DE19815958C1 - Nicht-menschliches Säugetier sowie Verfahren zu seiner Herstellung und seine Verwendung - Google Patents
Nicht-menschliches Säugetier sowie Verfahren zu seiner Herstellung und seine VerwendungInfo
- Publication number
- DE19815958C1 DE19815958C1 DE1998115958 DE19815958A DE19815958C1 DE 19815958 C1 DE19815958 C1 DE 19815958C1 DE 1998115958 DE1998115958 DE 1998115958 DE 19815958 A DE19815958 A DE 19815958A DE 19815958 C1 DE19815958 C1 DE 19815958C1
- Authority
- DE
- Germany
- Prior art keywords
- human mammal
- function
- dna
- cells
- vector
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Fee Related
Links
- 102000003676 Glucocorticoid Receptors Human genes 0.000 title claims abstract description 13
- 108090000079 Glucocorticoid Receptors Proteins 0.000 title claims abstract description 13
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 title claims description 8
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 claims description 25
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 20
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 claims description 13
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims description 9
- 210000001671 embryonic stem cell Anatomy 0.000 claims description 8
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 8
- 208000035475 disorder Diseases 0.000 claims description 7
- 230000006798 recombination Effects 0.000 claims description 7
- 238000005215 recombination Methods 0.000 claims description 7
- 201000010099 disease Diseases 0.000 claims description 6
- 230000004568 DNA-binding Effects 0.000 claims description 5
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 claims description 5
- 238000006471 dimerization reaction Methods 0.000 claims description 5
- AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N Threonine Natural products CC(O)C(N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 239000004473 Threonine Substances 0.000 claims description 4
- 238000013459 approach Methods 0.000 claims description 4
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims description 4
- 239000000126 substance Substances 0.000 claims description 4
- 206010048998 Acute phase reaction Diseases 0.000 claims description 3
- 201000009623 Myopathy Diseases 0.000 claims description 3
- 208000001132 Osteoporosis Diseases 0.000 claims description 3
- 206010040070 Septic Shock Diseases 0.000 claims description 3
- 230000001154 acute effect Effects 0.000 claims description 3
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 claims description 3
- 206010012601 diabetes mellitus Diseases 0.000 claims description 3
- 229940079593 drug Drugs 0.000 claims description 3
- 201000006417 multiple sclerosis Diseases 0.000 claims description 3
- 206010039073 rheumatoid arthritis Diseases 0.000 claims description 3
- 230000036303 septic shock Effects 0.000 claims description 3
- 208000017520 skin disease Diseases 0.000 claims description 3
- 208000011580 syndromic disease Diseases 0.000 claims description 3
- 238000012360 testing method Methods 0.000 claims description 3
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 claims description 3
- 208000000059 Dyspnea Diseases 0.000 claims description 2
- 206010013975 Dyspnoeas Diseases 0.000 claims description 2
- 238000002955 isolation Methods 0.000 claims description 2
- 208000013220 shortness of breath Diseases 0.000 claims description 2
- 238000001890 transfection Methods 0.000 claims description 2
- 125000000341 threoninyl group Chemical group [H]OC([H])(C([H])([H])[H])C([H])(N([H])[H])C(*)=O 0.000 claims 2
- 208000021642 Muscular disease Diseases 0.000 claims 1
- 241000011102 Thera Species 0.000 claims 1
- 230000002267 hypothalamic effect Effects 0.000 claims 1
- 208000020016 psychiatric disease Diseases 0.000 claims 1
- 230000001718 repressive effect Effects 0.000 claims 1
- 150000003431 steroids Chemical class 0.000 claims 1
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 26
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 13
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 7
- 102000016540 Tyrosine aminotransferases Human genes 0.000 description 6
- 108010042606 Tyrosine transaminase Proteins 0.000 description 6
- 229960003957 dexamethasone Drugs 0.000 description 6
- UREBDLICKHMUKA-CXSFZGCWSA-N dexamethasone Chemical compound C1CC2=CC(=O)C=C[C@]2(C)[C@]2(F)[C@@H]1[C@@H]1C[C@@H](C)[C@@](C(=O)CO)(O)[C@@]1(C)C[C@@H]2O UREBDLICKHMUKA-CXSFZGCWSA-N 0.000 description 6
- 210000003743 erythrocyte Anatomy 0.000 description 6
- 230000000754 repressing effect Effects 0.000 description 6
- 210000000130 stem cell Anatomy 0.000 description 6
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 5
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 5
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 5
- 238000000636 Northern blotting Methods 0.000 description 4
- 230000006907 apoptotic process Effects 0.000 description 4
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 4
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 3
- 108060005980 Collagenase Proteins 0.000 description 3
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 3
- 230000002349 favourable effect Effects 0.000 description 3
- 210000002950 fibroblast Anatomy 0.000 description 3
- 230000004110 gluconeogenesis Effects 0.000 description 3
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 3
- 108010085238 Actins Proteins 0.000 description 2
- 102000007469 Actins Human genes 0.000 description 2
- 208000023275 Autoimmune disease Diseases 0.000 description 2
- 102100027995 Collagenase 3 Human genes 0.000 description 2
- 108050005238 Collagenase 3 Proteins 0.000 description 2
- 108700024394 Exon Proteins 0.000 description 2
- 101150047053 GR gene Proteins 0.000 description 2
- 102100031181 Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase Human genes 0.000 description 2
- QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N L-alanine Chemical compound C[C@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N 0.000 description 2
- 101000577888 Mus musculus Collagenase 3 Proteins 0.000 description 2
- 108010018242 Transcription Factor AP-1 Proteins 0.000 description 2
- 102100023132 Transcription factor Jun Human genes 0.000 description 2
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 2
- 235000004279 alanine Nutrition 0.000 description 2
- 108020004445 glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase Proteins 0.000 description 2
- 230000004179 hypothalamic–pituitary–adrenal axis Effects 0.000 description 2
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 2
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 2
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 1
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 1
- 241000282693 Cercopithecidae Species 0.000 description 1
- 102000008186 Collagen Human genes 0.000 description 1
- 108010035532 Collagen Proteins 0.000 description 1
- 108010051219 Cre recombinase Proteins 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 241000283073 Equus caballus Species 0.000 description 1
- 241000282326 Felis catus Species 0.000 description 1
- 206010064571 Gene mutation Diseases 0.000 description 1
- 108090000723 Insulin-Like Growth Factor I Proteins 0.000 description 1
- 102000004218 Insulin-Like Growth Factor I Human genes 0.000 description 1
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 1
- 241001494479 Pecora Species 0.000 description 1
- 241000009328 Perro Species 0.000 description 1
- 239000012979 RPMI medium Substances 0.000 description 1
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 1
- 241000282898 Sus scrofa Species 0.000 description 1
- HCHKCACWOHOZIP-UHFFFAOYSA-N Zinc Chemical compound [Zn] HCHKCACWOHOZIP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 description 1
- 230000027455 binding Effects 0.000 description 1
- 210000002459 blastocyst Anatomy 0.000 description 1
- 210000004556 brain Anatomy 0.000 description 1
- 229920001436 collagen Polymers 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 230000001186 cumulative effect Effects 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 210000002257 embryonic structure Anatomy 0.000 description 1
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 1
- 210000003013 erythroid precursor cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000013613 expression plasmid Substances 0.000 description 1
- 230000001605 fetal effect Effects 0.000 description 1
- 238000001943 fluorescence-activated cell sorting Methods 0.000 description 1
- IRSCQMHQWWYFCW-UHFFFAOYSA-N ganciclovir Chemical compound O=C1NC(N)=NC2=C1N=CN2COC(CO)CO IRSCQMHQWWYFCW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960002963 ganciclovir Drugs 0.000 description 1
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 239000003862 glucocorticoid Substances 0.000 description 1
- 230000006882 induction of apoptosis Effects 0.000 description 1
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 1
- 210000001161 mammalian embryo Anatomy 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 1
- XJMOSONTPMZWPB-UHFFFAOYSA-M propidium iodide Chemical compound [I-].[I-].C12=CC(N)=CC=C2C2=CC=C(N)C=C2[N+](CCC[N+](C)(CC)CC)=C1C1=CC=CC=C1 XJMOSONTPMZWPB-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 1
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 1
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 1
- 238000003757 reverse transcription PCR Methods 0.000 description 1
- 229940037128 systemic glucocorticoids Drugs 0.000 description 1
- 230000026727 thymocyte apoptotic process Effects 0.000 description 1
- 238000011830 transgenic mouse model Methods 0.000 description 1
- 238000003146 transient transfection Methods 0.000 description 1
- 239000011701 zinc Substances 0.000 description 1
- 229910052725 zinc Inorganic materials 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
- C12N15/8509—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells for producing genetically modified animals, e.g. transgenic
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
- A01K67/00—Rearing or breeding animals, not otherwise provided for; New or modified breeds of animals
- A01K67/027—New or modified breeds of vertebrates
- A01K67/0275—Genetically modified vertebrates, e.g. transgenic
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
- C07K14/72—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants for hormones
- C07K14/721—Steroid/thyroid hormone superfamily, e.g. GR, EcR, androgen receptor, oestrogen receptor
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
- A01K2217/00—Genetically modified animals
- A01K2217/05—Animals comprising random inserted nucleic acids (transgenic)
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
- A01K2227/00—Animals characterised by species
- A01K2227/10—Mammal
- A01K2227/105—Murine
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
- A01K2267/00—Animals characterised by purpose
- A01K2267/03—Animal model, e.g. for test or diseases
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2800/00—Nucleic acids vectors
- C12N2800/30—Vector systems comprising sequences for excision in presence of a recombinase, e.g. loxP or FRT
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Environmental Sciences (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Animal Husbandry (AREA)
- Biodiversity & Conservation Biology (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Endocrinology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Immunology (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
Abstract
Die vorliegende Erfindung betrifft ein nicht-menschliches Säugetier, dessen Glukokortikoid-Rezeptor (GR) in seiner induzierenden Funktion verändert ist. Ferner betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Herstellung eines solchen Säugetiers sowie dessen Verwendung zur Testung von Chemikalien, Arzneimitteln und Therapieansätzen.
