JP2002543767A - 生殖細胞と体細胞が４ｅ−ｂｐ１をコードするｄｎａにノックアウト突然変異を含有する非ヒトトランスジェニック動物 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 真核生物ｍＲＮＡ ５’キャップ構造はｅＩＦ４Ｅにより認識され、これは、翻訳制御と細胞増殖において必須の役割を果たす。ｅＩＦ４Ｅ−結合タンパク質（４Ｅ−ＢＰ）と呼ばれるタンパク質のファミリーのメンバーは、ｅＩＦ４Ｅの活性を阻害し、従って翻訳を抑制する。ホルモン、サイトカインおよび増殖因子に細胞を暴露後、４Ｅ−ＢＰは高度リン酸化され、ｅＩＦ４Ｅから解離し、翻訳阻害を解放する。ｅＩＦ４Ｅからの４Ｅ−ＢＰ１の解離に至るリン酸化イベントは、Ｐ１３キナーゼ／ＦＲＡＰ／ｍＴＯＲシグナル伝達経路により仲介される。本研究は、マウス中のその遺伝子を破壊することにより、インビボでの４Ｅ−ＢＰ１の生物学的重要性を説明する。ホモ接合性４Ｅ−ＢＰ１欠損マウスは、健康であり正常に成長する。しかしこれは、白色脂肪組織と血中グルコースレベルの大きな低下を示し、雄は、総体重の減少と休止代謝速度の増加を示す。初代マウス胚繊維芽細胞は、加速された細胞増殖とキャップ依存性翻訳の増強を、ｅＩＦ４Ｅリン酸化の上昇とともに示す。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】 （発明の分野） 本発明は、その生殖細胞と体細胞が、４Ｅ−ＢＰ１をコードするＤＮＡにノッ
クアウト突然変異を含有する非ヒトトランスジェニック動物に関する。さらに具
体的には本発明は、その生殖細胞と体細胞が、４Ｅ−ＢＰ１をコードするＤＮＡ
にノックアウト突然変異を含有する非ヒトトランスジェニック哺乳動物に関し、
さらに詳しくは、その生殖細胞と体細胞が、４Ｅ−ＢＰ１をコードするＤＮＡに
ノックアウト突然変異を含有するトランスジェニックマウスに関する。１つの具
体的な態様において、４Ｅ−ＢＰ１遺伝子の両方のコピーが破壊されたマウスは
、４Ｅ−ＢＰ１タンパク質の検出可能な発現が欠如している。本発明までは、４
Ｅ−ＢＰ１とｅＩＦ−４Ｅとの相互作用、およびホメオスタシス、脂肪組織増殖
、グルコース代謝に及ぼすその影響は、不明であった。本発明はまた、ｅＩＦ−
４Ｅ封鎖（sequestration）および特に４Ｅ−ＢＰ１の活性を調節する物質を同
定し選択するためのアッセイと方法に関する。

【０００２】 （発明の背景） 肥満は、糖尿病、心血管疾患、および関節疾患に至るよく見られる障害である
。肥満の発症に至る正確な機序はまだよくわかっていないが、通常はホメオスタ
シスや正常な体重を維持するように機能する多くの機序が関与していることは明
らかなようである。

【０００３】 真核生物のｍＲＮＡの翻訳開始は、リボソームを開始コドンに向かわせる大き
なマルチタンパク質−ＲＮＡ複合体の集合を含む巧妙に制御されている過程であ
る。キャップ依存性翻訳の最も一般的なケースでは、タンパク質合成は、真核生
物開始因子４Ｆ（ｅＩＦ−４Ｆ）による７−メチル−Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）
Ｎの認識で始まる。高等真核生物では、ｅＩＦ−４Ｆは３つのポリペプチド鎖、
ｅＩＦ−４Ｅ、ｅＩＦ−４Ａ、およびｅＩＦ−４Ｇからなる（総説は、Sonenber
g, 1996）。ｅＩＦ−４Ｅは、キャップ構造と特異的に相互作用する２５kDaのタ
ンパク質である。ｅＩＦ−４Ａは、ＡＴＰ依存性のＲＮＡヘリカーゼであり、別
の一般的翻訳開始因子（ｅＩＦ−４Ｂ）と協調して、ｍＲＮＡの５’非翻訳領域
をほどくと考えられている。哺乳動物はｅＩＦ−４Ｇの２つのアイソフォーム（
それぞれ１７１kDaと１７６kDaのｅＩＦ−４ＧＩとｅＩＦ−４ＧII）を有し、こ
れらはアミノ酸レベルで４６％同一である。ｅＩＦ−４ＧＩとｅＩＦ−４ＧIIの
両方とも、ｅＩＦ−４ＥとｅＩＦ−４Ａの分子ブリッジとして作用して、ｅＩＦ
−４Ｆを生成する。ｅＩＦ−４ＧはまたｅＩＦ３（４０Ｓリボゾームサブユニッ
トと結合するマルチサブユニット翻訳開始因子）と相互作用して、ｅＩＦ−４Ｆ
が４０ＳリボソームサブユニットをｍＲＮＡの５’末端に動員することを可能に
する。さらにｅＩＦ−４ＧＩとｅＩＦ−４ＧIIは、ポリ（Ａ）結合タンパク質（
ＰＡＢＰ）に直接結合する。ｅＩＦ−４ＧとＰＡＢＰとの結合は、ｅＩＦ−４Ｅ
の存在下でのｍＲＮＡのｅＩＦ−４Ｇ誘導性環化に相関している（Wellら, 1998
）。ｍＲＮＡ環化の生物学的意義は現在不明であるが、おそらくリボゾームのリ
サイクリングを促進して翻訳効率を上昇させると考えられる（総説は、Jacobson
）。

【０００４】 翻訳開始の中心的プレーヤーとしてｅＩＦ−４Ｇは、細胞性タンパク質発現の
制御の当然の標的である。哺乳動物の４Ｅ−ＢＰ１、４Ｅ−ＢＰ２、４Ｅ−ＢＰ
３（総説は、Sonenberg, 1996）と酵母ｐ２０（Altmannら, 1997）は、ｅＩＦ−
４Ｅへの結合に対してｅＩＦ−４Ｇと競合して、キャップ依存性タンパク質合成
を阻害する。生化学的試験は、ｅＩＦ−４Ｇと４Ｅ−ＢＰが、ｅＩＦ−４Ｅの表
面上の互いに排他的な結合部位を占め（Haghighatら, 1995）、こうしてキャッ
プ認識に影響を与えることなく翻訳機序の組み立てを阻止していることを証明し
た。４Ｅ−ＢＰとｅＩＦ−４Ｇの配列解析は、これらの２つのタンパク質ファミ
リーが、同じｅＩＦ−４Ｅ結合方策上で収束し、これはＴｙｒ−Ｘ−Ｘ−Ｘ−Ｘ
−Ｌｅｕ−□ｅＩＦ−４Ｅ認識モチーフ（ここで、Ｘは可変であり、□は疎水性
アミノ酸、さらに詳しくはＬｅｕ、ＭｅｔまたはＰｈｅである）を使用すること
を示唆する（Maderら、1995；Altmannら、1997）。細胞を分裂促進剤または増殖
因子で処理すると、４Ｅ−ＢＰの抑制作用を緩和することにより少なくとも部分
的にキャップ依存性翻訳をアップレギュレートする。１つ以上のセリンおよび／
またはスレオニン残基をホスファチジルイノシトール３−キナーゼシグナル伝達
経路によりリン酸化後、４Ｅ−ＢＰはもうｅＩＦ−４Ｅに結合せず、翻訳が開始
される（総説は、SonenbergとGingras、1998）。

【０００５】 キャップ類似体である７−メチル−ＧＤＰに結合した哺乳動物のｅＩＦ−４Ｅ
（Marcotrigianoら、1997）と酵母のｅＩＦ−４Ｅ（Matsuoら、1997）の構造は
、カップ状にした手に似ており、３つの長いｃｘらせんに支持された曲がった８
つの鎖の平行ではない∃−シートからなる。キャップ類似体は、分子のへこんだ
表面の狭いスロットに結合する。ｅＩＦ−４Ｅによる７−メチル−グアニン認識
は、２つの保存されたトリプトファンと３つのワトソン−クリック様水素結合の
間のＢ−Ｂ積重ねにより仲介され、保存グルタミン酸の骨格アミノ基と側鎖が関
与する。メチル基は、第３の保存トリプトファンとファンデアワールス接触をす
る。そのへこんだ背面の表面で、ｅＩＦ−４Ｅは、ｅＩＦ−４Ｇと４Ｅ−ＢＰの
両方のＴｙｒ−Ｘ−Ｘ−Ｘ−Ｘ−Ｌｅｕ−□モチーフの結合部位であると予測さ
れた系統樹的に不変の疎水性／酸性部分を示す（Marcotrigianoら、1997の図５
Ｂを参照）。この主張は、酵母ｅＩＦ−４Ｅと哺乳動物４Ｅ−ＢＰ１を使用した
ＮＭＲ実験の結果により部分的に確認されている（Fletcherら、1998）。

【０００６】 さらに最近、哺乳動物のｅＩＦ−４ＧII（活性複合体と呼ぶ）と４Ｅ−ＢＰ１
（阻害複合体と呼ぶ）からのｅＩＦ−４Ｅ認識モチーフと相互作用する、ｅＩＦ
−４Ｅと７−メチル−ＧＤＰのバイナリー複合体の２つの高分解能結晶構造が、
開示された（Marcotrigianoら、1999, Molecular Cell 3:707-716）。そこでは
、両方のオリゴペプチドが、キャップ結合スロットからははるかに遠い、ｅＩＦ
−４Ｅのへこんだ背面の表面の同じ保存部分に結合することが証明された。２つ
のＴｙｒ−Ｘ−Ｘ−Ｘ−Ｘ−Ｌｅｕ−□モチーフは、各ペプチド内とｅＩＦ−４
Ｅとの同様の接触により安定化される、同一のＬ型の伸長鎖／ｃｘらせんコンフ
ォメーションをとる。完全長４Ｅ−ＢＰ１と２つのオリゴペプチドの生化学的研
究は、これらが、同様の親和性でｅＩＦ−４Ｅに結合し、ｅＩＦ−４Ｅの不存在
下で２次構造を組合せ、インビトロで翻訳を阻害することを示している。４Ｅ−
ＢＰ１は、ｅＩＦ−４Ｅに結合すると無秩序から秩序的への同じ変化を受ける、
ｅＩＦ−４Ｇの分子模倣体であることが示唆された。生じる競合により、真核生
物の翻訳開始の制御が可能になり、これは、４Ｅ−ＢＰのリン酸化により克服す
ることができる（Marcotrigianoら、1999、前述）。

【０００７】 ホルモン疾患および特に糖尿病の治療に有用な物質のスクリーニング法が、米
国特許第５，８７４，２３１号に開示されている。さらに詳しくは米国特許第５
，８７４，２３１号は、ｅＩＦ−４Ｅと４Ｅ−ＢＰ１の間およびｅＩＦ−４Ｅと
４Ｅ−ＢＰ２の間の相互作用を調節する、ホルモンの活性を模倣する物質の同定
法を教示している。そこには多くのアッセイと方法も記載されている。

【０００８】 しかし、どのホメオスタシス機序が破壊され機能異常を起こして、脂肪組織増
殖および肥満と関連疾患（すなわち、糖尿病）の発症に関与しているかを、より
正確に確認するニーズがある。さらに、肥満と関連疾患の動物モデルを提供し、
脂肪組織増殖および肥満と関連疾患の発症に関与している経路を調節する物質の
同定と選択を可能にすることができるモデル系を提供するニーズがある。さらに
、肥満と関連疾患の最終的治療の標的を同定するニーズがある。

【０００９】 本発明は、これらおよび他のニーズを満足させようとするものである。さらに
本発明の非ヒトトランスジェニック動物は、これらおよび他のニーズを満足させ
ることを助けるのに有用である。

【００１０】 本発明は、多くの文献について言及しているが、これらはその全体が参照によ
り本明細書に組み込まれる。

【００１１】 （発明の要約） 一般に本発明は、先行技術の欠点を克服し、スクリーニング測定法提供する非
ヒトトランスジェニック動物と、脂肪組織増殖と代謝およびエネルギーホメオス
タシスに関与する経路を調節する、この測定法により同定される物質に関する。

【００１２】 簡単に説明すると本発明は、４Ｅ−ＢＰ１欠損非ヒトトランスジェニック動物
に関し、さらに詳しくはトランスジェニック哺乳動物に関する。さらに詳しくは
本発明は、その生殖細胞と体細胞が、４Ｅ−ＳＰ１ポリペプチドをコードするＤ
ＮＡにノックアウト突然変異を含有するトランスジェニック非ヒト動物に関する
。特に好適な態様において、トランスジェニック哺乳動物はまた、ヒト４Ｅ−Ｂ
Ｐ１ポリペプチドをコードするＤＮＡを発現する生殖細胞と体細胞を含有する。

【００１３】 また一般に本発明は、４Ｅ−ＢＰ１とｅＩＦ−４Ｅとの相互作用が脂肪代謝に
影響を与えるという、驚くべき証明に関する。確かに、本発明の４Ｅ−ＢＰ１ノ
ックアウトマウスは、脂肪組織増殖、代謝、グルコース代謝、および体重増加に
変化を示す。従って本発明の目的は、これらのプロセスに影響を与える手段を提
供することである。本発明のノックアウトマウスにおける４Ｅ−ＢＰ１の破壊の
影響は、４Ｅ−ＢＰ１活性またはそのパートナーであるｅＩＦ−４Ｅの変化は、
脂肪組織増殖、代謝およびさらに詳しくはインビボ（すなわち、生きている動物
）のグルコース代謝を調節することができることを示す。本発明のノックアウト
マウスで観察される低血糖症から考えて、４Ｅ−ＢＰ１ノックアウトは、生きて
いる動物でのインスリンシグナル伝達を調節することができるようである。本発
明のノックアウトマウスはまた、４Ｅ−ＢＰ１（または、間接的にｅＩＦ−４Ｅ
）の活性の変化が、動物の体重増加に影響を与えることも証明する。

【００１４】 本明細書で示される結果に基づき、４Ｅ−ＢＰ１の阻害は、非インスリン依存
性糖尿病（II型糖尿病）ならびに肥満の治療に関係する。

【００１５】 本発明までは、ｅＩＦ−４Ｅと４Ｅ−ＢＰ１の相互作用の研究は、インビトロ
の研究と培養細胞での研究、またはこれらの抽出物での研究に限定されていた。
従ってそのような研究は、ｅＩＦ−４Ｅに対する４Ｅ−ＢＰ１の作用、およびそ
のような相互作用に依存する代謝経路に対する作用、または間接的に、キャップ
依存性翻訳の負の制御によるｅＩＦ−４Ｅの脱封鎖（これは、例えば生きている
動物または好ましくは生きている哺乳動物の脂肪組織増殖、代謝、グルコース代
謝、もしくは体重増加のような生理学的に重要な作用を引き起こす）に対する作
用を評価しなかった。

【００１６】 細胞や動物でのホメオスタシスの維持のための翻訳制御の複雑さおよびｅＩＦ
−４Ｅの必須性のために、できるだけ生きている状態に近い環境でのｅＩＦ−４
Ｅと４Ｅ−ＢＰ１との相互作用（または、ｅＩＦ−４Ｅの封鎖、例えば阻害複合
体）の研究に対するニーズがあった。本発明のトランスジェニック動物は、この
ニーズを満足させることを助けるという利点を提供する。

【００１７】 本発明以前には、翻訳制御および特に４Ｅ−ＢＰ１を介するｅＩＦ−４Ｅ活性
の調節が、グルコース代謝、脂肪組織増殖または体重増加に影響を与えることは
、証明も示唆もされていなかった。翻訳制御の複雑さを考えると、本発明以前に
は、４Ｅ−ＢＰ１のノックアウトが、動物の代謝に非常に大きな影響を与えるこ
とは教示も示唆もされていなかった。さらに本発明以前には、４Ｅ−ＢＰ１とｅ
ＩＦ−４Ｅとの相互作用の阻害が、インビボで脂肪組織増殖、代謝、グルコース
代謝、および体重増加を調節することは、当然予測できなかった。確かに、細胞
での翻訳制御に対してｅＩＦ−４Ｅを介して作用する厳密かつ複雑な制御、およ
びその過剰発現が細胞を形質転換させ、動物で腫瘍を引き起こすという証明（So
nenberg, 1996、ｍＲＮＡ ５’Ｃａｐ結合ｅＩＦ−４Ｅと細胞増殖の制御、Tra
nslational Control中、Hersheyら編、245-270、Cold Spring Harbor Laborator
y Press, Cold Spring Harbor、ニューヨーク；およびLazaris-Karatzasら、199
0, Nature 345:544-547）を考えると、動物が見かけ上生理学的に正常なのに、
４Ｅ−ＢＰ１の１つののノックアウトが、動物の代謝に対してそのような重要か
つ特異的な影響を示すことは、当然予測できなかった。さらに、その翻訳を調節
する異なるｅＩＦ−４Ｅ結合タンパク質を考えると、４Ｅ−ＢＰ１のノックアウ
トが、ｅＩＦ−４Ｅと相互作用する他の因子により相殺されることは、当然予測
できなかった。

