DE69534310T2

DE69534310T2 - Ptc gene und ihre verwendung

Info

Publication number: DE69534310T2
Application number: DE69534310T
Authority: DE
Inventors: P. Matthew SCOTT; V. Lisa GOODRICH; Ronald L. Johnson
Original assignee: Leland Stanford Junior University
Current assignee: Leland Stanford Junior University
Priority date: 1994-10-07
Filing date: 1995-10-06
Publication date: 2006-04-27
Anticipated expiration: 2015-10-07
Also published as: ES2245454T3; CA2201887C; US7659371B2; US6610507B2; WO1996011260A1; US6172200B1; EP0804548A4; US20030148388A1; CA2201887A1; AU4001195A; US20080300167A1; DK0804548T3; JPH10507349A; US20100221724A1; EP1616942A3; US6921646B2; US8178298B2; EP1616942A2; DE69534310D1; US20030032085A1

Description

Gebiet der Erfindung
Das Gebiet der Erfindung betrifft Segmentpolaritätsgene und ihre Verwendungen.
Hintergrund der Erfindung
Segmentpolaritätsgene wurden in Fliegen als Mutationen entdeckt, die das Muster von Strukturen der Körpersegmente verändern. Mutationen in den Genen führen dazu, dass sie die veränderten Muster an den Oberflächen von Körpersegmenten entwickeln, wobei das Muster in der Kopf-Schwanz-Achse beeinflusst wird. Beispielsweise führen Mutationen im Patched-Gen dazu, dass sich jedes Körpersegment ohne die normalen Strukturen im Zentrum jedes Segmentes entwickelt. Anstelle dessen findet man ein Spiegelbild des Musters, das normalerweise im vorderen Segment zu finden ist. Somit bilden Zellen im Zentrum des Segments die falschen Strukturen und richten sie unter Bezugnahme auf die gesamte Kopf-Schwanz-Ausrichtung des Tieres in die falsche Richtung aus. Etwa sechszehn Gene sind in der Gruppe bekannt. Die kodierten Proteine umfassen Kinasen, Transkriptionsfaktoren, ein Zell-Junction-Protein, zwei sekretierte Proteine genannt "flügellos" (wingless, WG) und "Igel" (hedgehog, HH), ein einzelnes Transmembranprotein genannt Patched- (PTC-) Protein und einige neue Proteine, die mit keinem bekannten Protein verwandt sind. Von allen diesen Proteinen wird angenommen, dass sie über Signalwege zusammenwirken, die Zellen über ihre Nachbarn informieren, um Bestimmung und Polarität für Zellen festzulegen.
Einige der Segmentpolaritätsproteine von Drosophila und anderen Wirbellosen sind eng mit Proteinen von Wirbeltieren verwandt was darauf hinweist, dass die eingebundenen molekularen Mechanismen alt sind. Unter den Wirbeltierproteinen, die mit den Fliegengenen verwandt sind, befinden sich En-1 und -2, die in der Entwicklung des Wirbeltiergehirns wirken, und WNT-1, das auch in die Gehirnentwicklung eingebunden ist, das jedoch zuerst als jenes Onkogen entdeckt wurde, das in zahlreichen Fällen in Brustkrebs von Mäusen eingebunden ist. Bei Fliegen wird das Patched-Gen in einem komplexen und dynamischen Muster in Embryos in RNA transkribiert, einschließlich feiner transverser Streifen in jedem Körpersegmentprimordium. Für das kodierte Protein wird vorhergesagt, dass es zahlreiche transmembrane Domänen enthält. Es weist keine signifikante Ähnlichkeit mit irgendeinem anderen Protein auf. Andere Proteine mit großen Anzahlen an transmembranen Domänen schließen zahlreiche Membranrezeptoren, Kanäle durch Membranen und Transporter durch Membranen ein.
Für das Hedgehog- (HH-) Protein von Fliegen wurde gezeigt, dass es zumindest drei Wirbeltier-Verwandte hat: Sonic hedgehog (Shh); Indian hedgehog und Desert hedgehog. Das Shh wird in einer Gruppe von Zellen am hinteren Ende jeder sich entwickelnden Extremitätenknospe exprimiert. Dies ist exakt dieselbe Gruppe von Zellen, die beim Signalisieren von Polarität in der sich entwickelnden Extremität eine wichtige Rolle spielt. Das Signal scheint abgestuft zu sein, wobei Zellen, die nahe der posterioren Quelle des Signals sind, hintere Glieder bilden und andere Extremitätenstrukturen und -zellen, die weiter weg sind von der Signalquelle, eher vordere Strukturen bilden. Seit mehreren Jahren ist bekannt, dass Transplantation der signalisierenden Zellen, eine Region der Extremitätenknospe, die als die "Zone polarisierender Aktivität (ZPA)" bekannt ist, drastische Auswirkungen auf die Strukturierung von Extremitäten hat. Das Implantieren einer zweiten ZPA anterior zur Extremitätenknospe verursacht, dass sich die betreffende Extremität mit Eigenschaften posteriorer Glieder entwickelt, die die Eigenschaften anteriorer Glieder ersetzten (d.h. kleine Finger anstelle von Daumen). Es wurde für Shh erkannt, dass es das lange gesuchte ZPA-Signal ist. Kultivierte Zellen, die Shh-Protein (SHH) produzieren, wenn sie in die anteriore Extremitätenknospenregion implantiert werden, haben dieselbe Wirkung wie eine implantierte ZPA. Dies zeigt, dass Shh eindeutig ein maßgeblicher Auslöser für posteriore Extremitätenentwicklung ist.
Eine bestimmte Zeit lang wurde angenommen, dass der Faktor in der ZPA mit einem anderen wichtigen Entwicklungssignal verbunden ist, der das sich entwickelnde Rückenmark polarisiert. Die Chorda dorsalis, ein Mesodermstab, der entlang der dorsalen Seite jedes frühen Wirbeltierembryos verläuft, ist eine Signalquelle, die das Neuralrohr entlang der dorsal-ventralen Achse polarisiert. Das Signal veranlasst den Teil des Neuralrohrs, der der Chorda dorsalis am nächsten liegt, dazu, eine Bodenplatte zu bilden, einen morphologisch unterschiedlichen Teil zum Neuralrohr. Die Bodenplatte wiederum sendet Signale zu den weiter dorsal gelegenen Teilen des Neuralrohrs aus, um Zellfunktionalitäten näher zu bestimmen. Von der ZPA wurde berichtet, dass sie dieselbe Signalwirkung wie die Chorda dorsalis aufweist, wenn sie so transplantiert wird, dass sie mit dem Neuralrohr benachbart ist, was darauf schließen lässt, dass die ZPA dasselbe Signal wie die Chorda dorsalis hervorbringt. Unter Berücksichtigung dieser Tatsachen wurde für Shh erkannt, dass es durch Zellen der Chorda dorsalis und der Bodenplatte produziert wird. Test auf zusätzliche Expression von Shh in Mäusen führten zu der Entdeckung von zusätzlicher Expression von Bodenplattengenen in Zellen, die sie normalerweise nicht anschalten würden. Daher scheint Shh eine Komponente des Signals ausgehend von der Chorda dorsalis an die Bodenplatte und von der Bodenplatte zu weiter dorsal gelegenen Teilen des Neuralrohrs zu sein. Neben Extremitäten und Neuralrohren werden Wirbeltier-Hedgehog-Gene auch in zahlreichen anderen Geweben exprimiert, einschließlich, jedoch nicht beschränkt auf, peripheres Nervensystem, Gehirn, Lunge, Leber, Niere, Zahnprimordia, Genitalien und Endoderm des Enddarms sowie des embryonalen Kopfdarms.
PTC wurde, basierend auf genetischen Experimenten an Fliegen, als ein Rezeptor für HH-Protein vorgeschlagen. Ein Ansatz zur Erklärung für diese Beziehung ist, dass PTC über einen großteils unbekannten Stoffwechselweg wirkt, um sowohl seine eigene Transkription als auch die Transkription des Wingless-Segmentpolaritätsgens zu deaktivieren. Dieser Ansatz schlägt vor, dass sich HH-Protein, das von benachbarten Zellen sekretiert wird, an den PTC-Rezeptor bindet, ihn deaktiviert und dadurch vermeidet, dass PTC seine eigene Transkription oder die des Wingless-Gens beendet. Zahlreiche Experimente zeigten koordinierte Ereignisse zwischen PTC und HH.
Relevante Literatur
Beschreibungen von Patched-Genen selbst oder von ihrer Rolle mit Hedgehog-Genen können in Hooper & Scott, Cell 59, 751-765 (1989); Nakano et al., Nature, 341, 508-513 (1989) (die beide auch die Sequenz für Drosophila-Patched-Gen beschreiben), Simcox et al., Development 107, 715-722 (1989); Hidalgo & Ingham, Development 110, 291-301 (1990); Phillips et al., Development 110, 105-114 (1990); Sampedro & Guerrero, Nature 353, 187-190 (1991); Ingham et al., Nature 353, 184-187 (1991); und Taylor et al., Mechanisms of Development 42, 89-96 (1993), gefunden werden. Diskussionen zur Rolle von Hedgehog sind in Riddle et al., Cell 75, 1401-1416 (1993); Echelard et al., Cell 75, 1417-1430 (1993); Krauss et al., Cell 75, 1431-1444 (1993); Tabata & Kornberg, Cell 76, 89-102 (1994); Heemskerk & DiNardo, Cell 76, 449-460 (1994); Relink et al., Cell 76, 761-775 (1994); und in einem kurzen Überblicksartikel von Ingham, Current Biology 4, 347-350 (1994), zu finden. Die Sequenz für die Drosophila-5'-Nichtkodierregion wurde von GenBank unter der Zugriffsnummer M28418 festgehalten, auf die in Hooper & Scott, s.o., (1989) Bezug genommen wird. Siehe auch Forbes et al., Development, Beilage, 115-124 (1993).