Description
Die vorliegende Erfindung betrifft ein nicht-menschliches Säugetier, das einen
veränderten Glukokortikoid-Rezeptor aufweist. Ferner betrifft die Erfindung ein
Verfahren zur Herstellung eines solchen Säugetiers sowie dessen Verwendung
zur Testung von Chemikalien, Arzneimitteln und Therapieansätzen.
Der Glukokortikoid-Rezeptor (nachstehend mit GR bezeichnet) ist ein in vielen
Zellen vorliegender Rezeptor, der durch Bindung von Glukokortikoiden aktiviert
wird. In dieser Form induziert GR die Expression von Zielgenen. Solche sind z. B.
Gene, deren Produkte in der Glukoneogenese, der Proliferation von Erythrozyten-
Vorläuferzellen oder der Apoptose von Thymozyten eine Rolle spielen. Anderer
seits reprimiert aktivierter GR auch die Expression von Zielgenen. Solche sind
z. B. Gene, die von AP1, wie Kollagenase-Gen, oder NFKB aktiviert werden.
Es wird angedacht, selektiv in die Funktionen von GR einzugreifen. Insbesondere
scheint die reprimierende Funktion hierfür interessant zu sein, da sie eine mögli
che Ansatzstelle für das Eingreifen in die verschiedensten Erkrankungen gibt.
Solche Erkrankungen sind z. B. Störungen der Akut-Phase-Reaktion, septischer
Schock, akutes Atemnot-Syndrom, Autoimmunerkrankungen, wie rheumatoide
Arthritis oder multiple Sklerose, neuropsychiatrische Erkrankungen, Erkrankun
gen der Hypothalamus-Hypophysen-Nebennieren-Achse, Osteoporose, Diabetes,
Steroid-Myopathie oder Hauterkrankungen.
Der vorliegenden Erfindung liegt daher die Aufgabe zugrunde, ein Mittel bereitzu
stellen, mit dem selektiv die reprimierende Funktion von GR untersucht und
gegebenenfalls in sie eingegriffen werden kann.
Erfindungsgemäß wird dies durch die Gegenstände in den Patentansprüchen
erreicht.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist somit ein nicht-menschliches Säuge
tier, dessen GR in seiner induzierenden Funktion verändert ist. Insbesondere ist
die induzierende Funktion ausgeschaltet.
Die vorliegende Erfindung beruht auf der Erkenntnis, daß die
einzelnen Funktionen von GR getrennt voneinander verändert werden können.
Es wurde gefunden, daß die induzierende Funktion von GR verändert, insbesondere
ausgeschaltet werden kann, ohne daß hiervon die reprimierende Funktion betrof
fen wird. Ferner wurde erkannt, daß die induzierende Funktion von GR mit seiner
Dimerisierung bzw. DNA-Bindung zusammenhängt und durch Mutation dieser,
z. B. im D-Loop von GR, insbesondere durch die Punktmutation A 458 T, die
induzierende Funktion von GR verändert, insbesondere ausgeschaltet werden
kann. Die Erkenntnisse wurden durch eine transgene Maus erhalten,
deren GR in seiner induzierenden Funktion verändert ist.
Erfindungsgemäß werden die Erkenntnisse genutzt, ein nicht-
menschliches Säugetier bereitzustellen, dessen GR in seiner induzierenden
Funktion verändert, insbesondere diese ausgeschaltet ist.
Der Ausdruck "nicht-menschliches Säugetier" umfaßt jegliches Säugetier,
dessen GR in seiner induzierenden Funktion verändert sein kann. Beispiele
solcher Säugetiere sind Maus, Ratte, Kaninchen, Pferd, Rind, Schaf, Ziege, Affe,
Schwein, Hund und Katze, wobei Maus bevorzugt ist.
