DE69534022T2

DE69534022T2 - Genomische DNS Fragmente der regulierenden Sequenz der Beta 2 Untereinheit des neuronalen Nikotin-Acetycholin Rezeptors; damit transformierte transgene Tiere.

Info

Publication number: DE69534022T2
Application number: DE69534022T
Authority: DE
Inventors: Jean-Pierre Changeux; Marina Picciotto; Alain Bessis
Original assignee: Institut Pasteur de Lille
Current assignee: Institut Pasteur de Lille
Priority date: 1994-12-14
Filing date: 1995-12-14
Publication date: 2006-04-27
Anticipated expiration: 2015-12-15
Also published as: AU4037395A; US6452066B1; JP2008099686A; JP4450874B2; US6177242B1; JP4468429B2; US6455754B1; DK0717105T3; ATE289628T1; CA2165098C; EP0717105A3; ES2238677T3; EP0717105B1; DE69534022D1; CA2165098A1; PT717105E; JPH08242866A; NZ280674A; US20090013421A1; EP0717105A2

Description

Hintergrund der Erfindung
Gebiet der Erfindung
Diese Erfindung betrifft genomische DNA-Fragmente, enthaltend regulatorische Sequenzen für den neuronalen β2-Untereinheit-nAChR, und transgene Tiere, hergestellt unter Verwendung dieser Fragmente oder mutierter Fragmente. Die 5'-flankierenden Sequenzen enthalten einen Promotor, der eine neuronen-spezifische Expression vermittelt. Die genomischen Klone zeigen die Wichtigkeit des β2-Untereinheit-Gens in dem nikotinischen System und in der pharmakologischen Antwort auf Nikotin. Die Erfindung betrifft auch Vektoren, enthaltend die DNA-Sequenzen, mit den Vektoren transformierte Zellen, transgene Tiere, welche die Sequenzen tragen, und Zelllinien, welche aus diesen transgenen Tieren abgeleitet sind. Darüber hinaus beschreibt die Erfindung die Anwendungen von all dem oben Genannten.
In dieser Beschreibung zitierte Bezugsstellen erscheinen am Ende nach Autor und Veröffentlichungsjahr oder nach der Zitat-Nummer.
Neuronenspezifische Expression. Viele auf rekombinanter DNA basierende Vorgehensweisen erfordern eine gewebespezifische Expression. Ungewollte oder potenziell gefährliche Nebenwirkungen von Gentransfer-Therapien und -Vorgehen können durch eine korrekte gewebespezifische Expression verringert werden. Darüber hinaus bringt das Vermögen, die Expression von bestimmten Proteinen auf allein einen Zelltyp zu dirigieren, die Fähigkeit von Wissenschaftlern voran, diese Zellen für wichtige therapeutische oder analytische Zwecke zu kartieren, zu identifizieren oder zu reinigen. Falls die Zellen von Interesse Neuronen oder eine besondere Untergruppe von Neuronen sind, besteht ein Bedarf für DNA-Sequenzen, welche neuronenspezifische oder untergruppenspezifische Expression vermitteln.
Proteine, welche überall in einem Organismus exprimiert werden, werden von Neuronen häufig für spezifische Zwecke verwendet. Durch Expremieren einer besonderen Untereinheit oder Komponente dieser Proteine lediglich in neuronalem Gewebe schneidert das Neuron die Pro teinaktivität für seine Zwecke zurecht. Das Finden der besonderen neuronenspezifischen Untereinheiten oder Komponenten und das Enträtseln, warum diese lediglich in neuronalem Gewebe hergestellt werden, birgt den Schlüssel zu DNA-Elementen, welche neuronenspezifische Expression vermitteln.
Das Wissen der Erfinder um die Biologie von Acetylcholin-Rezeptoren stellte eine wichtige Grundlage für diese Erfindung bereit (siehe Changeux, The New Biologist, Band 3, Nr. 5, S. 413–429). Verschiedene Typen von Acetylcholin-Rezeptoren werden in unterschiedlichen Geweben gefunden und sprechen auf unterschiedliche Agonisten an. Ein Typ, der nikotinische Acetylcholin-Rezeptor (nAChR) spricht auf Nikotin an. Eine Untergruppe dieses Typs wird lediglich in Neuronen gefunden und wird als der neuronale nAChR bezeichnet.
Im Allgemeinen bauen fünf Untereinheiten einen Acetylcholin-Rezeptor-Komplex auf. Der Typ der Untereinheiten in dem Rezeptor bestimmt die Spezifität gegenüber Agonisten. Es ist das Expressionsmuster dieser Untereinheiten, welches die Lokalisierung von jeweiligen Acetylcholin-Rezeptor-Typen auf bestimmte Zellgruppen reguliert. Die bei der Erwerbung dieser spezifischen Expressionsmuster beteiligten genetischen Mechanismen könnten zu einer Fähigkeit führen, die gewebespezifische oder sogar eine noch definiertere Zellgruppenspezifische Expression zu steuern. Die Arbeit der Erfinder weist darauf hin, dass definierte Elemente in der Promotorsequenz die neuronenspezifische Expression für die β2-Untereinheit vermitteln.
Die pharmakologischen Effekte von Nikotin. Wie obenstehend bemerkt, spricht nAChR auf den Agonisten Nikotin an. Nikotin ist mit vielen Aspekten des Verhaltens in Verbindung gebracht worden, einschließlich Lernen und Erinnerungsvermögen (1, 2). Die pharmakologischen und verhaltensmäßigen Effekte von Nikotin beteiligen die neuronalen nAChRs. Untersuchungen unter Verwendung von geringen Dosen an Nikotin (23) oder nikotinischen Agonisten (16) legen nahe, dass Hochaffinitäts-nAChRs im Gehirn die Effekte von Nikotin auf das passive Vermeidungsverhalten vermitteln. Modellsysteme, in welchen neuronaler nAChR verändert worden ist, können deshalb nützliche Informationen über die pharmakologischen Auswirkungen von Nikotin, die Rolle von neuronalem nAChR bei kognitiven Prozessen, Nikotin-Abhängigkeit und Demenz-Arten, welche Defizite im nikotinischen System beteiligen, bereitstellen.
Funktionelle neuronale nAChRs sind pentamere Proteinkomplexe, enthaltend mindestens einen Typ von α-Untereinheit und einen Typ von β-Untereinheit (3–5) (obwohl die α7-Untereinheit funktionelle Homooligomere in vitro bilden kann^{6, 7}). Die β2-Untereinheit wurde für diese Untersuchung unter den 7 bekannten α-Untereinheiten und 3 bekannten β-Untereinheiten (3) aufgrund ihrer weiten Expression im Gehirn (8–10) und der Abwesenheit der Expression von anderen β-Untereinheiten in den meisten Hirnregionen (10) ausgewählt. Die Mutation dieser Untereinheit sollte deshalb zu signifikanten Defiziten im nikotinischen System des ZNS führen. Die Erfinder haben die Beteiligung der β2-Untereinheit an Pharmakologie und Verhalten untersucht. Gen-Targeting wurde angewandt, um die β2-Untereinheit in transgenen Mäusen zu mutieren.
Die Erfinder haben festgestellt, dass Hochaffinitäts-Bindungsstellen für Nikotin von den Gehirnen von Mäusen abwesend sind, welche hinsichtlich der β2-Untereinheit-Mutation homozygot, β2–/–, sind. Ferner enthüllt die elektrophysiologische Aufzeichnung aus Gehirnscheiben, dass Thalamus-Neuronen aus diesen Mäusen nicht auf Nikotin-Applikation ansprechen. Schließlich demonstrieren Verhaltenstests, dass Nikotin das Leistungsverhalten von β2(–/–)-Mäusen beim Test der Passiv-Vermeidung, einem Maß des assoziativen Lernens, nicht länger erhöht. Paradoxerweise sind mutante Mäuse bei dieser Aufgabe in der Lage, eine bessere Leistung aufzuzeigen als ihre nicht-mutanten Geschwister.
Kurze Zusammenfassung der Erfindung und ihrer Nützlichkeit
In einem Aspekt dieser Erfindung beschreiben wir ein 15 kb großes DNA-Fragment, welches regulatorische und codierende Regionen für die β2-Untereinheit des neuronalen nAChR trägt. Wir charakterisieren den Promotor des β2-Untereinheit-Gens in vitro und in transgenen Mäusen. Wir beschreiben mehrere DNA-Elemente, einschließlich einer E-Box und anderer Konsensus-Proteinbindungs-Sequenzen, welche an der Positiv-Regulierung dieses Gens beteiligt sind. Darüber hinaus zeigen wir, dass die zellspezifische Transkription des β2-Untereinheit-Promotors mindestens zwei negative regulatorische Elemente beteiligt, einschließlich eines solchen, welches in der transkribierten Sequenz lokalisiert ist.
Bevorzugte Ausführungsformen dieser Aspekte betreffen spezifische Promotorsequenzen und ihre Verwendung bei der Steuerung von neuronenspezifischer Expression in verschiedenen Zellen und Organismen. Eine 1163 bp große Sequenz und eine 862 bp große Sequenz vermitteln beide neuronenspezifische Expression. Andere Ausführungsformen schließen die Sequenz von –245 bis –95 von 1 ein, enthaltend ein essentielles Aktivatorelement, und die Sequenz von –245 bis –824 von 1, welche einen Repressor enthält. Ein Repressorelement, aufgebaut aus der NRSE/RE1-Sequenz, ist ebenfalls in der transkribierten Region vorhanden. Bestimmte Plasmide, welche diese genomischen Sequenzen umfassen, werden gleichfalls beschrieben.
Die Promotorsequenzen sind hinsichtlich ihres Vermögens bedeutsam, Protein-, Polypeptid- oder Peptid-Expression in bestimmten definierten Zellen zu lenken. Beispielsweise können in den transgenen Mäusen, wie nachstehend gezeigt, Proteine, welche Toxine oder dergleichen codieren, zu Neuronen gelenkt werden, um den Abbau dieser Zellen in Krankheitszuständen nachzuahmen. Andere werden aus den nachstehend beschriebenen Daten offensichtlich werden.
Alternativ dazu können die Promotoren codierte Wachstumsfaktoren oder onkogenische, tumorerzeugende oder immortalisierende Proteine zu bestimmten Neuronen lenken, um die Tumorentstehung nachzuahmen. Diese Zellen können dann isoliert und in Kultur gezüchtet werden. In einer anderen Anwendung können die Promotorsequenzen funktionstüchtig an Reportersequenzen verknüpft werden, um spezifische Neuronen in situ zu identifizieren oder Neuronen mittels Zellsortierungstechniken zu isolieren. Die isolierten gereinigten Neuronen können dann für eine biochemische oder genetische Analyse in vitro verwendet werden. Reportersequenzen, wie LacZ und Luciferase, werden nachstehend beschrieben.
Die Erfinder sehen die genomischen Klone für die Maus-β2-Untereinheit des neuronalen nAChR vor. Diese Klone sind nützlich in der Analyse des nikotinischen Systems bei Säugern und der Pharmakologie von Nikotin. Die Erfinder beschreiben Assays unter Verwendung transgener Mäuse, worin die genomischen Klone der β2-Untereinheit verwendet worden sind, um die Hochaffinitäts-Bindung von Nikotin "auszuknocken" bzw. zu beseitigen.
Zusätzlich zu den beschriebenen Deletionsmutanten werden in die Exons oder regulatorischen Sequenzen für die β2-Untereinheit eingebrachte Mutationen zu nützlichen mutanten transgenen Tieren führen. Diese Mutationen können Punktmutationen, Deletionen oder Insertionen sein, welche zu einer nicht-effizienten Aktivität des nAChR oder sogar einem nicht-aktiven Rezeptor führen. Mit derartigen mutanten Tieren sind Verfahren zum Bestimmen der Fähigkeit einer Verbindung, die nAChR-Aktivität oder -Funktion wiederherzustellen oder zu modulieren, möglich und können konzipiert werden. Die Modulation der Funktion kann entweder durch Hochregulieren oder Niederregulieren der Rezeptorzahl, der Aktivität oder andere kompensierende Mechanismen vorgesehen werden. Des Weiteren können Verfahren zum Bestimmen der Fähigkeit einer Verbindung zum Wiederherstellen oder Modulieren von Wildtyp-Verhalten in den beschriebenen oder bekannten Verhaltenstests (siehe 17, 22, 18, 2, 19, 21, 23, 24) mit den mutanten Tieren entwickelt werden. Verhaltenstests umfassen, ohne darauf jedoch eingeschränkt zu sein, das Testen des Erinnerungsvermögens, Lernens, Angstverhaltens, der lokomotorischen Aktivität und der Aufmerksamkeit im Vergleich zu dem unbe handelten Tier oder Patienten. Pharmakologische Assays (siehe 12, 13, 14, 15, 20) zum Auswählen von Verbindungen, welche mit nAChR zusammenhängendes) Aktivität oder Verhalten wiederherstellen oder modulieren, können somit mit den von dieser Erfindung vorgesehenen Mutanten-Tieren durchgeführt werden. Dosis und Menge von möglichen therapeutischen Mitteln werden durch gut etablierte Techniken bestimmt (siehe zum Beispiel Bezugsstelle 16).
Die vorliegenden Modellsysteme, umfassend transgene Tiere oder aus diesen Tieren abgeleitete Zellen, können angewandt werden, um die Rolle von Nikotin auf das Lernen und das Verhalten, die Pharmakologie von Nikotin, Nikotin-Abhängigkeit und Krankheitszustände, welche Defizite im nikotinischen System beinhalten, zu analysieren. Darüber hinaus können potenzielle Therapien für Nikotin-Abhängigkeit oder Defizite im nikotinischen System mit den transgenen Tieren oder den aus ihnen abgeleiteten Zellen und Zelllinien oder jeglicher Zelllinie getestet werden, welche mit einem DNA-Fragment oder der vollständigen DNA des Phagen β2 (CNCM-Zugangsnummer I-1503) transfiziert worden ist, getestet werden. Diese Zelllinien würden alle diejenigen einschließen, welche direkt aus homozygoten oder heterozygoten transgenen Tieren erhalten werden, welche die β2-Untereinheit-Sequenzen tragen oder darin mutiert sind. Darüber hinaus würde dies Zelllinien einschließen, welche in Kultur unter Verwendung natürlicher β2-Untereinheit-Sequenzen oder mutierter β2-Untereinheit-Sequenzen erzeugt wurden. Angewandte Techniken könnten beispielsweise diejenigen sein, die in der PCT WO 90/11354 zitiert werden.
Demenzen, wie die Alzheimer-Krankheit, in welchen die Hochaffinitäts-Nikotin-Bindungsstellen vermindert sind, legen nahe, dass das vorliegende Modell angewandt werden kann, um Arzneimittel hinsichtlich einer Kompensation dieses Defizits zu screenen. Folglich können Verfahren zum Screening von Verbindungen hinsichtlich der Fähigkeit zur Wiederherstellung oder nachweisbaren Beeinflussung der Aktivität des neuronalen nikotinischen Acetylcholin-Rezeptors entwickelt werden, welche das Zusetzen der Verbindung zu einer geeigneten Zelllinie oder das Einbringen der Verbindung in ein transgenes Tier umfassen. Transgene Tiere und Zelllinien, welche aus dieser Erfindung erzeugt werden, können in diesen Verfahren verwendet werden. Solche Tier- oder Zellliniensysteme können auch verwendet werden, um Verbindungen zu selektieren, welche in der Lage sein könnten, die Aktivität des β2-Gens wiederherzustellen oder zu modulieren.
Die mit der β2-Untereinheit-Gensequenz (Wildtyp oder mutierte Fragmente davon) erhaltenen transgenen Tiere können verwendet werden, um doppelt transgene Tiere zu erzeugen. Für diesen Zweck können hinsichtlich der β2-Untereinheit transgene Tiere mit anderen transgenen Tieren der gleichen Art oder mit natürlich vorkommenden mutanten Tieren der gleichen Art gepaart werden. Das resultierende doppelt transgene Tier, oder aus selbigem abgeleitete Zellen, können in den gleichen Anwendungen verwendet werden, wie das hinsichtlich der β2-Untereinheit transgene Eltern-Tier.
Sowohl die Promotorsequenzen als auch die genomischen Klone können verwendet werden, um einen Assay hinsichtlich der Gegenwart oder Abwesenheit von Regulator-Proteinen vorzunehmen. Die nachstehenden Gel-Shift-Assays exemplifizieren eine solche Verwendung. Die Sequenzen oder Klone können ebenfalls als Sonden verwendet werden durch Einbauen oder Verknüpfen von Markern, wie radioaktiven Nukliden, fluoreszierenden Verbindungen oder vernetzenden Proteinen oder Verbindungen, wie Avidin-Biotin. Diese Sonden können verwendet werden, um Proteine, Nukleinsäuren oder andere Verbindungen, welche an der Neuronen-Wirkung oder dem Acetylcholin-Rezeptor-System beteiligt sind, zu identifizieren oder zu assayen.
Bekannte Verfahren zum Mutieren oder Modifizieren von Nukleinsäuresequenzen können im Zusammenhang mit dieser Erfindung angewandt werden, um nützliche β2-mutante Tiere, Zelllinien oder Sequenzen zu erzeugen. Derartige Verfahren schließen, ohne darauf eingeschränkt zu sein, Punktmutationen, ortsgerichtete Mutagenese, Deletionsmutationen, Insertionsmutationen, Mutationen, welche aus homologer Rekombination erhältlich sind, und Mutationen, welche aus chemischer oder Strahlungs-Behandlung von DNA oder die DNA tragenden Zellen erhältlich sind. Eine DNA-Sequenzierung wird verwendet, um die erzeugte Mutation zu bestimmen, falls gewünscht oder notwendig. Die mutanten Tiere, Zelllinien oder Sequenzen werden dann in den DNA-Sequenzen, Systemen, Assays, Methoden oder Verfahren verwendet, welche die Erfinder beschreiben. Die mutierte DNA wird, per Definition, unterschiedlich oder nichtidentisch zur genomischen DNA sein. Mutante Tiere werden auch durch Paaren eines ersten transgenen Tiers, enthaltend die hier beschriebenen Sequenzen oder verfügbar gemacht durch diese Erfindung, mit einem zweiten Tier erzeugt. Das zweite Tier kann DNA enthalten, welche sich von der DNA unterscheidet, die im ersten Tier enthalten ist. Auf eine derartige Weise können verschiedene Linien von mutanten Tieren erzeugt werden.