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Es werden Verfahren zum Isolieren von Patched-Genen, insbesondere von Säugetieren-Patched-Genen, einschließlich der Maus- und Mensch-Patched-Gene, sowie von Patched-Genen von Wirbellosen und Sequenzen bereitgestellt. Die Verfahren umfassen die Identifikation von Patched-Genen aus anderen Spezies sowie Mitgliedern derselben Familie von Proteinen. Die betreffenden Gene liefern Verfahren zur Produktion des Patched-Proteins, worin die Gene und Proteine als Sonden für Forschung, Diagnose und Bindung von Hedgehogprotein für seine Isolierung und Reinigung, Gentherapie sowie in anderen Einsatzbereichen verwendet werden können.
Gemäß einem Aspekt der vorliegenden Erfindung wird eine isolierte DNA, die kein Drosophila-Patched-Gen oder ein Fragment davon ist, mit einer DNA-Sequenz mit zumindest 12 bp, die sich von der Sequenz des Drosophila-Patched-Gens unter scheiden, bereitgestellt, worin die DNA unter stringenten Bedingungen an jede beliebige der Seq.-ID Nr. 1, 3, 5, 7, 9, 18 und Fragmente davon hybridisiert und für ein Patched-Polypeptid kodiert, das sich an ein Hedgehog-Polypeptid bindet.
Gemäß einem anderen Aspekt der vorliegenden Erfindung wird eine isolierte DNA bereitgestellt, die kein Drosophila-Patched-Gen oder ein Fragment davon ist, mit einer DNA-Sequenz mit zumindest 12 bp, die sich von der Sequenz des Drosophila-Patched-Gens unterscheiden, worin die DNA-Sequenz jede beliebige der Seq.-ID Nr. 1, 3, 5, 7, 9, 18 oder ein Fragment von zumindest 12 bp Länge davon umfasst.
Bevorzugte Eigenschaften dieser Aspekte sind in den Ansprüchen beschrieben.
KURZBESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
1 ist ein Diagramm mit einer Restriktionskarte von etwa 10 kbp der 5'-Region stromauf vom Startcodon von Drosophila-Patched-Gen und Balkendiagrammen von Konstrukten trunkierter Abschnitte der 5'-Region, gebunden an β-Galactosidase, worin die Konstrukte in Fliegenzelllinien zur Herstellung von Embryonen eingeführt werden. Die Expression von β-gal in den Embryonen während früher und später Entwicklung des Embryos ist in der Tabelle rechts neben dem Diagramm angegeben. Je größer die Anzahl an + ist, desto intensiver ist die Färbung.
BESCHREIBUNG DER SPEZIFISCHEN AUSFÜHRUNGSFORMEN
Es werden Verfahren zur Identifikation von Mitgliedern der Patched- (ptc-) Genfamilie von Wirbellosen und Wirbeltieren, z.B. Säugetieren, sowie der gesamten cDNA-Sequenz des Maus- und Mensch-Patched-Gens bereitgestellt. Ebenfalls bereitgestellt werden Sequenzen für Wirbellose-Patched-Gene. Das Patched-Gen kodiert für ein transmembranes Protein mit einer großen Anzahl an transmembranen Sequenzen.
Zur Identifikation der Maus- und Mensch-Patched-Gene werden Primer aus der bekannten Drosophila-ptc-Sequenz verwendet, um sich durch den evolutionären Baum zu bewegen. Zwei Primer werden aus der Drosophilasequenz mit geeigneten Restriktionsenzymlinkern werden verwendet, um Abschnitte genomischer DNA eines verwandten Wirbellosen, wie z.B. Stechmücke, zu amplifizieren. Die Sequenzen werden aus Regionen ausgewählt, die im Laufe der Evolution eher nicht divergierten und die geringe Degeneration aufweisen. Praktischerweise sind diese Regionen die N-terminale proximale Sequenz, im Allgemeinen innerhalb der ersten 1,5 kb, üblicherweise innerhalb der ersten 1 kb, des Kodierabschnittes der cDNA, vorteilhafterweise in der ersten hydrophilen Schleife des Proteins. Unter Einsatz von Polymerasekettenreaktion (PCR) mit den Primern kann eine Bande aus genomischer Stechmücken-DNA gewonnen werden. Die Bande kann dann amplifiziert und wiederum als Sonde verwendet werden. Diese Sonde kann verwendet werden, um eine cDNA-Bibliothek aus einem Organismus in einem unterschiedlichen Zweig des evolutionären Baums, wie z.B. aus einem Schmetterling, zu sondieren. Durch Screenen der Bibliothek und Identifizieren von Sequenzen, die an die Sonde hybridisieren, kann ein Abschnitt des Schmetterling-Patched-Gens gewonnen werden. Einer oder mehrere der resultierenden Klone können dann verwendet werden, um die Bibliothek neuerlich zu screenen, um eine verlängerte Sequenz, bis hin zur und einschließlich der gesamten Kodierregion, sowie die nichtkodierenden 5'- und 3'-Sequenzen zu gewinnen. Soweit erforderlich kann die gesamte resultierende cDNA-Kodiersequenz oder ein Teil davon sequenziert werden.
Anschließend kann dann eine genomische oder eine cDNA-Bibliothek einer Spezies, die in der evolutionären Rangordnung höher steht, mit geeigneten Sonden aus einer oder beiden der zuvor genannten Sequenzen gescreent werden. Von besonderem Interesse ist das Screenen einer genomischen Bibliothek eines entfernt verwandten Wirbellosen, z.B. eines Käfers, worin eine Kombination der Sequenzen verwendet werden kann, die aus den vorigen zwei Spezies erhalten wurden, in diesem Fall von Drosophila und dem Schmetterling. Mittels geeigneter Verfahren können spezifische Klone identifiziert werden, die sich an die Sonden binden, die dann auf Kreuzhybridi sierung mit jeder der Sonde einzeln gescreent werden können. Die resultierenden Fragmente werden dann z.B. durch Subklonieren amplifiziert.
Stehen nun alle 4 verschiedenen Patched-Genes oder Teile davon, im gegenwärtig dargestellten Beispiel Drosophila (Fliege), Stechmücke, Schmetterling und Käfer, zur Verfügung, können nun die Patched-Gene auf konservierte Sequenzen verglichen werden. Zellen aus einer geeigneten Säugetier-Extremitätenknospe oder aus anderen Zellen, die Patched exprimieren, wie z.B. Chorda dorsalis, Neuralrohr, Darm, Lungentrachealrinne oder andere Gewebe, insbesondere fötales Gewebe, können zum Screenen verwendet werden. Alternativ dazu kann erwachsenes Gewebe, das Patched produziert, zum Screenen verwendet werden. Basierend auf der Consensus-Sequenz, die aus den 4 anderen Spezies erhältlich ist, können Sonden entwickelt werden, worin an jeder Seite zumindest 2 der Sequenzen dasselbe Nucleotid aufweisen, und variiert die Stelle, sodass jede Spezies ein einmaliges Nucleotid aufweist, so kann Inosin verwendet werden, das sich an alle 4 Nucleotide bindet.
Entweder kann PCR unter Verwendung von Primern eingesetzt werden, oder es kann, sofern erwünscht, eine genomische Bibliothek aus einer geeigneten Quelle sondiert werden. Bei PCR kann eine cDNA-Bibliothek oder Umkehrtranskriptase-PCR (RT-PCR) verwendet werden, worin mRNA aus dem Gewebe erhältlich ist. Wird fötales Gewebe verwendet, so wird üblicherweise Gewebe aus dem ersten oder zweiten Trimester, vorzugsweise aus der zweiten Hälfte des ersten Trimesters oder dem zweiten Trimester, je nach bestimmtem Wirt, verwendet. Alter und Quelle des Gewebes hängt zu einem signifikanten Ausmaß von der Fähigkeit ab, das Gewebe chirurgisch zu entfernen, was wiederum von seiner Größe, dem Expressionsgrad von Patched in den Zellen des Gewebes, der Zugänglichkeit des Gewebes, der Anzahl an Zellen, die Patched exprimieren, und dergleichen abhängt. Die Menge an zugänglichem Gewebe sollte groß genug sein, um eine ausreichende Menge an mRNA bereitzustellen, sodass sie auf nützliche Weise transkribiert und amplifiziert werden kann. Bei Mausgewebe können Extremitätenknospen von etwa 10 bis 15 dpc (Tage nach Empfängnis) verwendet werden.
In den Primern umfasst die komplementäre Bindungssequenz üblicherweise zumindest 14 Nucleotide, vorzugsweise zumindest etwa 17 Nucleotide und üblicherweise nicht mehr als 30 Nucleotide. Die Primer können auch eine Restriktionsenzymsequenz zum Isolieren und Klonieren umfassen. Mittels RT-PCR kann die mRNA gemäß bekannter Mittel angereichert werden und revers transkribiert werden, woraufhin Amplifikation mit den geeigneten Primern folgt. (Verfahren, die zum molekularen Klonieren eingesetzt werden, sind in Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Sambrook et al. (Hrsg.), Cold Spring Harbor Laboratories, Cold Spring Harbor, NY (1988), zu finden.) Insbesondere können die Primer gut aus der N-terminalen proximalen Sequenz oder aus einer anderen konservierten Region stammen, wie beispielsweise jene Sequenzen, in denen zumindest fünf Aminosäuren von acht Aminosäuren in drei der vier Sequenzen konserviert sind. Dies wird durch die Sequenzen (Seq.-ID Nr. 11) IITPLDCFWEG, (Seq.-ID Nr. 12) LIVGG und (Seq.-ID Nr. 13) PFFWEQY veranschaulicht. Resultierende PCR-Produkte von erwarteter Größe werden subkloniert und können, sofern erwünscht, sequenziert werden.
