JP2003513645A - メラノコルチン−3レセプター欠失細胞、非ヒトトランスジェニック動物及び体重を調節する化合物の選択方法 - Google Patents
メラノコルチン−3レセプター欠失細胞、非ヒトトランスジェニック動物及び体重を調節する化合物の選択方法Info
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Abstract
(57)【要約】
メラノコルチン−3レセプタータンパク質(MC−3R)をコードする遺伝子を欠失するように細胞と非ヒトトランスジェニック動物を構築した。MC−3R欠失トランスジェニック動物は脂肪量が増加し、除脂肪体重が減少しており、MC−3Rタンパク質が体脂肪及び筋肉量の調節に関与していることを示す。これらのMC−3R欠失トランスジェニック動物を使用してMC−3Rの潜在的モジュレーターを選択及び試験することができる。このデータから体重に作用するMC−3Rモジュレーターのスクリーニング法と、体重の不適切な調節に関連する種々の障害の関連治療法が可能になる。本発明はMC−3R及び/又はMC−4Rの潜在的モジュレーター(例えばアゴニスト又はアンタゴニスト)を選択及び試験するために使用可能なMC−3R/MC−4R二重ノックアウトマウスにも関する。MC−3RはMC−4Rに比較してエネルギー恒常性の調節に非冗長的な役割を果たすことも示す。
Description
【0001】
発明の技術分野
本発明はメラノコルチン−3レセプタータンパク質(MC−3R)をコードす
る遺伝子を欠失するように構築した細胞と非ヒトトランスジェニック動物に関す
る。本明細書ではMC−3R欠失トランスジェニック動物が脂肪量増加と除脂肪
体重減少を示し、MC−3Rタンパク質が体脂肪及び除脂肪体重の調節に関与し
ていることを示す。MC−3R/MC−4R二重ノックアウトマウスを含む本発
明のMC−3R欠失トランスジェニック動物はMC−3Rの潜在的モジュレータ
ー(例えばアゴニスト又はアンタゴニスト)及びMC−3RとMC−4Rの二重
モジュレーターを選択及び試験するために使用することができる。本明細書では
MC−3RがMC−4Rに比較してエネルギー恒常性の調節に非冗長的な役割を
果たすことを示す。従って、本発明は体重に作用するMC−3Rモジュレーター
のスクリーニング法と、メラノコルチンレセプターの1種以上の作用に応答性の
種々の障害又は疾患の関連治療法にも関し、このような疾患としては(食欲低下
、代謝率増加、脂肪摂取量低下又は炭水化物欲求低下により)肥満、(グルコー
ス耐性亢進、インスリン耐性低下により)糖尿病、高血圧、高脂血症、骨関節炎
、癌、胆嚢疾患、睡眠無呼吸、鬱病、不安、強迫、ノイローゼ、不眠症/睡眠障
害、物質乱用、疼痛、男性及び女性性機能不全(インポテンス、性欲低下及び勃
起障害を含む)、発熱、炎症、免役調節、関節リウマチ炎、学習記憶、サイトカ
イン放出調節、皮膚黒硬化、にきび及び他の皮膚障害、神経再生及び神経保護並
びに認知及び記憶増進(アルツハイマー病の治療を含む)が挙げられるが、これ
らに限定されない。
る遺伝子を欠失するように構築した細胞と非ヒトトランスジェニック動物に関す
る。本明細書ではMC−3R欠失トランスジェニック動物が脂肪量増加と除脂肪
体重減少を示し、MC−3Rタンパク質が体脂肪及び除脂肪体重の調節に関与し
ていることを示す。MC−3R/MC−4R二重ノックアウトマウスを含む本発
明のMC−3R欠失トランスジェニック動物はMC−3Rの潜在的モジュレータ
ー(例えばアゴニスト又はアンタゴニスト)及びMC−3RとMC−4Rの二重
モジュレーターを選択及び試験するために使用することができる。本明細書では
MC−3RがMC−4Rに比較してエネルギー恒常性の調節に非冗長的な役割を
果たすことを示す。従って、本発明は体重に作用するMC−3Rモジュレーター
のスクリーニング法と、メラノコルチンレセプターの1種以上の作用に応答性の
種々の障害又は疾患の関連治療法にも関し、このような疾患としては(食欲低下
、代謝率増加、脂肪摂取量低下又は炭水化物欲求低下により)肥満、(グルコー
ス耐性亢進、インスリン耐性低下により)糖尿病、高血圧、高脂血症、骨関節炎
、癌、胆嚢疾患、睡眠無呼吸、鬱病、不安、強迫、ノイローゼ、不眠症/睡眠障
害、物質乱用、疼痛、男性及び女性性機能不全(インポテンス、性欲低下及び勃
起障害を含む)、発熱、炎症、免役調節、関節リウマチ炎、学習記憶、サイトカ
イン放出調節、皮膚黒硬化、にきび及び他の皮膚障害、神経再生及び神経保護並
びに認知及び記憶増進(アルツハイマー病の治療を含む)が挙げられるが、これ
らに限定されない。
【0002】
発明の背景
メラノコルチンレセプターはGタンパク質連合レセプター(GPCR)のロド
プシンサブファミリーに属する。5種の異なるサブタイプが知られている。これ
らのメラノコルチンレセプターはプロオピオメラノコルチン(POMC)遺伝子
に由来するα、β又はγメラノサイト刺激ホルモン(α、β、γ−MSH)等の
ペプチドと結合して活性化される。広範な生理機能がメラノコルチンペプチドと
そのレセプターにより媒介されると考えられている。
プシンサブファミリーに属する。5種の異なるサブタイプが知られている。これ
らのメラノコルチンレセプターはプロオピオメラノコルチン(POMC)遺伝子
に由来するα、β又はγメラノサイト刺激ホルモン(α、β、γ−MSH)等の
ペプチドと結合して活性化される。広範な生理機能がメラノコルチンペプチドと
そのレセプターにより媒介されると考えられている。
【0003】
Desarnaudら(1994,Biochem J.299(2):36
7−372)はマウスMC−3RをコードするcDNAクローンを開示している
。
7−372)はマウスMC−3RをコードするcDNAクローンを開示している
。
【0004】
Roselli−Rehfussら(1993,Proc.Natl.Aca
d.Sci 90:8856−8860)はラットMC−3R cDNAをコー
ドするcDNAクローンを開示している。
d.Sci 90:8856−8860)はラットMC−3R cDNAをコー
ドするcDNAクローンを開示している。
【0005】
YamadaとGantzの米国特許第5,622,860号(1997年4
月22日発行)及び米国特許第5,703,220号(1997年12月30日
発行)は夫々ヒトMC−3RとヒトMC−4RをコードするDNA分子を開示し
ている(Gantzら,1993,J.Biol.Chem.268(11):
8246−8250も参照)。
月22日発行)及び米国特許第5,703,220号(1997年12月30日
発行)は夫々ヒトMC−3RとヒトMC−4RをコードするDNA分子を開示し
ている(Gantzら,1993,J.Biol.Chem.268(11):
8246−8250も参照)。
【0006】
アグーチマウスはコルチコステロン非依存性の肥満を晩発する天然肥満齧歯類
である。このモデルの肥満は131アミノ酸アグーチタンパク質の異所性発現に
起因する。アグーチは通常は毛色を調節する皮膚でしか発現されない。このタン
パク質は毛嚢のGタンパク質連合レセプターであるメラノコルチン−1レセプタ
ー(MC−1R)のパラクリンアンタゴニストである。MC−1Rアゴニスムは
その天然リガンドであるαMSHを介してcAMPを増加し、酵素チロシナーゼ
の発現を増す。MC−1Rのアグーチアンタゴニスムの結果としてチロシナーゼ
が低レベルになると、毛色素フェオメラニンからユーメラニンへの変換が低下す
る。その結果、毛色は黒でなく薄くなる(アグーチ)。アグーチマウスの肥満表
現型は脳でアグーチが発現され、MC−3R及びMC−4Rレセプターを阻害す
るためであると予想された。この推論はアグーチ突然変異マウスの肥満表現型を
反復するMC−4Rノックアウトマウスの作製により確証された(Leeらの1
999年8月3日発行米国特許第5,932,779号参照)。齧歯類では、M
C−4Rはペプチドアゴニスト及びアンタゴニスト(Fanら,1997,Na
ture 385:165−168)やMC−4Rノックアウトマウス(Hus
zarら,1997,Cell 88:131−141、Leeらの1999年
8月3日発行米国特許第5,932,779号も参照)を用いた試験により体重
を調節する摂食行動の主要レギュレーターであると考えられている。
である。このモデルの肥満は131アミノ酸アグーチタンパク質の異所性発現に
起因する。アグーチは通常は毛色を調節する皮膚でしか発現されない。このタン
パク質は毛嚢のGタンパク質連合レセプターであるメラノコルチン−1レセプタ
ー(MC−1R)のパラクリンアンタゴニストである。MC−1Rアゴニスムは
その天然リガンドであるαMSHを介してcAMPを増加し、酵素チロシナーゼ
の発現を増す。MC−1Rのアグーチアンタゴニスムの結果としてチロシナーゼ
が低レベルになると、毛色素フェオメラニンからユーメラニンへの変換が低下す
る。その結果、毛色は黒でなく薄くなる(アグーチ)。アグーチマウスの肥満表
現型は脳でアグーチが発現され、MC−3R及びMC−4Rレセプターを阻害す
るためであると予想された。この推論はアグーチ突然変異マウスの肥満表現型を
反復するMC−4Rノックアウトマウスの作製により確証された(Leeらの1
999年8月3日発行米国特許第5,932,779号参照)。齧歯類では、M
C−4Rはペプチドアゴニスト及びアンタゴニスト(Fanら,1997,Na
ture 385:165−168)やMC−4Rノックアウトマウス(Hus
zarら,1997,Cell 88:131−141、Leeらの1999年
8月3日発行米国特許第5,932,779号も参照)を用いた試験により体重
を調節する摂食行動の主要レギュレーターであると考えられている。
【0007】
宿主でメラノコルチンレセプターを選択的に調節する新規体重障害治療薬を発
見することが望ましい。
見することが望ましい。
【0008】
体重調節に関与する付加レセプターターゲットを同定することも望ましい。
【0009】
本発明はMC−3R欠失動物細胞及び/又はMC−3R/MC−4R欠失動物
細胞、同様にMC−3R又はMC−3R/MC−4Rを欠失する関連非ヒトトラ
ンスジェニック胚、非ヒトトランスジェニック動物及び非ヒトトランスジェニッ
ク同腹子を開示することによりこれらの必要にも応える。
細胞、同様にMC−3R又はMC−3R/MC−4Rを欠失する関連非ヒトトラ
ンスジェニック胚、非ヒトトランスジェニック動物及び非ヒトトランスジェニッ
ク同腹子を開示することによりこれらの必要にも応える。
【0010】
本発明はMC−3Rを調節する化合物のスクリーニングと選択を含む体重に作
用する化合物のスクリーニング法を開示することによりこれらの必要に応える。
用する化合物のスクリーニング法を開示することによりこれらの必要に応える。
【0011】
発明の要約
本発明はMC−3Rをコードする遺伝子の破壊によりMC−3R欠失について
ホモ接合性の動物細胞に関する。従って、本発明はMC−3Rをコードする遺伝
子の破壊によりMC−3Rを欠失する(無MC−3R)非ヒトトランスジェニッ
ク胚、非ヒトトランスジェニック動物及び非ヒトトランスジェニック同腹子にも
関する。
ホモ接合性の動物細胞に関する。従って、本発明はMC−3Rをコードする遺伝
子の破壊によりMC−3Rを欠失する(無MC−3R)非ヒトトランスジェニッ
ク胚、非ヒトトランスジェニック動物及び非ヒトトランスジェニック同腹子にも
関する。
【0012】
本発明は更に動物に固有の機能的MC−3R遺伝子についてヘテロ接合性の動
物細胞、非ヒトトランスジェニック胚、非ヒトトランスジェニック動物及び非ヒ
トトランスジェニック同腹子にも関する。
物細胞、非ヒトトランスジェニック胚、非ヒトトランスジェニック動物及び非ヒ
トトランスジェニック同腹子にも関する。
【0013】
本発明は天然(野生型)MC−3Rの存在下又は不在下で発現されるMC−3
Rタンパク質をコードする非天然遺伝子をもつ動物細胞、非ヒトトランスジェニ
ック胚及び非ヒトトランスジェニック同腹子にも関する。非天然MC−3R遺伝
子はヒトMC−3R遺伝子が好ましい。
Rタンパク質をコードする非天然遺伝子をもつ動物細胞、非ヒトトランスジェニ
ック胚及び非ヒトトランスジェニック同腹子にも関する。非天然MC−3R遺伝
子はヒトMC−3R遺伝子が好ましい。
【0014】
本発明は少なくとも1種の付加メラノコルチンレセプター、特に体重調節に関
与することが分かっているメラノコルチンレセプター(例えばMC−4R)をそ
の野生型形態でコードする別個の対立遺伝子の欠失についてホモ接合、ヘテロ接
合又はヘミ接合性であると共に、MC−3R遺伝子の少なくとも一部の欠失に関
してホモ接合、ヘテロ接合又はヘミ接合性であるトランスジェニック胚、非ヒト
トランスジェニック胚、非ヒトトランスジェニック動物及び非ヒトトランスジェ
ニック同腹子にも関する。従って、本発明の各側面はMC−3R−/+/MC−
4R−/−、MC−3R−/+/MC−4R−/+、MC−3R−/−/MC−
4R−/+であるトランスジェニック胚、非ヒトトランスジェニック胚、非ヒト
トランスジェニック動物及び非ヒトトランスジェニック同腹子と、2種の別個の
対立遺伝子に関するヘミ接合性代替物に関する。本発明の特に好ましい側面はM
C−3R−/−/MC−4R−/−二重ノックアウトマウスと関連トランスジェ
ニック胚、非ヒトトランスジェニック胚、非ヒトトランスジェニック動物及び非
ヒトトランスジェニック同腹子に関する。
与することが分かっているメラノコルチンレセプター(例えばMC−4R)をそ
の野生型形態でコードする別個の対立遺伝子の欠失についてホモ接合、ヘテロ接
合又はヘミ接合性であると共に、MC−3R遺伝子の少なくとも一部の欠失に関
してホモ接合、ヘテロ接合又はヘミ接合性であるトランスジェニック胚、非ヒト
トランスジェニック胚、非ヒトトランスジェニック動物及び非ヒトトランスジェ
ニック同腹子にも関する。従って、本発明の各側面はMC−3R−/+/MC−
4R−/−、MC−3R−/+/MC−4R−/+、MC−3R−/−/MC−
4R−/+であるトランスジェニック胚、非ヒトトランスジェニック胚、非ヒト
トランスジェニック動物及び非ヒトトランスジェニック同腹子と、2種の別個の
対立遺伝子に関するヘミ接合性代替物に関する。本発明の特に好ましい側面はM
C−3R−/−/MC−4R−/−二重ノックアウトマウスと関連トランスジェ
ニック胚、非ヒトトランスジェニック胚、非ヒトトランスジェニック動物及び非
ヒトトランスジェニック同腹子に関する。
【0015】
本発明のトランスジェニック細胞及び動物は非限定的な例として肥満、糖尿病
、心臓血管病、食欲低下、悪液質、癌、男性及び女性性機能不全、疼痛、記憶、
ニューロン再生及び神経障害等の体重調節に関してMC−3R遺伝子及び/又は
タンパク質の活性又はMC−3R遺伝子及び/又はタンパク質の発現に及ぼす調
節効果の試験に有用である。
、心臓血管病、食欲低下、悪液質、癌、男性及び女性性機能不全、疼痛、記憶、
ニューロン再生及び神経障害等の体重調節に関してMC−3R遺伝子及び/又は
タンパク質の活性又はMC−3R遺伝子及び/又はタンパク質の発現に及ぼす調
節効果の試験に有用である。
【0016】
本発明は本明細書に記載するような体重調節に関連する種々の公知障害により
体重調節に作用するこのレセプタータンパク質のモジュレーターを選択するため
のMC−3Rアッセイにも関する。例えば、MC−3Rモジュレーターを使用し
てこれらの体重障害を治療することができ、例えばMC−3Rアゴニストを肥満
の治療又はMC−3Rアンタゴニストを食欲低下と関連障害の治療に使用するこ
とができる。これらのアッセイは細胞アッセイでもよいし、MC−3Rを含む膜
調製物を使用してもよい。MC−3Rの調節はGH、IGF1機能低下に関連す
る成長障害の治療や、虚弱高齢者に生じるような除脂肪体重低下、GH欠損に起
因する他の状態、癌悪液質、鬱病と不安に関連する障害の治療、(食欲低下、代
謝率増加、脂肪摂取量低下又は炭水化物欲求低下により)肥満、(グルコース耐
性亢進、インスリン耐性低下により)糖尿病、高血圧、高脂血症、骨関節炎、癌
、胆嚢疾患、睡眠無呼吸、鬱病、不安、強迫、ノイローゼ、不眠症/睡眠障害、
物質乱用、疼痛、男性及び女性性機能不全(インポテンス、性欲低下及び勃起障
害を含む)、発熱、炎症、免役調節、関節リウマチ炎、学習記憶、サイトカイン
放出調節、皮膚黒硬化、にきび及び他の皮膚障害、神経再生及び神経保護並びに
認知及び記憶増進(アルツハイマー病の治療を含む)にも使用できる。
体重調節に作用するこのレセプタータンパク質のモジュレーターを選択するため
のMC−3Rアッセイにも関する。例えば、MC−3Rモジュレーターを使用し
てこれらの体重障害を治療することができ、例えばMC−3Rアゴニストを肥満
の治療又はMC−3Rアンタゴニストを食欲低下と関連障害の治療に使用するこ
とができる。これらのアッセイは細胞アッセイでもよいし、MC−3Rを含む膜
調製物を使用してもよい。MC−3Rの調節はGH、IGF1機能低下に関連す
る成長障害の治療や、虚弱高齢者に生じるような除脂肪体重低下、GH欠損に起
因する他の状態、癌悪液質、鬱病と不安に関連する障害の治療、(食欲低下、代
謝率増加、脂肪摂取量低下又は炭水化物欲求低下により)肥満、(グルコース耐
性亢進、インスリン耐性低下により)糖尿病、高血圧、高脂血症、骨関節炎、癌
、胆嚢疾患、睡眠無呼吸、鬱病、不安、強迫、ノイローゼ、不眠症/睡眠障害、
物質乱用、疼痛、男性及び女性性機能不全(インポテンス、性欲低下及び勃起障
害を含む)、発熱、炎症、免役調節、関節リウマチ炎、学習記憶、サイトカイン
放出調節、皮膚黒硬化、にきび及び他の皮膚障害、神経再生及び神経保護並びに
認知及び記憶増進(アルツハイマー病の治療を含む)にも使用できる。
【0017】
本明細書で使用する「機能的」なる用語は細胞又はin vitro系に存在
するときに天然又は未改変状態又は環境にあるかのように一般に挙動する遺伝子
又はタンパク質を表すために使用する。従って、非機能的(即ち「非機能的」「
破壊」「改変」等)遺伝子は野生型、天然又は非改変タンパク質として機能しな
いタンパク質をコードするか、あるいはタンパク質を全くコードしない。このよ
うな非機能的遺伝子(例えば非機能的MC−3R遺伝子)は本明細書に記載する
ような相同組換えイベントの産物でもよく、即ち遺伝子の機能的形態を含むター
ゲット染色体の領域に非機能的遺伝子を特異的に標的導入して野生型又は天然遺
伝子を「ノックアウト」させたものでもよい。
するときに天然又は未改変状態又は環境にあるかのように一般に挙動する遺伝子
又はタンパク質を表すために使用する。従って、非機能的(即ち「非機能的」「
破壊」「改変」等)遺伝子は野生型、天然又は非改変タンパク質として機能しな
いタンパク質をコードするか、あるいはタンパク質を全くコードしない。このよ
うな非機能的遺伝子(例えば非機能的MC−3R遺伝子)は本明細書に記載する
ような相同組換えイベントの産物でもよく、即ち遺伝子の機能的形態を含むター
ゲット染色体の領域に非機能的遺伝子を特異的に標的導入して野生型又は天然遺
伝子を「ノックアウト」させたものでもよい。
【0018】
本明細書で使用する「モジュレーター」とはMC−3Rの発現もしくは活性に
変化を生じるか、又はMC−3Rとそのリガンド又は他のタンパク質(例えばア
ゴニスト又はアンタゴニスト)の相互作用の効果に変化を生じる化合物である。
変化を生じるか、又はMC−3Rとそのリガンド又は他のタンパク質(例えばア
ゴニスト又はアンタゴニスト)の相互作用の効果に変化を生じる化合物である。
【0019】
本明細書では本発明のトランスジェニック動物に関して「トランスジーン」及
び「遺伝子」なる用語を使用する。本明細書で使用するトランスジーンとは遺伝
子を含む遺伝子構築物である。トランスジーンは当分野で公知の方法により動物
の細胞の1個以上の染色体に組込まれる。一旦組込まれると、トランスジーンは
トランスジェニック動物の染色体の少なくとも1カ所に担持される。遺伝子はタ
ンパク質をコードするヌクレオチド配列又は構造RNAである。遺伝子及び/又
はトランスジーンは当分野で公知の遺伝子調節エレメント及び/又は構造エレメ
ントを含む場合もある。
び「遺伝子」なる用語を使用する。本明細書で使用するトランスジーンとは遺伝
子を含む遺伝子構築物である。トランスジーンは当分野で公知の方法により動物
の細胞の1個以上の染色体に組込まれる。一旦組込まれると、トランスジーンは
トランスジェニック動物の染色体の少なくとも1カ所に担持される。遺伝子はタ
ンパク質をコードするヌクレオチド配列又は構造RNAである。遺伝子及び/又
はトランスジーンは当分野で公知の遺伝子調節エレメント及び/又は構造エレメ
ントを含む場合もある。
【0020】
本明細書で使用する「動物」なる用語は全動物を表すために使用するが、トラ
ンスジェニック動物と言う場合には、この用語の使用はヒトを除外する。この用
語は胚及び胎児段階を含む全発生段階の個体動物も含む。「トランスジェニック
動物」とは例えば組換えウイルスのマイクロインジェクション又は感染により細
胞下レベルで故意に遺伝子操作することにより直接又は間接的に受容した遺伝情
報をもつ1個以上の細胞を含む動物である。この導入DNA分子は染色体内に組
込んでもよいし、染色体外で複製するDNAでもよい。特に明記するか又は動物
の記載の関係外で解釈する場合を除き、本明細書で使用する「トランスジェニッ
ク動物」なる用語は遺伝情報が生殖細胞系に導入され、その情報を子孫に伝達す
る能力を付与されたトランスジェニック動物を意味する。子孫が実際に遺伝情報
の一部又は全部をもつならば、これらの子孫もトランスジェニック動物である。
遺伝情報は一般にトランスジェニック動物がもつトランスジーンの形態で提供さ
れる。
ンスジェニック動物と言う場合には、この用語の使用はヒトを除外する。この用
語は胚及び胎児段階を含む全発生段階の個体動物も含む。「トランスジェニック
動物」とは例えば組換えウイルスのマイクロインジェクション又は感染により細
胞下レベルで故意に遺伝子操作することにより直接又は間接的に受容した遺伝情
報をもつ1個以上の細胞を含む動物である。この導入DNA分子は染色体内に組
込んでもよいし、染色体外で複製するDNAでもよい。特に明記するか又は動物
の記載の関係外で解釈する場合を除き、本明細書で使用する「トランスジェニッ
ク動物」なる用語は遺伝情報が生殖細胞系に導入され、その情報を子孫に伝達す
る能力を付与されたトランスジェニック動物を意味する。子孫が実際に遺伝情報
の一部又は全部をもつならば、これらの子孫もトランスジェニック動物である。
遺伝情報は一般にトランスジェニック動物がもつトランスジーンの形態で提供さ
れる。
【0021】
本明細書で使用する「標的遺伝子」又は「ノックアウト」(KO)とは非限定
的な例として本明細書に記載する方法等の人的介入により非ヒト動物の生殖細胞
系に導入したDNA配列である。本発明の標的遺伝子としてはコグネート内因性
対立遺伝子、特にMC−3R又はMC−3RとMC−4Rをコードする内因性対
立遺伝子を特異的に改変するように設計した核酸配列が挙げられる。「ノックア
ウト」はMC−3R遺伝子の改変又は好ましくは完全欠失の結果とすることがで
きるが、それだけでなく、例えばMC−3R(及びMC−4R)遺伝子欠失、遺
伝子変異及び/又は遺伝子挿入により天然遺伝子を非機能的又は少なくとも実質
的に非機能的にして「ノックアウト」トランスジェニック動物を生産してもよい
し、MC−3R(又はMC−3RとMC−4R)レセプターの発現又は活性を改
変してもよい。上述のように、活性化MC−3R遺伝子をもたない非ヒトトラン
スジェニック動物は肥満及び他の関連障害におけるMC−3Rの役割を評価する
ために使用することができ、MC−3R/MC−4Rノックアウトは肥満及び本
明細書に記載する他の障害におけるMC−3R/MC−4R二重モジュレーター
の役割を評価するために使用することができる。
的な例として本明細書に記載する方法等の人的介入により非ヒト動物の生殖細胞
系に導入したDNA配列である。本発明の標的遺伝子としてはコグネート内因性
対立遺伝子、特にMC−3R又はMC−3RとMC−4Rをコードする内因性対
立遺伝子を特異的に改変するように設計した核酸配列が挙げられる。「ノックア
ウト」はMC−3R遺伝子の改変又は好ましくは完全欠失の結果とすることがで
きるが、それだけでなく、例えばMC−3R(及びMC−4R)遺伝子欠失、遺
伝子変異及び/又は遺伝子挿入により天然遺伝子を非機能的又は少なくとも実質
的に非機能的にして「ノックアウト」トランスジェニック動物を生産してもよい
し、MC−3R(又はMC−3RとMC−4R)レセプターの発現又は活性を改
変してもよい。上述のように、活性化MC−3R遺伝子をもたない非ヒトトラン
スジェニック動物は肥満及び他の関連障害におけるMC−3Rの役割を評価する
ために使用することができ、MC−3R/MC−4Rノックアウトは肥満及び本
明細書に記載する他の障害におけるMC−3R/MC−4R二重モジュレーター
の役割を評価するために使用することができる。
【0022】
本明細書で使用する「MC−1R」とはメラノコルチン−1レセプターを意味
する。
する。
【0023】
本明細書で使用する「MC−3R」とはメラノコルチン−3レセプターを意味
する。
する。
【0024】
本明細書で使用する「MC−4R」とはメラノコルチン−4レセプターを意味
する。
する。
【0025】
図面の簡単な説明
図1はマウスMC−3Rをコードするヌクレオチド配列(配列番号1)を示す
。
。
【0026】
図2はマウスMC−3Rのアミノ酸配列(配列番号2)を示す。
【0027】
図3はヒトMC−3Rをコードするヌクレオチド配列(配列番号3)を示す。
【0028】
図4はヒトMC−3Rのアミノ酸配列(配列番号4)を示す。
【0029】
図5はターゲティング遺伝子ベクターpAL10の構築の概略図を示す。
【0030】
図6はMC−3Rをコードするマウスゲノム配列との相同組換えにターゲティ
ング遺伝子ベクターpAL10を利用するストラテジーを示す。
ング遺伝子ベクターpAL10を利用するストラテジーを示す。
【0031】
図7A及び7Bは同系交配プログラムで作製したホモ接合及びヘテロ接合MC
−3Rトランスジェニックマウスと野生型マウスのサザンハイブリダイゼーショ
ン(図7A)とPCR分析(図7B)を示す。
−3Rトランスジェニックマウスと野生型マウスのサザンハイブリダイゼーショ
ン(図7A)とPCR分析(図7B)を示す。
【0032】
図8はMC−3Rノックアウト(N=8)、ヘテロ接合(N=7)及び野生型
(N=5)マウスの体組成の比較を示す。5〜6カ月齢雌雄マウス群をDEXA
スキャンし、体組成を測定した。**はノックアウトマウスを野生型マウスに比
較した場合のP<0.01を示す。
(N=5)マウスの体組成の比較を示す。5〜6カ月齢雌雄マウス群をDEXA
スキャンし、体組成を測定した。**はノックアウトマウスを野生型マウスに比
較した場合のP<0.01を示す。
【0033】
図9はMC−3R−/−マウス脳の視床下部弓状(ARC)及び腹内側(VM
H)核におけるMC−3R mRNA発現の不在を示す。野生型(+/+)及び
MC−3R−/−(−/−)雌マウスからの14μm冠状脳切片でin sit
uハイブリダイゼーションを実施した。
H)核におけるMC−3R mRNA発現の不在を示す。野生型(+/+)及び
MC−3R−/−(−/−)雌マウスからの14μm冠状脳切片でin sit
uハイブリダイゼーションを実施した。
【0034】
図10A〜Dは野生型(+/+)、ヘテロ接合突然変異(+/−)及びホモ接
合突然変異(−/−)同腹マウスの成長曲線(A、B)と体組成(C、D)を示
す。群毎に収容したマウス(雄、n=11〜37、雌、n=11〜31)の体重
を毎週測定した。群毎に収容した15〜17及び26〜27週齢雄(n=8〜1
2)及び雌(n=8〜13)F2子孫のDEXAスキャンにより脂肪量と除脂肪
体重を含む体組成を測定した。全値は平均±標準誤差である。統計は両側無対ス
チューデントT検定により実施した。全P値はMC−3R−/−マウスと野生型
マウスの比較である。*P<0.05、**P<0.01。
合突然変異(−/−)同腹マウスの成長曲線(A、B)と体組成(C、D)を示
す。群毎に収容したマウス(雄、n=11〜37、雌、n=11〜31)の体重
を毎週測定した。群毎に収容した15〜17及び26〜27週齢雄(n=8〜1
2)及び雌(n=8〜13)F2子孫のDEXAスキャンにより脂肪量と除脂肪
体重を含む体組成を測定した。全値は平均±標準誤差である。統計は両側無対ス
チューデントT検定により実施した。全P値はMC−3R−/−マウスと野生型
マウスの比較である。*P<0.05、**P<0.01。
【0035】
図11A〜Hは野生型(+/+)、ヘテロ接合突然変異(+/−)及びホモ接
合突然変異(−/−)同腹マウスの脂肪組織量を示す(A〜D)。全マウスは図
10C〜Dで評価したと同一マウスである。脂肪褥:精巣上体(Epi)、卵巣
(Ova)、鼠径(Ing)、腸間膜(Mes)、腹膜後(Retro)及び肩
甲間褐色脂肪組織(BAT)。全値は平均±標準誤差である。統計は両側無対ス
チューデントT検定により実施した。全P値はMC−3R−/−マウスと野生型
マウスの比較である。*P<0.05、**P<0.01。4カ月齢野生型(図
11E、G)及びMC−3R−/−(図11F、H)マウスにおけるBAT(図
11E〜F)とWAT(白色脂肪組織)(図11G、H)の形態も示す。組織は
10%緩衝ホルムアルデヒドで固定し、パラフィン包埋した。8μm切片を切断
し、標準H&E法で染色した。倍率は40倍とした。
合突然変異(−/−)同腹マウスの脂肪組織量を示す(A〜D)。全マウスは図
10C〜Dで評価したと同一マウスである。脂肪褥:精巣上体(Epi)、卵巣
(Ova)、鼠径(Ing)、腸間膜(Mes)、腹膜後(Retro)及び肩
甲間褐色脂肪組織(BAT)。全値は平均±標準誤差である。統計は両側無対ス
チューデントT検定により実施した。全P値はMC−3R−/−マウスと野生型
マウスの比較である。*P<0.05、**P<0.01。4カ月齢野生型(図
11E、G)及びMC−3R−/−(図11F、H)マウスにおけるBAT(図
11E〜F)とWAT(白色脂肪組織)(図11G、H)の形態も示す。組織は
10%緩衝ホルムアルデヒドで固定し、パラフィン包埋した。8μm切片を切断
し、標準H&E法で染色した。倍率は40倍とした。
【0036】
図12A〜Dは野生型(+/+)、ヘテロ接合突然変異[MC−3R−/+]
(+/−)及びホモ接合突然変異[MC−3R−/−](−/−)同腹マウスの
レプチン(A)、インスリン(B)、グルコース(C)及びコルチコステロン(
D)の4種の血漿値を示す。血漿レプチン、インスリン及びグルコース値は図3
B、Dで評価したと同一の6カ月齢マウス(雄、n=8〜12、雌、n=8〜1
3)から測定した。血漿コルチコステロン値は3.5〜4カ月齢マウス(雄、n
=8〜10、雌、n=8)から測定した。全値は平均±標準誤差である。統計は
両側無対スチューデントT検定により実施した。特に指定しない限り、全P値は
MC−3R−/−マウスと野生型マウスの比較である。*P<0.05、**P
<0.01。
(+/−)及びホモ接合突然変異[MC−3R−/−](−/−)同腹マウスの
レプチン(A)、インスリン(B)、グルコース(C)及びコルチコステロン(
D)の4種の血漿値を示す。血漿レプチン、インスリン及びグルコース値は図3
B、Dで評価したと同一の6カ月齢マウス(雄、n=8〜12、雌、n=8〜1
3)から測定した。血漿コルチコステロン値は3.5〜4カ月齢マウス(雄、n
=8〜10、雌、n=8)から測定した。全値は平均±標準誤差である。統計は
両側無対スチューデントT検定により実施した。特に指定しない限り、全P値は
MC−3R−/−マウスと野生型マウスの比較である。*P<0.05、**P
<0.01。
【0037】
図13A〜Fは個別収容して普通固形飼料を与えた雄野生型(+/+、n=1
1)、ヘテロ接合突然変異[MC−3R−/+](+/−、n=20)及びホモ
接合突然変異[MC−3R−/−](−/−、n=16)同腹マウスの摂飼量、
体重増加及び飼料効率を示す。マウスは〜1カ月齢で個別ケージに分離し、摂飼
量を8週間にわたって毎週測定した。(A)1日摂飼量を毎週計算した。6週間
の平均1日摂飼量を右上部の差し込み図に示す。(B)出発体重に対する体重増
加百分率。(C)飼料効率は隔週体重増加を対応する隔週摂飼量で割ることによ
り計算した。雌野生型(+/+、n=11)、ヘテロ接合突然変異[MC−3R −/+ ](+/−、n=7)及びホモ接合突然変異[MC−3R−/−](−/
−、n=10)同腹マウスを個別ケージに分離し、〜1カ月齢で高脂肪飼料を与
えた。(D)10週間の平均1日摂飼量。(E)出発体重に対する体重増加百分
率。(F)飼料効率は隔週体重増加を隔週摂飼量で割ることにより計算した(7
週齢の−/−対+/+、P=0.001)。全値は平均±標準誤差である。統計
は両側無対スチューデントT検定により実施した。全P値はMC−3R−/−マ
ウスと野生型マウスの比較である。*P<0.05、**P<0.01、***
P<0.001。
1)、ヘテロ接合突然変異[MC−3R−/+](+/−、n=20)及びホモ
接合突然変異[MC−3R−/−](−/−、n=16)同腹マウスの摂飼量、
体重増加及び飼料効率を示す。マウスは〜1カ月齢で個別ケージに分離し、摂飼
量を8週間にわたって毎週測定した。(A)1日摂飼量を毎週計算した。6週間
の平均1日摂飼量を右上部の差し込み図に示す。(B)出発体重に対する体重増
加百分率。(C)飼料効率は隔週体重増加を対応する隔週摂飼量で割ることによ
り計算した。雌野生型(+/+、n=11)、ヘテロ接合突然変異[MC−3R −/+ ](+/−、n=7)及びホモ接合突然変異[MC−3R−/−](−/
−、n=10)同腹マウスを個別ケージに分離し、〜1カ月齢で高脂肪飼料を与
えた。(D)10週間の平均1日摂飼量。(E)出発体重に対する体重増加百分
率。(F)飼料効率は隔週体重増加を隔週摂飼量で割ることにより計算した(7
週齢の−/−対+/+、P=0.001)。全値は平均±標準誤差である。統計
は両側無対スチューデントT検定により実施した。全P値はMC−3R−/−マ
ウスと野生型マウスの比較である。*P<0.05、**P<0.01、***
P<0.001。
【0038】
図14A〜Eは個別収容したMC−3R−/−マウスと野生型マウスの代謝率
(A)、歩行活動(B、D)、及び微小運動(C、E)を示す。代謝率と呼吸商
(RER)は雌MC−3R−/−(−/−、n=10)及び野生型(+/+、n
=10)同腹マウスで間接測熱により24時間測定し、毎時平均として報告した
。雌雄MC−3R−/−(−/−、性別毎n=11)及び野生型(+/+、性別
毎n=11)同腹マウスの歩行活動を12時間明12時間暗サイクルで測定し、
移動距離(メートル)として報告した。同一時点で微小運動も測定し、光線遮断
数として報告した。全値は平均±標準誤差である。統計は両側無対スチューデン
トT検定により実施した。全P値はMC−3R−/−マウスと野生型マウスの比
較である。*P<0.05。
(A)、歩行活動(B、D)、及び微小運動(C、E)を示す。代謝率と呼吸商
(RER)は雌MC−3R−/−(−/−、n=10)及び野生型(+/+、n
=10)同腹マウスで間接測熱により24時間測定し、毎時平均として報告した
。雌雄MC−3R−/−(−/−、性別毎n=11)及び野生型(+/+、性別
毎n=11)同腹マウスの歩行活動を12時間明12時間暗サイクルで測定し、
移動距離(メートル)として報告した。同一時点で微小運動も測定し、光線遮断
数として報告した。全値は平均±標準誤差である。統計は両側無対スチューデン
トT検定により実施した。全P値はMC−3R−/−マウスと野生型マウスの比
較である。*P<0.05。
【0039】
図15はターゲティング遺伝子ベクターpAJ7の構築に使用するストラテジ
ーの概略図を示す。
ーの概略図を示す。
【0040】
図16はMC−4Rをコードするマウスゲノム配列との相同組換えにターゲテ
ィング遺伝子ベクターpAJ7を利用するストラテジーを示す。
ィング遺伝子ベクターpAJ7を利用するストラテジーを示す。
【0041】
図17は26週齢雌マウスの体重に及ぼすMC−3R及びMC−4R遺伝子欠
失の効果を示す。
失の効果を示す。
【0042】
図18A〜Bは雌(図18A)MC−3R−/−/MC−4R−/−二重ノッ
クアウトマウスが6週齢でMC−4R−/−マウスよりも有意に(p<0.01
)重いことを示す。26週齢まで雌MC−3R−/−×MC−4R−/−マウス
はMC−4Rのみを欠失する同腹子よりも有意に(〜27%)重く(MC−3R −/− ×MC−4R−/−64.58±1.92g、MC−4R−/−50.7
7±1.48g;n=10〜18;P<0.0001)、同齢の雄MC−3R− /− ×MC−4R−/−マウス(図18B)はMC−4R−/−同腹子よりも有
意に(〜13%)重い(MC−3R−/−×MC−4R−/−62.57±1.
