DE69734725T2 - Neues verfahren zur überprüfung des differenzierungszustands pankreatischer zellen eines säugetiers - Google Patents

Neues verfahren zur überprüfung des differenzierungszustands pankreatischer zellen eines säugetiers Download PDF

Info

Publication number
DE69734725T2
DE69734725T2 DE69734725T DE69734725T DE69734725T2 DE 69734725 T2 DE69734725 T2 DE 69734725T2 DE 69734725 T DE69734725 T DE 69734725T DE 69734725 T DE69734725 T DE 69734725T DE 69734725 T2 DE69734725 T2 DE 69734725T2
Authority
DE
Germany
Prior art keywords
pax4
cells
pax6
mammal
gene
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Expired - Lifetime
Application number
DE69734725T
Other languages
English (en)
Other versions
DE69734725D1 (de
Inventor
Beatriz Sosa-Pineda
Peter Gruss
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Max Planck Gesellschaft zur Foerderung der Wissenschaften eV
Original Assignee
Max Planck Gesellschaft zur Foerderung der Wissenschaften eV
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority claimed from US08/778,423 external-priority patent/US6071697A/en
Application filed by Max Planck Gesellschaft zur Foerderung der Wissenschaften eV filed Critical Max Planck Gesellschaft zur Foerderung der Wissenschaften eV
Publication of DE69734725D1 publication Critical patent/DE69734725D1/de
Application granted granted Critical
Publication of DE69734725T2 publication Critical patent/DE69734725T2/de
Anticipated expiration legal-status Critical
Expired - Lifetime legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/8509—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells for producing genetically modified animals, e.g. transgenic
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K67/00—Rearing or breeding animals, not otherwise provided for; New or modified breeds of animals
    • A01K67/027—New or modified breeds of vertebrates
    • A01K67/0275—Genetically modified vertebrates, e.g. transgenic
    • A01K67/0276—Knock-out vertebrates
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/82—Translation products from oncogenes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2217/00—Genetically modified animals
    • A01K2217/05—Animals comprising random inserted nucleic acids (transgenic)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2217/00—Genetically modified animals
    • A01K2217/07—Animals genetically altered by homologous recombination
    • A01K2217/072—Animals genetically altered by homologous recombination maintaining or altering function, i.e. knock in
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2217/00—Genetically modified animals
    • A01K2217/07—Animals genetically altered by homologous recombination
    • A01K2217/075—Animals genetically altered by homologous recombination inducing loss of function, i.e. knock out
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2227/00—Animals characterised by species
    • A01K2227/10—Mammal
    • A01K2227/105—Murine
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2267/00—Animals characterised by purpose
    • A01K2267/03—Animal model, e.g. for test or diseases
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2267/00—Animals characterised by purpose
    • A01K2267/03—Animal model, e.g. for test or diseases
    • A01K2267/0306—Animal model for genetic diseases
    • A01K2267/0325—Animal model for autoimmune diseases
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2267/00—Animals characterised by purpose
    • A01K2267/03—Animal model, e.g. for test or diseases
    • A01K2267/0393—Animal model comprising a reporter system for screening tests
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/158—Expression markers

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Environmental Sciences (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Biodiversity & Conservation Biology (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Animal Husbandry (AREA)
  • Hematology (AREA)