Das klonierte PCR-Fragment kann dann als eine Sonde verwendet werden, um eine cDNA-Bibliothek von Säugetier-Gewebezellen, die Patched exprimieren, zu screenen, wobei hybridisierende Klone unter geeigneten stringenten Bedingungen isoliert werden können. Die cDNA-Bibliothek sollte wieder aus Gewebe stammen, das Patched exprimiert, wobei dieses Gewebe in den zuvor beschriebenen Bereich fällt. Klone, die hybridisieren, können subkloniert und neuerlich gescreent werden. Die hybridisierenden Subklone können dann isoliert und sequenziert werden oder können durch Verwendung von RNA-Blots und In-situ-Hybridisierungen in ganzen Embryonen und in Embryonenschnitten weiter analysiert werden. Geeigneterweise kann ein Fragment von etwa 0,5 bis 1 kbp der N-terminalen Kodierregion für das Northern-Blotting verwendet werden.
Das Säugetiergen kann sequenziert werden, und konservierte Regionen können wie zuvor beschrieben identifiziert und als Primer zur Untersuchung anderer Spezies verwendet werden. Die N-terminale proximale Region, die C-terminale Region oder eine Zwischenregion kann für die Sequenzen verwendet werden, worin die Sequen zen mit minimaler Degeneration und dem erwünschten Konservierungsgrad gegenüber der Sondensequenz ausgewählt wird.
Die DNA-Sequenz, die für PTC kodiert, kann cDNA oder genomische DNA oder ein Fragment davon, insbesondere vollständige Exone aus der genomischen DNA, sein, kann als die Sequenz, die im Wesentlichen frei von Wildtyp-Sequenz ist, aus dem Chromosom isoliert werden, kann ein Fragment mit 50 kbp oder weniger sein, kann an heterologe oder fremde DNA gebunden sein, die ein einzelnes Nucleotid, ein Oligonucleotid von bis zu 50 bp sein kann, die eine Restriktionsstelle oder eine andere identifizierende DNA zur Verwendung als ein Primer, Sonde oder dergleichen sein kann, oder eine Nucleinsäure von mehr als 50 bp, worin die Nucleinsäure ein Teil eines Klonier- oder Expressionsvektors sein kann, die Regulationsregionen einer Expressionskassette umfasst oder dergleichen. Die DNA kann isoliert sein, gereinigt sein, im Wesentlichen frei von Proteinen und anderen Nucleinsäuren sein, kann in Lösung sein oder dergleichen.
Das Gen von Interesse kann zur Produktion des gesamten Patched-Proteins oder eines Teils davon verwendet werden. Das Gen von Interesse oder ein Fragment davon, im Allgemeinen ein Fragment von zumindest 12 bp, üblicherweise von zumindest 18 bp, kann zur extrachromosomalen Erhaltung oder zur Integration in den Wirt in einen geeigneten Vektor eingeführt werden. Fragmente werden üblicherweise unmittelbar am 5'- und/oder 3'-Terminus an ein Nucleotid oder eine Sequenz gebunden, das/die im natürlichen oder im Wildtyp-Gen nicht vorhanden ist, oder sie werden an eine Markierung gebunden, die keine Nucleinsäuresequenz ist. Zur Expression kann eine Expressionskassette verwendet werden, die eine Transkriptions- und Translationsstartregion, die induzierbar oder konstitutiv sein kann, die Kodierregion unter der Transkriptionskontrolle der Transkriptionsstartregion und eine Transkriptions- und Translationsterminationsregion bereitstellt. Verschiedene Transkriptionsstartregionen können verwendet werden, die im Expressionswirt funktionell sind. Das Peptid kann je nach Zweck der Expression in Prokaryoten oder Eukaryoten gemäß herkömmlicher Arten exprimiert werden. Zur umfassenden Produktion des Proteins können ein einzelliger Organismus oder Zellen eines höheren Organismus, z.B. Eukaryoten wie beispielsweise Wirbeltiere, insbesondere Säugetiere, als Expressionswirt verwendet werden, wie z.B. E. coli, B. subtilis, S. cerevisiae und dergleichen. In zahlreichen Situationen kann es wünschenswert sein, das Patched-Gen in einem Säugetierwirt zu exprimieren, wobei für verschiedene Studien das Patched-Gen zur zellulären Membran transportiert wird. Das Protein hat zwei Teile, die insgesamt sechs Transmembranregionen bereitstellen, mit insgesamt sechs extrazellulären Schleifen, drei für jeden Teil. Die Das Protein hat in seinen Eigenschaften Ähnlichkeit mit einem Transporterprotein. Das Protein weist zwei konservierte Glykosylierungs-Signaltriaden auf.
Die Nucleinsäuresequenzen von Interesse können für zahlreiche Zwecke modifiziert werden, insbesondere, wenn sie intrazellulär verwendet werden, beispielsweise durch Anbinden an ein Nucleinsäure-Spaltmittel, z.B. an ein chelatiertes Metallion, wie z.B. Eisen oder Chrom, um das Gen zu spalten; als eine Antisense-Sequenz; oder dergleichen. Modifikationen können das Ersetzen von Sauerstoff der Phosphatester durch Schwefel oder Stickstoff, das Ersetzen des Phosphats durch Phosphoramid usw. einbinden.
Durch die Verfügbarkeit des Proteins in großen Mengen durch Verwendung eines Expressionswirts kann das Protein gemäß herkömmlicher Verfahren isoliert und gereinigt werden. Aus dem Expressionswirt kann ein Lysat hergestellt werden, und das Lysat kann mittels HPLC, Ausschlusschromatographie, Gelelektrophorese, Affinitätschromatographie oder anderer Reinigungsverfahren gereinigt werden. Das gereinigte Protein ist im Allgemeinen zu zumindest etwa 80 % rein, vorzugsweise zu zumindest etwa 90 % rein, und kann bis zu 100 % rein sein. Rein bedeutet frei von anderen Proteinen sowie von Zelltrümmern.
Das Polypeptid kann zur Herstellung von Antikörpern verwendet werden, wobei kurze Fragmente Antikörper bereitstellen, die für das bestimmte Polypeptid spezifisch sind, während größere Fragmente oder das gesamte Gen die Herstellung von Antikörpern über die Oberfläche des Polypeptids oder Proteins ermöglichen, wobei das Protein in seiner natürlichen Konformation vorliegen kann.
Antikörper können gemäß herkömmlicher Mittel hergestellt werden, wobei das exprimierte Polypeptid oder Protein als ein Immunogen verwendet werden kann, alleine oder an bekannte immungene Träger, z.B. KLH, pre-S HBsAg, andere virale oder eukaryotische Proteine oder dergleichen, konjugiert. Verschiedene Adjuvantien können, soweit erforderlich, mittels einer Reihe von Injektionen verwendet werden. Bei monoklonalen Antikörpern kann nach einer oder mehreren Boosterinjektionen die Milz isoliert werden, die Splenozyten unbegrenzt vermehrt und dann auf Hochaffinitäts-Antikörperbindung gescreent werden. Die sich unbegrenzt vermehrenden Zellen, z.B. Hybridome, die die erwünschten Antikörper produzieren, können dann vermehrt werden. Weitere Beschreibungen sind in Monoclonal Antibodies: A Laboratory Manual, Harlow & Lane (Hrsg.), Cold Spring Harbor Laboratories, Cold Spring Harbor, New York (1988), zu finden. Sofern erwünscht, kann die mRNA, die für die schweren und leichten Ketten kodiert, isoliert und durch Klonieren in E. coli mutagenisiert werden, und die schweren und leichten Ketten können vermischt werden, um die Affinität des Antikörpers weiter zu steigern. Die Antikörper können in Diagnosetests zum Nachweisen der Gegenwart des PTC-Proteins an der Oberfläche von Zellen verwendet werden oder auch, um die Transduktion von Signalen durch den PTC-Proteinliganden mittels Konkurrieren um die Bindungsstelle zu hemmen.
Das Maus-Patched-Gen (Seq.-ID Nr. 09) kodiert für ein Protein (Seq.-ID Nr. 10), das über etwa 1.200 Aminosäuren etwa 38 % identische Aminosäuren mit Fliegen-PTC (Seq.-ID Nr. 6) aufweist. Diese Konservierungsmenge wird durch einen Großteil des Proteins unter Ausnahme der C-terminalen Region dispergiert. Das Maus-Protein weist auch ein 50-Aminosäuren-Insert relativ zum Fliegenprotein auf. Das menschliche Patched-Gen (Seq.-ID Nr. 18) enthält einen offenen Leseraster von etwa 1.450 Aminosäuren (Seq.-ID Nr. 19), der zu etwa 96 % identisch (98 % ähnlich) mit Mausptc (Seq.-ID Nr. 09) ist. Das menschliche Patched-Gen (Seq.-ID Nr. 18), das Kodier- und Nichtkodiersequenzen einbindet, ist zu etwa 89 % mit dem Maus-Patched-Gen (Seq.-ID Nr. 09) identisch.