86g、MC−4R−/−55.60±1.70g;n=9〜13;P<0.0
5)。
クアウトマウスが6週齢でMC−4R−/−マウスよりも有意に(p<0.01
)重いことを示す。26週齢まで雌MC−3R−/−×MC−4R−/−マウス
はMC−4Rのみを欠失する同腹子よりも有意に(〜27%)重く(MC−3R −/− ×MC−4R−/−64.58±1.92g、MC−4R−/−50.7
7±1.48g;n=10〜18;P<0.0001)、同齢の雄MC−3R− /− ×MC−4R−/−マウス(図18B)はMC−4R−/−同腹子よりも有
意に(〜13%)重い(MC−3R−/−×MC−4R−/−62.57±1.
86g、MC−4R−/−55.60±1.70g;n=9〜13;P<0.0
5)。
【0043】
図19A〜Bは9週齢雄(図19A)及び雌(図19B)MC−3R−/−×
MC−4R−/−マウスの血漿インスリン値がMC−4Rのみを欠失する同腹子
よりも統計的に高いことを示す(雄:8.88±1.83ng/mlに対してM
C−3R−/−×MC−4R−/−、50.72±17.92ng/ml;n=
11〜13;P<0.05及び雌1.65±0.53ng/mlに対してMC−
3R−/−×MC−4R−/−、8.59±1.63ng/ml;n=10〜1
4;P<0.01)。図19A及び19Bに示すようにグルコース値はMC−3
R−/−×MC−4R−/−マウスとMC−4R−/−マウスで同様である。B
W=体重、ins=インスリン、glu=グルコース、cho=コレステロール
、及びtri=トリグリセリド。
MC−4R−/−マウスの血漿インスリン値がMC−4Rのみを欠失する同腹子
よりも統計的に高いことを示す(雄:8.88±1.83ng/mlに対してM
C−3R−/−×MC−4R−/−、50.72±17.92ng/ml;n=
11〜13;P<0.05及び雌1.65±0.53ng/mlに対してMC−
3R−/−×MC−4R−/−、8.59±1.63ng/ml;n=10〜1
4;P<0.01)。図19A及び19Bに示すようにグルコース値はMC−3
R−/−×MC−4R−/−マウスとMC−4R−/−マウスで同様である。B
W=体重、ins=インスリン、glu=グルコース、cho=コレステロール
、及びtri=トリグリセリド。
【0044】
図20A〜BはMC−3R−/−×MC−4R−/−マウスがMC−4R−/ −
マウスと同等量の飼料を消費し、どちらも7週齢まで野生型(WT)マウスに
比較して有意に過食であったことを示す(図20A)。しかし、雌MC−3R− /− ×MC−4R−/−マウスは5〜6週齢で雌MC−4R−/−マウス及び野
生型(WT)マウスよりも有意に高い飼料効率を示した(図20B)。雄MC−
3R−/−×MC−4R−/−マウスも同様の傾向を示したが、飼料効率は統計
的有意に達しなかった。
比較して有意に過食であったことを示す(図20A)。しかし、雌MC−3R− /− ×MC−4R−/−マウスは5〜6週齢で雌MC−4R−/−マウス及び野
生型(WT)マウスよりも有意に高い飼料効率を示した(図20B)。雄MC−
3R−/−×MC−4R−/−マウスも同様の傾向を示したが、飼料効率は統計
的有意に達しなかった。
【0045】
発明の詳細な説明
本発明は天然MC−3Rタンパク質を欠失するトランスジェニック非ヒト動物
(無MC−3R、MC−3R−/−)、ヘテロ接合トランスジェニック非ヒト動
物、天然MC−3Rの存在下又は不在下で発現される非天然MC−3Rタンパク
質をもつトランスジェニック動物、及びMC−3R欠失トランスジェニック動物
に関する。従って、本発明はMC−3Rをコードする遺伝子の破壊によりMC−
3R欠失についてホモ接合性の動物細胞と、MC−3Rをコードする遺伝子の破
壊によりMC−3Rを欠失する(無MC−3R)非ヒトトランスジェニック胚、
非ヒトトランスジェニック動物及び非ヒトトランスジェニック同腹子に関する。
本発明は動物に固有の機能的MC−3R遺伝子についてヘテロ接合性の動物細胞
、非ヒトトランスジェニック胚、非ヒトトランスジェニック動物及び非ヒトトラ
ンスジェニック同腹子にも関する。更に、本発明は天然(野生型)MC−3Rの
存在下又は不在下で発現されるMC−3Rタンパク質をコードする非天然遺伝子
をもつ動物細胞、非ヒトトランスジェニック胚及び非ヒトトランスジェニック同
腹子にも関する。非天然MC−3R遺伝子はヒトMC−3R遺伝子が好ましい。
(無MC−3R、MC−3R−/−)、ヘテロ接合トランスジェニック非ヒト動
物、天然MC−3Rの存在下又は不在下で発現される非天然MC−3Rタンパク
質をもつトランスジェニック動物、及びMC−3R欠失トランスジェニック動物
に関する。従って、本発明はMC−3Rをコードする遺伝子の破壊によりMC−
3R欠失についてホモ接合性の動物細胞と、MC−3Rをコードする遺伝子の破
壊によりMC−3Rを欠失する(無MC−3R)非ヒトトランスジェニック胚、
非ヒトトランスジェニック動物及び非ヒトトランスジェニック同腹子に関する。
本発明は動物に固有の機能的MC−3R遺伝子についてヘテロ接合性の動物細胞
、非ヒトトランスジェニック胚、非ヒトトランスジェニック動物及び非ヒトトラ
ンスジェニック同腹子にも関する。更に、本発明は天然(野生型)MC−3Rの
存在下又は不在下で発現されるMC−3Rタンパク質をコードする非天然遺伝子
をもつ動物細胞、非ヒトトランスジェニック胚及び非ヒトトランスジェニック同
腹子にも関する。非天然MC−3R遺伝子はヒトMC−3R遺伝子が好ましい。
【0046】
本発明は少なくとも1種の付加メラノコルチンレセプター、特に体重調節に関
与することが分かっているメラノコルチンレセプター(例えばMC−4R)をそ
の野生型形態でコードする別個の対立遺伝子の欠失に関してホモ接合、ヘテロ接
合又はヘミ接合性であると共に、MC−3R遺伝子の少なくとも一部の欠失に関
してホモ接合、ヘテロ接合又はヘミ接合性であるトランスジェニック胚、非ヒト
トランスジェニック胚、非ヒトトランスジェニック動物及び非ヒトトランスジェ
ニック同腹子にも関する。従って、本発明の各側面はMC−3R−/+/MC−
4R−/−、MC−3R−/+/MC−4R−/+、MC−3R−/−/MC−
4R−/+であるトランスジェニック胚、非ヒトトランスジェニック胚、非ヒト
トランスジェニック動物及び非ヒトトランスジェニック同腹子と、2種の別個の
対立遺伝子に関するヘミ接合性代替物に関する。本発明の特に好ましい側面はM
C−3R−/−/MC−4R−/−二重ノックアウトマウスと関連トランスジェ
ニック胚、非ヒトトランスジェニック胚、非ヒトトランスジェニック動物及び非
ヒトトランスジェニック同腹子に関する。本発明のトランスジェニック動物は体
重及び除脂肪体重により表されるような筋肉量の調節におけるMC−3R遺伝子
及び/又はタンパク質の発現と活性に及ぼすモジュレーターの効果の試験に使用
することができ、このような調節としては例えば肥満、糖尿病、食欲低下、悪液
質、癌、男性及び女性性機能不全、疼痛、記憶、ニューロン再生及び神経障害、
GH、IGF1機能低下に関連する成長障害、虚弱高齢者に生じるような除脂肪
体重低下の治療、GH欠損に起因する他の状態、癌悪液質、鬱病と不安に関連す
る障害が挙げられるが、これらに限定されない。本発明のトランスジェニック非
ヒト動物は鬱病や不安等の行動障害と、嗜癖行動(例えばモルヒネやコカイン等
の薬物の慢性使用に関連する嗜癖行動)の試験にも使用することができる。従っ
て、本発明のトランスジェニック動物はMC−3R遺伝子又はタンパク質の発現
と活性に及ぼす所定モジュレーターの効果、MC−3R遺伝子又はタンパク質の
直接モジュレーター、並びに体重の調節に関連する障害の側面を調べるために利
用することができる。
与することが分かっているメラノコルチンレセプター(例えばMC−4R)をそ
の野生型形態でコードする別個の対立遺伝子の欠失に関してホモ接合、ヘテロ接
合又はヘミ接合性であると共に、MC−3R遺伝子の少なくとも一部の欠失に関
してホモ接合、ヘテロ接合又はヘミ接合性であるトランスジェニック胚、非ヒト
トランスジェニック胚、非ヒトトランスジェニック動物及び非ヒトトランスジェ
ニック同腹子にも関する。従って、本発明の各側面はMC−3R−/+/MC−
4R−/−、MC−3R−/+/MC−4R−/+、MC−3R−/−/MC−
4R−/+であるトランスジェニック胚、非ヒトトランスジェニック胚、非ヒト
トランスジェニック動物及び非ヒトトランスジェニック同腹子と、2種の別個の
対立遺伝子に関するヘミ接合性代替物に関する。本発明の特に好ましい側面はM
C−3R−/−/MC−4R−/−二重ノックアウトマウスと関連トランスジェ
ニック胚、非ヒトトランスジェニック胚、非ヒトトランスジェニック動物及び非
ヒトトランスジェニック同腹子に関する。本発明のトランスジェニック動物は体
重及び除脂肪体重により表されるような筋肉量の調節におけるMC−3R遺伝子
及び/又はタンパク質の発現と活性に及ぼすモジュレーターの効果の試験に使用
することができ、このような調節としては例えば肥満、糖尿病、食欲低下、悪液
質、癌、男性及び女性性機能不全、疼痛、記憶、ニューロン再生及び神経障害、
GH、IGF1機能低下に関連する成長障害、虚弱高齢者に生じるような除脂肪
体重低下の治療、GH欠損に起因する他の状態、癌悪液質、鬱病と不安に関連す
る障害が挙げられるが、これらに限定されない。本発明のトランスジェニック非
ヒト動物は鬱病や不安等の行動障害と、嗜癖行動(例えばモルヒネやコカイン等
の薬物の慢性使用に関連する嗜癖行動)の試験にも使用することができる。従っ
て、本発明のトランスジェニック動物はMC−3R遺伝子又はタンパク質の発現
と活性に及ぼす所定モジュレーターの効果、MC−3R遺伝子又はタンパク質の
直接モジュレーター、並びに体重の調節に関連する障害の側面を調べるために利
用することができる。
【0047】
マウスを含むMC−3R欠失トランスジェニック非ヒト動物の作製は特に体重
調節におけるMC−3Rの相互作用に関連してMC−3Rのin vivo機能
を定義するのに有用であり、本明細書に挙げる他の適応症としては(食欲低下、
代謝率増加、脂肪摂取量低下又は炭水化物欲求低下により)肥満、(グルコース
耐性亢進、インスリン耐性低下により)糖尿病、高血圧、高脂血症、骨関節炎、
癌、胆嚢疾患、睡眠無呼吸、鬱病、不安、強迫、ノイローゼ、不眠症/睡眠障害
、物質乱用、疼痛、男性及び女性性機能不全(インポテンス、性欲低下及び勃起
障害を含む)、発熱、炎症、免役調節、関節リウマチ炎、学習記憶、サイトカイ
ン放出調節、皮膚黒硬化、にきび及び他の皮膚障害、神経再生及び神経保護及び
認知並びに記憶増進(アルツハイマー病の治療を含む)が挙げられるが、これら
に限定されない。更に、無MC−3R動物はヒトMC−3R遺伝子の挿入用株と
して使用することができ、MC−3R活性及び発現の調節の種々のアプローチの
設計と評価に有用な動物モデルを提供する。このような改変トランスジェニック
非ヒト動物は細胞培養用細胞源としても使用できる。これらの細胞はMC−3R
発現、活性及びその調節の対応するin vitro試験に使用することができ
る。
調節におけるMC−3Rの相互作用に関連してMC−3Rのin vivo機能
を定義するのに有用であり、本明細書に挙げる他の適応症としては(食欲低下、
代謝率増加、脂肪摂取量低下又は炭水化物欲求低下により)肥満、(グルコース
耐性亢進、インスリン耐性低下により)糖尿病、高血圧、高脂血症、骨関節炎、
癌、胆嚢疾患、睡眠無呼吸、鬱病、不安、強迫、ノイローゼ、不眠症/睡眠障害
、物質乱用、疼痛、男性及び女性性機能不全(インポテンス、性欲低下及び勃起
障害を含む)、発熱、炎症、免役調節、関節リウマチ炎、学習記憶、サイトカイ
ン放出調節、皮膚黒硬化、にきび及び他の皮膚障害、神経再生及び神経保護及び
認知並びに記憶増進(アルツハイマー病の治療を含む)が挙げられるが、これら
に限定されない。更に、無MC−3R動物はヒトMC−3R遺伝子の挿入用株と
して使用することができ、MC−3R活性及び発現の調節の種々のアプローチの
設計と評価に有用な動物モデルを提供する。このような改変トランスジェニック
非ヒト動物は細胞培養用細胞源としても使用できる。これらの細胞はMC−3R
発現、活性及びその調節の対応するin vitro試験に使用することができ
る。
【0048】
本発明の1側面は細胞が動物に固有の機能的MC−3R遺伝子を欠失する動物
を獲得するための方法である。本方法は動物に固有のMC−3R遺伝子の改変形
の遺伝子をトランスジーン形態で提供し、トランスジーンを天然MC−3R遺伝
子の位置又は別の染色体位置で動物の染色体への標的とする。トランスジーンは
エレクトロポレーション、マイクロインジェクション及びリポフェクション等の
当分野で公知の種々の方法により胚性幹細胞に導入することができる。その後、
トランスジーンをもつ細胞を胚盤胞に注入した後、偽妊娠マウスに移植すること
ができる。別法では、トランスジーンを標的導入した胚性幹細胞を受精卵又は桑
実胚と同時培養した後に雌に移植することができる。妊娠後に得られる動物はキ
メラファウンダートランスジェニック動物である。ファウンダー動物を別態様で
使用し、野生型動物と交配すると、改変MC−3R遺伝子についてヘテロ接合性
のF1動物を生産することができる。別態様では、これらのヘテロ接合動物を同
系交配すると、体細胞と生殖細胞が改変MC−3Rについてホモ接合性であり、
従って機能的MC−3R遺伝子を欠失する生存可能なトランスジェニック胚が得
られる。他の態様では、ヘテロ接合動物を使用して細胞系を生産することができ
る。好適態様では、動物はマウスである。
を獲得するための方法である。本方法は動物に固有のMC−3R遺伝子の改変形
の遺伝子をトランスジーン形態で提供し、トランスジーンを天然MC−3R遺伝
子の位置又は別の染色体位置で動物の染色体への標的とする。トランスジーンは
エレクトロポレーション、マイクロインジェクション及びリポフェクション等の
当分野で公知の種々の方法により胚性幹細胞に導入することができる。その後、
トランスジーンをもつ細胞を胚盤胞に注入した後、偽妊娠マウスに移植すること
ができる。別法では、トランスジーンを標的導入した胚性幹細胞を受精卵又は桑
実胚と同時培養した後に雌に移植することができる。妊娠後に得られる動物はキ
メラファウンダートランスジェニック動物である。ファウンダー動物を別態様で
使用し、野生型動物と交配すると、改変MC−3R遺伝子についてヘテロ接合性
のF1動物を生産することができる。別態様では、これらのヘテロ接合動物を同
系交配すると、体細胞と生殖細胞が改変MC−3Rについてホモ接合性であり、
従って機能的MC−3R遺伝子を欠失する生存可能なトランスジェニック胚が得
られる。他の態様では、ヘテロ接合動物を使用して細胞系を生産することができ
る。好適態様では、動物はマウスである。
【0049】
本発明の別の側面はヌル天然MC−3Rバックグラウンドで非天然MC−3R
を発現するトランスジェニック非ヒト動物である。特定態様では、ヌルバックグ
ラウンドは非機能的な改変天然MC−3R遺伝子をもつ動物(即ちノックアウト
)を生産することにより生成される。動物は改変MC−3Rについてヘテロ接合
性(即ち2倍体ゲノムの1対の染色体の各々に遺伝子の異なる対立遺伝子形をも
つ)でもよいし、ホモ接合性(即ち2倍体ゲノムの1対の染色体の各々に同一形
の遺伝子をもつ)でもよいし、ヘミ接合性(即ち2倍体ゲノムの1対の染色体の
一方のみに遺伝子をもつ)でもよいし、非天然MC−3R一方についてホモ接合
性でもよい。好適態様では、動物はマウスである。特定態様では、非天然MC−
3R遺伝子は野生型又は突然変異対立遺伝子、好ましくは野生型又は突然変異ヒ
ト対立遺伝子とすることができる。別態様では、非天然MC−3R遺伝子はプロ
モーターに作動的に連携している。本明細書で使用する作動的に連携とは相互の
方向が変化してもよい2つのエレメント間の機能的結合を表すために使用する。
この特定例では、当分野で自明の通り、遺伝子構築物でコーディング配列から種
々の距離に配置されながらコーディング配列の発現を誘導するようにプロモータ
ーを遺伝子のコーディング配列に作動的に連携できる。別態様は本発明のこの側
面の動物に由来する細胞系及び細胞である。
を発現するトランスジェニック非ヒト動物である。特定態様では、ヌルバックグ
ラウンドは非機能的な改変天然MC−3R遺伝子をもつ動物(即ちノックアウト
)を生産することにより生成される。動物は改変MC−3Rについてヘテロ接合
性(即ち2倍体ゲノムの1対の染色体の各々に遺伝子の異なる対立遺伝子形をも
つ)でもよいし、ホモ接合性(即ち2倍体ゲノムの1対の染色体の各々に同一形
の遺伝子をもつ)でもよいし、ヘミ接合性(即ち2倍体ゲノムの1対の染色体の
一方のみに遺伝子をもつ)でもよいし、非天然MC−3R一方についてホモ接合
性でもよい。好適態様では、動物はマウスである。特定態様では、非天然MC−
3R遺伝子は野生型又は突然変異対立遺伝子、好ましくは野生型又は突然変異ヒ
ト対立遺伝子とすることができる。別態様では、非天然MC−3R遺伝子はプロ
モーターに作動的に連携している。本明細書で使用する作動的に連携とは相互の
方向が変化してもよい2つのエレメント間の機能的結合を表すために使用する。
この特定例では、当分野で自明の通り、遺伝子構築物でコーディング配列から種
々の距離に配置されながらコーディング配列の発現を誘導するようにプロモータ
ーを遺伝子のコーディング配列に作動的に連携できる。別態様は本発明のこの側
面の動物に由来する細胞系及び細胞である。
【0050】
本発明の別の側面はヌル天然MC−3Rバックグラウンドに非天然MC−3R
遺伝子を含むトランスジーンをもつトランスジェニック動物である。本方法は細
胞が機能的MC−3Rタンパク質をコードする天然遺伝子と改変天然MC−3R
遺伝子についてヘテロ接合性である本発明のトランスジェニック動物を提供する
。非天然MC−3R遺伝子を含むトランスジーンについてヘミ接合性の本発明の
トランスジェニック動物とこれらの動物を交配すると、改変天然MC−3R遺伝
子にヘテロ接合性であると同時に非天然MC−3R遺伝子についてヘミ接合性で
ある動物が得られる。このような動物を同系交配すると、非天然MC−3Rにつ
いてホモ接合性又はヘミ接合性であり、改変天然MC−3R遺伝子についてホモ
接合性又はヘテロ接合性である動物が得られる。特定態様では、細胞系を生産し
、方法の段階で生産した動物の任意のものから細胞を分離する。
遺伝子を含むトランスジーンをもつトランスジェニック動物である。本方法は細
胞が機能的MC−3Rタンパク質をコードする天然遺伝子と改変天然MC−3R
遺伝子についてヘテロ接合性である本発明のトランスジェニック動物を提供する
。非天然MC−3R遺伝子を含むトランスジーンについてヘミ接合性の本発明の
トランスジェニック動物とこれらの動物を交配すると、改変天然MC−3R遺伝
子にヘテロ接合性であると同時に非天然MC−3R遺伝子についてヘミ接合性で
ある動物が得られる。このような動物を同系交配すると、非天然MC−3Rにつ
いてホモ接合性又はヘミ接合性であり、改変天然MC−3R遺伝子についてホモ
接合性又はヘテロ接合性である動物が得られる。特定態様では、細胞系を生産し
、方法の段階で生産した動物の任意のものから細胞を分離する。
【0051】
本発明のトランスジェニック動物及び細胞は体重調節における非天然MC−3
Rのin vivo機能の判定に有用である。これらの動物は非天然MC−3R
の野生型及び突然変異対立遺伝子の種々の形態について天然MC−3Rヌル欠損
を救済する能力を判定するのにも有用である。これらの動物は種々の化合物が非
天然MC−3Rの発現又は活性のin vivoモジュレーターとして作用する
能力の確認と調査又はin vitro試験のための培養用細胞の提供にも有用
である。
Rのin vivo機能の判定に有用である。これらの動物は非天然MC−3R
の野生型及び突然変異対立遺伝子の種々の形態について天然MC−3Rヌル欠損
を救済する能力を判定するのにも有用である。これらの動物は種々の化合物が非
天然MC−3Rの発現又は活性のin vivoモジュレーターとして作用する
能力の確認と調査又はin vitro試験のための培養用細胞の提供にも有用
である。
【0052】
動物により受容される遺伝情報は天然遺伝子を非機能的にし、「ノックアウト
」動物を生産することができる。あるいは、動物により受容される遺伝情報はレ
シピエントが属する動物種に外来であってもよいし、特定個体レシピエントのみ
に外来であってもよい。後者の場合には、情報は改変することができ、あるいは
天然遺伝子とは別様に発現させることができる。
」動物を生産することができる。あるいは、動物により受容される遺伝情報はレ
シピエントが属する動物種に外来であってもよいし、特定個体レシピエントのみ
に外来であってもよい。後者の場合には、情報は改変することができ、あるいは
天然遺伝子とは別様に発現させることができる。
【0053】
本発明の非ヒトトランスジェニック動物としては非ヒト哺乳動物種が挙げられ
、トランスジェニックマウス、トランスジェニックラット、トランスジェニック
モルモット、トランスジェニックウサギ、トランスジェニックヤギ、トランスジ
ェニック非ヒト霊長類(例えばチンパンジー、アカゲザル及びアフリカミドリザ
ル)及びトランスジェニックウシが挙げられるが、これらに限定されない。トラ
ンスジェニックマウスが好ましく、本明細書で例示する。
、トランスジェニックマウス、トランスジェニックラット、トランスジェニック
モルモット、トランスジェニックウサギ、トランスジェニックヤギ、トランスジ
ェニック非ヒト霊長類(例えばチンパンジー、アカゲザル及びアフリカミドリザ
ル)及びトランスジェニックウシが挙げられるが、これらに限定されない。トラ
ンスジェニックマウスが好ましく、本明細書で例示する。
【0054】
本発明は特にノックアウトトランスジェニックマウスを作製し、これらの改変
動物の体内で種々の潜在的モジュレーターががどのように相互作用するかを試験
することにより肥満と糖尿病に関連するMC−3Rの複雑な機能の分析に関する
。本明細書により詳細に記載するように、天然野生型遺伝子は全能性ES細胞(
例えば本明細書に記載するようなもの)で選択的に不活化され、本発明のトラン
スジェニックマウスを作製するために使用される。任意遺伝子領域を不活化する
技術や、標的相同組換えを使用して特定変異を染色体対立遺伝子に挿入すること
により任意遺伝子領域を任意所望突然変異に改変する技術が利用可能である。マ
ウスMC−3Rノックアウトを生産できるか否かは今日まで分かっていなかった
。従って、本発明はMC−3Rタンパク質の欠損生産を生じるように破壊MC−
3R遺伝子についてヘテロ接合性又はホモ接合性である2倍体動物細胞、非ヒト
トランスジェニック胚、非ヒトトランスジェニック動物及び非ヒトトランスジェ
ニック同腹子に関する。細胞、胚及び非ヒトトランスジェニック動物はMC−3
R活性が野生型レベル未満となるようにMC−3R対立遺伝子の少なくとも1個
を変異させたMC−3Rの2個の染色体対立遺伝子を含む。破壊MC−3R遺伝
子についてホモ接合性の2倍体マウス細胞、胚又は非ヒトトランスジェニックマ
ウスは野生型2倍体細胞に比較して少なくとも約50%〜約100%のMC−3
R活性低下を示そう。破壊MC−3R遺伝子についてヘテロ接合性の2倍体マウ
ス細胞、胚又は非ヒトトランスジェニックマウスは野生型2倍体細胞に比較して
少なくとも約10%〜約100%のMC−3R活性低下を示そう。突然変異MC
−3R遺伝子についてホモ接合性、ヘテロ接合性又はヘミ接合性のマウス細胞に
おける転写、発現及び/又は機能的MC−3R活性レベルを測定するために公知
分子生物学技術を使用することは当業者が予想可能である。従って、本発明は特
にホモ接合性、ヘテロ接合性又はヘミ接合性トランスジェニックマウスを作製し
、これらの改変動物の体内で種々の潜在的モジュレーターがどのように相互作用
するかを試験することにより肥満に関連するMC−3Rの複雑な機能の分析に関
する。好適態様では、本発明の動物を提供し、動物を化合物に暴露し、体重に及
ぼす前記化合物の効果と他の関連生化学及び生理的応答を測定することによりア
ッセイを実施する。化合物に暴露していない遺伝的に類似又は同一の動物におけ
るこれらの測定値と測定値を比較することができる。このような測定を容易にす
る1方法としてはMC−3Rノックアウトマウスと野生型マウスに高脂肪飼料を
与えて肥満を促進する(飼料誘発肥満[DIO])。肥満になった後に、MC−
3Rノックアウトマウスにおける無効果と対照させて野生型マウスにおける体脂
肪低下について潜在的MC−3Rアゴニストの効果を測定することができる。他
の関連障害(例えば糖尿病)におけるMC−3Rモジュレーターの効果を試験す
るにも同様のプロトコールが有用であろう。従って、MC−3Rの調節に関連す
る任意数の複雑なイベントを試験するために本発明の非ヒトトランスジェニック
動物を使用することは当業者が予想可能である。限定するものではないが、付加
例として、MC−3Rがペニスへのシグナル伝達の主要中核であるラミナXを含
む腰髄及び仙髄で発現されるという事実に鑑みて性機能不全におけるMC−3R
の潜在的役割を試験することもできる。本明細書に明記するように、本発明のM
C−3R−/−「ノックアウト」マウスは体重及び除脂肪体重により表される筋
肉量の調節におけるMC−3R遺伝子及び/又はタンパク質の発現と活性に及ぼ
すモジュレーターの効果等の疾患及び障害の研究に使用することができ、例えば
(食欲低下、代謝率増加、脂肪摂取量低下又は炭水化物欲求低下により)肥満、
(グルコース耐性亢進、インスリン耐性低下により)糖尿病、高血圧、高脂血症
、骨関節炎、癌、胆嚢疾患、睡眠無呼吸、鬱病、不安、強迫、ノイローゼ、不眠
症/睡眠障害、物質乱用、疼痛、男性及び女性性機能不全(インポテンス、性欲
低下及び勃起障害を含む)、発熱、炎症、免役調節、関節リウマチ炎、学習記憶
、サイトカイン放出調節、皮膚黒硬化、にきび及び他の皮膚障害、神経再生及び
神経保護、認知及び記憶増進(アルツハイマー病の治療を含む)、食欲低下、悪
液質、疼痛、記憶、ニューロン再生及び神経障害、GH、IGF1機能低下に関
連する成長障害、虚弱高齢者に生じるような除脂肪体重低下の治療、GH欠損に
起因する他の状態、癌悪液質、鬱病と不安に関連する障害、鬱病や不安等の行動
障害、嗜癖行動(例えばモルヒネやコカイン等の薬物の慢性使用に関連する嗜癖
行動)が挙げられるが、これらに限定されない。
動物の体内で種々の潜在的モジュレーターががどのように相互作用するかを試験
することにより肥満と糖尿病に関連するMC−3Rの複雑な機能の分析に関する
。本明細書により詳細に記載するように、天然野生型遺伝子は全能性ES細胞(
例えば本明細書に記載するようなもの)で選択的に不活化され、本発明のトラン
スジェニックマウスを作製するために使用される。任意遺伝子領域を不活化する
技術や、標的相同組換えを使用して特定変異を染色体対立遺伝子に挿入すること
により任意遺伝子領域を任意所望突然変異に改変する技術が利用可能である。マ
ウスMC−3Rノックアウトを生産できるか否かは今日まで分かっていなかった
。従って、本発明はMC−3Rタンパク質の欠損生産を生じるように破壊MC−
3R遺伝子についてヘテロ接合性又はホモ接合性である2倍体動物細胞、非ヒト
トランスジェニック胚、非ヒトトランスジェニック動物及び非ヒトトランスジェ
ニック同腹子に関する。細胞、胚及び非ヒトトランスジェニック動物はMC−3
R活性が野生型レベル未満となるようにMC−3R対立遺伝子の少なくとも1個
を変異させたMC−3Rの2個の染色体対立遺伝子を含む。破壊MC−3R遺伝
子についてホモ接合性の2倍体マウス細胞、胚又は非ヒトトランスジェニックマ
ウスは野生型2倍体細胞に比較して少なくとも約50%〜約100%のMC−3
R活性低下を示そう。破壊MC−3R遺伝子についてヘテロ接合性の2倍体マウ
ス細胞、胚又は非ヒトトランスジェニックマウスは野生型2倍体細胞に比較して
少なくとも約10%〜約100%のMC−3R活性低下を示そう。突然変異MC
−3R遺伝子についてホモ接合性、ヘテロ接合性又はヘミ接合性のマウス細胞に
おける転写、発現及び/又は機能的MC−3R活性レベルを測定するために公知
分子生物学技術を使用することは当業者が予想可能である。従って、本発明は特
にホモ接合性、ヘテロ接合性又はヘミ接合性トランスジェニックマウスを作製し
、これらの改変動物の体内で種々の潜在的モジュレーターがどのように相互作用
するかを試験することにより肥満に関連するMC−3Rの複雑な機能の分析に関
する。好適態様では、本発明の動物を提供し、動物を化合物に暴露し、体重に及
ぼす前記化合物の効果と他の関連生化学及び生理的応答を測定することによりア
ッセイを実施する。化合物に暴露していない遺伝的に類似又は同一の動物におけ
るこれらの測定値と測定値を比較することができる。このような測定を容易にす
る1方法としてはMC−3Rノックアウトマウスと野生型マウスに高脂肪飼料を
与えて肥満を促進する(飼料誘発肥満[DIO])。肥満になった後に、MC−
3Rノックアウトマウスにおける無効果と対照させて野生型マウスにおける体脂
肪低下について潜在的MC−3Rアゴニストの効果を測定することができる。他
の関連障害(例えば糖尿病)におけるMC−3Rモジュレーターの効果を試験す
るにも同様のプロトコールが有用であろう。従って、MC−3Rの調節に関連す
る任意数の複雑なイベントを試験するために本発明の非ヒトトランスジェニック
動物を使用することは当業者が予想可能である。限定するものではないが、付加
例として、MC−3Rがペニスへのシグナル伝達の主要中核であるラミナXを含
む腰髄及び仙髄で発現されるという事実に鑑みて性機能不全におけるMC−3R
の潜在的役割を試験することもできる。本明細書に明記するように、本発明のM
C−3R−/−「ノックアウト」マウスは体重及び除脂肪体重により表される筋
肉量の調節におけるMC−3R遺伝子及び/又はタンパク質の発現と活性に及ぼ
すモジュレーターの効果等の疾患及び障害の研究に使用することができ、例えば
(食欲低下、代謝率増加、脂肪摂取量低下又は炭水化物欲求低下により)肥満、
(グルコース耐性亢進、インスリン耐性低下により)糖尿病、高血圧、高脂血症
、骨関節炎、癌、胆嚢疾患、睡眠無呼吸、鬱病、不安、強迫、ノイローゼ、不眠
症/睡眠障害、物質乱用、疼痛、男性及び女性性機能不全(インポテンス、性欲
低下及び勃起障害を含む)、発熱、炎症、免役調節、関節リウマチ炎、学習記憶
、サイトカイン放出調節、皮膚黒硬化、にきび及び他の皮膚障害、神経再生及び
神経保護、認知及び記憶増進(アルツハイマー病の治療を含む)、食欲低下、悪
液質、疼痛、記憶、ニューロン再生及び神経障害、GH、IGF1機能低下に関
連する成長障害、虚弱高齢者に生じるような除脂肪体重低下の治療、GH欠損に
起因する他の状態、癌悪液質、鬱病と不安に関連する障害、鬱病や不安等の行動
障害、嗜癖行動(例えばモルヒネやコカイン等の薬物の慢性使用に関連する嗜癖
行動)が挙げられるが、これらに限定されない。
【0055】
マウスMC−3R遺伝子(図1、配列番号1、Desarnaudら,199
4,Biochem.J.299(2):367−373参照)は323アミノ
酸長タンパク質(図2、配列番号2)を発現する969ヌクレオチドのオ―プン
リーディングフレーム(ヌクレオチド110〜1078とヌクレオチド1079
〜1081からの「TAG」終結コドン)を含む。このDNA分子は好適ターゲ
ット宿主であるMus musculus(ハツカネズミ)に関連するMC−3
R遺伝子のオープンリーディングフレームに関する。
4,Biochem.J.299(2):367−373参照)は323アミノ
酸長タンパク質(図2、配列番号2)を発現する969ヌクレオチドのオ―プン
リーディングフレーム(ヌクレオチド110〜1078とヌクレオチド1079
〜1081からの「TAG」終結コドン)を含む。このDNA分子は好適ターゲ
ット宿主であるMus musculus(ハツカネズミ)に関連するMC−3
R遺伝子のオープンリーディングフレームに関する。
【0056】
マウスMC−3R遺伝子を含むヌクレオチド配列(図1、配列番号1)は以下
の通りである。
の通りである。
【0057】
【化1】
【0058】
マウスMC−3Rのアミノ酸配列は以下の通りである。
【0059】
【化2】
【0060】
動物に天然に存在するMC−3R遺伝子を天然遺伝子と呼び、突然変異体でな
い場合には野生型とも言うことができる。改変MC−3R遺伝子は宿主動物に固
有の同一MC−3Rを完全にコードすべきではなく、その発現産物は多少程度ま
で改変していてもよいし、完全に不在でもよい。天然MC−3Rの不在下にトラ
ンスジェニック動物で非天然MC−3R遺伝子を発現させることが有用な場合に
は、改変MC−3R遺伝子は動物でヌルノックアウト表現型を誘導することが好
ましい。しかし、より低度に改変したMC−3R遺伝子も有用であり、本発明の
範囲に含まれる。MC−3R突然変異は標的欠失変異、標的置換変異及び/又は
標的挿入変異とすることができる。しかし、好適変異は欠失変異であり、特にM
C−3R遺伝子の全部ではないとしても大半の欠失をもたらすような欠失変異が
