JP6443811B2 - Mrap2ノックアウト - Google Patents
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Description
本出願は、米国特許法第119条(e)の下で、2013年7月10日に提出された米国仮出願第61/844,666号の恩典を主張するものであり、その内容は参照によりその全文が本明細書に組み入れられる。
本発明は、国立衛生研究所によって授与された助成金第T32DK07699号および第NIHP30-HD18655号の下で連邦政府資金によりなされた。米国政府は、本発明において一定の権利を有する。
本出願は、ASCII形式で電子的に提出され、かつ参照によりその全体として本明細書に組み入れられる配列表を含有する。2014年6月27日に作成された該ASCIIコピーは、068570-078611-PCT_SL.txtと名付けられ、サイズが25,182バイトである。
本明細書において記載される技術は、ノックアウトおよびトランスジェニック動物に関する。
食料または繁殖などの目的のために動物を飼育する場合、付随するコストの大きな要因となるのは、動物を必要なサイズおよび/または重量まで成長させるのにかかる時間である。動物が必要なサイズおよび/または重量に達するのが速ければ速いほど、動物を飼育することに付随するコストは下がり、かつ機能的動物を作製するのに消費される資源は少なくなる。畜産は、急速な成長を助長するように餌、環境、および獣医学的ケアを調節することによって、この時間を最小化しようと努める場合が多い。加えて、動物を市場に出すコストの大部分が動物用飼料であり、したがって「餌効率(動物成長の重量/消費される飼料の重量)」の増加が、家畜のコストを減少させるために求められる。
本明細書において記載されるように、本発明者は、動物におけるMrap2のレベルおよび/または活性を阻害することによって、該動物の重量が、野生型動物と比較して極めて急速な速度で増加することを発見した。実際、該動物は、野生型動物よりも50%程度速く成熟成体サイズに達し得る。さらに、Mrap2活性を欠いている動物は、より少ない食餌に制限された場合、野生型動物とちょうど同じくらいの迅速さで成長し得る。したがって、畜産物をより効率的に産出させるための、Mrap2の改変を有する細胞、それらの細胞を含む動物、およびそのような動物を用いる方法が本明細書において記載される。
本明細書において記載されるように、本発明者らは、Mrap2のノックアウトが、ノックアウト動物が発達中に重量増加の加速を呈するように脳におけるメラノコルチン受容体シグナル伝達を変調させ、野生型動物よりもはるかに急速に成熟重量に達することを発見した。低下したかつ/または検出不能なレベルのMrap2および/またはMrap2活性を有する細胞および動物が、本明細書において提供される。そのような動物は、野生型動物よりも短い時間で、かつしたがってより少ない資源を消費することによって、成熟重量に達すると考えられ、これにより様々な畜産物(例えば、食肉、繊維、ミルク、および他の産物)のより効率的な産出が可能となる。
2. 改変がMrap2コード配列の欠失を含む、パラグラフ1の細胞。
3. 改変がMrap2遺伝子のエクソン3の欠失を含む、パラグラフ1〜2のいずれか一つの細胞。
4. 改変がMrap2の膜貫通ドメインの欠失を含む、パラグラフ1〜3のいずれか一つの細胞。
5. 改変がMrap2の細胞内ドメインの欠失を含む、パラグラフ1〜4のいずれか一つの細胞。
6. 改変が、SEQ ID NO: 1内の少なくとも1個のアミノ酸の変異を含む、パラグラフ1〜5のいずれか一つの細胞。
7. 改変に関してヘテロ接合性である、パラグラフ1〜6のいずれか一つの細胞。
8. 改変に関してホモ接合性である、パラグラフ1〜6のいずれか一つの細胞。
9. 前記非ヒト哺乳動物細胞が、ブタ、ウシ、ヒツジ、ウサギ、およびヤギからなる群より選択される種のものである、パラグラフ1〜8のいずれか一つの細胞。
10. 改変がCRISPRヌクレアーゼ、TALENヌクレアーゼ、またはZFNヌクレアーゼの作用によって生じる、パラグラフ1〜9のいずれか一つの細胞。
11. 改変がリコンビナーゼの作用によって生じる、パラグラフ1〜9のいずれか一つの細胞。
