DE69722035T2 - Neue testmethode, um den differenzierungszustand von bauchspeicheldrüsenzellen eines säugetieres festzustellen. - Google Patents

Neue testmethode, um den differenzierungszustand von bauchspeicheldrüsenzellen eines säugetieres festzustellen. Download PDF

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Description

  • BEREICH DER ERFINDUNG
  • Die vorliegende Erfindung betrifft in vitro-Verfahren zur Prüfung des Differenzierungsstatus von Pankreaszellen eines Säugers; zum Beispiel durch Ermitteln des Anteils oder des Status von Pax6 mRNA und/oder Protein in Pankreaszellen (oder Vorläufern von Pankreaszellen) und Vergleichen des Anteils oder des Status mit dem entsprechenden Anteil oder dem Status in normalen Pankreaszellen (oder Vorstufen pankreatischer Zellen). Dieses Verfahren stellt ein Mittel zur Diagnose oder zum Nachweis von Erkrankungen bereit, die aus bestimmten Pankreas- oder Hirn-Zellen entstehen, insbesondere ein Mittel zur Diagnose oder zum Nachweis von zum Beispiel Hypoglykämie oder geistigen Störungen. Das Verfahren kann in Verbindung mit der Ermittlung des Anteils oder des Status von Pax4 mRNA und/oder Protein in Pankreaszellen (oder Vorläufern von Pankreaszellen) und durch Vergleichen des Anteils oder des Status mit dem entsprechenden Anteil oder dem Status in normalen Pankreaszellen (oder Vorläufern von Pankreaszellen) durchgeführt werden.
  • Die im Folgenden dargelegten Ergebnisse zeigen, dass der Verlust an Pax6-Expression auf einen Verlust oder eine Fehlfunktion bei der α-Zell-Entwicklung hinweist und damit der Glucagon-Produktion (und somit auf Hypoglykämie und eine geistige Störung). Die Erfindung ist deshalb nützlich für die Wiederherstellung der Pax6-Expression zur Behandlung, Vermeidung oder Verzögerung einer Pankreas- oder Hirn-Erkrankung, wie Hypoglykämie, oder einer geistigen Störung, die auf einer nicht angemessenen Expression des Glucagon-Gens beruhen; und damit für transgene nicht menschliche Säuger, die durch Modifikation eine wiederhergestellte Pax6-Expression zeigen, indem sie zumindest ein erstes Nucleinsäure-Molekül umfassen, das eine Sequenz besitzt, die ein funktionelles und exprimierbares Pax6-Protein codiert und gegebenenfalls eine zweite Nucleinsäuresequenz, die ein funktionelles und exprimierbares Pax4-Protein codiert. In einer anderen Ausführungsform oder zusätzlich betrifft die Erfindung die Verwendung von Pax6 alleine oder zusammen mit Pax4 und/oder einem Mittel zur Stimulation der Expression von Pax6 oder von Pax4 und Pax6 für die Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung, Vermeidung oder Verzögerung einer Pankreas- oder Hirn-Erkrankung, wie Hypoglykämie, oder einer geistigen Störung, die auf einer nicht angemessenen Expression des Glucagon-Gens beruhen.
  • Da die nachfolgend dargestellten Ergebnisse zeigen, dass der Mangel an Pax6-Expression auf den Verlust oder einer Fehlfunktion bei der α-Zell-Entwicklung und damit also der Glucagon-Produktion (und damit auf Hypoglykämie) hinweist, betrifft die vorliegende Erfindung auch transgene, nicht menschliche Säuger, die derart modifiziert sind, dass sie mindestens ein inaktiviertes Pax6-Allel umfassen. Dieses Säugetier hat zahlreiche Verwendungsmöglichkeiten, einschließlich als ein Forschungsmodell für Pankreas- und/oder Hirn-Erkrankungen, wie Hypoglykämie, und/oder eine geistige Störung; und deshalb stellt es ein neues und wertvolles Tier zur Entwicklung von Therapien, zur Behandlung, etc. von Erkrankungen dar, die durch den Ausfall oder die Fehlfunktion von Pankreaszellen verursacht werden. Demgemäß ist in diesem Fall der Säuger nicht menschlich, z. B. ein Labortier, wie eine Maus oder eine Ratte.
  • Darüber hinaus bestimmen Pax4 und Pax6 anhand der hierin vorliegenden Ergebnisse das zelluläre Schicksal der endokrinen Vorläufer während der Entwicklung. Im Einzelnen definiert in einem ersten Schritt das Pdx1-Gen den Bereich des Endoderms, aus dem exokrine und endokrine Pankreas-Vorläufer entstehen, da dessen Expression vor der Expression der Pax-Gene auftritt und Mäuse, denen Pdx1 fehlt, keinen Pankreas ausbilden. Das Einschalten der Pax-Expression im Pankreas unterteilt die endokrinen Vorläufer in zwei Populationen: Zellen, die sowohl Pax4 als auch Pax6 exprimieren, differenzieren in reife β-Zellen, während Zellen, die ausschließlich Pax6 exprimieren, in α-Zellen differenzieren. Die Abwesenheit von Pax4 leitet alle Vorläufer in die α-Zelllinie um, da Pax6 in diesen Zellen weiterhin verbleibt. Der Ausfall von Pax6 eliminiert die α-Zelllinie vollständig oder kann Vorläufer in die β-Zelllinie umleiten. Wenn sowohl Pax4 als auch Pax6 fehlen, versagen die Vorläufer dabei, sich in reife endokrine Zellen zu entwickeln. Somit sind beide Pax-Gene für die endokrine Zelldifferenzierung während der Pankreas-Entwicklung erforderlich.
  • Entsprechend betrifft die vorliegende Erfindung weiterhin in vitro-Verfahren zur Prüfung des Differenzierungsstatus von Pankreaszellen eines Säugers durch Ermitteln des Anteils oder des Status von Pax4 und Pax6 mRNA und/oder Protein in Pankreaszellen (oder Vorläufern von Pankreaszellen) und Vergleichen des Anteils oder des Status mit dem entsprechenden Anteil oder des Status in normalen Pankreaszellen (oder Vorstufen von Pankreaszellen). Dieses Verfahren stellt ein Mittel zur Diagnose oder den Nachweis von Erkrankungen, die von bestimmten Pankreaszellen ausgehen, insbesondere ein Mittel zur Diagnose oder zum Nachweis von zum Beispiel Diabetes, wie jugendlichen Diabetes und/oder Hypoglykämie, bereit.
  • Zusätzlich ist die Erfindung nützlich zur Wiederherstellung von Pax4 und Pax6-Expression zur Behandlung, Vermeidung oder Verzögerung einer Pankreas-Erkrankung, wie Diabetes, z. B. jugendlichen Diabetes und/oder Hypoglykämie; und somit für transgene Tiere, die durch Modifikation die Pax4- und Pax6-Expression wieder hergestellt haben, derart dass sie mindestens ein erstes Nucleinsäure-Molekül umfassen, das eine Sequenz besitzt, die ein funktionelles und exprimierbares Pax4-Protein codiert und eine zweite Nucleinsäuresequenz, die ein funktionelles und exprimierbares Pax6-Protein codiert. In einer anderen Ausführungsform oder zusätzlich betrifft die Erfindung die Verwendung von Pax4 zusammen mit Pax6 und/oder einem Mittel zur Stimulation der Expression von Pax4 und Pax6 für die Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung, Vermeidung oder Verzögerung einer Pankreas-Erkrankung wie Diabetes, z. B. jugendlichen Diabetes und/oder Hypoglykämie.