【００１８】 さらに一般的な面において本発明は、インビボで脂肪組織増殖、代謝、グルコ
ース代謝、体重増加およびエネルギーホメオスタシスを制御する標的としての４
Ｅ−ＢＰ１に関する。本発明の４Ｅ−ＢＰ１、細胞株および動物は、４Ｅ−ＢＰ
１活性とレベル、ならびに４Ｅ−ＢＰ１−ｅＩＦ−４Ｅ相互作用の制御物質をス
クリーニングするのに使用することができる。従って本発明は、インビボで４Ｅ
−ＢＰ１の活性およびその相互作用または封鎖の活性を調節することができる、
小さな拡散性のリガンドを同定するための手段を提供する。すなわち本発明はま
た、ｅＩＦ−４Ｅを脱封鎖し、および／またはこれと４Ｅ−ＢＰ１との相互作用
に影響を与える物質または化合物に関する。従ってその本質において本発明は一
部は、不活性な翻訳複合体と活性なもの（例えば、ｅＩＦ−４Ｆ）との相互作用
を調節することができる物質に関する。脂肪代謝、グルコース代謝、および体重
増加におけるキャップ依存性翻訳の意味を証明したため、体重増加、脂肪組織増
殖などを上昇させるために本発明を容易に適合させることができることは当業者
により認識されるであろう。すなわち本発明はまた、ｅＩＦ−４Ｅの封鎖、およ
びこれを促進する化合物や物質に関する。従って広い意味で本発明は、インビボ
の脂肪組織増殖、代謝、グルコース代謝、および体重増加を調節する方法、およ
びそのような調節に影響を与える物質を同定する方法に関する。

【００１９】 さらに本発明は、内因性４Ｅ−ＢＰ１ポリペプチドの発現が欠如している低脂
肪の表現型を示すトランスジェニック非ヒト動物の産生方法であって、該方法は
、４Ｅ−ＢＰ１をコードするＤＮＡの破壊と、その生殖細胞と体細胞が、４Ｅ−
ＢＰ１をコードするＤＮＡにノックアウト突然変異を含有する子孫の選択とを含
み、こうして低脂肪の非ヒトトランスジェニック動物を得ることを含んでなる、
上記方法に関する。もちろんそのような低脂肪のトランスジェニック動物は、そ
の発現または４Ｅ−ＢＰ１に対して特異的な抗体を完全に排除することとは対照
的に、少量の４Ｅ−ＢＰ１（例えば、アンチセンス４Ｅ−ＢＰ１を使用する）を
使用して産生することもできる。さらに、４Ｅ−ＢＰ１とｅＩＦ−４Ｅとの相互
作用の阻害を可能にする核酸配列を発現する動物を産生することもできる。本発
明はまた、対照動物より高い封鎖したｅＩＦ−４Ｅレベルを有する、より太った
トランスジェニック非ヒト動物の産生方法を提供する。１つの具体的な態様にお
いてこの封鎖は、４Ｅ−ＢＰ１、またはｅＩＦ−４Ｅと相互作用するその断片も
しくは変種の過剰発現により行われる。

【００２０】 好適な態様において本発明は、４Ｅ−ＢＰ１突然変異についてホモ接合性であ
るトランスジェニックマウスに関し、このマウスは生存活性があり繁殖力がある
が、脂肪組織含量、グルコースホメオスタシス、および代謝速度、ならびに可能
な体重減少（ただし、見かけは正常な健康である）が大きな低下を示す。

【００２１】 さらに本発明は、４Ｅ−ＢＰ１−ｅＩＦ−４Ｅ相互作用は、動物の脂肪組織代
謝、グルコース代謝、代謝速度、およびある場合には体重維持を調節し、こうし
て肥満、脂肪沈着障害、および関連疾患、ならびにグルコース代謝関連疾患（例
えば、糖尿病）の治療薬の開発のための新しい標的を提供する。

【００２２】 本発明はさらに、脂質代謝、グルコース代謝、エネルギーホメオスタシス、お
よび関連疾患の研究ための新しいモデルとしての、４Ｅ−ＢＰ１が欠損したヒト
以外の動物に関する。

【００２３】 別の面において本発明は、機能的に活性のある内因性ではない４Ｅ−ＢＰ１ポ
リペプチドを発現することができるトランスジェニックなヒト以外の動物の産生
方法であって、（ａ）その生殖細胞と体細胞が４Ｅ−ＢＰ１が欠損している（例
えば、４Ｅ−ＢＰ１ノックアウト）トランスジェニックなヒト以外の動物を提供
し、（ｂ）ヒト以外の動物の細胞に、内因性ではない４Ｅ−ＢＰ１ポリペプチド
を導入し、そして（ｃ）内因性ではないトランス遺伝子を発現する子孫を得る、
ことを含んでなる方法を特徴とする。好適な態様において、内因性ではない４Ｅ
−ＢＰ１トランス遺伝子は、ヒトトランス遺伝子である。特に好適な態様におい
て、内因性ではないトランス遺伝子は、肥満または糖尿病が関与する細胞および
組織中で発現されるであろう。

【００２４】 すなわち本発明はまた、ノックインアプローチに関し、これにより、４Ｅ−Ｂ
Ｐ１遺伝子の野生型または突然変異コピー（例えば、ヒト）が導入されるか、ま
たは内因性４Ｅ−ＢＰ１遺伝子の破壊されたコピーを置換する。ノックインアプ
ローチは、Hanksら, 1995,「Science」269:679-682に記載されており、内因性遺
伝子と同じ細胞中の遺伝子の内因性ではないコピーの発現を可能にすることが証
明されている。

【００２５】 関連する面において本発明は、４Ｅ−ＢＰ１活性または４Ｅ−ＢＰ１−ｅＩＦ
−４Ｅ相互作用を調節する化合物または物質をスクリーニングするための、内因
性ではない４Ｅ−ＢＰ１トランス遺伝子を発現するそのような非ヒトトランスジ
ェニック動物の使用であって、本発明の非ヒトトランスジェニック動物を候補化
合物に接触させ、その動物の４Ｅ−ＢＰ１の活性を測定し、ここで未処理のヒト
以外の動物と比較して翻訳が上昇していることは、化合物が４Ｅ−ＢＰ１活性を
低下、または４Ｅ−ＢＰ１によるｅＩＦ−４Ｅの相互作用もしくは封鎖を低下さ
せることができることを示し、一方、未処理のヒト以外の動物と比較して翻訳が
低下していることは、化合物が４Ｅ−ＢＰ１活性を上昇、または４Ｅ−ＢＰ１に
よるｅＩＦ−４Ｅの相互作用もしくは封鎖を上昇させることができることを示す
、上記使用に関する。好適な態様において本方法はさらに、体のまたは生理的パ
ラメータの測定を含む。その非限定例は、体重、体温、体脂肪含量、肥満対低脂
肪体重比、白色の脂肪組織沈着物、白色の脂肪組織および／または褐色の脂肪組
織、多房性脂肪組織細胞、脂質液滴、ＵＣＰ１および／またはＵＣＰ２の発現レ
ベル、基礎代謝速度、食物摂取、肝合成機能、絶食血清トリグリセリド、血清グ
ルコースレベル、褐色脂肪組織（ＢＡＴ）および骨格筋中の共役していないタン
パク質ｍＲＮＡの発現レベル、脂肪体中の脂肪細胞容量、脂肪生成、および脂肪
酸エステル化と酸化の測定を含む。

【００２６】 当業者には理解されるように、本発明は、多くの大きな利点を提供する。例え
ば、一般的に生物学的プロセスの研究のためにおよびヒトの健康科学の一般的お
よび具体的な側面のための動物モデル系として有用であることが証明されている
トランスジェニック動物について、本発明のトランスジェニック動物は、薬物を
スクリーニングして治療薬を単離するための有意かつ関連するモデル系を提供す
る。具体的な態様において本発明の新規トランスジェニック動物は、４Ｅ−ＢＰ
１の発現および／または活性の調節物質の選択と同定を可能にする。好適な態様
において、これらの物質は、抗肥満剤、抗脂肪沈着障害剤、抗糖尿病剤、および
脂肪沈着障害剤に関連する抗代謝疾患剤として有用である。

【００２７】 具体的な態様において本発明は、エネルギーホメオスタシス、グルコース代謝
、および／または脂質代謝を調節する能力を有する化合物の同定方法であって、
ａ）ｅＩＦ−４Ｅ相互作用ドメインを含む第１のペプチドと、直接結合により第
１のペプチドと直接相互作用する配列を含む第２のペプチドとに、この化合物を
接触させ（ここで、この直接結合の調節物質は、これが、その化合物の不存在下
と比較して存在下で大きく異なる時、同定される）、およびｂ）この直接結合の
調節物質として選択された化合物を動物に投与し、選択された生理学的および／
または生化学的パラメータを測定する（こうして、この選択された物質がインビ
ボでグルコースおよび／または脂肪代謝を調節物質するかどうかを決定すること
が可能になる）ことを含んでなる、上記方法に関する。

【００２８】 本発明が関係する分野の当業者には、本発明のトランスジェニック動物はさら
に、脂質代謝、グルコース代謝、または代謝関連障害に関連した既知の遺伝子型
を有する他の動物と交配することができることは明らかであろう。同様に発明の
トランスジェニック哺乳動物は、肥満や関連障害をさらに理解、検討、および／
または治療するために、生化学的実験などで使用することができる。

【００２９】 本発明のトランスジェニック動物の細胞と組織は、脂肪沈着と関連障害（４Ｅ
−ＢＰ１の発現および／または活性を調節することができる化合物の合理的な設
計および／またはスクリーニングを含む）に関するインビトロ方法に有用である
。関連する面で本発明はさらに、４Ｅ−ＢＰ１の活性（ｅＩＦ−４Ｅの封鎖に関
する）が改変された細胞株に関する。本発明のトランスジェニック動物から得ら
れる以外に、そのような細胞株は、例えば本発明の構築体またはその誘導体もし
くは変種を使用して、当該分野で公知のものとして得ることができる。そのよう
な細胞株は、本発明の動物またはその誘導体もしくは変種と同様に使用すること
ができる。そのような細胞株は、本発明の動物と同様に使用して、４Ｅ−ＢＰ１
レベルおよび／または活性を調節し、４Ｅ−ＢＰ１の生理学的および生化学的機
能（翻訳および脂質代謝とグルコース代謝に関する構造／機能相関を含む）を検
討することを可能にする。すなわち本発明はまた、本発明の動物から得られる樹
立された細胞株または始原細胞に関する。同様に本発明の４Ｅ−ＢＰ１ノックア
ウト動物から得られる細胞株は、公知の方法に従って野生型または修飾４Ｅ−Ｂ
Ｐ１でトランスフェクトすることができる。そのような細胞株は、多くのアッセ
イや方法で使用することができる。そのようなアッセイの非限定例は、５，８７
４，２３１号に記載されているか、または以下で例示される。

【００３０】 前記したように４Ｅ−ＢＰ１とｅＩＦ−４Ｅが脂質代謝およびグルコース代謝
関連障害に関与していることを決定したため、本発明は４Ｅ−ＢＰ１、ｅＩＦ−
４Ｅ、および４Ｅ−ＢＰ１とｅＩＦ−４Ｅとの相互作用を、そのような障害の治
療および診断の標的として同定する。さらに本発明は、４Ｅ−ＢＰ１の活性／レ
ベルを調節する手段を提供する。例えば４Ｅ−ＢＰ１に対するアンチセンスは、
４Ｅ−ＢＰ１ポリペプチドの発現を低下または排除するのに使用することができ
る。これは、低脂肪型表現型に関連すると予想される。抗体、ペプチド、薬剤リ
ガンド、小分子などは、４Ｅ−ＢＰ１とｅＩＦ−４Ｅとの相互作用の調節に対し
て同じ作用で使用することができるであろう。あるいはある態様において、脂肪
沈着は、例えば細胞または組織中で４Ｅ−ＢＰ１を過剰発現することにより増加
させることができるであろう。もちろん上記の非限定的物質は、この相互作用の
刺激物質またはアゴニストとして作用するであろう。

【００３１】 本発明は哺乳動物のトランスジェニック動物に注目しているが、本発明はまた
、トランスジェニックな家禽のようなあまり一般的ではないトランスジェニック
動物にも有用である。低脂肪型の家禽の産生はまた、食肉産業において利点とな
るであろう。

【００３２】 従って本発明は、トランスジェニック動物、さらに詳しくはトランスジェニッ
ク哺乳動物およびさらに詳しくはトランスジェニックマウスに関する。本発明の
ある具体的な態様において、トランスジェニック動物は、４Ｅ−ＢＰ１の両方の
コピーが破壊され、従って４Ｅ−ＢＰ１タンパク質を検出できないマウスである
。

【００３３】 本発明はさらに、ｅＩＦ−４Ｅ封鎖の同定、および動物の体の代謝を調節する
ための標的としての４Ｅ−ＢＰ１の調節に関する。

【００３４】 脂肪組織増殖、グルコース代謝、脂肪調節、糖尿病、体重増加、エネルギーホ
メオスタシスなどの標的として４Ｅ−ＢＰ１を同定したことは、同じ経路のさら
なる標的（すなわち、翻訳制御）の同定への道が開かれる。そのような標的の非
限定例には、ｅＩＦ−４Ｅ、ｅＩＦ−４Ｆ、キナーゼ、ホスファターゼ、４Ｅ−
ＢＰ１−ｅＩＦ−４Ｅ相互作用またはｅＩＦ−４Ｅの活性および／またはレベル
に影響を与える他の物質を含む。

【００３５】 さらに本発明は、ここから得られるヒトトランスジェニック動物および細胞株
の産生法に関する。

【００３６】 また本発明は、ｅＩＦ−４ＥまたはｅＩＦ−４Ｆのレベルおよび／または活性
に影響を与えることにより、グルコースまたは脂肪代謝、エネルギーホメオスタ
シスなどを調節する物質を同定するためのアッセイと方法に関する。

【００３７】 本発明以前には、ｅＩＦ−４Ｅと４Ｅ−ＢＰ１との相互作用およびインビボの
動物の生理に対する役割は評価されていなかった。本発明は広い意味で、脂肪組
織増殖、代謝、グルコース代謝、および体重増加を制御する決定的に重要な生化
学的プロセスとしての、翻訳の同定に関する。さらに詳しくは本発明は、これら
のプロセスの決定的に重要な制御物質としてのキャップ依存性翻訳を同定する。
さらに詳しくは本発明は、これらのプロセスの制御物質として４Ｅ−ＢＰ１の同
定に関する。４Ｅ−ＢＰ１のヌル突然変異（ｅＩＦ−４Ｆ生成のためのｅＩＦ−
４Ｅの利用性が増加する）、従ってキャップ依存性翻訳を増強させることは、肥
満においてある役割を果たすことを証明したため、４Ｅ−ＢＰ１ノックアウト動
物（例えば、ノックアウトマウス）におけるレプチンの作用を研究することは興
味深くなる。レプチンは、脂肪細胞により分泌され、視床下部に作用して、食欲
や他の生理学的応答を抑えるホルモンである。例えば、脂肪組織が増加すると、
レプチン量の低下に食欲の上昇が伴う。注目すべきは、本発明のノックアウトマ
ウスは、レプチンの６０％の低下を示したことである。しかし食物摂取は、あま
り変化しなかった。すなわちこれらのマウスは、異なる機序により食物摂取を制
御しているに違いない。従って本発明のノックアウトマウスは、食物摂取の機序
を同定するための理想的なモデル系となるであろう。

【００３８】 本発明のノックアウトマウスの褐色脂肪分析は、白色の脂肪組織は褐色の脂肪
組織（これは、ミトコンドリアプロトンバッテリーを短絡させて熱を発生させる
共役していないタンパク質を含有する）により置換されるらしいことを証明した
。これは、４Ｅ−ＢＰ１ノックアウトマウスの高い代謝速度を説明するであろう
。再度４Ｅ−ＢＰ１ノックアウトマウスとこれから得られる細胞株は、この仮説
を検定するための理想的な系として機能するであろう。

【００３９】 本発明のさらに一般的な面において、ｅＩＦ−４Ｅの封鎖または脱封鎖を含む
、細胞と動物における脂肪代謝の調節方法が提供される。関連する面において、
本方法は、細胞と組織におけるｅＩＦ−４Ｅのレベルの調節を含み、従って脂肪
代謝に影響を与える。

【００４０】 本発明の目的のために以下の略語と用語を説明する。

【００４１】 （定義） 本明細書において「トランスジェニック動物」という用語は、細胞中に挿入さ
れ、その細胞から成長する動物のゲノムの一部となった核酸配列を有する任意の
動物を意味する。好適な態様において、トランスジェニック哺乳動物はマウスで
ある。しかし他のトランスジェニック動物は本発明の範囲に包含される。そのよ
うなトランスジェニック動物の非限定例には、トランスジェニックげっ歯類（す
なわち、ラット、ハムスター、モルモット、およびウサギ）、およびトランスジ
ェニックブタ、ウシおよびヒツジ、ならびにトランスジェニック家禽がある。そ
のようなトランスジェニック動物の調製法は、当該分野で周知である（例えば、
ＥＳ細胞にトランス遺伝子を導入する；受精卵の雄の前核にトランス遺伝子を微
量注入する；または細胞を組換えウイルスで感染させる）。確かに低脂肪のトラ
ンスジェニック動物は、肉製品中の脂肪の程度に関する消費者の意識の向上の点
から、食品産業において有用である。本明細書において、「非ヒトトランスジェ
ニック動物」は、少なくとも１つの細胞は、公知の手段（例えば、微量注入法、
ウイルス由来の感染、または相同的組換え）により遺伝的に改変された情報を含
む、任意のヒト以外の動物である。本発明の特に好適な１つの態様において、ト
ランスジェニック動物はトランスジェニックマウスであり、ここでは、生殖細胞
系細胞中に遺伝的改変が導入されており、その結果その子孫への遺伝子改変の伝
達が可能になる。この遺伝子ライブラリーを含有するそのような子孫はまた、ト
ランスジェニックマウスである。