12. リコンビナーゼがcreリコンビナーゼである、パラグラフ11の細胞。
13. リコンビナーゼが組織特異的プロモーターの制御下にある、パラグラフ11〜12のいずれか一つの細胞。
14. プロモーターがニューロンまたは脳組織に特異的である、パラグラフ13の細胞。
15. プロモーターがSim1プロモーターである、パラグラフ14の細胞。
16. パラグラフ1〜15のいずれか一つの細胞を含む、非ヒト哺乳動物。
17. パラグラフ1〜16のいずれか一つの細胞からなる、非ヒト哺乳動物。
18. Mrap2遺伝子の改変を含むノックアウト非ヒト哺乳動物であって、検出可能なレベルの機能的Mrap2を発現しない、ノックアウト非ヒト哺乳動物。
19. 改変がMrap2コード配列の欠失を含む、パラグラフ18の哺乳動物。
20. 改変がMrap2遺伝子のエクソン3の欠失を含む、パラグラフ18〜19のいずれか一つの哺乳動物。
21. 改変がMrap2の膜貫通ドメインの欠失を含む、パラグラフ18〜20のいずれか一つの哺乳動物。
22. 改変がMrap2の細胞内ドメインの欠失を含む、パラグラフ18〜21のいずれか一つの哺乳動物。
23. 改変が、SEQ ID NO: 1内の少なくとも1個のアミノ酸の変異を含む、パラグラフ18〜22のいずれか一つの哺乳動物。
24. 改変に関してヘテロ接合性である、パラグラフ18〜23のいずれか一つの哺乳動物。
25. 改変に関してホモ接合性である、パラグラフ18〜23のいずれか一つの哺乳動物。
26. 前記非ヒト哺乳動物が、ブタ、ウシ、ヒツジ、ウサギ、およびヤギからなる群より選択される種のものである、パラグラフ18〜25のいずれか一つの哺乳動物。
27. 以下の工程を含む、屠体の使用のための哺乳動物を作製する方法:
パラグラフ16〜26のいずれか一つの哺乳動物に、種に適した飼料を与える工程;
該哺乳動物を、使用のために所望されるサイズに達した時点で屠殺する工程。
28. パラグラフ16〜26のいずれか一つの哺乳動物が、野生型哺乳動物よりも80%程度早期に屠殺される、パラグラフ28の方法。
29. パラグラフ16〜26のいずれか一つの哺乳動物が、野生型哺乳動物よりも50%程度早期に屠殺される、パラグラフ27の方法。
30. 哺乳動物に、実質的に随時餌を与える、パラグラフ27〜29のいずれか一つの方法。
31. 哺乳動物がブタである、パラグラフ27〜30のいずれか一つの方法。
32. 哺乳動物が約75〜約125日齢で屠殺される、パラグラフ31の方法。
33. 哺乳動物に、制限されたレベルの飼料を与える、パラグラフ27の方法。
34. 制限されたレベルの飼料が、野生型哺乳動物に与えるレベルの約60%〜約95%である、パラグラフ33の方法。
35. 制限されたレベルの飼料が、野生型哺乳動物に与えるレベルの約80%〜約95%である、パラグラフ33の方法。
36. 哺乳動物がブタである、パラグラフ33〜35のいずれか一つの方法。
メラノコルチン受容体付属タンパク質(MRAP)は、インビトロでメラノコルチン受容体のシグナル伝達を変調させる。脳で発現するメラノコルチン2受容体付属タンパク質2(MRAP2)の生理学的役割を調べるために、どちらも若齢で重度の肥満を発生させる、Mrap2の全身のおよび脳特異的な的を絞った欠失を有するマウスを特徴付けした。Mrap2は、哺乳動物肥満に先に関わるタンパク質であるメラノコルチン4受容体(Mc4r)と直接相互作用し、かつそれは、セカンドメッセンジャーであるサイクリックAMPのMc4rを介した生成を増強し、Mc4rシグナル伝達の変更が、Mrap2破壊と肥満との間の関連性の根底にある1つのメカニズムであり得ることを示唆している。重度の早期発症型肥満を有するヒトの研究において、MRAP2の4種の希少な潜在的な病因性遺伝子変種が見出され、該遺伝子が、ヒトにおける体重調節にも寄与し得ることを示唆した。
*対象の性別(男性[M]、女性[F])/年齢(年)/BMI(kg/m2)/SDS(標準偏差スコア)
**MAF(マイナー対立遺伝子頻度、NHLBIエクソーム変種サーバーhttp://evs.gs.washington.edu/EVS/)
***Polyphen(http://genetics.bwh.harvard.edu/pph2/)
動物