Weiterhin sind rekombinante DNA-Techniken verfügbar, um die hier beschriebenen DNA-Sequenzen, wie obenstehend, zu mutieren, diese DNA-Sequenzen an Expressionsvektoren zu verknüpfen und das β2-Untereinheit-Protein oder eine Mutante, abgeleitet aus den β2-Untereinheit-Sequenzen, zu exprimieren. Die β2-Untereinheit oder -Mutante kann somit hinsichtlich der biochemischen oder verhaltensmäßigen Aktivität analysiert werden. Auf eine solche Weise können mutierte DNA-Sequenzen erzeugt werden, welche die Expression eines wirksamen nAChR verhindern.
Alternativ dazu können die beschriebenen Promotorsequenzen in Expressionsvektoren oder Systemen verwendet werden, um die Expression von anderen Proteinen anzutreiben. Erhältliche DNA-Sequenze können somit an die Promotor- oder regulatorischen Sequenzen verknüpft werden, welche die Erfinder beschreiben, um diese DNA-Sequenzen zu transkribieren oder Protein, Polypeptid oder Peptide herzustellen, welche von diesen DNA-Sequenzen codiert werden.
Beschreibung des betroffenen Fachgebiets
Frühere Untersuchungen mittels in situ-Hybridisierung (Wada et al., 1989; Hill et al., 1993; Zoli et al., 1994) und Immunhistochemie (Hill et al., 1993) demonstrieren, dass alle der neuronalen nAChR-Untereinheiten, welche bis heute kloniert wurden, eine strikte neuronenspezifische Verteilung aufzeigen. Verschiedene Untereinheiten zeigen jedoch eine noch schmalere Verteilung auf lediglich kleine Untergruppen von Neuronen im Gehirn. Beispielsweise werden die nAChR-α2-Untereinheit-Transkripte nur im Nucleus spiriformis lateralis im Hühner-Diencephalon (Daubas et al., 1990) oder dem Nucleus interpeduncularis in der Ratte (Wada et al., 1988) nachgewiesen. Auch die β3-, β4- und α3-Untereinheit-Transkripte werden nur in einer kleinen Gruppe von Strukturen im Wirbeltiergehirn nachgewiesen (Referenzen in Zoli et al., 1994).
Die Gentranskripte für die nAChR-Unterheiten α4, α5, α7 und β2 zeigen im Vergleich eine viel weitere Verteilung (Wada et al., 1989; Referenzen in Zoli et al., 1994). Zum Beispiel werden die β2-Untereinheit-Transkripte im Großteil der Neuronen im ZNS und in allen peripheren Neuronen, welche den nAChR exprimieren, gefunden (Role, 1992; Hill et al., 1993).
Als eine Folge der differenziellen Expression dieser Untereinheiten tritt eine große Diversität von nAChR-Spezies in Wirbeltieren auf. Jede Spezies besitzt ein definiertes Expressionsmuster, welches diverse Kategorien oder Gruppen von Neuronen beteiligt. Zum Beispiel sind die Neuronen aus der medialen Habenula mit denjenigen aus dem Interpeduncularis-Kern verbunden und exprimieren dennoch jeweils unterschiedliche Sätze von nAChR-Untereinheiten (siehe Role, 1992, Übersichtsartikel), welche unterschiedliche physiologische und pharmakologische Profile aufzeigen (Mulle et al., 1991).
Bis heute sind nur begrenzte Informationen über die genetischen Mechanismen verfügbar, welche für die Regulierung der nAChR-Gentranskription in Neuronen verantwortlich sind. Frühere Arbeiten am in vitro analysierten Promotor des Hühner-α7-Untereinheit-Gens versagten darin, die für transkriptionelle Regulierung verantwortlichen DNA-Elemente zu charakterisieren (Matter-Sadzinski et al., 1992). In einer anderen Untersuchung wurde der Promotor des α2-Untereinheit-Gens teilweise charakterisiert, und ein Silencer wurde beschrieben und sequenziert (Bessis et al., 1993, siehe auch Daubas et al., 1993).
Wir stellen fest, dass gewisse Beweise zur Untersuchung insbesondere der β2-Untereinheit führen. Diese wird im Großteil der Neuronen im Gehirn exprimiert (Hill et al., 1993). Auch ist die Zeitgebung des Auftretens der β2-Transkripte in enger Weise parallel zu demjenigen der neuronalen Differenzierung (Zoli et al., 1994). Daher entschieden wir uns, die genetischen Mechanismen, welche ihre Transkription regulieren, zu untersuchen.
Kurze Beschreibung der Erfindung
Genstruktur
Wir haben ein genomisches Fragment kloniert, welches die regulatorischen Sequenzen und Sequenzen, codierend das Maus-nAchR-β2-Untereinheit-Gen, enthält. Die Erfinder haben herausgefunden, dass wenigstens ein Teil der regulatorischen Region unter verschiedenen Säugerspezies konserviert ist; insbesondere die Region zwischen +16 und +38 bp, entsprechend dem NRSE/RE1, wie beschrieben in der 1. Unter Verwendung von RNase-Schutz und Amplifikation von Primer-Verlängerungsprodukten haben wir eine hauptsächliche und drei nebenrangige Transkriptions-Startstellen gefunden (1). Die Primer-Verlängerungsexperimente wurden unter Verwendung von zwei verschiedenen reversen Transkriptasen, mit unterschiedlichen Ansätzen von mRNA und mit unterschiedlichen Primern durchgeführt. Diese PCR-basierenden Techniken erlaubten uns, selbige Fragmente, welche vielmehr den Transkriptions-Startstellen als den Reverse-Transkriptase-Stopps entsprachen, zu amplifizieren und subklonieren. Die Transkriptions-Startstellen, welche wir charakterisiert haben, sind stromabwärts von der Position des 5'-Endes der längsten β2-cDNA aus Ratten (Deneris et al., 1988) und Menschen (Anand und Lindstrom, 1990) lokalisiert (siehe 1). Dies impliziert, dass in Menschen und Ratten eine andere Transkriptions-Startstelle verwendet wird. Eine solche Diskrepanz zwischen Spezies ist bereits für die ε-Untereinheit des Muskel-nAChR demonstriert worden (Dürr et al., 1994, siehe auch Dong et al., 1993; Toussaint et al., 1994). Im Gegensatz zu dem α2-Untereinheit-Gen (Bessis et al., 1993) konnte kein stromaufwärts gelegenes Exon nachgewiesen werden.
Die Strukturanalyse einer 1,2 kbp großen flankierenden Region offenbarte viele Konsensusmotive für Zellkernprotein-Bindung, einschließlich einer Sp1-Stelle und einer E-Box. Ungefähr 90 bp des undeletierten 1,2-kb-Promotors werden transkribiert, und diese Region enthält eine NRSE/RE1-Sequenz (Kraner et al., 1992; Mori et al., 1992). Es sind bereits regulatorische Elemente stromabwärts der Transkriptionsstartstelle in verschiedenen Systemen beschrieben worden, wie dem Polyomavirus (Bourachot et al., 1989) oder dem fos-Gen (Lamb et al., 1990).
Die Promotorregion liegt zwischen der im Exon 1 gelegenen Eco47III-Stelle (siehe 1) und der 4,5 kb stromaufwärts befindlichen BamHI-Stelle. Eine bevorzugte Ausführungsform ist die 1163-bp-Sequenz, beschrieben in der 1, zwischen den EcoRI- und Eco47III-Stellen. Regulatorische Sequenzen können in den 2 kb stromabwärts von der Eco47III-Stelle lokalisiert sein. Die regulatorischen Elemente aus den nAchR-β2-Untereinheit-Sequenzen können verwendet werden, um die neuronenspezifische Expression einer Nukleotidsequenz, codierend ein Protein, Polypeptid oder Peptid, welche an selbige verknüpft ist, zu steuern. Bei dem Protein, Polypeptid oder Peptid kann es sich um Toxine, trophische Faktoren, Neuropeptide, Tumor-erzeugende, onkogene oder immortalisierende Proteine oder jedwedes andere Protein, das die Funktion des Neurons verändern kann, handeln.
Ein 1163-bp-Promotor erzielt zellspezifische Transkription
Der 1163-bp-Promotor enthält regulatorische Sequenzen sowohl für gewebespezifische als auch zeitpunkt-spezifische Transkription des β2-Untereinheit-Gens. Transiente Transfektionsexperimente zeigten, dass das 1163-bp-Fragment ausreichend Information enthält, um eine zellspezifische Expression des nAchR-β2-Untereinheit-Gens zu vermitteln. Wir zeigten, dass derselbe Promotor eine strikt zellspezifische Transkription des β-Galactosidase(β-Gal)-Reportergens steuert. Darüber hinaus scheint das transgene Konstrukt mit demselben Timing aktiviert zu werden, wie das endogene β2-Untereinheit-Gen während der Entwicklung des frühen embryonalen Nervensystems (Zoli et al., 1994). In späteren Stadien der Entwicklung sind die meisten der peripheren β2-exprimierenden Neuronen noch markiert (4C, D).
Die Promotorsequenz wurde in transgenen Mäusen durch Erzeugen von zwei Linien (13 und 26) getestet, welche β-Gal unter der Steuerung des β2-Untereinheit-Promotors exprimieren.
Im ZNS ist das Expressionsmuster von β-Galactosidase zwischen den zwei Linien unterschiedlich. Nur eine Untergruppe der Zellen, welche β2 normalerweise exprimieren, exprimiert das Transgen. Dieser Typ von Diskrepanz zwischen der Expression des Transgens und des endogenen Gens ist bereits für den Promotor des Dopamin-β-Hydroxylase-Gens (Mercer et al., 1991; Hoyle et al., 1994) oder für das GAP-43-Gen (Vanselow et al., 1994) beschrieben worden. Eine unerwartete Expression ist in der transgenen Linie 13 im Geschlechtshöcker und in Hautmuskeln beobachtet worden. Diese Expression beruht wahrscheinlich auf der Integrationsstelle des Transgens, da diese Gewebe in der Linie 26 nicht gefärbt sind. Nach unserem Wissensstand zeigen die meisten der mittels Transgenese untersuchten neuronalen Promotoren eine ektopische Expression in einem gewissen kleinen Prozentsatz der transgenen Linien (Forss-Petter et al., 1990; Kaneda et al., 1991; Banerjee et al., 1992; Hoesche et al., 1993; Logan et al., 1993, Vanselow et al., 1994). Allerdings gewähren Techniken auf dem Fachgebiet die Konstruktion von Linien, worin das Expressionsmuster des Transgens in enger Weise dasjenige des Originalgens widerspiegelt oder verdoppelt; siehe Bezugsstellen für weitere Details, welche den Erfolg des Transgenese-Vorgehens zeigen.
Durch Vergleichen der β-gal-positiven Zellverteilung mit derjenigen von anderen bekannten neuronalen Markern wird es offensichtlich, dass eine Ähnlichkeit mit der Verteilung von Cholin-Acetyltransferase, TrkA (den Hochaffinitäts-Nervenwachstumsfaktor-Rezeptor) und p⁷⁵ (den Niederaffinitäts-Nervenwachstumsfaktor-Rezeptor) exprimierenden Zellen besteht (Yan und Johnson, 1988; Pioro und Cuello, 1990a, b; Ringstedt et al., 1993). Insbesondere wird in sich entwickelnden Ratten p⁷⁵ in fast allen der peripheren Ganglien- und Zentral-Kernen (mit Ausnahme der zona incerta und der hypothalamischen Kerne) exprimiert, welche das Transgen exprimieren (Yan und Johson, 1988). Es ist ebenfalls interessant, zu bemerken, dass die p⁷⁵-Expression (wie die Expression des β2-Promotor-Transgens) in vielen peripheren Ganglien und Hirnkernen vorübergehend ist, wobei sie im perinatalen oder frühen postnatalen Alter auf nicht nachweisbare Spiegel absinkt. Es ist deshalb möglich, dass der β2-Untereinheit-Promotor ein Element enthält, kontrolliert durch die Aktivierung von p⁷⁵, oder dass beide, das β2-Transgen sowie das p⁷⁵-Gen, von einem gemeinsamen Regulator gesteuert werden.
Zusammenfassend sind, obwohl dem Promotor einige im Gehirn aktive regulatorische Elemente zu fehlen scheinen, die existierenden regulatorischen Elemente ausreichend, um eine zell- und entwicklungsspezifische Expression von β-Galactosidase im PNS, im Rückenmark und in mehreren Hirnstrukturen zu gestatten. Der Promotor kann auch in Assays verwendet werden, um Regulatorproteine in neuronalem Gewebe zu identifizieren.
Regulatorische DNA-Elemente
Um die bei der Transkription des β2-Untereinheit-Gens beteiligten DNA-Elemente weiter zu charakterisieren, deletierten oder mutierten wir den 1163-bp-Promotor und analysierten die resultierenden Konstrukte durch transiente Transfektion. Ein in der distalen 5'-Ende-Region vorhandenes Repressorelement ist in Fibroblasten aber nicht in Neuroblastomen aktiv. Dieses Element ist daher wenigstens teilweise für die neuronenspezifische Expression des β2-Untereinheit-Gens verantwortlich. Eine weitere Analyse des Promotors zeigt, dass ein Deletieren von 589 bp die Aktivität in Neuroblastomen, aber nicht in Fibroblasten erhöht (6, vergleiche 862E und 283E-Luci).
Ein NRSE/RE1-Element ist an der 3'-Extremität des Promotors lokalisiert. Von diesem Element ist bereits gezeigt worden, die Aktivität von Promotoren in neuralen Zellen einzuschränken (Kraner et al., 1992; Mori et al., 1992; Li et al., 1993). In dem 1163-bp-Promotor des β2-Untereinheit-Gens führt die Punktmutation dieser Sequenz zu einer ~100fachen Erhöhung der transkriptionalen Aktivität in Fibroblasten, was impliziert, dass diese Sequenz an der neuronenspezifischen Expression des β2-Untereinheit-Gens beteiligt ist. Darüber hinaus zeigt der Sequenzvergleich, dass diese Sequenz in Ratten- und Menschen-β2-Untereinheit-cDNAs (Deneris et al., 1988; Anand und Lindstrom, 1990), ebenso wie in mehreren Promotoren von im Nervensystem exprimierten Genen, wie dem Mittelgewicht-Neurofilament-Gen, dem CAM-L1-Gen, dem Calbinbin-Gen oder dem cerebellaren Ca-bindenden-Protein-Gen, hoch konserviert ist (siehe Tabelle 1B).
Die in der 6 beschriebenen Deletionsexperimente zeigen, dass ein essentielles Aktivatorelement zwischen den Nukleotiden –245 und –95 vorhanden ist. Eine Sp1-Bindungsstelle und eine E-Box konnten in dieser Region nachgewiesen werden. Sp1-Stellen sind ubiquitäre Faktoren, wohingegen E-Boxen mit mehreren genetischen Regulationsmechanismen im Muskel (siehe Bessereau et al,, 1994, für die nAchR α1-Untereinheit) sowie in Neuronen (Guillemot et al., 1993) in Zusammenhang gebracht worden sind. Auch in einigen neuronalen Promotoren wurde über Dyaden-Elemente berichtet, wie denjenigen des Tyrosinhydroxylase-Gens (Yoon und Chikaraishi, 1994), des SCG10-Gens (Mori et al., 1990), des GAP 43-Gens (Nedivi et al., 1992) oder in der flankierenden Region des N-CAM-Gens (Chen et al., 1990). Die in der Tabelle 1A gezeigten Ergebnisse demonstrieren, dass in Neuroblastomen der in der E-Box/Dyade mutierte 1163-bp-Promotor signifikant weniger aktiv ist als der Wildtyp-Promotor. Darüber hinaus zeigt ein Gel-Shift-Assay (7) ferner, dass die E-Box/Dyade fähig ist, spezifische Komplexe zu binden. Dies legt nahe, dass die E-Box/Dyade für wenigstens einen Teil der Aktivierung der Transkription des Gens für die β2-Untereinheit verant wortlich ist. Allerdings legen Transaktivierungs-Experimente mit heterologen Promotoren nahe, dass die E-Box mit der 27 bp stromaufwärts gelegenen Sp1-Stelle kooperiert, um die Transkription positiv zu aktivieren. Dieser Typ von Kooperation zwischen einer E-Box und einer Sp1-Bindungsstelle ist bereits für die Regulierung der Transkription der α1-Untereinheit von Muskel-nAchR gezeigt worden (Bessereau et al., 1993).
Als Schlussfolgerung haben wir gezeigt, dass das Gen für die β2-Untereinheit hauptsächlich durch negativ wirkende Elemente und durch ein positives Element, welches eine E-Box umfasst, reguliert wird. Diese Doppelregulierung scheint ein allgemeines Merkmal zu sein, welches mehrere neuronale Gene gemeinsam haben (Mandel und Mckinnon, 1993), und gestattet eine Feineinstellung der Transkription von neuronalen Genen. Darüber hinaus zeigen unsere transgenen Untersuchungen, dass der 1163-bp-Promotor eine strikte neuronenspezifische Expression vermittelt, ihm jedoch einige entwicklungsmäßige oder ZNS-spezifische regulatorische Elemente fehlen.
Beschreibung der Figuren
1: Nukleotidsequenz der Region, welche das Initiator-ATG des β2-Untereinheit-Gens umgibt.
Die vier vertikalen Pfeilköpfe zeigen die vier Extremitäten, welche unter Verwendung von RACE-PCR und SLIC gefunden wurden, entsprechend den Transkriptions-Startstellen. Die vertikalen Pfeile zeigen die Position, entsprechend dem 5'-Ende der längsten β2-Untereinheit-cDNA-Klone aus Ratte (r) und Mensch (h) (Deneris et al., 1988). Die Endpunkte der Deletionen, welche in den in 3 beschriebenen Experimenten verwendet wurden, sind über der Sequenz angezeigt. Im Intron lokalisierte Nukleotide sind in Kleinbuchstaben angegeben.
2: Kartierung des 5'-Endes der β2-Untereinheit-mRNA.

