해 확인되는 단계
    를 포함하는 방법.
  16. 게놈이 돌연변이된 Slc30a8 유전자를 포함하는 내인성 Slc30a8 유전자좌를 포함하는 설치류 세포로서, 돌연변이된 Slc30a8 유전자는 Slc30a8 유전자의 제3 엑손의 3' 단부에서 넌센스 돌연변이를 포함하고, 돌연변이된 Slc30a8 유전자를 포함하는 설치류는 돌연변이가 없는 설치류에 비교하여 증강된 인슐린 분비 능력을 가지고 상기 설치류는 래트 또는 마우스인, 설치류 세포.
  17. 제1항 또는 제2항의 설치류의 제조 방법으로서,
    (I) (a) 만능 래트 또는 마우스 세포를, Slc30a8 유전자의 제3 엑손의 3' 단부에서 넌센스 돌연변이를 포함하는 돌연변이된 Slc30a8 유전자를 포함하는 내인성 Slc30a8 유전자좌를 포함하도록 변형시키는 단계;
    (b) 돌연변이된 Slc30a8 유전자를 포함하는 내인성 Slc30a8 유전자좌를 포함하는 유전자 변형된 만능 래트 또는 마우스 세포를 확인 또는 선택하는 단계;
    (c) 유전자 변형된 만능 래트 또는 마우스 세포를 래트 또는 마우스 숙주 배아에 도입하는 단계; 및
    (d) 래트 또는 마우스 숙주 배아를 래트 또는 마우스 대리 모체에 잉태시키는 단계; 또는
    (II) (a) 래트 또는 마우스 단세포 단계 배아의 게놈을 돌연변이된 Slc30a8 유전자를 포함하는 내인성 Slc30a8 유전자좌를 포함하도록 변형시키는 단계;
    (b) 돌연변이된 Slc30a8 유전자를 포함하는 내인성 Slc30a8 유전자좌를 포함하는 유전자 변형된 래트 또는 마우스 단세포 단계 배아를 선택하는 단계; 및
    (c) 유전자 변형된 래트 또는 마우스 단세포 단계 배아를 래트 또는 마우스 대리 모체에 잉태시키는 단계
    를 포함하는 방법.
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