DE10016083A1

DE10016083A1 - Nicht-menschliches Tiermodell für Wachstumsdefizienz und Defekte der Informationsverarbeitung oder der kognitiven Funktion und seine Verwendung

Info

Publication number: DE10016083A1
Application number: DE2000116083
Authority: DE
Inventors: Emmanuelle Cornali; Michael Christian Nehls; Frank Wattler; Sigrid Wattler; Dirk Korthaus; Martin Klingenspor; Carola Meyer
Original assignee: Ingenium Pharmaceuticals GmbH
Current assignee: Ingenium Pharmaceuticals GmbH
Priority date: 2000-03-31
Filing date: 2000-03-31
Publication date: 2001-10-18
Also published as: WO2001072119A3; AU2001265855A1; WO2001072119A2

Abstract

Die Erfindung betrifft ein nicht-menschliches Tiermodell und insbesondere ein Mausmodell für Wachstumsdefizienz und Defekte der Informationsverarbeitung oder der kognitiven Funktion. Weiterhin betrifft die Erfindung ein modifiziertes Wachstumshormon und dafür kodierende Nukleinsäuresequenzen.

Description

Gebiet der Erfindung

Die Erfindung betrifft ein nicht-menschliches Tiermodell, und insbesondere ein Maus- Modell für Wachstumsdefizienz und Defekte der Informationsverarbeitung oder der kognitiven Funktion. Ferner betrifft die Erfindung ein modifiziertes Wachstumshormon und dafür kodierende Nukleinsäuresequenzen.

Hintergrund der Erfindung Wachstumsdefizienzstörungen

Proportionale, verkürzte Körpermaße, begleitet von verzögerter Wachstumsgeschwindigkeit und verzögerter Skelettreifung sind der wichtigste klinische Befund für eine Diagnose von Wachstumshormondefizienz (GHD). Während alle diese Symptome oder Anzeichen mit GHD in Verbindung stehen, ist keines von ihnen spezifisch für GHD. Die weiteren Befunde einer verzögerten Knochenreifung und das Fehlen von Knochendysplasien und chronischen Erkrankungen sind weitere Kriterien. Eine richtige Funktion des Wachstumshormon(GH)-Weges ist während der Kindheit erforderlich, um ein normales Wachstum aufrechtzuerhalten.

Phillips und Cogan (1994) beschrieben 4 Formen einer isolierten Wachstumshormondefizienz (IGHD). IGHD IA und IB werden autosomal rezessiv vererbt. Bei IGHD IA führen Deletionen, Rasterverschiebungen und Nonsense- Mutationen zu einem Fehlen von GH, begleitet von schwerem Zwergwuchs; Patienten entwickeln häufig anti-GH Antikörper, falls ihnen exogenes Wachstumshormon verabreicht wird. Bei IGHD IB sind Mutationen der Splicestelle die Ursache für geringe, jedoch nachweisbare Mengen an GH. Der Zwergwuchs ist weniger stark ausgeprägt als bei IGHD IA und die Patienten reagieren gewöhnlich gut auf exogenes GH. IGHD II wird autosomal dominant vererbt und wird durch Mutationen der Splicestelle oder Missense- Mutationen, die dominant-negative Wirkungen besitzen, hervorgerufen. Der klinische Schweregrad von IGHD II variiert zwischen Verwandten. Die Patienten reagieren gewöhnlich gut auf exogenes GH. IGHD III ist eine X-gekoppelte Erkrankung, die häufig mit Hypogammaglobulinämie in Verbindung steht, was ein benachbartes Gensyndrom nahelegt.

Fälle, bei denen Wachstumshormon fehlt oder defizient ist, einschließlich IIIig-Typ- Defizienz (Cogan et al., 1993) und Kowarsky-Syndrom (Takahashi et al., 1996) wurden Mutationen des menschlichen Wachstumshormongens GH zugeschrieben, das auf Chr 17q liegt (George et al., 1981).

Wachstumshormon (GH) ist ein von azidophilen oder somatotropen Zellen der vorderen Hypophyse (Adenohypophyse) synthetisiertes und sekretiertes Protein. Die Regulation der GH-Synthese und die Freisetzung wird durch eine Genfamilie moduliert, zu der die Transkriptionsfaktoren PROP1 und PIT1 gehören. PROP1 und PIT1 regulieren die Differenzierung der Hypophysenzellen in Somatotrope, die GH synthetisieren und freisetzen. Gene, die für die Freisetzung von GH wichtig sind, umfassen Wachstumshormon-freisetzendes Hormon GHRH und seinen Rezeptor GHRHR, während Somatostatin die GH-Freisetzung hemmt.

Menschliches und Mäuse-Wachstumshormon besitzen ein Molekulargewicht von 22.005 und enthalten 191, bzw. 193 Aminosäurereste, 2 konservierte Disulfidbrücken (Niall et al., 1971) und 4 Helixdomänen. GH besitzt direkte Wirkungen, die ein Muskelwachstum ermöglichen und durch Erhöhung der peripheren Resistenz gegenüber Insulin Glukose einsparen. Seine Wirkungen auf das Skelettwachstum sind teilweise direkte Wirkungen auf die Chondrozytendifferenzierung und teilweise indirekte Wirkungen über Insulin-ähnliche Wachstumsfaktoren auf das Wachstum von Chondrozyten und Muskel (Barton et al., 1989).

Nach Freisetzung ins Blut bindet Wachstumshormon an zwei Moleküle des in der Membran verankerten Wachstumshormonrezeptors GHR, was zu einer Induktion der Expression des Insulin-ähnlichen Wachstumsfaktors IGF1 führt. IGF1 und sein Rezeptor (IGF1 R) stimulieren das Wachstum in verschiedenen Geweben, einschließlich Knochen und Muskel (Phillips, 1995; Rimoin und Phillips, 1997) und die kodierenden Nukleinsäuresequenzen gehören zu den Hauptgenen, die am GH- Transduktionsweg beteiligt sind. GH-Moleküle, die an in der Membran verankerte GH- Rezeptoren gebunden sind, können durch Abtrennen des extrazellulären Teils der GHR-Moleküle in den Blutkreislauf freigesetzt werden. Hier dient der extrazelluläre Teil des GHR, der als GHBP bezeichnet wird, der Stabilisierung von GH im Blutkreislauf.

Begleitende oder kombinierte Defizienzen anderer Hypophysenhormone (Luteinisierendes Hormon (LH, 152780); Follikel-stimulierendes Hormon (FSH); Thyroidea-stimulierendes Hormon (TSH); und/oder ACTH) zusätzlich zu GH wird kombinierte Hypophysenhormondefizienz (CPHD) oder Panhypopituitarismus- Zwergwuchs genannt. Die Kombination von GH- und diesen zusätzlichen Hormondefizienzen verursacht häufig eine schwerere Verzögerung des Wachstums und der Skelettreifung und eine spontane Geschlechtsreife kann nicht erfolgen (Phillips, 1995). Eine signifikante Verminderung der Knochenmineraliendichte (BMD) in Verbindung mit Abnormalitäten der Knochenumsetzungsparameter wurde nur in Patienten mit einer sehr schweren oder schweren Wachstumsfaktordefizienz (GHD) gefunden, während normale BMD-Werte bei Patienten mit einer nicht-GHD Hypopituitarismus-Patienten gefunden wurden.

Die Behandlung von GH-Defizienz erfolgt durch eine Austauschtherapie mit exogenem, biosynthetischem GH. Für die klinische Reaktion wichtige Faktoren umfassen die Ätiologie und Stärke der Defizienz, das Alter des Ausbruchs, die Dauer des Austauschs, sowie das Geschlecht des Erkrankten.

Burman et al. (1997) beschrieb, dass Männer und Frauen mit GHD ausgeprägte Unterschiede in Bezug auf ihre Reaktion gegenüber einer GH-Austauschtherapie zeigen. Sie legten nahe, dass diese Unterschiede in Betracht gezogen werden sollten, falls die Behandlung von GHD-Patienten optimiert wird.

In der Maus beginnt die GH-Expression am embryonalen Tag 15,5, mit einem starken Anstieg der Anzahl an Somatotropen und Signalintensitäten bis zum Tag 17,5.

Vorläufer eines jeden der verschiedenen Hormon-produzierenden Zelltypen sind früh in der Hypophysenentwicklung festgelegt (Japon et al., 1994).

Morgan et al. (1987) zeigten, dass retroviral-vermittelter Gentransfer für die Einbringung eines rekombinanten menschlichen GH1-Gens in menschliche Keratinozyten in Kultur verwendet werden kann. Die transduzierten Keratinozyten sekretierten biologisch aktives GH in das Kulturmedium. Bei der Verpflanzung als epitheliale Schicht auf athymische Mäuse, stellten diese kultivierten Keratinozyten eine normal erscheinende Epidermis her, aus der jedoch menschliches Wachstumshormon extrahiert werden konnte. Transduzierte Epidermiszellen könnten ein allgemeiner Träger für die Bereitstellung von Genprodukten durch eine Verpflanzung sein.

Das Aufkommen der transgenen Technologie stellte Verfahren zur Herstellung pharmazeutischer Wirkstoffe durch Isolierung von Proteinen aus dem Blut transgener Tiere bereit. Man konzentrierte sich auf die Brustdrüse als Bioreaktor, da Milch einfach von milchgebenden Tieren gewonnen werden kann und die Proteinproduktion 1 kg pro Tag bei Rindern und 200 g pro Tag bei Ziegen erreichen kann. Brustdrüsen-spezifische Promotoren wurden in transgenen Tieren verwendet, um eine Expression des Transgens auf die Brustdrüse zu begrenzen. Archer et al. (1994) verwendeten Gentherapieverfahren, um ein Fremdgen zu einem einzigen Organ zu bringen. Sie brachten replikationsdefiziente Retroviren, die das Gen für menschliches Wachstumshormon trugen, über den Zitzenkanal während eines Zeitraums einer Hormoninduzierten Mammogenese direkt durch eine Infusion in die Brustdrüse von Ziegen ein. Dies führte bei einer Fortsetzung der Milchgabe am Tage 14 der Behandlung zu einer Sekretion von menschlichem GH in die Milch.

Smith et al. (1997) zeigten eine Funktion von GH bei der retinalen Neovaskularisierung, die Hauptursache einer nicht-behandelbaren Erblindung. Sie fanden heraus, dass retinale Neovaskularisierung in transgenen Mäusen, die ein GH-Antagonistengen exprimierten und in normalen Mäusen, denen ein Hemmstoff der GH-Sekretion verabreicht worden war, gehemmt wurde. In diesen Mäusen wurde retinale Neovaskularisierung umgekehrt proportional zu den Serummengen an GH und IGF1 gehemmt. Die Hemmung wurde durch Verabreichung von exogenem IGF1 rückgängig gemacht. Eine GH-Hemmung verringerte nicht die Expression von Hypoxie-stimuliertem retinalem vaskulärem Endothel-Wachstumsfaktor (VEGF) oder VEGF-Rezeptor (VEGFR). Smith et al. (1997) legten nahe, dass eine systemische Hemmung von GH oder IGF1 oder beiden eine therapeutische Möglichkeit für die Prävention einiger Formen von Retinopathie sein könnte.

Bei Mäusen, die homozygot für die kleine Mutation des Gens für den Wachstumshormon-freisetzendes Hormon-Rezeptor sind, Ghrhr^lit, fehlen den Somatotropen sekretorische Granula, während den Ames-Zwerg (Prop1^df)- und Snell- Zwerg (Pit1^dw)-Homozygoten Somatotrope vollständig fehlen. Den letzteren beiden Zwergtypen fehlen auch GH-Transkripte, während Mäuse mit der kleinen Mutation eine Defizienz für derartige Transkripte zeigten (Cheng et al., 1983). Nicht-eindeutige Zellen, die entweder Somatotrope oder Mammotrope (Prolaktin-sekretierende Zellen) in Hypophysen von Snell-Zwergmäusen darstellen, enthalten nur Granula mit adrenokortikotropem Hormon (Wilson et al., 1993).