Das Schmetterling-PTC-Homolog (Seq.-ID Nr. 4) ist 1.300 Aminosäuren lang und weist insgesamt eine 50%ige Aminosäurenidentität (72 % Ähnlichkeit) zu Fliegen- PTC (Seq.-ID Nr. 6) auf. Unter Ausnahme eines unterschiedlichen C-Terminus ist diese Homologie gleichmäßig über die Kodiersequenz verteilt. Ein Exon mit 267 by aus dem Käfer-Patched-Gen kodiert für ein 89 Aminosäuren langes Proteinfragment, für das 44 % und 51 % Identität zu den entsprechenden Regionen von Fliegen- bzw. Schmetterling-PTC erkannt wurde.
Die Maus-ptc-Nachricht ist etwa 8 kb lang, und die Nachricht ist zu geringen Graden bereits 7 dpc vorhanden, wobei die Abundanz um 11 und 15 dpc steigt. Northern-Blot zeigt einen klaren Rückgang der Nachrichtenmenge bei 17 dpc an. Beim erwachsenen Tier ist PTC-RNA in hohen Mengen im Gehirn und der Lunge sowie in mäßigen Mengen in der Niere und der Leber vorhanden. Schwache Signale werden in Herz, Milz, Skelettmuskeln und Hoden nachgewiesen.
In Mausembryonen ist ptc-mRNA unter Verwendung von In-situ-Hybridisierung zu 7 dpc vorhanden. ptc ist in hohen Konzentrationen entlang der Neuralachse bei 8,5-dpc-Embryonen vorhanden. Bei 11,5 dpc kann ptc in sich entwickelnden Lungentrachealrinnen und im Darm nachgewiesen werden, was mit dem Northern-Profil übereinstimmt. Darüber hinaus ist das Gen zu hohen Konzentrationen in der ventrikulären Zone des Zentralnervensystems sowie in der Zona limitans des Prosenzephalons vorhanden. ptc wird auch in Perichondrium-kondensierenden Knorpel von 11,5- und 13,5-dpc-Extremitätenknospen stark transkribiert, sowie im ventralen Abschnitt der Somiten, einer Region, die potentielles Sklerotom darstellt und schließlich Knochen in der Wirbelsäule bildet. PTC ist in einem breiten Bereich an Geweben endodermalen, mesodermalen sowie ektodermalen Ursprungs vorhanden, was als Beweis für die essenzielle Rolle in der embryonalen Entwicklung in zahlreichen Aspekten steht, einschließlich der Kondensation von Knorpeln, der Strukturierung von Extremitäten, der Differenzierung von Lungengewebe und der Bildung von Neuronen.
Die Patched-Nucleinsäure kann zum Isolieren des Gens aus zahlreichen Säugetierquellen von Interesse, insbesondere von Primaten, noch spezifischer von Menschen, oder von Haustieren, sowohl von Haus- und Nutztieren, z.B. Lagomorpha, Nagetiere, Schweine, Rinder, Katzen, Hunde, Schafe, Pferde usw., verwendet werden. Unter Verwendung von Sonden, insbesondere von markierten Sonden von DNA-Sequenzen, des Patched-Gens hat man die Möglichkeit, mRNA oder genomische DNA zu isolieren, die dann zur Identifikation von Mutationen, insbesondere von solchen in Verbindung mit genetischen Erkrankungen, wie z.B. mit Spina bifida, Defekten an den Extremitäten, an der Lunge, Problemen mit Zahnentwicklung, Leber- und Nierenentwicklung, Entwicklung des peripheren Nervensystems, und anderen Stellen, in denen ein Patched-Gen in die Regulierung eingebunden ist, verwendet werden kann. Diese Sonden können auch zur Identifikation des Expressionsgrades in Zellen verwendet werden, die mit den Hoden assoziiert sind, um die Beziehung zwischen dem Expressionsgrad und der Spermienproduktion zu bestimmen.
Das Gen oder Fragmente davon kann bzw. können als Sonden zur Identifikation der 5'-Nichtkodierregion, umfassend die Transkriptionsstartregion, insbesondere den Enhancer, der die Transkription von Patched reguliert, verwendet werden. Durch Sondieren einer genomischen Bibliothek, insbesondere mit einer Sonde, die die 5'-Kodierregion umfasst, können Fragmente erhalten werden, die die 5'-Nichtkodierregion umfassen. Sofern erforderlich, kann das Fragment Walking unterzogen werden, um weitere 5'-Sequenz zu erhalten, um sicherzustellen, dass zumindest ein funktioneller Abschnitt des Enhancers zur Verfügung steht. Es wurde erkannt, dass der Enhancer proximal zur 5'-Kodierregion steht, wobei ein Abschnitt in der transkribierten Sequenz und stromab von den Promotorsequenzen liegt. Die Transkriptionsstartregion kann für zahlreiche Zwecke verwendet werden, zur Untersuchung embryonaler Entwicklung, zur Bereitstellung regulierter Expression von Patched-Protein oder anderen Proteinen von Interesse während der Embryonalentwicklung oder danach und zur Gentherapie.
Das Gen kann durch Transfektion des normalen Gens in embryonale Stammzellen oder in reife Zellen auch zur Gentherapie verwendet werden. Zahlreiche verschiedene virale Vektoren können zur Transfektion und stabilen Integration des Gens in das Genom der Zellen verwendet werden. Alternativ dazu kann Mikroinjektion, Fusion oder dergleichen zur Einführung von Genen in eine geeignete Wirtszelle verwendet werden. Siehe beispielsweise Dhawan et al., Science 254, 1509-1512 (1991), und Smith et al., Molecular and Cellular Biology, 3268-3271 (1990).
Durch Ermöglichen der Herstellung von großen Mengen an PTC-Protein kann das Protein zur Identifikation von Liganden verwendet werden, die sich an das PTC-Protein binden. Insbesondere kann das Protein in Zellen hergestellt werden, und die Polysomen können in Säulen zum Isolieren von Liganden für das PTC-Protein verwendet werden. Das PTC-Protein kann durch Kombinieren des Proteins mit geeigneten Lipidtensiden, z.B. mit Phospholipiden, Cholesterin usw., in Liposomen inkorporiert werden, und das Gemisch des PTC-Proteins und der Tenside kann in einem wässrigen Medium beschallt werden. Mit einem oder mehreren bekannten Liganden, z.B. Hedgehog, kann das PTC-Protein verwendet werden, um auf Antagonisten zu screenen, die das Binden des Liganden hemmen. Auf diese Weise können Wirkstoffe identifiziert werden, die die Transduktion von Signalen durch das PTC-Protein in normale oder abnormale Zellen unterbinden können.
Das PTC-Protein, insbesondere Bindefragmente davon, das für das Protein kodierende Gen oder Fragmente davon, insbesondere Fragmente von zumindest etwa 18 Nucleotiden, häufig von zumindest etwa 30 Nucleotiden und bis hinauf zu einem vollständigen Gen, noch spezifischer Sequenzen, die mit hydrophilen Schleifen assoziiert sind, können in zahlreichen verschiedenen Tests verwendet werden. In diesen Situationen werden die bestimmten Moleküle normalerweise an ein anderes Molekül gebunden, das als Markierung dient, worin die Markierung direkt oder indirekt ein nachweisbares Signal bereitstellen kann. Verschiedene Markierungen umfassen Radioisotope, fluoreszierende Substanzen, chemilumineszierende Substanzen, Enzyme, spezifische Bindungsmoleküle, Partikel, z.B. magnetische Partikel, und dergleichen. Spezifische Bindungsmoleküle umfassen Paare, wie z.B. Biotin und Streptavidin, Digoxin und Antidigoxin usw. Für die spezifischen Bindungselemente wird das komplementäre Element normalerweise gemäß bekannter Verfahren mit einem Molekül markiert, das für Detektion sorgt. Die Tests können zur Detektion der Gegenwart von Molekülen verwendet werden, die sich an das Patched-Gen oder das PTC-Protein binden, zum Isolieren von Molekülen, die sich an das Patched-Gen binden, zum Messen der Menge an Patched, entweder in Form des Proteins oder der Nachricht, zur Identifikation von Molekülen, die als Agonisten oder Antagonisten dienen können, oder dergleichen.
Verschiedene Formate können in den Tests verwendet werden. Zum Beispiel können Säugetier- oder Wirbellose-Zellen entworfen werden, worin die Zellen reagieren, wenn sich ein Agonist an PTC in der Membran der Zelle bindet. Eine Expressionskassette kann in die Zelle eingeführt werden, wobei die Transkriptionsstartregion von Patched an ein Markergen, wie z.B. β-Galactosidase, gebunden ist, für das ein Substrat, das eine Blaufärbung bildet, erhältlich ist. Ein 1,5-kb-Fragment, das auf PTC-Signale reagiert, konnte identifiziert werden, und es wurde gezeigt, dass es während der embryonalen Entwicklung die Expression eines heterologen Gens reguliert. Bindet sich ein Agonist an das PTC-Protein, so verfärbt sich die Zelle blau. Durch Verwendung von Konkurrenz zwischen einem Agonisten und einer Verbindung von Interesse weist ausbleibende Blaufärbung auf die Gegenwart eines Antagonisten hin. Diese Tests sind in der Literatur bekannt. Anstelle von Zellen kann auch das Protein in einer Membranumgebung verwendet werden, und Bindungsaffinitäten von Verbindungen können bestimmt werden. Das PTC kann an eine Oberfläche gebunden und ein markierter Ligand für PTC verwendet werden. Zahlreiche Markierungen wurden hierfür bereits vorgeschlagen. Die Kandidatenverbindung wird mit dem markierten Liganden in einem geeigneten gepufferten Medium zum Oberflächen-gebundenen PTC zugesetzt. Nach einer Inkubation zur Sicherstellung, dass Bindung eingetreten ist, können von der Oberfläche sämtliche nicht-spezifisch gebundenen Komponenten des Testmediums, insbesondere sämtliche nicht-spezifisch gebundenen markierten Liganden, abgewaschen werden, und jegliche Markierung, die an die Oberfläche gebunden ist, wird bestimmt. Ist die Markierung ein Enzym, so kann Substrat, das ein nachweisbares Produkt produziert, verwendet werden. Die Markierung kann nachgewiesen und gemessen werden. Unter Verwendung von Standards kann die Bindungsaffinität der Kandidatenverbindung bestimmt werden.