別様に注記されていない限り、0700に点灯される12時間:12時間の明:暗サイクルで、22℃でマウスを収容した。マウスに、標準的齧歯類固形飼料(Isopro RMH 3000、PMI Nutrition International, St. Louis, MO)または高脂肪固形飼料(D12451、Research Diets, New Brunswick, NJ)のいずれかを給餌した。随時の飼料摂取量は、個々に収容されたマウスでは、翌日ケージ床にこぼれている飼料を計算しつつ、吊るされた飼料用ビン内の飼料間での重量の差として、最高55日間毎日、または群で収容されたマウス(同じ性別の4匹/ケージ)では4日間にわたってのいずれかで、測定した。個々に収容されたマウスのペアフィードに関しては、野生型マウスによって毎日消費される飼料の平均量を、翌日同じ性別の実験用遺伝子型に与えた。飼料摂取量を測定するのと同時に体重を測定した。制限給餌に関しては、野生型マウスによって毎日消費される飼料の平均量より10〜15%少ない量を、翌日同じ性別の実験用遺伝子型に与えて、2群間で同じ体重を維持した。飼料摂取量に対するメラノタンII(MTII:アセチル-(Nle4, Asp5, D-Phe7, Lys10)-シクロ-□-MSH(4-10)酢酸アミド塩、Bachem Americas, Torrance, CA)の効果を、記載されているように(13)、個々に収容されたマウスにおいて行った。1800に、飼料をマウスから取り去った。1830に、生理食塩水またはMTII(2μg/g体重)を腹腔内注射によって投与した。1900に、事前に計量した飼料を提供し、かつ2030に再計量した。(エネルギー測定のための)糞便を、個々に収容されたマウスのケージ床から24時間の期間にわたって回収し、かつ糞便重量が安定するまで22℃で16〜24時間凍結乾燥させた。糞便および固形飼料のエネルギーを、2つの別個の群の動物および研究室(アーカンソー大学およびノースカロライナ州立大学)において、Parr断熱熱量計(14)を用いて測定し、同一の結果を有した。代謝ケージ内で個々に収容されたマウスから、(カテコールアミン測定のための)尿を、ドライアイス中で24時間の期間にわたって冷却されたチューブ内に回収した。1900から0700に、グルコース(2g/kg体重)の腹腔内注射に対する応答を、臨床用血糖測定器(glucometer)を用いて尾部静脈血を測定することによって、12時間の断食後の朝に実施した。4℃に曝露後の意識のあるマウスにおいて1分間肛門を越えて1cm挿入される携帯型直腸プローブ(シリーズ500プローブを有するYSIモデル43遠隔温度計、Yellow Springs Instrument Co., Yellow Springs, OH)、または22℃に曝露中の体温日周期リズムを測定する、皮下に埋め込まれたマイクロチップ応答装置(DAS-5002、BioMedic Data Systems, Seaford, DE)のいずれかを用いて、深部体温を測定した。総エネルギー消費量および呼吸交換比率を、Oxymaxの包括的実験動物モニタリングシステム(CLAMS、Columbus Instruments, Columbus, OH)を用いた間接熱量測定法によって、随時のまたは飼料制限されたマウスのいずれかにおいて測定した。24時間の順応期間の次に、熱量測定ケージにおける48時間の測定(17分間に1回のサンプル採取)を行い、光フォトセル回路の遮断の割合によって、自発運動活性も測定した(1分間に1回のサンプル採取)。除脂肪量および脂肪量を、二重エネルギーX線吸収測定法(DEXA、Lunar PIXImus Densitometer, Fitchburg, WI)によって測定した。静脈切開術を、麻酔なしの後眼窩の静脈穿刺によって実施し、マウスケージに触れることから静脈切開術までの間隔は60秒未満であった。血中コルチコステロンの日周期性およびストレス応答性を、高脂肪の食餌を給餌されたマウスにおいて、1900、0800における逐次的静脈切開術によって、および0830における30分間の拘束ストレス後に実施した。すべてのマウスプロトコールは、ボストン小児病院(Boston Children's Hospital)の動物実験委員会によって承認された。
