DE69133372T2 - Transgenes, nicht-menschliches säugetier das die amyloidbildende pathologie der alzheimerschen krankheit zeigt - Google Patents

Transgenes, nicht-menschliches säugetier das die amyloidbildende pathologie der alzheimerschen krankheit zeigt Download PDF

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Description

  • 1. Gebiet der Erfindung
  • Die Erfindung betrifft allgemein Tiermodelle, die sich zum Testen einer Hypothese in Verbindung mit der Behandlung einer Krankheit eignen. Insbesondere betrifft die Erfindung transgene Säugetiere, in deren Genom spezifische Segmente von exogenem genetischen Material eingebaut sind, die für β-Amyloid-Proteine, deren Vorläufer und Teile von derartigen Proteinen und Vorläufern kodieren und sie in spezifischen Zelltypen überall überexprimieren.
  • 2. Hintergrund der Erfindung
  • Den Hintergrund der vorliegenden Erfindung bilden die folgenden beiden Aspekte: (1) biologische Organismen, die genetisch transformiert worden sind; und (2) Untersuchung von genetischem Material mit Bezug zu Amyloidose. Diese beiden Aspekte werden nachstehend erörtert.
  • 2.1. Genetische Transformationen
  • Seit einiger Zeit ist es bekannt, dass die Möglichkeit zur Durchführung der genetischen Transformation einer Zygote (und der daraus entstehenden Embryos und reifen Organismen) besteht, indem man exogenes genetisches Material in den Nucleus der Zygote oder in ein beliebiges genetisches Nucleusmaterial, das letztendlich einen Teil des Nucleus der Zygote bildet, einbringt oder inseriert. Der Genotyp der Zygote und des Organismus, der aus einer Zygote entsteht, schließt den Genotyp des exogenen genetischen Materials ein. Ferner führt der Einbau von exogenem genetischen Material in die Zygote zu einer Phänotypexpression des exogenen genetischen Materials.
  • Der Genotyp des exogenen genetischen Materials wird bei der Zellteilung der Zygote exprimiert. Jedoch erfolgen die Phänotypexpression, z. B. die Erzeugung eines Proteinprodukts oder von Produkten des exogenen genetischen Materials, oder Veränderungen des natürlichen Phänotyps der Zygote oder des Organismus an dem Punkt der Entwicklung der Zygote oder des Organismus, an dem das spezielle exogene genetische Material aktiv ist. Veränderungen der Expression des Phänotyps umfassen eine Verstärkung oder Verringerung der Expression eines Phänotyps oder eine Veränderung der Förderung und/oder eine Steuerung eines Phänotyps, einschließlich der Addition eines neuen Promotors und/oder eines Steuerelements oder die Ergänzung eines existierenden Promotors und/oder Steuerelements des Phänotyps.
  • Die genetische Transformation von verschiedenen Typen von Organismen wird ausführlich im US-Patent 4 873 191 (Ausgabetag 10. Oktober 1989) beschrieben. Auf diese Druckschrift wird bezüglich der Verfahren zur Erzeugung von transgenen Organismen Bezug genommen. Die genetische Transformation von Organismen kann als eine in vivo-Analyse der Genexpression während der Differenzierung und zur Beseitigung oder Verringerung von genetischen Krankheiten herangezogen werden.
  • Die genetische Transformation einer Zygote (und der Organismen, die daraus heranreifen) wird durch Addition von exogenem genetischen Material in der Weise durchgeführt, dass das exogene genetische Material zu einem Bestandteil des Nucleusteils der Zygote vor einer Teilung der Zygote wird. Wenn das exogene genetische Material nach der Mitose oder Zellteilung der Zygote zugefügt wird, muss das exogene genetische Material zu jedem einzelnen entstandenen Nucleus hinzugefügt werden. Es besteht jedoch die Möglichkeit, dass das exogene genetische Material nicht in das genetische Material der Zygote und des daraus entstehenden Organismus integriert wird und zu einem Bestandteil dieses genetischen Materials wird. Somit kann das exogene genetische Material zu einem beliebigen genetischen Nucleusmaterial zugesetzt werden, das letztlich einen Bestandteil des Nucleus der Zygote bildet, unter Einschluss des Zygoten-Nucleus.
  • Das genetische Nucleusmaterial des der Transformation unterliegenden Organismus muss sich in einem physikalischen Zustand befinden, der die Aufnahme des exogenen genetischen Materials ermöglicht. Um dies zu erreichen, gibt es zahlreiche Möglichkeiten. Beispielsweise kann das exogene genetische Material in den Nucleus einer primordialen Keimzelle, die diploid ist, z. B. in ein Spermatogonium oder Oogonium, platziert werden. Man lässt dann die primordiale Keimzelle zu einem Gameten reifen, der mit einem weiteren Gameten oder einer Quelle für einen haploiden Satz von Chromosomen unter Bildung einer Zygote vereinigt wird.
  • Das exogene genetische Material kann in den Nucleus eines reifen Eis platziert werden. Vorzugsweise liegt das Ei in einem befruchteten oder aktivierten (durch Parthenogenese) Zustand vor. Nach der Addition des exogenen genetischen Materials wird ein komplementärer haploider Satz von Chromosomen (z. B. eine Spermazelle oder Polkörperchen) hinzugefügt, um die Bildung einer Zygote zu ermöglichen. Man lässt die Zygote sich zu einem Organismus entwickeln, indem man sie beispielsweise einem pseudoträchtigen weiblichen Tier implantiert. Der erhaltene Organismus wird auf die Integration des exogenen genetischen Materials analysiert. Wenn eine positive Integration festgestellt wird, kann der Organismus für die in vivo-Analyse der Genexpression, von der angenommen wird, dass sie mit einer bestimmten genetischen Krankheit im Zusammenhang steht, herangezogen werden.
  • Es wurden Versuche zur Untersuchung einer Anzahl unterschiedlicher Typen genetischer Krankheiten unter Verwendung derartiger transgener Tiere gemacht. Versuche im Zusammenhang mit dem Studium der Alzheimer-Krankheit sind in WO89/06689 und WO89/06693 (beide am 27. Juli 1989 veröffentlicht) beschrieben. Auf diese Druckschriften wird durch Verweis Bezug genommen. Diese Druckschriften beschreiben genetische Sequenzen, die für das Alzheimersche β-Amyloid-Protein kodieren, und den Einbau derartiger Sequenzen in das Genom von transgenen Tieren.
  • Wie nachstehend ausführlich beschrieben, nimmt man an, dass die Bildung von β-Amyloid-Protein im Zusammenhang mit der Alzheimer-Krankheit steht. Jedoch besteht ein ernstes Hindernis bei der Aufklärung des molekularen Mechanismus, der bei der Amyloid-Synthese- und -Ablagerung in einem an Alzheimer erkrankten Gehirn beteiligt ist, darin, dass keine überzeugenden Tiermodelle für diese besondere Störung beim Menschen verfügbar sind. WO89/06689 und WO89/06693 beschreiben spezielle DNA-Sequenzen, von denen man annimmt, dass sie im Zusammenhang mit der Bildung von Amyloid stehen. Diese speziellen Sequenzen werden mit neu entwickelten Tumorvirus-Vektoren, die sich von SV40 und dem JC-Virus ableiten, unter Bildung von Konstrukten fusioniert. Diese Konstrukte werden zur Transfektion von Zellen und transgenen Mäusen zur Bereitstellung von Modellen einer Amyloid-Überexpression, die mit einer Amyloid-Anreicherung in einem an Alzheimer erkrankten Gehirn in Zusammenhang stehen kann, verwendet.
  • Die erfindungsgemäß erzeugten transgenen Tiere sollen ein experimentelles Medium zur Aufklärung von Aspekten der molekularen Pathogenese der Alzheimer-Krankheit bereitstellen und als Werkzeuge zum Screening von Arzneistoffen dienen, für die potentielle Anwendungsmöglichkeiten als therapeutische Mittel zur Verhinderung oder Begrenzung der Amyloid-Anreicherung bestehen.
  • 2.2. Alzheimer-Krankheit und β-Amyloid-Protein
  • Man schätzt, dass mehr als 5 % der US-Bevölkerung im Alter von mehr als 65 Jahren und mehr als 15 % der US-Bevölkerung im Alter von mehr als 85 Jahren von einer gewissen Form der Alzheimer-Krankheit betroffen sind (A. J. Cross, Eur J. Pharmacol., Bd. 82 (1982), S. 77-80; R. D. Terry et al., Ann. Neurol., Bd. 14 (1983), S. 497-506). Man nimmt an, dass diese Krankheit den wichtigsten Grund für die Aufnahme von älteren Personen in Langzeitpflegeeinrichtungen darstellt und dass etwa 65 % der Personen, die in Intensivpflegeeinrichtungen sterben, an dieser Krankheit leiden.
  • Es sind bestimmte Fakten über die biochemischen und metabolischen Erscheinungen bei Vorliegen der Alzheimer-Krankheit bekannt. Zwei morphologische und histopathologische Veränderungen, die im an Alzheimer erkrankten Gehirn festgestellt werden, sind neurofibrilläre Gewirre (NFT) und Amyloid-Ablagerungen. Intraneuronale neurofibrilläre Gewirre kommen auch bei anderen degenerativen Etkrankungen vor, jedoch scheint die Anwesenheit von Amyloid-Abscheidungen sowohl in den interneuronalen Zwischenräumen (neuritische Plaques) und in der umgebenden Mikrovaskulatur (vaskuläre Plaques) charakteristisch für Alzheimer zu sein. Darunter scheinen die neuritischen Plaques besonders vorherrschend zu sein (D. L. Price et al., Drug Development Research, Bd. 5 (1985), S. 59-68). Plaques treten auch in den Gehirnen von älteren Patienten mit Down-Syndrom, bei denen sich die Alzheimer-Krankheit entwickelt, auf.
  • Das Protein, das den Großteil dieser Plaques ausmacht, wurde partiell gereinigt und sequenziert. Plaque-reiche Gehirne von verstorbenen Alzheimer-Patienten wurden als Quelle zur Extraktion eines etwa 4,2 kd umfassenden "Kern"-Polypeptids, des Amyloid-Plaque-Kernproteins (APCP), das hier als "β-Amyloid-Kernprotein" bezeichnet wird, verwendet. Dieses Peptid erhielt von G. Glenner et al. (Biochem. Biophys. Res. Commun., Bd. 120 (1984), S. 885-890) die Bezeichnung β-Protein. Die Aminosäuresequenz des Aminoterminus wurde bestimmt (G. Glenner et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., Bd. 122 (1984), S. 1131-1135; C. L. Masters et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Bd. 82 (1985), S. 4245-4259). Die von den beiden Arbeitsgruppen angegebenen Aminosäuresequenzen sind identisch, mit der Ausnahme, dass Glenner et al. über einen Glutaminrest in Position 11 für zerebrales vaskuläres Amyloid der Alzheimer-Krankheit berichten, während Masters et al. für die Position 11 einen Glutaminsäurerest angeben. Ferner berichten die erstgenannten Autoren, dass das zerebrale vaskuläre Amyloid einen besonderen Aminoterminus aufweist, während die letztgenannten Autoren angeben, dass die in Amyloid-Plaquekernen festgestellte Form einen "ausgefransten" Aminoterminus aufweisen, d. h. bei aus dieser Quelle isolierten Peptiden scheinen 3, 7 oder 8 Aminosäuren vom Aminoterminus zu fehlen. Beide Gruppen haben gezeigt, dass das gleiche Peptid in Amyloid-Plaquekernen und im vaskulären Amyloid von erwachsenen Personen mit Down-Syndrom auftritt, und geben an, dass sich Glutaminsäure in Position 11 befindet.
  • Weitere Untersuchungen über das β-Amyloid-Kernprotein wurden ferner von A. Roher et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Bd. 83 (1986), S. 2662-2666, durchgeführt, die die vollständige Aminosäurezusammensetzung des β-Proteins angaben und bestätigten, dass keine Übereinstimmung mit einem bekannten Protein vorliegt. Die erzielten Zusammensetzungen stimmten jedoch offensichtlich weder mit denen von D. Allsop et al., Brain, Res., Bd. 259 (1983), S. 348-352, noch mit den von Glenner oder Masters veröffentlichten Zusammensetzungen (a.a.O.) überein.
  • C. W. Wong et al., Proc, Natl. Acad. Sci. USA, Bd. 82 (1985), S. 8729-8732 zeigten, dass ein synthetisches Peptid, das mit den ersten zehn Aminosäuren des von Masters beschriebenen β-Amyloid-Kernproteins (a.a.O.) homolog war, dazu befähigt war, Antikörper in Mäusen zu erzeugen, und dass diese Antikörper zur Färbung nicht nur von mit Amyloid beladenen zerebralen Gefäßen, sondern auch von neuritischen Plaques befähigt waren. Diese Ergebnisse wurden von D. Allsop et al., Neuroscience Letters, Bd. 68 (1986), S. 252-256, unter Verwendung von monoklonalen Antikörpern gegen ein synthetisches Peptid, das den Aminosäuren 8-17 entspricht, bestätigt. Somit scheint im allgemeinen das an verschiedenen Stellen des Gehirns von Alzheimer-Patienten gefundene Plaque-Protein eine ähnliche Immunoreaktivität aufzuweisen. Es ist hochgradig unlöslich wie durch die Unmöglichkeit, es in zahlreichen, üblicherweise verwendeten Denaturierungsmitteln, wie Detergenzien und chaotropen Mitteln, in Lösung zu bringen, gezeigt wird (Masters, a.a.O.; D. Allsop et al., a.a.O.).
  • Man nimmt in Analogie zu einigen anderen Amyloid-Proteinen an, dass β-Amyloid-Kernprotein aus einem Vorläufer im peripheren Kreislaufsystem oder lymphatischen System gebildet werden kann. Es gibt sechs bekannte Fälle von krankheitsbedingten Amyloid-Ablagerungen, bei denen die Natur des Vorläuferproteins für das Amyloid-Protein bekannt ist: für primäre Amyloidose ist die Quelle eine leichte Kette eines Immunoglobulins; für sekundäre Amyloidose handelt es sich beim Vorläufer um Amyloid A-Protein; für familiäre Amyloid-Polyneuropathie und senile Herzamyloidose handelt es sich um Präalbumin, auch als Transthyreitin bekannt, oder eine Variante davon; für medulläres Thyroidkarzinom handelt es sich um ein Procalcitonin-Fragment; und für vererbliche zerebrale Hämorrhagie handelt es sich um gamma-Spurenfragment, das auch als Cystatin C bekannt ist (vergl. z. B. G. Glenner, New England Journal of Medicine, Bd. 302 (1980), S. 1283; K. Sletton et al., Biochem. J., Bd. 195 (1981), S. 561; Benditt et al., FEBS Lett., Bd. 19 (1971), S. 169; K. Sletton et al., Eur. J. Biochem., Bd. 41 (1974), S. 117; K. Sletton et al., J. Exp. Med., Bd. 143 (1976), S. 993). Die vorstehende Aufzählung stellt nur eine Teilliste dar; es gibt eine Anzahl von weiteren Literaturstellen bezüglich des Procalcitonin-Fragments als Vorläufer für das Amyloid des Thyroidkarzinoms. Alternativ kann ein derartiger Vorläufer für das β-Amyloid-Kernprotein im Gehirn oder an einer anderen Stelle erzeugt und spezifisch im Gehirn abgelagert werden.
  • Es wurde beschrieben, dass ein Protein mit einem Gehalt an der β-Amyloid-Kernprotein-Sequenz (bezeichnet als A4) innerhalb des Rahmens eines größeren Proteins vorliegt (J. Kang et al., Nature, Bd. 325 (1987), S. 733-736). Dieses Protein, das einen potentiellen in vivo-Vorläufer des β-Amyloid-Kernproteins darstellt, wurde aus der Sequenz eines cDNA-Klons, der aus einer humanen fötalen Hirngewebe-cDNA-Bibliothek isoliert worden war, vorhergesagt und besteht aus 695 Aminosäureresten (bezeichnet als A695), wobei der Aminoterminus des β-Amyloid-Kernproteins in Position 597 beginnt. In Analogie zur vorstehend beschriebenen Serie kann es der Fall sein, dass ein derartiger Vorläufer oder ein Fragment davon im Serum in einer höheren Konzentration zirkuliert, die bei Alzheimer-Betroffenen im Vergleich zu nicht betroffenen Personen unterscheidbar ist. Alternativ oder zusätzlich können derartige Unterschiede in der zerebralen Spinalflüssigkeit nachgewiesen werden.
  • Neben A695, das von Kang et al. beschrieben wurde, gibt es offensichtlich eine Anzahl von Vorläuferproteinen. Ein derartiges Vorläuferprotein wird in der gleichzeitig anhängigen US-Anmeldung 361,912 (Anmeldetag 6. Juni 1989) von Forschern, die der Forschungsorganisation wie die vorliegenden Erfinder angehören, beschrieben (A751). Weitere Arbeitsgruppen charakterisierten ein zusätzliches Amyloid-Vorläuferprotein (vergl. Kitaguchi et al., Nature, Bd. 331 (1988), S. 530-532), das geringfügig größer ist, nämlich 770 Aminosäuren. Es ist darauf hinzuweisen, dass diese A751- und A770-Proteine ein Insert mit etwa 57 Aminosäuren über A695 hinaus enthalten. Diese spezielle Insert- Sequenz mit 57 Aminosäuren ist hochgradig homolog zu einer Anzahl von Inhibitoren vom Kunitz-Typ, die für eine Reihe von Serin-Proteasen spezifisch sind. Zusätzliche 19 Aminosäuren sind in Nachbarstellung zum Insert mit 57 Aminosäuren in der A770-Form vorhanden.