特に好ましい。MC−3R遺伝子が改変され、好ましくは完全に欠失したトラン
スジェニック動物を作製する。MC−3R遺伝子欠失、遺伝子改変又は遺伝子挿
入により天然遺伝子を非機能的にし、「ノックアウト」トランスジェニック動物
を生産してもよいし、MC−3Rの発現又は活性を改変してもよい。上述のよう
に、活性化MC−3R遺伝子をもたない非ヒトトランスジェニック動物は肥満及
び他の関連障害におけるMC−3Rの役割を評価するために使用することができ
る。MC−3Rタンパク質はリガンド結合細胞外ドメインと、7個の膜貫通ドメ
インと、アデニルシクラーゼの活性化に関連する細胞内ドメインを含むGタンパ
ク質関連レセプターである。メラノコルチンレセプターはGPCRのロドプシン
サブファミリーに属する。しかし、MC−3Rの数種の特徴(例えばTM1のE
Nモチーフ、TM2とTM3又はTM4とTM5の間のループにおけるCysの
欠失、TM5のMxxxxxxxYモチーフ、及びTM7のDPxxYモチーフ
)は他の全レセプターと共通しており、大半の他のGPCRには欠けている。全
メラノコルチンレセプターはロドプシンサブファミリーの他の全メンバーに存在
する細胞外ループのCys残基を欠失しているので、(例えばTM3とTM5の
上部近傍のCys残基間の)螺旋間ジスルフィド結合は大半の他のGPCRでル
ープ間ジスルフィド結合と同一機能を果たすと思われる。このような公知特徴は
特定宿主MC−3R突然変異を目標とするのに有用である。好適欠失突然変異は
、野生型MC−3Rに関連するオープンリーディングフレームと関連シス作用調
節配列を含む、1ヌクレオチドから遺伝子全体の欠失までのどこででもとするこ
とができる。オープンリーディングフレーム内の小さい欠失は、非機能である確
率が最も高いタンパク質となるフレームシフト変異を生じるよう、3で割れない
ことが好ましい。このような3で割れない小さい欠失は、非機能的切断タンパク
質産物の生成の可能性を増すように、オープンリーディングフレームの5’領域
を標的とすることが好ましい。しかし、上述のように、欠失変異は機能的MC−
3Rタンパク質が発現しないようにMC−3R遺伝子の全部ではないとしても大
半に及ぶことが好ましい。
い場合には野生型とも言うことができる。改変MC−3R遺伝子は宿主動物に固
有の同一MC−3Rを完全にコードすべきではなく、その発現産物は多少程度ま
で改変していてもよいし、完全に不在でもよい。天然MC−3Rの不在下にトラ
ンスジェニック動物で非天然MC−3R遺伝子を発現させることが有用な場合に
は、改変MC−3R遺伝子は動物でヌルノックアウト表現型を誘導することが好
ましい。しかし、より低度に改変したMC−3R遺伝子も有用であり、本発明の
範囲に含まれる。MC−3R突然変異は標的欠失変異、標的置換変異及び/又は
標的挿入変異とすることができる。しかし、好適変異は欠失変異であり、特にM
C−3R遺伝子の全部ではないとしても大半の欠失をもたらすような欠失変異が
特に好ましい。MC−3R遺伝子が改変され、好ましくは完全に欠失したトラン
スジェニック動物を作製する。MC−3R遺伝子欠失、遺伝子改変又は遺伝子挿
入により天然遺伝子を非機能的にし、「ノックアウト」トランスジェニック動物
を生産してもよいし、MC−3Rの発現又は活性を改変してもよい。上述のよう
に、活性化MC−3R遺伝子をもたない非ヒトトランスジェニック動物は肥満及
び他の関連障害におけるMC−3Rの役割を評価するために使用することができ
る。MC−3Rタンパク質はリガンド結合細胞外ドメインと、7個の膜貫通ドメ
インと、アデニルシクラーゼの活性化に関連する細胞内ドメインを含むGタンパ
ク質関連レセプターである。メラノコルチンレセプターはGPCRのロドプシン
サブファミリーに属する。しかし、MC−3Rの数種の特徴(例えばTM1のE
Nモチーフ、TM2とTM3又はTM4とTM5の間のループにおけるCysの
欠失、TM5のMxxxxxxxYモチーフ、及びTM7のDPxxYモチーフ
)は他の全レセプターと共通しており、大半の他のGPCRには欠けている。全
メラノコルチンレセプターはロドプシンサブファミリーの他の全メンバーに存在
する細胞外ループのCys残基を欠失しているので、(例えばTM3とTM5の
上部近傍のCys残基間の)螺旋間ジスルフィド結合は大半の他のGPCRでル
ープ間ジスルフィド結合と同一機能を果たすと思われる。このような公知特徴は
特定宿主MC−3R突然変異を目標とするのに有用である。好適欠失突然変異は
、野生型MC−3Rに関連するオープンリーディングフレームと関連シス作用調
節配列を含む、1ヌクレオチドから遺伝子全体の欠失までのどこででもとするこ
とができる。オープンリーディングフレーム内の小さい欠失は、非機能である確
率が最も高いタンパク質となるフレームシフト変異を生じるよう、3で割れない
ことが好ましい。このような3で割れない小さい欠失は、非機能的切断タンパク
質産物の生成の可能性を増すように、オープンリーディングフレームの5’領域
を標的とすることが好ましい。しかし、上述のように、欠失変異は機能的MC−
3Rタンパク質が発現しないようにMC−3R遺伝子の全部ではないとしても大
半に及ぶことが好ましい。
【0061】
欠失MC−3R遺伝子についてホモ接合性、ヘテロ接合性又はヘミ接合性のト
ランスジェニック動物は、野生型MC−3R活性又は発現をin vivo調節
する化合物を同定し、MC−3Rレセプターの活性化又はアンタゴニスムにより
付与され得る体重調節の側面を研究するのに有用である。マウスを含むMC−3
R欠失トランスジェニック非ヒト動物の作製はMC−3Rのin vivo機能
を決定するのにも有用である。更に、トランスジェニック動物はヒトMC−3R
遺伝子の挿入用株として使用することもでき、MC−3R活性及び発現の調節の
種々のアプローチの設計と評価に有用な動物モデルを提供する。改変MC−3R
遺伝子は宿主動物に固有の同一MC−3Rを完全にコードすべきでなく、その発
現産物は多少程度まで改変していてもよいし、完全に不在でもよい。しかし、よ
り低度に改変したMC−3R遺伝子も有用であり、本発明の範囲に含まれる。本
発明の改変細胞、胚及び/又は非ヒトトランスジェニック動物は細胞培養用細胞
源としても使用できる。これらの細胞はMC−3R発現、活性及びその調節の対
応するin vitro研究に使用することができる。本明細書に開示する非ヒ
トトランスジェニック動物は薬剤アンタゴニスト又はアゴニスト研究、ヒト疾患
の動物モデル、及びMC−3Rに関連する障害又は疾患の治療の試験にも有用で
ある。天然MC−3Rを欠失するトランスジェニック動物はMC−3Rのin
vivo機能を特性決定するのに有用である。天然MC−3Rの不在下に非天然
MC−3Rをもつトランスジェニック動物はMC−3Rに関連する疾患(例えば
肥満)の非ヒトモデルの樹立、非ヒトMC−3Rの研究、非天然遺伝子のモジュ
レーターの研究、更にはin vivoシステムとin vitroシステムで
非天然MC−3Rの活性を区別するために有用である。
ランスジェニック動物は、野生型MC−3R活性又は発現をin vivo調節
する化合物を同定し、MC−3Rレセプターの活性化又はアンタゴニスムにより
付与され得る体重調節の側面を研究するのに有用である。マウスを含むMC−3
R欠失トランスジェニック非ヒト動物の作製はMC−3Rのin vivo機能
を決定するのにも有用である。更に、トランスジェニック動物はヒトMC−3R
遺伝子の挿入用株として使用することもでき、MC−3R活性及び発現の調節の
種々のアプローチの設計と評価に有用な動物モデルを提供する。改変MC−3R
遺伝子は宿主動物に固有の同一MC−3Rを完全にコードすべきでなく、その発
現産物は多少程度まで改変していてもよいし、完全に不在でもよい。しかし、よ
り低度に改変したMC−3R遺伝子も有用であり、本発明の範囲に含まれる。本
発明の改変細胞、胚及び/又は非ヒトトランスジェニック動物は細胞培養用細胞
源としても使用できる。これらの細胞はMC−3R発現、活性及びその調節の対
応するin vitro研究に使用することができる。本明細書に開示する非ヒ
トトランスジェニック動物は薬剤アンタゴニスト又はアゴニスト研究、ヒト疾患
の動物モデル、及びMC−3Rに関連する障害又は疾患の治療の試験にも有用で
ある。天然MC−3Rを欠失するトランスジェニック動物はMC−3Rのin
vivo機能を特性決定するのに有用である。天然MC−3Rの不在下に非天然
MC−3Rをもつトランスジェニック動物はMC−3Rに関連する疾患(例えば
肥満)の非ヒトモデルの樹立、非ヒトMC−3Rの研究、非天然遺伝子のモジュ
レーターの研究、更にはin vivoシステムとin vitroシステムで
非天然MC−3Rの活性を区別するために有用である。
【0062】
本明細書の教示に鑑みて、アンチセンスRNAトランスジーン、リボザイム又
は他のRNA発現モジュレーター又は他のMC−3R RNA生産調節手段(例
えばプロモーター突然変異、転写に関する突然変異)を利用してマウスMC−3
Rタンパク質の発現を部分的又は完全にノックアウトすることは当業者が予想可
能である。本発明で使用するアンチセンストランスジーンは宿主MC−3R遺伝
子の全部又は一部に少なくとも部分的に相補的であり且つ宿主MC−3R遺伝子
によりコードされるターゲット配列、より具体的には宿主MC−3R遺伝子から
発現されるmRNA転写産物にハイブリダイズするポリヌクレオチドをコードす
る。このような任意オリゴヌクレオチド配列は少なくとも約15〜30ヌクレオ
チド長とすべきであり、約30ヌクレオチド長を上回ることが好ましく、この配
列はターゲット宿主遺伝子と実質的に相補的である。アンチセンストランスジー
ンは完全補体である必要はなく、発現されるアンチセンスRNAトランスジーン
が同時タンパク質発現を有効に阻害するように宿主ターゲット遺伝子から発現さ
れるmRNAと有効にハイブリダイズするように十分な配列一致を含むべきであ
る。これらのアンチセンスポリヌクレオチドは目的配列を適当な遺伝子発現ベク
ターにサブクローニングし、本明細書に記載するように使用可能な全能性胚性幹
細胞にこのベクターを導入し、MC−3R欠失非ヒトトランスジェニック動物の
別の形態を作製することにより生産することができる。
は他のRNA発現モジュレーター又は他のMC−3R RNA生産調節手段(例
えばプロモーター突然変異、転写に関する突然変異)を利用してマウスMC−3
Rタンパク質の発現を部分的又は完全にノックアウトすることは当業者が予想可
能である。本発明で使用するアンチセンストランスジーンは宿主MC−3R遺伝
子の全部又は一部に少なくとも部分的に相補的であり且つ宿主MC−3R遺伝子
によりコードされるターゲット配列、より具体的には宿主MC−3R遺伝子から
発現されるmRNA転写産物にハイブリダイズするポリヌクレオチドをコードす
る。このような任意オリゴヌクレオチド配列は少なくとも約15〜30ヌクレオ
チド長とすべきであり、約30ヌクレオチド長を上回ることが好ましく、この配
列はターゲット宿主遺伝子と実質的に相補的である。アンチセンストランスジー
ンは完全補体である必要はなく、発現されるアンチセンスRNAトランスジーン
が同時タンパク質発現を有効に阻害するように宿主ターゲット遺伝子から発現さ
れるmRNAと有効にハイブリダイズするように十分な配列一致を含むべきであ
る。これらのアンチセンスポリヌクレオチドは目的配列を適当な遺伝子発現ベク
ターにサブクローニングし、本明細書に記載するように使用可能な全能性胚性幹
細胞にこのベクターを導入し、MC−3R欠失非ヒトトランスジェニック動物の
別の形態を作製することにより生産することができる。
【0063】
胚性幹細胞(ES)はトランスジーンを導入するターゲット細胞の1例でもあ
る。ES細胞はin vitro培養した移植前の胚から得られ、胚と融合する
ことができる(Evansら,1981,Nature 292:154−15
6;Bradleyら,1984,Nature 309:255−258;G
osslerら,1986,Proc.Nal.Acad.Sci.USA 8
3:9065−9069;及びRobertsonら,1986,Nature
322:445−448)。トランスジーンはDNAトランスフェクション、
マイクロインジェクション又はレトロウイルス媒介形質導入等の種々の標準技術
によりES細胞に効率的に導入することができる。その後、得られた形質転換E
S細胞を非ヒト動物からの胚盤胞と結合することができる。その後、導入したE
S細胞は胚に定着し、得られるキメラ動物の生殖細胞系に加わる(Jaenis
ch,1988,Science 240:1468−1474)。遺伝子標的
トランスジェニックマウスの作製における遺伝子標的ES細胞の使用は1987
年に記載され(Thomasら,Cell 51:503−512(1987)
)、他の文献にも記載されている(Frohmanら,Cell 56:145
−147(1989);Capecchi,Trends in Genet.
5:70−76(198ら,Mol.Biol.Med.6:481−492(
1989);Wagner,EMBO J.9:3025−3032(1990
);Bradleyら,Bio/Technology 10:534−539
(1992))。更にいずれも参考資料として本明細書に組込むCappecc
hiとThomasの1995年11月7日発行米国特許第5,464,764
号、Bermsらの1998年8月4日発行米国特許第5,789,215号も
参照。従って、本発明のMC−4R欠失動物細胞、非ヒトトランスジェニック胚
、非ヒトトランスジェニック動物及び非ヒトトランスジェニック同腹子を作製す
るための技術は当分野で入手可能である。標的組換えイベントと得られるノック
アウトマウスの評価方法も当分野で容易に入手可能であり、公知である。このよ
うな方法としてはDNA(サザン)ハイブリダイゼーションによる標的対立遺伝
子の検出、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)、ポリアクリルアミドゲル電気泳動
(PAGE)、in situハイブリダイゼーション並びにウェスタンブロッ
トによるDNA、RNA及びタンパク質の検出が挙げられるが、これらに限定さ
れない。
る。ES細胞はin vitro培養した移植前の胚から得られ、胚と融合する
ことができる(Evansら,1981,Nature 292:154−15
6;Bradleyら,1984,Nature 309:255−258;G
osslerら,1986,Proc.Nal.Acad.Sci.USA 8
3:9065−9069;及びRobertsonら,1986,Nature
322:445−448)。トランスジーンはDNAトランスフェクション、
マイクロインジェクション又はレトロウイルス媒介形質導入等の種々の標準技術
によりES細胞に効率的に導入することができる。その後、得られた形質転換E
S細胞を非ヒト動物からの胚盤胞と結合することができる。その後、導入したE
S細胞は胚に定着し、得られるキメラ動物の生殖細胞系に加わる(Jaenis
ch,1988,Science 240:1468−1474)。遺伝子標的
トランスジェニックマウスの作製における遺伝子標的ES細胞の使用は1987
年に記載され(Thomasら,Cell 51:503−512(1987)
)、他の文献にも記載されている(Frohmanら,Cell 56:145
−147(1989);Capecchi,Trends in Genet.
5:70−76(198ら,Mol.Biol.Med.6:481−492(
1989);Wagner,EMBO J.9:3025−3032(1990
);Bradleyら,Bio/Technology 10:534−539
(1992))。更にいずれも参考資料として本明細書に組込むCappecc
hiとThomasの1995年11月7日発行米国特許第5,464,764
号、Bermsらの1998年8月4日発行米国特許第5,789,215号も
参照。従って、本発明のMC−4R欠失動物細胞、非ヒトトランスジェニック胚
、非ヒトトランスジェニック動物及び非ヒトトランスジェニック同腹子を作製す
るための技術は当分野で入手可能である。標的組換えイベントと得られるノック
アウトマウスの評価方法も当分野で容易に入手可能であり、公知である。このよ
うな方法としてはDNA(サザン)ハイブリダイゼーションによる標的対立遺伝
子の検出、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)、ポリアクリルアミドゲル電気泳動
(PAGE)、in situハイブリダイゼーション並びにウェスタンブロッ
トによるDNA、RNA及びタンパク質の検出が挙げられるが、これらに限定さ
れない。
【0064】
従って、本発明のMC−3R欠失動物細胞、非ヒトトランスジェニック胚、非
ヒトトランスジェニック動物及び非ヒトトランスジェニック同腹子は上記パラグ
ラフに例示したような当分野で公知の任意技術により作製することができる。
ヒトトランスジェニック動物及び非ヒトトランスジェニック同腹子は上記パラグ
ラフに例示したような当分野で公知の任意技術により作製することができる。
【0065】
MC−3Rノックアウトマウスの作製は報告されておらず、MC−3Rノック
アウトマウスが表現型をもつことは明らかでなかった。本発明の本質はMC−3
Rノックアウトマウスが肥満症であり、このレセプターが肥満の発症に関与して
おり、本明細書に記載する種々のアッセイが体重に作用するMC−3Rモジュレ
ーターの選択と種々の体重障害の関連治療に有用であることを立証したことにあ
るる。本発明のMC−3Rノックアウトマウスは脂肪量が増加している(DEX
A分析によると〜5カ月齢で対照の〜22%に比較して〜45%)。MC−3R
が体重調節に関与しているという知見に基づき、選択化合物(MC−3Rアゴニ
スト)を試験してその体脂肪調節(低下)効率を直接測定することができ、こう
して肥満治療の治療可能性を評価することができる。上述のように、メラノコル
チン3レセプターが肥満の発症に関与していることはこれまで明らかになってい
なかった。
アウトマウスが表現型をもつことは明らかでなかった。本発明の本質はMC−3
Rノックアウトマウスが肥満症であり、このレセプターが肥満の発症に関与して
おり、本明細書に記載する種々のアッセイが体重に作用するMC−3Rモジュレ
ーターの選択と種々の体重障害の関連治療に有用であることを立証したことにあ
るる。本発明のMC−3Rノックアウトマウスは脂肪量が増加している(DEX
A分析によると〜5カ月齢で対照の〜22%に比較して〜45%)。MC−3R
が体重調節に関与しているという知見に基づき、選択化合物(MC−3Rアゴニ
スト)を試験してその体脂肪調節(低下)効率を直接測定することができ、こう
して肥満治療の治療可能性を評価することができる。上述のように、メラノコル
チン3レセプターが肥満の発症に関与していることはこれまで明らかになってい
なかった。
【0066】
MC−3Rノックアウトターゲティングベクターは当分野で公知の方法により
作製することができる。マウスゲノムDNAライブラリーをラットMC−3Rプ
ローブによりスクリーニングした。17Kbマウスゲノムクローンを単離し、1
.8Kb5’配列(短アーム)と8.5Kb3’配列(長アーム)と陽性選択用
pgk−neo遺伝子及び陰性選択用HSV−tk遺伝子から構成される遺伝子
ターゲティングベクターを構築し、pAL10と命名した。直鎖化構築物をAB
2.1細胞にエレクトロポレートし、陽性及び陰性選択のためにG418/FI
AUと共に培養した。24個の陽性クローンを増殖と胚盤胞へのマイクロインジ
ェクションのために選択し、キメラマウスを作製した。直鎖化pAL10をAB
2.2細胞にもエレクトロポレートし、12個の陽性クローンを増殖とマイクロ
インジェクションのために選択した。標的ESクローンを胚盤胞に注入すること
により合計13頭のキメラマウス(60〜100%毛色キメリズム)を作製した
。試験同系交配の結果、3系列から生殖細胞系伝達(アグーチ子)が判明した。
オリゴヌクレオチドプライマーを使用し、同系交配プログラムで作製したノック
アウトマウスと野生型マウスを識別した。ヘテロ接合交配からの54頭の子を遺
伝子型類別したところ、9頭がノックアウトであり、27頭がヘテロ接合であり
、18頭が野生型であった。全身及び骨無機質含量の非侵襲的定量法である2エ
ネルギーX線吸光光度法(DEXA;QDR 4500,Hologic,In
c.,Waltham.MA)により体組成を測定した(Kelleyら,19
98,Theory and Practice Appl.Radiat.I
sol.49:511−513;Wolden−Hansonら,1999,J
ournal of Gerotology:Biological Scie
nces 54A:B:99−107)。
作製することができる。マウスゲノムDNAライブラリーをラットMC−3Rプ
ローブによりスクリーニングした。17Kbマウスゲノムクローンを単離し、1
.8Kb5’配列(短アーム)と8.5Kb3’配列(長アーム)と陽性選択用
pgk−neo遺伝子及び陰性選択用HSV−tk遺伝子から構成される遺伝子
ターゲティングベクターを構築し、pAL10と命名した。直鎖化構築物をAB
2.1細胞にエレクトロポレートし、陽性及び陰性選択のためにG418/FI
AUと共に培養した。24個の陽性クローンを増殖と胚盤胞へのマイクロインジ
ェクションのために選択し、キメラマウスを作製した。直鎖化pAL10をAB
2.2細胞にもエレクトロポレートし、12個の陽性クローンを増殖とマイクロ
インジェクションのために選択した。標的ESクローンを胚盤胞に注入すること
により合計13頭のキメラマウス(60〜100%毛色キメリズム)を作製した
。試験同系交配の結果、3系列から生殖細胞系伝達(アグーチ子)が判明した。
オリゴヌクレオチドプライマーを使用し、同系交配プログラムで作製したノック
アウトマウスと野生型マウスを識別した。ヘテロ接合交配からの54頭の子を遺
伝子型類別したところ、9頭がノックアウトであり、27頭がヘテロ接合であり
、18頭が野生型であった。全身及び骨無機質含量の非侵襲的定量法である2エ
ネルギーX線吸光光度法(DEXA;QDR 4500,Hologic,In
c.,Waltham.MA)により体組成を測定した(Kelleyら,19
98,Theory and Practice Appl.Radiat.I
sol.49:511−513;Wolden−Hansonら,1999,J
ournal of Gerotology:Biological Scie
nces 54A:B:99−107)。
【0067】
従って、本発明はMC−3Rの調節に関連する肥満の病因の側面の研究に有用
なトランスジェニック動物、特にMC−3R−/−マウス、細胞及びアッセイか
ら構成されるモデルシステムを提供することが明らかである。種々のアッセイは
体重調節に効果のある化合物のスクリーニングと選択、これらの化合物の更に詳
細な研究及び障害を調節するための選択化合物の可能なヒト投与にも有用であり
、このような障害としては例えば(食欲低下、代謝率増加、脂肪摂取量低下又は
炭水化物欲求低下により)肥満、(グルコース耐性亢進、インスリン耐性低下に
より)糖尿病、高血圧、高脂血症、骨関節炎、癌、胆嚢疾患、睡眠無呼吸、鬱病
、男性及び女性性機能不全(インポテンス、性欲低下及び勃起障害を含む)、発
熱、炎症、免役調節、関節リウマチ炎、皮膚黒硬化、神経保護及び認知増進(ア
ルツハイマー病の治療を含む)、食欲低下、悪液質、癌、疼痛、記憶、ニューロ
ン再生及び神経障害、GH、IGF1機能低下に関連する成長障害、虚弱高齢者
に生じるような除脂肪体重低下の治療、GH欠損に起因する他の状態、鬱病、不
安、強迫、ノイローゼ、不眠症/睡眠障害、物質乱用、疼痛、男性及び女性性機
能不全(インポテンス、性欲低下及び勃起障害を含む)、発熱、炎症、免役調節
、関節リウマチ炎、学習記憶、サイトカイン放出調節、皮膚黒硬化、にきび及び
他の皮膚障害、神経再生及び神経保護、認知及び記憶増進(鬱病や不安に関連す
る障害の治療を含む)、鬱病や不安等の行動障害、嗜癖行動(例えばモルヒネや
コカイン等の薬物の慢性使用に関連する嗜癖行動)が挙げられるが、これらに限
定されない。好適対象はヒトであるが、他の哺乳動物も本発明の要素により同定
される化合物の有効な宿主であり、例えば他の哺乳動物、特にイヌ及びネコ種、
農耕用動物(例えばウシ、ヒツジ、ブタ、ウマ、ヤギ)等の家畜用哺乳動物や、
齧歯類及び他の非家畜哺乳動物が挙げられるが、これらに限定されない。MC−
3Rが体重調節に関与するという知見に基づき、選択したMC−3Rアゴニスト
を試験してその体脂肪調節(低下)効率を直接測定することができ、こうして肥
満治療の治療可能性を評価することができる。MC−3Rノックアウトマウスは
メラノコルチンレセプターサブタイプ特異的化合物を試験するために使用するこ
とができる。
なトランスジェニック動物、特にMC−3R−/−マウス、細胞及びアッセイか
ら構成されるモデルシステムを提供することが明らかである。種々のアッセイは
体重調節に効果のある化合物のスクリーニングと選択、これらの化合物の更に詳
細な研究及び障害を調節するための選択化合物の可能なヒト投与にも有用であり
、このような障害としては例えば(食欲低下、代謝率増加、脂肪摂取量低下又は
炭水化物欲求低下により)肥満、(グルコース耐性亢進、インスリン耐性低下に
より)糖尿病、高血圧、高脂血症、骨関節炎、癌、胆嚢疾患、睡眠無呼吸、鬱病
、男性及び女性性機能不全(インポテンス、性欲低下及び勃起障害を含む)、発
熱、炎症、免役調節、関節リウマチ炎、皮膚黒硬化、神経保護及び認知増進(ア
ルツハイマー病の治療を含む)、食欲低下、悪液質、癌、疼痛、記憶、ニューロ
ン再生及び神経障害、GH、IGF1機能低下に関連する成長障害、虚弱高齢者
に生じるような除脂肪体重低下の治療、GH欠損に起因する他の状態、鬱病、不
安、強迫、ノイローゼ、不眠症/睡眠障害、物質乱用、疼痛、男性及び女性性機
能不全(インポテンス、性欲低下及び勃起障害を含む)、発熱、炎症、免役調節
、関節リウマチ炎、学習記憶、サイトカイン放出調節、皮膚黒硬化、にきび及び
他の皮膚障害、神経再生及び神経保護、認知及び記憶増進(鬱病や不安に関連す
る障害の治療を含む)、鬱病や不安等の行動障害、嗜癖行動(例えばモルヒネや
コカイン等の薬物の慢性使用に関連する嗜癖行動)が挙げられるが、これらに限
定されない。好適対象はヒトであるが、他の哺乳動物も本発明の要素により同定
される化合物の有効な宿主であり、例えば他の哺乳動物、特にイヌ及びネコ種、
農耕用動物(例えばウシ、ヒツジ、ブタ、ウマ、ヤギ)等の家畜用哺乳動物や、
齧歯類及び他の非家畜哺乳動物が挙げられるが、これらに限定されない。MC−
3Rが体重調節に関与するという知見に基づき、選択したMC−3Rアゴニスト
を試験してその体脂肪調節(低下)効率を直接測定することができ、こうして肥
満治療の治療可能性を評価することができる。MC−3Rノックアウトマウスは
メラノコルチンレセプターサブタイプ特異的化合物を試験するために使用するこ
とができる。
【0068】
本発明は少なくとも1種の付加メラノコルチンレセプター、特に体重調節に関
与することが分かっているメラノコルチンレセプター(例えばMC−4R)をそ
の野生型形態でコードする別個の対立遺伝子の欠失に関してホモ接合、ヘテロ接
合又はヘミ接合性であると共に、MC−3R遺伝子の欠失に関してホモ接合、ヘ
テロ接合又はヘミ接合性であるトランスジェニック胚、非ヒトトランスジェニッ
ク胚、非ヒトトランスジェニック動物及び非ヒトトランスジェニック同腹子にも
関する。従って、本発明の各側面はMC−3R−/+/MC−4R−/−、MC
−3R−/+/MC−4R−/+、MC−3R−/−/MC−4R−/+である
トランスジェニック胚、非ヒトトランスジェニック胚、非ヒトトランスジェニッ
ク動物及び非ヒトトランスジェニック同腹子と、2種の別個の対立遺伝子に関す
るヘミ接合性代替物に関する。本発明の特に好ましい側面は実施例3に開示する
ようなMC−3R−/−/MC−4R−/−二重ノックアウトマウスと関連トラ
ンスジェニック胚、非ヒトトランスジェニック胚、非ヒトトランスジェニック動
物及び非ヒトトランスジェニック同腹子に関する。これらのMC−3R−/−/
MC−4R−/−二重ノックアウトマウスはMC−4R−/−ノックアウトマウ
スよりも肥満しており(体重が重い)、体重に及ぼすMC−3R及びMC−4R
ノックアウトの潜在的付加及び相乗効果を示している。本発明の好適側面は肥満
、糖尿病及びMC−3R−/−ノックアウトマウスに関連するとして本明細書に
開示するような他の用途の改良モデルとなるMC−3R−/−/MC−4R−/ − 二重ノックアウト非ヒト動物(例えばマウス)に関する。MC−3R−/−/
MC−4R−/−二重ノックアウトマウスはMC−3R−/−単独ノックアウト
マウスに関連するとして本明細書に開示する疾患及び障害の研究用改良モデルと
なる。本明細書に開示するデータによると、MC−3RはMC−4Rに比較して
エネルギー恒常性の調節に非冗長的な役割を果たす。更に、データはMC−3R
とMC−4Rが相乗的に作用するらしいことも示しており、MC−3R−/−/
MC−4R−/−マウスはMC−4R−/−マウスよりも肥満及び他の関連疾患
の治療の良好なモデルとして機能すると思われる。従って、MC−3R−/−/
MC−4R−/−二重ノックアウトマウスは摂飼量、体組成及びエネルギー代謝
の調節に関与する化合物(例えばMC−3R及び/又はMC−4Rのアゴニスト
又はアンタゴニスト等のモジュレーター)をスクリーニング及び選択するために
使用することができ、このようなモジュレーターと肥満治療の経路特異性を評価
するか又はその治療に使用することができる。更に、本発明のMC−3R−/− /MC−4R−/−二重ノックアウトマウスは遺伝バックグラウンドにおける他
の経路の調節効果を測定するために使用することもでき、体重調節に関与する経
路間の潜在的相互作用を決定することができる。より特定的には、本発明のMC
−3R−/−/MC−4R−/−二重ノックアウトマウスはMC−3Rレセプタ
ーとMC−4Rレセプターの二重モジュレーター即ちMC−3RレセプターとM
C−4Rレセプターの両者の二重アゴニスト又は二重アンタゴニストである化合
物をスクリーニング及び選択するために使用することができる。
与することが分かっているメラノコルチンレセプター(例えばMC−4R)をそ
の野生型形態でコードする別個の対立遺伝子の欠失に関してホモ接合、ヘテロ接
合又はヘミ接合性であると共に、MC−3R遺伝子の欠失に関してホモ接合、ヘ
テロ接合又はヘミ接合性であるトランスジェニック胚、非ヒトトランスジェニッ
ク胚、非ヒトトランスジェニック動物及び非ヒトトランスジェニック同腹子にも
関する。従って、本発明の各側面はMC−3R−/+/MC−4R−/−、MC
−3R−/+/MC−4R−/+、MC−3R−/−/MC−4R−/+である
トランスジェニック胚、非ヒトトランスジェニック胚、非ヒトトランスジェニッ
ク動物及び非ヒトトランスジェニック同腹子と、2種の別個の対立遺伝子に関す
るヘミ接合性代替物に関する。本発明の特に好ましい側面は実施例3に開示する
ようなMC−3R−/−/MC−4R−/−二重ノックアウトマウスと関連トラ
ンスジェニック胚、非ヒトトランスジェニック胚、非ヒトトランスジェニック動
物及び非ヒトトランスジェニック同腹子に関する。これらのMC−3R−/−/
MC−4R−/−二重ノックアウトマウスはMC−4R−/−ノックアウトマウ
スよりも肥満しており(体重が重い)、体重に及ぼすMC−3R及びMC−4R
ノックアウトの潜在的付加及び相乗効果を示している。本発明の好適側面は肥満
、糖尿病及びMC−3R−/−ノックアウトマウスに関連するとして本明細書に
開示するような他の用途の改良モデルとなるMC−3R−/−/MC−4R−/ − 二重ノックアウト非ヒト動物(例えばマウス)に関する。MC−3R−/−/
MC−4R−/−二重ノックアウトマウスはMC−3R−/−単独ノックアウト
マウスに関連するとして本明細書に開示する疾患及び障害の研究用改良モデルと
なる。本明細書に開示するデータによると、MC−3RはMC−4Rに比較して
エネルギー恒常性の調節に非冗長的な役割を果たす。更に、データはMC−3R
とMC−4Rが相乗的に作用するらしいことも示しており、MC−3R−/−/
MC−4R−/−マウスはMC−4R−/−マウスよりも肥満及び他の関連疾患
の治療の良好なモデルとして機能すると思われる。従って、MC−3R−/−/
MC−4R−/−二重ノックアウトマウスは摂飼量、体組成及びエネルギー代謝
の調節に関与する化合物(例えばMC−3R及び/又はMC−4Rのアゴニスト
又はアンタゴニスト等のモジュレーター)をスクリーニング及び選択するために
使用することができ、このようなモジュレーターと肥満治療の経路特異性を評価
するか又はその治療に使用することができる。更に、本発明のMC−3R−/− /MC−4R−/−二重ノックアウトマウスは遺伝バックグラウンドにおける他