【００４２】 「遺伝子ノックアウト」または「ノックアウト」という用語は、それにコード
されるポリペプチドの生物活性を大幅に低下させる、および好ましくは抑制また
は破壊する核酸配列の破壊を意味する。例えば、４Ｅ−ＢＰ１ノックアウト動物
は、動物の４Ｅ−ＢＰ１をコードするゲノムＤＮＡ配列の少なくとも一部を破壊
する４Ｅ−ＢＰ１配列を含む組換え核酸分子の導入により、４Ｅ−ＢＰ１の発現
が低下または抑制されている動物を意味する。ノックアウト動物は、あらかじめ
選択された核酸配列の１つまたは両方のコピーが破壊されている。後者の場合、
ホモ接合性破壊が存在し、この突然変異は「ヌル」突然変異と呼ばれる。あらか
じめ選択された核酸配列の１つのコピーのみが破壊されている場合、ノックアウ
ト動物は「ヘテロ接合性ノックアウト動物」である。

【００４３】 「ｅＩＦ−４Ｅ脱封鎖剤」という用語は、キャップ依存性翻訳インヒビターま
たはダウンレギュレーター（例えば、阻害複合体）との相互作用からｅＩＦ−４
Ｅを脱封鎖する物質を意味する。さらに詳しくはこの用語は、封鎖剤によりｅＩ
Ｆ−４Ｅの封鎖を低下させるかまたは排除し、こうしてｅＩＦ−４Ｅを脱封鎖し
ｅＩＦ−４Ｅ依存性ｍＲＮＡの翻訳を増加させるように、ｅＩＦ−４Ｅまたはそ
の封鎖剤と相互作用し、その相互作用を改変する物質を意味する。ｅＩＦ−４Ｅ
封鎖剤の非限定例には、４Ｅ−ＢＰ１、４Ｅ−ＢＰ２、４Ｅ−ＢＰ３、およびこ
れらの断片もしくは変種がある。ｅＩＦ−４Ｅ封鎖剤および特にそのｅＩＦ−４
Ｅ結合ドメインのコード配列の突然変異は当該分野で公知であり、さらなる突然
変異も容易に得られるであろう。ｅＩＦ−４Ｅ封鎖剤は反対の作用（すなわち、
ｅＩＦ−４Ｅ依存性翻訳の低下を促進する）を有することを理解されたい。

【００４４】 本明細書においてペプチドについて「断片」という用語は、少なくとも７つの
連続したアミノ酸、好ましくは約１４〜１６個の連続したアミノ酸、およびさら
に好ましくは４０個より多い長さの連続したアミノ酸を意味する。そのようなペ
プチドは、当該分野で公知の方法（例えば、タンパク質分解性切断、遺伝子操作
または化学合成）により、産生することができる。

【００４５】 当該分野で一般的に知られている「翻訳因子」という用語は、ポリペプチドへ
のｍＲＮＡの翻訳に直接参加する因子または分子の群を意味する。その非限定例
には、ｅＩＦ１、ｅＩＦ２、ｅＩＦ３およびｅＩＦ−４Ａ、ｅＩＦ−４Ｂ、ｗＩ
Ｆ−４Ｆ、およびｅＩＦ−４Ｇがある。

【００４６】 「２つの因子の調節」という用語は、２つの因子の間の親和性、強度、速度な
どの変化を意味する。「翻訳の調節」という用語は、タンパク質合成の定性的ま
たは定量的変化または速度を引き起こすｍＲＮＡの翻訳効率または速度の変化を
意味する。

【００４７】 「ｅＩＦ−４Ｅ依存性翻訳」という用語は、翻訳の開始にｅＩＦ−４Ｅを必要
とするｍＲＮＡの翻訳を意味する。当該分野で公知のように、異なるｍＲＮＡは
、翻訳の開始について、ｅＩＦ４Ｅに対する異なる程度の依存性を示す。真核生
物ｍＲＮＡの５’部分に連結した７−メチルグアノシン残基からなるキャップ構
造の存在、およびキャップ構造と開始ＡＵＧの間の２次構造の程度は、ｅＩＦ４
ＥへのｍＲＮＡの依存性に影響を与える２つの非限定因子である。

【００４８】 本明細書においてヌクレオチド配列は、当該分野で一般的に使用される一文字
ヌクレオチド記号を使用して、およびＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ生化学命名法委員会（
IUPVAC-IUB Biochemical Nomenclature Commission）の勧めに従って、５’〜３
’方向へ、左から右へ１本鎖で示される。

【００４９】 特に明記しない場合は、本明細書で使用された科学用語、技術用語および命名
法は、本発明が関係する分野の当業者により一般的に理解されているものと同じ
意味を有する。一般に、細胞培養法、感染法、分子生物学的方法などは、当該分
野で使用されている一般的なものである。そのような標準的方法は、例えばSamb
rookら（1989, Molecular Cloning-A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor
Laboratories）およびAusubelら（1994, Current protocols in Molecular Biol
ogy, Wiley, New York）のような文献中に見いだされる。

【００５０】 本発明は、多くの一般的に使用される組換えＤＮＡ技術（ｒＤＮＡ）用語につ
いて言及している。しかし、明瞭にするためと一貫性を持たせるために、そのよ
うなｒＤＮＡ用語の選択された例の定義は提供する。

【００５１】 本明細書において「核酸分子」という用語は、ヌクレオチドのポリマーを意味
する。その非限定例には、ＤＮＡ（例えば、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ）およびＲ
ＮＡ分子（例えば、ｍＲＮＡ）がある。核酸分子は、クローニング法により得ら
れるかまたは合成される。ＤＮＡは２本鎖でも１本鎖でもよい（コード鎖または
非コード鎖［アンチセンス］）。

【００５２】 当該分野で公知の「組換えＤＮＡ」という用語は、ＤＮＡのセグメントを結合
させることにより得られるＤＮＡ分子を意味する。これはしばしば、遺伝子操作
と呼ばれる。

【００５３】 本明細書において「ＤＮＡセグメント」という用語は、ヌクレオチドの線形の
ストレッチまたは配列を含むＤＮＡ分子を意味する。遺伝子コードに従って読ま
れるときこの配列は、アミノ酸の線形のストレッチまたは配列をコードし、これ
はポリペプチド、タンパク質、タンパク質断片などと呼ばれる。

【００５４】 本明細書において「増幅対」という用語は、本発明の一対のオリゴヌクレオチ
ド（オリゴ）を意味し、これらは、多くの増幅反応の１つ、好ましくはポリメラ
ーゼ連鎖反応により、選択された核酸配列を増幅するのに一緒に使用するように
選択される。他のタイプの増幅反応には、リガーゼ連鎖反応、鎖置換増幅、また
は核酸配列ベースの増幅（以下で詳述する）がある。一般的に知られているよう
に、オリゴは、選択された条件下で相補的配列に結合するように設計される。

【００５５】 本発明を実施するための核酸（例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡ）は、公知の方法
に従って得られる。

【００５６】 本発明のオリゴヌクレオチドプローブまたはプライマーは、使用される具体的
なアッセイフォーマットおよび具体的なニーズおよび標的であるゲノムに依存し
て、任意の適当な長さでよい。一般にオリゴヌクレオチドプローブまたはプライ
マーは、少なくとも１２ヌクレオチドの長さであり、好ましくは１５〜２４ヌク
レオチドの長さであり、これらは、選択された核酸増幅系に特に適するように改
変される。当該分野で公知のように、オリゴヌクレオチドプローブおよびプライ
マーは、その標的配列とのハイブリダイゼーションの融点を考慮して設計される
（下記、およびSambrookら、1989, Molecular Cloning-A Laboratory Manual, 2
nd Edition, CSH Laboratories；Ausubelら, 1994, Current protocols in Mole
cular Biology, John Wiley & Sons., New Yorkを参照）。

【００５７】 「オリゴヌクレオチド」または「ＤＮＡ」分子または配列という用語は、デオ
キシリボヌクレオチドであるアデニン（Ａ）、グアニン（Ｇ）、チミン（Ｔ）お
よび／またはシトシン（Ｃ）を２本鎖中に含み、かつ本明細書で定義されるよう
な本発明の「制御要素」を含む分子を意味する。「オリゴヌクレオチド」または
「ＤＮＡ」という用語は、線状のＤＮＡ分子もしくは断片、ウイルス、プラスミ
ド、ベクター、染色体、または合成で得られるＤＮＡ中に存在する。本明細書に
おいて、具体的な２本鎖ＤＮＡ配列は、配列を５’〜３’方向にのみ記載すると
いうふつうの慣行に従って記載される。

【００５８】 「核酸ハイブリダイゼーション」という用語は一般に、熱力学的に好ましい２
本鎖構造を形成する適当な条件下で、相補的塩基配列を有する２つの１本鎖核酸
分子をハイブリダイズさせることを意味する。ハイブリダイゼーション条件の例
は、前記の２つの実験室マニュアル（Sambrookら、1989（前述）とAusubelら、1
989（前述））中のものと、当該分野で一般的に公知のようなものである。例え
ば公知のサザンブロッティング法のニトロセルロースフィルターへのハイブリダ
イゼーションの場合、ニトロセルロースフィルターは、５０％ホルムアミド、高
塩（５×ＳＳＣまたは５×ＳＳＰＥ）、５×デンハルツ溶液、１％ＳＤＳ、およ
び１００μg/mlの変性担体ＤＮＡ（例えば、変性サケ精子ＤＮＡ）を含有する溶
液中で標識プローブとともに、６５℃で一晩インキュベートされる。非特異的結
合プローブは、所望の厳密性を考慮して選択される温度（室温（低ストリンジェ
ント）、４２℃（中ストリンジェント）、または６５℃（高ストリンジェント）
）で、０．２×ＳＳＣ／１％ ＳＤＳ中で数回洗浄することにより、フィルター
から洗い流される。選択される温度は、ＤＮＡハイブリッドの融点（Ｔｍ）に基
づく。ＲＮＡ−ＤＮＡハイブリッドを形成し検出することもできる。このような
場合、ハイブリダイゼーションと洗浄の条件は、当業者により公知の方法に従っ
て変更することができる。ストリンジェント条件の使用が好ましい（Sambrookら
、1989、前述）。

【００５９】 本発明のプローブは、天然に存在する糖−リン酸骨格ならびにホスホロチオエ
ート、ジチオネート、アルキルホスホネートおよびｃｘ−ヌクレオチドなどを含
む修飾骨格とともに使用することができる。修飾糖リン酸骨格は、一般的にMill
er, 1988,「Ann. Reports Med. Chem.」23:295およびMoranら、1987,「Nucleic
acid molecule Acids Res.」, 14:5019に記載されている。本発明のプローブは
、リボ核酸（ＲＮＡ）またはデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）のいずれか、好ましく
はＤＮＡから構築される。

【００６０】 プローブを使用することができる検出法のタイプには、サザンブロット（ＤＮ
Ａ検出）、ドットブロットまたはスロットブロット（ＤＮＡ、ＲＮＡ）およびノ
ーザンブロット（ＲＮＡ検出）がある。あまり好適ではないが、標識タンパク質
も、それが結合する特定の核酸配列を検出するのに使用することができる。他の
検出法には、ディップスティック構造などの上にプローブを含有するキットがあ
る。

【００６１】 本発明は、特定の核酸配列の検出のための標識物の使用に依存しないが、その
ような標識物は、検出感度を上昇させるため有利である。さらにこれは自動化を
可能にする。プローブは、多くの周知の方法（Sambrookら、1989、前述）に従っ
て標識することができる。標識物の非限定例には、³Ｈ、¹⁴Ｃ、³²Ｐ、および³⁵
Ｓがある。検出マーカーの非限定例には、リガンド、蛍光性物質、化学発光物質
、酵素、および抗体がある。本発明の方法の感度の上昇を可能にする、プローブ
とともに使用するための他の検出可能なマーカーには、ビオチンと放射性核種が
ある。特定の標識物の選択は、それがプローブに結合する方法を規定することは
、当業者には明らかであろう。

【００６２】 一般に知られているように、放射性核種はいくつかの方法で本発明のプローブ
に取り込むことができる。その非限定例には、ガンマ³²Ｐ ＡＴＰとポリヌクレ
オチドキナーゼを使用するプローブの５’末端のキナーゼ処理、放射性ｄＮＴＰ
の存在下の大腸菌（E. coli）のＰｏｌＩのクレノウ断片の使用（例えば、低融
点ゲル中のランダムオリゴヌクレオチドプライマーを使用して均一に標識された
ＤＮＡプローブ）、１つ以上の放射性ＮＴＰの存在下でＤＮＡセグメントを転写
するためのＳＰ６／Ｔ７系の使用などがある。

【００６３】 本明細書において「オリゴヌクレオチド」または「オリゴ」という用語は、２
つまたはそれ以上のヌクレオチド（リボまたはデオキシリボヌクレオチド）を有
する分子を規定する。オリゴのサイズは、具体的な状況および最終的にはその具
体的な用途により規定され、従って当業者により改変される。オリゴヌクレオチ
ドは、化学合成されるかまたは周知の方法に従ってクローニングにより得られる
。

【００６４】 本明細書において「プライマー」とは、標的配列にアニーリングでき、こうし
て適当な条件下でＤＮＡ合成ための開始点として作用する２本鎖領域を生み出す
オリゴヌクレオチドを規定する。

【００６５】 選択されたかまたは標的の核酸配列の増幅は、多くの適当な方法により行われ
る。一般的にはKwohら、1990,「Am. Biotechnol. Lab.」8:14-25を参照されたい
。無数の増幅法が開示されており、当業者の具体的なニーズに会うように容易に
改変することができる。増幅法の非限定例には、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ
）、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）、鎖置換増幅法（ＳＤＡ）、転写ベースの増幅
、Ｑβレプリカーゼ系、およびＮＡＳＢＡがある（Kwohら, 1989, Proc. Natl.
Acad. Sci. USA 86, 1173-1177; Lizardiら、1988, BioTechnology 6:1197-1202
；Malekら、1994, Methods Mo. Biol., 28:253-260；Sambrookら、1989、前述）
。好ましくは増幅は、ＰＣＲを使用して行われる。

【００６６】 ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）は、公知の方法に従って行われる。例えば米
国特許第４，６８３，１９５号；４，６８３，２０２号；４，８００，１５９号
；および４，９６５，１８８号を参照されたい（これらの３つすべての米国特許
第の開示内容は、参照することにより本明細書に組み込まれる）。一般にＰＣＲ
には、検出すべき特異配列の各鎖について１つのオリゴヌクレオチドとともに、
ハイブリダイゼーション条件下での核酸試料の処理（例えば、熱安定性ＤＮＡポ
リメラーゼの存在下）を含む。合成される各プライマーの伸長産物は、２つの核
酸鎖のそれぞれに相補的であり、プライマーは、それとハイブリダイズする特異
配列の各鎖と充分に相補的である。各プライマーから合成される伸長産物はまた
、同じプライマーを使用して、伸長産物のさらなる合成の鋳型として機能する。
伸長産物を充分な回数合成した後、検出すべき配列が存在するかどうかについて
試料を分析する。増幅配列の検出は、ゲル電気泳動後のＤＮＡのＥｔＢｒ染色後
に視覚化して行われるか、または公知の方法に従って検出可能な標識物などを用
いて行われる。ＰＣＲ法の総説については、「PCR Protocols, A Guide to Meth
ods and Amplifications」Mechaelら編、Acad. Press, 1990を参照されたい。

【００６７】 リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）は、公知の方法に従って行われる（Weiss, 1991,
Science 254:1292）。当業者は所望のニーズに会うようにプロトコールを変更
する、ことができる。鎖置換増幅法（ＳＤＡ）はまた、具体的なニーズに合うよ
うに公知の方法またはその変法に従って行われる（Walkerら、1992, Proc. Natl
. Acad. Sci. USA 89:392-396；および同上、1992, Nucleic Acids Res. 20:169
1-1696）。

【００６８】 本明細書において「遺伝子」という用語は、当該分野で周知であり、単一のタ
ンパク質またはポリペプチドを規定する核酸配列に関する。「構造遺伝子」は、
ＲＮＡに転写され、特異的なアミノ酸配列を有しており従って特異的ポリペプチ
ドまたはタンパク質を与えるタンパク質に翻訳されるＤＮＡ配列を規定する。本
発明の核酸配列を、当該分野で周知の多くの確立されたキットフォーマットのい
ずれかに取り込むことができることは、当業者に容易に認識されるであろう。

【００６９】 ＤＮＡ分子の「異種」（例えば、異種遺伝子）領域は、自然には結合して存在
しない大きなセグメント内の、ＤＮＡのサブセグメントである。「異種」という
用語は、天然には結合していない２つのポリペプチドセグメントを規定するのに
同様に使用することができる。異種遺伝子の非限定例には、異種の制御領域また
は異種のポリペプチドに隣接または結合することができる、ルシフェラーゼ、ク
ロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ、β−ガラクトシダーゼなどの
レポーター遺伝子がある。