A. RNase-Schutz-Experimente. Gesamt-RNA aus DBA2-Maus-Gehirn (5 und 15 μg, Spur 2 bzw. 3) und Hefe-tRNA (15 μg, Spur 1) wurden an eine ³²P-markierte RNA-Sonde hybridisiert, enthaltend 158 Nukleotide von Intron 1 und 789 Nukleotide von stromaufwärts gelegenen Sequenzen (–634/+155). Die Größe der geschützten Banden wurde gemäß der geringeren Mobilität von RNA in Acrylamid im Vergleich zu DNA (Ausubel et al., 1994) und durch den Vergleich mit der Sequenz von M13mp18, geprimed mit dem Universalprimer, abgeschätzt. Der Pfeil auf dem linken Teil des Gels zeigt auf die größere geschützte Bande.
B. Identifizierung der Transkriptionsstartstelle unter Anwendung von SLIC. Der untere Teil der Figur zeigt die Strategie und beschreibt die Oligonukleotide, welche für die SLIC oder die RACE-PCR verwendet wurden. In dem SLIC-Experiment wurde eine Primerverlängerung unter Verwendung des Oligonukleotids pE × 3 durchgeführt. Der erste Strang der cDNA wurde anschließend an das Oligonukleotid A5' ligiert, und das resultierende Fragment wurde unter Verwendung der Oligonukleotide A5'-1/p0 und dann A5'-2/p1 amplifiziert. Das amplifizierte Fragment wurde danach auf ein 1,2%iges Agarosegel aufgetragen. Das Gel wurde geblottet und an das Oligonukleotid p2 hybridisiert. Spur 1: 5 μg DBA2-Mausgehirn-Gesamt-RNA. Spur 2–3: Jeweilige Kontrollen ohne reverse Transkriptase bzw. ohne RNA. Minus: Die T4-RNA-Polymerase wurde weggelassen. Das gleiche Ergebnis wurde unter Anwendung von RACE-PCR erhalten.

3: Zellspezifische Expression des β2-Untereinheit-Promotors in vitro.
Die Luciferaseaktivität der Plasmide wurde hinsichtlich der Aktivität des promotorlosen Plasmids normiert (KS-Luci, beschrieben in Materialien und Methoden). Die RACE-PCR an mRNA, extrahiert aus SK-N-Be, transfiziert mit EE1.2-Luci, unter Verwendung von Luciferase-Oligonukleotiden (beschrieben in Material und Methoden), zeigte, dass das amplifizierte Fragment die für die korrekte Transkriptionsinitiationsstelle erwartete Größe besaß.
4: Zellspezifische Expression des β2-Untereinheit-Promotors in transgenen Mäusen.

A. "Whole mount"- bzw. Ganzkörper-Färbung von E13-Embryonen. Die Pfeilköpfe weisen auf ektopische Expression in Hautmuskeln.
B. Nachweis der β-Galactosidase-Aktivität in einem Parasagittal-Schnitt eines E13-Embryos auf der lumbo-sakralen Ebene. Die Pfeilköpfe zeigen die Markierung im ventralen und dorsalen Horn des Rückenmarks. C. Nachweis der β2-Untereinheit-Transkripte in einem benachbarten Schnitt desselben Embryos. dr: Dorsalwurzelganglion; t: Tectum; og: orthosympathische Ganglion-Kette; tr: Trigeminus-Ganglion.

5: Expression von β-Galactosidase in transgenen Mäusen.

A. Färbung der Retina (re) und der Trigeminus-Ganglien (tr) (E14.5). B. Färbung der parasympathischen ganglionischen Herz-Neuronen (pg) (E14.5). C. Querschnitt des Rückenmarks (P1). dr: Dorsalwurzelganglion, og: orthosympathisches Ganglion. D. Ventralansicht des Rückenmarks (P1). Die kleineren Pfeile zeigen Neuronen, welche nicht identifiziert worden sind.