の経路の調節効果を測定するために使用することもでき、体重調節に関与する経
路間の潜在的相互作用を決定することができる。より特定的には、本発明のMC
−3R−/−/MC−4R−/−二重ノックアウトマウスはMC−3Rレセプタ
ーとMC−4Rレセプターの二重モジュレーター即ちMC−3RレセプターとM
C−4Rレセプターの両者の二重アゴニスト又は二重アンタゴニストである化合
物をスクリーニング及び選択するために使用することができる。
【0069】
本明細書に記載する(夫々MC−3R及びMC−4Rレセプタータンパク質を
使用する)任意in vitro又はin vivo細胞及び/又は膜アッセイ
は非限定的な例としてMC−3R−/−ノックアウトマウス及び/又はMC−3
R−/−/MC−4R−/−二重ノックアウトマウス等の本明細書に開示するト
ランスジェニック動物の任意のものと併用することができ、あるいはMC−3R
及び/又はMC−4Rを調節することができる他の任意化合物と併用することが
でき、本明細書に開示する種々の障害及び疾患、即ち肥満や性機能不全の治療に
有用な改良化合物を提供することができる。これらの二重ノックアウトマウスは
本明細書に記載する障害に関連する他の過程の調節に関与するモジュレーター(
この場合もMC−3R及び/又はMC−4Rのアゴニスト又はアンタゴニスト)
の選択にも有用であり、このような障害としては例えば(食欲低下、代謝率増加
、脂肪摂取量低下又は炭水化物欲求低下により)肥満、糖尿病、高血圧、高脂血
症、骨関節炎、癌、胆嚢疾患、睡眠無呼吸、鬱病、男性及び女性性機能不全(イ
ンポテンス、性欲低下及び勃起障害を含む)、発熱、炎症、免役調節、関節リウ
マチ炎、皮膚黒硬化、神経保護及び認知増進(アルツハイマー病の治療を含む)
、食欲低下、悪液質、癌、疼痛、記憶、ニューロン再生及び神経障害、GH、I
GF1機能低下に関連する成長障害、虚弱高齢者に生じるような除脂肪体重低下
の治療、GH欠損に起因する他の状態、癌悪液質、鬱病と不安に関連する障害、
鬱病や不安等の行動障害、嗜癖行動(例えばモルヒネやコカイン等の薬物の慢性
使用に関連する嗜癖行動)が挙げられるが、これらに限定されない。
使用する)任意in vitro又はin vivo細胞及び/又は膜アッセイ
は非限定的な例としてMC−3R−/−ノックアウトマウス及び/又はMC−3
R−/−/MC−4R−/−二重ノックアウトマウス等の本明細書に開示するト
ランスジェニック動物の任意のものと併用することができ、あるいはMC−3R
及び/又はMC−4Rを調節することができる他の任意化合物と併用することが
でき、本明細書に開示する種々の障害及び疾患、即ち肥満や性機能不全の治療に
有用な改良化合物を提供することができる。これらの二重ノックアウトマウスは
本明細書に記載する障害に関連する他の過程の調節に関与するモジュレーター(
この場合もMC−3R及び/又はMC−4Rのアゴニスト又はアンタゴニスト)
の選択にも有用であり、このような障害としては例えば(食欲低下、代謝率増加
、脂肪摂取量低下又は炭水化物欲求低下により)肥満、糖尿病、高血圧、高脂血
症、骨関節炎、癌、胆嚢疾患、睡眠無呼吸、鬱病、男性及び女性性機能不全(イ
ンポテンス、性欲低下及び勃起障害を含む)、発熱、炎症、免役調節、関節リウ
マチ炎、皮膚黒硬化、神経保護及び認知増進(アルツハイマー病の治療を含む)
、食欲低下、悪液質、癌、疼痛、記憶、ニューロン再生及び神経障害、GH、I
GF1機能低下に関連する成長障害、虚弱高齢者に生じるような除脂肪体重低下
の治療、GH欠損に起因する他の状態、癌悪液質、鬱病と不安に関連する障害、
鬱病や不安等の行動障害、嗜癖行動(例えばモルヒネやコカイン等の薬物の慢性
使用に関連する嗜癖行動)が挙げられるが、これらに限定されない。
【0070】
本発明は非限定的な例として肥満、糖尿病、食欲不振及び悪液質等の障害によ
る体重調節に作用する哺乳動物MC−3Rの選択的アゴニスト及び/又はアンタ
ゴニストの細胞及び膜に基づく同定法にも関する。従って、本発明の目的は体重
調節に関連する種々の公知障害により体重調節に作用するこのレセプタータンパ
ク質のモジュレーターを選択するためのMC−3Rによるアッセイを提供するこ
とである。MC−3Rモジュレーターはこれらの体重障害の治療に使用すること
ができ、例えばMC−3Rアゴニストを使用して肥満を治療することができ、M
C−3Rアンタゴニストを使用して食欲不振を治療することができる。これらの
アッセイは細胞アッセイであることが好ましく、MC−3RをコードするDNA
分子を宿主細胞にトランスフェクト又は形質転換し、MC−3Rを発現させるた
めに十分な時間この組換え宿主細胞を増殖させた後に本明細書に記載する種々の
アッセイで使用する。あるいは、MC−3Rを過剰発現するように遺伝子改変し
た任意「非組換え」細胞系を使用して体重障害の治療に有用なMC−3Rのモジ
ュレーターをスクリーニング及び/又は選択してもよい。更に、(1)MC−3
RをコードするDNA発現ベクターをトランスフェクトした宿主細胞又は(2)
MC−3Rを過剰発現するように遺伝子操作した細胞系からの実質的に精製した
膜画分を使用して体重障害の治療に有用なMC−3Rのモジュレーターをスクリ
ーニング及び/又は選択してもよい。従って、別の目的は体重障害に関連するM
C−3R活性のモジュレーターをスクリーニング及び/又は選択するためのアッ
セイで使用するようにこれらの組換え又は遺伝子改変宿主細胞からの膜調製物を
提供することである。従って、本発明はMC−3Rに直接作用するモジュレータ
ーの投与による体重障害の治療方法に関し、モジュレーターはこれらの細胞又は
膜スクリーン及び/又は本発明のトランスジェニック動物を使用するアッセイに
より最初に同定される。
る体重調節に作用する哺乳動物MC−3Rの選択的アゴニスト及び/又はアンタ
ゴニストの細胞及び膜に基づく同定法にも関する。従って、本発明の目的は体重
調節に関連する種々の公知障害により体重調節に作用するこのレセプタータンパ
ク質のモジュレーターを選択するためのMC−3Rによるアッセイを提供するこ
とである。MC−3Rモジュレーターはこれらの体重障害の治療に使用すること
ができ、例えばMC−3Rアゴニストを使用して肥満を治療することができ、M
C−3Rアンタゴニストを使用して食欲不振を治療することができる。これらの
アッセイは細胞アッセイであることが好ましく、MC−3RをコードするDNA
分子を宿主細胞にトランスフェクト又は形質転換し、MC−3Rを発現させるた
めに十分な時間この組換え宿主細胞を増殖させた後に本明細書に記載する種々の
アッセイで使用する。あるいは、MC−3Rを過剰発現するように遺伝子改変し
た任意「非組換え」細胞系を使用して体重障害の治療に有用なMC−3Rのモジ
ュレーターをスクリーニング及び/又は選択してもよい。更に、(1)MC−3
RをコードするDNA発現ベクターをトランスフェクトした宿主細胞又は(2)
MC−3Rを過剰発現するように遺伝子操作した細胞系からの実質的に精製した
膜画分を使用して体重障害の治療に有用なMC−3Rのモジュレーターをスクリ
ーニング及び/又は選択してもよい。従って、別の目的は体重障害に関連するM
C−3R活性のモジュレーターをスクリーニング及び/又は選択するためのアッ
セイで使用するようにこれらの組換え又は遺伝子改変宿主細胞からの膜調製物を
提供することである。従って、本発明はMC−3Rに直接作用するモジュレータ
ーの投与による体重障害の治療方法に関し、モジュレーターはこれらの細胞又は
膜スクリーン及び/又は本発明のトランスジェニック動物を使用するアッセイに
より最初に同定される。
【0071】
機能的MC−3Rをコードする任意ポリヌクレオチド配列を本発明の組換え細
胞及び膜アッセイで使用することができる。適切なDNA発現ベクターの構築に
使用するのに好適なポリヌクレオチドは下記配列番号3(図3も参照)に示すよ
うなヒトMC−3Rのオープンリーディングフレームを含むDNA分子であり、
このような配列はYamadaとGantzの1997年4月22日発行米国特
許第5,622,860号及びYamadaとGantzの1997年12月3
0日発行米国特許第5,703,220号に開示されている。
胞及び膜アッセイで使用することができる。適切なDNA発現ベクターの構築に
使用するのに好適なポリヌクレオチドは下記配列番号3(図3も参照)に示すよ
うなヒトMC−3Rのオープンリーディングフレームを含むDNA分子であり、
このような配列はYamadaとGantzの1997年4月22日発行米国特
許第5,622,860号及びYamadaとGantzの1997年12月3
0日発行米国特許第5,703,220号に開示されている。
【0072】
【化3】
【0073】
この配列は下記配列番号4(図4も参照)に示すようなMC−3Rタンパク質
の完全オープンリーディングフレームをコードする。
の完全オープンリーディングフレームをコードする。
【0074】
【化4】
【0075】
配列番号3に示すようなDNA分子又は生物学的に等価のポリヌクレオチドを
適当なベクターに挿入し、他のDNA分子(即ちMC−3Rが天然には結合して
いないDNA分子)と結合させて、レセプターを発現する「組換えDNA分子」
を形成することができる。これらのベクターはDNA又はRNAから構成するこ
とができ、ほとんどのクローニング目的にはDNAベクターが好ましい。典型的
なベクターとしてはプラスミド、改変ウイルス、バクテリオファージ及びコスミ
ド、酵母人工染色体並びにMC−3Rをコードすることが可能な他の形態のエピ
ソーム又は組込みDNAが挙げられる。特定用途に適したベクターを決定するこ
とは当業者が予測可能である。
適当なベクターに挿入し、他のDNA分子(即ちMC−3Rが天然には結合して
いないDNA分子)と結合させて、レセプターを発現する「組換えDNA分子」
を形成することができる。これらのベクターはDNA又はRNAから構成するこ
とができ、ほとんどのクローニング目的にはDNAベクターが好ましい。典型的
なベクターとしてはプラスミド、改変ウイルス、バクテリオファージ及びコスミ
ド、酵母人工染色体並びにMC−3Rをコードすることが可能な他の形態のエピ
ソーム又は組込みDNAが挙げられる。特定用途に適したベクターを決定するこ
とは当業者が予測可能である。
【0076】
種々の哺乳動物発現ベクターを使用して哺乳動物細胞で組換えMC−3Rを発
現させることができる。上述のように、発現ベクターは本明細書ではクローニン
グしたDNAの転写と適当な宿主におけるそのmRNAの翻訳に必要なDNA配
列として定義される。このようなベクターを使用すると、細菌、藍藻類、植物細
胞及び動物細胞等の種々の宿主で真核DNAを発現させることができる。特別に
設計したベクターでは細菌−酵母又は細菌−動物細胞等の宿主間でDNAを往復
させることができる。適切に構築した発現ベクターは宿主細胞での自律複製用複
製起点、選択マーカー、制限数の有用制限酵素部位、高コピー数の可能性及び活
性プロモーターを含む。プロモーターはRNAポリメラーゼをDNAと結合させ
てRNA合成を開始するDNA配列として定義される。強力なプロモーターは高
頻度でmRNAを活性化するプロモーターである。発現ベクターとしては例えば
クローニングベクター、改変クローニングベクター、特別に設計したプラスミド
又はウイルスが挙げられるが、これらに限定されない。組換えMC−3R発現に
利用可能であると思われる市販哺乳動物発現ベクターとしてはpcDNA3.n
eo(Invitrogen)、pcDNA3.1(Invitrogen)、
pCI−neo(Promega)、pLITMUS28、PLITMUS29
、pLITMUS38及びpLITMUS39(New England Bi
olabs)、pcDNAI、pcDNAIamp(Invitrogen)、
pcDNA3(Invitrogen)、pMC1neo(Stratagen
e)、pXT1(Stratagene)、pSG5(Stratagene)
、EBO−pSV2−neo(ATCC37593)、pBPV−1(8−2)
(ATCC37110)、pdBPV−MMTneo(342−12)(ATC
C37224)、pRSVgpt(ATCC37199)、pRSVneo(A
TCC37198)、pSV2−dhfr(ATCC37146)、pUCTa
g(ATCC37460)及び1ZD35(ATCC37565)が挙げられる
が、これらに限定されない。
現させることができる。上述のように、発現ベクターは本明細書ではクローニン
グしたDNAの転写と適当な宿主におけるそのmRNAの翻訳に必要なDNA配
列として定義される。このようなベクターを使用すると、細菌、藍藻類、植物細
胞及び動物細胞等の種々の宿主で真核DNAを発現させることができる。特別に
設計したベクターでは細菌−酵母又は細菌−動物細胞等の宿主間でDNAを往復
させることができる。適切に構築した発現ベクターは宿主細胞での自律複製用複
製起点、選択マーカー、制限数の有用制限酵素部位、高コピー数の可能性及び活
性プロモーターを含む。プロモーターはRNAポリメラーゼをDNAと結合させ
てRNA合成を開始するDNA配列として定義される。強力なプロモーターは高
頻度でmRNAを活性化するプロモーターである。発現ベクターとしては例えば
クローニングベクター、改変クローニングベクター、特別に設計したプラスミド
又はウイルスが挙げられるが、これらに限定されない。組換えMC−3R発現に
利用可能であると思われる市販哺乳動物発現ベクターとしてはpcDNA3.n
eo(Invitrogen)、pcDNA3.1(Invitrogen)、
pCI−neo(Promega)、pLITMUS28、PLITMUS29
、pLITMUS38及びpLITMUS39(New England Bi
olabs)、pcDNAI、pcDNAIamp(Invitrogen)、
pcDNA3(Invitrogen)、pMC1neo(Stratagen
e)、pXT1(Stratagene)、pSG5(Stratagene)
、EBO−pSV2−neo(ATCC37593)、pBPV−1(8−2)
(ATCC37110)、pdBPV−MMTneo(342−12)(ATC
C37224)、pRSVgpt(ATCC37199)、pRSVneo(A
TCC37198)、pSV2−dhfr(ATCC37146)、pUCTa
g(ATCC37460)及び1ZD35(ATCC37565)が挙げられる
が、これらに限定されない。
【0077】
種々の細菌発現ベクターを使用して組換えMC−3Rを細菌細胞で発現させて
もよい。組換えMC−3R発現に利用可能であると思われる市販細菌発現ベクタ
ーとしてはpCR2.1(Invitrogen)、pET11a(Novag
en)、λgt11(Invitrogen)及びpKK223−3(Phar
macia)が挙げられるが、これらに限定されない。
もよい。組換えMC−3R発現に利用可能であると思われる市販細菌発現ベクタ
ーとしてはpCR2.1(Invitrogen)、pET11a(Novag
en)、λgt11(Invitrogen)及びpKK223−3(Phar
macia)が挙げられるが、これらに限定されない。
【0078】
更に、種々の真菌発現ベクターを使用して組換えMC−3Rを真菌細胞で発現
させてもよい。組換えMC−3R発現に利用可能であると思われる市販真菌発現
ベクターとしてはpYES2(Invitrogen)及びPichia発現ベ
クター(Invitrogen)が挙げられるが、これらに限定されない。
させてもよい。組換えMC−3R発現に利用可能であると思われる市販真菌発現
ベクターとしてはpYES2(Invitrogen)及びPichia発現ベ
クター(Invitrogen)が挙げられるが、これらに限定されない。
【0079】
更に、種々の昆虫発現ベクターを使用して組換えMC−3Rを昆虫細胞で発現
させてもよい。組換えMC−3R発現に利用可能であると思われる市販昆虫発現
ベクターとしてはpBlueBacIII及びpBlueBacHis(Inv
itrogen)とpAcG25(Pharmingen)が挙げられるが、こ
れらに限定されない。
させてもよい。組換えMC−3R発現に利用可能であると思われる市販昆虫発現
ベクターとしてはpBlueBacIII及びpBlueBacHis(Inv
itrogen)とpAcG25(Pharmingen)が挙げられるが、こ
れらに限定されない。
【0080】
in vitro生産した合成mRNAを使用してMC−3R DNAの発現
を実施してもよい。合成mRNAは非限定的な例として麦芽エキスや網状赤血球
エキス等の種々の無細胞系において効率的に翻訳することができ、更に非限定的
な例としてカエル卵母細胞へのマイクロインジェクション等により細胞系におい
て効率的に翻訳することもでき、カエル卵母細胞へのマイクロインジェクション
が好ましい。
を実施してもよい。合成mRNAは非限定的な例として麦芽エキスや網状赤血球
エキス等の種々の無細胞系において効率的に翻訳することができ、更に非限定的
な例としてカエル卵母細胞へのマイクロインジェクション等により細胞系におい
て効率的に翻訳することもでき、カエル卵母細胞へのマイクロインジェクション
が好ましい。
【0081】
最適レベルのMC−3Rを生じるMC−3R cDNA配列を決定するために
、これらに限定されない、例えばMC−3Rの完全長オープンリーディングフレ
ームを含むcDNAフラグメントや、タンパク質の特定ドメインのみ又はタンパ
ク質の再配置ドメインをコードするcDNAの部分を含む種々の構築物などのc
DNA分子を構築することができる。全構築物はMC−3R cDNAの5’及
び/又は3’未翻訳領域を全く含まないように設計してもよいし、その全部又は
一部を含むように設計してもよい。MC−3Rの発現レベルと活性は適当な宿主
細胞へのこれらの構築物の単独又は併用導入後に決定することができる。トラン
ジェントアッセイで最適発現を生じるMC−3R cDNAカセットを決定した
後に、このMC−3R cDNA構築物を非限定的な例として哺乳動物細胞、植
物細胞、昆虫細胞、卵母細胞、細菌及び酵母細胞等の種々の発現ベクター(組換
えウイルスを含む)に導入する。
、これらに限定されない、例えばMC−3Rの完全長オープンリーディングフレ
ームを含むcDNAフラグメントや、タンパク質の特定ドメインのみ又はタンパ
ク質の再配置ドメインをコードするcDNAの部分を含む種々の構築物などのc
DNA分子を構築することができる。全構築物はMC−3R cDNAの5’及
び/又は3’未翻訳領域を全く含まないように設計してもよいし、その全部又は
一部を含むように設計してもよい。MC−3Rの発現レベルと活性は適当な宿主
細胞へのこれらの構築物の単独又は併用導入後に決定することができる。トラン
ジェントアッセイで最適発現を生じるMC−3R cDNAカセットを決定した
後に、このMC−3R cDNA構築物を非限定的な例として哺乳動物細胞、植
物細胞、昆虫細胞、卵母細胞、細菌及び酵母細胞等の種々の発現ベクター(組換
えウイルスを含む)に導入する。
【0082】
MC−3RをコードするDNA配列を含むか及び/又は発現するように構築し
た宿主細胞はMC−3R又は生物学的に等価な形態を生産するために適した条件
下で培養することができる。組換え宿主細胞は原核細胞でも真核細胞でもよく、
例えば細菌類(例えば大腸菌)、真菌細胞(例えば酵母)哺乳動物細胞(非限定
的な例としてヒト、ウシ、ブタ、サル及び齧歯類起源の細胞系)、及び昆虫細胞
(非限定的な例としてショウジョウバエ及びカイコに由来する細胞系)が挙げら
れるが、これらに限定されない。従って、MC−3R様タンパク質をコードする
DNAを含む発現ベクターを使用して組換え宿主細胞でMC−3Rを発現させる
ことができる。組換え宿主細胞は原核細胞でも真核細胞でもよく、例えば細菌類
(例えば大腸菌)、真菌細胞(例えば酵母)哺乳動物細胞(非限定的な例として
ヒト、ウシ、ブタ、サル及び齧歯類起源の細胞系)、及び昆虫細胞(非限定的な
例としてショウジョウバエ及びカイコに由来する細胞系)が挙げられるが、これ
らに限定されない。例えば、昆虫発現系の1例はバキュロウイルス発現ベクター
(pAcG2T,Pharmingen)とタンデムでSpodeptera
frugiperda(Sf21)昆虫細胞(Invitrogen)を使用す
る。また、利用可能な市販哺乳動物種としてはL細胞L−M(TK−)(ATC
C CCL 1.3)、L細胞L−M(ATCC CCL 1.2)、Saos
−2(ATCC HTB−85)、293(ATCC CRL 1573)、R
aji(ATCC CCL 86)、CV−1(ATCC CCL 70)、C
OS−1(ATCC CRL 1650)、COS−7(ATCC CRL 1
651)、CHO−K1(ATCC CCL 61)、3T3(ATCC CC
L 92)、NIH/3T3(ATCC CRL 1658)、HeLa(AT
CC CCL 2)、C127I(ATCC CRL 1616)、BS−C1
(ATCC CCL 26)、MRC−5(ATCC CCL 171)及びC
PAE(ATCC CCL 209)が挙げられるがこれらに限定されない。発
現ベクターは非限定的な例として形質転換、トランスフェクション、プロトプラ
スト融合及びエレクトロポレーション等の多数の技術の任意の1種により宿主細
胞に導入することができる。発現ベクターを導入した細胞を個々に分析し、MC
−3Rタンパク質を生産するか否かを判定する。MC−3Rを発現する細胞の同
定は非限定的な例として抗MC−3R抗体との免役反応性、標識リガンド結合及
び宿主細胞関連MC−3R活性の存在等の数種の手段により実施することができ
る。
た宿主細胞はMC−3R又は生物学的に等価な形態を生産するために適した条件
下で培養することができる。組換え宿主細胞は原核細胞でも真核細胞でもよく、
例えば細菌類(例えば大腸菌)、真菌細胞(例えば酵母)哺乳動物細胞(非限定
的な例としてヒト、ウシ、ブタ、サル及び齧歯類起源の細胞系)、及び昆虫細胞
(非限定的な例としてショウジョウバエ及びカイコに由来する細胞系)が挙げら
れるが、これらに限定されない。従って、MC−3R様タンパク質をコードする
DNAを含む発現ベクターを使用して組換え宿主細胞でMC−3Rを発現させる
ことができる。組換え宿主細胞は原核細胞でも真核細胞でもよく、例えば細菌類
(例えば大腸菌)、真菌細胞(例えば酵母)哺乳動物細胞(非限定的な例として
ヒト、ウシ、ブタ、サル及び齧歯類起源の細胞系)、及び昆虫細胞(非限定的な
例としてショウジョウバエ及びカイコに由来する細胞系)が挙げられるが、これ
らに限定されない。例えば、昆虫発現系の1例はバキュロウイルス発現ベクター
(pAcG2T,Pharmingen)とタンデムでSpodeptera
frugiperda(Sf21)昆虫細胞(Invitrogen)を使用す
る。また、利用可能な市販哺乳動物種としてはL細胞L−M(TK−)(ATC
C CCL 1.3)、L細胞L−M(ATCC CCL 1.2)、Saos
−2(ATCC HTB−85)、293(ATCC CRL 1573)、R
aji(ATCC CCL 86)、CV−1(ATCC CCL 70)、C
OS−1(ATCC CRL 1650)、COS−7(ATCC CRL 1
651)、CHO−K1(ATCC CCL 61)、3T3(ATCC CC
L 92)、NIH/3T3(ATCC CRL 1658)、HeLa(AT
CC CCL 2)、C127I(ATCC CRL 1616)、BS−C1
(ATCC CCL 26)、MRC−5(ATCC CCL 171)及びC
PAE(ATCC CCL 209)が挙げられるがこれらに限定されない。発
現ベクターは非限定的な例として形質転換、トランスフェクション、プロトプラ
スト融合及びエレクトロポレーション等の多数の技術の任意の1種により宿主細
胞に導入することができる。発現ベクターを導入した細胞を個々に分析し、MC
−3Rタンパク質を生産するか否かを判定する。MC−3Rを発現する細胞の同
定は非限定的な例として抗MC−3R抗体との免役反応性、標識リガンド結合及
び宿主細胞関連MC−3R活性の存在等の数種の手段により実施することができ
る。
【0083】
本発明の1態様では、宿主MC−3Rを過剰発現し、好ましくは選択した「野
生型」宿主細胞での発現を少なくとも5倍にするように遺伝子改変した細胞で本
明細書に記載するアッセイを実施することができる。このような過剰発現の改善
は当分野で現在公知の任意手段により得られ、例えばコーディング領域を無傷の
ままで相同組換えによりプロモーターを導入するか、又は単に何らかの生物学的
理由で高レベルのMC−3Rを発現する細胞を選択するなどの方法が挙げられる
が、これらに限定されない。
生型」宿主細胞での発現を少なくとも5倍にするように遺伝子改変した細胞で本
明細書に記載するアッセイを実施することができる。このような過剰発現の改善
は当分野で現在公知の任意手段により得られ、例えばコーディング領域を無傷の
ままで相同組換えによりプロモーターを導入するか、又は単に何らかの生物学的
理由で高レベルのMC−3Rを発現する細胞を選択するなどの方法が挙げられる
が、これらに限定されない。
【0084】
本発明の別の好適態様では、MC−3Rの発現を誘導する発現をベクターを一
過的又は安定的にトランスフェクト又は形質転換した細胞で本明細書に記載する
アッセイを実施することができる。発現ベクターは非限定的な例として形質転換
、トランスフェクション、プロトプラスト融合及びエレクトロポレーション等の
多数の技術の任意の1種により宿主細胞に導入することができる。形質転換とは
DNAの組込みによるターゲット細胞の遺伝的変異を意味する。トランスフェク
ションとはMC−3Rを試験細胞に導入するために当分野で公知の任意方法を意
味する。例えば、トランスフェクションとしてはリン酸カルシウム又は塩化カル
シウム媒介トランスフェクション、リポフェクション、MC−3Rを含むレトロ
ウイルス構築物感染、及びエレクトロポレーションが挙げられる。発現ベクター
を含む細胞を個々に分析し、MC−3Rタンパク質を生産するか否かを判定する
。MC−3Rを発現する細胞の同定は非限定的な例として抗MC−3R抗体との
免役反応性、標識リガンド結合及び宿主細胞関連MC−3R活性の存在等の数種
の手段により実施することができる。
過的又は安定的にトランスフェクト又は形質転換した細胞で本明細書に記載する
アッセイを実施することができる。発現ベクターは非限定的な例として形質転換
、トランスフェクション、プロトプラスト融合及びエレクトロポレーション等の
多数の技術の任意の1種により宿主細胞に導入することができる。形質転換とは
DNAの組込みによるターゲット細胞の遺伝的変異を意味する。トランスフェク
ションとはMC−3Rを試験細胞に導入するために当分野で公知の任意方法を意
味する。例えば、トランスフェクションとしてはリン酸カルシウム又は塩化カル
シウム媒介トランスフェクション、リポフェクション、MC−3Rを含むレトロ
ウイルス構築物感染、及びエレクトロポレーションが挙げられる。発現ベクター
を含む細胞を個々に分析し、MC−3Rタンパク質を生産するか否かを判定する
。MC−3Rを発現する細胞の同定は非限定的な例として抗MC−3R抗体との
免役反応性、標識リガンド結合及び宿主細胞関連MC−3R活性の存在等の数種
の手段により実施することができる。
【0085】
MC−3Rに対して親和性を示す化合物の結合特異性はクローニングしたレセ
プターを発現する組換え細胞又はこれらの細胞からの膜に対する化合物の親和性
を測定することにより示される。クローニングしたレセプターの発現と、MC−
3Rに結合するか又はMC−3Rの公知放射性標識リガンドとこれらの細胞又は
これらの細胞から調製した膜の結合を阻止する化合物のスクリーニングは、体重
障害の治療に有用であると思われるMC−3Rに高親和性をもつ化合物の迅速な
選択に有効な方法を提供する。このようなリガンドは必ずしも放射性標識する必
要はなく、結合した放射性標識化合物の代りに使用可能であるか又は機能アッセ
イでアクチベーターとして使用可能な非同位化合物を使用してもよい。上記方法
により同定した化合物はMC−3Rのアゴニスト又はアンタゴニストであると思
われ、いずれも体重障害の治療に有用であると思われるペプチド、タンパク質又
は非タンパク性有機分子であると思われる。
プターを発現する組換え細胞又はこれらの細胞からの膜に対する化合物の親和性
を測定することにより示される。クローニングしたレセプターの発現と、MC−
3Rに結合するか又はMC−3Rの公知放射性標識リガンドとこれらの細胞又は
これらの細胞から調製した膜の結合を阻止する化合物のスクリーニングは、体重
障害の治療に有用であると思われるMC−3Rに高親和性をもつ化合物の迅速な
選択に有効な方法を提供する。このようなリガンドは必ずしも放射性標識する必
要はなく、結合した放射性標識化合物の代りに使用可能であるか又は機能アッセ
イでアクチベーターとして使用可能な非同位化合物を使用してもよい。上記方法
により同定した化合物はMC−3Rのアゴニスト又はアンタゴニストであると思
われ、いずれも体重障害の治療に有用であると思われるペプチド、タンパク質又
は非タンパク性有機分子であると思われる。
【0086】
本発明はMC−3Rタンパク質をコードするDNA又はRNAの発現を調節す
る化合物と、MC−3Rタンパク質の機能、従って体重障害に作用する化合物の
スクリーニング方法に関する。他のレセプターのアゴニスト及びアンタゴニスト
の同定方法は当分野で周知であるので、MC−3Rのアゴニスト及びアンタゴニ
ストを同定するように応用することができる。例えば、Cascieriら(1
992,Molec.Pharmacol.41:1096−1099)はラッ
トニューロキニンレセプターに結合するアゴニストを阻害し、従ってニューロキ
ニンレセプターの潜在的アゴニスト又はアンタゴニストである物質の同定方法を
記載している。この方法はラットニューロキニンレセプターを含む発現ベクター
をCOS細胞にトランスフェクトし、ニューロキニンレセプターを発現させるた
めに十分な時間トランスフェクトした細胞を増殖させ、トランスフェクトした細
胞を回収し、物質の存在下又は不在下でニューロキニンレセプターの既知放射性
標識アゴニストを含むアッセイ緩衝液に細胞を再懸濁した後、ニューロキニンレ
セプターの既知放射性標識アゴニストとニューロキニンレセプターの結合を測定
する。この物質の不在下よりもこの物質の存在下のほうが既知アゴニストの結合
量が少ない場合には、この物質はニューロキニンレセプターの潜在的アゴニスト
又はアンタゴニストである。MC−3Rのアゴニスト又はアンタゴニスト等の物
質の結合を測定する場合には、標識物質又はアゴニストを使用することによりこ
のような結合を測定することができる。この物質又はアゴニストは例えば放射能
、蛍光、酵素等の当分野で公知の適当な任意方法で標識することができる。ター
ゲットレセプター(例えばMC−3R及び/又はMC−4R)を阻害するモジュ
レーターをスクリーニングする場合には、既知リガンドを試験化合物と併用して
細胞アッセイを実施し、試験化合物がレセプター活性を阻害する機能性を測定す
ることができる。本明細書に記載するように、これらの細胞及び膜アッセイはM
C−3R及びMC−4Rレセプターの両者を調節することが可能な主要化合物を
スクリーニング及び選択するために使用することができる。両者レセプターのア
ゴニスト又はアンタゴニストとしてのこれらの二重モジュレーターは本明細書に
記載するような体重調節に関連する障害等の両者レセプターに関連する疾患の治
療用の改良化合物を提供することができる。
る化合物と、MC−3Rタンパク質の機能、従って体重障害に作用する化合物の
スクリーニング方法に関する。他のレセプターのアゴニスト及びアンタゴニスト
の同定方法は当分野で周知であるので、MC−3Rのアゴニスト及びアンタゴニ
ストを同定するように応用することができる。例えば、Cascieriら(1
992,Molec.Pharmacol.41:1096−1099)はラッ
トニューロキニンレセプターに結合するアゴニストを阻害し、従ってニューロキ
ニンレセプターの潜在的アゴニスト又はアンタゴニストである物質の同定方法を
記載している。この方法はラットニューロキニンレセプターを含む発現ベクター
をCOS細胞にトランスフェクトし、ニューロキニンレセプターを発現させるた
めに十分な時間トランスフェクトした細胞を増殖させ、トランスフェクトした細
胞を回収し、物質の存在下又は不在下でニューロキニンレセプターの既知放射性
標識アゴニストを含むアッセイ緩衝液に細胞を再懸濁した後、ニューロキニンレ
セプターの既知放射性標識アゴニストとニューロキニンレセプターの結合を測定
する。この物質の不在下よりもこの物質の存在下のほうが既知アゴニストの結合
量が少ない場合には、この物質はニューロキニンレセプターの潜在的アゴニスト
又はアンタゴニストである。MC−3Rのアゴニスト又はアンタゴニスト等の物
質の結合を測定する場合には、標識物質又はアゴニストを使用することによりこ
のような結合を測定することができる。この物質又はアゴニストは例えば放射能
、蛍光、酵素等の当分野で公知の適当な任意方法で標識することができる。ター