  • Wie die vorstehenden Druckschriften und zahlreiche weitere, nicht zitierte Druckschriften zeigen, ist das genetische Material, das für die Bildung von β-Amyloid-Vorläuferproteinen kodiert, Gegenstand eingehender Untersuchungen. Derzeit gibt es aber keine direkten nachprüfbaren Informationen über die spezifischen Mechanismen, die die Bildung und Ablagerung von Amyloid-Protein in einem an Alzheimer erkrankten Gehirn regulieren. Es ist bekannt, dass das genetische Material, das für die Bildung von β-Amyloid-Vorläuferprotein kodiert, sich am Chromosom 21 befindet. Ferner lassen zahlreiche Untersuchungen darauf schließen, dass es komplizierte Wechselwirkungen gibt, an denen das genetische Material an diesem Chromosom beteiligt ist. Man nimmt an, dass derartige Wechselwirkungen die Bildung von Vorläuferproteinen, Proteasen und Protease-Inhibitoren beinhalten. Ferner wird angenommen, dass bei Personen, die an der Alzheimer-Krankheit leiden, diese Wechselwirkungen in irgendeiner Weise gestört sind, so dass ein ungewöhnlich hoher Anteil an β-Amyloid-Kernprotein erzeugt und/oder im Gehirn abgelagert wird. Die hohe Konzentration an β-Amyloid-Kernprotein könnte das Ergebnis von verschiedenen biochemischen Aktivitäten sein, einschließlich der Überproduktion von derartigen Proteinen und/oder der Unfähigkeit, eine ausreichende Anzahl von derartigen, bereits gespaltenen Proteinen zu spalten.
  • Die erfindungsgemäßen transgenen Säugetiere liefern einen Einblick bezüglich der Art und der Ablaufstellen dieser Wechselwirkungen und liefern somit wertvollere Modelle zum Testen der Wirksamkeit bestimmter Arzneistoffe in Bezug auf eine Verhinderung oder Verringerung der Anreicherung von β-Amyloid-Kernprotein im Gehirn. Die erfindungsgemäßen transgenen, nicht-humanen Säugetiere enthalten rekombinantes genetisches Material, das aus speziellen Segmenten von β-Amyloid-Vorläuferproteinen besteht, wobei diese Segmente mit spezifischen Promotoren fusioniert sind, die zur Expression des Proteins in spezifischen Geweben, wie in Nervengeweben allgemein, und/oder spezifischen Typen von Nervengewebe, z. B. im Gehirn, befähigt sind.
  • 3. Zusammenfassende Darstellung der Erfindung
  • Die Erfindung stellt Mittel zur Aufklärung der molekularen Mechanismen bereit, die an der Synthese und, was wichtiger ist, an der Hemmung der Synthese und der Abscheidung von β-Amyloid-Protein (von besonderer Bedeutung im Gehirn) durch Hemmung der Bildung und/oder Verstärkung der Spaltung nach der Bildung beteiligt sind. Klonierte rekombinante oder synthetische DNA-Sequenzen, die mit der Pathologie der Alzheimer-Krankheit in Zusammenhang stehen, werden befruchteten Säugetiereiern (vorzugsweise Eiern von Mäusen) injiziert. Die mit der Injektion versehenen Eier werden pseudoträchtigen weiblichen Tieren implantiert und bis zu Ende ausgetragen, um transgene Mäuse bereitzustellen, deren Zellen Proteine, die im Zusammenhang mit der Pathologie der Alzheimer-Krankheit stehen, exprimieren. Bei den injizierten Sequenzen handelt es sich um Konstrukte mit Promotorsequenzen, die so verbunden sind, dass das gewünschte Protein in spezifischen Geweben der transgenen Säugetiere exprimiert wird.
  • Es wird angenommen, dass die β-Amyloid-Kernproteine A99 und A42 (gemäß der hier gegebenen Definition) zunächst in Form der Vorläuferproteine A695 und/oder A751 exprimiert werden. Die Vorläuferproteine können der Wirkung eines Protease-Enzyms unterworfen werden, was die Bildung von β-Amyloid-Kernproteinen ermöglicht, die bei Bildung in ausreichenden Mengen die Erzeugung von Plaques, die mit der Alzheimer-Krankheit verbunden sind, ermöglichen.
  • Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung werden Nucleotidsequenzen, die für die Bildung von speziellen β-Amyloid-Vorläuferproteinen und β-Amyloid-Kernproteinen exprimieren, mit speziellen Promotorsequenzen verknüpft. Die Promotorsequenzen werden sorgfältig so gewählt, dass einige Sequenzen die Nucleotidsequenz exprimieren, an die sie in sämtlichen Gewebetypen gebunden sind, während andere Promotorsequenzen nur das Nucleotid exprimieren, an das sie gebunden sind, wenn der Promotor innerhalb spezifischer Typen von Zellen eines spezifischen Gewebetyps, z. B. Nervengewebe, vorhanden ist. Durch Erzeugung von derartigen transgenen Mäusen lassen sich zusätzliche Informationen bezüglich der Art und den Stellen der Bildung (und gelegentlich des Abbaus) von β-Amyloid-Kernproteinen und deren Ablagerung in einem an Alzheimer erkrankten Gehirn erhalten. Unter Ausnützen dieser zusätzlichen Informationen bezüglich des Mechanismus und der Orte der Bildung (und möglicherweise des Abbaus) und der Ablagerung von β-Amyloid-Kernproteinen lassen sich therapeutische Mittel in wirksamerer Weise bezüglich ihrer Fähigkeit zur Verhinderung der Bildung und/oder der Ablagerung von derartigen Proteinen testen und somit die Alzheimer-Krankheit lindern oder verhindern.
  • Die erfindungsgemäßen transgenen Säugetiere stellen wertvolle Modelle zur Untersuchung der in vivo-Beziehungen der Proteine untereinander und mit anderen Verbindungen, die in Bezug auf ihre Eignung zur Behandlung der Alzheimer-Krankheit getestet werden, dar.
  • 3.1. Aufgaben, Merkmale und Vorteile
  • Eine Hauptaufgabe der Erfindung besteht in der Bereitstellung eines transgenen, nicht-humanen Säugetiers, dessen Zellen eine rekombinante DNA-Sequenz enthalten, die für einen Zelltyp kodiert, der spezifisch für die Expression von β-Amyloid-Proteinen ist, wobei diese Säugetiere zur Untersuchung der Ätiologie der Alzheimer-Krankheit sowie der Wirksamkeit von Arzneistoffen bei der Behandlung dieser Krankheit herangezogen werden können.
  • Ein Vorteil der vorliegenden Erfindung besteht darin, in vivo-Mittel zur Untersuchung der Einflüsse der Expression von verschiedenen Proteinen in verschiedenen Geweben (z. B. Nervengewebe einschließlich spezielle Typen von Nervengeweben und nicht-Nervengeweben) auf die Synthese von β-Amyloid-Protein und auf die Bildung von Plaques, die mit der Alzheimer-Krankheit in Zusammenhang stehen, bereitzustellen.
  • Die vorliegende Erfindung stellt ein transgenes, nicht-humanes Säugetier bereit, dessen Zellen die geklonte rekombinante oder synthetische DNA-Sequenz enthalten, wobei die Sequenz folgendes umfasst: eine Nervengewebe-spezifische Promotorsequenz, bei der es sich um den neuronal-spezifischen Enolase-Promotor handelt, und eine Kodierungssequenz, die das A751-β-Amyloid-Vorläuferprotein kodiert, und wobei der Promotor und die Kodierungssequenz funktionell miteinander verbunden sind, stabil in das Genom des nicht-humanen Säugetiers eingebaut sind und zur Bildung von β-Amyloid-Proteinablagerungen im Gehirn des nicht-humanen Säugetiers exprimiert werden.
  • Gemäß einem weiteren Aspekt stellt die Erfindung ein Verfahren zur Herstellung einer genetisch-transformierten Zygote mit der Fähigkeit, sich in ein transgenes, nicht-humanes Säugetier zu entwickeln, bereit, das dadurch gekennzeichnet ist, dass es eine Vielzahl von Zellen aufweist die eine geklonte rekombinante oder synthetische DNA-Sequenz enthalten, wobei die Sequenz folgendes umfasst: eine Nervengewebe-spezifische Promotorsequenz, bei der es sich um den neuronal-spezifischen Enolase-Promotor handelt, der funktionell mit einer Kodierungssequenz, die das A751-β-Amyloid-Vorläuferprotein kodiert, verbunden ist, wobei das Verfahren den folgenden Schritt umfasst:
    • Einführen der Promotorsequenz und der Kodierungssequenz durch Mikroinjektion in einen Pronucleus einer Säugetier-Zygote, wobei die Zygote zur Entwicklung in ein Säugetier fähig ist, wobei eine genetisch transformierte Zygote erhalten wird;
    • wobei die Promotorsequenz und die Kodierungssequenz so ausgewählt sind, dass die Kodierungssequenz nicht in solcher Weise und in einem solchen Grad aktiviert ist, dass sie die normale Entwicklung des Embryos bis zum Ende verhindern würde; und
    • wobei das β-Amyloid-Vorläuferprotein zur Bildung von β-Amyloid-Proteinablagerungen im Gehirn des nicht-humanen Säugetiers exprimiert wird.
  • Ein Merkmal der erfindungsgemäßen transgenen Säugetiere besteht darin, dass sie sowohl prognostische als auch diagnostische Mittel zur Untersuchung der Alzheimer-Krankheit und zur Bestimmung der Wirksamkeit von pharmazeutischen Arzneistoffen bei der Behandlung von Alzheimer-Krankheit bei einem Testsubjekt darstellen. Zunächst werden die transgenen Mäuse als Standards zur Identifikation von einer oder mehreren in Frage kommenden Verbindungen herangezogen, die zur Verstoffwechselung des β-Amyloid-Proteins (oder zur Verhinderung von dessen Bildung), das mit einer Prädisposition für die Alzheimer-Krankheit verbunden ist, befähigt sind.
  • Weitere Aufgaben, Vorteile und Merkmale der vorliegenden Erfindung umfassen die Bereitstellung von transgenen, nicht-humanen Säugetieren, die Informationen bezüglich des Mechanismus und der Orte der Bildung und Ablagerung liefern, sowie die Bereitstellung von in vivo-Modellen zum Testen von Arzneistoffen, die zur Störung oder Verhinderung einer derartigen Bildung und/oder Ablagerung befähigt sind.
  • Diese und weitere Aufgaben, Merkmale und Vorteile der Erfindung ergeben sich noch deutlicher aus der folgenden ausführlichen Beschreibung der Erfindung im Zusammenhang mit den beigefügten Figuren.
  • 4. Kurze Beschreibung der Figuren
  • 1, die die 1-1, 1-2, 1-3 und 1-4 umfasst, zeigt die Basissequenz eines cDNA-Klons mit der Bezeichnung λAPCP168i4, die für die Aminosäuren 1-751 von β-Amyloid-Vorläuferprotein kodiert. Das 168 bp- Insert, das diesen Klon von der Sequenz von Kang et al. unterscheidet, ist unterstrichen.
  • 2 zeigt die Aminosäuresequenz von A99.
  • 3 zeigt die Aminosäuresequenz von A42, die dem β-Amyloid-Kernprotein entspricht.
  • 4 zeigt die Konstruktionsstrategie für den mit A42 und A99 verknüpften NSE-Promotor.
  • 5 zeigt die Konstruktionsstrategie für den mit A695 und A751 verknüpften NSE-Promotor.
  • 6 zeigt die Konstruktionsstrategie für den mit A42 und A99 verknüpften MT-Promotor.
  • 7 zeigt das Konstruktionsschema für einen Säugetierzellen-Expressionsvektor für die Expression von MT-A751 und MT-A695.
  • 8, die die 8-1 und 8-2 umfasst, zeigt die Beziehung zwischen dem durch das λAPCP168i4-168 bp-Insert kodierte Peptid mit der Oberfamilie von Proteinen, von denen zahlreiche Mitglieder eine Hemmwirkung auf Serin-proteasen ausüben.
  • 9 zeigt die NSE-Promotorsequenz und ein PCR-Amplifikationsschema für NSE.
  • 10 zeigt ein Konstruktionsschema für einen Säugetierzellen-Expressionsvektor für die β-Amyloid-Expression/Selektion von β-Amyloid-Kernkonstrukten.
  • 11A zeigt eine schematische Darstellung des transgenen NSE-A751.
  • 11B zeigt Southern-Blots von DNA aus Wildtyp- und transgenen Mäusen.
  • 12 (A, B, C und D) zeigen die Immunoperoxidase-Färbung von humanem und murinem Hirn.
  • 13 (A, B, C, D und E) sind mikrophotographische Aufnahmen von immunoreaktiven Ablagerungen in NSE-A751-Gehirnen.
  • 5. Ausführliche Beschreibung von bevorzugten Ausführungsformen
  • Bevor die vorliegenden transgenen Mäuse sowie Verfahren zu ihrer Erzeugung und Verwendung zum Testen von Arzneistoffen beschrieben werden, ist darauf hinzuweisen, dass die Erfindung nicht auf die speziellen beschriebenen Verfahren und Materialien beschränkt ist, da derartige Verfahren und Materialien selbstverständlich variieren können. Ferner ist darauf hinzuweisen, dass die hier eingesetzte Terminologie nur zur Beschreibung bestimmter Ausführungsformen dient und nicht als Beschränkung anzusehen ist, da der Schutzumfang der Erfindung nur durch die beigefügten Ansprüche eingegrenzt wird.
  • Es ist darauf hinzuweisen, dass die in der Beschreibung und den beigefügten Ansprüchen verwendeten Singularformen mit dem jeweiligen unbestimmten und bestimmten Artikel auch die entsprechenden Pluralformen umfassen, sofern der Zusammenhang nicht klar etwas anderes vorschreibt. So umfasst beispielsweise der Hinweis auf "einen Klon" oder "eine Sequenz" Gemische von Klonen oder Sequenzen des beschriebenen Typs, der Hinweis auf "ein Amyloid-Protein" auch Gemische von derartigen Proteinen des beschriebenen Typs und der Hinweis auf "die transgene Maus" unterschiedliche Spezies derartiger Mäuse und dergl.
  • 5.1. Definitionen
  • Die Ausdrücke "Kernprotein" und "β-Amyloid-Kernprotein" bedeuten ein Protein mit 99 Aminosäuren gemäß der Darstellung in 2 und Fragmente davon, z. B. die in 3 dargestellte Sequenz mit 42 Aminosäuren. Diese Proteine werden hier auch als A99 und A42 bezeichnet. Ein Kernprotein mit 42 Aminosäuren wird von C. L. Masters et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Bd. 82 (1985), S. 4245-4249 (hier als "Masters et al." bezeichnet, beschrieben. "A99" ist ein Symbol, das die C-terminalen 99 Aminosäuren des β-Amyloid-Vorläufers wiedergibt und wird als "Kernprotein" angesehen.
  • "A42" bezieht sich auf ein Kernprotein des β-Amyloid-Vorläufers. Beim N-Terminus handelt es sich um den N-Terminus des Kerns mit 42 Aminosäuren. Er enthält daher die gesamte Kerndomäne. In der gesamten Beschreibung bedeutet der Ausdruck "A42" die 42 Aminosäuren umfassende Kernsequenz des β-Amyloid-Vorläuferproteins.
  • Der Ausdruck "β-Amyloid-verwandtes Protein" ist hier folgendermaßen definiert: (1) ein Protein mit 751 Aminosäuren gemäß der Darstellung in 1; (2) ein Protein mit 695 Aminosäuren gemäß der Darstellung in 1, abzüglich die 57 unterstrichenen Aminosäuren; (3) die in 1 unterstrichene Sequenz mit 57 Aminosäuren; und (4) Analoge von einer der Sequenzen (1) bis (3) und Fragmente davon, einschließlich (ohne Beschränkung hierauf) A99 und A42. Beispielsweise wird dieser Ausdruck verwendet, um das von J. Kang et al., Nature, Bd. 325 (1987), S. 733-736 (hier als "Kang et al." bezeichnet), beschriebene Protein zu beschreiben, das das β-Amyloid-Kernprotein innerhalb seiner Struktur an der Aminosäure 597 eines Proteins mit 695 Aminosäuren enthält.
  • Der Ausdruck "β-Amyloid-Vorläuferprotein" umfasst eine Untergruppe der vorstehend definierten "β-Amyloid-verwandten Proteine". Derartige Vorläuferproteine wurden erstmals von "Kang et al." beschrieben und werden natürlicherweise als größere Vorläuferproteine des "β-Amyloid-Kernproteins" gebildet. Die Sequenz mit 751 Aminosäuren ist das bemerkenswerteste Beispiel eines Vorläuferproteins gemäß der Verwendung im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung.
  • Die Ausdrücke "immunogenes -Amyloid-Kernpeptid" oder "immunogenes β-Amyloid-verwandtes Peptid" beziehen sich auf Peptide, deren Aminosäuresequenzen mit den Sequenzen einer gewissen Region des β-Amyloid-Kernproteins oder β-Amyloid-Vorläuferproteins übereinstimmen und die dazu befähigt sind, in einem immunisierten Tier eine Antikörperreaktion hervorzurufen. Beispiele für derartige Proteine werden ausführlich von Kitaguchi et. al., Biochemical and Biophysical Research Communications, Bd. 166, Nr. 3, (14. Februar 1990), beschrieben.
  • Eine "genetische Veranlagung zur Alzheimer-Krankheit" bezieht sich auf eine identifizierbare genetische Mutation oder Veränderung, die in Genomen von Personen mit Alzheimer-Krankheit oder von Personen mit Veranlagung zur Entwicklung der Alzheimer-Krankheit auftreten, jedoch nicht bei normalen (nicht-erkrankten) Personen.
  • Der hier verwendete Ausdruck "A4i" bezieht sich auf die in 1 unterstrichene Sequenz mit 57 Aminosäuren. Beim Ausdruck "A4i" kann es sich um ein Polypeptid handeln, das dem neuartigen Serin-protease-Inhibitor entspricht, der durch das vom Bacteriophagen λAPCP168i4 abgeleitete Polynucleotid kodiert wird. Das A4i-Polypeptid leitet sich nicht notwendigerweise physikalisch vom Expressionsprodukt dieses Bacteriophagen ab, sondern kann auf beliebige Weise erzeugt werden, einschließlich durch Peptidsynthese, rekombinante DNA-Techniken oder eine Kombination davon. Der Ausdruck "entsprechend" bedeutet eine homologe oder im wesentlichen äquivalente Beschaffenheit mit der bezeichneten Sequenz.
  • Der Ausdruck "genetisches Material" bedeutet ein Material, das eine oder mehrere beliebige DNA-Sequenzen entweder in gereinigter Form oder in nativem Zustand enthält, z. B. ein Fragment eines Chromosoms oder ein vollständiges Chromosom, natürliche auftretende oder synthetisch oder teilsynthetisch hergestellte DNA-Sequenzen, DNA-Sequenzen, die ein Gen oder Gene und Gen-Chimäre darstellen, die beispielsweise durch Ligation verschiedener DNA-Sequenzen geschaffen worden sind. Der Ausdruck "genetisches Material" umfasst keine DNA-Sequenzen, die in Plasmide, Viren oder Phagen eingebaut sind oder von diesen getragen werden.