6: Expression der Luciferase-Fusionsgene, enthaltend 5'-Ende-Deletionen des β2-Untereinheit-Promotors.
Die Plasmide werden als nnnE-Luci bezeichnet, wobei nnn die Größe der Insertion in Nukleotiden ist, und E die 5'-Ende-Restriktionsstelle (Eco47III) ist. Der Pfeil gibt die Transkriptionsstartstelle an. Die Aktivitäten von EE1.2-Luci stammen aus 3.
7: Gel-Shift-Experiment. Autoradiogramm des Mobilitätsverschiebungs-Experiments. Die verwendete Sonde war ein mit ³²P markiertes doppelsträngiges E-D-Oligonukleotid. Dieses Oligonukleotid trägt lediglich das E-Box/Dyaden-Element, wohingegen das Oligonukleotid S-E die Sp1-Bindungsstelle sowie das E-Box/Dyaden-Element trägt. Die Kompetitor-Oligonunkleotide wurden in 10- und 100-fachem molaren Überschuss verwendet, mit Ausnahme für S-E, welches nur in 100-fachem molaren Überschuss verwendet wurde.
Tabelle 1: Positive und negative regulatorische Elemente in der proximalen Region des 1163-bp-Promotors.

A. Effekt von Mutationen im proximalen Teil des 1163-bp-Promotors. Die Aktivitäten der Wildtyp- oder mutierten Promotoren werden hinsichtlich der Luciferase-Aktivität des promotorlosen KS-Luci-Plasmids normiert. Die Aktivitäten von EE1.2-Luci stammen von 3.
B. Alignierung des proximalen Silencers des β2-Untereinheit-Promotors mit anderen neuronalen Promotoren. Die Sequenzen wurden entnommen aus (Maue et al., 1990, Na-Kanal, Zugangs-Nummer M31433), (Mori et al., 1990; SCG10, M90489), (Sauerwald et al., 1990; Synapsin I, M55301), (Kohl et al., 1992; CAML1-Gen, X63509), (Gilt und Christakos, 1993, Calbindin-Gen, L11891), (Zopf et al., 1990; Neurofilament-Gen, X17102, reverse Orientierung). Die Nummerierung bezieht sich auf die Sequenzen in der Genbank/EMBL-Bibliothek.

