DE60126122T2

DE60126122T2 - Nicht-menschliche transgene oder rekombinante säugetiere für das stop protein und verwendungen davon zur auswahl von psychoaktiven arzneimitteln

Info

Publication number: DE60126122T2
Application number: DE60126122T
Authority: DE
Inventors: Annie Andrieux; Didier Job; Eric Denarier; Christophe Bosc; Muriel Vernet
Original assignee: Commissariat a lEnergie Atomique CEA; Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale INSERM
Current assignee: Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale INSERM; Commissariat a lEnergie Atomique et aux Energies Alternatives CEA
Priority date: 2000-11-24
Filing date: 2001-11-23
Publication date: 2007-11-08
Anticipated expiration: 2021-11-24
Also published as: EP1335646B1; EP1335646A2; DE60126122D1; WO2002041691A3; WO2002041691A2; ES2280432T3; US20040093625A1; FR2817117A1; US8198507B2; US20090064353A1; FR2817117B1

Description

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf nicht-menschliche transgene oder rekombinante Säugetiere, bei denen die Expression des Gens, das für ein Mikrotubuli-assoziiertes Protein (MAP) codiert, modifiziert ist (Inaktivierung oder Überexpression) und auf ihre Anwendungen in der Durchmusterung von Medikamenten, die bei Angst, Schizophrenie und schizoaffektiven Störungen mit Angst-, Paranoia- oder Depressionskomponente nützlich sind.
Die Mikrotubuli der Säugetierzellen sind einer Regulation unterworfen: während der Interphase organisieren sie sich im intrazellulären Raum, und sie sind für den intrazellulären Transport von Organellen verantwortlich; während der Mitose reorganisieren sie sich, um die Mitosespindel zu bilden, die für die Aufteilung der Chromosomen zwischen den beiden Tochterzellen verantwortlich ist.
Die in vitro, ausgehend von Lösungen von gereinigtem Tubulin, assemblierten bzw. aufgebauten Mikrotubuli sind labil und werden bei einer Kälteexposition rasch depolymerisiert.
Ähnliche Verhaltensweisen werden in vivo beobachtet, werden aber in diesem Fall durch den zellulären Metabolismus reguliert. Beispielsweise wird die Depolymerisation von Mikrotubuli durch das Phosphoprotein Stathmin, das Tubulindimere verbindet und sequestriert, begünstigt, während die Stabilisierung der Mikrotubuli von den Mikrotubuli-assoziierten Proteinen (MAPs), die mit den Polymeren assoziieren, vermittelt wird.
Die Neuronen enthalten große Mengen an Mikrotubuli, und diese sind beinahe in ihrer Gesamtheit kältestabil. Ausgehend von Präparationen stabiler neuronaler Mikrotubuli ist ein Calmodulin-reguliertes Protein, das dazu in der Lage ist, die Mikrotubuli vollständig zu stabilisieren (d.h., dazu befähigt, ihre dynamische Aktivität zu unterdrücken und sie beständig gegenüber Kälte zu machen), isoliert worden; es handelt sich um das STOP-Protein (für Stable Tubulin Only Polypeptide). Die molekulare Natur dieses Proteins ist lange rätselhaft geblieben. 1996 ist ein entscheidender Schritt gemacht worden, als die für dieses STOP-Protein codierende cDNA kloniert wurde (Christophe Bosc et al., P.N.A.S., 1996, 93, 2125-2130).
Das STOP-Protein, das die Dynamik der Mikrotubuli auf reversible Weise blockieren kann, indem es die Empfindlichkeit neuronaler Mikrotubuli gegenüber Kälte und depolymeri sierenden Wirkstoffen vollständig aufhebt, weist zwei bemerkenswerte sich wiederholende bzw. repetitive Domänen auf: eine zentrale Domäne, die aus fünf quasi-perfekten Wiederholungen eines Motivs von 46 Aminosäuren besteht, und eine carboxyterminale Domäne, die von 28 unvollkommenen Wiederholungen eines Motivs von 11 Aminosäuren gebildet wird. Diese zwei sich wiederholenden Domänen sind durch eine Sequenz, die Lysin- und Argininreste im Überfluss enthält (KR-Domäne), und durch eine Verbindungssequenz oder Linker-Sequenz voneinander getrennt. Die N-terminale Domäne des STOP-Proteins enthält prolinreiche Sequenzen, die potentielle Bindungsstellen mit den SH3-Domänen (src homology domain 3) darstellen.
Die Exon-Struktur des STOP-Gens von Mäusen ist aufgeklärt worden (Eric Denarier et al., B.B.R.C., 1998, 243, 791-796). Diese Struktur entspricht der Domänenstruktur des Proteins: Exon 1 codiert für die N-terminale Domäne einschließlich der sich wiederholenden zentralen Domäne, Exon 2 codiert für die Linker-Sequenz, Exon 3 codiert für die KR-Domäne und Exon 4 codiert für die sich wiederholende carboxyterminale Region.
Die Verteilung und die Rolle des STOP-Proteins in den Neuronen sind vor kurzem charakterisiert worden (Laurent Guillaud et al., Cell Biol., 1998, 142, 1, 167-179). Die Verteilung des Proteins ist auf einer ultrastrukturellen Ebene in neuronalen embryonalen Zellen, den DRG-(Dorsal Root Ganglia) Zellen, die sich in vitro (aus)differenzieren können, untersucht worden und hat die Existenz von Isoformen dieses Proteins enthüllt. Eine Haupt-Isoform (E-STOP-Protein) ist charakterisiert worden: diese Isoform tritt früher in der Entwicklung auf als das Standard-STOP-Protein oder N-STOP-Protein, und überwiegt im embryonalen Gehirn. Die cDNA von E-STOP gibt die Sequenz wieder, die der Genbank-Eingangsnummer AJ002556 entspricht. Das E-STOP-Protein unterscheidet sich vom N-STOP-Protein durch die Deletion sich wiederholender carboxyterminaler Sequenzen, die vom Exon 4 codiert werden; es handelt sich somit um eine Spleißvariante des STOP-Proteins. Eine andere Isoform, das F-STOP-Protein, ist in Fibroblasten von Mäusen (3T3-Zellen) beobachtet worden. Dieses Protein mit einem apparenten Molekulargewicht von 45 kDa, ist viel kleiner als das N-STOP-Protein (115 kDa) oder das E-STOP-Protein (88 kDa). Die Klonierung und Sequenzierung der entsprechenden cDNA (Genbank Y16032 und Eric Denarier et al., P.N.A.S., 1998, 95, 6055-6060) haben gezeigt, dass die von den Exon 3 und 4 codierten Sequenzen (KR und carboxyterminale Wiederholungen bzw. Repetitionen) im F-STOP-Protein fehlen. Darüber hinaus fehlt im F-STOP-Protein der Hauptteil der N-terminalen Domäne des N-STOP- Proteins, die stromaufwärts der zentralen Repetition liegt und vom Exon 1 codiert wird. Das F-STOP-Protein umfasst somit die von Exon 2 codierten Sequenzen und einen Teil derer, die dem Exon 1 entsprechen, einschließlich der zentralen Repetitionen. Trotz der mehrfachen Deletionen hat das F-STOP-Protein die gleichen funktionellen Grundeigenschaften wie das N-STOP-Protein: das F-STOP-Protein bindet an Calmodulin und hat die Fähigkeit, eine Stabilisierung von Mikrotubuli gegenüber Kälte in vitro und in vivo zu induzieren. Im Gegensatz zum N-STOP-Protein, das beinahe dauerhaft mit den Mikrotubuli assoziiert zu sein scheint, bleibt das F-STOP-Protein in den Zellen während bzw. in der Interphase in der löslichen Phase und assoziiert, außer bei der Exposition gegenüber Kälte, nicht mit den Mikrotubuli. Offensichtlich hindern Regulationsmechanismen das F-STOP-Protein daran, während der Interphase mit dem Mikrotubuli-Cytoskelett zu Wechselwirken, wodurch folglich eine schnelle mikrotubläre Dynamik ermöglicht wird, und diese Regulationen werden gehemmt, sobald die Zellen tiefen Temperaturen ausgesetzt werden. In mitotischen Zellen ist das F-STOP-Protein bei physiologischer Temperatur mit Mikrotubuli-Spindeln assoziiert.
Folglich ist ein und dieselbe Klasse von Proteinen, die STOP-Proteine, für die Stabilisierung der Mikrotubuli in mehreren verschiedenen Zelltypen verantwortlich.
Die N-, E- und F-Formen des STOP-Proteins sind nicht die einzigen existierenden Isoformen; die STOP-Proteine sind tatsächlich in zahlreichen Geweben, insbesondere in den Lungen, die eine spezifische Isoform enthalten, vorhanden. Gleichermaßen scheint die F-STOP-Form in verschiedenen Geweben vorhanden zu sein. Im Gegensatz dazu scheint es, dass die N-STOP- und E-STOP-Proteine strikt neuronal sind (C. Bosc et al., Cell Struct. Function, 1999, 24, 393-399).
Es könnte den Anschein haben, dass die Stabilität der Mikrotubuli für die Entwicklung und Aufrechterhaltung der Morphologie und der Funktion der Neuronen wichtig sei (Laurent Guillaud et al., oben zitiert). Es ist daher gezeigt worden, dass die Inhibierung der STOP-Proteine in vitro durch Injektion spezifischer blockierender Antikörper die Stabilität der Mikrotubuli in der Kälte in neuronalen und nicht-neuronalen Zellen unterdrückt (Eric Denarier, P.N.A.S., 1998, oben zitiert). Es ist gleichermaßen gezeigt worden, dass die Inhibierung der STOP-Proteine in vitro in Neuronen die neuronale Differenzierung verändert (Laurent Guillaud et al., oben zitiert).
Die Erfinder haben unerwarteterweise gefunden, dass es die Abschaltung bzw. Ausschaltung ("invalidation") der verschiedenen Isoformen des STOP-Proteins erlaubt, Tiere und insbesondere Mäuse, zu erhalten, die für die Durchmusterung psychoaktiver Medikamente besonders nützlich sind.
Die vorliegende Erfindung hat folglich ein nicht-menschliches rekombinantes Säugetier, Träger wenigstens eines modifizierten Allels des Gens, das für ein STOP-Protein codiert, zum Gegenstand.
Unter modifiziertem STOP-Gen versteht man ebenso ein verändertes Gen (Knock-in-Tiere), wie auch ein vollständig oder teilweise inaktiviertes, inhibiertes oder verkürztes bzw. trunkiertes Gen (Knock-out-Tiere).
Vorteilhafterweise sind die genannten rekombinanten oder transgenen Tiere dafür empfänglich, mittels homologer Rekombination in einer embryonalen Stammzelle erhalten zu werden:

– entweder durch Insertion wenigstens eines STOP-Codons oder einer Antisense-Sequenz,
– oder durch Deletion eines Teils oder des gesamten nativen Gens (codierende Region oder nicht-codierende Regionen, Promotor, regulatorische 3'-Sequenzen, Aktivatoren),
– oder durch Sequenzsubstitution.

Genauer wird eine erfindungsgemäße Konstruktion vorteilhafterweise ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus:

– Konstruktionen, die eine Sequenz enthalten, die für ein Antisense-STOP-Protein codiert, die die Expression der nativen STOP-Sequenz blockieren wird;
– Konstruktionen, die die Region des STOP-Promotors (Positionen 1-3400 von 2) in Kombination mit einem Reportergen oder mit der STOP-codierenden Region umfassen. Positive oder negative Selektionsmarker können vorteilhafterweise eingeschlossen sein, wie z.B. lacZ, bei dem die Regulation der Expression zu einer Änderung des Phänotyps führen wird. Ein bevorzugtes Reportergen ist das Gen des GFPs (green fluorescent protein).
– Konstruktionen, die wenigstens einen Teil des STOP-Gens (codierende Region oder nicht-codierende Regionen, Promotor, regulatorische 3'-Sequenzen, Aktivatoren), der die erwünschte(n) Modifikationen) (Deletionen, Mutationen usw.) einschließt, umfassen; vorteilhafterweise sollen die für eine gezielte Integration verwendeten DNA-Konstruktionen eine Region einschließen, die eine Homologie mit der Zielsequenz (STOP-Gen) zeigt, um eine Rekombination zu induzieren.
– Konstruktionen, die wenigstens einen Teil des STOP-Gens, funktionell an einen Promotor, der konstitutiv oder induzierbar sein kann, und an andere regulatorische Sequenzen, die für die Expression im Wirtstier erforderlich sind, gebunden, umfassen. Mit funktionell Binden ist gemeint, dass eine DNA-Sequenz und eine regulatorische Sequenz auf eine solche Weise assoziiert bzw. verbunden sind, dass sie die Expression des Gens erlauben, wenn die geeigneten Moleküle, z.B. die Transkriptions-aktivierenden Proteine, an regulatorische Sequenzen gebunden sind.