Der Ausdruck "GR, dessen induzierende Funktion verändert, insbesondere ausge
schaltet ist" umfaßt einen GR eines nicht-menschliches Säugetiers, dessen repri
mierende Funktion unverändert ist, das aber eine Veränderung in der induzieren
den Funktion aufweist. Vorzugsweise ist die induzierende Funktion ausgeschal
tet. Dies kann z. B. dadurch erreicht werden, daß die Dimerisierung von GR bzw.
seine DNA-Bindung mutiert wird. Solches wird z. B. durch eine Mutation im D-
Loop von GR, insbesondere durch die Punktmutation A 458 T erzielt.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind Zellen, die aus dem
vorstehenden nicht-menschlichen Säugetier erhalten werden. Diese Zellen
können in jeglicher Form vorliegen, z. B. in einer Primär- oder Langzeit-Kultur.
Ein erfindungsgemäßes nicht-menschliches Säugetier kann durch übliche Ver
fahren bereitgestellt werden. Günstig ist ein Verfahren, das folgende Schritte
umfaßt:
- a) Transfektion von embryonalen Stammzellen eines nicht-menschlichen Säugetiers mit einem Vektor, der eine Rekombination zwischen der für die induzierende Funktion von GR kodierenden DNA der embryonalen Stamm zellen und einer entsprechenden mutierten DNA des Vektors ermöglicht,
- b) Isolierung von in (a) stabil transfizierten Zellen und Einbringung dieser in weibliche Tiere eines nicht-menschlichen Säugetiers, sowie
- c) Analyse der in (b) erhaltenen Nachkommen auf einen GR, dessen indu zierende Funktion verändert, insbesondere ausgeschaltet ist.
Für die Ausdrücke "nicht-menschliches Säugetier" und "GR, dessen induzierende
Funktion verändert, insbesondere ausgeschaltet ist" gelten die vorstehenden
Ausführungen entsprechend.
Ferner betrifft der Ausdruck "embryonale Stammzellen" jegliche embryonalen
Stammzellen eines nicht-menschlichen Säugetiers, die sich zur Mutierung der für
die induzierende Funktion von GR kodierenden DNA eignen. Vorzugsweise sind
die embryonalen Stammzellen von der Maus, insbesondere die Zellen E14/1.
Der Ausdruck "Vektor" umfaßt jeglichen Vektor, der durch Rekombination mit
der DNA von embryonalen Stammzellen eine Veränderung der für die induzieren
de Funktion von GR kodierenden DNA ermöglicht. Vorzugsweise ist die Ver
änderung dergestalt, daß die induzierende Funktion von GR ausgeschaltet ist.
Günstig ist es, wenn der Vektor eine DNA aufweist, die eine Mutation in einem
Bereich trägt, der für die Dimerisierung von GR bzw. seine DNA-Bindung not
wendig ist. Insbesondere kann die Mutation in einem Bereich liegen, der für den
D-Loop von GR kodiert. Ganz besonders kann die Mutation die Punktmutation A
458 T sein. Ferner ist es günstig, wenn der Vektor einen Marker aufweist, mit
dem auf vorhandene Stammzellen selektioniert werden kann, in denen die
gewünschte Rekombination erfolgt ist. Ein solcher Marker ist z. B. die IoxP/tkneo-
Cassette, die mit Hilfe des Cre/IoxP-Systems wieder aus dem Genom entfernt
werden kann. Ein vorstehender Vektor ist ebenfalls Gegenstand der vorliegenden
Erfindung. Ein solcher Vektor, d. h. der Vektor von Beispiel 1 bzw. Fig. 1 wurde,
bei der DSMZ als pmGR2-tr unter DSM 12026 am 19. Februar 1998 hinterlegt.
Desweiteren kennt der Fachmann Bedingungen und Materialien, um die Schritte
(a)-(c) durchzuführen. Hinsichtlich der Analyse in (c) wird er z. B. an Verfahren
denken, mit denen er nachweisen kann, daß die Induzierung von Genen abge
schwächt bzw. verhindert ist, deren Produkte in der Glukoneogenese, der
Proliferation von Erythrozyten-Vorläuferzellen oder der Apoptose von Thymozy
ten eine Rolle spielen. Solche Verfahren werden nachstehend in den Beispielen
beschrieben.