Mäuse, die das GH-Gen aus Rind tragen, exprimieren das Hormon transgen im Herzen und in der gestreiften Muskulatur in einem Alter von 5-6 Wochen, und zeigen ein verstärktes Wachstum ab einem Alter von 6 Wochen. Es gibt keine pathologischen Wirkungen auf das Myokard oder die Fasern der gestreiften Muskulatur, ältere Tiere weisen jedoch eine schwere Glomerulosklerose und einen veränderten Lebermetabolismus auf (Conti et al., 1995). Wachstumshormon von transgenen normalen und zwergmutanten Rindern besitzt verschiedene Wirkungen bei auf starkes Wachstum selektierten und nicht-selektierten Mäuselinien. GH von normalen Rindern erhöht das Wachstum stärker in den nicht-selektierten Linien als in den selektierten Linien, obwohl es immer noch eine signifikante Erhöhung bei der selektierten Linie gibt. Das GH der zwergmutanten Rinder verringert das Wachstum bei den selektierten Mäusen stärker als bei der nicht-selektierten Linie und verringert oder beseitigt auch das stärkere Wachstum, das in männlichen gegenüber den weiblichen Nachkommen beobachtet wurde (Eisen et al., 1993).

Allele Unterschiede, die durch eine Variation der Restriktionsfragmentlängen identifiziert wurden, treten bei Inzucht-Mäusestämmen auf (Elliot et al., 1990). Gh wurde bei Verwendung somatischer Zellhybride auf Chr 11 in der Maus kartiert (Jackson- Grusby et al., 1988). Intraspezifische und intersubspezifische Rückkreuzungen bestätigen die Lokalisation von Gh auf dem distalen Teil von Chr 11 (Elliot et al., 1990), obwohl Gene für andere Hormone dieser Familie auf Chr 13 liegen (Jackson-Grusby et al., 1988).

Fälle, bei denen Wachstumshormon fehlt oder defizient ist, einschließlich Illig-Typ- Defizienz (Cogan et al., 1993) und Kowarsky-Syndrom (Takahashi et al., 1996) wurden Mutationen des Gens für das menschliche Wachstumshormon GH zugeordnet, das auf Chr 17q liegt (George et al., 1981).

Es gibt kein Tiermodell mit einer Mutation in endogenem Wachstumshormon, das menschliche Erkrankungen wiedergeben könnte, die mit Wachstumshormondefizienz in Verbindung stehen.

Das zuvor Gesagte zeigt, dass ein Erfordernis für ein Tiermodell für die Untersuchung der Defekte besteht, die mit der Bioinaktivität von Wachstumshormon in Verbindung stehen.

Dieses technische Problem wird durch den Gegenstand der Erfindung gelöst.

Beschreibung der Erfindung Zusammenfassung der Erfindung

Die Erfindung stellt ein nicht-menschliches Tier bereit, das als Modell für Wachstumsverzögerung und Defekte der Informationsverarbeitung (kognitive Funktion) verwendbar ist. Das erfindungsgemäße Tier trägt ein mutiertes Wachstumshormongen, das für ein Wachstumshormon mit einer im Vergleich zur Wildtypsequenz modifizierten Aminosäuresequenz kodiert. Ferner stellt die Erfindung Wachstumshormone mit einer im Vergleich zur Wildtypsequenz modifizierten Aminosäuresequenz bereit und dafür kodierende Nukleinsäuren.

Die Erfindung betrifft auch die Verwendung des erfindungsgemäßen Tiermodells für die Untersuchung von Störungen, die mit einer Defizienz der Wachstumshormonaktivität in Verbindung stehen, vorzugsweise Defekte der Informationsverarbeitung (kognitive Funktion) und insbesondere Wachstumsverzögerung und -defizienz, sowie für die Auftrennung des Wirkmechanismus-Weges von Wachstumshormon, insbesondere die Identifikation von verwandten oder stromabwärts gelegenen Genen und Proteinen, die an der Informationsverarbeitung und dem Zellwachstum beteiligt sind.

In einem weiteren Aspekt stellt die Erfindung ein Verfahren zum Screening von präventiven oder therapeutischen Stoffen für Störungen und Symptome, die mit einer Defizienz der Wachstumshormonaktivität, Wachstumsverzögerung oder -defizienz, Zwergwuchs, Illig-Typ-Krankheit, Kowarsky-Syndrom, Störungen in Bezug auf Informationsverarbeitung und kognitive Funktion, Osteoporose und kardiovaskulären Erkrankungen in Verbindung stehen, bereit, wobei das erfindungsgemäße Tiermodell verwendet wird.

In einem weiteren Aspekt stellt die Erfindung Zelllinien bereit, die von dem erfindungsgemäßen Tiermodell abstammen.

Detaillierte Beschreibung der Erfindung

Die Erfindung stellt ein nicht-menschliches Tiermodell bereit, das ein im Vergleich mit der Aminosäuresequenz des Wildtypproteins modifiziertes Wachstumshormonprotein exprimiert. Das exprimierte Wachstumshormon kann Ähnlichkeit in Sequenz und Sekundärstruktur mit Vertebraten-Wachstumshormon besitzen, einschließlich in nicht beschränkender Weise Säuger-Wachstumshormone, vorzugsweise Wachstumshormon aus Rind und Ratte, und insbesondere Wachstumshormon aus Maus. Das Tier gehört vorzugsweise zu einer Gattung ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Mus (wie Mäuse), Rattus (wie Ratten), Oryctologus (wie Kaninchen) und Mesocricetus (wie Hamster). In einer besonders bevorzugten Ausführungsform ist das Tier eine Maus. Tiere, die ein mutiertes Wachstumshormongen tragen, das modifiziertes Wachstumshormon exprimiert, zeigen eine oder mehrere der nachstehenden phänotypischen Eigenschaften:

- Proportionale, verkürzte Körpermaße, charakterisiert durch ein(e) geringere(s) Körpergewicht und -länge und verringerte Größe aller Körperteile und -organe
- Nicht-proportionale verringerte Größe und gestörte Histologie der vorderen Hypophyse
- Niedrige IGF-1 Plasmaspiegel
- GH-Plasmaspiegel, die mit denen von Wildtyp-Tieren vergleichbar sind (subnormal)
- Verringerter O₂-Verbrauch
- Normale Körpertemperatur
- Verringerte oder defekte kognitive Funktionen und Kapazität der Informationsverarbeitung

Der Begriff "modifiziert" betrifft erfindungsgemäß eine Veränderung gegenüber dem Wildtyp.

Der Begriff "Phänotyp" betrifft erfindungsgemäß eine Gruppe von morphologischen, physiologischen, Verhaltens- und biochemischen Merkmalen, die eine Zelle oder ein Organismus besitzt und die sich aus der Zusammenwirkung des Genotyps mit der Umgebung ergeben. Somit zeigt das erfindungsgemäße Tiermodell einfach zu erkennende Abnormalitäten. In einer bevorzugten Ausführungsform zeigt das erfindungsgemäße Tier 2, vorzugsweise 4, insbesondere 6 und am besten alle der vorstehend aufgelisteten phänotypischen Merkmale.

Erfindungsgemäß wurden Mäuse geschaffen, die eine Punktmutation im Sten Exon des Mäuse-Wachstumshormongens, wie in SEQ ID NO : 1 des Sequenzprotokolls gezeigt, tragen, wodurch der Asparaginsäurerest an der Position 193 in der vierten Helixdomäne am C-Terminus des Proteins ersetzt wird. Position 193 betrifft erfindungsgemäß das nicht-reife Protein. Jedoch wird der Fachmann erkennen, dass auch das reife Protein erfindungsgemäß umfasst ist und in dem erfindungsgemäßen Tiermodell exprimiert werden kann, das sich aus der Abspaltung der ersten 26 Aminosäuren ergibt. Diese Modifikation des Wachstumshormons ergibt die vorstehend genannten phänotypischen Merkmale. Der Asparaginsäurerest an Position 193 in der Aminosäuresequenz von SEQ ID NO : 1 ist bei den Wachstumshormonen verschiedener Spezies konserviert, wie in dem in Fig. 9 gezeigten Alignment verschiedener Mitglieder der Wachstumshormonfamilie zu erkennen ist.

Somit trägt das erfindungsgemäße nicht-menschliche Tiermodell eine für Wachstumshormon kodierende Nukleinsäuresequenz, wobei das Kodon für die Aminosäure an Position 193 der in SEQ ID NO : 1 gezeigten Aminosäuresequenz oder das dieser Position in anderen Wachstumshormonen entsprechende Kodon, das einen Asparaginsäurerest im Wildtyp kodiert, mutiert ist und eine andere Aminosäure als Asparaginsäure kodiert. In einer bevorzugten Ausführungsform exprimiert das erfindungsgemäße Tiermodell die in SEQ ID NO : 3 gezeigte Aminosäuresequenz. "Nukleinsäüresequenz" bedeutet hier eine aufeinanderfolgende Sequenzserie von Nukleotidbasen und kann eine Ribonukleinsäure oder Desoxyribonukleinsäure sein. Vorzugsweise ist die Nukleinsäuresequenz cDNA. Der Ausdruck "entspricht dieser Position in anderen Wachstumshormonen" betrifft die Aminosäureposition von Wachstumshormonen verschiedener Spezies, die mit dem Asparaginsäurerest an Position 193 der in SEQ ID NO : 1 gezeigten Aminosäuresequenz in einem Homologiealignment übereinstimmt; vgl. Fig. 9.

In einer bevorzugten Ausführungsform trägt das erfindungsgemäße Tiermodell eine modifizierte Wachstumshormonnukleinsäuresequenz, die von einem Wirbeltier, vorzugsweise einem Säuger, insbesondere Maus stammt. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform ist die Nukleinsäuresequenz von der in SEQ ID NO : 1 des Sequenzprotokolls gezeigten Nukleinsäuresequenz abgeleitet.

Vorzugsweise ist der Asparaginsäurerest des erfindungsgemäßen modifizierten Wachstumshormonproteins durch eine Aminosäure mit einer anderen Größe und/oder Polarität ersetzt; d. h. eine nicht-konservative Aminosäuresubstitution. Nicht konservative Substitutionen werden als Austausch einer Aminosäure durch eine andere, in einer anderen wie nachstehend gezeigten Gruppe aufgeführte Aminosäure definiert:

1. kleine aliphatische, nicht-polare oder leicht-polare Reste: Ala, Ser, Thr (Pro, Gly)
2. negativ geladene Reste und ihre Amide: Asn, Asp, Glu, Gln
3. positiv geladene Reste: His, Arg, Lys
4. große aliphatische, nicht-polare Reste: Met, Leu, Ile, Val (Cys)
5. große aromatische Reste: Phe, Tyr, Trp.

Drei Reste sind aufgrund ihrer besonderen Rolle für die Proteinarchitektur in Klammern gesetzt. Gly ist der einzige Rest ohne eine Seitenkette und verleiht der Kette somit Flexibilität. Pro besitzt eine ungewöhnliche Geometrie, die die Kette stark einschränkt. Cys kann eine Disulfidbrücke bilden.

Vorzugsweise wird der Asparaginsäurerest des erfindungsgemäßen Wachstumshormons durch eine andere Aminosäure als Asn, Glu, Gln ersetzt, und vorzugsweise durch eine Aminosäure ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Alanin, Serin, Threonin, Prolin und Glycin, insbesondere durch Prolin, Alanin und Glycin und am besten durch Glycin. In der am meisten bevorzugten Ausführungsform besitzt das in dem erfindungsgemäßen Tiermodell exprimierte Wachstumshormon die in SEQ ID NO : 4 gezeigte Aminosäuresequenz.