Description

  • GEBIET DER ERFINDUNG
  • Die vorliegende Erfindung beschreibt Verfahren zum Testen des Differenzierungsstatus von Bauchspeicheldrüsenzellen in einem Säugetier; beispielsweise durch Feststellen des Gehalts oder Status von Pax4 mRNA und/oder Protein in Bauchspeicheldrüsenzellen (oder Bauchspeicheldrüsenvorläuferzellen) und durch Vergleich des Gehalts oder Status mit dem entsprechenden Gehalt oder Status in normalen Bauchspeicheldrüsen- (oder Bauchspeicheldrüsenvorläufer-) Zellen. Dieses Verfahren stellt ein Mittel zur Diagnose und Erkennung von Krankheiten, die von bestimmten Bauchspeicheldrüsenzellen ausgehen, dar, insbesondere ein Mittel zur Diagnose und Erkennung von, beispielsweise, Diabetes, wie etwa juveniler Diabetes. Das Verfahren kann in Verbindung mit dem Feststellen des Gehalts oder Status von Pax6 mRNA und/oder Protein in Bauchspeicheldrüsenzellen (oder Bauchspeicheldrüsenvorläuferzellen) und dem Vergleich des Gehalts oder Status mit dem entsprechenden Gehalt oder Status in normalen Bauchspeicheldrüsen- (oder Bauchspeicheldrüsenvorläufer-) Zellen durchgeführt werden.
  • Die unten ausgeführten Daten zeigen, dass ein Mangel an Pax4 Expression einen Mangel oder ein Ausbleiben der β-Zellentwicklung und damit der Insulinbildung (und somit Diabetes, wie etwa juvenile Diabetes) anzeigt. Die Erfindung bezieht sich somit auf die Wiederherstellung der Pax4 Expression zur Behandlung, Vorbeugung oder Verzögerung einer Bauchspeicheldrüsenerkrankung, wie etwa Diabetes, z.B. juveniler Diabetes und damit auf transgene Säugetiere, die durch Veränderung eine wiederhergestellte Pax4 Expression aufweisen, indem sie mindestens ein erstes Nukleinsäuremolekül umfassen, welches eine Sequenz aufweist, die für ein funktionelles und exprimierbares Pax4 Protein kodiert und gegebenenfalls eine zweite Nukleinsäuresequenz, die für ein funktionelles und exprimierbares Pax6 Protein kodiert. Alternativ oder darüber hinaus bezieht sich die Erfindung auf die Verabreichung von Pax4 allein oder mit Pax6 und/oder einem Mittel zur Stimulierung der Expression von Pax4 oder Pax4 und Pax6 zur Behandlung, Vorbeugung oder Verzögerung einer Bauchspeicheldrüsenerkrankung, wie etwa Diabetes, z.B. juveniler Diabetes.
  • Da die unten ausgeführten Daten zeigen, dass ein Mangel an Pax4 Expression einen Mangel oder ein Ausbleiben der β-Zellentwicklung und damit der Insulinbildung (und somit Diabetes, wie etwa juvenile Diabetes) anzeigt, erstreckt sich die vorliegende Erfindung auch auf transgene Säugetiere, die so modifiziert wurden, dass sie mindestens ein inaktiviertes Pax4 Allel umfassen. Dieses Säugetier hat zahlreiche Verwendungen, einschließlich der eines Forschungsmodells für Bauchspeicheldrüsenerkrankungen, wie etwa juvenile Diabetes und stellt somit ein neuartiges und wertvolles Tier zur Entwicklung von Therapien, Behandlungen etc. von Krankheiten dar, die durch einen Mangel oder ein Fehlen von Bauchspeicheldrüsenzellen verursacht werden. Demgemäß handelt es sich in diesem Fall um ein nicht-menschliches Säugetier, z.B. ein Labortier, wie etwa eine Maus oder Ratte.
  • Ferner, da eine fehlerhafte Expression von Pax4 auch Krankheiten wie Tumore verursachen kann, bezieht sich die Erfindung auch auf mindestens ein inaktiviertes Pax4 Allel zur Behandlung, Vorbeugung oder Verzögerung einer Bauchspeicheldrüsenerkrankung, die durch eine fehlerhafte Expression von Pax4 verursacht wird, wie etwa eines Tumors. In diesem Fall kann es sich bei dem zu behandelnden Tier um einen Menschen handeln, da die Einführung des mindestens einen inaktivierten Pax4 Allels zu therapeutischen Zwecken erfolgt. Alternativ oder darüber hinaus erstreckt sich die Erfindung auf die Verabreichung eines Mittels, welches Pax4 oder Pax4 und Pax6 hemmt zur Behandlung, Vorbeugung oder Verzögerung einer Bauchspeicheldrüsenerkrankung, die durch fehlerhafte Expression von Pax4 hervorgerufen wird, wie etwa eines Tumors.
  • Es werden im Text dieser Patentschrift mehrere Dokumente zitiert. Jedes der hier zitierten Dokumente (einschließlich von Herstellerdaten, Anleitungen, etc.) wird durch Querverweis hierin einbezogen.
  • ALLGEMEINER STAND DER TECHNIK
  • Die Bauchspeicheldrüse ist ein wesentliches Organ, welches sowohl eine exokrine Funktion, die bei der Zuführung von Enzymen in den Verdauungstrakt mitwirkt, als auch eine endokrine Funktion, durch welche verschiedene Hormone in den Blutstrom abgegeben werden, besitzt. Die exokrine Funktion wird durch acinare und centroacinare Zellen sichergestellt, die verschiedene Verdauungsenzyme (Amylase, Proteasen, Nuklease, etc.) bilden, sowie interkalierende Zellen des Duktus, welche diese Enzyme in alkaliner Lösung zum Zwölffingerdarm transportieren.
  • Die funktionelle Einheit der endokrinen Bauchspeicheldrüse sind die Langerhans'schen Inseln, die über den gesamten exokrinen Anteil der Bauchspeicheldrüse verteilt sind und aus vier Zelltypen bestehen: α-, β-, δ- und PP-Zellen, wie besprochen in Slack, Development 121 (1995), 1569-1580. β-Zellen bilden Insulin, stellen die Mehrheit der endokrinen Zellen dar und bilden den Kern der Inseln, während α-Zellen Glukagon ausscheiden und an der Peripherie angeordnet sind. δ-Zellen und PP-Zellen sind weniger zahlreich und scheiden Somatostatin beziehungsweise ein Bauchspeicheldrüsenpolypeptid aus. Insulin und Glukagon sind Schlüsselregulatoren des Glukosegehalts des Bluts. Insulin erniedrigt den Glukosegehalt des Bluts durch zelluläre Aufnahme von Glukose und deren Umwandlung in Glykogen. Glukagon erhöht den Glukosegehalt des Bluts durch Vermittlung des Abbaus von Leberglykogen. Gewöhnliche Bauchspeicheldrüsenerkran kungen, welche die endokrine Funktion beeinträchtigen, umfassen Diabetes mellitus und hormonausscheidende Tumoren.
  • Es wird angenommen, dass sämtliche vier endokrinen Zellen von einem gemeinsamen pluripotenten Vorläufer abstammen, der aus dem Endoderm stammt. Diese Vorläufer koexprimieren in einem frühen Stadium der Bauchspeicheldrüsenentwicklung verschiedene Hormone, wie etwa Insulin und Glukagon. Bei der Maus sind die α-Zellen die ersten sich differenzierenden endokrinen Zellen am Tag 9.5 nach der Empfängnis (p.c.), gefolgt von den β- und δ-Zellen am Tag 14.5 p.c. und den PP-Zellen am Tag 1 nach der Geburt. Es ist sehr wenig über die molekularen und genetischen Faktoren bekannt, die an der Definition der verschiedenen endokrinen Zelllinien beteiligt sind. Eines der wenigen bereits beschriebenen Gene ist das Homeoboxgen Pdx1, welches in den Anfangsstadien der Bauchspeicheldrüsenentwicklung exprimiert wird und auf β-Zellen in adulten Inseln beschränkt ist (Guz et al., Development 121 (1995), 11-18). Homozygote Pdx1 Mutanten der Maus bilden keine Bauchspeicheldrüse aus und sterben einige Tage nach der Geburt (Jonsson et al., Nature 371 (1994), 606-609).
  • Zwei Mitglieder der Pax Genfamilie, Pax4 und Pax6, werden ebenfalls in endokrinen Zellen während der Bauchspeicheldrüsenentwicklung exprimiert. Bis heute war es jedoch nicht bekannt, wie insbesondere das Pax4 und das Pax6 Gen die Bauchspeicheldrüsenentwicklung beeinträchtigen.
  • Ein Verfahren zum Testen einer Vielzahl von Differenzierungsparametern in der Bauchspeicheldrüse stand bislang nicht zur Verfügung, ist nichtsdestoweniger in hohem Maße erwünscht. Die durch ein solches Verfahren erhältlichen Ergebnisse haben einen signifikanten Einfluß auf z.B. die Diagnose und Therapie von Krankheiten, die in Beziehung zur Bauchspeicheldrüse stehen.
  • KURZDARSTELLUNG DER ERFINDUNG
  • Die vorliegende Erfindung beschreibt ein neues in-vitro Verfahren zum Testen des Differenzierungsstatus von Bauchspeicheldrüsenzellen in Säugetieren. Die vorliegende Erfindung bezieht sich weiterhin auf Anwendungen auf medizinischem Gebiet, welche sich direkt aus dem erfindungsgemäßen Verfahren ergeben. Darüber hinaus erstreckt sich die vorliegende Erfindung auf nicht-menschliche transgene Säugetiere, die mindestens ein inaktiviertes Pax4 Gen und gegebenenfalls mindestens ein inaktiviertes Pax6 Gen umfassen.
  • AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
  • Dementsprechend war ein der vorliegenden Erfindung zu Grunde liegendes Problem die Bereitstellung eines solchen Verfahrens zur Kontrolle des Differenzierungsstatus von Bauchspeicheldrüsenzellen. Die Lösung dieses Problems wird durch die in den Ansprüchen gekennzeichneten Ausführungsformen erreicht.
  • Die vorliegende Erfindung bezieht sich somit auf ein in-vitro Verfahren zum Testen des Differenzierungsstatus in Bauchspeicheldrüsenzellen eines Säugetiers umfassend
    • (a) das Feststellen des Gehalts oder Status von Pax4 mRNA in Bauchspeicheldrüsenzellen des Säugetiers, und/oder
    • (b) das Feststellen des Gehalts oder Status von Pax4 Protein in Bauchspeicheldrüsenzellen des Säugetiers, und
    • (c) das Vergleichen des Gehalts oder Status von Pax4 mRNA und/oder Pax4 Protein mit dem entsprechenden Gehalt in normalen Bauchspeicheldrüsenzellen,
    wobei das Feststellen und das Vergleichen des Status von Pax4 mRNA und/oder Pax4 Protein die Feststellung und den Vergleich kennzeichnet, ob die mRNA oder das Protein eine Mutation, Deletion oder eine posttranslationale Modifikation trägt, was die Gesamtaktivität des Gens bei einem Vergleich mit dem normalen Genprodukt des Wildtyps beeinflussen würde.
  • Im Rahmen der vorliegenden Erfindung bezeichnet der Begriff „Gehalt" die Menge an hergestellter mRNA oder hergestelltem Protein. Der Begriff „Status" umfasst die Möglichkeiten, dass Gen, mRNA, Protein oder ein transkriptorisches Kontrollelement, z.B. Promotor/Verstärkersequenz eine Mutation, Deletion oder jede beliebige andere Modifikationen tragen kann, welche die Gesamtaktivität des Gens im Vergleich zu dem normalen Genprodukt des Wildtyps beeinflussen würde. In diesen Begriff sind posttranslationale Modifikationen des Proteins eingeschlossen.
  • Das Verfahren der vorliegenden Erfindung erlaubt erstmals eine detaillierte Untersuchung der Entwicklung verschiedener Zelltypen, d. h. α-, β-, δ- und PP-Zellen im Bauchspeicheldrüsengewebe. Wie in den angefügten Beispielen ausgeführt, ist das Pax4 Gen, gegebenenfalls in Verbindung mit dem Pax6 Gen, an den frühen Stufen der Bauchspeicheldrüsenentwicklung beteiligt. Dieses überraschende Ergebnis erlaubt die Kontrolle des Zellschicksals sowie die Untersuchung der Entstehung von Krankheiten, die von bestimmten in der Bauchspeicheldrüse enthaltenen Zelltypen ausgehen. Die gemäß der vorliegenden Erfindung gezeigten Ergebnisse erlauben ferner die Schlußfolgerung, dass Pax4 und/oder Pax6 Hauptregulatoren für spezifische Bauchspeicheldrüsenzellen darstellen. Pax4 scheint somit ein Hauptregulator von β-Zellen zu sein. Pax4 wird auch in Nicht-Bauchspeicheldrüsenzellen exprimiert. Pax4 Expression wird in einem Teil von Zellen des sich entwickelnden Rückenmarks nachge wiesen. Daher kann Pax4 ebenso eine Rolle im Differenzierungsstatus dieser Zellen spielen.
  • Demgemäß stellt das vorliegende Verfahren ein Mittel zur Diagnose und Erkennung von Krankheiten bereit, die von bestimmten Bauchspeicheldrüsenzellen ausgehen, insbesondere ein Mittel zur frühzeitigen Erkennung oder Diagnose; beispielsweise Erkennung oder Diagnose von Diabetes, wie etwa juveniler Diabetes, wobei eine solche Diagnose und Erkennung prä- oder postnataler Natur sein kann.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst das in vitro Verfahren der vorliegenden Erfindung
    • (d) das Feststellen des Gehalts oder Status von Pax6 mRNA in Bauchspeicheldrüsenzellen des Säugetiers, und/oder
    • (e) das Feststellen des Gehalts oder Status von Pax6 Protein in Bauchspeicheldrüsenzellen des Säugetiers, und
    • (f) das Vergleichen des Gehalts oder Status von Pax6 mRNA und/oder Pax6 Protein mit dem entsprechenden Gehalt in normalen Bauchspeicheldrüsenzellen,
    wobei das Feststellen und das Vergleichen des Status von Pax6 mRNA und/oder Pax6 Protein die Feststellung und den Vergleich kennzeichnet, ob die mRNA oder das Protein eine Mutation, Deletion oder eine posttranslationale Modifikation trägt, was die Gesamtaktivität des Gens bei einem Vergleich mit dem normalen Genprodukt des Wildtyps beeinflussen würde.
  • Diese Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ermöglicht die Untersuchung der synergistischen Wirkungen der Pax4 und der Pax6 Genprodukte. Es wird erwartet, dass die Analyse dieser synergistischen Wirkungen einen tieferen Einblick in die Regulation zellspezifischer Entwicklungsvorgänge in der Bauchspeicheldrüse bereitstellt. Die Entwicklung diagnostischer und pharmazeutischer Zusammensetzungen in Bezug auf für die Bauchspeicheldrüse spezifische Krankheiten wird von diesem tieferen Einblick in hohem Maße profitieren.
  • In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens befindet sich das Säugetier in der
    • (i) embryonalen;
    • (ii) neugeborenen; oder
    • (iii) adulten Phase.
  • Wie erfindungsgemäß gezeigt wurde, wird das Pax4 Gen, vorzugsweise in Verbindung mit dem Pax6 Gen, in unterschiedlicher Höhe und in unterschiedlichen Phasen der Bauchspeicheldrüsenentwicklung eines Säugetiers exprimiert. Die spezifische Analyse der Entwicklungsphase der Bauchspeicheldrüsenzellen in der embryonalen, neugeborenen oder adulten Phase wird weiteren Einblick in beispielsweise spezifische Krankheitszustände, die mit den jeweiligen Phasen in Verbindung stehen, bereitstellen. Zum Beispiel wird erwartet, dass die Ätiologie z.B. der juvenilen Diabetes durch Anwendung des Verfahrens der vorliegenden Erfindung wie auch durch Verwendung der erfindungsgemäßen transgenen (nicht-menschlichen) Säugetiere aufgeklärt wird (in der Folge diskutiert; siehe auch die Beispiele). Auf Grundlage dieses Wissens werden neuartige pharmazeutisch wirksame Medikamente z.B. gegen juvenile Diabetes entwickelt und getestet werden.
  • Das erfindungsgemäße Verfahren kann, je nach Zielsetzung der Untersuchung, auf eine Anzahl von Säugetieren angewandt werden. In einer bevorzugten Ausführungsform handelt es sich bei dem Säugetier somit um eine Maus. Diese Ausführungsform ist insbesondere für die Grundlagenforschung nützlich, um eine klarere Auffassung von der funktionellen Wechselbeziehung verschiedener Proteine, welche die Bauch speicheldrüsenentwicklung regulieren, zu erhalten. In einer weiteren Ausführungsform handelt es sich bei dem Säugetier um einen Menschen. Bei dieser Ausführungsform wird vorzugsweise an diagnostische und therapeutische Anwendungen gedacht.
  • Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren werden die Schritte (a) und wahlweise (d) und/oder (b) und wahlweise (e) in vitro durchgeführt.
  • Es wird erwartet, dass die Vorteile dieser Ausführungsform in erster Linie diagnostischen Anwendungen und erneut der Grundlagenforschung zugute kommen.
  • In einer weiteren Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens wird das Feststellen in Schritt (a) und wahlweise in Schritt (d) durch den Einsatz
    • (i) einer Nukleinsäuresequenz, die mindestens einem Teil des Pax4 Gens entspricht und vorzugsweise mindestens für einen Teil des Pax4 Proteins kodiert und wahlweise einer zweiten Nukleinsäuresequenz, die mindestens einem Teil des Pax6 Gens entspricht und vorzugsweise mindestens für einen Teil des Pax6 Proteins kodiert;
    • (ii) einer Nukleinsäuresequenz, die zu der/den Nukleinsäuresequenz(en) von (i) komplementär ist; oder