Mit der vorliegenden Erfindung wird ein nicht-menschliches Säugetier bereitge
stellt, dessen GR in seiner induzierenden Funktion verändert ist. Diese Verände
rung kann ein Ausschalten der induzierenden Funktion sein. Mit einem solchen
Säugetier bzw. Zellen daraus kann selektiv die reprimierende Funktion von GR
untersucht werden. Ferner ist es hiermit möglich, Substanzen, Arzneimittel und
Therapieansätze zu finden, mit denen selektiv auf die reprimierende Funktion von
GR eingewirkt werden kann. Daher Liefert die vorliegende Erfindung eine Basis,
um auf die verschiedensten Erkrankungen einzuwirken. Solche Erkrankungen
sind z. B. Störungen der Akut-Phase-Reaktion, septischer Schock, akutes Atem
not-Syndrom, Autoimmunerkrankungen, wie rheumatoide Arthritis oder multiple
Sklerose, neuropsychiatrische Erkrankungen, Erkrankungen der Hypothalamus-
Hypophysen-Nebennieren-Achse, Osteoporose, Diabetes, Steroid-Myopathie
oder Hauterkrankungen.
Fig. 1 zeigt die Einführung der Punktmutation A 485 T in GR. In (a) wird
die Aminosäuresequenz des zweiten Zinkfingers in der DNA-Bin
dungsdomäne von GR angegeben. Der Austausch von Alanin 458
zu Threonin ist angegeben. In (b) wird die Strategie für die Rekom
bination angegeben. Die Sterne markieren die Position der Punkt
mutation. Der modifizierte Locus repräsentiert die Struktur des GR-
Locus nach Rekombination, der End-Locus die Struktur nach der
zusätzlichen Rekombination der zwei IoxP-Stellen (Dreiecke) durch
Cre-Rekombinase. In (c) wird der Genotyp durch PCR angegeben.
Ein 240 Basenpaar-Fragment wird unter der Verwendung der in (b)
durch Pfeile angegebenen Primer amplifiziert und durch das Restrik
tionsenzym BsrG1 gespalten, für das eine neue Erkennungsstelle
durch die Punktmutation eingeführt worden ist. Die zwei 120 bp-
Fragmente, die durch die Punktmutation geschaffen worden sind,
werden von dem ungeschnittenen Fragment durch Gelelektrophore
se unterschieden. In (d) wird ein Sequenzvergleich angegeben.
Gehirn-RNA wird durch RT-PCR amplifiziert, wobei Primer verwen
det werden, deren Sequenzen in den Exons 3 und 5 von GR vor
liegen. Die erhaltenen Fragmente werden subkloniert und sequen
ziert. Die zwei mutierten Basen sind angegeben.
Fig. 2 zeigt den Vergleich zwischen einer erfindungsgemäßen Maus und
einer Wildtyp-Maus hinsichtlich der induzierenden Funktion von GR.
In (a) wird die Induzierung von Tyrosinaminotransferase (TAT)
angegeben. Dexamethason wird in eine erfindungsgemäße Maus
und in eine Wildtyp-Maus injiziert und Leber-mRNA-Expression von
TAT bzw. β-Aktin als Kontrolle wird durch Northern Blot analysiert.
In (b) wird die Induzierung der Proliferation von Erythrozyten-Vor
läuferzellen angegeben. Erythrozyten-Vorläuferzellen werden isoliert
und kultiviert. Kumulative Zell-Zahlen werden bestimmt. In (c) wird
die Induzierung der Apoptose von Thymozyten angegeben. Der
Prozentsatz von lebensfähigen Zellen nach Behandlung mit Dexa
methason (schraffierte Balken) oder in Kontrollen (ausgefüllte Bal
ken) sind angegeben.
Fig. 3 zeigt die Inhibierung der AP-1 bedingten Reprimierung des Kollage
nase-Gens. Primäre Fibroblasten werden mit Dexamethason (Dex),
TPA, oder beidem behandelt und mRNA-Mengen von MMP-13
(Maus-Kollagenase-3) und GAPDH als Kontrolle werden durch
Northern Blot analysiert.
Die Erfindung wird durch die nachstehenden Beispiele erläutert
Es wird ein nicht-menschliches Säugetier bereitgestellt, dessen GR in seiner
induzierenden Funktion ausgeschaltet ist. Hierzu wird ein Vektor verwendet, der
ca. 11 kb des GR-Gens, einschließlich der Exons 3 und 4 aufweist. Ferner weist
der Vektor in Exon 4 eine Punktmutation auf, wodurch der hierdurch kodierte GR
an der Position 458 anstelle von Alanin Threonin aufweist. Desweiteren umfaßt
der Vektor eine IoxP-tkneo-Selektionscassette (vgl. Fig. 1).