  • Der Ausdruck "exogenes genetisches Material" bedeutet ein genetisches Material, das nicht aus den spezifischen Keimzellen oder Gameten, die die spezielle, der genetischen Transformation unterliegende Zygote bilden, erhalten worden ist oder natürlicherweise einen Bestandteil dieser Keimzellen oder Gameten bildet.
  • Der Ausdruck "DNA-Sequenz" bedeutet eine lineare Sequenz, die aus einer beliebigen Kombination der vier DNA-Monomeren, d. h. die Nucleotide von Adenin, Guanin, Cytosin und Thymin, besteht und für eine genetische Information kodiert, z. B. ein Code für eine Aminosäure, ein Promotor, ein Kontrollelement oder ein Genprodukt. Bei einer spezifischen DNA-Sequenz handelt es sich um eine Sequenz, die eine bekannte spezifische Funktion aufweist, beispielsweise für ein bestimmtes Polypeptid oder einen bestimmten genetischen Zug kodiert oder die Expression eines besonderen Phänotyps beeinflusst.
  • Bei einem "Gen" handelt es sich um die kleinste, unabhängig funktionsfähige Einheit von genetischem Material, das für ein Proteinprodukt kodiert oder die Transkription steuert oder beeinflusst und mindestens eine DNA-Sequenz umfasst.
  • Der Ausdruck "Genotyp" bedeutet die genetische Konstitution eines Organismus.
  • Der Ausdruck "Phänotyp" stellt eine Sammlung von morphologischen, physiologischen und biochemischen Merkmalen einer Zelle oder eines Organismus dar, die sich aus der Wechselwirkung des Genotyps und der Umgebung ergeben.
  • Eine "phänotypische Expression" ist die Expression des Codes einer oder mehrerer DNA-Sequenzen, die zur Bildung eines Produkts, z. B. eines Polypeptids oder Proteins, führt oder die Expression der Zygote oder den natürlichen Phänotyp des Organismus verändert.
  • "Zygote" bedeutet eine diploide Zelle mit der Möglichkeit zur Entwicklung zu einem vollständigen Organismus. Die Zygote kann sich durch Parthenogenese, Nucleustransplantation, Verschmelzung von zwei Gameten durch künstliche oder natürliche Befruchtung oder einem beliebigen anderen Verfahren ergeben, das eine diploide Zelle entstehen lässt, die das Potential zur Entwicklung zu einem vollständigen Organismus hat. Die Zygote kann aus dem Pflanzen- oder Tierreich stammen.
  • Der Ausdruck "Parthenogenese" bezeichnet beliebige Techniken, die die Entwicklung eines weiblichen oder männlichen Gameten zu einer Zelle und wiederum deren Entwicklung zu einem Organismus ermöglichen, wobei diese Techniken sich von der natürlichen Entwicklung von weiblichen und männlichen Gameten unterscheiden.
  • 5.2. Überblick und Gliederung
  • Um die Erfindung in gegliederter Form zu beschreiben, werden bestimmte Aspekte der Erfindung in unterschiedlichen Abschnitten beschrieben. Die Definitionen für die Ausdrücke finden sich im vorstehenden Abschnitt 5.1.
  • Der folgende Abschnitt 5.3 beschreibt die verschiedenen DNA-Sequenzen, die unterschiedliche Proteine, Vorläuferproteine und Inhibitoren exprimieren, sowie Promotorsequenzen, die mit diesen Sequenzen fusioniert werden, um eine Expression des Proteins in bestimmten Geweben zu erreichen. Diese DNA-Sequenzen werden teilweise durch im Zusammenhang mit der vorliegenden Offenbarung gemachte biologischen Hinterlegungen und durch Hinweis auf die beigefügten Figuren beschrieben.
  • Der Abschnitt 5.4 beschreibt Vorgehensweisen, mit denen bestätigt werden konnte, dass die in Abschnitt 5.3 beschriebene Sequenz zur Erzeugung von Proteinen exprimiert werden konnte.
  • Der Abschnitt 5.5 beschreibt acht verschiedene Promotor/A4-Sequenzkonstrukte sowie unter Bezugnahme auf die 4 bis 7 die Synthese der Konstrukte.
  • Der Abschnitt 5.6 beschreibt Verfahren zur Erzeugung der erfindungsgemäßen transgenen Mäuse unter Verwendung der in den vorhergehenden Abschnitten beschriebenen DNA-Sequenzen, Konstrukte und anderer Informationen.
  • Verschiedene Verfahren und Materialien, die in Verbindung mit unterschiedlichen Aspekten der Erfindung herangezogen werden, sind im Abschnitt 5.7 beschrieben.
  • Dem schließen sich ausführliche Beispiele, die Ansprüche und die Zusammenfassung an.
  • 5.3. DNA-Sequenzen
  • Zur Beschreibung der erfindungsgemäßen transgenen Mäuse ist es erforderlich, bestimmte DNA-Sequenzen zu beschreiben. Beispielsweise ist es wichtig, die DNA-Sequenz zu beschreiben, die für ein β-Amyloid-Vorläuferprotein kodiert, umfassend die Nucleotidsequenz und die entsprechende abgeleitete Aminosäuresequenz gemäß der Darstellung in 1. Diese DNA-Sequenz kodiert für ein Protein mit annähernd 82 610 Dalton, das ein β-Amyloid-verwandtes Kernprotein enthält.
  • Als erste Stufe zur Erzeugung der erfindungsgemäßen transgenen Mäuse lässt sich die in 1 dargestellte β-Amyloid-Protein-cDNA-Sequenz in einer beliebigen, dem Fachmann geläufigen Art und Weise erhalten. Ein Verfahren, um A751 zu erhalten, besteht in dessen Isolierung aus einem Bacteriophagen, der den cDNA-Klon λAPCP168i4 enthält. Dieser als λAPCP168i4 bekannte humane Fibroblasten-cDNA-Klon wurde am 1. Juli 1987 bei der ATCC unter der Hinterlegungsnummer 40347 hinterlegt.
  • Das Insert mit 168 Basenpaaren (in 1 unterstrichen) unterbricht das Codon für Val289 der Kang et al.-Sequenz, was zum Verlust dieser Aminosäure aus dem λAPCP168i4-Protein führt. Das Insert mit 168 Basenpaaren kodiert zusammen mit den drei Basenpaaren, die aus dem unterbrochenen Val289-Codon erhalten worden sind, für 57 neue Aminosäuren, die in 1 unterstrichen sind. Stromabwärts von dieser Insertion befindet sich am Codon 653 von 1 das aminoterminale Aspartat des von Masters et al. beschriebenen β-Amyloid-Kernproteins.
  • Ein besonderes Merkmal der erfindungsgemäßen transgenen Mäuse betrifft die Aufnahme von zellspezifischen Promotoren vor den Sequenzen, die für A751 kodieren.
  • Die Fähigkeit der transgenen Mäuse zur selektiven Expression dieser speziellen Peptide (in spezifischen Zelltypen), einschließlich von beliebigen Fragmenten davon, unterscheidet die vorliegenden transgenen Mäuse von anderen Mäusen.
  • Die klonierten rekombinanten und/oder synthetischen DNA-Sequenzen werden im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung verwendet. Zu speziellen Sequenzen, die für die Herstellung eines biologisch aktiven, erneut gefalteten Proteins kodiert werden, gehören:
  • Figure 00160001
  • A4i ist in 1 unterstrichen. Mäuse, denen eine Sequenz einverleibt ist, die A4i allgemein oder in spezifischen Zellen exprimiert, sind Gegenstand der vorliegenden Erfindung (d. h. ungeachtet von zellspezifischen Promotoren), wobei das A4i-Protein selbst eine wertvolle Verbindung bei der Verhinderung oder Verringerung der Auswirkungen der Alzheimer-Krankheit darstellen kann. Transgene Tiere, die Sequenzen enthalten, die A4i exprimieren, waren bisher nicht bekannt.
  • 5.4. Proteinherstellung
  • cDNA-Klone, die Kodierungssequenzen umfassen, lassen sich unter Bildung von einem der Produkte A42, A99, A695, A751 und A4i exprimieren. Die Sequenzen werden zunächst in einen für die Replikation geeigneten Expressionsvektor inseriert und die Bildung des Proteins wird bestätigt.
  • Kurz zusammengefasst, es wurde ein E. coli-Expressionsvektor mit der Bezeichnung pAPCP118-3 für die Expression eines Fusionsproteins, das aus den Aminosäureresten 655 bis 751 gemäß 1 bestand, konstruiert. Die Konstruktion von pAPCPl18-3 wurde durch Verbindung der folgenden drei Fragmente erreicht: (1) ein Plasmidgerüst (bestehend aus pBR322-Replikationsfunktionen, einem Ampicillin-Resistenzgen, dem Tryptophan-Promotor und -Operator, einer Ribosomen-Bindungsstelle, DNA, die für die sieben aminoterminalen Codons des β-Galactosidase-Strukturgens gefolgt von sechs Threoninresten kodiert, und Transkriptionsterminationssignale); (2) ein EcoRI-HaeII-Fragment, das für die Aminosäurereste 655-728 der Sequenz von 1 kodiert; und (3) ein synthetisches Fragment, das für die Aminosäurereste 729-751 der Sequenz von 1 kodiert, gefolgt von einem Stoppcodon.
  • Der erhaltene Vektor wurde zur Transformation von E. coli W3110 verwendet und die Expression des Fusionsproteins wurde durch Verringerung der Tryptophankonzentration und anschließende Zugabe von 3-β-Indolacrylsäure induziert. Das erhaltene Protein lässt sich unter Anwendung herkömmlicher Reinigungstechniken reinigen. Das erhaltene gereinigte Material steht zur Herstellung von Antikörpern für diagnostische Tests zur Verfügung.
  • Die vollständige Kodierungssequenz des β-Amyloid-Vorläuferproteins, die in 1 dargestellt ist, wurde in zwei Fragmenten vom hinterlegten λAPCP168i4-Klon subkloniert und für die Insertion in pSC11- oder pUV1-Vaccinia-Virus-Expressionsvektoren vorbereitet. Kurz zusammengefasst, ein etwa 1,06 Kilobasen (kb) umfassendes EcoRI-Fragment, das die Aminosäurereste 655-751 des in 1 dargestellten Proteins überspannt, wurde in EcoRI-verdautes Plasmid pGEM-3R (erhältlich von der Fa. Promega Biotec) kloniert, um einen Zwischenvektor mit der Bezeichnung p4BI zu erzeugen. Anschließend wurde p4BI mit HindIII verdaut, um die 3'-nicht kodierende Sequenz der β-Amyloid-verwandten Sequenz zu entfernen. Der erhaltene Vektor p4BWRI wurde mit EcoRI verdaut und mit alkalischer Phosphatase aus Kälberdarm behandelt, bevor die Ligation mit dem 2088 bp-EcoRI-Fragment, das von λAPCPl68i4 abgeleitet ist, durchgeführt wurde, um p4T4B zu bilden. Dieses Plasmid wurde mit SmaI und XmnI verdaut, um ein 2678 bp-Fragment zu erzeugen, das die vollständige Protein-Kodierungssequenz gemäß der Darstellung in 1 überspannt.
  • Das durch dieses SmaI-XmnI-Fragment kodierte Gen wurde in einen der beiden bekannten Vaccinia-Virus-Vektoren pSC11 und pUV1 inseriert, um anschließend eine Expression des β-Amyloid-Vorläuferproteins in CV-1-Affennierenzellen unter Verwendung eines eukaryontischen vorübergehenden Expressionssystems gemäß den Angaben von M. A. Cochran et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Bd. 82 (1985), S. 19-23, durchzuführen. Üblicherweise werden diese Vektoren für die in vivo-Erzeugung von Proteinen und Antikörpern in Tieren verwendet, nachdem ihre Sequenzen in das Vaccinia-Virus-Genom inseriert worden sind.
  • Gleichermaßen lassen sich Säugetiervektoren für die Expression des β-Amyloid-Kernproteins oder der β-Amyloid-Vorläuferproteine, die hier beschrieben sind, verwenden. Ein geeigneter Säugetiervektor unter Verwendung von humanem β-Actin als Promotor ist in 10 dargestellt. Die Einzelheiten bezüglich einer Beschreibung des in 10 dargestellten Vektors sind nachstehend angegeben:
  • Bei den Basenpaaren 1-4300 handelt es sich um das 4,3 kb-EcoRI-AluI-Fragment aus dem humanen β-Actin-Gen-Isolationsprodukt p14Tβ-17 (Leavitt et al., Mol. Cell. Biol., Bd. 4 (1984), S. 1961-1969).
  • Bezüglich der Sequenzierungsdetails des Promotors wird auf Ng et al., Mol. Cell. Biol., Bd. 5 (1985), S. 2720-2732, verwiesen. Das Capsid, die 5'-untranslatierte Region und die IVS 1-Positionen sind angegeben. Ein ATG-Codon ist weder in der 5'UT- noch in der Polylinkerregion von der 3'-Spleißstelle bis zur BamHI-Stelle vorhanden.
  • Die Basenpaare 4300-4320 sind teilweise vom pSP64-Polylinker abgeleitet (Melton et al., Nucl. Acids Res., Bd. 12 (1984), S. 7035-7056).
  • Die Basenpaare 4320-6600 sind von pcDVl (Okavama & Berg, Mol. Cell. Biol., Bd. 3 (1983), S. 280-289) abgeleitet und enthalten das pBR322-AmpR-Gen und die bakterielle Ursprungsstelle plus das SV40-Spätregion-Polyadenylierungssignal.
  • Bei den Basenpaaren 6600-10000 handelt es sich um das PvuII-EcoRI-Fragment von pSV2-neo (Southern & Berg, J. Mol. App. Genet., Bd. 1 (1982), S. 327-341) mit einem Gehalt an dem bakteriellen neo-Gen, das mit SV40-ori und dem frühen Promotor verknüpft ist. Die Transkriptionsrichtung ist angegeben. Der Vektor kann für eine wirkungsvolle Proteinexpression in CHO-Zellen verwendet werden.
  • Ein Beispiel für einen weiteren potentiell wertvollen Vektor ist das Plasmid phGH-SV (10) (ein in EP-A-217 822 (Veröffentlichungstag 15. April 1987; auf diese Druckschrift wird durch Verweis Bezug genommen) beschriebenes Plasmid). Es enthält ein pUC8-Plasmidgerüst, den hMT-IIa-Genpromotor und regulatorische Elemente, SV-40-DNA-Promotor- und -Enhancerelemente und die kodierenden Bereiche des hGH-Gens und 3'-regulatorische Sequenzen. Dieses Plasmid kann mit BamHI und SmaI verdaut und mit BamHI-Linkern behandelt werden, um die für das humane Wachstumshormon-Protein kodierende Sequenz zu deletieren, wobei die 3'-nicht-kodierenden Sequenzen und regulatorische Elemente, die an das Plasmidgerüst gebunden sind, verbleiben. Dieses DNA-Stück mit etwa 5100 Basenpaaren wird einer Gelreinigung und Verknüpfung mit BamHI-Linkern unterzogen.
  • Ein Verdau mit BamHI, eine erneute Reinigung des DNA-Fragments und eine anschließende Ligation führen zu einem Plasmid mit der Bezeichnung pMTSV40-polyA-Bam, das die strukturellen und regulatorischen Elemente mit einem Säugetierzellen-Expressionsvektor enthält. Nach BamHI-Verdau von pMTSV40-polyA-BamHI und Reparatur in Gegenwart von DNA-Polymerase I und sämtlichen vier dNTPs steht dieser Vektor für die Insertion des ⁓2678 bp-SmaI-XmnI-Restriktionsfragments des Plasmids p4T4B zur Verfügung. Der Vektor kann sodann für eine wirkungsvolle Proteinexpression in CHO-Zellen verwendet werden.
  • 5.5. Promotor/A4-Sequenz-Fusionskonstrukte
  • Acht verschiedene Fusionskonstrukte wurden durch Fusionierung von einem von zwei verschiedenen Promotoren mit verschiedenen DNA-Sequenzen, die für β-Amyloid-Vorläuferproteine kodieren, hergestellt. Bei den verwendeten Promotorsequenzen handelte es sich um Mäuse-Metallothionein-I (MT) und neuralspezifische Ratten-Enolase (NSE). Diese Promotoren oder andere dem Fachmann bekannte Promotoren können mit verschiedenen A4-Sequenzen des vorstehend beschriebenen Typs verknüpft werden.
  • Ohne Festlegung auf eine spezielle Theorie bezüglich der Pathologie der Alzheimer-Krankheit wird angenommen, dass das Verhältnis der Menge von A751 zur Menge von A659-Vorläufern, die im Nervensystem einzigartig sind, in einem Ungleichgewichtszustand sein kann, was zur Entstehung der Alzheimer-Pathologie führt. Dieses Ungleichgewicht (aufgrund einer Über- oder Unterexpression von einem Vorläufer) könnte einen Zustand schaffen, dass Amyloid im Übermaß gebildet wird und die Plaques entstehen. Auf der Grundlage dieser Theorie wurden Konstrukte konstruiert, um entweder den A751- oder den A695 β-Amyloid-Proteinvorläufer zu exprimieren.
  • Alternativ kann die Alzheimer-Pathologie aufgrund eines unangemessenen und unvollständigen Katabolismus des Carboxyschwanzes des β-Amyloid-Vorläuferproteins (A99-Sequenzen) entstehen, das freigesetzt wird, wenn A695 und A751 zu löslichen extrazellulären Proteinen prozessiert werden (vergl. A. Weidemann et al., Cell, Bd. 57 (1989), S. 115-126). Auf der Grundlage dieser Theorie wurden Konstrukte konstruiert, um den Carboxyschwanz (A99) oder das β-Amyloid-Kernprotein (A42) zu exprimieren. Sämtliche Konstrukte wurden so konstruiert, dass eine Expression des Konstrukts entweder spezifisch für neurale Gewebe (NSE) ermöglicht wurde oder allgegenwärtig in sämtlichen Gewebetypen exprimiert wurde (MT-Promotoren).