Das erfindungsgemäße Tiermodell exprimiert vorzugsweise ein modifiziertes Wachstumshormonprotein in allen seinen Zellen, und insbesondere in azidophilen Zellen der Hypophyse, jedoch sind Tiere, die das modifizierte Wachstumshormonprotein in manchen, jedoch nicht allen Zellen exprimieren, und die zelluläre Mosaiktiere genannt werden, auch umfasst. Die Erfindung stellt ferner durch Inzucht geschaffene, sukzessive Tierlinien bereit, die die erfindungsgemäße mutante Wachstumshormonnukleinsäure tragen und den Vorteil eines scheinbar homogenen genetischen Hintergrunds bieten. Eine genetisch homogene Tierlinie stellt ein funktionell reproduzierbares Modellsystem für Störungen oder Symptome bereit, die mit einer Defizienz der Wachstumshormonaktivität in Verbindung stehen, vorzugsweise Störungen der Informationsverarbeitung oder kognitiven Funktion und insbesondere Wachstumsverzögerung oder -defizienz.

Die Erfindung ist nicht auf die Modifikation des Asparaginsäurerestes an Position 193 der in SEQ ID NO : 1 gezeigten Aminosäuresequenz oder an der entsprechenden Position in anderen Wachstumshormonen beschränkt, die nötig ist, um den erfindungsgemäßen Tieren den gewünschten Phänotyp zu verleihen. Vielmehr sind zusätzliche Mutationen in dem Wachstumshormon umfasst, sofern sie nicht zu einem Verlust des Phänotyps führen. Derartige Mutationen umfassen einzelne oder mehrere weitere Aminosäuresubstitutionen, -deletionen und -insertionen. Erfindungsgemäße Aminosäureinsertionsderivate umfassen amino- und/oder carboxyterminale Fusionen, sowie Insertionen von einzelnen oder mehreren Aminosäuren in der Sequenz. Bei Aminosäuresequenzvarianten mit einer Insertion werden ein oder mehrere Aminosäurereste in eine vorbestimmte Stelle in dem Protein eingebracht, obwohl eine zufällige Insertion mit geeignetem Screening des resultierenden Produkts auch möglich ist. Varianten mit einer Deletion sind durch die Entfernung von einer oder mehreren Aminosäuren aus der Sequenz charakterisiert. Bei Aminosäurevarianten mit einer Substitution wurde wenigstens ein Rest in der Sequenz entfernt und ein anderer Rest an dessen Stelle eingefügt. Vorzugsweise ist das erfindungsgemäße Wachstumshormon wenigstens 40%, vorzugsweise wenigstens 50%, insbesondere wenigstens 80% und am besten wenigstens 90% zu der Wildtyp- Wachstumshormonsequenz aus Wirbeltieren, vorzugsweise Säugern, insbesondere Rind, Ratte und insbesondere Maus (SEQ ID NO : 1) homolog. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform ist das Polypeptid mit der Wildtyp-Sequenz identisch, mit der Ausnahme des Austauschs des Asparaginsäurerestes an Position 193 der in SEQ ID NO : 1 gezeigten Aminosäuresequenz oder an der entsprechenden Position in anderen Wachstumshormonsequenzen. Bevorzugte Modifikationen der erfindungsgemäßen Wachstumshormonaminosäuresequenz, zusätzlich zu der Modifikation an Position 193 der in SEQ ID NO : 1 gezeigten Aminosäuresequenz oder an einer entsprechenden Position, befinden sich an Positionen, die unter den Wachstumshormonen von Wirbeltieren nicht konserviert sind. Vorzugsweise ersetzen derartige Modifikationen eine Aminosäure durch eine mit einer ähnlichen Größe und Polarität. Bei einer Betrachtung, welche zusätzlichen Substitutionen erfolgen können, kann man zuerst die Analysen der Häufigkeiten von Aminosäureveränderungen zwischen homologen Proteinen verschiedener Organismen betrachten. Basierend auf derartigen Analysen, werden konservative Substitutionen als Austausch innerhalb der nachstehend gezeigten Gruppen definiert:

Drei Reste sind aufgrund ihrer besonderen Rolle für die Proteinarchitektur in Klammem gesetzt. Gly ist der einzige Rest ohne eine Seitenkette und verleiht der Kette somit Flexibilität. Pro besitzt eine ungewöhnliche Geometrie, die die Kette stark einschränkt. Cys kann eine Disulfidbrücke bilden.

Man wird erkennen, dass das erfindungsgemäße Tiermodell eine erfindungsgemäße mutierte Wachstumshormonnukleinsäure tragen kann, die von der gleichen oder von einer anderen Spezies stammt. Vorzugsweise ist die erfindungsgemäße mutierte Wachstumshormonnukleinsäure in den erfindungsgemäßen Tieren homozygot. Vorzugsweise unterliegt die Transkription des erfindungsgemäßen mutierten Wachstumshormongens einer Kontrolle durch die Promotorsequenz, die die Transkription der endogenen Wildtypsequenz des Tieres kontrolliert, es kann jedoch auch ein anderer Promotor verwendet werden.

Die erfindungsgemäßen Tiere können in an sich bekannter Weise hergestellt werden, einschließlich durch in nicht beschränkender Weise Mikroinjektion, Elektroporation, Zellkanone, Zellfusion, Mikroinjektion von Teratokarzinom-Stammzellen oder funktionell gleichen embryonalen Stammzellen in Embryos usw. Die erfindungsgemäßen Tiere können durch Verfahren hergestellt werden, die zu einem Tier mit einem Genom führen, das exogenes genetisches Material so inkorporiert/integriert, dass die Funktion des normalen Wachstumshormons modifiziert oder zerstört wird. Das Verfahren kann die Gewinnung von genetischem Material oder einen Teil davon umfassen, das ein Wachstumshormon kodiert. Die isolierte native Sequenz wird sodann durch Insertion von Mutationen, die für den Austausch des Asparaginsäurerestes an der Position 193 der in SEQ ID NO : 1 gezeigten Aminosäuresequenz (SEQ ID NO : 3) oder des entsprechenden Restes anderer Wachstumshormone genetisch verändert. Das veränderte Konstrukt kann dann in embryonale Stammzellen zum Beispiel durch Elektroporation inseriert werden. Die Zellen, die diesem Verfahren unterzogen wurden, werden zum Auffinden positiver Zellen, d. h. Zellen, in deren Genom das gewünschte, für das veränderte Wachstumshormon kodierende Konstrukt inseriert wurde, gescreent. Die positiven Zellen können isoliert, kloniert (oder vermehrt) und in Blastozysten aus einem Wirtstier der gleichen oder einer anderen Spezies injiziert werden. Zum Beispiel werden positive Zellen in Blastozysten von Mäusen injiziert. Die Blastozysten werden sodann in ein weibliches Wirtstier gebracht und zur Geburt angewachsen. Die Nachkommen des Weibchens werden getestet, um zu bestimmen, welche Tiere transgen sind, d. h. in welches Tier die exogene mutierte DNA-Sequenz inseriert wurde. Ein Verfahren umfasst das Einbringen des rekombinanten Gens im Stadium der gereiften Oozyte, was sicherstellt, dass die Gensequenz in allen Keim- und Somazellen des "Gründer"-Tieres vorhanden sein wird. "Gründer"-Tier bedeutet hier das Tier, in das das rekombinante Gen im Stadium des einzelligen Mausembryos eingebracht worden war.

Die Erfindung stellt auch eine modifizierte Wachstumshormonaminosäuresequenz bereit, wobei der Wildtyp-Asparaginsäurerest an Position 193 der in SEQ ID NO : 1 gezeigten Aminosäuresequenz oder an der entsprechenden Position in anderen Wachstumshormonsequenzen durch einen anderen Aminosäurerest ersetzt ist und dafür kodierende Nukleinsäuresequenzen. Vorzugsweise besitzt das modifizierte Wachstumshormon die in SEQ ID NO : 3 gezeigte Aminosäuresequenz. Vorzugsweise stammt das Wachstumshormon aus einem Säuger, insbesondere aus einer Maus. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform ist die Aminosäuresequenz von der in SEQ ID NO : 1 des Sequenzprotokolls gezeigten Aminosäuresequenz abgeleitet.

Vorzugsweise ist der Asparaginsäurerest des modifizierten Wachstumshormonproteins durch eine Aminosäure mit einer anderen Größe und/oder Polarität ersetzt; d. h. eine nicht-konservative Aminosäuresubstitution. Nichtkonservative Substitutionen werden als Austausch einer Aminosäure durch eine andere, in einer anderen wie nachstehend gezeigten Gruppe aufgeführte Aminosäure definiert:

Vorzugsweise wird der Asparaginsäurerest des erfindungsgemäßen Wachstumshormons durch eine andere Aminosäure als Asn, Glu, Gln ersetzt, und vorzugsweise durch eine Aminosäure ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Alanin, Serin, Threonin, Prolin und Glycin, insbesondere durch Prolin, Alanin und Glycin und am besten durch Glycin. In der am meisten bevorzugten Ausführungsform besitzt das erfindungsgemäße Wachstumshormon die in SEQ ID NO : 4 gezeigte Aminosäuresequenz.

Die Erfindung ist nicht auf die Modifikation des Asparaginsäurerestes an Position 193 der in SEQ ID NO : 1 gezeigten Aminosäuresequenz oder an der entsprechenden Position in anderen Wachstumshormonen beschränkt. Vielmehr sind zusätzliche Mutationen in dem Wachstumshormon umfasst. Derartige Mutationen umfassen einzelne oder mehrere weitere Aminosäuresubstitutionen, -deletionen und -insertionen wie vorstehend definiert. Vorzugsweise ersetzen solche Veränderungen eine Aminosäure durch eine mit einer ähnlichen Größe und Polarität. Vorzugsweise ist das Polypeptid wenigstens 40%, vorzugsweise wenigstens 50%, insbesondere wenigstens 80% und am besten wenigstens 90% zu der Wildtyp-Wachstumshormonsequenz homolog. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform ist das Polypeptid mit der Wildtyp-Sequenz identisch, mit Ausnahme des Austauschs des Asparaginsäurerestes an Position 193 der in SEQ ID NO : 1 des Sequenzprotokolls gezeigten Aminosäuresequenz oder an der entsprechenden Position in anderen Wachstumshormonsequenzen. Bevorzugte Modifikationen der Aminosäuresequenz, zusätzlich zu dem Austausch an Position 193 der in SEQ ID NO : 1 gezeigten Aminosäuresequenz oder an einer entsprechenden Position in anderen Wachstumshormonen, befinden sich an Positionen, die unter den Wachstumshormonen von Wirbeltieren nicht konserviert sind. Bei einer Betrachtung, welche zusätzlichen Substitutionen erfolgen können, kann man zuerst die Analysen der Häufigkeiten von Aminosäureveränderungen zwischen homologen Proteinen verschiedener Organismen betrachten. Basierend auf derartigen Analysen, werden konservative Substitutionen als Austausch innerhalb der nachstehend gezeigten Gruppen definiert:

Die Erfindung stellt auch ein diagnostisches Verfahren für eine Defizienz der Wachstumshormonaktivität bereit.

In einer Ausführungsform basiert das Prinzip des Verfahrens auf der Identifizierung des modifizierten Wachstumshormons, wobei die Modifikation mit dem Austausch einer Aminosäure an einer Position, die der Position 193 in der in SEQ ID NO : 1 gezeigten Aminosäuresequenz entspricht, in Verbindung steht. Dies umfasst in nicht beschränkender Weise jedes bekannte Verfahren, das veränderte konformationelle Eigenschaften der erfindungsgemäßen Aminosäuresequenz im Vergleich zum Wildtyp- Wachstumshormon identifiziert, wie die spezifische Erkennung des modifizierten Proteins durch andere Proteine, insbesondere Antikörper, das Aminosäuresequenz- Spaltmuster durch alle bekannten Proteasen oder Chemikalien, mit dem Aminosäurematerial eines Patienten, direkt oder nach einer Extraktion, Isolierung und/oder Reinigung durch Standardverfahren der erfindungsgemäßen Aminosäuresequenz.