Dieser Vektor wird durch Elektroporation in die embryonalen Maus-Stammzellen
E14/1 eingeführt. Stabil transfizierte Zellen werden durch Selektion mit 350
µg/ml G418 erhalten. Diese Zellen werden einer transienten Transfektion mit 20
µg eines Cre-Expressionsplasmids unterzogen, bevor ihnen 1 µM Gancyclovir
zugegeben wird. Damit wird auf Zellen selektioniert, welche die Selektions
cassette verloren haben. Diese Zellen weisen im GR-Gen die angegebene Punkt
mutation und zusätzlich ca. 50 Basenpaare entlang der verbliebenen Iox P-Stelle
im Intron 3 auf.
Letztere Zellen werden in Maus-Blastozysten injiziert und diese dann in weibliche
Mäuse eingeführt. Es werden chimäre Mäuse erhalten, aus denen durch Verpaa
rung heterozygote und homozygote Mäuse gewonnen werden.
Es wird das in Beispiel 1 bereitgestellte nicht-menschliche Säugetier verwendet.
Dieses wird in Testversuche eingesetzt, die spezifisch für die einzelnen Funktio
nen von GR sind.
Einer erfindungsgemäßen Maus und einer Wildtyp-Maus werden jeweils 10
µg/100 g Dexamethason bzw. PBS injiziert. Nach zwei Stunden werden die Tiere
getötet. Leber-RNA wird isoliert und die mRNA-Expression von Tyrosinamino
transferase (TAT) bzw. von β-Aktin als Kontrolle wird in einem Northern-Blot
bestimmt (vgl. Fig. 2a).
Es zeigt sich, daß eine Wildtyp-Maus, nicht aber eine erfindungsgemäße Maus
eine TAT mRNA induzieren kann.
Aus einem erfindungsgemäßen Maus- und einem Wildtyp-Mausembryo wird
jeweils fötale Leber isoliert und in Einzelzellen dispergiert. Diese werden dann in
modifiziertem CFU-E-Medium, das SCF, hEpo, IGF-1 und Dexamethason enthält,
vermehrt. Eine Wachstumskinetik wird erstellt, indem täglich die Zellen unter
Verwendung eines elektronischen Zellzählers gezählt werden (vgl. Fig. 2b).
Es zeigt sich, daß eine Wildtyp-Maus, nicht aber eine erfindungsgemäße Maus
die Proliferation von Erythrozyten-Vorläuferzellen induzieren kann.
Aus einer 6-12 Wochen alten erfindungsgemäßen Maus und einer entsprechend
alten Wildtyp-Maus werden jeweils Thymozyten isoliert und in RPMI-Medium 24
Stunden in Gegenwart bzw. Abwesenheit von Dexamethason (10-6 M) kultiviert.
Die Zellen werden dann mit Propidiumjodid gefärbt und auf ihre Fluoreszenz
intensität mittels FACS analysiert. Der Verlust an DNA-Gehalt wird als Maß für
Apoptose genommen.
Es zeigt sich, daß eine Wildtyp-Maus, nicht aber eine erfindungsgemäße Maus
die Apoptose von Thymozyten induzieren kann.
Primäre Fibroblasten werden aus Embryonen einer erfindungsgemäßen Maus und
einer Wildtyp-Maus isoliert. Die Fibroblasten werden 6 Stunden mit 10-6 M
Dexamethason, 10-7 M TPA oder beidem behandelt, bevor RNA isoliert und die
mRNA-Expression von MMP-13(Maus-Kollagenase 3-Gen) und von GAPDH als
Kontrolle in einem Northern-Blot bestimmt werden (vgl. Fig. 3).
Es zeigt sich, daß eine Wildtyp-Maus und auch eine erfindungsgemäße Maus die
AP1-bedingte Aktivierung des Kollagenase-Gens inhibieren können.
Somit wird deutlich, daß ein erfindungsgemäßes Säugetier, z. B. eine Maus,
einen GR exprimiert, bei dem die reprimierende Funktion erhalten, die induzieren
de Funktion allerdings verändert, insbesondere ausgeschaltet ist.
Claims (10)
1. Nicht-menschliches Säugetier, dessen Glukokortikoid-Rezeptor (GR) in
seiner induzierenden Funktion verändert ist.
2. Nicht-menschliches Säugetier nach Anspruch 1, wobei die induzierende
Funktion ausgeschaltet ist.
3. Nicht-menschliches Säugetier nach Anspruch 1 oder 2, wobei GR in
seiner Dimerisierung bzw. DNA-Bindung mutiert ist.
4. Nicht-menschliches Säugetier nach einem der Ansprüche 1-3, wobei GR
an der Position 458 ein Threonin aufweist.