8: Disruption des Gens, welches die β2-Untereinheit des neuronalen nAChR codiert. a-i, Normale genomische Struktur des Maus-β2-Untereinheit-Gens. Der durch das Rekombinationsereignis entfernte Abschnitt des Exons 1 ist hellgrau schattiert. ATG – Initiator-Methionin. Die Rechtecke repräsentieren die Exons I–IV. a-ii, Targeting-Ersetzungsvektor, verwendet zum Disruptieren des endogenen β2-Untereinheit-Gens. Das Initiator-Methionin und der Rest des ersten Exons wurden durch die codierende Region von NLS-lacZ und der MCl-neo^R-Expressionskassette²⁵ ersetzt. Das Konstrukt war in der Lage, die lacZ-Expression nach einer stabilen Transfektion von PC12-Zellen zu steuern (nicht gezeigt), aber eine lacZ-Expression wurde nie in rekombinanten Tieren nachgewiesen, trotz der Abwesenheit einer offensichtli chen Rekombination in der lacZ-DNA. Diphtherietoxin-A-Gen (DTA)²⁶ wurde verwendet, um gegen eine zufällige Integration zu selektieren. a-iii, Struktur des mutierten β2-Gens. Restriktionsstellen: H, HindIII; R, EcoRI; E, Eco47III; P, PstI. Schwarze Pfeile: Primer, verwendet zum Nachweisen von Rekombinationsereignissen in embryonalen Stammzellen (ES). Graue Pfeile: Primer, verwendet zum Nachweisen der Wildtyp- oder mutierten β2-Gene. b, PCR-Analyse von Tail-DNA aus den Mäusen a +/+, +/– und a –/–. c, Southern-Blot-Analyse von Tail-DNA, restriktionsbehandelt mit HindIII, aus denselben Mäusen, welche in Tafel b analysiert wurden. d, Western-Blot-Analyse von Gesamt-Hirnprotein unter Verwendung eines monoklonalen Antikörpers, der gegen die β2-Untereinheit gewonnen wurde.
Methoden: a: Der β2-Targetingvektor wurde durch Inserieren einer Mehrfach-Klonierungsstelle (MCS) in die MC1-Neo-Kassette konstruiert (GTC GAC GGT ACC GCC CGG GCA GGC CTG CTA GCT TAA TTA AGC GGC CGC CTC GAG GGG CCC ATG CAT GGA TCC). Ein 4,1 kB großes genomisches EcoRI-Eco47III-β2-Fragment, 5' vom ATG, und ein 1,5 kB großes genomisches PstI-β2-Fragment, beginnend innerhalb des ersten Introns des β2-Gens, wurden in die MCS kloniert. HM1^27,28-Embryostammzellen (5 × 10⁷) wurden mit dem linearisierten Targetingvektor mittels Elektroporation wie beschrieben²⁵ transfiziert. Vierundzwanzig überlebende G418-resistente Klone wurden mittels PCR gescreent (β2-Primer: GCC CAG ACA TAG GTC ACA TGA TGG T; neo-Primer: GTT TAT TGC AGC TTA TAA TGG TTA CA). Vier waren positiv und wurden später mittels Southern-Blot-Analyse bestätigt. Klone wurden in 3,5 Tage alte Blastocysten aus Nicht-Agouti-C57BL/6-Mäusen injiziert und in empfängnisbereite Weibchen eingepflanzt. Alle resultierenden männlichen chimären Mäuse wurden mit F1-C57BL/6 × DBA/2-Nicht-Agouti-Weibchen gekreuzt. Von 15 Chimären zeigte Eine eine Keimbahn-Transmission. β2(+/–)-Heterozygoten wurden gekreuzt und die Nachkommenschaft wurde mittels PCR-Analyse ausgewertet (Tafel b). b: Die PCR bestand aus 35 Zyklen von 94°/1 min., 65°/2 min. und 72°/1 min. c: Das Southern-Blotting wurde durchgeführt, wie beschrieben²⁹. Das 1,5 kB große genomische PstI-Fragment, welches für das Targetingkonstrukt verwendet wurde, wurde durch statistisches Priming markiert. d: Ein Western-Blot wurde wie beschrieben²⁹ unter Verwendung des monoklonalen Antikörpers 270¹¹ durchgeführt.
9: Kartierung des neuronalen nAChR in Mausgehirn unter Verwendung von in situ-Hybridisierung und Bindung von tritiummarkiertem Nikotin. A, In-situ-Hybridisierung unter Verwendung von Antisense-Oligonukleotidsonden, basierend auf der Sequenz der cDNAs, codierend die Untereinheiten β2, α4 und β4 des nAChR, um deren jeweilige mRNAs in Serienschnitten von den Gehirnen von β2(+/+)-, (+/–)- und (–/–)-Mäusen nachzuweisen. Es sind Schnitte des mittleren Thalamus gezeigt. Weiße Pfeile geben die MHb, markiert durch das β4- Antisense-Oligonukleotid, an. B, Rezeptor-Autoradiographie unter Verwendung von tritiummarkiertem Nikotin, wobei Hochaffinitäts-Bindungsstellen in den Gehirnen von Wildtyp-, heterozygoten und β2-mutanten Mäusen aufgezeigt werden. Jeweilige Schnitte in der Ebene des Striatum, Thalamus und Tectums sind gezeigt.
Methoden, A, Die in situ-Hybridisierung wurde wie folgend durchgeführt:
In situ-Hybridisierungs-Vorgehensweise. Tiefgefrorene Gewebe wurden auf einem Cryostat [14 μm dicke Schnitte] geschnitten, auf mit Poly-1-lysin beschichteten Objektträgern taumontiert und 1 bis 3 Tage lang bei –80°C aufbewahrt. Das Vorgehen wurde gemäß Young et al. (1986) durchgeführt. Kurz gesagt, wurden die Schnitte mit 4% Paraformaldehyd 5 Minuten lang bei Raumtemperatur fixiert, in phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) gewaschen und dann acetyliert und Ethanol und Chloroform delipidiert (5 Minuten). Sie wurden 2–4 Stunden lang bei 37°C unter Parafilm-Deckblättchen vorhybridisiert. Die Zusammensetzung der Vorhybridisierungs- und Hybridisierungsmischungen bestand aus 50% Formamid, 0,6 M NaCl, 0,1 M Dithiothreitol, 10% Dextransulfat, 1 mM Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA), 1 × Denhardt-Lösung (50 x = 1% Rinderserumalbumin/1% Ficoll/1% Polyvinylpyrrolidon), 0,1 mg/ml PolyA (Boehringer), 0,5 mg/ml Hefe-RNA (Sigma), 0,05 mg/ml Heringssperma-DNA (Promega) in 0,02 M Tris-HCl, pH 7,5. Die Sonden wurden bei einer Konzentration von 2000–3000 Bcq/30-μl-Schnitt angewandt (entsprechend ungefähr 15 fmol/Schnitt). Nach Entfernen der Deckblättchen und einem anfänglichen Spülen in 2 × standardmäßiger Kochsalzlösung-Citrat-Lösung (SSC) (3 M NaCl/03 M Natriumcitrat) bei Raumtemperatur (zweimal 5 Minuten lang) wurden die Schnitte viermal 15 Minuten lang in 2 × SSC/50% Formamid bei 42°C und danach zweimal 30 Minuten lang in 1 × SSC bei Raumtemperatur gewaschen. 1 mM Dithiothreitol wurde allen Waschlösungen zugesetzt. Nach Spülen in eiskaltem destilliertem Wasser und Trocknen wurden sie 10–20 Tage lang an Hyperfilm βmax (Amersham) und dann 1–2 Monate lang an eine fotografische Emulsion (NTB2, Kodak) exponiert.
Analyse der histologischen Präparationen. Die Analyse des Markierungsmusters für die verschiedenen mRNAs wurde sowohl an Film- als auch Emulsions-Autoradiogrammen durchgeführt.
Die Identifizierung von anatomischen Strukturen wurde nach Gegenfärben der Serienschnitte des gesamten Embryos mit Toluidin-Blau durchgeführt. Die Definition von anatomischen Bereichen im Gehirn und die Erkennung von Strukturen des peripheren Nervensystems (PNS) beruhte auf verschiedenen Atlanten, einschließlich "The Rat Brain in Stereotaxic Coordinates" (Paxinos und Watson, 1986), "The Atlas of Developing Rat Brain" (Paxinos et al, 1991), "The Atlas of Mouse Development" (Kaufman, 1992), und "The Atlas of the Prenatal Mouse Brain" (Schambra et al., 1992). Für die kraniale Nervenganglion-Entwicklung wurden die Tafeln und Beschreibungen von Altman und Bayer (1982) konsultiert. Um die Identifikation von gewissen zentralen und peripheren Strukturen (z.B. kraniale Nerven-Motor-Kerne, autonome motorische Ganglien) zu bestätigen, wurde an einigen Schnitten eine in situ-Hybridisierung hinsichtlich Cholinacetyltransferase durchgeführt.
Eine Bewertung von 1 + (niedrige Intensität) bis 3 + (hohe Intensität) wurde der Markierung der anatomischen Strukturen, basierend auf der subjektiven Bewertung von zwei Experimentatoren, zugewiesen. Die Hintergrund-Markierung wurde als die Korndichte in nicht-neuralen Geweben mit hoher Zellularität (wie der Leber und den Muskeln) oder mit einer hohen Dichte der extrazellulären Matrix (wie Knorpel) oder als die Dichte der Markierung über neuralen Strukturen nach einer Verdrängung mit 20 × kalter Sonde berücksichtigt. In Abwesenheit einer Korn-Zählung auf dem zellulären Niveau müssen die Bewertungen mit Vorsicht betrachtet werden. Zum Beispiel können Verringerungen der Markierungsintensität einer in Entwicklung befindlichen Struktur auf der Zerstreuung positiver Zellen in der Struktur beruhen, welche durch die Vermehrung negativer Zellen oder die Ausbildung von Nervenfortsätzen verursacht wird. Obwohl die Oligonukleotide die gleiche Länge hatten und sie gemäß des gleichen Protokolls markiert worden waren, wurde kein Versuch, die Signalintensität von unterschiedlichen Transkripten zu vergleichen, unternommen. Außer es ist anderweitig angegeben, ist die in den Bildern gezeigte Markierung durch Verwendung der Oligonukleotide Nr. 31 (α3), 47 (α4), 51 (α2) und 62 (α4) erhalten worden (siehe Tabelle 1 für Oligonukleotid-Merkmale).
Spezifitätskontrollen. Für jede mRNA wurden zwei bis vier Oligonukleotide in einmaligen Teilen der Sequenz ausgewählt (z.B. die vermutliche cytoplasmatische Schleife zwischen M3 und M4 für nAChR-Untereinheiten). Eine anfängliche Einschätzung der Spezifität wurde durchgeführt durch Suchen nach einer möglichen Homologie mit anderen bekannten Sequenzen in Genbank/EMBL. Als histologische Tests auf Spezifität wurden die folgenden in Betracht gezogen: 1. Zwei oder mehrere Oligonukleotidsonden für jede mRNA ergaben das gleiche Hybridisierungsmuster (1). 2. Das Muster der Markierung in zentralen Strukturen in der ausgewachsenen Ratte stand in Übereinstimmung mit demjenigen, welches von anderen Autoren beobachtet wurde (Wada et al., 1989; Dineley-Miller und Patrick, 1992). 3. Angesichts der Tatsache, dass die meisten verwendeten Oligonukleotide 45-mere mit ähnlichem GC-Gehalt waren (Tabelle 1), bildete jede Oligonukleotidsonde eine Kontrolle für die Spezifität der anderen. 4. Die Zugabe eines 20-fachen Überschusses an kalter Sonde zur Hybridisierungsmischung rief ein vollständiges Verschwinden der Markierung hervor (2).
Die verwendeten Oligonukleotidsonden erfüllten alle diese Kriterien, mit der Ausnahme der vier Sonden gegen α3-mRNA, welche das Kriterium 2 nicht erfüllten. Frühere Untersuchungen, basierend auf cRNA-Sonden, zeigten eine verhältnismäßig weit verbreitete Verteilung dieser Untereinheit-mRNA in adulten Ratten, insbesondere hohe Spiegel in der cerebralen Kortexschicht IV, der entorhinalen Kortexschicht II, den anterioren und ventralen Thalamus-Kernen, medialen und lateralen Kniehöckern, der medialen Habenula, posterioren Hypothalamus- und Supramammilar-Kernen, der Zirbeldrüse, den motorischen Kernen der Nerven V und VII, im Locus coeruleus, Nucleus ambiguus und der Area postrema (Wada et al., 1989). Im Widerspruch zu diesen Beobachtungen konnten wir in adulten Ratten hohe Spiegel von α3-mRNA-Signal nur in der medialen Habenula, intermediäre Spiegel in der Zirbeldrüse, Area postrema, im motorischen Kern des Nervs V und im Cerebellum, und niedrige Spiegel in einigen wenigen thalamischen Kernen und dem Locus coeruleus nachweisen. Ein Teil der Diskrepanz kann einer geringeren Empfindlichkeit von Oligonukleotidsonden im Vergleich zu Ribo-Sonden zugeschrieben werden. In Anbetracht der Schwierigkeit des Ausführens von Spezifitätskontrollen für cRNA-Sonden, speziell wenn eine Hydrolyse der Sonde in dem histologischen Vorgehen durchgeführt wird (Wada et al., 1989), ist es jedoch möglich, dass eine gewisse Markierung, welche früher der α3-mRNA zugeschrieben wurde, tatsächlich aus der Hybridisierung an andere (nAChR-verwandte) RNA-Sequenzen stammt.
Oligonukleotide: β2: 5'-TCG CAT GTG GTC CGC AAT GAA GCG TAC GCC ATC CAC TGC TTC CCG-3'; α4: 5'-CCT TCT CAA CCT CTG ATG TCT TCA AGT CAG GGA CCT CAA GGG GGG-3; β4: 5'-ACC AGG CTG ACT TCA AGA CCG GGA CGC TTC ATG AAG AGG AAG GTG-3'. B, ³H-Nikotin-Bindung wurde durchgeführt, wie beschrieben von Clarke et al³⁰. 14-μm-Koronal-Schnitte wurden 30 Minuten lang bei Raumtemperatur in 50 mM Tris pH 7,4/8 mM CaCl₂/4 nM ³H-L-Nikotin inkubiert. Die nicht-spezifische Bindung wurde in Gegenwart von 10 μm L-Nikotin-Bitartrat ausgewertet. Im Anschluss an die Inkubation wurden die Schnitte 2 × 2 Minuten in eiskaltem PBS gespült und kurz in eiskaltem Wasser gespült. Die Objektträger wurden 60 Tage lang an Hyperfilm ³H exponiert.
10: Patch-Clamp-Aufzeichnung von durch Nikotin hervorgerufenen Strömen in der MHb und im anterioren Thalamus von β2(+/+)- und (–/–)-Mäusen. A, Repräsentative Aufzeichnungen aus Zellen in der MHb und dem anterioren Thalamus von Wildtyp- und β2(–/–)-Mäusen. Die Abschalt-Rate bzw. Off-Rate des Agonisten ist in der MHb signifikant größer als im anterioren Thalamus, was zu einer unterschiedlichen Kinetik der Antwort in den zwei Strukturen führt. Die Antwort der MHb auf nikotinische Agonisten wird in β2(–/–)-Tieren aufrechterhalten, während die Antwort auf nikotinische Agonisten des anterioren Thalamus in β2(–/–)-Mäusen vollständig eliminiert ist. B, Tabelle der Antworten auf nikotinische Agonisten in verschiedenen Kernen von β2(+/+)- und (–/–)-Mäusen.
Verfahren, Koronal-Scheiben wurden aus dem Thalamus von 8 – 12 Tage alten Mäusen unter Verwendung eines Dosaka-Scheibenschneiders in eiskaltem ACSF-Medium (125 mM NaCl/26 mM NaHCO₃/25 mM Glukose/1,25 mM NaH₂PO₄/2,5 mM KCl 2,5/2 mM CaCl₂/1 mM MgCl₂, pH 7,3) erhalten. Die Scheiben wurden 1–8 Stunden lang im gleichen Medium gehalten. Die Zellen in den Scheiben wurden durch ein Zeiss-Mikroskop sichtbar gemacht. Ganzzell-Aufzeichnungen wurden mit 2–4 MOhm-Hartglaspipetten erhalten, welche 150 mM CsCl/10 mM EGTA/10 mM HEPES/4 mM Dinatrium-ATP/4 mM MgCl₂ enthielten, wobei der pH mit KOH auf 7,3 eingestellt war. Fünf bis zehn Sekunden lange Pulse mit Arzneimittel wurden an die Zelle schnell durch eine Pipette mit einem Durchmesser von 50 μm oberhalb der Scheibe aufgebracht, wobei die Zuführung durch Schwerkraft mit einer Lösung erfolgte, welche 150 mM NaCl/10 mM Hepes/2,5 mM KCl/2 mM CaCl₂/1 mM MgCl₂ enthielt. Aufzeichnungen wurden in Gegenwart von CNQX (5 μm) und des GABA_A-Antagonisten SR-95531 (10 μm) durchgeführt. Die Ströme wurden mit einem Axopatch ID (Axon Instrument) Patch-Verstärker aufgezeichnet, auf einem Compaq-PC digitalisiert und ferner mit dem Programm PClamp (Axon Instrument) analysiert.
11: Leistungsverhalten von β2(–/–)-Mäusen und ihren Wildtyp-Geschwistern im passiven Vermeidungs-Test. A, Antwort auf verschiedene Höhen von Fuß-Schock im Retentionstest im Anschluss an eine nach einem Training erfolgende Injektion von entweder Vehikel oder Nikotin (10 μg/kg). Die durchschnittliche Übertritts-Latenz während des Trainings-Versuchs belief sich auf 17,0 +/– 3,6 Sekunden für Mutanten-Mäuse und 15,0 +/– 3,5 Sekunden für ihre nicht-mutanten Geschwister. B, Säulengrafik, welche den Unterschied in der Retentions-Latenz zwischen Wildtyp- und Homozygoten-β2-Mutanten-Mäusen, injektionsbehandelt entweder mit Vehikel oder Nikotin (10 μg/kg), bei einer Fuß-Schock-Intensität von 2,00 mAmp zeigt. Die Daten sind als Mittelwerte +/– Standardabweichung vom Mittelwert bzw. S. E. M. der folgenden Gruppen repräsentiert: Wildtyp + Vehikel (n = 27); Wildtyp + Nikotin (n = 23); β2-mutante Mäuse + Vehikel (n = 17); β2-mutante Mäuse + Nikotin (n = 17). Eine statistische Analyse wurde unter Verwendung einer gemischten faktoriellen Varianzanalyse, gefolgt von a-posteriori-Testen von einfachen Effekten ausgeführt. # p < 0,05, Wildtyp gegenüber mutanten Mäusen im Anschluss an Vehikel-Injektion; * p < 0,01, Nikotin gegenüber Vehikel in Wildtypmäusen.
Verfahren: Der passive Vermeidungs-Test wurde, wie beschrieben im Text, gemäß Nordberg und Bergh²⁰ und Faiman et al²⁰ durchgeführt. Nikotin (Bitartrat, Sigma) wurde frisch in PBS gelöst. Eine IP-Injektion desselben Volumens entweder von Nikotin oder Vehikel folgte unmittelbar auf den Fuß-Schock während des Trainings-Versuchs.
12: Phage und Plasmide, enthaltend die Gesamtheit oder einen Teil des β2-Untereinheit-Gens und den Promotor. In den Namen der Plasmide geben die Ziffern die Größe des Fragments an, und die Buchstaben geben die zu seiner Erzeugung verwendeten Restriktionsstellen an.
Ausführliche Beschreibung
Die nachstehenden Beschreibungen und Beispiele sind exemplarisch für die Ausführungsformen und den Umfang dieser Erfindung. Die Erfindung ist nicht auf den Umfang dieser Beschreibung eingeschränkt. Weiterhin ermöglicht diese Beschreibung zusammen mit den begleitenden Abschnitten dieser Spezifikation und dem durch Bezugnahme einbezogenen Material die Ausführung aller Patentansprüche, welche folgen.