In einer weiteren erfindungsgemäßen Ausführungsform basiert das Prinzip des erfindungsgemäßen diagnostischen Verfahrens auf dem Nachweis einer Nukleinsäuresequenz, die für das erfindungsgemäße modifizierte Wachstumshormon kodiert. Dies umfasst in nicht beschränkender Weise jedes bekannte Verfahren, das Nukleinsäure-hybridisierende Eigenschaften verwendet, wie Northern-Blot, Southem- Blot, Nukleinsäure(genomische DNA, cDNA, mRNA, synthetische Oligonukleotide)- Microarray-Standardverfahren und Nukleinsäurespaltmuster durch alle bekannten Restriktionsenzyme, vorzugsweise PpuMI und in einer besonders bevorzugten Ausführungsform Avall.

Die erfindungsgemäßen Aminosäuresequenzen können mit bekannten Peptidsynthesetechniken, wie Festphasenpeptidsynthese (Merrifield, 1964) oder durch rekombinante DNA-Verfahren hergestellt werden. Verfahren zur Herstellung von Substitutionsmutationen an vorbestimmten Stellen in DNA mit einer bekannten Sequenz sind bekannt und umfassen zum Beispiel M13-Mutagenese. Die Veränderung von DNA- Sequenzen zur Herstellung von Variantenproteinen, die sich durch eine Substitution, Insertion oder Deletion auszeichnen, ist zum Beispiel in Sambrook et al. (1989) beschrieben.

Die Erfindung stellt auch Nukleinsäuresequenzen bereit, die für die vorstehend beschriebenen modifizierten Wachstumshormone kodieren. Vorzugsweise hybridisieren die erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenzen mit einer Wildtyp- Nukleinsäuresequenz, die für Wachstumshormon kodiert und/oder besitzen wenigstens 40%, vorzugsweise wenigstens 50%, insbesondere wenigstens 80% und am besten wenigstens 90% Sequenzhomologie mit einer Wildtyp-Nukleinsäuresequenz, die für Wachstumshormon kodiert, insbesondere mit der in SEQ ID NO : 1 gezeigten Nukleinsäuresequenz. In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform ist die erfindungsgemäße Nukleinsäuresequenz in Bezug auf die Wildtyp- Nukleinsäuresequenz degeneriert.

Die erfindungsgemäßen, Wachstumshormon-kodierenden Nukleinsäuresequenzen können alleine oder in Kombination mit anderen Nukleinsäuren, wie Vektormolekülen, vorliegen.

Die erfindungsgemäßen Tiere zeigen einen Phänotyp, dessen Charakteristika für viele Symptome repräsentativ sind, die mit menschliche Wachstumshormondefizienz assoziierten Störungen in Verbindung stehen, was das erfindungsgemäße Tiermodell zu einem besonders geeigneten Modell für die Untersuchung dieser Erkrankungen macht.

Insbesondere zeigt das erfindungsgemäße Tiermodell einen Phänotyp, der durch ein reduziertes Gewicht, proportionale, verkürzte Körpermaße und eine geringere Größe alter Körperteile und -organe charakterisiert ist, die alle phänotypische Charakteristika menschlicher Erkrankungen oder Symptome sind, die mit einer Wachstumshormondefizienz, insbesondere Wachstumsverzögerungs- und - defizienzerkrankungen, wie Zwergwuchs, Laron Syndrom, Illig-Typ-Krankheit, Kowarsky-Syndrom in Verbindung stehen.

Da die erfindungsgemäßen Tiere Wachstumshormon-Plasmaspiegel aufweisen, die denen von Wildtyp-Tieren vergleichbar sind, zeigen sie ferner Symptome, die denjenigen ähnlich sind, die menschliche Störungen einer Wachstumsverzögerung oder -defizienz betreffen, die sich durch das Auftreten von normalen oder subnormalen Plasmaspiegel des Wachstumshormon-Genprodukts, assoziiert mit einer Bioinaktivität des Wachstumshormons, wie Illig-Typ-Krankheit und Kowarsky-Syndrom auszeichnen.

Weiterhin wurde eine verminderte Knochenmineraliendichte (BMD) für Patienten mit einer isolierten GHD und/oder multiplen Hypophysenhormondefizienzen beschrieben. Eine signifikante Verminderung von BMD, in Verbindung mit Abnormalitäten der Knochenumsetzungsparameter wurde nur in Patienten mit einer sehr schweren oder schweren GHD aufgefunden, während normale BMD-Werte in nicht-GHD Hypopituitarismus-Patienten aufgefunden wurden (Calao et al., 1999). Diese Abnormalitäten traten übereinstimmend in allen Patienten mit GHD auf, ohne Rücksicht auf das Auftreten von zusätzlichen Hormonfehlern, was nahe legt, dass GHD eine zentrale Rolle bei der Entwicklung von Osteopenie bei Hypopituitarismus-Patienten spielt (Tobiume et al., 1997). Die erfindungsgemäßen Tiere besitzen eine verkleinerte vordere Hypophyse und dünne kortikale Knochen. Daher können die erfindungsgemäßen Tiere für die Untersuchungen von Krankheiten und Symptomen verwendet werden, die mit einer Defizienz der Hypophyse und/oder vermindertem BMD und/oder Osteoporose in Verbindung stehen.

Schließlich wurde beim Menschen gezeigt, dass niedrige Plasmaspiegel an IGF-1 mit Defekten der kognitiven Funktion und der Informationsverarbeitung in Wechselbeziehung stehen. Ältere Menschen, denen IGF-1 verabreicht wurde, zeigten wieder ein verbessertes Vermögen zur Informationsverarbeitung und für kognitive Funktionen. Ferner wurde ein erhöhter Blutdruck und verstärkte myokardiale Kontraktilität für Mäuse mit einer schweren IGF-1-Defizienz beschrieben (Lembo et al., 1996), während mehrere Beweislinien beim Menschen und bei Ratten eine wichtige Rolle von IGF-1 bei der kardiovaskulären Physiologie nahelegten (Copeland et al., 1994; Wahlander et al., 1992; Duerr et al., 1995; Cittadini et al., 1996; Pfeifer et al., 1999). Daher können die erfindungsgemäßen Tiere auch für die Untersuchung von Erkrankungen und Symptomen davon oder von Symptomen, die mit niedrigen Plasmaspiegeln von IGF-1 in Verbindung stehen, wie Wachstumsverzögerung und - defizienz, Störungen des Glukosemetabolismus, Defekte der kognitiven Funktion und der Informationsverarbeitung und kardiovaskuläre Störungen verwendet werden.

Die erfindungsgemäßen Tiere können daher als Model für die Untersuchung von Erkrankungen oder Symptomen verwendet werden, die mit einer Defizienz der Wachstumshormonaktivität oder IGF-1-Defizienz in Verbindung stehen, wie Wachstumsverzögerung oder -defizienz, insbesondere Zwergwuchs, Illig-Typ- Krankheit, Laron-Syndrom und Kowarsky-Syndrom, Defizienz der Hypophyse, verminderter BMD, Osteoporose, Defekte der Informationsverarbeitung und der kognitiven Funktionen, Störungen des Glukosemetabolismus und kardiovaskuläre Störungen. Insbesondere können manche phänotypischen Charakteristika des erfindungsgemäßen Tiermodells, einschließlich in nicht beschränkender Weise IGF-1- Plasmaspiegel, Wachstumsrate, Kapazität der kognitiven Funktion und der Informationsverarbeitung über einen langen Zeitraum und in verschiedenen Umgebungen aufgezeichnet werden, um das Profil und das Fortschreiten derartiger Erkrankungen in einem gesteuerten und standardisierten Umfeld zu bestimmen, was die Bestimmung des Einflusses externer Umweltfaktoren erlaubt.

Die erfindungsgemäßen Tiere können auch für die Identifizierung von frühen diagnostischen Markern für Erkrankungen, die mit einer Defizienz der Wachstumshormonaktivität oder IGF-1-Defizienz in Verbindung stehen, wie Wachstumsverzögerung oder -defizienz, insbesondere Zwergwuchs, Laron-Syndrom, Illig-Typ-Krankheit und Kowarsky-Syndrom, Defizienz der Hypophyse, verminderter BMD, Osteoporose, Defekte der Informationsverarbeitung und der kognitiven Funktionen, Störungen des Glukosemetabolismus und kardiovaskuläre Störungen verwendet werden. Die Identifikation von Surrogatmarkern, einschließlich in nicht beschränkender Weise Ribonukleinsäuren oder Proteine, kann durch jedes bekannte Verfahren der Proteom- oder Genexpressionsanalyse erfolgen. Verfahren der Proteomanalyse umfassen in nicht beschränkender Weise ELISA, 2D-Gel, Protein- Mikroarrays oder Massenspektrometrie-Analyse einer jeden Organ- oder Gewebeprobe, wie Blutproben oder Derivate davon, vorzugsweise Blut, zu einem unterschiedlichen Alter oder Stadium der Entwicklung von Erkrankungen, die mit einer Defizienz der GH- Aktivität in Verbindung stehen, oder der Symptome davon. Als weiteres Beispiel umfassen Verfahren der Genexpressionsanalyse in nicht beschränkender Weise Differential Display, cDNA-Mikroarrays, Analyse der Qualität und Quantität der Ribonukleinsäuren aus irgendeiner Organ- oder Gewebeprobe, wie Blutproben oder Derivate davon zu einem unterschiedlichen Alter oder Stadium der Entwicklung von Erkrankungen, die mit einer Defizienz der GH-Aktivität in Verbindung stehen, oder der Symptome davon.

Das erfindungsgemäße Tiermodell kann auch für die Aufzeichnung der Aktivität von Stoffen verwendet werden, die für die Prävention oder Behandlung der vorstehend genannten Erkrankungen oder Symptome verwendbar sind, wie Wachstumsverzögerung oder -defizienz, insbesondere Zwergwuchs, Laron-Syndrom, Illig-Typ-Krankheit und Kowarsky-Syndrom, Defizienz der Hypophyse, verminderter BMD, Osteoporose, Defekte der Informationsverarbeitung und der kognitiven Funktionen, Störungen des Glukosemetabolismus und kardiovaskuläre Störungen. Der zu testende Stoff kann einem erfindungsgemäßen Tier verabreicht und zum Beispiel die Wachstumsrate, der IGF-1-Plasmaspiegel, die Kapazität der Informationsverarbeitung und/oder die kognitiven Funktionen des erfindungsgemäßen Tieres aufgezeichnet werden.

In einer weiteren Ausführungsform können die erfindungsgemäßen Tiere für das Testen von therapeutischen Stoffen gegen alle Störungen oder Symptome verwendet werden, von denen gezeigt wurde, dass sie mit einer Defizienz der Wachstumshormonaktivität oder mit einer IGF-1-Defizienz in Verbindung stehen.

Die erfindungsgemäßen Tiere können auch als Test-Modellsystem für Stoffe, einschließlich in nicht beschränkender Weise Chemikalien und Peptide, insbesondere Arzneistoffe, verwendet werden, die im Verdacht stehen, die vorstehend beschriebenen Erkrankungen, die mit einer Defizienz der Wachstumshormonaktivität in Verbindung stehen, zu verstärken oder zu erschweren. Zum Beispiel kann der Stoff dadurch getestet werden, dass das erfindungsgemäße Tier für verschiedene Zeit, Dosen und/oder Kombinationen derartiger Stoffe exponiert wird und die Wirkungen auf den Phänotyp des erfindungsgemäßen Tieres aufgezeichnet werden, einschließlich in nicht beschränkender Weise Wachstumsraten, IGF-1-Blutspiegel, Knochenmineralisierung, Kapazitäten der Informationsverarbeitung und der kognitiven Funktionen.

Weiterhin können die erfindungsgemäßen Tiere für die Auftrennung der molekularen Mechanismen des Weges der Wachstumshormonaktivität verwendet werden, das heißt für die Identifikation von stromabwärts gelegenen Genen oder Proteinen davon, die durch die Wachstumshormonaktivität reguliert werden und bei Störungen, die mit einer Defizienz der Wachstumshormonaktivität in Verbindung stehen, dereguliert sind, insbesondere die Gene und Proteine, die an zellulärem Wachstum und kognitiven Funktionen oder der Informationsverarbeitung beteiligt sind. Dies kann zum Beispiel durch differentielle Proteomanalyse erfolgen, wobei Techniken verwendet werden, die in nicht beschränkender Weise 2D-Gelanalyse, Protein-Chip-Mikroarrays oder Massenspektrometrie von Leber-, Fett- oder Gehirngeweben des erfindungsgemäßen Tieres umfassen, wie Leber-, Fett- oder Gehirnzellen, die alle den Wachstumshormonrezeptor (GHR) exprimieren und auf GH-Stimuli reagieren.