  • HINTERGRUND DER ERFINDUNG
  • Die Bauchspeicheldrüse ist ein unverzichtbares Organ, das sowohl eine exokrine Funktion, die bei der Bereitstellung von Enzymen in den Verdauungstrakt beteiligt ist, sowie auch eine endokrine Funktion, bei der verschiedene Hormone in den Blutstrom sekretiert werden, besitzt. Die exokrine Funktion erfolgt durch acinöse und zentroacinöse Zellen, die verschiedene Verdauungsenzyme produzieren (Amylase, Proteasen, Nuclease, etc.) und durch dazwischengeschaltete Ductuszellen, die diese Enzyme in alkalischer Lösung in den Zwölffingerdarm transportieren.
  • Die funktionelle Einheit des endokrinen Pankreas sind die Langerhans'schen Inseln, die über den ganzen exokrinen Bereich des Pankreas verstreut liegen und aus vier Zelltypen zusammengesetzt sind: α-, β-, δ- und PP-Zellen, was von Slack, Development 121 (1995), 1569–1580 in Form einer Übersicht dargestellt ist. β-Zellen produzieren Insulin, repräsentieren die Mehrheit der endokrinen Zellen und bilden den Kern der Inseln, während α-Zellen Glucagon sekretieren und in der Peripherie lokalisiert sind. δ-Zellen und PP-Zellen sind weniger zahlreich und sekretieren Somatostatin bzw. ein pankreatisches Polypeptid. Insulin und Glucagon sind Schlüsselregulatoren der Blutglucose-Spiegel. Insulin erniedrigt den Blutglucosespiegel indem es die zelluläre Aufnahme von Glucose und deren Umwandlung in Glycogen erhöht. Glucagon erhöht die Blutglucosespiegel durch Eingreifen in den Abbau des Glycogens der Leber. Weitläufige Pankreas-Erkrankungen, die die endokrine Funktion beeinträchtigen, beinhalten Diabetes mellitus und Hormon-sekretierende Tumoren.
  • Man geht davon aus, dass alle vier endokrinen Zelltypen aus einem gemeinsamen pluripotenten Vorläufer entstehen, der aus dem Endoderm abstammt. Früh während der Pankreas-Entwicklung, co-exprimieren diese Vorläufer einige Hormone wie Insulin und Glucagon. In der Maus sind die α-Zellen die ersten endokrinen Zellen, die an Tag 9,5 nach Empfängnis (post conception; p.c.) ausdifferenzieren, gefolgt von den β- und δ-Zellen am Tag 14,5 p.c. und den PP-Zellen am Tag 1 nach der Geburt. Über die molekularen und genetischen Faktoren, die bei der Bestimmung der Verzweigung zu den unterschiedlichen endokrinen Zellen beteiligt sind, ist sehr wenig bekannt. Eines der wenigen bisher beschriebenen Gene ist das Homeobox-Gen Pdx1, das während den anfänglichen Stadien der Pankreas-Entwicklung exprimiert wird, und sich in den Inseln des Adulten auf die β-Zellen beschränkt (Guz et al., Development 121 (1995), 11–18). Homozygote Maus-Pdx1-Mutanten sind nicht in der Lage eine Bauchspeicheldrüse zu entwickeln und sterben wenige Tage nach der Geburt (Jonsson et al., Nature 371 (1994), 606–609). Zwei Mitglieder der Pax-Gen-Familie, Pax6 und Pax4, werden ebenfalls während der Pankreas-Entwicklung in endokrinen Zellen exprimiert. Bis jetzt war jedoch nicht bekannt, wie das Pax6- und das Pax4-Gen im Einzelnen die Pankreas-Entwicklung beeinflussen.
  • Ein Verfahren zum Prüfen einer Vielzahl von Differenzierungsparametern im Pankreas war bisher nicht erhältlich, ist jedoch höchst wünschenswert. Ergebnisse, die durch ein solches Verfahren erhältlich wären, würden, so die Erwartungen, z. B. einen signifikanten Einfluss auf die Diagnose und Therapie Pankreas-bezogener Erkrankungen besitzen.
  • ZUSAMMENFASUNG DER ERFINDUNG
  • Die vorliegende Erfindung betrifft ein neues in vitro-Verfahren zur Prüfung des Differenzierungsstatus von Pankreaszellen in Säugern. Die vorliegende Erfindung betrifft weiter Anwendungen im medizinischen Bereich, die sich direkt anhand des erfindungsgemäßen Verfahrens ergeben. Zusätzlich betrifft die vorliegende Erfindung nicht menschliche, transgene Säuger, die mindestens ein inaktiviertes Pax6-Gen und gegebenenfalls mindestens ein inaktiviertes Pax4-Gen umfassen.
  • DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
  • Entsprechend war ein technisches Problem, das der vorliegenden Erfindung zugrunde lag, ein solches Verfahren zur Kontrolle des Differenzierungsstatus von Pankreaszellen in vitro bereitzustellen. Die Lösung dieses technischen Problems wird durch die Ausführungsformen erreicht, die in den Ansprüchen charakterisiert sind. Somit betrifft die vorliegende Erfindung ein in vitro-Verfahren zur Prüfung des Differenzierungsstatus von Pankreaszellen eines Säugers, umfassend
    • (a) Bestimmen des Anteils oder Status von Pax6-mRNA in Pankreaszellen des Säugers; und/oder
    • (b) Bestimmen des Anteils oder Status von Pax6-Protein in Pankreaszellen des Säugers; und
    • (c) Vergleichen des Anteils oder Status von Pax6-mRNA und/oder Pax6-Protein mit dem entsprechenden Anteil in normalen Pankreaszellen.
  • In Verbindung mit der vorliegenden Erfindung bezeichnet der Begriff "Anteil" die hergestellte Menge von mRNA oder Protein. Der Begriff "Status" beinhaltet die Möglichkeiten, dass das Gen, die mRNA, das Protein oder ein Transkriptionskontrollelement, z. B. Promotor/Enhancer-Sequenz eine Mutation, Deletion oder irgendeine andere Modifikation tragen können, die die Gesamtaktivität des Gens beeinflussen würde, wenn sie mit dem normalen Genprodukt des Wildtyps verglichen wird. Eingeschlossen in diesem Begriff sind post-translationale Modifikationen des Proteins.
  • In Übereinstimmung mit der vorliegenden Erfindung wurde überraschenderweise gefunden, dass Pax6 im Pankreas exprimiert wird.
