DE69721005T2

DE69721005T2 - Gebrauch von galanin um nervenschäden zu reparieren

Info

Publication number: DE69721005T2
Application number: DE69721005T
Authority: DE
Inventors: David Wynick
Original assignee: Neurotargets Ltd
Current assignee: Neurotargets Ltd
Priority date: 1996-07-24
Filing date: 1997-07-24
Publication date: 2004-06-09
Anticipated expiration: 2017-07-25
Also published as: WO1998003059A1; JP2000516212A; EP1342410A3; GB2331301A; DK1342410T3; ES2196349T3; DK0918455T3; PT918455E; DE69721005D1; GB2331301B; US20030009777A1; EP1342410A2; DE69739760D1; AU3630297A; EP0918455A1; EP0918455B1; GB2331301C; ATE237346T1; ATE457125T1; PT1342410E

Description

Die Erfindung betrifft Galanin einschließlich seiner Analoge und deren Verwendungen.
Galanin ist ein Neuropeptid mit 29 Aminosäuren, das zuerst 1983 aus Schweineeingeweiden isoliert wurde. In der Folge wurde die cDNA für Galanin 1987 aus einer früheren Rattenhypophysenbibliothek geklont. Die Analyse der Nucleotid- und Aminosäuresequenz legt nahe, dass Galanin mit den anderen bekannten Familien regulatorischer Peptide nicht verwandt ist und das einzige Mitglied seiner Familie bleibt. Der N-terminale Teil von Galanin ist zwischen den Spezies stark erhalten, im C-terminalen Teil gibt es Variationen.
Galanin ist im peripheren und zentralen Nervensystem, im Darm und Pankreas gut verteilt. Es wird in höchsten Konzentrationen in der Medianvorwölbung des Hypothalamus und in der Hypophyse gefunden.
In der WO92/12997 (General Hospital Corporation), veröffentlicht 1992, wird die Sequenz von humanem Galanin beschrieben. Es werden die Untersuchungen anderer Forscher diskutiert, die sich mit der Verabreichung von Rattengalanin oder seiner N-terminalen Fragmente zum Verstärken der Wirksamkeit von Morphin befassen und diese Patentanmeldung legt nahe, dass zu erwarten ist, dass Galanin analgetische Wirkungen zeigt, so dass es alleine oder in Kombination mit anderen Analgetika verabreicht werden kann. In der Anmeldung wird die Verwendung von Galanin oder seinen Analogen bei der Schmerzbehandlung und die Verwendung von Galaninantagonisten bei der Behandlung bestimmter anderer Leiden beansprucht.
In der WO92/20709 (Astra AB) wird eine Reihe mutmaßlicher Galaninantagonisten beschrieben. Die Antagonisten, die beschrieben werden, basieren sämtliche auf den ersten 12 Aminosäuren von Galanin, gefolgt von Teilsequenzen anderer Peptide, d. h. chimärer Peptide. Einige können Agonisten sein, einige Antagonisten und einige können je nach Rezeptorsubtyp beides sein. In der Anmeldung wird beschrieben, dass die Antagonisten zur Behandlung von Insulin-, Wachstumshormons-, Acetylcholin-, Dopamin-, Substanz-P-, Somatostatin-, und Noradrenalin-bezogener Leiden einschließlich Endokrinologie, Nahrungsmittelaufnahme, Neurologie und Psychiatrie, Dementia vom Alzheimertyp, Analgesie und Darmleiden brauchbar sein können. Die Anmeldung beschreibt die Ergebnisse von Untersuchungen, bei denen einige der darin beschriebenen Antagonisten verwendet werden, bezüglich verschiedener Wirkungen, wie beispielsweise der Galanininhibierung von glucosestimulierter Insulinfreisetzung; galanininduzierte Inhibierung von scopolamininduzierter ACh-Freisetzung im Hippocampus; galanininduzierter Facilitation des Flexorreflexes; Verdrängen gebundenen iodierten Galanins in Membranbindungsuntersuchungen. In der Anmeldung wird vorgeschlagen, dass die Antagonisten als Analgetika indiziert sein können, in der Anmeldung findet sich jedoch keine Beschreibung von Ergebnissen zu diesem Effekt.
Etwa 2–4% der westlichen Bevölkerung leitet an Diabetes mellitus und von diesen Menschen leiden 10–15% unter chronischen Schmerzen und Taubheit in ihren Extremitäten – was als „schmerzhafte Neuropathie" bezeichnet wird. Die derzeitigen Behandlungsmaßnahmen für schmerzhafte Neuropathie sind inadequat.
