DE69332798T2 - Ikaros: ein regulatorisches gen bei der t-zell differenzierung - Google Patents

Description

• HINTERGRUND DER ERFINDUNG
• Die Erfindung bezieht sich auf das Ikaros Gen und auf die Differenzierung und Generierung von T-Zellen.
• Die Generierung des T-Zell-Repertoires von einer Vorläufer-Stammzelle erfolgt durch einen Differenzierungsweg, bei welchem die späteren intathymischen Schritte gut dokumentiert sind, während die frühen extrathymischen Ereignisse nur wenig charakterisiert sind. Einer der frühesten definitiven T-Zell-Differenzierungsmarker ist das CD3δ-Gen des CD3/TCR-Komplexes.
• Science, Band 258, 30. Oktober 1992, Seite 808–812 berichtet von Ikaros, einem frühen lymphoidspezifischen Transkriptionsfaktor und einem putativen Mediator der T-Zell-Festlegung.
• ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
• Das Ikaros-Gen, ein in der frühen Differenzierung von T-Zellen aktives Gen, ist entdeckt worden. Das Gen codiert für eine Familie einzigartiger Zink-Finger-Proteine, die Ikaros-Proteine. Die Proteine der Ikaros-Familie sind Isoformen, welche durch differentielles Spleißen der Ikaros-Gentranskripte entstehen. Die Isoformen der Ikaros-Familie schließen im allgemeinen ein gemeinsames 3'-Exon (Ikaros-Exon E7, welches die Aminosäurereste 203–431 des Maus-Ikaros einschließt) ein, aber unterscheiden sich in der 5'-Region. Die Ikaros-Familie schließt alle Spleiß-Varianten ein, welche sich durch Transkription und Prozessieren des Ikaros-Gens ergeben. Fünf Isoformen sind hierin beschrieben. Ikaros-Proteine können den Enhancer des CD3δ-Gens binden und aktivieren und sind in erster Linie, wenn nicht sogar ausschließlich, auf T-Zellen beim Erwachsenen beschränkt. Das Expressionsmuster von diesem Transkriptionsfaktor während der embryonalen Entwicklung legt nahe, dass Ikaros-Proteine eine Rolle spielen als ein genetischer Schalter, welcher den Eintritt in die T-Zell-Abstammungslinie reguliert. Das Ikaros-Gen wird auch exprimiert im proximalen Corpus striatum während der frühen Embryogenese in Mäusen.
• Im Allgemeinen behandelt die Erfindung eine DNS, vorzugsweise eine gereinigte DNS, einschließlich (oder bestehend aus) einer Sequenz, welche für ein Peptid codiert einschließlich (oder bestehend aus) einem oder mehreren Ikaros-Exons der 4 (SEQ ID NO: 5) und welches eine Ikaros-Aktivität hat. In bevorzugten Ausführungsformen ist das Ikaros-Exon eines von E1/2, E3, E4, E5, E6 oder E7; codiert die gereinigte DNS nicht Exon E7.
• In anderen bevorzugten Ausführungsformen: schließt das codierte Peptid weiterhin ein zweites Ikaros-Exon ein; ist das zweite Exon eines von E1/2, E3, E4, E5, E6 oder E7; ist das erste Exon E7 und das zweite Exon eines von E1/2, E3, E4, E5, E6.
• In anderen bevorzugten Ausführungsformen: schließt das codierte Peptid weiterhin ein drittes Ikaros-Exon ein; ist das dritte Exon eines von E1/2, E3, E4, E5, E6 oder E7; ist das erste Exon E7, das zweite Exon E3 und ist das dritte Exon E1/2; ist das Peptid Ikaros-Isoform 5.
• In anderen bevorzugten Ausführungsformen: schließt das codierte Peptid weiterhin ein viertes Ikaros-Exon ein; ist das viere Exon eines von E1/2, E3, E4, E5, E6 oder E7; ist das erste Exon E7, das zweite Exon E6, das dritte Exon E4 und das vierte Exon E1/2; ist das erste Exon E7, das zweite Exon E4, das dritte Exon E3 und das vierte Exon E1/2; ist das Peptid die Ikaros-Isoform 3 oder 4.
• In anderen bevorzugten Ausführungsformen: schließt das codierte Peptid weiterhin ein fünftes Ikaros-Exon ein; ist das fünfte Exon eines von E1/2, E3, E4, E5, E6 oder E7; ist das erste Exon E7, das zweite Exon E6, das dritte Exon E5, das vierte Exon E4 und das fünfte Exon E1/2; ist das Peptid die Ikaros-Isoform 2.
• In bevorzugten Ausführungsformen: schließt das codierte Peptid weiterhin ein sechstes Ikaros-Exon ein; ist das sechste Exon eines von E1/2, E3, E4, E5, E6 oder E7; ist das erste Exon E7, das zweite Exon E6, das dritte Exon E5, das vierte Exon E4, das fünfte Exon E3 und das sechste Exon E1/2; ist das Peptid Ikaros-Isoform 1.
• In bevorzugten Ausführungsformen: ist die Sequenz des codierten Ikaros-Exon die gleiche wie die eines natürlich vorkommenden Ikaros-Exons, oder eines Fragments davon mit Ikaros-Aktivität; ist die DNS-Sequenz, welche das Ikaros-Exon codiert, mindestens zu 85%, mehr bevorzugt mindestens zu 90%, noch bevorzugter mindestens zu 95% und am meisten bevorzugt zu 98 oder 99% homolog zu einer DNS, welche ein natürlich vorkommendes Ikaros-Exon codiert oder ein Fragment davon mit Ikaros-Aktivität, z.B. Ikaros-Exon-codierende DNS von SEQ ID NO:2 oder SEQ ID NO:3; hybridisiert die Sequenz, welche ein Ikaros-Exon codiert, bei hoher oder niedriger Stringenz mit einer Nukleinsäure, welche ein natürlich vorkommendes Ikaros-Exon codiert, oder ein Fragment davon mit Ikaros-Aktivität, z.B. ein Ikaros-Exon mit der gleichen Aminosäuresequenz wie ein Ikaros-Exon von SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3 oder SEQ ID NO: 5; hat die Aminosäuresequenz des codierten Ikaros-Exons eine Länge von mindestens 30, mehr bevorzugt mindestens 40, mehr bevorzugt mindestens 50 und am meisten bevorzugt mindestens 60, 80, 100 oder 200 Aminosäureresten; ist die codierte Ikaros-Aminosäuresequenz mindestens zu 50%, mehr bevorzugt zu 60%, mehr. bevorzugt zu 70%, mehr bevorzugt zu 80%, mehr bevorzugt zu 90% und am meisten bevorzugt zu 95% so lang wie ein natürlich vorkommendes Ikaros-Exon oder ein Fragment davon mit Ikaros-Aktivität; ist das codierte Ikaros-Exon von gleicher Länge wie ein natürlich vorkommendes Ikaros-Exon oder ein Teilstück davon mit (karos-Aktivität; ist die Aminosäuresequenz des codierten Ikaros-Exons mindestens zu 80%, mehr bevorzugt mindestens zu 85%, noch bevorzugter mindestens zu 90%, noch bevorzugter mindestens zu 95% und am meisten bevorzugt mindestens zu 98 oder 99% homolog zu einer natürlich vorkommenden Ikaros-Exon-Sequenz oder einem Fragment davon mit Ikaros-Aktivität, z. B. einer Ikaros-Exon-Sequenz von SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3 oder SEQ ID NO: 5; ist die Aminosäuresequenz des codierten Ikaros-Exons die gleiche wie die eines natürlich vorkommenden Ikaros-Exons oder eines Fragments der Sequenz davon, z. B. ein Ikaros-Exon beschrieben in SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3 oder SEQ ID NO: 5; und hat das Peptid Ikarospeptid-Aktivität.
• In bevorzugten Ausführungsformen: sind die Exons in dem codierten Peptid in der gleichen relativen linearen Reihenfolge angeordnet wie sie vorgefunden wird in einer natürlich vorkommenden Isoform, z. B. Ikaros-Isoform 1, z. B. ist in einem Peptid mit den Exons E3 und E7 E3 N-terminal zu E7 lokalisiert; ist die lineare Anordnung der codierten Exons verschieden von der in einer natürlichen Isoform, z. B. Ikaros-Isoform 1, vorgefundenen, z. B. ist in einem Peptid mit den Exons E3, E5 und E7 in Richtung N-terminales zu C-terminalem Ende die Anordnung E5, E3, E7; unterscheiden sich die Exons in dem codierten Peptid in einem oder mehreren Merkmalen wie Zusammensetzung (d. h. welche Exons vorhanden sind), lineare Anordnung oder Anzahl (d. h. wie viele Exons vorhanden sind oder wie oft ein gegebenes Exon vorhanden ist) von einer natürlich vorkommenden Ikaros-Isoform, z. B. von Ikaros-Isoform 1, 2, 3, 4 oder 5.
• In einem anderen Aspekt weist die Erfindung ein Peptid auf, vorzugsweise ein reines Peptid, welches ein oder mehrere Ikaros-Exons einschließt (oder daraus besteht). In bevorzugten Ausführungsformen ist das Ikaros-Exon E1/2, E3, E4, E5, E6 oder E7; schließt das Peptid nicht Exon E7 ein.
• In anderen bevorzugten Ausführungsformen: schließt das Peptid weiterhin ein zweites Ikaros-Exon ein; ist das zweite Exon eines von E1/2, E3, E4, E5, E6 oder E7; ist das erste Exon E7 und das zweite Exon ist eines von E1/2, E3, E4, E5, E6.
• In anderen bevorzugten Ausführungsformen: schließt das Peptid weiterhin ein drittes Ikaros-Exon ein; ist das dritte Exon eines von E1/2, E3, E4, E5, E6 oder E7; ist das erste Exon E7 und das zweite Exon E3 und ist das dritte Exon E1/2; ist das Peptid Ikaros-Isoform 5.
• In anderen bevorzugten Ausführungsformen: schließt das Peptid weiterhin ein viertes Ikaros-Exon ein; ist das vierte Exon eines von E1/2, E3, E4, E5, E6 oder E7; ist das erste Exon E7, das zweite Exon E6, das dritte Exon E4 und das vierte Exon E1/2; ist das erste Exon E7, das zweite Exon E4, das dritte Exon E3 und das vierte Exon E1/2; ist das Peptid Ikaros-Isoform 3 oder 4.
• In anderen bevorzugten Ausführungsformen: schließt das Peptid weiterhin ein fünftes Ikaros-Exon ein; ist das fünfte Exon eines von E1/2, E3, E4, E5, E6 oder E7; ist das erste Exon E7, ist das zweite Exon E6, das dritte Exon E5, das vierte Exon E4 und das fünfte Exon E1/2; ist das Peptid Ikaros-Isoform 2.
• In anderen bevorzugten Ausführungsformen: schließt das Peptid weiterhin ein sechstes Ikaros-Exon ein; ist das sechste Exon eines von E1/2, E3, E4, E5, E6 oder E7; ist das erste Exon E7, das zweite Exon E6, das dritte Exon E5, das vierte Exon E4 das fünfte Exon E3 und das sechste Exon E1/2; ist das Peptid Ikaros-Isoform 1.
• In bevorzugten Ausführungsformen: ist die Sequenz des Ikaros-Exons die gleiche wie die von einem natürlich vorkommenden Ikaros-Exon oder einem Fragment davon mit Ikaros-Aktivität; ist die Aminosäuresequenz des Ikaros-Exons derart, dass eine Nukleinsäuresequenz, welche für sie codiert, mindestens zu 85%, mehr bevorzugt mindestens zu 90%, noch bevorzugter mindestens zu 95% und am meisten bevorzugt mindestens zu 98 bis 99% homolog ist zu DNS, welche ein natürlich vorkommendes Ikaros-Exon codiert oder ein Fragment davon mit Ikaros-Aktivität, z. B. Ikaros-Exon-codierende DNS von SEQ ID NO: 2 oder SEQ ID NO:3; ist die Aminosäuresequenz des Ikaros-Exons derart, dass eine Nukleinsäuresequenz, welche für sie codiert, bei hoher oder niedriger Stringenz mit einer Nukleinsäure hybridisiert, welche ein natürlich vorkommendes Ikaros-Exon codiert oder ein Teilstück davon mit Ikaros-Aktivität, z. B. ein Ikaros-Exon mit der gleichen Aminosäuresequenz wie ein Ikaros-Exon von SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3 oder SEQ ID NO: 5; hat die Aminosäuresequenz des Ikaros-Exons eine Länge von mindestens 30, mehr bevorzugt mindestens 40, mehr bevorzugt mindestens 50 und am meisten bevorzugt mindestens 60, 80, 100 oder 200 Aminosäurereste; ist die codierte Ikaros-Aminosäuresequenz mindestens zu 50%, mehr bevorzugt zu 60%, mehr bevorzugt zu 70%, mehr bevorzugt zu 80%, mehr bevorzugt zu 90% und am meisten bevorzugt zu 95% so lang wie ein natürlich vorkommendes Ikaros-Exon oder ein Fragment davon mit Ikaros-Aktivität; hat das Ikaros-Exon die gleiche Länge wie ein natürlich vorkommendes Ikaros-Exon; ist die Aminosäuresequenz vom Ikaros-Exon mindestens zu 80%, mehr bevorzugt mindestens zu 85%, noch bevorzugter mindestens zu 90%, noch bevorzugter mindestens zu 95% und am meisten bevorzugt mindestens zu 98 oder 99% homolog zu einer natürlich vorkommenden Ikaros-Exon-Sequenz oder einem Fragment davon mit Ikaros-Aktivität, z. B. einer Ikaros-Exon-Sequenz von SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3 oder SEQ ID NO: 5; ist die Aminosäuresequenz des Ikaros-Exons die gleiche wie die eines natürlich vorkommenden Ikaros-Exons oder eines Fragmentes der Sequenz davon, z. B. eines Ikaros-Exons beschrieben in SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3 oder SEQ ID NO: 5; und hat das Peptid Ikarospeptid-Aktivität.
• In bevorzugten Ausführungsformen: sind die Exons im Peptid in der gleichen relativen linearen Reihenfolge angeordnet wie in einer natürlich vorkommenden Isoform, z. B. in Ikaros-Isoform 1, z. B. ist in einem Peptid mit den Exons E3 und E7 E3 N-terminal zu E7 lokalisiert; ist die lineare Anordnung der Exons verschieden von der, die in einer natürlich vorkommenden Isoform, z. B. in Ikaros-Isoform 1, vorkommt, z. B. ist in einem Peptid mit den Exons E3, E5 und E7 in Richtung N-terminales zu C-terminalem Ende die Anordnung E5, E3, E7; unterscheiden sich die Exons im Peptid in einem oder mehreren Merkmalen wie Zusammensetzung (d. h. welche Exons vorhanden sind), lineare Anordnung oder Anzahl (d. h. wie viele Exons vorhanden sind und wie oft ein jeweiliges Exon vorhanden ist) von einer natürlich vorkommenden Ikaros-Isoform, z. B. von Ikaros-Isoform 1, 2, 3, 4 oder 5.
• In einem anderen Aspekt weist die Erfindung eine DNS auf, vorzugsweise eine gereinigte DNS, welche eine DNS-Sequenz einschließt (oder daraus besteht), welche für ein Ikarospeptid codiert, z. B. ein Ikarospeptid mit Ikaros-Aktivität, z. B. Ikaros-Isoform 1, 2, 3, 4 oder 5. In bevorzugten Ausführungsformen: ist die Sequenz des codierten Ikarospeptids die gleiche wie die Sequenz eines natürlich vorkommenden Ikarospeptids oder eines Fragments davon mit Ikaros-Aktivität; ist die DNS-Sequenz mindestens zu 85%, mehr bevorzugt mindestens zu 90%, noch bevorzugter mindestens zu 95% und am meisten bevorzugt mindestens zu 98 oder 99% homolog zu DNS, welche ein natürlich vorkommendes Ikarospeptid codiert oder ein Fragment davon mit Ikaros-Aktivität; z. B. homolog zu DNS von SEQ ID NO: 2 oder SEQ ID NO: 3; ist die Aminosäuresequenz des codierten Peptids so, dass sie durch eine Nukleinsäure codiert werden kann, welche unter hoch oder niedrig stringenten Bedingungen mit einer Nukleinsäure, welche ein Peptid mit der gleichen Aminosäuresequenz codiert wie das Peptid von SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3 oder SEQ ID NO: 5, hybridisiert; hat das codierte Peptid eine Länge von mindestens 30, mehr bevorzugt mindestens 40, mehr bevorzugt mindestens 50 und am meisten bevorzugt mindestens 60, 80, 100 oder 200 Aminosäureresten; ist das codierte Peptid mindestens zu 50%, mehr bevorzugt mindestens zu 60%, mehr bevorzugt zu 70%, mehr bevorzugt zu 80%, mehr bevorzugt zu 90% und am meisten bevorzugt zu 95% so lang wie ein natürlich vorkommendes Ikaros-Peptid oder ein Fragment davon mit Ikaros-Aktivität; hat das codierte Peptid die gleiche Länge wie ein natürlich vorkommendes Ikaros-Peptid oder ein Fragment davon mit Ikaros-Aktivität; ist das codierte Peptid mindestens zu 80%, mehr bevorzugt mindestens zu 85%, noch bevorzugter mindestens zu 90%, noch bevorzugter mindestens zu 95% und am meisten bevorzugt mindestens zu 98 oder 99% homolog zu einer Aminosäuresequenz, welche die gleiche ist wie ein natürlich vorkommendes Ikaros-Peptid oder ein Fragment davon mit Ikaros-Aktivität, z. B. die Peptidsequenz von SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3 oder SEQ ID NO:5; ist auch die Aminosäuresequenz des Peptids die gleiche wie die Sequenz eines natürlich vorkommenden Ikaros-Peptids oder eines Fragments davon mit Ikaros-Aktivität, z. B. die in SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3 oder SEQ ID NO: 5 beschriebene Sequenz.
• In einem anderen Aspekt weist die Erfindung eine DNS auf vorzugsweise eine gereinigte DNS, welche eine Sequenz einschließt (oder aus ihr besteht), die ein Peptid von 20 oder mehr Aminosäuren Länge codiert, wobei das Peptid mindestens 90% Homologie hat zu einer Aminosäuresequenz, welche die gleiche ist wie ein natürlich vorkommendes Ikaros-Peptid, z. B. die Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3 oder SEQ ID NO: 5. In bevorzugten Ausführungsformen: codiert die gereinigte DNS: für ein Peptid, welches eine Länge von mindestens 30, mehr bevorzugt mindestens 40, mehr bevorzugt mindestens 50 und am meisten bevorzugt mindestens 60, 80, 100 oder 200 Aminosäureresten hat; ist das codierte Peptid mindestens zu 50%, mehr bevorzugt mindestens zu 60%, mehr bevorzugt zu 70%, mehr bevorzugt zu 80%, mehr bevorzugt zu 90% und am meisten bevorzugt zu 95% so lang wie ein natürlich vorkommendes Ikaros-Peptid oder ein Fragment davon mit Ikaros-Aktivität; ist das codierte Peptid von der gleichen Länge wie ein natürlich vorkommendes Ikaros-Peptid; ein Peptid, welches mindestens zu 80%, mehr bevorzugt mindestens zu 85%, noch bevorzugter mindestens zu 90%, noch bevorzugter mindestens zu 95% und am meisten bevorzugt mindestens zu 98 oder 99% homolog ist zu einer Aminosäuresequenz, welche die gleiche ist wie ein natürlich vorkommendes Ikaros-Peptid oder ein Fragment davon mit Ikaros-Aktivität, z. B. wie die Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3 oder SEQ ID NO: 5; und ein Peptid mit Ikaros-Aktivität, In einem anderen Aspekt weist die Erfindung eine DNS auf, vorzugsweise eine gereinigte DNS, welche eine DNS-Sequenz einschließt (oder daraus besteht), die bei hoher oder niedriger Stringenz mit einer Nukleinsäure hybridisiert, welche für ein Peptid codiert mit der gleichen Aminosäuresequenz wie ein natürlich vorkommendes Ikaros-Peptid, z. B. das Peptid von SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3 oder SEQ ID NO: 5. In bevorzugten Ausführungsformen: ist die DNS-Sequenz mindestens zu 85%, mehr bevorzugt mindestens zu 90%, noch mehr bevorzugt mindestens zu 95% und am meisten bevorzugt mindestens zu 98 oder 99% homolog zu DNS, welche für ein natürlich vorkommendes Ikaros-Peptid codiert oder ein Fragment davon mit Ikaros-Aktivität, z. B. zu DNS von SEQ ID NO: 2 oder SEQ ID NO: 3; codiert die gereinigte DNS für ein Peptid von mindestens 30, mehr bevorzugt mindestens 40, mehr bevorzugt mindestens 50 und am meisten bevorzugt mindestens 60, 80, 100 oder 200 Aminosäureresten Länge; ist das codierte Peptid mindestens zu 50%, mehr bevorzugt mindestens zu 60%, mehr bevorzugt zu 70%, mehr bevorzugt zu 80%, mehr bevorzugt zu 90% und am meisten bevorzugt zu 95% so lang wie ein natürlich vorkommendes Ikaros-Peptid oder ein Fragment davon mit Ikaros-Aktivität; ist das codierte Peptid von der gleichen Länge wie ein natürlich vorkommendes Ikaros-Peptid; codiert die gereinigte DNS für ein Peptid , welches mindestens zu 80%, mehr bevorzugt mindestens zu 85%, noch bevorzugter mindestens zu 90%, noch bevorzugter mindestens zu 95% und am meisten bevorzugt mindestens zu 98 oder 99% homolog ist zu einer Aminosäuresequenz, welche die gleiche ist wie ein natürlich vorkommendes Ikaros-Peptid, z. B. die Aminosäuresequenz SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3 oder SEQ ID NO: 5; codiert die gereinigte DNS für ein Peptid mit der gleichen Aminosäuresequenz, oder einem Fragment der Aminosäuresequenz, beschrieben in SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3 oder SEQ ID NO: 5.
• In einem anderen Aspekt schließt die Erfindung einen Vektor ein, welcher DNS der Erfindung einschließt, vorzugsweise eine gereinigte DNS der Erfindung, welche für ein Peptid der Erfindung codiert.
• Die Erfindung schließt ebenfalls ein: eine kultivierte Zelle oder eine hämatopoetische Stammzelle, welche gereinigte DNS, codierend für ein Ikaros-Protein, enthält; eine Zelle mit der Fähigkeit, ein Ikaros-Protein zu exprimieren; eine Zelle mit der Fähigkeit, einen Anstoß zu geben hin zu einem transgenen Tier oder einer homogenen Population hämatopoetischer Zellen, z. B. lymphoider Zellen, z. B. T-Zellen; eine homogene Population von Zellen, von denen jede gereinigte DNS, codierend für ein Ikaros-Protein, einschließt; und ein Verfahren zur Herstellung eines Peptids der Erfindung einschließlich Kultivieren einer Zelle, welche eine DNS, vorzugsweise eine gereinigte DNS; der Erfindung einschließt in einem Medium zur Expression des Peptids.
• In einem anderen Aspekt weist die Erfindung ein Peptid der Erfindung auf, vorzugsweise ein reines Peptid der Erfindung, z.B.: ein Peptid mit Ikaros-Aktivität, z. B. Ikaros-Isoform 1, 2, 3, 4 oder 5. In bevorzugten Ausführungsformen: ist die Sequenz des codierten Ikaros-Peptids die gleiche wie die Sequenz von einem natürlich vorkommenden Ikaros-Peptid oder einem Fragment davon mit Ikaros-Aktivität; ist die Sequenz vom Peptid so, dass sie codiert wird von einer DNS-Sequenz, welche mindestens zu 85%, mehr bevorzugt mindestens zu 90%, noch bevorzugter mindestens zu 95% und am meisten bevorzugt mindestens zu 98 oder 99% homolog ist zu DNS, welche ein natürlich vorkommendes Ikaros-Peptid codiert oder ein Fragment davon mit Ikaros-Aktivität; z. B. homolog zu DNS von SEQ ID NO: 2 oder SEQ ID NO:3; ist die Aminosäuresequenz von dem Peptid mit Ikaros-Aktivität so, dass sie durch eine Nukleinsäure codiert werden kann, welche unter Bedingungen von hoher oder niedriger Stringenz mit einer Nukleinsäure hybridisiert, welche für ein Peptid mit der gleichen Aminosäuresequenz wie das Peptid von SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3 oder SEQ ID NO: 5 codiert; hat das Peptid eine Länge von mindestens 30, mehr bevorzugt mindestens 40, mehr bevorzugt mindestens 50 und am meisten bevorzugt mindestens 60, 80, 100 oder 200 Aminosäureresten; ist das Peptid mindestens zu 50%, mehr bevorzugt mindestens zu 60%, mehr bevorzugt zu 70%, mehr bevorzugt zu 80%, mehr bevorzugt zu 90% und am meisten bevorzugt zu 95% so lang wie ein natürlich vorkommendes Ikaros-Peptid oder ein Fragment davon mit Ikaros-Aktivität; ist das Peptid von der gleichen Länge wie ein natürlich vorkommendes Ikaros-Peptid oder ein Fragment davon mit Ikaros-Aktivität; ist das Peptid mindestens zu 80%, mehr bevorzugt mindestens zu 85%, noch bevorzugter mindestens zu 90%, noch bevorzugter mindestens zu 95% und am meisten bevorzugt mindestens zu 98 oder 99% homolog zu einer Aminosäuresequenz, welche die gleiche ist wie ein natürlich vorkommendes Ikaros-Peptid oder ein Fragment davon mit Ikaros-Aktivität, z. B. die Peptid-Sequenz von SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3 oder SEQ ID NO: 5; und ist die Aminosäuresequenz des Peptids die gleiche wie die Sequenz eines natürlich vorkommenden Ikaros-Peptids oder eines Fragments davon mit Ikaros-Aktivität, z. B. die Sequenz, beschrieben in SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3 oder SEQ ID NO: 5.
• In bevorzugten Ausführungsformen wird ein Peptid der Erfindung, vorzugsweise ein gereinigtes Peptid der Erfindung, produziert durch Expression einer DNS der Erfindung, vorzugsweise einer gereinigten DNS der Erfindung.
• Die Erfindung schließt ebenfalls eine reine Präparation eines Antikörpers, vorzugsweise eines monoklonalen Antikörpers, gerichtet gegen ein Ikaros-Protein ein; eine therapeutische Zusammensetzung, welche ein Ikaros-Protein und einen pharmazeutisch verträglichen Träger einschließt; eine therapeutische Zusammensetzung, welche eine gereinigte DNS der Erfindung und einen pharmazeutisch verträglichen Träger einschließt.
• In einem anderen Aspekt erlaubt die Erfindung ein Verfahren zur Behandlung eines Tieres, z.B. eines Menschen, einer Maus, eines transgenen Tieres oder eines Tiermodells für eine Störung des Immunsystems, z. B. für eine T- oder B-Zell-bezogene Störung, z. B. einer nackten Maus oder einer SCID-Maus, wobei das Verabreichen einer therapeutisch effektiven Menge eines Ikaros-Peptids an das Tier eingeschlossen ist.
• In einem anderen Aspekt erlaubt die Erfindung ein Verfahren zur Behandlung eines Tieres, z. B. eines Menschen, einer Maus, eines transgenen Tieres oder eines Tiermodells für eine Störung des Immunsystems, z. B. für eine T- oder B-Zell-bezogene Störung, z. B. einer nackten Maus oder einer SCID-Maus, wobei das Verabreichen von ausgewählten Zellen, z. B. in vitro ausgewählt, zur Expression eines Ikaros-Genproduktes, z. B. hämatopoetische Stammzellen, z. B. Zellen, transformiert mit Ikarospeptid-codierender DNS, z. B. hämatopoetische Stammzellen, transformiert mit Ikarospeptid-codierender DNS, an das Tier eingeschlossen ist.
• In bevorzugten Ausführungsformen: werden die Zellen von dem Tier genommen, dem sie auch verabreicht werden; werden die Zellen von einem Tier genommen, welches MHC-passend zu dem Tier ist, dem sie verabreicht werden; werden die Zellen von einem Tier genommen, welches syngen mit dem Tier ist, dem sie verabreicht werden; werden die Zellen von einem Tier genommen, welches von der gleichen Spezies ist wie das Tier, dem sie verabreicht werden.
• In einem anderen Aspekt erlaubt die Erfindung ein Verfahren zur Behandlung eines Tieres, z. B. eines Menschen, einer Maus, eines transgenen Tieres oder eines Tiermodells für eine Störung des Immunsystems, z. B. für eine T- oder B-Zell-bezogene Störung, z. B. einer nackten Maus oder einer SCID-Maus, einschließend das Verabreichen einer Nukleinsäure, welche für ein Ikarospeptid codiert, an das Tier und die Expression der Nukleinsäure.
• In einem anderen Aspekt erlaubt die Erfindung ein Verfahren zur Auswertung des Effektes einer Behandlung, z. B. einer Behandlung geplant zur Förderung oder Hemmung der Hämatopoese, einschließend die Ausführung der Behandlung und Auswertung des Effektes der Behandlung auf die Expression des Ikaros-Gens.