Das erfindungsgemäße Tiermodell kann für die Identifizierung und Klonierung sogenannter Modifiergene verwendet werden, die zur Modifizierung, Verschlimmerung, Verminderung oder Hemmung des Phänotyps fähig sind, der mit einer Defizienz der Wachstumshormonaktivität in Verbindung steht. Insbesondere kann für diesen Zweck das erfindungsgemäße Tiermodell mit Mäusen anderer Stämme gepaart werden, die einen anderen genetischen Hintergrund besitzen, was für die Möglichkeit sorgt, dass die Gene, die den Phänotyp modifizieren, kartiert werden. Zum Beispiel kann das erfindungsgemäße Tiermodell bei Produktion in einem C3HeB/Fe-Inzucht-Stamm- Hintergrund mit C57B1/6Jico-lnzucht-Mäusen gepaart werden. Die Hybridtiere dieser Nachkommenschaft werden sodann weiter gepaart, entweder in einer Rückkreuz- Strategie wieder mit C57BI/6Jico-Inzucht-Mäusen oder in einer Zwischenkreuz- Strategie untereinander. Das Modifiergen kann sodann kartiert und kloniert werden, unter Verwendung von Mikrosatelliten- oder SNP-Strategie mit den sich aus der Rückkreuzung oder Zwischenkreuzung ergebenden Mäusen, die in Bezug auf die Intensität des Phänotyps gruppiert wurden.

Die erfindungsgemäßen Tiere können auch als Quelle für Primärzellen, einschließlich alle Zelltypen und insbesondere die azidophilen Zellen der Hypophyse, für Zellkulturexperimente, einschließlich in nicht beschränkender Weise die Produktion von immortalisierten Zelllinien durch jedes bekannte Verfahren, wie retrovirale Transformation, verwendet werden. Zellen der Tiere können vorteilhafterweise gewünschte Eigenschaften sowohl normaler, als auch transformierter kultivierter Zellen zeigen, d. h. sie werden morphologisch und physiologisch normal oder nahezu normal sein, können jedoch für lange, möglicherweise unbestimmte Zeiträume kultiviert werden.

Die Erfindung stellt auch Primärzellen und davon abstammende Zelllinien bereit, die von den erfindungsgemäßen Tieren abstammen. Diese Primärzellen oder davon abstammende Zelllinien können für die Herstellung des erfindungsgemäßen Tiermodells verwendet werden.

In weiteren Ausführungsformen können Zelllinien durch Insertion eines Nukleinsäurekonstrukts, umfassend die erfindungsgemäße Nukleinsäuresequenz oder ein Fragment davon, umfassend das Kodon, das dem erfindungsgemäßen Tiermodell den vorstehend beschriebenen Phänotyp verleiht, hergestellt werden. Geeignete Zellen für eine Insertion umfassen aus einem Tier gewonnene Primärzellen und Zellen, die zu einer immortalisierten Zelllinie gehören. Die erfindungsgemäßen rekombinanten Nukleinsäurekonstrukte können in die Zellen durch jedes bekannte Verfahren eingebracht werden, einschließlich in nicht beschränkender Weise durch Transfektion, retrovirale Infektion, Mikroinjektion, Elektroporation, Transduktion, DEAE-Dextran. Zellen, die das rekombinante Konstrukt exprimieren, können zum Beispiel durch Verwendung eines zweiten rekombinanten Nukleinsäurekonstrukts, umfassend ein Reportergen, das zur Schaffung einer selektiven Expression gebraucht wird, identifiziert werden. Zellen, die die erfindungsgemäße Nukleinsäuresequenz oder ein Fragment davon exprimieren, können indirekt durch Nachweis der Expression des Reportergens identifiziert werden.

Weitere Merkmale und Vorteile der Erfindung werden aus den nachstehenden Beispielen und Ansprüchen deutlich werden.

Abbildungen:

Abb. 1 ist eine Aufnahme von SMA-1-Tieren verglichen mit Wildtypmäusen. Diese zeigt die proportionale Reduktion der Körpermaße der Mutante. +/+ C3HeB/FeJ Wildtypmaus, -/+ heterozygote und -/- homozygote C3HeB/FeJ-SMA1 Mutantenmäuse.

Abb. 2 stellt eine Wachstumskurve der Nachkommen von C3Heß/FeJ-SMA1 Tieren im Vergleich zu C3HeB/FeJ Wildtyp-Tieren dar. Deutlich ist zu erkennen, dass etwa die Hälfte der (C3HeB/FeJ-SMA1^+/- × C3HeB/FeJ-WT) Nachkommen ein geringeres Wachstum und ein geringeres Körpergewicht aufweisen. Dies zeigt ein dominantes Vererbungsmuster gemäß den Mendelschen Regeln einer genetischen Verteilung mit 100% Penetranz der Mutation.

Abb. 3 vergleicht die Längenmasse einiger Körperabschnitte der (C3HeB/FeJ-SMA1 × C3HeB/FeJ-WT) Nachkommen mit denen von C3HeB/FeJ Wildtypmäusen, was zeigt, dass die heterozygoten C3HeB/FeJ-SMA1 Mutanten-Mäuse proportional kleinere Körperteile besitzen.

Abb. 4 stellt die Insulin-ähnliche Wachstums-Faktor-1 (IGF-1) Konzentrationen im Plasma von heterozygoten C3HeB/FeJ-SMA1 Mutanten und C3HeB/FeJ-SMA1 oder Wildtyp-Mäusen dar. Es wurde eine ELISA-Messung durchgeführt. Es ist deutlich zu sehen, dass heterozygvte C3HeB/FeJ-SMA1 Mutantenmäuse, verglichen mit C3HeB/FeJ Wildtyp Mäusen oder C3HeB/FeJ-SMA1 × C3HeB/FeJ-Wildtyp Nachkommen ohne Phänotyp, geringere Werte im Plasma zeigen.

Abb. 5 stellt die Wachstumshormon (GH)-Konzentrationen im Plasma von heterozygoten C3HeB/FeJ-SMA1 Mutanten und C3HeB/FeJ-SMA1 oder Wildtyp- Mäusen dar. Es wurde eine ELISA-Messung durchgeführt. Es ist deutlich zu sehen, dass heterozygote C3HeB/FeJ-SMA1 Mutanten, verglichen mit C3HeB/FeJ Wildtyp- Mäusen oder C3HeB/FeJ-SMA1 × C3HeB/FeJ-Wildtyp Nachkommen ohne Phänotyp, subnormale bis normale Werte im Plasma zeigen.

Abb. 6 ist eine mikroskopische Aufnahme von histologischen Querschnitten der Hypophyse. Diese zeigen eine Reduktion der Größe des vorderen Lappen (A und B) der Adenohypophyse und die Abwesenheit von Sekretionsgranula in azidophilen Zellen (C und D) der Adenohypophyse, ein Charakteristikum der C3HeB/FeJ-SMA1 heterozygoten Mutanten im Vergleich zu C3HeB/FeJ Wildtyp-Mäusen.

Abb. 7 zeigt (A) die chromosomale Lokalisation der SMA1 Mutation, (B) die Mikrosatellitenanalyse des Haplotyps von [(C3HeB/FeJ-SMA1^+/- × C57B1/6Jico) × C57BI/6Jico]-Mäusen und (C) die Chromatogramme der Teilsequenz des fünften Exons des Gh-Gens von C3HeB/FeJ Wildtyp-Mäusen und homozygoten und heterozygoten C3HeB/FeJ-SMA1 Mutanten. Dies zeigt, dass die SMA1-assoziierte Mutation auf dem Chromosom 11 liegt (A), zwischen den Mikrosatellitenmarken D11Mit333 und D11Mit301 (B), und dass es sich um einen A (639) zu C Austausch (Codon 193, Aminosäure 193) handelt, der innerhalb des fünften Exons des Wachstumshormongens liegt.

Abb. 8 zeigt den Unterschied im Avall-Restriktionsmuster zwischen der Wildtyp- und der mutierten Nukleinsäuresequenz, kodierend für das Wachstumshormon. Dies zeigt die Möglichkeit des Nachweises der Punktmutation in der genomischen Nukleinsäuresequenz von heterozygoten Mutanten C3HeB/FeJ-SMA1^+/- und homozygoten Mutanten C3HeB/FeJ-SMA1^-/- im Vergleich zu Wildtypen C3HeB/FeJ beruhend auf dem Fehlen einer Avall-Restriktionsschnittstelle in der Nukleinsäure sequenz des mutierten Wachstumshormongens.

Abb. 9 stellt die Aminosäure-Translation der Nukleinsäuresequenz von den SMA1 Mutanten verglichen mit der Wildtypsequenz von vielen anderen Spezies dar. Dies zeigt, dass die Punktmutation zu einem D zu G Aminosäureaustausch führt, und dass sie innerhalb der vierten konservierten Helix-Domäne am C-Terminus des Wachstumshormons liegt.

Abb. 10 ist eine schematische Darstellung eines Verfahrens zur Erstellung und Klonierung eines rekombinanten DNA-Vektors zur Punktmutation der Nukleinsäuresequenz des Wachstumshormongens aus Maus.

Beispiel 1 Herstellung erfindungsgemäßer Tiere durch ENU- Mutagenese ENU-Behandlung und Zuchtstrateaien

Für die Produktion mutanter Mäuse wurde 8-10 Wochen alten, männlichen Mäusen des Stammes C3HeB/FeJ (Jackson Laboratory, Maine, USA) im wöchentlichen Abstand 3 Mal das starke Mutagen Ethyl-Nitroso-Harnstoff (ENU, Serva, Heidelberg, Deutschland) intraperitoneal verabreicht. Die Konzentration lag bei 90 mg/kg Körpergewicht. 50 Tage nach der letzten Injektion wurden die injizierten Mäuse permanent mit weiblichen C3HeB/FeJ-Mäusen verpaart. Bis zu 100 Nachkommen wurden sodann auf dominante Merkmale des Phänotyps (Körpergewicht, -länge) untersucht.

Erste phänotypische Identifizierung

Mit einem polynomischen Regressionsmodell wurde eine Standard-Wachstumskurve für Wildtyp-Inzucht-Tiere des Stammes C3HeB/FeJ (Jackson Laboratory, Maine, USA) erstellt. Es wurden 10305 männliche und 9008 weibliche Tiere im Alter von 10 bis 227 Tagen untersucht. Die resultierenden Gleichungen beschreiben das Durchschnittsgewicht für männliche und weibliche Tiere an einem bestimmten Tag (t):

Männchen

f(t) = -9.487025 + 1.4385603xt - 0.021653xt²

+ 0.00015285xt³

- 0.000003937xt⁴

± 2x(1.26865119 + 0.02151744xt)

Weibchen

f(t) = 1.532645 + 0.688995xt - 0.08334xt²

+ 0.000054345xt³

- 0.0000001302xt⁴

± 2x(1.26865119 + 0.02151744xt).

Im Alter von 3 bis 9 Wochen wurden die Tiere wöchentlich einer Gewichtsbestimmung unterzogen. Als abnormal bezogen auf ihr Körpergewicht (in Abhängigkeit von Geschlecht und Alter) wurden Tiere bezeichnet, deren Körpergewicht sich um mehr als zwei Standardabweichungen (v < -2) vom entsprechenden Durchschnittskörpergewicht unterschied. Mit dieser Strategie wurde ein männliches Tier (Nachkomme eines ENU- injizierten Tieres) identifiziert, das ein reduziertes Körpergewicht sowie reduzierte Körperlänge aufwies und deshalb als SMA-1 (small = engl. klein) bezeichnet wurde. (Abb. 1, -/+ SMA1 Mutante versus +/+ Wildtyptier).