    • (iii) eines Starters oder eines Starterpaares, das an die Nukleinsäuresequenz(en) von (i) oder (ii) hybridisiert, erfolgt.
  • Gemäß dieser Ausführungsform der vorliegenden Erfindung kann das Verfahren zum Testen des Differenzierungsstatus durch Verwendung eines Nukleinsäuremoleküls, das für das Pax4 Gen und/oder das Pax6 Gen oder einen Teil dessen kodiert, erfolgen, z.B. in Form eines Southern oder Northern Blots oder einer in situ Analyse. Das Nukleinsäuremolekül kann an eine kodierende Region eines der Gene oder an eine nichtkodierende Region hybridisieren. Im Falle des Einsatzes einer komplementären Sequenz gemäß (ii) für das erfindungsgemäße Verfahren, kann das Nukleinsäuremolekül wiederum in Northern Blots verwendet werden. Zusätzlich kann das Testen in Verbindung mit einer tatsächlichen Blockierung z.B. der Transkription des Gens durchgeführt werden, wodurch eine therapeutische Bedeutung erwartet wird. Weiterhin kann ebenfalls ein Starter oder Oligonukleotid zur Hybridisierung an eines der oben erwähnten Pax Gene oder der entsprechenden mRNAs verwendet werden. Die zur Hybridisierung verwendeten Nukleinsäuren können selbstverständlich praktischerweise markiert werden durch Einbau oder Anheftung z.B. eines radioaktiven oder anderweitigen Markers. Solche Marker sind im Stand der Technik hinlänglich bekannt. Die Markierung der Nukleinsäuremoleküle kann mittels herkömmlicher Verfahren erfolgen.
  • Zusätzlich kann das Vorhandensein oder die Expression von Pax4 und wahlweise Pax6 unter Verwendung eines Starterpaares kontrolliert werden, welches in spezifischer Art und Weise an eine der entsprechenden Nukleinsäuresequenzen bindet, sowie unter Durchführung einer PCR Reaktion nach Standardverfahren.
  • Eine spezifische Hybridisierung der oben erwähnten Sonden oder Starter erfolgt vorzugsweise unter stringenten Hybridisierungsbedingungen. Der Begriff „stringente Hybridisierungsbedingungen" ist im Stand der Technik gängig; siehe beispielsweise Sambrook et al., „Molecular Cloning, A Laboratory Manual" zweite Auflage, CSH Press, Cold Spring Harbor, 1989; „Nucleic Acid Hybridisation, A Practical Approach", Hames and Higgins eds., IRL Press, Oxford, 1985.
  • Weitere Modifikationen der obigen Ausführungsform der Erfindung können durch den Fachmann auf einfache Art und Weise, ohne unangemessenes Experimentieren ausgehend von dieser Offenbarung unternommen werden.
  • Eine weitere Ausführungsform der vorliegenden Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren, wobei das Feststellen in Schritt (b) und wahlweise Schritt (e) durch Einsatz eines Antikörpers oder eines Fragmentes desselben, der sich spezifisch an das Pax4 Protein bindet, erfolgt und wahlweise durch Einsatz eines zweiten Antikörpers oder eines Fragmentes desselben, der sich spezifisch an das Pax6 Protein bindet.
  • Antikörper oder deren Fragmente gegen das genannte Protein können unter Verwendung herkömmlicher Verfahren erhalten werden, die z.B. in Harlow and Lane „Antibodies, A Laboratory Manual", CSH Press, Cold Spring Harbor, 1988 beschrieben werden. Diese Antikörper können monoklonale Antikörper sein oder in polyklonalen Antiseren oder deren Fragmenten enthalten sein. Der in dem erfindungsgemäßen Verfahren verwendete Antikörper kann mit nachweisbaren Tags, wie etwa Histidinflags oder einem Biotinmolekül, markiert werden.
  • In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform des Verfahrens der vorliegenden Erfindung handelt es sich bei den Bauchspeicheldrüsenzellen um β-Zellen oder δ-Zellen.
  • Erfindungsgemäß wurde festgestellt, dass Pax4 in β-Zellen exprimiert wird. Eine Störung der Pax4 Genfunktion ermöglicht daher eine genaue Kontrolle der Entwicklung dieser Zellen in der Bauchspeicheldrüse. Da Pax6 ebenso in sowohl α- als auch β-Zellen exprimiert wird, kann eine Pax6 Expression zur Bildung eines angemessenen Hintergrunds für die Wirkungsweise von Pax4 erforderlich sein.
  • Da sowohl Pax4 als auch Pax6 regulatorische Proteine sind, die für die richtige Differenzierung endokriner Zellen erforderlich sind, kann diese Ausführungsform eine Anzahl von Schlussfolgerungen hinsichtlich der Ausbildung von Krankheiten, wie etwa Bauchspeicheldrüsentumoren, gestatten.
  • Demgemäß bezieht sich eine weitere Ausführungsform auf ein Verfahren, bei dem der Differenzierungsstatus eine Malignität oder ein malignes Potential der Bauchspeicheldrüsenzelle anzeigt. Die Überexpression oder Abwesenheit eines funktionellen Pax4 und wahlweise Pax6 Produkts kann normale endokrine Zellen dazu induzieren, kanzerogen zu werden. In Übereinstimmung mit dieser Aussage werden allelische Deletionen im Chromosom 7q in der Nähe des Pax4 Gens in vielen Bauchspeicheldrüsenkarzinomen beobachtet (Alberto et al., Cancer Res. 56 (1996), 3808-3818). Pax4 und wahlweise Pax6 können auch mit weiteren onkogenen Faktoren zusammenwirken.
  • Malignität oder malignes Potential wird erfindungsgemäß vorzugsweise aber nicht ausschließlich in Verbindung mit Bauchspeicheldrüsentumoren, wie etwa Insulinomen, Glucagonomen, Somatostatinomen und Adenokarcinomen der Ductuszellen verwendet.
  • Die vorliegende Erfindung bezieht sich in einer weiteren bevorzugten Ausführungsform auf ein Verfahren, das ferner umfasst
    • (a') vor dem Testen, die Entfernung eines festen Bauchspeicheldrüsentumors aus dem Säugetier; sowie
    • (b') nach dem Testen, mindestens teilweise Ausschaltung der Expression des Pax4 Gens und wahlweise des Pax6 Gens in Zellen des Tumors, falls das/die Gen(e) überexprimiert wird/werden, oder die Anregung der Expression des Pax4 Gens und wahlweise des Pax6 Gens oder die Einführung eines funktionellen und exprimierbaren Pax4 Gens und wahlweise eines funktionellen und exprimierbaren Pax6 Gens in die Zellen, falls das/die Gen(e) unterexprimiert oder nicht exprimiert wird/werden; sowie
    • (b'') die Wiedereinführung der als Produkt aus Schritt (b') erhaltenen Zellen in das Säugetier.
  • In diesem Zusammenhang und wie in dieser Beschreibung durchgängig verwendet bedeutet „funktionelles" Pax4 (Pax6) ein Protein, welches ganz oder teilweise die primäre strukturelle Konformation des Pax4 (Pax6) Proteins aufweist, das die biologische Eigenschaft besitzt, zur Entwicklung von endokrinen Zellen zu β-Zellen (α-Zellen und Langerhans Zellen) beizutragen, wobei das Protein ein Produkt der prokaryotischen oder eukaryotischen Expression einer DNA Sequenz ist, die für Pax4 (Pax6) kodiert und eine Aminosäuresequenz aufweist, welche die Aminosäuresequenz in SEQ ID Nr:2 oder 18 (SEQ ID Nr: 4) oder ein beliebiges Fragment oder Derivat davon durch Deletion, Substitution, Insertion, Addition und/oder Ersetzen von Aminosäuren der in SEQ ID Nr:2 oder 18 (SEQ ID Nr: 4) angegebenen Aminosäuresequenz aufweist. Weiterhin wird von dem Begriff „funktionelles" Pax4 (Pax6) Protein die Fähigkeit des Proteins oder eines Teiles davon umfasst, eine spezifische Immunantwort, wie etwa eine Antikörperantwort, hervorzurufen.
  • Diese Ausführungsform der vorliegenden Erfindung eignet sich für die Therapie von Tumoren, insbesondere beim Menschen. Es wird daher vorgesehen, dass Tumorzellen der Bauchspeicheldrüse hinsichtlich des Expressionsniveaus des Pax4 Proteins und wahlweise des Pax6 Proteins kontrolliert werden. Der Nachweis einer Überexpression dieses Proteins bzw. dieser Proteine würde die Schlussfolgerung zulassen, dass diese Überexpression mit der Ausbildung und Aufrechterhaltung des Tumors in Zusammenhang steht. Dementsprechend würden Maßnahmen unternommen, die Expressionsniveaus auf normale Niveaus zu senken. Dies kann beispielsweise durch ein zumindest teilweises Ausschalten der Expression des Pax4 Gens durch biologische Mittel ausgeführt werden, zum Beispiel durch die Verwendung von Ribozymen, Antisinn-Nukleinsäuremolekülen oder intrazellulären Antikörpern gegen entweder das Pax4 oder das Pax6 Protein. Ferner können pharmazeutische Produkte entwickelt werden, welche die Expressionsniveaus von Pax4 herabsetzen. Während es momentan unklar erscheint, wie Pax4 und wahlweise Pax6 in Bauchspeicheldrüsengewebe reguliert werden, erscheint es möglich, dass verschiedene Entwicklungs- und hormonale Faktoren das Aktivitätsniveau dieser Gene bestimmen. Beispielsweise ist es bekannt, dass kleine Moleküle die Expression bestimmter Gene unterdrücken können. Es konnte gezeigt werde, dass Aktivin A, ein Mitglied der TGFβ Superfamilie, die Expression von Pax6 im sich entwickelnden Rückenmark regulatorisch senken kann (Pituello et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92 (1995), 6952-6956). Ähnliche Moleküle könnten die Expression von Pax4 oder wahlweise Pax6 in der Bauchspeicheldrüse regulatorisch senken. Andererseits kann ein Fehlen der Expression oder eine Unterexpression durch ein funktionelles Pax4 Gen und wahlweise ein funktionelles Pax6 Gen, wobei beide in den Tumorzellen exprimierbar sein sollten, behoben werden. Eine Stimulation oder Induzierung der Expression kann wiederum unter Verwendung kleiner Moleküle oder anderer Mittel erhalten werden, welche in diesem Fall die Pax4 Genexpression aktivieren. In dieser Hinsicht ist es von Bedeutung festzustellen, dass die vorliegende Erfindung die Möglichkeiten vorsieht, dass eines der Pax Gene in diesem malignen Zustand überexprimiert wird, während das zweite Pax Gen unterexprimiert wird. Schließlich hinterläßt eine chirurgische Entfernung oder eine chemotherapeutische Behandlung von Bauchspeicheldrüsentumoren beim Menschen den Patienten oftmals ohne eine signifikante Zahl Insulin produzierender Zellen. Pax4 und wahlweise Pax6 können im Rahmen der Gewebetechnik (Langer and Vacanti, Science 260 (1993), 920-924) zur Entwicklung funktionellen Ersatzes für fehlende oder beschädigte β-Zellen verwendet werden. Bauchspeicheldrüsentumorzellen, welche in vitro normale Niveaus der Pax4 Expression und wahlweise der Pax6 Expression zurückgebildet haben, können in den Patienten wieder eingeführt werden, so dass der Patient mit normalen Insulin produzierenden Zellen seines eigenen genetischen Hintergrundes versorgt wird, wobei das Risiko einer immunologischen Abstoßung der Zellen verringert wird.
  • In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist das Testen des Differenzierungsstatus in Bauchspeicheldrüsenzellen ein Testen des Entwicklungsstatus in β-Zellen, der, wie in den Beispielen gezeigt, juvenile Diabetes anzeigt. Juvenile Diabetes ist oftmals das Resultat des Mangels oder Fehlens einer β-Zellentwicklung. Die Beispiele zeigen, dass ein Mangel der Pax4 Expression den Mangel oder das Fehlen einer β-Zellentwicklung und somit der Insulinproduktion (und folglich Diabetes, wie etwa juvenile Diabetes) anzeigt.
  • Eine frühzeitige Diagnose juveniler Diabetes ist besonders vorteilhaft und von beträchtlicher medizinischer Bedeutung. Es ist somit eine bevorzugte Ausführungsform, die Verfahren der Erfindung zur Diagnose oder zum Nachweis von Diabetes einzusetzen. Diese bevorzugte Ausführungsform kann zur Diagnose juveniler Diabetes in den koronaren Villi, das heißt vor der Implantation des Embryos, verwendet werden. Ferner kann juvenile Diabetes nach dem erfindungsgemäßen Verfahren durch Amniozentese diagnostiziert werden. Die frühzeitige Diagnose juveniler Diabetes gemäß aller Anwendungen des Verfahrens der vorliegenden Erfindung erlaubt die Behandlung unmittelbar nach der Geburt, vor dem Einsetzen klinischer Symptome.
  • In einer besonders bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens wird das Testen des Differenzie rungsstatus in β-Zellen bei einem embryonalen oder neugeborenen Säugetier durchgeführt.
  • Wie im obigen angedeutet, wird die Aufnahme mindestens eines weiteren Schrittes in das Verfahren der Erfindung besonders bevorzugt, welcher für unterschiedliche pharmazeutische und gentherapeutische Anwendungen spezifisch ist. Wie oben erwähnt, könnten verschiedene kleine, pharmazeutisch aktive Moleküle verwendet werden, die Pax4- und wahlweise die Pax6-Expression zu aktivieren und somit die Differenzierung und Bildung Insulin produzierender β-Zellen zu induzieren. Dementsprechend würde eine intrazelluläre zielgerichtete Manipulation von aktivem Pax4 und/oder wahlweise Pax6 ähnliche Konsequenzen hervorrrufen. Im Einklang mit dieser Aussage wurde vorgeschlagen, dass epitheliale Zellen des Bauspeicheldrüsenductus potentielle Stammzellen für endokrine Zelltypen enthielten. Eine Induktion von Pax4 in diesen Zellen, aber nicht ausschließlich in diesen Zellen, kann eine Differenzierung zu Insulin produzierenden Zellen fördern (Parsa et al., 1985, Cancer Res. 45:1285-1290).
  • In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens ist der Differenzierungsstatus der Bauchspeicheldrüsenzellen das Ergebnis der Wirkung eines Medikamentes oder einer gentherapeutischen Anwendung. Beispielsweise kann der Differenzierungsstatus durch gentherapeutische Anwendungen beeinflusst werden, bei denen ein funktionelles Pax4 und wahlweise Pax6 Gen in vitro in Zellen eingeführt wird unter Verwendung eines retroviralen Vektors (Naldini et al., Science 272 (1996), 263-267; Mulligan, Science 260 (1993), 926-932) oder eines anderen geeigneten Vektors. Dementsprechend können erfindungsgemäß Zellen eines Patienten isoliert, zur Differenzierung zu β-Zellen unter Verwendung von herkömmlichen Gewebekulturtechniken in vitro modifiziert und wieder in den Patienten eingeführt werden.
  • In einer besonders bevorzugten Ausführungsform beeinträchtigt die medikamentöse oder gentherapeutische Anwendung das Expressionsniveau des Pax4 Gens und wahlweise des Pax6 Gens auf der mRNA- oder Proteinebene.
  • Die obigen Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung gestatten unter anderem das Testen eines Medikamentes hinsichtlich dessen Einfluß auf die Expression der zuvor erwähnten Pax Gene. Wie im obigen ferner festgestellt wurde, wird angenommen, dass abnormale Expressionsniveaus von Pax4 und wahlweise Pax6 für die Entstehung von beispielsweise soliden Tumoren der Bauchspeicheldrüse ursächlich sind. Das erfindungsgemäße Verfahren gestattet somit das Testen von Medikamenten, deren Anwendung der Zelle das Zurückkehren auf ein normales Expressionsniveau erlauben würde. Es würde erwartet, dass diese normale Expression einen direkten Einfluß auf z.B. die Malignität einer Zelle hat. Wenn beispielsweise eine Krankheit oder ein Tumor das direkte oder indirekte Ergebnis einer Unterexpression von Pax4 darstellt, würde der den betreffenden Patienten behandelnde Arzt ein Medikament verabreichen, das die Expression von Pax4 anregt.
  • In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens ist das Testen des Differenzierungsstatus in Bauchspeicheldrüsenzellen ein Testen des Entwicklungsstatus von Pax4 Knockout Mäusen, welche wahlweise gleichzeitig Pax6 Knockout Mäuse sind.
  • In einer zusätzlichen bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens umfasst das Verfahren ferner das Einführen eines funktionellen und exprimierbaren Pax4 Gens und umfasst wahlweise ferner das Einführen eines funktionellen und exprimierbaren Pax6 Gens in α-Zellen oder epitheliale Ductuszellen der Bauchspeicheldrüse, die einen ähnlichen aber dennoch unterschiedlichen Differenzierungsweg im Vergleich zu β-Zellen aufweisen. Durch diese Ausführungsform der Erfindung wird der Fachmann in die Lage versetzt, das Schicksal von α-Zellen in epitheliale Ductuszellen oder β-Zellen umzuleiten. Es wird somit erwartet, dass α-Zellen nach der Transfektion mit dem Pax4 Gen und wahlweise dem Pax6 Gen zu β-Zellen differenzieren. Eine entsprechende pharmazeutische Anwendung ist vorgesehen, wenn ein Patient an β-Zell- und somit Insulinmangel leidet. Die Durchführung dieses Verfahrens ist in vitro oder in vivo vorgesehen.