Unter STOP-Gen versteht man im Sinne der vorliegenden Erfindung die von einem beliebigen Säugetier, wie z.B. Ratte, Maus, Rind oder Mensch, oder von einem Huhn oder einem Kugelfisch, erhaltenen STOP-Gene sowie die verschiedenen mutierten Formen des genannten STOP-Gens; es schließt gleichermaßen die verschiedenen offenen Leseraster, die Exons, die Introns, die nicht-codierenden Regionen in 3' und 5', die an der Regulation der Expression dieses Gens beteiligt sind, bis etwa 4 kb beiderseits der codierenden Region, den Promotor und die Aktivatoren ein.
Vorzugsweise werden die Konstruktionen aus den folgenden Konstruktionen ausgewählt:

– Konstruktionen, die ein Fragment der genomischen Sequenz, die für ein STOP-Protein codiert, zwischen dem Initiationscodon und dem STOP-Codon (C. Bosc et al., E. Denarier et al., L. Guillaud et al., oben zitiert), insbesondere einschließlich aller Introns, die normalerweise im nativen Chromosom vorhanden sind, enthalten. Sie kann die nicht übersetzten 3'- und 5'-Regionen, die in der reifen mRNA wiedergefunden werden, enthalten. Sie kann außerdem Transkriptions- oder Translationsregulationssequenzen (Promotor, Aktivator ...), einschließlich etwa 4 kb der 3'- oder 5'-flankierenden genomischen Regionen, enthalten.
– Konstruktionen, die nicht die Region zwischen den Positionen 4118 und 5131 der genomischen Sequenz, die für ein STOP-Protein codiert, umfassen.
– Konstruktionen, die 4,1 kb des STOP-Gens (entsprechend den Positionen 1-4118 von 2), das Gen, das für die β-Galactosidase codiert, das unter die Kontrolle des endogenen STOP-Promotors gestellt ist, ein Gen für Resistenz gegen Neomycin unter der Kontrolle des PGK-Promotors, 1,57 kb der Sequenz des STOP-Gens (entsprechend den Positionen 5131-6701 der Sequenz von 2) und schließlich das Gen der Thymidinkinase unter der Kontrolle des PGK-Promotors umfassen.

Erfindungsgemäß stellen die erhaltenen transgenen Tiere zwei Gruppen dar, die Knock-out-Tiere und die Knock-in-Tiere.
Im Rahmen der vorliegenden Erfindung:

– Die Knock-out-Tiere haben einen partiellen oder vollständigen Funktionsverlust in einem oder beiden Allelen des für ein endogenes STOP-Protein codierenden Gens; ein solches modifiziertes Gen induziert die Expression des entsprechenden STOP-Proteins nicht mehr. Die erfindungsgemäßen Knock-out-Tiere schließen auch konditionale Knock-out-Tiere ein: (i) Modifikation des für ein STOP-Protein codierenden Gens, die nur nach Exposition des Tieres gegenüber einer Substanz, die die Modifikation des genannten Gens induziert, auftritt, (ii) Einführung eines Enzyms, das die Rekombination auf der Ebene eines Genortes, der für ein STOP-Protein codiert, induziert (z.B. Cre im System Cre-lox), oder (iii) ein anderes Verfahren, das eine Modifikation des für ein STOP-Protein codierenden Gens nach der Geburt induziert.
– Die Knock-in-Tiere weisen ein Transgen auf, das das endogene Gen, das für ein STOP-Protein codiert, verändert. Ein Knock-in-Tier entspricht einer Veränderung in den Zellen des Wirtes, die eine modifizierte Expression oder eine modifizierte Funktion des nativen STOP-Gens nach sich zieht. Eine erhöhte oder verringerte Expression kann somit durch Einführung einer zusätzlichen Kopie des STOP-Gens oder durch funktionelle Insertion einer Regulationssequenz, die eine signifikant erhöhte Expression einer endogenen Kopie des STOP-Gens erzeugt, erhalten werden. Diese Veränderungen können entweder konstitutiv oder konditional in Abhängigkeit vom Vorhandensein eines Aktivators oder eines Repressors sein. Das exogene Gen wird entweder ausgehend von einer anderen Art als der des Wirtstieres erhalten oder ist auf der Ebene der codierenden oder nicht-codierenden Sequenz modifiziert. Das eingeführte Gen kann ein Gen vom Wildtyp oder eine manipulierte Sequenz sein, die beispielsweise Deletionen, Substitutionen oder Insertionen in den codierenden oder nicht-codierenden Regionen aufweist.

Die zwei Verfahren können kombiniert werden: bei einem ersten Mal wird das Ursprungsgen aus- bzw. abgeschaltet, dann wird, bei einem zweiten Mal, eine modifizierte Form des genannten Gens in das genannte Tier eingeführt.
Die so erhaltenen rekombinanten oder transgenen Tiere umfassen eine exogene Nucleinsäuresequenz, die entweder in Form eines extrachromosomalen Elements oder stabil in tegriert in alle oder einen Teil der Zellen des genannten Tieres, spezieller die Keimzellen, vorliegt.
Überraschenderweise sind die Homozygotenmäuse, die zwei inaktivierte Allele des STOP-Gens enthalten (Knock-out- oder STOP KO (-/-)-Mäuse), erhalten durch Kreuzung heterozygoter Tiere, lebensfähig und weisen keine anatomische Veränderung des Gehirns auf; sie weisen dagegen Defizite hinsichtlich der synaptischen Plastizität auf, die mit multiplen schweren Verhaltensstörungen, die ein völliges Fehlen der Nachwuchspflege ("maternage"), eine tiefe Angst bzw. Ängstlichkeit, eine Unfähigkeit, Gegenstände wiederzuerkennen, und abnormale soziale Interaktionen umfassen, zusammenhängen.
Interessanterweise können diese multiplen Verhaltensstörungen durch verlängerte anhaltende Verabreichung von Neuroleptika gebessert werden.
Folglich stellen die Mäuse, in denen das STOP-Gen inaktiviert worden ist (STOP KO (-/-)-Mäuse), ein Modell dar, das für den Test und die Behandlung von Krankheiten, die mit einem synaptischen Defekt zusammenhängen, und die gegenüber Neuroleptika empfindlich sind, insbesondere die Schizophrenie und die schizoaffektiven Störungen mit Angst-, Paranoia- oder Depressionskomponente, besonders nützlich ist.
Die vorliegende Erfindung hat auch die Verwendung des genannten nichtmenschlichen rekombinaten Säugetiers, das Träger wenigstens eines Allels des Gens, das für ein modifiziertes STOP-Protein codiert, ist, für die Selektion bzw. Auswahl oder die Durchmusterung psychoaktiver Produkte zum Gegenstand.
Die Nucleinsäuremoleküle, die die Sequenz eines modifizierten Allels des für ein STOP-Protein codierenden Gens, wie es oben definiert ist (insbesondere die Sequenzen der inaktivierten STOP-Gene), umfassen, werden insbesondere durch Mutation auf an sich bekannte Weisen, zum Erzeugen der gesuchten Zielmodifikationen erhalten: Substitutionen, Insertionen oder Deletionen auf der Ebene einer Domäne oder eines Exons, die zur Expression eines inaktivierten STOP-Proteins oder dem Fehlen der Expression des STOP-Proteins führen. Die Deletionen können wichtige Modifikationen einschließen: Deletion einer Domäne oder eines Exons (insbesondere Exon 1).
Die Fragmente der genannten Sequenzen werden vorteilhafterweise mittels chemischer Synthese aus bzw. von Oligonucleotiden, mittels enzymatischem Verdau oder mittels PCR-Amplifikation als Beispiel, erhalten.
Die genannten Fragmente umfassen wenigstens 15 Nucleotide, bevorzugt etwa 18 Nucleotide und stärker bevorzugt wenigstens 50 Nucleotide.
Solche Fragmente sind nützlich als PCR-Primer oder zur Durchmusterung mittels Hybridisierung von rekombinanten ES-Zellen oder rekombinanten nicht-menschlichen Tieren.
Die genannten Primer oder Sonden zur Durchmusterung von rekombinanten ES-Klonen oder rekombinanten Tieren sind dadurch gekennzeichnet, dass sie ausgewählt sind aus der Gruppe, bestehend aus Fragmenten eines STOP-Gens, die wenigstens 15 Nucleotide, bevorzugt etwa 18 Nucleotide und stärker bevorzugt wenigstens 50 Nucleotide umfassen. Solche Primer oder Sonden erlauben das Durchmustern von Zellen oder Tieren, die eine der modifizierten Sequenzen, wie sie oben stehend definiert sind, umfassen.
Vorzugsweise werden die folgenden Primer zur Durchmusterung eingesetzt:

– Oligonucleotid A4080: Positionen 4067-4095 von 2 (SEQ ID NO: 3);
– Oligonucleotid 770: Positionen 4488-4515 von 2 (SEQ ID NO: 4);
– Oligonucleotid AS2: Positionen 6680-6701 von 2 (SEQ ID NO: 5).

Die wichtigsten Fragmente (mehr als 100 Nucleotide) sind für die Produktion von STOP-Proteinen nützlich.
Die zu den klonierten STOP-Sequenzen homologen Sequenzen werden mittels verschiedener Verfahren bzw. Methoden, die dem Fachmann bekannt sind, identifiziert.
Die Ähnlichkeit der Nucleinsäuresequenzen wird mittels Hybridisierung unter Bedingungen geringer Stringenz, z.B. bei 50°C und 10 × SSC (0,9 M Salzpuffer und 0,09 M Natriumcitrat), detektiert.
Die genannten Sequenzen bleiben assoziiert bzw. angelagert, wenn sie einem Waschschritt bei 55°C in einem 1 × SSC-Puffer unterworfen werden.
Die Identität der Sequenzen kann mittels Hybridisierung unter stringenten Bedingungen, z.B. bei 50°C oder mehr und 0,1 × SSC (9 mM Salzpuffer/0,9 mM Natriumcitrat), bestimmt werden.
Die vorliegende Erfindung hat auch Sonden zur Detektion und Durchmusterung der genomischen DNA mittels Hybridisierung von rekombinanten ES-Klonen oder rekombinanten Tieren zum Gegenstand, die dadurch gekennzeichnet sind, dass sie aus einem Fragment des gleichen STOP-Gens, lokalisiert außerhalb (stromaufwärts oder stromabwärts) der Se quenz des aus dem verwendeten Rekombinationsvektor stammenden STOP-Gens (Zone der homologen Rekombination), bestehen.
Vorteilhafterweise entspricht die genannte Sonde den Positionen 700-1881 von 3 (SEQ ID NO: 6).
Die vorliegende Erfindung hat auch ein Verfahren zur Durchmusterung und Selektion von Molekülen, die in der Behandlung von Schizophrenie und schizoaffektiven Störungen mit Angst-, Paranoia- oder Depressionskomponente verwendbar sind, zum Gegenstand, wobei das Verfahren dadurch gekennzeichnet ist, dass es wenigstens die folgenden Stufen umfasst:

– in vitro-Inkontaktbringen wenigstens einer zu durchmusternden Substanz mit einer biologischen Probe, die aus einem Extrakt von Zellen oder Organschnitten, vorzugsweise neuronalen oder cerebralen, gebildet wird, die aus wenigstens einem nicht-menschlichen rekombinanten Säugetier stammt, das Träger wenigstens eines modifizierten Allels des Gens, das für ein STOP-Protein codiert, ist,
– Messen der Wirkung der genannten zu durchmusternden Substanz auf die genannten Zellen oder Organschnitte und
– Vergleich der erhaltenen Werte mit denen der Zellen oder Organschnitte einer biologischen Probe, die von einem nicht-menschlichen Säugetier desselben Typs, das Träger von zwei Wildallelen des Gens, das für ein STOP-Protein codiert, ist, stammt.