一般的なターゲティングベクターおよび組換え工学(recombineering)を用いて(15、16)、Mrap2-/-およびMrap2flox/floxマウスの両方を作製した。必要とされる全プラスミド(PL253、PL452、およびPL451)、および組換え誘導性(recombinogenic)細菌系統(EL350)を、David Conner(ハーバード大学医学大学院遺伝学部門)から入手した。DH10B内にMrap2(アクセッション番号XM_147017、NM_001101482によって置き換えられている)を含有する129Sv BACクローン(bMQ-392015)をサンガー研究所(Sanger Institute)(http://www.sanger.ac.uk/)から入手した。Mrap2ゲノム領域を読み出すPL253に対するミニアーム、上流へのLoxP挿入のためのPL452に対するミニアーム、および下流へのFRT-Neo-FRT-LoxP挿入のためのPL451に対するミニアームを創出するように、プライマーを設計した。最終的なターゲティングベクターをNotIで線状化し、129Sv ES細胞内にエレクトロポレーションし、かつG418(Invitrogen, Carlsbad, CA)で選択した。G418耐性ES細胞株を単離し、かつLA Tag(商標)(TAKARA, Otsu, Japan)、それに加えて5'および3'末端の両方における、外側のMrap2ゲノムプライマーおよび内側のベクタープライマーを用いたロングレンジPCRによって解析して、適正なMrap2ゲノム遺伝子座内への構築物の正しい5'および3'組み込みをDNA配列解析によって確認した。Mrap2+/- ES細胞を作製するために、クローンにCMV-CreをコードするpOG231をトランスフェクトした。Mrap2+/flox ES細胞を作製するために、クローンにpCAGGS-Flpeをトランスフェクトした。検証されたES細胞を核型分析し、かつC57BL/6偽妊娠雌マウスに外科的に移植した。雄のキメラ動物を入手し、かつ129S6/SvEvTac雌マウス(Taconic, Hudson, NY)と交配した。F1ヘテロ接合性雄マウスをF1ヘテロ接合性雌マウスと交配して、純粋な129バックグラウンドのF2コロニーを作製した。次いで、これらのマウスを繁殖させて、後続の研究のための、野生型(Mrap2+/+)、ヘテロ接合性(Mrap2+/-)、およびヌル(Mrap2-/-)マウスを1:2:1の予想される頻度で作製した。また、Mrap2ヌル対立遺伝子を、C57BL/6J(Jackson Laboratories, Bar Harbor, ME)バックグラウンドに対して10世代戻し交配した。Mrap2ヌルマウスは、正常な生殖能を有する。
Mrap2flox/floxマウスをSim1CreBACマウス(006451、Jackson Laboratories, Bar Harbor, ME)と交配させて、Sim1CreBAC::Mrap2f/fマウスを作製した。これらのマウスを、Creを介した組換えによってtdTomato発現が誘導されて脳におけるSim1-Cre発現をマッピングする、R26flox-終止-tdTomatoレポーターマウス(007576、Jackson Laboratories, Bar Harbor, ME)に対して繁殖させた。ゲノムDNAについてのMrap2特異的PCR、ならびに頭頂皮質、視床下部、および脳幹におけるRNAについてのRT-PCRによって、脳におけるMrap2エクソン3の部位特異的欠失も査定した(表2)。Mrap2flox/floxおよびSim1CreBAC::Mrap2f/f同胞の体重および飼料摂取量を、35〜89日齢に毎日測定した。70日齢までマウスに随時給餌し、そこで、Sim1CreBAC::Mrap2f/fマウスの半分を、随時給餌されたMrap2flox/floxマウスの飼料摂取量にペアフィードされるように切り替えた。
Mc4rヌルマウス(006414、混合型C57BL/6-129バックグラウンド、Jackson Laboratories, Bar Harbor, ME)とMrap2ヌルマウスとを交配させて、両遺伝子のノックアウトのヘテロ接合性およびホモ接合性の組み合わせを有するマウスを創出した。上記で記載されるように、同腹の同胞において、体重を28〜84日齢まで毎日測定した。