  • Die vorliegende Erfindung bezieht sich ferner auf ein nicht-menschliches transgenes Säugetier, das mindestens ein inaktiviertes Pax4 Allel umfasst.
  • Das nicht-menschliche transgene Säugetier der vorliegenden Erfindung kann vorzugsweise zur Kontrolle der Entwicklung verschiedener Zellen, beispielsweise in der Bauchspeicheldrüse, verwendet werden. Die Verwendung des nichtmenschlichen transgenen Säugetiers ist jedoch nicht auf das Studium der Bauchspeicheldrüsenentwicklung beschränkt. Da erfindungsgemäß nunmehr angenommen wird, dass Pax4 ein Hauptregulator für β-Zellen ist, kann dessen Einfluß auch in anderen Zelltypen des Körpers untersucht werden.
  • Da das erfindungsgemäße nicht-menschliche transgene Säugetier, bei dem es sich vorzugsweise um eine homozygote transgene Maus handelt, schwerwiegende Bauchspeicheldrüsenkrankheiten aufweist, die im Falle transgener Mäuse zum Tod innerhalb von drei Tagen nach der Geburt führen, kann das transgene Tier ferner zur Untersuchung von Krankheiten verwendet werden, die in Verbindung mit Entwicklungskrankheiten, insbesondere der Bauchspeicheldrüse, stehen. Da die transgenen Mäuse einen Mangel an Insulin produzierenden Zellen aufweisen und klinische Symptome zeigen, die denen menschlicher Patienten, welche an juveniler Diabetes leiden, ähneln, können die Mäuse als Tiermodell für die thera peutische und pharmazeutische Forschung gegen juvenile Diabetes dienen.
  • Vorzugsweise umfasst das erfindungsgemäße nicht-menschliche Säugetier mindestens ein inaktiviertes Pax6 Allel.
  • Diese Ausführungsform gestattet das Studium des Zusammenwirkens von Pax4 und Pax6 bei der Entwicklung des Säugetiers oder bestimmter Gewebe dessen, insbesondere der Bauchspeicheldrüse. Alle Anwendungen, die im vorigen hinsichtlich des Pax4 transgenen Säugetiers diskutiert wurden, gelten auch für das Säugetier, welches zwei Transgene trägt. Es kann auch wünschenswert sein, die Pax4 Expression und wahlweise die Pax6 Expression in einem bestimmten Entwicklungs- und/oder Lebensstadium des nicht-menschlichen trangenen Säugetiers zu inaktivieren. Dies kann durch die Verwendung von z.B. gewebespezifischen, entwicklungsspezifischen und/oder zellregulierten und/oder induzierbaren Promotoren erreicht werden, welche die Expression z.B. eines Antisinnmoleküls oder eines Ribozyms steuern, die gegen das RNA Transkript, welches für das Pax4 Protein kodiert und wahlweise die für Pax6 kodierende RNA gerichtet sind. Ein geeignetes induzierbares System ist beispielsweise die durch Tetrazyklin regulierte Genexpression wie beschrieben z.B. durch Gossen und Bujard (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89 (1992), 5547-5551) und Gossen et al. (Trends Biotech. 12 (1994), 58-62).
  • In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist das transgene Säugetier ein Mensch, eine Maus oder eine Ratte.
  • Erfindungsgemäß kann das transgene Tier homozygot oder heterozygot für entweder das inaktivierte Pax4, das inaktivierte Pax6 oder für beide inaktivierte Gene sein.
  • Weiterhin bezieht sich die vorliegende Erfindung auf die Verwendung mindestens einer ersten Nukleinsäuresequenz, die für ein funktionelles und exprimierbares Pax4 Protein kodiert und wahlweise einer zweiten Nukleinsäuresequenz, die für ein funktionelles und exprimierbares Pax6 Protein kodiert zur Behandlung, Vorbeugung und/oder Verzögerung von Diabetes bei einem Säugetier. Erfindungsgemäß können Vektoren, die diese Nukleinsäuresequenzen enthalten, in operativer Verbindung zu regulatorischen Elementen stehen, welche die Expression der Nukleinsäuresequenzen und/oder das zielgerichtete Einschleusen der Nukleinsäuresequenzen in Bauchspeicheldrüsenzellen gestatten.
  • Die Erfindung bezieht sich ferner auf die Verwendung eines funktionellen Pax4 Proteins und wahlweise eines funktionellen Pax6 Proteins zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung zur Behandlung, Vorbeugung und/oder Verzögerung von Diabetes bei einem Säugetier. Der Begriff „funktionell" trägt dieselbe Bedeutung wie im obigen erläutert.
  • Vorzugsweise handelt es sich bei dem Säugetier, bei dem Diabetes behandelt, vorgebeugt und/oder verzögert wird, um einen Menschen, eine Ratte oder eine Maus. Die Erfindung erstreckt sich ferner auf ein nicht-menschliches transgenes Säugetier, welches modifiziert wurde, so dass es mindestens ein erstes Nukleinsäuremolekül umfasst, das eine Sequenz enthält, die für ein funktionelles und exprimierbares Pax4 Protein kodiert sowie wahlweise ein zweites Nukleinsäuremolekül, das eine Sequenz enthält, die für ein funktionelles und exprimierbares Pax6 Protein kodiert (wobei das Säugetier eine Expression des Nukleinsäuremoleküls bzw. der Nukleinsäuremoleküle aufweist). Das Säugetier kann pränatal oder postnatal modifiziert werden, z.B. nachdem ein erfindungsgemäßes Verfahren wenig, verändertes oder kein Pax4 Protein oder mRNA zeigt, zur Behandlung, Vorbeugung oder Verzögerung von Diabetes und die Modifikation kann mittels hierin diskutierter Techniken oder mittels Techniken erfol gen, die im Kenntnisbereich des Fachmanns, ohne unverhältnismäßigen Experimentieraufwand ausgehend von der vorliegenden Offenbarung liegen.
  • Die vorliegende Erfindung sieht vor, dass die Nukleinsäuren und Proteine allein oder in jedweder Kombination sowie wahlweise gemeinsam mit einem pharmazeutisch verträglichen Träger oder Bindemittel verabreicht werden. Die Nukleinsäuresequenzen können stabil in das Genom des Säugetiers eingebaut werden. Andererseits können virale Vektoren verwendet werden, die für bestimmte Zellen oder Gewebe, insbesondere Bauchspeicheldrüse und/oder Gehirn spezifisch sind, und welche in den Zellen verbleiben, wodurch eine Expression der Pax Gene in den Zellen vermittelt wird. Geeignete pharmazeutische Träger und Bindemittel sind im Stand der Technik hinlänglich bekannt. Elemente, die zur zielgerichteten Einschleusung eines Nukleinsäuremoleküls und/oder Proteins in spezifische Zellen befähigt sind, werden im Stand der Technik beschrieben, beispielsweise in Somia et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92 (1995), 7570-7574. Die pharmazeutischen Zusammensetzungen können dem Säugetier in einer geeigneten Dosis verabreicht werden, die ausgehend von der vorliegenden Offenbarung und allgemeinem Fachwissen ohne unverhältnismäßigen Experimentieraufwand seitens des Fachmanns bestimmt werden kann, unter Berücksichtigung typischer Faktoren wie unter anderen Art, Alter, Geschlecht, Gewicht, Zustand des Säugetieres, Weg der Verabreichung, ob ein Pax4 Protein oder Pax4 und Pax6 Proteine verabreicht werden, ob ein Mittel zur Hemmung oder Stimulation von Pax4 oder Pax4 und Pax6 verabreicht wird, ob eine Nukleinsäure oder Nukleinsäuren verabreicht werden und ob die Nukleinsäure oder Nukleinsäuren zur Expression von Pax4 oder Pax4 und Pax6 oder zur Hemmung der Expression von Pax4 oder Pax4 und Pax6 gedacht sind. Eine typische Dosis kann beispielsweise im Bereich von 0,001 bis 1000 μg liegen (oder von Nukleinsäuren zur Expression oder zur Hemmung der Expression in diesem Bereich); jedoch werden Dosen unterhalb oder oberhalb dieses beispielhaften Bereiches in Betracht gezogen, insbesondere in Anbetracht der zuvor genannten Faktoren.
  • Eine Verabreichung der geeigneten Zusammensetzungen kann auf unterschiedlichem Wege erfolgen, z.B. durch intravenöse, intraperitoneale, subcutane, intramuskuläre, topische oder intradermale Verabreichung. Die erfindungsgemäß hergestellten pharmazeutischen Zusammensetzungen können zur Vorbeugung oder Behandlung oder Verzögerung verschiedener Arten von Krankheiten, beispielsweise Bauchspeicheldrüsenerkrankungen, nämlich Diabetes und verwandten Erkrankungen verwendet werden. Diese Krankheiten und Funktionsstörungen gehen vorzugsweise von endokrinen Geweben, z.B. der Bauchspeicheldrüse, aus.
  • Es ist ferner möglich, eine pharmazeutische Zusammensetzung zur Gentherapie zu verwenden, die eine Nukleinsäuresequenz umfasst, welche für ein Pax4 Protein kodiert und wahlweise eine Nukleinsäuresequenz, welche für ein Pax6 Protein kodiert. Natürlich können beide Sequenzen auch in demselben Vektor enthalten sein. Wie oben ausgeführt, entwickeln sich die Krankheiten häufig, wenn Zellen beide funktionellen Kopien der Pax Gene verlieren. In einem solchen Fall kann die Einführung funktioneller Kopien des entsprechenden Gens helfen, die Situation zu verbessern. Beispielsweise ist die sich mit dem Gentransfer in Zellen der Keimbahn befassende Forschung eines der am schnellsten wachsenden Gebiete der reproduktiven Biologie. Die Gentherapie, die auf der Einführung therapeutischer Gene in Zellen durch ex-vivo oder in-vivo Techniken beruht, ist eine der bedeutendsten Anwendungen des Gentransfers. Geeignete Vektoren und Verfahren für die in-vitro oder in-vivo Gentherapie werden in der Literatur beschrieben und sind dem Fachmann bekannt; siehe z.B. Giordano, Nature Medicine 2 (1996), 534-539; Schaper, Circ. Res. 79 (1996), 911-919; Anderson, Science 256 (1992), 808-813; Isner, Lancet 348 (1996), 370-374; Muhl hauser, Circ. Res. 77 (1995), 1077-1086; Wang, Nature Medicine 2 (1996), 714-716; WO94/29469 oder WO97/00957, und darin zitierte Querverweise. Die für Pax4 und wahlweise Pax6 kodierenden Gene können zur direkten Einführung oder zur Einführung durch Liposomen oder virale Vektoren (z.B. adenovirale, retrovirale) in die Zelle entworfen werden. Beispielsweise können die für das menschliche Pax4 und wahlweise das Pax6 Gen kodierenden Sequenzen in operativer Verbindung zu regulatorischen Sequenzen stehen, welche die Expression in den Zielzellen und -geweben gestatten. Bei genetischen Erkrankungen repräsentiert die Einführung eines normalen oder funktionell gleichwertigen Allels eines mutierten Kerngens die Genersatztherapie (siehe z.B. Mouellic, Proc. Natl. Acad. Sci USA, 87 (1990), 4712-4716; Joyner, Gene Targeting, A Practical Approach, Oxford University Press), welche hauptsächlich bei monogenen rezessiven Funktionsstörungen, wie etwa beispielsweise Diabetes und Hypoglykämie, anwendbar ist.
  • Somit bezieht sich die Erfindung in einer weiteren Ausführungsform auf ein Verfahren zur Behandlung von Diabetes, umfassend:
    • (a) die Entfernung einer Zelle aus einem Säugetier;
    • (b) die Einführung eines funktionellen und exprimierbaren Pax4 Gens und wahlweise eines funktionellen und exprimierbaren Pax6 Gens in die Zelle; sowie
    • (c) die Wiedereinführung der als Produkt aus Schritt (b) erhaltenen Zelle in das Säugetier oder in ein Säugetier derselben Art.
  • In einer weiteren Ausführungsform bezieht sich die Erfindung auf ein Verfahren zur Behandlung einer neuronalen Funktionsstörung, umfassend
    • (a) die Entfernung einer Zelle aus einem Säugetier;
    • (b) die Einführung eines funktionellen und exprimierbaren Pax4 Gens und wahlweise eines funktionellen und exprimierbaren Pax6 Gens in die Zelle; sowie
    • (c) die Wiedereinführung der als Produkt aus Schritt (b) erhaltenen Zelle in das Säugetier oder in ein Säugetier derselben Art.
  • Es versteht sich, dass die eingeführten Gene nach der Einführung in die Zelle funktionell und exprimierbar sind und vorzugsweise während der Lebensdauer der Zelle in diesem Zustand verbleiben.
  • Das Säugetier ist vorzugsweise ein Mensch, eine Ratte oder eine Maus.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens ist die Zelle eine nicht-menschliche Keimzelle oder nicht-menschliche embryonale Zelle oder stammt davon ab. Eine embryonale Zelle kann beispielsweise eine embryonale Stammzelle, wie in z.B. Nagy, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90 (1993), 8424-8428 beschrieben, sein. In einer bevorzugten Ausführungsform ist die Zelle eine nicht-menschliche Eizelle oder stammt davon ab.
  • Geeignete Vektoren und Verfahren zur in-vitro oder in-vivo Gentherapie werden in der Literatur beschrieben und sind dem Fachmann bekannt. Die erfindungsgemäßen pharmazeutischen Zusammensetzungen können zur Behandlung von Arten von Krankheiten verwendet werden, von denen bislang nicht bekannt war, dass sie in Beziehung zu der Expression und/oder Nicht-Expression des Pax4 und/oder Pax6 Gens stehen.
  • Diese und weitere Ausführungsformen werden von der Beschreibung und den Beispielen der vorliegenden Erfindung offenbart und umfaßt. Beispielsweise kann weitere Litera tur, die beliebige erfindungsgemäß angewandte Verfahren, Verwendungen und Verbindungen betrifft, aus öffentlichen Bibliotheken, beispielsweise unter Verwendung elektronischer Vorrichtungen, bezogen werden. Es kann zum Beispiel die öffentliche Datenbank „Medline" verwendet werden, welche auf dem Internet, beispielsweise unter http://www.ncbi.nlm.nih.gov/PubMed/medline.html, zugänglich ist. Weitere Datenbanken und Adressen, wie etwa http://www.ncbi.nlm.nih.gov/, http://www.infobiogen.fr http://www.fmi.ch/biology/research_tools.html, http://www.tigr.org/ sind dem Fachmann bekannt und können auch unter Verwendung von http://www.lycos.com erhalten werden. Eine Übersicht über Patentinformation in Biotechnologie und ein Überblick über relevante Quellen von zur rückblickenden Recherche und zum laufenden Bewußtsein nützlichen Quellen von Patentinformation wird in Berks, TIBTECH 12 (1994), 352-364 bereitgestellt.
  • KURZDARSTELLUNG DER ZEICHNUNGEN
  • Die Offenbarung wird am besten verständlich in Verbindung mit den beiliegenden, hierin durch Referenz einbezogenen Zeichnungen, welche das folgende zeigen:
  • 1 (1a, 1b, 1c, 1d). Zielgerichtete Störung von Pax4 und Herstellung von Pax4 (–/–) Mäusen.
    • a. Struktur der Wildtyp und zielgerichtet gestörten Pax4 Loci. Es wurde eine zielgerichtete Deletion beinahe der gesamten Domäne gepaarter Boxen (dunkle Boxen; Exons 2, 3 und 4) von Pax4 hergestellt durch Fusionierung einer β-Galaktosidase-Neomycin Resistenzkassette im Leserahmen (die Transkriptionsrichtung wird durch doppelte Pfeilköpfe angedeutet). Restriktionsenzyme: A, ApaI; K, KpnI; Nh, NheI; N, NotI; S, SpeI; St, StuI; X, XhoI.
    • b. Aus ES Zellklonen isolierte DNA wurde mit SpeI verdaut und durch Southern Blot Hybridisierung mit sowohl einem 0,7 kb externen genomischen Fragment (Sonde 1, links) als auch einem 0,5 kb cDNA Fragment (Sonde 2, rechts) analysiert. Größen werden in Kilobasen angegeben. In beiden Fällen zeigt das 26 kb Fragment das Wildtyp Allel an, während die 20 kb beziehungsweise 7,8 kb Fragmente von dem zielgerichtet manipulierten Allel herrühren. Die Sternchen zeigen zwei für homologe Rekombination positive Klone an.
    • c. Ein Paar von 2 Tage alten Wurfgeschwistern, Wildtyp (oben) und Pax4 defizient (unten), welches die verringerte Größe der Nullmutanten-Mäuse zeigt.
    • d. Embryos wurden durch PCR Analyse genotypisiert unter Verwendung von genomischer DNA aus Eidottersäcken oder Schwänzen sowie zweier Startersätze (angeordnet wie durch Pfeile in a) gezeigt), zur Vervielfältigung der Wildtyp gepaarten Domäne und/oder des Neo-Gens.
  • 2 (2a, 2b, 2c, 2d, 2e, 2f, 2g, 2h). Analyse der LacZ Aktivität, Insulin- und Glukagonexpression in der Bauchspeicheldrüse von Pax4 (+/–) und Pax4 (–/–) E16.5 Embryonen sowie neugeborenen Mäusen.