Um die dominant-genetische Transmission des reduzierten Körpergewichts und der reduzierten Länge zu bestätigen, wurde die Transmission dieser Merkmale in den Nachkommen dieses C3HeB/FeJ SMA1-Tieres untersucht.

Die 15-20 Nachkommen wurden in einem nicht-spezifisch-pathogen-freien (spf = specific pathogene free) Haltungsraum bei einer Temperatur von 23 ± 2⁰C (relative Luftfeuchtigkeit: 40-50%) und einer täglichen Photoperiode von 12:12 (Licht an: 6:00 MEZ) bei freiem Zugang zu Altromin 1314 Standard Zucht-Diät gehalten. Jungtiere wurden im Alter von 21 Tagen entwöhnt und in Gruppen von 2-4 gleichgeschlechtlichen Individuen gehalten. Die Haltungskäfige waren mit Sägespan-Einstreu und Zellstoff ausgestattet. Um die Mäuse eines Käfigs individuell unterscheiden zu können, wurden sie an der Schwanzwurzel mit handelsüblicher Künstler-Acrylfarbe tätowiert.

Die Körpergewichte von 43 (24 Männchen, 19 Weibchen) Nachkommen aus C3HeB/FeJ SMA1 × C3HeB/FeJ-Wildtyp Verpaarungen und 14 (6 Männchen, 8 Weibchen) C3HeB/FeJ Wildtyp × C3HeB/FeJ Wildtyp-Verpaarungen wurden nach dem Absetzen jeden 7.±1. Tag bis zum 119. Lebenstag (15. Woche) mit einer digitalen Waage (Kern 449-447, d = ±0.1 g) gewogen. (Drei weitere Mäuse (1 Männchen, 2 Weibchen) aus SMA1-Verpaarungen wurden am 42. Lebenstag zu Zuchtzwecken aus der Versuchsgruppe ausgeschlossen). Am 56. ±1 Lebenstag (Woche 8) erfolgten Längenvermessungen des Körpers am dorsal ausgestreckten, mit Halothan betäubten Tier (Fluothane, Zeneca). Mit einem Lineal (d = ±1 mm) wurde die naso-anale Körperlänge (mm) sowie die Schwanzlänge (Entfernung Anus-Schwanzspitze in mm) gemessen. Das Tier wurde auf die Ventralseite gedreht und mit einer Schieblehre (d = ± 0.1 mm) die Kopflänge als Entfernung Nasenspitze-Hinterhaupt sowie die Tarsuslänge (rechter Hinterfuß) in mm ermittelt. Alle Längenparameter wurden bei allen Nachkommen bestimmt. Es wurde immer vormittags zwischen 8:30 und 11:00 MEZ gemessen (Abb. 3).

Unter den weiblichen und männlichen SMA1 F1-Nachkommen ist ab dem 28. Lebenstag ein bimodales Verteilungsmuster der Körpergewichte mit einer normal- und einer untergewichtigen Gruppe im Vergleich zu den Nachkommen aus der Wildtyp- Kontrollgruppe zu erkennen (Abb. 2). Eine Maus wurde als SMA1 phänotypisiert, wenn ihr Körpergewicht am 42. Lebenstag den Mittelwert der Referenzpopulation um mehr als das zweifache der Standardabweichung unterschritt. Mit dieser Methode wurden unter 43 Nachkommen 20 (46.5%) SMA1-Mutanten entdeckt. (Unter Einbeziehung der am Tag 42 aus dem Experiment ausgeschlossenen Individuen erhöht sich der Anteil der SMA1-Mutanten auf 22/46 Nachkommen (47.8%)). Dieser Anteil kommt den nach Mendel bei Vorliegen eines dominanten Allels erwarteten 50% sehr nahe und bestätigt die Tatsache, dass SMA1 dominant vererbt wird. Die Penetranz der Mutation liegt bei fast 100%.

Das Muster der Gewichtsverteilung blieb bis zum 63., 77. und 105. Lebenstag bimodal. Drei initial als Mutanten phänotypisierte Mäuse erhöhten ihr Körpergewicht sukzessive auf Wildtyp (v ≧ -2). Diese Körpergewichtszunahme könnte durch eine altersabhängige, überproportional starke Zunahme an Speicherfett bei diesen Individuen zu erklären sein und soll Gegenstand einer nachfolgenden Analyse der Körperzusammensetzung der Tiere sein.

Anhand der Ergebnisse aus den Längenvermessungen ist zu erkennen, daß die am 42. Lebenstag als SMA1 phänotypisierten Mäuse nicht nur leichter, sondern auch deutlich kleiner sind als ihre Wildtyp-Geschwister und die Wildtyp-F1-Nachkommen der Kontrollgruppe. Das geringe Körpergewicht von SMA1 (v < -2) scheint also Folge eines mutierten Allels zu sein, dass sich auf die Körpergröße und nicht auf das Körpergewicht selbst auswirkt.

Bestätigte SMA-1 Mutanten wurden dann durch Verpaarung mit C3HeB/FeJ Wildtyp- Mäusen zur Erstellung einer Kolonie dieser mutanten Linie auf einem homogenen Inzucht-C3HeB/FeJ Hintergrund vermehrt.

Beispiel 2 Metabolische und physiologische Charakteristika der mutierten Tiere Metabolische Messungen

Die Ruhestoffwechselraten wurden wie von Heldmaier und Ruf, 1992 beschrieben in einem offenen System gemessen, wobei ein paramagnetischer O₂-Analysator (S3AII Ametek) und ein CO₂-Analysator (Advance Optima, Hartmann & Braun) verwendet wurden. Beide Geräte sind zwei-Kanal-Instrumente (d = ±0,001 vol. %) und erlauben einen direkten Vergleich der Luft vor und nach Passage der Plastikkammer (1,8 I), in die eine Maus gesetzt wurde. Die analogen Messgrössen wurden durch einen PC überwacht und die Stoffwechselrate (metabollc rate (= MR)) nach folgender Gleichung berechnet: MR[mlO₂*h^-1] = ΔVol%O₂*Fluß[l*h^-1]*10. Der Aufbau erlaubte die parallele Messung von 6 Mäusen, wobei alle sechs Minuten ein individueller Wert für CO₂- Produktion und O₂-Verbrauch innerhalb eines einminütigen Messintervalls erfasst wurde.

Von insgesamt 45 C3HeB/FeJ Wildtyp × C3HeB/FeJ-SMA1 Nachkommen wurden die Ruhestoffwechselraten bei einer Umgebungstemperatur von 28 ± 0.5°C erfasst. In vorangegangenen Experimenten hatte sich gezeigt, dass diese Temperatur nahe der Thermoneutralzone von Wildtyp und SMA1 Mäusen liegt. Das Alter der Tiere lag am Versuchstag bei 19-21 Wochen. Die Mäuse waren zuvor für mindestens zwei Wochen einzeln gehalten worden. Die Messungen wurden immer von morgens bis mittags während der Ruhephase der Mäuse durchgeführt. Vor Beginn der Datenerhebung wurden die Mäuse für eine Stunde an die Stoffwechselkammer gewöhnt, während der Messung erhielten sie weder Futter noch Wasser. Die Ruhestoffwechselrate eines Tieres errechnet sich als Mittelwert des niedrigsten O₂-Verbrauchs und der beiden benachbarten Werte, die während der dreistündigen Erfassungsperiode gemessen wurden (25-34 Werte pro Maus). Vor und nach dem Versuch wurde das Gewicht der Mäuse mit einer digitalen Waage (Sartorius 1401MP, d = ±0.1 g) bestimmt.

Bezogen auf das ganze Tier, ist der Ruhestoffwechsel bei 28°C von SMA1-Phänotypen geringer als der ihrer Wildtyp Geschwister (Männchen: 27.99 ± 3.59 (Mittelwert ± Standardabweichung) ml O² (n = 14) versus 37.03 ± 4.50 ml O₂(n = 10); Weibchen: 25.40 ± 3.54 ml O₂ (n = 8) versus 38.71 ± 3.36 ml O₂ (n = 13)). Anhand dieser Ergebnisse ist zu vermuten, dass der Ruhestoffwechsel von Mutanten verglichen zum Wildtyp proportional zur Körpergröße verringert ist. Eine genauere Analyse der metabolischen Daten folgt.

Rektaltemperatur

Unmittelbar im Anschluss an die Stoffwechselmessungen, bevor die Mäuse in ihre Haltungskäfige zurückgesetzt wurden, erfolgte eine Bestimmung der Rektaltemperatur mittels eines Rektalfühlers (C 856-1, Ahlborn, ∅ 2 mm), der an einen Therm. (2241- NTC, Ahlborn, d = ±0.1°C) angeschlossen war, und 15 mm tief in das Rektum eingeführt wurde. Die Temperatur innerhalb des 30 sekündigen Messintervalls wurde nach Insertion des Fühlers gemessen, falls die Werte für mindestens 10 Sekunden stabil blieben.

Die Rektaltemperatur von Wildtyp- und SMA1-Mäusen nach der vierstündigen Haltung bei 28°C war ähnlich. Die mittlere Rektaltemperatur betrug 35.3 ± 0.7°C bei Wildtypen (n = 23) und 35.1 ± 0.8°C bei SMA1-Mäusen (n = 22) mit dem Phänotyp.

Beispiel 3 Nekroskopie und Organhistologie der Mutanten

Im Vergleich zu Wildtypmäusen haben die SMA1-Mäuse ein erhöhtes Verhältnis zwischen dem Körpergewicht und der Tibialänge, dünnere kortikale Knochen und kleinere Skelettmuskelfasern. Außer der reduzierten Größe waren keine weiteren Veränderungen in endokrinen Organen wie Schilddrüse, Pankreas oder adrenergen Drüsen zu beobachten. Aktive Spermiogenese konnte in den Testis nachgewiesen werden, und Zeichen von sexuellem Dimorphismus waren in der submandibularen Drüse zu erkennen. Im Gegenteil, die Glomeruli zeigten einen weiblichen Typ von Bowman-Kapseln, was auf ein Defizit von Sexualhormonen hinweist. Eosinophile Einschlüsse konnten in den Arcuate-Nukleus des Hypothalamus gefunden werden.

Die Adenohypophyse erschien kleiner als üblich im Vergleich zu der Neurohypophyse (Abb. 6). Mikroskopische Analysen von Querschnitten der vorderen, mittleren und hinteren Bereiche der Hypophyse zeigten nach klassischer HematoxiliNEosin- und PAS-Färbung eine Hypoplasie der Adenohypophyse. Die Hypophyse zeigte eine normale Architektur mit wohldefinierter Neurohypophyse und Adenohypophyse, aber die Aufnahme zeigt deutlich, dass der vordere Lappen der Adenohypophyse kleiner als bei Kontrollen ist, während die Neurohypophyse normale Größe zeigt.

Bei stärkerer Vergrößerung erkennt man, dass die azidophilen Zellen der Adenohypophyse, normalerweise zahlreich und leicht zu identifizieren in Kontrollmäusen, wegen ihrer starken azidophilen Einschlüsse im Zytoplasma (stemmarkierte Zellen), in den Adenohypophysen der Mutanten nicht zu finden sind. Das weist darauf hin, dass azidophile Zellen, welche das Wachstumshormon oder Prolaktin sekretieren, nicht vorhanden sind oder keine sekretorischen Vesikel beinhalten.

Beispiel 4 IGF-1 und GH-Plasmawerte der erfindungsgemäßen Mutanten

Blutproben: EDTA-Blutproben von 3 Monate alten Mäusen, die über Nacht gehungert wurden, wurden durch retroorbitale Punktion, unter Betäubung mit Ether, mit heparinisierten Kapillaren in EDTA-beschichtete Sammelgefässe abgenommen.

Die Bestimmung der IGF-1-Konzentration im Plasma erfolgte mit dem IGF-1 Active rat IGF-1-EIA von DSL nach den Anweisungen des Herstellers. Hierfür wurden 10 µl unverdünntes EDTA Plasma eingesetzt, das wie oben beschrieben abgenommen wurde.