  • Das erfindungsgemäße Verfahren erlaubt erstmals eine detaillierte Studie über die Entwicklung unterschiedlicher Zelltypen, d. h. α-, β-, δ- und PP-Zellen in pankreatischem Gewebe. Wie anhand der anhängenden Beispiele gezeigt ist, ist das Pax6-Gen, gegebenenfalls in Verbindung mit dem Pax4-Gen, an den frühen Schritten der Entwicklung des Pankreas beteiligt. Dieses überraschende Ergebnis erlaubt die Kontrolle der Bestimmung der Zelle sowie die Untersuchung der Entwicklung von Krankheiten, die aus bestimmten Zelltypen entstehen, die in dem Pankreas vorkommen. Die Ergebnisse, die in Übereinstimmung mit der vorliegenden Erfindung dargestellt sind, erlauben weiterhin die Folgerung, dass Pax6 und/oder Pax4 Hauptregulatoren für spezifische Pankreaszellen sind.
  • Somit scheint Pax6 ein Hauptregulator für α-Zellen zu sein. Pax6 wird auch in Nicht-Pankreaszellen exprimiert. Pax6-Expression wird in einem Teil der Zellen exprimiert, die man im sich entwickelnden Rückenmark findet. Im Besonderen wird die Expression des Pax6-Gens im angehenden Vorderhirn und Rautenhirn beobachtet und bleibt während der gesamten Entwicklung im Gehirn, dem Auge und dem Neuralrohr erhalten (Grindley et al., Development 121 (1995), 1433–1442; Stoykova et al., Development 122 (1996), 3453–3465). Aus diesem Grund kann Pax6 wahrscheinlich beim Differenzierungsstadium dieser Zellen eine Rolle spielen. Das Fehlen der Pax6-Gen-Expression kann unter Verwendung des Markers "Small eyes" (kleine Augen) beobachtet werden.
  • Demgemäß stellt das erfindungsgemäße Verfahren Mittel für die in vitro-Diagnose oder den Nachweis von Erkrankungen bereit, die von bestimmten Zellen abstammen, wie Pankreaszellen und Gehirnzellen, insbesondere ein Mittel zur/zum frühen Diagnose oder Nachweis, zum Beispiel Nachweis oder Diagnose von Hypoglykämie oder geistigen Störungen.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst das erfindungsgemäße Verfahren darüber hinaus
    • (d) Bestimmen des Anteils oder Status von Pax4-mRNA in Pankreaszellen des Säugers; und/oder
    • (e) Bestimmen des Anteils oder Status von Pax4-Protein in Pankreaszellen des Säugers; und
    • (f) Vergleichen des Anteils oder Status Pax4-mRNA und/oder Pax4-Protein mit dem entsprechenden Anteil in normalen Pankreaszellen.
  • Diese Ausführungsform der vorliegenden Erfindung erlaubt das Studium der synergistischen Auswirkungen der Pax6- und Pax4-Genprodukte. Man geht davon aus, dass die Analyse dieser synergistischen Auswirkungen einen tieferen Einblick in die Regulation der zellspezifischen Entwicklung im Pankreas bereitstellt. Von dieser tieferen Einsicht wird die Entwicklung von Diagnostika und Arzneimitteln, die Pankreas-spezifische Erkrankungen betreffen, außerordentlich profitieren.
  • In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahren ist der Säuger in der
    • (i) Embryonal-;
    • (ii) Neugeborenen-; oder
    • (iii) Erwachsenen-Phase.
  • Wie in Übereinstimmung mit der vorliegenden Erfindung gezeigt wurde, wird das Pax6-Gen, vorzugsweise in Verbindung mit dem Pax4-Gen, in einem unterschiedlichen Anteil und in verschiedenen Stadien der Entwicklung des Säuger-Pankreas und -Gehirns exprimiert. Die spezifische Analyse des Entwicklungsstadiums von Pankreaszellen im Embryonal-, Neugeborenen- oder Erwachsenen-Stadium wird weitere Einsicht in z. B. spezifische Krankheitszustände bereitstellen, die mit den jeweiligen Stadien assoziiert sind. Es wird zum Beispiel erwartet, dass die Etiologie von z. B. Hypoglykämie durch Anwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens wie auch durch Einsatz der erfindungsgemäßen transgenen Säuger (Nicht-Mensch) (hierin diskutiert; siehe auch die Beispiele) aufgeklärt wird. Zusätzlich wird erwartet, dass durch das Fachwissen, das aus dem Studium der Expression von Pax6 im Pankreas und durch den Einsatz der erfindungsgemäßen transgenen Säuger (Nicht-Mensch) (hierin diskutiert; siehe auch die Beispiele), Einblick in die Etiologie und die Behandlung von geistigen Störungen gewonnen wird. Das beruht darauf, dass bekannt ist, dass das Pax6-Genprodukt und das Glukagon-Gen im Gehirn exprimiert werden (Drucker and Asa, J. Biol Chem. 263 (1988), 13475–13478; Lee et al., Endocrinology 127 (1990), 2217–2222; Lui et al., Endocrinology 126 (1990) 110–117; Han et al., J. Neurosci. Res. 16 (1986), 97–107). Auf der Grundlage dieses Fachwissens, werden neue pharmazeutisch aktive Arzneimittel, z. B. gegen Hypoglykämie und geistige Störungen entwickelt und getestet werden.
  • Das erfindungsgemäße Verfahren kann in Abhängigkeit von dem Zweck der Untersuchung für eine Vielzahl von Säugern angewendet werden. So ist in einer bevorzugten Ausführungsform der Säuger eine Maus. Diese Ausführungsform ist besonders nützlich für Grundlagenforschung, um die funktionellen Beziehungen verschiedener Proteine zueinander zu verstehen, die die Entwicklung des Pankreas regulieren. In einer weiteren Ausführungsform ist der Säuger ein Mensch. In dieser Ausführungsform werden bevorzugt diagnostische und therapeutische Anwendungen ins Auge gefasst.
  • In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens werden die Schritte (a) und gegebenenfalls (d) und/oder (b) und gegebenenfalls (e) in vitro durchgeführt.
  • Es wird erwartet, dass die Vorteile dieser Ausführungsform hauptsächlich bei diagnostischen Anwendungen und, wiederum in der Grundlagenforschung liegen.
  • In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens wird diese Bestimmung in Schritt (a) und gegebenenfalls in Schritt (d) durchgeführt, wobei folgendes verwendet wird
    • (i) eine Nucleinsäuresequenz, die zumindest in einem Teil dem Pax6-Gen entspricht und, vorzugsweise, zumindest einen Teil des Pax6-Proteins codiert und, gegebenenfalls, einer zweiten Nucleinsäuresequenz, die zumindest in einem Teil dem Pax4-Gen entspricht und, vorzugsweise, zumindest einen Teil des Pax4-Proteins codiert;
    • (ii) eine Nucleinsäuresequenz, die komplementär zu der/den Nucleinsäuresequenz(en) aus (i) ist/sind; oder
    • (iii) ein Primer oder ein Primerpaar, der/das mit der/den Nucleinsäuresequenz(en) von (i) oder (ii) hybridisiert.