  • In der E16.5 (+/–) Bauspeicheldrüse stehen Insulin (Pfeil in a) und Glukagon (Pfeil in b) Zellen mit Regionen, in denen LacZ Aktivität (Pfeilköpfe in a und b) nachgewiesen wird, in Verbindung. Im Gegensatz dazu ist die Expression von LacZ (Pfeilköpfe in e) in der Bauchspeicheldrüse von E16.5 (–/–) Embryonen vermindert, wohingegen Insulin nicht vorkommt (vergleiche a und e). In der E16.5 (–/–) Bauchspeicheldrüse wird eine größere Anzahl von Glukagonzellen vorgefunden (Pfeil in f), die mit Regionen von LacZ Aktivität (Pfeilkopf in f) in Verbindung stehen. In der Bauchspeicheldrüse von (+/–) Neugeborenen beschränkt sich die LacZ Expression auf Insulinzellen (Pfeil in c) und scheint von den Glukagonzellen (Pfeil in d) umgeben zu sein. In der Bauchspeicheldrüse von (+/–) Neugeborenen wird keine LacZ Aktivität oder Insulin nachgewiesen (vergleiche c, d und g). Währenddessen sind in der Bauchspeicheldrüse von (–/–) Neugeborenen zahlreiche Glukagonzellen vorhanden (Pfeil in h), auch in abnormaler Weise in Gruppen verteilt (vergleiche d und h). Vergrößerung 400x.
  • 3 (3a, 3b, 3c, 3e, 3f). Expression von Pdx1 und Somatostatin in der Bauchspeicheldrüse von Pax4 (+/+) und (–/–) Neugeborenen.
  • In der dorsalen Bauchspeicheldrüse sowohl von (+/+) als auch (–/–) E10.5 Embryonen ähnelt sich die frühe Expression von Pdx1 (vergleiche a und b).
  • In der Bauchspeicheldrüse von (+/+) Neugeborenen ist Pdx1 auf reife Insulin-produzierende β-Zellen beschränkt (Pfeile in c). In der Bauchspeicheldrüse von Pax4 (–/–) neugeborenen Mäusen wird keine Pdx1 Expression nachgewiesen (vergleiche c und d). In der Bauchspeicheldrüse von (+/+) Neugeborenen sind Somatostatin bildende δ-Zellen hauptsächlich innerhalb der Zellen verteilt, welche die Langerhans'schen Inseln umgeben (Pfeile in e). In der Bauchspeicheldrüse von (–/–) Neugeborenen wird Somatostatin jedoch nicht nachgewiesen (vergleiche e und f). a und b sind Vibratomschnitte. C und d sind Kryostatschnitte. E und f sind Paraffinschnitte. Vergrößerung in (c-f) (200x) sowie in a und b (400x).
  • 4 (4a, 4b, 4c, 4d). Histologische Analyse der Pax4 (+/+) und (–/–) Bauchspeicheldrüse neugeborener Mäuse und Expression von α-Amylase.
  • In (a) sind exokrine Acini gezeigt, die Gruppen pyramidalgeformter Zellen (Pfeilköpfe) enthalten, deren Kerne sich an der Basis befinden. Exokrine Zellen befinden sich ebenfalls in der Bauchspeicheldrüse von (–/–) Neugeborenen (Pfeilköpfe). Es werden jedoch ausgedehnte cytoplasmatische Bereiche beobachtet sowie eine ungeordnete Verteilung derer Kerne (vergleiche a und b). In der Bauchspeicheldrüse von (+/+) Neugeborenen enthalten die exokrinen Zellen unterschiedliche Mengen an α-Amylase (Pfeile und Pfeilkopf in ac), was den Rückgang an Verdauungsenzymen, der normalerweise dem Säugen folgt, widerspiegelt. In beinahe dem gesamten exokrinen Gewebe der Bauchspeicheldrüse von (–/–) Neugeborenen kommt jedoch eine hohe Menge an α-Amylase vor (Pfeile in e), was anzeigt, dass deren Ausscheidung beeinträchtigt sein könnte. Vergrößerung in a und b (400x) sowie in c und d (200x).
  • 5. Modell für die Rolle von Pax4 bei der endokrinen Differenzierung in der Bauchspeicheldrüse der Maus.
  • Die frühesten endokrinen Vorläuferzellen sind durch die Expression von Pdx1 bei ungefähr E8.5 der Mäuseentwicklung gekennzeichnet (Guz et al., Development 121 (1995), 11-18). Die Differenzierung der α-Zellen findet sehr früh in der Entwicklung statt, bei Vorläufern, in denen Pdx1 wahrscheinlich nicht mehr vorkommt. In den frühesten Vorläufern von β-Zellen werden Gene wie Pdx1 und Insulin selektiv exprimiert, und die Aufrechterhaltung der Expression dieser scheint für das Voranschreiten der Zellen zur Differenzierung von Bedeutung zu sein. In reifen endokrinen Zellen ist die Expression von Pdx1, Insulin und Pax4 auf die β-Linie beschränkt. Pax4 kann die Expression von Genen, die für die Insulin produziernden β-Zellen spezifisch sind, fördern und/oder aufrechterhalten.
  • 6. Hormonkonzentrationen in Bauchspeicheldrüsen von neugeborenen Mäusen des Wildtyps und von heterozygoten und homozygoten Pax4 Mutanten.
  • Es wurden geringe oder keine Unterschiede der Insulin- oder Glukagonkonzentration zwischen Wildtyp und heterozygoten Tieren beobachtet. Homozygote Tiere zeigten eine beinahe vollständige Verringerung der Insulinkonzentration und eine 3-fache Steigerung der Glukagongehalte.
  • 7. Northern Blot Analyse von Tumorzelllinien der Bauchspeicheldrüse.
  • Die Zelllinie AR42J enthielt zwei Pax4 RNA-Transkripte: eines, das eine ähnliche Größe wie das Wildtyp-Transkript aufweist (Pfeilkopf) und ein zweites, das größer ist (Stern). In den Zelllinien βTC-1 und αTC1-9 wird eine schwache Pax4 Expression nachgewiesen.
  • Die zur Veranschaulichung angefügten folgenden Beispiele sollen ein besseres Verständnis der vorliegenden Erfindung und deren zahlreicher Vorzüge vermitteln.
  • BEISPIELE
  • Antikörper, die gegen Insulin, Glukagon und Amylase verwendet werden, sind im Handel von verschiedenen Firmen erhältlich. Die für die Versuche des Anmelders verwendeten Antikörper wurden von Boehringer Mannheim erworben. Der Pdx1 Antikörper war eine großzügige Spende von Prof. Thomas Edlund (Abteilung Mikrobiologie, Universität Umea, S-901 87 Umea, Schweden). Antikörper, welche dieselbe Spezifität aufweisen, d.h. die das Pdx1 Protein in spezifischer Weise erkennen, können unter Verwendung des Pdx1 Proteins als Antigen nach herkömmlichen Methoden hergestellt werden.
  • Beispiel 1: Herstellung eines Konstrukts zur homologen Rekombination und Erzeugung Pax4-defizienter Mäusen
  • Eine zielgerichtete Deletion beinahe der vollständigen gepaarten Boxdomäne (dunkle Boxen; Exons 2, 3 und 4) von Pax4 wurde hergestellt durch Fusionierung einer β-Galaktosidase-Neomycin Resistenzkassette im Leserahmen. Ein 5,1 kb Xba-XhoI Fragment, das LacZpA-pGKNeopA Sequenzen enthält, wurde mit stumpfen Enden versehen und in das mit NheI verdaute und mit stumpfen Enden versehene Pax4 Konstrukt ligiert. Das LacZpA-pGKNeopA Konstrukt wurde durch Kombination des pGKneo Plasmids (Soriano et al., 1991, Cell 64:693-702) mit dem β-Galaktosidase-Gen, welches aus verschiedenen Handelsquellen (z.B. Vektor. pCH110 von Pharmacia) erhältlich ist, hergestellt.
  • Die 5' NheI Schnittstelle wurde beibehalten und eine neue SpeI Schnittstelle wurde am 3' Ende eingeführt. Ein aus dem F9 Polyoma Early Promotor abgeleitetes HSV TK Gen wurde stromaufwärts der 5' Homologie zur negativen Selektion hinzugefügt. R1 ES-Zellen wurden elektroporiert und nach Standardverfahren selektiert. Positive Klone wurden zur Erzeugung von Chimären durch Morulaaggregation verwendet. Die DNA-Isolierung und PCR-Amplifikation genomischer DNA aus Schwanz und Eidottersack wurde nach Standardverfahren durchgeführt. Die phänotypische Analyse wurde bei NMR1 und C57BL/6 Mäusen vorgenommen. Es wurden keine Unterschiede zwischen beiden genetischen Hintergründen beobachtet.
  • Beispiel 2: Untersuchungen der Expression von Pax4 während der Entwicklung
  • Eine genomische Durchforstung hat Pax4 zuvor als Mitglied der Familie muriner Pax Gene identifiziert (Walther et al., Genomics 11 (1991), 424-434). Die Anmelder haben die entsprechende cDNA Sequenz durch RT-PCR isoliert.
  • Die PCR Amplifikation eines Fragmentes (615 nt), das für die gepaarten und Homeoboxdomänen der Pax4 cDNA kodiert, wurde mit 1 μg aus E13.5 Mäuseembryonen isolierter Gesamt-RNA durchgeführt. Es wurde eine reverse Transkription mit einem Kit von Pharmacia und Zufallsstartern durchgeführt.
  • Die verwendeten Starter wurden erhalten durch Sequenzierung der entsprechenden genomischen Regionen, welche für die gepaarten (5', Sinnstarter: 5' AGC AAT AAG AGG GAT GCG ACC 3' (SEQ ID Nr: 5)) beziehungsweise Homeoboxdomänen (3' Antisinn: 5' AGC TGT GCT TCC CAT TTC AGC 3' (SEQ ID Nr: 6)) kodieren. Bei allen durchgeführten PCR Reaktionen (einschließlich 5' und 3' RACE) wurde Taq Polymerase nach dem ersten Denaturierungsschritt (95 °C, 3 min) vor Ablauf der Zyklen zugegeben. Es wurden 2 Einheiten Taq Polymerase gemeinsam mit 1 Einheit „Perfect Match" (von Stratagene) hinzugefügt. 35 Zyklen wurden ausgeführt: 95 °C, 1,5 min; 60 °C, 1,5 min; 72 °C, 2,5 min. Es wurde ein abschließender Schritt mit 60°C, 1,5 min und 72 °C, 10 min durchgeführt. Es wurde eine schwache Bande der erwarteten Größe nach der Gelelektrophorese in 2 %iger niedrigschmelzender Agarose sichtbar. Diese wurde ausgeschnitten und erneut nach demselben Programm amplifiziert (5 μl geschmolzene Agarose). Die DNA wurde aus einem 2 %igen präparativen Gel elektroeluiert, aufgefüllt und über stumpfe Enden in den mit SmaI verdauten Bluescript-Vektor nach Standardverfahren kloniert. Die Sequenzierung der isolierten Klone wurde mit einem Sequenzierkit von Pharmacia durchgeführt. Eine 5' RACE-Amplifikation wurde unter Verwendung eines Kits von GIBCO-BRL nach Angaben des Herstellers ausgeführt. Zusammengefaßt wurden 5 μg Gesamt-RNA, die aus der posterioren Region von E10.5 Mäuseembryonen (posterior des letzten Wirbels: „Schwanz-RNA") isoliert wurden, als Vorlage zur Erststrang-cDNA-Synthese verwendet. Zwei Sätze von geschachtelten Startern wurden in Kombination mit den AP (Starter BS41: 5' GCG AAT TCC CTG AAG TGC CCG AAG TRC TCG ATT 3' (SEQ ID Nr: 7)) beziehungsweise UAP Startern (Starter BS57: 5' GGC TCC GTG AAA TGT CAC AG 3' (SEQ ID Nr: 8)) verwendet. Bei der ersten PCR Reaktion wurde ein für Pax4 spezifischer Starter, der nahe der 5' Region der bekannten Sequenz liegt, in Verbindung mit dem „AP" Starter 5' CGT AGT ACT GTC GAC TAG CAG GGI IGG GII GGG IIG 3' (SEQ ID Nr: 9) aus dem im Handel erhältlichen Kit (5' RACE System von GIBCO-BRL) eingesetzt. Der „AP" Starter enthält einen mit einem dG-Schwanz verbundenen Adapter, der sich an die cDNA mit dC-Schwanz anlagert. Bei der zweiten Reaktion wurde ein geschachtelter Pax4 Starter (geschachtelt bedeutet, dass dieser mehr in 5' Richtung oder stromaufwärts des bei der ersten Reaktion verwendeten Pax4 Starters liegt) zusammen mit dem im Handel erhältlichen „UAP" Starter (ein Starter, der nur die Adaptersequenz des AP Starters 5' CGT AGT ACT GTC GAC TAG CA 3' (SEQ ID Nr: 10) enthält, verwendet. Die erste PCR Reaktion (AP/BS41 Starter) wurde mit 5 μl cDNA mit dC-Schwanz ausgeführt (35 Zyklen: 94 °C, 1,5 min; 55 °C, 1,5 min; 72 °C, 3 min). 2 μl der erhaltenen PCR Reaktion (20-fach verdünnt) wurden nochmals amplifiziert mit den Startern UAP/BS57 und 40 Zyklen: 94 °C, 1 min; 60 °C, 1 min; 72 °C 2,5 min. Nach der Gelelektrophorese wurde eine einzelne Bande von annähernd 500 Nt sichtbar. Diese wurde elktroeluiert und in den Vektor TA-pGEM (PROMEGA) kloniert. Mit diesem Ansatz wurden 180 Nt neuer 5' Sequenzinformation erhalten. Die 3' RACE Amplifikation wurde unter Verwendung von 2,5 μg „Schwanz" E10.5 RNA als Vorlage durchgeführt. Die Erststrang-cDNA-Synthese wurde mit dem im Erststrang-cDNA-Synthesekit (Pharmacia) bereitgestellten NotI-oligo dT Starter ausgeführt. Die erste PCR Reaktion wurde mit dem NotI Starter (5' AAC TGG AAG AAT TCG CGG CCG CAG GAA 3' (SEQ ID Nr: 11)) und dem BS36 Starter (5' CAG GAA GAC CAG AGC TTG CAC TGG 3' (SEQ ID Nr: 12)) durchgeführt. Es wurden 35 Zyklen (94 °C, 1,5 min; 55 °C, 1,5 min; 72 °C, 3 min) ausgeführt. 2 μl dieser PCR Reaktion (20-fach verdünnt) wurden mit einem geschachtelten Starter (BS42: 5' GCG GAT CCC ACA GGA ATC GGG CTA TCT TC 3' (SEQ ID NO: 13)) und dem NotI Starter nochmals amplifiziert. Nach der Gelelektrophorese wurde eine starke Bande von annähernd 550 Nt aus einem 2 %igen niedrig-schmelzenden Agarosegel entnommen. 2 μl geschmolzener Agarose wurden mit einem weiteren geschachtelten Starter (BS59: 5' GCG CAG GCA AGA GAR GCT GA 3' (SEQ ID Nr: 14)) und dem NotI Starter nochmals amplifiziert. Die letzten beiden PCR Reaktionen waren wir folgt: 40 Zyklen 60 °C, 1,5 min; 72 °C, 3 min; 94 °C, 1,5 min. Eine starke 420 Nt Bande wurde elektroeluiert und in den TA-pGEM Vektor subkloniert. Die Wiedergabegenauigkeit der amplifizierten 5' und 3' PCR-Fragmente wurde durch zwei Verfahren beurteilt: erstens wurde ein 1,1 kb Fragment aus der „Schwanz" E10.5 RNA amplifiziert unter Verwendung von Startern (Sinnstarter: 5' CTT CCA GAA GGA GCT CTC 3' (SEQ ID Nr: 15) und dessen Antisinnstarter: 5' TGG GAT GAT GGC ACT TGT C 3' (SEQ ID Nr: 16)), die aus den am weitesten 5' und 3' gelegenen neuen Sequenzen entworfen wurden. Dessen Größe und Sequenz waren erwartungsgemäß. Die Sequenz der drei mit PCR isolierten Fragmente (5'-, 615 Nt und 3'-) wurde ebenfalls mit den entsprechenden kodierenden Bereichen eines genomischen Klons verglichen.
  • Die Analyse der Pax4 Expression enthüllte, dass dessen Transkripte auf einige Zellen des ventralen Rückenmarks und die Bauchspeicheldrüse im frühen Entwicklungsstadium beschränkt sind. Zur Untersuchung der Funktion dieses Gens während der Entwicklung wurden von den Anmeldern Pax4-defiziente Mäuse erzeugt; siehe Beispiel 1. Es wurde eine Inaktivierung von Pax4 nach homologer Rekombination in ES-Zellen erzielt, nach Deletion der beinahe vollständigen gepaarten Box-Domäne und Fusionierung des β-Galaktosidase-Gens im Leserahmen mit dem Amino-terminalen Ende von Pax4 (1a). Dieser Ansatz gestattete den Anmeldern auch eine ausführlichere Analyse der Pax4 Expression während der Entwicklung durch Nachweis der LacZ Aktivität.
  • Heterozygote Mäuse zeigen keine offensichtlichen Anomalitäten und sind lebensfähig und fruchtbar. Eine Färbung von (+/–) Embryonen am Tag 10.5 der Entwicklung (E10.5) enthüllte LacZ Aktivität in Zellen innerhalb der dorsalen Bauchspeicheldrüse. Zum Nachweis der LacZ Aktivität wurde eine X-Gal Färbung von Mäuseembryonen und isolierter Bauchspeicheldrüse aus Neugeborenen nach Standardverfahren durchgeführt. Eine Nachfixierung wurde in 4 % Paraformaldehyd bei 4 °C über Nacht durchgeführt. Zur immunohisto chemischen Untersuchung wurden X-Gal gefärbte Embryonen und Gewebe in Paraffin eingebettet und mit einem Mikrotom geschnitten (10 μM). Die Expression von LacZ in der Bauchspeicheldrüse von Pax4 (+/–) Embryonen schritt bis zur Geburt voran. In der Bauchspeicheldrüse von heterozygoten Neugeborenen war die LacZ Aktivität auf eigenständige Bereiche beschränkt, die den β-Zellen der Langerhans'schen Inseln entsprechen, wie durch Coexpression von LacZ und Insulin beurteilt wurde (1c und d).
  • Pax4-defizienter Nachwuchs wurde mit der erwarteten Mendelschen Verteilung geboren, was anzeigt, dass die Abwesenheit von Pax4 im Uterus nicht lethal ist. Bei der Geburt erscheinen Pax4 (–/–) Mäuse normal und waren von ihren Wurfgeschwistern nicht zu unterscheiden. 48 Stunden später jedoch zeigten sie Größenverringerung und Dehydrierung (1c). Sämtliche Pax4-defizienten Mäuse starben innerhalb der ersten drei Tage nach der Geburt, was die vollständige Durchsetzung des mutanten Phänotyps zeigt. Die Bauchspeicheldrüse von neugeborenen (–/–) Mäusen zeigte eine normale makroskopische Erscheinung. Die Expression von LacZ in der Bauchspeicheldrüse von Pax4 (–/–) mutanten Mäusen wurde ebenfalls untersucht. In E10.5 (–/–) Embryonen wurde LacZ Aktivität in Zellen der dorsalen Bauchspeicheldrüse nachgewiesen, in ähnlicher Weise wie bei heterozygoten Embryonen. Es wurden keine Unterschiede in der Expression von LacZ Aktivität in der sich entwickelnden Bauchspeicheldrüse von Pax4 (+/–) und (–/–) Embryonen bis ungefähr E16.5 beobachtet. Danach begann sich jedoch die LacZ Expression von Pax4-defizienten Mäusen zu verringern (vergleiche 2a, b sowie 2e, f) und war nach der Geburt nicht mehr nachweisbar (vergleiche 2d und 2g).
