DE19815958C1 - Nicht-menschliches Säugetier sowie Verfahren zu seiner Herstellung und seine Verwendung - Google Patents
Nicht-menschliches Säugetier sowie Verfahren zu seiner Herstellung und seine VerwendungInfo
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Abstract
Die vorliegende Erfindung betrifft ein nicht-menschliches Säugetier, dessen Glukokortikoid-Rezeptor (GR) in seiner induzierenden Funktion verändert ist. Ferner betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Herstellung eines solchen Säugetiers sowie dessen Verwendung zur Testung von Chemikalien, Arzneimitteln und Therapieansätzen.
Description
Die vorliegende Erfindung betrifft ein nicht-menschliches Säugetier, das einen
veränderten Glukokortikoid-Rezeptor aufweist. Ferner betrifft die Erfindung ein
Verfahren zur Herstellung eines solchen Säugetiers sowie dessen Verwendung
zur Testung von Chemikalien, Arzneimitteln und Therapieansätzen.
Der Glukokortikoid-Rezeptor (nachstehend mit GR bezeichnet) ist ein in vielen
Zellen vorliegender Rezeptor, der durch Bindung von Glukokortikoiden aktiviert
wird. In dieser Form induziert GR die Expression von Zielgenen. Solche sind z. B.
Gene, deren Produkte in der Glukoneogenese, der Proliferation von Erythrozyten-
Vorläuferzellen oder der Apoptose von Thymozyten eine Rolle spielen. Anderer
seits reprimiert aktivierter GR auch die Expression von Zielgenen. Solche sind
z. B. Gene, die von AP1, wie Kollagenase-Gen, oder NFKB aktiviert werden.
Es wird angedacht, selektiv in die Funktionen von GR einzugreifen. Insbesondere
scheint die reprimierende Funktion hierfür interessant zu sein, da sie eine mögli
che Ansatzstelle für das Eingreifen in die verschiedensten Erkrankungen gibt.
Solche Erkrankungen sind z. B. Störungen der Akut-Phase-Reaktion, septischer
Schock, akutes Atemnot-Syndrom, Autoimmunerkrankungen, wie rheumatoide
Arthritis oder multiple Sklerose, neuropsychiatrische Erkrankungen, Erkrankun
gen der Hypothalamus-Hypophysen-Nebennieren-Achse, Osteoporose, Diabetes,
Steroid-Myopathie oder Hauterkrankungen.
Der vorliegenden Erfindung liegt daher die Aufgabe zugrunde, ein Mittel bereitzu
stellen, mit dem selektiv die reprimierende Funktion von GR untersucht und
gegebenenfalls in sie eingegriffen werden kann.
Erfindungsgemäß wird dies durch die Gegenstände in den Patentansprüchen
erreicht.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist somit ein nicht-menschliches Säuge
tier, dessen GR in seiner induzierenden Funktion verändert ist. Insbesondere ist
die induzierende Funktion ausgeschaltet.
Die vorliegende Erfindung beruht auf der Erkenntnis, daß die
einzelnen Funktionen von GR getrennt voneinander verändert werden können.
Es wurde gefunden, daß die induzierende Funktion von GR verändert, insbesondere
ausgeschaltet werden kann, ohne daß hiervon die reprimierende Funktion betrof
fen wird. Ferner wurde erkannt, daß die induzierende Funktion von GR mit seiner
Dimerisierung bzw. DNA-Bindung zusammenhängt und durch Mutation dieser,
z. B. im D-Loop von GR, insbesondere durch die Punktmutation A 458 T, die
induzierende Funktion von GR verändert, insbesondere ausgeschaltet werden
kann. Die Erkenntnisse wurden durch eine transgene Maus erhalten,
deren GR in seiner induzierenden Funktion verändert ist.
Erfindungsgemäß werden die Erkenntnisse genutzt, ein nicht-
menschliches Säugetier bereitzustellen, dessen GR in seiner induzierenden
Funktion verändert, insbesondere diese ausgeschaltet ist.