【００７０】 「ベクター」という用語は、当該分野で一般に公知であり、プラスミドＤＮＡ
、ファージＤＮＡ、ウイルスＤＮＡなどを規定し、これらは、本発明のＤＮＡを
クローン化することができるＤＮＡビヒクルとして機能することができる。無数
のタイプのベクターが存在し、これらは当該分野で周知である。

【００７１】 「発現」という用語は、遺伝子がｍＲＮＡに転写され（転写）、次にｍＲＮＡ
が１つのポリペプチド（またはタンパク質）またはそれ以上に翻訳される（翻訳
）プロセスを規定する。

【００７２】 「発現ベクター」という用語は、上記ベクターまたはビヒクルであるが、宿主
への形質転換後に挿入配列の発現を可能にするように設計されるものを規定する
。クローン化遺伝子（挿入配列）は、通常プロモーター配列のような制御要素配
列の制御下に置かれる。クローン化遺伝子を制御配列下に置くことは、しばしば
制御要素または配列に機能的に連結しているという。

【００７３】 機能的に連結した配列はまた、同じＲＮＡ転写体に転写される２つの配列を含
む。すなわち２つの配列（例えば、プロモーターと「レポーター配列」）は、プ
ロモーター中で始まる転写が、レポーター配列のＲＮＡ転写体を産生するなら、
機能的に連結している。「機能的に連結」するために、２つの配列が互いに直接
隣接する必要は無い。

【００７４】 発現制御配列は、原核生物もしくは真核生物宿主またはその両方（シャトルベ
クター）中でベクターが機能的に連結した遺伝子を発現するように設計されてい
るかどうか、および、さらに転写要素（例えば、エンハンサー要素、停止配列、
組織特異性要素、および／または翻訳開始および停止部位）を含有するかどうか
に依存して異なる。

【００７５】 原核生物発現は、目的のＤＮＡ配列によりコードされるタンパク質を大量に調
製するのに有用である。このタンパク質は、例えばそのサイズや荷電のようなそ
の本質的性質を利用する標準的プロトコール（例えば、ＳＤＳゲル電気泳動、ゲ
ル濾過、遠心分離、イオン交換クロマトグラフィー・・・）に従って精製するこ
とができる。さらに目的のタンパク質は、ポリクローナル抗体またはモノクロー
ナル抗体を使用して親和性クロマトグラフィーにより精製することができる。精
製されたタンパク質は、治療用途に使用することができる。

【００７６】 ＤＮＡ構築体は、本発明のオリゴヌクレオチド配列に機能的に連結したプロモ
ーターを含むベクターでもよく、これは次に、異種遺伝子（例えば、ルシフェラ
ーゼレポーター分子の遺伝子）に機能的に連結してもよい。「プロモーター」と
は、細胞中のＲＮＡポリメラーゼに直接または間接に結合でき、下流（３’方向
）のコード配列の転写を開始させることができるＤＮＡ制御領域である。本発明
の目的においてプロモーターは、その３’末端で転写開始部位に結合し、上流（
５’方向）に伸長し、バックグランドより高く検出可能な最小数の塩基または要
素を含む。プロモーター内には、転写開始部位（Ｓ１ヌクレアーゼを用いてマッ
ピングして規定することが便利である）、ならびにＲＮＡポリメラーゼの結合に
関与するタンパク質結合ドメイン（共通配列）がある。真核生物プロモーターは
しばしば（しかし、いつもではない）、「ＴＡＴＡ」ボックスおよび「ＣＣＡＴ
」ボックスを含有する。原核生物プロモーターは、−１０および−３５共通配列
以外にシャイン・ダルガルノ配列を含有する。

【００７７】 本明細書において「機能的誘導体」という表示は、配列の機能的誘導体の意味
において、生物活性（機能または構造）を保持する分子である核酸またはアミノ
酸配列が、元々の配列と実質的に同じであるかどうかを意味する。この機能的誘
導体または同等物は、天然の誘導体であるかまたは合成で調製される。そのよう
な誘導体は、１つ以上のアミノ酸の置換、欠失、または付加を有する（ただし、
タンパク質の生物活性は保存されている）アミノ酸配列を含む。同じことが、核
酸の誘導体にも当てはまり、これは、一般に配列の生物活性が保持されるなら、
１つ以上のヌクレオチドの置換、欠失、または付加を有してもよい。タンパク質
配列に関する時は、置換するアミノ酸は、置換されるアミノ酸と同様の化学−物
理的性質を有する。同様の化学−物理的性質には、荷電、大きさ、疎水性、親水
性などの類似性を含む。「機能的誘導体」という用語は、本発明の主題の「断片
」、「セグメント」、「変種」、「類似体」または「化学誘導体」を意味する。

【００７８】 当該分野で周知のように、アミノ酸の保存的突然変異または置換は、１）ポリ
ペプチドの骨格構造（例えば、ベータシートまたはアルファらせん構造）；２）
アミノ酸の荷電または疎水性；または３）側鎖が大きいこと、を保持する突然変
異または置換を意味する。さらに詳しくは周知の用語「親水性残基」は、セリン
またはスレオニンを意味する。「疎水性残基」は、ロイシン、イソロイシン、フ
ェニルアラニン、バリンまたはアラニンを意味する。「陽性に荷電した残基」と
は、リジン、アルギニンまたはヒスチジンを意味する。陰性に荷電した残基は、
アスパラギン酸またはグルタミン酸を意味する。「大きな側鎖」を有する残基は
、フェニルアラニン、トリプトファン、またはチロシンを意味する。

【００７９】 本発明のペプチド、タンパク質断片などは、その配列に依存性にまたは非依存
性に、周知の方法に従って修飾することができる。例えば、ペプチドは、１、２
、３またはそれ以上の位置の保存的アミノ酸置換を使用して、本明細書で図に記
載の野生型配列から得ることができる。「保存的アミノ酸置換」という用語は、
当該分野で周知であり、同様の特徴を有するアミノ酸（例えば、グルタミン酸に
アスパラギン酸、ロイシンにイソロイシン）による特定のアミノ酸の置換を意味
する。もちろん他のタイプの修飾（例えば、欠失または挿入）と同様に非保存的
アミノ酸置換も実施できるが、ただしこれらの修飾は、適切に（例えば、これが
修飾の目的であっても、ペプチドの生物活性に影響を与えることなく）ペプチド
を修飾する。保存的アミノ酸置換のリストを以下に示す。

【００８０】

【表１】

【００８１】 この表で明らかなように、これらの修飾の一部は、ペプチドをタンパク質分解
に対してより抵抗性にするために使用することができる。もちろんペプチドの修
飾は、当該分野で周知の酵素的または化学的処理を使用して、その１次構造に影
響を与えることなく行うことができる。

【００８２】 すなわち本明細書において「変種」という用語は、構造と生物活性が本発明の
タンパク質または核酸と実質的に同じタンパク質または核酸分子を意味する。

【００８３】 ｅＩＦ−４Ｅの脱封鎖に至る４Ｅ−ＢＰ１ノックアウトで例示されるが、本発
明が限定されないことは当業者には明らかであろう。例えば脂肪組織の減少させ
るために、ｅＩＦ４Ｅを脱封鎖するための多くの手段が利用できる。非限定例に
は、４Ｅ−ＢＰ２と４Ｅ−ＢＰ３のノックアウト（または、上記したようにｅＩ
Ｆ−４Ｅ封鎖物質のレベルもしくは活性の低下）または突然変異を含む。逆に、
脂肪組織を増加、体重増加などのために、多くのｅＩＦ−４Ｅ封鎖物質が使用で
きるであろう。ｅＩＦ４Ｅを封鎖するために使用されるタンパク質または断片の
非限定例には、ｅＩＦ４Ｅ結合部位を含むタンパク質またはアミノ酸配列がある
。そのようなタンパク質の例には、４Ｅ−ＢＰ１、４Ｅ−ＢＰ２、４Ｅ−ＢＰ３
、およびｅＩＦ−４Ｇがある。さらに進化中のそのようなタンパク質のｅＩＦ４
Ｅ結合ドメインの保存を考えると、多様な動物や植物起源から無数の配列を合成
または得ることができる。

【００８４】 本発明の機能的誘導体は、化学的に合成されるか組換えＤＮＡ技術により産生
され、これらのすべての方法は当該分野で周知である。本発明の１つの具体的な
態様において、本発明の変種は、ｅＩＦ４Ｅ封鎖物質（例えば、ｅＩＦ４Ｅを封
鎖する能力を保持する４Ｅ−ＢＰ１変種または断片）を含み、こうして翻訳開始
を調節し、従って脂肪とグルコース代謝を調節する。ｅＩＦ４Ｅと４Ｅ−ＢＰ１
の相互作用ドメインがわかったため、ｅＩＦ４Ｅについて修飾された親和性（以
下の整列を参照されたい）を有する４Ｅ−ＢＰ１変種を同定および／または設計
することは、当業者にとって可能となる。さらにインビボのグルコースおよび脂
肪代謝に関与する中心的な生化学的プロセスとしてのｅＩＦ４Ｅ依存性翻訳が同
定されたため、本発明は、異なる封鎖物質と相互作用するｅＩＦ４Ｅのドメイン
を修飾して、または異なる開始因子とのｅＩＦ４Ｅ相互作用の調節が起きるよう
にｅＩＦ４Ｅまたは他の因子を標的とする物質を使用して、これらのプロセスに
影響を与える手段を提供する。

【００８５】 本明細書において「化学的誘導体」という用語は、通常は本発明の主題の一部
ではない追加の化学残基を包含することを意味する。そのような残基は、誘導体
の物理化学的特徴に影響を与える（例えば、溶解度、吸着、半減期など、毒性の
低下）。そのような残基は、Remington's Pharmaceutical Sciences（例えば、1
980）に例示されている。これらの化学物理的残基をポリペプチドに結合させる
方法は、当該分野で周知である。

【００８６】 「アレレ」という用語は、染色体上のある遺伝子座を占める遺伝子の別の型を
規定する。

【００８７】 一般に知られているように、「突然変異」は、娘細胞に伝搬することができる
遺伝物質の検出可能な変化である。例えば周知のように突然変異は１以上のデオ
キシヌクレオチドにおける検出可能な変化である。例えば、新しい位置にヌクレ
オチドを付加、欠失、置換、逆転、または転置することができる。自然の突然変
異と実験的に誘導した突然変異が存在する。核酸分子の突然変異の結果は、突然
変異核酸分子である。突然変異ポリペプチドは、この突然変異核酸分子からコー
ドすることができる。

【００８８】 本明細書において「精製された」という用語は、ある分子が細胞成分から分離
されたことを意味する。すなわち例えば、「精製されたタンパク質」は、天然に
は存在しないレベルまで精製される。「実質的に純粋」な分子は、ほとんどの他
の細胞成分が欠如した分子である。

【００８９】 本明細書において「分子」、「化合物」または「リガンド」という用語は、同
義的に使用され、広い意味で天然の、合成のまたは半合成の分子または化合物を
意味する。従って「分子」という用語は、例えば化学物質、巨大分子、細胞もし
くは組織抽出物（植物または動物から）などを意味する。分子の非限定例には、
核酸分子、ペプチド、抗体、炭水化物、および薬剤がある。これらの物質は、多
くの手段（ランダムスクリーニング、合理的選択、および例えばコンピューター
モデリング、組合せライブラリースクリーニングなどのタンパク質もしくはリガ
ンドモデリング法を使用した合理的設計）により、選択およびスクリーニングす
ることができる。「合理的に選択された」または「合理的に設計された」という
用語は、本発明の相互作用ドメインの形状に基づいて選択された化合物を規定す
ることを意味する。当業者には理解されるように、天然には存在しない修飾を有
する巨大分子もまた、「分子」という用語に含まれる。例えば医薬品業界で周知
のおよび一般にはペプチド類似体について言及されるペプチド模倣物は、前記し
たモデリングを使用して作成することができる。同様に好適な態様において本発
明のポリペプチドは、その安定性を増強させるために修飾される。多くの場合こ
の修飾は、相互作用ドメインの生物学的活性を変えるものではないことを理解さ
れたい。本発明の教示に従って同定される分子は、脂肪組織代謝および／または
グルコース代謝の欠陥および／または肥満および／または糖尿病により細胞およ
び／または組織の生理もしくはホメオスタシスが弱っている疾患または症状に、
治療的価値を有する。あるいは本発明の教示に従って同定される分子は、脂肪組
織代謝および／またはグルコース代謝の欠陥および／または肥満および／または
糖尿病を低下もしくは逆転させることができる、より効率的な物質の開発に有用
である。

【００９０】 化合物のライブラリー（公に入手できるか市販されているもの）は当該分野で
周知である。「化合物」という用語はまた、リボザイム(例えば、ＵＳ第５，７
１２，２９１号、ＵＳ第５，８７９，９３８号；および第４，９８７，０７１号
）を包含し、アプタマー（例えば、ＵＳ５，７５６，２９１号およびＵＳ第５，
７９２，６１３号を参照）を包含することを意味する。

【００９１】 本発明のある態様においてペプチドは、ｅＩＦ−４Ｅ−４Ｅ−ＢＰ１相互作用
を妨害するか、またはｅＩＦ−４Ｅの脱封鎖を妨害する物質として使用される。
ある具体的な態様において、ｅＩＦ−４Ｅを封鎖することができるペプチドは、
少なくとも７個のアミノ酸、好ましくは少なくとも１４〜１６個のアミノ酸を有
し、後述する４Ｅ−ＢＰまたはこれも後述する４Ｅ結合部位のアミノ酸配列と少
なくとも８０％の配列同一性を有する。本発明のある具体的な態様において封鎖
性ペプチドは、ＹｘｘｘｘＬψ、＋ψｘｘＹｘ＋ｘｆψψ、＋ψψＹ−＋ｘＦ／
ＡψψｘｘＲｘＳＰ、および＋ψψＹ−＋ｘｆＬψｘｘＲｘＳＰから選択される
共通配列を含む。好ましくはｅＩＦ−４Ｅに結合し従って動物のエネルギーホメ
オスタシスを調節する能力を有する封鎖性ペプチドは、７〜１６個のアミノ酸を
含有し、下記の図に示す４Ｅ結合部位のアミノ酸配列と少なくとも９５％の配列
同一性を有する。さらに好ましくは封鎖性ペプチドは、図に示すアミノ酸配列と
１００％の配列同一性を有し、哺乳動物４Ｅ結合部位と特にヒトラットマウス４
Ｅ結合部位と１００％の配列同一性を有する。逆に、ｅＩＦ−４Ｅ脱封鎖物質は
、ある態様において、４Ｅ−ＢＰに結合するペプチドから選択することができる
。ある具体的な態様において、そのようなペプチドは、ｅＩＦ−４Ｅの４Ｅ−Ｂ
Ｐ相互作用ドメインから選択される。

【００９２】 本明細書において、ｅＩＦ−４Ｅ−４Ｅ−ＢＰ１相互作用のアゴニストとアン
タゴニストはまた、そのようなアゴニストまたはアンタゴニスト性を有する既知
の化合物の強化物質も含む。ある態様においてアゴニストは、指示細胞を化合物
または混合物または分子のライブラリー（例えば、組合せライブラリー）と一定
時間接触させて、例えば次に翻訳活性を測定することにより検出することができ
る。

【００９３】 ある態様において、処理細胞内のレポーター遺伝子の遺伝子発現のレベル（例
えば、産生されるルシフェラーゼ、またはβ−ｇａｌのレベル）を、その分子の
不存在下でのレポーター遺伝子と比較することができる。遺伝子発現レベルの差
は、目的の分子が上記相互作用を作動させるかどうかを示す。発現されたレポー
ター遺伝子産物（処理対未処理細胞）のレベルの大きさは、アゴニストとしての
分子の強さの相対的指標である。アンタゴニストの存在下で、同じタイプのアプ
ローチを使用することができる。

【００９４】 本発明はまた、例えば本発明の核酸配列またはタンパク質の発現を低下させる
かまたは排除するのに使用することができるアンチセンス核酸分子を提供する。
本発明のアンチセンス核酸分子は、その標的の核酸配列（ＤＮＡまたはＲＮＡ）
の一部と安定な２本鎖または３本鎖を形成することができる分子を意味する。あ
る具体的な態様において、アンチセンスは４Ｅ−ＢＰ１に特異的である。アンチ
センス核酸分子の使用とそのような分子の設計および修飾は、当該分野で周知で
あり、例えばＷＯ９６／３２９６６号、ＷＯ９６／１１２６６号、ＷＯ９４／１
５６４６号、ＷＯ９３／０８８４５号、および米国特許第５，５９３，９７４号
に記載されている。本発明のアンチセンス核酸分子は、核酸配列から得られ、か
つ周知の方法に従って修飾される。例えば、あるアンチセンス分子は、その標的
化配列への親和性を上昇させるために分解に対してより耐性になるように、選択
された細胞タイプもしくは細胞コンパートメントへの輸送に影響を与えるように
、および／またはヌクレオチド類似体を使用しておよび／もしくは選択された化
学的断片（当該分野で公知のもの）を置換して、その脂質溶解度を増強するよう
に、設計することができる。