  • Beispiel 3: Expression von Insulin und Glukagon in zielgerichtet manipulierten Pax4 Mäusen
  • In der Bauchspeicheldrüse entstehen sämtliche endokrinen Zellen aus gemeinsamen multipotenten Vorläufern (Alpert, Cell 53 (1988), 295-308. Die ersten Vorläuferzellen, die Insulin und Glukagon enthalten, erscheinen um E9.5 (Gittes et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89 (1992), 1128-1132; Teitelman et al., Development 118 (1993), 1031-1039). In der Bauchspeicheldrüse der Maus beginnt die Differenzierung der exokrinen und der meisten endokrinen Zellen um E16.5 der Entwicklung (Githens, The Pancreas: biology, pathobiology, and disease. Second Edition (ed. Vay Liang W. Go, et al.) Raven, New York, (1993), 21-73). Bei der Geburt ist die Insulinproduktion hauptsächlich auf vollständig differenzierte β-Zellen beschränkt, welche im Zentrum der Langerhans'schen Inseln liegen. Diese sind von den Glukagonbildenden α-Zellen umgeben. Die β-Zellen umfassen die Mehrheit der endokrinen Population, wohingegen die α-Zellen nur einen kleinen Anteil darstellen (Slack, Development 121 (1995), 1569-1580). Die Anmelder haben in der Bauchspeicheldrüse von Pax4 heterozygoten und Pax4 nullmutanten Mäusen auf Insulin- und Glukagonexpression getestet durch Immunochemie an Paraffinschnitten, ausgeführt auf zuvor beschriebene Weise (Oliver et al., EMBO J. 7 (1988), 3199-3209).
  • Bei E10.5 wurden Insulin-produzierende Zellen in der Bauchspeicheldrüse von Pax4 (+/–) und (–/–) Embryonen nachgewiesen. Bei E16.5 heterozygoten Embryonen befanden sich sämtliche Insulinzellen innerhalb des Bereiches von LacZ Aktivität (2a). Wie zuvor erwähnt wurden LacZ und Insulin bei heterozygoten neugeborenen Mäusen in denselben Zellen nachgewiesen (2c), was anzeigt, dass die Pax4 Expression in der späteren Entwicklung auf Insulin produzierende β-Zellen beschränkt ist. Im Gegensatz hierzu wurden in der Bauchspeicheldrüse von Pax4 (–/–) E16.5 Embryonen und neugeborenen Mäusen wenn überhaupt, dann nur wenige Insulin-produzierende Zellen nachgewiesen (2e, g). Dies lässt erkennen, dass in Abwesenheit von Pax4 die Reifung der β-Zellen der Bauchspeicheldrüse beeinträchtigt war. In der Bauchspeicheldrüse von E10.5 (+/–) und (–/–) Embryonen sind Zellen vorhanden, die Glukagon enthalten. Bei heterozygoten E16.5 Embryonen wurde Glukagon in Zellen nachgewiesen, von denen sich die meisten im Bereich der LacZ Aktivität befanden (2b). In der Bauchspeicheldrüse von heterozygoten Neugeborenen kam Glukagon in Zellen vor, welche den Bereich umgaben, in dem LacZ exprimiert wurde, die sich jedoch nicht darin befanden (2d). In der Bauchspeicheldrüse von Pax4 (–/–) E16.5 Embryonen und neugeborenen Mäusen fand sich eine beträchtlich größere Anzahl von Glukagon-produzierenden Zellen. Diese Zellen zeigten außerdem eine anomal gruppierte Verteilung (2f und h).
  • Beispiel 4: Expression von Pdx1 in zielgerichtet manipulierten Pax4 Mäusen
  • Zur weiteren Bestätigung, dass in der Bauchspeicheldrüse Pax4-defizienter neugeborener Mäuse β-Zellen fehlen, wurde auf die Expression eines spezifischen β-Zellmarkers, Pdx1, getestet. Dieses Gen erscheint sehr frühzeitig während der Entwicklung der Bauchspeicheldrüse (höchstwahrscheinlich in den frühesten Bauchspeicheldrüsenvorläufern), ist jedoch später auf die vollständig differenzierten β-Zellen beschränkt (Guz et al., Development 121, 11-18 (1995); Miller et al., EMBO J. 13 (1994), 1145-56) (3c). Die frühzeitige Expression wurde durch „whole-mount" Immunofärbung von E10.5 Mäuseembryonen nach einem bestehenden Protokoll (Ohlsson et al., EMBO J. 13 (1994), 1145-1158) getestet, mit Ausnahme eines Bleichens für 24 Stunden. Nach der Färbung wurden die E10.5 Embryonen nachfixiert, in eine Gelatine-BSA-Matrix eingebettet und mit einem Vibratom geschnitten. Die Expression von Pdx1 in der Bauchspeicheldrüse von Neugeborenen durch Immunofärbung auf Kryostatschnitten wurde wie zuvor beschrieben durchgeführt, mit den folgenden Änderungen: die Bauchspeicheldrüse von Neugebore nen wurde 3 Stunden lang mit 4 % Paraformaldehyd fixiert und anschließend mit 30 % Saccharose in PBS über nacht gefriergeschützt. Nach dem Abwaschen des sekundären Antikörpers wurden die Schnitte mit 0,6 % H2O2 20 Minuten lang inkubiert. Bei E10.5 wurde Pdx1 in ähnlicher Weise in der Bauchspeicheldrüse von sowohl Pax4 (+/+) als auch (–/–) Embryonen exprimiert (3a, b). In der Bauchspeicheldrüse von Pax4-defizienten neugeborenen Mäusen wurde jedoch keine Pdx1 Expression nachgewiesen. Dies bestätigt die anfängliche Schlußfolgerung, dass in der Bauchspeicheldrüse von Pax4 nullmutanten Mäusen die reifen β-Zellen fehlen. Es läßt weiterhin darauf schließen, dass, obwohl Pax4 zur Bildung der frühesten endokrinen Vorläufer nicht erforderlich sein mag, es für die β-Zelldifferenzierung entscheidend ist.
  • Beispiel 5: Expression von Somatostatin in zielgerichtet manipulierten Pax4 Mäusen
  • Im Laufe der Embryogenese der Maus beginnen sich Somatostatin-produzierende Zellen später zu differenzieren als α- und β-Zellen (Teitelman et al., Development 118 (1993), 1031-1039). In der Bauchspeicheldrüse von Pax4 (+/+) neugeborenen Mäusen waren Somatostatin-produzierende Zellen vornehmlich an der Peripherie der Inseln verteilt, vermischt mit den α-Zellen (3e), was darauf schließen läßt, dass die Inaktivierung von Pax4 auch die Reifung der δ-Linie beeinträchtigt. Die Expression von Somatostatin im Darm schien jedoch nicht beeinträchtigt zu sein.
  • Beispiel 6: Histologische Analyse der Bauchspeicheldrüse neugeborener zielgerichtet manipulierter Pax4 Mäuse
  • Die exokrine Bauchspeicheldrüse ist eine lobuläre, verzweigte, acinare Drüse mit pyramidal geformten sekretorischen Zellen und basalen Zellkernen (Pictet, Devl. Biol. 29 (1972), 436-436) (4a). Die histologische Analyse der Bauchspeicheldrüse Pax4 (–/–) Neugeborener zeigte, dass in dieser Drüse exokrines Gewebe vorkommt. Das Cytoplasma der exokrinen Zellen erschien jedoch ausgedehnt und ihre Zellkerne zeigten keine homogen basale Verteilung (4b). Die Analyse der Bauchspeicheldrüse von 3 Tage alten Wildtyp Mäusen auf das Vorhandensein eines spezifischen exokrinen Enzyms (α-Amylase), zeigten große Anteile des exokrinen Gewebes eine geringe oder keine Expression solcher Marker (4c). Höchstwahrscheinlich spiegelt dies die Verringerung exokriner Verdauungsenzyme wider, die normalerweise nach dem Säugen auftritt (Githens, The Pancreas: biology, pathobiology, and disease. Second Edition (ed. Vay Liang W. Go, et al.) Raven, New York, (1993), 21-73). Bei der Geburt sind Pax4 defiziente Mäuse in der Lage zu säugen, da ihre Mägen voller Milch sind (1c). Eine 3 Tage alte Pax4 (–/–) Bauchspeicheldrüse zeigte jedoch eine starke Expression von α-Amylase in allen exokrinen Zellen, was anzeigt, dass diese nicht fähig sein könnten, ihre Enzyme in den Verdauungstrakt auszuscheiden (4d).
  • Die aus den Ergebnissen der obigen Beispiele zu ziehenden Folgerungen in Bezug auf den Einfluß der Pax4 und Pdx1 Gene auf die Entwicklung von Bauchspeicheldrüsenzellen wird in 5 gezeigt.
  • Beispiel 7: Insulin- und Glukagonkonzentrationen in Bauchspeicheldrüsen heterozygoter und homozygoter neugeborener Pax4 mutanter Mäuse
  • Die Produktion von Insulin und Glukagon in vollständigen Bauchspeicheldrüsen heterozygoter oder homozygoter neugeborener Pax4-LacZ Mäuse wurde durch Radioimmuntest (RIA) quantifiziert. Es wurden keine signifikanten Unterschiede der Insulin- oder Glukagonkonzentrationen zwischen Wildtyp und heterozygoten Tieren beobachtet (6). Eine schwerwiegende und beinahe vollständige Verringerung der Insulinkonzentrationen wurde jedoch bei homozygoten Tieren beob achtet, während eine dreifache Steigerung der Glukagongehalte festgestellt wurde. Diese Ergebnisse stimmen mit denen überein, die durch Immunochemie erhalten wurden (Beispiel 3), die ein beinahe vollständiges Fehlen von β-Zellen und eine größer als normale Population von α-Zellen in den Bauchspeicheldrüsen mutanter Tiere zeigten, denen Pax4 fehlte. Diese Beobachtungen zeigen, dass Pax4 zur Bildung von β-Zellen während der Entwicklung der Bauchspeicheldrüse erforderlich ist.
  • Insulin RIAs wurden unter Verwendung eines im Handel erhältlichen Kits von Linco Research (Kat#: RI-13K) und nach den Anweisungen des Herstellers durchgeführt. Die Bauchspeicheldrüsen von Wildtyp und mutanten Mäusen wurden unmittelbar vor der Geburt durch Kaiserschnitt bei e19 der Schwangerschaft isoliert. Die einzelnen Bauchspeicheldrüsen wurden in 40 μl Säureextraktionspuffer (80 ml Ethanol, 17,9 ml destilliertes Wasser, 2,1 ml konzentrierte HCl) überführt und zur Extraktion ihrer Proteininhalte auf Eis ultraschallbehandelt. Nach einer Inkubation über Nacht bei 4 °C wurden die Proben 15 Minuten lang bei 13000 UPM zentrifugiert. Die Überstände wurden daraufhin in ein neues Röhrchen überführt und die RIA wurden bei jedem Proteinextrakt mit einer Verdünnung von 1:1000 bis 1:10000 ausgeführt. Zusammengefasst wurden 100 μl jedes verdünnten Extrakts 18 Stunden lang bei 4 °C mit 100 μl Ratteninsulinantikörper und 100 μl 125I-Insulinmarker inkubiert. Die Proben wurden anschließend mit 1 ml Fällungsreagenz 20 Minuten lang bei 4 °C gefällt und 15 Minuten bei 2000 UPM zentrifugiert. Die Überstände wurden abgegossen und die Pellets in einem Szintillationszähler gezählt. Glukagon RIAs wurden unter Verwendung eines im Handel erhältlichen Kits von Linco Research (Kat#: GL-32K) und nach den Anweisungen des Herstellers durchgeführt. Proteine aus den Bauchspeicheldrüsen des Wildtyps und von Mutanten wurden wie oben beschrieben isoliert und 100 μl jedes verdünnten Extrakts wurden 18 Stunden lang bei 4 °C mit 100 μl Rattenglukagonantikörper inkubiert, gefolgt von einer Inkubation für 24 Stunden bei 4 °C mit 100 μl 125I-Glukagonmarker. Die Proben wurden anschließend mit 1 ml Fällungsreagenz 20 Minuten lang bei 4 °C gefällt und 15 Minuten bei 2000 UPM zentrifugiert. Die Überstände wurden abgegossen und die Pellets in einem Szintillationszähler gezählt.
  • Beispiel 8: Expression von Pax4 in Tumorzellinien der Bauchspeicheldrüse
  • Die Pax4 Expressionsgrade in verschiedenen Insulinomen (RIN 5F, βTC1), Glucagonomen (αTC 1-9), Somatostatinomen (RIN 14β), Inseltumoren (HC 13, HC 13T, RINm), ductalen Adenokarzinomen (mPAC) und tumoralen AR42J Zelllinien wurden analysiert (7). Niedrige Grade von Pax4 Expression wurden in βTC1 und αTC 1-9 Zelllinien nachgewiesen, was die endogenen niedrigen Expressionsgrade in β-Zellen normaler Mäuse widerspiegelt. In RINm, RIN 5F, RIN 14β, HC 13T und mPac Linien wurde keine Expression beobachtet. Interessanterweise wurden hohe Expressionsgrade von Pax4 in AR42J Zellen nachgewiesen, die aus einem Tumor des exokrinen Gewebes der Bauchspeicheldrüse stammt (besprochen in Christophe J, Am. J. Physiol. 266 (1994), G963-G971). Ferner wird ein zweites größeres Boten-RNA Transkript in dieser Zelllinie nachgewiesen, was mögliche genomische Modifikationen in einem der Allele von Pax4 nahelegt. Chromosomale Veränderungen unter Einbezug der Pax Gene wurden mit der Entwicklung bestimmter Tumoren, wie etwa alveolarer Rhabdomoysarkome (Galili et al., Nature Genetics 5 (1993), 230-235; Davis et al., Cancer Res. 54 (1994), 2869-2872) in Verbindung gebracht. Die bei AR42J Zellen erhaltenen Ergebnisse legen nahe, dass solche chromosomale Veränderungen innerhalb des Pax4 Genorts vorkommen können, was die Eigenschaften des Proteins verändert, und dass dies für den tumorösen Phänotyp relevant sein könnte.
  • Die Expressionsgrade in den verschiedenen Zelllinien wurden durch herkömmliche Northern Blot Analyse ausgewertet, wie z.B. beschrieben in Sambrook et al., „Molecular Cloning: A Laboratory Manual", CSH Press, Cold Spring Harbor, 1989. Zusammengefasst wurden die Zellen mit Trypsin behandelt und in ein Röhrchen überführt, das 1 ml Homogenisierungspuffer (3M LiCl, 6M Harnstoff, 0,1 % SDS) enthielt sowie 3-4 mal 20 Sekunden lang auf Eis ultraschallbehandelt. Nach einer Inkubation über Nacht bei 4 °C wurden die Lysate 30 Minuten mit 18600 UPM zentrifugiert. Die RNA Pellets wurden zweifach in 1 ml 3M LiCl gewaschen, in 500 μl Lösungspuffer (10 mM Tris-Cl pH 7,5, 0,5 % SDS) aufgenommen und durch Phenol-Chloroform Extraktion gefolgt von einer Ethanolfällung gereinigt. 20 μg RNA wurden über ein Agarosegel getrennt und auf eine Nylonmembran gemäß üblicher Northern Blot Protokolle überführt. Die Membranen wurden daraufhin hybridisiert mit entweder einer Pax4 cDNA Sonde der Maus (EMBL Zugangsnr. Y09584), einer Glukagon cDNA Sonde der Maus (EMBL Zugangsnr. Z46845) oder einer Insulin cDNA Sonde der Ratte (EMBL Zugangsnr. J04807). Die Zelllinien RINm (Kat# CRL-2057), RIM 5F (Kat# CRL-2058) und RIN 14β (Kat# CRL-2059) wurden von der American Type Culture Collection erhalten. Die Zelllinien βTC1, αTC 1-9, HC 13, HC 13T und mPac können aus Rip1Tag2 transgenen Mäusen (Hanahan, D., Nature 315 (1985), 115-122) unter Verwendung herkömmlicher Gewebekulturtechniken isoliert werden. Die Zelllinie AR42J kann aus Azaserin-induzierten malignen Knoten aus der Bauchspeicheldrüse der Ratte erhalten werden (Longnecker et al., Cancer Lett. 7 (1979), 197-202).
  • Beispiel 9: Klonierung einer weiteren Pax4 cDNA Sequenz
  • Eine weitere Pax4 cDNA Sequenz wurde aus einer β-Zellbibliothek isoliert. Diese Sequenz (SEQ ID Nr: 17) ist identisch mit der Nukleotidsequenz, die in SEQ ID Nr: 1 dargestellt ist, mit der Ausnahme eines zusätzlichen G Nukleotids nach Position 1131, was zur Verwendung eines alternativen translationellen STOP Kodons an Position 1214 führt. Die resultierenden 11 Aminosäuren am C-terminalen Ende des durch SEQ ID Nr: 17 erzeugten Proteins sind daher verändert und um 17 Aminosäuren im Vergleich zu dem durch SEQ ID Nr: 1 erzeugten Protein verlängert.
  • Die β-Zellbibliothek kann aus der βTC1 Zelllinie unter Verwendung eines ZAP-cDNA Synthesekits von Stratagene (Kat# 200400) nach Angaben des Herstellers hergestellt werden. Annähernd 1 × 106 Klone dieser Bibliothek wurden ausplattiert, auf eine Nylonmembran überführt und unter hoher Stringenz mit einer 32P markierten Sonde von Pax4 (EMBL Zugangsnr. Y09584) hybridisiert. Die Hybridisierung wurde über Nacht bei 65 °C in 6 × SSPE, 5 × Denhardts, 0,5 % SDS, 0,1 mg/ml denaturierter Lachssperma DNA durchgeführt und gefolgt von zweimaligem Waschen für 30 Minuten bei 65 °C in 2 × SSC/0,5 % SDS und einmaligem Waschen bei 65 °C für 30 Minuten in 0,1 × SSC/0,5 % SDS. Positive Klone wurden aus Plaques aufgereinigt und die resultierenden cDNA Sequenzen wurden unter Verwendung eines Rapid Excision Kit von Stratagene (Kat# 211204) isoliert. Die Nukleotidsequenzen wurden nach üblichen Sequenzierungstechniken erhalten, wie z.B. beschrieben in Sambrook et al., „Molecular Cloning: A Laboratory Manual", CSH Press, Cold Spring Harbor, 1989.
  • SEQUENZLISTE
    Figure 00430001
  • Figure 00440001
  • Figure 00450001
  • Figure 00460001
  • Figure 00470001
  • Figure 00480001
  • Figure 00490001
  • Figure 00500001
  • Figure 00510001
  • Figure 00520001
  • Figure 00530001
  • Figure 00540001
  • Figure 00550001
  • Figure 00560001
  • Figure 00570001
  • Figure 00580001
  • Figure 00590001
  • Figure 00600001
  • Figure 00610001
  • Figure 00620001
  • Figure 00630001