Die Verfügbarkeit des Gens und des Proteins ermöglicht die Untersuchung der Entwicklung des Fötus und die Rolle, die Patched und andere Moleküle in dieser Ent wicklung spielen. Durch Verwenden von Antisense-Sequenzen des Patched-Gens, worin die Sequenzen in Zellen in Kultur eingeführt werden können, oder eines Vektors, der für Transkription des Antisense des Patched-Gens, das in die Zellen eingeführt wurde, sorgt, kann untersucht werden, welche Rolle das PTC-Protein in der zellulären Entwicklung spielt. Durch Bereitstellen des PTC-Proteins oder eines Fragmentes davon in einer löslichen Form, die mit dem normalen zellulären PTC-Protein für Liganden konkurrieren kann, kann die Bindung von Liganden an das zelluläre PTC-Protein gehemmt werden, um die Wirkung einer Veränderung der Konzentration an Liganden für das PTC-Protein auf die zelluläre Entwicklung des Wirts zu beobachten. Antikörper gegen PTC können auch verwendet werden, um Funktion zu blockieren, da PTC an der Zelloberfläche frei liegt.
Das Gen von Interesse kann auch zur Herstellung transgener Labortiere verwendet werden, die zur Untersuchung embryonaler Entwicklung und der Rolle des PTC-Proteins in dieser Entwicklung eingesetzt werden können. Durch Sorgen für Veränderung in der Expression des PTC-Proteins unter Verwendung verschiedener Transkriptionsstartregionen, die konstitutiv oder induzierbar sein können, kann die Wirkung von unterschiedlichen PTC-Proteinkonzentrationen auf die Entwicklung bestimmt werden. Alternativ dazu kann die DNA verwendet werden, um das PTC-Protein in embryonalen Stammzellen auszuschalten, sodass Wirte mit nur einem einzelnen funktionellen Patched-Gen oder Wirte, denen ein funktionelles Patched-Gen fehlt, produziert werden. Mittels homologer Rekombination kann ein Patched-Gen eingeführt werden, das differenziell reguliert ist, das z.B. zur Entwicklung des Fötus exprimiert wird, jedoch nicht im erwachsenen Tier. Auch kann für Expression des Patched-Gens in Zellen oder Geweben, in denen es normalerweise nicht exprimiert wird, oder auch zu abnormalen Entwicklungszeitpunkten gesorgt werden. Man kann auch Fehlexpression oder Ausfallen von Expression in bestimmten Geweben verursachen, um eine menschliche Erkrankung nachzuahmen. So werden Mausmodelle von Spina bifida oder abnormaler Motorneurondifferenzierung in dem sich entwickelnden Rückenmark verfügbar gemacht. Durch Bereitstellen von Expression von PTC-Protein in Zellen, in denen es normalerweise nicht produziert wird, können durch Bindung von Liganden an das PTC-Protein Veränderungen im Zellverhalten induziert werden.
Forschungsbereiche können die Entwicklung von Krebsbehandlungen einbinden. Das Wingless-Gen, dessen Transkription in Fliegen durch PTC reguliert wird, ist eng verbunden mit einem Säugetier-Onkogen, Wnt-1, einem Schlüsselfaktor in zahlreichen Fällen von Mausbrustkrebs. Andere Wnt-Familienmitglieder, die sekretierte Signalproteine sind, sind in zahlreiche Aspekte der Entwicklung eingebunden. Bei Fliegen wird der Signalfaktor Decapentaplegic, ein Mitglied der TGF-beta-Familie von Signalproteinen, der dafür bekannt ist, Wachstum und Entwicklung von Säugetieren zu beeinflussen, auch durch PTC kontrolliert. Da Mitglieder sowohl der TGF-beta- als auch der Wnt-Familien in Mäusen an Stellen exprimiert werden, die mit Patched beinahe überlappen, liefert die gemeinsame Regulation eine Gelegenheit zur Behandlung von Krebs. Auch bei der Reparatur und Regeneration können vermehrungskompetente Zellen, die PTC-Protein bilden, Verwendung finden, um Regeneration und Heilung von geschädigtem Gewebe zu fördern, wobei das Gewebe durch Transfektion von Zellen von geschädigtem Gewebe mit dem ptc-Gen und seiner normalen Transkriptionsstartregion oder einer modifizierten Transkriptionsstartregion regeneriert werden kann. Beispielsweise kann PTC nützlich sein, um Wachstum von neuen Zähnen durch Herstellen von Zellen von Zahnfleisch- oder anderen Geweben zu stimulieren, worin PTC-Protein während eines früheren Entwicklungsstadium vorhanden ist oder exprimiert wird.
Da Northern-Blot-Analyse angibt, dass ptc in hohen Konzentrationen in erwachsenem Lungengewebe vorhanden ist, kann die Regulation von ptc-Expression oder Bindung an seinen natürlichen Liganden dazu dienen, Proliferation von kanzerösen Lungenzellen zu hemmen. Die Verfügbarkeit des für PTC kodierenden Gens und die Expression des Gens ermöglicht die Entwicklung von Agonisten und Antagonisten. Weiters ist PTC maßgeblich für die Fähigkeit von Neuronen, früh in der Entwicklung zu differenzieren. Die Verfügbarkeit des Gens ermöglicht das Einführen von PTC in erkranktes Gewebe eines Wirts und die Stimulation des fötalen Teilungs- und/oder Differenzierungsprogramms. Dies könnte in Verbindung mit anderen Genen, die PTC-Aktivität regulierende Liganden bereitstellen, oder durch Bereitstellung von Agonisten, die keine natürlichen Liganden sind, erfolgen.
Die Verfügbarkeit der Kodierregion für verschiedene ptc-Gene aus verschiedenen Spezies ermöglicht das Isolieren der 5'-Nichtkodierregion, die den Promotor und Enhancer, der mit den ptc-Genen assoziiert ist, umfasst, um so Transkriptions- und Posttranskriptionsregulation des ptc-Gens oder anderer Gene zu erwirken, was die Regulierung von Genen in Verbindung mit der Regulierung des ptc-Gens ermöglicht. Da das ptc-Gen autoreguliert ist, resultiert die Aktivierung des ptc-Gens in der Aktivierung von Transkription eines Gens unter der Transkriptionskontrolle der Transkriptionsstartregion des ptc-Gens. Die Transkriptionsstartregion kann aus jeder beliebigen Wirtspezies gewonnen werden und in eine heterologe Wirtspezies eingeführt werden, wobei solch eine Startregion zu dem erwünschten Ausmaß im fremden Wirt funktionell ist. Beispielsweise kann ein Fragment von etwa 1,5 kb stromauf vom Startcodon, bis zu etwa 10 kb, vorzugsweise bis zu etwa 5 kb, verwendet werden, um für den Transkriptionsstart zu sorgen, der durch das PTC-Protein, insbesondere durch die Drosophila-5'-Nichtkodierregion (GenBank Zugriffsnummer M28418), reguliert wird.
Die folgenden Beispiele sind als Veranschaulichung und nicht als Einschränkung bereitgestellt.
VERSUCHSTEIL
Verfahren und Materialien
I. PCR an genomischer Stechmücken- (Anopheles-gambiae-) DNA:
PCR-Primer basierten auf Aminosäureabschnitten von Fliegen-PTC, die keine Neigung hatten, sich über die Dauer der Evolution divergent zu entwickeln, und die geringe Degeneration aufwiesen. Zwei solche Primer (P2R1 (Seq.-ID Nr. 14): GGACGAATTCAARGTNCAYCARYTNTGG, P4R1 (Seq.-ID Nr. 15): GGACGAATTCCYTCCCARAARCANTC) (die unterstrichenen Sequenzen sind Eco RI-Linker) amplifizierten eine Bande mit geeigneter Größe aus genomischer Stechmücken-DNA unter Verwendung von PCR. Die Programmbedingungen waren wie folgt:
94 °C 4 min; 72 °C Zusatz von Taq;
[49 °C 30 s, 72 °C 90 s; 94 °C 15 s] 3-mal
[94 °C 15 s, 50 °C 30 s; 72 °C 90 s] 35-mal
72 °C 10 min, 4 °C Halten
Diese Bande wurde in die EcoRV-Stelle von pBluescript II subkloniert und unter Verwendung des USB-Sequenz-Sets sequenziert.