Die Alzheimererkrankung ist ein Hauptgrund für die Sterblichkeit weltweit, wobei die Erkrankung durch Gedächtnisverlust und Persönlichkeitsveränderungen charakterisiert ist. Auf anatomischer Ebene liegt eine schwerwiegende Abnahme in der Anzahl der cholinergen Nerven im basalen Vorderhirn und Hippocampus vor, von denen angenommen wird, dass sie die Hauptbereiche des Gehirns zum Verarbeiten und Speichern von Erinnerungen sind. Vorangegangene Arbeiten haben gezeigt, dass Galanin in diesen Hippocampusnerven ebenfalls exprimiert wird und dass die Galaninkonzentrationen in den Gehirnen von Patienten mit Alzheimererkrankung zweifach erhöht sind.
Die vorliegende Erfindung betrifft die Herstellung einer Maus mit gezielter Disruption des Galaningens; Experimente, bei denen die Maus eingesetzt wird und Implikation der Ergebnisse dieser Experimente zur Behandlung der Erkrankung. Insbesondere betrifft die Erfindung die Herstellung einer mutanten Maus, die eine Keimlinienfunktionsverlustmutation des Galaninlocus trägt. Die inaktivierende Mutation wurde unter Verwendung gezielter Mutagenese in Embryostammzellen durch homologe Rekombination in das Mausgenom eingeführt. Die Mutation beeinträchtigt, wenn sie auf dem Hintergrund des Inzuchtstamms 129sv zur Homozygosität gezüchtet wird, das Futterverhalten, die Laktation und die Schmerzempfindlichkeit. Die Mutation kann auch das Gedächtnis und das Verhalten, die sexuelle Fortpflanzung und die Fruchtbarkeit und die Insulinsekretion mit daraus folgenden Veränderungen in den Glucosespiegeln im Blutkreislauf beeinträchtigen.
Gemäß dem ersten Aspekt der Erfindung wird die Verwendung eines Galaninagonisten bei der Herstellung eines Medikaments zum Reparieren einer Nervenschädigung bereitgestellt.
Ausführungen der Erfindung werden nun lediglich mittels Beispielen beschrieben, wobei auf die beigefügten Zeichnungen 1 bis 16 Bezug genommen wird, in denen:
1 die genomische Struktur von Mausgalanin darstellt;
2 den Targetvektor darstellt, der bei der Herstellung des Nagetiers der Erfindung verwendet wurde;
3 das spezifische Rekombinationsereignis bei der Herstellung des erfindungsgemäßen Nagetiers veránschaulicht;
4 den Genotyp der Nachkommenschaft darstellt, der mittels Southern-Blotting und PCR bestimmt wurde und identische Ergebnisse zeigt von dem selben Wurf, der aus einer Vereinigung von zwei heterozygoten Tieren abstammt;
5 den Effekt der Galanininaktivierung auf die Kurzzeitregeneration sensorischer Neuronen darstellt;
6 die Wirkung der Galanininaktivierung auf die Langzeitregenerierung sensorischer Neuronen darstellt;
7 die Expression einer Exon 6-spezifischen Riboprobe darstellt, um die Verteilung galaninerger Neuronen im Gehirn und im Ganglion der dorsalen Rückenmarkswurzel des Wildtyps und der mutanten Mäuse zu untersuchen;
8 die Wirkungen der Galanininaktivierung auf die Bildung der Langzeitpotenzierung im Stratum radiatum-Bereich des Hippocampus veranschaulicht;
9 die Auswirkungen der Galanininaktivierung auf die Bildung der Langzeitpotenzierung im Stratum oriens-Bereich des Hippocampus veranschaulicht.
Zur Herstellung einer Knockout-Maus, d. h. die Einführung einer Funktionsverlust- oder Funktionsgewinn-Mutation eines spezifischen Genlocus (gemäß dem bei Kuehn, M. R. et al Nature. 1987; 326; 295–8; Thomas, K. R. und Capecchi, M. R. Nature. 1986; 324: 34–8 beschriebenen Verfahrens) ist eine Reihe von Schritten erforderlich: – (1) Klonen des interessierenden Mausgenomlocus; (2) die Konstruktion eines Zielvektors, so dass der interessierende Locus/Gen modifiziert wird, um seine Struktur und Funktion in gewisser Weise zu inaktivieren oder zu verändern; (3) Einführen des Zielvektors in eine Embryonenstammzellenbibliothek und Selektieren und Identifizieren einzelner Zellklone, in denen das geeignete korrekte Zielereignis stattgefunden hat und in denen die normale Chromosomenanzahl unverändert ist; (4) Einführen solcher Klone in 3,5 Tage alte Blastozysten und Kreuzen der resultierenden chimären Mäuse mit Wildtypen des entgegengesetzten Geschlechts. Die erhaltenen Nachkommen, von denen gezeigt wurde, dass sie die Mutation tragen, sind somit Heterozygoten und bei geeigneter Kreuzung werden Homozygoten für die eingeführte Mutation gezüchtet.