Der Ausdruck "nicht-menschliches Säugetier" umfaßt jegliches Säugetier,
dessen GR in seiner induzierenden Funktion verändert sein kann. Beispiele
solcher Säugetiere sind Maus, Ratte, Kaninchen, Pferd, Rind, Schaf, Ziege, Affe,
Schwein, Hund und Katze, wobei Maus bevorzugt ist.
Der Ausdruck "GR, dessen induzierende Funktion verändert, insbesondere ausge
schaltet ist" umfaßt einen GR eines nicht-menschliches Säugetiers, dessen repri
mierende Funktion unverändert ist, das aber eine Veränderung in der induzieren
den Funktion aufweist. Vorzugsweise ist die induzierende Funktion ausgeschal
tet. Dies kann z. B. dadurch erreicht werden, daß die Dimerisierung von GR bzw.
seine DNA-Bindung mutiert wird. Solches wird z. B. durch eine Mutation im D-
Loop von GR, insbesondere durch die Punktmutation A 458 T erzielt.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind Zellen, die aus dem
vorstehenden nicht-menschlichen Säugetier erhalten werden. Diese Zellen
können in jeglicher Form vorliegen, z. B. in einer Primär- oder Langzeit-Kultur.
Ein erfindungsgemäßes nicht-menschliches Säugetier kann durch übliche Ver
fahren bereitgestellt werden. Günstig ist ein Verfahren, das folgende Schritte
umfaßt:
- a) Transfektion von embryonalen Stammzellen eines nicht-menschlichen Säugetiers mit einem Vektor, der eine Rekombination zwischen der für die induzierende Funktion von GR kodierenden DNA der embryonalen Stamm zellen und einer entsprechenden mutierten DNA des Vektors ermöglicht,
- b) Isolierung von in (a) stabil transfizierten Zellen und Einbringung dieser in weibliche Tiere eines nicht-menschlichen Säugetiers, sowie
- c) Analyse der in (b) erhaltenen Nachkommen auf einen GR, dessen indu zierende Funktion verändert, insbesondere ausgeschaltet ist.
Für die Ausdrücke "nicht-menschliches Säugetier" und "GR, dessen induzierende
Funktion verändert, insbesondere ausgeschaltet ist" gelten die vorstehenden
Ausführungen entsprechend.
Ferner betrifft der Ausdruck "embryonale Stammzellen" jegliche embryonalen
Stammzellen eines nicht-menschlichen Säugetiers, die sich zur Mutierung der für
die induzierende Funktion von GR kodierenden DNA eignen. Vorzugsweise sind
die embryonalen Stammzellen von der Maus, insbesondere die Zellen E14/1.
Der Ausdruck "Vektor" umfaßt jeglichen Vektor, der durch Rekombination mit
der DNA von embryonalen Stammzellen eine Veränderung der für die induzieren
de Funktion von GR kodierenden DNA ermöglicht. Vorzugsweise ist die Ver
änderung dergestalt, daß die induzierende Funktion von GR ausgeschaltet ist.
Günstig ist es, wenn der Vektor eine DNA aufweist, die eine Mutation in einem
Bereich trägt, der für die Dimerisierung von GR bzw. seine DNA-Bindung not
wendig ist. Insbesondere kann die Mutation in einem Bereich liegen, der für den
D-Loop von GR kodiert. Ganz besonders kann die Mutation die Punktmutation A
458 T sein. Ferner ist es günstig, wenn der Vektor einen Marker aufweist, mit
dem auf vorhandene Stammzellen selektioniert werden kann, in denen die
gewünschte Rekombination erfolgt ist. Ein solcher Marker ist z. B. die IoxP/tkneo-
Cassette, die mit Hilfe des Cre/IoxP-Systems wieder aus dem Genom entfernt
werden kann. Ein vorstehender Vektor ist ebenfalls Gegenstand der vorliegenden
Erfindung. Ein solcher Vektor, d. h. der Vektor von Beispiel 1 bzw. Fig. 1 wurde,
bei der DSMZ als pmGR2-tr unter DSM 12026 am 19. Februar 1998 hinterlegt.