Die getesteten Substanzen werden insbesondere aus Substanzbanken (für natürliche oder synthetische Substanzen) erhalten.
Gemäß einer vorteilhaften Ausführungsform des genannten Verfahrens wird das genannte Messen mit Hilfe eines Protein-Protein-Bindungstests durchgeführt; in solch einem Fall können eines oder mehrere eingesetzte Moleküle mittels eines Markers markiert sein; der genannte Marker kann ein detektierbares Signal entweder direkt oder indirekt bereitstellen.
Als verwendbare Marker kann man beispielsweise Radioisotope, fluoreszierende Moleküle, chemilumineszierende Moleküle, Enzyme, spezifische Bindungsmoleküle, Partikel, wie z.B. magnetische Partikel, usw. nennen.
Die spezifischen Bindungsmoleküle umfassen Molekülpaare, wie Biotin und Streptavidin, Digoxin und Anti-Digoxin, usw. ...
Bei den Elementen bzw. Mitgliedern der spezifischen Bindung wird das komplementäre Element bzw. Mitglied mit einem an die Detektion angepassten Molekül nach bekannten Verfahren markiert.
Viele andere Reagenzien können in einem derartigen Durchmusterungstest eingesetzt werden; er umfasst z.B. Salze, neutrale Proteine, wie z.B. Albumin, Detergenzien, usw. ..., die eingesetzt werden, um eine optimale Protein-Protein-Bindung zu erleichtern und/oder um nicht-spezifische Wechselwirkungen oder das Grundrauschen zu verringern.
Reagenzien, die die Wirksamkeit des Assays verbessern, wie z.B. Proteaseinhibitoren, Nucleaseinhibitoren, antimikrobielle Mittel, können auch verwendet werden.
Das Gemisch der Komponenten wird ohne Beachtung der Reihenfolge auf eine Weise zugegeben, die die gesuchte Bindung erlaubt.
Die Inkubationen werden bei zweckdienlicher Temperatur, üblicherweise zwischen 4°C und 40°C, bewerkstelligt.
Die Inkubationszeiträume können variieren; sie liegen gewöhnlicherweise zwischen 0,1 und 1 h und werden innerhalb dieser Zeitspanne optimiert, insbesondere um eine rasche Durchmusterung zu erleichtern.
Antikörper, die für die Polymorphismen der STOP-Proteine spezifisch sind, können in Immunoassays zur Durchmusterung eingesetzt werden, spezieller, um die Bindung von Substrat oder STOP-Protein zu detektieren oder um das Vorhandensein oder Fehlen eines STOP-Proteins in einer Zelle oder einer Probe, wie z.B. einer biologischen Probe, zu bestätigen.
Gemäß einer weiteren vorteilhaften Ausführungsform des genannten Verfahrens wird die genannte Messung durch Detektion der Intensitätsänderung eines elektrischen Signals durchgeführt; was die Nervenzellen erfindungsgemäßer rekombinanter Tiere anbelangt, kann man tatsächlich eine Veränderung der Organisation der Synapse (Positionierung und Transport von Neurorezeptoren) bei den erfindungsgemäßen rekombinanten Tieren beobachten.
Die vorliegende Erfindung ist auch auf ein Verfahren zur Durchmusterung und Auswahl von Molekülen, die in der Behandlung von Angst, Schizophrenie und schizoaffektiven Störungen mit Angst-, Paranoia- oder Depressionskomponente nützlich sind, gerichtet, wobei das Verfahren dadurch gekennzeichnet ist, dass es umfasst:

– Verabreichung wenigstens einer zu durchmusternden Substanz an wenigstens ein nicht-menschliches rekombinantes Säugetier, das Träger wenigstens eines modifizierten Allels des Gens, das für ein STOP-Protein codiert, ist; und
– Verhaltenstest bzw. Untersuchung des Verhaltens des genannten Säugetiers im Vergleich zu einer Reihe von Kontrolltieren und/oder Bestimmung der Lokalisierung der Medikamente nach ihrer Verabreichung.

Solche Tiere können vorteilhafterweise als Modelle für die Durchmusterung von psychoaktiven Molekülen, die eine geringe Toxizität beim Menschen aufweisen, dienen.
Die vorliegende Erfindung hat gleichermaßen einen Vektor zur homologen Rekombination eines Gens, das für ein STOP-Protein codiert, zum Gegenstand, dadurch gekennzeichnet, dass er eine Nucleotidsequenz eines modifizierten STOP-Gens, das für ein inaktiviertes STOP-Protein codiert, umfasst, von dem ein Fragment mit 1012 bp, das sich wiederholende Sequenzen der codierenden Region von Exon 1 enthält, deletiert und durch eine Expressionskassette ersetzt wurde, die das Gen für Neomyzinresistenz (neo) unter der Kontrolle des PGK-Promotors und das Gen der β-Galactosidase (lacZ) unter der Transkriptionskontrolle des endogenen STOP-Promotors enthält.
Die vorliegende Erfindung hat auch ein Verfahren zur Herstellung von nichtmenschlichen rekombinanten Säugetieren, die Träger wenigstens eines Allels des Gens, das für ein inaktiviertes STOP-Protein codiert, sind, zum Gegenstand, dadurch gekennzeichnet, dass man:

– ein Allel des Gens, das für ein STOP-Protein codiert, trunkiert;
– die genannte modifizierte Sequenz in einen Abschnitt der genomischen DNA eines nicht-menschlichen Säugetieres des gleichen Typs, assoziiert mit einem geeigneten Marker, derart einführt, um eine markierte Sequenz M zu erhalten, die das genannte modifizierte Allel enthält;
– die genannte Sequenz M in vitro in Stammzellen aus Keimbahnen von Embryonen eines nicht-menschlichen Säugetiers mittels Transfektion integriert und man die Zellen, die das genannte Allel aufgrund homologer Rekombinationsereignisse aufweisen, selektiert; dann
– die genannten selektierten Stammzellen in einen einem nicht-menschlichen Säugetier des gleichen Typs reimplantierten Embryo injiziert, um chimäre Tiere zu erhalten; und
– man in der F1-Generation nicht-menschliche rekombinante heterozygote Säugetiere und in der F2-Generation nicht-menschliche rekombinante homozygote Säugetiere vom Typ STOP -/-, erkennbar am Vorhandensein des Markers, und sogenannte wilde Mäuse vom Typ (+/+) erhält.