Die optische Dichte wurde in einer 96-Loch Mikrotiterplatte mit dem MTP Reader MRX II (Dynex) bestimmt.

Die Ergebnisse in Abb. 4 zeigen deutlich, daß die heterozygoten C3HeB/FeJ-SMA1 Mutanten, verglichen mit den C3HeB/FeJ Wildtypen oder den C3HeB/FeJ-SMA1 × C3HeB/FeJ Wildtyp-Nachkommen ohne Phänotyp (~ 150-200 ng/ml) geringere IGF-1 Konzentrationen im Plasma zeigen (~ 50-100 ng/ml).

Die Bestimmung erfolgte mit dem Growth Hormone EIA von Amersham Pharmacia Biotech nach den Anweisungen des Herstellers. Es wurden 25 µl 1 : 5 (in EIA Kit sample buffer) verdünntes Plasma verwendet.

Die Ergebnisse in Abb. 5 zeigen deutlich, dass die heterozygoten C3HeB/FeJ-SMA1 Mutanten, verglichen mit den C3HeB/FeJ Wildtypen oder den C3HeB/FeJ-SMA1 × C3HeB/FeJ Wildtyp-Nachkommen ohne Phänotyp, subnormale bis normale GH- Konzentrationen zeigen.

Beispiel 5 Kartierung und Klonierung der Mutation durch die Analyse der erfindungsgemäßen mutierten Tiere

Um die chromosomale Lokalisation der Mutation innerhalb der SMA1-Mutantenlinie zu ermitteln, wurde eine Standard Aus- und Rückkreuzungs-Zuchtstrategie im C57BI/6Jico Stamm (Ifacredo, Frankreich) durchgeführt, wobei für die C3HeB/FeJ und C57B1/6Jico Stämme spezifische Mikrosatellitenmarker verwendet wurden.

Isolierung von DNA aus Mausschwänzen: Genomische DNA wurde aus einem 1 cm langen Schwanzstück, sowohl von C3H und C57BI/6 J Wildtypmäusen, als auch von C3HeB/FeJ-SMA1^+/-, C3HeB/FeJ-SMA1^-/- und [(C3HeB/FeJ-SMA1^+/- × C57BI/6Jico) × C57B1/6Jico] F₂R-Mutanten unter Verwendung von "Dneasy 96 Tissue Kit° (Qiagen, Hilden, Germany) nach Vorschrift des Herstellers aufgereinigt.

Genotypisierung der Mäuse mittels PCR: Die Genotypen der F₂-R- Nachkommenschaft wurden mittels Mikrosatelliten, die spezifisch für C3HeB/FeJ und C57BI/6Jico sind, bestimmt. Die verwendeten Oligonukleotide wurden von MWG BIOTECH (Ebersberg, Germany) bezogen. In der PCR-Reaktion wurden fluoreszenzmarkierte Primer eingesetzt; deren Sequenzen aus folgenden Quellen stammen: Schalkwyk et al., 1999 und http://www-genome.wi.mit.edu/. Die PCR- Reaktionen wurden in einem MJ tetrad thermocycler PTC225 (MJ Research, INC., Waltham, USA) in einem 10 µl Reaktionsvolumen mit der Pharmacia Taq-DNA- Polymerase (Amersham Pharmacia Biotech, NJ, USA) durchgeführt. Nach einem 4 minütigen Denaturierungsschritt folgten 28 Amplifikationszyklen mit je 30 sec Denaturierung, 30 sec Anlagerung bei den in Schalkwyk et al., 1999 angegebenen Temperaturen und 30 sec Polymerisation bei 72°C. Die Produkte der Proben mit unterschiedlichen Farbstoffen wurden auf einem ABI 377 DNA Sequenzierer (PE Applied Biosystems, Foster City, USA) aufgetrennt, wobei in jeder Spur ein Längenstandard eingesetzt wurde. Zur Analyse wurde die Software Genotyper Version 2.1 und Genescan Version 3.0 von ABl verwendet. Die Analyse von 48 [(C3HeB/FeJ- SMA1^+/- × C57B1/6Jico) × C57BI/6Jico] Mäusen zeigte, dass die SMA1-Mutation mit dem D11Mit23-Marker auf dem Chromosom 11 koseggregierte (Abb. 7A). Nach einer detaillierten Haplotypenanalyse dieser Tiere unter Verwendung von weiteren Mikrosatelliten aus dieser Region des Chromosoms 11, ergab die Feinkartierung, dass die Mutation zwischen den Markern D11Mit333 und D11Mit301 lokalisiert ist. Dort ist auch das Wachstumshormongen lokalisiert (Abb. 7B).

PCR-Amplifikation des Wachstumshormongens wurde wie zuvor beschrieben durchgeführt.

Die Nukleotidsequenz des Mus musculus Wachstumshormongens und seines Promotors wurden GenBank/EMBL (Accesssion number Z46663) entnommen. Die untenstehenden Primer, die für das Wachstumshormongen spezifisch sind, wurden generiert mit "DOPE interactiva" (http://doprimer.interactiva.de). Zur Amplifikation wurden in einem 25 µl Reaktionsvolumen 10 ng genomischer DNAs eingesetzt und die Pharmacia Taq-DNA-Polymerase (Amersham Pharmacia Biotech, NJ, USA) für 28 Amplifikationszyklen mit je 30 sec Denaturierung bei 94°C, 30 sec Anlagerung bei 55°C und 30 sec Polymerisation bei 72°C verwendet.
11M-Gh-F2: TCGGACCGTGTCTATGAGAAA;
11M-Gh-R2: GGTTCCAGGAACAAGATTGACA;
11M-Gh-F3: TAAGAGATCTAGCCACAGGGA;
11M-Gh-R3: CACTGCTGTTGGGAAAAGAAAG;
11M-Gh-F5: TCCTACCCTTGGATTCAAAA;
11 M-Gh-R5: ACCAGCTTGTGTCTCGTCA;
11 M-Gh-F6: CCGTTTGTGGAAGCAGGAA;
11 M-Gh-R6: ATAACCCCAGGCTAGTCCAT;
11 M-Gh-F8: GACAGTGCCCTCTAGTGCTCAGTG;
11 M-Gh-R8: TTATCGTCTCATCGCCACCTTTGC

DNA-Sequenzierung: Die PCR-Amplifikate wurden mit "QIAquick PCR Purification Kit" (Qiagen, Hilden, Germany) nach Vorschrift des Herstellers aufgereinigt. Die PCR- Produkte wurden mit den forward/reverse Primern unter Verwendung von "Big Dye thermal cycle sequencing Kit" (ABI PRISM, Applied Biosystems) sequenziert. Die Reaktionsprodukte wurden mit dem ABI 377 DNA Sequenzierer analysiert.

Sequenzanalyse: Nach manueller Edition der Sequenzen wurden diese zum Mutationsnachweis mit der Software Sequencher Version 4.0.5 zur Gesamtsequenz zusammengefügt. Die Sequenzanalyse zeigt das Chromatogramm in der Abb. 7C. Dort ist ein A (Position 639 in der Nukleinsäuresequenz SEQ ID Nr. 1) zu G Austausch im fünften Exon des Gh Gens in homozygoten und heterozygoten C3HeB/FeJ-SMA1 Mutanten und C3HeB/FeJ Wildtypen dargestellt (Abb. 7C). Dieser Austausch führt zu einem Aminosäureaustausch von Asp (193) zu Gly (Position wie in der Aminosäuresequenz SEQ ID Nr.: 1 gekennzeichnet) in der C-terminalen Helixdomäne, die sehr konserviert ist (Abb. 9).

Beispiel 6 Verfahren zur Herstellung erfindungsgemäßer mutanter Tiere durch Gen-Targeting

Zur Erstellung eines Rekombinationsvektors zur Punktmutation der 128ten Base des Sten Exons des Mäuse-Wachstumshormongens Gh wird das λKOS-System, ein Hefe- Bakterien-Shuttle-System verwendet (Watuer et ei. 1999, Biotechniques: 26, 1150-1159). Aus der λ-KOS-Bibliothek wird ein Klon isoliert, der die vollständige Gh-kodierende Sequenz sowie weitere 1,5 kb stromabwärts liegende Sequenzen enthält (Abb. 10). Für eine Hybridisierung wird eine Sonde verwendet, die dem mit dem folgenden Primer-Set erhaltenen PCR-Produkt entspricht: C-5'-gaggatggactagcctggg-3', D-5'- cctgtcgtgggaaagaaggg-3'. Die beiden Primer amplifizieren ein 150 bp Produkt aus dem 4ten Intron.

Zum Einfügen der Punktmutation an Nukleotid 128 von Exon 5 des Gh-Gens wurden folgende Oligonukleotide verwendet:

Oligonukleotid 1: Oligonukleotid 1 entspricht den Nukleotiden der Positionen 159-106 im Sten Exon des Gh-Gens. An der Position 128 befindet sich anstelle des G in der Wildtypsequenz ein C (5'-gacccgcaggtaggtctccgctttgtgcaggcccttcttgaagcaggagagca g-3'.

Oligonukleotid 2; Oligonukleotid 2 entspricht den Nukleotiden der Positionen 103-125 im 4ten Intron des Gh-Gens und besitzt eine Sfi-Restriktionsstelle am 5'-Ende (fettgedruckt) (5'-gcgggccgtagcggccgggaggcacagctcccgagtctcc-3').

Oligonukleotid 3: Oligonukleotid 3 entspricht den Nukleotiden der Positionen 103-78 im 4ten Intron des Gh-Gens und besitzt eine Sfi-Schnittstelle am 5'-Ende (fettgedruckt). 5'-gcgggccacgcaggcctccaccccaggaccgaaggaaaagcc-3'

Oligonukleotid 4: Oligonukleotid 4 entspricht den Nukleotiden der Positionen 3-29 im 4ten Intron: 5'-gaggatggactagcctggggttatgcc-3' Die Oligonukleotide 1 und 2 und 3 und 4 werden in der PCR verwendet, um die Fragmente A und B zu amplifizieren. Die Fragmente A und B werden nach Aufreinigung (Qiagen, Deutschland: QIAquick Kit, Verfahren nach den Angaben des Herstellers) mit Sfi gespalten und anschließend an eine Hefe/Bakterien-Selektionskassette (Wattler et al. 1999) ligiert.

Das Ligationsprodukt (A + B + Hefe/Bakterien-Selektrionskassette) wird zusammen mit dem pKOS-Klon in Wildtyp-Hefen transformiert und diese auf Doppel-Selektionsplatten (-ura/-trp) selektiert. Es können nur die Hefen überleben, in denen eine homologe Rekombination zwischen Selektionskassette mit den ligierten Fragmenten A und B und genomischer DNA des pKOS-Klons stattgefunden hat. Individuelle Hefekolonien werden propagiert und in einer Kolonie-PCR auf das Vorhandensein der Punktmutation hin überprüft. Dabei dienen die Oligonukleotide 5 und 6 als 5'- und 3'-Primer. Oligonukleotid 5 entspricht den Nukleotiden der Positionen 203-180 im Sten Exon des Gh-Gens: 5'-ggatgaaggcacagctgctttcc-3'.

Oligonukleotid 6 entspricht der Sequenz CAT-1: 5'-tcatcatgccgtctgtgatg-3' des Bakterienresistenzgens.