組織を採取し、かつ4%パラホルムアルデヒド中に漬けた。パラフィン包埋した組織の切片(5〜7μm)を切り取り、かつヘマトキシリンおよびエオシンで染色した。Nikon Eclipse 800(商標)顕微鏡を用いて、画像を撮影した。所定の組織の全画像を、その後操作することなく、同じ倍率および露光条件で記録した。
TRIZOL(商標)試薬(Invitrogen, Carlsbad, CA)を用いて、およそ50mgの組織/細胞からトータルRNAを単離した。RNAサンプルをDNase(6.8 Kunitz unit/サンプル)(Qiagen, Valencia, CA)で処理してゲノムDNA混入を取り除き、かつメーカーのプロトコールに従ってRNeasy(商標)Mini kit(Qiagen)を用いて精製した。精製されたRNAサンプルを、iScript(商標)cDNA Synthesis kit(Biorad, Hercules, CA)を用いた逆転写に供した。従来的RT-PCRに関して、50ngのRNAと同等量のcDNAを、94℃2分間、(94℃10秒間、60℃30秒間)×35サイクル、72℃7分間というプログラムに従って、遺伝子特異的プライマーセットを用いて35サイクルでPCR増幅した。PCR産物を、エチジウムブロマイドで染色された2.0%アガロースゲルで電気泳動した。同じ遺伝子特異的プライマーセットを用い、かつiQ SYBR green Supermix(Biorad)を用いて、95℃3分間、(95℃10秒間、60℃40秒間)×45サイクルというプログラムおよびΔΔCT法(17)に従って、リアルタイムqPCRを行った。遺伝子特異的プライマーセットは、表4に挙げられている。
組織切片(10μm)をSuperFrost(商標)スライド(Fisher Scientific, Pittsburgh, PA)上に融解-マウントさせ、かつ-20℃で保存した。ハイブリダイゼーション前に、切片を、リン酸緩衝生理食塩水(PBS)中4%パラホルムアルデヒド中で氷上15分間固定した。インサイチューハイブリダイゼーション(18)のための521bpのMc4r鋳型プラスミド、およびcRNAを35S-UTP(Perkin Elmer, Waltham, MA)で標識した。Mrap2プローブ鋳型に関して、443bpのMrap2 cDNA PCRフラグメント(表S1)をPCRII TOPO(商標)(Invitrogen, Carlsbad, CA)内にクローニングし、かつcRNAアンチセンスプローブを、メーカーのプロトコールに従ってDIG RNA Labeling Mix(商標)(Roche)およびT7 RNAポリメラーゼ(Roche)を用いて、ジゴキシゲニン(DIG)で標識した。cRNAプローブを90℃で3分間変性させた後に、50%脱イオン化ホルムアミド、10%硫酸デキストラン、0.5M NaCl、1×デンハルト液、10mM Tris(pH8)、1mM EDTA(pH8)、500μg/ml酵母tRNA、10mM DTTを含有するハイブリダイゼーション溶液に添加した。切片を、2×SSC(0.3M塩化ナトリウム、0.03Mクエン酸ナトリウム)で2分間、0.1Mトリエタノールアミン(TEA)で2分間、0.1M TEA中0.25%無水酢酸で10分間、および2×SSCで2分間、順々に、すべて室温(RT)で前処理した。切片を漸増濃度のエタノールで脱水し、かつクロロホルム中で5分間の脱脂に供した。切片を95%エタノール中で2分間リンスし、かつ空気乾燥させた。およそ150μlのハイブリダイゼーション溶液を切片上に広げ、かつ65℃で一晩インキュベートした。ハイブリダイゼーション後、切片を、22℃で15分間2×SSC/1mMジチオスレイトール(DTT)中に2回浸し、続いて37℃で30分間RNase消化溶液(20μg/ml RNAase A(Roche)、0.5M NaCl、10mM Tris (pH8)、および1mM EDTA)中に浸した。切片を、10分間22℃の2×SSC/1mM DTTで、10分間 RTの0.5×SSC/1mM DTTで3回、30分間65℃の0.5×SSC/1mM DTTで、そして2分間22℃の2×SSCで、洗浄した。