II. Screening einer Schmetterling-cDNA-Bibliothek mit Stechmücken-PCR-Produkt
Unter Verwendung des Stechmücken-PCR-Produkts (Seq.-ID Nr. 7) als Sonde wurde eine 3 Tage alte embryonale Precis-coenia-λgt10-cDNA-Bibliothek (freundlicherweise von Sean Carroll zur Verfügung gestellt) gescreent. Die Filter wurden bei 65 °C über Nacht in einer Lösung, die 5 × SSC, 10 % Dextransulfat, 5 × Denhardt's, 200 μg/ml beschallte Lachssperma-DNA und 0,5 % SDS enthielt, hybridisiert. Die Filter wurden in 0,1 × SSC, 0,1 % SDS bei Raumtemperatur mehrere Male gewaschen, um nichtspezifische Hybridisierung zu entfernen. Von den anfänglich 100.000 gescreenten Plaques wurden 2 überlappende Klone, L1 und L2, isoliert, die dem N-Terminus von Schmetterling-PTC entsprachen. Unter Verwendung von L2 als Sonde wurden die Bibliotheksfilter erneut gescreent, und 3 weitere Klone (L5, L7, L8) wurden isoliert, die den Rest der ptc-Kodiersequenz abdeckten. Die Volllängensequenz von Schmetterling-ptc (Seq.-ID Nr. 3) wurde durch automatisiertes ABI-Sequenzieren bestimmt.
III. Screeninq einer genomischen Tribolium- (Käfer-) Bibliothek mit Stechmücken-PCR-Produkt und 900-bp-Fragment aus dem Schmetterlingsklon
Eine genomische λgem11-Bibliothek aus Tribolium casteneum (Geschenk von Rob Dennell) wurde mit einem Gemisch aus dem Stechmücken-PCR-Produkt (Seq.-ID Nr. 7) und BstXI/EcoRI-Fragment von L2 sondiert. Filter wurden bei 55 °C über Nacht hybridisiert und wie zuvor beschrieben gewaschen. Von den 75.000 gescreenten Plaques wurden 14 Klone identifiziert, und das SacI-Fragment von T8 (Seq.-ID Nr. 1), das mit den Stechmücken- und Schmetterlingsonden kreuzhybridisierte, wurde in pBluescript subkloniert.
IV. PCR an Maus-cDNA unter Verwendung von degenerierten Primern, abstammend aus Regionen, die in den vier Insektenhomologen konserviert waren
Zwei degenerierte PCR-Primer (P4REV: (Seq.-ID Nr. 16) GGACGAATTCYTNGANTGYTTYTGGGA; P22: (Seq.-ID Nr. 17) CATACCAGCCAAGCTTGTCIGGCCARTGCAT) wurden basierend auf einem Vergleich von PTC-Aminosäuresequenzen von Fliege (Drosophila melanogaster) (Seq.-ID Nr. 6), Stechmücke (Anopheles gambiae) (Seq.-ID Nr. 8), Schmetterling (Precis coenia) (Seq.-ID Nr. 4) und Käfer (Tribolium casteneum) (Seq.-ID Nr. 2) entworfen. I steht für Inosin, das Basenpaare mit allen vier Nucleosiden bilden kann. P22 wurde verwendet, um RNA aus 12,5-dpc-Maus-Extremitätenknospen (Geschenk von David Kingsley) 90 min lang bei 37 °C revers zu transkribieren. PCR unter Verwendung von P4REV (Seq.-ID Nr. 17) und P22 (Seq.-ID Nr. 18) wurde dann an 1 μl der resultierenden cDNA unter den folgenden Bedingungen durchgeführt:
94 °C 4 min; 72 °C Zusatz von Taq;
[94 °C 15 s, 50 °C 30 s; 72 °C 90 s] 35-mal
72 °C 10 min, 4 °C Halten
PCR-Produkte von erwarteter Größe wurden in den TA-Vektor (Invitrogen) subkloniert und mit dem Sequenase-DNA-Sequenzierungs-Set, Version 2.0 (U.S.B.), sequenziert.
Unter Verwendung des klonierten Maus-PCR-Fragments als Sonde wurden 300.000 Plaques einer Maus-8,5-dpc-λgt10-cDNA-Bibliothek (Geschenk von Brigid Hogan) bei 65 °C wie oben gescreent und in 2 × SSC, 0,1 % SDS bei Raumtemperatur gewaschen 7 Klone wurden isoliert, und drei (M2, M4 und M8) wurden in pBluescript II subkloniert. 200.000 Plaques aus dieser Bibliothek wurden unter Verwendung erstens eines 1,1-kb-EcoRI-Fragments aus M2 zur Identifikation von 6 Klonen (M9-M16) und zweitens einer gemischten Sonde, die die meisten N-terminalen (XhoI-Fragment aus M2) und die meisten C-terminalen Sequenzen (BamHI/BglIII-Fragment aus M9) enthielten, zum Isolieren von 5 Klonen (M17-M21) neuerlich gescreent. M9, M10, M14 und M17-21 wurden in die EcoRI-Stelle von pBluescript II (Strategene) subkloniert.
V. RNA-Blots und In-situ-Hybridisierung in ganzen Mausembryonen und Schnitten von Mausembryonen
Northerns:
Ein Mausembryo-Northern-Blot und ein Northern-Blot von multiplem erwachsenem Gewebe (erhalten von Clontech) wurden mit einem 900-bp-EcoRI-Fragment aus einer N-terminalen Kodierregion von Maus-ptc sondiert. Hybridisierung erfolgte bei 65 °C in 5 × SSPE, 10 × Denhardt's, 100 μg/ml beschallter Lachssperma-DNA und 2 % SDS. Nach mehreren kurzen Waschschritten bei Raumtemperatur in 2 × SSC, 0,05 % SDS, wurden die Blots unter hoher Stringenz in 0,1 × SSC, 0,1 % SDS bei 50 °C gewaschen.
In-situ-Hybridisierung von Schnitten:
7,75-, 8,5-, 11,5- und 13,5-dpc-Mausembryonen wurden in PBS, seziert und in Tissue-Tek-Medium bei -80 °C eingefroren. 12-16 μm große gefrorene Schnitte wurden zugeschnitten, auf VectaBond- (Vector Laboratories) beschichteten Objektträgern gesammelt und 30-60 Minuten lang bei Raumtemperatur getrocknet. Nach einer 10-minütigen Fixierung in 4 % Paraformaldehyd in PBS wurden die Objektträger 3-mal 3 Minuten lang in PBS gewaschen, 10 Minuten lang in 0,25 % Essigsäurean hydrid in Triethanolamin acetyliert und drei weitere Male 5 Minuten lang in PBS gewaschen. Prähybridisierung (50 % Formamid, 5 × SSC, 250 μg/ml Hefe-tRNA, 500 μg/ml beschallte Lachssperma-DNA und 5 × Denhardt's) wurde 6 Stunden lang bei Raumtemperatur in 50 % Formamid / 5 × SSC befeuchteten Kammern durchgeführt. Die Sonde, die aus 1 kb aus dem N-Terminus von ptc bestand, wurde bei einer Konzentration von 200-1.000 ng/ml zu derselben Lösung zugesetzt, die für die Prähybridisierung verwendet wurde, und wurde anschließend fünf Minuten lang bei 80 °C denaturiert. Etwa 75 μl Sonde wurden zu jedem Objektträger zugesetzt und mit Parafilm bedeckt. Die Objektträger wurden über Nacht bei 65 °C in derselben befeuchteten Kammer wie zuvor inkubiert. Am folgenden Tag wurde die Sonde nacheinander in 5 × SSC (5 Minuten, 65 °C), 0,2 × SSC (1 Stunde, 65 °C) und 0,2 × SSC (10 Minuten, Raumtemperatur) gewaschen. Nach fünf Minuten in Puffer B1 (0,1 M Maleinsäure, 0,15 M NaCl, pH 7,5) wurden die Objektträger 1 Stunde lang bei Raumtemperatur in 1 % Blocker (Boehringer-Mannheim) in Puffer B1 blockiert und anschließend 4 Stunden lang in Puffer B1, der den DIG-AP-konjugierten Antikörper (Boehringer-Mannheim) enthielt, bei einer Verdünnung von 1:5.000 inkubiert. Überschüssiger Antikörper wurde während zwei 15-minütiger Waschschritte in Puffer B1 entfernt, woraufhin fünf Minuten in Puffer B3 (100 mM Tris, 100 mM NaCl, 5 mM MgCl₂, pH 9,5) folgten. Der Antikörper wurde durch Zusatz eines alkalischen Phosphatasesubstrats (350 μl 75 mg/ml X-Phosphat in DMF, 450 μl 50 mg/ml NBT in 70 % DMF in 100 ml von Puffer B3) nachgewiesen, und die Reaktion wurde über Nacht im Dunklen laufen gelassen. Nach einer kurzen Spülung in 10 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 8,0, wurden die Objektträger auf Aquamount (Lerner Laboratories) fixiert.