Die Beispiele und Ausführungsformen, welche folgen, können selbstverständlich durch im Fachgebiet bekannte Techniken modifiziert werden. Variationen in den beschriebenen oder beanspruchten Nukleinsäuresequenzen können durch bekannte Verfahren erzeugt werden, ohne die Effekte oder Vorteile zu verändern, welche die Erfinder aufgezeigt haben. Solche Variationen sind deshalb innerhalb des Umfangs dieser Beschreibung und Erfindung eingeschlossen.
Materialien und Methoden
Isolierung genomischer Klone.
Das PCX49-Plasmid (Deneris et al., 1988), enthaltend die gesamte Ratten-cDNA (freundlicherweise zur Verfügung gestellt von Drs. J. Boulter und S. Heinemann, The Salk Institut, San Diego, CA) wurde mit EcoRI geschnitten, das ~2,2 kb große Fragment wurde isoliert und als eine Sonde verwendet, um eine EMBL3-Bakteriophagenbibliothek von genomischer Maus-DBA2-DNA zu screenen. Man erhielt einen einmaligen Klon, welcher ~15 kb DNA stromaufwärts und ~5 kb stromabwärts des ersten Exons überspannte. Die 1 zeigt die Nukleotidsequenz 1,2 kb stromaufwärts des Initiator-ATG.
Hybridisierungsbedingungen können durch bekannte Techniken²⁹ modifiziert werden, um stringente Bedingungen für diese Sonde zu bestimmen. Änderungen in den Hybridisierungsbedingungen, wie Temperatur (von etwa 45°C bis etwa 65°C) und SSC-Pufferkonzentration (von etwa 0,1 × SSC bis etwa 6 × SSC) sowie Änderungen in der Temperatur und dem Puffer für die Waschbedingungen können vorgenommen werden, um ausreichend stringente Bedingungen zu entwickeln, welche die Hybridisierung an die β2-Untereinheit-Sequenzen gestatten. Andere verwandte Sequenzen können somit aus anderen Bibliotheken basierend auf diesem Hybridisierungsvorgehen isoliert werden. Humane Sequenzen werden unter Anwendung von Hybridisierungsbedingungen, wie 45°C und 6 × SSC, isoliert werden.
Am 13. Dezember 1994 wurden drei Hinterlegungen bei der Collection Nationale de Cultures de Microorganismes (CNCM), Institut Pasteur, 25 Rue du Docteur Roux, 75724 PARIS CEDEX 15, Frankreich, vorgenommen. Ein Phage, λβ2 nAchR, wurde unter der Zugangsnummer I-1503 hinterlegt. Dieser Phage enthält 15–20 kb genomische DNA, einschließlich der Promotorsequenzen und der codierenden Sequenzen für alle Exons der murinen β2-Untereinheit des neuronalen nAchR. Zwei E.coli-Kulturen, welche Plasmide trugen, sind ebenfalls hinterlegt worden. Das Plasmid pSA9 in E.coli DH5α besitzt die Zugangsnummer I-1501 und enthält 9 kb genomische Maus-DNA, einschließlich der regulatorischen Sequenzen und der Regionen, codierend für die Exons 1, 2 und 3 der β2-Untereinheit. Das Plasmid pEA5 in E.coli DH5α besitzt die Zugangsnummer I-1502 und enthält 5 kb genomische Maus-DNA, einschließlich einer Region von etwa 1,2 kb stromaufwärts der Eco47-III-Stelle und einer Region, codierend für die Exons 1 bis 5 der β2-Untereinheit. Die Erfinder beabsichtigen, die hier berichteten Nukleotidsequenz-Daten in den Nukleotidsequenz-Datenbanken EMBL, GenBank und DDBJ unter der Zugangsnummer: X82655 zu hinterlegen.
Kartierung der Transkriptions-Initiationsstelle.
Für die mRNA-Kartierung verwendeten wir unterschiedliche Ansätze von Gesamt-RNA, extrahiert aus DBA2-Embryonen im Stadium E13 oder E15. Die RNA-Proben wurden zuerst mit DNase I verdaut, um eine DNA-Kontamination zu vermeiden.
RNase-Protektion. Ein XbaI/PstI-Fragment, enthaltend einen Teil des Introns 1, wurde in Blueskript SK (Stratagene) eingefügt. Das Plasmid wurde dann durch BglII linearisiert, und eine RNA-Sonde wurde unter Verwendung des T7-Promotors synthetisiert. Die Schutzexperimente wurden dann wie beschreiben in Ausubel et al. (1994) durchgeführt.
RACE-PCR (Frohman et al., 1988). Die mRNA wurde 5 Minuten bei 80°C mit 10 pMol Primer hybridisiert. Die Synthese der cDNA wurde unter Verwendung von 400 u MMLV (Gibco) 45 Minuten lang bei 37°C in dem vom Hersteller empfohlenen Puffer durchgeführt. Nach einer Phenol/Chloroform-Extraktion wurde die cDNA mit Ethanol gefällt. Die Terminale-Transferase-Reaktion wurde in 0,2 M Kaliumcacodylat; 25 mM Tris-HCl pH 6,6; 25 mg/ml BSA; 1,5 mM CoCl₂; 50 nM dATP und 50 u terminale Transferase (Boehringer) 30 Minuten lang bei 37°C durchgeführt. Nach Phenol/Chloroform-Extraktion und Ethanolfällung wurde ein Zehntel der Terminale-Transferase-Reaktion unter Verwendung von Promega's Taq-DNA-Polymerase amplifiziert (30 Zyklen, 1 Minute bei: 94°C; 55°C; 72°C). Das amplifizierte Fragment wurde dann auf ein Agarosegel aufgetragen. Das Gel wurde geblottet und und mit Oligonukleotid p2 hybridisiert. Wir verwendeten pE × 2 als einen Primer für die cDNA-Synthese, und p0/BEpT für PCR zur Kartierung von mRNA aus Gehirn. OLUCI3 (Synthese von cDNA) und OLUCI2/BEpT (PCR) wurden zur Kartierung von mRNA aus transfizierten Zellen verwendet.
SLIC (Dumas Milnes Edwards et al., 1991). Die cDNA wurde zuerst aus 5 μg Gesamt-RNA unter Verwendung von pE × 3 (6 pmol) als einem Primer in 50 mM Tris-HCl, pH 8,3; 8 mM KCl; 1,6 mM MgCl₂; 5 mM Spermidin; 0,5 mM dNTP; 1 u/μl RNasin; 0,1 mg/ml BSA; 70 mM β-Mercaptoethanol; 80 u AMV-Reverse-Transkriptase (Promega) bei 42° während 45 Minuten synthetisiert. Die RNA wurde anschließend in NaOH abgebaut. Der Erststrang der cDNA wurde dann mit dem Oligonukleotid A5' ligiert. Die resultierende einzelsträngige cDNA wurde dann zwei Runden PCR-Amplifikation mit den Oligonukleotiden A5'-1/p0 und A5'-2/p1 unterzogen (35 Zyklen 94°C 1 Minute; 60°C 30 Sekunden; 72°C 45 Sekunden).
Die Sequenz der Oligonukleotide war die Folgende:
Konstruktion von Plasmiden.
KS-Luci: Das HindIII/KpnI-Restriktionsfragment des Plasmids pSVOAL (de Wet et al., 1987) wurde in die entsprechende Stelle von Blueskript KS subkloniert. Das am meisten 5' liegende EcoRI/BsmI-Fragment (45 bp) des Luciferase-Gens wurde dann gemäß (de Wet et al., 1987) deletiert und durch eine SalI-Stelle ersetzt. Anschließend wurde das 342 bp große Pvu-II/HindIII-Restriktionsfragment von SV40, enthaltend die Polyadenylierungsstellen, unter Verwendung von Adaptern in die EagI-Stellen subkloniert.
EE1.2-Luci: Das 1,2 kbp große EcoRI/Eco47II-Fragment des λβ2-Phagen wurde in die EagI/SalI-Stellen von KS-Luci unter Verwendung von Adaptern inseriert. Die 5'-Enden-Deletionen des Promotors wurden unter Verwendung der Exonuklease Bal3.1 erhalten, wie in Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel et al., 1994).
Die Mutationen wurden unter Verwendung des Sculptor-Kit (Amersham) eingeführt. In der NRSE/RE1-Sequenz war die mutierte Sequenz: +24 ACCACTTACA anstelle von ACCACGGACA, da von dieser Mutation gezeigt wurde, die Aktivität des NRSE-Elements zu verringern (Mori et al., 1992). In der E-Box-Sequenz war die mutierte Sequenz: –120 TCCTCAGG anstelle von TCCACTTG. Die 7 zeigt, dass ein Zellkernprotein in der Lage ist, an die Wildtypsequenz zu binden, aber nicht an die mutierte Sequenz.
Transfektion von Zellen.
Die Neuroblastome N1E115, humanes SK-N-Be, HeLa- und 3T6-Fibroblasten, 293-Nierenzellen vom Menschen und SVLT-Striatumzellen (Evrard et al., 1990) wurden in DMEM + 10% FCS, supplementiert mit 1% Glutamin und 1% Streptomycin, wachsen gelassen. PC12-Zellen wurden in DMEM + 10% HS + 5% FCS, supplementiert mit 1% Glutamin und 1% Streptomycin, herangezogen.
Die Zellen wurden bei 10⁵ bis 4 × 10⁵ Zellen/60 mm²-Platten ausplattiert. Am nächsten Tag wurden die Zellen in 750 μl DMEM + 2% Penizillin/Streptomycin 5 bis 12 Stunden lang mit 1 μg DNA, gemischt mit 2,5 μl Tranfectam (IBF/Sepracor) in 150 mM NaCl, transfiziert. Die Luciferase-Aktivität wurde 48 Stunden später gemessen. DNA wurde unter Verwendung von Qiagen- oder Wizard-Prep(Promega)-Kits hergestellt. Als die Plasmidaktivitäten verglichen wurden, wurden alle Plasmide am selben Tag präpariert. Mindestens zwei verschiedene DNA-Präparationen wurden für jedes Plasmid getestet. Alle Transfektionen wurden in zweifacher Ausfertigung vorgenommen und mindestens dreimal wiederholt.
Herstellung von transgenen Mäusen.
Das Luciferase-Gen aus EE1.2-Luci wurde herausgeschnitten und durch das nlsLacZ-Gen (Kalderon et al., 1984) ersetzt. Das β2-Promotor/nlsLacZ-Fragment wurde aus einem TAE-Agarose-Gel elektroeluiert, danach durch Ethanolfällung weiter gereinigt und schließlich in Tris-HCl, 10 mM, pH 7,5; 0,1 mM EDTA, resuspendiert. Die DNA-Lösung (3 ng/ml) wurde in befruchtete Oozyten von C57BL6 × SJL-Hybriden injiziert. Die Färbung der Gewebe wurde durchgeführt, wie beschrieben in Mercer et al., 1991.
Siehe auch die Verfahren unter 8.
Gel-Shift-Assay
Oligonukleotide wurden entweder mit γ[³²P]-ATP und T4-Polynukleotid-Kinase, oder mit α[³²P]-CTP und Klenow-Enzym markiert, wie in Current Protocols in Molecular Biology. Zellkernextrakte wurden aus ~10⁷ Zellen wie beschrieben hergestellt (Bessis et al., 1993). Für die Bindung wurde 1 nMol markiertes Oligonukleotid mit 0,5 μg Proteinextrakt in 10 mM Hepes pH 8, 10% Glycerol, 0,1 mM EDTA, 0,1 M NaCl, 2 mM DTT, 0,1 mg/ml BSA, 4 mM MgCl₂, 4 mM Spermidin, 1 mM PMSF, 1 μg polydIdC, in 20 μl gemischt. Die Reaktion wurde 10 Minuten lang auf Eis inkubiert. Die DNA-Protein-Komplexe wurden dann auf einem 7%igem Polyacrylamid analysiert.
Die in diesen Experimenten verwendeten Oligonukleotide waren doppelsträngig mit den folgenden Sequenzen (die unterstrichenen Nukleotide werden zwischen den mutierten und den Wildtyp-Oligonukleotiden ausgetauscht):
Ergebnisse
Charakterisierung der 5'-flankierenden Sequenzen des Gens, welches die β2-Untereinheit codiert
Ein λ-Phage, enthaltend das für die β2-Untereinheit codierende Gen, wurde kloniert, und eine Region, welche das Initiator-ATG umgibt, wurde sequenziert (1). Die Transkriptionsinitiationsstelle wurde zuerst durch RNase-Protektion kartiert (2A). Dieses Verfahren gestattete uns, mindestens drei Initiationsstellen nachzuweisen. Allerdings könnten nebenrangige weitere Startstellen in diesen Experimenten nicht nachgewiesen worden sein. Die Größe der hauptsächlichen geschützten Bande wurde auf etwa 150 Nukleotide geschätzt. Um die Initiationsstellen zu bestätigen und genauer zu lokalisieren, führten wir sowohl eine RACE-PCR ("Rapid Amplification of cDNA Ends"; Frohman et al., 1988) als auch eine SLIC ("Single Strand Ligation of cDNA"; Dumas Milnes Edwards et al., 1991) durch, welche in der Amplifizierung des Primer-Verlängerungsprodukts bestand (2B). Beide Techniken ermöglichten es uns, dieselben Fragmente zu subklonieren und zu sequenzieren, entsprechend den vier Initiationsstellen, welche in der 1 beschrieben sind. Es ist möglich, dass die –13-Startstelle sehr selten ist und durch RNase-Kartierung nicht nachgewiesen wurde.
Eine Analyse der Sequenz der flankierenden Region (1) enthüllte mehrere Konsensus-DNA-Bindungselemente: eine Sp1-Stelle (–146), eine cAMP-Responsives-Element-Bindungsstelle (CREB) (–287; Sassone-Corsi, 1988), ein nukleäres Rezeptor-Response-Element (–344 bis –356; Parker, 1993), eine GATA-3-Stelle (–1073; Ko und Engel, 1993) und ein schwach degeneriertes Octamer-Motiv (–522). Darüber hinaus konnte eine E-Box (–118), enthalten in einem dyadenartigen symmetrischen Element, erkannt werden. Die proximale Region (–245 bis +82) besitzt des Weiteren einen ungewöhnlich hohen GC-Gehalt (67%) und eine hohe Anzahl von Dinukleotid-CpG, welche eine gewisse regulatorische Bedeutung besitzen können (Antequera und Bird, 1993). Schließlich wurde eine 20-bp-Sequenz, identisch zur Sequenz von NRSE (Neural Restrictive Silencer Element; Mori et al., 1992) oder RE1 (restriktives Element; Kraner et al., 1992), im 3'-Ende des 1,2-kbp-Fragments gefunden (+18 bis +38).
Ein 1,2 kbp großes Fragment von flankierender Sequenz des β2-Untereinheit-Gens fördert die neuronenspezifische Expression in Vitro.
Ein Konstrukt wurde erzeugt, enthaltend das 1163 bp große EcoRI/Eco47III-Fragment (von –1125 bis +38) der 5'-flankierenden Region der β2-Untereinheit, fusioniert an das Luciferase-Gen (de Wet et al., 1987) (Plasmid EE1.2-Luci). Die Polyadenylierungsstellen von SV40 wur wurden stromaufwärts von den β2-Untereinheit-Sequenzen inseriert, um ein Durchlesen bzw. "Readthrough" zu vermeiden. Die transkriptionale Aktivität des Plasmids EE1.2-Luci wurde dann durch transiente Transfektion in Pheochromocytom(PC12)-Zellen, Neuroblastom-Zelllinien NIE 115 und SK-N-Be, SVLT, einer Striatum-Zelllinie (Evrard et al., 1990), NIH3T6- oder HeLa-Fibroblasten und der humanen Nieren-Zelllinie 293 getestet. Unter Verwendung von RT-PCR bestätigten wir, dass die Neuroblastome und die PC12-Zellen die β2-Untereinheit-mRNA normal exprimieren, jedoch nicht die Striatum-SVLT-Zelllinien oder die 3T6-Fibroblasten. Die 3 zeigt, dass in PC12-Zellen und Neuroblastomen das 1,2-kbp-Fragment 20- bis 180-fach aktiver bei der Vermittlung der Transkription des Reportergens als in den anderen Zelllinien ist. In Fibroblasten, 293-Zellen und SVLT-Zellen ist die transkriptionale Aktivität des 1,2-kbp-Fragments nicht signifikant höher als jene des promotorlosen Vektors (3). Deshalb ist der β2-Untereinheit-Promotor in diesen Zelllinien nicht aktiv. Diese in vitro-Transfektions-Experimente zeigen, dass das 1163-bp-Fragment das Expressionsmuster des endogenen β2-Untereinheit-Gens nachahmt und somit einen zellspezifischen Promotor enthält.
Der 1163-bp-Promotor in transgenen Mäusen
Um den 1163-bp-Promotor in vivo zu testen, wurde das EcoRI/Eco47III-Fragment stromaufwärts des nls-β-Galactosidase-Reportergens (Kalderon et al., 1984) verknüpft. Die Polyadenylierungssignale aus SV40 wurden stromabwärts der codierenden Sequenzen ligiert. Das resultierende 4,7 kb große Fragment wurde anschließend in die männlichen Vorkerne von befruchteten Eiern aus F1-Hybrid-Mäusen (C57B16 × SJL) mikroinjiziert. Aus den Schwänzen der Nachkommenschaft extrahierte DNA wurde auf die Gegenwart des β-Galactosidase-Gens mittels der Polymerasekettenreaktion (PCR) analysiert. Es wurden drei unabhängige Gründer erhalten und auf Expression analysiert.
Zwei Linien (13 und 26) wiesen eine Expression in Neuronen auf, und eine dritte Linie zeigt überhaupt keine Expression. Dies zeigt, dass der 1163-bp-Promotor ausreichende regulatorische Elemente enthält, um eine neuronen-spezifische Expression in vivo zu steuern. Im peripheren Nervensystem PNS exprimierten beide Linien in derselben Struktur. Im ZNS ist dahingegen das Markierungsmuster von Linie 26 eine Teilmenge desjenigen von Linie 13. Wir werden nur die Linie 13 ausführlich beschreiben. Wie erwartet, exprimierten die meisten peripheren β2-exprimierenden Ganglien β-Galactosidase (β-Gal), wohingegen im ZNS nur eine Untergruppe von β2-positiven Regionen die β-Gal exprimierte. Zum Beispiel zeigt 4C, dass die große Mehrheit der Neuronen des lumbo-sakralen Rückenmarks die β2-Untereinheit- Transkripte exprimiert, wohingegen nur eine Untergruppe von Neuronen in den ventralen und dorsalen Hörnern β-Gal-Aktivität aufzeigt.
Die Expression des Transgens konnte in den peripheren Ganglien in E10.5- und E11-Embryonen nachgewiesen werden. Die Markierung wurde in E13-Gesamtembryonen ( 4A) und in Gehirnen der späteren Altersstufen (E17, PO und Erwachsenenalter) untersucht. Bei E13 war die Markierung im PNS vorherrschend: Eine starke Markierung wurde in den Dorsalwurzelganglien (DRG, 4 und 5C, D); einigen mit den Kranialnerven assoziierten Ganglien (den Trigeminus-, siehe 5A, Kniehöcker-, Glossopharyngeal- und Vagus-Ganglien); den Ganglien der sympathischen Kette (5C, D), den ganglionischen Zellen der Netzhaut (5A); und den vermeintlichen parasympathischen Ganglien in der Herzwand (5B) beobachtet. Bei E13 waren Cluster von positiven Zellen auch in mehreren Ebenen des Neuraxis bzw. Neuraxons vorhanden, und zwar sowohl im Hirnstamm als auch im Proenzephalon. Cluster von gefärbten Neuronen wurden auch im ventralen und lateralen Rückenmark beobachtet.