切片を、ブロッキング溶液(2×SSC、2%正常ヒツジ血清、0.05% Triton X-100)中にて22℃で2時間インキュベートし、GB1バッファー(100mM Tris-HCl、pH7.5、150mM NaCl)中で5分間2回リンスし、かつ抗DIG-アルカリホスファターゼ抗体溶液(100mM Tris-HCl、pH7.5、150mM NaCl、1%正常ヒツジ血清、0.3% Triton X-100、抗DIG-アルカリホスファターゼ、Roche, Indianapolis, IN)中で一晩インキュベートした。切片を、GB1で10分間、GB3(100mM Tris-HCl、pH9.5、100mM NaCl、50mM MgCl2-6H2O)で10分間洗浄し、かつ250mlのGB3中レバミゾール溶液(250mg塩酸レバミゾール(Sigma, St. Louis, MO))中で5分間インキュベートした。7.5mlのGB3、2.5mlのレバミゾール溶液、33.8mlの100mg/mlニトロブルーテトラゾリウム(NBT)クロライド溶液(Roche)、および35mlの50mg/ml 5-ブロモ-4-クロロ-3-インドリル-ホスフェート(BCIP)溶液(Roche)を混合することによって、色素原(chromagen)溶液を調製した。切片を、アルミホイルで包んだガラス製コプリンジャー中の色素原溶液中に48時間浸した。10mM Tris-HCl、pH8.0、1mM EDTA、pH8.0で2回、および1×PBS中4% PFA、および蒸留水でリンスすることによって、呈色反応を止めた。切片を完全に空気乾燥させ、酢酸アミル中2% Parlodion(SPI Supplies, West Chester, PA)でコーティングし、かつ空気乾燥させた。切片を、蒸留水で1:1に希釈した事前に温めた銀乳剤NTB2(Kodak, Rochester, NY)中に42℃で浸漬した。浸漬しかつ空気乾燥させた切片を、アルミホイルで包んだスライド用ボックス内に置き、かつ4℃で1ヶ月間保存した。現像液D-19(Kodak, Rochester, NY)中にスライドを4分間浸し、蒸留水で10秒間リンスし、かつProfessional Fixer(Kodak)で5分間固定することによって、切片を現像した。切片を蒸留水でリンスし、乾燥させ、かつカバースリップで覆った。
レプチンおよびインスリンを、メーカーのプロトコールを用いて、ELISA(Crystal Chem, Downers Grove, IL)によって測定した。コルチコステロンを、放射免疫アッセイ(MP Biomedicals, Santa Ana, CA)によって測定した。尿およびノルエピネフリンを、C-18逆相カラム、それに続く電気化学的検出を用いたHPLCによって測定した。
CHO細胞(ATCC, Manassas, VA)を、10%ウシ胎仔血清および1%ペニシリン/ストレプトマイシンを補充したF12培地中で成長させた。プラスミド(Mrap2-pCDNA-Myc-HisおよびMc4r-pEGFP-N1)を、FuGENE 6(商標)(Promega, Madison, WI)を用いた一過性トランスフェクションによってCHO細胞内に導入した。トランスフェクションの24時間後に、細胞をリン酸緩衝生理食塩水中で洗浄し、かつそれらをRIPAバッファー(40mM Hepes pH7.4、2mM EDTA、10mMピロリン酸ナトリウム、10mMグリセロリン酸ナトリウム、1%デオキシコール酸ナトリウム、0.3% CHAPS、0.1% SDS、それとともにプロテアーゼ阻害剤)中で超音波処理することによって溶解物を調製した。免疫沈降のために、溶解物を抗GFP(290、Abcam, Cambridge, MA)または抗Myc(9106、Abcam, Cambridge, MA)抗体とともに4℃で一晩インキュベートした。プロテインA Sepharoseビーズ(CL-4B17-0963-03、GE Healthcare Biosciences, Pittsburgh, PA)を添加し、かつ4℃で2時間インキュベートした。ビーズを高塩(150mM NaCl)溶解バッファーで洗浄し、上清を取り去り、かつビーズをSDSローディングバッファー(Laemmle)中に再懸濁した。Mycエピトープを検出するために、サンプルを100℃で5分間加熱した。Mc4r-GFPを検出するためには、サンプルを加熱しなかった。タンパク質をSDS-PAGEによって分解した。ウェスタンブロッティングを、抗GFPまたは抗Myc一次抗体、およびHRP連結型プロテインA二次抗体(NA9120、GE Healthcare Biosciences, Pittsburgh, PA)を用いて実施した。