【００９５】 あるいは、本発明の指示細胞は、アンタゴニストを同定するために使用するこ
とができる。例えば、試験分子は、一定の濃度で保持される１つ以上のアゴニス
トとともに宿主細胞とインキュベートされる。分子のアンタゴニスト性の指標お
よび相対的強度は、アゴニストの存在下で、試験分子の不存在下対その存在下で
指示細胞中の遺伝子発現のレベルを比較することにより提供される。もちろん分
子のアンタゴニスト作用は、アゴニストの不存在下で、試験分子の存在下および
不存在下でレポーター遺伝子の発現レベルを単に比較することにより、測定する
ことができる。

【００９６】 「インビボ」の実験的モデルはまた、「インビトロ」アッセイを実施するのに
使用することができることを理解されたい。例えば、指示細胞から細胞抽出物お
よび／または本発明の非ヒトトランスジェニック動物から細胞抽出物が調製でき
、本発明のインビトロ法の１つまたは当該分野で公知のインビトロ法の１つで使
用することができる。アッセイの非限定例は、本明細書に例示され、米国特許第
５，８７４，２３１号に教示されている。

【００９７】 本明細書において「指示細胞」は、ある具体的な態様において、４Ｅ−ＢＰ１
とｅＩＦ−４Ｅまたは相互作用するそのドメインを発現する細胞を意味し、これ
らのタンパク質またはその相互作用ドメイン間の相互作用は、これらの間の相互
作用の評価を提供するように、同定可能なまたは選択可能な表現型または特徴と
共役している。このような指示細胞は、本発明のスクリーニングアッセイに使用
することができる。ある態様において指示細胞は、これらの相互作用ドメインの
選択された誘導体、断片、同族体、または突然変異体を発現するように操作され
ている。細胞は、酵母細胞または高等真核細胞(例えば、哺乳動物細胞）（ＷＯ
９６／４１１６９号）でもよい。ある具体的な態様において指示細胞は、当該分
野で周知（Ausubelら、1994、前述）のように２つのハイブリッドシステム技術
の使用を可能にするベクターを有する酵母細胞であり、試験化合物またはそのラ
イブラリーを試験するのに使用することができる。ある態様において、選択マー
カーまたは測定可能なタンパク質をコードするレポーター遺伝子は、選択マーカ
ーまたは測定可能はタンパク質の発現が、ｅＩＦ−４Ｅと４Ｅ−ＢＰ１相互作用
ドメインの相互作用に依存するように、制御要素に機能的に連結することができ
る。このような指示細胞は、大量の試験化合物を高い処理能力で迅速にスクリー
ニングするのに使用することができる。具体的な態様において、レポーター遺伝
子はルシフェラーゼまたはβ−Ｇａｌである。

【００９８】 ある態様において、本発明の少なくとも１つの４Ｅ−ＢＰ１とｅＩＦ−４Ｅの
相互作用ドメインは、融合タンパク質として提供されてよい。そのための構築体
の設計と融合タンパク質の発現と産生は、当該分野で周知である（Sambrookら、
1989, 前述；およびAusubelら、1994、前述）。具体的な態様において、両方の
相互作用ドメインは融合タンパク質の一部である。そのような融合タンパク質の
非限定例には、ＬｅｘＡ−４Ｅ−ＢＰ１融合体（ＤＮＡ結合ドメイン−４Ｅ−Ｂ
Ｐ１；えさ）とＢ４２−ｅＩＦ−４Ｅ融合体（トランスアクチベータードメイン
−ｅＩＦ−４Ｅ；獲物）がある。さらに別の具体例において、ＬｅｘＡ−４Ｅ−
ＢＰ１とＢ４２−ｅＩＦ−４Ｅ融合タンパク質は、ＬｅｘＡオペレーターおよび
／またはＬｅｘＡ応答要素に機能的に連結したレポーター遺伝子を有する酵母細
胞中で発現される。もちろん、他の融合タンパク質をそのような２ハイブリッド
系で使用することができることを認識されたい。さらに、融合タンパク質は完全
長４Ｅ−ＢＰ１またはｅＩＦ−４Ｅポリペプチドを含有する必要は無いことは認
識されるであろう。これらのポリペプチドの断片は、相互作用ドメインを含むな
ら、本発明で使用することができる。

【００９９】 そのような融合タンパク質の非限定例には、血球凝集素誘導体であるグルタチ
オン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）融合体およびマルトース結合タンパク
質（ＭＢＰ）融合体がある。ある態様において、融合された２つのポリペプチド
配列の間にプロテアーゼ切断部位を導入することが有用であろう。そのような２
つの異種の融合ポリペプチドの間のプロテアーゼ切断部位は、当該分野で周知で
ある。

【０１００】 ある態様において、本発明の相互作用ドメインを、宿主細胞からの融合タンパ
ク質の分泌を可能にするシグナルペプチド配列に融合することが有用かも知れな
い。多様な生物からのシグナルペプチドは当該分野で周知である。細菌性Ｏｍｐ
Ａおよび酵母Ｓｕｃ２は、シグナル配列を含有するタンパク質の２つの非限定例
である。ある態様において、相互作用ドメインと異種ポリペプチド部分との間に
リンカー（公知である）を導入することが有用かも知れない。そのような融合タ
ンパク質は、本発明のアッセイならびに精製目的、検出目的などに有用である。

【０１０１】 明確にするために、本発明の実施に有用な配列とポリペプチドには、特に限定
されないが、突然変異体、同族体、サブタイプ、アレレなどがある。一般に本発
明の配列は、機能的（たとえ欠陥性であっても）相互作用ドメインをコードする
ことを理解されたい。本発明の相互作用ドメイン、その変種、誘導体、または断
片が、そのパートナーに結合する機能を保持しているかどうかは、本発明の教示
とアッセイおよび当該分野の一般的教示を使用して容易に測定することができる
ことは当業者に明らかであろう。

【０１０２】 以下に例示するように本発明の相互作用ドメインは、例えばインビトロ突然変
異誘発により修飾して、構造−機能相関を検討し、調節化合物のより良好な設計
と同定を可能にするように修飾する。しかし、各相互作用パートナー（４Ｅ−Ｂ
Ｐ１またはｅＩＦ−４Ｅ）と相互作用する生物学的機能を喪失した一部の誘導体
または類似体は、例えば抗体を産生するにはまだ有用かも知れない。そのような
類似体または誘導体は、例えば、本発明の相互作用ドメインに対する抗体を作成
するのに使用することができる。これらの抗体は、検出または精製目的に使用す
ることができる。さらにこれらの抗体は、競合または非競合インヒビターとして
作用し、４Ｅ−ＢＰ１−ｅＩＦ−４Ｅ相互作用の調節物質であることがわかる。

【０１０３】 宿主細胞または指示細胞は、外来性または異種ＤＮＡ（例えば、ＤＮＡ構築体
）が細胞内に導入されている時、これらのＤＮＡにより「トランスフェクト」さ
れている。トランスフェクトするＤＮＡは、染色体ＤＮＡ中に組み込まれて（共
有結合して）細胞のゲノムを構成してもしなくてもよい。例えば原核生物、酵母
、および哺乳動物細胞では、トランスフェクトするＤＮＡは、エピソーム成分（
例えば、プラスミド）として維持される。真核細胞に関して、安定にトランスフ
ェクトされる細胞は、トランスフェクトするＤＮＡが染色体複製を介して娘細胞
により遺伝されるように、染色体中に組み込まれるものである。この安定性は、
トランスフェクトするＤＮＡを含有する娘細胞の集団からなる細胞株またはクロ
ーンを樹立する真核細胞の能力により証明される。トランスフェクション法は、
当該分野で周知である（Sambrookら、1989, 前述；およびAusubelら、1994、前
述）。指標としての哺乳動物細胞の使用は、中間体因子を提供し、これは例えば
、下等真核生物または原核生物には存在しないかも知れない、試験される２つの
ポリペプチドの相互作用を可能にするという利点を与える。もちろん試験される
両方のポリペプチドが直接相互作用する場合は、この利点は無意味になる。例え
ば哺乳動物細胞からの抽出物が、選択された指示細胞中のいくつかの因子の欠如
を補うために、いくつかの態様で使用できることは理解されるであろう。翻訳の
分野は、翻訳抽出物を調製し再構成する方法の充分な教示を与えることは理解さ
れるであろう。

【０１０４】 一般に抗体の調製法（モノクローナル抗体やハイブリドーマを含む）および抗
体を使用する抗原の検出法は当業界で周知である（Campbell, 1984、"Monoclona
l Antibody Technology: Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecul
ar Biology"中, Elsevier Science Publisher, アムステルダム、オランダ）お
よびHarlowら、1988（Antibody- A Laboratory Manual, CSH Laboratories中）
。本発明はまた、各相互作用ドメインおよび／またはそれに特異的なものを阻害
または中和するポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、またはそのヒト化体
、キメラ抗体などを提供する。

【０１０５】 明細書と添付の特許請求の範囲から、治療薬という用語は、少なくとも２つの
治療薬の組合せを含むように、広い意味でとるべきである。さらに本発明のＤＮ
Ａセグメントまたはタンパク質は、多くの方法で個体に導入することができる。
例えば造血細胞は、罹患し、罹患した個体から単離され、本発明のＤＮＡ構築体
で形質転換され、罹患した個体に多くの方法（静脈内注射を含む）で再導入され
る。あるいはＤＮＡ構築体は、例えば骨髄中に注入して、罹患した個体に直接投
与される。ＤＮＡ構築体はまた、特定の細胞タイプを標的とするように設計する
ことができ、異なる経路を介して投与されるように操作されたビヒクル（例えば
、リポソーム）を介して送達することができる。

【０１０６】 ある具体的な態様において本発明は、４Ｅ−ＢＰ１発現の低下または完全な排
除を含む、体重関連疾患または症状を治療する手段を提供する。４Ｅ−ＢＰ１発
現の欠如は脂肪組織を減少させることを証明したことは、動物の脂肪減少を達成
する無数の手段を提供することは認識されるであろう。そのような手段の非限定
例には、４Ｅ−ＢＰ１花虫類（anthozoans）、４Ｅ−ＢＰ１リガンド（例えば、
抗体）、４Ｅ−ＢＰ１突然変異体（例えば、ｅＩＦ−４Ｅ相互作用ドメインの突
然変異体）などがある。

【０１０７】 ヒトへの投与のために、処方する医師が、患者にとって適当な剤型と投与量を
最終的に決定し、これは、選択された治療法（例えば、ＤＮＡ構築体、タンパク
質、分子）、患者の応答と症状、ならびに疾患の重症度に従って変化すると予測
される。

【０１０８】 本発明の範囲内の組成物は、活性物質（例えば、タンパク質、核酸、または分
子）を、有害な副作用を避けながら所望の治療作用を達成するのに有効な量で含
有する。典型的には本発明の核酸は、哺乳動物（例えば、ヒト）に、１日当たり
治療される哺乳動物の体重１kg当たり０．００５〜１mgの用量である。薬剤学的
に許容される調製物および活性物質の塩は、本発明の範囲内にあり、当該分野で
周知である（Remington's Pharmaceutical Sciences、第１６版、Mack編）。ポ
リペプチド、アンタゴニスト、アゴニストなどの投与について、投与される量は
、副作用を避けるように選択される。投与量は、臨床家により従来の因子（例え
ば、疾患の範囲と、患者からの異なるパラメータ）に従って、臨床家により適合
される。典型的には、０．００１〜５０mg/kg/日が哺乳動物に投与される。

【０１０９】 （好適な態様の説明） 本発明の産生法とトランスジェニック動物を以下に記載する。一般に、これら
の動物は、核酸構築体を操作することにより産生され、これは内因性標的化遺伝
子（例えば、４Ｅ−ＢＰ１遺伝子、およびさらに詳しくはマウスの４Ｅ−ＢＰ１
遺伝子）の発現を破壊することができる。既知の方法を使用して、この構築体を
細菌細胞中で増幅し、精製し、ＥＳ細胞または単離した卵母細胞中にトランスフ
ェクトすることができる。トランスフェクトされたＥＳ細胞は次に、胚盤胞中に
注入してキメラを作成する。その子孫に突然変異を伝搬するキメラが同定され選
択される。次にこれらの動物を創始者動物として、選択された動物との交配から
異なる動物系統を得る。次にヘテロ接合性の動物を産生し、さらに交配させてハ
イブリッドＦ１交雑種を得る。Ｆ１ヘテロ接合体をさらに交配させて、４Ｅ−Ｂ
Ｐ１の野生型、ヘテロ接合体、およびホモ接合体ヌル突然変異体（４Ｅ−ＢＰ１
遺伝子の両方のコピーが破壊されている）を作成する。ホモ接合性の動物は次に
、多くの実験で役に立つ。その非限定例には：その表現型の性状解析、および野
生型４Ｅ−ＢＰ１遺伝子または突然変異体もしくは変種４Ｅ−ＢＰ１遺伝子の非
内因性コピーによる相補性による４Ｅ−ＢＰ１活性の再構成がある。４Ｅ−ＢＰ
１遺伝子の突然変異型（例えばヒトから）を発現する動物（または、そこから得
られる細胞）は、４Ｅ−ＢＰ１の突然変異体型をより特異的に調節する化合物に
ついてスクリーニングするために使用することができる。

【０１１０】 従って本発明は、４Ｅ−ＢＰ１が、インビボの基本的な細胞機能の制御物質で
あることを強く示す。この細胞機能は種を越えて発生することが予測される。種
（ヒトマウス、ラット、魚、およびキイロショウジョウバエ（Drosophila）のよ
うな下等動物）の間の４Ｅ−ＢＰ１遺伝子の存在とその保存は、生理における基
本的な役割を支持する。すなわち本発明の方法とアッセイにより同定される４Ｅ
−ＢＰ１−ｅＩＦ−４Ｅ相互作用の調節物質は、ヒトおよび他の動物の肥満や、
脂質またはグルコース代謝の機能異常に関連する他の代謝性疾患の治療に有用な
はずである。

【０１１１】 Ｅｉｆ４ｅｂｐ１遺伝子ターゲティングベクターを構築して、Ｅｉｆ４ｅｂｐ
１エキソン２のスプライスアクセプター部位と最初の５７ヌクレオチドをネオマ
イシン耐性遺伝子で置換した（図１ａ）。エキソン２は、アミノ酸４７〜１０８
をコードし、これはｅＩＦ４Ｅの結合ドメインを包含する。エキソン２の破壊さ
れた部分は、４Ｅ−ＢＰ１のアミノ酸４７〜６６をコードする。線状化したター
ゲティングベクターＤＮＡをＪ１−１２９／ＳＶ胚幹（ＥＳ）細胞中に電気穿孔
後、８００個のＧ４１８耐性コロニーを、相同的組換えについてサザンブロッテ
ィングにより分析した。２つのＥＳクローンが、正しい置換を含有することがわ
かった（図１ｂ）。これらのクローンの１つは、Ｂａｌｂ／ｃ胚盤胞に注入後、
生殖細胞系の伝搬を可能にした。次にヘテロ接合性（Ｅｉｆ４ｅｂｐ１^+/-）マ
ウスを交配して、ホモ接合性（Ｅｉｆ４ｅｂｐ１^-/-）子孫を作成し、これらの
動物中の４Ｅ−ＢＰ１発現の欠損を、ウェスタンブロッティング法により証明し
た（図１ｃ）。４Ｅ−ＢＰ２または４Ｅ−ＢＰ３タンパク質レベルの補償的上昇
は観察されなかったことに注意されたい（データは示していない）。

【０１１２】 Ｅｉｆ４ｅｂｐ１^-/-子孫の数は、メンデルの法則に一致した。通常サイズの
同腹子とマウスは、正常に成長した。２年以上経過後は、寿命の差は観察されず
、Ｅｉｆ４ｅｂｐ１^-/-マウスは、肉眼解剖学的分析では疾患または腫瘍の証拠
は示さなかった。マウスを死ぬまで追跡した。しかし血中グルコースレベルは、
Ｅｉｆ４ｅｂｐ１^-/-マウスではわずかに低かった（約１５％；表１）。野生型
もノックアウトマウスも血漿インスリンレベルは同じであったため、低血糖は高
インスリン血症では説明できなかった（表１）。さらにグルコース運搬体Ｇｌｕ
ｔ−１とＧｌｕｔ−４の量と血漿膜転移は、野生型もノックアウトマウスも同じ
であった（データは示していない）。

【０１１３】

【表２】

【０１１４】 ^* Ｐ＜０．０５ データは、平均±s.e.m.として示す。統計解析は、両側の、
対応のないスチューデントｔ検定を用いて行った。

【０１１５】 主要臓器（例えば、肝臓と腎臓）のルーチンの組織学的観察では、形成異常組
織のような異常はなかった。しかし、野生型同腹子に比較してホモ接合性の雄で
は、体重の約１０％の有意な（Ｐ＜０．０５）低下が観察された（表２）。食物
摂取は野生型もＥｉｆ４ｅｂｐ１^-/-マウスも同じであったため、体重の差は少
食症（hypophagia）のせいではなかった（データは示していない）。体重の減少
は、Ｅｉｆ４ｅｂｐ１^-/-の雄の白色脂肪組織（ＷＡＴ）の重さの約６０％の顕
著な減少により部分的に説明された（表２）。心臓（表２）や他の組織（データ
は示していない）は野生型とＥｉｆ４ｅｂｐ１^-/-マウスの間で有意な体重の差
を示さなかったため、この大きさの低下は、脂肪組織に特異的であった（表２）
。雌のＥｉｆ４ｅｂｐ１^-/-マウスは、同様の表現型を示した（表２）。脂肪組
織の大きさの減少に一致して、Ｅｉｆ４ｅｂｐ１^-/-マウスでは循環レプチンレ
ベルは低下した（約６０％、表１）。トリグリセリドレベルも測定したが、野生
型とノックアウトマウスとの間で統計的に有意な差は観察されなかった（表１）
。しかし、雌のＥｉｆ４ｅｂｐ１^-/-マウスは、雄と比較してその脂肪パッドも
体重中で減少（約５０％、表１）したが、総体重は同程度に減少しなかったため
、この表現型には性的二形性があるようである。