• In bevorzugten Ausführungsformen wird die Behandlung verabreicht: einem Tier, z. B. einem Menschen, einer Maus, einem transgenen Tier oder einem Tiermodell für eine Störung des Immunsystems, z. B. für eine T- oder 8-Zell-bezogene Störung, z. B. einer nackten Maus oder einer SCID-Maus, oder einer Zelle, z. B. einer kultivierten hämatopoetischen Stammzelle.
• In einem anderen Aspekt erlaubt die Erfindung ein Verfahren zur Bestimmung, ob ein Individuum, z. B. ein Mensch, ein Risiko hat für eine Störung bezogen auf Fehlexpression des Ikaros-Gens, z. B. leukämische Störung oder eine andere Störung des Immunsystems, z. B. eine Immundefizienz, oder eine T- oder B-Zell-bezogene Störung, z. B. eine Störung charakterisiert durch eine Knappheit an T- oder B-Zellen, einschließend die Untersuchung des Individuums auf die Expression des Ikaros-Gens, wobei Nicht-Wildtyp-Expression oder Fehlexpression ein Risiko anzeigt.
• In einem anderen Aspekt weist die Erfindung ein Verfahren auf zur Bestimmung, ob ein Individuum, z. B. ein Mensch, das Risiko hat für eine Störung bezogen auf Fehlexpression des Ikaros-Gens, z. B. eine leukämische Störung oder eine andere Störung des Immunsystems, z. B. eine Immundefizienz, oder eine T- oder B-Zell-bezogene Störung, z. B. eine Störung charakterisiert durch eine Knappheit an Toder B-Zellen, einschließend das Bereitstellen einer Nukleinsäureprobe vom Individuum und Bestimmung, ob die Struktur eines Ikaros-Gen-Allels des Individuums sich vom Wildtyp unterscheidet.
• In bevorzugten Ausführungsformen: schließt die Bestimmung ein, zu bestimmen, ob ein Ikaros-Gen-Allel des Individuums ein starkes chromosomales Rearrangement aufweist; schließt die Bestimmung ein, das Ikaros-Gen des Individuums zu sequenzieren.
• In einem anderen Aspekt erlaubt die Erfindung ein Verfahren zur Auswertung eines Tier- oder Zell-Modells für eine Immunstörung, z. B. eine T-Zell-bezogene Störung, z. B. eine Störung charakterisiert dwch eine Knappheit an T- oder B-Zellen, einschließlich Bestimmung, ob das Ikaros-Gen im Tier- oder Zell-Modell auf einem vorherbestimmten Spiegel exprimiert wird oder ob das Ikaros-Gen fehl-exprimiert wird. In bevorzugten Ausführungsformen: ist der vorherbestimmte Spiegel niedriger als der Spiegel in einem Wildtyp oder normalen Tier; ist der vorherbestimmte Spiegel höher als der Spiegel in einem Wildtyp oder normalen Tier; oder ist das Muster der Isoform-Expression verändert gegenüber dem Wildtyp.
• In einem anderen Aspekt weist die Erfindung einen transgenen Nager auf, z. B. eine Maus, mit einem Transgen, welches ein Ikaros-Gen oder eine DNS, die für ein Ikaros-Protein codiert, enthält. In bevorzugten Ausführungsformen: schließt das Ikaros-Gen oder die DNS eine Deletion ein, z. B. eine Deletion, teilweise oder vollständig, von einem oder mehreren Ikaros-Exons, z. B. eine Deletion, teilweise oder vollständig, von Exon E7 oder eine Deletion, teilweise oder vollständig, von den Exons E3 oder E4, oder ist auf andere Weise fehlexprimiert.
• In einem anderen Aspekt weist die Erfindung ein Verfahren auf zur Expression eines heterologen Gens, z. B. in einer kultivierten Zelle z. B. einer hämatopoetischen Stammzelle, und schließt ein, das Gen unter Kontrolle eines Ikaros-responsiven Kontrollelementes zu platzieren und das Ikaros-responsive Kontrollelement mit einem Ikaros-Protein in Kontakt zu bringen.
• In bevorzugten Ausführungsformen: schließt das Ikaros-responsive Kontrollelement einen Enhancer ein, z. B. ein δA-Element, ein NFKB-Element oder eine der Ikaros-bindenden Sequenzen, z. B. eine der Consensus-Sequenzen, welche hierin veröffentlicht sind; schließt das Ikaros-responsive Kontrollelement die regulatorische Region des CD3δ-Gens ein; werden das heterologe Gen und das Ikarosresponsive Kontrollelement auf einem Vektor getragen; schließt das Verfahren weiterhin den Schritt ein, eine Zelle zu transformieren mit einem Vektor, welcher ein heterologes Gen unter der Kontrolle eines Ikaros-responsiven Kontrollmittels einschließt; wird das heterologe Gen exprimiert in einer Zelle, welche normalerweise ein Ikaros-Protein einschließt oder exprimiert.
• In einem anderen Aspekt weist die Erfindung ein Verfahren auf zur Expression eines Genes unter der Kontrolle eines Ikaros-responsiven Kontrollelementes in einer Zelle, einschließlich der Verabreichung eines Ikaros-Proteins an die Zelle.
• In bevorzugten Ausführungsformen: schließt das Verfahren weiterhin die Transformation der Zelle mit DNS ein, welche für ein Ikaros-Protein codiert, um ein Ikaros-Protein zu liefern; ist das Gen ein heterologes Gen.
• In einem anderen Aspekt erlaubt die Erfindung ein Verfahren zur Behandlung eines Tieres, z. B. eines Menschen, einer Maus, eines transgenen Tieres, oder eines Tiermodells für eine Störung des Nervensystems, z. B. einer Störung des Corpus striatum, z. B. Alzheimer-Krankheit, Störung des Immunsystems, einschließlich der Verabreichung einer therapeutisch effektiven Menge von Ikaros-Protein an das Tier.
• In einem anderen Aspekt erlaubt die Erfindung ein Verfahren zur Behandlung eines Tieres, z. B. eines Menschen, einer Maus, eines transgenen Tieres, oder eines Tiermodells für eine Störung des Nervensystems, z. B. eine Störung des Corpus striatum, z. B. Alzheimer-Krankheit, einschließlich der Verabreichung von ausgewählten Zellen, z. B. ausgewählt in vitro zur Expression eines Produktes des Ikaros-Gens, z. B. hämatopoetische Stammzellen, z. B. Zellen transformiert mit Ikarosprotein-codierender DNS, z. B. hämatopoetische Stammzellen transformiert mit Ikarosprotein-codierender DNS, an das Tier.
• In bevorzugten Ausführungsformen: werden die Zellen von dem Tier genommen, dem sie verabreicht werden; werden die Zellen von einem Tier genommen, welches MHC-passend zu dem Tier ist, dem sie verabreicht werden; werden die Zellen von einem Tier genommen, welches syngen mit dem Tier ist; dem sie verabreicht werden; werden die Zellen von einem Tier genommen, welches von der gleichen Spezies ist wie das Tier, dem sie verabreicht werden.
• In einem anderen Aspekt erlaubt die Erfindung ein Verfahren zur Behandlung eines Tieres, z. B. eines Menschen, einer Maus, eines transgenen Tieres, oder eines Tiermodells für eine Störung des Nervensystems, z. B. eine Störung des Corpus striatum, z. B. Alzheimer-Erkrankung, einschließlich Verabreichung einer Nukleinsäure, welche für ein Ikarospeptid codiert, an das Tier und Expression der Nukleinsäure.
• In einem anderen Aspekt erlaubt die Erfindung ein Verfahren zur Auswertung des Effektes einer Behandlung einer Störung des Nervensystems, z. B. einer Störung des Corpus striatum, z. B. Alzheimer-Krankheit, einschließlich der Verabreichung der Behandlung und der Auswertung des Effektes der Behandlung auf die Expression des Ikaros-Gens.
• In bevorzugten Ausführungsformen wird die Behandlung verabreicht: einem Tier, z. B. einem Menschen, einer Maus, einem transgenen Tier, oder einem Tiermodell für eine Störung des Nervensystems, z. B. einer Störung des Corpus striatum, z. B. Alzheimer-Krankheit, oder einer Zelle, z. B. einer kultivierten hämatopoetischen Stammzelle.
• In einem anderen Aspekt erlaubt die Erfindung ein Verfahren zur Bestimmung, ob ein Individuum, z. B. ein Mensch, das/ein Risiko hat für eine Störung bezogen auf Fehlexpression des Ikaros-Gens, z. B. eine Störung des Nervensystems, z. B. eine Störung des Corpus striatum, z. B. Alzheimer-Krankheit, einschließlich Untersuchung des Individuums auf Expression des Ikaros-Gens, wobei Nicht-Wildtyp-Expression oder Fehlexpression ein Risiko anzeigt.
• In einem anderen Aspekt weist die Erfindung ein Verfahren auf zur Bestimmung, ob ein Individuum, z. B. ein Mensch, ein Risiko hat für eine Störung bezogen auf Fehlexpression des Ikaros-Gens, z. B. eine Störung des Nervensystems, z.B, eine Störung des Corpus striatum, z. B. Alzheimer-Krankheit, einschließlich dem Liefern einer Nukleinsäure-Probe des Individuums und Bestimmung, ob die Struktur eines Ikaros-Gen-Allels des Individuums sich vom Wildtyp unterscheidet.
• In bevorzugten Ausführungsformen: schließt die Bestimmung ein, zu bestimmen, ob ein Ikaros-Genallel des Individuums ein starkes chromosomales Rearrangement aufweist; schließt die Bestimmung das Sequenzieren des Ikaros-Gens des Individuums ein.
• In einem anderen Aspekt erlaubt die Erfindung ein Verfahren zur Auswertung eines Tier- oder Zellmodells für eine Störung des Nervensystems, z. B. eine Störung des Corpus striatum, z. B.
• Alzheimer-Krankheit, einschließlich der Bestimmung, ob das Ikaros-Gen im Tier- oder Zellmodell auf einem vorherbestimmten Spiegel exprimiert wird oder ob das Ikaros-Gen fehlexprimiert wird.
• In bevorzugten Ausführungsformen: ist der vorherbestimmte Spiegel niedriger als der Spiegel in einem Wildtyp oder normalen Tier; ist der vorherbestimmte Spiegel höher als der Spiegel in einem Wildtyp oder normalen Tier.
• In einem anderen Aspekt weist die Erfindung ein Verfahren auf zur Hemmung einer Interaktion, z. B. der Bindung zwischen einem Protein, z. B. einer ersten Ikaros-Isoform, und einer DNS-Sequenz, z. B. einer DNS-Sequenz unter der Kontrolle einer δA-Sequenz, einer NKFB-Sequenz, einer Sequenz, welche einem Ikaros-bindenden Oligonukleotid, das hierin beschrieben wird, entspricht, oder einer Stelle, welche vorhanden ist in der Kontrollregion eines auf Lymphozyten-beschränkten Gens, z. B. eines der TCR-α-, -β- oder -δ-, CD3-δ-, -ε-, -γ-Gene, des SL3-Gens oder des HIV-LTR-Gens. Die Verfahren schließen das in Kontakt bringen der DNS-Sequenz mit einer effektiven Menge einer zweiten Ikaros-Isoform ein, oder mit einem DNS-bindenden Fragment einer Ikaros-Isoform, z. B. der zweiten Ikaros-Isoform.
• In bevorzugten Ausführungsformen zeigt das Fragment Deletion eines gesamten oder eines Teils eines Ikaros-Exons, z. B. eines gesamten oder eines Teiles von E1/2, E3, E4, E5, E6 oder E7.
• In einem anderen Aspekt weist die Erfindung ein Verfahren auf zur Hemmung einer Interaktion, z. B. der Bindung zwischen einem Protein, z. B. einer ersten Ikaros-Isoform, und einer DNS-Sequenz, z. B. einer δA-Sequenz, einer NKFB-Sequenz, einer Sequenz, welche einem Ikaros-bindenden Oligonukleotid, das hierin beschrieben ist, entspricht, oder einer Stelle, welche vorhanden ist in der Kontroll-Region eines auf Lymphozyten-beschränkten Gens, z. B. eines der TCR-α-, -β- oder -δ-, CD3-δ-, -ε-, -γ-Gene, des SL3-Gens oder des HIV-LTR-Gens. Die Verfahren schließen das in Kontakt bringen des Proteins mit einer effektiven Menge eines Ikaros-bindenden Oligonukleotids ein. In bevorzugten Ausführungsformen schließt das Oligonukleotid eine Sequenz ein, ausgewählt aus IK-BS1, IK-BS2, IK-BS3, IK-BS4 oder IK-BS5.
• In bevorzugten Ausführungsformen: bindet das Oligonukleotid bevorzugt an eine erste Ikaros-Isoform; bindet das Oligonukleotid bevorzugt an eine zweite Ikaros-Isoform.
• In einem anderen Aspekt schließt die Erfindung ein Ikaros-bindendes Oligonukleotid ein, z. B. IK-BS1, IK-BS2, IK-BS3, IK-BS4 oder IK-BS5. In bevorzugten Ausführungsformen enthält das Oligonukleotid mindestens zwei, drei, vier oder fünf Kopien von einer der Ikaros-bindenden Oligonukleotid-Sequenzen, die hierin veröffentlicht werden.
• In einem anderen Aspekt weist die Erfindung ein Verfahren auf zur Verminderung der Bindung einer ersten Ikaros-Isoform an die Ziel-DNS. Das Verfahren schließt das in Kontakt bringen der Ziel-DNS mit einer effektiven Menge einer zweiten Ikaros-Isoform ein oder mit einem DNS-bindenden Fragment der zweiten Isoform.
• Ein heterologes Gen, wie hierin verwendet, ist ein Gen, welches normalerweise nicht unter der Kontrolle eines Ikaros-responsiven Kontrollelementes ist.
• Ein Ikaros-responsives Kontrollelement, wie hierin verwendet, ist eine Region der DNS, welche, falls sie stromaufwärts oder stromabwärts von einem Gen vorhanden ist, zu einer Regulation führt, z. B. erhöhter Transkription des Gens bei Anwesenheit eines Ikaros-Proteins.
• Gereinigte DNS ist DNS, bei welcher zwei codierende Sequenzen nicht unmittelbar aneinander grenzen , welche unmittelbar aneinander grenzen (d. h. eines am 5'-Ende und eines am 3'-Ende) im natürlich vorkommenden Genom des Organismus, von dem die DNS der Erfindung herstammt. Der Begriff schließt deshalb ein, z. B. eine rekombinante DNS, welche in einen Vektor aufgenommen wird; in ein autonom replizierendes Plasmid oder Virus; oder in die genomische DNS eines Prokaryonten oder Eukaryonten, oder welche als ein separates Molekül existiert (z. B. eine cDNS oder ein genomisches DNS-Fragment, hergestellt durch PCR oder Behandlung mit Restriktions-Endonuklease) unabhängig von anderen DNS-Sequenzen. Er schließt auch eine rekombinante DNS ein, welche Teil eines Hybrid-Gens ist, das für eine zusätzliche Polypeptid-Sequenz codiert.
• Homolog bezieht sich auf die Sequenzähnlichkeit zwischen zwei Polypeptidmolekülen oder zwischen zwei Nukleinsäuremolekülen. Wenn eine Position in beiden der zwei verglichenen Sequenzen von der gleichen monomeren Basen- oder Aminosäure-Untereinheit besetzt ist, z. B. wenn eine Position in jeder der beiden DNS-Moleküle durch ein Adenin besetzt ist, dann sind die Moleküle an dieser Position homolog. Die Homologie zwischen zwei Sequenzen ist eine Funktion der Anzahl der übereinstimmenden oder homologen Positionen, die von den beiden Sequenzen geteilt werden. Wenn beispielsweise 6 von 10 der Positionen in zwei Sequenzen übereinstimmend oder homolog sind, dann sind die zwei Sequenzen zu 60% homolog. Als ein Beispiel teilen die DNS-Sequenzen ATTGCC und TATGGC eine Homologie von 50%.
• Ein Transgen ist definiert als ein Stück DNS, welches durch einen Kunstgriff in eine Zelle eingesetzt wird und ein Teil wird des Genoms vom Tier, welches sich aus dieser Zelle ganz oder zum Teil entwickelt. Solch ein Transgen kann teilweise oder vollständig heterolog sein zum transgenen Tier.
• Ein transgenes Tier, z. B. eine transgene Maus, ist ein Tier mit Zellen, die ein Transgen enthalten, wobei das Transgen in das Tier eingeführt wurde oder in einen Vorfahren des Tieres in einem pränatalen z. B. einem embryonalen Stadium.
• Eine Enhancer-Region ist definiert als eine DNS-Sequenz agierend als cis-Element und befähigt zur Erhöhung der Transkription von einem Promotor, welcher entweder stromaufwärts oder stromabwärts der Enhancer-Region lokalisiert ist. Solche DNS-Sequenzen sind Fachleuten auf dem Gebiet der eukaryontischen Genexpression gut bekannt.
• Eine reine Präparation eines Peptids ist eine Präparation, welche frei ist von den Peptidn, mit denen es natürlicherweise in einer Zelle auftritt. Eine reine Präparation eines nicht natürlich vorkommenden Peptids enthält mindestens 10 Gewichtsprozent des interessierenden Peptids.
• Fehlexpression, wie hierin verwendet, bezieht sich auf ein Muster der Genexpression, das nicht das Muster des Wildtyps ist. Sie schließt ein: Expression auf Spiegeln, die nicht dem Wildtyp-Spiegel entsprechen, d. h. Über- oder Unterexpression; ein Expressionsmuster, das sich vom Wildtyp unterscheidet, bezüglich dem Zeitpunkt oder dem Stadium, zu welchem das Gen exprimiert wird; z. B. erhöhte oder erniedrigte Expression (im Vergleich zum Wildtyp) zu einer vorherbestimmten Entwicklungsperiode oder einem vorherbestimmten Entwicklungsstadium; ein Expressionsmuster, das sich vom Wildtyp unterscheidet bezüglich der Gewebespezifität der Expression, z. B. erhöhte oder erniedrigte Expression (im Vergleich zum Wildtyp) in einem vorherbestimmten Zelltyp oder Gewebetyp; ein Expressionsmuster, das sich vom Wildtyp unterscheidet bezüglich der Größe, der Aminosäuresequenz, post-translationaler Modifikation oder einer biologischen Aktivität eines Ikaros-Genproduktes; ein Expressionsmuster, das sich vom Wildtyp unterscheidet bezüglich des Effektes eines Umgebungs-Stimulus oder extrazellulären Stimulus auf die Genexpression, z. B. ein Muster erhöhter oder erniedrigter Expression (im Vergleich zum Wildtyp) in der Gegenwart eines Anstiegs oder einer Verminderung in der Stärke des Stimulus; oder ein Expressionsmuster von Isoformen, das sich vom Wildtyp unterscheidet.
• Die Begriffe Peptid, Protein und Polypeptid werden hierin untereinander austauschbar verwendet.
• Ein Peptid hat Ikaros-Aktivität, wenn es eine oder mehrere der folgenden Eigenschaften hat: Die Fähigkeit, Transkription einer DNS-Sequenz zu stimulieren, welche unter der Kontrolle steht von entweder einem δA-Element, einem NFKB-Element oder einer der Ikaros-bindenden Oligonukleotid-Consensus-Sequenzen, die hierin veröffentlicht sind; die Fähigkeit, jeweils an ein δA-Element, ein NFKB-Element oder eine der Ikaros-bindenden Oligonukleotid-Consensus-Sequenzen, die hierin veröffentlicht sind, zu binden; oder die Fähigkeit, die Bindung von einer natürlich vorkommenden Ikaros-Isoform jeweils an ein δA-Element, ein NFKB-Element oder eine der Ikaros-bindenden Oligonukleotid-Consensus-Sequenzen, die hierin veröffentlicht sind, kompetitiv zu hemmen. Ein Ikaros-Peptid ist ein Peptid mit Ikaros-Aktivität.
• Die Erfindung ist verwendbar zur Identifikation von T-Zellen; zur Identifikation von Zellen, welche sich zu T-Zellen entwickeln können; und im Allgemeinen bei der Untersuchung der Hämatopoese, z. B. bei der Differenzierung von hämatopoetischen Vorläufer-Stammzellen zu T-Zellen. Die Rolle des Ikaros-Gens und seiner Produkte kann studiert werden z. B. in Zellen, z. B. kultivierten Zellen, die transformiert wurden mit dem Ikaros-Gen oder Fragmenten davon, oder in transgenen Tieren. Die Erfindung ist auch verwendbar: zur Förderung der Expression von Markern der Zellabstammungslinie, z. B. CD3δ-Gene; zur Steigerung der Fähigkeit einer Zelle, z. B. einer hämatopoetischen Stammzelle, sich zu einer T-Zelle zu entwickeln; für die Reihenuntersuchung (Screening) von Individuen auf das Risiko für genetische T-Zell-Störungen, z. B. Leukämie; und zur Behandlung von Immunstörungen (z. B. Immundefekten, z. B. AIDS oder chemisch, durch Arzneimittel oder Bestrahlung induzierten Immundefekten oder Krebsarten, z. B. Leukämie), welche durch eine Knappheit an T-Zellen charakterisiert sind; zur Untersuchung der Struktur und Expression des Ikaros-Gens oder Isoformen des Genproduktes; zur Untersuchung von Unterschieden bei Spezies oder Gewebe bezüglich der Expression des Ikaros-Gens oder seiner Isoformen; zur Untersuchung der Struktur und Funktion von DNS-Bindeproteinen; zu Studien der Struktur und Funktion von Zinkfinger-enthaltenden Proteinen; zur Konstruktion transgener Tiere; zur Hemmung der Bindung von Ikaros an ein Zielmolekül; für Studien der relativen Affinitäten von Ikaros Isoformen zur Ziel-DNS; und zur Suche nach oder Manipulation von Expression von Genen unter der Kontrolle von Ikaros-Isoformen.
• Andere Merkmale und Vorteile der Erfindung werden verdeutlicht durch die folgende Beschreibung und durch die Patentansprüche.
• DETAILLIERTE BESCHREIBUNG
• Die Zeichnungen werden zuerst kurz beschrieben. ZEICHNUNGEN
• 1A ist eine Karte des δA-Elementes vom CD3-Enhancer (SEQ ID NO: 1).
• 1B ist eine Graphik des Beitrages von CRE und der G-Box an der Aktivität des Elementes, wie er durch Expression des tkCAT-Reporter-Gens unter der Kontrolle der Sequenzen von verschiedenen Elementen analysiert wurde. In der linksstehenden Balkengraphik steht der ausgefüllte Balken für das tkcat-Reporter-Gen, der schattierte Balken steht für tkcat3δA, der horizontal linierte Balken steht für tkcat3δAmu1(-CRE) und der punktierte Balken steht für tkcat3δAmu2(-G-Box). In der rechtsstehenden Balkengraphik steht der ausgefüllte Balken für tkcat, der diagonal schraffierte Balken links in der Graphik ist tkcatδehn, der punktierte Balken ist tkcatδenh(-CRE), der diagonal schraffierte Balken weiter rechts ist tkcatδenh(-δA) und der leere Balken steht für tkcatδenh(-G-Box).
• 1C ist eine Graphik vom Effekt der Ikaros-Expression auf die Aktivität des δ-Elementes in Nicht-T-Zellen. In der Balkengraphik steht der ausgefüllte Balken für tkcat, der punktiere Balken steht für tkcat3δA und der schraffierte Balken steht für tkcatδenh.
• 2 ist ein Karte der DNS-Sequenz von einer Ikaros-cDNS einer Maus und die erwünschte davon codierte Aminosäuresequenz (SEQ ID NO: 2).
• 3 ist eine Teilsequenz von einer menschlichen Ikaros-cDNS (SEQ ID NO: 3).
• 4 ist eine Veranschaulichung der Aminosäurezusammensetzung von IK-1-cDNS (SEQ ID NO: 5). IK-1 wird umfasst von allen sechs codierenden Exons (Ex1/2; Ex3; Ex4; Ex5; Ex6 und Ex7). Ein Pfeil zeigt die erste Aminosäure in jedem Exon an.
• 5 ist ein Diagramm der Exon-Verwendung in den cDNS von Ikaros 1–5. Die Nummern der Exons sind an der unteren linken Ecke von jedem Kasten (E x) angegeben. Zink-Finger-Module werden oberhalb der codierenden Exons angezeigt (F x). Die erste Reihe steht für Ikaros 1, die zweite Reihe für Ikaros 2, die dritte Reihe für Ikaros 3, die vierte Reihe für Ikaros 4 und die fünfte Reihe für Ikaros 5.
• 6 ist eine Veranschaulichung der Exon-Organisation am Ikaros-Locus, welche die Primer-Sets 1/2 und 3/4 zeigt, die für Amplifikation der jeweiligen Isoformen verwendet werden. Im Speziellen stellt 6 Oligo 1/2 IK-1/IK-2/IK-4 und Oligo 3/4 IK-1/IK-3/IK-5 dar.
• 7 ist eine Karte der genomischen Organisation des Ikaros-Gens der Maus. Das gesamte Gen hat eine Länge von 80–90 kB. Intron- oder uncharakterisierte DNS wird als eine Linie zwischen 5' und 3' angezeigt. Exons werden als Kästen angezeigt. Die Linien nummeriert mit f2, fl0, f4 und f8 zeigen Phagen-Insertionen an, die der Sequenz unmittelbar darüber entsprechen. Restriktionsstellen werden durch die üblichen Abkürzungen angezeigt.
• 8 ist ein Modell der Kontrolle der Ikaros-Isoform von differentiellen Genexpressionen.
• Th=Thymus; Sp=Milz; E x= Tag der embryonalen Entwicklung; D x=Tag des postnatalen Lebens. Die Säule auf der linken Seite stellt die relative Expression einer Isoform zu einem gegebenen Entwicklungsstadium dar. Offener Balken=Ik-1; horizontale Streifen=Ik-2; diagonale Streifen=Ik-3; und ausgefüllter Balken=Ik-4. Die rechte Seite zeigt die resultierende Reaktivität der Ikaros-Bindestellen zu einem gegebenen Entwicklungsstadium. Helle Balken=Stellen geringer Affnität (Stellen, an denen Isoformen 1, 2, 3 und 4 mit ähnlichen Affinitäten binden); dunkle Balken=Stellen hoher Affinität, welche invertierte oder direkte Sequenzwiederholung (inverted or direct repeat) enthalten (z. B. NFKB-Stellen, Ik1-4 binden mit hoher Affinität); diagonal-schraffierte Balken=Stellen singulär hoher Affinität (Stellen, an denen Ik1 und Ik2 binden aber Ik3 und Ik4 nicht binden, und deshalb die Bindung von Ik-1 und Ik-2 nicht abschwächen).
• IKAROS: EIN „MASTER"-REGULATOR DER HÄMATOPOETISCHEN DIFFERENZIERUNG
• Eine hämatopoetische Stammzelle in der geeigneten Mikroumgebung wird sich festlegen und sich differenzieren in eine von vielen Zellabstammungslinien. Signaltransduktionsmoleküle und Transkriptionsfaktoren, welche an verschiedenen Kontrollpunkten auf diesem Entwicklungsweg einwirken, werden das Zell-Schicksal von diesen frühen Vorläufern spezifizieren. Solche Moleküle werden als „Master"-Regulatoren in der Entwicklung angesehen, aber dienen auch als Marker für die schlecht definierten Stadien der frühen Hämatopoese.
• Studien der transkriptionellen Mechanismen, die Genexpression in T- und B-Zellen unterliegen, identifizierten mehrere transkriptionelle Faktoren, die bei der Lymphozyten-Differenzierung beteiligt sind. Jedoch scheinen manche dieser Gene eine Rolle in mehreren Entwicklungssystemen zu spielen, wie durch ihr nicht restriktives Expressionsmuster beim Erwachsenen und beim sich entwickelnden Embryo bestimmt wurde. Die HMG Box-DNS-Bindeproteine TCF und LEF, welche beim Erwachsenen auf T-Zellen und frühe Lymphozyten beschränkt sind, werden im sich entwickelnden Embryo weit verbreitet exprimiert. Der T-Zellen-spezifische GATA-3-Transkriptionsfaktor wird ebenfalls im frühen Embryo außerhalb des hämatopoetischen Systems exprimiert. Die ets-Familienmitglieder Ets-1 und Elf-1 sind auch weit verbreitet. Zusätzlich wird die Bindungsaffinität und das Transkriptionspotential der meisten dieser Proteine kontrolliert . durch andere gewebsbeschränkte Moleküle. Die ets-Proteine interagieren mit zusätzlichen Faktoren zur Hochaffinitätsbindung an ihre Erkennungssequenzen. TCFI, LEF und Ets-1 müssen mit anderen lymphoid-beschränkten akzessorischen Proteinen interagieren, um Transkription zu aktivieren.