VI. Drosophila-5-Transkriptionsstartregion-β-gal-Konstrukte
Eine Reihe von Konstrukten wurde entworfen, die verschiedene Regionen des ptc-Promotors aus Drosophila an ein LacZ-Reportergen banden, um die cis-Regulation des ptc-Expressionsmusters zu untersuchen. Siehe 1. Ein 10,8-kb-BamHI/BspM1-Fragment, das die 5'-Nichtkodierregion der mRNA an seinem 3'-Terminus umfasste, wurde gewonnen und durch Restriktionsenzymverdau wie in 1 gezeigt trunkiert. Diese Expressionskassetten wurden unter Verwendung eines P-Elementvektors in Drosophila-Linien eingeführt (Thummel et al., Gene 74, 445-456 (1988)), die in Embryonen injiziert wurden, woraus Fliegen entstanden, die gezüchtet werden konnten, um Embryonen zu bilden. (Siehe Spradling & Rubin, Science 218, 341-347 (1982), für eine Beschreibung des Verfahrens.) Der Vektor verwendete einen pUC8-Hintergrund, in den das weiße Gen eingeführt wurde, um gelbe Augen als Resultat zu erhalten, Abschnitte des P-Elements zur Integration, und die Konstrukte wurden in einen Polylinker stromauf vom LacZ-Gen insertiert. Die resultierenden Embryonen wurden unter Verwendung von Antikörpern gegen LacZ-Protein, konjugiert an HRP, gefärbt, und die Embryonen wurden mit OPD-Farbstoff entwickelt, um die Expression des LacZ-Gens zu identifizieren. Das Färbungsmuster wird in 1 beschrieben, die angibt, ob Färbung während der frühen und späten Entwicklung des Embryos auftrat oder nicht.
VII. Isolation eines Maus-ptc-Gens
Homologe von Fliegen-PTC (Seq.-ID Nr. 6) wurden aus drei Insekten isoliert: Stechmücke, Schmetterling und Käfer, entweder unter Verwendung von PCR oder von Bibliotheks-Screens mit niedriger Stringenz. PCR-Primer zu sechs Aminosäureabschnitten von PTC mit geringer Mutationsfähigkeit und Degeneration wurden entworfen. Ein Primerpaar, P2 und P4, amplifizierte ein homologes Fragment von ptc aus genomischer Stechmücken-DNA, das der ersten hydrophilen Schleife des Proteins entsprach. Das 345-bp-PCR-Produkt (Seq.-ID Nr. 7) wurde subkloniert und sequenziert, und bei einem Abgleich mit Fliegen-PTC zeigte es 67 % Aminosäureidentität.
Das klonierte Stechmückenfragment wurde verwendet, um eine Schmetterling-λGT-10-cDNA-Bibliothek zu screenen. Aus 100.000 gescreenten Plaques wurden fünf überlappende Klone isoliert und verwendet, um die Volllängen-Kodiersequenz zu erhalten. Das Schmetterling-PTC-Homolog (Seq.-ID Nr. 4) weist eine Länge von 1.311 Aminosäuren auf und hat insgesamt 50 % Aminosäureidentität (72 % Ähnlichkeit) mit Fliegen-PTC. Unter Ausnahme des divergenten C-Terminus ist diese Homologie gleichmäßig über die Kodiersequenz verteilt. Der Stechmücken-PCR-Klon (Seq.-ID Nr. 7) und ein entsprechendes Fragment von Schmetterling-cDNA wurden verwen det, um eine genomische Käfer-λgem11-Bibliothek zu screenen. Von den gescreenten Plaques wurden 14 Klone identifiziert. Ein Fragment von einem Klon (T8), das mit den originalen Sonden hybridisierte, wurde subkloniert und sequenziert. Dieses 3-kb-Stück enthält ein 89-Aminosäuren-Exon (Seq.-ID Nr. 2), das zu 44 % und 51 % identisch mit den entsprechenden Regionen von Fliegen- bzw. Schmetterling-PTC ist.
Unter Verwendung eines Abgleichs der vier Insektenhomologe in der ersten hydrophilen Schleife des PTC wurden zwei PCR-Primer so entworfen, dass sie fünf und sechs Aminosäurenabschnitte aufwiesen, die identisch waren und geringe Degeneration aufwiesen. Diese Primer wurden verwendet, um das Maushomolog unter Verwendung von RT-PCR an embryonaler Extremitätenknospen-RNA zu isolieren. Eine Bande mit geeigneter Größe wurde amplifiziert, und durch Klonieren und Sequenzieren wurde erkannt, dass sie für ein Protein kodiert, das 65 % Identität mit Fliegen-PTC aufwies. Unter Verwendung des klonierten PCR-Produkts und in weiterer Folge von Fragmenten aus Maus-ptc-cDNA wurde eine embryonale MausλcDNA-Bibliothek gescreent. Aus etwa 300.000 Plaques wurden 17 Klone identifiziert, und von diesen bilden 7 überlappende cDNA, die den Großteil der für das Protein kodierenden Sequenz (Seq.-ID Nr. 9) umfassen.
VIIa. Entwicklungs- und Gewebeverteilung von Maus-PTC-RNA
Sowohl in embryonalen als auch in erwachsenen Northern-Blots detektiert die ptc-Sonde eine einzelne 8-kb-Nachricht. Weiter Exposition bringt keine weiteren Nebenbanden zum Vorschein. Hinsichtlich der Entwicklung ist ptc-mRNA in geringen Konzentration bereits an 7 dpc vorhanden und tritt bei 11 und 15 dpc relativ häufig auf. Während das Gen an 17 dpc immer noch vorhanden ist, weist der Northern-Blot auf einen eindeutigen Rückgang der Menge an Nachricht in diesem Stadium hin. Im Erwachsenen ist ptc-RNA in großen Mengen in Gehirn und Lunge sowie in mäßigen Mengen in Niere und Leber vorhanden. Schwache Signale werden in Herz, Milz, Skelettmuskel und Hoden nachgewiesen.
VIIb. In-situ-Hybridisierung von Maus-PTC in ganzen Embryonen und Embryonen schnitten
Northern-Analyse weist darauf hin, dass ptc-mRNA an 7 dpc vorhanden ist, während in Schnitten von 7,75-dpc-Embryonen kein nachweisbares Signal vorhanden ist. Dieser Unterschied erklärt sich aus dem geringen Transkriptionsniveau. Im Gegensatqz dazu ist ptc in hohen Konzentrationen entlang der Neuralachse von 8,5-dpc-Embryonen vorhanden. Bei 11,5 dpc kann ptc in den sich entwickelnden Lungentrachealrinnen und dem Darm nachgewiesen werden, was mit dem Northern-Profil von Erwachsenen übereinstimmt. Weiters ist das Gen in hohen Konzentrationen in der ventrikulären Zone des Zentralnervensystems sowie in der Zona limitans des Prosenzephalons vorhanden. ptc wird auch in den kondensierenden Knorpeln von 11,5- und 13,5-dpc-Extremitätenknospen stark transkribiert, sowie im ventralen Abschnitt der Somiten, einer Region, die potentielles Sklerotom darstellt und schließlich Knochen in der Wirbelsäule ausbildet. ptc ist in einem weiten Bereich an Geweben endodermalen, mesodermalen und ektodermalen Ursprungs vorhanden, was seine maßgebliche Rolle in der Embryonalentwicklung untermauert.
VIII. Isolation des menschlichen ptc-Gens
Um menschliches ptc (hptc) zu isolieren, wurden 2 × 10⁵ Plaques aus einer menschlichen Lungen-cDNA-Bibliothek (HL3022a, Clonetech) mit einem 1-kbp-Maus-ptc-Fragment, M2-2, gescreent. Die Filter wurden über Nacht unter reduzierter Stringenz (60 °C in 5 × SSC, 10 % Dextransulfat, 5 × Denhardt's, 0,2 mg/ml beschallte Lachssperma-DNA und 0,5 % SDS) hybridisiert. Zwei positive Plaques (H1 und H2) wurden isoliert, die Inserts wurden in pBluescript kloniert, und beim Sequenzieren wurde erkannt, dass beide eine Sequenz enthielten, die dem Maus-ptc-Homolog äußerst ähnlich war. Um das 5'-Ende zu isolieren, wurden zusätzliche 6 × 105 Plaques in doppelter Ausführung mit M2-3-EcoR-I- und M2-3-Xho-I- (die untranslatierte 5'-Sequenz von Maus-ptc enthielt) Sonden gescreent. Zehn Plaques wurden gereinigt, und von diesen wurden 6 Inserts in pBluescript subkloniert. Um die Volllängen-Kodiersequenz zu erhalten, wurde H2 zur Gänze und H14, H20 und H21 teilweise sequenziert. Die 5,1-kbp-Mensch-ptc-Sequenz (Seq.-ID Nr. 18) enthält einen offenen Leseraster von 1.447 Aminosäuren (Seq.-ID Nr. 19), der mit Maus-ptc zu 96 % identisch und zu 98 % ähnlich ist. Die untranslatierten 5'- und 3'-Sequenzen von menschlichem ptc (Seq.-ID Nr. 18) sind Maus-ptc (Seq.-ID Nr. 09) ebenfalls äußerst ähnlich, was auf eine konservierte Regulationssequenz schließen lässt.
IX. Vergleich von Maus-, Mensch-, Fliegen- und Schmetterling Sequenzen
Die abgeleitete Maus-PTC-Proteinsequenz (Seq.-ID Nr. 10) weist etwa 38 % mit Fliegen-PTC identische Aminosäuren innerhalb von etwa 1.200 Aminosäuren auf. Diese Menge an Konservierung ist unter Ausnahme der C-terminalen Region über einen Großteil des Proteins verteilt. Das Mausprotein weist auch ein 50-Aminosäuren-Insert mit Bezug auf das Fliegenprotein auf. Auf Grundlage der Sequenzkonservierung von PTC und der funktionellen Konservierung von Hedgehog zwischen Fliege und Maus kann geschlossen werden, dass ptc-Funktionalitäten in den zwei Organismen ähnlich sind. Ein Vergleich der Aminosäurensequenzen von Maus (mptc) (Seq.-ID Nr. 10), Mensch (hptc) (Seq.-ID Nr. 19), Schmetterling (bptc) (Seq.-ID Nr. 4) und Drosophila (ptc-) (Seq.-ID Nr. 6) ist in Tabelle 1 gezeigt.