  • Die nachstehenden Fusionskonstrukte stellen Beispiele für Konstrukte dar:
    Figure 00200001
  • Wie vorstehend ausgeführt, sind in den 4 bis 7 und 10 die für die Herstellung der verschiedenen Fusionskonstrukte herangezogenen Klonierungsstrategien angegeben. Es ist darauf hinzuweisen, dass β-Actin-A42- und β-Actin-A99-Plasmide als Quelle für die A42- bzw. A99-Sequenzen für die Konstruktionen dienten. Eine vollständige Kodierungstreue wurde in den A42- und A99-Konstrukten aufrechterhalten. Jedem Konstrukt ging lediglich ein Methionin-Initiationscodon voraus.
  • Die β-Actin-A751- und β-Actin-A695-Vektoren wurden zur Herstellung der übrigen NSE-Promotorkonstrukte verwendet. Sämtliche Plasmidkonstruktionen wurden durch Restriktionskartierungsanalyse bestätigt. Sämtliche Konstrukte wurden definitiv durch DNA-Sequenzanalyse der Klonierungsverbindungen bestätigt.
  • Der für die Fusionskonstrukte verwendete MT-I-Promotor wurde unter Verwendung von synthetischen Oligonucleotiden abgeleitet. Der MT-I-Promotor wurde von L. W. Swanson et al., Novel Developmental Specificity in the Nervous Systems of Transgenic Animals Expressing Growth Hormone Fusion Genes, Nature, Bd. 317 (1985), S. 363-366, sequenziert und ausführlich beschrieben (auf diese Literaturstelle wird zur Beschreibung des MT-I-Promotors Bezug genommen). Die MT-I-Promotorregion umfasst 373 Basenpaare und kann durch Synthese und Ligation von DNA-Oligomeren konstruiert werden.
  • Es werden 5 Paare von Oligomeren mit einer Länge von 70 bis 80 Nucleotiden verwendet. Das erhaltene Fragment mit 373 Basenpaaren kann kloniert und sequenziert werden. Der MT-I-Promotor kann ferner durch selektive Amplifikation dieser Region des Mäusegenoms unter Anwendung der Polymerase-Kettenreaktion (PCR) isoliert werden. Das amplifizierte Fragment kann kloniert und durch DNA-Sequenzanalyse charakterisiert werden.
  • Der MT-I-Promotor wurde sequenziert und ausführlich beschrieben von L. W. Swanson, Novel Developmental Specifity in the Nervous System of Transgenic Animals Expressing Growth Hormone Fusion Genes, Nature Bd. 317 (1985), S. 363-366 (auf diese Literaturstelle wird bezüglich der Beschreibung des MT-I-Prommotors durch Verweis Bezug genommen).
  • Zwei verschiedene Wege können ferner zur Isolierung des neuronalspezifischen Ratten-Enolase-Promotors (NSE) herangezogen werden. Die Nucleotidsequenz der Promotorregion wurde veröffentlicht. Demzufolge ist es möglich, synthetische Oligonucleotide zur Verwendung bei der PCR und für das Screening von Genombibliotheken zu konstruieren.
  • Oligonucleotid-Primer wurden zur selektiven Amplifikation der in Frage stehenden Region unter Verwendung von PCR und Ratten-Genom-DNA verwendet. Ein Fragment mit 1,15 Kilobasenpaaren wurde isoliert und kloniert. Das gleiche Oligonucleotid wurde als Sonde zum Screening von Ratten-Genombibliotheken verwendet.
  • Es hat sich herausgestellt, dass der MT-I-Promotor funktionell ist für die Bestimmung der vorübergehenden Expression eines Konstrukts, das das CAT-Reportergen (d. h. das Reportergen Chloramphenicolacetyltransferase) trägt, und zwar nach Transfektion der DNA in CHO-Zellen.
  • Der NSE-Promotor kann ferner aus einem genomischen Klon isoliert werden, der aus einer Büffelratten-DNA-Bibliothek unter Verwendung von Oligonucleotidsonden gereinigt worden ist, die aus der veröffentlichten Sequenz des Promotors (Sakimura et al., Gene, Bd. 60 (1987), S. 103-113; auf diese Literaturstelle wird zur Beschreibung eines derartigen Promotors durch Verweis Bezug genommen) konstruiert worden ist.
  • Ein Promotorregionfragment mit 2,3 Kilobasen, einschließlich eines 1,2 Kilobasen-Introns in der 5'-untranslatierten Region wurde aus einem 11 kb-Klon unter Anwendung der Polymerase-Kettenreaktionsamplifikation hergestellt. Die PCR-Strategie und die verwendeten Oligonucleotid-Primer sind in 9 beschrieben. Der 3'-terminale Primer für das NSE-Promotorfragment plus Intron enthielt 2 Nucleotidsubstitutionen zur Schaffung einer NcoI-Stelle für Klonierungszwecke sowie zur Einführung des Initiator-Methionin-Codons für die A4-Sequenzen. Es ist darauf hinzuweisen, dass für die Amplifikation durch die Polymerase-Kettenreaktion eine niedrige Fehlerrate angegeben wird.
  • 5.6. Transgene Organismen
  • Die erfindungsgemäßen transgenen Organismen enthalten innerhalb einer Vielzahl ihrer Zellen eine klonierte, rekombinante oder synthetische DNA-Sequenz, von der angenommen wird, dass sie mit der Pathogenese der Alzheimer-Krankheit in Zusammenhang steht. Speziell enthalten die transgenen Organismen spezifische Sequenzen von exogenem genetischen Material, z. B. die vorstehend ausführlich beschriebenen Sequenzen, die aus einer gewebespezifischen Promotorsequenz und einer Sequenz, die für die Bildung eines β-Amyloid-Vorläuferproteins kodiert, bestehen. Da es möglich ist, erfindungsgemäße transgene Organismen unter Verwendung von einer oder mehreren der vorstehend beschriebenen Sequenzen zu erzeugen, wird eine allgemeine Beschreibung für die Herstellung von transgenen Organismen unter allgemeiner Bezugnahme auf exogenes genetisches Material gegeben. Diese allgemeine Beschreibung kann vom Fachmann so angepasst werden, um die vorstehend beschriebenen spezifischen DNA-Sequenzen in Organismen einzubauen und eine Expression von diesen Sequenzen unter Verwendung der nachstehend beschriebenen Verfahren und Materialien zu erzielen. Bezüglich weiterer Einzelheiten über die Erzeugung von transgenen Organismen und insbesondere von transgenen Mäusen wird auf das US-Patent 4 873 191 (Ausgabetag 10. Oktober 1989 Bezug genommen) (diese Druckschrift wird bezüglich der Beschreibung von Verfahren zur Erzeugung von transgenen Mäusen durch Verweis zum Gegenstand der Beschreibung gemacht). Ferner wird auf zahlreiche wissenschaftliche Veröffentlichungen, die darin erwähnt und zitiert sind, verwiesen.
  • Das exogene genetische Material kann in den männlichen oder weiblichen Pronucleus der Zygote platziert werden. Vorzugsweise wird er in den männlichen Pronucleus möglichst bald nach dem Eindringen des Spermas in das Ei platziert, mit anderen Worten, unmittelbar nach der Bildung des männlichen Pronucleus, wenn die Pronuclei klar definiert und gut getrennt sind und sich jeweils nahe der Zygotenmembran befinden. Der männliche Pronucleus eines befruchteten Mäuseeis stellt den bevorzugten Ort für die Addition des erfindungsgemäßen exogenen genetischen Materials dar.
  • Es ist besonders bevorzugt, dass das exogene genetische Material dem männlichen DNA-Komplement der Zygote vor der Prozessierung durch den Ovum-Nucleus oder durch den weiblichen Zygoten-Pronucleus zugesetzt wird. Es wird angenommen, dass der Ovum-Nucleus oder weibliche Pronucleus Moleküle freisetzt, die das männliche DNA-Komplement beeinflussen, vermutlich aufgrund eines Ersatzes der Protamine der männlichen DNA durch Histone, wodurch die Kombination von weiblichen und männlichen DNA-Komplementen unter Bildung einer diploiden Zygote erleichtert wird.
  • Somit ist es bevorzugt, dass das exogene genetische Material dem männlichen DNA-Komplement oder einem beliebigen anderen DNA-Komplement vor der Beeinflussung durch den weiblichen Pronucleus zugesetzt wird. Beispielsweise wird das exogene genetische Material dem frühen männlichen Pronucleus möglichst bald nach der Bildung des männlichen Pronucleus zugesetzt, wobei dieser Zeitpunkt dann gegeben ist, wenn die männlichen und weiblichen Pronuclei gut getrennt sind und sich beide nahe an der Zellmembran befinden. Alternativ kann das exogene genetische Material dem Nucleus des Spermas nach dessen Induktion zur Einleitung einer Dekondensation zugesetzt werden. Sperma, das das exogene genetische Material enthält, kann sodann zum Ovum gegeben werden oder das dekondensierte Sperma kann zum Ovum gegeben werden, wobei das exogene genetische Material möglichst bald danach zugesetzt wird.
  • Für die Zwecke der Erfindung handelt es sich bei einer Zygote im wesentlichen um die Bildung einer diploiden Zelle, die zur Entwicklung zu einem vollständigen Organismus befähigt ist. Im allgemeinen besteht die Zygote aus einem Ei, das einen Nucleus enthält, der auf natürlichem oder künstlichem Wege durch die Fusion von zwei haploiden Nuclei von einem oder mehreren Gameten gebildet worden ist. Somit müssen die Gameten-Nuclei so beschaffen sein, dass sie von Natur aus verträglich sind, d. h. dass sie zu einer lebensfähigen Zygote führen, die zu einer Differenzierung und zur Entwicklung zu einem funktionsfähigen Organismus befähigt ist. Im allgemeinen wird eine euploide Zygote bevorzugt. Wenn eine aneuploide Zygote erhalten wird, sollte die Anzahl von Chromosomen im Bezug zur euploiden Anzahl des Organismus, aus dem der Gamete stammt, um nicht mehr als 1 abweichen.
  • Zusätzlich zu ähnlichen biologischen Erwägungen bestimmen ferner physikalische Gesichtspunkte die Menge des exogenen genetischen Materials, die dem Nucleus der Zygote oder dem genetischen Material, das Bestandteil des Zygoten-Nucleus ist, zugesetzt werden kann. Wenn kein genetisches Material entfernt wird, so ist die Menge des exogenen genetischen Materials, die zugesetzt werden kann, durch die Menge begrenzt, die absorbiert werden kann, ohne dass eine physikalische Zerstörung auftritt. Im allgemeinen übersteigt das Volumen des inserierten exogenen genetischen Materials die Menge von etwa 10 Pikoliter nicht. Die physikalischen Wirkungen der Zugabe dürfen nicht so groß sein, dass sie die Lebensfähigkeit der Zygote physikalisch zerstören. Die biologische Grenze für die Anzahl und die Verschiedenartigkeit der DNA-Sequenzen variiert je nach der speziellen Zygote und den Funktionen des exogenen genetischen Materials und kann vom Fachmann festgestellt werden, da das genetische Material, einschließlich des exogenen genetischen Materials, der erhaltenen Zygote biologisch zur Einleitung und Aufrechterhaltung der Differenzierung und zur Entwicklung der Zygote zu einem funktionellen Organismus befähigt sein muss.
  • Die Anzahl von Kopien der DNA-Sequenzen, die der Zygote zugesetzt werden, hängt von der Gesamtmenge des zugesetzten exogenen genetischen Materials ab und bildet die Menge, die das Auftreten der genetischen Transformation ermöglicht. Theoretisch ist nur eine einzige Kopie erforderlich. Jedoch werden im allgemeinen zahlreiche Kopien verwendet, z. B. 1 000-20 000 Kopien eines Gens, um zu gewährleisten, dass eine Kopie funktionsfähig ist. Erfindungsgemäß besteht im allgemeinen ein Vorteil darin, dass mehr als eine funktionsfähige Kopie der einzelnen inserierten exogenen DNA-Sequenzen vorliegt, um die phänotypische Expression der exogenen DNA-Sequenzen zu verstärken (d. h. um eine allgegenwärtige Expression der β-Amyloid-verwandten Vorläuferproteine und Protease-Inhibitor-Proteine zu erhalten).
  • Beliebige Techniken, die die Addition des exogenen genetischen Materials in das genetische Nucleusmaterial ermöglichen, können herangezogen werden, sofern sie nicht zu einer Zerstörung der Zelle, der Kernmembran oder von anderen vorhandenen zellulären oder genetischen Strukturen führen. Das exogene genetische Material wird vorzugsweise durch Mikroinjektion in das genetische Nucleusmaterial inseriert. Eine Mikroinjektion von Zellen und Zellstrukturen ist bekannt und wird gemäß dem Stand der Technik angewandt.
  • Die erfindungsgemäß erzeugten transgenen Säugetiere enthalten exogenes genetisches Material. Beim exogenen genetischen Material handelt es sich um eine DNA-Sequenz, die zur Bildung eines A751-β-Amyloid-Vorläuferproteins führt. Ferner ist die Sequenz mit einer neuronalspezifischen Enolase verbunden, die die Expression des β-Amyloid-verwandten Proteins spezifisch in Nervengewebe ermöglicht.
  • 5.7. Methoden und Materialien
  • Die meisten Techniken, die zur Transformation von Zellen, Konstruktion von Vektoren, Extraktion von Messenger-RNA, Herstellung von cDNA und dergl. verwendet werden, werden in breitem Umfang auf dem einschlägigen Gebiet ausgeführt. Die meisten Bearbeiter sind mit den üblichen Ressourcenmaterialien sowie mit den speziellen Bedingungen und Vorgehensweisen vertraut. Jedoch können zur Erleichterung die nachstehenden Abschnitte als Richtlinien dienen.
  • 5.7.a. Wirte und Steuersequenzen
  • Sowohl prokaryontische als auch eukaryontische Systeme können zur Expression des β-Amyloid-Kerns und der β-Amyloid-verwandten Sequenzen verwendet werden. Prokaryontische Wirte sind selbstverständlich für die Klonierungsverfahren besonders zweckmäßig. Prokaryonten werden besonders häufig durch verschiedene Stämme von E. coli repräsentiert. Jedoch können auch andere mikrobielle Stämme herangezogen werden. E. coli-Stämme können den β-Amyloid-Kern und die β-Amyloid-Vorläuferproteine in das Periplasma sezernieren, wenn die für diese Proteine kodierenden Gene mit entsprechenden Signalpeptiden fusioniert werden. Bestimmte E. coli-Stämme, z. B. ein Lipoprotein-Mutantenstamm, wie JE5505 (T. Kanamari, Gene, Bd. 66 (1988), S. 295-300) scheidet die chimären Proteine direkt in das Kulturmedium aus.
  • Plasmidvektoren, die Replikationsstellen, selektierbare Marker und Steuersequenzen, die von einer mit dem Wirt verträglichen Spezies abgeleitet sind, enthalten, werden verwendet. Beispielsweise wird E. coli typischerweise unter Verwendung von Derivaten von pBR322, einem von einer E. coli-Spezies von Bolivar et al., Gene, Bd. 2 (1977), S. 95, abgeleiteten Plasmid, transformiert. pBR322 enthält Gene für Ampicillin und Tetracyclin-Resistenz und liefert somit mehrfache selektierbare Marker, die bei der Konstruktion des angestrebten Vektors entweder aufrechterhalten oder zerstört werden können. Üblicherweise verwendete prokaryontische Steuersequenzen, umfassen gemäß der hier gegebenen Definition Promotoren für die Transkriptionsinitiation, gegebenenfalls mit einem Operator, zusammen mit Sequenzen einer Ribosomenbindungsstelle, einschließlich üblicherweise verwendete Promotoren, wie β-Lactamase-(Penicillinase)- und Lactose-(lac)-Promotorsysteme (Chang et al., Nature, Bd. 198 (1977), S. 1056) und das Tryptophan-(trp)-Promotorsystem (Goeddel et al., Nucleic Acids Res., Bd. 8 (1980), S. 4057) sowie den lambdaabgeleiteten PL-Promotor und die N-Gen-Ribosomenbindungsstelle (Shimatake et al., Nature, Bd. 292 (1981), S. 128).
  • Weitere prokaryontische Steuersequenzen umfassen Signalsequenzen, die die Sekretion eines Proteins in das Periplasma dirigieren. Üblicherweise verwendete bakterielle Signalpeptide umfassen das ompA-(Kikuchi et al., Nucleic Acids Res., Bd. 9 (1981), S. 5671-5678) und das phoA-Signalpeptid (Beck und Bremer, Nucleic Acids Res., Bd. 8 (1980), S. 3011-3024), die mit der erfindungsgemäßen Protease-Inhibitor-Sequenz fusioniert werden können.
  • Neben Bakterien können auch eukaryontische Mikroorganismen, wie Hefe, als Wirte verwendet werden. Laboratoriumsstämme von Saccharomyces cerevisiae, Bäckerhefe, werden großenteils verwendet, obgleich auch eine Anzahl von anderen Stämmen oder Spezies allgemein verfügbar sind. Vektoren, die sich beispielsweise der 2 m-Replikationsursprungsstelle (J. R. Broach, Meth. Enz., Bd. 101 (1983), S. 307, oder anderer mit Hefe verträglichen Replikationsursprungsstellen (vergl. beispielsweise Stinchcomb et al., Nature, Bd. 282 (1979), S. 39, G. Tschumper et al., Gene, Bd. 10 (1980), S. 157, und L. Clarke et al., Meth. Enz., Bd. 101 (1983), S. 300) bedienen, können ebenfalls verwendet werden. Zu Steuersequenzen für Hefevektoren gehören Promotoren für die Synthese von glykolytischen Enzymen (Ness et al., J. Adv. Enzyme Reg., Bd. 7 (1968), S. 149; Holland et al., Biochemistry, Bd. 17 (1978), S. 4900). Zu weiteren, aus dem Stand der Technik bekannten Promotoren gehören der Promotor für 3-Phosphoglycerat-kinase (Hitzeman et al., J. Biol. Chem., Bd. 255 (1980), S. 2073). Weitere Promotoren, die den zusätzlichen Vorteil einer durch die Wachstumsbedingungen und/oder den genetischen Hintergrund gesteuerten Transkription aufweisen, sind die Promotorregionen für Alkohol-dehydrogenase 2, Isocytochrom C, saure Phosphatase, abbauende Enzyme in Verbindung mit dem Stickstoff-Stoffwechsel, das β-Faktor-System und Enzyme, die für die Verwertung von Maltose und Galactose verantwortlich sind. Ferner wird angenommen, dass am 3'-Ende der Kodierungssequenzen Terminatorsequenzen erwünscht sind. Derartige Terminatoren finden sich in der 3'-untranslatierten Region im Anschluss an die Kodierungssequenzen in von Hefe abgeleiteten Genen.