• Auf der Suche nach einem lymphoid-beschränkten transkriptionellen Enhancer, bei Kontrolle der Gen-Expression in frühen T-Zellen, haben wie das Ikaros-Gen isoliert, welches für ein Zinkfinger-DNS-Bindeprotein codiert. Im frühen Embryo wird das Ikaros-Gen in der hämatopoetischen Leber exprimiert, aber von der mittleren bis zur späten Gestation wird dieses auf den Thymus beschränkt. Die einzige andere Stelle im Embryo mit Ikaros-mRNS ist ein kleiner Bereich im Corpus striatum. Beim Erwachsenen wird Ikaros-mRNS nur im Thymus und in der Milz detektiert (Georgopoulos et al., 1992). Das Ikaros-Gen funktioniert bei ektopischer Expression in nicht-lymphoiden Zellen als ein transkriptioneller Enhancer.
• Das Ikaros-Gen spielt eine wichtige Rolle bei der Differenzierung früher Lymphozyten und T-Zellen. Das Ikaros-Gen wird reichlich exprimiert an frühen embryonalen hämatopoetischen Stellen und ist später beschränkt auf den sich entwickelnden Thymus. Der Thymus zusammen mit der Milz sind die Stimulierungsstellen für Expression beim Erwachsenen. Diese hoch angereicherte Expression des Ikaros-Gens wurde auch in frühen und reifen primären T-Zellen und Zelllinien gefunden. Dieses beschränkte Expressionsmuster des Ikaros-Gens auf Stellen, wo embryonale und erwachsene T-Zell-Vorläufer herstammen, zusammen mit der Fähigkeit des codierten Proteins, Transkription zu aktivieren von dem regulatorischen Bereich eines frühen 7-Zell-Differenzierungs-Antigen unterstützte eine determinierende Rolle in der T-Zell-Spezifizierung.
• Differentielles Spleißen am genomischen Ikaros-Locus erzeugt mindestens fünf Transkripte, welche für Proteine mit distinkten DNS-Bindedomänen codieren. Diese Ikarosprotein-Isoformen (IK-1, IK-2, IK-3, IK-4, IK-5) haben überlappende, aber auch distinkte DNS-Bindespezifität, welche durch die differentielle Verwendung von Zinkfinger-Modulen an ihrem N-Terminus festgeschrieben wird. Die Core-Bindestelle für vier der Ikarosproteine ist das GGGA-Motiv, aber außerhalb dieser Sequenz unterscheidet sich ihre Spezifität dramatisch. Das IK-3-Protein zeigt starke Präferenzen für Basen an den beiden 5'- und 3'-flankierenden Sequenzen, was die Anzahl der Stellen, an die es binden kann, beschränkt. Das Ik-1-Protein zeigt auch starke Präferenzen für manche dieser flankierenden Basen und kann an ein weiteres Spektrum von Sequenzen binden. Das Ik-2-Protein, das wahlloseste der drei Proteine, kann an Stellen nur mit dem GGGAa/t-Motiv binden. Schließlich bindet das Ik-4-Protein, welches ähnliche Sequenzen-Spezifität wie Ik-1 hat, nur mit hoher Affinität, wenn eine zweite Stelle in enger Nähe ist, was auf eine kooperative Stellenbesetzung durch dieses Protein deutet. Eine Anzahl putativer Bindestellen für das Ikarosprotein wurden identifiziert in den Enhancern der Zelle T-Zell-Rezeptor -δ -β und -α, und den CD3-δ, -ε und -γ-Genen, in HIV-LTR in dem IL2-R-Promotor und in einer Vielzahl von anderen auf Lymphozyten beschränkten Genen. Eine von diesen Stellen, die NFkB-Variante im I1-2Rα-Enhancer bindet all diese Proteine mit hoher Affinität. Dieses NFkB-Motiv, ein entscheidendes regulatorisches Element für die Expression vom I12-Rezeptor α in T-Zellen wird stark aktiviert durch die Ik-1- und Ik-2-Isoformen in T- und Nicht-T-Zellen. Das IL-2Rα-Gen wird mit hohen Spiegeln in aktivierten T-Zellen exprimiert, aber auch in fötalen Thymozyten, welche auch hohe Spiegel des Ikaros-Gens exprimieren. Somit kann die Genregulation zumindest des IL2α-Rezeptors während der T-Zell-Differenzierung und -Aktivierung kontrolliert werden durch die komplizierte Wechselwirkung von NFkB und Ikaros-Transkriptionsfaktoren, welche auf gemeinsamen Gebieten interagieren.
• Das embryonale Expressionsmuster und das Aktivierungspotential der Ikaros-Isoform ist deutlich unterschiedlich. Die starken Transkriptionsfaktoren Ik-1 und Ik-2 werden reichlich exprimiert in der frühfötalen Leber, im reifenden Thymus und in einem kleinen Bereich des sich entwickelnden Gehirns, während die schwachen Aktivatoren Ik-3, Ik-4 mit niedrigeren Spiegeln exprimiert werden. Da jedoch die Ik-1- und insbesondere die Ik-2-Proteine an ein weiteres Spektrum von Stellen binden als Ik-3 und Ik-4, können die verfügbaren Moleküle, die an die gleichen Sequenzen wie Ik-3 und Ik-4 binden, mit ähnlicher Konzentration vorliegen. Überdies ist im embryonalen Thymus des Tages 14 der schwache Aktivator Ik-4 mit gleichen oder größeren Spiegeln vorhanden verglichen mit Ik-1- und Ik-2-Isoformen. Kompetition zwischen Ik-4, Ik-1 und Ik-3 um perfekt oder unvollkommen invertierte und direkte Sequenzwiederholungen ihres Erkennungsmotivs (NFkB-Varianten) können niedrige Spiegel transkriptioneller Aktivierung von diesen Stellen im frühen Thymus vermitteln. Fließgleichgewichts-Spiegel der aktivierenden Ikarosfaktoren in Kombination mit abnehmenden Spiegeln nicht-aktivierender Ik-4-Proteinen reifender Thymozyten können die Aktivität dieser Doppelstellen in dem sich entwickelnden Thymus anschalten. Dies kann in de novo-Expression von Stadium-spezifischen T-Zell-Differenzierungs-Antigenen resultieren. Schließlich kann Aktivierung von Bindungsstellen niedriger Affinität nur möglich sein in diesen späten Stadien der 7-Zell-Differenzierung, wenn die aktivierenden Ikarosproteine im Überschuss vorliegen. Konzentrationsgradienten vom Drosophila-NKkB-Homolog Dorsal und distinkte Protein-Protein-Interaktionen mit anderen Kernfaktoren sind verantwortlich für den Aktivierungsspiegel und die Schwellenreaktion von Niedrig- und Hoch-Affmitäts-Bindestellen im Fliegenembryo. 8 liefert ein Modell, in welchem die relativen Konzentrationen von Ikaros-Isoformen zu unterschiedlichen Entwicklungsstadien unterschiedliche Reaktivitäten an den verschiedenen Stellen vermitteln.
• Die Transkriptionsaktivität von den Ik-3- und Ik-4-Proteinen kann weiterhin reguliert werden durch auf T-Zell-beschränkte Signale, welche posttranslationale Modifikationen vermitteln, oder durch Protein-Protein-Interaktionen. Das Ik-4-Protein bindet das NFkB-Motiv in einer kooperativen Weise und kann deshalb in situ mit anderen Mitgliedern der Ikaros- oder der NFkB-Familie interagieren. Diese Protein-Protein-DNS-Komplexe können ein differenziertes Transkriptionsergebnis festschreiben.
• Die differenzierte Expression der Ikaros-Isoformen während der T-Zell-Ontogenese, deren überlappende aber distinkte Bindungsspezifität und ihr verschiedenartiges Transkriptionspotential können verantwortlich sein für die methodische Aktivierung von stadiumspezifischen T-Zell-Differenzierungs-Markem. Vielfache Schichten der Genexpression im sich entwickelnden Lymphozyten können der Regulation dieser Proteine unterworfen sein. Synergistische Interaktionen und/oder Kompetition zwischen den Mitgliedern der Ikaros-Familie und anderen Faktoren in diesen Zellen an qualitativ ähnlichen und distinkten Zielstellen könnte die genetische Fertigstellung des ruhenden und aktivierten Lymphozyten festschreiben. Diese funktionelle Untersuchung des Ikarosgens unterstreicht deutlich seine vorgeschlagene Funktion als ein „Master"-Gen in Lymphozyten. Die Rolle des Ikaros-Gens als der notwendige genetische Schalter für die frühe Hämatopoese und T-Zellentwicklung wird letztlich zugeschrieben in Genablationsstudien in transgenen Tieren.
• MUTATIONSANALYSE DES δ-ELEMENTES VOM CD3δ-ENHANCER
• Eine nützliche Herangehensweise zur Charakterisierung früher Ereignisse bei der T-Zell-Differenzierung ist es, die Regulation der Transkription von T-Zell-beschränkten Antigenen zu studieren. Wir haben die transkriptionelle Kontrolle von einem der frühesten und definitiven T-Zell-Differenzierungsmarker gewählt, dem CD3δ-Gen des CD3/TCR-Komlexes. Um einen Transkriptionsfaktor, exprimiert zur oder vor T-Zell-Festlegung, zu identifizieren, welcher als ein genetischer Schalter, der den Eintritt in die T-Zellabstammungslinie reguliert, funktionieren kann, haben wir einen T-Zell-spezifischen Enhancer charakterisiert, der die Expression dieses Gens vermittelt. Dieser Enhancer ist zusammengesetzt aus zwei funktionell distinkten Elementen, δA und δB, mit auf T-Zellen beschränkter Aktivität. Durch Mutationsanalyse des δA-Elementes wurden weiterhin zwei transkriptionell aktive Bindestellen identifiziert, ein CRE (Cyclic AMP response)-ähnliches Element und ein G-reiches Sequenzmotiv, welche beide für die volle Aktivität des δA-Elementes und des CD3-Enhancers benötigt werden, siehe 1.
• 1 veranschaulicht die funktionelle Untersuchung des δA-Elementes vom CD3δ-Enhancer. 1A zeigt die Bindestellen in dem δ-Element (SEQ ID NO: 1). Die eingekasteten Sequenzen stehen für das CRE-ähnliche und das G-reiche Motiv, die beide wichtig sind für die Aktivität des δA-Elementes. In das δA-Element eingeführte Mutationen werden unterhalb der Sequenz gezeigt.
• 1B zeigt den Beitrag von CRE und G-Box zur Aktivität des δA-Elementes und des CD3δ-Enhancers, wie durch Untersuchungen des Expressionsverlaufs in der T-Zelllinie EL4 analysiert wurde. Die Aktivität des tkCAT-Reportergens unter der Kontrolle von Wildtyp δA, δAmu1 und δAmu2 als sich wiederholende Elemente oder im Kontext mit dem CD3δ-Enhancer wurde bestimmt wie in Georgopoulos et al. (1992) Mol. Cell. Biol. 12: 747 beschrieben. Reportergen Aktivierung (R . A.) wurde ausgedrückt als das Verhältnis von Chloramphenicol-Acetyl-Transferase (CAT) zu Wachstumshormon (=GH =Growth Hormone)-Aktivität ermittelt für jede Transfektions-Untersuchung. 1C zeigt, dass die Expression des Ikaros-Gens (IK-2) in Nicht-T-Zellen die Aktivität des δA-Elementes hochreguliert. Die Expressionsvektoren CDM8 und CDM8:Ikaros-Rekombinantel wurden cotransfiziert mit den tkcat 3δA-, tkcat 3δAmu1-, tkcat 3δAmu2- und tkcat δ-Enhancer-Reporter-Genen in CV1 (Nieren-Epithel-)Zellen wie beschrieben in Georgopoulos et al. (1992). Das Verhältnis der Reportergen-Aktivierung (R. A.= CAT/GH) bei Anwesenheit und Abwesenheit von Ikaros-Expression wurde ermittelt. Drei Isoformen des ubiquitär exprimierten CRE-Bindeproteins wurden kloniert von T-Zellen wegen ihrer Fähigkeit mit der CRE-ähnlichen Bindestelle des δA-Elementes zu interagieren, siehe Georgopoulos et al. (1992). Obwohl dominant negative Mutanten dieses Proteins die Aktivität von diesem Enhancer-Element in T-Zellen herunterregulieren, spricht die Expression dieses Transkriptionsfaktors in allen hämatopoetischen und nicht hämatopoetischen Zellen dagegen, dass es der Schalter ist, welcher den CD3δ-Enhancer in dem frühen prothymozytischen Vorläufer aktiviert. Eine Variante des δA-Elementes (δAmu1-CRE) wurde verwendet, um eine T-Zell-Expressions-Bibliothek zu screenen, wie in Georgopoulos et al. (1992) beschrieben. Wie unten beschrieben wurde eine T-Zell-beschränkte cDNS kloniert, welche für ein neues Zink-Finger-Protein (Ikaros) codierte, das an die G-Box des A-Elementes bindet.
• KLONIEREN DES IKAROS-GENS
• Eine T-Zell-Expressions-cDNS-Bibliothek von der reifen T-Zelllinie EL4 wurde in den λZAP-Phagenvektor eingebaut.
• Eine multimerisierte codierende Oligonukleotid-Sequenz (SEQ ID NO: 4) von einer der Protein-Bindestellen des CD3δ-Enhancers wurde als eine radiomarkierte Probe verwendet, um diese Expressions-Bibliothek zu screenen auf die T-Zell-spezifischen Proteine, die binden und Enhancer-Funktion vermitteln, durch das Southwestern-Protokoll von Singh und McKnight. Vier Gene, die für DNS-Bindeproteine codieren, wurden isoliert. Eines, das Ikaros-Gen, codierte für ein T-Zell-spezifisches Protein.
• SEQUENZ VON IKAROS
• Die Sequenz des Ikaros-Gens wurde bestimmt unter Verwendung des Sanger Didesoxy-Sequenzierprotokolls. Die abgeleitete Aminosäuresequenz wurde bestimmt unter Verwendung des MAP-Programms von GCG (verfügbar bei der Universität von Wisconsin) und Strider-Sequenz-Analyse-Programmen. 2 liefert die Sequenz einer Ikaros-cDNS und der abgeleiteten Aminosäuresequenz, für die dadurch codiert wird (SEQ ID NO: 2).
• EIN IKAROS-PROTEIN
• Das in 2 gezeigte Ikaros-Protein (Ik-2) umfasst 431 Aminosäuren mit fünf CX₂CX¹²HX₃H-Zink-Finger-Motiven, organisiert in zwei separaten Clustern. (Siehe auch 5) Das erste Cluster von drei Fingern ist 59 Aminosäuren von initiierenden Methionin entfernt lokalisiert, während des zweite Cluster am C-Terminus des Proteins gefunden wird, 245 Aminosäuren stromabwärts vom ersten entfernt. Zwei der Finger-Module dieses Proteins weichen von der Consensus-Aminosäurezusammensetzung der Cys-His-Familie von Zink-Fingern ab; Finger 3 im ersten Cluster und Finger 5 am C-Terminus haben vier Aminosäuren zwischen den Histidin-Resten. Diese Anordnung der Zink-Finger in zwei weit separierten Regionen erinnert an die des Drosophila-Segmentations-gap-Gens Hunchback. Suchen nach Ähnlichkeit in der Protein-Datenbank ergab eine 43%ige Übereinstimmung des zweiten Finger-Clusters von Ikaros und Hunchback am C-Terminus dieser Moleküle. Diese Ähnlichkeit am C-Terminus dieser Proteine und die ähnliche Anordnung ihrer Finger-Domänen erhöht die Wahrscheinlichkeit, dass diese Proteine evolutionär verwandt sind und zu einer Unterfamilie von Zinkfingerproteinen gehören, die durch die Spezies hindurch konserviert ist.
• IKAROS-ISOFORMEN
• Zusätzlich zu der cDNS, die Ik-2 entspricht, wurden vier andere cDNS, welche durch differentielles Spleißen am genömischen Ikaros-Locus produziert werden, kloniert. Diese für Isoformen codierende cDNS wurden identifiziert unter Verwendung eines 300 Basenpaar-Fragmentes vom 3'-Ende der zuvor charakterisierten Ikaros-cDNS (Ik-2, 1). Wie in 4 und 5 gezeigt, leitet sich jede Isoform von drei oder mehreren der sechs Exons ab, die als E1/2, E3, E4, E5, E6 und E7 bezeichnet werden. Alle fünf cDNS haben gemeinsam die Exons E1/2 und E7, welche jeweils für die N-53- und die C-terminale 236-Aminosäure-Domäne codieren. Diese fünf cDNS bestehen aus unterschiedlichen Kombinationen der Exons E3-6, die für die N-terminale Zinkfinger-Domäne codieren. Die Ik-1-cDNS codiert für ein 58 kDa-Protein mit vier Zinkfingern an seinem N-Terminus und zweien an seinem C-Terminus und sie hat die stärkste Ähnlichkeit zum Drosophila-Segmentations-Protein Hunchback (Zinkfinger werden in 5 als F1, F2+F3, F4 und F5+F6 bezeichnet). Die Ik-2- und Ik-3-cDNS codieren für Proteine von 48 kDa mit überlappenden, aber unterschiedlichen Kombinationen von Zinkfingern. Das Ik-3 enthält Finger 1, 2, 3, während Ik-2 Finger 2, 3 und 4 enthält. Das 43,5 kDa-Protein Ik-4 hat zwei Finger an seinem N-Terminus, die auch in Ik-1 und Ik-2 vorhanden sind. Die Ik-S-cDNS codiert für ein 42-kDa-Protein mit nur einem N-terminalen Finger gemeinsam mit Ik-1 und Ik-3 (1). Diese differentielle Verwendung der Zinkfinger-Module durch die Ikaros-Proteine unterstützt die Annahme einer überlappenden, aber differentiellen DNS-Bindespezifität.
• Die cDNS-Klonierung der Isoformen wurde wie folgt durchgeführt. Eine cDNS-Bibliothek, hergestellt aus der T-Zelllinie EL4 in λZAP, wurde unter hoher Stringenz mit einem 300-Basenpaar-Fragment vom 3'-Ende der zuvor beschriebenen Ikaros-cDNS (Isoform 2) gescreent. Positive Klone wurden durch Sequenzierung charakterisiert unter Verwendung eines Antisense-Primers vom 5'-Ende des Exons 7.
• IKAROS-EXPRESSION GEWEBESPEZIFISCHE EXPRESSION DES IKAROS-GENS
• Das Ikarosgen wird in T-Zellen und ihren Vorläufern exprimiert. Bei der erwachsenenausgewachsenen Maus ist Ikaros-mRNS auf den Thymus und die Milz beschränkt, wobei die Expression im Thymus etwa 3mal höher ist als in der Milz. Milzzell-Präparationen, die an T-Zellen erschöpft waren, exprimierten nur sehr geringe Spiegel dieser Botennachricht. Eine Untersuchung der Ikaros-Expression in Zelllinien bestätigt die Sichtweise, dass das Ikarosgen in T-Zellen und ihren Vorläufern exprimiert wird. Ikaros-mRNS wurde in einer Reihe von T-Lymphom-Zelllinien detektiert. Die T-Zelllinie EL4 exprimierte die höchsten Spiegel, während D011.10-, BW5147- und SL12.1-Lymphoma mäßige bis niedrige Expression zeigten. Keine Expression oder sehr niedrige Spiegel wurden in Zelllinien detektiert, die andere hämatopoetische Abstammungslinien repräsentieren, einschließlich aus Knochenmark stammenden Vorläuferzellen FDCP1, die myeloide Morphologie und Differenzierungspotential zeigen, die Mastzelllinie RBL, die Makrophagen-Linie J774 (detektierte Expression ist 25fach niedriger als die in Thymozyten) und MEL-Zellen, welche induziert wurden, in erythroide Zellen zu differenzieren. Trotzdem wurden gemäßigte Spiegel von Ikaros-mRNS im B-Zell-Lymphom A20 und in der proerythroleukämischen Zelllinie MEL detektiert. Immortalisierung dieser Zelllinien und ihr leukämischer Phänotyp können die abweichende Expression dieses Kernfaktors erklären, welcher anscheinend weder in normalen B-Zellen (an T-Zellen-erschöpfte Milz-Population) noch in vivo in erythroiden Vorläufern mit signifikanten Spiegeln exprimiert wird (nach in situ-Daten). Expression dieses Thymozyten-beschränkten Faktors in diesen Zelllinien kann alternativ die Existenz eines frühen Vorläufers widerspiegeln mit der Fähigkeit, sich in die lymphoide oder die erythroide Abstammungslinie zu differenzieren.
• Gewebeverbreitung des Ikarosgens wurde bestimmt durch Northern-Hybridisierung der Gesamt-RNS präpariert aus: T-Lymphom-Zelllinien EL4, BW5147, D011.10, SL12.1; B-Zell-Lymphom A20; Geweben von Thymus, Milz, Niere, Hirn und Herz, die von einer ausgewachsenen Maus isoliert wurden; Milz-Thymozyten (Gesamt- und polyA-RNS); vom Knochenmark abgeleiteten Stammzell-Vorläufern FDCP1; Makrophagen-Zelllinie J774; Mastzellenlinie RBL; undifferenzierten MEL- und 58-stündig-DMSO-induzierten MEL-Zellen; und schließlich aus T-Zell-erschöpften Milzzellen (T depleted spleen cells= TDSC). Ein Fragment von 320 Basenpaaren (Basenpaar 1230- 1550) vom 3'-Ende der Ikaros Ik-2-cDNS wurde als Sonde verwendet.
• ZEITLICHE REGULATION DER EXPRESSION VOM IKAROSGEN
• Um zu bestimmen, wann bei der Hämatopoese das Ikarosgen aktiviert wird, wurde seine Expression in situ untersucht im sich entwickelnden Maus-Embryo. Hämatopoese beginnt am siebten Tag im Dottersack des Mausembryos mit der Generierung einer großen Population primitiver Erythroblasten. Die Ikaros-mRNS wird am Tage 8 nicht im Dottersack detektiert im Gegensatz zum Erythroid-spezifischen Transkriptionsfaktor GATA-1, welcher zu dieser Zeit in der Entwicklung exprimiert wird. Im eigentlichen Embryo wird Expression von Ikaros zuerst in der frühen Leberanlage bei Aufnahme ihrer hämatopoetischen Funktion (Tag 9½ – 10½) detektiert. Zu dieser Zeit werden sowohl pluripotente Stammzellen als auch stärker beschränkte Vorläufer in der Leber gefunden, welche erfolgreich bestrahlte Tiere mit dem gesamten Spektrum hämatopoetischer Abstammungslinien erfolgreich rekonstituieren können. Die Expression des Ikarosgens in der Leber bleibt stark bis zu Tag 14 und beginnt danach abzufallen, obgleich die Leber der Hauptsitz der Hämatopoese während mittleren Gestation ist und aktiv bleibt bis zur Geburt. Die abfallende Expression des Ikarosgens in der fötalen Leber in der Gestationsmitte entspricht den Veränderungen in den hämatopoetischen Profilen von pluripotenten Stammzellen zu mehr festgelegten Erythroid-Vorläufern.
• Die zweite Stelle der Ikaros-Expression ist in der Thymus-Anlage um Tag 12, wenn lymphopoetische Stammzellen zuerst in dieses Organ einwandern. Eine Gruppe exprimierender Zellen wird im Zentrum der Thymus-Anlage detektiert, umgeben von nicht-exprimierenden Zellen in der Peripherie. Expression im sich entwickelnden Thymus wird am Tag 16 ziemlich herausragend und besteht fort während der Embryogenese bis hin zum ausgewachsenen Organismus. In diesen Entwicklungsstadien wird Expression der Ikaros-mRNS überall im Thymus detektiert mit Spiegeln, die in den Medulla-Sektionen leicht stärker erhöht sind als die in der Cortex.
• Ikaros-Expression wird in der Milz zuerst während der späten Gestation detektiert mit geringen Spiegeln im Vergleich zu denen des Thymus (Tag 19). Obwohl die Milz bei Erythropoese und Myelopoese von der Gestationsmitte an aktiv ist, findet ihre Besiedelung mit reifen T-Zellen vom Thymus spät in der Embryogenese statt und korreliert mit der späten Expression des Ikarosgens. Am Tag 19 wird keine Expression der Botennachricht von Ikaros detektiert im Knochenmark der langen Knochen oder der Wirbelsäule im Gegensatz zum Myeloid-spezifischen Faktor Spyl und zum Erythroid-Faktor GATA-1. Das Expressionsmuster des Ikarosgens, detektiert während der Embryonalentwicklung an distinkten hämatopoetischen Stellen, entspricht seiner Beschränkung auf T-Zellen und ihren Vorläufern. Die einzige andere Stelle im Mausembryo, die Ikaros-Expression zeigte, war ein beschränkter Bereich im Gehirn, aus dem sich das proximale Corpus striatum entwickelt (Tag 12 bis zu Tag 19).
• Embryos wurden von termingenau trächtigen CD1-Mäusen (Charles River) erhalten und in 4 %igem Paraformaldehyd fixiert für 2 Stunden bis zu 2 Tagen in Abhängigkeit von der Größe. Eine Reihe von Dehydratationsschritten wurde in Alkoholen durchgeführt, gefolgt von Xylenen vor Einbettung in Paraplast. Schnitte wurden präpariert und behandelt gemäß veröffentlichten Protokollen. Sense- und Antisense-P-UTP-RNS-Sonden mit einer Größe von 300 Basenpaaren wurden von der untranslatierten 3'-Region der Ikaros-cDNS gemacht und wurden verwendet, um mit ausgewählten Schnitten bei 48°C über Nacht zu hybridisieren. Nach hochstringenten Waschungen wurden die Schnitte dehydratisiert und für drei Wochen in verdünnte photographische Emulsion (NBT2) getaucht. Die eingetauchten Schnitte wurden entwickelt, mit Giemsa gefärbt und durch Hell- und Dunkelfeld-Mikroskopie analysiert.
• EXPRESSION DER IKAROS-ISOFORMEN
• Das Expressionsmuster von Ikaros-Isoformen im sich entwickelnden Embryo wurde untersucht. Es wurden zwei Sätze Primer verwendet, um die fünf cDNS zu amplifizieren als distinkte Größen-Banden von embryonalen und postnatalen Geweben (6). Ein dritter Primer-Satz, komplementär zur (β-Aktin-cDNS, wurde verwendet, um die cDNS-Menge, die in der Reaktion verwendet wurde, zu normalisieren. Primer 1/2 amplifizierten ein 720-, ein 457- und ein 335-Basenpaar-Fragment von Ik-1-, Ik-2- und Ik-4-cDNS. Primer 3/4 amplifizierten ein 715-, ein 458- und ein 293-Basenpaar-Fragment von Ik-1-, Ik-3- und Ik-S-cDNS. Eine detektierte 650-Basenpaar-Bande ist ein Artefakt aus Coamplifikation von Ik-1 und Ik-2, welches Ik-1/Ik-2- und Ik-1/Ik-3-Hybridmoleküle darstellt. Es ist in signifikanten Spiegeln vorhanden bei den späteren Amplifikationszyklen, wenn das Verhältnis von Primern zu Ik-1, Ik-2 und Ik-3 vermindert ist. Diese Bande wird auch detektiert, wenn wir Ik-1-, Ik-2- und Ik-3-DNS-Matrizen coamplifizieren. Die Identität der oben beschriebenen Banden wurde ebenfalls durch Klonieren und Sequenzieren bestätigt. Es ist beachtenswert, dass die 650-Basenpaar-Spezies niemals als eine neue cDNS kloniert wurde.
• Während der embryonalen Entwicklung wurden alle fünf Ikaros-mRNS in hämatopoetischen Zentren und im Gehirn mit relativ unterschiedlichen Spiegeln exprimiert. Die Ik-1-mRNS wurde reichlich in der früh-fötalen Leber und im reifenden Thymus exprimiert, während Ik-2 bei der relativen Konzentration an zweiter Stelle lag. Die Isoform Ik-4 wurde im Vergleich zu Ik-1 und Ik-2 mit niedrigen Spiegeln in der früh-fötalen Leber und im reifenden Thymus exprimiert (Leber E14, Thymus E16 und D1). Es wurde im frühen Thymus und in der Leber zur Mitte der Gestation trotzdem in mit Ik-1 und Ik-2 vergleichbaren Mengen exprimiert (Tabelle 1, Thymus E14, Leber E16). Die Ik-3- und Ik-5-Isoformen wurden exprimiert, aber mit signifikant niedrigeren Spiegeln als Ik-1 und Ik-2 während der Entwicklung hindurch (Tabelle 1). Alle fünf Isoformen wurden im embryonalen Gehirn exprimiert. Die mRNS von Ik-1 war die reichlichste, die von Ik-2 und Ik-4 war vorhanden mit ähnlichen, aber niedrigeren Spiegeln, während die von Ik-3 und Ik-5 am wenigsten exprimiert wurden.
• Das Expressionmuster der Ikaros-Isoformen, welches im spät-embryonalen Thymus detektiert wurde, bestand nach der Geburt fort, während die abnehmende Leberexpression ausgeschaltet wurde. Die neonatale Milz exprimierte nur Ik-1- und Ik-2-mRNS in signifikanten Mengen. Niedrige Konzentration von Ik-1 wurde im neonatalen Gehirn noch detektiert. Mit unseren früheren in situ-Hybridisierungsstudien, die unter Verwendung einer RNS-Sonde, hergestellt aus dem 3'-Ende des Ikarosgens, das allen identifizierten Ikaros-Spleißprodukten gemeinsam ist, durchgeführt wurden, stimmen diese Daten überein und ergänzen sie weiter.
• TABELLE 1: Eine Zusammenfassung der embryonalen Expressionsmuster für die Ik-1-5-Transkripte