ゲットレセプター(例えばMC−3R及び/又はMC−4R)を阻害するモジュ
レーターをスクリーニングする場合には、既知リガンドを試験化合物と併用して
細胞アッセイを実施し、試験化合物がレセプター活性を阻害する機能性を測定す
ることができる。本明細書に記載するように、これらの細胞及び膜アッセイはM
C−3R及びMC−4Rレセプターの両者を調節することが可能な主要化合物を
スクリーニング及び選択するために使用することができる。両者レセプターのア
ゴニスト又はアンタゴニストとしてのこれらの二重モジュレーターは本明細書に
記載するような体重調節に関連する障害等の両者レセプターに関連する疾患の治
療用の改良化合物を提供することができる。
【0087】
従って、MC−3Rに対して親和性を示す化合物の結合特異性はクローニング
したレセプターを発現する組換え細胞又はこれらの細胞からの膜に対する化合物
の親和性を測定することにより示される。クローニングしたレセプターの発現と
、MC−3Rに結合するか又はMC−3Rの公知放射性標識リガンドとこれらの
細胞又はこれらの細胞から調製した膜の結合を阻止する化合物のスクリーニング
は、体重障害の治療に有用であると思われるMC−3Rに高親和性をもつ化合物
の迅速な選択に有効な方法を提供する。このようなリガンドは必ずしも放射性標
識する必要はなく、結合した放射性標識化合物の代りに使用可能であるか又は機
能アッセイでアクチベーターとして使用可能な非同位化合物を使用してもよい。
上記方法により同定した化合物はMC−3Rのアゴニスト又はアンタゴニストで
あると思われ、種々の疾患の治療に有用であると思われるペプチド、タンパク質
又は非タンパク性有機分子であると思われ、このような疾患としては例えば(食
欲低下、代謝率増加、脂肪摂取量低下又は炭水化物欲求低下により)肥満、糖尿
病、高血圧、高脂血症、骨関節炎、癌、胆嚢疾患、睡眠無呼吸、鬱病、男性及び
女性性機能不全(インポテンス、性欲低下及び勃起障害を含む)、発熱、炎症、
免役調節、関節リウマチ炎、皮膚黒硬化、神経保護及び認知増進(アルツハイマ
ー病の治療を含む)、食欲低下、悪液質、癌、疼痛、記憶、ニューロン再生及び
神経障害、GH、IGF1機能低下に関連する成長障害、虚弱高齢者に生じるよ
うな除脂肪体重低下の治療、GH欠損に起因する他の状態、癌悪液質、鬱病と不
安に関連する障害、鬱病や不安等の行動障害、嗜癖行動(例えばモルヒネやコカ
イン等の薬物の慢性使用に関連する嗜癖行動)が挙げられるが、これらに限定さ
れない。化合物はMC−3RをコードするDNA又はRNAの発現を増加又は減
衰することにより調節するものでもよいし、MC−3Rレセプタータンパク質の
アゴニスト又はアンタゴニストとして作用することにより調節するものでもよい
。MC−3RをコードするDNAもしくはRNAの発現又はその生物学的機能を
調節するこれらの化合物は種々のアッセイにより検出することができる。アッセ
イは単に発現又は機能の変化の有無を決定する「イエス/ノー」アッセイでよい
。アッセイは試験サンプルの発現又は機能を標準サンプルにおける発現又は機能
レベルと比較する定量アッセイでもよい。MC−3Rを含むキット、MC−3R
の抗体又は改変MC−3Rはこのような用途に公知の方法で作製することができ
る。
したレセプターを発現する組換え細胞又はこれらの細胞からの膜に対する化合物
の親和性を測定することにより示される。クローニングしたレセプターの発現と
、MC−3Rに結合するか又はMC−3Rの公知放射性標識リガンドとこれらの
細胞又はこれらの細胞から調製した膜の結合を阻止する化合物のスクリーニング
は、体重障害の治療に有用であると思われるMC−3Rに高親和性をもつ化合物
の迅速な選択に有効な方法を提供する。このようなリガンドは必ずしも放射性標
識する必要はなく、結合した放射性標識化合物の代りに使用可能であるか又は機
能アッセイでアクチベーターとして使用可能な非同位化合物を使用してもよい。
上記方法により同定した化合物はMC−3Rのアゴニスト又はアンタゴニストで
あると思われ、種々の疾患の治療に有用であると思われるペプチド、タンパク質
又は非タンパク性有機分子であると思われ、このような疾患としては例えば(食
欲低下、代謝率増加、脂肪摂取量低下又は炭水化物欲求低下により)肥満、糖尿
病、高血圧、高脂血症、骨関節炎、癌、胆嚢疾患、睡眠無呼吸、鬱病、男性及び
女性性機能不全(インポテンス、性欲低下及び勃起障害を含む)、発熱、炎症、
免役調節、関節リウマチ炎、皮膚黒硬化、神経保護及び認知増進(アルツハイマ
ー病の治療を含む)、食欲低下、悪液質、癌、疼痛、記憶、ニューロン再生及び
神経障害、GH、IGF1機能低下に関連する成長障害、虚弱高齢者に生じるよ
うな除脂肪体重低下の治療、GH欠損に起因する他の状態、癌悪液質、鬱病と不
安に関連する障害、鬱病や不安等の行動障害、嗜癖行動(例えばモルヒネやコカ
イン等の薬物の慢性使用に関連する嗜癖行動)が挙げられるが、これらに限定さ
れない。化合物はMC−3RをコードするDNA又はRNAの発現を増加又は減
衰することにより調節するものでもよいし、MC−3Rレセプタータンパク質の
アゴニスト又はアンタゴニストとして作用することにより調節するものでもよい
。MC−3RをコードするDNAもしくはRNAの発現又はその生物学的機能を
調節するこれらの化合物は種々のアッセイにより検出することができる。アッセ
イは単に発現又は機能の変化の有無を決定する「イエス/ノー」アッセイでよい
。アッセイは試験サンプルの発現又は機能を標準サンプルにおける発現又は機能
レベルと比較する定量アッセイでもよい。MC−3Rを含むキット、MC−3R
の抗体又は改変MC−3Rはこのような用途に公知の方法で作製することができ
る。
【0088】
従って、本発明はMC−3Rレセプター活性を調節する物質の同定方法として
、 (a)MC−3Rレセプタータンパク質(非限定的な例として配列番号2及び/
又は配列番号4に記載のアミノ酸配列を含むMC−3Rレセプタータンパク質)
の存在下と不在下に試験物質を加える段階と、 (b)MC−3Rレセプタータンパク質の存在下と不在下の試験物質の効果を測
定及び比較する段階を含む方法にも関する。
、 (a)MC−3Rレセプタータンパク質(非限定的な例として配列番号2及び/
又は配列番号4に記載のアミノ酸配列を含むMC−3Rレセプタータンパク質)
の存在下と不在下に試験物質を加える段階と、 (b)MC−3Rレセプタータンパク質の存在下と不在下の試験物質の効果を測
定及び比較する段階を含む方法にも関する。
【0089】
更に、MC−3Rレセプタータンパク質を発現する発現ベクターとタンデムで
当業者が使用することができる種々のスクリーニング又は選択アッセイを示すた
めに本明細書には数種の特定態様を開示する。他のレセプターのアゴニスト及び
アンタゴニストの同定方法は当分野で周知であり、MC−3Rのアゴニスト及び
アンタゴニストを同定するように応用することができる。従って、これらの態様
は例示であり、これらに限定するものではない。従って、本発明はMC−3Rモ
ジュレーター(例えばアゴニスト、逆アゴニスト及びアンタゴニスト)を同定す
ることが可能なアッセイを含む。従って、本発明は物質が体重障害の治療に有用
なMC−3Rの潜在的アゴニスト又はアンタゴニストであるか否かを判定する方
法として、 (a)細胞でMC−3Rの発現を誘導する発現ベクターを細胞にトランスフェク
ト又は形質転換し、試験細胞を得る段階と、 (b)MC−3Rを発現させるために十分な時間試験細胞を増殖させる段階と、 (c)物質の存在下と不在下で細胞をMC−3Rの標識リガンドに暴露する段階
と、 (d)標識リガンドとMC−3Rの結合を測定し、標識リガンドの結合量が物質
の不在下よりも物質の存在下のほうが少ない場合には物質がMC−3Rの潜在的
アゴニスト又はアンタゴニストであると判定する段階を含む方法に関する。
当業者が使用することができる種々のスクリーニング又は選択アッセイを示すた
めに本明細書には数種の特定態様を開示する。他のレセプターのアゴニスト及び
アンタゴニストの同定方法は当分野で周知であり、MC−3Rのアゴニスト及び
アンタゴニストを同定するように応用することができる。従って、これらの態様
は例示であり、これらに限定するものではない。従って、本発明はMC−3Rモ
ジュレーター(例えばアゴニスト、逆アゴニスト及びアンタゴニスト)を同定す
ることが可能なアッセイを含む。従って、本発明は物質が体重障害の治療に有用
なMC−3Rの潜在的アゴニスト又はアンタゴニストであるか否かを判定する方
法として、 (a)細胞でMC−3Rの発現を誘導する発現ベクターを細胞にトランスフェク
ト又は形質転換し、試験細胞を得る段階と、 (b)MC−3Rを発現させるために十分な時間試験細胞を増殖させる段階と、 (c)物質の存在下と不在下で細胞をMC−3Rの標識リガンドに暴露する段階
と、 (d)標識リガンドとMC−3Rの結合を測定し、標識リガンドの結合量が物質
の不在下よりも物質の存在下のほうが少ない場合には物質がMC−3Rの潜在的
アゴニスト又はアンタゴニストであると判定する段階を含む方法に関する。
【0090】
方法の段階(c)を実施する条件はタンパク質−リガンド相互作用の試験に当
分野で一般に使用される条件であり、例えば生理的pH、PBS等の通常使用さ
れる緩衝液又は組織培地中の塩条件、約4℃〜約55℃の温度である。試験細胞
を回収し、物質と標識リガンドの存在下に再懸濁してもよい。上記方法の変形例
では、段階(c)を変形し、細胞を回収及び再懸濁せずに、細胞を例えば組織培
養プレート等の支持体に結合したまま放射性標識既知アゴニストと物質を細胞と
接触させる。
分野で一般に使用される条件であり、例えば生理的pH、PBS等の通常使用さ
れる緩衝液又は組織培地中の塩条件、約4℃〜約55℃の温度である。試験細胞
を回収し、物質と標識リガンドの存在下に再懸濁してもよい。上記方法の変形例
では、段階(c)を変形し、細胞を回収及び再懸濁せずに、細胞を例えば組織培
養プレート等の支持体に結合したまま放射性標識既知アゴニストと物質を細胞と
接触させる。
【0091】
本発明は物質がMC−3Rに結合することができるか、又は機能的でなくなっ
ているがリガンド結合に関与している可能性のある突然変異体であるか、即ち物
質がMC−3Rの潜在的アゴニスト、逆アゴニスト又はアンタゴニストであり、
従って体重障害の治療に有用であるか否かを判定する方法として、 (a)細胞でMC−3Rの発現を誘導する発現ベクターを細胞にトランスフェク
ト又は形質転換し、試験細胞を得る段階と、 (b)試験細胞を物質に暴露する段階と、 (c)物質のMC−3R結合量を測定する段階と、 (d)試験細胞における物質のMC−3R結合量を、MC−3Rをトランスフェ
クトしていない対照細胞との物質の結合量と比較し、物質の結合量が対照細胞よ
りも試験細胞のほうが多い場合には物質がMC−3Rと結合できると判定する段
階を含む方法にも関する。この場合、物質が実際にアゴニスト又はアンタゴニス
トであるか否かの判定は、例えば下記無差別タンパク質の使用によるアッセイ等
の機能的アッセイの使用により実施することができる。
ているがリガンド結合に関与している可能性のある突然変異体であるか、即ち物
質がMC−3Rの潜在的アゴニスト、逆アゴニスト又はアンタゴニストであり、
従って体重障害の治療に有用であるか否かを判定する方法として、 (a)細胞でMC−3Rの発現を誘導する発現ベクターを細胞にトランスフェク
ト又は形質転換し、試験細胞を得る段階と、 (b)試験細胞を物質に暴露する段階と、 (c)物質のMC−3R結合量を測定する段階と、 (d)試験細胞における物質のMC−3R結合量を、MC−3Rをトランスフェ
クトしていない対照細胞との物質の結合量と比較し、物質の結合量が対照細胞よ
りも試験細胞のほうが多い場合には物質がMC−3Rと結合できると判定する段
階を含む方法にも関する。この場合、物質が実際にアゴニスト又はアンタゴニス
トであるか否かの判定は、例えば下記無差別タンパク質の使用によるアッセイ等
の機能的アッセイの使用により実施することができる。
【0092】
方法の段階(c)を実施する条件はタンパク質−リガンド相互作用の研究に当
分野で一般に使用される条件であり、例えば生理的pH、PBS等の通常使用さ
れる緩衝液又は組織培地中の塩条件、約4℃〜約55℃の温度である。試験細胞
を回収し、物質と標識リガンドの存在下に再懸濁してもよい。
分野で一般に使用される条件であり、例えば生理的pH、PBS等の通常使用さ
れる緩衝液又は組織培地中の塩条件、約4℃〜約55℃の温度である。試験細胞
を回収し、物質と標識リガンドの存在下に再懸濁してもよい。
【0093】
Chenら(1995,Analytical Biochemistry
226:349−354)はLacZ遺伝子に融合したcAMP応答性エレメン
トをもつプロモーターを含む第2の発現ベクターと共にGタンパク質共役レセプ
ターをコードする発現ベクターをトランスフェクトした組換え細胞を使用する比
色アッセイを記載している。過剰発現されたGタンパク質共役レセプターの活性
をβ−Galの発現及びOD測定として測定する。従って、本発明のこの部分の
別の側面は物質がMC−3Rの潜在的アゴニスト又はアンタゴニストであるか否
かを判定する非放射性方法として、 (a)MC−3Rをコードする発現ベクターを細胞にトランスフェクト又は形質
転換し、試験細胞を得る段階と、 (b)LacZ等の比色遺伝子に融合したcAMP誘導プロモーターを含む発現
ベクターを段階(a)の試験細胞にトランスフェクト又は形質転換する段階と、 (c)MC−3Rを発現させるために十分な時間トランスフェクトした細胞を増
殖させる段階と、 (d)トランスフェクトした細胞を回収し、MC−3Rの既知アゴニストの存在
下又は試験化合物の存在下と不在下で細胞を再懸濁する段階と、 (e)過剰発現MC−3Rに対する既知アゴニストと試験化合物の結合を比色ア
ッセイにより測定してcAMP誘導プロモーターの発現を測定し、既知アゴニス
トの存在下及び未知物質の存在下と不在下の発現レベルを比較し、未知物質がM
C−3Rの潜在的アゴニスト又はアンタゴニストとして作用するか否かを判定す
る段階を含む方法に関する。
226:349−354)はLacZ遺伝子に融合したcAMP応答性エレメン
トをもつプロモーターを含む第2の発現ベクターと共にGタンパク質共役レセプ
ターをコードする発現ベクターをトランスフェクトした組換え細胞を使用する比
色アッセイを記載している。過剰発現されたGタンパク質共役レセプターの活性
をβ−Galの発現及びOD測定として測定する。従って、本発明のこの部分の
別の側面は物質がMC−3Rの潜在的アゴニスト又はアンタゴニストであるか否
かを判定する非放射性方法として、 (a)MC−3Rをコードする発現ベクターを細胞にトランスフェクト又は形質
転換し、試験細胞を得る段階と、 (b)LacZ等の比色遺伝子に融合したcAMP誘導プロモーターを含む発現
ベクターを段階(a)の試験細胞にトランスフェクト又は形質転換する段階と、 (c)MC−3Rを発現させるために十分な時間トランスフェクトした細胞を増
殖させる段階と、 (d)トランスフェクトした細胞を回収し、MC−3Rの既知アゴニストの存在
下又は試験化合物の存在下と不在下で細胞を再懸濁する段階と、 (e)過剰発現MC−3Rに対する既知アゴニストと試験化合物の結合を比色ア
ッセイにより測定してcAMP誘導プロモーターの発現を測定し、既知アゴニス
トの存在下及び未知物質の存在下と不在下の発現レベルを比較し、未知物質がM
C−3Rの潜在的アゴニスト又はアンタゴニストとして作用するか否かを判定す
る段階を含む方法に関する。
【0094】
この他、体重障害治療用MC−3Rアゴニスト又はアンタゴニストの同定方法
としては以下の方法が挙げられるが、これらに限定されない。
としては以下の方法が挙げられるが、これらに限定されない。
【0095】
I.(a)MC−3Rの発現を誘導する第1の発現ベクターとプロミスカスG
タンパク質の発現を誘導する第2の発現ベクターを細胞にトランスフェクト又は
形質転換し、試験細胞を得る段階と、 (b)試験細胞をMC−3Rの被疑アゴニストである物質に暴露する段階と、 (c)細胞中のリン酸イノシトール値を測定し、被疑アゴニストの不在下の細胞
中のリン酸イノシトール値に比較して細胞中のリン酸イノシトール値が増加して
いる場合には物質がMC−3Rのアゴニストであると判定する段階を含む方法。
タンパク質の発現を誘導する第2の発現ベクターを細胞にトランスフェクト又は
形質転換し、試験細胞を得る段階と、 (b)試験細胞をMC−3Rの被疑アゴニストである物質に暴露する段階と、 (c)細胞中のリン酸イノシトール値を測定し、被疑アゴニストの不在下の細胞
中のリン酸イノシトール値に比較して細胞中のリン酸イノシトール値が増加して
いる場合には物質がMC−3Rのアゴニストであると判定する段階を含む方法。
【0096】
II.(a)MC−3Rの発現を誘導する第1の発現ベクターとプロミスカス
Gタンパク質の発現を誘導する第2の発現ベクターを細胞にトランスフェクト又
は形質転換し、試験細胞を得る段階と、 (b)試験細胞をMC−3Rのアゴニストである物質に暴露する段階と、 (c)段階(b)の後又はそれと同時に試験細胞をMC−3Rの被疑アンタゴニ
ストである物質に暴露する段階と、 (d)細胞中のリン酸イノシトール値を測定し、被疑アンタゴニストの存在下の
細胞中のリン酸イノシトール値が被疑アンタゴニストの不在下の細胞中のリン酸
イノシトール値に比較して低下している場合には物質がMC−3Rのアンタゴニ
ストであると判定する段階を含む方法。
Gタンパク質の発現を誘導する第2の発現ベクターを細胞にトランスフェクト又
は形質転換し、試験細胞を得る段階と、 (b)試験細胞をMC−3Rのアゴニストである物質に暴露する段階と、 (c)段階(b)の後又はそれと同時に試験細胞をMC−3Rの被疑アンタゴニ
ストである物質に暴露する段階と、 (d)細胞中のリン酸イノシトール値を測定し、被疑アンタゴニストの存在下の
細胞中のリン酸イノシトール値が被疑アンタゴニストの不在下の細胞中のリン酸
イノシトール値に比較して低下している場合には物質がMC−3Rのアンタゴニ
ストであると判定する段階を含む方法。
【0097】
III.段階(a)の第1及び第2の発現ベクターを、そのC末端でプロミス
カスGタンパク質に融合したキメラMC−3Rタンパク質を発現する単一発現ベ
クターで置換える方法。
カスGタンパク質に融合したキメラMC−3Rタンパク質を発現する単一発現ベ
クターで置換える方法。
【0098】
上記方法を変形し、試験細胞を物質に暴露するのでなく、試験細胞から膜を調
製し、その膜を物質に暴露してもよい。細胞でなく膜を使用するこのような変形
は当分野で周知であり、例えばHessら,1992,Biochem.Bio
phys.Res.Comm.184:260−268に記載されている。従っ
て、本発明の別の態様は試験細胞の代りに試験細胞からの膜調製物を使用して物
質がMC−3Rに結合するか及び/又はMC−3Rの潜在的アゴニスト又はアン
タゴニストであるか否かを判定する方法に関する。このような方法は、 (a)細胞でMC−3Rの発現を誘導する発現ベクターを細胞にトランスフェク
ト又は形質転換し、試験細胞を得る段階と、 (b)試験細胞からMC−3Rを含む膜を調製し、リガンドが膜内のMC−3R
と結合する条件下で膜をMC−3Rのリガンドに暴露する段階と、 (c)段階(b)の後又はそれと同時に試験細胞からの膜を物質に暴露する段階
と、 (d)物質の存在下と不在下で膜内のMC−3Rとリガンドの結合量を測定する
段階と、 (e)物質の存在下と不在下の膜内のMC−3Rとリガンドの結合量を比較し、
物質の存在下の膜内のMC−3Rとリガンドの結合量が低下している場合には物
質がMC−3Rと結合できると判定する段階を含み、上記のような生理的条件を
使用することができる。
製し、その膜を物質に暴露してもよい。細胞でなく膜を使用するこのような変形
は当分野で周知であり、例えばHessら,1992,Biochem.Bio
phys.Res.Comm.184:260−268に記載されている。従っ
て、本発明の別の態様は試験細胞の代りに試験細胞からの膜調製物を使用して物
質がMC−3Rに結合するか及び/又はMC−3Rの潜在的アゴニスト又はアン
タゴニストであるか否かを判定する方法に関する。このような方法は、 (a)細胞でMC−3Rの発現を誘導する発現ベクターを細胞にトランスフェク
ト又は形質転換し、試験細胞を得る段階と、 (b)試験細胞からMC−3Rを含む膜を調製し、リガンドが膜内のMC−3R
と結合する条件下で膜をMC−3Rのリガンドに暴露する段階と、 (c)段階(b)の後又はそれと同時に試験細胞からの膜を物質に暴露する段階
と、 (d)物質の存在下と不在下で膜内のMC−3Rとリガンドの結合量を測定する
段階と、 (e)物質の存在下と不在下の膜内のMC−3Rとリガンドの結合量を比較し、
物質の存在下の膜内のMC−3Rとリガンドの結合量が低下している場合には物
質がMC−3Rと結合できると判定する段階を含み、上記のような生理的条件を
使用することができる。
【0099】
本発明は更に物質がMC−3Rに結合できるか否かを判定する方法として、
(a)細胞でMC−3Rの発現を誘導する発現ベクターを細胞にトランスフェク
ト又は形質転換し、試験細胞を得る段階と、 (b)試験細胞からMC−3Rを含む膜を調製し、試験細胞からの膜を物質に暴
露する段階と、 (c)試験細胞からの膜内のMC−3Rと物質の結合量を測定する段階と、 (d)試験細胞からの膜内のMC−3Rと物質の結合量を、MC−3Rをトラン
スフェクトしていない対照細胞からの膜との物質の結合量と比較し、試験細胞か
らの膜内のMC−3Rと物質の結合量が対照細胞からの膜と物質の結合量よりも
多い場合にはMC−3Rと結合できると判定する段階を含む方法にも関する。
ト又は形質転換し、試験細胞を得る段階と、 (b)試験細胞からMC−3Rを含む膜を調製し、試験細胞からの膜を物質に暴
露する段階と、 (c)試験細胞からの膜内のMC−3Rと物質の結合量を測定する段階と、 (d)試験細胞からの膜内のMC−3Rと物質の結合量を、MC−3Rをトラン
スフェクトしていない対照細胞からの膜との物質の結合量と比較し、試験細胞か
らの膜内のMC−3Rと物質の結合量が対照細胞からの膜と物質の結合量よりも
多い場合にはMC−3Rと結合できると判定する段階を含む方法にも関する。
【0100】
本発明の1好適態様は種々の濃度の未標識リガンドの存在下に標識リガンドと
して125I標識NDP−α−MSGを使用して種々のリガンド結合親和性を測
定する。第2のメッセンジャー経路の活性化は種々の濃度でアゴニストにより誘
発した細胞内cAMPを測定することにより測定することができる。
して125I標識NDP−α−MSGを使用して種々のリガンド結合親和性を測
定する。第2のメッセンジャー経路の活性化は種々の濃度でアゴニストにより誘
発した細胞内cAMPを測定することにより測定することができる。
【0101】
好ましくは本明細書に記載するようなトランスジェニック又は野生型動物に目
的化合物を投与してMC−3Rレセプターに及ぼす化合物のin vivo効果
を測定し、更に非ヒト動物に及ぼす化合物投与の生物学的及び生理的効果を測定
することにより、MC−3Rにin vitro調節効果を示すスクリーニング
後の化合物をin vivo分析することは本発明の範囲に含まれる。これらの
in vivo試験は単独で実施してもよいし、非限定的な例として例えばα−
MSH、アグーチタンパク質又はアグーチ様タンパク質等の公知MC−3Rリガ
ンドと併用して実施してもよい。例えば、MC−3R KO及び野生型マウスを
使用して摂飼量、体重、体組成、グルコース、インスリン、レプチン及びコレス
テロール値、性機能、記憶、学習、神経再生、疼痛等の数種の異なるパラメータ
ーに及ぼす候補化合物の効果をin vivo試験することができる。体重及び
糖尿病に関するこのような測定を容易にするためには、ノックアウトマウスと野
生型マウスの両者をまずDIO(飼料誘発肥満)にした後に化合物を試験するこ
とができる。従って、野生型、ノックアウト及びヘテロ接合マウスに及ぼす効果
の比較は前記化合物の選択性の評価の必須要素である。
的化合物を投与してMC−3Rレセプターに及ぼす化合物のin vivo効果
を測定し、更に非ヒト動物に及ぼす化合物投与の生物学的及び生理的効果を測定
することにより、MC−3Rにin vitro調節効果を示すスクリーニング
後の化合物をin vivo分析することは本発明の範囲に含まれる。これらの
in vivo試験は単独で実施してもよいし、非限定的な例として例えばα−
MSH、アグーチタンパク質又はアグーチ様タンパク質等の公知MC−3Rリガ
ンドと併用して実施してもよい。例えば、MC−3R KO及び野生型マウスを
使用して摂飼量、体重、体組成、グルコース、インスリン、レプチン及びコレス
テロール値、性機能、記憶、学習、神経再生、疼痛等の数種の異なるパラメータ
ーに及ぼす候補化合物の効果をin vivo試験することができる。体重及び
糖尿病に関するこのような測定を容易にするためには、ノックアウトマウスと野
生型マウスの両者をまずDIO(飼料誘発肥満)にした後に化合物を試験するこ
とができる。従って、野生型、ノックアウト及びヘテロ接合マウスに及ぼす効果
の比較は前記化合物の選択性の評価の必須要素である。
【0102】
他のメラノコルチン又は上方または下方調節されていると思われる他の経路に
対する感度を測定し、これらの経路を調節する化合物の感度における変化を測定
することも本発明の必須部分である。従って、MC−4R又は他のメラノコルチ
ンレセプター、NPYレセプター、ゲラニンレセプター、MCHレセプター、イ
ンスリンレセプター、オレキシンレセプター、ボムベシンファミリーレセプター
に属するレセプター(BRS−3、ニューロメディンレセプター、ガストリン放
出ペプチドレセプター)、モチリンレセプター、ニューロメディンUレセプター
、アドレナリンレセプター、レプチンレセプター、STAT及びSOC転写因子
のモジュレーター、ホスホジエステラーゼ酵素等が本発明の非ヒトトランスジェ
ニック動物に使用する範囲に含まれ、このような動物としては例えば本明細書に
記載し、実施例3に例示するような改変天然MC−3R遺伝子についてホモ接合
、ヘテロ接合又はヘミ接合性のトランスジェニックマウスと、MC−3R及びM
C−4R天然遺伝子の二重ノックアウトについてホモ接合、ヘテロ接合又はヘミ
接合性のトランスジェニックマウスが挙げられるが、これらに限定されない。従
って、本発明の1好適側面はMC−3R及び/又はMC−4Rをターゲティング
することによりin vitro細胞及び/又は膜アッセイにより初期同定する
ことができるMC−3R及び/又はMC−4Rレセプターを調節することが示さ
れる化合物の選択に関する。当然のことながら、このようなMC−4Rアッセイ
は当分野で周知のようにMC−3Rについて本明細書に記載するように使用する
ことができる(例えばLeeらの1999年8月3日発行米国特許第5,932
,779号;Huszarら,1997,Cell 88:131−141参照
)。MC−4R及び/又はMC−3R遺伝子を改変したトランスジェニックマウ
スに投与し、本発明のMC−3R及びMC−3R/MC−4R改変マウスについ
て本明細書に開示するような生物学的特徴を測定することにより、このような任
意化合物を更に試験することができる。
対する感度を測定し、これらの経路を調節する化合物の感度における変化を測定
することも本発明の必須部分である。従って、MC−4R又は他のメラノコルチ
ンレセプター、NPYレセプター、ゲラニンレセプター、MCHレセプター、イ
ンスリンレセプター、オレキシンレセプター、ボムベシンファミリーレセプター
に属するレセプター(BRS−3、ニューロメディンレセプター、ガストリン放
出ペプチドレセプター)、モチリンレセプター、ニューロメディンUレセプター
、アドレナリンレセプター、レプチンレセプター、STAT及びSOC転写因子
のモジュレーター、ホスホジエステラーゼ酵素等が本発明の非ヒトトランスジェ
ニック動物に使用する範囲に含まれ、このような動物としては例えば本明細書に
記載し、実施例3に例示するような改変天然MC−3R遺伝子についてホモ接合
、ヘテロ接合又はヘミ接合性のトランスジェニックマウスと、MC−3R及びM
C−4R天然遺伝子の二重ノックアウトについてホモ接合、ヘテロ接合又はヘミ
接合性のトランスジェニックマウスが挙げられるが、これらに限定されない。従
って、本発明の1好適側面はMC−3R及び/又はMC−4Rをターゲティング
することによりin vitro細胞及び/又は膜アッセイにより初期同定する
ことができるMC−3R及び/又はMC−4Rレセプターを調節することが示さ
れる化合物の選択に関する。当然のことながら、このようなMC−4Rアッセイ
は当分野で周知のようにMC−3Rについて本明細書に記載するように使用する
ことができる(例えばLeeらの1999年8月3日発行米国特許第5,932
,779号;Huszarら,1997,Cell 88:131−141参照
)。MC−4R及び/又はMC−3R遺伝子を改変したトランスジェニックマウ
スに投与し、本発明のMC−3R及びMC−3R/MC−4R改変マウスについ
て本明細書に開示するような生物学的特徴を測定することにより、このような任
意化合物を更に試験することができる。
【0103】
医薬的に許容可能なキャリヤーの混合等の公知方法により、MC−3Rのモジ
ュレーターを含む医薬的に有用な組成物を処方することができる。このようなキ
ャリヤーと処方方法の例はRemington’s Pharmaceutic
al Sciencesに記載されている。有効な投与に適した医薬的に許容可
能な組成物を形成するためには、このような組成物は有効量のタンパク質、DN
A、RNA、改変MC−3R、又はMC−3Rアゴニストもしくはアンタゴニス
トを含む。
ュレーターを含む医薬的に有用な組成物を処方することができる。このようなキ
ャリヤーと処方方法の例はRemington’s Pharmaceutic
al Sciencesに記載されている。有効な投与に適した医薬的に許容可
能な組成物を形成するためには、このような組成物は有効量のタンパク質、DN
A、RNA、改変MC−3R、又はMC−3Rアゴニストもしくはアンタゴニス
トを含む。
【0104】
本発明の治療用又は診断用組成物は障害を治療又は診断するために十分な量を
個体に投与する。有効量は個体の状態、体重、性別及び年齢等の種々の因子によ
り変えることができる。他の因子としては投与方法もある。
個体に投与する。有効量は個体の状態、体重、性別及び年齢等の種々の因子によ
り変えることができる。他の因子としては投与方法もある。
【0105】
医薬組成物は皮下、局所、経口及び筋肉内等の種々の経路で個体に投与するこ
とができる。
とができる。
【0106】
「化学的誘導体」なる用語は通常は基本分子の一部でない付加化学部分を含む
分子を意味する。このような部分は基本分子の溶解度、半減期、吸収等を改善す
ることができる。あるいは、部分は基本分子の望ましくない副作用を緩和するか
、又は基本分子の毒性を低下させることができる。このような部分の例はRem
ington’s Pharmaceutical Sciencesを始めと
する種々の教科書に記載されている。
分子を意味する。このような部分は基本分子の溶解度、半減期、吸収等を改善す
ることができる。あるいは、部分は基本分子の望ましくない副作用を緩和するか
、又は基本分子の毒性を低下させることができる。このような部分の例はRem
ington’s Pharmaceutical Sciencesを始めと
する種々の教科書に記載されている。
【0107】
本明細書に開示する方法に従って同定した化合物は適当な用量で単独使用する
ことができる。あるいは、他の薬剤を同時又は逐次投与することが望ましい場合
もある。
ことができる。あるいは、他の薬剤を同時又は逐次投与することが望ましい場合
もある。
【0108】
本発明は本発明の新規治療方法で使用するのに適した局所、経口、全身及び非
経口医薬製剤を提供することも目的とする。本発明により活性成分として同定さ
れた化合物を含む組成物は慣用投与ビヒクル中で広範な治療剤形で投与すること
ができる。例えば、タブレット、カプセル(各々定時放出製剤及び持続放出製剤
を含む)、ピル、散剤、顆粒剤、エリキシル剤、チンキ剤、溶液、懸濁液、シロ
ップ及び乳剤等の経口剤形又は注射により投与することができる。同様に、静脈
内(ボーラス剤と輸液の両者)、腹膜組織内、皮下、閉鎖の有無を問わずに局所
、又は筋肉内形態で投与することもでき、いずれも薬剤分野の当業者に周知の形
態を使用する。
経口医薬製剤を提供することも目的とする。本発明により活性成分として同定さ
れた化合物を含む組成物は慣用投与ビヒクル中で広範な治療剤形で投与すること
ができる。例えば、タブレット、カプセル(各々定時放出製剤及び持続放出製剤
を含む)、ピル、散剤、顆粒剤、エリキシル剤、チンキ剤、溶液、懸濁液、シロ
ップ及び乳剤等の経口剤形又は注射により投与することができる。同様に、静脈
内(ボーラス剤と輸液の両者)、腹膜組織内、皮下、閉鎖の有無を問わずに局所