5. Verfahren zur Bereitstellung eines nicht-menschlichen Säugetiers nach
einem der Ansprüche 1-4, umfassend die folgenden Schritte:
- a) Transfektion von embryonalen Stammzellen eines nicht-mensch lichen Säugetiers mit einem Vektor, der eine Rekombination zwi schen der für die induzierende Funktion von GR kodierenden DNA der embryonalen Stammzellen und einer entsprechenden mutierten DNA des Vektors ermöglicht,
- b) Isolierung von in (a) stabil transfizierten Zellen und Einbringung dieser in weibliche Tiere eines nicht-menschlichen Säugetiers, sowie
- c) Analyse der in (b) erhaltenen Nachkommen auf einen GR, dessen induzierende Funktion verändert ist.
6. Verfahren nach Anspruch 5, wobei die induzierende Funktion ausgeschal
tet ist.
7. Verfahren nach Anspruch 6, wobei GR in seiner Dimerisierung bzw. DNA-
Bindung mutiert ist.
8. Verfahren nach einem der Ansprüche 5-7, wobei GR an der Position 458
ein Threonin aufweist.
9. Verwendung eines nicht-menschlichen Säugetiers nach einem der An
sprüche 1-4 zur Testung von Substanzen, Arzneimitteln und/oder Thera
pieansätzen hinsichtlich der reprimierenden Funktion von GR.
10. Verwendung nach Anspruch 9, wobei die Substanzen, Arzneimittel und/-
oder Therapieansätze hinsichtlich Störungen der Akut-Phase-Reaktion,
eines septischen Schocks, eines akuten Atemnot-Syndroms, Autoimm
unerkrankungen, wie rheumatoide Arthritis oder multiple Sklerose, neuro
psychiatrischen Erkrankungen, Erkrankungen der Hypothalamus-Hypophy
sen-Nebennieren-Achse, Osteoporose, Diabetes, Steroid-Myopathie oder
Hauterkrankungen zu verstehen sind.
Priority Applications (6)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE1998115958 DE19815958C1 (de) | 1998-03-12 | 1998-03-12 | Nicht-menschliches Säugetier sowie Verfahren zu seiner Herstellung und seine Verwendung |
| EP99922034A EP1061798A1 (de) | 1998-03-12 | 1999-03-12 | Nicht-menschliches transgenisches säugetier, sowie verfahren zu seiner herstellung und verwendung |
| PCT/DE1999/000747 WO1999045767A1 (de) | 1998-03-12 | 1999-03-12 | Nicht-menschliches transgenisches säugetier, sowie verfahren zu seiner herstellung und verwendung |
| AU39249/99A AU3924999A (en) | 1998-03-12 | 1999-03-12 | Non-human transgenic mammal, method for producing same and its use |
| JP2000535196A JP2002505858A (ja) | 1998-03-12 | 1999-03-12 | 非ヒトトランスジェニック哺乳動物、その生産方法およびその使用 |
| US10/326,087 US20030172393A1 (en) | 1998-03-12 | 2002-12-23 | Non-human transgenic mammal, method for producing same and its use |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE1998115958 DE19815958C1 (de) | 1998-03-12 | 1998-03-12 | Nicht-menschliches Säugetier sowie Verfahren zu seiner Herstellung und seine Verwendung |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| DE19815958C1 true DE19815958C1 (de) | 1999-09-16 |
Family
ID=7864125
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| DE1998115958 Expired - Fee Related DE19815958C1 (de) | 1998-03-12 | 1998-03-12 | Nicht-menschliches Säugetier sowie Verfahren zu seiner Herstellung und seine Verwendung |
Country Status (5)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP1061798A1 (de) |
| JP (1) | JP2002505858A (de) |
| AU (1) | AU3924999A (de) |
| DE (1) | DE19815958C1 (de) |
| WO (1) | WO1999045767A1 (de) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE19933075A1 (de) * | 1999-07-19 | 2001-03-01 | Deutsches Krebsforsch | Nicht-menschliches Säugetier mit gewebespezifisch verändertem Glukokortikoidrezeptor |
| DE10001975A1 (de) * | 2000-01-18 | 2001-07-26 | Deutsches Krebsforsch | Nicht-menschliches Säugetier mit verändertem Glukokortikoid-Rezeptor und verändertem c-Fos |
Family Cites Families (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0451206A4 (en) * | 1988-12-23 | 1992-07-22 | The Salk Institute For Biological Studies | Receptor transcription-repression activity compositions and methods |
-
1998
- 1998-03-12 DE DE1998115958 patent/DE19815958C1/de not_active Expired - Fee Related
-
1999
- 1999-03-12 JP JP2000535196A patent/JP2002505858A/ja active Pending
- 1999-03-12 WO PCT/DE1999/000747 patent/WO1999045767A1/de not_active Application Discontinuation