  
• Embryonale Gewebe wurden von Embryos termingenau-trächtiger Mütter erhalten. 2μg Gesamt-RNS, präpariert von Thymus, Leber, Gehirn und Milz zu verschiedenen Stadien der embryonalen Entwicklung, wurden für cDNS-Synthese verwendet mit zufälligen Hexameren und SuperscriptRNaseH. Ein Zehntel der hergestellten cDNS wurde bei PCR-Amplifikation verwendet mit dem Primerset 1/2, 3/4 und Actin A/B. PCR-Reaktionen wurden denaturiert bei 95°C für 5 Minuten, Polymerase wurde bei 80°C zugefügt und dann wurde über 25 Zyklen bei 94°C für 45''(Sekunden), 63°C für 1'(Minute) und 72°C für 1'(Minute) amplifiziert. PCR-Amplifikation für die Aktin-cDNS wurde über 30 Zyklen durchgeführt. Die Produkte wurden an 2%iger Seakam FMC-Agarose aufgetrennt, die Banden wurden ausgeschnitten, kloniert (TA-Klonierungsset, Clonteck) und sequenziert , um ihre Identität zu verifizieren.
• IKAROS STIMULIERT DIE TRANSKRIPTION VOM δA-ELEMENT TRANSKRIPTIONELLE ANFANGS-UNTERSUCHUNGEN
• Wir überprüften, ob das Ikaros-Protein, welches an das δA-Element binden kann, auch Transkription von dieser Bindestelle aktivieren kann. Das tkCAT-Reportergen unter der Kontrolle entweder von einer sich wiederholenden δA-Bindestelle (+/-CRE/-G) oder unter der Kontrolle des CD3δ-Enhancers wurde cotransfiziert mit einem rekombinanten Vektor, welcher das Ikarosgen in der Nierenepithelzelllinie CV1 exprimiert. Expression des Ikarosgens in Nicht-T-Zellen stimulierte stark Transkription von der G-Box eines sich wiederholenden δA-Elementes und im Kontext vom CD3δ-Enhancer (siehe 1C). Die Aktivität der δA- und δAmu1(-CRE)-Elemente wurde auf das Acht- bzw. Siebenfache gesteigert, während die Expression vom CD3δ-Enhancer auf das Fünffache gesteigert wurde. Da der CD3δ-Enhancer mindestens zwei regulatorische Elemente umfasst, ist für sein volles Aktivierungspotential die Expression all der Transkriptionsfaktoren nötig, die an diese Stellen binden. Expression des Ikarosgens stimulierte nicht signifikant die Aktivität des Thymidin-Kinase-Promotors oder die des δAmu2(-G-Box)-Elementes (siehe 1C). Diese Daten bestätigen unsere Hypothese, dass das Ikarosgen die Aktivität des T-Zell-spezifischen δA-Elementes vom CD3δ-Enhancer kontrollieren kann und lassen darauf schließen, dass es zumindest die Expression des CD3δ-Gens in T-Zellen vermitteln kann.
• Das Expressionsmuster des Ikaros-Proteins und seine Fähigkeit, die Aktivität des CD3δ-Enhancers zu modulieren, stimmen überein mit einer Rolle beim Vermitteln der Genexpression in T-Zellen vom Embryo und vom Erwachsenen. Seine frühe Expression in hämatopoetischen Stammzellen der fötalen Leber lässt darauf schließen, dass es in frühen prothymozytischen Vorläufern exprimiert werden könnte und erhöht die Wahrscheinlichkeit, dass es verantwortlich ist für die Festlegung einer pluripotenten Stammzelle auf die T-Zell-Abstammungslinie.
• AUSWAHL DER BINDESTELLEN FÜR DIE IKAROS-ISOFORMEN 1–3
• Um die Möglichkeit zu untersuchen, dass differentielle Verwendung der Zinkfinger-Module am N-Terminus der fünf Ikaros-Isoformen ihrer DNS-Bindung eine Spezifität verleiht, klonierten wir Bindungsstellen hoher Affinität für drei dieser Proteine. Die Ik-1-, Ik-2- und Ik-3-Proteine wurden ausgewählt, da sie entweder alle vier (Ik-1) oder zwei distinkte Kombinationen von dreien (Ik-2 und Ik-3) aus der Gesamtheit der vier N-terminalen Finger (5) enthalten. Wir erwarteten von diesen Proteinen, in der Spezifität mit Ik-4- und Ik-5-Proteinen, welche nur zwei oder eines dieser putativen DNS-Binde-Module enthalten, zu überlappen.
• Nach fünf Runden der Auswahl von Bindestellen aus einem Pool zufälliger Oligonukleotide, wurden die von Ik-1, Ik-2 und Ik-3 selektierten Oligomere kloniert, sequenziert und aligniert auf ein gemeinsames Motiv hin (Tabelle 2, 3 und 4, Fettdruck zeigt in der Tabelle konservierte Sequenz an).
• TABELLE 2