  • Ferner ist es selbstverständlich möglich, Gene, die für Polypeptide kodieren, in eukaryontischen Wirtszellkulturen, die sich von multizellulären Organismen ableiten, zu exprimieren; vergl. beispielsweise Axel et al., US-Patent 4 399 216. Diese Systeme haben den zusätzlichen Vorteil, dass es möglich ist, Introns auszuspleißen, so dass sie direkt zur Expression von genomischen Fragmenten herangezogen werden können. Zu geeigneten Wirtszelllinien gehören VERO- und HeLa-Zellen und Ovarialzellen des chinesischen Hamsters (CHO). Expressionsvektoren für derartige Zellen umfassen üblicherweise Promotoren und Steuersequenzen, die mit Säugetierzellen verträglich sind, z. B. die üblicherweise eingesetzten frühen und späten Promotoren aus Simian Virus 40 (SV 40) (Fiers et al., Nature, Bd. 273 (1978), S. 113) oder andere virale Promotoren, z. B. die von Polyoma, Adenovirus 2, Rinder-Papillomavirus oder Vögel-Sarcomaviren abgeleiteten Promotoren. Der steuerbare Promotor hMTII (M. Karin et al., Nature, Bd. 299 (1982), S. 797-802) kann ebenfalls verwendet werden. Allgemeine Aspekte von Säugetierzellen-Wirtssystemtransformationen wurden von Axel (a.a.O.) beschrieben. Es hat nunmehr den Anschein, dass auch "Enhancer"-Regionen für die Optimierung der Expression wichtig sind. Es handelt sich dabei im allgemeinen um Sequenzen, die stromaufwärts oder stromabwärts von der Promotorregion in nicht-kodierenden DNA-Regionen auftreten. Replikationsursprungsstellen lassen sich gegebenenfalls aus viralen Quellen erhalten. Jedoch stellt die Integration in das Chromosom einen üblichen Mechanismus für die DNA-Replikation in Eukaryonten dar.
  • 5.7.b. Transformationen
  • Je nach der verwendeten Wirtszelle wird die Transformation unter Anwendung standardmäßiger Techniken, die für derartige Zellen geeignet sind, durchgeführt. Die Behandlung mit Calcium unter Verwendung von Calciumchlorid gemäß S. N. Cohen, Proc. Natl. Acad. Sci. (USA), Bd. 69 (1972), S. 2110, oder das RbCl2-Verfahren gemäß Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press (1982), S. 254, und D. Hanahan, J. Mol. Biol., Bd. 166 (1983), S. 557-580, können für Prokaryonten oder andere Zellen, die erhebliche Zellwandbarrieren enthalten, eingesetzt werden. Für Säugetierzellen ohne derartige Zellwände kann das Calciumphosphat-Fällungsverfahren gemäß Graham und van der Eb, Virology, Bd. 52 (1978), S. 546, gegebenenfalls unter Modifikation gemäß M. Wigler et al., Cell, Bd. 16 (1979), S. 777-785, eingesetzt werden.
  • Transformationen in Hefe können gemäß den Verfahren von J. D. Beggs, Nature, Bd. 275 (1978), S. 104-109, oder A. Hinnen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA), Bd. 75 (1978), S. 1929, durchgeführt werden.
  • 5.7.c. Vektorkonstruktion
  • Bei der Konstruktion von geeigneten Vektoren, die die gewünschten Kodierungs- und Steuersequenzen enthalten, bedient man sich standardmäßiger Ligations- und Restriktionstechniken, die aus dem Stand der Technik bekannt sind. Isolierte Plasmide, DNA-Sequenzen oder synthetisierte Oligonucleotide werden gespalten, zugeschnitten und in der gewünschten Form religiert.
  • Die DNA-Sequenzen, die die Vektoren bilden, sind aus einer Anzahl von Quellen erhältlich. Gerüstvektoren und Steuersysteme finden sich im allgemeinen an verfügbaren "Wirts"-Vektoren, die für den Großteil der zu konstruierenden Sequenzen verwendet werden. Für die einschlägige Kodierungssequenz kann die anfängliche Konstruktion darin bestehen (und üblicherweise ist dies auch der Fall), die geeigneten Sequenzen aus cDNA- oder genomischen DNA-Bibliotheken aufzufinden. Wenn jedoch die Sequenz beschrieben ist, ist es möglich, die gesamte Gensequenz in vitro zu synthetisieren, wobei man von den einzelnen Nucleotid-Derivaten ausgeht. Die vollständige Gensequenz für Gene von ansehnlicher Länge, z. B. 500-1000 bp, kann durch Synthese von einzelnen, überlappenden, komplementären Oligonucleotiden und Auffüllen in einzelsträngigen, nicht überlappenden Bereichen unter Verwendung von DNA-Polymerase in Gegenwart von Desoxyribonucleotid-triphosphaten durchgeführt werden. Dieser Weg wurde in erfolgreicher Weise bei der Konstruktion mehrerer Gene von bekannter Sequenz eingeschlagen; vergl. beispielsweise M. D. Edge, Nature, Bd. 292 (1981), S. 756; K. P. Nambair et al., Science, Bd. 223 (1984), S. 1299; Ernest Jay, J. Biol. Chem., Bd. 259 (1984), S. 6311.
  • Synthetische Oligonucleotide werden entweder nach dem Phosphotriester-Verfahren gemäß Edge et al., Nature (a.a.O.), und Duckworth et al., Nucleic Acids Res., Bd. 9 (1981), S. 1691, oder nach dem Phosphoramidit-Verfahren gemäß S. L. Beaucage und M. H. Caruthers, Tet. Lett., Bd. 22 (1981), S. 1859, und M. D. Matteucci und M. H. Caruthers, J. Am. Chem. Soc., Bd. 103 (1981), S. 3185, hergestellt. Sie lassen sich unter Verwendung handelsüblicher automatisierter Oligonucleotid-Synthesegeräte herstellen. Eine Kinasebehandlung einzelner Stränge vor dem Annealing oder für eine Markierung wird unter Verwendung eines Kinase-Überschusses erreicht, z. B. etwa 10 Einheiten Polynucleotid-kinase auf 1 nmol Substrat in Gegenwart von 50 mM Tris, pH-Wert 7,6, 10 mM MgCl2, 5 mM Dithiothreit, 1-2 mM ATP, 1,7 pmol γ32P-ATP (2,9 mCi/mmol), 0,1 mM Spermidin und 0,1 mM EDTA.
  • Nachdem die Komponenten der angestrebten Vektoren auf diese Weise erhältlich sind, können sie unter Anwendung standardmäßiger Restriktions- und Ligationsverfahren ausgeschnitten und verknüpft werden.
  • Eine ortsspezifische DNA-Spaltung wird durch Behandlung mit dem geeigneten Restriktionsenzym (oder Enzymen) unter Bedingungen, die aus dem Stand der Technik geläufig sind, durchgeführt. Die Einzelheiten hierfür ergeben sich aus den Spezifikationen der Hersteller dieser handelsüblichen Restriktionsenzyme; vergl. beispielsweise den Produktkatalog von New England Biolabs. Im allgemeinen wird etwa 1 mg Plasmid oder DNA-Sequenz durch 1 Einheit Enzym in etwa 20 ml Pufferlösung gespalten. In den hier aufgeführten Beispielen wird typischerweise ein Überschuss an Restriktionsenzym verwendet, um einen vollständigen Verdau des DNA-Substrats zu gewährleisten. Inkubationszeiten von etwa 1 Stunde bis 2 Stunden bei etwa 37 °C sind geeignet, obgleich Abänderungen möglich sind. Nach jeder Inkubation wird das Protein durch Extraktion mit Phenol/Chloroform entfernt, wonach sich eine Etherextraktion anschließen kann. Die Nucleinsäure wird aus wässrigen Fraktionen durch Fällung mit Ethanol gewonnen. Gegebenenfalls kann eine Größenauftrennung der gespaltenen Fragmente durch Polyacrylamid-Gelelektrophorese oder Agarose-Gelelektrophorese gemäß üblichen Techniken durchgeführt werden. Eine allgemeine Beschreibung von Größentrennungen findet sich in Methods in Enzymology, Bd. 65 (1980), S. 499-560.
  • Durch Restriktion gespaltene Fragmente können stumpfendig gemacht werden, indem man sie mit dem großen Fragment von E. coli-DNA-Polymerase I (Klenow) in Gegenwart der vier Desoxynucleotid-triphosphate (dNTPS) unter Einhaltung von Inkubationszeiten von etwa 15 bis 25 Minuten bei 20 bis 25 °C in 50 mM Tris, pH-Wert 7,6, 50 mM NaCl, 6 mM MgCl2, 6 mM DTT und 0,1-1,0 mM dNTPs behandelt. Das Klenow-Fragment füllt am 5'-Ende einzelsträngige Überhänge auf, stutzt aber vorstehende 3'-Einzelstränge zurück, selbst wenn die vier dNTPs vorhanden sind. Gegebenenfalls kann eine selektive Reparatur durchgeführt werden, indem man nur eines der dNTPs oder ausgewählte dNTPS innerhalb der Einschränkungen, die von der Beschaffenheit des Überhangs diktiert werden, zuführt. Nach Behandlung mit Klenow wird das Gemisch mit Phenol/Chloroform extrahiert und einer Ethanolfällung unterzogen. Eine Behandlung unter geeigneten Bedingungen mit S1-Nuclease oder BAL-31 führt zur Hydrolyse von etwaigen einzelsträngigen Abschnitten.
  • Ligationen werden in 15-50 ml-Volumina unter den folgenden standardmäßigen Bedingungen und Temperaturen durchgeführt: beispielsweise 20 mM Tris-HCl, pH-Wert 7,5, 10 mM MgCl2, 10 mM DTT, 33 μg/ml BSA, 10 mM 50 mM NaCl und entweder 40 μM ATP, 0,01-0,02 (Weiss) Einheiten T4-DNA-Ligase bei 0 °C (für eine Ligation von "klebrigen Enden") oder 1 mM ATP, 0,3-0,6 (Weiss) Einheiten T4-DNA-Lipase bei 14 °C (für eine Ligation von "stumpfen Enden"). Intermolekulare Ligationen von "klebrigen Enden" werden im allgemeinen bei DNA-Gesamtkonzentrationen von 33-100 μg/ml (5-100 mM gesamte Endkonzentration) durchgeführt. Intermolekulare stumpfendige Ligationen werden bei einer Gesamtendkonzentration von 1 mM vorgenommen.
  • Bei der Vektorkonstruktion unter Verwendung von "Vektorfragmenten" wird das Vektorfragment üblicherweise mit bakterieller alkalischer Phosphatase (BAP) oder alkalischer Phosphatase aus Kälberdarm (CIP) behandelt, um das 5'-Phosphat zu entfernen und eine Selbstligation des Vektors zu verhindern. Verdauungen werden beim pH-Wert 8 in etwa 10 mM Tris-HCl und 1 mM EDTA unter Verwendung von etwa 1 Einheit BAP oder CIP pro 1 mg Vektor etwa 1 Stunde bei 60 °C durchgeführt. Um die Nucleinsäurefragmente zu gewinnen, wird das Präparat mit Phenol/Chloroform extrahiert und mit Ethanol gefällt. Alternativ kann eine Religation in Vektoren verhindert werden, die einer doppelten Verdauung durch einen zusätzlichen Restriktionsenzym-Verdau und einer Abtrennung der unerwünschten Fragmente unterzogen worden sind.
  • Für Abschnitte von Vektoren, die sich von cDNA oder genomischer DNA ableiten, die Sequenzmodifikationen erfordern, kann man sich einer ortsspezifischen, Primer-dirigierten Mutagenese bedienen (M. J. Zoller und M. Smith, Nucleic Acids Res., Bd. 10 (1982), S. 6487-6500, und J. P. Adelman et al., DNA, Bd. 2 (1983), S. 183-193). Dieser Vorgang wird unter Verwendung eines synthetischen Primer-Oligonucleotids durchgeführt, der komplementär zu einer zu mutagenisierenden, einzelsträngigen Phagen-DNA ist, mit Ausnahme von begrenzten Übereinstimmungsfehlern, die die angestrebte Mutation darstellen. Kurz zusammengefasst, es wird das synthetische Oligonucleotid als Primer zum Dirigieren der Synthese eines mit dem Phagen komplementären Stranges verwendet. Die erhaltene, partiell oder vollständig doppelsträngige DNA wird in ein phagenunterstützendes Wirtsbakterium transformiert. Kulturen der transformierten Bakterien werden in Deckagar ausgestrichen, wodurch die Plaquebildung aus einzelnen Zellen, die den Phagen beinhalten, ermöglicht wird.
  • Theoretisch enthalten 50 % der neuen Plaques den Phagen, der als einzigen Strang die mutierte Form aufweist. 50 % weisen die ursprüngliche Sequenz auf. Die erhaltenen Plaques werden nach Hybridisierung mit kinasebehandeltem, synthetischem Primer bei einer Waschtemperatur gewaschen, die eine Bindung eines genau passenden Produkts ermöglicht, bei der aber die Übereinstimmungsfehler mit dem ursprünglichen Strang zur Verhinderung einer Bindung ausreichen. Plaques, die mit der Sonde hybridisieren, werden sodann aufgenommen, gezüchtet und die DNA wird gewonnen.
  • 5.7.d. Überprüfung der Konstruktion
  • Bei den vorstehend geschilderten Konstruktionen werden korrekte Ligationen für die Plasmidkonstruktion bestätigt, indem man zunächst den von Dr. M. Casadaban (M. Casadaban et al., J. Mol. Biol., Bd. 138 (1980), S. 179-207) erhaltenen E. coli-Stamm MC1061 oder einen anderen geeigneten Wirt mit dem Ligationsgemisch transformiert. Erfolgreiche Transformanten werden durch Resistenz gegen Ampicillin, Tetracyclin oder ein anderes Antibiotikum oder unter Verwendung anderer Marker je nach der Art der Plasmidkonstruktion ausgewählt, wie es aus dem Stand der Technik bekannt ist. Plasmide aus den Transformanten werden sodann gemäß dem Verfahren von D. B. Clewell et al „ Proc. Natl. Acad. Sci. (USA), Bd. 62 (1969), S. 1159, hergestellt, wonach sich gegebenenfalls eine Chloramphenicol-Amplifikation anschließt (D. B. Clewell, J. Bacteriol., Bd. 110 (1972), S. 667). Üblicherweise werden mehrere Mini-DNA-Präparationen verwendet; vergl. beispielsweise D. S. Holmes et al., Anal. Biochem., Bd. 114 (1981), S. 193-197, und H. C. Birnboim et al., Nucleic Acids Res., Bd. 7 (1979), S. 1513-1523. Die isolierte DNA wird durch Restriktion analysiert und/oder durch das Didesoxynucleotid-Verfahren von F. Sanger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA), Bd. 74 (1977), S. 5463, gemäß den weiteren Angaben von Messing et al., Nucleic Acids Res., Bd. 9 (1981), S. 309, oder durch das Verfahren von Maxam, et al., Methods in Enzymology, Bd. 65 (1980), S. 499, sequenziert.
  • 6.0
  • Beispiele
  • Die folgenden Beispiele liefern dem Fachmann eine vollständige Offenbarung und Beschreibung bezüglich der Herstellung der DNA-Sequenzen, der Fusionskonstrukte, der Proteine und der transgenen Säugetiere gemäß der Erfindung und sollen den Schutzumfang dessen, was die Erfinder als ihre Erfindung ansehen, nicht beschränken. Dabei wird Genauigkeit bezüglich der angegebenen Zahlenwerte (z. B. Mengen, Temperatur und dergl.) angestrebt, wobei aber gewisse experimentelle Fehler und Abweichungen hinzunehmen sind. Sofern nichts anderes angegeben ist, gilt folgendes: Teilangaben beziehen sich auf das Gewicht, Temperaturangaben beziehen sich auf °C und die Drücke liegen bei oder in der Nähe von atmosphärischem Druck.
  • 6.1
  • Beispiel 1
  • Expression von β-Amyloid-verwandtem Protein (1-751) in gezüchteten Säugetierzellen
  • Zur Erleichterung der Expression des β-Amyloid-Vorläuferproteins in Säugetierzellen wird ein Plasmid so konstruiert, dass das Kodierungssegment für das Protein mit einem leistungsfähigen, regulierten Promotor, der sich vom humanen Metallothionin II (hMTII)-Gen ableitet, fusioniert. Dieses Verfahren wird in zwei Stufen durchgeführt. Zunächst wurde ein Expressionsvektor pMTSV40-polyA-Bam vom phGH-SV(10)-Vektor durch Verdau von phGH-SV(10) mit BamHI- und SmaI-Restriktionsenzymen unter anschließender Inkubation mit DNA-Polymerase I (Klenow-Fragment) zur Schaffung von stumpfendigen Molekülen abgeleitet. Die stumpfen Enden wurden anschließend mit BamHI-Linkern ligiert, mit BamHI geschnitten und zur Rezirkularisation religiert. Diese Stufe entfernt die gesamte Genomsequenz des humanen Wachstumshormons aus phGH-SV(10) mit Ausnahme des Großteils der 3'-untranslatierten Region der mRNA und der genomischen Sequenzen, die für die mutmaßlichen 3'-transkriptionalen Stopp- und Prozessierungssignale kodieren. Für das Säugetierzellen-Expressionskonstrukt wird pMTSV40-polyA-Bam mit BamHI verdaut, sodann mit sämtlichen 4 Nucleotidtriphosphaten und mit DNA-Polymerase I inkubiert, um stumpfe Enden zu schaffen. Dieses Fragment wird anschließend mit dem gereinigten 2678 bp-SmaI-XmnI-Fragment, das von p4T4B abgeleitet ist, ligiert. Die rekombinanten Moleküle werden sodann durch Transformation in MC1061 eingeführt.