  • In Übereinstimmung mit dieser Ausführungsform der vorliegenden Erfindung kann das in vitro-Verfahren zur Prüfung des Differenzierungsstatus durchgeführt werden, indem ein Nucleinsäure-Molekül, das das Pax6-Gen und/oder das Pax4-Gen oder einen Teil davon codiert, z. B. in Form einer Southern- oder Northern-Blot oder in situ-Analyse verwendet wird. Diese Nucleinsäuresequenz kann mit einer codierenden Region eines der beiden Gene oder mit einer nicht-codierenden Region hybridisieren. Im Falle, dass eine komplementäre Sequenz in Übereinstimmung mit (ii) in dem erfindungsgemäßen Verfahren eingesetzt wird, kann dieses Nucleinsäure-Molekül ebenfalls in Northern Blots verwendet werden. Zusätzlich kann dieser Test in Verbindung mit einer tatsächlichen Blockierung, z. B. der Transkription des Gens, durchgeführt werden und kann somit therapeutische Relevanz haben. Darüber hinaus kann auch ein Primer oder Oligonucleotid für die Hybridisierung mit einem der vorstehend erwähnten Pax-Gene oder mit entsprechenden mRNAs verwendet werden. Die für die Hybridisierung verwendeten Nucleinsäuren können natürlich auf herkömmliche Art und Weise durch den Einbau oder das Anheften von z. B. einem radioaktiven oder anderen Marker markiert werden. Solche Marker sind im Stand der Technik gut bekannt. Das Markieren dieser Nucleinsäure-Moleküle kann mit herkömmlichen Verfahren durchgeführt werden.
  • Zusätzlich kann die Anwesenheit oder Expression von Pax6 und, gegebenenfalls, Pax4 durch Verwendung eines Primerpaars kontrolliert werden, das spezifisch mit einer der beiden entsprechenden Nucleinsäuresequenzen hybridisiert und durch das Durchführen einer PCR-Reaktion in Anlehnung an Standardverfahren.
  • Die spezifische Hybridisierung der vorstehend erwähnten Sonden oder Primer erfolgt vorzugsweise unter stringenten Hybridisierungsbedingungen. Der Begriff "stringente Hybridisierungsbedingungen" ist im Stand der Technik gut bekannt; siehe zum Beispiel Sambrook et al., "Molecular Cloning, A Laboratory Manual" 2. Ausg., CSH Press, Cold Spring Harbor, 1989; "Nucleic Acid Hybridisation, A Practical Approach", Hames and Higgins Hrsg., IRL Press, Oxford, 1985.
  • Weitere Modifikationen der vorstehend erwähnten Ausführungsformen der Erfindung können durch den Fachmann leicht entwickelt werden.
  • Eine zusätzliche Ausführungsform der vorliegenden Erfindung betrifft ein Verfahren, worin die Bestimmung in Schritt (b) und, gegebenenfalls, in Schritt (e) durch den Einsatz eines Antikörpers oder eines Fragmentes davon durchgeführt wird, der/das spezifisch an das Pax6-Protein bindet und, gegebenenfalls, durch Verwendung eines zweiten Antikörpers oder Fragmentes davon, der/das spezifisch an das Pax4-Protein bindet.
  • Antikörper oder Fragmente davon gegen die zuvor erwähnten Proteine können durch Verwenden herkömmlicher Verfahren erhalten werden, die zum Beispiel in Harlow and Lane "Antibodies, A Laboratory Manual", CSH Press, Cold Spring Harbor, 1988, beschrieben sind. Diese Antikörper können monoclonale Antikörper sein oder können in polyclonalen Antiseren umfasst sein oder Fragmente davon sein. Der in dem erfindungsgemäßen Verfahren verwendete Antikörper kann mit nachweisbaren Markierungen, wie ein Histidin, Flag oder ein Biotin-Molekül markiert sein.
  • In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens sind die Pankreaszellen α-Zellen oder β-Zellen.
  • In Übereinstimmung mit der vorliegenden Erfindung wurde gefunden, dass Pax6 in α-Zellen und β-Zellen exprimiert ist. Darüber hinaus konnte der Erfinder zeigen, dass Pax6 in Somatostatin-produzierenden δ-Zellen und in PP-Zellen exprimiert wird. Die Zerstörung der Pax6-Gen-Funktion erlaubt deshalb eine engmaschige Kontrolle der Entwicklung dieser Zellen im Pankreas. Da Pax4 auch in β-Zellen exprimiert wird, kann die Pax6-Expression erforderlich sein, um einen kompetenten Hintergrund für die Wirkung von Pax4 festzulegen.
  • Da sowohl Pax6 als auch Pax4 regulatorische Proteine sind, die für eine angemessene Entwicklung endokriner Zellen erforderlich sind, kann diese Ausführungsform eine Vielzahl von Folgerungen hinsichtlich der Ausbildung von Erkrankungen wie Pankreastumoren erlauben.
  • Demgemäß betrifft eine weitere bevorzugte Ausführungsform ein Verfahren, worin dieser Differenzierungsstatus Indikativ für einen bösartigen Tumor oder ein bösartiges Potenzial dieser Pankreaszellen ist. Die Überexpression oder das Fehlen eines funktionellen Pax6- und gegebenenfalls Pax4-Produktes kann normale endokrine Zellen dazu veranlassen krebsartig zu werden. In Übereinstimmung mit dieser Aussage werden auf dem Chromosom 7q in der Nachbarschaft des Pax4-Gens in vielen pankreatischen Karzinomen allelische Deletionen beobachtet (Alberto et al., Cancer Res. 56 (1996), 2808–2818). Pax6 und, gegebenenfalls, Pax4 können auch mit anderen onkogenen Faktoren wechselwirken.
  • Bösartige Tumoren oder bösartiges Potenzial wird in Übereinstimmung mit dieser Erfindung bevorzugt, aber nicht ausschließlich, in Verbindung mit pankreatischen Tumoren, wie Insulinomen, Glucagonomen, Somatostatinomen und Ductalzell-Adenokarzinomen verwendet.
  • Die vorliegende Erfindung betrifft in einer weiteren bevorzugten Ausführungsform die Durchführung der nachfolgenden Schritte
    • (a') vor diesem Test das Entfernen eines soliden Pankreas-Tumors aus diesem Säuger; und
    • (b') nach diesem Test zumindest den teilweisen Verlust der Expression des Pax6- und, gegebenenfalls, des Pax4-Gens in Zellen dieses Tumors, falls dieses) Gen e) überexprimiert ist/sind oder die Stimulation der Expression des Pax6-Gens und, gegebenenfalls, des Pax4-Gens oder das Einbringen eines funktionellen oder exprimierbaren Pax6-Gens und, gegebenenfalls, eines funktionellen und exprimierbaren Pax4-Gens in diese Zellen, falls dieses) Gen e) verringert exprimiert oder nicht exprimiert ist/sind; und
    • (b'') Wiedereinbringen der Zellen, die als ein Produkt aus Schritt (b') erhalten werden, in diesen Säuger.