Später in der Entwicklung (E17) wurden positive Neuronen gehäuft in mehreren basalen Telencephalon-Kernen gefunden, wohingegen verstreute Zellen im Caudate-Putamen gefärbt waren. Auf der Ebene des Dienzephalons waren positive Cluster in der Zona incerta und im retikularen thalamischen Kern und in vielen hypothalamischen Kernen vorhanden. Im Hirnstamm zeigten die meisten motorischen Kerne der Kranial-Nerven (mit Ausnahme des dorsalen motorischen Kerns des Nervus vagus) eine gewisse bis hohe Markierung. Darüber hinaus erschienen die verstreuten Zellen des V-Mesencephalon-Kern stark gefärbt, ebenso wie die Brücken-Kerne, der Präpositus-Hypoglossal-Kern und einige wenige verstreute Zellen in dem Tegmentum pontis.
Bei PO in der Linie 13, erschien die Verteilung von positiven Zellen bereits eingegrenzter als in früheren Altersstufen (beispielsweise war die Markierung im basalen Telencephalon und den oculomotorischen Kernen deutlich vermindert). Im ZNS von erwachsenen Tieren wurden markierte Zellen nur im Hypothalamus nachgewiesen. In der Linie 13 waren einige Cluster von Zellen in der Schleimhaut des Magen-Darm-Trakts (Magen und Duodenum) und in der Bauchspeicheldrüse gefärbt. Eine ektopische Markierung wurde im Geschlechtshöcker und in mehreren superfiziellen Muskeln der Linie 13 nachgewiesen, aber keines dieser Gewebe war in der Linie 26 gefärbt.
Identifikation eines minimalen zellspezifischen Promotors
Um die an der Promotoraktivität beteiligten regulatorischen Elemente ausführlicher zu untersuchen, erzeugten wir eine Reihe von Plasmiden, enthaltend 5'-Deletionen des 1163-bp-Promotors. Diese Plasmide wurden durch transiente Transfektion in Fibroblasten und SK-N-Be-Zellen getestet. Diese zwei Zelllinien wurden ausgewählt, da sie die am einfachsten transfizierten Zelllinien waren. Darüber hinaus wurde die Neuroblastom-Linie anfänglich aus peripheren Strukturen isoliert (Biedler et al., 1978) und ist ein zweckmäßiges Werkzeug, um die von dem 1163-bp-Promotor getragenen regulatorischen Elemente zu untersuchen.
Als 157 bp aus dem 5'-Ende des 1163-bp-Promotors deletiert wurden (Plasmid 1006E-Luci, beschrieben in 1), veränderte sich die Luciferaseaktivität in Neuroblastomen nicht signifikant, stieg jedoch in Fibroblasten an (6). Als weitere 301 bp deletiert wurden, stieg die Aktivität des verbleibenden Promotors in den Fibroblasten fortgesetzt an, jedoch nicht in Neuroblastomen (siehe Plasmid 862E-Luci, 6). Somit tragen die um 157 und 301 bp deletierten Plasmide Repressor-Elemente, welche nur in Fibroblasten aktiv sind. Allerdings zeigte der trunkierte 862-bp-Promotor noch eine neuronenspezifische Aktivität (6, vergleiche Aktivität von 862E-Luci in beiden Zelllinien), welche zeigt, dass zusätzliche regulatorische Elemente von dem 1,2-kbp-Promotor getragen werden. Darüber hinaus könnte ein Repressor zwischen –824 und –245 vorhanden sein (vergleiche die Aktivitäten von 862E- und 283E-Luci in den Neuroblastomen). Dieses vermutliche regulatorische Element wurde nicht weiter analysiert. Tatsächlich ist ein 283-bp-Promotor (Plasmid 283E-Luci) noch ~160mal aktiver in Neuroblastomen als in Fibroblasten, was die Gegenwart anderer neuronenspezifischer regulatorischer Elemente in diesem proximalen Abschnitt des Promotors bestätigt.
Als 150 bp vom 5'-Ende des proximalen 283-bp-Promotors deletiert wurden, wurde ein sehr starkes Absinken der transkriptionalen Aktivität sowohl in Fibroblasten als auch Neuroblastomen nachgewiesen (siehe Aktivität des Plasmids 133E-Luci). Dies zeigt, dass entscheidende positive regulatorische Elemente deletiert worden sind. Diese positiven und negativen Elemente wurden durch Deletions- und Mutations-Untersuchungen des proximalen Abschnitts des Promotors weiter untersucht.
Negative und positive regulatorische Elemente in der proximalen Region.
Das 3'-Ende des β2-Untereinheit-Promotors enthält vermeintliche Proteinfaktor-Bindungsstellen. Um die Rolle dieser Elemente in der β2-Untereinheit-Genregulation zu analysieren, erzeugten wir Plasmide, welche Mutationen in diesen Bindungsstellen enthalten. Unter Ver wendung von Deletionsexperimenten wurde ein Aktivator zwischen –95 und –245 nachgewiesen (siehe 3, der Unterschied zwischen 283E- und 133E-Luci). Da die E-Box, lokalisiert an nt-118, ein guter Kandidat war, analysierten wir den Effekt von Mutationen in diesem Element auf die transkriptionale Aktivität. Die Tabelle 1A zeigt eine 40%ige Reduktion der transkriptionalen Aktivität des mutierten Promotors, verglichen mit derjenigen des Wildtyp-Promotors. Die Rolle der E-Box in nicht-neuronalen Geweben war schwieriger zu untersuchen, da der basale Spiegel der Transkription in Fibroblasten bereits niedrig war.
Um die Rolle der E-Box in der Regulierung des Promotors weiter zu verstehen, untersuchten wir die Proteinkomplexe, die in der Lage waren, mit dieser Sequenz zu interagieren. Gel-Shift-Assays wurden unter Verwendung der 33-bp-Sequenz (nt-135 bis –103, Oligonukleotid E-D) als Sonde durchgeführt. Als das ³²P-markierte Oligonukleotid mit Zellkernextrakten aus Neuroblastomen oder Fibroblasten gemischt wurde, wurden drei Komplexe beobachtet ( 7). Alle von ihnen wurden durch einen Überschuss des unmarkierten Oligonukleotids E-D vollständig verdrängt. Im Gegensatz dazu wurde keine Kompetition beobachtet, als das Kompetitor-Oligonukleotid innerhalb der E-Box/Dyade mutiert wurde (Oligonukleotid Mut.E, siehe 7, Spur "Mut-E"). Dies zeigt, dass die E-Box/Dyade das einzige Element ist, enthalten innerhalb der –135/103-Sequenz, das in der Lage zur Bindung an Zellkern-Protein ist. Diese Sequenz ist wahrscheinlich an der Aktivität des β-Untereinheit-Promotors beteiligt.
Eine NRSE/RE1-Sequenz ist ebenfalls in der proximalen Region vorhanden und wirkt gezeigtermaßen als ein Silencer in Fibroblasten, aber nicht in PC12-Zellen oder Neuroblastomen (Kraner et al,; 1992, Li et al., 1993; Mori et al., 1992). Die Punktmutation dieser Sequenz im Kontext des 1163-bp-Promotors führte zu einem 105-fachen Zuwachs der transkriptionalen Aktivität in Fibroblasten und zu einem nur 3-fachen Zuwachs in Neuroblastomen (Tabelle 1A). Diese Sequenz ist somit für wenigstens einen Teil der zellspezifischen Expression des β2-Untereinheit-Gens verantwortlich.
Eliminierung des Hochaffinitäts-Nikotinrezeptors in transgenen Mäusen führt zur Veränderung des Vermeidungs-Lernens
Die β2-Untereinheit des nAChR wurde in embryonalen Stammzellen (ES) disruptiert, und anschließend wurden hinsichtlich dieser Untereinheit defiziente Mäuse erzeugt (8). β2(–/– )-Mäuse waren lebensfähig, paarten sich normal und zeigten keine offensichtlichen körperlichen Mängel. Die Gesamthirngröße und -organisation waren normal (siehe zum Beispiel 9, A und B). Eine Western-Blot-Analyse von Gesamthirn-Homogenaten unter Verwendung von monoklonalem Anti-β2-270¹¹ (8d) und Immuncytochemie über das gesamte Gehirn hinweg unter Verwendung eines polyklonalen Anti-β2-Antikörpers⁹ zeigten, dass die in Kontrollmäusen nachgewiesene Immunreaktivität in β2(–/–)-Mäusen abwesend war und in β(+/–)-Mäusen vermindert war. β2-codierende mRNA war in β(–/–)-Mäusen mittels in situ-Hybridisierung unter Verwendung von β2-Antisinn-Oligonukleotiden nicht nachweisbar ( 9A).
Die Verteilungen der α4- und β2-Untereinheiten überlappen sich im Gehirn im großen Maße, und diese Untereinheiten kombinieren angenommenermaßen unter Bildung der vorherrschenden nAChR-Isoform im ZNS¹². Basierend auf Oozyten-Expressions-Experimenten⁶, ist β4 die einzige bislang identifizierte Untereinheit, welche auch in der Lage sein könnte, funktionelle Heteropentamere mit der α4-Untereinheit zu bilden. Die β4-Untereinheit wurde in den Gehirnen von β2(+/–)-Mäusen oder β2(–/–)-Mäusen normal exprimiert, mit einer Expression in der medialen Habenula (MHb) und dem Nucleus interpeduncularis (IPN)¹⁰, und ohne Hochregulierung andernorts im Gehirn unter Ersetzung der β2-Untereinheit (9A). Ebenso wenig war die Expression der α4- (9A), α5- oder β3-Untereinheit-mRNAs in mutanten Mäusen signifikant verändert.
Gleichgewichts-Bindungsexperimente haben gezeigt, dass Nikotin an eine Population von Hochaffinitäts-Stellen (KD nahe 10 nM^13,14) bindet, deren Verteilung gut mit derjenigen der α4- und β2-Untereinheiten^13-15 übereinstimmt. Eine quantitative Rezeptor-Autoradiographie wurde unter Verwendung von ³H-Nikotin (4 nM) durchgeführt, um Hochaffinitäts-nAChR in Gehirnschnitten aus β2(+/+)-, (+/–)- und (–/–)-Mäusen sichtbar zu machen (9B). Die Nikotinbindung in situ war in β2(–/–)-Tieren vollständig eliminiert und war in β2(+/–)-Tieren um ungefähr 50% in allen Gehirnbereichen vermindert, was die β2-Untereinheit mit der Vermittlung dieser Hochaffinitäts-Bindung in Verbindung bringt.
Elektrophysiologie von transgenen Mäusen.
Neuronen des anterioren Thalamus, welche sehr hohe Spiegel an β2- (und α4)-UntereinheitmRNAs exprimieren (9A), wurden hinsichtlich einer elektrophysiologischen Antwort auf Nikotin untersucht. Dieses Areal, in einer Scheiben-Präparation leicht zugänglich, antwortete konsistent auf 10 μm Nikotin in Wildtyp-Tieren mit einem durchschnittlichen Einwärts-Strom von 155+/–73 pA, welcher durch 1 μM Dihydro-β-erythroidin blockiert wurde. Die Agonisten-Rangfolge der Antwort war mit derjenigen kompatibel, welche für α4/β2-enthaltende nikotinische Rezeptoren in vitro⁶ beobachtet wurde (Nikotin > DMPP > Cytisin) (10A). Anteriore thalamische Neuronen benötigten mehrere Minuten bis zu einer Stunde für eine vollständige Erholung der Agonisten-Antwort, was nahelegt, dass die Rezeptor-Antwort einer Desensitivierung unterliegt. Darüber hinaus war eine relativ hohe Dosis von 1 μm für eine reproduzierbare Antwort erforderlich, was impliziert, dass Nikotin nicht an seine Hochaffinitäts-Stelle bindet, um eine Aktivierung durchzuführen. Hochaffinitäts-Nikotin-Bindungsstellen können deshalb nAChRs in einer desensitivierten Konformation sein.
In β2(–/–)-Mäusen war die Antwort von anterioren thalamischen Neuronen auf Nikotin in 100% der getesteten Neuronen vollständig eliminiert (10B). Als eine Kontrolle wurden Neuronen in der MHb, wo sowohl α3 als auch β4 stark exprimiert sind, ebenfalls getestet. Nikotin verursachte einen durchschnittlichen Einwärtsstrom von 505 +/– 132 pA in Wildtypmäusen, und die Agonistenwirksamkeit dieser Antwort folgte der Rangfolge für den α3/β4-enthaltenden Rezeptor (Cytisin = Nikotin > DMPP) (10A). Wie erwartet, wurde die Antwort von Zellen in der MHb auf Nikotin in mutanten Mäusen beibehalten.
Die β2-Untereinheit wird in den Ganglien von Wildtyptieren^8-10 exprimiert, aber es gab keinen offensichtlichen Unterschied in der Herzgeschwindigkeit oder basalen Körpertemperatur. Die spontane lokomotorische Aktivität, welche gegenüber hohen Nikotindosen empfindlich ist und nicht von Arzneimitteln modifiziert wird, welche selektiv für die β2/α4-Isoform des nAChR¹⁶ sind, war in β2(–/–)-, β(+/1)- und β(+/+)-Mäusen nicht signifikant unterschiedlich.
Kognitive und das Verhalten betreffende Ergebnisse.
Das Lernen und das Erinnerungsvermögen wurden unter Anwendung von zwei Vorgehensweisen in mutanten und Wildtypmäusen untersucht. Das Morris-Wasserlabyrinth^{17, 18} untersucht das Lernen der räumlichen Orientierung. Das Leistungsverhalten von mutanten Mäusen in diesem Test unterschied sich nicht von denjenigen von Wildtyp-Mäusen, bei Testen in der sichtbaren Plattform-Aufgabe oder mit der versteckten Plattform-Aufgabe (minimale Schwimmzeit, erreicht nach 5 Tagen Training: Mutanten (n = 8): 7,4 +/– 1,4 Sekunden; Wildtyp (n = 8): 8,2 +/– 2,0 Sekunden). In dem Transfertest verbrachten beide Tiergruppen ungefähr 35% der Zeit in dem Plattform-Quadranten, mit der gleichen Anzahl von Plattform-Überquerungen (Mutanten: 4 +/– 0,4; Wildtyp: 3,9 +/– 0,6).
Die Retention einer inhibitorischen Vermeidungsantwort wurde unter Verwendung des Passiv-Vermeidungs-Tests untersucht, welcher auch wegen seiner pharmakologischen Empfindlichkeit auf Nikotinverabreichung gewählt wurde^{19, 20}. Dieser Test bestand aus einem Trainings-Versuch, in welchem die Maus in eine gut beleuchtete Kammer einer Shuttle-Box gebracht wurde und die Latenz des Eintretens in die benachbarte dunkle Kammer gemessen wurde. Nach dem Eintritt in die dunkle Kammer wurde ein milder unausweichlicher Fuß- Schock abgegeben, und Vehikel oder Nikotin (10 μg/kg) wurde in die Maus injiziert. Vierundzwanzig (24) Stunden später wurde die Retention durch Messen der Latenz, in die dunkle Kammer einzutreten, überprüft. Die in der beleuchteten Kammer verbrachte Zeit (Retentions-Latenz) nahm sowohl in mutanten als auch in Wildtyp-Mäusen proportional zum abgegebenen Fuß-Schock zu. Allerdings erleichterte die Behandlung mit Nikotin in konsistenter Weise die Retention (p < 0,01) durch Aufwärts-Verschieben der Kurve um ungefähr 80 Sekunden nur in Wildtyp-Mäusen (10A). Die Nikotinverabreichung war in mutanten Mäusen völlig unwirksam. Interessanterweise war die Retentionslatenz für mutante Mäuse signifikant höher als für ihre nicht-mutanten, mit Vehikel injektionsbehandelten Geschwister (p < 0,05) (10B).
Eine erhöhte Retention im Passiv-Vermeidungs-Test kann in Tieren mit einer verringerten Schmerzschwelle oder einer erhöhten Emotionalität beobachtet werden. Deshalb wurden weitere Verhaltenstests an allen, in diesem Experiment eingeschlossenen, Mäusen durchgeführt. Mutante Mäuse unterschieden sich nicht von ihren nicht-mutanten Geschwistern hinsichtlich Zurückschreck-, Vokalisations- oder Sprung-Antwort auf einen Fuß-Schock. Die Emotionalität wurde durch Messen der explorativen Aktivität in einer Zwei-Abteilungs-Vorrichtung 15 Minuten lang getestet^21,22. Die durchschnittliche, im dunklen Abteil verbrachte Zeit, die lokomotorische Aktivität in dem dunklen Abteil und die Übergänge zwischen den Abteilen unterschieden sich nicht zwischen den Mutanten- und den Wildtyp-Mäusen. Deshalb können weder Änderungen in der Schmerzempfindlichkeit noch Änderungen in der Emotionalität für den Unterschied in der Retentionslatenz verantwortlich sein, welcher in dem Passiv-Vermeidungs-Test beobachtet wurde.
Untersuchungen unter Verwendung von niedrigen Dosen an Nikotin²³ oder spezifischen nikotinischen Agonisten¹⁶ legen nahe, dass Hochaffinitäts-nAChRs im Gehirn die Effekte von Nikotin auf die Passiv-Vermeidung vermitteln. Folglich kann Nikotin die Leistung von β2(–/– )-Mäusen in diesem Test nicht verändern, da ihnen Hochaffinitäts-Bindungsstellen fehlen. Die erhöhte Leistung von mutanten Mäusen gegenüber Wildtyp-Mäusen ist allerdings ziemlich überraschend. Mehrere Erklärungen für den paradoxen Effekt der β2-Untereinheit-Mutation können vorgeschlagen werden. Eine Hypothese besteht darin, dass eine Nikotininjektion die Leistung von Wildtyp-Mäusen bei der Passiv-Vermeidung als Ergebnis einer Desensitivierung, und somit Inaktivierung von nAChRs, welche zu der erhöhten Leistung im Test führt, verbessert. Deshalb könnte das Verhalten von Mäusen, denen der Rezeptor fehlt, jenes von Mäusen, deren Rezeptoren desensitiviert worden sind²⁴, nachahmen. Eine andere Möglichkeit besteht darin, dass nAChRs in mindestens zwei Wegen vorhanden sein können, welche mit entgegengesetzten Effekten interagieren, um das in der Passiv-Vermeidung gemessene Verhalten zu erzeugen. Wenn ein Weg physiologisch aktiver als der andere ist, wird der inaktive Weg präferenziell durch Injektion von Nikotin in Wildtyp-Tiere stimuliert werden, wohingegen der aktivere Weg präferenziell von β2-Gen-Inaktivierung beeinflusst werden wird.
Die obenstehend beschriebenen Experimente demonstrieren, dass nAChRs, welche die β-Untereinheit enthalten, die Effekte von Nikotin auf die Passiv-Vermeidung, eine spezifische Lernaufgabe, vermitteln. Diese Mäuse sehen ein Modellsystem zur Untersuchung der pharmakologischen Effekte von Nikotin im ZNS vor und sind nützlich bei der Aufklärung der Rolle von Hochaffinitäts-nAChRs in kognitiven Prozessen, Nikotinabhängigkeit und Demenz-Formen, an denen Defizite des nikotinischen Systems beteiligt sind.
Bezugsstellen
Jede nachfolgende Bezugstelle ist hierin spezifisch durch den Bezug darauf in dieser Beschreibung einbezogen.