  • Ovarialzellen des chinesischen Hamsters (CHO-K1-Zellen) werden in einem Medium aus einem 1:1-Gemisch aus F12-Medium und DME-Medium mit 10 % fötalem Kälberserum gezüchtet. Die kompetenten Zellen werden mit dem rekombinanten Expressionsvektor und pSV2:NEO kotransformiert (P. Southern et al., J. Mol. Appl. Genet., Bd. 1 (1982), S. 327-341). pSV2:NEO enthält ein funktionelles Gen, das Resistenz gegen das Neomycin-Analoge G418 verleiht. Bei der Transformation werden 500 ng pSV2:NEO und 5 μg des rekombinanten Vektors auf eine 60 mm-Schale mit CHO-Zellen in Form eines Calciumphosphat-DNA-Copräzipitats gemäß den Angaben von F. L. Graham und A. J. Van der Eb, Virology, Bd. 52 (1973), S. 456-467, aufgetragen. Ein Wachstum der Zellen im Antibiotikum G418 gemäß den Angaben von Southern et al. führt zu einem Pool von stabil transfizierten CHO-Zellen, die Expressionsvektor-DNA mit der Fähigkeit zur Expression von β-Amyloidverwandter mRNA und entsprechendem Protein enthalten.
  • 6.2
  • Beispiel 2
  • Expression von β-Amyloid-Vorläufer in Säugetierzellen
  • In Beispiel 1 ist die Konstruktion eines Expressionssystems für das β-Amyloid-Vorläuferprotein (1-751) unter Antrieb durch den humanen Promotor dargelegt. Ein nahezu identisches Konstrukt wurde unter Verwendung des gereinigten 2548 bp-SmaI-XmnI-Fragments hergestellt, das aus p4T4B abgleitet ist, aus dem 116 bp von der 5'-untranslatierten Region deletiert worden sind. Dieses Fragment wurde in die SalI-Stelle hinter dem humanen Promotor an einem Plasmid, das den Neomycin-Selektionsmarker für die Säugetierzellen-Expression und das Ampicillin-Resistenzgen für die Selektion von bakteriellen Transformanten enthielt, inseriert. Dieser Vektor, pHbAPr-1-neo, wurde von Gunning et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Bd. 84 (1987), S. 4831-4835) beschrieben und wurde unter Entfernung der EcoRI-Stelle aus dem Körper des ursprünglichen Vektors und unter Substitution der ursprünglichen Polylinkerregion mit einem neuen Polylinker, der eine EcoRI-Stelle zusätzlich zu den ursprünglich vorhandenen SalI-, HindIII- und BamHI-Klonierungsstellen enthielt, modifiziert. Der modifizierte Vektor wird als pAXneoR bezeichnet. Der pAXneoR-Vektor wurde mit SalI linearisiert. Die Termini wurden unter Verwendung des Klenow-Fragments von DNA-Polymerase zur Erzeugung von stumpfendigen Molekülen aufgefüllt. Das 2548 bp-SmaI-XmnI-β-Amyloid-Fragment wurde unter Verwendung von T4-Ligase stumpf in den Vektor ligiert. Die rekombinanten Moleküle wurden durch Transformation in E. coli MC1061 eingeführt und ein Klon, der die geeignete Orientierung aufwies, wurde amplifiziert. Eine ähnliche Konstruktion wurde unter Verwendung der von Kang et al. (a.a.O.) beschriebenen 695 β-Amyloid-Sequenzen durchgeführt, wobei das 695-Amyloid-Protein unter die Kontrolle des humanen Promotors gestellt wird.
  • 600 μg gesamte DNA von pAXneo/751-β-Amyloid oder pAXneo/695-β-Amyloid oder ein Gemisch beider Plasmidkonstrukte in gleicher Menge wurden durch Elektroporation (Neumann, J. Membrane Biol., Bd. 10 (1972), S. 279-290; Zimmerman, Biophys. J., Bd. 13 (1973), S. 1005-1013) unter Verwendung eines BTX Transfector 100-Geräts, steriler Bio-Rad-Einmalküvetten und eines einzeln angefertigtem Küvettenhalters in 107 CHO-Zellen eingeführt. G418-resistente Zellen, die die exogene DNA aufgenommen hatten, wurden durch übliche Verfahren (Southern, 1982, a.a.O.) unter Verwendung von 500 μg/ml G418 der Fa. Gibco ausgewählt.
  • Der Pool von positiv transfizierten Zellen, die gegenüber G418 resistent waren, von jeder der drei Transfektionen wurde bezüglich der β-Amyloid-Vorläuferprotein-Expression charakterisiert. 5 ml serumfreies Medium mit einem Gehalt an etwa 2 × 106 Zellen von jedem Pool wurden 48 Stunden bei 37 °C inkubiert. Die konditionierten Medien wurden entfernt und das Protein wurde durch Zugabe von Trichloressigsäure in einer Endkonzentration von 10 % gefällt. Die Zellen wurden durch Abschaben geerntet, in phosphatgepufferter Kochsalzlösung gewaschen und in 50 μl Puffer für eine 30-fache Konzentration resuspendiert. 25 μl der einzelnen Proben wurden auf ein 12,5%iges Polyacrylamidgel (Laemmli, Nature, Bd. 277 (1970), S. 680-685) aufgesetzt. Der β-Amyloid-Vorläufer wurde durch Western-Blot-Analyse (Towbin, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Bd. 76 (1979), S. 4350-4354) unter Verwendung von β-Amyloid-spezifischen, polyklonalen Antikörpern, die durch rekombinantes Vaccinia-Virus, das die β-Amyloid-751-cDNA enthielt, unter Anwendung üblicher Verfahren erzeugt worden waren, nachgewiesen. Typischerweise wird festgestellt, dass der Großteil des etwa 110 000 Dalton aufweisenden β-Amyloid-Vorläufers in das Kulturmedium freigesetzt wird und sehr geringe Mengen des Proteins zellassoziiert sind. Dieses Ergebnis stimmt mit der Hypothese von Allsop et al., (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Bd. 85 (1988), S. 2790-2794) überein, die angibt, dass es sich beim β-Amyloid-Protein um ein sezerniertes Prohormon handelt. Das scheinbare Molekulargewicht von 110 000 Dalton des rekombinant exprimierten β-Amyloid-Proteins ist ähnlich mit den von anderen Autoren festgestellten Werten (T. Dyrks et al., EMBO J., Bd. 7 (4) (1988), S. 949-957) unter Verwendung von in vitro-Transkriptions/Translationssystemen und unter Verwendung von Zellen in Kultur (A. Weidemann et al., Cell, Bd. 57 (1989), S. 115-126.
  • 6.3
  • Beispiel 3
  • Test zur Unterscheidung von genetischen Varianten von β-Amyloidverwandten Protein-mRNA-Spezies
  • Die Fähigkeit zur Unterscheidung zwischen genetischen Varianten von β-Amyloid-Vorläuferprotein-mRNA-Spezies unter Verwendung von Oligonucleotidsonden wird hier belegt. Dieser diagnostische Test kann zwischen zwei eng verwandten genetischen Varianten von β-Amyloid-Vorläuferproteinen oder ihren mRNAs unterscheiden und die relativen Expressionsgrade dieser Proteine oder mRNAs quantifizieren.
  • Gesamte zelluläre RNA oder zytoplasmatische RNA wurde aus humanen Zellen in Kultur oder humanem Hirngewebe (Alzheimer-Hirn oder normales Hirn) mit oder ohne Entfernung von Nuclei (zytoplasmatisch bzw. gesamt) durch das von Maniatis et al. beschriebene Guanidinthiocyanat/CsCl-Verfahren präpariert. RNA wurde durch oligo-dT-Cellulosechromatographie fraktioniert, an einem Formaldehyd-Agarose-Gel der Elektrophorese unterzogen und als Blot auf Nitrocellulose übertragen (alle Maßnahmen gemäß Maniatis et al.). Die Filter wurden einer Wärmebehandlung unterzogen und gemäß üblichen Verfahren mit den angegebenen Sonden vorhybridisiert und hybridisiert.
  • Oligonucleotidsonden wurden einer Endmarkierung mit [32P]-dCTP durch Inkubation mit terminaler Transferase gemäß den Empfehlungen des Herstellers und nach den Angaben von Ponte et al., Nature, (11. Februar 1988), 331, 525, 527 (auf diese Literaturstelle wird zur Beschreibung einer derartigen Endmarkierung Bezug genommen) unterzogen. Das Actin-Insert war durch Nick-Translation radioaktiv mit [32P]-CTP markiert. Nach der Hybridisierung wurden die mit Oligonucleotiden hybridisierten Filter mit 1 × SSC bei 55 °C gewaschen. Der mit Actin hybridisierte Filter wurde mit 0,1 × SSC bei 55 °C gewaschen. Die Filter wurden sodann zur Erzeugung des dargestellten Autoradiogramms auf einen Röntgenfilm aufgelegt. Die Insert-Sonde weist in sämtlichen geprüften Proben die in 1 dargestellte β-Amyloid-Vorläuferprotein-mRNA nach. Die Verbindungssonde weist die von Kang et al. beschriebene β-Amyloid-verwandte mRNA in sämtlichen Zellen mit Ausnahme von HeLa und MRC5 nach. Die Actin-Sonde stellt eine Kontrolle dar, von der erwartet wird, dass sie in sämtlichen Zellen mit einer reichlich vorhandenen RNA hybridisiert.
  • 6.4
  • Beispiel 4
  • Konstruktion der transgenen NSE-A42- und -A99-Expressionsplasmide
  • A42- und A99-Sequenzen wurden von den β-Actin-A42- und -A99-Expressionsplasmiden, die in der US-Patentanmeldung SN-07/408,767 beschrieben sind, abgeleitet. Speziell wurden die β-Actin-A42- und β-Actin-A99-Plasmide mit NcoI und EcoRI verdaut, wobei die β-Actin-Promotorregion sowie die SV2-neo-Promotorregion freigesetzt wurden. Ferner wurden durch Verdau mit EcoRI fünf Aminosäuren von A42 oder A99 entfernt, die unter Verwendung eines synthetischen Polylinkers ersetzt werden können. Das in Bezug auf die β-Actin- und SV2-neo-Promotoren deletierte A42- oder A99-Plasmid wurde durch Agarose-Gelelektrophorese gereinigt. Ein synthetischer Oligonucleotid-Polylinker, der mehrfache Klonierungsstellen erzeugt, sowie die fünf Aminosäuren für A42 und A99 wurden synthetisiert und mit dem vorher durch NcoI- und EcoRI-Verdau erzeugten A42- oder A99-Plasmidfragment verknüpft. Durch Addition des Polylinkers wird die NcoI-Stelle im ursprünglichen Plasmid deletiert und diese Stelle in den Polylinker bewegt, und die EcoRI-Stelle innerhalb der A42- oder A99-Sequenzen wird ersetzt. Nach Ligation des Polylinkers mit dem A42- oder A99-Plasmidfragment wurde Plasmid-DNA hergestellt. Das neue Plasmid wurde zunächst mit BglII und NcoI gespalten. Diese beiden Stellen wurden in der neu addierten Polylinkerregion synthetisiert. In der durch BglII- und NcoI-Verdau geschaffenen Stelle wird der NSE-Promotor addiert.
  • Der NSE-Promotor wurde aus einer Ratten-Genombibliothek isoliert. Ein 11 kb-Genom-EcoRI-Fragment wurde unter Hybridisierung mit Oligonucleotiden, die aus der bekannten NSE-Promotorregion-Sequenz konstruiert worden waren, selektiert. Das 11 kb-Genom-EcoRI-NSE-Promotorfragment wurde in ein pUC-Plasmid kloniert. Aus diesem Genomfragment wurde die angestrebte Promotorregion unter Anwendung von PCR-Amplifikation gemäß 9 isoliert. Ein großer Teil der Promotorregion, die ein Intron in der 5'-untranslatierten Region des NSE-Gens enthielt, wurde durch PCR-Amplifikation unter Verwendung von Oligonucleotid-Primern mit BglII- und NcoI-Restriktionsstellen an den 5'- bzw. 3'-Termini erzeugt. Das NSE-Promotorfragment wurde durch Gelelektrophorese gereinigt und sodann in die BglII-NcoI-Polylinkerregion des früher erzeugten A42- oder A99-Plasmids kloniert. Zum Verdauen, Ligieren und Isolieren der Fragmente wurden übliche molekulare Rekombinationstechniken herangezogen. Eine DNA-Sequenzierung belegte die Korrektheit der NSE-A42- und NSE-A99-Expressionsplasmide.
  • 6.5
  • Beispiel 5
  • Konstruktion der transgenen NSE-A695- und NSE-A751-Expressionsplasmide
  • Das in Beispiel 4 hergestellte NSE-A99-Plasmid wurde zur Herstellung von NSE-A695- und NSE-A751-Expressionsplasmiden verwendet, indem man die A99-Sequenzen entfernte und durch die A695- oder A751-Sequenzen ersetzte. Zur Entfernung der A99-Sequenzen aus dem NSE-A99-Plasmid wurde das Plasmid mit NcoI und anschließend mit Mungobohnen-nuclease verdaut. Die Behandlung mit Mungobohnen-nuclease erzeugt ein stumpfes Ende an der NcoI-Stelle für weitere Klonierungszwecke. Das Plasmid wurde anschließend mit HindIII verdaut. Diese Stelle befindet sich innerhalb der Polylinkerregion in 3'-Stellung zu den A99-Sequenzen, was die Freisetzung des A99-Kodierungsfragments bewirkt. Das restliche Plasmid, das den NSE-Promotor, die Plasmidsequenzen, die poly A-Additionsstelle und einen Teil der Polylinkerregion enthielt, wurde durch Gelelektrophorese gereinigt. Anschließend wurden die A695- und A751-Fragmente zur Klonierung in das A99-deletierte NSE-Plasmid hergestellt. Die A695- und A751-Sequenzen wurden von β-Actin-A695- und β-Actin-A751-Expressionsplasmiden abgeleitet. Zur Entfernung der 695- und 751-Sequenzen wurden die Plasmide mit NruI und HindIII verdaut. Die NruI-Stelle befindet sich unmittelbar in 5'-Stellung zum einleitenden Methionincodon von 695 und 751. Die HindIII-Stelle befindet sich in der Polylinkerregion in 3'-Stellung zum Terminationscodon von 695 und 751. Das NruI-HindIII-Fragment, das die A695- oder A751-Sequenzen enthielt, wurde in das stumpfendig gemachte, NcoI-HindIII-behandelte, A99-deletierte NSE-Plasmid kloniert. Für die endgültigen Plasmide NSE-A695 und NSE-A751 wurde durch DNA-Sequenzierung der Klonierungsverbindungen die korrekte Beschaffenheit festgestellt.
  • Nach Transfektion in Säugetierzellen ergab sich, dass diese Plasmide 695- und 751-Protein exprimierten.
  • 6.6
  • Beispiel 6
  • Herstellung der transgenen Metallothionein-A42- und Metallothionein-A99-Expressionsplasmide
  • Ein synthetischer Metallothionein I-Mäuse-Promotor, der aus der veröffentlichten Sequenz konzipiert worden war, wurde durch Oligonucleotid-Synthese und -Ligation hergestellt. Der synthetische Metallothionein- oder MT-Promotor wurde in pUC19 kloniert. Zur Herstellung der transgenen MT-A99- und MT-A42-Expressionsplasmide wurden die A42- und A99-Sequenzen aus den β-Actin-A42- bzw. A99-Expressionsplasmiden isoliert. Die A42- und A99-Sequenzen wurden aus dem β-Actin-Expressionsplasmid unter Verdau mit SalI und BamHI für A42 und mit SalI und HindIII für A99 ausgeschnitten. Die bei A42 und A99 gemeinsam auftretende SalI-Stelle befindet sich in 5'-Stellung zum Initiator-Methionin von A42 und A99. Die BamHI-Stelle und die HindIII-Stellen sind beide in der Polylinkerregion in 3'-Stellung zu den A42- und A99-Kodierungssequenzen enthalten. Das SalI-BamHI-Fragment für A42 und das SalI-HindIII-Fragment für A99 wurden durch Gelelektrophorese gereinigt. Das synthetische MT-Promotorfragment wurde durch Verdau des pUC-Plasmids mit EcoRI und SalI isoliert. Das EcoRI-SalI-MT-Promotorfragment wurde mit dem SalI-BamHI-A42-Fragment ligiert. Gleichermaßen wurde das EcoRI-SalI-MT-Promotorfragment mit dem SalI-HindIII-Fragment von A99 ligiert. Die MT-Promotor-A42- und MT-Promotor-A99-Fragmente wurden sodann zur Erzielung eines vollständigen Expressionsplasmids in ein Plasmidgerüst kloniert. Beim verwendeten Plasmidgerüst handelte es sich um den parentalen β-Actin-Vektor, aus dem das modifizierte pAXneoR-Plasmid abgeleitet wurde. Der Plasmidvektor wurde zur Klonierung durch Verdau mit EcoRI und BamHI zur Insertion des EcoRI-BamHI-MT-A42-Fragments hergestellt oder das Plasmidgerüst wurde mit EcoRI und HindIII zur Insertion des EcoRI-HindIII-MT-A99-Fragments verdaut. Übliche Methoden der rekombinanten DNA-Manipulation wurden zur Erzeugung der Plasmide herangezogen. Für die transgenen MT-A42- und MT-A99-Expressionsplasmide wurde durch DNA-Sequenzanalyse die Korrektheit der Sequenz bestätigt.
  • 6.7
  • Beispiel 7
  • Konstruktion von transgenen MT-A751- und MT-A695-Expressionsplasmiden
  • Ein Promotor-Plasmid wurde unter Verwendung des früher beschriebenen synthetischen MT-I-Fragments konstruiert. Dieses Plasmid enthält ferner die SV40-Terminationsregion, das ein Intron aufweist. Zwischen dem Promotor und den SV40-Terminationssequenzen ist eine XbaI-Stelle vorhanden. Das Plasmid wurde an dieser XbaI-Stelle geschnitten und sodann zur Schaffung eines stumpfen Endes mit Mungobohnen-nuclease behandelt. An der stumpfendigen XbaI-Stelle des MT-Plasmids werden die 751- und. 695-Sequenzen inseriert. Vollständige 695- und 751-Kodierungssequenzen wurden von den β-Actin-695- und β-Actin-751-Expressionsplasmiden abgeleitet. Um dieses Fragment zu erhalten, wurden die β-Actin-Expressionsplasmide mit NruI und HindIII verdaut. Die NruI-Stelle befindet sich unmittelbar in 5'-Stellung zum Initiator-Methionin von A695 und A751. Die HindIII-Stelle befindet sich in 3'-Stellung zu Beginn des Terminationscodons von A695 und A751 innerhalb der Polylinkerregion des Plasmids. Durch Verdau mit NruI entsteht ein stumpfendiger Terminus. Durch Verdau mit HindIII entsteht ein klebriges Ende, das mit Klenow-Fragment aufgefüllt wurde, um ein stumpfendiges Fragment an den beiden 3'- und 5'-Termini von 695 und 751 zu schaffen. Das stumpfendige 695- und 751-Endfragment wurde in das stumpfe XbaI-Metallothionein-SV40-Plasmid kloniert. Für die erhaltenen MT-A695- und MT-A751-Plasmide wurde durch DNA-Sequenzanalyse eine korrekte Sequenz an den Klonierungsverbindungen festgestellt.