  
• TABELLE 3

  
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• TABELLE 4

  
• TABELLE 5

  
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• Eine Consensus-Erkennungssequenz für jedes dieser Proteine wurde abgeleitet. Die Ik-1-, Ik-2- und Ik-3-Core-Motive waren jeweils:

  

  Die Ik-1- und Ik-3-Sequenzen hatten das sieben Basenpaar lange Core T-G-G-G-A-A-T (SEQ ID NO: 149) gemeinsam. Das Ik-3-Protein zeigte eine starke Präferenz für besondere Nukleotide sowohl an den 5'- als auch an den 3'-flankierenden Positionen dieses Motivs, während das Ik-1-Protein an diesen Positionen keine besonderen Basen auswählte. Der Ik-2-Consensus hatte fünf Basen gemeinsam mit dem Ik-1- und Ik-3-Heptanukleotid und zeigte außerhalb dieser Sequenz große Degenerierung. Dies könnte dem Ik-2-Protein gestatten, mit hoher Affinität an ein weiteres Spektrum von Erkennungssequenzen zu binden. Ein anderes Kennzeichen der Oligonukleotide, die dwch das Ik-3-Protein ausgewählt werden, ist, dass 85% von ihnen einen zweiten Consensus enthielten (wie in Tabelle 2 unterstrichen). Im Gegensatz dazu hatten nur 50% und 38% der Oligonukleotide, ausgewählt dwch Ik-1 respektive Ik-2, das Potential für eine zweite Bindestelle (wie in Tabelle 1 und 3 unterstrichen). Dies könnte auf Unterschiede in der Affinität von Ik-1, Ik-2 und Ik-3 für das gewählte Core-Motiv schließen lassen. Doppelte Erkennungssequenzen können eine Erhöhung der apparenten Bindungsaffinität dieser Proteine für diese Stellen ermöglichen.
• Auswahl der Bindestellen wurde folgendermaßen vorgenommen. Ein Pool zufälliger Oligomere wurde entworfen mit 25 Basenpaaren definierter Sequenz an 5' und 3' (einschließlich Bam HI- und EcoRI-Restriktionsstellen) und 15 Basenpaaren zufälliger Sequenz in der Mitte. In der ersten Runde der Auswahl wurden Ikaros-GST-Fusionen, angebunden an Glutathion-Agarose-Kugeln (20 μl Kugelvolumen), zu Bindungsuntersuchungen verwendet zusammen mit 500.000 cpm (Zählungen pro Minute) endmarkierten Zufalls-Primern. Nach 20-minütiger Bindungsreaktion auf Eis wurden die Kugeln vorsichtig herunterzentrifugiert und zwei- bis dreimal mit dem zehnachen Überschuss an eiskaltem 1X-Bindepuffer gewaschen. Gebundene Primer wurden in 0,1% SDS 10mM Tris, pH7,5 , eluiert, die dabei zurückgewonnene Radioaktivität wurde bestimmt und dann wurde Phenol-extrahiert und in der Gegenwart von 10 μg Glykogen präzipitiert. Ein Fünftel der zurückgewonnenen DNS wurde reamplifiziert mittels Primern, komplementär zu den definierten 5'- und 3'-Sequenzen, mit in die Reaktion eingebrachtem a-P³²dCTP, um einen homogen markierten Pool ausgewählter Oligomere zu erzeugen. Alle Sonden wurden Gel-gereinigt. In höheren Runden wurden verminderte Mengen ausgewählter Oligomere bei den Bindungsreaktionen verwendet, um auf Stellen höherer Affinität hin anzureichern (2000.000/100.000 cpm). Fünf Auswahlrunden wurden durchgeführt. Am Ende der letzten Runde wurden die eluierten DNS amplifiziert, mit EcoRI- und BamHI-Restriktionsenzymen verdaut, in pGEM3Z kloniert und sequenziert mit normalen und reversen Primern. Sequenzen der selektierten Primer wurden auf ein in allen DNS vorhandenes gemeinsames Motiv hin aligniert.
• Fusionsprotein- und DNS-Bindungsuntersuchungen wurden folgendermaßen durchgeführt. Die codierende Region der Ikaros-Isoformen wurden PCR-amplifiziert mit Vent-Polymerase von ihren jeweiligen cDNS unter Verwendung von Primem und in die BamHI/EcoRI-Stellen von pGEXIII kloniert. Rekombinante Plasmide wurden durch Sequenzieren analysiert. Übernacht-Kulturen der passenden rekombinanten PGEX-Vektoren wurden zehnfach verdünnt und bei 37°C für 90 Minuten angezogen vor einer 3-ständigen Induktion mit 2 mM IPTG bei 26°C. Rohe Bakterienlysate wurden wie vorher beschrieben (Georgopoulos, 1992) hergestellt. Ikaros-GST-Fusionen wurden teilweise gereinigt an Glutathion-Agarose-Kugeln, eluiert bei 4°C für 1 Stunde mit Puffer D, welcher 20 mM freies Glutathion und 0,5 M NaCl enthält. Die eluierten Proteine wurden durch SDS-PAGE überprüft, ihre Konzentrationen dwch die Lowry-Methode ermittelt und die geeigneten Verdünnungen wurden zu DNS-Bindestudien verwendet. DNS-Bindungsuntersuchungen wurden durchgeführt. Bindereaktionsgemische enthielten 50.000 cpm markierte Oligonukleotide (0,5 – 1 ng), 100 ng Fusionsproteine, 0,1 μg dI/dC und der Bindungspuffer wurde supplementiert mit 20 μM ZnCl₂. Bindereaktionen für Methylierungs-Interferenz-Untersuchungen wurden im Maßstab verzehnfacht und wie vorher beschrieben durchgeführt (Georgopoulos, 1990).
• BINDUNGSSPEZIFITÄT DER IKAROS-ISOFORMEN IK-1-5
• Die Bindungsspezifität der fünf Ikaros-Proteine für eine einzelne Erkennungsstelle, welche aus dem ausgewählten Consensus stammt, wurde in einer Gel-Retardationsuntersuchung getestet. Ein 24-Basenpaar-Oligonukleofid ((1K-BS1-T-t-T-T-G-G-G-A-A-T-A-C-Cc) (SEQ ID NO:101) (SEQ ID NO: 101), so gestaltet, um sich Hochaffinitätsbindung der drei auswählenden Proteine anzupassen, wurde getestet. Die Isoform Ik-1 band diese Sequenz mit der höchsten Affinität gefolgt von Ik-2 und Ik-3. Das Vorhandensein von nur zwei oder einem Zinkfinger am N-Terminus von Ik-5 und Ik-4 war nicht ausreichend für ihre stabile Interaktion mit dieser Stelle. Dann wurde ein Oligonukleotid, welches eine zweite Stelle niedriger Affinität in enger Nachbarschaft zur ersten enthielt, getestet: (IK-BS2)TCAGCTTTTGGGAATCTCCTGTCA (SEQ ID NO: 150). Vier der Isoformen banden an diese Sequenz und nur Ik-5 mit dem einzelnen N-terminalen Finger band nicht. Dann überprüften wir die Fähigkeit des kurzen Ik-2-Coremotivs, an diese Proteine zu binden ((IK-BS3, TCAGCTTTTGGGATTCTCCTGTCA (SEQ ID NO: 151)). Ik-2 band gleichermaßen gut an das aus fünf wie an das aus sieben Basenpaaren bestehende Core, während Ik-1 an diese Stelle mit einer mindestens dreifach geringeren Affinität band. Die Ik-3- und Ik-4-Isoformen banden nicht an diese Sequenz. Oligonukleotide mit nicht-bevorzugten Basen an den 3'- und 5'-flankierenden Positionen vom Ik-1/Ik-3-Core banden mit hoher Affinität das Ik-2-Protein, mit niedrigerer Affinität Ik-1 und banden nicht Ik-3 ((IK-BSS, TCAGCGGGGGGGAATACCCTGTCA. (SEQ ID NO: 152)). Dies stimmte überein mit Selektionsdaten, wobei Ik-2 das am meisten wahllose der drei Proteine war, gefolgt von Ik-1, und wobei Ik-3 das am stärksten restriktive in der Bindespezifität war.
• Das Ik-5-Protein interagierte mit keiner dieser DNS. Trotzdem band es mit geringer Affinität, aber in einer Sequenz-spezifischen Weise an das δA-Element des CD3δ-Enhancers. Der gleiche Komplex wurde detektiert für Ik-4, während Ik-1, Ik-2 und Ik-3 diese DNS in einer qualitativ und quantitativ verschiedenen Weise banden. Die schwache Bindung von Ik-4 und Ik-5 an das δA-Element wird wahrscheinlich durch die zwei C-terminalen Finger vermittelt, während die Hochaffmitätsbindung von Ik-1, Ik-2 und Ik-3 vermittelt wird durch die N-terminale Finger-Domäne (auch durch Selektions- und Bindungsuntersuchungen mit den N-terminalen Finger-Domänen dokumentiert).
• Diese Bindungsdaten über die fünf Ikaros-Isoformen unterstreichen weiterhin die vorher beschriebene Auswahl und zeigen, dass die Ikarosproteine an überlappende, aber auch distinkte Erkennungssequenzen binden können.
• CHEMISCHES „FOOTPRINTING" DER IKAROS-ISOFORMEN IK-1-4 AN IHREN VERWANDTEN STELLEN
• Die Protein/DNS-Interaktionen von Ik-1-4 wurden durch chemisches Footprinting („Fußabdruck-Methode") weiter abgesichert. Das Ik-BS2-Oligonukleotid (TCAGCTTTTGGGAATCTCCTGTCA) (SEQ ID NO: 102), welches mit hoher Affinität an die vier Isoformen bindet, wurde bei einer Methylierungs-Interferenz-Untersuchung (Methylation interference assay) verwendet. Am positiven Strang zeigten alle vier Proteine ähnliche Kontakte. Die drei Guanine an den Positionen 2, 3 und 4 der Consensus-Sequenz griffen zu 100% bei der Bindung aller vier Proteine ein. Ik-2 zeigte zusätzliche Kontakte der großen Furche mit dem Guanin an Position -5 und mit Adenin an Position 5. Am negativen Strang ergaben die vier Proteine dramatische Footprints. Ik-2 zeigte nur mit dem Guanin an Position -3 Kontakt, während Ik-1 einen zusätzlichen Teil-Kontakt mit Position -1 zeigte. Das Ik-3-Protein zeigte Kontakte mit Adenin an Position 1 und -2 und Guanin an -1 und -3. Der Footprint vom Ik-4-Protein war der extensivste, welcher die drei Guanine an Position -1, -3 und -4 und das Adenin an Position -5 einschloss.
• Von den drei Proteinen zeigte Ik-3 mit der striktesten Bindungsspezifität die meisten DNS-Kontakte. Das Ik-2-Protein, das am meisten wahllose der drei, zeigte die wenigsten DNS-Kontakte. Schließlich unterstützt der extensive, aber qualitativ abweichende Footprint von Ik-4 weiter die kooperative Besetzung von Erkennungsstellen in enger Nähe durch dieses Protein. Diese Methylierungs-Interferenz-Daten zeigen, dass von den vier Ikarosproteine qualitativ distinkte DNS-Kontakte ausgehen und unterstreichen ihre Fähigkeit, DNS differentiell zu binden.
• TRANSKRIPTIONELLE AKTIVIERUNG DURCH DIE IK-PROTEINE
• Wir hatten zuvor gezeigt, dass Ik-2 die Transkription von einem vervielfältigten δA-Element auf gemäßigte Spiegel aktivieren kann. Wir überprüfen hier die Fähigkeit von vier der Ikaros-Isoformen, die Transkription von einer wiederholten Kopie einer bevorzugten Bindestelle zu aktivieren in Untersuchungen des Expressionsverlaufs in NTH-3T3-Fibroblasten. Das IK-BS3-Oligonukleotid, welches Ik-1-4 mit hoher Affinität bindet, wurde auf seine Fähigkeit untersucht, Transkription des tkCAT-Reportergens zu stimulieren bei Expression dieser Proteine. Die Aktivität dieses Reportergens, detektiert in dieser Fibroblasten-Zelllinie, wurde um das 22-fache gesteigert, wenn Cotransfektion mit einem Expressionsvektor, welcher die Ik-1-cDNS enthielt, erfolgte. Die Aktivität dieses Reportergens wurde um das 11-fache gesteigert durch den Ik-2-Expressionsvektor. Jedoch stimulierte die Expression der Ik-3- und Ik-4-cDNS die Transkription nur um das 2- bis 3-fache. Dies ließ darauf schließen, dass diese Proteine dienen können zur Abschwächung der Transkription von Bindungsstellen, die auch an Ik-1 und Ik-2 angepasst sind (Verlauf der Protein-Expression von Ikaros-cDNS war vergleichbar).
• Die Ik-1- und Ik-2-Enhancerproteine konnten die Transkription von einer mutierten Bindungsstelle aus, welche keinen dieser Faktoren binden konnte, nicht stimulieren, wodurch gezeigt wurde, dass ihr Aktivierungspotential sequenzspezifisch ist.
• Da die Sequenzzusammensetzung für eine Hochaffinitäts-Bindungsstelle von Ikaros identisch ist mit den NFKb-Motiven, welche im IL2-Rezeptor a und (3-Interferon-Promotoren vorhanden sind, untersuchten wir ihre transkriptionelle Aktivität in einer reifen T-Zelllinie bei Abwesenheit und Anwesenheit mitogener Stimulierung. Wir wählten die menschliche Jurkat-T-Zelllinie aus folgenden Gründen. Erstens ist die Aktivität der NFkB-Erkennungssequenzen, welche sehr eng mit den ausgewählten Ikaros-Bindungsstellen übereinstimmen, extensiv in dieser Zellinie untersucht worden und zweitens wissen wir, dass das menschliche Ikarosgen hochkonserviert gegenüber dem Maus-Gen ist, bezüglich sowohl der Aminosäurezusammensetzung als auch den Spleiß-Varianten. Im Gegensatz zu früheren Berichten detektierten wir hohe Spiegel transkriptioneller Aktivität von dieser vervielfachten Stelle aus, welche durch mitogene Behandlung nicht weiter stimuliert wurden. Diese Aktivität wurde um das Fünffache vermindert, wenn Ikaros-Antisense-Expressionsvektoren zusammen mit diesem Reportergen cotransfiziert wurden. Kein solcher Effekt wurde detektiert, wenn Reportergene, getrieben durch RSV oder SL3 LTR, in einem Parallelexperiment verwendet wurden, was darauf schließen lässt, das transkriptionelle Hemmung durch die Ikaros-Antisense-RNS spezifisch ist für diese Stelle.
• Transkriptionelle Aktivierung von einer sich wiederholenden NFkB-Variante in NIH3T3-Fibroblasten bei Expression der Ikaros-Isoformen 1–4 wurde folgendermaßen bestimmt. Die Stimulation der CAT-Aktivität in der Gegenwart der Ikaros-Proteine wurde berechnet als das Verhältnis der Aktivität bei Cotransfektion mit einem rekombinanten CDM8/CDM8-Vektor allein. Diese Daten repräsentierten einen Durchschnitt von drei/vier Experimenten mit jeder Kombination der transfizierten Plasmide bei zweimaliger Wiederholung pro Experiment. Alle Transfektionen wurden normalisiert auf GH-Spiegel, wie in Material und Methoden beschrieben.
• Aktivität und Repression des sich wiederholenden NFkB-ähnlichen Elementes in menschlichen T-Zellen wurden folgendermaßen bestimmt. Das Reportergen unter der Kontrolle von Ik-BS2 (FNKB-ähnliche Variante) oder von RSV und SL3 LTR wurde in Jurkat-Zellen transfiziert in der Gegenwart von Ikarosantisense-exprimierenden CDM8-Plasmiden. Das Ausmaß der Induktion relativ zu Plasmiden ohne Enhancer und der Suppression in Gegenwart von Antisense-RNS wurde bestimmt.
• Expressionsvektor- und Transfektions-Experimente bei Säugern wurden folgendermaßen durchgeführt. Die fünf Ikaros-Isoformen wurden subkloniert in die HindIII-NotI-Stelle des CDM8-Expressionsvektors. Das tkCAT-Reportergen unter der Kontrolle von vier „Sense"-Kopien von IKBS1, lKBS2, IKBS7 und 8 wurden cotransfiziert mit den passenden Expressionsvektoren und mit den SV40 oder RSV GH-Plasmiden in den NIH 3T3-Fibroblasten und der reifen T-Zelllinie Jurkat wie zuvor beschrieben. Die Zellen wurden 36–48 Stunden später geerntet und auf CAT-Aktivität und Wachstumshormon(GH)-Spiegel hin analysiert. Die Ergebnisse wurden als der Durchschnitt von 3/4 unabhängigen Experimenten bestimmt, wobei jede Kombination von Reporter- mit Expressions-Plasmiden zweimal durchgeführt wurde.
• ZIEL-STELLEN FÜR IKAROSPROTEINE IN AUF LYMPHOID-BESCHRÄNKTEN REGULATORISCHEN DOMÄNEN
• Potentielle Hochaffinitäts-Bindungsstellen für Ikarosproteine wurden gefunden in den Enhancer- und Promotorregionen der TCR-α-, -β- und -δ-, den CD3-δ-,-ε- und -γ-Gene, von SL3 und HIV LTR und in den regulatorischen Domänen anderer auf T-Zellen beschränkter Antigene (Tabelle 5). Einige dieser Stellen können alle vier Proteine binden, während andere nur mit Ik-2 und Ik-1 interagieren. Die ausgewählten Erkennungssequenzen für die drei Ikaros-Isoformen stimmen eng mit dem NFkB-Motiv überein, das im Promotor vom IL2-Rα, im PRDII-Element von β-Interferon und im H-2K-Gen vorhanden ist. Diese NFkB-Stelle bindet mit hoher Affinität vier der Ikaros-Proteine.
• Dem Ikaros-Motiv verwandte Sequenzen wurden auch in der oben beschriebenen regulatorischen Domänen gefunden, genauso wie in den Purin-Boxen des IL2-Gens, an der LYF-Stelle des TDT-Promotors und an den NFkB-Varianten-Stellen von HIV LTR (Tabelle 5). Um die Affinität der Ikaros-Proteine für diese Stellen zu überprüfen, untersuchten wir ihre Fähigkeit, mit den ausgewählten Erkennungssequenzen zu kompetitieren. Basenpaarsubstitutionen innerhalb und außerhalb des sieben-Basenpaar-Motivs wurden eingeführt, um die Sequenzzusammensetzung einigen dieser Stellen, die in lymphoid- oder T-Zell-spezifischen regulatorischen Domänen vorhanden sind, anzupassen. Oligonukleotide mit den geeigneten Basenpaaraustauschen wurden in Kompetitionsexperimenten gegen das Consensus-Motiv (IKB-S1) verwendet.
• Das Ik-BS2-Oligonukleotid, identisch mit dem NFkB-Motiv von IL2-Rα, band an die vier Proteine mit einer zweifach höheren Affinität als eine Einzelkopie des Consensus-Motivs. Wir glauben, dass dies auf der zweiten Bindungsstelle niedriger Affinität auf dem Gegenstrang beruht.
• Die Existenz von Bindungsstellen niedriger Affinität in enger Nähe in einer regulatorischen Domäne erhöht die relative Affinität der Ikarosproteine zu diesen Stellen. Dies ist deutlich der Fall für δA- und möglicherweise andere Elemente. Die Besetzung von Hochaffinitätsstellen könnte auch durch Stellen niedriger Affinität in der unmittelbaren Region beeinflusst werden. Die apparente Bindungskonstante dieser Proteine für diese Stellen kann auf einen noch höheren Wert steigen und könnte die Reihenfolge der Zielgene vorschreiben, die durch die Ikaros-Enhancer im sich entwickelnden Lymphozyten aktiviert werden.
• KLONIEREN DES MENSCHLICHEN IKAROS-GENS
• Da die cDNS-Sequenz des Ikarosgens von der Maus bestimmt worden ist, kann das menschliche Ikarosgen kloniert werden unter Verwendung einer aus einer Reihe von Techniken, die dem Fachmann auf dem Gebiet bekannt sind. Solche Klonierungstechniken sind detailliert beschrieben in (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Sambrook et al. 1989, Zweite Ausgabe, Cold Spring Harbor Labor, Cold Spring Harbor, NY, hiermit als Literaturstelle aufgenommen). Beispielsweise können Oligonukleotide, welche übereinstimmen mit Ausdehnungen von 1020 Aminosäureresten der kodierenden Region von Maus-Ikaros, an einem Oligonukleotid-Synthetisierer synthetisiert werden. Diese Oligonukleotide können als Sonden verwendet werden, um eine Bibliothek menschlicher cDNS, z. B. eine Bibliothek von Jurkat-T-Zellen, oder eine Humangenom-Bibliothek zu screenen. Positive Klone werden sequenziert, die Sequenz wird verglichen mit der bekannten Aminosäuresequenz von Maus-Ikaros. Die funktionelle Aktivität von Ikaros, welches durch diese DNS codiert wird, kann wie hierin beschrieben untersucht werden.
• Die Teilsequenz einer menschlichen Ikaros-cDNS wird in 3 (SEQ ID NO:3) gezeigt.
• DER GENOMISCHE IKAROS-LOCUS
• Ausgehend von einer Sequenzanalyse von Varianten-cDNS, glaubt man, dass der genomische Locus etwa 9–11 Exons einschließt. Genomische DNS, welche die meisten oder alle der im Genom vorhandenen Ikaros-Exons umfasst, wurde isoliert durch Screenen einer genomischen Maus-SV 129- Bibliothek angelegt im λDASH II-Phagen-Vektor, unter Verwendung der verschiedenen Ikaros-cDNS als Sonden. Das Ikarosgen umschließt mindestens 80–90 kb genomischer Sequenz, welche als distinkte, aber auch überlappende genomische Klone isoliert wurde. Einige der genomischen Ikaros-Klone werden in den Fig.en 7 gezeigt. Die Exons sind als Kästen dargestellt, die Introns hingegen als Linien. Die DNS-Sequenz für: die 5'-Grenze (SEQ ID NO: 143) und die 3'-Grenze (SEQ ID NO: 144) von Exon E5; die 5'-Grenze (SEQ ID NO: 145) von Exon E3; und die 5'-Grenze (SEQ ID NO: 146) und die 3'-Grenze (SEQ ID NO: 147) von Exon E7 wurden bestimmt.
• HOMOLOGE REKOMBINATIONSEXPERIMENTE IN VITRO UND IN VIVO UND KNOCKOUT-MÄUSE
• Um die Rolle des lymphoid-beschränkten Transkriptionsfaktors Ikaros in vivo zuzuordnen, führten wir gezielte Mutationen am genomischen Locus von Maus-Ikaros in embryonalen Stammzellen (E. S) ein. Zwei Ziel-Vektoren, welche distinkte Deletionen am genomischen Ikaros-Locus tragen, wurde transfiziert in die J1 E. S-Linie, abgeleitet von der SV129-Maus (En li, Cell, 1992). Homologe Rekombinationsereignisse in den E. S-Zellen wurden ausgezählt durch ein Doppel-Selektions-Zähler-Selektions-Schema; G418 und FIAU wurden in Medien verwendet, um auf Neomycin-Genaktivität zu selektieren und auf die Abwesenheit von Thymidin-Kinase-Genaktivität. Das neo-Gen ist in der Mitte des Konstruktes lokalisiert, während das tk-Gen an 5' oder 3' des Zielvektors vorliegt und Selektion gegen nicht-homologe Rekombinationsereignisse ermöglicht. E. S-Zelllinien, die entweder Mutation eins oder zwei tragen, wurden durch Southern-Analyse abgesichert und wurden in die Blastozyten von schwarzen Mäusen, Balbe oder C57, injiziert. Die chimären Blastozyten wurden reimplantiert in pseudoträchtige Mäuse und ergaben chimäre Tiere. Mäuse, welche mehr als 70% chimär für den SV129-Stamm waren, wie durch Fellfarbe bestimmt (agouti = wildfarben vs weißen oder schwarzen Untergrund), wurden weiter gezüchtet. Keimlinien-Transmission wurde bestimmt durch Fellfarbe (agouti) und durch Southernanalyse der Schwanz-DNS. Wir sind im Verlauf der Züchtung dieser Mäuse, um Tiere zu erhalten, welche homozygot für diese Mutationen sind.
• Beide gezielten Mutationen sind Deletionen. Die erste Mutation deletiert das letzte Exon, E7, welches allen Ikaros-Isoformen gemeinsam ist. Dies sollte Proteine erzeugen, welche DNS binden können, welche aber nicht die Transkription aktivieren können. Diese Proteine können als dominante negative Regulatoren der Transkription wirken, da sie mit den Wildtyp-Ikarosproteinen um die DNS-Bindung kompetitieren können, aber nicht die Transkription aktivieren können. Für diese Mutation heterozygote Mäuse können eine Abnahme im Expressionsspiegel der Gene, die sich auf die Ikaros-Proteine für ihre Regulation stützen, aufweisen. Diese Mäuse können einen weniger ernsthaft beeinträchtigten Phänotypen aufweisen als diejenigen, mit einem vollständigen Fehlen der Expression von Ikaros-Proteinen. Eine Analyse dieser Tiere kann sich als notwendig erweisen, wenn der Phänotyp bei Mäusen mit totalem Verlust der Funktion ernsthaft beeinträchtigt ist.
• Die zweite Mutation (eine Deletion von Exon E3 und E4) sollte in einem vollständigen Funktionsverlust des Ikarosgens resultieren. Für diese Mutation homozygote Mäuse können eine ernsthafte Beeinträchtigung des Ikarosgens haben. Für diese Mutation homozygote Mäuse können eine ernsthafte Beeinträchtigung ihres Immunsystems haben, als ein Ergebnis der veränderten Expression der Gene, welche durch das Ikarosgen reguliert werden. Mögliche Kandidaten für Ikaros-Regulation sind TDT(Rekombinationsweg) CD3-Komplex; TCR-Komplex, IL2Gen, HIV LTR etc.. Lymphoide Zelllinien, welche von diesen Mäusen stammen, können verwendet werden, um den regulatorischen Entwicklungsweg zu umreißert, der zu reifen T- und B-Zellen führt, aber die Mäuse selber können verwendet werden, um die komplexen- Interaktionen zwischen den verschiedenen Abstammungslinien in dem hämatopoetischen Entwicklungsweg zu studieren und in vivo-Experimente zu entwickeln, um Immundefizienz-Syndrome zu studieren und zu korrigieren. Schließlich können ES-Zelllinien, welche von diesen Tieren stammen, studiert werden dwch in vivo-Differenzierung in die hämatopoetische/lymphopoetische Abstammungslinie.
• VERWENDUNG
• Die Peptid der Erfindung können einem Säuger, insbesondere einem Menschen, verabreicht werden auf eine der traditionellen Weisen (z. B. oral, parenteral, transdermal oder transmukosal?) in einer langzeitwirkenden Formulierung unter Verwendung eines biologisch abbaubaren, biokompatiblen Polymers oder dwch Freisetzung vor Ort unter Verwendung von Mizellen, Gelen und Liposomen oder auf transgene Weisen.
• ANDERE AUSFÜHRUNGSFORMEN
• Nukleinsäure, welche das Ikarosgen ganz oder teilweise codiert, kann verwendet werden, um Zellen zu transformiren. Beispielsweise kann das Ikarosgen, z. B. eine fehlexprimierende oder mutierte Form des Ikarosgens, z. B. eine Deletion, oder DNS, die für ein lkaros-Protein codiert, verwendet werden, um eine Zelle zu transformieren und eine Zelle herzustellen, in welcher das genomische Ikarosgen der Zelle ersetzt wurde durch das transformierte Gen, wodurch z.B eine Zelle mit Deletion für das Ikarosgen produziert wird. Wie oben beschrieben kann diese Vorgehensweise verwendet werden mit Zellen, welche imstande sind, in Kultur aufgezogen zu werden, z. B. kultivierte hämatopoetische Stammzellen, um die Funktion des Ikarosgens zu untersuchen.
• In analoger Weise kann Nukleinsäure, welche das Ikarosgen ganz oder teilweise codiert, z. B. eine fehlexprimierende oder mutierte Form des Gens, z. B. eine Deletion, verwendet werden, um eine Zelle zu transformieren, aus welcher sich nachfolgend ein transgenes Tier entwickelt. Diese Vorgehensweise kann verwendet werden, um beispielsweise ein transgenes Tier zu schaffen, in welchem das Ikarosgen z. B. inaktiviert ist, z. B. durch Deletion. Homozygote transgene Tiere können dwch Kreuzungen zwischen den Nachkommen eines primär transgenen Gründertieres ausgebildet werden. Zell- oder Gewebekulturen können sich von einem transgenen Tier ableiten lassen. Ein Individuum mit dem Risiko für eine Störung, charakterisiert dwch eine Anomalie in der T-Zell-Entwicklung oder -Funktion, z. B. Leukämie, kann detektiert werden dwch Vergleich der Struktur des Ikarosgens vom Individuum mit der Struktur des Ikarosgens von einem Wildtyp. Abweichungen von der Wildtyp-Struktur dwch, z. B. Frameshifts, kritische Punktmutationen, Deletionen, Insertionen oder Translokationen sind ein Hinweis für ein Risiko. Hierin sind die DNS-Sequenz der codierenden Region mehrerer Exons ebenso wie mehrere Intron-Exon-Grenzen eingeschlossen. Andere Regionen können erhalten oder sequenziert werden dwch Verfahren, die dem Fachmann auf diesem Gebiet bekannt sind.
• Die Erfindung schließt jedes Protein ein, welches homolog zu einem lkaros-Protein ist, z. B. dem in SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3 oder SEQ ID NO: 5 gezeigten Ikaros-Protein, oder anderen Isoformen. Ebenfalls eingeschlossen sind: Allel-Variationen; natürliche Mutanten; induzierte Mutanten, z. B. in vitro-Deletionen; Proteine, die dwch DNS codiert werden, welche unter Bedingungen hoher oder niedriger (z. B. Waschen bei 2xSSC bei 40°C mit einer Sonde von mindestens 40 Nukleotiden Länge) Stringenz mit einer natürlich vorkommenden Nukleinsäure hybridisiert (für andere Definitionen hoher oder niedriger Stringenz siehe Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York, 1989, 6.3.1–6.3.6, als Referenz hiermit aufgenommen); und PolyPeptid oder Proteine, welche dwch Antisera gegen ein Ikaros-Protein spezifisch gebunden werden, insbesondere dwch Antisera gegen die aktive Stelle oder Bindedomäne eines Ikaros-Proteins. Der Ausdruck schließt auch chimäre PolyPeptid ein, die ein Ikaros-Protein einschließen.
• DNS- und Peptid-Sequenzen der Erfindung können z. B. Maus-, Primaten-, z. B. menschliche, oder nicht-natürlich vorkommende Sequenzen sein.
• Die Erfindung schließt ebenfalls jedes biologisch aktive Fragment oder Analogon eines Ikaros-Proteins ein. Mit „biologisch aktiv" ist gemeint, eine beliebige in vivo- oder in vitro- Aktivität zu besitzen, welche charakteristisch ist für eine Ikaros-Isoform, z. B. eine Isoform gezeigt in (SEQ ID NO: 2) oder 3 (SEQ ID NO: 3) oder (SEQ ID NO: 5), z. B. Ikaros-Aktivität wie oben beschrieben. Da die Ikaros-Proteine einen breiten Bereich physiologischer Eigenschaften zeigen und da solche Eigenschaften verschiedenen Teilen des Ikarosprotein-Moleküls zuzuordnen sein können, ist ein verwendbares Ikarosprotein-Fragment oder Ikarosprotein-Analog eines, welches eine biologische Aktivität in irgendeinem oder mehreren einer Anzahl von Ikarosprotein-Untersuchungen zeigt, beispielsweise die Fähigkeit, anzubinden an ein oder die Transkription zu stimulieren von einem δA-Element oder NKFB-Element, wie oben beschrieben. Ein Ikarosprotein-Fragment oder Analog besitzt am stärksten bevorzugt 90%, bevorzugt 40% oder mindestens 10% der Aktivität von einer natürlich vorkommenden Ikaros-Isoform, z. B. vom Ikarosprotein gezeigt in (SEQ ID NO: 2), (SEQ ID NO: 3) oder (SEQ ID NO: 5) bei einer beliebigen in vivo- oder in vitro-Ikaros-Untersuchung.
• Bevorzugte Analoga schließen IkarosPeptid oder -Exons (oder biologisch aktive Fragmente davon) ein, deren Sequenzen sich von der Wildtyp-Sequenz unterscheiden durch eine oder mehrere konservative Aminosäuresubstitutionen oder dwch eine oder mehrere nicht-konservative Aminosäuresubstitutionen, Deletionen oder Insertionen, welche die biologische Aktivität nicht vernichten. Konservative Substitutionen schließen typischerweise Substitution von einer Aminosäure dwch ein andere mit ähnlichen Charakteristika ein, z. B. Substitutionen innerhalb der folgenden Gruppen: Valin, Glycin; Glycin, Alanin; Valin, Isoleucin, Leucin; Asparaginsäwe, Glutaminsäwe; Asparagin, Glutamin; Serin, Threonin; Lysin, Arginin; und Phenylalanin, Tyrosin. Andere konservative Substitutionen können der untenstehenden Tabelle entnommen werden.
• KONSERVATIVE AMINOSÄURE-ERSETZUNGEN