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Claims

Isolierte DNS, umfassend entweder a. einen Promotor der Maus-β2-Untereinheit eines neuronalen nikotinischen Acetylcholin-Rezeptors umfassend die in der 1 dargestellte Sequenz, oder b. eine Nukleinsäure, die an die in der 1 dargestellte Sequenz unter stringenten Bedingungen hybridisiert, oder c. ein Fragment der in der 1 dargestellten Sequenz, wobei die hybridisierende Nukleinsäure, wie in (b) definiert, oder das Fragment, wie in (c) definiert, eine neuronenspezifische Transkription einer DNS-Sequenz in funktionsfähiger Verknüpfung promotet.
Isolierte DNS, umfassend die DNS gemäß Anspruch 1, in funktionfähiger Verknüpfung mit einer Nukleotidsequenz, die für ein Protein, ein Polypeptid oder ein Peptid codiert.
Isolierte DNS gemäß Anspruch 2, worin das Protein, das Polypeptid oder das Peptid ein Reporter-Gen ist.
Isolierte DNS gemäß Anspruch 3, worin das Reporter-Gen IacZ oder Luciferase ist.
Isolierte Nukleinsäure, die zu einer isolierten DNS gemäß Anspruch 1 komplementär ist.
Isolierte DNS gemäß Anspruch 1, die eine Sequenz von Nukleotid –245 bis Nukleotid –95 in der 1 umfaßt.
Isolierte DNS gemäß Anspruch 1, worin die Sequenz die Sequenz von Nukleotid –245 bis Nukleotid –824 in der 1 ist.
Isolierte DNS gemäß Anspruch 1, worin die Sequenz die Sequenz von Nukleotid –135 bis Nukleotid –103 in der 1 ist.
Isolierte DNS gemäß Anspruch 1, worin die Sequenz die Sequenz von Nukleotid +16 bis Nukleotid +36 in der 1 ist.
Isolierte DNS gemäß Anspruch 1, worin die Sequenz die Sequenz von Nukleotid –1125 bis Nukleotid –825 in der 1 ist.
Rekombinanter Vektor, enthaltend die Nukleotidsequenz gemäß Anspruch 1.
Rekombinanter Vektor, enthaltend die Nukleotidsequenz gemäß Anspruch 2.
Transformierter nicht-menschlicher Organismus, enthaltend den Vektor gemäß Anspruch 11 oder Anspruch 12.
Isolierte DNS mit einer Sequenz umfassend die DNS gemäß Anspruch 1 in funktionfähiger Verknüpfung mit einem karzinogenen, onkogenen oder immortalisierenden Gen.
Transgener, nicht-menschlicher Säuger, dessen gesamte Keimzellen und somatische Zellen eine DNS gemäß Anspruch 1 oder 2 enthalten, wobei die DNS in den Säuger oder einen Vorfahren des Säugers in einem embrionalen Stadium eingeführt wurde.
Verfahren zur in vitro Kultur von Säugerzellen, worin die Zellen aus dem Säuger gemäß Anspruch 15 isoliert sind.
Säuger gemäß Anspruch 15, worin der Säuger eine Maus ist.
Verfahren gemäß Anspruch 16, worin der Säuger eine Maus ist.
Plasmid pSA9.
Plasmid pEA5.
Phage λβ2 nAchR.
Nukleinsäuresonde, umfassend die DNS-Sequenz gemäß Anspruch 1.
Makromolekularer Komplex, umfassend eine DNS gemäß Anspruch 1 und ein Protein.
Verfahren zum Assay oder zur Identifizierung von transkriptionell aktiven Proteinen, worin die DNS gemäß Anspruch 1 unter geeigneten Bedingungen mit nukleären Extrakten inkubiert wird.
Verfahren gemäß Anspruch 24, worin die DNS die Sequenz von Oligonukleotid E-D, Mut-E oder S-E ist.
Verfahren zum Isolieren von Neuronen aus nicht-menschlichem Gewebe, umfassend das Bereitstellen eines transgenen Säugers gemäß Anspruch 15, worin das kodierte Protein ein Reporter-Gen ist, das Identifizieren der Neuronen, die das Reporter-Gen exprimieren, und Abtrennen der Neuronen, die das Reporter-Gen exprimieren, von anderen Zellen.
Verfahren zur zielgerichteten Expression eines gewünschten Polypeptids, Proteins oder Proteinprodukts in Neuronen in einem nicht-menschlichen transgenen Säuger, umfassend das Ersetzen des Gens für die β2-Untereinheit eines nikotinischen Acetylcholin-Rezeptors durch die DNS, die für das gewünschte Produkt kodiert, in dem Genom des Säugers mittels homologer Rekombination, wobei das Produkt durch eine DNS-Sequenz kodiert wird.
Säuger gemäß Anspruch 15, worin die in den Säuger oder einen Vorfahren des Säugers eingeführte DNS durch Punktmutation, Deletion, Insertion oder weitere Mittel mutiert wurde, wodurch die Aktivität des neuronalen nikotinischen Acetylcholin-Rezeptors verändert wurde, wie mittels einem biochemischen Assay oder einem Verhaltensassay eines transgenen Säugers gemessen.
Zelllinie, produziert aus dem Säuger gemäß Anspruch 28.
Isolierte DNS, enthaltend einen Promotor der β2-Untereinheit eines neuronalen nikotinischen Acetylcholin-Rezeptors umfassend die in der 1 dargestellte Sequenz, wobei der Promotor durch Punktmutation, Deletion, Insertion oder weitere Mittel mutiert wurde, wodurch die Expression der β2-Untereinheit eines neuronalen nikotinischen Acetylcholin-Rezeptors verändert wurde, wie mittels einem biochemischen Assay oder einem Verhaltensassay in einem transgenen Säuger gemessen.
Isolierte DNS gemäß Anspruch 30, die eine mutierte DNS von Anspruch 1 ist.
Zelllinie, umfassend in ihrem Genom eine fremde Nukleotidsequenz, die der DNS gemäß einem der Ansprüche 1 bis 10 oder 14 entspricht.
Verfahren zum Screenen von Verbindungen auf die Fähigkeit, die Aktivität des neuronalen nikotinischen Acetylcholin-Rezeptors wiederherzustellen oder nachweisbar zu beeinflussen, umfassend die Zugabe der Verbindung zu einer Zelllinie gemäß Anspruch 29 oder Anspruch 32 oder das Einführen der Verbindung in einen Säuger gemäß Anspruch 28.
Isolierte DNS gemäß Anspruch 30, worin die DNS die Expression eines wirksamen nikotinischen Acetylcholin-Rezeptors in einem geeigneten Expressionssystem und Wirt verhindert.
Transgener Säuger gemäß Anspruch 15, der durch Bereitstellen eines ersten Säugers, der eine Wildtyp-DNS oder eine mutierte DNS trägt, und Kreuzen dieses ersten Tieres mit einem zweiten Säuger, der andere und nicht-identische DNS trägt, erzeugt werden kann.