Desweiteren kennt der Fachmann Bedingungen und Materialien, um die Schritte
(a)-(c) durchzuführen. Hinsichtlich der Analyse in (c) wird er z. B. an Verfahren
denken, mit denen er nachweisen kann, daß die Induzierung von Genen abge
schwächt bzw. verhindert ist, deren Produkte in der Glukoneogenese, der
Proliferation von Erythrozyten-Vorläuferzellen oder der Apoptose von Thymozy
ten eine Rolle spielen. Solche Verfahren werden nachstehend in den Beispielen
beschrieben.
Mit der vorliegenden Erfindung wird ein nicht-menschliches Säugetier bereitge
stellt, dessen GR in seiner induzierenden Funktion verändert ist. Diese Verände
rung kann ein Ausschalten der induzierenden Funktion sein. Mit einem solchen
Säugetier bzw. Zellen daraus kann selektiv die reprimierende Funktion von GR
untersucht werden. Ferner ist es hiermit möglich, Substanzen, Arzneimittel und
Therapieansätze zu finden, mit denen selektiv auf die reprimierende Funktion von
GR eingewirkt werden kann. Daher Liefert die vorliegende Erfindung eine Basis,
um auf die verschiedensten Erkrankungen einzuwirken. Solche Erkrankungen
sind z. B. Störungen der Akut-Phase-Reaktion, septischer Schock, akutes Atem
not-Syndrom, Autoimmunerkrankungen, wie rheumatoide Arthritis oder multiple
Sklerose, neuropsychiatrische Erkrankungen, Erkrankungen der Hypothalamus-
Hypophysen-Nebennieren-Achse, Osteoporose, Diabetes, Steroid-Myopathie
oder Hauterkrankungen.
Fig. 1 zeigt die Einführung der Punktmutation A 485 T in GR. In (a) wird
die Aminosäuresequenz des zweiten Zinkfingers in der DNA-Bin
dungsdomäne von GR angegeben. Der Austausch von Alanin 458
zu Threonin ist angegeben. In (b) wird die Strategie für die Rekom
bination angegeben. Die Sterne markieren die Position der Punkt
mutation. Der modifizierte Locus repräsentiert die Struktur des GR-
Locus nach Rekombination, der End-Locus die Struktur nach der
zusätzlichen Rekombination der zwei IoxP-Stellen (Dreiecke) durch
Cre-Rekombinase. In (c) wird der Genotyp durch PCR angegeben.
Ein 240 Basenpaar-Fragment wird unter der Verwendung der in (b)
durch Pfeile angegebenen Primer amplifiziert und durch das Restrik
tionsenzym BsrG1 gespalten, für das eine neue Erkennungsstelle
durch die Punktmutation eingeführt worden ist. Die zwei 120 bp-
Fragmente, die durch die Punktmutation geschaffen worden sind,
werden von dem ungeschnittenen Fragment durch Gelelektrophore
se unterschieden. In (d) wird ein Sequenzvergleich angegeben.
Gehirn-RNA wird durch RT-PCR amplifiziert, wobei Primer verwen
det werden, deren Sequenzen in den Exons 3 und 5 von GR vor
liegen. Die erhaltenen Fragmente werden subkloniert und sequen
ziert. Die zwei mutierten Basen sind angegeben.
Fig. 2 zeigt den Vergleich zwischen einer erfindungsgemäßen Maus und
einer Wildtyp-Maus hinsichtlich der induzierenden Funktion von GR.
In (a) wird die Induzierung von Tyrosinaminotransferase (TAT)
angegeben. Dexamethason wird in eine erfindungsgemäße Maus
und in eine Wildtyp-Maus injiziert und Leber-mRNA-Expression von
TAT bzw. β-Aktin als Kontrolle wird durch Northern Blot analysiert.
In (b) wird die Induzierung der Proliferation von Erythrozyten-Vor
läuferzellen angegeben. Erythrozyten-Vorläuferzellen werden isoliert
und kultiviert. Kumulative Zell-Zahlen werden bestimmt. In (c) wird
die Induzierung der Apoptose von Thymozyten angegeben. Der
Prozentsatz von lebensfähigen Zellen nach Behandlung mit Dexa
methason (schraffierte Balken) oder in Kontrollen (ausgefüllte Bal
ken) sind angegeben.