Die PCR-Produkte werden mit Oligonukleotid 5 sequenziert. DNA von Kolonien mit der Punktmutation wurde isoliert und diese in E.coli transformiert und diese auf Selektionsplatten (amp/cat) vermehrt. Die Transformation von Mäuse-129-Es-Zellen mit dem Vektorkonstrukt erfolgte in an sich bekannter Weise. Resultierende Es-Zellklone wurden doppelt selektiert, positiv mit G418 und negativ mit FIAU. Für die Identifizierung positiver Zielklone wurde Es-Zell-DNA verdaut und mit einer 5'-externen Sonde wie in Abb. 10 gezeigt, hybridiziert. Eine einzelne Integration wurde durch Hybridisieren des gleichen Southern Blots mit einer ausgehend von der Selektionskassette geschaffenen Sonde, wie in Abb. 10 gezeigt, bestätigt. Mit einer PCR wird zudem auf das Vorhandensein der Punktmutation hin überprüft. Der Primer 5 und ein Primer aus der neo-Selektionskassette (5'-gcagcgcatcgccttctatc-3') dienen als PCR-Primer. Als Sequenzierprimer für das PCR-Produkt wird sodann das Oligonukleotid 5 eingesetzt. Klone mit der Punktmutation werden in Blastocysten injiziert und im Standardverfahren chimäre Mäuse generiert, die anschließend mit Wildtypmäusen verpaart werden. In der nächsten Generation wurde unter Verwendung der oben beschriebenen Southernhybridisierungen überprüft, ob Keimbahn-Transmission stattgefunden hatte. Durch Verpaaren der heterozygoten Mäuse mit einer transgenen Mauslinie, die das Gen für die Cre-Recombinase unter Kontrolle des Protaminpromotors trägt, entstehen Heterozygote, die bezüglich der Mutation und cre heterozygot sind. Diese Männchen werden mit Wildtypweibchen verpaart und die Nachkommen auf cre-Rekombination durch PCR überprüft. Die Primer-Kombination 4 und 5 ergibt ein informatives Bandshift. Ein Wildtyp-Tier ergibt ein 390 bp PCR-Produkt und ein rekombinantes heterozygotes Tier zeigt ein 423 bp Produkt, das die IoxP-Stelle, die sich links im Genom nach der Cre-Rekombination befindet, und die Wildtyp-Bande umfasst. Ohne Cre-Rekombination wird die Selektionskassette (2,1 kb) amplifiziert.

Beispiel 7 Verfahren zum Nachweis der erfindungsgemäßen Nukleinsäure

Nachweis der Mutation durch Verwendung einer polymorphen Avall Restriktionsschnittstelle: Der Nukleotidaustausch A zu G in der Nukleinsäuresequenz des Gh Gens führt zu dem Verlust einer Restriktionsschnittstelle der zwei Restriktionsendonukleasen AvaII und PpuMI. Dadurch lässt sich das Restriktionsbandenmuster der Gh-Nukleinsäuresequenz zwischen der Wildtyp-Sequenz von der mutierten Sequenz, die vom Restriktionsenzymen nicht mehr erkannt wird, unterscheiden. Dieses Verfahren wurde an PCR-Produkten, die wie in diesem Beispiel beschrieben von Wildtyp- und mutierter Nukleinsäure amplifiziert wurden, durchgeführt. Die PCR und die Restriktionsspaltung erfolgte nach folgendem Protokoll:

Die PCR-Reaktionen erfolgten in einem 25 µl Reaktionsvolumen mit 10 ng genomischen DNAs und der Pharmacia Taq-DNa-Polymerase (Amersham Pharmacia Biotech, NJ, USA) nach Vorschrift des Herstellers. Als Primer wurden 11M-Gh-F2 und 11M-Gh-R2 eingesetzt (11M-Gh-F2: TCGGACCGTGTCTATGAGAAA; 11M-Gh- R2: GCTTCCAGGAACAAGATTGACA). Nach einem 4 minütigen Denaturierungsschritt folgten 28 Amplifikationszyklen mit je 30 sec Denaturierung bei 94°C, 30 sec Anlagerung bei 55°C und 90 sec Polymerisation bei 72°C. Der Ansatz für den enzymatischen Verdau beinhaltete 7 µl der PCR-Reaktion, 10 µl Wasser, 2 µl NEB- Puffer 4 und 1 unit AvaII (New England BioLabs INC., Beverly, USA) und wurde bei 37°C 2 Stunden inkubiert. Die Grössentrennung der Restriktionsfragmente erfolgte durch Elektrophorese in einem 2% Agarosegel (SeaKem ME Agarose, Biozym Diagnostik GmbH, Hess. Oldenburg, Germany), das 0,5 µg Ethidiumbromid pro ml Agarose enthielt. Nach 2-stündiger Elektrophorese bei 3 Vm^-1 wurden die Gele photographiert. Die Abb. 8 zeigt, daß die Punktmutation zum Verschwinden einer der AvaII- bzw. PpuMI-Schnittstellen, die in den PCR-Produkten vorkommen, führt, was durch das Auftreten eines längeren Restriktionsfragments zu erkennen ist; in solch einem Fall spricht man von einem Restriktionspolymorphismus (Abb. 8). Dieses Verfahren ermöglicht die Unterscheidung zwischen hetero- und homozygoten SMA1- Mutanten, da bei Homozygoten ein kleineres Fragment durch die zusätzliche AvaII Spaltung verschwindet.

Literaturstellen

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SEQUENZPROTOKOLL

Claims

1. Ein nicht-menschliches Tiermodell, das ein modifiziertes Wachstumshormon exprimiert, wobei die Modifikation eine Aminosäuresubstitution in der Wildtyp- Wachstumshormonsequenz an der Position ist, die der Position 193 der in SEQ ID NO:1 gezeigten Aminosäuresequenz entspricht.

2. Nicht-menschliches Tiermodell gemäß Anspruch 1, wobei das modifizierte Wachstumshormon von einem Wirbeltier, insbesondere von einem Säuger stammt.

3. Nicht-menschliches Tiermodell gemäß Anspruch 2, wobei das modifizierte Wachstumshormon von Rind, Ratte oder Maus stammt.

4. Nicht-menschliches Tiermodell gemäß einem der Ansprüche 1-3, wobei die Aminosäuresubstitution einen Asparaginsäurerest ersetzt.

5. Nicht-menschliches Tiermodell gemäß den Ansprüchen 1-4, wobei die Aminosäuresubstitution durch eine Aminosäure erfolgt, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Alanin, Serin, Threonin, Prolin und Glycin.

6. Nicht-menschliches Tiermodell gemäß Anspruch 5, wobei das modifizierte Wachstumshormon die in SEQ ID NO:4 gezeigte Aminosäuresequenz besitzt.

7. Nicht-menschliches Tiermodell gemäß einem der Ansprüche 1-6, wobei die Wachstumshormonsequenz weiter Modifikationen umfasst, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Aminosäuresubstitutionen, -deletionen und -insertionen.

8. Nicht-menschliches Tiermodell gemäß einem der Ansprüche 1-7, wobei das Tier zu einer Gattung gehört, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Mus (wie Mäuse), Rattus (wie Ratten), Oryctologus (wie Kaninchen) und Mesocricetus (wie Hamster).

9. Nicht-menschliches Tiermodell gemäß Anspruch 8, wobei das Tier eine Maus ist.

10. Nicht-menschliches Tiermodell gemäß einem der Ansprüche 1-9, wobei das modifizierte Wachstumshormon von einer Nukleinsäuresequenz kodiert wird, die in diesem Tiermodell homozygot ist.

11. Nicht-menschliches Tiermodell gemäß einem der Ansprüche 1-10, wobei das Tier ein oder mehrere der nachstehenden phänotypischen Merkmale zeigt:

a) proportionale, verkürzte Körpermaße, charakterisiert durch ein(e) geringere(s) Körpergewicht und Länge und verringerte Größe aller Körperteile und -organe;
b) nicht-proportionale verringerte Größe und gestörte Histologie der vorderen Hypophyse;
c) niedrige IGF-1-Plasmaspiegel;
d) GH-Plasmaspiegel, die mit denen von Wildtyptieren vergleichbar sind (subnormal);
e) verringerter 0₂-Verbrauch;
f) normale Körpertemperatur;
g) verringerte oder defekte kognitive Funktionen und Kapazität der Informationsverarbeitung.

12. Primärzellen und Zelllinien, abgeleitet von dem Tiermodell gemäß einem der Ansprüche 1-11.

13. Modifizierte Wachstumshormon-Aminosäuresequenz, wobei die Modifikation eine Aminosäuresubstitution in der Wildtyp-Wachstumshormonsequenz an der Position ist, die der Position 193 der in SEQ ID N0 : 1 gezeigten Aminosäuresequenz entspricht.

14. Wachstumshormon-Aminosäuresequenz gemäß Anspruch 13, wobei das Wachstumshormon von einem Wirbeltier, insbesondere von einem Säuger stammt.

15. Wachstumshormon-Aminosäuresequenz gemäß Anspruch 14, wobei das Wachstumshormon von Rind, Ratte oder Maus stammt.

16. Wachstumshormon-Aminosäuresequenz gemäß einem der Ansprüche 13-15, wobei die Substitution durch einen Aminosäurerest erfolgt, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Alanin, Serin, Threonin, Prolin und Glycin.

17. Wachstumshormon-Aminosäuresequenz gemäß Anspruch 16, wobei die Aminosäuresequenz in SEQ ID N0 : 4 gezeigt ist.

18. Wachstumshormon-Aminosäuresequenz gemäß den Ansprüchen 13-17, ferner umfassend Modifikationen, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Aminosäuresubstitutionen, -deletionen und -insertionen.

19. Nukleinsäuresequenz, kodierend für die Wachstumshormon-Aminosäuresequenz gemäß einem der Ansprüche 13-18.

20. Verwendung des Tiermodells gemäß einem der Ansprüche 1-11 für die Untersuchung von Erkrankungen oder Symptomen, die mit einer Defizienz der Wachstumshormonaktivität oder IGF-1-Defizienz in Verbindung stehen, wie Wachstumsverzögerung oder -defizienz, insbesondere Zwergwuchs, Illig-Typ- Defizienz, Laron-Syndrom und Kowarsky-Syndrom, Defizienz der Hypophyse, verminderter BMD, Osteoporose, Defekte der Informationsverarbeitung und der kognitiven Funktionen, Störungen des Glukosemetabolismus und kardiovaskuläre Störungen.

21. Verwendung das Tiermodells gemäß einem der Ansprüch 1-11 für die Identifizierung von frühen diagnostischen Markern für Erkrankungen die mit einer Defizienz der Wachstumshormonaktivität oder IGF-1-Defizienz in Verbindung stehen, wie Wachstumsverzögerung oder -defizienz, insbesondere Zwergwuchs, Illig-Typ-Defizienz, Laron-Syndrom und Kowarsky-Syndrom, Defizienz der Hypophyse, verminderter BMD, Osteoporose, Defekte der Informationsverarbeitung und der kognitiven Funktionen, Störungen des Glukosemetabolismus und kardiovaskuläre Störungen.

22. Verwendung des Tiermodells gemäß einem der Ansprüche 1-11 für die Aufzeichnung der Aktivität von Stoffen, die für die Prävention oder Behandlung von Erkrankungen oder Symptomen verwendbar sind, die mit Wachstumsverzögerung oder -defzienz in Verbindung stehen, insbesondere Zwergwuchs, Illig-Typ-Defizienz, Laron-Syndrom und Kowarsky-Syndrom, Defizienz der Hypophyse, verminderter BMD, Osteoporose, Defekte der Informationsverarbeitung und der kognitiven Funktionen, Störungen des Glukosemetabolismus und kardiovaskuläre Störungen.

23. Verwendung des Tiermodells gemäß einem der Ansprüche 1-11 als Testmodellsystem für Stoffe, die im Verdacht stehen, Erkrankungen zu verstärken oder zu erschweren, die mit Wachstumsverzögerung oder -defizienz in Verbindung stehen, insbesondere Zwergwuchs, Illig-Typ-Defrzienz, Laron- Syndrom und Kowarsky-Syndrom, Defizienz der Hypophyse, verminderter BMD, Osteoporose, Defekte der Informationsverarbeitung und der kognitiven Funktionen, Störungen des Glukosemetabolismus und kardiovaskuläre Störungen.

24. Verwendung des Tiermodells gemäß einem der Ansprüche 1-11 für die Auftrennung der molekularen Mechanismen des Weges der Wachstumshormonaktivität.

25. Verwendung des Tiermodells gemäß einem der Ansprüche 1-11 für die Identifizierung und Klonierung von Modifiergenen, die zur Modifizierung, Verschlimmerung, Verminderung oder Hemmung des Phänotyps fähig sind, der mit einer Defizienz der Wachstumshormonaktivität in Verbindung steht.