【０１１６】

【表３】

【０１１７】 データは、平均±s.e.m.として示す。ここで試験したマウスは１０〜１２月齢
である。統計解析は、両側の、対応のないスチューデントｔ検定を用いて行った
。

【０１１８】 Ｅｉｆ４ｅｂｐ１^-/-マウスの脂肪組織の減少を考えると、Ｅｉｆ４ｅｂｐ１
の破壊がグルコースホメオスタシスと代謝速度に影響を与えるかどうかを決定す
ることが興味深かった。この可能性を調べるために、インスリン耐性試験を行っ
た。簡単に説明すると、５匹の食物を与えた雄のマウスの血中グルコース濃度を
測定した（１６：３０）５匹の雄のマウスを６時間（３：００〜９：００AM）絶
食させ、インスリン（Eli-Lilly）を腹腔内注射（０．４U/kg）した。血液は、
眼窩後洞または尾静脈から麻酔下で連続的に採取し、血中グルコースレベルを測
定した；インスリン耐性試験を２回行い、平均と平均からの標準偏差を計算した
。

【０１１９】 食物を与えた状態（図２ａ）では、絶食後のグルコースの基礎レベルは、野生
型の同腹子と比較してＥｉｆ４ｅｂｐ１^-/-マウスでは約２０％低かった（図２
ｂ、ｔ＝０）。この比は、インスリン処理後と回復中に維持された（図２ｂ）。
すなわち４Ｅ−ＢＰ１^-/-マウスは糖尿病ではなかった。この結果は、インスリ
ンに対応するグルコース取り込みと代謝は、Ｅｉｆ４ｅｂｐ１^-/-マウスでは変
化しないが、Ｅｉｆ４ｅｂｐ１^-/-マウスではグルコースホメオスタシスの一部
の構成的変化が起きていることを示す。グルコース耐性試験も実施したが、野生
型とノックアウトマウスの間で有意な差は観察されなかった（データは示してい
ない）。

【０１２０】 脂肪組織の表現型をさらに性状解析するために、白色脂肪組織（ＷＡＴ）と肩
甲骨間の褐色脂肪組織（ＩＢＡＴ）の組織切片を調べた。Ｅｉｆ４ｅｂｐ１^-/-
マウスの鼠蹊と後腹膜のＷＡＴ（ＩＷＡＴとＲＷＡＴ）は、多房性脂肪組識の数
が顕著に増加し、これは褐色の脂肪組織に特徴的である（図３ａ）。さらにＥｉ
ｆ４ｅｂｐ１^-/- ＩＢＡＴは、より小さな脂質の液滴を示す（図３ａ）。ノッ
クアウトマウスでエネルギー消費が上昇しているなら、これらの組織学的観察を
説明することができる。従ってＥｉｆ４ｅｂｐ１^-/-マウスの休止状態の代謝速
度（ＲＭＲ）を調べ、雄で有意な上昇（約１５％；表３）が観察された。Ｅｉｆ
４ｅｂｐ１^-/-と野生型の雌のマウスのＲＭＲの間の差は、統計的に有意ではな
かった（表３）。

【０１２１】 分子レベルで、ＷＡＴとＢＡＴの間の大きな差は、非結合タンパク質（ＵＣＰ
１）の発現であり、これは、ＢＡＴ内部ミトコンドリア膜中の酸化的リン酸化を
分離させる（Bossら、1998）。ＵＣＰ１は、褐色の脂肪細胞に関連する熱発生の
上昇の原因（Lowellら、1993、およびEnerbackら、1997）であり、この過剰発現
は、マウスの遺伝的肥満を防ぐ（Kopeckyら、1995）。こうして野生型とＥｉｆ
４ｅｂｐ１^-/-マウスからのＩＷＡＴ中のＵＣＰ１とＵＣＰ２ ｍＲＮＡの発現
レベルを調べた（図３ｂ）。多房性脂肪細胞の数の増加に一致して、ＵＣＰ１（
ＵＣＰ２ではない）のｍＲＮＡ発現がＩＷＡＴで約６倍上昇した（図３ｃ）。す
なわち、Ｅｉｆ４ｅｂｐ１ノックアウトマウスの白色の脂肪細胞中で、褐色の脂
肪細胞の組織学的、生理学的、および分子的特徴がすべて明瞭に明らかである。

【０１２２】

【表４】

【０１２３】 ^* Ｐ＜０．０５ 結果のデータは、平均±s.e.m.として示す。統計解析は、両
側の、対応のないスチューデントｔ検定を用いて行った。

【０１２４】 すなわち、ここに提示したデータは、脂肪代謝の制御における４Ｅ−ＢＰ１の
予想外の役割を明らかにする。しかし、この制御を説明する機序はまだ明らかで
はない。代謝の制御における４Ｅ−ＢＰ１の予想外の役割は、タンパク質合成の
調節物質を介するかどうかについての評価を、野生型とＥｉｆ４ｅｂｐ１^-/-マ
ウスから得られる初代胚繊維芽細胞（ＭＥＦ）で調べた。全体的翻訳速度を、³
Ｈ［ロイシン］で代謝標識することにより調べたが、野生型とＥｉｆ４ｅｂｐ１ ^-/- ＭＥＦの間で有意な変化は観察されなかった（データは示していない）。
４Ｅ−ＢＰ１は、キャップ依存性翻訳（キャップ非依存性翻訳ではない）を阻害
（Pauseら、1994、前述）するため、両方の翻訳モードに及ぼすＥｉｆ４ｅｂｐ
１破壊の影響を調べた。すなわち、翻訳がキャップ依存性である構築体（Ｔ７−
ＣＡＴ）からのクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）の
発現を、翻訳がキャップ非依存性であるものからの内部リボゾーム侵入部位（Ｉ
ＲＥＳ）により翻訳が指令される構築体（Ｔ７−ＥＭＣＶ−ＣＡＴ）と比較した
（図４ａ）。４Ｅ−ＢＰ１を排除すると、ｅＩＦ４Ｆ形成のためのｅＩＦ４Ｅの
利用可能性が上昇するため、野生型ＭＥＦの翻訳に比較して４Ｅ−ＢＰ１^-/-の
キャップ依存性翻訳の優先的増強が予測される。この予測に一致して、ＲＮＡ分
子当たりのＣＡＴタンパク質産生量は、野生型ＭＥＦよりＥｉｆ４ｅｂｐ１^-/-
ＭＥＦで１１７％高かった（図４ｂ）。これに対して、ＩＲＥＳ依存性ＥＭＣ
Ｖ-ＣＡＴベクターからのＣＡＴ発現はわずかに低下したのみであった（１５％
；図４ｂ）。この実験で観察された差が、ＲＮＡレベルの差ではなく翻訳の変化
を反映していることを確認するために、リアルタイム検出ＰＣＲ法を使用するＲ
ＮＡ定量を行い（データは示していない）、こうして１０⁹個のＲＮＡコピー当
たりのＣＡＴタンパク質の量を得た（図４ｂ）。これをまとめると、図４ａと４
ｂは、４Ｅ−ＢＰ１の排除により、キャップ依存性翻訳の開始が増強されること
を示す。

【０１２５】 ４Ｅ−ＢＰ１の排除は、ｅＩＦ４Ｆへの取り込みのために利用できるｅＩＦ４
Ｅの量が増加させ、ｅＩＦ４Ｅ過剰発現により引き起こされる翻訳の変化は、細
胞増殖の変化に関連しているため、野生型とＥｉｆ４ｅｂｐ１^-/-初代マウス胚
繊維芽細胞（ＭＥＦ）を調べた。図４ｃに示すように、Ｅｉｆ４ｅｂｐ１^-/-
ＭＥＦは、野生型ＭＥＦより速い増殖速度（１０〜２０％）を示した（図４）。
これはまた、細胞をより長期間培養して維持された時明らかであった（データは
示していない）。

【０１２６】 多くの研究が、細胞増殖と翻訳速度およびｅＩＦ４Ｅリン酸化状態との正の相
関を報告している。さらに２つのキナーゼ（Ｍｎｋ１とＰＫＣ）によるｅＩＦ４
Ｅのインビトロのリン酸化は、４Ｅ−ＢＰ１への結合により阻害されることが証
明されている。Ｅｉｆ４ｅｂｐ１^-/- ＭＥＦを使用して、翻訳速度および細胞
増殖状態と相関することが知られている（Gingrasら、1999）ｅＩＦ４Ｅリン酸
化の状態を試験した。ｅＩＦ４Ｅは、ｅＩＦ４ＧにＭｎｋ１（セリン／スレオニ
ンキナーゼ）が結合することによりリン酸化され、４Ｅ−ＢＰ１がｅＩＦ４Ｅに
結合することにより妨害される（Pyronnetら、1999）。こうしてマウス中の４Ｅ
−ＢＰ１の検出は、ｅＩＦ４Ｅリン酸化の上昇を引き起こすことが予想される。
ｅＩＦ４Ｅリン酸化に対する４Ｅ−ＢＰ１検出の影響を、等電点電気泳動により
分析した（図５ｂ）。ＭＥＦ中のｅＩＦ４Ｅリン酸化は、野生型ＭＥＦ中の１６
％からＥｉｆ４ｅｂｐ１^-/-細胞中の４４％まで上昇した（図５ｃ）。Ｅｉｆ４
ｅｂｐ１^-/-細胞中のｅＩＦ４Ｅリン酸化の上昇が、４Ｅ−ＢＰ１の欠如により
引き起こされたものであることを確認するために、Ｅｉｆ４ｅｂｐ１^-/- ＭＥ
Ｆを４Ｅ−ＢＰ１発現ベクターでトランスフェクトした（ノックアウトインアプ
ローチ）（図５ａ）。ｅＩＦ−４Ｅのリン酸化状態に影響を与える４Ｅ−ＢＰ１
の直接的役割に一致して、Ｅｉｆ４ｅｂｐ１^-/-細胞中での４Ｅ−ＢＰ１の発現
により、ｅＩＦ４Ｅリン酸化が低下した（約６６％）（図５ｂと５ｃ）。こうし
てこれらのデータは、４Ｅ−ＢＰ１がまたｅＩＦ４Ｅリン酸化も制御するという
証拠を提供する。

【０１２７】 これらをまとめると、本明細書に記載したデータは、４Ｅ−ＢＰ１が哺乳動物
のエネルギーホメオスタシスの新規メディエーターであることを示している。さ
らにこれらは翻訳制御を確認し、さらに詳しくは動物のエネルギーホメオスタシ
スにおける主要なプロセスとしてキャップ依存性翻訳を確認する。特定の理論に
拘泥されるつもりはないが、これらの結果を説明する最も可能性の高い機序は、
ｅＩＦ４Ｅ活性のアップレギュレーションであり、これは次に、褐色脂肪細胞の
活性化と機能に関与するｍＲＮＡの翻訳に特異的に影響を与える。そのような候
補ｍＲＮＡの１つは、非結合タンパク質−１（ＵＣＰ１）であり、これは褐色脂
肪細胞の特異的マーカーである。しかしＵＣＰ１ ｍＲＮＡ発現の上昇は、翻訳
開始におけるｅＩＦ４Ｅの機能に直接に関連していない。その代わりｅＩＦ４Ｅ
は、褐色脂肪細胞の分化、ミトコンドリア生物生成、またはアップレギュレーシ
ョンＵＣＰ１発現に関与する因子をコードするｍＲＮＡの翻訳を刺激するかも知
れない。褐色脂肪細胞の分化を制御する分子決定基は、まだあまり性状解析され
ていない。１つの考えられる候補は、ペルオキシソーム増殖活性化受容体γ（Ｐ
ＰＡＲγ）であり、これは褐色脂肪細胞中のＵＣＰ１プロモーターを特異的にト
ランス活性化することができる（Wuら、1999a）。しかしＰＰＡＲγはまた、白
色の脂肪細胞中でも発現され、従ってＵＣＰ１誘導の特異性を説明できない。別
の候補はＰＰＡＲγコアクチベーター１（ＰＧＣ１）であり、これは適合性熱発
生とミトコンドリア生物発生に関与する核受容体のコアクチベーターである（Wu
ら、1999b）。ＰＧＣ１は、３Ｔ３−Ｆ４４２Ａプレ脂肪細胞中で異所性に発現
されるとＵＣＰ１発現を活性化し、Ｃ２Ｃ１２筋管中で発現されるとＵＣＰ２発
現を活性化する。こうしてＰＧＣ１ ｍＲＮＡの発現が翻訳制御下にあるかどう
かを調べることは興味深いであろう。最後に、ｅＩＦ４Ｅは、ＵＣＰ１プロモー
ターを活性化するシグナル伝達経路に関与するタンパク質の発現に影響を与える
ことができる。

【０１２８】 Ｅｉｆ４ｅｂｐ１ノックアウトマウスはすでに報告されているが、そこでは、
本研究で説明したＷＡＴ中の脂肪組織の減少と多房性脂肪細胞の増加の特徴は、
報告も示唆もされていないが、雄のマウスの体重の低下は注目された（Blackshe
arら、1997）。この不一致の可能な説明は、Ｆ０マウスを戻し交配するのに使用
される異なるマウス系統かも知れない。本明細書において１２９株を交配するの
にＢａｌｂ／ｃマウスを使用したが、Blackshearらは、Ｃ５７ＢＬ６／Ｊを使用
した。特に代謝障害を評価するとき、マウスの株依存性表現型変化を示す無数の
報告がある（例えば、Ewart-Tolandら、1999；Surwitら、1995，Colemanら、197
3；およびHummelら、1972）。さらに白色の脂肪中の褐色脂肪細胞の出現は、複
雑な遺伝制御下にあることが証明されており（Guerraら、1998）、これはＵＣＰ
１発現レベルの変動を説明するかも知れない（図３ｂ）。従ってＥｉｆ４ｅｂｐ
１^-/-突然変異は、１２９のキメラを戻し交配するのに最初に使用されたＢａｌ
ｂ／ｃ株に転移されている。近交系バックグランドでは、Ｅｉｆ４ｅｂｐ１^-/-
表現型は、代謝研究がより容易である。Ｂａｌｂ／ｃに基づくそのような遺伝的
バックグランド（例えば、近交系バックグランド）において、変動は最小になる
であろう。キャップ依存性翻訳の意味はグルコース代謝である。

【０１２９】 培養細胞について多数の研究は、ｅＩＦ４Ｅが細胞増殖の制御において重要な
役割を果たすという証拠を提供した。初期の研究からの結論は本結果により支持
され、これは、動物における翻訳開始は、細胞増殖と体の代謝において重要な役
割を果たすという証拠を提供する。

【０１３０】 ４Ｅ−ＢＰ１−ｅＩＦ−４Ｅ相互作用の特異的調節、ならびにｅＩＦ−４Ｆ強
化複合体の形成とｅＩＦ−４Ｇ１へのｅＩＦ−４Ｅ複合体のレベルの調節は、例
えば脂肪とグルコース代謝を調節するのに使用することができるため、脂肪組織
増殖、代謝、およびグルコースホメオスタシスの制御に４Ｅ−ＢＰ１が関与する
という知見は、薬学的意味がある。この可能性は、４Ｅ−ＢＰ１の排除がマウス
の健康に有害ではないという事実から、特に興味深い。

【０１３１】 さらに、インビボの代謝に関与する生化学的経路としてｅＩＦ４Ｅによる翻訳
開始とｅＩＦ−４Ｇとの関連を確認したため、本発明は、代謝調節物質、特に脂
肪とグルコース代謝調節物質をスクリーニングし同定するための無数のアッセイ
と方法を提供する。

【０１３２】 ２つの機能的４Ｅ−ＢＰ１同族体（４Ｅ−ＢＰ２と４Ｅ−ＢＰ３）が、哺乳動
物中に存在する（Pauseら、1994；およびPoulinら、1998）。これらの間で機能
的な差は報告されていないが、これらの組織分布は異なる（Poulinら、1998；お
よびTsukiyama-Koharaら、1996）。例えば、４Ｅ−ＢＰ１は、他の同族体に比較
してＷＡＴ中により豊富に存在する（データは示していない、Huら、1994；およ
びLinら、1996）。Ｅｉｆ４ｅｂｐ１^-/-マウスにおいて４Ｅ−ＢＰ２と４Ｅ−Ｂ
Ｐ３の存在は、３つすべてのタンパク質の欠失により観察されている表現型を弱
めるかも知れないことが考えられる。すなわち、２重および３重のノックアウト
は、ＷＡＴの減少中でより重症の表現型を示し、またＥｉｆ４ｅｂｐ１^-/-中で
観察されない追加の表現型変化を示すかも知れない。４Ｅ−ＢＰ２、４Ｅ−ＢＰ
３単一ノックアウト動物または２重もしくは３重ノックアウトの実際の表現型は
、正式な試験を待っている。