Fig. 3 zeigt die Inhibierung der AP-1 bedingten Reprimierung des Kollage
nase-Gens. Primäre Fibroblasten werden mit Dexamethason (Dex),
TPA, oder beidem behandelt und mRNA-Mengen von MMP-13
(Maus-Kollagenase-3) und GAPDH als Kontrolle werden durch
Northern Blot analysiert.
Die Erfindung wird durch die nachstehenden Beispiele erläutert
Es wird ein nicht-menschliches Säugetier bereitgestellt, dessen GR in seiner
induzierenden Funktion ausgeschaltet ist. Hierzu wird ein Vektor verwendet, der
ca. 11 kb des GR-Gens, einschließlich der Exons 3 und 4 aufweist. Ferner weist
der Vektor in Exon 4 eine Punktmutation auf, wodurch der hierdurch kodierte GR
an der Position 458 anstelle von Alanin Threonin aufweist. Desweiteren umfaßt
der Vektor eine IoxP-tkneo-Selektionscassette (vgl. Fig. 1).
Dieser Vektor wird durch Elektroporation in die embryonalen Maus-Stammzellen
E14/1 eingeführt. Stabil transfizierte Zellen werden durch Selektion mit 350
µg/ml G418 erhalten. Diese Zellen werden einer transienten Transfektion mit 20
µg eines Cre-Expressionsplasmids unterzogen, bevor ihnen 1 µM Gancyclovir
zugegeben wird. Damit wird auf Zellen selektioniert, welche die Selektions
cassette verloren haben. Diese Zellen weisen im GR-Gen die angegebene Punkt
mutation und zusätzlich ca. 50 Basenpaare entlang der verbliebenen Iox P-Stelle
im Intron 3 auf.
Letztere Zellen werden in Maus-Blastozysten injiziert und diese dann in weibliche
Mäuse eingeführt. Es werden chimäre Mäuse erhalten, aus denen durch Verpaa
rung heterozygote und homozygote Mäuse gewonnen werden.
Es wird das in Beispiel 1 bereitgestellte nicht-menschliche Säugetier verwendet.
Dieses wird in Testversuche eingesetzt, die spezifisch für die einzelnen Funktio
nen von GR sind.
Einer erfindungsgemäßen Maus und einer Wildtyp-Maus werden jeweils 10
µg/100 g Dexamethason bzw. PBS injiziert. Nach zwei Stunden werden die Tiere
getötet. Leber-RNA wird isoliert und die mRNA-Expression von Tyrosinamino
transferase (TAT) bzw. von β-Aktin als Kontrolle wird in einem Northern-Blot
bestimmt (vgl. Fig. 2a).
Es zeigt sich, daß eine Wildtyp-Maus, nicht aber eine erfindungsgemäße Maus
eine TAT mRNA induzieren kann.
Aus einem erfindungsgemäßen Maus- und einem Wildtyp-Mausembryo wird
jeweils fötale Leber isoliert und in Einzelzellen dispergiert. Diese werden dann in
modifiziertem CFU-E-Medium, das SCF, hEpo, IGF-1 und Dexamethason enthält,
vermehrt. Eine Wachstumskinetik wird erstellt, indem täglich die Zellen unter
Verwendung eines elektronischen Zellzählers gezählt werden (vgl. Fig. 2b).
Es zeigt sich, daß eine Wildtyp-Maus, nicht aber eine erfindungsgemäße Maus
die Proliferation von Erythrozyten-Vorläuferzellen induzieren kann.
Aus einer 6-12 Wochen alten erfindungsgemäßen Maus und einer entsprechend
alten Wildtyp-Maus werden jeweils Thymozyten isoliert und in RPMI-Medium 24
Stunden in Gegenwart bzw. Abwesenheit von Dexamethason (10-6 M) kultiviert.
Die Zellen werden dann mit Propidiumjodid gefärbt und auf ihre Fluoreszenz
intensität mittels FACS analysiert. Der Verlust an DNA-Gehalt wird als Maß für
Apoptose genommen.