Claims (29)

  1. In vitro Verfahren zum Testen des Differenzierungsstatus in Bauchspeicheldrüsenzellen eines Säugetiers, umfassend (a) das Feststellen des Anteils oder Status von Pax4 mRNA in Bauchspeicheldrüsenzellen des genannten Säugetiers; und/oder (b) das Feststellen des Anteils oder Status von Pax4 Protein in Bauchspeicheldrüsenzellen des genannten Säugetieres; und (c) das Vergleichen des genannten Anteils oder Status von Pax4 mRNA und/oder Pax4 Protein mit dem entsprechenden Anteil in normalen Bauchspeicheldrüsenzellen, wobei das genannte Feststellen und der genannte Vergleich des Status von Pax4 mRNA und/oder Pax4 Protein die Feststellung und den Vergleich kennzeichnet, ob die/das genannte mRNA oder Protein eine Mutation, Deletion oder eine posttranslationale Modifikation trägt, was die Gesamtaktivität des Gens bei einem Vergleich mit dem normalen Genprodukt des Wildtyps beeinflussen würde.
  2. Verfahren nach Anspruch 1, weiterhin umfassend (d) das Feststellen des Anteils oder Status von Pax6 mRNA in Bauchspeicheldrüsenzellen des genannten Säugetiers; und/oder (e) das Feststellen des Anteils oder Status von Pax6 Protein in Bauchspeicheldrüsenzellen des genannten Säugetiers; und (f) den Vergleich des genannten Anteils oder Status von Pax6 mRNA und/oder Pax6 Protein mit dem entsprechenden Anteil in normalen Bauchspeicheldrüsenzellen, wobei das genannte Feststellen und der Vergleich des Status von Pax6 mRNA und/oder Pax6 Protein die Feststellung und den Vergleich kennzeichnet, ob die/das genannte mRNA oder Protein eine Mutation, Deletion oder eine posttranslationale Modifikation trägt, was die Gesamtaktivität des Gens bei einem Vergleich mit dem normalen Genprodukt des Wildtyps beeinflussen würde.
  3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei sich das Säugetier in der (i) embryonalen; (ii) neugeborenen; oder (iii) adulten Phase befindet.
  4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei es sich bei dem genannten Säugetier um eine Maus handelt, oder wobei es sich bei dem genannten Säugetier um einen Menschen handelt.
  5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei das genannte Feststellen in Schritt (a) und wahlweise in Schritt (d) durch den Einsatz (i) einer Nukleinsäuresequenz, die mindestens einem Teil des Pax4-Gens entspricht und bevorzugt für mindestens einen Teil des Pax4 Proteins kodiert, und wahlweise einer zweiten Nukleinsäuresequenz, die mindestens einem Teil des Pax6-Gens entspricht und bevorzugt für mindestens einen Teil des Pax6 Proteins kodiert; (ii) einer Nukleinsäuresequenz komplementär zu der (den) Nukleinsäuresequenz(en) von (i); oder (iii) eines Starters oder eines Starterpaares, das an die Nukleinsäuresequenz(en) von (i) oder (ii) hybridisiert, erfolgt.
  6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei das genannte Feststellen in Schritt (b), und wahlweise in Schritt (e), durch den Einsatz eines Antikörpers oder eines Fragments desselben erfolgt, der sich speziell an das Pax4 Protein bindet, und wahlweise durch den Einsatz eines zweiten Antikörpers oder eines Fragments desselben, der sich speziell an das Pax6 Protein bindet.
  7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, wobei es sich bei den genannten Bauchspeicheldrüsenzellen um β-Zellen oder δ-Zellen handelt.
  8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, wobei der genannte Entwicklungsstatus auf die Malignität oder das maligne Potenzial der genannten Bauchspeicheldrüsenzelle hinweist.
  9. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, wobei der genannte Differenzierungsstatus in den genannten β-Zellen auf juvenile Diabetes hinweist.
  10. Verfahren nach Anspruch 9, wobei der Differenzierungsstatus in den genannten β-Zellen im embryonalen Status oder in dem neugeborenen Status ausgeführt wird.
  11. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 10, wobei der genannte Differenzierungsstatus das Ergebnis der Aktivität eines Medikamentes oder eines Gentherapieansatzes ist.
  12. Verfahren nach Anspruch 11, wobei das genannte Medikament den Expressionsanteil des Pax4-Gens, und wahlweise des Pax6-Gens am mRNA- oder Proteinebene beeinflusst.
  13. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 10, wobei der genannte Differenzierungsstatus in Pax4-Knock-out-Mäusen getestet wird, die wahlweise gleichzeitig auch Pax6-Knock-out-Mäuse sind.
  14. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 10, weiterhin umfassend das Einführen des funktionellen und exprimierbaren Pax4-Gens, und wahlweise weiterhin umfassend das Einführen eines funktionellen und exprimierbaren Pax6-Gens in die Bauchspeicheldrüsen-alpha-Zellen oder Bauchspeicheldrüsenkanal-Epithelzellen.
  15. Nicht zur menschlichen Rasse gehörendes, transgenes Säugetier, umfassend mindestens ein inaktiviertes Pax4-Allel.
  16. Nicht zur menschlichen Rasse gehörendes, transgenes Säugetier gemäß Anspruch 15, weiterhin umfassend mindestens ein inaktiviertes Pax6-Allel.
  17. Nicht zur menschlichen Rasse gehörendes, transgenes Säugetier gemäß Anspruch 15, wobei mindestens ein inaktiviertes Pax4-Allel durch homologe Rekombination mit einem Konstrukt umfassend das β-Galactosidase-Gen im Leserahmen des Aminoterminus von Pax4 erzeugt worden ist.
  18. Nicht zur menschlichen Rasse gehörendes, transgenes Säugetier gemäß Anspruch 17, wobei es sich dabei um eine Maus oder eine Ratte handelt.
  19. Verwendung einer effektiven Nukleinsäuresequenzdosis, die für ein funktionelles und exprimierbares Pax4 Protein kodiert, und wahlweise eine zweite Nukleinsäuresequenzdosis, die für ein funktionelles und exprimierbares Pax6 Protein kodiert, zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung zur Behandlung, Verhütung und/oder Verzögerung von Diabetes in einem Säugetier.
  20. Verwendung nach Anspruch 19, wobei die Nukleinsäuresequenz mit den regulatorischen Elementen funktionell verbunden ist, wodurch die Expression und/oder Zielsetzung des Pax4 Proteins, und wahlweise des Pax6 Proteins, für spezifische Zellen ermöglicht wird.
  21. Verwendung einer effektiven Dosis eines funktionellen Pax4 Proteins, und wahlweise eines funktionellen Pax6 Proteins, zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung zur Behandlung, Verhütung und/oder Verzögerung von Diabetes in einem Säugetier.
  22. Verwendung nach einem der Ansprüche 19 bis 21, wobei die genannte pharmazeutische Zusammensetzung verabreicht wird, um die Expression des Pax4-Gens, und wahlweise des Pax6-Gens, in Bauchspeicheldrüsenzellen zu stimulieren und/oder ein funktionelles und exprimierbares Pax4-Gen, und wahlweise ein funktionelles und exprimierbares Pax6-Gen, in Bauchspeicheldrüsenzellen eines Säugetiers einzuführen.
  23. Verwendung eines funktionellen und exprimierbaren Pax4-Gens, und wahlweise eines funktionellen und exprimierbaren Pax6-Gens, zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung zur Behandlung von Diabetes in einem Säugetier.
  24. Verwendung nach Anspruch 23, wobei die genannte pharmazeutische Zusammensetzung in vitro in eine Zelle eines Säugetiers eingeführt wird.
  25. Verwendung nach Anspruch 24, wobei die genannte Zelle in das genannte Säugetier, oder in ein Säugetier der gleichen Art eingeführt werden soll.
  26. Verwendung nach Anspruch 24 oder 25, wobei es sich bei der genannten Zelle um eine nicht-menschliche Keimzelle, eine nicht-menschliche Eizelle, eine nicht-menschliche Embryozelle oder eine davon abgeleitete, nicht-menschliche Zelle handelt.
  27. Verwendung nach einem der Ansprüche 19 bis 25, wobei es sich bei dem Säugetier um einen Menschen handelt, oder die Verwendung nach Anspruch 26, wobei das Säugetier eine Ratte oder eine Maus ist.
  28. Verwendung eines nicht-menschlichen, transgenen Tiers gemäß Anspruch 15, 17 oder 18 zur Untersuchung von Krankheiten, die mit einer Entwicklungsstörung der Bauchspeicheldrüse in Zusammenhang stehen.
  29. Verwendung nach Anspruch 28, wobei es sich bei der genannten Entwicklungsstörung der Bauchspeicheldrüse um juvenile Diabetes handelt.
DE69734725T 1996-12-31 1997-12-30 Neues verfahren zur überprüfung des differenzierungszustands pankreatischer zellen eines säugetiers Expired - Lifetime DE69734725T2 (de)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US778423 1996-12-31
US08/778,423 US6071697A (en) 1992-08-03 1996-12-31 Method for testing the differentiation status in pancreatic cells of a mammal
PCT/EP1997/007321 WO1998029566A2 (en) 1996-12-31 1997-12-30 Novel method for testing the differentiation status in pancreatic cells of a mammal