【０１３３】 図６と図７に示すように、進化的に遠い生物からの無数のタンパク質のｅＩＦ
４Ｅ結合部位（またはｅＩＦ４Ｅ相互作用ドメイン）は、大きな相同性／同一性
を示す。さらにラットとマウスの４Ｅ−ＢＰ１、４Ｅ−ＢＰ２および４Ｅ−ＢＰ
３の配列は、ここに示した領域中のヒトの配列と１００％同一である。ｅＩＦ４
Ｅ結合活性を保持する共通配列が提供される。例えば４Ｅ−ＢＰのコンセンサス
４Ｅ結合部位は、＋ψψＹ−＋ｘＦ／ＡψψｘｘＲｘＳＰ（ここで、＋と−は、
荷電アミノ酸；ψは、疎水性アミノ酸；ｘは任意のアミノ酸；および大文字は、
アミノ酸の公知の一文字コードを意味する）である。好ましくは共通配列は、配
列＋−ψψＹ−＋ｘｆＬψｘｘＲｘＳＰ（ここで、ｆは好適なしかし明らかに必
須ではないアミノ酸Ｐｈｅであり、残りは前の共通配列である）である。さらに
別の態様において、４Ｅ結合共通配列は、配列＋ψｘｘＹｘ＋ＸｆψψまたはＹ
ｘｘｘｘＬψを有する。逆にこれらは、ｅＩＦ−４Ｅまたはその負の制御物質を
設計するのに使用され、これは相互作用しないかまたは低い親和性を示す。これ
らの共通配列は、ｅＩＦ４Ｅ封鎖物質または他のｅＩＦ４Ｅ封鎖物質を設計する
ための出発点として使用できるであろう。

【０１３４】 ４Ｅ−ＢＰ１およびｅＩＦ−４ＧIIから得られる組換えペプチドは、ｍＲＮＡ
の翻訳を阻害することが証明されている（Marcotrigianoら、1999，Molecul. Ce
ll 3:707-716）ことに注意すべきである。

【０１３５】 本発明は、以下の非限定例により詳述される。

【０１３６】 実施例１ Ｅｉｆ４ｅｂｐ１欠損マウスの作成 マウスＥｉｆ４ｅｂｐ１遺伝子の断片（４kb；ＳｐｅＩ−ＳａｌＩ）と（３．
５kb；ＭｓｃＩ−ＢａｍＨＩ）を、ｐＧＫ−Ｎｅｏベクター（ｐｏｌｙＡ−）の
５’末端と３’末端に連結して、遺伝子破壊のためのターゲティングベクターを
構築した。ＤＮＡをＳｐｅＩとＸｈｏＩで消化し、ＬＧＴアガロース（ＦＭＣ）
で精製し、ジーンパルサー（Gene Pulser）（Bio-Rad）でＥＳ細胞（１２９／ｓ
ｖ）中に電気穿孔した。既に記載されているように、細胞をＧ４１８で選択した
。Ｇ４１８耐性クローンを、プローブａ（図１ａ、ｂ）を有するサザンブロッテ
ィングにより、正しいターゲティングについてスクリーニングし、陽性クローン
をプローブｃ（図１ａ、ｂ）で確認した。正しくターゲティングされたヘミ接合
性のＥＳ細胞をＢａｌｂ／ｃ胚盤胞に注入し、キメラマウスをＢａｌｂ／ｃマウ
スに戻し交配して、Ｅｉｆ４ｅｂｐ１^+/-マウスを作成した。ヘテロ接合性マウ
スの交配後、プローブａまたはｂを使用してゲノムサザンブロッティングを行い
、子孫のマウスを遺伝子型判定した（図１ｃ）。マウス組織中の４Ｅ−ＢＰ１の
欠如を、エキソン２の一部（ＳｍａＩ−ＭｓｃＩ、コード領域のヌクレオチド１
４２−２０３）をプローブとして使用してノーザンブロット解析（データは示し
ていない）で、抗４Ｅ−ＢＰ１抗体を使用してウェスタンブロット解析で、確認
した（図１ｃ）。ＭＥＦ細胞を、前記したように１４日齢の胚から調製した。

【０１３７】 実施例２ プラスミドとトランスフェクション ４Ｅ−ＢＰ１発現ベクターを以下のように構築した：マウス４Ｅ−ＢＰ１ ｃ
ＤＮＡをＲＴ−ＰＣＲにより、プライマー５’−ＴＧＣＡＧＧＡＧＡＣＡＴＧＴ
ＣＧ−３’とアンチセンスプライマー５’−ＡＣＡＧＴＴＴＧＡＧＡＴＧＧＡＣ
−３’を使用して、SUPERSCRIPTII（Gibco-BRL）とＰｆｕポリメラーゼ（TOYOBO
）でクローン化した。これを配列決定し、ＣＡＧプロモーター（ＣＭＶ−ＩＥエ
ンハンサーを有するＡＧプロモーター）の制御下でサブクローン化した。ｐＢａ
ｂｅ−ＰＵＲＯベクターからプロマイシン耐性カセットを得て、４Ｅ−ＢＰ１発
現ベクター中に導入し、これをリポフェクチン（Gibco-BRL）でＭＥＦ細胞（６c
mのプレート）中にトランスフェクト（４mg）した。Ｔ７−ＣＡＴはすでに記載
したものであり、ＥＭＣＶ-ＣＡＴは、Sung-Key Jang博士（POHANG Institute o
f Science and Technology、韓国）から供与された。

【０１３８】 実施例３ ｅＩＦ４Ｅの等電点電気泳動 proteanIIミニゲル装置（Bio-Rad）を使用して、既に記載されているように
一次元垂直スラブ等電点電気泳動を行った。９．５Ｍ尿素、３％アンホラインｐ
Ｈ４．５〜５．５、１％アンホラインｐＨ３．５〜１０、２％ＣＨＡＰＳを含有
する５％アクリルアミドゲルで、タンパク質をフォーカシングした。陰極緩衝液
としてヒスチジン（１０mM）を使用し、陽極緩衝液としてグルタミン酸（５０mM
）を使用した。フォーカシングは、５００〜７５０Ｖで３時間行い、次にタンパ
ク質をフッ化ポリビニルピロリドン膜（Immobilon P、Millipore）に移した。既
に記載されている（Fredericksonら、1991）ように、抗ｅＩＦ４Ｅウサギポリク
ローナル抗体を用いてフィルターをプローブ結合させた。

【０１３９】 実施例４ 外因性ＲＮＡの発現とその定量 ＭＥＦ細胞を、Ｔ７−ＣＡＴとＴ７−ＥＭＣＶ−ＣＡＴプラスミドを用いてリ
ポフェクチンによりトランスフェクトし、次に既に記載されている（Takuchiら
、1999）ようにＴ７ ＲＮＡポリメラーゼ遺伝子（ＬＯＴ７−１ ＲＶＶ）を発
現する組換えワクシニアウイルスで感染させた。ＲＮＡ定量は、リアルタイム検
出ＰＣＲ法により、センスプライマー（５’−ＧＧＧＴＧＡＧＴＴＴＣＡＣＣＡ
ＧＴＴＴＴＧＡ−３’）、アンチセンスプライマー（５’−ＣＣＡＣＴＣＡＴＣ
ＧＣＡＧＴＡＣＴＧＴＴＧＴ−３’）、およびプローブ（５’（ＦＡＭ）−ＣＡ
ＡＴＡＴＧＧＡＣＡＡＣＴＴＣＴＴＣＧＣＣＣＣ−（ＴＡＭＲＡ）３’）を使用
して、既に記載されている（Yasuiら、1988）ように行った。発現されたＣＡＴ
タンパク質を、ＣＡＴ−ＥＬＩＳＡ（Roche）により測定した。

【０１４０】 実施例５ 酸素消費 Oxymax代謝チャンバー（Columbus Instruments）中で、各実験につき４匹のマ
ウスについて、酸素消費（ＶＯ₂）を同時に測定した。個々のマウス（１８〜２
４週齢）を、空気流０．５Ｌ/分のチャンバー中に入れた。周囲温度は２４．５
〜２５．５℃に維持した。雄のマウスの実験は１２：００pm〜３：００pmに行い
、雌のマウスの実験は３：００pm〜６：００pmに行った。不安を解消させるため
に、マウスをチャンバーに１時間入れてから実験を開始した。５０分間かけて１
０分間隔で５つの読み値を得て、平均した。

【０１４１】 実施例６ 代謝パラメータ 雄のマウスに、自由に飲食させた（Ｆｅｄ）かまたは６時間絶食（Ｆａｓｔｅ
ｄ）させた。血清グルコースレベルを、One Touch Basicグルコメーター（Lifes
can Canada Ltd.）を使用して測定した。Ｆｅｄのインスリンレベルは、放射免
疫定量法（Linco）を使用して測定した。Ｆｅｄの血清レプチンレベルは、ＥＬ
ＩＳＡ（R & D Systems）により測定した。Ｆｅｄの血清トリグリセリドレベル
は、トリグリセリド検出キット（WAKO）を使用して測定した。

【０１４２】結論 これらの知見は、キャップ依存性翻訳が、動物のエネルギーホメオスタシス、
およびグルコースと脂肪代謝を有意に制御することを示す。さらに詳しくはこれ
は、これらの決定的に重要な経路における重要な決定基として、ｅＩＦ−４Ｅを
同定している。さらに４Ｅ−ＢＰ１は、翻訳の抑制物質としての機能の結果とし
て、体の代謝の重要な制御物質であることが証明される。

【０１４３】 本発明を好適な実施態様について説明したが、これは特許請求の範囲に記載の
本発明の範囲と性質を逸脱することなく修飾することができる。

【表５】

【表６】

【表７】

【表８】

【表９】

【図面の簡単な説明】

本発明を一般的に説明したが、例として好適な態様を記載する添付の図面を参
照されたい。

【図１】 図１は、マウス４Ｅ−ＢＰ１の遺伝子ターゲティングを示し、ａは標的ベクタ
ー、マウス４Ｅ−ＢＰ１遺伝子の制限酵素地図、および相同的組換え後の突然変
異遺伝子座の構造を示し、コーディングエキソンは、黒い四角（２と３）により
記載され、白い四角は、第３のエキソン中の３’非コーディング部分を示し、サ
ザンブロッティングのプローブとして使用されるゲノム断片は、黒四角（プロー
ブａ、プローブｂ、およびプローブｃ）により示される。遺伝子タイピングのＰ
ＣＲ領域は、黒い線で示され（略語と記号：Ｎｅｏ、ネオマイシントランスフェ
ラーゼ遺伝子、Ｂ、ＢａｍＨＩ、Ｘ、ＸｂａＩ）、ｂは、ＥＳ細胞クローンから
のゲノムＤＮＡのサザンブロット解析を示し、ＤＮＡはＸｂａＩとＢａｍＨＩで
消化し、プローブａ、ｂ、およびｃとハイブリダイズさせ、野生型（ＷＴ）と破
壊された（ＫＯ）アレレのサイズを示す：ＥＳ細胞クローンの遺伝子型を、レー
ンの上に示し、ｃは、ゲノムサザンブロッティング、ＰＣＲおよびウェスタンブ
ロッティングによるマウス子孫の分析を示し、ＷＴとＫＯアレレ（サザン、プロ
ーブｂ、ＢａｍＨＩ）、およびＰＣＲ増幅産物のサイズを示し、マウス遺伝子型
は、レーンの上に示す。

【図２】 図２は、マウス血糖症とインスリン試験を示す。ａは、５匹の雄のマウスの血
中グルコース濃度が測定（１６：３０）されたことを示し、ｂは、５匹の雄のマ
ウスを６時間（３：００〜９：００ＡＭ）絶食させ、インスリン（Eli-Lilly）
を腹腔内注射（０．４U/kg）し、血液は、眼窩後洞または尾静脈から麻酔下で連
続的に採取し、血中グルコースレベルを測定した；インスリン耐性試験を２回行
い、平均と平均からの標準偏差を示す。

【図３】 図３は、褐色の脂肪細胞が、Ｅｉｆ４ｅｂｐ１^-/-マウスで誘導されることを
示す。ａ、野生型（＋／＋）とＥｉｆ４ｅｂｐ１^-/-（−／−）の雄同腹子から
の肩甲骨間の褐色脂肪組織（ＩＢＡＴ）の切片と鼠蹊と後腹膜の白色脂肪組織（
ＩＷＡＴとＲＷＡＴ）。切片は、ヘマトキシリンとエオシンで染色した。ｂ、野
生型（＋／＋）とＥｉｆ４ｅｂｐ１^-/-（−／−）の雄マウスからの、結合して
いないタンパク質１（ＵＣＰ１）、結合していないタンパク質２（ＵＣＰ２）お
よび鼠蹊の白色脂肪組織中のアクチンのｍＲＮＡ発現レベル。データは、Phosph
orimager（登録商標）（Fuji）を使用して定量した。ｃ、ＵＣＰ１とＵＣＰ２の
ｍＲＮＡ発現の定量。レベルは、アクチンに標準化し、平均±s.e.m.（標準誤差
）として示す。統計解析は、Mann-Whitney検定を使用して行い、ＵＣＰ１レベル
は、野生型とＥｉｆ４ｅｂｐ１^-/-マウスの間に有意差（ｐ＜０．０５）があっ
た。

【図４】 図４は、Ｅｉｆ４ｅｂｐ１（−／−）ＭＥＦ中でキャップ依存性翻訳が上昇し
ていることを示す。ａは、発現ベクター、Ｔ７−ＣＡＴとＴ７−ＥＭＣＶ−ＣＡ
Ｔの構造を例示する：Ｔ７転写プロモーター；ＣＡＴ：クロラムフェニコールア
セチルトランスフェラーゼ；ＥＭＣＶ： 脳心筋炎ウイルス；ＩＲＥＳ：内部リ
ボゾーム侵入部位。ｂは、Ｅｉｆ４ｅｂｐ１^-/-（−／−）と野生型（＋／＋）
ＭＥＦ中のＣＡＴタンパク質合成を示す。Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ（Yasuiら
、1998）を発現するＴ７組換えワクシニアウイルスにより、モノシストロニック
Ｔ７−ＣＡＴ（網掛けした棒）とＴ７−ＥＭＣＶ−ＣＡＴ ＲＮＡ（細い線を引
いた棒）を合成した。Ｅｉｆ４ｅｂｐ１^+/+とＥｉｆ４ｅｂｐ１^-/- ＭＥＦ細胞
中の発現されたＣＡＴタンパク質を示し、細胞中の合成ＲＮＡの量をＲＴＤ−Ｐ
ＣＲ（リアルタイム検出ＰＣＲ）により測定した。データは、三重測定した２つ
の実験の平均±s.e.m.（平均の標準誤差）として示す。ｃは、マウス胚繊維芽細
胞の増殖性を示す。ＭＥＦは、前記したように１４日の胚から調製した。ＭＥＦ
は、１０％胎児牛血清と１０mMヘペスを含有するＤＭＥＭ中で維持し、増殖曲線
は、継代５〜６のＭＥＦについて決定し、各細胞の遺伝子型を図に示す。細胞（
１０⁵）を三重測定で直径３５mmのプレートに広げ、３つの独立した実験で計測
し、平均と平均からの標準偏差を計算した。

【図５】 図５は、ｅＩＦ４Ｅリン酸化がＥｉｆ４ｅｂｐ１^-/-（−／−）ＭＥＦで上昇
していることを示し、ａは、Ｅｉｆ４ｅｂｐ１^+/+（野生型（＋／＋））とＥｉ
ｆ４ｅｂｐ１^-/- ＭＥＦ中の４Ｅ−ＢＰ１を示す。細胞をベクター単独（ｖｅ
ｃ．）または４Ｅ−ＢＰ１（ＢＰ１）でトランスフェクトし、タンパク質発現を
、後述するようにウェスタンブロットにより検出した。ｂは、ｅＩＦ４Ｅのリン
酸化状態を示す。リン酸化は、等電点電気泳動、次にポリクローナル抗ｅＩＦ４
Ｅ抗体を使用してウェスタンブロッティング法により評価し、リン酸化されたｅ
ＩＦ４Ｅ（Ｐ．Ｉ．＝５．９）と脱リン酸化されたｅＩＦ４Ｅ（Ｐ．Ｉ．＝６．
３）の強度を、デンシトメーターで測定した。ｅＩＦ４Ｅの定量はリン酸化を示
す。データは、３つの実験の平均±s.e.m.として示す。

【図６】 図６は、４Ｅ−ＢＰの４Ｅ結合部位の配列を整列したものと、４Ｅ封鎖物質と
してまたはさらなる４Ｅ封鎖物質の開発のために使用できる共通配列を示す。薄
い灰色は、アラニンへに突然変異がｅＩＦ−４Ｅへの結合を排除することを示す
（Maderら、1995；およびPoulinら、1998）。濃い灰色は、保存性の高いアミノ
酸位置を示す。＋／−は、荷電アミノ酸を示す。Φは、疎水性アミノ酸を示し、
Ｙはチロシンを意味し、ｆはフェニルアラニンを意味するが、ディクトステリウ
ム・ジスコイデウム（dyctostelium discoideum）共通配列に基づくと、このア
ミノ酸に対する絶対的な必要性は無いようである。Ｌはロイシンを意味し、「．
」は、この特定の位置の４Ｅ結合部位は、特定のアミノ酸には依存しないことを
示す。ｈ＝ヒト（この領域では、マウスとラットが同じ配列を有することに注意
されたい）；ｇｇ＝ガルスガルス（gallus gallus）（ニワトリ）；ｈｒ＝ハロ
シンチア・ロレッツイ（haloncynthia roretzi）；ｂｍ＝ボンビックス・モリ（
bombyx mori）；ｓｍ＝シストソーマ・マンソニ（schistosoma mansoni）；ｄｄ
＝ディクチオステリウム・ジスコイデウム（dyctyostelium discoideum）。Ｙ、
Ｌ、Ｒ、Ｓ、およびＰは、アミノ酸の標準的な一文字コードを意味する。