  • In diesem Zusammenhang und wie in dieser gesamten Spezifizierung verwendet bedeutet ein "funktionelles" Pax6 (Pax4) ein Protein, das Teile oder alle primären strukturellen Konformationen des Pax6 (Pax4)-Proteins beinhaltet, die die biologische Eigenschaft besitzen zu der Entwicklung von endokrinen Zellen in α-Zellen und Langerhans-Zellen (β-Zellen) beizutragen, wobei dieses Protein das Produkt der prokaryontischen oder eukaryontischen Expression einer Pax6 (Pax4)-codierenden DNA-Sequenz ist und eine Aminosäuresequenz beinhaltet, die die Aminosäuresequenz von SEQ ID Nr. 2 (SEQ ID Nr. 4) umfasst oder ein beliebiges Fragment oder Derivat davon, das mit Hilfe von Aminosäure-Deletion, Substitution, Insertion, Addition und/oder Ersatz der Aminosäuresequenz, die in SEQ ID Nr. 2 (SEQ ID Nr. 4) bereitgestellt ist. Ebenfalls von dem Begriff "funktionelles" Pax6 (Pax4)-Protein, ist die Fähigkeit dieses Proteins oder eines Teiles davon, eine spezifische Immunantwort zu erzeugen, wie eine Antikörper-Antwort umfasst.
  • In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist die Prüfung des Differenzierungsstatus von Pankreaszellen eine Prüfung des Entwicklungsstatus von α-Zellen, was, wie anhand der Beispiele gezeigt, indikativ ist für Hypoglykämie. Hypoglykämie ist häufig das Ergebnis einer Unzulänglichkeit oder eines Ausfalls bei der α-Zell-Entwicklung. Die Beispiele zeigen, dass das Fehlen der Pax6-Expression indikativ ist für den Ausfall oder einen Defekt in der α-Zell-Entwicklung und somit der Glucagon-Produktion (und somit für Hypoglykämie).
  • Die frühe Diagnose von Hypoglykämie ist besonders wünschenswert und von bemerkenswerter medizinischer Bedeutung. Somit ist es eine bevorzugte Ausführungsform die erfindungsgemäßen Verfahren zur Diagnose oder den Nachweis von Hypoglykämie einzusetzen. Diese bevorzugte Ausführungsform kann dazu verwendet werden, Hypoglykämie in den Chorionzotten, d. h. vor der Implantation des Embryos, zu diagnostizieren. Darüber hinaus kann Hypoglykämie mit dem erfindungsgemäßen Verfahren anhand von Amniocentese diagnostiziert werden. Die frühe Diagnose von Hypoglykämie in Übereinstimmung mit allen Verwendungen der erfindungsgemäßen Verfahren erlaubt die Behandlung direkt nach der Geburt bevor klinische Symptome entstanden sind.
  • In einer besonders bevorzugten in vitro-Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens wird die Prüfung des Differenzierungsstatus in diesen α-Zellen mit einem Säuger-Embryo oder einem Neugeborenensäuger durchgeführt.
  • Wie hierin vorstehend angegeben, wird es besonders bevorzugt, mindestens einen weiteren Schritt in das erfindungsgemäße Verfahren einzuschließen, der für verschiedene pharmazeutische und genetisch-therapeutische Ansätze spezifisch ist. Wie vorstehend erwähnt, könnten verschiedene kleine pharmazeutisch aktive Moleküle verwendet werden, um Pax6 zu aktivieren und somit die Differenzierung und Produktion von Glucagon-produzierenden α-Zellen und die Entwicklung von Langerhans-Inseln zu induzieren. Gleichermaßen würde das intrazelluläre Targetieren von aktivem Pax6 ähnliche Konsequenzen fördern. In Übereinstimmung mit dieser Anmerkung wurde vorgeschlagen, dass Epithelzellen des Pankreasgangs potenzielle Stammzellen für endokrine Zelltypen enthalten würden. Man geht davon aus, dass die Induktion von Pax6-Aktivität in diesen Zellen, jedoch nicht ausschließlich in diesen Zellen, die Differenzierung in Glucagon-produzierende Zellen vorantreibt.
  • In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens ist der Differenzierungsstatus pankreatischer Zellen das Ergebnis der Aktivität eines Medikaments oder eines gentherapeutischen Ansatzes. Dieser Differenzierungsstatus kann zum Beispiel durch gentherapeutische Ansätze beeinflusst werden, wobei ein funktionelles Pax6- und gegebenenfalls Pax4-Gen unter Verwendung eines retroviralen Vektors (Naldini et al., Science 272 (1996), 263–267; Mulligan, Science 260 (1993), 926–932) oder anderer geeigneter Vektoren in vivo in Zellen eingebracht wird/werden. Gleichermaßen können in Übereinstimmung mit der vorliegenden Erfindung Zellen von einem Patienten isoliert werden, in vitro so modifiziert werden, dass sie in α-Zellen und Langerhans-Inseln von β-Zellen differenzieren, wobei Standard-Gewebekulturverfahren verwendet werden, und diese werden dann wiederum in den Patienten zurückgebracht.
  • In einer besonders bevorzugten Ausführungsform beeinflusst dieses Medikament oder dieser gentherapeutische Ansatz den Expressionsspiegel des Pax6-Gens und, gegebenenfalls, des Pax4-Gens auf Ebene von mRNA oder Protein.
  • In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens ist die Prüfung des Differenzierungsstatus von Pankreaszellen ein Prüfen des Entwicklungsstatus in Pax6-knockout-Mäusen, die gegebenenfalls gleichzeitig Pax4-knock -out-Mäuse sind.
  • In einer zusätzlichen bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung soll ein funktionelles und exprimierbares Pax6-Gen und, gegebenenfalls, ein funktionelles und exprimierbares Pax4-Gen in duktale Epithelzellen eingebracht werden, die, verglichen mit α- und β-Zellen, einen ähnlichen, aber doch unterschiedlichen Differenzierungsweg besitzen. Mit dieser erfindungsgemäßen Ausführungsform ist der Fachmann in der Lage die Bestimmung von duktalen Epithelzellen in α- und β-Zellen umzulenken. Somit geht man davon aus, dass diese Zellen nach Transfektion mit dem Pax6-Gen in α-Zellen differenzieren und die β-Zellen Langerhans'sche Inseln ausbilden. Eine entsprechende pharmazeutische Verwendung wird ins Auge gefasst, falls ein Patient an einer α-Zell-Defizienz und somit einer Glucagon-Defizienz leidet. Es ist beabsichtigt, dass dieses Verfahren in vitro durchgeführt wird, oder dass es in vivo durchgeführt werden soll.
  • Die vorliegende Erfindung betrifft weiter einen transgenen, nicht-menschlichen Säuger, der mindestens ein inaktiviertes Pax6-Allel umfasst.
  • Das erfindungsgemäße, nicht-menschliche, transgene Tier kann vorteilhafterweise zur Kontrolle der Entwicklung unterschiedlicher Zellen verwendet werden, zum Beispiel im Pankreas. Die Verwendung des nicht-menschlichen, transgenen Säugers ist jedoch nicht eingeschränkt auf das Studium der Entwicklung des Pankreas. Da man jetzt davon ausgeht, dass Pax6 in Übereinstimmung mit der vorliegenden Erfindung ein Hauptregulator für α-Zellen ist, kann dessen Einfluss auch in anderen Zelltypen des Körpers untersucht werden.