  
• 
• Andere verwendbare Modifikationen schließen solche ein, welche die Stabilität des Peptids erhöhen; solche Analoga können beispielsweise eine oder mehrere nicht-peptidische Bindungen (welche die Peptidbindungen ersetzen) oder D-Aminosäuren in der Peptidsequenz enthalten.
• Analoga können sich von einem natürlich vorkommenden Ikaros-Protein in der Aminosäuresequenz unterscheiden oder können in einer Weise modifiziert sein, die nicht die Sequenz betrifft, oder es liegt beides vor. Analoga der Erfindung werden im allgemeinen mindestens 70%, mehr bevorzugt 80%, mehr bevorzugt 90% und am meisten bevorzugt 95% oder sogar 99% Homologie aufweisen mit einem Segment von 20 Aminosäureresten, bevorzugt von mehr als 40 Aminosäureresten oder mehr bevorzugt der gesamten Sequenz der natürlich vorkommenden Ikarosprotein-Sequenz.
• Änderungen der Primärsequenz schließen genetische Variationen ein, sowohl natürliche wie auch induzierte. Ebenso eingeschlossen sind Analoga, welche andere Reste als natürlich vorkommende L-Aminosäuren einschließen, z. B. D-Aminosäuren oder nicht-natürlich vorkommende oder synthetische Aminosäuren, z. B. β- oder γ-Aminosäuren. Alternativ kann erhöhte Stabilität durch Zyklisieren des Peptidmoleküls vermittelt werden.
• Modifikationen, welche nicht die Sequenz betreffen, schließen chemische Derivatisierung der PolyPeptid in vivo oder in vitro ein, z. B. Acetylierung, Methylierung, Phosphorylierung, Carboxylierung oder Glykosylierung; die Glykosylierung kann modifiziert werden, z. B. durch Modifizieren der Glykosylierungsmuster eines Polypeptids während seiner Synthese und seines Prozessierens oder bei weiteren Prozessierungsschritten, z. B. indem das Polypeptid den die Glykosylierung-betreffenden Enzymen ausgesetzt wird, die von Zellen stammen, die normalerweise solches Prozessieren liefern, z. B. Glykosylierungsenzyme von Säugetieren; Phosphorylierung kann modifiziert werden, indem das Polypeptid Enzymen ausgesetzt wird, die Phosphorylierung verändern, z. B. Kinasen oder Phosphatasen.
• Zusätzlich zu den PolyPeptidn der vollen/gesamten Länge, schließt die Erfindung auch biologisch aktive Fragment der PolyPeptid ein. Der Ausdruck „Fragment" wie hierin verwendet bezogen auf ein Polypeptid wird von einer Länge sein, wie oben für ein Ikaros-Peptid beschrieben, und wird gewöhnlich eine Länge von mindestens 20 Resten, typischer von mindestens 40 Resten, bevorzugt von mindestens 6o Resten umfassen.
• Fragmente von Ikaros-Peptidn oder -Introns können durch Methoden hergestellt werden, die den Fachleuten auf dem Gebiet bekannt sind, z. B. durch Expression von Ikaros-DNS, welche in vitro manipuliert wurde, um für das erwünschte Fragment zu codieren; z. B. durch Restnktionsverdau einer Ikaros-DNS, z. B. der Sequenz in SEQ ID NO: 1 oder SEQ ID NO: 2. Analoga können durch Methoden hergestellt werden, die dem Fachmann bekannt sind, z. B. durch in vitro-DNS-Sequenzmodifikationen von der Sequenz einer Ikaros-DNS, z. B. der Sequenz in SEQ ID NO: 1 oder SEQ ID NO: 2. Beispielsweise kann in vitro-Mutagenese verwendet werden, um die DNS-Sequenz von SEQ ID NO: 1 in eine Sequenz umzuformen, welche für ein Analogon codiert, bei dem ein oder mehrere Aminosäuereste einer Ersetzung unterzogen wurden, z. B. einer konservativen Ersetzung wie in der hierin mitgelieferten Tabelle der konservativen Aminosäureersetzungen beschrieben. Fragmente oder Analoga können durch Methoden, die den Fachleuten auf dem. Gebiet bekannt sind, auf die Gegenwart von Ikaros-Aktivität hin untersucht werden.
• Ebenfalls eingeschlossen sind Ikarosprotein-PolyPeptid, welche Reste enthalten, die nicht für die biologische Aktivität des Peptids benötigt werden, so wie Reste, die nicht für die biologische Aktivität des Polypeptids benötigt werden, oder die sich aus alternativem mRNS-Spleißen oder aus alternativen Protein-Prozessierungs-Ereignissen ergeben.
• Die Erfindung schließt ebenfalls Nukleinsäuren ein, welche für die PolyPeptid der Erfindung codieren.
• Um ein Ikarosprotein zu erhalten, kann man für Ikaros-codierende DNS in einen Expressionsvektor inserieren, den Vektor in eine Zelle einführen, die geeignet ist zur Expression des gewünschten Proteins, und das gewünschte Protein nach bereits bekannten Methoden wiedergewinnen und reinigen. Antikörper gegen Ikarosproteine können durch Immunisieren eines Tieres gemacht werden, z. B. eines Kaninchens oder einer Maus, und Anti-Ikaros-Antikörper durch bereits bekannte Methoden gewonnen werden.
• Um ein spezifisches Spleißprodukt (d. h. eine spezifische Isoform) zu erhalten, kann man ein synthetisches Strukturgen herstellen, welches nur die Exons einschließt, die für das erwünschte Spleißprodukt codieren, und das Gen wie oben beschrieben exprimieren.
• Andere Ausführungsformen sind innerhalb der nachfolgenden Patentansprüche.
• Es werden folgende Patentansprüche erhoben:
• SEQUENZAUFLISTUNG
• (1) ALLGEMEINE INFORMATIONEN:
• (i) ANMELDER:
• (A) NAME: The General Hospital Corporation
• (B) STRASSE: 55 Fruit Street
• (C) STADT: Boston
• (D) STAAT: Massachusetts
• (E) LAND: U.S.A
• (F) POSTLEITZAHL: 02114
• (G) TELEFON: (617) 726-8608
• (H) TELEFAX: (617) 726-1668
• (ii) BEZEICHNUNG DER ERFINDUNG: Ein regulatorisches Gen des T-Zell-Entwicklungsweges
• (iii) ANZAHL DER SEQUENZEN: 152
• (iv) COMPUTER-LESBARE FORM:
• (A) DATENTRÄGER: diskette
• (B) COMPUTER: IBM PC compatible
• (C) BETRIEBSSYSTEM: PC-DOS/MS-DOS
• (D) SOFTWARE: ASCII
• (v) VORLIEGENDE PATENTANMELDUNG:
• (A) NUMMER DER PATENTANMELDUNG:
• (vi) FRÜHERE PATENTANMELDUNG:
• (A) NUMMER DER PATENTANMELDUNG: US 946 233
• (B) ANMELDEDATUM: 14-Sep-1992
• (ix) INFORMATIONEN ZUR TELEKOMMUNIKATION:
• (A) Telefon: (617) 227-7400
• (B) Telefax: (617) 227-5941
• (2) INFORMATIONEN ZU SEQ ID NO:1:
• (i) SEQUENZ-CHARAKTERISTIKA:
• (A) SEQUENZ-LÄNGE: 38 Basenpaare
• (B) SEQUENZ-TYP: Nukleinsäure
• (C) STRANGCHARAKTER: Einzel
• (D) TOPOLOGIE: Linear
• (ii) MOLEKULAR-TYP: ADNc
• (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO:1:
  
• (2) INFORMATIONEN ZU SEQ ID NO:2:
• (i) SEQUENZ-CHARAKTERISTIKA:
• (A) SEQUENZ-LÄNGE: 1788 Basenpaare
• (B) SEQUENZ-TYP: Nukleinsäure
• (C) STRANGCHARAKTER: Einzel
• (D) TOPOLOGIE: Linear
• (ii) MOLEKULAR-TYP: ADNc
• (ix) MERKMAL:
• (A) NAME/SCHLÜSSEL: CDS
• (B) LAGE:223..1515
• (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO:2:
  
  
  
• (2) INFORMATIONEN ZU SEQ ID NO:3:
• (i) SEQUENZ-CHARAKTERISTIKA:
• (A) SEQUENZ-LÄNGE: 1611 Basenpaare
• (B) SEQUENZ-TYP: Nukleinsäure
• (C) STRANGCHARAKTER: Einzel
• (D) TOPOLOGIE: Linear
• (ii) MOLEKULAR-TYP: ADNc
• (ix) MERKMAL:
• (A) NAME/SCHLÜSSEL: CDS
• (B) LAGE: 1..1611
• (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO:3:
  
  
  
• (2) INFORMATIONEN ZU SEQ ID NO:4:
• (i) SEQUENZ-CHARAKTERISTIKA:
• (A) SEQUENZ-LÄNGE: 38 Basenpaare
• (B) SEQUENZ-TYP: Nukleinsäure
• (C) STRANGCHARAKTER: Einzel
• (D) TOPOLOGIE: Linear
• (ii) MOLEKULAR-TYP: ADNc.
• (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO:4:
  
• (2) INFORMATIONEN ZU SEQ ID NO:5:
• (i) SEQUENZ-CHARAKTERISTIKA:
• (A) SEQUENZ-LÄNGE: 568 Aminosäuren
• (B) SEQUENZ-TYP: Aminosäure
• (C) STRANGCHARAKTER: Einzel
• (D) TOPOLOGIE: Linear
• (ii) MOLEKULAR-TYP: Peptid
• (v) ART DES FRAGMENTES: Inneres
• (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO:5:
  
  
• (2) INFORMATIONEN ZU SEQ ID NO:6:
• (i) SEQUENZ-CHARAKTERISTIKA:
• (A) SEQUENZ-LÄNGE: 13 Basenpaare
• (B) SEQUENZ-TYP: Nukleinsäure
• (C) STRANGCHARAKTER: Einzel
• (D) TOPOLOGIE: Linear
• (ii) MOLEKULAR-TYP: ADNc
• (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO:6:
  
• (2) INFORMATIONEN ZU SEQ ID NO:7:
• (i) SEQUENZ-CHARAKTERISTIKA:
• (A) SEQUENZ-LÄNGE: 13 Basenpaare
• (B) SEQUENZ-TYP: Nukleinsäure
• (C) STRANGCHARAKTER: Einzel
• (D) TOPOLOGIE: Linear
• (ii) MOLEKULAR-TYP: ADNc
• (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO:7:
  
• (2) INFORMATIONEN ZU SEQ ID NO:8:
• (i) SEQUENZ-CHARAKTERISTIKA:
• (A) SEQUENZ-LÄNGE: 12 Basenpaare
• (B) SEQUENZ-TYP: Nukleinsäure
• (C) STRANGCHARAKTER: Einzel
• (D) TOPOLOGIE: Linear
• (ii) MOLEKULAR-TYP: ADNc
• (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO:8:
  
• (2) INFORMATIONEN ZU SEQ ID NO:9:
• (i) SEQUENZ-CHARAKTERISTIKA:
• (A) SEQUENZ-LÄNGE: 24 Basenpaare
• (B) SEQUENZ-TYP: Nukleinsäure
• (C) STRANGCHARAKTER: Einzel
• (D) TOPOLOGIE: Linear
• (ii) MOLEKULAR-TYP: ADNc
• (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO:9:
  
• (2) INFORMATIONEN ZU SEQ ID NO:10:
• (i) SEQUENZ-CHARAKTERISTIKA:
• (A) SEQUENZ-LÄNGE: 24 Basenpaare
• (B) SEQUENZ-TYP: Nukleinsäure
• (C) STRANGCHARAKTER: Einzel
• (D) TOPOLOGIE: Linear
• (ii) MOLEKULAR-TYP: ADNc
• (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO:10:
  
• (2) INFORMATIONEN ZU SEQ ID NO:11:
• (i) SEQUENZ-CHARAKTERISTIKA:
• (A) SEQUENZ-LÄNGE: 25 Basenpaare
• (B) SEQUENZ-TYP: Nukleinsäure
• (C) STRANGCHARAKTER: Einzel
• (D) TOPOLOGIE: Linear
• (ii) MOLEKULAR-TYP: ADNc
• (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO:11:
  
• (2) INFORMATIONEN ZU SEQ ID NO:12:
• (i) SEQUENZ-CHARAKTERISTIKA:
• (A) SEQUENZ-LÄNGE: 24 Basenpaare
• (B) SEQUENZ-TYP: Nukleinsäure
• (C) STRANGCHARAKTER: Einzel
• (D) TOPOLOGIE: Linear
• (ii) MOLEKULAR-TYP: ADNc
• (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO:12:
  
• (2) INFORMATIONEN ZU SEQ ID NO:13:
• (i) SEQUENZ-CHARAKTERISTIKA:
• (A) SEQUENZ-LÄNGE: 24 Basenpaare
• (B) SEQUENZ-TYP: Nukleinsäure
• (C) STRANGCHARAKTER: Einzel
• (D) TOPOLOGIE: Linear
• (ü) MOLEKULAR-TYP: ADNc
• (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO:13:
  
• (2) INFORMATIONEN ZU SEQ ID NO:14:
• (i) SEQUENZ-CHARAKTERISTIKA:
• (A) SEQUENZ-LÄNGE: 24 Basenpaare
• (B) SEQUENZ-TYP: Nukleinsäure
• (C) STRANGCHARAKTER: Einzel
• (D) TOPOLOGIE: Linear
• (ii) MOLEKULAR-TYP: ADNc
• (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO:14:
  
• (2) INFORMATIONEN ZU SEQ ID NO:15:
• (i) SEQUENZ-CHARAKTERISTIKA:
• (A) SEQUENZ-LÄNGE: 24 Basenpaare
• (B) SEQUENZ-TYP: Nukleinsäure
• (C) STRANGCHARAKTER: Einzel
• (D) TOPOLOGIE: Linear
• (ii) MOLEKULAR-TYP: ADNc
• (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO:15:
  
• (2) INFORMATIONEN ZU SEQ ID NO:16:
• (i) SEQUENZ-CHARAKTERISTIKA:
• (A) SEQUENZ-LÄNGE: 24 Basenpaare
• (B) SEQUENZ-TYP: Nukleinsäure
• (C) STRANGCHARAKTER: Einzel
• (D) TOPOLOGIE: Linear
• (ii) MOLEKULAR-TYP: ADNc
• (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO:16:
  
• (2) INFORMATIONEN ZU SEQ ID NO:17:
• (i) SEQUENZ-CHARAKTERISTIKA:
• (A) SEQUENZ-LÄNGE: 28 Basenpaare
• (B) SEQUENZ-TYP: Nukleinsäure
• (C) STRANGCHARAKTER: Einzel
• (D) TOPOLOGIE: Linear
• (ii) MOLEKULAR-TYP: ADNc
• (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO:17:
  
• (2) INFORMATIONEN ZU SEQ ID NO:18:
• (i) SEQUENZ-CHARAKTERISTIKA:
• (A) SEQUENZ-LÄNGE: 24 Basenpaare
• (B) SEQUENZ-TYP: Nukleinsäure
• (C) STRANGCHARAKTER: Einzel
• (D) TOPOLOGIE: Linear
• (ii) MOLEKULAR-TYP: ADNc
• (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO:18:
  
• (2) INFORMATIONEN ZU SEQ ID NO:19:
• (i) SEQUENZ-CHARAKTERISTIKA:
• (A) SEQUENZ-LÄNGE: 24 Basenpaare
• (B) SEQUENZ-TYP: Nukleinsäure
• (C) STRANGCHARAKTER: Einzel
• (D) TOPOLOGIE: Linear
• (ii) MOLEKULAR-TYP: ADNc
• (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO:19:
  
• (2) INFORMATIONEN ZU SEQ ID NO:20:
• (i) SEQUENZ-CHARAKTERISTIKA:
• (A) SEQUENZ-LÄNGE: 24 Basenpaare
• (B) SEQUENZ-TYP: Nukleinsäure
• (C) STRANGCHARAKTER: Einzel
• (D) TOPOLOGIE: Linear
• (ii) MOLEKULAR-TYP: ADNc
• (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO:20:
  
• (2) INFORMATIONEN ZU SEQ ID NO:21:
• (i) SEQUENZ-CHARAKTERISTIKA:
• (A) SEQUENZ-LÄNGE: 27 Basenpaare
• (B) SEQUENZ-TYP: Nukleinsäure
• (C) STRANGCHARAKTER: Einzel
• (D) TOPOLOGIE: Linear
• (ii) MOLEKULAR-TYP: ADNc
• (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO:21:
  
• (2) INFORMATIONEN ZU SEQ ID NO:22:
• (i) SEQUENZ-CHARAKTERISTIKA:
• (A) SEQUENZ-LÄNGE: 24 Basenpaare
• (B) SEQUENZ-TYP: Nukleinsäure
• (C) STRANGCHARAKTER: Einzel
• (D) TOPOLOGIE: Linear
• (ii) MOLEKULAR-TYP: ADNc
• (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO:22:
  
• (2) INFORMATIONEN ZU SEQ ID NO:23:
• (i) SEQUENZ-CHARAKTERISTIKA:
• (A) SEQUENZ-LÄNGE: 24 Basenpaare
• (B) SEQUENZ-TYP: Nukleinsäure
• (C) STRANGCHARAKTER: Einzel
• (D) TOPOLOGIE: Linear
• (ii) MOLEKULAR-TYP: ADNc
• (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO:23:
  
• (2) INFORMATIONEN ZU SEQ ID NO:24:
• (i) SEQUENZ-CHARAKTERISTIKA:
• (A) SEQUENZ-LÄNGE: 24 Basenpaare
• (B) SEQUENZ-TYP: Nukleinsäure
• (C) STRANGCHARAKTER: Einzel
• (D) TOPOLOGIE: Linear
• (ii) MOLEKULAR-TYP: ADNc
• (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO:24:
  
• (2) INFORMATIONEN ZU SEQ ID NO:25:
• (i) SEQUENZ-CHARAKTERISTIKA:
• (A) SEQUENZ-LÄNGE: 24 Basenpaare
• (B) SEQUENZ-TYP: Nukleinsäure
• (C) STRANGCHARAKTER: Einzel
• (D) TOPOLOGIE: Linear
• (ii) MOLEKULAR-TYP: ADNc
• (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO:25:
  
• (2) INFORMATIONEN ZU SEQ ID NO:26:
• (i) SEQUENZ-CHARAKTERISTIKA:
• (A) SEQUENZ-LÄNGE: 24 Basenpaare
• (B) SEQUENZ-TYP: Nukleinsäure
• (C) STRANGCHARAKTER: Einzel
• (D) TOPOLOGIE: Linear
• (ii) MOLEKULAR-TYP: ADNc
• (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO:26:
  
• (2) INFORMATIONEN ZU SEQ ID NO:27:
• (i) SEQUENZ-CHARAKTERISTIKA:
• (A) SEQUENZ-LÄNGE: 24 Basenpaare
• (B) SEQUENZ-TYP: Nukleinsäure
• (C) STRANGCHARAKTER: Einzel
• (D) TOPOLOGIE: Linear
• (ii) MOLEKULAR-TYP: ADNc
• (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO:27:
  
• (2) INFORMATIONEN ZU SEQ ID NO:28:
• (i) SEQUENZ-CHARAKTERISTIKA:
• (A) SEQUENZ-LÄNGE: 24 Basenpaare
• (B) SEQUENZ-TYP: Nukleinsäure
• (C) STRANGCHARAKTER: Einzel
• (D) TOPOLOGIE: Linear
• (ii) MOLEKULAR-TYP: ADNc
• (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO:28:
  
• (2) INFORMATIONEN ZU SEQ ID NO:29:
• (i) SEQUENZ-CHARAKTERISTIKA:
• (A) SEQUENZ-LÄNGE: 24 Basenpaare
• (B) SEQUENZ-TYP: Nukleinsäure
• (C) STRANGCHARAKTER: Einzel
• (D) TOPOLOGIE: Linear
• (ii) MOLEKULAR-TYP: ADNc
• (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO:29:
  
• (2) INFORMATIONEN ZU SEQ ID NO:30:
• (i) SEQUENZ-CHARAKTERISTIKA:
• (A) SEQUENZ-LÄNGE: 24 Basenpaare
• (B) SEQUENZ-TYP: Nukleinsäure
• (C) STRANGCHARAKTER: Einzel
• (D) TOPOLOGIE: Linear
• (ii) MOLEKULAR-TYP: ADNc
• (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO:30:
  
• (2) INFORMATIONEN ZU SEQ ID NO:31:
• (i) SEQUENZ-CHARAKTERISTIKA:
• (A) SEQUENZ-LÄNGE: 24 Basenpaare
• (B) SEQUENZ-TYP: Nukleinsäure
• (C) STRANGCHARAKTER: Einzel
• (D) TOPOLOGIE: Linear
• (ii) MOLEKULAR-TYP: ADNc
• (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO:31:
  
• (2) INFORMATIONEN ZU SEQ ID NO:32:
• (i) SEQUENZ-CHARAKTERISTIKA:
• (A) SEQUENZ-LÄNGE: 24 Basenpaare
• (B) SEQUENZ-TYP: Nukleinsäure
• (C) STRANGCHARAKTER: Einzel
• (D) TOPOLOGIE: Linear
• (ii) MOLEKULAR-TYP: ADNc
• (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO:32:
  
• (2) INFORMATIONEN ZU SEQ ID NO:33:
• (i) SEQUENZ-CHARAKTERISTIKA:
• (A) SEQUENZ-LÄNGE: 23 Basenpaare
• (B) SEQUENZ-TYP: Nukleinsäure
• (C) STRANGCHARAKTER: Einzel
• (D) TOPOLOGIE: Linear
• (ii) MOLEKULAR-TYP: ADNc
• (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO:33:
  
• (2) INFORMATIONEN ZU SEQ ID NO:34:
• (i) SEQUENZ-CHARAKTERISTIKA:
• (A) SEQUENZ-LÄNGE: 24 Basenpaare
• (B) SEQUENZ-TYP: Nukleinsäure
• (C) STRANGCHARAKTER: Einzel
• (D) TOPOLOGIE: Linear
• (ii) MOLEKULAR-TYP: ADNc
• (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO:34:
  
• (2) INFORMATIONEN ZU SEQ ID NO:35:
• (i) SEQUENZ-CHARAKTERISTIKA:
• (A) SEQUENZ-LÄNGE: 13 Basenpaare
• (B) SEQUENZ-TYP: Nukleinsäure
• (C) STRANGCHARAKTER: Einzel
• (D) TOPOLOGIE: Linear
• (ii) MOLEKULAR-TYP: ADNc
• (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO:35:
  
• (2) INFORMATIONEN ZU SEQ ID NO:36:
• (i) SEQUENZ-CHARAKTERISTIKA:
• (A) SEQUENZ-LÄNGE: 24 Basenpaare
• (B) SEQUENZ-TYP: Nukleinsäure
• (C) STRANGCHARAKTER: Einzel
• (D) TOPOLOGIE: Linear
• (ii) MOLEKULAR-TYP: ADNc
• (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO:36:
  
• (2) INFORMATIONEN ZU SEQ ID NO:37:
• (i) SEQUENZ-CHARAKTERISTIKA:
• (A) SEQUENZ-LÄNGE: 24 Basenpaare
• (B) SEQUENZ-TYP: Nukleinsäure
• (C) STRANGCHARAKTER: Einzel
• (D) TOPOLOGIE: Linear
• (ii) MOLEKULAR-TYP: ADNc
• (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO:37:
  
• (2) INFORMATIONEN ZU SEQ ID NO:38:
• (i) SEQUENZ-CHARAKTERISTIKA:
• (A) SEQUENZ-LÄNGE: 24 Basenpaare
• (B) SEQUENZ-TYP: Nukleinsäure
• (C) STRANGCHARAKTER: Einzel
• (D) TOPOLOGIE: Linear
• (ii) MOLEKULAR-TYP: ADNc
• (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO:38:
  
• (2) INFORMATIONEN ZU SEQ ID NO:39:
• (i) SEQUENZ-CHARAKTERISTIKA:
• (A) SEQUENZ-LÄNGE: 24 Basenpaare
• (B) SEQUENZ-TYP: Nukleinsäure
• (C) STRANGCHARAKTER: Einzel
• (D) TOPOLOGIE: Linear
• (ii) MOLEKULAR-TYP: ADNc
• (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO:39:
  
• (2) INFORMATIONEN ZU SEQ ID NO:40:
• (i) SEQUENZ-CHARAKTERISTIKA:
• (A) SEQUENZ-LÄNGE: 24 Basenpaare
• (B) SEQUENZ-TYP: Nukleinsäure
• (C) STRANGCHARAKTER: Einzel
• (D) TOPOLOGIE: Linear
• (ii) MOLEKULAR-TYP: ADNc
• s(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO:40:
  
• (2) INFORMATIONEN ZU SEQ ID NO:41:
• (i) SEQUENZ-CHARAKTERISTIKA:
• (A) SEQUENZ-LÄNGE: 24 Basenpaare
• (B) SEQUENZ-TYP: Nukleinsäure
• (C) STRANGCHARAKTER: Einzel
• (D) TOPOLOGIE: Linear
• (ii) MOLEKULAR-TYP: ADNc
• (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO:41:
  
• (2) INFORMATIONEN ZU SEQ ID NO:42:
• (i) SEQUENZ-CHARAKTERISTIKA:
• (A) SEQUENZ-LÄNGE: 24 Basenpaare
• (B) SEQUENZ-TYP: Nukleinsäure
• (C) STRANGCHARAKTER: Einzel
• (D) TOPOLOGIE: Linear
• (ii) MOLEKULAR-TYP: ADNc
• (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO:42:
  
• (2) INFORMATIONEN ZU SEQ ID NO:43:
• (i) SEQUENZ-CHARAKTERISTIKA:
• (A) SEQUENZ-LÄNGE: 24 Basenpaare
• (B) SEQUENZ-TYP: Nukleinsäure
• (C) STRANGCHARAKTER: Einzel
• (D) TOPOLOGIE: Linear
• (ii) MOLEKULAR-TYP: ADNc
• (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO:43:
  
• (2) INFORMATIONEN ZU SEQ ID NO:44:
• (i) SEQUENZ-CHARAKTERISTIKA:
• (A) SEQUENZ-LÄNGE: 24 Basenpaare
• (B) SEQUENZ-TYP: Nukleinsäure
• (C) STRANGCHARAKTER: Einzel
• (D) TOPOLOGIE: Linear
• (ii) MOLEKULAR-TYP: ADNc
• (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO:44:
  
• (2) INFORMATIONEN ZU SEQ ID NO:45:
• (i) SEQUENZ-CHARAKTERISTIKA:
• (A) SEQUENZ-LÄNGE: 24 Basenpaare
• (B) SEQUENZ-TYP: Nukleinsäure
• (C) STRANGCHARAKTER: Einzel
• (D) TOPOLOGIE: Linear
• (ii) MOLEKULAR-TYP: ADNc
• (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO:45:
  