Als ein erster Schritt wurde das Mausgalanin-Gen kloniert. Eine Mausgenombibliothek (Ehrich, E. et al Gene. 1987; 57: 229–37) wurde gescreent, wobei die gesamte Länge der Rattengalanin-cDNA als eine Sonde unter hoher Stringenz verwendet wurde. Es wurden zwei Kosmidklone identifiziert, die 60 Kb in der Nähe des Galaninlocus umspannen. Unter Verwendung von 5'- und 3'-Sonden aus der Ratten-cDNA wurde eine 14 Kb DNA-Region, die das gesamte Gen enthielt, subkloniert und teilweise sequenziert. Aus der Genomsequenz wurden Primer entwickelt, die zu nicht-translatierten exonischen Bereichen des Gens komplementär waren. Ein 360 bp-Fragment wurde mittels RT-PCR (Kit zur Verfügung gestellt von INVITROGEN BV, Niederlande) erzeugt, wobei ein ganzes Gehirn eines erwachsenen Weibchens als Quelle für mRNA verwendet wurde. Nachfolgendes Sequenzieren dieses Fragments zeigte, dass Mausund Rattengalanin im Proteingehalt 100% und im Nucleotidgehalt 94,8% identisch sind. Die Genomstruktur des Mausgens (1) ist mit derjenigen des Rattengens identisch. Das Gen umspannt 4,8 Kb und besteht aus sechs Exons. Die Translations startsteile (AUG) beginnt an der ersten Base von Exon zwei, die Kodierungsregion für Galanin erstreckt sich über die Exons drei und vier mit dem Stoppcodon (UGA) in der Mitte von Exon sechs.
Unter Verwendung des zuvor beschriebenen 14 Kb-Subklons wurde ein Zielvektor zur Positiv-/Negativselektion konstruiert (2). Die eingeführte Mutation entfernt die ersten fünf Exons, die den gesamten Codierungsbereich für das Galaninpeptid enthalten (3).
In 3: A und B sind die Stellen der externen Sonden, die zum Screenen der ES-Zellen für die geeignete Integration des Konstrukts verwendet wurden.
Neo = Neomycin-Resistenzgen
HSV-TK = Herpes simplex-Virus-Thymidinkinase-Gen
B = BamHI
E = EcoRI
X = XhoI
Bg = BglII
Insbesondere entfernt der Zielvektor ein 3,2 Kb-großes Stück DNA und entfernt somit die ersten fünf Exons des Galaningens. Die exakten Stellen, die das Stück entfernter DNA flankieren, sind 5' – die Bam HI-Stelle 10 bp stromabwärts von der Transkriptionsstartstelle und die 3'-Stelle ist die Bgl2-Stelle in der Mitte von Intron 5. Diese Stellen sind in 3 mit Sternchen angegeben. Andere Stellen, die verwendet werden könnten, sind dieselbe 5'-Stelle und eine davon verschiedene 3'-Xho1-Stelle in Intron 4, die lediglich 2,9 Kb der DNA entfernen würde und somit lediglich die ersten vier Exons entfernen würde.
Dieser Vektor wurde linearisiert und in die E14 embryonale Stammzellenlinie (ES) (Hooper, M. et al Nature. 1987; 326: 292–5) elektroporiert. Eine Restriktionskartierung des Wildtyplocus mit BglII erzeugt ein 9,3 Kb-Fragment, wenn es mit einer externen 5'-Sonde (markiert als A, 3) sondiert wird, wogegen der korrekte Ziellocus ein 4,4 Kb-Fragment erzeugt. Insgesamt wurden 9 Klone identifiziert, in denen ein Allel des Galaningens durch homologe Rekombination unter 209 doppelt resistenten Kolonien korrekt angezielt wurde, was eine Trefferquote von 4,3% ergibt. Diese 9 Klone wurden karyotypisiert, was die Euploidie bestätigt und in 3,5 Tage alte Blastozysten aus C57BL/6 Mäusen injiziert. Keimlinientransmission des disruptierten Galaninlocus wurde aus drei separaten ES-Zellklonen erhalten. Der Genotyp der Nachkommenschaft wurde mittels Southern-Blotting und mittels PCR bestimmt (4 zeigt identische Ergebnisse, die durch Southern-Blotting und PCR-Screenen desselben Wurfs erhalten wurden, der aus einer Kreuzung von zwei Heterozygoten abstammte). Die Mutation wurde zur Homozygosität auf dem Inzuchtstamm 129sv gezüchtet und sämtliche präsentierten Daten stammen von Mäusen dieser Abstammung.