- 1999-03-12 AU AU39249/99A patent/AU3924999A/en not_active Abandoned
- 1999-03-12 EP EP99922034A patent/EP1061798A1/de not_active Withdrawn
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| NICHTS ERMITTELT * |
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE19933075A1 (de) * | 1999-07-19 | 2001-03-01 | Deutsches Krebsforsch | Nicht-menschliches Säugetier mit gewebespezifisch verändertem Glukokortikoidrezeptor |
| DE19933075C2 (de) * | 1999-07-19 | 2001-11-29 | Deutsches Krebsforsch | Nicht-menschliches Säugetier mit gewebespezifisch verändertem Glukokortikoidrezeptor |
| DE10001975A1 (de) * | 2000-01-18 | 2001-07-26 | Deutsches Krebsforsch | Nicht-menschliches Säugetier mit verändertem Glukokortikoid-Rezeptor und verändertem c-Fos |
| WO2001052641A1 (de) * | 2000-01-18 | 2001-07-26 | Deutsches Krebsforschungszentrum Stiftung des öffentlichen Rechts | Nicht-menschliches säugetier mit verändertem glukokortikoid-rezeptor und verändertem c-fos |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| AU3924999A (en) | 1999-09-27 |
| WO1999045767A1 (de) | 1999-09-16 |
| JP2002505858A (ja) | 2002-02-26 |
| EP1061798A1 (de) | 2000-12-27 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| DE69833649T2 (de) | Ef-1-alpha transkriptionsregulatorische dna aus hamster | |
| DE69233477T2 (de) | Transgene nicht-menschliche tiere ohne prionprotein | |
| DE69333984T2 (de) | Androgen-regulierung durch dns sequenzen des rattenprobasin-gens | |
| DE69024440T2 (de) | Verfahren zum spezifischen ersetzen einer genkopie, die sich in einem rezeptorengenom befindet, durch genintegration | |
| DE69433034T2 (de) | Expression von heterologen genen nach einem ziel-expressionsprofil | |
| DE69133372T2 (de) | Transgenes, nicht-menschliches säugetier das die amyloidbildende pathologie der alzheimerschen krankheit zeigt | |
| DE69033531T2 (de) | Vektor zur integrationsstellenunabhängigen genexpression in säugetier-wirtszellen | |
| DE69935903T2 (de) | Genmutierte tiere | |
| DE69722035T2 (de) | Neue testmethode, um den differenzierungszustand von bauchspeicheldrüsenzellen eines säugetieres festzustellen. | |
| Manfredi et al. | Expression of mutant β2 nicotinic receptors during development is crucial for epileptogenesis | |
| DE19815958C1 (de) | Nicht-menschliches Säugetier sowie Verfahren zu seiner Herstellung und seine Verwendung | |
| DE69734143T2 (de) | Neue methoden zur charakterisierung von verbindungen, welche die stf-1 expression in inselzellen der bauchspeicheldrüse stimuliert | |
| DE69534022T2 (de) | Genomische DNS Fragmente der regulierenden Sequenz der Beta 2 Untereinheit des neuronalen Nikotin-Acetycholin Rezeptors; damit transformierte transgene Tiere. | |
| DE60313499T2 (de) | Mutante nichtmenschliche säuger mit sigmarezeptormangel und anwendungen dafür | |
| DE69825594T2 (de) | Screening-Methode unter Verwendung des FREAC-11 Transkriptionsfaktors | |
| DE69532115T2 (de) | P75 tnf-rezeptor-promotoren | |
| DE69734725T2 (de) | Neues verfahren zur überprüfung des differenzierungszustands pankreatischer zellen eines säugetiers | |
| AT501628B1 (de) | Promotor zur expression von fremdgenen in neuronalen zellen | |
| DE69920698T2 (de) | Transgenes nichthumanes tier mit inaktivem peg3 und dessen verwendung | |
| EP0386766A1 (de) | Verfahren zur gezielten Veränderung eines Gens | |
| DE19829660C1 (de) | Nicht-menschliches Säugetier | |
| DE10232151A1 (de) | Neuronal exprimierte Tryptophanhydroxylase und ihre Verwendung | |
| US20030172393A1 (en) | Non-human transgenic mammal, method for producing same and its use | |
| DE60223205T2 (de) | Transgenes Tiermodell für Alzheimer-Erkrankung | |
| DE19933075C2 (de) | Nicht-menschliches Säugetier mit gewebespezifisch verändertem Glukokortikoidrezeptor |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| 8100 | Publication of the examined application without publication of unexamined application | ||
| D1 | Grant (no unexamined application published) patent law 81 | ||
| 8363 | Opposition against the patent | ||
| 8368 | Opposition refused due to inadmissibility | ||
| 8339 | Ceased/non-payment of the annual fee |