マウスMrap2およびMc4rのコード配列を、脳cDNA(Mrap2)またはゲノムDNA(Mc4r)のPCRによって単離し(表S4)、TOPO-pCRII(商標)(Invitrogen, Carlsbad, CA)内にサブクローニングし、配列を確かめ、かつpRC/CMV(Invitrogen, Carlsbad, CA)内にライゲーションした。Mrap2-/-マウスの産物と同一であるMrap2delE3も創出し、かつpRC/CMV内にライゲーションした。6:1比のMrap2:Mc4r DNA(3μg Mrap2:0.5μg Mc4r)を、20μLのFugene HD(商標)(Promega)を用いて、1μgのpCRE-Luc(Clontech, Mountain View, CA)および0.5μgのpRL-TK(ウミシイタケルシフェラーゼ、Promega, Madison, WI)とともに、60mmディッシュにおける50万個のCHO細胞(ATCC, Manassas, VA)にトランスフェクトした。翌日、トランスフェクトされた細胞(12万個の細胞/ウェル)を12ウェルプレートに播種した。24時間後、血清飢餓の7時間後に、細胞を0〜10nMのα-メラニン細胞刺激ホルモン(αMSH、M4135-1MG、Sigma, St. Louis, MO)で5時間処理し、続いてルシフェラーゼアッセイを行った。
HEK293細胞(ECACC、DS Pharma Biomedical, Osaka, Japan)に、何もなし、空ベクター、Mrap2、またはMrap2delE3発現構築物(表4)をトランスフェクトし、続いて、Mrap2 mRNAおよび18S rRNAのRT-PCR(図1Aにおいて用いられた同じMrap2特異的RTPCRプライマーを用いた)、または、アミノ末端(アミノ酸
)に向けられた抗マウスMrap23〜12マウスモノクローナル抗体(Mrap2 mAb-NH2)もしくはカルボキシル末端(アミノ酸
)に向けられた抗ラットMrap2189〜204ウサギポリクローナル抗体(Mrap2 rAb-COOH)のいずれかを用いた(7)、Mrap2タンパク質のウェスタンブロッティングを行った。次いで、ウェスタンブロットを剥離し、かつ1:5,000希釈の抗βアクチン抗体(Sigma、A1978)を用いて再検出した。
肥満の遺伝学研究(GOOS)(11)プロトコールは、アングリアおよびオックスフォードの多領域倫理委員会によって承認された。各対象または親(<16歳の子ども)は、書面によるインフォームドコンセントを提供した(未成年者自身から口頭での同意を得た)。臨床研究は、ヘルシンキ宣言の原則に従って行われた。スウェーデン人肥満児コホートは以前に記載されており(12)、カロリンスカ大学病院およびカロリンスカ研究所のNational Childhood Obesity Centreに紹介された376人の肥満の子どもおよび若者(年齢6〜21歳、BMI>30kg/m2、または+3 SDS)、ならびに民族性および社会経済的地位に関して肥満群と一致する、ストックホルム周辺の17箇所の中等学校から募集され、かつ彼らの保健室の先生(school nurse)によって参加することを要請された376人の肥満でない若者(年齢15〜20歳、BMI 20〜25kg/m2)の群からなる。研究はストックホルムの地域倫理委員会によって承認され、かつすべての対象からインフォームドコンセントを得た。MRAP2、および重度の肥満に関連した他の9種の遺伝子(LEP、LEPR、POMC、MC4R、PC1/3、BDNF、TRKB、SIM1、およびSH2B1)に対するDNA配列解析を、ジデオキシヌクレオチド(サンガー)方法論を用いて実施した。
2つまたはそれを上回る数のサンプルの比較に適当であるように、それぞれスチューデントt検定によって、またはANOVAに引き続くボンフェローニのポストホック検定によって、データを解析した(Statview 5.0, SAS Institute Inc.)。エネルギー消費量に関しては、それぞれの性別のMrap2+/+およびMrap2-/-マウスにおける総エネルギー消費量に対する体重の効果を、共分散の解析を用いて比較した(SAS, SAS Institute Inc.)(9)。すべてのデータは平均±SEMとして示されており、p<0.05は統計的に有意と見なされる。