【図７】 図７は、多くの多様なｅＩＦ−４Ｅ結合タンパク質中に含まれる４Ｅ結合部位
の整列を示す。薄灰色は、アラニンへの突然変異がｅＩＦ４Ｅへの結合を排除す
ることを示す（Maderら、1995；およびPoulinら、1998）。＋／−は、荷電アミ
ノ酸を示す。Φは、疎水性アミノ酸を意味する。ＹとＬは、アミノ酸の標準的な
一文字コードを意味する。 本発明の他の目的、利点および特徴は、添付の図面（これは、例示のためであ
って、決して本発明の範囲を限定するものと解釈してはならない）を参照して、
好適な態様の非限定的な説明を読むことにより、より明らかとなるであろう。

【手続補正書】

【提出日】平成１３年１０月１９日（２００１．１０．１９）

【手続補正２】

【補正対象書類名】図面

【補正対象項目名】図１ａ

【補正方法】変更

【補正の内容】

【図１ａ】

【手続補正３】

【補正対象書類名】図面

【補正対象項目名】図２ａ

【補正方法】変更

【補正の内容】

【図２ａ】

【手続補正４】

【補正対象書類名】図面

【補正対象項目名】図２ｂ

【補正方法】変更

【補正の内容】

【図２ｂ】

【手続補正５】

【補正対象書類名】図面

【補正対象項目名】図３ｃ

【補正方法】変更

【補正の内容】

【図３ｃ】

【手続補正６】

【補正対象書類名】図面

【補正対象項目名】図４ａ

【補正方法】変更

【補正の内容】

【図４ａ】

【手続補正７】

【補正対象書類名】図面

【補正対象項目名】図４ｂ

【補正方法】変更

【補正の内容】

【図４ｂ】

【手続補正８】

【補正対象書類名】図面

【補正対象項目名】図５ｃ

【補正方法】変更

【補正の内容】

【図５ｃ】

【手続補正９】

【補正対象書類名】図面

【補正対象項目名】図６

【補正方法】変更

【補正の内容】

【図６】

【手続補正１０】

【補正対象書類名】図面

【補正対象項目名】図７

【補正方法】変更

【補正の内容】

【図７】

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｐ 3/04 Ａ６１Ｐ 3/04 3/08 3/08 3/10 3/10 43/00 １０５ 43/00 １０５ Ｃ１２Ｎ 5/10 Ｇ０１Ｎ 33/15 Ｚ 15/09 ＺＮＡ 33/50 Ｚ Ｇ０１Ｎ 33/15 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ 33/50 5/00 Ｂ (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ，ＺＷ )，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ， ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ， ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，Ｃ Ｎ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＤＺ，ＥＥ ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ， ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，Ｋ Ｐ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ， ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，Ｓ Ｇ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者 ツキアヤマ−コハラ キョウコ 東京都北区田端３−15−３−408 Ｆターム(参考） 2G045 AA29 AA40 BB20 CA25 CA26 CB01 DA31 DA60 FB02 FB03 4B024 AA10 CA01 DA02 GA11 GA25 4B065 AA91 AB05 BA16 4C084 AA13 AA16 CA62 NA14 ZA702 ZB212 ZC332 ZC352 ZC412 4C086 AA01 EA16 MA01 MA04 NA14 ZA70 ZB21 ZC33 ZC35 ZC41

Claims (41)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 その生殖細胞と体細胞が、４Ｅ−ＢＰ１をコードするＤＮＡ
   にノックアウト突然変異を含有し、かつ対照動物と比較して改変されたグルコー
   スおよび／または脂肪代謝の表現型を示す、非ヒトトランスジェニック動物。
2. 【請求項２】 該動物は哺乳動物である、請求項１のトランスジェニック動
   物。
3. 【請求項３】 該哺乳動物はマウスである、請求項２の哺乳動物。
4. 【請求項４】 請求項１の非ヒトトランスジェニック動物から得られる細胞
   株。
5. 【請求項５】 請求項３のマウスから得られる細胞株。
6. 【請求項６】 その少なくとも一部の細胞が、改変された４Ｅ−ＢＰ１をコ
   ードする改変された遺伝子を含有する、非ヒトトランスジェニック動物の産生方
   法であって、該改変された遺伝子は、該トランスジェニック動物中の野生型４Ｅ
   −ＢＰ１遺伝子を破壊するように標的化されており、 ａ）４Ｅ−ＢＰ１の改変型をコードし、該動物の胚幹細胞（ＥＳ）の該野生型
   ４Ｅ−ＢＰ１遺伝子を標的とし破壊するように設計された、改変された遺伝子を
   提供し； ｂ）該改変された遺伝子を該ＥＳ細胞中に導入し； ｃ）該改変された４Ｅ−ＢＰ１遺伝子が該野生型４Ｅ−ＢＰ１遺伝子を破壊し
   たＥＳ細胞を選択し； ｄ）ｃ）の該選択されたＥＳ細胞を胚盤胞中に注入し； ｅ）ｄ）の該胚盤胞を偽妊娠動物に移植し；そして ｆ）少なくとも一部の細胞が、該改変された４Ｅ−ＢＰ１をコードする該改変
   された４Ｅ−ＢＰ１遺伝子を有するトランスジェニック動物を産生する、 ことを含んでなる上記方法。
7. 【請求項７】 インビボでグルコースまたは脂肪代謝を調節する物質の同定
   方法であって、 ａ）キャップ依存性翻訳の調節物質であることが疑われる物質を動物に投与し
   ； ｂ）工程ａ）の動物中のグルコースおよび／または脂質レベルを測定し、これ
   を、該物質を投与されなかった対照動物と比較することを含んでなり、ここで対
   照動物と比較して工程ａ）の動物のグルコースおよび／または脂質レベルの差は
   、該物質がグルコースまたは脂肪代謝のインビボの調節物質であることを証明す
   る、上記方法。
8. 【請求項８】 キャップ依存性翻訳の該正の調節物質は、４Ｅ−ＢＰ１のレ
   ベルまたは活性の調節物質である、請求項７の方法。
9. 【請求項９】 該物質は、ｅＩＦ−４Ｅとの４Ｅ−ＢＰ１の相互作用を上昇
   および／または強化する、請求項８の方法。
10. 【請求項１０】 該物質は、ｅＩＦ−４Ｅとの４Ｅ−ＢＰ１の相互作用を低
    下および／または弱める、請求項７の方法。
11. 【請求項１１】 該物質は、ｅＩＦ−４Ｆ開始前複合体の量を低下させ、こ
    うしてグルコースまたは脂質代謝に関与するｍＲＮＡの翻訳を低下させる、請求
    項７の方法。
12. 【請求項１２】 ｅＩＦ−４Ｆ開始前複合体の量を低下は、ｅＩＦ−４Ｅ封
    鎖物質との複合体中のｅＩＦ−４Ｅの封鎖が関与する、請求項１１の方法。
13. 【請求項１３】 ｅＩＦ−４Ｅ封鎖物質は、ＹｘｘｘｘＬψ、Ｙｘ＋ｘｆψ
    ψ、＋ψｘＹｘ＋ｘｆψψ、＋ψψＹ−＋ｘＦ／ＡψψｘｘＲｘＳＰ、および＋
    ψψＹ−＋ｘｆＬψｘｘＲｘＳＰ、または＋ψｘＹｘ＋ｘｆＬψｘｘｘｘｘｘ（
    ここで、＋と−は、荷電アミノ酸；ψは、疎水性アミノ酸；ｘは任意のアミノ酸
    ；および大文字は、アミノ酸の公知の一文字コードを意味する）から選択される
    アミノ酸配列を有する配列を含む、請求項１２の方法。
14. 【請求項１４】 該封鎖物質は、４Ｅ−ＢＰ、ｅＩＦ４Ｇ、ｐ８２、ｐ１５
    ０、ｐ１３０、およびｐ２０から選択される、請求項１３の方法。
15. 【請求項１５】 該封鎖物質は、４Ｅ−ＢＰ１、４Ｅ−ＢＰ２、４Ｅ−ＢＰ
    ３、ｅＩＦ−４Ｇ１、ｅＩＦ４−Ｇ２、４Ｅ−ＢＰ、およびｅＩＦ−４Ｇから選
    択される、請求項１４の方法。
16. 【請求項１６】 該封鎖物質は、４Ｅ−ＢＰ１、４Ｅ−ＢＰ２、４Ｅ−ＢＰ
    ３、ｅＩＦ−４Ｇ１、ｅＩＦ−４Ｇ２、４Ｅ−ＢＰ、およびｅＩＦ−４Ｇから選
    択される、請求項１５の方法。
17. 【請求項１７】 インビボでグルコースおよび／または脂肪代謝を調節する
    物質の同定方法であって、 ａ）翻訳的に活性のある翻訳因子調製物と、その翻訳がキャップ依存性である
    キャップ構造を有する少なくとも１つのｍＲＮＡとを提供し； ｂ）該ｍＲＮＡ上の翻訳の開始を測定し、またはキャップ依存性ｍＲＮＡの翻
    訳効率を調節することが疑われる物質の存在下および不存在下で、該ｍＲＮＡの
    キャップへのａ）の少なくとも一部の翻訳因子の結合、またはキャップ構造への
    翻訳因子の結合を測定して、キャップ依存性翻訳を調節する物質を同定し、ここ
    で、その物質の不存在下と比較してその存在下での翻訳活性および／または結合
    の差は、該物質がキャップ依存性翻訳の調節物質であることを証明する； ｃ）ｂ）で同定された該物質を動物に投与し；そして ｄ）工程ｃ）の動物中のグルコースおよび／または脂質レベルを測定し、これ
    を、該物質を投与されなかった対照動物と比較することを含んでなり、ここで対
    照動物と比較して工程ｃ）の動物のグルコースおよび／または脂質レベルの差は
    、該物質がグルコースまたは脂肪代謝のインビボの調節物質であることを証明す
    る、上記方法。
18. 【請求項１８】 該物質は化合物のライブラリーから得られるものである、
    請求項１７の方法。
19. 【請求項１９】 動物は哺乳動物である、請求項１８の方法。
20. 【請求項２０】 該哺乳動物はマウスまたはヒトである、請求項１９の方法
    。
21. 【請求項２１】 請求項１７、１８、１９または２０の方法のいずれか１つ
    により同定される、インビボのグルコースまたは脂肪代謝の調節物質。
22. 【請求項２２】 脂肪組織増殖および／または体重増加を低下させる方法で
    あって、 ａ）封鎖物質からｅＩＦ−４Ｅを脱封鎖する物質を投与し、こうしてｅＩＦ−
    ４Ｆ開始前複合体の形成のために利用できるｅＩＦ−４Ｅの量を増加させ、組織
    増殖および／または体重増加の低下に関与するキャップ依存性ｍＲＮＡの翻訳を
    増加させることを含む、上記方法。
23. 【請求項２３】 ｅＩＦ−４Ｅの該封鎖は、４Ｅ−ＢＰ１との相互作用を介
    する、請求項２２の方法。
24. 【請求項２４】 ４Ｅ−ＢＰ１からのｅＩＦ−４Ｅの脱封鎖は、４Ｅ−ＢＰ
    １のｅＩＦ−４Ｅ相互作用ドメインに特異的な抗体、またはそのエピトープ担持
    部分により行われる、請求項２３の方法。
25. 【請求項２５】 該封鎖の脱封鎖または阻害は、４Ｅ−ＢＰ１の合成の阻害
    により行われる、請求項２４の方法。
26. 【請求項２６】 ４Ｅ−ＢＰ１の合成を阻害する物質を含み、該物質は、４
    Ｅ−ＢＰ１をコードするヌクレオチド配列に相補的なアンチセンスＲＮＡを含む
    、請求項２５の方法。
27. 【請求項２７】 物質が、動物の脂肪組織増殖および／または体重増加を調
    節するかどうかを決定する方法であって、 ａ）翻訳的に活性のある翻訳因子調製物と、その翻訳がキャップ依存性である
    キャップ構造を有する少なくとも１つのｍＲＮＡとを提供し； ｂ）該ｍＲＮＡ上の翻訳の開始を測定し、またはキャップ依存性ｍＲＮＡの翻
    訳効率を調節することが疑われる物質の存在下および不存在下で、該ｍＲＮＡの
    キャップへのａ）の少なくとも一部の翻訳因子の結合、またはそのキャップ構造
    への翻訳因子の結合を測定して、キャップ依存性翻訳を調節する物質を同定し、
    ここで、該物質の不存在下と比較してその存在下での翻訳活性および／または結
    合の差は、該物質がキャップ依存性翻訳の調節物質であることを証明する； ｃ）ｂ）で同定された該物質を動物に投与し；そして ｄ）工程ｃ）の動物中の脂肪組織増殖および／または体重増加を測定し、これ
    を、該物質を投与されなかった対照動物と比較することを含んでなり、ここで対
    照動物と比較して工程ｃ）の動物の脂肪組織増殖および／または体重増加の差は
    、該物質が脂肪組織増殖または体重増加のインビボの調節物質であることを証明
    する、上記方法。
28. 【請求項２８】 該物質は化合物のライブラリーから得られるものである、
    請求項２７の方法。
29. 【請求項２９】 動物は哺乳動物である、請求項２８の方法。
30. 【請求項３０】 該哺乳動物はマウスまたはヒトである、請求項２９の方法
    。
31. 【請求項３１】 請求項２８、２９、３０または３１の方法のいずれか１つ
    により同定される、インビボのグルコースまたは脂肪代謝の調節物質。
32. 【請求項３２】 肥満動物または肥満になりやすい動物に、ｅＩＦ−４Ｆ開
    始前複合体の形成のために利用できるｅＩＦ−４Ｅの量を増加させる物質を投与
    することを含んでなる、肥満の治療方法。
33. 【請求項３３】 該物質は、４Ｅ−ＢＰ１からｅＩＦ−４Ｅを脱封鎖する物
    質である、請求項３２の方法。
34. 【請求項３４】 物質が、動物の肥満を調節するかどうかを決定する方法で
    あって、 ａ）翻訳的に活性のある翻訳因子調製物と、その翻訳がキャップ依存性である
    キャップ構造を有する少なくとも１つのｍＲＮＡとを提供し； ｂ）該ｍＲＮＡ上の翻訳の開始を測定し、またはキャップ依存性ｍＲＮＡの翻
    訳効率を調節することが疑われる物質の存在下および不存在下で、該ｍＲＮＡの
    キャップへのａ）の少なくとも一部の翻訳因子の結合、またはそのキャップ構造
    への翻訳因子の結合を測定して、キャップ依存性翻訳を調節する物質を同定し、
    ここで、該物質の不存在下と比較してその存在下での翻訳活性および／または結
    合の差は、該物質がキャップ依存性翻訳の調節物質であることを証明する； ｃ）ｂ）で同定された該物質を動物に投与し；そして ｄ）工程ｃ）の動物の肥満を評価し、これを、該物質を投与されなかった対照
    動物と比較することを含んでなり、ここで、対照動物と比較して工程ｃ）の動物
    の肥満の差は、該物質が肥満のインビボの調節物質であることを証明する、上記
    方法。
35. 【請求項３５】 該物質は化合物のライブラリーから得られるものである、
    請求項１８の方法。
36. 【請求項３６】 動物は哺乳動物である、請求項３５の方法。
37. 【請求項３７】 該哺乳動物はマウスまたはヒトである、請求項３６の方法
    。
38. 【請求項３８】 請求項７、１７、２２、２７、３４、３５または３６の方
    法のいずれか１つにより同定されるインビボのグルコースおよび／または脂肪代
    謝の調節物質。
39. 【請求項３９】 II型糖尿病に罹っている動物またはII型糖尿病に罹るリス
    クを有する動物に、ｅＩＦ−４Ｆ開始前複合体の形成のために利用できるｅＩＦ
    −４Ｅの量を増加させる物質を投与することを含んでなる、II型糖尿病および関
    連合併症の治療方法。
40. 【請求項４０】 該物質は、４Ｅ−ＢＰ１からｅＩＦ−４Ｅを脱封鎖する物
    質である、請求項３９の方法。
41. 【請求項４１】 グルコースおよび／または脂肪代謝をインビボで調節する
    物質の同定方法であって、 ａ）ｅＩＦ−４Ｅ結合ドメインを含むペプチドと直接結合することができるｅ
    ＩＦ−４Ｅの部分をインキュベートし； ｂ）物質の存在下および不存在下でのｅＩＦ−４Ｅの該部分と該ペプチドの直
    接結合を評価して、物質の不存在下と比較してその存在下での該結合の差が観察
    される時、グルコースおよび／または脂肪代謝を調節する可能性のある物質が同
    定され； ｃ）ｂ）で同定された該物質を動物に投与し；そして ｄ）工程ｃ）の動物のグルコースおよび／または脂肪代謝を測定し、これを、
    該物質を投与されなかった対照動物と比較することを含んでなり、ここで対照動
    物と比較して工程ｃ）の動物のグルコースおよび／または脂質レベルの差は、該
    物質がグルコースまたは脂肪代謝のインビボの調節物質であることを証明する、
    上記方法。