TABELLE 1 Abgleich von Mensch-, Maus-, Fliegen- und Schmetterling-PTC-Homologen
Die Identität von zehn anderen Klonen, die aus der Mausbibliothek gewonnen wurden, ist nicht bestimmt. Diese cDNAs kreuzhybridisieren mit Maus-ptc-Sequenz, während sie sich hinsichtlich ihrer Restriktionskarten unterscheiden. Diese Gene kodieren für eine Familie von Proteinen, die mit dem Patched-Protein verwandt sind. Abgleich der menschlichen Nucleotidsequenz und der Maus-Nucleotidsequenz, die Kodier- und Nichtkodiersequenzen enthält, zeigt 89 % Identität.
Gemäß der vorliegenden Erfindung werden Säugetier-Patched-Gene, einschließlich Maus- und Mensch-Genen, bereitgestellt, die Hochleistungsproduktion von Patched-Protein ermöglichen, das zu zahlreichen Zwecken dienen kann. Das Patched-Protein kann in einem Screening auf Agonisten und Antagonisten, zur Isolation seines Liganden, insbesondere Hedgehog, noch spezifischer Sonic hedgehog, und zum Testen auf Transkription des mRNA-ptc verwendet werden. Das Protein oder Fragmente davon können verwendet werden, um Antikörper zu produzieren, die für das Protein oder für spezifische Epitope des Proteins spezifisch sind. Darüber hinaus kann das Gen zur Erforschung der Embryonalentwicklung durch Screenen fötalen Gewebes, Herstellen transgener Tiere, die als Modelle dienen, und dergleichen eingesetzt werden.
SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Isolierte DNA, die kein Drosophila-Patched-Gen oder Fragment davon ist, mit einer DNA-Sequenz mit zumindest etwa 12 bp, die sich von der Sequenz des Drosophila-Patched-Gens unterscheiden, worin die DNA unter stringenten Bedingungen an eine aus Seq.-ID Nr. 1, 3, 5, 7, 9, 18 und Fragmente davon hybridisiert und für ein Patched-Polypeptid kodiert, das ein Igel-Polypeptid bindet.
DNA nach Anspruch 1, worin das Patched-Gen ein Säugetiergen ist.
DNA nach Anspruch 1 für ein Patched-Gen eines Menschen, einer Maus, einer Stechmücke, eines Schmetterlings oder eines Käfers.
DNA nach Anspruch 3, worin die DNA-Sequenz eine menschliche Sequenz ist.
DNA nach Anspruch 4, worin die DNA-Sequenz eine Mäusesequenz ist.
DNA nach Anspruch 1, worin die DNA ein Fragment mit zumindest etwa 18 bp ist.
DNA nach Anspruch 1, die an eine DNA gebunden ist, welche eine Restriktionsenzymerkennungssequenz umfasst.
DNA nach Anspruch 1, worin die DNA-Sequenz eine aus Seq.-ID Nr. 1, 3, 5, 7, 9, 18 oder ein Fragment davon umfasst.
Expressionskassette, umfassend eine Transkriptionsinitiationsregion, die in einem Expressionswirt funktionell ist, eine DNA-Sequenz nach Anspruch 1 unter Transkriptionsregulation der Transkriptionsinitiationsregion und eine Transkriptionsterminationsregion, die in dem Expressionswirt funktionell ist.
Expressionskassette nach Anspruch 9, worin die Transkriptionsinitiationsregion heterolog zur DNA-Sequenz ist.
Expressionskassette nach Anspruch 9, worin die Transkriptionsinitiationsregion homolog zur DNA-Sequenz ist und die Enhancer-Region umfasst.
Zelle, umfassend eine Expressionskassette nach einem der Ansprüche 9 bis 11 als Teil eines extrachromosomalen Elements oder, als Ergebnis der Einführung der Expressionskassette in die Wirtszelle, in das Genom einer Wirtszelle integriert und die zelluläre Nachkommenschaft dieser Wirtszelle, worin die zelluläre Nachkommenschaft ebenfalls die Expressionskassette als Teil eines extrachromosomalen Elements oder in das Genom der Zelle integriert umfasst.
Zelle nach Anspruch 12, außerdem das Patched-Polypeptid in der Zellmembran der Zelle umfassend.
Zelle nach Anspruch 12, worin das Patched-Polypeptid ein Mäuse-Patched-Polypeptid ist.
Zelle nach Anspruch 12, worin das Patched-Gen für ein menschliches Patched-Polypeptid kodiert.
Zelle nach Anspruch 12, worin die Transkriptionsinitiationsregion eine Transkriptionsinitiationsregion eines Drosophila-Patched-Gens ist, die den Promotor und Enhancer an ein heterologes Gen gebunden umfasst.
Zelle, umfassend eine Expressionskassette, umfassend eine Transkriptionsinitiationsregion, die in einem Expressionswirt funktionell ist, wobei die Transkriptionsinitiationsregion aus einer 5'-nichtkodierenden Region besteht, welche die Transkription einer DNA-Sequenz nach Anspruch 1 reguliert, die den Promotor und Enhancer umfasst, ein Markergen und eine Transkriptionsterminationsregion als Teil eines ex trachromosomalen Elements oder, als Ergebnis der Einführung der Expressionskassette in den Wirt, in das Genom einer Wirtszelle integriert und die zelluläre Nachkommenschaft davon, worin die zelluläre Nachkommenschaft ebenfalls die Expressionskassette als Teil eines extrachromosomalen Elements oder in das Genom der Zelle integriert umfasst.
Zellen nach Anspruch 17, worin die Transkriptionsinitiationsregion die Drosophila-Region ist.
Verfahren zum Verfolgen nichtmenschlicher embryonaler Entwicklung unter Verwendung eines Patched-Polypeptids, wobei das Verfahren Folgendes umfasst: Integrieren einer Expressionskassette, umfassend eine Transkriptionsinitiationsregion, die in embryonalen Wirtszellen funktionell ist, wobei die Transkriptionsinitiationsregion aus einer 5'-nichtkodierenden Region besteht, welche die Transkription einer DNA-Sequenz nach Anspruch 1 reguliert, ein Markergen und eine Transkriptionsterminationsregion, worin die embryonalen Wirtszellen zur Entwicklung zu einem Fötus fähig sind; Züchten der embryonalen Wirtszellen, wodurch eine Proliferation und Differenzierung stattfinden; und Lokalisieren von Zellen, die das Patched-Polypeptid exprimieren, mithilfe der Expression des Markergens.
Verfahren zur Herstellung eines Patched-Polypeptids, wobei das Verfahren Folgendes umfasst: Züchten einer Zelle nach Anspruch 12, wodurch das Patched-Polypeptid exprimiert wird; und Isolieren des Patched-Polypeptids frei von anderen Proteinen.
Verfahren zum Screenen von Kandidatenverbindungen auf ihre Bindungsaffinität zu einem Patched-Polypeptid, wobei das Verfahren Folgendes umfasst: Kombinieren der Kandidatenverbindung mit einer Zelle eines Wirbeltiers oder wirbellosen Tiers, die das Patched-Protein in der Membran der Zelle umfasst, und einer Expressionskassette, umfassend eine Transkriptionsinitiationsregion, die in der Zelle funktionell ist, eine DNA-Sequenz nach Anspruch 1, umfassend die gesamte Kodierungssequenz unter Transkriptionsregulation der Transkriptionsinitiationsregion, und eine Transkriptionsterminationsregion, die in der Zelle funktionell ist, wodurch das Patched-Polypeptid in der Zelle exprimiert wird; und Prüfung der Bindung der Kandidatenverbindung an das Patched-Polypeptid.
Verfahren zum Screenen von Kandidatenverbindungen auf Agonistenaktivität mit einem Patched-Polypeptid, wobei das Verfahren Folgendes umfasst: Kombinieren der Kandidatenverbindung mit einer Zelle eines Wirbeltiers oder wirbellosen Tiers, die das Patched-Protein in der Membran der Zelle umfasst, und einer Expressionskassette, umfassend eine Transkriptionsinitiationsregion, die in einem Expressionswirt funktionell ist, wobei die Transkriptionsinitiationsregion aus einer 5'-nichtkodierenden Region besteht, welche die Transkription einer DNA-Sequenz nach Anspruch 1 reguliert, ein Markergen und eine Transkriptionsterminationsregion als Teil eines extrachromosomalen Elements oder in das Genom einer Wirtszelle integriert; und Prüfung der Expression des Markergens.
Monoklonaler Antikörper, der spezifisch an ein Patched-Polypeptid bindet, für das eine DNA-Sequenz nach Anspruch 1 kodiert.
Isolierte DNA, die kein Drosophila-Patched-Gen oder Fragment davon ist, mit einer DNA-Sequenz mit zumindest etwa 12 bp, die sich von der Sequenz des Drosophila-Patched-Gens unterscheiden, worin die DNA-Sequenz eine aus Seq.-ID Nr. 1, 3, 5, 7, 9, 18 oder ein Fragment davon mit zumindest 12 bp umfasst.
Isolierte DNA nach Anspruch 24, die für ein Patched-Polypeptid kodiert, das an ein Igel-Polypeptid bindet.
Isoliertes Polypeptid, für das eine Nucleinsäure nach einem der Ansprüche 1 – 8 oder 24 – 25 kodiert.
Monoklonaler Antikörper, der spezifisch an das Polypeptid nach Anspruch 26 bindet.