Publications (2)

Publication Number Publication Date
DE69734725D1 DE69734725D1 (de) 2005-12-29
DE69734725T2 true DE69734725T2 (de) 2006-08-17

Family

ID=25113304

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
DE69734725T Expired - Lifetime DE69734725T2 (de) 1996-12-31 1997-12-30 Neues verfahren zur überprüfung des differenzierungszustands pankreatischer zellen eines säugetiers

Country Status (8)

Country Link
EP (1) EP0958357B1 (de)
JP (1) JP3631765B2 (de)
AT (1) ATE310814T1 (de)
AU (1) AU5985998A (de)
CA (1) CA2276459C (de)
DE (1) DE69734725T2 (de)
DK (1) DK0958357T3 (de)
WO (1) WO1998029566A2 (de)

Families Citing this family (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AU4166699A (en) * 1998-06-16 2000-01-05 Yamanouchi Pharmaceutical Co., Ltd. Method for screening pax4 gene expression potentiator and medicinal compositionsfor potentiating pax4 gene expression
US20100135963A1 (en) * 2004-08-11 2010-06-03 Benoit Raymond Gauthier Use of pax4 in pancreatic cell proliferation
EP1885454A2 (de) 2005-05-04 2008-02-13 DeveloGen Aktiengesellschaft Verwendung von gsk-3-hemmern zur prävention und behandlung von pankreatischen autoimmunkrankheiten
US11172657B2 (en) 2017-09-19 2021-11-16 Pormedtec Co., Ltd. Method for developing organ that lacks specific functional cell

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE4225569C2 (de) * 1992-08-03 1996-04-25 Max Planck Gesellschaft Verwendung einer Sonde zur Tumordiagnostik oder Tumortherapie

Also Published As

Publication number Publication date
DE69734725D1 (de) 2005-12-29
CA2276459C (en) 2007-04-03
EP0958357A2 (de) 1999-11-24
AU5985998A (en) 1998-07-31
JP2000510000A (ja) 2000-08-08
WO1998029566A2 (en) 1998-07-09
CA2276459A1 (en) 1998-07-09
ATE310814T1 (de) 2005-12-15
DK0958357T3 (da) 2006-02-20
EP0958357B1 (de) 2005-11-23
JP3631765B2 (ja) 2005-03-23
WO1998029566A3 (en) 1998-09-03

Similar Documents

Publication Publication Date Title
DE69233477T2 (de) Transgene nicht-menschliche tiere ohne prionprotein
DE69133372T2 (de) Transgenes, nicht-menschliches säugetier das die amyloidbildende pathologie der alzheimerschen krankheit zeigt
Skynner et al. Promoter transgenics reveal multiple gonadotropin-releasing hormone-I-expressing cell populations of different embryological origin in mouse brain
Duchen et al. An hereditary motor neurone disease with progressive denervation of muscle in the mouse: the mutant'wobbler'.
Hassankhani et al. Overexpression of NGF within the heart of transgenic mice causes hyperinnervation, cardiac enlargement, and hyperplasia of ectopic cells
DE69428130T3 (de) Verwendung von bcl-2 zur herstellung von arzneimitteln zur therapeutischen behandlung und verhinderung von krankheiten
US5698766A (en) Transgenic animal model for testing drugs for treating eating disorders and epilepsy
DE69722035T2 (de) Neue testmethode, um den differenzierungszustand von bauchspeicheldrüsenzellen eines säugetieres festzustellen.
DE69832798T2 (de) Regulatorische sequenzen für die in-vivo-expression einer heterologen dns-sequenz in endothelzellen und ihre verwendungen.
DE69729730T2 (de) Transgene mäuse, die den leukämie inhibierungsfaktor exprimieren können
Giridharan Animal models of obesity & their usefulness in molecular approach to obesity
DE69721005T2 (de) Gebrauch von galanin um nervenschäden zu reparieren
DE60026347T2 (de) Anwendung von nicht menschliches SHIP2 'Knock-out' Säugtiere
DE69734725T2 (de) Neues verfahren zur überprüfung des differenzierungszustands pankreatischer zellen eines säugetiers
JP2000500341A (ja) 組換え基質による哺乳類体細胞モザイク現象の生成
DE60034877T2 (de) MENSCHLICHE, FüR NEUROGENIN 3 KODIERENDE NUKLEOTIDSEQUENZEN
DE69920698T2 (de) Transgenes nichthumanes tier mit inaktivem peg3 und dessen verwendung
US5948623A (en) Method for testing the differentiation status in pancreatic cells of a mammal
DE69833108T2 (de) Tiere, die ein transferiertes gen der 25-hydroxy-vitamin d3-24 hydroxylase enthalten
EP1288311A2 (de) Methode zum testen von wirkstoffen hinsichtlich der aktivierung von pax4 und der produktion von insulin produzierenden beta-zellen
DE60030539T2 (de) Tiere mit defizienter expression der uridin-phosphorylase
JP2000510001A (ja) 分断されたｎｐｙ ｙ１受容体遺伝子を有するトランスジェニック動物
DE10016083A1 (de) Nicht-menschliches Tiermodell für Wachstumsdefizienz und Defekte der Informationsverarbeitung oder der kognitiven Funktion und seine Verwendung
DE69937638T2 (de) Caspase-9 defiziente tiere und deren verwendung
US6350932B1 (en) Vitamin D receptor ablated mice

Legal Events

Date Code Title Description
8364 No opposition during term of opposition