  • Da das erfindungsgemäße nicht-menschliche, transgene Tier, das vorzugsweise eine transgene Maus im homozygoten Status ist, schwere Pankreas- und neuronale Schäden hat, die im Falle von transgenen Mäusen zum Tod innerhalb von wenigen Minuten nach der Geburt führen, kann dieses transgene Tier weiter für die Untersuchung von Erkrankungen verwendet werden, die mit Funktionsstörungen bei der Entwicklung assoziiert sind, insbesondere im Pankreas und im Gehirn. Da den transgenen Mäusen Glucagon-produzierende Zellen fehlen und sie klinische Symptome zeigen, die ähnlich denjenigen von menschlichen Patienten sind, die an Hypoglykämie leiden, können diese Mäuse als ein Tiermodell für therapeutische und pharmazeutische Forschung gegen Hypoglykämie dienen. Aus den gleichen Gründen wie hierin vorstehend dargelegt, können diese transgenen, nicht-menschlichen Säuger, vorzugsweise diese transgenen Mäuse, als ein Modellsystem zum Studium geistiger Störungen verwendet werden.
  • Vorzugsweise umfasst der erfindungsgemäße transgene, nicht-menschliche Säuger weiterhin mindestens ein inaktiviertes Pax4-Allel.
  • Diese Ausführungsform erlaubt das Studium der Interaktion von Pax6 und Pax4 bezüglich der Entwicklung des Säugers oder bestimmter Gewebe von diesem, insbesondere des Pankreas. All die Anwendungen, die hierin vorstehend hinsichtlich des Pax6-transgenen Säugers diskutiert wurden, gelten auch für den Säuger, der zwei Transgene trägt. Es könnte auch wünschenswert sein, Pax6-Genexpression und gegebenenfalls Pax4-Genexpression in einem bestimmten Entwicklungsstadium und/oder Leben des transgenen Tieres zu inaktivieren. Das kann erreicht werden, indem zum Beispiel gewebespezifische, Entwicklungs- und/oder Zell-regulierte und/oder induzierbare Promotoren verwendet werden, die die Expression von z. B, einem Antisense-Konstrukt oder Ribozym steuern, das gegen das RNA-Transkript gerichtet ist, das das Pax6-Protein codiert und gegebenenfalls gegen die Pax4-codierende RNA. Ein geeignetes induzierbares System ist zum Beispiel die Tetrazyklin-regulierte Genexpression wie z. B. von Gossen and Bujard (Proc. Natl. Acad. Sci. 89 USA (1992), 5547–5551) und Gossen et al. (Trends Biotech. 12 (1994), 58–62) beschrieben.
  • Demgemäß ist in dieser Ausführungsform der transgene, nicht-menschliche Säuger z. B. ein Labortier wie eine Maus oder eine Ratte.
  • In Übereinstimmung mit der vorliegenden Erfindung kann das transgene Tier entweder homozygot oder heterozygot für entweder inaktiviertes Pax4 oder inaktiviertes Pax6 oder für beide inaktivierten Gene sein.
  • Darüber hinaus betrifft die vorliegende Erfindung die Verwendung von mindestens einer ersten Nucleinsäuresequenz, die ein funktionales und exprimierbares Pax6-Protein codiert und, gegebenenfalls, einer zweiten Nucleinsäuresequenz, die ein funktionales und exprimierbares Pax4-Protein codiert, für die Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung, Vermeidung und/oder Verzögerung von Hypoglykämie und/oder eines neuronalen Leidens in einem Säuger. Gemäß der Erfindung können Vektoren, die diese Nucleinsäuresequenzen enthalten, funktionell mit regulatorischen Elementen verknüpft sein, die die Expression dieser Nucleinsäuresequenzen erlauben und/oder Targetierung dieser Nucleinsäuresequenzen in Pankreaszellen erlauben.
  • Die Erfindung betrifft weiter die Verwendung eines funktionalen Pax6-Proteins und gegebenenfalls eines funktionalen Pax4-Proteins zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung, Verhinderung und/oder Verzögerung von Hypoglykämie und/oder eines neuronalen Leidens in einem Säuger. Der Begriff "funktional" besitzt die gleiche Bedeutung wie hierin vorstehend umrissen.
  • Vorzugsweise ist der Säuger, auf den sich in den vorstehenden Ausführungsformen bezogen wird, ein Mensch, eine Ratte oder eine Maus und somit beinhaltet die Erfindung weiterhin einen nicht-menschlichen, transgenen Säuger, der so modifiziert wurde, dass er mindestens ein erstes Nucleinsäure-Molekül umfasst, das eine Sequenz enthält, die ein funktionales und exprimierbares Pax6-Protein codiert und gegebenenfalls ein zweites Nucleinsäure-Molekül, das eine Sequenz beinhaltet, die ein funktionales und exprimierbares Pax4-Protein codiert (wobei der Säuger das/die Nucleinsäure-Molekül(e) exprimiert). Der Säuger kann pränatal oder postnatal modifiziert werden, z. B. nachdem ein erfindungsgemäßes in vitro-Verfahren geringe Mengen, veränderte s) oder kein Pax6-Protein oder mRNA zeigt, zur Behandlung, Verhinderung oder Verzögerung von Hypoglykämie oder einer geistigen Störung; und die Modifikation kann durchgeführt werden mit Verfahren, die hierin diskutiert wurden oder mit Hilfe von Verfahren, die innerhalb des Bereichs eines Fachmanns liegen, ohne dass dabei ausgehend von dieser Offenbarung ein übermäßiger Aufwand betrieben werden muss.
  • Es wird durch die vorliegende Erfindung ins Auge gefasst, dass die Nucleinsäuren und Proteine entweder alleine oder in einer beliebigen Kombination und gegebenenfalls zusammen mit einem pharmazeutisch verträglichen Träger oder einem Arzneimittelträger verabreicht werden. Die Nucleinsäuresequenzen können stabil in das Genom des Säugers integriert werden. Andererseits können virale Vektoren verwendet werden, die spezifisch sind für bestimmte Zellen oder Gewebe, vorzugsweise für Pankreas und/oder Gehirn und die in diesen Zellen fortbestehen, wobei sie die Expression der Pax-Gene in diese Zellen übertragen. Geeignete pharmazeutische Träger und Arzneimittelträger sind im Stand der Technik gut bekannt. Elemente, die in der Lage sind, ein Nucleinsäure-Molekül und/oder ein Protein in spezifische Zellen zu targetieren, sind im Stand der Technik beschrieben, zum Beispiel in Somia et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA 92 (1995), 7570–7574. Die Arzneimittel können dem Säuger in einer geeigneten Dosierung verabreicht werden, die anhand dieser Offenbarung und der Erkenntnis im Stand der Technik bestimmt werden kann, ohne dass dabei von einem Fachmann ein übermäßiger Aufwand betrieben werden muss, wobei typische Faktoren zu bedenken sind, wie die Art, das Alter, das Geschlecht, das Gewicht und die Verfassung des Säugers, die Art der Verabreichung, ob ein Pax6-Protein oder Pax4- und Pax6-Proteine verabreicht werden, ob ein Mittel zur Hemmung oder Stimulierung von Pax6 oder Pax4 und Pax6 verabreicht wird, ob eine Nucleinsäure oder Säuren verabreicht werden und ob die Nucleinsäure oder Säuren für die Expression von Pax6 oder Pax4 und Pax6 oder für die Hemmung der Expression von Pax6 oder Pax4 und Pax6 gedacht sind, unter anderem. Eine typische Dosierung kann zum Beispiel in dem Bereich von 0,001-1000 μg liegen (oder von Nucleinsäure zur Expression oder zur Hemmung der Expression in diesem Bereich); es werden jedoch auch Dosierungen unterhalb oder oberhalb dieses exemplarischen Bereichs ins Auge gefasst, insbesondere unter Inbetrachtziehung der vorstehend erwähnten Faktoren.