、又は筋肉内形態で投与することもでき、いずれも薬剤分野の当業者に周知の形
態を使用する。
【0109】
本発明の化合物は1日1回投与してもよいし、合計1日用量を1日に2、3又
は4回に別けて投与してもよいという利点がある。更に、本発明の化合物は適当
な鼻孔内ビヒクルを局所使用により鼻孔内形態で投与してもよいし、当業者に周
知の経皮パッチ形態を使用する経皮経路により投与してもよい。経皮送達系の形
態で投与するためには、製剤投与は当然のことながら投与期間を通して間欠的に
投与するよりも連続投与したほうがよい。
は4回に別けて投与してもよいという利点がある。更に、本発明の化合物は適当
な鼻孔内ビヒクルを局所使用により鼻孔内形態で投与してもよいし、当業者に周
知の経皮パッチ形態を使用する経皮経路により投与してもよい。経皮送達系の形
態で投与するためには、製剤投与は当然のことながら投与期間を通して間欠的に
投与するよりも連続投与したほうがよい。
【0110】
2種以上の活性剤を別個の製剤で使用して併用治療する場合には、活性剤を同
時に投与してもよいし、各々時間をずらせて投与してもよい。
時に投与してもよいし、各々時間をずらせて投与してもよい。
【0111】
本発明の化合物を使用する投与法は患者の型、種、年齢、体重、性別及び病態
;治療する状態の重篤度;投与経路;患者の腎、肝及び心臓血管機能;並びに使
用するその特定化合物等の種々の因子に応じて選択する。通常の知識をもつ医師
又は獣医であれば、状態の進行を防止、抑制又は阻止するために必要な薬剤の有
効量を容易に決定及び処方することができる。毒性を生じずに効力を発揮する範
囲内の薬剤濃度に達するように最適に調整するには、薬剤の標的部位利用率の動
態に基づく投与計画が必要である。これには、薬剤の分配、平衡及び排出を考慮
する必要がある。
;治療する状態の重篤度;投与経路;患者の腎、肝及び心臓血管機能;並びに使
用するその特定化合物等の種々の因子に応じて選択する。通常の知識をもつ医師
又は獣医であれば、状態の進行を防止、抑制又は阻止するために必要な薬剤の有
効量を容易に決定及び処方することができる。毒性を生じずに効力を発揮する範
囲内の薬剤濃度に達するように最適に調整するには、薬剤の標的部位利用率の動
態に基づく投与計画が必要である。これには、薬剤の分配、平衡及び排出を考慮
する必要がある。
【0112】
以下の実施例は例示であり、種々の他の態様が当業者に自明であるので、以下
の実施例は発明の範囲を制限するものではない。
の実施例は発明の範囲を制限するものではない。
【0113】
実施例1
MC−3Rターゲティングベクターの構築
MC−3R遺伝子を含むゲノムDNAを単離するために、1KbラットMC−
3R PCR産物をプローブとして使用してマウス129sjvλゲノムライブ
ラリー(Lambda FIX II Library,Stratagene
,La Jolla,CA)をスクリーニングした。このプローブは全長ラット
MC−3Rコーディング領域に対応する。17Kb SalIマウスゲノムクロ
ーンを単離し、pBluescriptII KS(−)にサブクローニングし
、pAL−1と命名した。コーディング領域で切断する数種の制限酵素で消化し
たところ、この17Kb SalI制限フラグメントは3Kbの5’フランキン
グ領域と13Kbの3’フランキング領域をもつMC−3Rコーディング配列を
含むことが判明した。ベクターpAL−1をSalI/XbaIで消化し、この
5’3.0KbフラグメントをSalI/XbaIで消化したpBluescr
iptII KS(−)にサブクローニングし、pAL−2と命名した。ベクタ
ーpAL−1をBamHIでも消化し、得られた3’アームに相当する8.5K
bフラグメントをBamHIで消化したpBluescriptII KS(−
)ベクターにサブクローニングし、次に続く指向性クローニングのためのSac
II及びClaI部位を生成した。得られたクローンをpAL−5と命名した。
5’アームに相当するEcoRI−XbaIフラグメントをpAL−2から取出
し、pGEM−9Zfと連結して3’HindIII部位を生成し、pAL−6
を得た。(ターゲティングベクターにおける陰性選択マーカーとしての)単純ヘ
ルペスウイルスチミジンキナーゼ(tk)遺伝子もXbaIとHindIIIで
消化し、pSP72にクローニングしてさらなるクローニングのためのKpnI
(5’)及びPvuII(3’)部位を生成した。このクローンをpAL7と命
名した。pKOスクランブラーベクター918(Lexicon Geneti
csから購入、Stratageneからも市販)をバックボーンとして使用し
てターゲティングベクターを作製した。1.8kbEcoRI−HindIII
フラグメントをpAL6から取出し、1.7KbHindIII−SacIIフ
ラグメントをPGK−Neo(ホスホグリセロキナーゼプロモーターの制御下の
ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子[pPGKneobpA,Ala
n Bradely博士から入手;例えばTybulewiczら,1991,
Cell 65:1153−1163も参照])から取出した。両者フラグメン
トをEcoRI/SacIIで消化したpKO V918に3部分連結により連
結した。得られたクローンをpAL8と命名した。チミジンキナーゼ(tk)遺
伝子をターゲティングベクターにサブクローニングするために、2.0KpnI
−PvuIIフラグメントをpAL7から取出し、(HpaIとKpnIで消化
した)pAL8に連結し、pAL−9を得た。このベクターに3’(長)アーム
を挿入するためには、pAL9とpAL5をSacIIとClaIで消化するこ
とが必要であった。しかし、ClaIはdam+大腸菌株(DH5α)によるD
NAメチル化によりpALベクターを消化することができず、TK遺伝子の3’
末端には別の予想外のSacII部位があった。この最初の問題を解決するため
に、pAL9プラスミドをdam−/dam−大腸菌株(DM1)に形質転換し
た。pAL9の予想外のSacII部位が切断しないように部分制限消化を使用
した。pAL5からの8.5KbSacII−ClaIフラグメントをpAL9
にサブクローニング後にMC−3RターゲティングベクターをpAL10と命名
した。BamHI、EcoRI、HindIII、NotI、SacII、Sa
lI及びXbaI等の数種の制限酵素を使用してこのターゲティングベクターの
同一性を確認した。5’配列中のターゲティングベクターの外側の約500bp
ApaI−EcoRIフラグメントをプローブとして試験した処、実施例2に記
載する標的ES細胞クローンと遺伝子ノックアウトマウスをスクリーニングする
のに適していることが判明した。pAL10作製の概略図を図5に示し、マウス
MC−3Rゲノム配列を欠失させるためのターゲティングストラテジーの全体図
を図6に示す。
3R PCR産物をプローブとして使用してマウス129sjvλゲノムライブ
ラリー(Lambda FIX II Library,Stratagene
,La Jolla,CA)をスクリーニングした。このプローブは全長ラット
MC−3Rコーディング領域に対応する。17Kb SalIマウスゲノムクロ
ーンを単離し、pBluescriptII KS(−)にサブクローニングし
、pAL−1と命名した。コーディング領域で切断する数種の制限酵素で消化し
たところ、この17Kb SalI制限フラグメントは3Kbの5’フランキン
グ領域と13Kbの3’フランキング領域をもつMC−3Rコーディング配列を
含むことが判明した。ベクターpAL−1をSalI/XbaIで消化し、この
5’3.0KbフラグメントをSalI/XbaIで消化したpBluescr
iptII KS(−)にサブクローニングし、pAL−2と命名した。ベクタ
ーpAL−1をBamHIでも消化し、得られた3’アームに相当する8.5K
bフラグメントをBamHIで消化したpBluescriptII KS(−
)ベクターにサブクローニングし、次に続く指向性クローニングのためのSac
II及びClaI部位を生成した。得られたクローンをpAL−5と命名した。
5’アームに相当するEcoRI−XbaIフラグメントをpAL−2から取出
し、pGEM−9Zfと連結して3’HindIII部位を生成し、pAL−6
を得た。(ターゲティングベクターにおける陰性選択マーカーとしての)単純ヘ
ルペスウイルスチミジンキナーゼ(tk)遺伝子もXbaIとHindIIIで
消化し、pSP72にクローニングしてさらなるクローニングのためのKpnI
(5’)及びPvuII(3’)部位を生成した。このクローンをpAL7と命
名した。pKOスクランブラーベクター918(Lexicon Geneti
csから購入、Stratageneからも市販)をバックボーンとして使用し
てターゲティングベクターを作製した。1.8kbEcoRI−HindIII
フラグメントをpAL6から取出し、1.7KbHindIII−SacIIフ
ラグメントをPGK−Neo(ホスホグリセロキナーゼプロモーターの制御下の
ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子[pPGKneobpA,Ala
n Bradely博士から入手;例えばTybulewiczら,1991,
Cell 65:1153−1163も参照])から取出した。両者フラグメン
トをEcoRI/SacIIで消化したpKO V918に3部分連結により連
結した。得られたクローンをpAL8と命名した。チミジンキナーゼ(tk)遺
伝子をターゲティングベクターにサブクローニングするために、2.0KpnI
−PvuIIフラグメントをpAL7から取出し、(HpaIとKpnIで消化
した)pAL8に連結し、pAL−9を得た。このベクターに3’(長)アーム
を挿入するためには、pAL9とpAL5をSacIIとClaIで消化するこ
とが必要であった。しかし、ClaIはdam+大腸菌株(DH5α)によるD
NAメチル化によりpALベクターを消化することができず、TK遺伝子の3’
末端には別の予想外のSacII部位があった。この最初の問題を解決するため
に、pAL9プラスミドをdam−/dam−大腸菌株(DM1)に形質転換し
た。pAL9の予想外のSacII部位が切断しないように部分制限消化を使用
した。pAL5からの8.5KbSacII−ClaIフラグメントをpAL9
にサブクローニング後にMC−3RターゲティングベクターをpAL10と命名
した。BamHI、EcoRI、HindIII、NotI、SacII、Sa
lI及びXbaI等の数種の制限酵素を使用してこのターゲティングベクターの
同一性を確認した。5’配列中のターゲティングベクターの外側の約500bp
ApaI−EcoRIフラグメントをプローブとして試験した処、実施例2に記
載する標的ES細胞クローンと遺伝子ノックアウトマウスをスクリーニングする
のに適していることが判明した。pAL10作製の概略図を図5に示し、マウス
MC−3Rゲノム配列を欠失させるためのターゲティングストラテジーの全体図
を図6に示す。
【0114】
実施例2
MC−3Rノックアウトマウスの作製
動物飼育−本発明で使用する全動物プロトコールはRahway,NJに所在
のMerck Research Laboratories Institu
tional Animal Care and Use Committee
の推奨に従った。空気シャワー口付き防壁動物施設又はSPF動物施設(高脂肪
飼料又はMTII試験)でマウスをマイクロアイソレーターケージ(Labpr
oducts(登録商標))に群毎又は個体毎に収容した。マウスにTekla
d 7012(普通マウス固形飼料)又はTeklad 97070(高脂肪飼
料)(Harlan Teklad,Madison,Wis.)を与え、水は
自由に与えた。Bio−Rad Gene Pulserを使用して標準条件下
にAB2.1細胞1×107個と25μgの直鎖化pAL10でエレクトロポレ
ーションを実施した。陽性及び陰性選択のためにこれらの細胞にG418/FI
AUを加えて培養した。約800個の耐性クローンをAB2.1細胞から選択し
た。サザンブロット分析によると非常に高いターゲティング効率が判明した(約
1/5)。24個のクローンを増殖と胚盤胞へのマイクロインジェクションに選
択してキメラマウスを作製した。クローン3D8、4C10及び4E4は良好な
キメラを生じた。AB2.2細胞でも直鎖化pAL10のエレクトロポレーショ
ンを実施した。AB2.1ES細胞は129sv系マウスから得た(例えばZh
engら,1995,Cell 81:525−531;Zhengら,199
5,Immunity 3:9−19;Wangら,1997,Nature
387:288−291;Von Kochら,1997,Neurobiol
ogy of Aging 18:661−669参照)。AB2.2ES細胞
も129sv系マウスから得た(Lexincon Geneticsから市販
)。約800個の耐性クローンを分析に選択した。サザンブロットの結果、ター
ゲティング効率は約1/13であることが判明した。12個のクローンを増殖と
マイクロインジェクションに選択した。クローン3A8、3F5、4G5は良好
なキメラを生じた。標的ESクローンをC57BL/6J胚盤胞に注入すること
により13頭のキメラマウス(60〜100%毛色キメリズム)を作製した。3
個の独立ESクローンから得られた3頭のキメラは突然変異対立遺伝子の生殖細
胞系伝達を示した。試験交配の結果、3種の系からの生殖細胞系伝達(アグーチ
子)が判明した。交配プログラムで作製したノックアウトマウスと野生型マウス
を識別し易くするために、PCRによりノックアウト対立遺伝子を野生型対立遺
伝子から区別するように3個のプライマーを設計した(図7B)。プライマー対
は野生型MC−3R(+/+)マウスの514bpフラグメントと、294bp
と、MC−3R(−/+)ヘテロ接合マウスの514bpと、MC−3Rノック
アウト(−/−)マウスの294bpフラグメントを生成する。これらのPCR
結果はテールサンプルのサザンブロット分析により確認した(図7A)。5’側
のターゲティングベクターの外側に位置する約500bpのApaI−EcoR
Iフラグメントをプローブとして使用して正しく標的したES細胞クローンと後
期突然変異マウスをスクリーニングした。MC−3Rコーディング配列をPGK
−neoカセットで標的破壊して付加HindIII部位を導入した。従って、
このプローブはWT ES細胞からの〜8.5Kb HindIIIフラグメン
トを検出し、標的MC−3R対立遺伝子を含むES細胞からはもっと小さい7K
bバンドが検出された。
のMerck Research Laboratories Institu
tional Animal Care and Use Committee
の推奨に従った。空気シャワー口付き防壁動物施設又はSPF動物施設(高脂肪
飼料又はMTII試験)でマウスをマイクロアイソレーターケージ(Labpr
oducts(登録商標))に群毎又は個体毎に収容した。マウスにTekla
d 7012(普通マウス固形飼料)又はTeklad 97070(高脂肪飼
料)(Harlan Teklad,Madison,Wis.)を与え、水は
自由に与えた。Bio−Rad Gene Pulserを使用して標準条件下
にAB2.1細胞1×107個と25μgの直鎖化pAL10でエレクトロポレ
ーションを実施した。陽性及び陰性選択のためにこれらの細胞にG418/FI
AUを加えて培養した。約800個の耐性クローンをAB2.1細胞から選択し
た。サザンブロット分析によると非常に高いターゲティング効率が判明した(約
1/5)。24個のクローンを増殖と胚盤胞へのマイクロインジェクションに選
択してキメラマウスを作製した。クローン3D8、4C10及び4E4は良好な
キメラを生じた。AB2.2細胞でも直鎖化pAL10のエレクトロポレーショ
ンを実施した。AB2.1ES細胞は129sv系マウスから得た(例えばZh
engら,1995,Cell 81:525−531;Zhengら,199
5,Immunity 3:9−19;Wangら,1997,Nature
387:288−291;Von Kochら,1997,Neurobiol
ogy of Aging 18:661−669参照)。AB2.2ES細胞
も129sv系マウスから得た(Lexincon Geneticsから市販
)。約800個の耐性クローンを分析に選択した。サザンブロットの結果、ター
ゲティング効率は約1/13であることが判明した。12個のクローンを増殖と
マイクロインジェクションに選択した。クローン3A8、3F5、4G5は良好
なキメラを生じた。標的ESクローンをC57BL/6J胚盤胞に注入すること
により13頭のキメラマウス(60〜100%毛色キメリズム)を作製した。3
個の独立ESクローンから得られた3頭のキメラは突然変異対立遺伝子の生殖細
胞系伝達を示した。試験交配の結果、3種の系からの生殖細胞系伝達(アグーチ
子)が判明した。交配プログラムで作製したノックアウトマウスと野生型マウス
を識別し易くするために、PCRによりノックアウト対立遺伝子を野生型対立遺
伝子から区別するように3個のプライマーを設計した(図7B)。プライマー対
は野生型MC−3R(+/+)マウスの514bpフラグメントと、294bp
と、MC−3R(−/+)ヘテロ接合マウスの514bpと、MC−3Rノック
アウト(−/−)マウスの294bpフラグメントを生成する。これらのPCR
結果はテールサンプルのサザンブロット分析により確認した(図7A)。5’側
のターゲティングベクターの外側に位置する約500bpのApaI−EcoR
Iフラグメントをプローブとして使用して正しく標的したES細胞クローンと後
期突然変異マウスをスクリーニングした。MC−3Rコーディング配列をPGK
−neoカセットで標的破壊して付加HindIII部位を導入した。従って、
このプローブはWT ES細胞からの〜8.5Kb HindIIIフラグメン
トを検出し、標的MC−3R対立遺伝子を含むES細胞からはもっと小さい7K
bバンドが検出された。
【0115】
このストラテジーを使用することにより、ヘテロ接合交配からの54頭の子の
遺伝子型を類別した処、9頭が相同ノックアウトであり、27頭がヘテロ接合で
あり、18頭が野生型であった。種々の試験に十分な数の同齢子孫を生産するた
めにヘテロ接合交配対を作製してもよい。ノックアウトマウスと野生型マウスを
大量生産するためにKO×KO及びWT×WTを使用する付加ストラテジーも使
用できる。
遺伝子型を類別した処、9頭が相同ノックアウトであり、27頭がヘテロ接合で
あり、18頭が野生型であった。種々の試験に十分な数の同齢子孫を生産するた
めにヘテロ接合交配対を作製してもよい。ノックアウトマウスと野生型マウスを
大量生産するためにKO×KO及びWT×WTを使用する付加ストラテジーも使
用できる。
【0116】
ノックアウトマウスのPCR分析−作製したノックアウトマウスと野生型マウ
スを識別し易くするために、PCRによりノックアウト対立遺伝子を野生型対立
遺伝子から区別するように3種のオリゴヌクレオチドを設計した。合成オリゴヌ
クレオチド5’−GATGAGAGAAGACTGGAGAGAGAGGGTC
−3’(配列番号5)及び5’−GAAGAAGTACATGGGAGAGTG
CAGGTT−3’(配列番号6)を使用して野生型対立遺伝子から514bp
PCR産物が得られ、5’−GATGAGAGAAGACTGGAGGAGAG
GGTC−3’(配列番号7)及び5’−TACCGGTGGATGTGGAA
TGTGTGC−3’(配列番号8)を使用して突然変異対立遺伝子から294
bpPCR産物が得られる。結果を図7Bに示す。
スを識別し易くするために、PCRによりノックアウト対立遺伝子を野生型対立
遺伝子から区別するように3種のオリゴヌクレオチドを設計した。合成オリゴヌ
クレオチド5’−GATGAGAGAAGACTGGAGAGAGAGGGTC
−3’(配列番号5)及び5’−GAAGAAGTACATGGGAGAGTG
CAGGTT−3’(配列番号6)を使用して野生型対立遺伝子から514bp
PCR産物が得られ、5’−GATGAGAGAAGACTGGAGGAGAG
GGTC−3’(配列番号7)及び5’−TACCGGTGGATGTGGAA
TGTGTGC−3’(配列番号8)を使用して突然変異対立遺伝子から294
bpPCR産物が得られる。結果を図7Bに示す。
【0117】
in situハイブリダイゼーション−MC3−R KOマウスと同一齢/
性別の野生型対照マウスを断頭により殺し、すぐに脳を取出して−40℃イソペ
ンタンで凍結させ、使用時まで−80℃で保存した。冠状脳切片(14μM)を
−17℃でクライオスタットミクロトームで切断し、熱したマイクロスライドに
載せて解凍した。氷冷4%リン酸緩衝パラホルムアルデヒドで固定後、組織切片
を使用時まで4℃の95%エタノールで保存した。ハイブリダイゼーションプロ
ーブはMC3−Rのコーディング領域に対する3種のオーバーラップしないアン
チセンスオリゴヌクレオチドの等モル混合物から構成する。それらの配列はオリ
ゴ282:5’−AGCCAGGATCACCAGGATGTTTTCCATC
AGACTGACGATGCCCAG−3’(配列番号9)、オリゴ345:5
’−TGCCCATGAGGAGCACCATGGCGAAGAACATGGT
GATGAGGCACA−3’(配列番号10)、オリゴ346:5’−ATG
ATGAGGACCAGGTGGAGGAAGAAAGGCGCCCAGCAG
AAGATG−3’(配列番号11)である。プローブは[α−33P]dAT
Pと末端トランスフェラーゼで末端標識し、ハイブリダイゼーション及び洗浄条
件はGuanら,1997,Brain Res Mol Brain Res
48(1):23−9,1997に詳細に記載されている通りとした。MC−
3R−/−マウスはMC−3Rの検出可能な発現がなかったが、WTマウスの視
床下部にはMC−3R mRNAが容易に検出された(図9)。
性別の野生型対照マウスを断頭により殺し、すぐに脳を取出して−40℃イソペ
ンタンで凍結させ、使用時まで−80℃で保存した。冠状脳切片(14μM)を
−17℃でクライオスタットミクロトームで切断し、熱したマイクロスライドに
載せて解凍した。氷冷4%リン酸緩衝パラホルムアルデヒドで固定後、組織切片
を使用時まで4℃の95%エタノールで保存した。ハイブリダイゼーションプロ
ーブはMC3−Rのコーディング領域に対する3種のオーバーラップしないアン
チセンスオリゴヌクレオチドの等モル混合物から構成する。それらの配列はオリ
ゴ282:5’−AGCCAGGATCACCAGGATGTTTTCCATC
AGACTGACGATGCCCAG−3’(配列番号9)、オリゴ345:5
’−TGCCCATGAGGAGCACCATGGCGAAGAACATGGT
GATGAGGCACA−3’(配列番号10)、オリゴ346:5’−ATG
ATGAGGACCAGGTGGAGGAAGAAAGGCGCCCAGCAG
AAGATG−3’(配列番号11)である。プローブは[α−33P]dAT
Pと末端トランスフェラーゼで末端標識し、ハイブリダイゼーション及び洗浄条
件はGuanら,1997,Brain Res Mol Brain Res
48(1):23−9,1997に詳細に記載されている通りとした。MC−
3R−/−マウスはMC−3Rの検出可能な発現がなかったが、WTマウスの視
床下部にはMC−3R mRNAが容易に検出された(図9)。
【0118】
DEXAスキャンによる体脂肪測定−全身及び骨無機質含量の非侵襲的定量法
である2エネルギーX線吸光光度法(DEXA;QDR 4500,Holog
ic,Inc.,Waltham.MA)により体組成を測定した(Kelle
yら,1998:Wolden−Hansonら,1999)。このソフトウェ
アはラットに最適化されているが、マウスで実施した精度及び感度試験の結果、
このソフトウェアはマウスの全身体組成の分析にも使用できることが判明した(
同一動物の反復測定で得られる%CVが1%未満)。QDR 4500は全身及
び骨無機質含量の非侵襲的定量法である。このシステムはスキャン領域内の組織
による高低エネルギーX線の示差減衰に基づく。エネルギーは組織密度に比例し
て減衰するので、組織校正ファントムを考慮してこの情報を検出器と関連ソフト
ウェアにより使用し、体組成を測定する。脂肪量は主に脂肪組織から構成され、
除脂肪体重は骨格筋に加えて、臓器、腱、軟骨、血液及び体液を含む。5.5カ
月齢雄マウスをDexaスキャン分析のためにケタミン/キシラジンで麻酔した
。結果を図8に示すが、同図は雌雄マウスのデータを含む。図8から明らかなよ
うに、MC−3Rノックアウトマウスは脂肪量が増加している(DEXA分析に
よると〜5カ月齢で〜45%、対照〜22%)。本明細書に記載するように、M
C−3Rは体脂肪の調節に関与していることが判明したため、選択化合物(MC
−3Rアゴニスト)を試験してその体脂肪調節(低下)効率を直接測定すること
ができ、こうして肥満治療の治療可能性を評価できるようになる。MC−3Rは
体脂肪の調節に関与していることが判明したため、選択したMC−3Rアゴニス
トを試験してDIOモデルでその体脂肪調節(低下)効率を直接測定することが
でき、こうして肥満治療の治療可能性を評価できるようになる。本明細書に記載
するMC−3Rノックアウトマウスを使用すると、メラノコルチンレセプターサ
ブタイプ特異的化合物を試験することができる。
である2エネルギーX線吸光光度法(DEXA;QDR 4500,Holog
ic,Inc.,Waltham.MA)により体組成を測定した(Kelle
yら,1998:Wolden−Hansonら,1999)。このソフトウェ
アはラットに最適化されているが、マウスで実施した精度及び感度試験の結果、
このソフトウェアはマウスの全身体組成の分析にも使用できることが判明した(
同一動物の反復測定で得られる%CVが1%未満)。QDR 4500は全身及
び骨無機質含量の非侵襲的定量法である。このシステムはスキャン領域内の組織
による高低エネルギーX線の示差減衰に基づく。エネルギーは組織密度に比例し
て減衰するので、組織校正ファントムを考慮してこの情報を検出器と関連ソフト
ウェアにより使用し、体組成を測定する。脂肪量は主に脂肪組織から構成され、
除脂肪体重は骨格筋に加えて、臓器、腱、軟骨、血液及び体液を含む。5.5カ
月齢雄マウスをDexaスキャン分析のためにケタミン/キシラジンで麻酔した
。結果を図8に示すが、同図は雌雄マウスのデータを含む。図8から明らかなよ
うに、MC−3Rノックアウトマウスは脂肪量が増加している(DEXA分析に
よると〜5カ月齢で〜45%、対照〜22%)。本明細書に記載するように、M
C−3Rは体脂肪の調節に関与していることが判明したため、選択化合物(MC
−3Rアゴニスト)を試験してその体脂肪調節(低下)効率を直接測定すること
ができ、こうして肥満治療の治療可能性を評価できるようになる。MC−3Rは
体脂肪の調節に関与していることが判明したため、選択したMC−3Rアゴニス
トを試験してDIOモデルでその体脂肪調節(低下)効率を直接測定することが
でき、こうして肥満治療の治療可能性を評価できるようになる。本明細書に記載
するMC−3Rノックアウトマウスを使用すると、メラノコルチンレセプターサ
ブタイプ特異的化合物を試験することができる。
【0119】
脂肪組織の生化学的分析−2個の鼠径白色(WAT)脂肪褥と2個の肩甲間褐
色(BAT)脂肪褥を28〜30週齢雄MC−3R−/−及びWTマウスから抽
出し、計量した(WAT:MC−3R−/−1.21±0.12g、WT0.5
5±0.06,P<0.0005,n=8;BAT:MC−3R−/−0.23
±0.02g、WT0.15±0.01,P<0.006,n=8)。全核酸を
SDS/プロテイナーゼK消化により分離した後、フェノール/クロロホルム抽
出し、イソプロパノール沈殿させた。DNAを溶解させ、260nm吸光度によ
り総含量を測定した。DNA含量はHoechst 33258の蛍光により測
定した。TNAからDNAを差引いてRNA含量を計算した。
色(BAT)脂肪褥を28〜30週齢雄MC−3R−/−及びWTマウスから抽
出し、計量した(WAT:MC−3R−/−1.21±0.12g、WT0.5
5±0.06,P<0.0005,n=8;BAT:MC−3R−/−0.23
±0.02g、WT0.15±0.01,P<0.006,n=8)。全核酸を
SDS/プロテイナーゼK消化により分離した後、フェノール/クロロホルム抽
出し、イソプロパノール沈殿させた。DNAを溶解させ、260nm吸光度によ
り総含量を測定した。DNA含量はHoechst 33258の蛍光により測
定した。TNAからDNAを差引いてRNA含量を計算した。
【0120】
摂飼量測定−MC−3R−/−、MC−3R+/−及びWTマウスを約1カ月
齢で個々のマイクロアイソレーターケージに分けた。普通マウス固形飼料(Te
klad 7012;5%脂肪、19%タンパク質及び5%繊維;3.75g/
Kcal及び脂肪から14.8%Kcal)に関する試験では、網ケージ上部の
フードホッパーに固形飼料を入れ、飼料を毎週計量した。高脂肪飼料(Tekl
ad 97070;33.5%脂肪、27.4%タンパク質及び26.5%炭
水化物;脂肪から60%カロリー)に関する試験では、粉砕した飼料をガラスジ
ャーに入れてケージに入れ、飼料を入れたジャーを毎日又は毎週計量した。
齢で個々のマイクロアイソレーターケージに分けた。普通マウス固形飼料(Te
klad 7012;5%脂肪、19%タンパク質及び5%繊維;3.75g/
Kcal及び脂肪から14.8%Kcal)に関する試験では、網ケージ上部の
フードホッパーに固形飼料を入れ、飼料を毎週計量した。高脂肪飼料(Tekl
ad 97070;33.5%脂肪、27.4%タンパク質及び26.5%炭
水化物;脂肪から60%カロリー)に関する試験では、粉砕した飼料をガラスジ
ャーに入れてケージに入れ、飼料を入れたジャーを毎日又は毎週計量した。
【0121】
末梢MTII投与−個別収容した23〜25週齢雄MC−3R−/−(n=9
)及びWT(n=9)マウスに明サイクルの暗相開始の約30分前に滅菌0/9
%NaClビヒクル溶液を連続7日間腹膜組織内(ip)注射した。同時に、試
験の連続8日目にビヒクル中10mg/kg用量でMTIIをマウスにip注射
した。注射の約15分前に体重と飼料(Teklad 7012)重量を毎日測
定し、記録した。
)及びWT(n=9)マウスに明サイクルの暗相開始の約30分前に滅菌0/9
%NaClビヒクル溶液を連続7日間腹膜組織内(ip)注射した。同時に、試
験の連続8日目にビヒクル中10mg/kg用量でMTIIをマウスにip注射
した。注射の約15分前に体重と飼料(Teklad 7012)重量を毎日測
定し、記録した。
【0122】
血漿レプチン、インスリン、グルコース及びコルチコステレン測定−マウスを
4時間絶食させてからレプチン、インスリン、グルコース、トリグリセリド及び
コレステロール測定のために採血した。レプチン測定には心臓穿刺により採血し
、コルチコステレン以外の他の全因子には眼窩後洞から採血した。血漿コルチコ
ステレン及び全T4測定のために採血する前に、マウスに自由に飼料と水を与え
た。ストレスによるコルチコステレン値上昇を防ぐために、マウスをすぐに断頭
し、ヘパリン添加管に胴体血を採った。血漿レプチン及びインスリンはLinc
o(Linco,St.Louis,MO)製品RIAにより測定し、血漿コル
チコステレンはICN(ICN,Biomedicals,Inc.,Cost
a Mesa,CA)製品RIAにより測定し、血漿全T4はDiagnost
ic Products Co.(Diagnostic Products
Co.,Los Angeles,CA)製品RIAにより測定した。血漿グル
コース分析はBoehringer Mannheim Hitachi 91
1自動臨床化学分析器(Boehringer Mannheim Corp.
,Indianapolis,IN)で実施した。
4時間絶食させてからレプチン、インスリン、グルコース、トリグリセリド及び
コレステロール測定のために採血した。レプチン測定には心臓穿刺により採血し
、コルチコステレン以外の他の全因子には眼窩後洞から採血した。血漿コルチコ
ステレン及び全T4測定のために採血する前に、マウスに自由に飼料と水を与え
た。ストレスによるコルチコステレン値上昇を防ぐために、マウスをすぐに断頭
し、ヘパリン添加管に胴体血を採った。血漿レプチン及びインスリンはLinc
o(Linco,St.Louis,MO)製品RIAにより測定し、血漿コル
チコステレンはICN(ICN,Biomedicals,Inc.,Cost
a Mesa,CA)製品RIAにより測定し、血漿全T4はDiagnost
ic Products Co.(Diagnostic Products
Co.,Los Angeles,CA)製品RIAにより測定した。血漿グル
コース分析はBoehringer Mannheim Hitachi 91
1自動臨床化学分析器(Boehringer Mannheim Corp.