Über die vorstehenden Bestimmungen hinaus umfasst die Erfindung auch andere Bestimmungen, die aus der folgenden Beschreibung, die sich auf die Ausführungsbeispiele des Verfahrens, das Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist, bezieht, hervorgehen werden, und zwar unter Bezug auf die anhängenden Zeichnungen bzw. Figuren, bei denen:
1 die genomische Organisation des STOP-Gens auf der Ebene von Exon 1 und die Etablierung von Knock-out-Mäusen für das STOP-Gen [STOP KO (-/-)-Mäuse] durch Veränderung von Exon 1 illustriert. A: Restriktionskarte eines Fragments des STOP-Gens (Wildallel), das zur Herstellung eines genomischen Fragments mit Homologie verwendet wurde, Struktur des Vektors zur homologen Rekombination oder des Zielvektors bzw. Vektors ptSTOP, und die vorhergesagte Struktur des mutierten Allels. EV: EcoRV; EI: EcoRI; TK: Thymidinkinase; pgk: Phosphoglyceratkinase; neo: Neomycin; NTR: Nucleotide Translation Region. B: Southern-Blot-Profile des STOP-Gens bei wilden (+/+; 8 kb) und heterozygoten (+/-; 5,3 kb) Mäusen.
2 die Sequenz des STOP-Gens auf der Ebene von Exon 1 (Positionen 333-5150) (genomischer Klon von 7,2 kb) darstellt; die zur Etablierung der STOP KO (-/-)-Mäuse verwendeten Fragmente sind wie folgt: 5'-homologe Sequenz: 4,118 kb, Positionen 1-4118; 3'-homologe Sequenz: 1,57 kb, Positionen 5131 bis 6701.
3: die 3A gibt die genomische Sequenz des STOP-Gens, die in Bezug auf die Sequenz von 2 5' lokalisiert ist, wieder, und die 3B gibt die zur Durchmusterung verwendete Sonde wieder, die ein EcoRV-EcoRI-Fragment ist (Positionen 701-1881 aus 3A).
4 illustriert die Western Blot-Analyse der Expression der STOP-Proteine (E-STOP und N-STOP) im Gehirn von STOP KO (-/-)-Mäusen oder Mäusen vom Wildtyp mit Hilfe polyklonaler 23C-Antikörper (Laurent Guillaud et al., oben zitiert). Diese Figur zeigt das Fehlen von STOP-Proteinen im Gehirn von STOP KO (-/-)-Mäusen im Vergleich zu Mäusen vom Wildtyp; das Vorliegen einer äquivalenten Menge an Proteinen in den beiden Probentypen, die auf das Gen aufgebracht wurden, wird durch das mit einem Anti-Tubulin β-Antikörper erhaltene Signal (β-tub) demonstriert.
die 5 bis 8 illustrieren die Veränderung der Langzeitdepression (LTD für long-term depression) und der Langzeitpotentialisierung (LTP für long-term potentiation) bei STOP KO (-/-)-Mäusen:
5 illustriert die basale synaptische Reaktion bzw. Antwort der Schaffer-Kollateralen: die Kurven vom Typ "Eingang-Ausgang" geben die Steigung der Kurve des erregenden postsynaptischen Potentials (EPSP für excitatory post-synaptic potential) als Funktion der Erregbarkeit der Fasern der Schaffer-Kollateralen, ausgehend von einem Schnitt einer Maus vom Wildtyp (a) oder einer STOP KO (-/-)-Maus (b) wieder. Zusammenfassung der von sechs Mäusen vom Wildtyp und sechs STOP KO (-/-)-Mäusen erhaltenen Ergebnisse (c). Die Steigungen der Kurven sind nicht signifikant voneinander verschieden, was eine normale basale synaptische Übertragung bzw. Transmission bei den STOP KO (-/-)-Mäusen anzeigt.
6 illustriert die Ergebnisse der Experimente zur Langzeitpotentialisierung (LTP für "Long-term potentiation" auf Ebene der Synapsen der Schaffer-Kollateralen und der Pyramidenzellen der CA1-Region des Hippocampus:
6(a) zeigt, dass eine Stimulation bei erhöhter Frequenz (tetanische Stimulation, die durch 4 Stimuli von 100 Hz während 1 s, angewandt in Intervallen von 10 bis 20 s, induziert wurde) eine langzeitige Erhöhung der Steigung der EPSP-Kurve in einem Schnitt aus einer Maus vom Wildtyp nach sich zieht;
6(b) zeigt, dass eine identische Stimulation in einem Schnitt aus einer STOP KO (-/-)-Maus dagegen einzig eine schwache Erhöhung der Steigung der EPSP-Kurve nach sich zieht; und
6(c) gibt eine Zusammenfassung der bei Mäusen vom Wildtyp und STOP KO (-/-)-Mäusen erhaltenen Ergebnisse wieder. Die Anfangswerte der Steigungen der EPSP-Kurven sind in jedem Experiment normalisiert worden, wobei der während des Kontrollzeitraums (-10 bis 0 min) erhaltene Mittelwert der Kurve verwendet wurde. Die als Mittelwert ± SEM bzw. Standardabweichung des Mittelwerts angegebenen Ergebnisse entsprechen den Werten, die an 13 und 9 Schnitten, die von 7 Mäusen vom Wildtyp bzw. 6 Mäusen vom STOP -/--Typ stammten, erhalten wurden. Diese Ergebnisse zeigen ein signifikantes Defizit der Langzeitpotentialisierung bei STOP KO (-/-)-Mäusen (p = 0,0007 bei einer Messung, die nach 30 bis 40 Minuten aufgezeichnet wurde).
7 illustriert die Ergebnisse der Experimente zur Langzeitdepression (LTD) auf der Ebene der Synapsen der Schaffer-Kollateralen und der CA1-Pyramidenzellen:
7(a) zeigt, dass die Stimulation bei niedriger Frequenz (LFS für low frequency stimulation, 1 Hz während 15 min) eine langzeitige Verringerung der Steigung der EPSP-Kurve in den Schnitten von Mäusen vom Wildtyp induziert;
7(b) zeigt, dass die Stimulation bei niedriger Frequenz dagegen keine langzeitige Verringerung der Steigung der EPSP-Kurve in Schnitten von Mäusen vom Typ KO -/- induziert; und
7(c) gibt eine Zusammenfassung der Experimente zur LTD in STOP KO (-/-)-Mäusen und in Mäusen vom Wildtyp wieder. Die als Mittelwerte ± SEM ausgedrückten Ergebnisse entsprechen den Werten, die an 15 und 9 Schnitten, die von 9 Mäusen vom Wildtyp bzw. 6 STOP KO (-/-)-Mäusen erhalten wurden. Diese Ergebnisse zeigen eine signifikante Änderung der Langzeitdepression (LTD) bei den STOP KO (-/-)-Mäusen (p = 0,01, Ergebnisse nach 40-45 Minuten aufgezeichnet).
8A illustriert das Verhältnis NMDA/AMPA auf Ebene der Synapsen der Schaffer-Kollateralen und der CA1-Pyramidenzellen, entsprechend dem Verhältnis der Werte der EPSP-Kurven des NMDA (N-Methyl-D-aspartat)-Rezeptors und des AMPA (α-Amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazolpropionsäure)-Rezeptors bei 14 und 9 Schnitten von sechs Mäusen vom Wildtyp bzw. sechs STOP KO (-/-)-Mäusen. Die Steigungen der NMDA- und der AMPA-Rezeptoren sind bei einer Intensität des Stimulus, die dem Zweifachen des Schwellenwerts entsprach, gemessen worden. Zwischen den Mäusen vom Wildtyp und den STOP KO (-/-)-Mäusen ist kein signifikanter Unterschied beobachtet worden.
8B illustriert die Depolarisation während einer tetanischen Stimulation der Schaffer-Kollateralen: das Diagramm gibt die Zusammenfassung der Ergebnisse der Quantifizierung der Depolarisation während einer tetanischen Stimulation wieder. Die Depolarisation wird 300 ms nach dem Beginn des ersten Stimulus von 100 Hz berechnet. Die Experimente sind an 11 Schnitten von Mäusen vom Wildtyp und 8 Schnitten von STOP KO (-/)-Mäusen durchgeführt worden, die von sieben Mäusen vom Wildtyp bzw. sechs STOP KO (/-)-Mäusen stammten. Die Ergebnisse sind bei den Mäusen vom Wildtyp und den STOP KO (-/-)-Mäusen nicht signifikant voneinander verschieden.
9 illustriert die kurzzeitige Veränderung der synaptischen Plastizität bei den STOP KO (-/-)-Mäusen:
9A illustriert die Ergebnisse der Versuche zur post-tetanischen Potentialisierung der synaptischen Transmission von Schaffer-Kollateralen. Eine Stimulation bei hoher Frequenz in Gegenwart eines Antagonisten des NMDA-Rezeptors, D-APV (50-100 μM), induziert eine vorübergehende Erhöhung der EPSP-Steigung. Die Ergebnisse wurden ausgehend von 6 und 10 Schnitten erhalten, die von vier Mäusen vom Wildtyp bzw. fünf STOP KO (-/-)-Mäusen stammten. Die Ergebnisse zeigen eine Änderung der post-tetanischen Potentialisierung bei den STOP KO (-/-)-Mäusen (p = 0,04, Messungen von 0 bis 30 s nach der tetanischen Stimulierung durchgeführt);
9B illustriert die Ergebnisse der Versuche zur Erleichterung bzw. Bahnung mittels gekoppelter Stimulationen (PPF für paired pulse facilitation) der synaptischen Transmission von Schaffer-Kollateralen. Die erhaltenen Ergebnisse entsprechen 7 und 12 Schnitten, die von vier Mäusen vom Wildtyp bzw. fünf STOP KO (-/-)-Mäusen stammten. Die Erleichterung bzw. Bahnung durch gekoppelte Stimulationen ist bei den Mäusen vom STOP -/--Typ nicht signifikant verändert; und
9C illustriert die Versuche zur Frequenzbahnung von Moosfasern des Hippocampus. Die Ergebnisse wurden ausgehend von 10 und 12 Schnitten erhalten, die ausgehend von 7 und 8 Schnitten erhalten wurden, die von sechs Mäusen vom Wildtyp bzw. sieben STOP KO (-/-)-Mäusen stammten. Bei den Mäusen vom Wildtyp provozierte eine wiederholte Stimulierung der Synapsen der Moosfaser unter Verwendung von Stimulationsfrequenzen zwischen 0,033 und 1 Hz eine reversible Erhöhung der Amplitude der Reaktion der Moosfaser um einen Faktor von 3. Die Bahnung ist bei den STOP KO (-/-)-Mäusen auf signifikante Weise verändert (p = 0,03, Werte bei einer Stimulationsfrequenz von 1 Hz aufgezeichnet).
10 illustriert die Störungen des mütterlichen Verhaltens von STOP KO (-/-)-Mäusen:
10a: das Überleben der von primiparen Müttern, die das STOP-Wildallel oder das mutierte STOP-Allel (STOP -/-) tragen, abstammenden Neugeborenen wird am zweiten Tag nach der Geburt untersucht;
10b und 10c: die Manifestierung eines mütterlichen Verhaltens wird bei jungen primiparen Weibchen und jungen Männchen vom Typ STOP KO (-/-) im Vergleich zu Mäusen vom Wildtyp untersucht. Die Ergebnisse sind in Form des Mittelwerts ± SEM angegeben; n = 9 für die weiblichen Mäuse vom Wildtyp und STOP KO (-/-)-Typ und n = 10 für die männlichen Mäuse vom Wildtyp und STOP KO (-/-)-Typ.
11 illustriert die Verhaltensstörungen bei STO KO (-/-)-Mäusen; die Aktivitäten der Mäuse (Schlafen, Fressen, sich Putzen, Gehen bzw. Laufen und Unbewegtbleiben, obwohl wach) wurden während eines Zeitraums von 3 Stunden auf Video aufge zeichnet, n = 11 für die Mäuse vom Wildtyp (wt für wild-type) und die STOP KO (-/-)-Mäuse:
11a: mit jeder Aktivität verbrachte Zeit. Jeder Kasten entspricht einer andersartigen Aktivität, wie im Feld auf der linken Seite angegeben. Die STOP KO (-/-)-Mäuse verbringen mehr Zeit mit Laufen bzw. Gehen und mit Unbewegtbleiben als die Mäuse vom Wildtyp, wobei dies zu Lasten der mit Schlafen oder mit Fressen verbrachten Zeit geht.
11b: Zahl der Änderungen der Aktivität. Im Vergleich zu Mäusen vom Wildtyp zeigen die STOP KO (-/-)-Mäuse eine viel höhere Zahl der Änderungen der Aktivitäten mit einer viel höheren Zahl der Phasen des Gehens und des Ruhen.
11c: prozentualer Anteil der Putzphasen, denen eine Schlafphase folgt (GS), bezogen auf die Gesamtzahl der Schlafphasen (S), ausgedrückt als Mittelwert ± SEM. Die prozentualen Anteile werden für jede Maus vor dem Berechnen des Mittelwerts berechnet. Die typische G-S-Abfolge bei den Mäusen vom Wildtyp ist bei den STOP KO (-/-)-Mäusen häufig unterbrochen.
12 illustriert den Angstzustand von STOP KO (-/-)-Mäusen, bewertet mittels des Tests von Licht und Dunkelheit. 12a: die in einem beleuchteten Kasten verbrachte Zeit, und 12b: die Zahl der Passagen bzw. Wechsel zwischen den beiden Kästen werden jeweils während einer Zeitdauer von 5 Minuten ab dem ersten Eintritt des Tieres in den verdunkelten Kasten aufgezeichnet. Die Mäuse vom Wildtyp (+/+) werden als Kontrollen verwendet. Die Werte entsprechen dem Mittelwert ± Standardfehler des Mittelwerts (SEM). Die Unterschiede zwischen den KO-Mäusen und den Kontrollmäusen sind mit einem Risiko bzw. Signifikanzniveau von p < 0,01 (**) angegeben.
13 illustriert die Störungen des Kurzzeitgedächtnisses der STOP KO (-/-)-Mäuse, bewertet mittels des Tests der Wiedererkennung eines Gegenstandes. Die Mäuse vom Wildtyp (+/+) werden als Kontrollen verwendet. Die Ergebnisse sind durch den Wiedererkennungsindex (RI) ausgedrückt: RI-Werte signifikant über 50 % entsprechen einem positiven Wiedererkennungstest. Die Werte entsprechen dem Mittelwert ± Standardfehler des Mittelwerts (SEM).
14 illustriert das Sozialverhalten von STOP KO (-/-)-Mäusen; die Mäuse vom Wildtyp (+/+) werden als Kontrollen verwendet: 15a: Bewertung der Zeit, die ein Männchen mit sozialer Erkundung angesichts eines Eindringlings verbringt [n = 11 für die Mäuse vom Wildtyp und n = 13 für die STOP KO (-/-)-Mäuse]; 15b: Aggression zwischen Männchen; die Aggressionstests werden während zwei aufeinander folgenden Tagen bewerkstelligt [n = 11 für die Mäuse vom Wildtyp und n = 10 für die STOP KO (-/-)-Mäuse], die Zahl der Aggressionen und die mit Kämpfen verbrachte Zeit (Mittelwert ± Standardfehler des Mittelwerts (SEM)) werden während des 2. Tages aufgezeichnet; *: p < 0,05, **: p < 0,01; Mann-Whitney-U-Test.
15 illustriert die Wirkung von Neuroleptika auf das mütterliche Verhalten bei den STOP KO (-/-)-Mäusen:
15A: Wiedereinbringung von Neugeborenen in das post-partum Nest, die von Weibchen vom Wildtyp (wt) und STOP KO (-/-)-Typ abstammen. Die Wiedereinbringung der jungen Mäuse bzw. Mäuschen in das Nest ist während des ersten Tages post-partum bei Mäusen, die mit Neuroleptika (Mischung aus Haloperidol und Chlorpromazin), einem Anxiolytikum (Diazepam) behandelt wurden oder nicht-behandelt waren, untersucht worden. Die Mäuse haben eine Dosis von 0,5 mg/kg/Tag ab 6-8 Tage vor der Geburt bis zum Tag der Geburt erhalten. Die Weibchen wurden in Gegenwart von drei Neugeborenen gebracht, und die Wiedereinbringung in das Nest ist für jedes Weibchen aufgezeichnet worden. Der Mittelwert der erhaltenen Werte ist für jeden Genotyp angegeben (Mittelwert ± SEM, n = 6 für jede Gruppe von Mäusen vom Wildtyp und vom STOP KO (-/-)-Typ. * p < 0,05, ** p < 0,02, *** p < 0,01 nicht parametrischer Mann-Whitney-U-Test).
15B: Überleben der Neugeborenen bei den Mäusen vom Wildtyp und den STOP KO (-/-)-Mäusen. Das Überleben der Neugeborenen wird bei den STOP KO (-/-)-Mäusen, die unterschiedlichen Behandlungen unterworfen wurden, untersucht. Die Neugeborenen werden als überlebend betrachtet, wenn sie bis zur Entwöhnung aufgezogen werden. Bei den nicht-behandelten (n = 20) oder kurzzeitig behandelten STOP KO (-/-)-Mäusen ist kein Überleben Neugeborener beobachtet worden (15A). Dagegen wird ein Überleben Neugeborener bei vier der sieben STOP KO (-/-)-Mäuse, die mit Neuroleptika langzeitbehandelt wurden (4 Monate), beobachtet. Ein Überleben Neugeborener wird bei allen Mäusen vom Wildtyp (n = 7), die der gleichen Langzeitbehandlung mit Neuroleptika unterworfen wurden, beobachtet. * p < 0,05, ** p < 0,02, *** p < 0,01, exakter Fisher-Test.
Beispiel 1: Etablierung von "Knock out" (KO)-Mäusen, in denen das STOP-Gen inaktiviert ist: STOP KO (-/-)-Mäuse
1- Materialien und Methoden
1-1 Konstruktion des homologen genomischen Fragments und des Vektors zur homologen Rekombination (Targeting-Vektor)
Die Fragmente genomischer DNA, die zur Konstruktion des Vektors zur homologen Rekombination verwendet wurden, stammen aus einer Bank genomischer DNA von Mäusen der Linie bzw. des Stammes 129, die in den Phagen P1 kloniert und mittels einer cDNA des STOP-Gens oder einer Sonde aus cDNA des genannten Gens durchmustert wurden (Eric Denarier et al., B.B.R.C., 1998, oben zitiert).
Das homologe genomische Fragment des STOP-Gens wird ausgehend von einem Klon mit 7,2 kb, dessen Sequenz in 2 angegeben ist, gemäß den folgenden Stufen konstruiert: ein Fragment mit 1012 bp, das die sich wiederholenden Sequenzen der codierenden Region des STOP-Gens enthält, die sich über die Positionen 4118 bis 5131 der in 2 angegebenen Sequenz erstreckt, ist deletiert und durch eine Expressionskassette, die das Gen für Neomycinresistenz (neo) unter der Kontrolle des PGK-Promotors und das Gen der β-Galactosidase (lacZ) unter der Transkriptionskontrolle des endogenen STOP-Promotors enthält, ersetzt worden. Außerdem ist eine EcoRV-(Schnitt-)Stelle 5' des lacZ-Gens eingeführt worden.
Der Vektor zur homologen Rekombination (ptSTOP) wird durch Klonierung des homologen Fragments des STOP-Gens, das vorstehend im Vektor pGK-TK beschrieben wurde, erhalten. Der Vektor pGK-TK leitet sich vom Vektor pPNT, konstruiert von Tybulewicz et al. (Cell, 1991, 65, 1153-1163), ab durch Insertion des Gens der Thymidinkinase des Herpes simplex Virus (HSV) unter der Kontrolle des Promotors der Phosphoglyceratkinase (PGK).
1-2 Homologe Rekombination in ES-Zellen und Genotypisierung
Der Vektor ptSTOP wird mittels des Enzyms Not1 linearisiert und in ES-Zellen (ES-R1, A. Naguy et al., P.N.A.S., 1993, 90, 8428-8428) oder in ES-AT1-Zellen, isoliert ausgehend von Blastozyten in einem Alter von 3,5 Tagen, die von F1-Mäusen (129 Sv Pas × 129 Sv Pas) stammen, elektroporiert. Dann werden die elektroporierten ES-Zellen auf einer Schicht aus Fibroblasten, die neomycinresistent sind, zuvor mit Mitomycin behandelt, ausgesät und in glucosereichem DMEM-Medium (INVITROGEN), enthaltend 15 % fötales Kälberserum und 1000 EI/ml Leukämieinhibitorfaktor (Esgron, CHEMICON), kultiviert. 2 Tage nach der Transfektion wird Geneticin (G418, INVITROGEN) zu dem Kul turmedium in einer Endkonzentration von 250 μg/ml gegeben. Gancyclovir (SYNTEX) wird vom vierten bis zum achten Tag nach der Transfektion zugegeben. Klone der rekombinanten ES-Zellen werden 10 Tage nach der Transfektion entnommen und vermehrt bevor sie eingefroren oder untersucht werden. Der Genotyp der gegenüber G418 und Gancyclovir resistenten Klone wird verifiziert mittels Southern Blot-Tests von genomischer DNA, die mittels EcoRV verdaut wurde und hybridisiert wurde mit einer Sonde, die für das STOP-Gen spezifisch ist, die in der 5'-flankierenden Region der Region der homologen Rekombination lokalisiert ist (siehe 3) und den Positionen 698-1875 nach EcoRV-EcoRI-Verdau in der 3 entspricht. Die Größe der Restriktionsfragmente ist 8 kb für das Wildallel und 5,3 kb für das mutierte Allel (1B).
1-3 Mikroinjektion von rekombinanten ES-Zellen und Erhalt von transgenen Mäusen, die für das mutierte Allel des STOP-Gens homozygot sind [STOP KO (-/-)-Mäusel
Die rekombinanten ES-Zellen, die das mutierte Allel tragen, werden in Embryonen von OF1-Mäusen im Morula-Stadium mikroinjiziert, dann werden die Embryonen in den Uterus der austragenden Mutter reimplantiert, um chimären Mäusen das Leben zu schenken (Gene targeting: a practical approach, A. L. Joyner, Hrsg., New York, Oxford University Press, 1993, Seiten 174-179). Die Kreuzung dieser Chimären mit BalB/c- oder 129/sv-Mäusen (CHARLES RIVER Laboratoires) ergibt heterozygote F1-Abkömmlinge, in denen die Transmission bzw. Weitergabe der Mutation des STOP-Gens mittels Southern-Blot-Untersuchung genomischer DNA, die aus einer Schwanzprobe stammt, verifiziert wird. Die F1-Abkömmlinge werden untereinander gekreuzt, um homozygote F2-Abkömmlinge zu ergeben.
1-4 Western-Blot-Test der Expression des STOP-Gens im Gehirn der STOP KO (-/-)-Mäuse
Extrakte der Gehirne von STOP KO (-/-)-Mäusen und von Mäusen des Wildtyps werden hergestellt und im Western-Blot mit Hilfe von polyklonalen 23C-Antikörpern gemäß den in Guillaud et al., oben zitiert, beschriebenen Protokollen untersucht.
1-5 Histologischer Test, Immunmarkierung von STOP-Proteinen und Detektion der β-Galactosidaseaktivität des Gehirns der STOP KO (-/-)-Mäuse
a) Histologischer Test
Männliche Mäuse vom Wildtyp und vom STOP KO (-/-)-Typ mit einem Alter von 10 bis 12 Wochen werden mit einer Paraformaldehydlösung (PFA 4 %) perfundiert. Die Gehirne werden in der gleichen Lösung während 2 Stunden bei 4°C fixiert. Ein Test der Detektion der Cytochromoxidase (Y. Liu et al., J. Neurosci. Methods, 1993, 49, 181-184) und eine Kristallviolettfärbung werden an 100 μm-Schnitten der Gehirne durchgeführt.
b) Immunmarkierung der STOP-Proteine
Die Gehirne werden wie in Abschnitt a) beschrieben präpariert, dann in Saccharose (20 % in PBS) eingefroren. Gehirnschnitte von 20 μm werden stufenweise in den folgenden Lösungen inkubiert: 1 % H₂O₂ (15 min), 3 % BSA (30 min) und in einem Gemisch polyklonaler 23C-Antikörper (100 μg/ml) und des konjugierten Kaninchen-anti-Antikörpers, der an Peroxidase gekoppelt ist (eine Nacht), dann werden die STOP-Proteine mit Ethylcarbazol (AEC, DAKO) entwickelt bzw. sichtbar gemacht.
c) Detektion der β-Galactosidaseaktivität
Gehirnschnitte (100 μm) werden in 0,2 % Glutaraldehyd und 2 % Formaldehyd fixiert. Die β-Galactosidaseaktivität wird mittels Färbung der Schnitte in einer PBS-Lösung, enthaltend 5 mM Kaliumhexacyanoferrat(III), 5 mM Kaliumhexacyanoferrat(II), 2 mM Magnesiumchlorid und 1 mg/ml X-Gal, bei 30°C während 3 bis 5 Stunden detektiert.
1-6 Test der Stabilität der Mikrotubuli in den Neuronen und den Gliazellen der STOP KO (-/-)-Mäuse
Neuronen und Gliazellen von Embryonen von Mäusen vom Wildtyp und von STOP KO (-/-)-Mäusen werden bei Umgebungstemperatur gehalten oder einer Temperatur von 0°C während 45 Minuten unterworfen. Nach Extraktion des freien Tubulins gemäß dem in Laurent Guillaud et al., oben zitiert, beschriebenen Protokoll werden die Mikrotubuli mit einem anti-Tubulin-Antikörper gefärbt und die (Zell-) Kerne werden mittels Hoechst-Lösung gefärbt.
2- Ergebnisse
2-1 Etablierung von STOP KO (-/-)-Mäusen
Das genotypische Profil der homozygoten Mutante STOP KO (-/-) zeigt das Vorhandensein eines Fragments mit 5,3 kb (1B), das die Deletion des Fragments mit 1012 bp, das die sich wiederholenden Sequenzen der codierenden Region des STOP-Gens enthält, anzeigt.
Der Test der verschiedenen heterozygoten Kreuzungen zeigt, dass das mutierte STOP-Allel auf Mendelsche Weise weitergegeben wird.
Die homozygoten STOP KO (-/-)-Mäuse sind lebensfähig, sie scheinen bei guter Gesundheit zu sein und weisen keine makroskopisch sichtbaren Läsionen auf.
Man erhält einen Null-Phänotyp; die Mäuse, die das mutierte Allel im homozygoten Zustand tragen, exprimieren kein STOP-Protein:

– die Untersuchung von Extrakten aus Gehirnen von STOP KO (-/-)-Mäusen im Western-Blot mit Hilfe des polyklonalen 23C-Antikörpers (Guillaud et al., oben zitiert), zeigt das Fehlen der STOP-Proteine (E-STOP und N-STOP) bei diesen Mäusen, während diese zwei Isoformen bei den adulten Mäusen vom Wildtyp detektiert werden (4);
– der immunhistologische Test von Schnitten der Gehirne von STOP KO (-/-)-Mäusen zeigt ein Fehlen der spezifischen Markierung der STOP-Proteine (E-STOP und N-STOP) bei diesen Mäusen, während eine spezifische Markierung dieser STOP-Proteine in der Gesamtheit der Nervengewebe von adulten Mäusen vom Wildtyp beobachtet wird.

2-2 Fehlen der Kältestabilität der Mikrotubuli von Zellen die aus STOP KO (-/-)-Mäusen stammen
Wegen des Fehlens von STOP-Protein bei den STOP KO (-/-)-Mäusen beobachtet man eine Depolymerisation der Mikrotubuli nach Kälteexposition, zugleich in den Neuronen, den Gliazellen oder den Fibroblasten.
2-3 Fehlen anatomischer Läsionen im Gehirn der STOP KO (-/-)-Mäuse
Die Untersuchung der Anatomie des Gehirns der STOP KO (-/-)-Mäuse mittels optischer Mikroskopie und ausgehend von parasagitalen Schnitten, die mit Kristallviolett gefärbt wurden, um die Zellkerne sichtbar zu machen, zeigt keine Unterschiede zwischen den KO -/-Mäusen und den Mäusen vom Wildtyp.
Genauer:

– die Untersuchung der Zellschichten des Kleinhirns, des Neocortex, des Hippocampus und des Riechkolbens, die jenen entsprechen, die eine bedeutende Expression der STOP-Proteine bei den Mäusen vom Wildtyp zeigen, zeigt eine in perfekter Weise normale Organisation bei den Mäusen vom KO -/--Typ;
– die Untersuchung des somatosensorischen Cortex, ausgehend von tangentialen Schnitten, die gefärbt wurden, um die Cytochromoxidaseaktivität hervorzuheben, hat eine normale Organisation der Tännchenfelder ("champs de tonneaux") bei den Mäusen vom KO -/--Typ gezeigt;
– das Expressionsprofil der β-Galactosidase im Gehirn der STOP KO (-/-)-Mäuse ist identisch mit dem, das bei den heterozygoten Mäusen beobachtet wird, was zeigt, dass die Zellen, die im normalen Zustand bedeutende Mengen an STOP-Proteinen exprimieren, bei den Mäusen vom STOP -/--Typ noch vorhanden sind.