Claims (34)
- 改変を有するMrap2遺伝子を含む非ヒト哺乳動物の幹細胞または生殖系列細胞であって、検出可能なレベルの機能的Mrap2を発現しない、非ヒト哺乳動物の幹細胞または生殖系列細胞。
- 改変がMrap2コード配列の欠失を含む、請求項1記載の細胞。
- 改変がMrap2遺伝子のエクソン3の欠失を含む、請求項1〜2のいずれか一項記載の細胞。
- 改変がMrap2の膜貫通ドメインの欠失を含む、請求項1〜3のいずれか一項記載の細胞。
- 改変がMrap2の細胞内ドメインの欠失を含む、請求項1〜4のいずれか一項記載の細胞。
- 改変に関してヘテロ接合性である、請求項1〜5のいずれか一項記載の細胞。
- 改変に関してホモ接合性である、請求項1〜5のいずれか一項記載の細胞。
- 前記非ヒト哺乳動物細胞が、ブタ、ウシ、ヒツジ、ウサギ、およびヤギからなる群より選択される種のものである、請求項1記載の細胞。
- 改変がCRISPRヌクレアーゼ、TALENヌクレアーゼ、またはZFNヌクレアーゼの作用によって生じる、請求項1〜8のいずれか一項記載の細胞。
- 改変がリコンビナーゼの作用によって生じる、請求項1〜8のいずれか一項記載の細胞。
- リコンビナーゼがcreリコンビナーゼである、請求項10記載の細胞。
- リコンビナーゼが組織特異的プロモーターの制御下にある、請求項10〜11のいずれか一項記載の細胞。
- プロモーターがニューロンまたは脳組織に特異的である、請求項12記載の細胞。
- プロモーターがSim1プロモーターである、請求項13記載の細胞。
- 請求項1〜14のいずれか一項記載の細胞を含む、非ヒト哺乳動物。
- 請求項1〜14のいずれか一項記載の細胞からなる、非ヒト哺乳動物。
- 改変を有するMrap2遺伝子を含むノックアウト非ヒト哺乳動物であって、検出可能なレベルの機能的Mrap2を発現しない、ノックアウト非ヒト哺乳動物。
- 改変がMrap2コード配列の欠失を含む、請求項17記載の哺乳動物。
- 改変がMrap2遺伝子のエクソン3の欠失を含む、請求項17〜18のいずれか一項記載の哺乳動物。
- 改変がMrap2の膜貫通ドメインの欠失を含む、請求項17〜19のいずれか一項記載の哺乳動物。
- 改変がMrap2の細胞内ドメインの欠失を含む、請求項17〜20のいずれか一項記載の哺乳動物。
- 改変に関してヘテロ接合性である、請求項17〜21のいずれか一項記載の哺乳動物。
- 改変に関してホモ接合性である、請求項17〜21のいずれか一項記載の哺乳動物。
- 前記非ヒト哺乳動物が、ブタ、ウシ、ヒツジ、ウサギ、およびヤギからなる群より選択される種のものである、請求項17〜23のいずれか一項記載の哺乳動物。
- 以下の工程を含む、屠体の使用のための哺乳動物を作製する方法:
請求項15〜24のいずれか一項記載の哺乳動物に、種に適した飼料を与える工程;
該哺乳動物を、使用のために所望されるサイズに達した時点で屠殺する工程。 - 請求項15〜24のいずれか一項記載の哺乳動物が、野生型哺乳動物よりも少なくとも80%早期に屠殺される、請求項25記載の方法。
- 請求項15〜24のいずれか一項記載の哺乳動物が、野生型哺乳動物よりも少なくとも50%早期に屠殺される、請求項25記載の方法。
- 哺乳動物に、随時餌を与える、請求項25〜27のいずれか一項記載の方法。
- 哺乳動物がブタである、請求項25〜28のいずれか一項記載の方法。
- 哺乳動物が75〜125日齢で屠殺される、請求項29記載の方法。
- 哺乳動物に、制限されたレベルの飼料を与える、請求項25記載の方法。
- 制限されたレベルの飼料が、野生型哺乳動物に与えるレベルの60%〜95%である、請求項31記載の方法。
- 制限されたレベルの飼料が、野生型哺乳動物に与えるレベルの80%〜95%である、請求項31記載の方法。
- 哺乳動物がブタである、請求項31〜33のいずれか一項記載の方法。
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