1. Ergebnisse der Genotypanalyse lebend Geborener liegen in dem erwarteten Verhältnis, das von der Mendelschen Erblehre vorhergesagt wird und das Geschlechtsverhältnis beträgt 1 : 1. Die Galaninkonzentrationen wurden mittels Radioimmunassay und Immunozytochemie gemessen in Bereichen, in denen bereits vorher gezeigt wurde, dass sie Galanin in hohem Maß exprimieren und umfassen Gehirn, Hypophyse, Ganglion der dorsalen Rückenmarkswurzel, Magen, Dünndarm und Uterus. Galaninkonzentrationen in Heterozygoten für die Deletion betrugen 50% der Wildtypkontrollen, wohingegen Galaninkonzentrationen in den Homozygoten für die Deletion in sämtlichen Zellen nicht nachweisbar waren.
Ein Vergleich der Konzentrationen der Galaninexpression zwischen Wildtyp, Heterozygote und Mutantenmaus in mehreren Körpergeweben ist in Tabelle 1 angeben.
Tabelle 1
Sämtliche Werte sind mittlere Galanin-LI pmol/g ± SEM, außer der weiblichen vorderen Hypophyse, die in pmol/Drüse ± SEM angegeben ist. UD = nicht nachweisbar.
Es zeigt sich, dass Galanin in keinem der getesteten Gewebe in den homozygotischen mutanten Mäusen nachgewiesen wurde und in der heterozygoten mutanten Maus um 50% abgenommen hatte.
2. Die regenerativen Fähigkeiten der sensorischen Axons im Ischiasnerv wurden direkt gemessen durch den sogenannten Pinchtest (Danielsen, N., Kerns, J. M., Holmquist, B., Zhao, Q., Lundborg, G. & Kanje, M. Brain Res. 681, 105–108 1995). Nach dem Quetschen der Nerven regenerieren sensorische Axons im distalen Nerv und können durch ein nachfolgendes Zwicken des Nervs simuliert werden, was eine abdominale motorische Reflexantwort hervorruft. Die ersten regenerierenden Axons werden lokalisiert indem aufeinanderfolgende Segmente des Nervs in einer distalen und proximalen Richtung gezwickt werden, bis ein Reflex beobachtet wird und die Entfernung von der Nervenquetschung berechnet werden kann. Die Regenerierung zeigte eine statistisch signifikante Reduktion von 30–40% in Homozygoten verglichen mit dem Mauswildtyp bei 2, 4 und 6 Tagen nach der Nervenquetschung (5). Die Regenerierung war in heterozygoten Mäusen sofort, war jedoch immer noch signifikant verschieden von Tieren des Wildtyps.
Um zu testen, ob die verminderte Regenerationsrate in Mäusen mit Galanindefizienz die funktionale Erholung nach einer Quetschverletzung beeinträchtigt, wurde eine verhaltenskorrelierte Regenerierung mittels des Zehenspreizindex getestet (Hoogeveen, J. F., Van Der Kracht, A. H., Wondergem, J., Gonzalez Gonzalez, D. & Haveman, J. Neurotoxicology. 14, 1–7 1993). Nagetiere spreizen die Zehen an ihren hinteren Füßen bei Kontakt mit einer festen Oberfläche, eine Reaktion, die eine sensorische Innervation erfordert. Das Spreizen der Zehen geht daher nach Axotomie verloren, bis eine sensorische Reinnervation des Axons stattfindet. Der Abstand der gespreizten Zehen wurde sechs Wochen nach einseitiger Quetschung des rechten Ischiasnervs gemessen und mit dem intakten kontralateralen (linken) Fuß verglichen. Während das Spreizen der Zehen bei Mäusen vom Wildtyp innerhalb von drei Wochen nach dem Quetschen des Ischiasnervs wieder normal wurde, war die funktionale Regeneration in den mutanten Mäusen nach sechs Wochen immer noch unvollständig (6).