,Indianapolis,IN)で実施した。
【0123】
体温測定−個別収容した25〜27週齢雌雄MC−3R−/−(n=10〜1
1)及びWT(n=10〜11)同腹マウスの体温を明サイクルの明相中間部で
BAT−10型T熱電対温度計とマウス用RET−3直腸プローブ(Physi
temp Instruments,Inc.,Clifton,NJ)により
測定した。
1)及びWT(n=10〜11)同腹マウスの体温を明サイクルの明相中間部で
BAT−10型T熱電対温度計とマウス用RET−3直腸プローブ(Physi
temp Instruments,Inc.,Clifton,NJ)により
測定した。
【0124】
間接測熱−16室開路Oxymaxシステム(Columbus Instr
uments,Columbus,Ohio)を使用して代謝率を間接測熱によ
り測定した。27〜29週齢雌MC−3R−/−(体重29.5±2.0g、n
=10)及びWT(体重26.3±0.4g、n=10)同腹マウスに飼料と水
を自由に与えながら12時間明暗サイクルで21〜24℃に維持した。動物は特
別に組立たプレキシガラスケージ(20cm×10.5cm×12cm)に個別
収容し、0.53リットル/分の流速で通風した。各室からの排気を15分間隔
で75秒間サンプリングした。サンプル空気を逐次O2及びCO2分析器(Co
lumbus Instruments)に通してO2及びCO2濃度を測定し
た。次式:(3.815+1.232×RER)×vO2(式中RERは呼吸商
[消費O2容量(ml/kg体重/時)当たりの発生CO2容量(ml/kg体
重/時)]であり、vO2は毎時消費O2容量である)から代謝率(kcal/
時)を計算した。
uments,Columbus,Ohio)を使用して代謝率を間接測熱によ
り測定した。27〜29週齢雌MC−3R−/−(体重29.5±2.0g、n
=10)及びWT(体重26.3±0.4g、n=10)同腹マウスに飼料と水
を自由に与えながら12時間明暗サイクルで21〜24℃に維持した。動物は特
別に組立たプレキシガラスケージ(20cm×10.5cm×12cm)に個別
収容し、0.53リットル/分の流速で通風した。各室からの排気を15分間隔
で75秒間サンプリングした。サンプル空気を逐次O2及びCO2分析器(Co
lumbus Instruments)に通してO2及びCO2濃度を測定し
た。次式:(3.815+1.232×RER)×vO2(式中RERは呼吸商
[消費O2容量(ml/kg体重/時)当たりの発生CO2容量(ml/kg体
重/時)]であり、vO2は毎時消費O2容量である)から代謝率(kcal/
時)を計算した。
【0125】
歩行活動と微小運動の評価−個別収容した21〜23週齢雌雄MC−3R−/ −
(n=10〜11)及びWT(n=10)同腹マウスの歩行活動と微小運動を
ケージラックPhotobeam Activity System(San
Diego Instruments,San Diego,CAで評価した。
マウスは評価前数週間透明プレキシガラスケージ(40×20×20cm)に個
別収容した。隣接光線に連続して生じる2回以上の光線遮断を歩行運動として採
点し、同一光線に光線遮断が連続して2回以上発生し、他の光線は遮断されない
場合を微小運動として採点した。明サイクルの所与部分における合計歩行運動回
数に2本の隣接光線間の距離(0.053975m)を乗じ、明サイクルのこの
所与部分中の合計移動距離とした。
ケージラックPhotobeam Activity System(San
Diego Instruments,San Diego,CAで評価した。
マウスは評価前数週間透明プレキシガラスケージ(40×20×20cm)に個
別収容した。隣接光線に連続して生じる2回以上の光線遮断を歩行運動として採
点し、同一光線に光線遮断が連続して2回以上発生し、他の光線は遮断されない
場合を微小運動として採点した。明サイクルの所与部分における合計歩行運動回
数に2本の隣接光線間の距離(0.053975m)を乗じ、明サイクルのこの
所与部分中の合計移動距離とした。
【0126】
ヘテロ接合及びホモ接合突然変異雌雄マウスが予想頻度で誕生し、生存可能で
あり、成体期間を通して稔性であった(MC−3R−/−マウス約300頭生産
)。突然変異マウスの脳及び他の臓器の肉眼及び組織学的試験によると顕性異常
は認められなかった。突然変異雄マウスの成長は約25週齢まで正常であったが
、この時点でヘテロ接合及びホモ接合突然変異雄マウスはWT同腹子よりも僅か
ではあるが有意に重くなった(図10A)。5週齢雌MC−3R−/−マウスは
WT同腹子よりも僅かではあるが有意に重かったが、7週齢までにその体重は正
常になり、26週齢までにWT同腹子に比較して体重増加傾向を示すようになっ
た(図10B)。ヘテロ接合突然変異雌マウスの成長曲線はWT雌マウスの成長
曲線からずれなかった。
あり、成体期間を通して稔性であった(MC−3R−/−マウス約300頭生産
)。突然変異マウスの脳及び他の臓器の肉眼及び組織学的試験によると顕性異常
は認められなかった。突然変異雄マウスの成長は約25週齢まで正常であったが
、この時点でヘテロ接合及びホモ接合突然変異雄マウスはWT同腹子よりも僅か
ではあるが有意に重くなった(図10A)。5週齢雌MC−3R−/−マウスは
WT同腹子よりも僅かではあるが有意に重かったが、7週齢までにその体重は正
常になり、26週齢までにWT同腹子に比較して体重増加傾向を示すようになっ
た(図10B)。ヘテロ接合突然変異雌マウスの成長曲線はWT雌マウスの成長
曲線からずれなかった。
【0127】
4及び6カ月齢で全3種の遺伝子型の雌雄マウスの2エネルギーX線吸光光度
分析(DEXAスキャン)により全身体組成を測定した。6カ月齢では、MC−
3R−/−マウスは有意脂肪量増加と有意除脂肪体重減少を示した(図10C、
D)。この年齢までMC−3R−/−マウスの脂肪量はWT同腹子の約2倍であ
り、除脂肪体重は約15〜20%低下した。ヘテロ接合突然変異雌雄マウスで正
常体組成が観察された。2種の付加ES細胞クローンから作製したF2子孫の体
組成を測定した。6〜8カ月齢までこれらの2種のES細胞クローンに由来する
ホモ接合突然変異マウスもWT同腹子に対して有意脂肪量増加と有意除脂肪体重
減少を示し、観察される表現型がクローン変動によるものではないことが判明し
た。これらの体組成の差は体重に逆効果があり、突然変異マウスの成長曲線に観
察される微妙な差を裏付ている。これらのデータは体組成の調節にMC−3Rが
関与していることを立証しており、MC−3Rの不在下では栄養は脂肪量に優先
的に分配されるが、除脂肪体重が犠牲になることを示唆している。
分析(DEXAスキャン)により全身体組成を測定した。6カ月齢では、MC−
3R−/−マウスは有意脂肪量増加と有意除脂肪体重減少を示した(図10C、
D)。この年齢までMC−3R−/−マウスの脂肪量はWT同腹子の約2倍であ
り、除脂肪体重は約15〜20%低下した。ヘテロ接合突然変異雌雄マウスで正
常体組成が観察された。2種の付加ES細胞クローンから作製したF2子孫の体
組成を測定した。6〜8カ月齢までこれらの2種のES細胞クローンに由来する
ホモ接合突然変異マウスもWT同腹子に対して有意脂肪量増加と有意除脂肪体重
減少を示し、観察される表現型がクローン変動によるものではないことが判明し
た。これらの体組成の差は体重に逆効果があり、突然変異マウスの成長曲線に観
察される微妙な差を裏付ている。これらのデータは体組成の調節にMC−3Rが
関与していることを立証しており、MC−3Rの不在下では栄養は脂肪量に優先
的に分配されるが、除脂肪体重が犠牲になることを示唆している。
【0128】
観察された脂肪量の増加を更に特性決定するために、数種の異なる脂肪褥を抽
出し、計量した。DEXAスキャン分析と一致し、4及び6カ月齢雌MC−3R −/− マウスから抽出した数種の貯蔵脂肪はWTマウスよりも有意に重かった(
図11A〜D)。雄の貯蔵脂肪重量の差は6カ月齢まで統計的有意に達しなかっ
た。6カ月齢まででは、雌腸間膜脂肪褥を除く全試験貯蔵脂肪はWTマウスより
も有意に重かった。鼠径白色脂肪組織(WAT)と肩甲間褐色脂肪組織(BAT
)の組織学的評価によると、MC−3R−/−マウスからの脂肪細胞は寸法が増
加していることが判明した(図11E〜H)。更に、MC−3R−/−マウスか
らのBATは典型的なミトコンドリア高含有多房性褐色脂肪細胞の数の減少と、
単房性細胞の存在の劇的な増加を示した。白色脂肪細胞の拡大外観に一致し、W
T及びMC−3R−/−マウスからの白色脂肪細胞の面積測定は突然変異マウス
からの脂肪細胞寸法が約20〜30%増加していることを示した。MC−3R− /− マウスからのこの貯蔵WATのDNA含量はWTマウスと同等であり(MC
−3R−/−207.04±5.82μg、WT205.09±5.63μg;
n=8)、RNAとDNAの比は正常であった。これに対して、RNAとDNA
の比は変わらないが、MC−3R−/−マウスからのBATのDNA含量は有意
に増加していた(P<0.01;MC−3R−/−151.18±7.31μg
、WT121.88±5.85μg;n=8)。これらのデータはMC−3R− /− マウスで観察されるWAT脂肪量の増加が主に脂肪細胞肥大に起因すること
を立証しており、MC−3Rの不在が脂肪細胞代謝の変化をもたらすことを示唆
している。BATのDNA含量の約24%の増加は褐色脂肪細胞過形成の存在又
は貯蔵BATへの白色脂肪細胞浸潤を示唆している。この表現型はMC−3R及
びMC−4R、アグーチ又はアグーチ関連タンパク質(Agrp)の天然アンタ
ゴニストを異所性発現する突然変異マウスにおける脂肪肥大外観に一致する。
出し、計量した。DEXAスキャン分析と一致し、4及び6カ月齢雌MC−3R −/− マウスから抽出した数種の貯蔵脂肪はWTマウスよりも有意に重かった(
図11A〜D)。雄の貯蔵脂肪重量の差は6カ月齢まで統計的有意に達しなかっ
た。6カ月齢まででは、雌腸間膜脂肪褥を除く全試験貯蔵脂肪はWTマウスより
も有意に重かった。鼠径白色脂肪組織(WAT)と肩甲間褐色脂肪組織(BAT
)の組織学的評価によると、MC−3R−/−マウスからの脂肪細胞は寸法が増
加していることが判明した(図11E〜H)。更に、MC−3R−/−マウスか
らのBATは典型的なミトコンドリア高含有多房性褐色脂肪細胞の数の減少と、
単房性細胞の存在の劇的な増加を示した。白色脂肪細胞の拡大外観に一致し、W
T及びMC−3R−/−マウスからの白色脂肪細胞の面積測定は突然変異マウス
からの脂肪細胞寸法が約20〜30%増加していることを示した。MC−3R− /− マウスからのこの貯蔵WATのDNA含量はWTマウスと同等であり(MC
−3R−/−207.04±5.82μg、WT205.09±5.63μg;
n=8)、RNAとDNAの比は正常であった。これに対して、RNAとDNA
の比は変わらないが、MC−3R−/−マウスからのBATのDNA含量は有意
に増加していた(P<0.01;MC−3R−/−151.18±7.31μg
、WT121.88±5.85μg;n=8)。これらのデータはMC−3R− /− マウスで観察されるWAT脂肪量の増加が主に脂肪細胞肥大に起因すること
を立証しており、MC−3Rの不在が脂肪細胞代謝の変化をもたらすことを示唆
している。BATのDNA含量の約24%の増加は褐色脂肪細胞過形成の存在又
は貯蔵BATへの白色脂肪細胞浸潤を示唆している。この表現型はMC−3R及
びMC−4R、アグーチ又はアグーチ関連タンパク質(Agrp)の天然アンタ
ゴニストを異所性発現する突然変異マウスにおける脂肪肥大外観に一致する。
【0129】
MC−3R−/−マウスに観察される除脂肪体重減少を更に検討するために、
肝IGF−I mRNA濃度を成長軸活性の尺度として測定した。MC−3R− /− マウスとWTマウスの間には肝IGF−I発現レベルに僅差が検出されたが
、これらの差は非常に小さく、除脂肪体重の減少に相関しなかった。肉眼的レベ
ルでは視床下部−下垂体軸はIGF−I遺伝子発現の負調節に関して正常である
。
肝IGF−I mRNA濃度を成長軸活性の尺度として測定した。MC−3R− /− マウスとWTマウスの間には肝IGF−I発現レベルに僅差が検出されたが
、これらの差は非常に小さく、除脂肪体重の減少に相関しなかった。肉眼的レベ
ルでは視床下部−下垂体軸はIGF−I遺伝子発現の負調節に関して正常である
。
【0130】
除脂肪体重は主に骨格筋、血液及び骨から構成される。DEXAスキャン分析
によると、MC−3R−/−マウスは正常骨無機質含量をもつが、15〜17及
び26〜27週齢雌MC−3R−/−マウスから抽出した大腿骨の平均長さは同
一齢WT同腹マウスよりも有意に短かった。より幼齢群の雌MC−3R−/−マ
ウスの鼻から肛門までの長さもWT同腹マウスより有意に短く、MC−3Rの不
在下では成長が妨げられることを示唆している。雄MC−3R−/−マウスも骨
及び体重に同様の傾向を示したが、これらの差は統計的有意には達しなかった。
によると、MC−3R−/−マウスは正常骨無機質含量をもつが、15〜17及
び26〜27週齢雌MC−3R−/−マウスから抽出した大腿骨の平均長さは同
一齢WT同腹マウスよりも有意に短かった。より幼齢群の雌MC−3R−/−マ
ウスの鼻から肛門までの長さもWT同腹マウスより有意に短く、MC−3Rの不
在下では成長が妨げられることを示唆している。雄MC−3R−/−マウスも骨
及び体重に同様の傾向を示したが、これらの差は統計的有意には達しなかった。
【0131】
MC−3R欠損が内分泌異常をもたらすか否かを調べるために、数種のモルホ
ンの血漿値を評価した。6カ月齢MC−3R−/−マウスは有意にレプチン過剰
血であり(図12A)、軽度のインスリン過剰血を生じ、雄突然変異マウスのみ
で統計的有意に達していた(図12B)。これらの内分泌異常は脂肪量増加に二
次的であると思われる。突然変異雄マウスではインスリン値の増加が観察された
が、血漿グルコース値は正常範囲内であった(図12C)。6カ月齢では血漿ト
リグリセリド値及びコレステロール値も雌雄MC−3R−/−マウスで正常範囲
内であった。MC−3R−/−マウスの血漿コルチコステロン値も3.5〜4カ
月齢でWTマウスと有意差がなかったが、雌MC−3R−/−マウスはコルチコ
ステロン値低下傾向を示した(図12D)。
ンの血漿値を評価した。6カ月齢MC−3R−/−マウスは有意にレプチン過剰
血であり(図12A)、軽度のインスリン過剰血を生じ、雄突然変異マウスのみ
で統計的有意に達していた(図12B)。これらの内分泌異常は脂肪量増加に二
次的であると思われる。突然変異雄マウスではインスリン値の増加が観察された
が、血漿グルコース値は正常範囲内であった(図12C)。6カ月齢では血漿ト
リグリセリド値及びコレステロール値も雌雄MC−3R−/−マウスで正常範囲
内であった。MC−3R−/−マウスの血漿コルチコステロン値も3.5〜4カ
月齢でWTマウスと有意差がなかったが、雌MC−3R−/−マウスはコルチコ
ステロン値低下傾向を示した(図12D)。
【0132】
摂飼量の変化は体組成の差をもたらすと考えられ、MC−4R−/−マウスと
アグーチ又はAtrpを異所性発現するマウスは有意過食であることが判明した
。これに対して、普通固形飼料で飼育した雄MC−3R−/−マウスは有意減食
であり(図13A)、正常体重増加を示す(図13B)。従って、これらのマウ
スは有意に高い飼料効率を示し、WTマウスよりも消費飼料グラム当たりの体重
増加が多い(図13C)。ヘテロ接合突然変異雄マウスも野生型同腹マウスに対
して平均1日摂飼量の有意減少を示した。普通固形飼料で飼育した雌MC−3R −/− マウスは有意減食を示さなかったが、10週齢でWTマウスよりも有意に
高い飼料効率を示した(データは示さず)。雌マウスに高脂肪飼料を与えた場合
、MC−3R−/−マウスは正常量の飼料を消費した(図13D)が、WT又は
ヘテロ接合突然変異マウスよりも有意に体重が増加し(図13C、E)、その結
果、飼料効率が有意に増加した(図13C、F)。これらのデータは、MC−3
R欠損が飼料効率の増加をもたらし、過食がMC−3R−/−マウスで観察され
る脂肪量増加の一次原因ではないことを立証している。更に、これらのデータは
摂飼量の減少が観察される除脂肪体重減少に加担しているらしいことを示唆して
いる。
アグーチ又はAtrpを異所性発現するマウスは有意過食であることが判明した
。これに対して、普通固形飼料で飼育した雄MC−3R−/−マウスは有意減食
であり(図13A)、正常体重増加を示す(図13B)。従って、これらのマウ
スは有意に高い飼料効率を示し、WTマウスよりも消費飼料グラム当たりの体重
増加が多い(図13C)。ヘテロ接合突然変異雄マウスも野生型同腹マウスに対
して平均1日摂飼量の有意減少を示した。普通固形飼料で飼育した雌MC−3R −/− マウスは有意減食を示さなかったが、10週齢でWTマウスよりも有意に
高い飼料効率を示した(データは示さず)。雌マウスに高脂肪飼料を与えた場合
、MC−3R−/−マウスは正常量の飼料を消費した(図13D)が、WT又は
ヘテロ接合突然変異マウスよりも有意に体重が増加し(図13C、E)、その結
果、飼料効率が有意に増加した(図13C、F)。これらのデータは、MC−3
R欠損が飼料効率の増加をもたらし、過食がMC−3R−/−マウスで観察され
る脂肪量増加の一次原因ではないことを立証している。更に、これらのデータは
摂飼量の減少が観察される除脂肪体重減少に加担しているらしいことを示唆して
いる。
【0133】
非選択的メラノコルチンアゴニストであるMTIIを中枢及び全身投与すると
、摂食が阻害される。MTIIの食欲抑制作用にMC−3Rが必要であるか否か
を調べるために、末梢投与したMTIIに対する雄MC−3R−/−マウスとW
Tマウスの応答を評価した。10mg/kgの用量でMTIIを1回腹膜組織内
注射すると、24時間で飼料消費はWTマウスとMC−3R−/−マウスで2日
ビヒクル処置基線に対して同程度まで有意に(P<0.05)低下した(WT1
1.1±4.3%低下、MC−3R−/−16.9±7.0%低下;P=0.4
9;n=9)。これらのデータはMC−3RがMTIIの食欲抑制作用に必要で
はないことを示しており、主にα−MSHがMC−4Rの調節により摂食を阻害
することを示唆している。MC−4R−/−マウスのMTII薬理試験からも同
様の結論が得られた。
、摂食が阻害される。MTIIの食欲抑制作用にMC−3Rが必要であるか否か
を調べるために、末梢投与したMTIIに対する雄MC−3R−/−マウスとW
Tマウスの応答を評価した。10mg/kgの用量でMTIIを1回腹膜組織内
注射すると、24時間で飼料消費はWTマウスとMC−3R−/−マウスで2日
ビヒクル処置基線に対して同程度まで有意に(P<0.05)低下した(WT1
1.1±4.3%低下、MC−3R−/−16.9±7.0%低下;P=0.4
9;n=9)。これらのデータはMC−3RがMTIIの食欲抑制作用に必要で
はないことを示しており、主にα−MSHがMC−4Rの調節により摂食を阻害
することを示唆している。MC−4R−/−マウスのMTII薬理試験からも同
様の結論が得られた。
【0134】
代謝率と歩行活動の低下も体組成変化の原因であると考えられる。雌雄MC−
3R−/−マウスの体温は正常であり(雄:WT36.88±0.07℃、MC
−3R−/−36.77±0.12℃;雌:WT37.37±0.19℃、MC
−3R−/−37.37±0.15℃;n=10〜11)、MC−3Rが存在し
なくても代謝率はさほど変わらないと思われた。間接測熱を使用して代謝率を更
に評価した。雌MC−3R−/−マウスは24時間飼料と水を自由に与えて評価
した場合にWT同腹マウスに対して正常な代謝率と呼吸商を示した(図14A)
。5〜6カ月齢雌雄マウスの歩行活動を評価した。雄MC−3R−/−マウスは
暗サイクル中に歩行活動及び微小運動レベルの低下傾向を示し(図14A、B、
C)、雌MC−3R−/−マウスではこれらの低下が統計的有意に達した(図1
4D、E)。これらのデータは歩行活動の低下が雌MC−3R−/−マウスに観
察される脂肪量増加に加担しているらしいことを示唆しているが、歩行活動のこ
れらの欠損がMC−3Rの不在に直接関係があるのか、又は体組成の変化に二次
的であるかは不明である。
3R−/−マウスの体温は正常であり(雄:WT36.88±0.07℃、MC
−3R−/−36.77±0.12℃;雌:WT37.37±0.19℃、MC
−3R−/−37.37±0.15℃;n=10〜11)、MC−3Rが存在し
なくても代謝率はさほど変わらないと思われた。間接測熱を使用して代謝率を更
に評価した。雌MC−3R−/−マウスは24時間飼料と水を自由に与えて評価
した場合にWT同腹マウスに対して正常な代謝率と呼吸商を示した(図14A)
。5〜6カ月齢雌雄マウスの歩行活動を評価した。雄MC−3R−/−マウスは
暗サイクル中に歩行活動及び微小運動レベルの低下傾向を示し(図14A、B、
C)、雌MC−3R−/−マウスではこれらの低下が統計的有意に達した(図1
4D、E)。これらのデータは歩行活動の低下が雌MC−3R−/−マウスに観
察される脂肪量増加に加担しているらしいことを示唆しているが、歩行活動のこ
れらの欠損がMC−3Rの不在に直接関係があるのか、又は体組成の変化に二次
的であるかは不明である。
【0135】
in situハイブリダイゼーションを使用してMC−3Rの不在が脳にお
けるニューロペプチド発現パターンの変化をもたらすか否かを調べた(Bagn
olら,1999,J Neurosci.19:RC26 1−7参照)。M
C−3Rは弓状核に位置する視床下部ニューロンでPOMCと同時発現されるの
で、α−MSHの自己受容体であるらしいと考えられる。しかし、弓状POMC
mRNAの有意変化は1又は3カ月齢雄MC−3R−/−マウスでは検出でき
なかった。ニューロペプチドY(NPY)は視床下部で多量に発現される強力な
食欲促進ペプチドである。1カ月齢雄MC−3R−/−マウスでは弓状核のNP
Y mRNAに小さいが有意(P<0.05;WT1315±101nCi/g
組織、MC−3R−/−1099±101nCi/g組織;n=5)な16%低
下が検出されたが、3カ月齢までにNPY mRNAレベルは正常まで戻ってい
た。弓状核におけるNPY発現低下は雄MC−3R−/−マウスに観察される減
食に加担している可能性がある。
けるニューロペプチド発現パターンの変化をもたらすか否かを調べた(Bagn
olら,1999,J Neurosci.19:RC26 1−7参照)。M
C−3Rは弓状核に位置する視床下部ニューロンでPOMCと同時発現されるの
で、α−MSHの自己受容体であるらしいと考えられる。しかし、弓状POMC
mRNAの有意変化は1又は3カ月齢雄MC−3R−/−マウスでは検出でき
なかった。ニューロペプチドY(NPY)は視床下部で多量に発現される強力な
食欲促進ペプチドである。1カ月齢雄MC−3R−/−マウスでは弓状核のNP
Y mRNAに小さいが有意(P<0.05;WT1315±101nCi/g
組織、MC−3R−/−1099±101nCi/g組織;n=5)な16%低
下が検出されたが、3カ月齢までにNPY mRNAレベルは正常まで戻ってい
た。弓状核におけるNPY発現低下は雄MC−3R−/−マウスに観察される減
食に加担している可能性がある。
【0136】
これらのデータはエネルギー恒常性の調節においてMC−3RがMC−4Rに
比較して非冗長的な独自の役割を果たすことを示している。MC−3Rは脳、脂
肪組織、心臓、骨格筋、腎臓、胃、十二指腸、胎盤及び膵臓等の別個組織で広く
発現されるので、これらの組織におけるMC−3R発現低下の直接効果は観察さ
れる表現型に影響すると思われる。最近、ヒト染色体20qのMC−3Rをコー
ドする遺伝子座が体重指数、皮下脂肪、脂肪量及び空腹時インスリン値の調節に
関係があるとされている。従って、これらの知見はMC−3R調節が肥満の治療
に有益であるらしいことを示している。
比較して非冗長的な独自の役割を果たすことを示している。MC−3Rは脳、脂
肪組織、心臓、骨格筋、腎臓、胃、十二指腸、胎盤及び膵臓等の別個組織で広く
発現されるので、これらの組織におけるMC−3R発現低下の直接効果は観察さ
れる表現型に影響すると思われる。最近、ヒト染色体20qのMC−3Rをコー
ドする遺伝子座が体重指数、皮下脂肪、脂肪量及び空腹時インスリン値の調節に
関係があるとされている。従って、これらの知見はMC−3R調節が肥満の治療
に有益であるらしいことを示している。
【0137】
実施例3
MC−3R/MC−4Rノックアウトマウス
MC−4R及びMC−3R二重ノックアウトマウスを作製するために、MC−
3Rヘテロ接合マウスをMC−4R KO雌と交配し、MC−3R−/+,MC
−4R−/+マウスを作製した。28頭のうち11頭の子が同定され、7頭をM
C−4R KO雌と交配してMC−3R−/+,MC−4R−/−マウスを作製
した。数頭の同腹子から7頭の雄と6頭の雌のMC−3R−/+,MC−4R− /− マウスが生まれた。これらのマウスを交配し、MC−3R−/−,MC−4
R−/−二重ノックアウトマウスを作製した。
3Rヘテロ接合マウスをMC−4R KO雌と交配し、MC−3R−/+,MC
−4R−/+マウスを作製した。28頭のうち11頭の子が同定され、7頭をM
C−4R KO雌と交配してMC−3R−/+,MC−4R−/−マウスを作製
した。数頭の同腹子から7頭の雄と6頭の雌のMC−3R−/+,MC−4R− /− マウスが生まれた。これらのマウスを交配し、MC−3R−/−,MC−4
R−/−二重ノックアウトマウスを作製した。
【0138】
MC−3R−/−,MC−4R−/−二重ノックアウトマウスの作製を開始す
るために使用したMC−4Rトランスジェニックマウスは参考資料として本明細
書に組込む1999年11月12日出願米国仮出願シリアル番号165,074
及びPCT国際出願番号 に詳細に記載されている。MC−4R−/−ノック
アウトマウスの作製もHuszarら,1997,Cell 88:131−1
41とLeeらの1999年8月3日発行米国特許第5,932,779号に記
載されている。要約すると、マウスMC−4R遺伝子を含むゲノムDNAをマウ
ス129sjvλゲノムライブラリー(Lambda FIX II Libr
ary,Stratagene,La Jolla,CA)から分離し、1キロ
塩基対(Kb)ラットMC−4R cDNAクローンをプローブとして使用して
スクリーニングした。4個のクローンのうちの1個を制限酵素消化により詳細に
マッピングした。クローンは29キロ塩基対(Kb)λベクターから構成され、
10Kbの5’フランキング配列と4Kbの3’フランキング配列の間に1Kb
MC−4Rコーディング配列をコードする15Kbゲノムインサートを含んで
いた。MC−4R翻訳開始コドンの約20塩基対(bp)下流に配置されたNC
oI部位からMC−4Rコーディング配列のATG停止コドンの約0.5Kb下
流に配置されたHindIII部位までの約1.5KbフラグメントをPGK−
neoカセット(ホスホグリセロキナーゼプロモーターの制御下のネオマイシン
ホスホトランスフェラーゼ遺伝子[pPGKneobpA、Alan Brad
ely博士から入手;Tybulewiczら,1991,Cell 65:1
153−1163も参照])で置換した。ターゲティングベクターは5’3.4
Kb HindIII−NcoIフラグメントと1.6Kb PGK−neoフ
ラグメントと3’3.5kb HindIII−SalIフラグメントから構成
されるpSP72(Promega)で構築した。pAJ7の完全な構築図を図
15に示し、マウスゲノム配列置換ストラテジーを図16に示す。遺伝子ターゲ
ティングベクターpAJ7を固有ScaI部位で直鎖化し、Gene Puls
er(Bio−Rad)を使用して標準条件下でAB2.2胚性幹細胞(Lex
icon Genetics)にエレクトロポレートした。G418耐性クロー
ンの選択は従来記載されているように実施した(Von Kochら,1997
)。多数のノックアウトマウスと野生型マウスを識別し易くするために、PCR
によりノックアウト対立遺伝子を野生型対立遺伝子から区別するように3種のオ
リゴヌクレオチドを設計した。合成オリゴヌクレオチド5’−CTAACCAT
AAGAAATCAGCAGCCCG−3’(配列番号12)及び5’−AGG
GAAGTATACATGCCATGGTGGT−3’(配列番号13)を使用
して野生型対立遺伝子から500bpPCR産物が得られる。当然のことながら
、これらのオリゴヌクレオチドを使用して本発明で使用するような野生型マウス
MC−4R遺伝子を含む29Kb/15Kbマウスゲノム配列を同定するための
野生型PCRプローブを得ることもできる。同様に、オリゴヌクレオチド5’−
CTAACCATAAGAAATCAGCAGCCCG−3’(配列番号14)
及び5’−TACCGGTGGATGTGGAATGTGTGC−3’(配列番
号15)を使用して突然変異対立遺伝子から650bpPCR産物が得られる。
るために使用したMC−4Rトランスジェニックマウスは参考資料として本明細
書に組込む1999年11月12日出願米国仮出願シリアル番号165,074
及びPCT国際出願番号 に詳細に記載されている。MC−4R−/−ノック
アウトマウスの作製もHuszarら,1997,Cell 88:131−1
41とLeeらの1999年8月3日発行米国特許第5,932,779号に記
載されている。要約すると、マウスMC−4R遺伝子を含むゲノムDNAをマウ
ス129sjvλゲノムライブラリー(Lambda FIX II Libr
ary,Stratagene,La Jolla,CA)から分離し、1キロ
塩基対(Kb)ラットMC−4R cDNAクローンをプローブとして使用して
スクリーニングした。4個のクローンのうちの1個を制限酵素消化により詳細に
マッピングした。クローンは29キロ塩基対(Kb)λベクターから構成され、
10Kbの5’フランキング配列と4Kbの3’フランキング配列の間に1Kb
MC−4Rコーディング配列をコードする15Kbゲノムインサートを含んで
いた。MC−4R翻訳開始コドンの約20塩基対(bp)下流に配置されたNC
oI部位からMC−4Rコーディング配列のATG停止コドンの約0.5Kb下
流に配置されたHindIII部位までの約1.5KbフラグメントをPGK−
neoカセット(ホスホグリセロキナーゼプロモーターの制御下のネオマイシン
ホスホトランスフェラーゼ遺伝子[pPGKneobpA、Alan Brad
ely博士から入手;Tybulewiczら,1991,Cell 65:1
153−1163も参照])で置換した。ターゲティングベクターは5’3.4
Kb HindIII−NcoIフラグメントと1.6Kb PGK−neoフ
ラグメントと3’3.5kb HindIII−SalIフラグメントから構成
されるpSP72(Promega)で構築した。pAJ7の完全な構築図を図
15に示し、マウスゲノム配列置換ストラテジーを図16に示す。遺伝子ターゲ
ティングベクターpAJ7を固有ScaI部位で直鎖化し、Gene Puls
er(Bio−Rad)を使用して標準条件下でAB2.2胚性幹細胞(Lex
icon Genetics)にエレクトロポレートした。G418耐性クロー
ンの選択は従来記載されているように実施した(Von Kochら,1997
)。多数のノックアウトマウスと野生型マウスを識別し易くするために、PCR
によりノックアウト対立遺伝子を野生型対立遺伝子から区別するように3種のオ
リゴヌクレオチドを設計した。合成オリゴヌクレオチド5’−CTAACCAT
AAGAAATCAGCAGCCCG−3’(配列番号12)及び5’−AGG
GAAGTATACATGCCATGGTGGT−3’(配列番号13)を使用
して野生型対立遺伝子から500bpPCR産物が得られる。当然のことながら
、これらのオリゴヌクレオチドを使用して本発明で使用するような野生型マウス
MC−4R遺伝子を含む29Kb/15Kbマウスゲノム配列を同定するための
野生型PCRプローブを得ることもできる。同様に、オリゴヌクレオチド5’−
CTAACCATAAGAAATCAGCAGCCCG−3’(配列番号14)
及び5’−TACCGGTGGATGTGGAATGTGTGC−3’(配列番
号15)を使用して突然変異対立遺伝子から650bpPCR産物が得られる。
【0139】
ターゲティングベクターの外側5’に位置する700bp NcoI−Hin
dIIIフラグメントをプローブとして使用してサザンブロット分析により標的
ESクローンを確認した。選択した600個のクローンのうち、3個は予想され
る5Kb野生型フラグメントに加えて7Kb標的ApaI制限酵素フラグメント
を示した(MC−4Rコーディング領域のApaI部位は相同組換えイベント中
に除去された)。これらの陽性クローンをC57B1/6J胚盤胞にマイクロイ
ンジェクトし、キメラマウスを作製した。2頭の雄キメラがそれらの子孫へ標的
対立遺伝子の生殖細胞系伝達を示した。F1ヘテロ接合マウスを同系交配し、ホ
モ接合ノックアウト、ヘテロ接合及び野生型F2子孫を生産した。これらのF2
同腹マウスを使用して5週齢から出発して体重を測定した。F2ホモ接合ノック
アウトマウスと野生型同腹マウスを使用して更にF3ハイブリッドを生産した。
代謝率試験にはF3ハイブリッドを使用した。ノックアウトマウスは年齢が上が
るにつれて肥満になるので、ホモ接合マウスは稔性が低下し、従ってノックアウ
トマウスの効率的大量生産には不適切であろうと仮定した。しかし、ホモ接合同
系交配対の同腹子寸法はヘテロ接合同系交配対に比較して正常であると思われた
。種々の年齢(2〜4.5カ月齢)のノックアウト雄を発情期の若いSW雌と交
配することにより生殖性能も評価した。その結果、挿入率(一晩膣挿入)と2〜
4.5カ月齢の雄の同腹子寸法は正常であった。
dIIIフラグメントをプローブとして使用してサザンブロット分析により標的
ESクローンを確認した。選択した600個のクローンのうち、3個は予想され
る5Kb野生型フラグメントに加えて7Kb標的ApaI制限酵素フラグメント
を示した(MC−4Rコーディング領域のApaI部位は相同組換えイベント中
に除去された)。これらの陽性クローンをC57B1/6J胚盤胞にマイクロイ
ンジェクトし、キメラマウスを作製した。2頭の雄キメラがそれらの子孫へ標的
対立遺伝子の生殖細胞系伝達を示した。F1ヘテロ接合マウスを同系交配し、ホ
モ接合ノックアウト、ヘテロ接合及び野生型F2子孫を生産した。これらのF2
同腹マウスを使用して5週齢から出発して体重を測定した。F2ホモ接合ノック
アウトマウスと野生型同腹マウスを使用して更にF3ハイブリッドを生産した。
代謝率試験にはF3ハイブリッドを使用した。ノックアウトマウスは年齢が上が
るにつれて肥満になるので、ホモ接合マウスは稔性が低下し、従ってノックアウ
トマウスの効率的大量生産には不適切であろうと仮定した。しかし、ホモ接合同
系交配対の同腹子寸法はヘテロ接合同系交配対に比較して正常であると思われた
。種々の年齢(2〜4.5カ月齢)のノックアウト雄を発情期の若いSW雌と交
配することにより生殖性能も評価した。その結果、挿入率(一晩膣挿入)と2〜
4.5カ月齢の雄の同腹子寸法は正常であった。
【0140】
MC−3R−/−マウスとMC−4R−/−マウスを比較すると有意差が顕著
である。MC−3R−/−マウスに比較してMC−4R−/−マウスマウスは過
食であり、有意過剰インスリン血と代謝率変化を示し、正常レベルの除脂肪体重
を維持する。MC−3R−/−マウスとMC−4R−/−マウスの表現型が非冗
長的であるという見解はMC−3RとMC−4Rの両者を欠失するマウス(本実
施例に記載し、図17(26週)及び18A〜B(26週まで)に示すようなM
C−3R−/−×MC−4R−/−マウス)の体重分析からも裏付られる。26
週齢で雌MC−3R−/−×MC−4R−/−マウスはMC−4Rのみを欠失す
る同腹子よりも有意に(〜27%;P<0.0001)重く(MC−3R−/− ×MC−4R−/−64.58±1.92g、MC−4R−/−50.77±1
.48g;n=10〜18)、雄MC−3R−/−×MC−4R−/−マウスも
MC−4R−/−同腹子よりも有意に(〜13%;P<0.05)重い(MC−
3R−/−×MC−4R−/−62.57±1.86g、MC−4R−/−55
.60±1.70g;n=9〜13)。このために図18A〜Bは雌(図18A
)二重ノックアウトマウスが6週齢でMC−4R−/−マウスよりも有意に(p
<0.01)重いことを示す。上述のように、26週齢まででは雌MC−3R− /− ×MC−4R−/−マウスはMC−4Rのみを欠失する同腹子よりも有意に
(〜27%)重く(MC−3R−/−×MC−4R−/−64.58±1.92
g、MC−4R−/−50.77±1.48g;n=10〜18;P<0.00
01)、同齢の雄MC−3R−/−×MC−4R−/−マウス(図18B)もM
C−4R−/−同腹子よりも有意に(〜13%)重い(MC−3R−/−×MC
−4R−/−62.57±1.86g、MC−4R−/−55.60±1.70
g;n=9〜13;P<0.05)。図19A〜Bは9週齢雌(図19A)及び
雄(図19B)MC−3R−/−×MC−4R−/−マウスの血漿インスリン値
がMC−4Rのみを欠失する同腹子よりも統計的に高いことを示す(雄:8.8
8±1.83ng/mlに対してMC−3R−/−×MC−4R−/−、50.