Es zeigt sich, daß eine Wildtyp-Maus, nicht aber eine erfindungsgemäße Maus
die Apoptose von Thymozyten induzieren kann.
Primäre Fibroblasten werden aus Embryonen einer erfindungsgemäßen Maus und
einer Wildtyp-Maus isoliert. Die Fibroblasten werden 6 Stunden mit 10-6 M
Dexamethason, 10-7 M TPA oder beidem behandelt, bevor RNA isoliert und die
mRNA-Expression von MMP-13(Maus-Kollagenase 3-Gen) und von GAPDH als
Kontrolle in einem Northern-Blot bestimmt werden (vgl. Fig. 3).
Es zeigt sich, daß eine Wildtyp-Maus und auch eine erfindungsgemäße Maus die
AP1-bedingte Aktivierung des Kollagenase-Gens inhibieren können.
Somit wird deutlich, daß ein erfindungsgemäßes Säugetier, z. B. eine Maus,
einen GR exprimiert, bei dem die reprimierende Funktion erhalten, die induzieren
de Funktion allerdings verändert, insbesondere ausgeschaltet ist.
Claims (10)
1. Nicht-menschliches Säugetier, dessen Glukokortikoid-Rezeptor (GR) in
seiner induzierenden Funktion verändert ist.
2. Nicht-menschliches Säugetier nach Anspruch 1, wobei die induzierende
Funktion ausgeschaltet ist.
3. Nicht-menschliches Säugetier nach Anspruch 1 oder 2, wobei GR in
seiner Dimerisierung bzw. DNA-Bindung mutiert ist.
4. Nicht-menschliches Säugetier nach einem der Ansprüche 1-3, wobei GR
an der Position 458 ein Threonin aufweist.
5. Verfahren zur Bereitstellung eines nicht-menschlichen Säugetiers nach
einem der Ansprüche 1-4, umfassend die folgenden Schritte:
- a) Transfektion von embryonalen Stammzellen eines nicht-mensch lichen Säugetiers mit einem Vektor, der eine Rekombination zwi schen der für die induzierende Funktion von GR kodierenden DNA der embryonalen Stammzellen und einer entsprechenden mutierten DNA des Vektors ermöglicht,
- b) Isolierung von in (a) stabil transfizierten Zellen und Einbringung dieser in weibliche Tiere eines nicht-menschlichen Säugetiers, sowie
- c) Analyse der in (b) erhaltenen Nachkommen auf einen GR, dessen induzierende Funktion verändert ist.
6. Verfahren nach Anspruch 5, wobei die induzierende Funktion ausgeschal
tet ist.
7. Verfahren nach Anspruch 6, wobei GR in seiner Dimerisierung bzw. DNA-
Bindung mutiert ist.
8. Verfahren nach einem der Ansprüche 5-7, wobei GR an der Position 458
ein Threonin aufweist.
9. Verwendung eines nicht-menschlichen Säugetiers nach einem der An
sprüche 1-4 zur Testung von Substanzen, Arzneimitteln und/oder Thera
pieansätzen hinsichtlich der reprimierenden Funktion von GR.
10. Verwendung nach Anspruch 9, wobei die Substanzen, Arzneimittel und/-
oder Therapieansätze hinsichtlich Störungen der Akut-Phase-Reaktion,
eines septischen Schocks, eines akuten Atemnot-Syndroms, Autoimm
unerkrankungen, wie rheumatoide Arthritis oder multiple Sklerose, neuro
psychiatrischen Erkrankungen, Erkrankungen der Hypothalamus-Hypophy
sen-Nebennieren-Achse, Osteoporose, Diabetes, Steroid-Myopathie oder
Hauterkrankungen zu verstehen sind.
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| 8100 | Publication of the examined application without publication of unexamined application | ||
| D1 | Grant (no unexamined application published) patent law 81 | ||
| 8363 | Opposition against the patent | ||
| 8368 | Opposition refused due to inadmissibility | ||
| 8339 | Ceased/non-payment of the annual fee |