3. Die verminderte Regenerierung und Autotomie in den Mäusen mit Galanindefizienz konnte in Verbindung gebracht werden mit dem Absterben von Neuronen, das auf die Axotomie folgt, insbesondere derjenigen Neuronen, die nach einer Verletzung normalerweise Galanin exprimieren würden. Um zu untersuchen, ob Galanin für das Überleben von Neuronen während der Entwicklung essentiell ist, wurde die Verteilung galaninerger Neuronen in Wildtypen und mutanten Mäusen untersucht. Da wir nicht in der Lage waren, die galaninergen Neuronen in den mutanten Tieren bei der Proteinkonzentration zu visualisieren, wurde die Expression der mRNA mittels einer Ribosonde untersucht, die für Exon 6 (markiert als B, siehe 3) untersucht. Um das Überleben anderer Populationen galaninexprimierender Neuronen zu bestätigen, wurde die Exon 6-spezifische Ribosonde verwendet, um galaninerge Neuronen im Hippocampus und im paraventrikulären Nucleus des Hypothalamus von erwachsenen Wildtyp-Mäusen und mutanten Mäusen sichtbar zu machen (7). Es wurden keine Unterschiede in der Exprimierung zwischen den Gruppen beobachtet, was nahelegt, dass die neurale Entwicklung in diesen Tieren normal verläuft und nicht galaninabhängig ist.
Die Exon 6-spezifische Ribosonde wurde weiterhin verwendet, um die Verteilung von galaninergen Neuronen im DRG zwei Wochen nach Axatomie des Ischiasnervs zu untersuchen. Eine merkliche Regulierung nach oben in den Konzentrationen und der Anzahl von Zellen, die Galanin exprimieren, wurde in den DRG-Neuronen des Maus-Wildtyps beobachtet (7). Es lag jedoch keine Expression in den homozygoten Mäusen mit Galanindefizienz vor, was nahelegt, dass Galanin für diese Zellen erforderlich ist, um eine Axotomie zu überleben.
Diese Ergebnisse bezüglich Regenerierung und Überleben der Zellen sind dadurch besonders signifikant, dass die Ergebnisse zeigen, dass das Galaningen das erste Gen ist, das eine Regeneration des peripheren Nervensystems beeinflußt.
Demgemäß betrifft die Erfindung die Verwendung eines Galaninagonisten bei der Behandlung von peripherer sensorischer Neuropathie, die beispielsweise von Diabetes mellitus oder einem Trauma (wie es beispielsweise bei Verkehrsunfällen verursacht wird) herrührt.
4. Galanin ist mit der Ätiologie der Alzheimererkrankung in Verbindung gebracht worden. Die Galaninexpression des Hippocampus ist in cholinergen Neuronen erhöht, wenn Acetylcholin- und Cholinacetyltransferase (ChAT)- Konzentrationen sinken. Die Verabreichung von Galanin vermindert das Lernverhalten in einer Reihe von Mausmo dellen, das Gegenteil trifft ebenfalls zu, wenn Galaninantagonisten als Infusion verabreicht werden. Es wurde die Langzeitpotenzierung (LTP) in Mäusen vom Wildtyp und in Mutanten gemessen. LTP ist ein elektrophysiologischer Test, bei dem spezifische Nerven im Hippocampus durch einen elektrischen Schock simuliert werden: Davies CH, Collingridge-GL. J. Physiol. Lond. 1996; 496: 451–470; Davies CH, Starkey SJ, Pozza MF, Collingridge GL. GABA Nature 1991; 349: 609–611. Diese Vorgehensweise wird invitro durchgeführt, wobei Hirnscheiben aus erst kürzlich getöteten Tieren verwendet werden. Die Ergebnisse zeigen, dass LTP im Stratum oriens bei einem Zeitpunkt von 80 Minuten bei den Mutanten im Vergleich zu Mäusen vom Wildtyp um 50% erhöht ist (9A vs C). Im Gegensatz dazu wurde in im Stratum radiatum gemessenen LTP kein Unterschied gefunden. Galanin wird im Stratum oriens in hohen Konzentrationen gefunden, jedoch NICHT im Stratum radiatum. Unsere Daten zeigen soweit eine Abnahme in der LTP in den Mutanten, was eine Abnahme in Gedächtnis und Kognition impliziert – Tests zur Bewertung dieser Funktionen werden durchgeführt. Diese Daten zeigen, dass ein Galaninagonist bei der Behandlung von Alzheimererkrankung und dem damit verbundenen Gedächtnisverlust mit einer Verbesserung in Gedächtnis und Kognition brauchbar ist.

Claims

Verwendung eines Galaninagonisten zur Herstellung eines Medikamentes zum Reparieren einer Nervenschädigung.