72±17.92ng/ml;n=11〜13;P<0.05及び雌1.65±
0.53ng/mlに対してMC−3R−/−×MC−4R−/−、8.59±
1.63ng/ml;n=10〜14;P<0.01)。図19A及び19Bに
示すようにグルコース値はMC−3R−/−×MC−4R−/−マウスとMC−
4R−/−マウスで同様である。更に、図20A〜BはMC−3R−/−×MC
−4R−/−マウスがMC−4R−/−マウスと同等量の飼料を消費し、どちら
も7週齢まで野生型(WT)マウスに比較して有意に過食であったことを示す(
図20A〜B)。しかし、雌MC−3R−/−×MC−4R−/−マウスは5〜
6週齢で雌MC−4R−/−マウス及び野生型(WT)マウスよりも有意に高い
飼料効率を示した(図20B)。雄MC−3R−/−×MC−4R−/−マウス
も同様の傾向を示したが、飼料効率は統計的有意に達しなかった。これらのデー
タはMC−3Rがエネルギー恒常性の調節においてMC−4Rに比較して非冗長
的な役割を果たすことを示している。更に、データはMC−3RとMC−4Rが
相乗的に作用するらしいことも示しており、MC−3R−/−/MC−4R−/ − マウスはMC−4R−/−マウスよりも肥満及び他の関連疾患の治療の良好な
モデルとして利用できると思われる。
である。MC−3R−/−マウスに比較してMC−4R−/−マウスマウスは過
食であり、有意過剰インスリン血と代謝率変化を示し、正常レベルの除脂肪体重
を維持する。MC−3R−/−マウスとMC−4R−/−マウスの表現型が非冗
長的であるという見解はMC−3RとMC−4Rの両者を欠失するマウス(本実
施例に記載し、図17(26週)及び18A〜B(26週まで)に示すようなM
C−3R−/−×MC−4R−/−マウス)の体重分析からも裏付られる。26
週齢で雌MC−3R−/−×MC−4R−/−マウスはMC−4Rのみを欠失す
る同腹子よりも有意に(〜27%;P<0.0001)重く(MC−3R−/− ×MC−4R−/−64.58±1.92g、MC−4R−/−50.77±1
.48g;n=10〜18)、雄MC−3R−/−×MC−4R−/−マウスも
MC−4R−/−同腹子よりも有意に(〜13%;P<0.05)重い(MC−
3R−/−×MC−4R−/−62.57±1.86g、MC−4R−/−55
.60±1.70g;n=9〜13)。このために図18A〜Bは雌(図18A
)二重ノックアウトマウスが6週齢でMC−4R−/−マウスよりも有意に(p
<0.01)重いことを示す。上述のように、26週齢まででは雌MC−3R− /− ×MC−4R−/−マウスはMC−4Rのみを欠失する同腹子よりも有意に
(〜27%)重く(MC−3R−/−×MC−4R−/−64.58±1.92
g、MC−4R−/−50.77±1.48g;n=10〜18;P<0.00
01)、同齢の雄MC−3R−/−×MC−4R−/−マウス(図18B)もM
C−4R−/−同腹子よりも有意に(〜13%)重い(MC−3R−/−×MC
−4R−/−62.57±1.86g、MC−4R−/−55.60±1.70
g;n=9〜13;P<0.05)。図19A〜Bは9週齢雌(図19A)及び
雄(図19B)MC−3R−/−×MC−4R−/−マウスの血漿インスリン値
がMC−4Rのみを欠失する同腹子よりも統計的に高いことを示す(雄:8.8
8±1.83ng/mlに対してMC−3R−/−×MC−4R−/−、50.
72±17.92ng/ml;n=11〜13;P<0.05及び雌1.65±
0.53ng/mlに対してMC−3R−/−×MC−4R−/−、8.59±
1.63ng/ml;n=10〜14;P<0.01)。図19A及び19Bに
示すようにグルコース値はMC−3R−/−×MC−4R−/−マウスとMC−
4R−/−マウスで同様である。更に、図20A〜BはMC−3R−/−×MC
−4R−/−マウスがMC−4R−/−マウスと同等量の飼料を消費し、どちら
も7週齢まで野生型(WT)マウスに比較して有意に過食であったことを示す(
図20A〜B)。しかし、雌MC−3R−/−×MC−4R−/−マウスは5〜
6週齢で雌MC−4R−/−マウス及び野生型(WT)マウスよりも有意に高い
飼料効率を示した(図20B)。雄MC−3R−/−×MC−4R−/−マウス
も同様の傾向を示したが、飼料効率は統計的有意に達しなかった。これらのデー
タはMC−3Rがエネルギー恒常性の調節においてMC−4Rに比較して非冗長
的な役割を果たすことを示している。更に、データはMC−3RとMC−4Rが
相乗的に作用するらしいことも示しており、MC−3R−/−/MC−4R−/ − マウスはMC−4R−/−マウスよりも肥満及び他の関連疾患の治療の良好な
モデルとして利用できると思われる。
【配列表】
【図1】
マウスMC−3Rをコードするヌクレオチド配列(配列番号1)を示す。
【図2】
マウスMC−3Rのアミノ酸配列(配列番号2)を示す。
【図3】
ヒトMC−3Rをコードするヌクレオチド配列(配列番号3)を示す。
【図4】
ヒトMC−3Rのアミノ酸配列(配列番号4)を示す。
【図5】
ターゲティング遺伝子ベクターpAL10の構築の概略図を示す。
【図6】
MC−3Rをコードするマウスゲノム配列との相同組換えにターゲティング遺
伝子ベクターpAL10を利用するストラテジーを示す。
伝子ベクターpAL10を利用するストラテジーを示す。
【図7A】
同系交配プログラムで作製したホモ接合及びヘテロ接合MC−3Rトランスジ
ェニックマウスと野生型マウスのサザンハイブリダイゼーションを示す。
ェニックマウスと野生型マウスのサザンハイブリダイゼーションを示す。
【図7B】
同系交配プログラムで作製したホモ接合及びヘテロ接合MC−3Rトランスジ
ェニックマウスと野生型マウスのPCR分析を示す。
ェニックマウスと野生型マウスのPCR分析を示す。
【図8】
図8はMC−3Rノックアウト(N=8)、ヘテロ接合(N=7)及び野生型
(N=5)マウスの体組成の比較を示す。
(N=5)マウスの体組成の比較を示す。
【図9】
図9はMC−3R−/−マウス脳の視床下部弓状(ARC)及び腹内側(VM
H)核におけるMC−3R mRNA発現の不在を示す。
H)核におけるMC−3R mRNA発現の不在を示す。
【図10A】
野生型(+/+)、ヘテロ接合突然変異(+/−)及びホモ接合突然変異(−
/−)同腹マウスの成長曲線を示す。
/−)同腹マウスの成長曲線を示す。
【図10B】
野生型(+/+)、ヘテロ接合突然変異(+/−)及びホモ接合突然変異(−
/−)同腹マウスの成長曲線を示す。
/−)同腹マウスの成長曲線を示す。
【図10C】
野生型(+/+)、ヘテロ接合突然変異(+/−)及びホモ接合突然変異(−
/−)同腹マウスの体組成を示す。
/−)同腹マウスの体組成を示す。
【図10D】
野生型(+/+)、ヘテロ接合突然変異(+/−)及びホモ接合突然変異(−
/−)同腹マウスの体組成を示す。
/−)同腹マウスの体組成を示す。
【図11A】
野生型(+/+)、ヘテロ接合突然変異(+/−)及びホモ接合突然変異(−
/−)同腹マウスの脂肪組織量を示す。
/−)同腹マウスの脂肪組織量を示す。
【図11B】
野生型(+/+)、ヘテロ接合突然変異(+/−)及びホモ接合突然変異(−
/−)同腹マウスの脂肪組織量を示す。
/−)同腹マウスの脂肪組織量を示す。
【図11C】
野生型(+/+)、ヘテロ接合突然変異(+/−)及びホモ接合突然変異(−
/−)同腹マウスの脂肪組織量を示す。
/−)同腹マウスの脂肪組織量を示す。
【図11D】
野生型(+/+)、ヘテロ接合突然変異(+/−)及びホモ接合突然変異(−
/−)同腹マウスの脂肪組織量を示す。
/−)同腹マウスの脂肪組織量を示す。
【図11E】
野生型(+/+)、ヘテロ接合突然変異(+/−)及びホモ接合突然変異(−
/−)同腹マウスの脂肪組織量を示し、4カ月齢野生型マウスにおけるBATの
形態も示す。
/−)同腹マウスの脂肪組織量を示し、4カ月齢野生型マウスにおけるBATの
形態も示す。
【図11F】
野生型(+/+)、ヘテロ接合突然変異(+/−)及びホモ接合突然変異(−
/−)同腹マウスの脂肪組織量を示し、MC−3R−/−マウスにおけるBAT
の形態も示す。
/−)同腹マウスの脂肪組織量を示し、MC−3R−/−マウスにおけるBAT
の形態も示す。
【図11G】
野生型(+/+)、ヘテロ接合突然変異(+/−)及びホモ接合突然変異(−
/−)同腹マウスの脂肪組織量を示し、4カ月齢野生型マウスにおけるWAT(
白色脂肪組織)の形態も示す。
/−)同腹マウスの脂肪組織量を示し、4カ月齢野生型マウスにおけるWAT(
白色脂肪組織)の形態も示す。
【図11H】
野生型(+/+)、ヘテロ接合突然変異(+/−)及びホモ接合突然変異(−
/−)同腹マウスの脂肪組織量を示し、MC−3R−/−マウスにおけるWAT
(白色脂肪組織)の形態も示す。
/−)同腹マウスの脂肪組織量を示し、MC−3R−/−マウスにおけるWAT
(白色脂肪組織)の形態も示す。
【図12A】
野生型(+/+)、ヘテロ接合突然変異[MC−3R−/+](+/−)及び
ホモ接合突然変異[MC−3R−/−](−/−)同腹マウスのレプチンの血漿
値を示す。
ホモ接合突然変異[MC−3R−/−](−/−)同腹マウスのレプチンの血漿
値を示す。
【図12B】
野生型(+/+)、ヘテロ接合突然変異[MC−3R−/+](+/−)及び
ホモ接合突然変異[MC−3R−/−](−/−)同腹マウスのインスリンの血
漿値を示す。
ホモ接合突然変異[MC−3R−/−](−/−)同腹マウスのインスリンの血
漿値を示す。
【図12C】
野生型(+/+)、ヘテロ接合突然変異[MC−3R−/+](+/−)及び
ホモ接合突然変異[MC−3R−/−](−/−)同腹マウスのグルコースの血
漿値を示す。
ホモ接合突然変異[MC−3R−/−](−/−)同腹マウスのグルコースの血
漿値を示す。
【図12D】
野生型(+/+)、ヘテロ接合突然変異[MC−3R−/+](+/−)及び
ホモ接合突然変異[MC−3R−/−](−/−)同腹マウスのコルチコステロ
ンの血漿値を示す。
ホモ接合突然変異[MC−3R−/−](−/−)同腹マウスのコルチコステロ
ンの血漿値を示す。
【図13A】
個別収容して普通固形飼料を与えた雄野生型(+/+、n=11)、ヘテロ接
合突然変異[MC−3R−/+](+/−、n=20)及びホモ接合突然変異[
MC−3R−/−](−/−、n=16)同腹マウスの1日摂飼量を毎週計算し
た摂飼量を示す。
合突然変異[MC−3R−/+](+/−、n=20)及びホモ接合突然変異[
MC−3R−/−](−/−、n=16)同腹マウスの1日摂飼量を毎週計算し
た摂飼量を示す。
【図13A−1】
個別収容して普通固形飼料を与えた雄野生型(+/+、n=11)、ヘテロ接
合突然変異[MC−3R−/+](+/−、n=20)及びホモ接合突然変異[
MC−3R−/−](−/−、n=16)同腹マウスの6週間の平均1日摂飼量
を示す。
合突然変異[MC−3R−/+](+/−、n=20)及びホモ接合突然変異[
MC−3R−/−](−/−、n=16)同腹マウスの6週間の平均1日摂飼量
を示す。
【図13B】
個別収容して普通固形飼料を与えた雄野生型(+/+、n=11)、ヘテロ接
合突然変異[MC−3R−/+](+/−、n=20)及びホモ接合突然変異[
MC−3R−/−](−/−、n=16)同腹マウスの出発体重に対する体重増
加百分率を示す。
合突然変異[MC−3R−/+](+/−、n=20)及びホモ接合突然変異[
MC−3R−/−](−/−、n=16)同腹マウスの出発体重に対する体重増
加百分率を示す。
【図13C】
個別収容して普通固形飼料を与えた雄野生型(+/+、n=11)、ヘテロ接
合突然変異[MC−3R−/+](+/−、n=20)及びホモ接合突然変異[
MC−3R−/−](−/−、n=16)同腹マウスの飼料効率を示す。
合突然変異[MC−3R−/+](+/−、n=20)及びホモ接合突然変異[
MC−3R−/−](−/−、n=16)同腹マウスの飼料効率を示す。
【図13D】
個別収容して高脂肪飼料を与えた雌野生型(+/+、n=11)、ヘテロ接合
突然変異[MC−3R−/+](+/−、n=7)及びホモ接合突然変異[MC
−3R−/−](−/−、n=10)同腹マウスの10週間の平均1日摂飼量を
示す。
突然変異[MC−3R−/+](+/−、n=7)及びホモ接合突然変異[MC
−3R−/−](−/−、n=10)同腹マウスの10週間の平均1日摂飼量を
示す。
【図13E】
個別収容して高脂肪飼料を与えた雌野生型(+/+、n=11)、ヘテロ接合
突然変異[MC−3R−/+](+/−、n=7)及びホモ接合突然変異[MC
−3R−/−](−/−、n=10)同腹マウスの出発体重に対する体重増加百
分率を示す。
突然変異[MC−3R−/+](+/−、n=7)及びホモ接合突然変異[MC
−3R−/−](−/−、n=10)同腹マウスの出発体重に対する体重増加百
分率を示す。
【図13F】
個別収容して高脂肪飼料を与えた雌野生型(+/+、n=11)、ヘテロ接合
突然変異[MC−3R−/+](+/−、n=7)及びホモ接合突然変異[MC
−3R−/−](−/−、n=10)同腹マウスの飼料効率を示す。
突然変異[MC−3R−/+](+/−、n=7)及びホモ接合突然変異[MC
−3R−/−](−/−、n=10)同腹マウスの飼料効率を示す。
【図14A】
個別収容したMC−3R−/−マウスと野生型マウスの代謝率を示す。
【図14B】
個別収容したMC−3R−/−マウスと野生型マウスの歩行活動を示す。
【図14C】
個別収容したMC−3R−/−マウスと野生型マウスの微小運動を示す。
【図14D】
個別収容したMC−3R−/−マウスと野生型マウスの歩行活動を示す。
【図14E】
個別収容したMC−3R−/−マウスと野生型マウスの微小運動を示す。
【図15】
ターゲティング遺伝子ベクターpAJ7の構築に使用するストラテジーの概略
図を示す。
図を示す。
【図16】
MC−4Rをコードするマウスゲノム配列との相同組換えにターゲティング遺
伝子ベクターpAJ7を利用するストラテジーを示す。
伝子ベクターpAJ7を利用するストラテジーを示す。
【図17】
26週齢雌マウスの体重に及ぼすMC−3R及びMC−4R遺伝子欠失の効果
を示す。
を示す。
【図18A】
雌MC−3R−/−/MC−4R−/−二重ノックアウトマウスが6週齢でM
C−4R−/−マウスよりも有意に(p<0.01)重いことを示す。g、MC
−4R−/−55.60±1.70g;n=9〜13;P<0.05)。
C−4R−/−マウスよりも有意に(p<0.01)重いことを示す。g、MC
−4R−/−55.60±1.70g;n=9〜13;P<0.05)。
【図18B】
雌と同齢の雄MC−3R−/−×MC−4R−/−マウス二重ノックアウトマ
ウスはMC−4R−/−同腹子よりも有意に重いことを示す。
ウスはMC−4R−/−同腹子よりも有意に重いことを示す。
【図19A】
9週齢雄MC−3R−/−×MC−4R−/−マウスの血漿インスリン値がM
C−4Rのみを欠失する同腹子よりも統計的に高いことを示す。
C−4Rのみを欠失する同腹子よりも統計的に高いことを示す。
【図19B】
9週齢雌MC−3R−/−×MC−4R−/−マウスの血漿インスリン値がM
C−4Rのみを欠失する同腹子よりも統計的に高いことを示す。
C−4Rのみを欠失する同腹子よりも統計的に高いことを示す。
【図20A】
雌MC−3R−/−×MC−4R−/−マウスがMC−4R−/−マウスと同
等量の飼料を消費し、どちらも7週齢まで野生型(WT)マウスに比較して有意
に過食であったことを示す。
等量の飼料を消費し、どちらも7週齢まで野生型(WT)マウスに比較して有意
に過食であったことを示す。
【図20B】
雌MC−3R−/−×MC−4R−/−マウスは5〜6週齢で雌MC−4R− /−
マウス及び野生型(WT)マウスよりも有意に高い飼料効率であったことを
示す。
示す。
─────────────────────────────────────────────────────
フロントページの続き
(51)Int.Cl.7 識別記号 FI テーマコート゛(参考)
G01N 33/15 C12N 15/00 ZNAA
33/50 5/00 B
(31)優先権主張番号 60/220,713
(32)優先日 平成12年7月26日(2000.7.26)
(33)優先権主張国 米国(US)
(81)指定国 EP(AT,BE,CH,CY,
DE,DK,ES,FI,FR,GB,GR,IE,I
T,LU,MC,NL,PT,SE,TR),OA(BF
,BJ,CF,CG,CI,CM,GA,GN,GW,
ML,MR,NE,SN,TD,TG),AP(GH,G
M,KE,LS,MW,MZ,SD,SL,SZ,TZ
,UG,ZW),EA(AM,AZ,BY,KG,KZ,
MD,RU,TJ,TM),AE,AG,AL,AM,
AT,AU,AZ,BA,BB,BG,BR,BY,B
Z,CA,CH,CN,CR,CU,CZ,DE,DK
,DM,DZ,EE,ES,FI,GB,GD,GE,
GH,GM,HR,HU,ID,IL,IN,IS,J
P,KE,KG,KR,KZ,LC,LK,LR,LS
,LT,LU,LV,MA,MD,MG,MK,MN,
MW,MX,MZ,NO,NZ,PL,PT,RO,R
U,SD,SE,SG,SI,SK,SL,TJ,TM
,TR,TT,TZ,UA,UG,US,UZ,VN,
YU,ZA,ZW
(72)発明者 チエン,ハワード・ワイ
アメリカ合衆国、ニユー・ジヤージー・
07065−0907、ローウエイ、イースト・リ
ンカーン・アベニユー・126
(72)発明者 チエン,アイル・エス
アメリカ合衆国、ニユー・ジヤージー・
07065−0907、ローウエイ、イースト・リ
ンカーン・アベニユー・126
Fターム(参考) 2G045 AA29 AA40 BB20 CB01 CB17
CB21 DA12 DA13 DA14 DA36
FB02 FB03 FB04
4B024 AA11 BA63 CA04 DA02 DA06
EA04 GA11 GA18 GA19 HA03
HA11
4B063 QA01 QA18 QQ20 QR42 QR45
QR48 QR77 QR80 QS12 QS38
QX07
4B065 AA90X AA91X AB01 AC14
BA02 CA24 CA60
Claims (57)
- 【請求項1】 体細胞と生殖細胞が非機能的MC−3Rタンパク質をコード
する改変MC−3R遺伝子に対してホモ接合性であるトランスジェニック非ヒト
動物。 - 【請求項2】 請求項1に記載のトランスジェニック動物に由来する細胞系
。 - 【請求項3】 体細胞と生殖細胞が非機能的MC−3Rタンパク質をコード
する改変MC−3R遺伝子についてホモ接合性であるトランスジェニックマウス
。 - 【請求項4】 肥満症候群、糖尿病、男性及び女性性機能不全、疼痛、記憶
、ニューロン再生及び神経障害、GH、IGF1機能低下に関連する成長障害、
並びにGH欠損に起因する他の状態から構成される群から選択される障害を示す
請求項3に記載のトランスジェニックマウス。 - 【請求項5】 肥満症候群を示す請求項4に記載のトランスジェニックマウ
ス。 - 【請求項6】 請求項3に記載のトランスジェニックマウスに由来する細胞
系。 - 【請求項7】 請求項4に記載のトランスジェニックマウスに由来する細胞
系。 - 【請求項8】 請求項5に記載のトランスジェニックマウスに由来する細胞
系。 - 【請求項9】 稔性であり、改変MC−3R遺伝子をその子孫に伝達するこ
とが可能な請求項6に記載のマウス。 - 【請求項10】 稔性であり、改変MC−3R遺伝子をその子孫に伝達する
ことが可能な請求項7に記載のマウス。 - 【請求項11】 稔性であり、改変MC−3R遺伝子をその子孫に伝達する
ことが可能な請求項8に記載のマウス。 - 【請求項12】 体細胞がMC−3Rタンパク質をコードする機能的マウス
遺伝子と改変MC−3R遺伝子に対してホモ接合性であるトランスジェニックマ
ウス。 - 【請求項13】 肥満症候群、糖尿病、男性及び女性性機能不全、疼痛、記
憶、ニューロン再生及び神経障害、GH、IGF1機能低下に関連する成長障害
、並びにGH欠損に起因する他の状態から構成される群から選択される障害を示
す請求項12に記載のトランスジェニックマウス。 - 【請求項14】 肥満症候群を示す請求項4に記載のトランスジェニックマ
ウス。 - 【請求項15】 請求項12に記載のトランスジェニック動物に由来する細
胞系。 - 【請求項16】 請求項13に記載のトランスジェニック動物に由来する細
胞系。 - 【請求項17】 請求項14に記載のトランスジェニック動物に由来する細
胞系。 - 【請求項18】 稔性であり、改変MC−3R遺伝子をその子孫に伝達する
ことが可能な請求項15に記載のマウス。 - 【請求項19】 稔性であり、改変MC−3R遺伝子をその子孫に伝達する
ことが可能な請求項16に記載のマウス。 - 【請求項20】 稔性であり、改変MC−3R遺伝子をその子孫に伝達する
ことが可能な請求項17に記載のマウス。 - 【請求項21】 体細胞が改変MC−3R遺伝子に対してヘミ接合性である
トランスジェニックマウス。 - 【請求項22】 肥満症候群、糖尿病、男性及び女性性機能不全、疼痛、記
憶、ニューロン再生及び神経障害、GH、IGF1機能低下に関連する成長障害
、並びにGH欠損に起因する他の状態から構成される群から選択される障害を示
す請求項21に記載のトランスジェニックマウス。 - 【請求項23】 肥満症候群を示す請求項22に記載のトランスジェニック
マウス。 - 【請求項24】 請求項21に記載のトランスジェニック動物に由来する細
胞系。 - 【請求項25】 請求項22に記載のトランスジェニック動物に由来する細
胞系。 - 【請求項26】 請求項23に記載のトランスジェニック動物に由来する細
胞系。 - 【請求項27】 稔性であり、改変MC−3R遺伝子をその子孫に伝達する
ことが可能な請求項24に記載のマウス。 - 【請求項28】 稔性であり、改変MC−3R遺伝子をその子孫に伝達する
ことが可能な請求項25に記載のマウス。 - 【請求項29】 稔性であり、改変MC−3R遺伝子をその子孫に伝達する
ことが可能な請求項26に記載のマウス。 - 【請求項30】 体細胞と生殖細胞がマウスMC−3Rタンパク質をコード
する機能的遺伝子を欠失しており、非天然MC−3Rタンパク質の遺伝子を含む
トランスジーンを含み、これを発現し、生存可能であるトランスジェニックマウ
ス。 - 【請求項31】 前記非天然MC−3Rトランスジーンが野生型ヒトMC−
3Rをコードする請求項30に記載のトランスジェニックマウス。 - 【請求項32】 前記非天然MC−3RトランスジーンがヒトMC−3Rの
突然変異形をコードする請求項31に記載のトランスジェニックマウス。 - 【請求項33】 MC−3Rをコードするマウス遺伝子を欠失する体細胞と
生殖細胞をもつマウスの生産方法であって、 (a)マウス胚性幹細胞のMC−3R対立遺伝子を標的とするように設計したM
C−3Rの改変形をコードする遺伝子を提供する段階と、 (b)改変遺伝子をマウス胚性幹細胞に導入する段階と、 (c)改変遺伝子を含む胚性幹細胞を選択する段階と、 (d)改変遺伝子を含む胚性幹細胞をマウス胚盤胞に導入する段階と、 (e)注入した胚盤胞を偽妊娠マウスに移植する段階と、 (f)胎児を満期まで発生させ、キメラファウンダートランスジェニックマウス
を生産する段階を含む前記方法。 - 【請求項34】 段階(d)の導入をマイクロインジェクションにより行う
請求項33に記載の方法。 - 【請求項35】 (g)キメラトランスジェニックマウスを野生型マウスと
同系交配し、前記改変MC−3R遺伝子についてヘテロ接合性のF1マウスを得
る段階を更に含む請求項33に記載の方法。 - 【請求項36】 体細胞と生殖細胞が非機能的MC−3Rタンパク質をコー
ドする改変MC−3R遺伝子についてホモ接合性であり、非機能的MC−4Rタ
ンパク質をコードする改変MC−4R遺伝子についてホモ接合性であるトランス
ジェニック非ヒト動物。 - 【請求項37】 請求項36に記載のトランスジェニック動物に由来する細
胞系。 - 【請求項38】 体細胞と生殖細胞が非機能的MC−3Rタンパク質をコー
ドする改変MC−3R遺伝子についてホモ接合性であり、非機能的MC−4Rタ
ンパク質をコードする改変MC−4R遺伝子についてホモ接合性であるトランス
ジェニックマウス。 - 【請求項39】 請求項38に記載のトランスジェニックマウスに由来する
細胞系。 - 【請求項40】 稔性であり、改変MC−3R遺伝子及びMC−4R遺伝子
をその子孫に伝達することが可能な請求項39に記載のマウス。 - 【請求項41】 体細胞が非機能的タンパク質を発現する改変MC−3R遺
伝子と改変MC−4R遺伝子についてヘテロ接合性又はホモ接合性であるトラン
スジェニックマウス。 - 【請求項42】 請求項41に記載のトランスジェニック動物に由来する細
胞系。 - 【請求項43】 稔性であり、改変MC−3R遺伝子及び/又はMC−4R
遺伝子をその子孫に伝達することが可能な請求項41に記載のマウス。 - 【請求項44】 体細胞と生殖細胞がマウスMC−3Rタンパク質とMC−
4Rタンパク質をコードする機能的遺伝子を欠失しており、非天然MC−3Rタ
ンパク質と非天然MC−4Rタンパク質の遺伝子を含むトランスジーンを含み、
これを発現し、生存可能であるトランスジェニックマウス。 - 【請求項45】 前記非天然MC−3Rトランスジーンが野生型ヒトMC−
3R及び野生型ヒトMC−4Rをコードする請求項44に記載のトランスジェニ
ックマウス。 - 【請求項46】 前記非天然MC−3R又はMC−4Rトランスジーンがタ
ンパク質の突然変異形をコードする請求項44に記載のトランスジェニックマウ
ス。 - 【請求項47】 物質がMC−3Rと結合できるか否かを判定する方法であ
って、 (a)細胞でMC−3Rの発現を誘導する発現ベクターを細胞にトランスフェク
トすることにより試験細胞を提供する段階と、 (b)試験細胞を物質に暴露する段階と、 (c)物質のMC−3R結合量を測定する段階と、 (d)試験細胞における物質のMC−3R結合量を、MC−3Rをトランスフェ
クトしていない対照細胞との物質の結合量と比較し、MC−3Rに結合する物質
を、体重を調節する潜在能力を有する物質として同定する段階を含む前記方法。 - 【請求項48】 物質がMC−3Rを活性化して体重を調節できるか否かを
判定する方法であって、 (a)細胞でMC−3Rの発現を誘導する発現ベクターを細胞にトランスフェク
トすることにより試験細胞を提供する段階と、 (b)試験細胞を物質に暴露する段階と、 (c)蓄積細胞内cAMP量を測定する段階と、 (d)物質に応答する試験細胞中のcAMP量を、物質に暴露していない試験細
胞中のcAMP量と比較し、MC−3Rに結合する物質を、体重を調節する潜在
能力を有する物質として同定する段階を含む前記方法。 - 【請求項49】 MC−3Rレセプター活性を調節し、体重を調節する物質
の同定方法であって、 (a)配列番号4に記載のアミノ酸配列を含むMC−3Rレセプタータンパク質
の存在下と不在下に試験物質を加える段階と、 (b)MC−3Rレセプタータンパク質の存在下と不在下の試験物質の効果を測
定及び比較する段階を含む前記方法。 - 【請求項50】 物質がMC−3Rの潜在的アゴニスト又はアンタゴニスト
であり、体重を調節するか否かを判定する方法であって、 (a)細胞でMC−3Rの発現を誘導する発現ベクターを細胞にトランスフェク
ト又は形質転換し、試験細胞を得る段階と、 (b)MC−3Rを発現させるために十分な時間試験細胞を増殖させる段階と、 (c)物質の存在下と不在下で細胞をMC−3Rの標識リガンドに暴露する段階
と、 (d)標識リガンドとMC−3Rの結合を測定し、標識リガンドの結合量が物質
の不在下よりも物質の存在下のほうが少ない場合には物質がMC−3Rのアゴニ
スト又はアンタゴニストとしての潜在能力を有するものであると判定する段階を
含む前記方法。 - 【請求項51】 物質がMC−3Rに結合して体重を調節できるか否かを判
定する方法であって、 (a)細胞でMC−3Rの発現を誘導する発現ベクターを細胞にトランスフェク
ト又は形質転換し、試験細胞を得る段階と、 (b)試験細胞を物質に暴露する段階と、 (c)物質のMC−3R結合量を測定する段階と、 (d)試験細胞における物質のMC−3R結合量を、MC−3Rをトランスフェ
クトしていない対照細胞との物質の結合量と比較し、物質の結合量が対照細胞よ
りも試験細胞のほうが多い場合には物質がMC−3Rと結合できると判定する段
階を含む前記方法。 - 【請求項52】 物質がMC−3Rに結合して体重を調節できるか否かを判
定する方法であって、 (a)細胞でMC−3Rの発現を誘導する発現ベクターを細胞にトランスフェク
ト又は形質転換し、試験細胞を得る段階と、 (b)試験細胞からMC−3Rを含む膜を調製し、リガンドが膜内のMC−3R
と結合する条件下で膜をMC−3Rのリガンドに暴露する段階と、 (c)段階(b)の後又はそれと同時に試験細胞からの膜を物質に暴露する段階
と、 (d)物質の存在下と不在下で膜内のMC−3Rとリガンドの結合量を測定する
段階と、 (e)物質の存在下と不在下の膜内のMC−3Rとリガンドの結合量を比較し、
物質の存在下の膜内のMC−3Rとリガンドの結合量が減少している場合には物
質がMC−3Rと結合できると判定する段階を含む前記方法。 - 【請求項53】 物質がMC−3Rに結合して体重を調節できるか否かを判
定する方法であって、 (a)細胞でMC−3Rの発現を誘導する発現ベクターを細胞にトランスフェク
ト又は形質転換し、試験細胞を得る段階と、 (b)試験細胞からMC−3Rを含む膜を調製し、試験細胞からの膜を物質に暴
露する段階と、 (c)試験細胞からの膜内のMC−3Rと物質の結合量を測定する段階と、 (d)試験細胞からの膜内のMC−3Rと物質の結合量を、MC−3Rをトラン
スフェクトしていない対照細胞からの膜との物質の結合量と比較し、試験細胞か
らの膜内のMC−3Rと物質の結合量が対照細胞からの膜との物質の結合量より
も多い場合には物質がMC−3Rと結合できると判定する段階を含む前記方法。 - 【請求項54】 体重を調節するMC−3Rのアゴニストの同定方法であっ
て、 (a)MC−3Rの発現を誘導する第1の発現ベクターとプロミスカスGタンパ
ク質の発現を誘導する第2の発現ベクターを細胞にトランスフェクト又は形質転
換し、試験細胞を得る段階と、 (b)試験細胞をMC−3Rの被疑アゴニストである物質に暴露する段階と、 (c)細胞中のリン酸イノシトール値を測定し、被疑アゴニストの不在下の細胞
中のリン酸イノシトール値に比較して細胞中のリン酸イノシトール値が増加して
いる場合には物質がMC−3Rのアゴニストであると判定する段階を含む前記方
法。 - 【請求項55】 体重を調節するMC−3Rのアンタゴニストの同定方法で
あって、 (a)MC−3Rの発現を誘導する第1の発現ベクターとプロミスカスGタンパ
ク質の発現を誘導する第2の発現ベクターを細胞にトランスフェクト又は形質転
換し、試験細胞を得る段階と、 (b)試験細胞をMC−3Rのアゴニストである物質に暴露する段階と、 (c)段階(b)の後又はそれと同時に試験細胞をMC−3Rの被疑アンタゴニ
ストである物質に暴露する段階と、 (d)細胞中のリン酸イノシトール値を測定し、被疑アンタゴニストの存在下の
細胞中のリン酸イノシトール値が被疑アンタゴニストの不在下の細胞中のリン酸
イノシトール値に比較して低下している場合には物質がMC−3Rのアンタゴニ
ストであると判定する段階を含む前記方法。 - 【請求項56】 段階(a)の第1及び第2の発現ベクターを、そのC末端
でプロミスカスGタンパク質に融合したキメラMC−3Rタンパク質を発現する
単一発現ベクターで置換える請求項55に記載のMC−3Rのアンタゴニストの
同定方法。 - 【請求項57】 MC−3Rの調節と体重調節にin vivo効力を示す
化合物の選択方法であって、請求項47から56のいずれか一項に記載の方法に
より選択した化合物を非ヒト動物に投与し、化合物の投与が非ヒト動物の体内で
体重調節に及ぼす効果を測定する前記方法。
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