  • Die Verabreichung der geeigneten Zusammensetzungen kann auf unterschiedliche Arten durchgeführt werden, z. B. durch intravenöse, intraperitoneale, subkutane, intramuskuläre, topikale oder intradermale Verabreichung. Die erfindungsgemäß hergestellten Arzneimittel können zur Verhinderung oder Behandlung oder Verzögerung von unterschiedlichen Arten von Erkrankungen verwendet werden, zum Beispiel Pankreas-bezogene Erkrankungen, namentlich Hypoglykämie oder unterschiedliche Arten von erworbenen oder angeborenen neuralen Leiden, neuraler Degeneriertheit und verwandter Leiden, wie geistige Erkrankungen. Solche Erkrankungen und Leiden stammen vorzugsweise von endokrinen oder neuralen Geweben ab, z. B. Pankreas und Gehirn.
  • Darüber hinaus ist es möglich, ein Arzneimittel, das eine Nucleinsäuresequenz umfasst, die ein Pax6-Protein codiert und gegebenenfalls eine Nucleinsäuresequenz, die ein Pax4-Protein codiert, für Gentherapie zu verwenden. Es können selbstverständlich auch beide Sequenzen in dem gleichen Vektor enthalten sein. Wie vorstehend beschrieben, entstehen die Krankheiten häufig, wenn die Zellen beide funktionalen Kopien der Pax-Gene verlieren. In einem solchen Fall kann das Einbringen funktionaler Kopien der entsprechenden Gene dabei helfen, die Situation zu verbessern. Forschung, die Gentransfer in Zellen der Keimbahn betrifft, ist, zum Beispiel, eines der am schnellsten wachsenden Gebiete der Reproduktionsbiologie. Gentherapie, die auf das Einbringen therapeutischer Gene in Zellen mit Hilfe von ex vivo- oder in vivo-Verfahren begründet ist, ist eine der wichtigsten Anwendungen von Gentransfer. Geeignete Vektoren und Verfahren für die in vitro- oder in vivo-Gentherapie sind in der Literatur beschrieben und sind dem Fachmann bekannt; siehe z. B. Giordano, Nature Medicine 2 (1996), 534–539; Schaper, Circ. Res. 79 (1996), 911–919; Anderson, Science 245 (1992), 808-813; Isner, Lancet 348 (1996), 370–374; Muhlhauser, Circ. Res. 77 (1955), 1077–1086; Wang, Nature Medicine 2 (1996), 714–716; WO 94/29469 oder WO 97/00957, und Referenzen, die darin zitiert sind. Das (die) Pax6- und, gegebenenfalls, Pax4-codierende(n) Gen e) kann/können für das direkte Einbringen konstruiert sein oder für das Einbringen unter Verwendung von Liposomen, oder viraler Vektoren (z. B. adenoviral, retroviral) in die Zelle. Die Sequenzen, die das menschliche Pax6- und, gegebenenfalls, das Pax4-Gen codieren, können funktionell mit regulatorischen Sequenzen gekoppelt sein, die die Expression dieses (dieser) Gens (Gene) in den Ziel-Zellen und -Geweben exprimieren. In genetischen Erkrankungen repräsentiert das Einbringen eines normalen, eines funktional-hinreichenden Allels, oder eines mutierten nucleären Gens eine Gen-Ersatz-Therapie (siehe z. B. Mouellic, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87 (1990), 4712–4716; Joyner, Gene Targeting, A Practical Approach, Oxford University Press), die hauptsächlich für monogene, rezessive Funktionsstörungen einsetzbar ist, wie zum Beispiel Diabetes und Hypoglykämie.
  • Somit betrifft die Erfindung in einer weiteren Ausführungsform die Verwendung des Pax6-Gens/(und gegebenenfalls des Pax4-Gens) zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung von Hypoglykämie, wobei diese Behandlung Folgendes umfasst:
    • (a) Entfernen einer Zelle aus einem Säuger; (b) Einbringen eines funktionalen und exprimierbaren Pax6-Gens und, gegebenenfalls, eines funktionalen und exprimierbaren Pax4-Gens in diese Zelle; und (c) Wiedereinführen der Zelle, die als ein Produkt aus Schritt (b) erhalten wurde, in diesen Säuger oder in einen Säuger der gleichen Art.
  • In noch einer weiteren Ausführungsform betrifft die Erfindung die Verwendung des Pax6-Gens/(und gegebenenfalls des Pax4-Gens) zur Herstellung eines Medikaments zur Verwendung in einem Verfahren zur Behandlung eines neuronalen Schadens, wobei dieses Verfahren Folgendes umfasst:
    • (a) Entfernen einer Zelle aus einem Säuger;
    • (b) Einbringen eines funktionalen und exprimierbaren Pax6-Gens und, gegebenenfalls, eines funktionalen und exprimierbaren Pax4-Gens in diese Zelle; und
    • (c) Wiedereinführen der Zelle, die als ein Produkt aus Schritt (b) erhalten wurde, in diesen Säuger oder in einen Säuger der gleichen Art. Dieses soll so verstanden werden, dass die eingebrachten Gene nach Einbringen in diese Zelle funktional und exprimierbar sind und vorzugsweise während der Lebenszeit dieser Zelle in diesem Stadium verbleiben.
  • Vorzugsweise ist dieser Säuger ein Mensch, eine Ratte oder eine Maus.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform der Verwendung der Erfindung ist diese Zelle eine Keimzelle oder eine nicht-menschliche embryonale Zelle, oder eine davon abstammende Zelle. Eine embryonale Zelle kann zum Beispiel eine embryonale Stammzelle sein, wie z. B. in Nagy, Proc. Natl. Acad. Sci. 90 (1993), 8424–8428 beschrieben. In einer am meisten bevorzugten Ausführungsform ist diese Zelle eine Eizelle oder stammt davon ab.
  • Geeignete Vektoren und Verfahren für die in vitro oder in vivo-Gentherapie sind in der Literatur beschrieben und sind dem Fachmann bekannt. Die erfindungsgemäßen Arzneimittel können für die Behandlung von Arten von Erkrankungen verwendet werden, die bisher unbekannt sind, soweit sie einen Bezug zu der Expression und/oder nicht-Expression des Pax6-Gens und/oder des Pax4-Gens haben.