• (2) INFORMATIONEN ZU SEQ ID NO:46:
• (i) SEQUENZ-CHARAKTERISTIKA:
• (A) SEQUENZ-LÄNGE: 25 Basenpaare
• (B) SEQUENZ-TYP: Nukleinsäure
• (C) STRANGCHARAKTER: Einzel
• (D) TOPOLOGIE: Linear
• (ii) MOLEKULAR-TYP: ADNc
• (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO:46:
  
• (2) INFORMATIONEN ZU SEQ ID NO:47:
• (i) SEQUENZ-CHARAKTERISTIKA:
• (A) SEQUENZ-LÄNGE: 23 Basenpaare
• (B) SEQUENZ-TYP: Nukleinsäure
• (C) STRANGCHARAKTER: Einzel
• (D) TOPOLOGIE: Linear
• (ii) MOLEKULAR-TYP: ADNc
• (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO:47:
  
• (2) INFORMATIONEN ZU SEQ ID NO:48:
• (i) SEQUENZ-CHARAKTERISTIKA:
• (A) SEQUENZ-LÄNGE: 24 Basenpaare
• (B) SEQUENZ-TYP: Nukleinsäure
• (C) STRANGCHARAKTER: Einzel
• (D) TOPOLOGIE: Linear
• (ii) MOLEKULAR-TYP: ADNc
• (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO:48:
  
• (2) INFORMATIONEN ZU SEQ ID NO:49:
• (i) SEQUENZ-CHARAKTERISTIKA:
• (A) SEQUENZ-LÄNGE: 24 Basenpaare
• (B) SEQUENZ-TYP: Nukleinsäure
• (C) STRANGCHARAKTER: Einzel
• (D) TOPOLOGIE: Linear
• (ii) MOLEKULAR-TYP: ADNc
• (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO:49:
  
• (2) INFORMATIONEN ZU SEQ ID NO:50:
• (i) SEQUENZ-CHARAKTERISTIKA:
• (A) SEQUENZ-LÄNGE: 26 Basenpaare
• (B) SEQUENZ-TYP: Nukleinsäure
• (C) STRANGCHARAKTER: Einzel
• (D) TOPOLOGIE: Linear
• (ii) MOLEKULAR-TYP: ADNc
• (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO:50:
  
• (2) INFORMATIONEN ZU SEQ ID NO:51:
• (i) SEQUENZ-CHARAKTERISTIKA:
• (A) SEQUENZ-LÄNGE: 24 Basenpaare
• (B) SEQUENZ-TYP: Nukleinsäure
• (C) STRANGCHARAKTER: Einzel
• (D) TOPOLOGIE: Linear
• (ii) MOLEKULAR-TYP: ADNc
• (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO:51:
  
• (2) INFORMATIONEN ZU SEQ ID NO:52:
• (i) SEQUENZ-CHARAKTERISTIKA:
• (A) SEQENZ-LÄNGE: 24 Basenpaare
• (B) SEQUENZ-TYP: Nukleinsäure
• (C) STRANGCHARAKTER: Einzel
• (D) TOPOLOGIE: Linear
• (ii) MOLEKULAR-TYP: ADNc
• (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO:52:
  
• (2) INFORMATIONEN ZU SEQ ID NO:53:
• (i) SEQUENZ-CHARAKTERISTIKA:
• (A) SEQUENZ-LÄNGE: 24 Basenpaare
• (B) SEQUENZ-TYP: Nukleinsäure
• (C) STRANGCHARAKTER: Einzel
• (D) TOPOLOGIE: Linear
• (ii) MOLEKULAR-TYP: ADNc
• (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO:53:
  
• (2) INFORMATIONEN ZU SEQ ID NO:54:
• (i) SEQUENZ-CHARAKTERISTIKA:
• (A) SEQUENZ-LÄNGE: 23 Basenpaare
• (B) SEQUENZ-TYP: Nukleinsäure
• (C) STRANGCHARAKTER: Einzel
• (D) TOPOLOGIE: Linear
• (ii) MOLEKULAR-TYP: ADNc
• (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO:54:
  
• (2) INFORMATIONEN ZU SEQ ID NO:55:
• (i) SEQUENZ-CHARAKTERISTIKA:
• (A) SEQUENZ-LÄNGE: 24 Basenpaare
• (B) SEQUENZ-TYP: Nukleinsäure
• (C) STRANGCHARAKTER: Einzel
• (D) TOPOLOGIE: Linear
• (ii) MOLEKULAR-TYP: ADNc
• (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO:55:
  
• (2) INFORMATIONEN ZU SEQ ID NO:56:
• (i) SEQUENZ-CHARAKTERISTIKA:
• (A) SEQUENZ-LÄNGE: 24 Basenpaare
• (B) SEQUENZ-TYP: Nukleinsäure
• (C) STRANGCHARAKTER: Einzel
• (D) TOPOLOGIE: Linear
• (ii) MOLEKULAR-TYP: ADNc
• (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO:56:
  
• (2) INFORMATIONEN ZU SEQ ID NO:57:
• (i) SEQUENZ-CHARAKTERISTIKA:
• (A) SEQUENZ-LÄNGE: 24 Basenpaare
• (B) SEQUENZ-TYP: Nukleinsäure
• (C) STRANGCHARAKTER: Einzel
• (D) TOPOLOGIE: Linear
• (ii) MOLEKULAR-TYP: ADNc
• (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO:57:
  
• (2) INFORMATIONEN ZU SEQ ID NO:58:
• (i) SEQUENZ-CHARAKTERISTIKA:
• (A) SEQUENZ-LÄNGE: 20 Basenpaare
• (B) SEQUENZ-TYP: Nukleinsäure
• (C) STRANGCHARAKTER: Einzel
• (D) TOPOLOGIE: Linear
• (ii) MOLEKULAR-TYP: ADNc
• (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO:58:
  
• (2) INFORMATIONEN ZU SEQ ID NO:59:
• (i) SEQUENZ-CHARAKTERISTIKA:
• (A) SEQUENZ-LÄNGE: 20 Basenpaare
• (B) SEQUENZ-TYP: Nukleinsäure
• (C) STRANGCHARAKTER: Einzel
• (D) TOPOLOGIE: Linear
• (ii) MOLEKULAR-TYP: ADNc
• (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO:59:
  
• (2) INFORMATIONEN ZU SEQ ID NO:60:
• (i) SEQUENZ-CHARAKTERISTIKA:
• (A) SEQUENZ-LÄNGE: 25 Basenpaare
• (B) SEQUENZ-TYP: Nukleinsäure
• (C) STRANGCHARAKTER: Einzel
• (D) TOPOLOGIE: Linear
• (ii) MOLEKULAR-TYP: ADNc
• (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO:60:
  
• (2) INFORMATIONEN ZU SEQ ID NO:61:
• (i) SEQUENZ-CHARAKTERISTIKA:
• (A) SEQUENZ-LÄNGE: 24 Basenpaare
• (B) SEQUENZ-TYP: Nukleinsäure
• (C) STRANGCHARAKTER: Einzel
• (D) TOPOLOGIE: Linear
• (ii) MOLEKULAR-TYP: ADNc
• (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO:61:
  
• (2) INFORMATIONEN ZU SEQ ID NO:62:
• (i) SEQUENZ-CHARAKTERISTIKA:
• (A) SEQUENZ-LÄNGE: 24 Basenpaare
• (B) SEQUENZ-TYP: Nukleinsäure
• (C) STRANGCHARAKTER: Einzel
• (D) TOPOLOGIE: Linear
• (ii) MOLEKULAR-TYP: ADNc
• (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO:62:
  
• (2) INFORMATIONEN ZU SEQ ID NO:63:
• (i) SEQUENZ-CHARAKTERISTIKA:
• (A) SEQUENZ-LÄNGE: 24 Basenpaare
• (B) SEQUENZ-TYP: Nukleinsäure
• (C) STRANGCHARAKTER: Einzel
• (D) TOPOLOGIE: Linear
• (ii) MOLEKULAR-TYP: ADNc
• (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO:63:
  
• (2) INFORMATIONEN ZU SEQ ID NO:64:
• (i) SEQUENZ-CHARAKTERISTIKA:
• (A) SEQUENZ-LÄNGE: 20 Basenpaare
• (B) SEQUENZ-TYP: Nukleinsäure
• (C) STRANGCHARAKTER: Einzel
• (D) TOPOLOGIE: Linear
• (ii) MOLEKULAR-TYP: ADNc
• (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO:64:
  
• (2) INFORMATIONEN ZU SEQ ID NO:65:
• (i) SEQUENZ-CHARAKTERISTIKA:
• (A) SEQUENZ-LÄNGE: 24 Basenpaare
• (B) SEQUENZ-TYP: Nukleinsäure
• (C) STRANGCHARAKTER: Einzel
• (D) TOPOLOGIE: Linear
• (ii) MOLEKULAR-TYP: ADNc
• (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO:65:
  
• (2) INFORMATIONEN ZU SEQ ID NO:66:
• (i) SEQUENZ-CHARAKTERISTIKA:
• (A) SEQUENZ-LÄNGE: 24 Basenpaare
• (B) SEQUENZ-TYP: Nukleinsäure
• (C) STRANGCHARAKTER: Einzel
• (D) TOPOLOGIE: Linear
• (ii) MOLEKULAR-TYP: ADNc
• (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO:66:
  
• (2) INFORMATIONEN ZU SEQ ID NO:67:
• (i) SEQUENZ-CHARAKTERISTIKA:
• (A) SEQUENZ-LÄNGE: 24 Basenpaare
• (B) SEQUENZ-TYP: Nukleinsäure
• (C) STRANGCHARAKTER: Einzel
• (D) TOPOLOGIE: Linear
• (ii) MOLEKULAR-TYP: ADNc
• (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO:67:
  
• (2) INFORMATIONEN ZU SEQ ID NO:68:
• (i) SEQUENZ-CHARAKTERISTIKA:
• (A) SEQUENZ-LÄNGE: 24 Basenpaare
• (B) SEQUENZ-TYP: Nukleinsäure
• (C) STRANGCHARAKTER: Einzel
• (D) TOPOLOGIE: Linear
• (ii) MOLEKULAR-TYP: ADNc
• (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO:68:
  
• (2) INFORMATIONEN ZU SEQ ID NO:69:
• (i) SEQUENZ-CHARAKTERISTIKA:
• (A) SEQUENZ-LÄNGE: 24 Basenpaare
• (B) SEQUENZ-TYP: Nukleinsäure
• (C) STRANGCHARAKTER: Einzel
• (D) TOPOLOGIE: Linear
• (ii) MOLEKULAR-TYP: ADNc
• (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO:69:
  
• (2) INFORMATIONEN ZU SEQ ID NO:70:
• (i) SEQUENZ-CHARAKTERISTIKA:
• (A) SEQUENZ-LÄNGE: 24 Basenpaare
• (B) SEQUENZ-TYP: Nukleinsäure
• (C) STRANGCHARAKTER: Einzel
• (D) TOPOLOGIE: Linear
• (ii) MOLEKULAR-TYP: ADNc
• (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO:70:
  
• (2) INFORMATIONEN ZU SEQ ID NO:71:
• (i) SEQUENZ-CHARAKTERISTIKA:
• (A) SEQUENZ-LÄNGE: 24 Basenpaare
• (B) SEQUENZ-TYP: Nukleinsäure
• (C) STRANGCHARAKTER: Einzel
• (D) TOPOLOGIE: Linear
• (ii) MOLEKULAR-TYP: ADNc
• (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO:71:
  
• (2) INFORMATIONEN ZU SEQ ID NO:72:
• (i) SEQUENZ-CHARAKTERISTIKA:
• (A) SEQUENZ-LÄNGE: 24 Basenpaare
• (B) SEQUENZ-TYP: Nukleinsäure
• (C) STRANGCHARAKTER: Einzel
• (D) TOPOLOGIE: Linear
• (ii) MOLEKULAR-TYP: ADNc
• (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO:72:
  
• (2) INFORMATIONEN ZU SEQ ID NO:73:
• (i) SEQUENZ-CHARAKTERISTIKA:
• (A) SEQUENZ-LÄNGE: 24 Basenpaare
• (B) SEQUENZ-TYP: Nukleinsäure
• (C) STRANGCHARAKTER: Einzel
• (D) TOPOLOGIE: Linear
• (ii) MOLEKULAR-TYP: ADNc
• (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO:73:
  
• (2) INFORMATIONEN ZU SEQ ID NO:74:
• (i) SEQUENZ-CHARAKTERISTIKA:
• (A) SEQUENZ-LÄNGE: 12 Basenpaare
• (B) SEQUENZ-TYP: Nukleinsäure
• (C) STRANGCHARAKTER: Einzel
• (D) TOPOLOGIE: Linear
• (ii) MOLEKULAR-TYP: ADNc
• (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO:74:
  
• (2) INFORMATIONEN ZU SEQ ID NO:75:
• (i) SEQUENZ-CHARAKTERISTIKA:
• (A) SEQUENZ-LÄNGE: 24 Basenpaare
• (B) SEQUENZ-TYP: Nukleinsäure
• (C) STRANGCHARAKTER: Einzel
• (D) TOPOLOGIE: Linear
• (ii) MOLEKULAR-TYP: ADNc
• (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO:75:
  
• (2) INFORMATIONEN ZU SEQ ID NO:76:
• (i) SEQUENZ-CHARAKTERISTIKA:
• (A) SEQUENZ-LÄNGE: 24 Basenpaare
• (B) SEQUENZ-TYP: Nukleinsäure
• (C) STRANGCHARAKTER: Einzel
• (D) TOPOLOGIE: Linear
• (ii) MOLEKULAR-TYP: ADNc
• (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO:76:
  
• (2) IFORMATIONEN ZU SEQ ID NO:77:
• (i) SEQUENZ-CHARAKTERISTIKA:
• (A) SEQUENZ-LÄNGE: 25 Basenpaare
• (B) SEQUENZ-TYP: Nukleinsäure
• (C) STRANGCHARAKTER: Einzel
• (D) TOPOLOGIE: Linear
• (ii) MOLEKULAR-TYP: ADNc
• (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO:77:
  
• (2) INFORMATIONEN ZU SEQ ID NO:78:
• (i) SEQUENZ-CHARAKTERISTIKA:
• (A) SEQUENZ-LÄNGE: 23 Basenpaare
• (B) SEQUENZ-TYP: Nukleinsäure
• (C) STRANGCHARAKTER: Einzel
• (D) TOPOLOGIE: Linear
• (ii) MOLEKULAR-TYP: ADNc
• (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO:78:
  
• (2) INFORMATIONEN ZU SEQ ID NO:79:
• (i) SEQUENZ-CHARAKTERISTIKA:
• (A) SEQUENZ-LÄNGE: 24 Basenpaare
• (B) SEQUENZ-TYP: Nukleinsäure
• (C) STRANGCHARAKTER: Einzel
• (D) TOPOLOGIE: Linear
• (ii) MOLEKULAR-TYP: ADNc
• (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO:79:
  
• (2) INFORMATIONEN ZU SEQ ID NO:80:
• (i) SEQUENZ-CHARAKTERISTIKA:
• (A) SEQUENZ-LÄNGE: 25 Basenpaare
• (B) SEQUENZ-TYP: Nukleinsäure
• (C) STRANGCHARAKTER: Einzel
• (D) TOPOLOGIE: Linear
• (ii) MOLEKULAR-TYP: ADNc
• (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO:80:
  
• (2) INFORMATIONEN ZU SEQ ID NO:81:
• (i) SEQUENZ-CHARAKTERISTIKA:
• (A) SEQUENZ-LÄNGE: 25 Basenpaare
• (B) SEQUENZ-TYP: Nukleinsäure
• (C) STRANGCHARAKTER: Einzel
• (D) TOPOLOGIE: Linear
• (ii) MOLEKULAR-TYP: ADNc
• (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO:81:
  
• (2) INFORMATIONEN ZU SEQ ID NO:82:
• (i) SEQUENZ-CHARAKTERISTIKA:
• (A) SEQUENZ-LÄNGE: 25 Basenpaare
• (B) SEQUENZ-TYP: Nukleinsäure
• (C) STRANGCHARAKTER: Einzel
• (D) TOPOLOGIE: Linear
• (ii) MOLEKULAR-TYP: ADNc
• (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO:82:
  
• (2) INFORMATIONEN ZU SEQ ID NO:83:
• (i) SEQUENZ-CHARAKTERISTIKA:
• (A) SEQUENZ-LÄNGE: 25 Basenpaare
• (B) SEQUENZ-TYP: Nukleinsäure
• (C) STRANGCHARAKTER: Einzel
• (D) TOPOLOGIE: Linear
• (ii) MOLEKULAR-TYP: ADNc
• (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO:83:
  
• (2) INFORMATIONEN ZU SEQ ID NO:84:
• (i) SEQUENZ-CHARAKTERISTIKA:
• (A) SEQUENZ-LÄNGE: 24 Basenpaare
• (B) SEQUENZ-TYP: Nukleinsäure
• (C) STRANGCHARAKTER: Einzel
• (D) TOPOLOGIE: Linear
• (ii) MOLEKULAR-TYP: ADNc
• (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO:84:
  
• (2) INFORMATIONEN ZU SEQ ID NO:85:
• (i) SEQUENZ-CHARAKTERISTIKA:
• (A) SEQUENZ-LÄNGE: 24 Basenpaare
• (B) SEQUENZ-TYP: Nukleinsäure
• (C) STRANGCHARAKTER: Einzel
• (D) TOPOLOGIE: Linear
• (ii) MOLEKULAR-TYP: ADNc
• (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO:85:
  
• (2) INFORMATIONEN ZU SEQ ID NO:86:
• (i) SEQUENZ-CHARAKTERISTIKA:
• (A) SEQUENZ-LÄNGE: 24 Basenpaare
• (B) SEQUENZ-TYP: Nukleinsäure
• (C) STRANGCHARAKTER: Einzel
• (D) TOPOLOGIE: Linear
• (ii) MOLEKULAR-TYP: ADNc
• (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO:86:
  
• (2) INFORMATIONEN ZU SEQ ID NO:87:
• (i) SEQUENZ-CHARAKTERISTIKA:
• (A) SEQUENZ-LÄNGE: 24 Basenpaare
• (B) SEQUENZ-TYP: Nukleinsäure
• (C) STRANGCHARAKTER: Einzel
• (D) TOPOLOGIE: Linear
• (ii) MOLEKULAR-TYP: ADNc
• (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO:87:
  
• (2) INFORMATIONEN ZU SEQ ID NO:88:
• (i) SEQUENZ-CHARAKTERISTIKA:
• (A) SEQUENZ-LÄNGE: 25 Basenpaare
• (B) SEQUENZ-TYP: Nukleinsäure
• (C) STRANGCHARAKTER: Einzel
• (D) TOPOLOGIE: Linear
• (ii) MOLEKULAR-TYP: ADNc
• (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO:88:
  
• (2) INFORMATIONEN ZU SEQ ID NO:89:
• (i) SEQUENZ-CHARAKTERISTIKA:
• (A) SEQUENZ-LÄNGE: 24 Basenpaare
• (B) SEQUENZ-TYP: Nukleinsäure
• (C) STRANGCHARAKTER: Einzel
• (D) TOPOLOGIE: Linear
• (ii) MOLEKULAR-TYP: ADNc
• (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO:89:
  
• (2) INFORMATIONEN ZU SEQ ID NO:90:
• (i) SEQUENZ-CHARAKTERISTIKA:
• (A) SEQUENZ-LÄNGE: 24 Basenpaare
• (B) SEQUENZ-TYP: Nukleinsäure
• (C) STRANGCHARAKTER: Einzel
• (D) TOPOLOGIE: Linear
• (ii) MOLEKULAR-TYP: ADNc
• (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO:90:
  
• (2) INFORMATIONEN ZU SEQ ID NO:91:
• (i) SEQUENZ-CHARAKTERISTIKA:
• (A) SEQUENZ-LÄNGE: 25 Basenpaare
• (B) SEQUENZ-TYP: Nukleinsäure
• (C) STRANGCHARAKTER: Einzel
• (D) TOPOLOGIE: Linear
• (ii) MOLEKULAR-TYP: ADNc
• (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO:91:
  
• (2) INFORMATIONEN ZU SEQ ID NO:92:
• (i) SEQUENZ-CHARAKTERISTIKA:
• (A) SEQUENZ-LÄNGE: 24 Basenpaare
• (B) SEQUENZ-TYP: Nukleinsäure
• (C) STRANGCHARAKTER: Einzel
• (D) TOPOLOGIE: Linear
• (ii) MOLEKULAR-TYP: ADNc
• (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO:92:
  
• (2) INFORMATIONEN ZU SEQ ID NO:93:
• (i) SEQUENZ-CHARAKTERISTIKA:
• (A) SEQUENZ-LÄNGE: 24 Basenpaare
• (B) SEQUENZ-TYP: Nukleinsäure
• (C) STRANGCHARAKTER: Einzel
• (D) TOPOLOGIE: Linear
• (ii) MOLEKULAR-TYP: ADNc
• (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO:93:
  
• (2) INFORMATIONEN ZU SEQ ID NO:94:
• (i) SEQUENZ-CHARAKTERISTIKA:
• (A) SEQUENZ-LÄNGE: 24 Basenpaare
• (B) SEQUENZ-TYP: Nukleinsäure
• (C) STRANGCHARAKTER: Einzel
• (D) TOPOLOGIE: Linear
• (ii) MOLEKULAR-TYP: ADNc
• (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO:94:
  
• (2) INFORMATIONEN ZU SEQ ID NO:95:
• (i) SEQUENZ-CHARAKTERISTIKA:
• (A) SEQUENZ-LÄNGE: 25 Basenpaare
• (B) SEQUENZ-TYP: Nukleinsäure
• (C) STRANGCHARAKTER: Einzel
• (D) TOPOLOGIE: Linear
• (ii) MOLEKULAR-TYP: ADNc
• (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO:95:
  
• (2) INFORMATIONEN ZU SEQ ID NO:96:
• (i) SEQUENZ-CHARAKTERISTIKA:
• (A) SEQUENZ-LÄNGE: 24 Basenpaare
• (B) SEQUENZ-TYP: Nukleinsäure
• (C) STRANGCHARAKTER: Einzel
• (D) TOPOLOGIE: Linear
• (ii) MOLEKULAR-TYP: ADNc
• (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO:96:
  
• (2) INFORMATIONEN ZU SEQ ID NO:97:
• (i) SEQUENZ-CHARAKTERISTIKA:
• (A) SEQUENZ-LÄNGE: 25 Basenpaare
• (B) SEQUENZ-TYP: Nukleinsäure
• (C) STRANGCHARAKTER: Einzel
• (D) TOPOLOGIE: Linear
• (ii) MOLEKULAR-TYP: ADNc
• (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO:97:
  
• (2) INFORMATIONEN ZU SEQ ID NO:98:
• (i) SEQUENZ-CHARAKTERISTIKA:
• (A) SEQUENZ-LÄNGE: 23 Basenpaare
• (B) SEQUENZ-TYP: Nukleinsäure
• (C) STRANGCHARAKTER: Einzel
• (D) TOPOLOGIE: Linear
• (ii) MOLEKULAR-TYP: ADNc
• (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO:98:
  
• (2) INFORMATIONEN ZU SEQ ID NO:99:
• (i) SEQUENZ-CHARAKTERISTIKA:
• (A) SEQUENZ-LÄNGE: 24 Basenpaare
• (B) SEQUENZ-TYP: Nukleinsäure
• (C) STRANGCHARAKTER: Einzel
• (D) TOPOLOGIE: Linear
• (ii) MOLEKULAR-TYP: ADNc
• (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO:99:
  
• (2) INFORMATIONEN ZU SEQ ID NO:100:
• (i) SEQUENZ-CHARAKTERISTIKA:
• (A) SEQUENZ-LÄNGE: 13 Basenpaare
• (B) SEQUENZ-TYP: Nukleinsäure
• (C) STRANGCHARAKTER: Einzel
• (D) TOPOLOGIE: Linear
• (ii) MOLEKULAR-TYP: ADNc
• (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO:100:
  
• (2) INFORMATIONEN ZU SEQ ID NO:101:
• (i) SEQUENZ-CHARAKTERISTIKA:
• (A) SEQUENZ-LÄNGE: 13 Basenpaare
• (B) SEQUENZ-TYP: Nukleinsäure
• (C) STRANGCHARAKTER: Einzel
• (D) TOPOLOGIE: Linear
• (ii) MOLEKULAR-TYP: ADNc
• (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO:101:
  
• (2) INFORMATIONEN ZU SEQ ID NO:102:
• (i) SEQUENZ-CHARAKTERISTIKA:
• (A) SEQUENZ-LÄNGE: 24 Basenpaare
• (B) SEQUENZ-TYP: Nukleinsäure
• (C) STRANGCHARAKTER: Einzel
• (D) TOPOLOGIE: Linear
• (ii) MOLEKULAR-TYP: ADNc
• (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO:102:
  
• (2) INFORMATIONEN ZU SEQ ID NO:103:
• (i) SEQUENZ-CHARAKTERISTIKA:
• (A) SEQUENZ-LÄNGE: 22 Basenpaare
• (B) SEQUENZ-TYP: Nükleinsäure
• (C) STRANGCHARAKTER: Einzel
• (D) TOPOLOGIE: Linear
• (ii) MOLEKULAR-TYP: ADNc
• (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO:103:
  