  • 11A zeigt eine schematische Darstellung des NSE-A751-Transgens. Der 2,3 kb-NSE-Promotor und die verbundene 5'-untranslatierte Region sind durch das schraffierte Kästchen gekennzeichnet. Das Intron innerhalb der NSE-DNA ist durch Linien dargestellt. Die A751-Sequenzen sind durch das ausgefüllte Kästchen dargestellt. Die die späte SV40-Region enthaltende 3'-untranslatierte Region, die die Polyadenylierungssignale enthält, ist durch ein offenes Kästchen gekennzeichnet. Gestrichelte Linien definieren Plasmidsequenzen. Restriktionsendonuclease-Stellen sowie Sonden (1-4), die für den Southern-Blot und reverse Transcriptase-PCR-Analysen verwendet wurden, sind angegeben.
  • 6.8
  • Beispiel 8
  • Gewinnen und Injizieren der Eier
  • 6.8.a. Verfahren
  • Befruchtete Eier wurden aus den Eileitern von weiblichen JU-Mäusen, die sich vorher mit männlichen Tieren gepaart hatten, gewonnen. Die Eier wurden in einem frühen pronuklearen Stadium gewonnen, indem die männlichen und weiblichen Pronuclei innerhalb des Zytoplasmas getrennt und unterscheidbar sind. Die gewonnenen Eier wurden von etwaigen umgebenden Zellen und Materialien getrennt, gründlich gewaschen und gemäß aus dem Stand der Technik bekannten Verfahren aufbewahrt. Die Zygoten wurden vorzugsweise in einem Objektträger mit einer Vertiefung, der Kulturmedium enthielt, unter Überschichtung mit Paraffinöl in einer Atmosphäre von 5 % Kohlendioxid, 5 % Sauerstoff und 90 % Stickstoff (Prozentangaben beziehen sich auf das Volumen) bei 37 °C gelagert. Ein Fusionskonstrukt von NSE mit dem 5'-Intron in Verbindung mit A751 wurde gemäß dem vorstehend beschriebenen Verfahren und der Darstellung in 9 erhalten. Sämtliche vorerwähnten Fusionskonstrukte lassen sich auf die hier beschriebene Art und Weise in ein befruchtetes Ei klonieren und aufnehmen. Demgemäß wird nachstehend eine spezielle Beschreibung in Bezug auf A751 vorgelegt, wobei es sich jedoch um ein allgemeines Verfahren handelt, das auf beliebige der vorerwähnten Fusionskonstrukte anwendbar ist.
  • Zunächst wurden die Fusionskonstrukte gemäß der schematischen Darstellung in 10 kloniert. Nach dem Klonieren wurden die Fusionskonstrukte vom Wirt extrahiert, gereinigt und sodann mit der geeigneten Nuclease verdaut, um einen möglichst großen Teil der unerwünschten bakteriellen Sequenzen zu entfernen. Die extrahierten Plasmide werden durch Cäsiumchlorid-Ethidiumbromid-Dichtegradientenzentrifugation und anschließende Extraktion des Ethidiumbromids und Dialyse der Plasmid-DNA gereinigt. Nach Durchführung derartiger Extraktions- und Reinigungsvorgänge an einer beliebigen der klonierten Sequenzen ist es möglich, relativ reine Plasmide, die die gewünschten Fusionskonstrukte enthalten, zu erhalten.
  • Die gereinigten Plasmide wurden sodann mit der geeigneten Endonuclease behandelt (SalI und NdeI wurden zur Erzielung von linearen Fragmenten von NSE-A751 oder NSE-A695 verwendet). Durch Gelelektrophorese wurden die gewünschten Fragmente unter Verwendung von Gene Clean-Glasperlen (vertrieben von Bio 101, San Diego, Kalifornien) isoliert. Anschließend wurde durch eine 0,22 μm-Membran filtriert.
  • Erhaltene gereinigte DNAs wurden unter Verwendung von Injektionspipetten mit einem Außendurchmesser von etwa 1 μl mikroinjiziert. Derartige Pipetten lassen sich aus Pyrex-Rohren gemäß Proc. Natl. Sci. USA, Bd. 74 (1971), S. 5657-5661, herstellen. Etwa 10 Pikoliter der Lösung, die die Fusionskonstrukte (d. h. etwa 20 000 DANN Sequenzen) enthalten, wurden in eine Injektionspipette aufgezogen. Die Zygote wurde an einer Haltepipette mit einem Außendurchmesser von etwa 60 bis 70 Mikroliter positioniert (diese Pipette lässt sich ebenfalls gemäß der vorstehenden Druckschrift herstellen). Die Zygote wurde so an der Haltepipette positioniert, dass der männliche Pronucleus mit den in der Injektionspipette vorhandenen Fusionskonstrukten injiziert wurde.
  • Sämtliche Zygoten wurden mikroinjiziert und anschließend in Kulturröhrchen gebracht, wo man sie sich 5 Tage entwickeln ließ. Geeignete Bedingungen für die Präimplantationsentwicklung sind in Biol. Reprod., Bd. 8 (1973), S. 420-426, beschrieben. Eier, die sich zu Morulae oder Blastozyten entwickelten, wurden in die Uteri von F1-Hybrid-JU-Mäusepflegemüttern, die sich am dritten Tag einer Scheinschwangerschaft befanden, transplantiert. Diese Pflegemütter trugen die implantierten Embryos bis zum Ende aus.
  • Injektionstechniken des vorstehend beschriebenen Typs sowie des dem Fachmann bekannten Typs wurden dazu herangezogen, Embryos mit verschiedenen erfindungsgemäßen Konjugaten zu injizieren, wie in der nachstehenden Tabelle 1 dargelegt ist. Dabei wurden die Experimente 1 bis 5 unter Verwendung der verschiedenen Konjugate an verschiedenen Anzahlen von Mäuseembryos durchgeführt. Die erwarteten und tatsächlichen Ergebnisse dieser Experimente sind in Tabelle 1 aufgeführt. Diese Tabelle zeigt die Anzahl der injizierten Mäuseeier, die Anzahl von lebenden Jungen, die durch Implantation dieser Eier erhalten wurden, und die Anzahl an Jungen, die sich tatsächlich als transgen erwiesen, d. h. die tatsächlich die fremde DNA, die in die Embryos injiziert worden war, enthielten.
  • Tabelle 1 Experimente
    Figure 00410001
  • Die bei den Experimenten 1 bis 5 der vorstehenden Tabelle 1 erhaltenen transgenen Mäuse eignen sich zur Bestimmung der Wirksamkeit eines Arzneistoffes zur Verringerung der Menge an Plaques, die aufgrund der Alzheimer-Krankheit entstehen. Transgene Mäuse von jedem der vorstehenden Experimente können im Vergleich zu Kontrollmäusen, die nicht transgen sind, herangezogen werden oder es können verschiedene Kombinationen der transgenen Mäuse miteinander und/oder mit den Kontrollen verglichen werden, mit dem Ziel, die Wirksamkeit von einem oder mehreren Arzneistoffen in Bezug auf eine Verringerung der Menge an gebildeten Plaques zu bestimmen und somit die Verringerung der Plaques mit der Wirksamkeit des Arzneistoffes bei der Behandlung der Alzheimer-Krankheit in Beziehung zu setzen.
  • Beispiel 9
  • Bestimmung der transgenen Kopienzahlen
  • In den folgenden Beispielen werden Ergebnisse für Embryos und Mäuse unter Injektion von NSE-A751-DNA beschrieben.
  • Wie in Table 1 angegeben ist, trugen 9 von 44 Mäusen, die sich aus Embryos mit einer Injektion von NSE-A751-DNA entwickelt hatten, das Transgen. Durch Zucht dieser Mäuse wurden 8 Linien geschaffen. Das Transgen von einer Stammmaus wurde nicht auf die Nachkommen vererbt. Drei Stämme wurden für die weitere Charakterisierung ausgewählt, nämlich Stammmaus 10 (F10), Stammmaus 11 (F11) und Stammmaus 24 (F24). (Tabelle 2). Die Transgen-Kopienzahlen wurden durch Vergleich des endogenen Einzelkopien-b-APP-Mäusegens unter Anwendung von Southern-Blot-Hybridisierung mit einer für Mäuse-b-APP und humanes b-A751 gemeinsamen Oligonucleotidsonde bestimmt (11B). 40 mg Schwanz-DNA wurden mit BglII verdaut und der Elektrophorese an einem 0,8 % Agarosegel unterworfen.
  • Southern-Blots wurden erstellt und mit einer Oligonucleotidsonde hybridisiert (11A, Sonde #1; 5'-GGATGTGTACTGTTTCTTCTTCA-3'), die mit 32P durch T4-Kinase radioaktiv markiert war, hybridisiert.
  • Die Blots wurden bei 60 °C in 6 × SET (1 × SET = 0,15 M NaCl, 30 mM Tris-HCl, pH-Wert ,0, 2 mM EDTA) mit 5 × Denhardt-Lösung hybridisiert und 40 Minuten bei 60 °C in 6 × SSC (1 × SSC = 0,15 M NaCl, 0,15 M Na- Citrat) gewaschen. Die F10-, F11- und F24-Linien wiesen etwa 1, 4 bzw. 8 Kopien von NSE:b-A751 pro haploides Genom auf.
  • 6.8.b. Analyse
  • Beispiel 10
  • RNA-Expression von vererbten Transgenen
  • Die RNA-Expression von vererbten Transgenen wurde in drei Stämmen untersucht. 2 mg gesamte Hirn-RNA wurden von positiven Tieren und Wildtyp-Kontrolltieren isoliert, einer reversen Transkription mit oligo-dT12-18, unterzogen, und ein spezifisches DNA-Unterfragment wurde durch Polymerase-Kettenreaktion (PCR) amplifiziert. Das Reaktionsgemisch wurde in zwei Aliquotanteile aufgeteilt.
  • Oligonucleotid-Primer für die PCR wurden so konstruiert, dass nur von dem Transgen abgeleitete Transkripte amplifiziert wurden, d. h. ein Primer hybridisierte mit der NSE-5'-untranslatierten Region (5'-CACCGCCACCGGCTGAGTCTGCAGTCCTCG-3') und der andere mit der 5'-Kodierungsregion des b-APP (5'-TCTTGCACTGCTTGCGGCCCCGCTTGCACC-3'). Um verunreinigende genomische DNA oder unprozessierte Transkripte zu berücksichtigen, entsprachen die NSE-PCR-Primer einer Stelle, die sich stromaufwärts vom Intron befand. Ein vorhergesagtes Fragment mit 373 Basenpaaren wurde aus revers transkribierter DNA, die aus jedem transgenen Tier hergestellt worden war, amplifiziert, jedoch nicht aus revers transkribierter RNA, die aus Wildtyp-Mäusen isoliert worden war. Als Kontrolle wurde der zweite Aliquotanteil der revers transkribierten RNA mit einem Primer für die native b-APP-Sekretionssignalsequenz (5'-TTGGCACTGCTCCTGCTGGCCGCCTGGACG-3') und dem vorstehend beschriebenen Primer für die 5'-kodierende Domäne von b-APP amplifiziert. Bei diesen Reaktionen bildeten sowohl Wildtyp-Proben als auch transgene, revers transkribierte Proben das DNA-Fragment mit 307 Basenpaaren, was die Amplifikation von endogener b-APP-RNA wiedergibt.
  • Die DNA wurde der Elektrophorese an 2 %-Agarosegelen unterworfen, durch Färben mit Ethidiumbromid sichtbar gemacht und sodann einem Southern-Blot und einer Hybridisierung mit einer 32P-markierten Oligonucleotidsonde mit der NSE-A751-Fusionssequenz (5'-AGATCCCAGCCACCGATGCTGCCCGGTTTG-3') hybridisiert.
  • Die Blots wurden bei 65 °C in 6 × SET hybridisiert und 40 Minuten in 4 × SSC bei 65 °C gewaschen. Wenn die PCR-Reaktionsprodukte mit der Oligonucleotidsonde, die die Verbindung zwischen NSE- und b-A751-Sequenzen überbrückte, hybridisiert wurden, hybridisierten nur die von den transgenen Hirnen abgeleiteten Produkte mit der Sonde, was die Authentizität des PCR-Produkts mit 373 bp beweist.
  • Beispiel 11
  • Western-Blot-Analyse
  • Veränderungen der Proteinexpression in Hirnen von transgenen NSE:b-A751-Tieren wurden durch Western-Blot-Analyse bestimmt. Proteinhomogenisate wurden aus vollständigem Hirn gemäß den Verfahren von B. D. Shivers et al., EMBO J., Bd. 7 (1988), S. 1365-1370, hergestellt. 50 mg von jeder Probe wurden der Elektrophorese an einem 7,5 % SDS-Polyacrylamidgel unterworfen und auf Membranen übertragen. Western-Blots wurden entwickelt, wobei man eine 1/500-Verdünnung von polyklonalem Antiserum gegen humanes A695 von voller Länge, das durch das rekombinante Vaccinia-Virus exprimiert worden war, und 125I-Protein A verwendete. Mehrere Banden von etwa 120 kD, entsprechend der bekannten durchschnittlichen Größe von Säugetierhirn-b-APP-Isoformen, wurden in den Kontrollen und in den einzelnen transgenen Proteinhomogenisaten festgestellt. In den NSE-A751-Proben wurden im Vergleich zu den Wildtyp-Proben geringfügig erhöhte Konzentrationen an b-APP festgestellt, was auf erhöhte Grade der A751-Expression in transgenen Hirnen schließen lässt. Eine genaue Bestimmung der neuronalen Grade der exogenen A751-Expression war jedoch schwer durchzuführen, was auf die kombinierte neurale und gliale Expression von endogenem b-APP zurückzuführen ist. Daher wurden die neuronalen Grade der exogenen A751-Expression durch Immunozytochemie der NSE-A751-Expression geprüft.
  • Beispiel 12
  • Histologische Analyse von transgenen Mäusehirnen mit monoklonalem Antikörper 4.1
  • Monoklonaler Antikörper 4.1 wurde für die histologische Analyse von transgenen Mäusehirnen verwendet. Dieser Antikörper erkennt ein Epitop, das den N-terminalen zehn Resten des β-Amyloid-Proteins zugeordnet ist, und weist eine hohe Affinität und Spezifität für neuritische Plaques auf. Jegliche Immunoreaktivität wurde durch Vorinkubation des monoklonalen Antikörpers mit dem synthetischen Peptidimmunogen vor der Färbung beseitigt. Kurz zusammengefasst, es wurde ein synthetisches Peptid, das den Resten 1-28 des β-Amyloid-Proteins entsprach, hergestellt und durch Einfrieren und Auftauen zur Selbstaggregation gebracht. Das Peptidaggregat wurde mit methyliertem Rinderserumalbumin und Adjuvans für eine Immunisierung und Auffrischungsimmunisierung von Mäusen vermischt.
  • Hybridome aus sensibilisierten Milzzellen wurden erzeugt. Klone, die anti-Peptid-Antikörper sezernierten, wurden durch Grenzverdünnung expandiert und subkloniert. Hirne von transgenen NSE-A751-Mäusen, Wildtyp-Mäusen und homozygotischen und hämizygotischen Tieren von drei transgenen Linien wurden analysiert (Tabelle 2). Die Hirne wurden entnommen, mit 4 % Paraformaldehyd vermischt und in Paraffin eingebettet. Im koronalen Mittelhirn wurden Schnitte von 6 mm hergestellt. Die Schnitte wurden deparaffiniert, rehydratisiert und 30 Minuten mit 0,3 % H2O2 und sodann etwa 2 Minuten mit 80 % Ameisensäure behandelt. Anschließend wurden die Schnitte 30 Minuten bei 37 °C mit einer 1/20-Verdünnung von konditioniertem Medium aus dem 4.1-Antikörper sezernierenden Hybridom inkubiert. Eine anti-Maus-Avidin-biotinylierte-Meerrettich-Peroxidase (ABC)-Testpackung wurde gemäß den Empfehlungen des Herstellers (Vektor, Burlingame, CA) verwendet. Die Meerrettichperoxidase wurde mit 3,3'-Diaminobenzidin sichtbar gemacht. Schnitte wurden mit Hämatoxylin und Eosin gegengefärbt. Zur Färbung von b-APP von voller Länge wurden eine 1/400-Verdünnung von Antiserum gegen humanes b-APP695 von voller Länge, das durch rekombinantes Vaccina exprimiert worden war, und eine anti-Kaninchen-ABC-Testpackung verwendet. Schnitte wurden mit Hämatoxylin und Eosin gegengefärbt. Humane Hirnschnitte wurden von Personen, bei denen die Alzheimer-Krankheit klinisch diagnostiziert worden war, erhalten. Die humanen Schnitte wurden in identischer Weise wie Mäusegewebeschnitte vorbereitet und gefärbt, mit der Ausnahme, dass sie 10 Minuten mit 98 % Ameisensäure behandelt wurden. Für kompetitive Experimente wurde das Antikörper-Verdünnungsmittel vor dem Aufsetzen 12 Stunden bei 4 °C und 30 Minuten bei 37 °C mit 250 mg/ml synthetischem 1-28-β-Amyloid-Peptid vorinkubiert. Wie in den 12A und 12B dargestellt ist, färbt der Antikörper selektiv neuritische Plaques in humanen Gewebeschnitten. Die Immunoreaktivität wird vor dem Färben durch Vorinkubation des monoklonalen Antikörpers mit dem synthetischen Peptidimmunogen beseitigt.
  • Schnitte von transgenen und Wildtyp-Hirnen wurden parallel mit dem 4.1-Antikörper gefärbt. Ein größeres Ausmaß an Immunoperoxidase-Reaktivität wurde in Neuronen und im gesamten Neuropil der transgenen Hirne im Vergleich mit Hirnen von Wildtyp-Mäusen festgestellt.