Die homozygoten STOP (-/-)-Mäuse, die keine mittels Mikroskopie detektierbaren anatomischen Läsionen des Gehirns aufweisen, weisen hingegen Verhaltensstörungen auf.
Beispiel 2: Elektrophysiologische Untersuchung der synaptischen Transmission bei den Mäusen vom KO STOP -/--Typ
1- Materialien und Methoden
Für die Präparation von Hippocampusschnitten werden Mäuse mit einem Alter von 1 bis 3 Monaten mit Nembutal tief anästhesiert. Gehirnschnitte (300-400 μm) werden in einer künstlichen cerebrospinalen Flüssigkeit (124 mM NaCl, 26 mM NaHCO₃, 2,5 mM KCl, 1,25 mM NaH₂PO₄, 2,5 mM CaCl₂ und 1,3 mM MgCl₂) bei einer Temperatur zwischen 4°C und 8°C hergestellt. Genauer: die Schnitte wurden während wenigstens 1 h bei Umgebungstemperatur gehalten, dann wurden sie in einer Kammer, die künstliche cerebrospinale Flüssigkeit, die mit 95 % 0₂ und 5 % CO₂ äquilibriert ist, enthält, untergetaucht und wurden in eine Superfusionskammer transferiert.
Das post-synaptische Erregungspotential bzw. erregende post-synaptische Potential (EPSP) der extrazellulären Felder ist mit Hilfe von Mikroelektroden (1 bis 3 MΩ), die mit künstlicher cerebrospinaler Flüssigkeit gefüllt waren, aufgezeichnet wurden. Die Messungen sind bei einer Temperatur zwischen ungefähr 22 bis 25°C durchgeführt worden. Bipolare Elektroden aus Stahl sind verwendet worden, um die Schaffer-Kollaterale und die Moosfaser zu stimulieren (Stimulation von 10 bis 100 mA während 0,1 ms mit Intervallen von 10 bis 30 s zwischen jeder Stimulation).
Für alle in der CA1-Region durchgeführten Tests sind die Stimulationselektroden und die Elektroden zur extrazellulären Messung im stratum radiatum platziert worden und Picrotoxin (Endkonzentration von 100 μM, SIGMA) ist der künstlichen cerebrospinalen Flüssigkeit zugesetzt worden. Diesen Testreihen ist die CA1-Region vor der Messung von der CA3-Region durch Sektion des Gehirnschnitts mit einem Messer getrennt worden.
Für die Kurven vom Typ Eingang/Ausgang ist die Erregbarkeit der Fasern nach Blockierung der Aktivierung des Glutamatrezeptors mit dem Antagonisten des AMPA (α-Amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazolpropionsäure)-Rezeptors, NBQX (5 bis 10 μM, TOCRIS), untersucht worden. Die Reaktionen des AMPA-Rezeptors wurden gemessen, dann wurden die Reaktionen des NMDA (N-Methyl-D-aspartat)-Rezeptors nach Unterdrückung des extrazellulären Magnesiums zu Tage gebracht und mittels Zugabe von NBQX (10 μM) isoliert, um eine quantitative Untersuchung durchzuführen.
Für die Analysen vom Typ post-tetanische Potentialisierung (PTP) ist eine erhöhte Dosis an D-APV (50 bis 100 μM; geliefert von TOCRIS) der Lösung des Bades zugefügt worden, und zwar wenigstens 10 Minuten vor dem tetanischen Schock.
Für die Experimente mit gekoppelten Stimulationen sind die Schaffer-Kollateralen auf wiederholte Weise mit zwei Stimuli gleicher Intensität, die von kurzen Intervallen variabler Zeitdauer getrennt waren, stimuliert worden. Das Ergebnis ist als das Verhältnis zwischen der Amplitude der Reaktion auf den zweiten Stimulus und auf den ersten Stimulus, bestimmt ausgehend vom Mittelwert von 15 bis 20 Reaktionen, für jeden Wert des Intervalls ausgedrückt.
Die Reaktionen der Moosfasern sind durch Anwendung eines Bades mit einem selektiven Agonisten des Glutamatrezeptors, DCG IV (metabotrope Gruppe vom Typ 2), untersucht worden. Die inhibitorischen Wirkungen von DCG IV (10 mM, geliefert von TOCRIS) auf die Eingänge in die Moosfasern sind bei den Mäusen vom Wildtyp und den STOP KO (-/)-Mäusen ähnlich. NBQX (5 bis 10 mM) ist am Ende jedes Tests der Moosfaser angewandt worden, um die Erregbarkeit dieser Fasern zu bestimmen.
Die Erfassung der Grundlagen bzw. Eingaben und die Untersuchung der Experimente zur Langzeitpotentialisierung (LTP) und zur Langzeitdepression (LTD) sind, bezogen auf den Genotyp der Mäuse, blind durchgeführt worden. Alle Ergebnisse sind in der Formel Mittelwert ± Standardabweichung des Mittelwerts (SEM) angegeben.
2- Ergebnisse
Die Funktion der Synapsen der STOP KO (-/-)-Mäuse ist im Hippocampus, wo die Expression der STOP-Proteine bedeutend ist, untersucht worden.
Zunächst ist, um die glutamaterge Transmission selektiv zu untersuchen, die synaptische Transmission in der CA1-Region des Hippocampus in Gegenwart von Picrotoxin, einem Antagonisten des GABA-Rezeptors vom Typ A, untersucht worden.
Die basale synaptische Transmission ist mittels Untersuchung des Verhältnisses bzw. der Beziehung zwischen der Erregbarkeit der Fasern der Schaffer-Kollateralen und der Amplitude der erregenden post-synaptischen Potentiale in der CA1-Region des Hippocampus bewertet worden. Die Untersuchung ist bei unterschiedlichen Intensitäten des Stimulus durchgeführt worden. Die Kurven vom Typ Eingang/Ausgang sind bei den STOP KO (-/-)-Mäusen und den Mäusen vom Wildtyp qualitativ ähnlich (5a und 5b). Die quantitative Unter suchung, die an den Steigungen der Eingang/Ausgang-Kurven von sechs Mäusen vom Wildtyp und von sechs Mäusen vom STOP KO (-/-)-Typ durchgeführt wurde, zeigt keinen Unterschied zwischen den zwei Gruppen von Mäusen (5c), was eine normale basale synaptische Transmission bei den Mäusen vom STOP -/--Typ anzeigt.
Für die Untersuchung der synaptischen Plastizität ist die synaptische Reaktion auf einen Standardstimulus mittels der Steigung der EPSP-Kurve bewertet worden. Die Basalwerte der Steigungen werden mittels wiederholter Stimulationen bei niedriger Frequenz (0,03-0,1 Hz) bestimmt. Zum Zeitpunkt Null wird ein Konditionierungsstimulationsprotokoll angewandt. Die synaptische Anpassung wird durch eine stabile Abweichung der Werte der EPSP-Steigungen in Bezug auf die Basalwerte festgestellt.
Ein Konditionierungsprotokoll bei erhöhter Frequenz (100 Hz), angewandt auf die Synapse Schaffer-Kollaterale-Pyramidenzelle der Region CA1, erzeugt eine stabile Erhöhung der Steigungen der Kurven in Schnitten von Mäusen vom Wildtyp (6a), was eine synaptische Potentialisierung bei diesen Mäusen anzeigt. Diese Potentialisierung hat für mehr als 30 Minuten bestanden und eine solche Beständigkeit gibt eine Langzeitpotentialisierung (LTP) wieder.
Bei den STOP KO (-/-)-Mäusen beobachtet man eine schwächere Potentialisierung der synaptischen Transmission (6b).
Dieser Unterschied wird durch die quantitative Untersuchung der Gesamtheit der in den zwei Gruppen von Mäusen erhaltenen Ergebnisse bestätigt (6c).
Die Langzeitdepression (LTD) ist auf Ebene der gleichen Synapsen der Schaffer-Kollateralen und der CA1-Pyramidenzellen untersucht worden. Das klassische Protokoll der Stimulation bei niedriger Frequenz ist verwendet worden (LFS, 900 Stimulationen von 1 Hz). Die Schnitte von STOP KO (-/-)-Mäusen haben eine signifikante Verringerung der LTD-Amplitude gezeigt (7b).
Diese Ergebnisse zeigen, dass die LTP und die LTP bei den STOP KO (-/-)-Mäusen verändert sind.
Die LTP und die LTD hängen auf entscheidende Weise von der Aktivität des NMDA-Rezeptors ab. Jedenfalls sind die basale Aktivität des NMDA-Rezeptors, die mittels des Verhältnisses der Reaktion NMDA/AMPA auf Stimuli gemessen wurde (8A), und die Aktivierung des NMDA-Rezeptors während der tetanischen Stimulation (8B) bei den STOP KO (-/-)-Mäusen und den Mäusen vom Wildtyp vergleichbar.
Diese Ergebnisse beweisen ein Defizit in den zwei Hauptformen der synaptischen Plastizität (LTP und LTD) bei den STOP KO (-/-)-Mäusen und weisen darauf hin, dass das Defizit nicht mit einem Fehler bzw. Mangel in der Expression des NMDA-Rezeptors bei den STOP KO (-/-)-Mäusen zusammenhängt.
9B zeigt, dass bei den STOP KO (-/-)-Mäusen die synaptische Potentialisierung während der ersten Minuten nach der tetanischen Stimulation sowie in späteren Momenten verändert ist. Folglich ist die Existenz eines möglichen Mangels an kurzzeitiger Plastizität auf der Ebene der Synapsen der Schaffer-Kollateralen und der CA1-Pyramidenzellen durch Messungen der post-synaptischen Potentialisierung (PTP) und der Bahnung durch gekoppelte Stimulationen (PPF) untersucht worden. Wie die LTP ist die PTP eine Form der Potentialisierung infolge einer tetanischen Stimulation (Stimulus von 1 Hz während 1 s), aber sie wird in Gegenwart des Antagonisten des NMDA-Rezeptors (D-APV) zum Blockieren der post-synaptischen Ereignisse, die an der LTP beteiligt sind, induziert und besteht nur während einiger Minuten nach der tetanischen Stimulation. Die PPF ist eine andere Form der synaptischen Plastizität, die beobachtet wird, wenn die Synapsen durch gekoppelte Stimulationen stimuliert werden. Die PPF ist definiert als eine Erhöhung der synaptischen Reaktion in Reaktion auf den zweiten Stimulus. Die PTP ist bei den STOP KO (-/-)-Mäusen verringert (9A). Dagegen ist die Bahnung durch gekoppelte Stimulationen (PPF) bei den Mäusen vom Wildtyp und den STOP KO (-/-)-Mäusen ähnlich (9B), und dies für einen ausgedehnten Bereich von abnehmenden Werten der extrazellulären Calciumkonzentration.
Die synaptische Plastizität auf Ebene der Synapsen der Moosfasern und der Pyramidenzellen der Region CA3 ist dann untersucht worden. Bei der Langzeitpotentialisierung sowie bei der Bahnung durch gekoppelte Stimulationen (PPF) ist kein Unterschied zwischen den STOP KO (-/-)-Mäusen und den Mäusen vom Wildtyp beobachtet worden. Um die Kurzzeitplastizität zu untersuchen, sind Moosfasern mit steigenden Frequenzen, die von 0,033 bis 1 Hz reichen, stimuliert worden. Dieses Protokoll induziert normalerweise eine bedeutende und vorübergehende bzw. transiente Erhöhung der Amplitude der Reaktion der Moosfasern, ein Phänomen, das als Frequenz-Bahnung bzw. Frequenz-abhängige Bahnung bezeichnet wird. Die Amplitude der Frequenz-Bahnung war bei den STOP KO (-/-)-Mäusen im Vergleich zu den Mäusen vom Wildtyp signifikant verringert (9C).
Die Gesamtheit dieser Ergebnisse zeigt, dass mehrere verschiedene Formen der Langzeit- und Kurzzeitplastizität bei den STOP KO (-/-)-Mäusen in unterschiedlichen Regionen des Hippocampus verändert sind.
Beispiel 3: Test bzw. Untersuchung der Verhaltensstörungen von Mäusen vom KO STOP -/--Typ
1- Materialien und Methoden
Alle Verhaltenstests bzw. -untersuchungen sind an Würfen von STOP KO (-/-)-Mäusen und von Kontrollmäusen vom Wildtyp, die aus der gleichen Kolonie (genetische Grundlage bei BALBc/129 Sv) stammten, durchgeführt worden.
1-1 Tests des mütterlichen Verhaltens (Nachwuchspflege)
Das mütterliche Verhalten wird mittels der Tätigung der folgenden Gesten eingeschätzt:

1. Herstellen eines Nests
2. Wiedereinbringen der Neugeborenen in das Nest.

Bei nulliparen Weibchen und bei Männchen durchgeführte Tests
Junge nullipare Weibchen mit einem Alter von 28 bis 49 Tagen werden einzeln während wenigstens eines Tages vor Beginn des Experiments verwahrt, dann wird ihnen Watte zum Bauen eines Nests bereitgestellt.
Am Tag 1 wird jedes Weibchen auf die folgende Weise in Gegenwart von drei Neugeborenen mit einem Alter von 1 bis 3 Tagen gebracht: die Neugeborenen werden einzeln in eine der Ecken des Käfigs mit Abstand zum Nest gesetzt und nach 30 Minuten werden die Neugeborenen zu ihrer natürlichen Mutter zurückgesetzt.
Am Tag 2 wird jedes Weibchen von neuem in Gegenwart der Neugeborenen gebracht und man bewertet für jedes Weibchen die Anzahl der jungen Mäuse bzw. Mäuschen, die während eines Zeitraums von 30 Minuten wieder in das Nest eingebracht werden.
Junge Männchen mit einem Alter von 30 bis 45 Tagen wurden unter den gleichen Bedingungen wie die nulliparen Weibchen verwendet, mit dem einzigen Unterschied, dass sie während zweier aufeinanderfolgender Tage in Gegenwart von jungen Mäusen gebracht wurden, bevor sie am Tag 3, anstelle von Tag 2 bei den nulliparen Weibchen, untersucht wurden.
Bei primiparen oder multiparen Müttern durchgeführte Tests
Weibchen post-partum (zweite Trächtigkeit) wurden ab dem Beginn ihrer Trächtigkeit einzeln aufgezogen. Am Tag der Geburt wurden die jungen Mäuse entnommen und während einer Stunde in der Wärme verwahrt. Die Mutter wurde dann aus ihrem gewohnten Käfig entnommen, und es wurden drei Neugeborene einzeln in einer Ecke des gleichen Käfigs in Entfernung zum Nest platziert. Dann wurde die Mutter zurück in ihr Nest gegeben und die Anzahl an jungen Mäusen, die während eines Zeitraums von 20 Minuten wieder in das Nest eingebracht wurden, wurde bewertet.
1-2 "Test hinsichtlich Licht und Dunkelheit"
Der Test hinsichtlich der Auswahl zwischen Licht und Dunkelheit, bezeichnet als "Test hinsichtlich Licht und Dunkelheit", wird eingesetzt, um einen Angstzustand aufzudecken, der durch einen Angst-erzeugenden Stimulus provoziert wurde. Diese Verfahrensweise, die von Misslin et al. (1990, Neuroreport, 1, 267-270) validiert wurde, beruht auf der natürlichen Neigung von Nagetieren, eine dunkle Umgebung zu bevorzugen, und erlaubt es, die emotionale Reaktion von Tieren zu bewerten, die einem von Licht gebildeten Stress unterworfen wurden.
Die Tiere werden in individuellen Käfigen, eingestellt in einen Inkubator mit einer Temperatur zwischen 21 °C und 22°C und einem umgekehrten Licht/Dunkelheit-Zyklus von 12 h/12 h, gehalten, wobei Wasser und Nahrung nach Belieben verfügbar sind. Alle Versuche werden in Übereinstimmung mit den institutionellen Richtlinien für Tierversuche durchgeführt.
Die Vorrichtung besteht aus zwei Kästen aus Polyvinylcarbonat (20 cm × 20 cm × 14 cm), die mit Plexiglas abgedeckt sind. Einer der Kästen ist verdunkelt und der andere Kasten wird mit Hilfe einer Schreibtischlampe von 100 W, die im Abstand von 15 cm aufgestellt ist, erhellt (4.400 1x). Ein opaker Tunnel aus Kunststoff (5 cm × 7 cm × 10 cm) trennt den abgedunkelten Kasten von dem erhellten Kasten.
Die Tiere werden einzeln in den erhellten Kasten gesetzt, wobei der Kopf zum Tunnel gerichtet ist. Die in dem erhellten Kasten verbrachte Zeit (TLB) und die Anzahl der Passagen zwischen den beiden Kästen werden in einem Zeitraum von 5 Minuten ab dem ersten Eintritt des Tieres in den verdunkelten Kasten aufgezeichnet. Die globale Untersuchung der Ergebnisse wird unter Verwendung des Mann-Whitney-U-Tests durchgeführt. Das Risiko bzw. das Signifikanzniveau (p) ist auf p < 0,05 festgelegt. Die Ergebnisse sind als Mittelwert ± Standardfehler des Mittelwerts (SEM) angegeben.
1-3 Test der Wiedererkennung eines Gegenstandes
Das Kurzzeitgedächtnis wird mittels des Tests der Wiedererkennung eines Gegenstandes, der zuvor beschrieben wurde und der auf der natürlichen Neigung von Nagern, einen neuen Gegenstand bevorzugt gegenüber einem vertrauten Gegenstand zu untersuchen, beruht, bewertet (Ennaceur et al., 1988, Behav. Brain Res., 31, 47-59; Dodart et al., 1997, Neuroreport, 8, 1173-1178).
Die Tiere werden unter Bedingungen, wie sie in Beispiel 3, Abschnitt 1-2 beschrieben sind, gehalten.
Der Test der Wiedererkennung eines Gegenstandes wird in einem offenen Raum aus Plexiglas (52 cm × 52 cm × 40 cm) durchgeführt. Der Boden ist in 9 Quadrate gleicher Größe unterteilt. Die zu unterscheidenden Gegenstände sind eine Kugel und ein Würfel. Die Tiere werden während 30 Minuten an das offene Terrain gewöhnt.
Am folgenden Tag werden sie einer Lernprobe von 10 min (1. Probe) unterworfen, während der sie einzeln in den offenen Raum in Gegenwart eines Gegenstandes A (Würfel oder Kugel) gesetzt werden. Während dieses Zeitraumes werden aufgezeichnet:

– die lokomotorische Aktivität, bewertet mittels der Anzahl durchschrittener Quadrate und
– die vom Tier mit dem Erkunden von Gegenstand A verbrachte Zeit, d.h. die Zeit, während der die Nase des Tieres in einem Abstand von weniger als 1 cm auf den Gegenstand gerichtet ist.

Drei Stunden später werden sie einer Wiedererkennungsprobe von 10 min (2. Probe) unterworfen. Für diese Probe werden der Gegenstand A und der andere Gegenstand B in den offenen Raum gegeben und die lokomotorische Aktivität sowie die Dauer der Erkundung des Gegenstandes A (t_A) und des Gegenstandes B (t_B) werden aufgezeichnet. Dann wird der Wiedererkennungsindex (RI, in der Ordinate von 6) aus der folgenden Formel berechnet: RI = t_A/(t_A + t_B)×100. Ein Wiedererkennungstest wird als positiv bewertet, wenn der Wiedererkennungsindex signifikant oberhalb von 50 % liegt.
Die globale Untersuchung der Ergebnisse wird wie in Beispiel 3, Abschnitt 1-2 beschrieben, durchgeführt.
1-4 Tests des Sozialverhaltens, Eindringlingstest
1-4-1 Soziale Untersuchung bzw. Erkundung
Das Sozialverhalten wird an jungen Männchen mit einem Alter von 4 Wochen, die während einer Woche in einem Käfig isoliert wurden (bewohnende junge Männchen), durchgeführt; ein männlicher Eindringling, der in einer Gruppe aufgezogen wurde, wird in den Käfig eingeführt und die Zeit der sozialen Erkundung (Annäherung, Schnüffeln, Sexualverhalten) der bewohnenden jungen Männchen wird während 6 Minuten bewertet. Die Untersuchung der Ergebnisse wird unter Verwendung des Mann-Whitney-U-Tests durchgeführt.
Die Ergebnisse sind als Mittelwert ± Standardfehler des Mittelwerts angegeben.
1-4-2 Aggression zwischen Männchen
Bewohnende Männchen werden während eines Monats isoliert und ein Eindringling (in einer Gruppe aufgezogenes Männchen) wird in den Käfig gesetzt. Man misst die Anzahl der Attacken und die Zeit, die die Bewohner mit Kämpfen verbringen, während eines Zeitraumes von 5 Minuten. Die Untersuchung der Ergebnisse wird unter Verwendung des Mann-Whitney-U-Tests durchgeführt. Die Ergebnisse sind als Mittelwert ± ein Standardfehler des Mittelwerts angegeben.
2- Ergebnisse
2-1 Mütterliches Verhalten der STOP KO (-/-)-Mäuse
Die STOP KO (-/-)-Mäuse weisen schwere Fehler des mütterlichen Verhaltens auf, die sich durch ein völliges Fehlen von Interesse an ihrer Nachkommenschaft zeigen, wie es die in 10 dargestellten Ergebnisse, die ausgehend von 161 jungen Mäusen, die von 20 weiblichen STOP KO (-/-)-Mäusen, die mit heterozygoten Männchen gekreuzt wurden, stammten, erhalten wurden, zeigen:

– alle Neugeborenen, die von primiparen STOP KO (-/-)-Müttern abstammen, sterben in den ersten 24 h nach der Geburt aufgrund fehlender Aufmerksamkeit der Mutter (11a), und zwar unabhängig von ihrem Genotyp (genetische Grundlage BALBc/129Sv oder 129Sv). Im Vergleich dazu beobachtet man eine Überlebensquote von 93 % bei den Neugeborenen, die von einer primiparen Mutter abstammen, die das Wildallel im homozygoten Zustand trägt [(+/+)-Mäuse des Wildtyps]. Diese weisen ein normales mütterliches Verhalten auf, das insbesondere die Herstellung des Nests und das Wiedereinbringen der jungen Mäuse in das Nest umfasst (11a). Es wurde auch gezeigt, dass das mütterliche Verhalten der STOP KO-Mäuse nicht durch wiederholte Trächtigkeiten (multipare Mütter) verbessert wurde.
– die von einer STOP KO (-/-)-Mutter geborenen jungen Mäuse werden niemals in kannibalischer Weise getötet ("cannibalises"), und sie werden bis zur Entwöhnung aufgezogen, wenn sie von Müttern vom Wildtyp adoptiert werden, was beweist, dass der Tod der jungen Mäuse direkt mit dem Genotyp der Mutter zusammenhängt. Um die Todesursachen zu bestimmen, wurde nach einem Fehler des Stillens, der mit einem Fehlen eines olfaktorischen Signals auf der Ebene der Brustdrüsen bzw. Mamillen der STOP KO (-/-)-Weibchen zusammenhängt, gesucht. Sobald die von einer STOP KO (-/-)-Mutter stammenden jungen Mäuse in Gegenwart ihrer Mutter gelassen werden, aber wiederholt durch einen menschlichen Eingriff in eine Position, um bemuttert zu werden, gebracht werden, zeigen alle jungen Mäuse ein Verhalten des Suchens und des Festhaltens an der Brustdrüse. Das Vorhandensein dieses gerichteten Verhaltens zeigt, dass die STOP KO (-/-)-Weibchen die für das Stillen unverzichtbaren olfaktorischen Signale besitzen. Darüber hinaus ist unter diesen Umständen das Vorhandensein von Milch im Magen der jungen Mäuse beobachtet worden. Diese Ergebnisse zeigen, dass der Tod der jungen Mäuse nicht mit Fehlern der Laktation bei den STOP KO (-/-)-Mäusen zusammenhing.
– die fehlende Wiedereinbringung in das Nest liegt nicht an einer fehlenden olfaktorischen Wiedererkennung der jungen Mäuse bei den STOP KO (-/-)-Mäusen, da die in die Nähe ihrer Nachkommenschaft gesetzten STOP KO (-/-)-Weibchen die jungen Mäuse beschnuppern und ein normales Verhalten in einem Geruchstest (Test der versteckten Nahrung) zeigen.
– um zu verifizieren, ob das bei den STOP KO (-/-)-Mäusen beobachtete Fehlen mütterlichen Verhaltens mit dem Hormonzustand zusammenhängt, wurden zusätzliche Tests bei nulliparen Weibchen und bei jungen Männchen durchgeführt. Die Ergebnisse dieser Tests der Wiedereinbringung in das Test, die bei diesen zwei Gruppen von Mäusen durchgeführt wurden, zeigen ein Fehlen mütterlichen Verhaltens bei männlichen oder nulliparen weiblichen STOP KO (-/-)-Mäusen (10b und 10c).

Die Gesamtheit dieser Ergebnisse zeigt an, dass das Fehlen mütterlichen Verhaltens, das bei STOP KO (-/-)-Mäusen beobachtet wurde, unabhängig von einem manifesten organischen Fehler und vom Hormonzustand dieser Mäuse ist, was anzeigt, dass es nur eine Manifestation der multiplen Verhaltensfehler bzw. Verhaltensstörungen, die bei diesen STOP KO (-/-)-Mäusen beobachtet wurden, ist.
2-2 Andere Verhaltensstörungen der STOP KO (-/-)-Mäuse
Während die Untersuchung des Allgemeinzustandes der STOP KO (-/-)-Mäuse keinen offensichtlichen Fehler bzw. Mangel offenbart, weisen sie ein seltsames Verhalten mit Phasenintensiver Aktivität, aber ohne offensichtliches Ziel, auf, die zufällig von häufigen Aktivitätsänderungen begleitet sind. Gelegentlich weisen die Mäuse eine Krisenperiode mit einer Dauer von etwa 20 min auf, während derer die Tiere auf zwanghafte Weise Kreise beschreiben oder im Käfig wühlen. Diese Mäuse machen auch Perioden eines offensichtlichen Kollapses durch, während derer sie unbewegt bleiben, nicht schlafen und nicht auf die Umgebung reagieren. Solche Krisen wurden bei den Mäusen vom Wildtyp nie beobachtet und ähneln epileptiformen Ereignissen nicht. Es ist schwierig, die akuten Krisen auf systematische Weise zu studieren, aber sie stellen anfallsweise Manifestationen eines fortgesetzten Grundrauschens von Verhaltensanomalien dar. Die Videoaufzeichnung ist eingesetzt worden, um das Verhalten der Mäuse in quantitativer Weise zu bewerten. Die Zeit, die die Mäuse mit Essen, Schlafen, sich Putzen, Laufen bzw. Gehen und Unbewegtbleiben verbringen, wobei sie stets wach sind, ist während einer Zeitdauer von 3 Stunden gemessen worden und die Ergebnisse sind in 11a dargestellt. Im Vergleich zu Mäusen vom Wildtyp verbringen die STOP KO (-/-)-Mäuse mehr Zeit damit, im Käfig umher zu gehen oder unbewegt zu bleiben, wobei sie wach sind, zum Nachteil der Zeit, die sie mit ihrer Ernährung und mit Schlafen verbringen. Die mutanten Mäuse weisen stärkere Aktivitätsänderungen auf, die zum Großteil an einer signifikant größeren Zahl an Phasen der Bewegung ohne Ziel und Phasen der Immobilität bzw. des Ruhens liegen (11a). Die Aktivitätsänderungen bei den STOP KO (-/-)-Mäusen unterbrechen häufig eine Periode charakteristischer Aktivität. Beispielsweise geht bei den Mäusen vom Wildtyp 71 % der Schlafphasen eine Putzphase mit oder ohne Einschub einer Phase der Ruhe voraus. Die entsprechende Häufigkeit bei den STOP KO (-/-)-Mäusen ist 47 %, ein Wert knapp oberhalb des Grundrauschens, wie im Fall der Abfolgen zufälliger Aktivität erwartet (35 %, 12a). Diese quantitativen Ergebnisse bestätigen den Eindruck einer unorganisierten und nicht auf ein Ziel gerichteten Aktivität, der durch die Beobachtung der STOP KO (-/-)-Mäuse vermittelt wird.
Die ergänzenden Untersuchungen des Verhaltens der STOP KO (-/-)-Mäuse sind mit Hilfe klassischer Tests durchgeführt worden.
Angstzustand der STOP KO (-/-)-Mäuse
Die STOP KO (-/-)-Mäuse werden durch einen Angst-erzeugenden Stimulus erschreckt und die Mäuse vom Wildtyp (+/+) haben ein normales Verhalten, wie es die Ergebnisse des Tests der Stimulation durch Licht (Licht-Dunkelheit-Test) zeigen, die in den 12a und 12b dargestellt sind. Es ist außerdem durch die vorhergehenden Tests gezeigt worden, dass die spontane lokomotorische Aktivität der mutanten Mäuse im Vergleich zu Mäusen des Wildtyps (+/+) nicht modifiziert war.
12a zeigt, dass die Mäuse vom Wildtyp (+/+) viel mehr Zeit in dem erhellten Kasten verbringen als die STOP KO (-/-)-Mäuse, die während beinahe der gesamten Dauer des Tests in dem verdunkelten Kasten bleiben. Die zwischen den KO (-/-)-Mäusen und den Mäusen vom Wildtyp (+/+) beobachteten Unterschiede sind statistisch signifikant: p < 0,01, Mann-Whitney-U-Test.
12b zeigt, dass die Mäuse vom Wildtyp häufiger in den erhellten Kasten eintreten als die STOP KO (-/-)-Mäuse. Die beobachteten Unterschiede zwischen den STOP KO (-/-)-Mäusen und den Mäusen vom Wildtyp (+/+) sind statistisch signifikant: p < 0,01, Mann-Whitney-U-Test.
Kurzzeitgedächtnis von STOP KO (-/-)-Mäusen
Die STOP KO (-/-)-Mäuse weisen Störungen des Kurzzeitgedächtnisses auf, wie die Ergebnisse des Wiedererkennungstests, die in 13 dargestellt sind, zeigen:

– der bei den Mäusen vom Wildtyp gemessene Wiedererkennungsindex (65 %) ist auf signifikante Weise stärker erhöht als der bei den STOP KO (-/-)-Mäusen beobachtete Index von 50 % (p = 0,004 für die (+/+)-Mäuse, Student-Test).
– die Zeit zur Erkundung der Gegenstände A und B, die während der zweiten Probe (Wiedererkennungsprobe) aufgezeichnet wurde, zeigt, dass die Mäuse vom Wildtyp den neuen Gegenstand bevorzugt gegenüber dem vertrauten Gegenstand erkunden.
– die STOP KO (-/-)-Mäuse erkunden keinen der Gegenstände während der zwei Proben (Lernen und Wiedererkennung). Sie bewegen sich im offenen Raum fort, sind aber nicht an den Objekten interessiert. Diese Verhaltensweise könnte sich aufgrund ihres Angstzustandes, wie ihn die Ergebnisse des Tests von Licht und Dunkelheit zeigen, erklären. Dieser Angstzustand wird insbesondere durch die Tatsache aufgedeckt, dass sich die Mäuse entlang der Wände fortbewegen und den offenen Raum nicht durchqueren, da sie von der Umgebung und den Gegenständen, die einen Angst-erzeugenden Stimulus darstellen, erschreckt zu sein scheinen.

Sozialverhalten
Die STOP KO (-/-)-Mäuse weisen Störungen der sozialen Erkundung auf (14a, 14b und 14c).
14a zeigt, dass die Zeit, die von den Bewohnern mit der Untersuchung bzw. Erkundung des Eindringlings verbracht wird, auf signifikante Weise verringert ist, wenn der Bewohner ein STOP KO (-/-)-Männchen ist (p < 0,05).
14b zeigt, dass die im Test der Aggression zwischen Männchen durch die STOP KO (-/-)-Bewohner ausgeführte Anzahl von Attacken geringer ist als die Anzahl an Attacken, die von männlichen Tieren des Wildtyps ausgeführt wird (p < 0,01).
14c zeigt, dass die Zeit, die von den männlichen STOP KO (-/-)-Bewohnern mit Kämpfen verbracht wird, im Vergleich zu männlichen Tieren des Wildtyps verringert ist (p < 0,01).
Beispiel 4: Wirkung von Anxiolytika und Neuroleptika auf das Verhalten von STOP KO (-/-)-Mäusen
1- Materialien und Methoden
Die Wirkung von Anxiolytika (Diazepam) und Neuroleptika (Chlorpromazin, Haloperidol oder Clozapin) auf die Verhaltensstörungen von STOP KO (-/-)-Mäusen ist im Test bzw. der Untersuchung des mütterlichen Verhaltens, wie im Beispiel 3 definiert (Test der Wiedereinbringung in das Test), bewertet worden.
Haloperidol (Haldol^®, JANSSEN-CILAG), Chlorpromazin (Largactil^®, RHONE-POULENC) und Diazepam (Valium^®, ROCHE) wurden den Mäusen im Getränk in einer Dosis von 0,5 mg/kg/Tag verabreicht.
2- Ergebnisse
a) Kurzzeitbehandlung
Die Wirkung der Kurzzeitverabreichung (während 6 bis 8 Tage nach dem 6. Tag vor der Geburt) von Anxiolytika (Diazepam) und Neuroleptika (Chlorpromazin, Haloperidol und Clozapin) auf die Verhaltensstörungen von STOP KO (-/-)-Mäusen ist im Test der Wiedereinbringung in das Nest bewertet worden.
Die Wiedereinbringung der Mäuse in das Nest ist auf dramatische Weise bei den nicht-behandelten STOP KO (-/-)-Müttern verändert und wird durch die Verabreichung von Diazepam geringfügig verbessert (15A). Im Gegensatz dazu verhalten sich die mit Neuroleptika behandelten STOP KO (-/-)-Mütter ebenso gut wie die Mäuse vom Wildtyp (15A). Jedoch wurde sowohl bei den behandelten als auch bei den nicht-behandelten STOP KO (-/-)-Mäusen kein Überleben der jungen Mäuse beobachtet. Diese Ergebnisse geben eine spezifische günstige, aber beschränkte Wirkung der kurzzeitigen Verabreichung von Neuroleptika auf das Verhalten von STOP KO (-/-)-Mäusen an.
b) Langzeitbehandlung
Sieben STOP KO (-/-)-Mäuse und sieben Mäuse vom Wildtyp erhielten eine tägliche Verabreichung eines Gemisches aus Chlorpromazin und Haloperidol während vier Monaten ab der Entwöhnung, die sich während des Wachstums, der Paarung mit Männchen, der Trächtigkeit, der Geburt und des Zeitraums post-partum fortsetzte. Die sieben Mäuse vom Wildtyp wiesen ein normales mütterliches Verhalten auf und alle ihre jungen Mäuse überlebten (15C). Bemerkenswerterweise war bei vier der sieben STOP KO (-/-)-Mäusen eine Verbesserung des mütterlichen Verhaltens hinreichend, um das Überleben der jungen Mäuse zu erlauben, mit Überlebende/Neugeborene-Verhältnissen von 3/11, 4/8, 2/4 bzw. 1/5 bei diesen vier Mäusen.
Der Anteil weiblicher STOP KO (-/-)-Mäusen mit überlebenden jungen Mäusen ist bei den langzeitig mit Neuroleptika behandelten Mäusen signifikant stärker erhöht (4/7) im Vergleich zu nicht-behandelten Mäusen (0/20) oder kurzzeitig mit Neuroleptika behandelten Mäusen (0/6, 15B).
Diese Ergebnisse zeigen an, dass die langzeitige Verabreichung von Neuroleptika dazu fähig ist, bei den STOP KO (-/-)-Mäusen wieder ein normales Verhalten zu etablieren, das mit dem Überleben von jungen Mäusen kompatibel ist.
Wie dies aus dem Vorstehenden hervorgeht, beschränkt sich die Erfindung nicht auf die Weisen der Ausführung, Realisierung und Anwendung, die auf genauere Weise beschrieben wurden; sie umfasst im Gegenteil alle Varianten, die einem Fachmann auf dem Gebiet einfallen können, ohne vom Rahmen oder dem Umfang der vorliegenden Erfindung abzuweichen. SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Nicht-menschliches rekombinantes Säugetier, Träger wenigstens eines modifizierten Allels des Gens, das für ein STOP-Protein codiert.
Nicht-menschliches rekombinantes Säugetier nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das genannte modifizierte Allel aus einer Konstruktion erhalten wird, die eine Nucleinsäuresequenz umfasst, die aus demselben Säugetier wie oder einem anderen Säugetier als das, in das die Konstruktion insertiert wird, stammt, wobei die Konstruktion ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus Konstruktionen, die eine Sequenz enthalten, welche für ein Antisense-STOP-Protein codiert; Konstruktionen, die die Region des STOP-Promotors in Kombination mit einem Reportergen oder mit der STOP-codierenden Region umfassen; Konstruktionen, die wenigstens einen Teil des STOP-Gens, der wenigstens eine Modifikation einschließt, umfassen; Konstruktionen, die wenigstens einen Teil des STOP-Gens funktionell an einen Promotor und gegebenenfalls an andere regulatorische Sequenzen, die für die Expression im Wirtstier erforderlich sind, gebunden umfassen.
Nicht-menschliches rekombinantes Säugetier nach Anspruch 1 oder Anspruch 2, dadurch ggekennzeichnet, dass die genannten Konstruktionen unter den folgenden Konstruktionen ausgewählt sind: Konstruktionen, die ein Fragment der genomischen Sequenz, die für ein STOP-Protein codiert, zwischen dem Initiationscodon und dem STOP-Codon enthalten; Konstruktionen, die nicht die Region zwischen den Positionen 4118 und 5131 der genomischen Sequenz, die für ein STOP-Protein codiert, umfassen; Konstruktionen, die 4,1 kb des STOP-Gens, das Gen, das für die β-Galactosidase codiert, das unter die Kontrolle des endogenen STOP-Promotors gestellt ist, ein Gen für Resistenz gegen Neomycin unter der Kontrolle des PGK-Promotors, 1,57 kb der Sequenz des STOP-Gens und schließlich das Gen der Thymidinkinase unter der Kontrolle des PGK-Promotors umfassen.
Verwendung eines nicht-menschlichen rekombinanten Säugetiers nach einem der Ansprüche 1 bis 3 für die Auswahl oder die Durchmusterung von psychoaktiven Produkten.
Primer oder Sonden zur Durchmusterung von rekombinanten ES-Klonen oder rekombinanten Tieren, dadurch gekennzeichnet, dass sie aus der Gruppe, bestehend aus den Sequenzen SEQ ID NO: 3 bis 6, ausgewählt sind.
Verfahren zur Durchmusterung und Auswahl von Molekülen, die in der Behandlung von Schizophrenie und schizoaffektiven Störungen mit Angst-, Paranoia-, oder Depressionskomponente verwendbar sind, wobei das Verfahren dadurch gekennzeichnet ist, dass es wenigstens die folgenden Stufen umfasst: – in-vitro-Inkontaktbringen wenigstens einer durchzumusternden Substanz mit einer biologischen Probe, die aus einem Extrakt von Zellen oder Organschnitten, vorzugsweise neuronalen oder zerebralen gebildet wird, die aus wenigstens einem nicht-menschlichen rekombinanten Säugetier stammt, das Träger wenigstens eines modifizierten Allels des Gens, das für ein STOP-Protein nach einem der Ansprüche 1 bis 3 codiert, ist; – Messen der Wirkung der genannten zu durchmusternden Substanz auf die genannten Zellen oder Organschnitte und – Vergleich der erhaltenen Werte mit denen der Zellen oder Organschnitte einer biologischen Probe, die von einem nicht-menschlichen Säugetier desselben Typs, das Träger von zwei Wildallelen des Gens, das für ein STOP-Protein codiert, ist, stammt.
Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass die Messung mit Hilfe eines Protein-Protein-Bindungstests durchgeführt wird.
Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass die genannte Messung durch Detektion der Intensitätsänderung eines elektrischen Signals durchgeführt wird.
Vektor zur homologen Rekombination eines Gens, das für ein STOP-Protein codiert, dadurch gekennzeichnet, dass er eine Nucleotidsequenz eines modifizierten STOP-Gens, das für ein inaktiviertes STOP-Protein codiert, umfasst, von dem ein Fragment mit 1012 bp, das die sich wiederholenden Sequenzen der codierenden Region von Exon 1, enthält, deletiert und durch eine Expressionskassette ersetzt wurde, die das Gen für Neomycinresistenz (neo) unter der Kontrolle des PGK-Promotors und das Gen der β-Galactosidase (lacZ) unter der Transkriptionskontrolle des endogenen STOP-Promotors enthält.
Verwendung eines Primers oder einer Sonde nach Anspruch 5 zur Durchmusterung von nicht-menschlichen rekombinanten ES-Zellen oder von nicht-menschlichen rekombinanten Tieren.