• (2) INFORMATIONEN ZU SEQ ID NO:104:
• (i) SEQUENZ-CHARAKTERISTIKA:
• (A) SEQUENZ-LÄNGE: 14 Basenpaare
• (B) SEQUENZ-TYP: Nukleinsäure
• (C) STRANGCHARAKTER: Einzel
• (D) TOPOLOGIE: Linear
• (ii) MOLEKULAR-TYP: ADNc
• (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO:104:
  
• (2) INFORMATIONEN ZU SEQ ID NO:105:
• (i) SEQUENZ-CHARAKTERISTIKA:
• (A) SEQUENZ-LÄNGE: 19 Basenpaare
• (B) SEQUENZ-TYP: Nukleinsäure
• (C) STRANGCHARAKTER: Einzel
• (D) TOPOLOGIE: Linear
• (ii) MOLEKULAR-TYP: ADNc
• (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO:105:
  
• (2) INFORMATIONEN ZU SEQ ID NO:106:
• (i) SEQUENZ-CHARAKTERISTIKA:
• (A) SEQUENZ-LÄNGE: 12 Basenpaare
• (B) SEQUENZ-TYP: Nukleinsäure
• (C) STRANGCHARAKTER: Einzel
• (D) TOPOLOGIE: Linear
• (ii) MOLEKULAR-TYP: ADNc
• (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO:106:
  
• (2) INFORMATIONEN ZU SEQ ID NO:107:
• (i) SEQUENZ-CHARAKTERISTIKA:
• (A) SEQUENZ-LÄNGE: 13 Basenpaare
• (B) SEQUENZ-TYP: Nukleinsäure
• (C) STRANGCHARAKTER: Einzel
• (D) TOPOLOGIE: Linear
• (ii) MOLEKULAR-TYP: ADNc
• (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO:107:
  
• (2) INFORMATIONEN ZU SEQ ID NO:108:
• (i) SEQUENZ-CHARAKTERISTIKA:
• (A) SEQUENZ-LÄNGE: 14 Basenpaare
• (B) SEQUENZ-TYP: Nukleinsäure
• (C) STRANGCHARAKTER: Einzel
• (D) TOPOLOGIE: Linear
• (ii) MOLEKULAR-TYP: ADNc
• (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO:108:
  
• (2) INFORMATIONEN ZU SEQ ID NO:109:
• (i) SEQUENZ-CHARAKTERISTIKA:
• (A) SEQUENZ-LÄNGE: 11 Basenpaare
• (B) SEQUENZ-TYP: Nukleinsäure
• (C) STRANGCHARAKTER: Einzel
• (D) TOPOLOGIE: Linear
• (ii) MOLEKULAR-TYP: ADNc
• (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO:109:
  
• (2) INFORMATIONEN ZU SEQ ID NO:110:
• (i) SEQUENZ-CHARAKTERISTIKA:
• (A) SEQUENZ-LÄNGE: 13 Basenpaare
• (B) SEQUENZ-TYP: Nukleinsäure
• (C) STRANGCHARAKTER: Einzel
• (D) TOPOLOGIE: Linear
• (ii) MOLEKULAR-TYP: ADNc
• (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO:110:
  
• (2) INFORMATIONEN ZU SEQ ID NO:111:
• (i) SEQUENZ-CHARAKTERISTIKA:
• (A) SEQUENZ-LÄNGE: 13 Basenpaare
• (B) SEQUENZ-TYP: Nukleinsäure
• (C) STRANGCHARAKTER: Einzel
• (D) TOPOLOGIE: Linear
• (ii) MOLEKULAR-TYP: ADNc
• (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO:111:
  
• (2) INFORMATIONEN ZU SEQ ID NO:112:
• (i) SEQUENZ-CHARAKTERISTIKA:
• (A) SEQUENZ-LÄNGE: 14 Basenpaare
• (B) SEQUENZ-TYP: Nukleinsäure
• (C) STRANGCHARAKTER: Einzel
• (D) TOPOLOGIE: Linear
• (ii) MOLEKULAR-TYP: ADNc
• (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO:112:
  
• (2) INFORMATIONEN ZU SEQ ID NO:113:
• (i) SEQUENZ-CHARAKTERISTIKA:
• (A) SEQUENZ-LÄNGE: 18 Basenpaare
• (B) SEQUENZ-TYP: Nukleinsäure
• (C) STRANGCHARAKTER: Einzel
• (D) TOPOLOGIE: Linear
• (ii) MOLEKULAR-TYP: ADNc
• (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO:113:
  
• (2) INFORMATIONEN ZU SEQ ID NO:114:
• (i) SEQUENZ-CHARAKTERISTIKA:
• (A) SEQUENZ-LÄNGE: 11 Basenpaare
• (B) SEQUENZ-TYP: Nukleinsäure
• (C) STRANGCHARAKTER: Einzel
• (D) TOPOLOGIE: Linear
• (ii) MOLEKULAR-TYP: ADNc
• (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO:114:
  
• (2) INFORMATIONEN ZU SEQ ID NO:115:
• (i) SEQUENZ-CHARAKTERISTIKA:
• (A) SEQUENZ-LÄNGE: 12 Basenpaare
• (B) SEQUENZ-TYP: Nukleinsäure
• (C) STRANGCHARAKTER: Einzel
• (D) TOPOLOGIE: Linear
• (ii) MOLEKULAR-TYP: ADNc
• (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO:115:
  
• (2) INFORMATIONEN ZU SEQ ID NO:116:
• (i) SEQUENZ-CHARAKTERISTIKA:
• (A) SEQUENZ-LÄNGE: 9 Basenpaare
• (B) SEQUENZ-TYP: Nukleinsäure
• (C) STRANGCHARAKTER: Einzel
• (D) TOPOLOGIE: Linear
• (ii) MOLEKULAR-TYP: ADNc
• (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO:116:
  
• (2) INFORMATIONEN ZU SEQ ID NO:117:
• (i) SEQUENZ-CHARAKTERISTIKA:
• (A) SEQUENZ-LÄNGE: 8 Basenpaare
• (B) SEQUENZ-TYP: Nukleinsäure
• (C) STRANGCHARAKTER: Einzel
• (D) TOPOLOGIE: Linear
• (ii) MOLEKULAR-TYP: ADNc
• (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO:117:
  
• (2) INFORMATIONEN ZU SEQ ID NO:118:
• (i) SEQUENZ-CHARAKTERISTIKA:
• (A) SEQUENZ-LÄNGE: 10 Basenpaare
• (B) SEQUENZ-TYP: Nukleinsäure
• (C) STRANGCHARAKTER: Einzel
• (D) TOPOLOGIE: Linear
• (ii) MOLEKULAR-TYP: ADNc
• (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO:118:
  
• (2) INFORMATIONEN ZU SEQ ID NO:119:
• (i) SEQUENZ-CHARAKTERISTIKA:
• (A) SEQUENZ-LÄNGE: 16 Basenpaare
• (B) SEQUENZ-TYP: Nukleinsäure
• (C) STRANGCHARAKTER: Einzel
• (D) TOPOLOGIE: Linear
• (ii) MOLEKULAR-TYP: ADNc
• (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO:119:
  
• (2) INFORMATIONEN ZU SEQ ID NO:120:
• (i) SEQUENZ-CHARAKTERISTIKA:
• (A) SEQUENZ-LÄNGE: 8 Basenpaare
• (B) SEQUENZ-TYP: Nukleinsäure
• (C) STRANGCHARAKTER: Einzel
• (D) TOPOLOGIE: Linear
• (ii) MOLEKULAR-TYP: ADNc
• (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO:120:
  
• (2) INFORMATIONEN ZU SEQ ID NO:121:
• (i) SEQUENZ-CHARAKTERISTIKA:
• (A) SEQUENZ-LÄNGE: 22 Basenpaare
• (B) SEQUENZ-TYP: Nukleinsäure
• (C) STRANGCHARAKTER: Einzel
• (D) TOPOLOGIE: Linear
• (ii) MOLEKULAR-TYP: ADNc
• (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO:121:
  
• (2) INFORMATIONEN ZU SEQ ID NO:122:
• (i) SEQUENZ-CHARAKTERISTIKA:
• (A) SEQUENZ-LÄNGE: 10 Basenpaare
• (B) SEQUENZ-TYP: Nukleinsäure
• (C) STRANGCHARAKTER: Einzel
• (D) TOPOLOGIE: Linear
• (ii) MOLEKULAR-TYP: ADNc
• (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO:122:
  
• (2) INFORMATIONEN ZU SEQ ID NO:123:
• (i) SEQUENZ-CHARAKTERISTIKA:
• (A) SEQUENZ-LÄNGE: 26 Basenpaare
• (B) SEQUENZ-TYP: Nukleinsäure
• (C) STRANGCHARAKTER: Einzel
• (D) TOPOLOGIE: Linear
• (ii) MOLEKULAR-TYP: ADNc
• (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO:123:
  
• (2) INFORMATIONEN ZU SEQ ID NO:124:
• (i) SEQUENZ-CHARAKTERISTIKA:
• (A) SEQUENZ-LÄNGE: 26 Basenpaare
• (B) SEQUENZ-TYP: Nukleinsäure
• (C) STRANGCHARAKTER: Einzel
• (D) TOPOLOGIE: Linear
• (ii) MOLEKULAR-TYP: ADNc
• (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO:124:
  
• (2) INFORMATIONEN ZU SEQ ID NO:125:
• (i) SEQUENZ-CHARAKTERISTIKA:
• (A) SEQUENZ-LÄNGE: (...)
• (B) SEQUENZ-TYP: Nukleinsäure
• (C) STRANGCHARAKTER: Einzel
• (D) TOPOLOGIE: Linear
• (ii) MOLEKULAR-TYP: ADNc
• (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO:125:
  
• (2) INFORMATIONEN ZU SEQ ID NO:126:
• (i) SEQUENZ-CHARAKTERISTIKA:
• (A) SEQUENZ-LÄNGE: 9 Basenpaare
• (B) SEQUENZ-TYP: Nukleinsäure
• (C) STRANGCHARAKTER: Einzel
• (D) TOPOLOGIE: Linear
• (ii) MOLEKULAR-TYP: ADNc
• (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO:126:
  
• (2) INFORMATIONEN ZU SEQ ID NO:127:
• (i) SEQUENZ-CHARAKTERISTIKA:
• (A) SEQUENZ-LÄNGE: 9 Basenpaare
• (B) SEQUENZ-TYP: Nukleinsäure
• (C) STRANGCHARAKTER: Einzel
• (D) TOPOLOGIE: Linear
• (ii) MOLEKULAR-TYP: ADNc
• (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO:127:
  
• (2) INFORMATIONEN ZU SEQ ID NO:128:
• (i) SEQUENZ-CHARAKTERISTIKA:
• (A) SEQUENZ-LÄNGE: 21 Basenpaare
• (B) SEQUENZ-TYP: Nukleinsäure
• (C) STRANGCHARAKTER: Einzel
• (D) TOPOLOGIE: Linear
• (ii) MOLEKULAR-TYP: ADNc
• (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO:128:
  
• (2) INFORMATIONEN ZU SEQ ID NO:129:
• (i) SEQUENZ-CHARAKTERISTIKA:
• (A) SEQUENZ-LÄNGE: 9 Basenpaare
• (B) SEQUENZ-TYP: Nukleinsäure
• (C) STRANGCHARAKTER: Einzel
• (D) TOPOLOGIE: Linear
• (ii) MOLEKULAR-TYP: ADNc
• (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO:129:
  
• (2) INFORMATIONEN ZU SEQ ID NO:130:
• (i) SEQUENZ-CHARAKTERISTIKA:
• (A) SEQUENZ-LÄNGE: 10 Basenpaare
• (B) SEQUENZ-TYP: Nukleinsäure
• (C) STRANGCHARAKTER: Einzel
• (D) TOPOLOGIE: Linear
• (ii) MOLEKULAR-TYP: ADNc
• (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO:130:
  
• (2) INFORMATIONEN ZU SEQ ID NO:131:
• (i) SEQUENZ-CHARAKTERISTIKA:
• (A) SEQUENZ-LÄNGE: 10 Basenpaare
• (B) SEQUENZ-TYP: Nukleinsäure
• (C) STRANGCHARAKTER: Einzel
• (D) TOPOLOGIE: Linear
• (ii) MOLEKULAR-TYP: ADNc
• (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO:131:
  
• (2) INFORMATIONEN ZU SEQ ID NO:132:
• (i) SEQUENZ-CHARAKTERISTIKA:
• (A) SEQUENZ-LÄNGE: 16 Basenpaare
• (B) SEQUENZ-TYP: Nukleinsäure
• (C) STRANGCHARAKTER: Einzel
• (D) TOPOLOGIE: Linear
• (ii) MOLEKULAR-TYP: ADNc
• (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO:132:
  
• (2) INFORMATIONEN ZU SEQ ID NO:133:
• (i) SEQUENZ-CHARAKTERISTIKA:
• (A) SEQUENZ-LÄNGE: 9 Basenpaare
• (B) SEQUENZ-TYP: Nukleinsäure
• (C) STRANGCHARAKTER: Einzel
• (D) TOPOLOGIE: Linear
• (ii) MOLEKULAR-TYP: ADNc
• (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO:133:
  
• (2) INFORMATIONEN ZU SEQ ID NO:134:
• (i) SEQUENZ-CHARAKTERISTIKA:
• (A) SEQUENZ-LÄNGE: 11 Basenpaare
• (B) SEQUENZ-TYP: Nukleinsäure
• (C) STRANGCHARAKTER: Einzel
• (D) TOPOLOGIE: Linear
• (ii) MOLEKULAR-TYP: ADNc
• (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO:134:
  
• (2) INFORMATIONEN ZU SEQ ID NO:135:
• (i) SEQUENZ-CHARAKTERISTIKA:
• (A) SEQUENZ-LÄNGE: 8 Basenpaare
• (B) SEQUENZ-TYP: Nukleinsäure
• (C) STRANGCHARAKTER: Einzel
• (D) TOPOLOGIE: Linear
• (ii) MOLEKULAR-TYP: ADNc
• (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO:135:
  
• (2) INFORMATIONEN ZU SEQ ID NO:136:
• (i) SEQUENZ-CHARAKTERISTIKA:
• (A) SEQUENZ-LÄNGE: 21 Basenpaare
• (B) SEQUENZ-TYP: Nukleinsäure
• (C) STRANGCHARAKTER: Einzel
• (D) TOPOLOGIE: Linear
• (ii) MOLEKULAR-TYP: ADNc
• (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO:136:
  
• (2) INFORMATIONEN ZU SEQ ID NO:137:
• (i) SEQUENZ-CHARAKTERISTIKA:
• (A) SEQUENZ-LÄNGE: 10 Basenpaare
• (B) SEQUENZ-TYP: Nukleinsäure
• (C) STRANGCHARAKTER: Einzel
• (D) TOPOLOGIE: Linear
• (ii) MOLEKULAR-TYP: ADNc
• (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO:137:
  
• (2) INFORMATIONEN ZU SEQ ID NO:138:
• (i) SEQUENZ-CHARAKTERISTIKA:
• (A) SEQUENZ-LÄNGE: 10 Basenpaare
• (B) SEQUENZ-TYP: Nukleinsäure
• (C) STRANGCHARAKTER: Einzel
• (D) TOPOLOGIE: Linear
• (ii) MOLEKULAR-TYP: ADNc
• (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO:138:
  
• (2) INFORMATIONEN ZU SEQ ID NO:139:
• (i) SEQUENZ-CHARAKTERISTIKA:
• (A) SEQUENZ-LÄNGE: 10 Basenpaare
• (B) SEQUENZ-TYP: Nukleinsäure
• (C) STRANGCHARAKTER: Einzel
• (D) TOPOLOGIE: Linear
• (ii) MOLEKULAR-TYP: ADNc
• (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO:139:
  
• (2) INFORMATIONEN ZU SEQ ID NO:140:
• (i) SEQUENZ-CHARAKTERISTIKA:
• (A) SEQUENZ-LÄNGE: 6 Basenpaare
• (B) SEQUENZ-TYP: Nukleinsäure
• (C) STRANGCHARAKTER: Einzel
• (D) TOPOLOGIE: Linear
• (ii) MOLEKULAR-TYP: ADNc
• (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO:140:
  
• (2) INFORMATIONEN ZU SEQ ID NO:141:
• (i) SEQUENZ-CHARAKTERISTIKA:
• (A) SEQUENZ-LÄNGE: 10 Basenpaare
• (B) SEQUENZ-TYP: Nukleinsäure
• (C) STRANGCHARAKTER: Einzel
• (D) TOPOLOGIE: Linear
• (ii) MOLEKULAR-TYP: ADNc
• (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO:141:
  
• (2) INFORMATIONEN ZU SEQ ID NO:142:
• (i) SEQUENZ-CHARAKTERISTIKA:
• (A) SEQUENZ-LÄNGE: 36 Basenpaare
• (B) SEQUENZ-TYP: Nukleinsäure
• (C) STRANGCHARAKTER: Einzel
• (D) TOPOLOGIE: Linear
• (ii) MOLEKULAR-TYP: ADNc
• (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO:142:
  
• (2) INFORMATIONEN ZU SEQ ID NO:143:
• (i) SEQUENZ-CHARAKTERISTIKA:
• (A) SEQUENZ-LÄNGE: 103 Basenpaare
• (B) SEQUENZ-TYP: Nukleinsäure
• (C) STRANGCHARAKTER: Einzel
• (D) TOPOLOGIE: Linear
• (ii) MOLEKULAR-TYP: ADNc
• (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO:143:
  
• (2) INFORMATIONEN ZU SEQ ID NO:144:
• (i) SEQUENZ-CHARAKTERISTIKA:
• (A) SEQUENZ-LÄNGE: 116 Basenpaare
• (B) SEQUENZ-TYP: Nukleinsäure
• (C) STRANGCHARAKTER: Einzel
• (D) TOPOLOGIE: Linear
• (ii) MOLEKULAR-TYP: ADNc
• (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO:144:
  
• (2) INFORMATIONEN ZU SEQ ID NO:145:
• (i) SEQUENZ-CHARAKTERISTIKA:
• (A) SEQUENZ-LÄNGE: 94 Basenpaare
• (B) SEQUENZ-TYP: Nukleinsäure
• (C) STRANGCHARAKTER: Einzel
• (D) TOPOLOGIE: Linear
• (ii) MOLEKULAR-TYP: ADNc
• (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO:145:
  
• (2) INFORMATIONEN ZU SEQ ID NO:146:
• (i) SEQUENZ-CHARAKTERISTIKA:
• (A) SEQUENZ-LÄNGE: 120 Basenpaare
• (B) SEQUENZ-TYP: Nukleinsäure
• (C) STRANGCHARAKTER: Einzel
• (D) TOPOLOGIE: Linear
• (ii) MOLEKULAR-TYP: ADNc
• (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO:146:
  
• (2) INFORMATIONEN ZU SEQ ID NO:147:
• (i) SEQUENZ-CHARAKTERISTIKA:
• (A) SEQUENZ-LÄNGE: 120 Basenpaare
• (B) SEQUENZ-TYP: Nukleinsäure
• (C) STRANGCHARAKTER: Einzel
• (D) TOPOLOGIE: Linear
• (ii) MOLEKULAR-TYP: ADNc
• (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO:147:
  
• (2) INFORMATIONEN ZU SEQ ID NO:148:
• (i) SEQUENZ-CHARAKTERISTIKA:
• (A) SEQUENZ-LÄNGE: 10 Basenpaare
• (B) SEQUENZ-TYP: Nukleinsäure
• (C) STRANGCHARAKTER: Einzel
• (D) TOPOLOGIE: Linear
• (ii) MOLEKULAR-TYP: ADNc
• (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO:148:
  
• (2) INFORMATIONEN ZU SEQ ID NO:149:
• (i) SEQUENZ-CHARAKTERISTIKA:
• (A) SEQUENZ-LÄNGE: 7 Basenpaare
• (B) SEQUENZ-TYP: Nukleinsäure
• (C) STRANGCHARAKTER: Einzel
• (D) TOPOLOGIE: Linear
• (ii) MOLEKULAR-TYP: ADNc
• (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO:149:
  
• (2) INFORMATIONEN ZU SEQ ID NO:150:
• (i) SEQUENZ-CHARAKTERISTIKA:
• (A) SEQUENZ-LÄNGE: 24 Basenpaare
• (B) SEQUENZ-TYP: Nukleinsäure
• (C) STRANGCHARAKTER: Einzel
• (D) TOPOLOGIE: Linear
• (ii) MOLEKULAR-TYP: ADNc
• (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO:150:
  
• (2) INFORMATIONEN ZU SEQ ID NO:151:
• (i) SEQUENZ-CHARAKTERISTIKA:
• (A) SEQUENZ-LÄNGE: 22 Basenpaare
• (B) SEQUENZ-TYP: Nukleinsäure
• (C) STRANGCHARAKTER: Einzel
• (D) TOPOLOGIE: Linear
• (ii) MOLEKULAR-TYP: ADNc
• (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO:151:
  
• (2) INFORMATIONEN ZU SEQ ID NO:152:
• (i) SEQUENZ-CHARAKTERISTIKA:
• (A) SEQUENZ-LÄNGE: 24 Basenpaare
• (B) SEQUENZ-TYP: Nukleinsäure
• (C) STRANGCHARAKTER: Einzel
• (D) TOPOLOGIE: Linear
• (ii) MOLEKULAR-TYP: ADNc
• (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO:152:
  

Claims (18)

1. Eine DNS-Sequenz, die für ein Peptid codiert, welches eine Aminosäuresequenz von mindestens einem Ikaros-Exon der 4 (SEQ ID No: 5) hat und welches eine Ikaros-Aktivität hat.
2. Eine DNS-Sequenz, welche unter stringenten Bedingungen mit einer DNS-Sequenz nach Anspruch 1 hybridisiert.
3. Eine DNS, welche für ein Peptid codiert, umfassend eine Sequenz mit mindestens 80% Homologie zu einer Aminosäuresequenz von einem Ikaros-Exon der 4 (SEQ ID No: 5) und welches eine Ikaros-Aktivität besitzt.
4. DNS-Sequenz nach Anspruch 3, worin die Sequenz mindestens 85% Homologie zu einer Aminosäuresequenz von einem Ikaros-Exon der 4 (SEQ ID No: 5) hat.
5. DNS-Sequenz nach Anspruch 3, worin die Sequenz mindestens 90% Homologie zu einer Aminosäuresequenz von einem Ikaros-Exon der 4 (SEQ ID No: 5) hat.
6. DNS-Sequenz nach Anspruch 3, worin die Sequenz mindestens 95% Homologie zu einer Aminosäuresequenz von einem Ikaros-Exon der 4 (SEQ ID No:5) hat.
7. Ein Peptid, welches durch eine DNS-Sequenz nach einem beliebigen vorangehenden Anspruch codiert wird.
8. Peptid nach Anspruch 7, worin das Exon ausgewählt ist aus einer Gruppe bestehend aus Exon 1/2, Exon 3, Exon 4, Exon 5, Exon 6 und Exon 7.
9. Vektor umfassend eine DNS-Sequenz nach einem beliebigen der Ansprüche 1 bis 6.
10. Kultivierte Zelle, welche den Vektor nach Anspruch 9 beinhaltet.
11. Verfahren zur Herstellung eines Ikaros-Peptids umfassend das Kultivieren der Zelle nach Anspruch 10 in einem Medium zur Expression des Ikaros-Peptids.
12. Zubereitung eines Antikörpers gerichtet gegen ein Ikaros-Peptid nach Anspruch 7 oder 8.
13. Zubereitung nach Anspruch 12, worin der Antikörper ein monoklonaler Antikörper ist.
14. Verwendung eines Ikaros-Peptids nach Anspruch 7 oder 8, einer Zelle ausgewählt zur Expression eines solchen Ikaros-Peptids, oder einer Nukleinsäure eines beliebigen der Ansprüche 1 bis 6, welche für ein Ikaros-Peptid codiert, in der Zubereitung einer Zusammensetzung zur Behandlung eines Tieres mit einer Immunstörung.
15. Verwendung einer DNS-Sequenz nach Anspruch 1 in der Zubereitung einer diagnostischen Zusammensetzung zur Bestimmung, ob bei dem Individuum das Risiko für eine Immunstörung besteht, durch Bestimmung, ob die Struktur einer Nukleinsäure-Probe eines Individuums, welche ein Ikaros-Gen enthält, sich vom Wildtyp unterscheidet.
16. Transgener Nager mit einem Transgen, welches die DNS-Sequenz nach einem beliebigen der Ansprüche 1 bis 6 umfasst.
17. Verwendung eines Ikaros-Peptids nach Anspruch 7 oder 8, einer Zelle nach Anspruch 10 ausgewählt zur Expression eines solchen Ikaros-Peptids, oder einer Nukleinsäure nach einem beliebigen der Ansprüche 1 bis 6, welche für ein Ikaros-Peptid codiert, in der Zubereitung einer Zusammensetzung zur Behandlung eines Tieres mit einer Störung des Corpus striatum.
18. Verwendung einer DNS-Sequenz nach Anspruch 1 in der Zubereitung einer diagnostischen Zusammensetzung anwendbar zur Bestimmung, ob bei dem Individuum das Risiko für eine Störung des Corpus striatum besteht durch Bestimmung, ob die Struktur einer Nukleinsäure-Probe eines Individuums, welche ein Ikaros-Gen enthält, sich vom Wildtyp unterscheidet.