  • 12C zeigt ein Beispiel einer verstärkten neuronalen Färbung in der pyramidalen Hippocampus-Zellschicht eines Tiers des NSE-A751-F10-Stammes (12C). Ferner wurde eine signifikante Färbung von neuritischen Prozessen beobachtet. Eine Verstärkung des verzweigenden neuronalen Prozesses war im Stratum neben der pyramidalen Zellschicht der CA-1- und CA-3-Regionen der transgenen Hippocampi besonders offensichtlich. Eine verstärkte Färbung von neuritischen Prozessen in den tieferen kortikalen Schichten von transgenen Hirnen war ebenfalls zu sehen. Die neuronale und Prozessfärbung stand vollständig in Konkurrenz mit einer vorherigen Inkubation des Antikörpers mit dem synthetischen β-Amyloid-Peptid mit 28 Resten und wurde durch Behandlung mit Ameisensäure verringert. Zusätzlich wurde, wie in 12D dargelegt, eine neuritische Färbung in transgenen Hirnen unter Verwendung von Antikörpern gegen b-APP von voller Länge nachgewiesen, was zeigt, dass es sich beim immunoreaktiven Material im neuronalen Prozess um b-APP von voller Länge handelt.
  • Extrazelluläre immunoreaktive Ablagerungen wurden auch in Hirnschnitten dieser drei transgenen Linien nach Färbung mit dem monoklonalen 4.1-Antikörper festgestellt (13A–D). Diese Ablagerungen wurden in den untersuchten Wildtyp-Tieren nicht festgestellt. Die Ablagerungen variieren in Bezug auf Größe, Gestalt und Häufigkeit. Kompakte Ablagerungen mit einem Durchmesser von 10-30 mm sind in 13A–E dargestellt. Die Ablagerungen wurden besonders häufig im Cortex und im Hippocampus festgestellt, obgleich sie gelegentlich auch im Thalamus und im Striatum beobachtet wurden. Die Ablagerungen neigen zum Auftreten in Clustern. Durchschnittlich wurden 5 Ablagerungen in einem einzelnen vollständigen Hirnschnitt von NSE-b-A751-F10- oder F11 beobachtet, wobei aber in einem einzelnen Schnitt 15 Ablagerungen mit einer Größe von 10-50 mm festgestellt wurden. Amorphe oder granuläre immunoreaktive extrazelluläre Ablagerungen wurden auch in den mit dem monoklonalen 4.1-Antikörper gefärbten Schnitten von transgenen Hirnen beobachtet, jedoch nicht in den Schnitten von Kontrollhirnen. 13e zeigt ein Beispiel für eine diffuse β-Amyloid-Immunoreaktivität im Hippocampus eines Tiers der NSE-b-A751-F11-Linie. Der Nachweis von extrazellulären Ablagerungen in Gewebeschnitten transgener Tiere erforderte die Behandlung mit Ameisensäure. Bei der Färbung der Strukturen bestand eine Konkurrenz mit dem β-Amyloid-Peptid, wie in Fig. 14e dargestellt ist. Die Ablagerungen färbten sich in variabler Weise mit Antikörpern gegen b-APP von voller Länge. Hirne von NSE-A751-F10 und -F11 zeigten eine größere Anzahl von kompakten Ablagerungen als die von NSE-b-A751-F24 (Tabelle 2), selbst wenn F24 mehr Kopien als das NSE-b-A751-Transgen aufweist.
  • Tabelle 2 Zusammenfassung der für die Immunohistologie eingesetzten Mäuse
    Figure 00470001
  • 1Monate; 2haploid; 3Größe >5 mm, (–) (+/++/+++) relative Häufigkeit von Ablagerungen, d. h. + <5; ++ 5–10; +++ >10 Ablagerungen pro Schnitt im Durchschnitt von mehrfachen gefärbten Schnitten. M und F bedeuten männliche bzw. weibliche Mäuse; AA und Aa bedeuten homozygotische bzw. hämizygotische Tiere; n.a. bedeutet "nicht zutreffend"; *NSE-A751-F10 #31 ging spontan aus unbekannter Ursache ein.
  • Mäuse, die die exogenen Gene beinhalten, können zu folgenden Zielen gezüchtet werden: 1) um zu dokumentieren, dass die NSE-751- oder NSE-695-DNA stabil in das Genom einverleibt wird; 2) um eine reine Linie zu erzeugen; 3) um die mRNA- und Proteinexpression zu charakterisieren; 4) um letztlich mögliche pathologische Konsequenzen der Expression der fremden DNA zu untersuchen; und 5) um potentielle therapeutische Verbindungen zu testen.
  • Eine Vielzahl von analytischen Verfahren kann zur Identifikation und Charakterisierung von transgenen Tieren gemäß den vorstehend beschriebenen Verfahrensweisen erzeugt werden. Es ist selbstverständlich notwendig, festzustellen, welches der transgenen Tiere die inserierten Sequenzen, wie NSE-A-99, NSE-A-42, MT-A-99 und MT-A-42, enthält. Diese Inserts sowie die A4i-Inserts können unter Anwendung identischer Grundprinzipien und spezieller PCR- und Southern-Blotting-Oligonucleotidreagenzien und Antikörper für das Western-Blotting nachgewiesen werden. Eine Vielzahl von verschiedenen Techniken und Kombinationen von Techniken ergeben sich für den Fachmann beim Studium der vorliegenden Beschreibung.
  • Es wurden Western-Blotting-Verfahren zum Identifizieren von A751- oder A695-Vorläufer in Nagetierhirnen entwickelt. Beispielsweise wurde ein Western-Blot unter Verwendung von Antiserum gegen A695 (erzeugt unter Verwendung des rekombinanten Vaccinia-Virus-Systems), das mit einem Homogenisat des gesamten Hirns umgesetzt worden war, durchgeführt. Es wurde ein einzelnes Protein mit 120 kd, dem vorhergesagten Molekulargewicht des Vorläufers, festgestellt. Die Membran, auf die das Protein für den Blot übertragen wird, beeinflusst in starkem Maße die Proteinübertragung. Für Proteine mit mehr als 30 kd ist Polyvinylendifluorid (PVDF) optimal, während unter 30 kd Nitrocellulose wirksamer ist. Weitere verfügbare Antiseren, die gegen Regionen des Amyloid-Vorläufers entwickelt wurden, insbesondere Seren gegen die Kunitz-Inhibitor-Domäne und gegen die Kerndomäne, können bei der Western-Blot-Analyse des gesamten Hirnproteins eingesetzt werden. Zusätzlich ist es unter Anwendung von aus dem Stand der Technik bekannten Verfahren möglich, monoklonale Antikörper gegen den Vorläufer zu isolieren. Mäuse wurden mit einem rekombinanten Vaccinia-Virus, der A751 exprimiert, immunisiert, wobei sich zeigte, dass sie Antikörper gegen dieses Protein entwickelten.
  • 11B zeigt einen Southern-Blot von DNA aus Wildtyp- und transgenen Mäusen. Bahnen 1 und 2: Wildtyp (WT); Bahnen 3 und 4: NSE-A751-F10; Bahnen 5 und 6: NSE-A751-F11; Bahnen 7 und 8: NSE-A751-F24. Der Pfeil zeigt das endogene Mäuse-b-APP-Gen. Pünktchen zeigen exogenes b-APP.
  • 12 (A, B, C und D) zeigen die Immunoperoxidase-Färbung von humanem und murinem Hirn. Die 12A und 12B zeigen Gewebeschnitte von humanem, an Alzheimer erkranktem Gewebe aus dem kaudalen Hippocampus bei Färbung mit 4.1-Antikörper ohne Vorinkubation (12A) und mit Vorinkubation (12B) mit dem synthetischen β-Amyloid-Peptid-Immunogen. 12C zeigt die pyramidale Zellschicht der Hippocampus-CA-1-Region von NSE-A751-F10 (#334) bei Färbung mit 4.1-Antikörper. 12D zeigt die gleiche Region bei der Wildtyp-Maus (#3) bei Färbung mit 4.1-Antikörper. Vergrößerung: 500 X.
  • 13 (A, B, C, D und E) sind Mikrophotographien von immunoreaktiven Ablagerungen in NSE-A751-Hirnen. 13A zeigt eine kompakte Ablagerung im frontalen parietalen Cortex von F11 (#0); 13B zeigt eine kompakte Ablagerung im Thalamus von F11 (#236); 13C zeigt eine kompakte Ablagerung im Hippocampus-CA-2-Feld von F11 (#0); 13D zeigt Cluster von Ablagerungen im frontalen parietalen Cortex von F10 (#168); 13E zeigt amorphe Ablagerungen im hippocampalen Stratum moleculare von F11 (#236).
  • 7. Anwendungen der Erfindung
  • Die erfindungsgemäßen transgenen Tiere eignen sich zur Bestimmung der Wirksamkeit von pharmazeutischen Arzneistoffen in Bezug auf ihre Fähigkeit zur Verringerung der Menge an Plaques, die im Hirn des Tiers entstehen. Speziell eignen sich die Tiere zum Testen der Wirksamkeit von derartigen Arzneistoffen bei der Verhinderung der Bildung oder der Verringerung der Menge der gebildeten β-Amyloid-Plaques sowie bei der Beseitigung oder Verringerung von bereits gebildeten Plaques.
  • Die Verfahren zur Erzeugung der transgenen Tiere wurden vorstehend beschrieben. Nach der Herstellung kann ein zu testender Arzneistoff einem Kontrolltier oder einer Gruppe von Tieren, bei denen es sich nicht um erfindungsgemäße transgene Tiere handelt, und gleichzeitig erfindungsgemäßen transgenen Tieren verabreicht werden. Der Arzneistoff wird vorzugsweise kontinuierlich über einen Zeitraum verabreicht, der normalerweise ausreicht, Amyloid-Protein-Ablagerungen im Hirn des Tiers hervorzurufen. Nach Verabreichung des Arzneistoffes für eine ausreichende Zeitspanne werden die Kontrolltiere und die transgenen Tiere getötet. Eine Prüfung des Hirns der Tiere wird durchgeführt. Durch Vergleich der Menge an Ablagerungen bei den Kontrolltieren zur Menge der Ablagerungen bei den erfindungsgemäßen transgenen Tieren lässt sich eine Feststellung über die Wirksamkeit des Arzneistoffes in Bezug auf eine Kontrolle der relativen Menge der Amyloid-Ablagerungen treffen.
  • Da die erfindungsgemäßen transgenen Tiere zum Testen der Wirksamkeit von Arzneistoffen in Bezug auf eine Verhinderung von Amyloid-Ablagerungen verwendet werden können, erweisen sich die Tiere als wertvolle Forschungswerkzeuge, die es den Forschern ermöglichen, die Wirksamkeit von derartigen Arzneistoffen bei der Behandlung von Krankheiten, die mit derartigen Amyloid-Ablagerungen verbunden sind, z. B. bei der Alzheimer- Krankheit, zu testen. Es ist jedoch darauf hinzuweisen, dass es sechs bekannte Fälle von krankheitsbedingten Amyloid-Ablagerungen gibt, bei denen die Natur des Vorläuferproteins für das Amyloid-Protein bekannt ist: für primäre Amyloidose handelt es sich bei der Quelle um eine leichte Kette eines Immunogloblins; bei sekundärer Amyloidose handelt es sich beim Vorläufer um Amyloid A-Protein; bei familiärer Amyloid-Polyneuropathie und seniler Herzamyloidose handelt es sich um Präalbumin, das auch als Transthyreitin bekannt ist, oder um eine Variante davon; bei medullärem Thyroidkarzinom handelt es sich um ein Procalcitonin-Fragment; und bei erblicher zerebraler Hämorrhagie handelt es sich um ein gamma-Spurenfragment, von dem gezeigt wurde, dass es sich um Cystatin C handelt (vergl. z. B. G. Glenner, New England Journal of Medicine, Bd. 302 (1980), S. 1283; K. Sletton et al., Biochem. J., Bd. 195 (1981), S. 561; Benditt et al., FEBS Lett., Bd. 19 (1971), S. 169; K. Sletton et al., Eur. J. Biochem., Bd. 41 (1974), S. 117; K. Sletton et al., J. Exp. Med., Bd. 143 (1976), S. 993). Die vorstehende Aufzählung stellt nur eine Teilliste dar. Es gibt zumindest eine Anzahl von weiteren Druckschriften in Bezug auf das Procalcitonin-Fragment als Vorläufer für das Amyloid des Thyroidkarzinoms. Alternativ und zusätzlich lässt sich ein derartiger Vorläufer für das β-Amyloid-Kernprotein im Hirn oder anderswo erzeugen und wird spezifisch im Hirn abgelagert.
  • Die transgenen Tiere und speziell die erfindungsgemäßen transgenen Tiere können zur Bestimmung der Wirksamkeit einer Vielzahl von Arzneistoffen bei der Behandlung einer Vielzahl von Krankheiten (einschließlich der vorstehend aufgeführten Krankheiten) verwendet werden, wobei diese Krankheiten mit β-Amyloid-Ablagerungen im Hirn verbunden sind. Dem Fachmann geläufige Verfahren zur Durchführung von Vergleichstests von Arzneistoffen können in Verbindung mit den erfindungsgemäßen transgenen Tieren herangezogen werden, um die Arzneistoffe zu testen.
  • Intraneuronale neurofibrilläre Gewirre liegen auch bei anderen degenerativen Krankheiten vor, wobei aber die Anwesenheit von Amyloid-Ablagerungen sowohl in den interneuronalen Räumen (neuritische Plaques) und im umgebenden Mikrogefäßsystem (vaskuläre Plaques) für Alzheimer-Krankheit charakteristisch zu sein scheinen. Darunter scheinen die neuritischen Plaques besonders vorzuherrschen (D. L. Price et al., Drug Development Research, Bd. 5 (1985), S. 59-68). Plaques treten auch in Gehirnen von älteren Patienten mit Down-Syndrom, bei denen sich die Alzheimer-Krankheit entwickelt, auf. Die erfindungsgemäßen transgenen Tiere können in Verbindung mit der Bestimmung der Wirksamkeit sämtlicher Typen von Arzneistoffen im Zusammenhang mit der Behandlung von Krankheiten, die mit Amyloid-Ablagerungen verbunden sind, verwendet werden, d. h. Alzheimer-Krankheit, (Dutch) erbliche zerebrale Hämorrhagie mit Amyloidose und Down-Syndrom.
  • Vorstehend wurden bevorzugte Ausführungsformen zur Ausübung und Anwendung der Erfindung beschrieben. Es ist aber ersichtlich, dass verschiedene Änderungen und Modifikationen vorgenommen werden können, ohne den Erfindungsbereich zu verlassen.
  • 8. Hinterlegungen
  • Die folgenden Kulturen wurden bei der American Type Culture Collection (ATCC), Rockville, MD, USA, zu Patentzwecken hinterlegt. Die Bacteriophagen-Phagen λSM2, λSM2W9 und λAPCP168i4 und das Plasmid pNSE-β-APP751 wurden unter den Bedingungen des Budapester Vertrags über die internationale Anerkennung der Hinterlegung von Mikroorganismen (Budapester Vertrag) hinterlegt.
  • Figure 00510001
  • Der Zugang zu den hinterlegten Stämmen ist nicht als eine Lizenz zur Ausführung der Erfindung unter Eingriff in Rechte, die von den jeweiligen Regierungsbehörden entsprechend den Patentgesetzen gewährt werden, aufzufassen.

Claims (6)

  1. Transgenes, nichtmenschliches Säugetier, dessen Zellen die geklonte rekombinante oder synthetische DNA-Sequenz enthalten, wobei die Sequenz umfasst: eine Nervengewebe-spezifische Promotorsequenz, die der neuronalspezifische Enolasepromotor ist, und eine Kodierungssequenz, die das A751-β-Amyloid-Vorläuferprotein kodiert und worin der Promotor und die Kodierungssequenz funktionell miteinander verbunden sind, stabil in das Genom des nichtmenschlichen Säugetiers eingebaut sind und zur Bildung von β-Amyloid-Proteinablagerungen im Gehirn des nichtmenschlichen Säugetiers exprimiert werden.
  2. Säugetier gemäß Anspruch 1, das eine Maus ist.
  3. Verfahren zur Herstellung einer genetisch-transformierten nichtmenschlichen Zygote mit der Fähigkeit, sich in ein transgenes nichtmenschliches Säugetier zu entwickeln, dadurch gekennzeichnet, dass es eine Vielzahl von Zellen hat, die eine geklonte rekombinante oder synthetische DNA-Sequenz enthalten, wobei die Sequenz umfasst: eine Nervengewebe-spezifische Promotorsequenz, die der neuronalspezifische Enolasepromotor ist, der funktionell mit einer Kodierungssequenz, die das A751-β-Amyloid Vorläuferprotein kodiert, verbunden ist, wobei das Verfahren folgenden Schritt umfasst: Einführen der Promotorsequenz und der Kodierungssequenz durch Mikroinjektion in einen Pronukleus einer Säugetier-Zygote, wobei die Zygote zur Entwicklung in ein Säugetier fähig ist, wobei eine genetisch transformierte Zygote erhalten wird; wobei die Promotorsequenz und die Kodierungssequenz so ausgewählt sind, dass die Kodierungssequenz nicht in solcher Weise und solchen Grad aktiviert ist, dass sie die normale Entwicklung des Embryos bis zum Ende verhindern würde, und wobei das β-Amyloid-Vorläuferprotein zur Bildung von β-Amyloid-Proteinablagerungen im Gehirn des nichtmenschlichen Säugetiers exprimiert wird.
  4. Verfahren gemäß Anspruch 3, bei welchem mindestens etwa 1000 Kopien des Gens in den Pronucleus mikroinjiziert werden und das Volumen des injizierten genetischen Materials etwa 10 Pikoliter nicht überschreitet.
  5. Verfahren gemäß Anspruch 3 oder 4, bei welchem die Promotorsequenz und die Kodierungssequenz in einen männlichen Pronucleus eines Eis mit separaten weiblichen und männlichen Pronuclei eingebracht wird.
  6. Verfahren gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche 3, 4 oder 5, bei welchem es der Zygote ermöglicht ist, sich in vitro zum Morula- oder Blastocystenstadium zu entwickeln.
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