  • Diese und andere Ausführungsformen sind anhand der Beschreibung und der Beispiele der vorliegenden Erfindung offenbart und umfasst. Weiterführende Literatur zum Beispiel, die irgendeines) der Verfahren, Verwendungen und Zusammensetzungen betrifft, die in Übereinstimmung mit der vorliegenden Erfindung eingesetzt werden, kann aus öffentlichen Bibliotheken abgefragt werden, zum Beispiel unter Verwendung von elektronischen Hilfsmitteln. Die öffentliche Datenbank "Medline" kann zum Beispiel verwendet werden, die zum Beispiel unter folgender Adresse erhältlich ist http://www.ncbi.nlm.nih.gov/PubMed/medline.html. Darüber hinaus sind dem Fachmann Datenbanken und Adressen wie http://www.ncbi.nlm.nih.gov/, http://www.infobiogen.fr/, http://www.fmi.ch/biology/research_tools.html, http://www.tigr.org/ bekannt und können ebenfalls verwendet werden, z. B. http://www.lycos.com. Ein Überblick über Patent-Information in der Biotechnologie und eine Prüfung relevanter Quellen von Patent-Information, die für eine zurückblickende Suche und für die gegenwärtige Erkenntnis zweckmäßig ist, ist in Berks, TIBTECH 12 (1994), 352–364 bereitgestellt.
  • KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
  • Diese Offenbarung kann am besten in Verbindung mit den sie begleitenden Zeichnungen verstanden werden, die hierin durch Bezugnahme enthalten sind, die Folgendes zeigen:
  • 1 (1a, 1b, 1c). Gezielter Ersatz von Pax6 durch das β-Galactosidase-Gen und Erzeugung heterozygoter Mäuse.
  • Struktur des Wildtyp- und des targetierten Pax6-Locus. Die Deletion des Pax6-Initiationscodons und der gesamten Paired-Domäne wurde durch Insertion der β-Galactosidase-Neomycin-Kassette pGNA erzeugt, die von Philippe Brulet (Le Mouellic, H., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 87 (1990), 4712-4716) entwickelt wurde.
  • Abkürzungen: A, ATG; B, Bam HI; K, Kpn I; RV, Eco RV; S, Spe I.
  • 2 (2a, 2b, 2c, 2d, 2e, 2f, 2g, 2h). β-Galactosidase-Aktivität in heterozygoten Pax6-LacZ-Embryonen in verschiedenen Entwicklungsstadien.
  • Pax6/β-Galactosidase-Färbung wurde in Tag 8,0-Embryonen in der offenen Neuralplatte und der geschlossenen Neuralfalte (Pfeilspitzen) zum ersten Mal nachgewiesen. Am Tag 8,5 wurde in der Vorderhirnanlage (f) und dem Hinterhirn (h) β-Galactosidase-Färbung beobachtet, die mit fortschreitendem Verschluss der Neuralröhre(n) kaudal progredierte. In der Anlage der Mittelhirn (m)-Region wurde keine Expression nachgewiesen. Am Tag 9,5 teilt sich das Vorderhirn in Telencephalon (t), Diencephalon (d) und es bildet sich das optische Vesikel aus. Eine starke β-Galactosidase-Aktivität wurde auch im Hinterhirn, in der Neuralröhre und in dem sich entwickelnden Pankreas nachgewiesen (Pfeilspitze). Im Gehirn, im Auge, in der Neuralröhre und im Pankreas wurde die Expression während der gesamten Entwicklung aufrechterhalten und persistierte in einigen Zellen des adulten Tieres.
  • 3 (3a, 3b). β-Galactosidase-Aktivität in homozygoten Pax6-LacZ-Tieren am Tag 13,5 p.c.
  • –/– -Tiere hatten keine Augen und keinen Riechkolben (Pfeilspitze)
  • 4 (4a, 4b, 4c). β-Galactosidase-Aktivität im Pankreas des Embryo und des Neugeborenen bei heterozygoten Pax6-LacZ-Mäusen.
    • a, β-Galactosidase-Aktivität im Tag 9,0 p.c.- +/– -Embryo. Eine starke Färbung wird im Prosencephalon, Diencephalon, im optischen Vesikel, in der Neuralröhre und im Pankreas nachgewiesen (Pfeilspitze).
    • b, Sagittalschnitt vom Tag 10,0 p.c.- +/– -Embryo. Nur eine Teilmenge der Zellen der Pankreasknospe färbten sich blau, entsprechend einer positiven β-Galactosidase-Expression. Vergrößerung, 400 ×. Abkürzungen: f, Darmrohr; p, Pankreasknospe.
    • c, Pankreas eines Neugeborenen, gefärbt zum Nachweis von β-Galactosidase-Aktivität und gegengefärbt mit Hämatoxylin-Eosin. Blaue β-Galactosidase-positive Zellen wurden ausschließlich in den Langerhans'schen Inseln gefunden, was bedeutet, dass Pax6 ausschließlich in endokrinen Zellen exprimiert wird.
  • 5 (5a, 5b, 5c, 5d, 5e, 5f).
  • Analyse von β-Galactosidase-, Insulin- und Glucagon-Expression im Pankreas von Neugeborenen +/– und –/– -Pax6-defizienten Mäusen.
  • β-Galactosidase-Färbung ist eingeschränkt auf Langerhans'sche Inseln von +/– -Mäusen (a, b, c). Blaugefärbte Zellen exprimieren entweder Insulin (a) oder Glucagon (b, c). Insulin-produzierende Zellen bilden den Kern der Inseln, während Glucagon-produzierende Zellen in der Peripherie lokalisiert sind (mit Pfeilspitzen markiert). In –/– -Mäusen (d, e, f) exprimierten ausschließlich β-Galactosidase-positive Zellen Insulin und waren nicht in der Lage sich in inselartige Strukturen zu organisieren. Die Spuren a, b und d, e sind benachbarte Bereiche. Die Vergrößerung ist 200 ×.
  • 6 (6a, 6b). Analyse der Insulin- und Glucagon-Expression im Pankreas von neugeborenen homozygoten Small eye-Maus-Mutanten.
  • Die Bauchspeicheldrüse eines homozygoten Small eye-Tieres poduziert ausschließlich Insulin (Pfeilspitze). Insulin-produzierende Zellen wurden nicht in Langerhans'sche Inseln organisiert, verblieben jedoch über das gesamte exokrine Gewebe verteilt. Glucagon-Synthese wurde niemals nachgewiesen, was bedeutet, dass die α-Zell-Population fehlte. Vergrößerung ist 200 ×.
  • 7 (7a, 7b). Analyse der Amylase-Expression in exokrinen Geweben des Pankreas von Neugeborenen +/– und –/– -Pax6-defizienten Mäusen.
  • Die Amylase-Expression in –/– -Mäusen in dem exokrinen Gewebe blieb unbeeinflusst.
  • 8 (8a, 8b, 8c, 8d). Analyse von β-Galactosidase-, Insulin-, Glucagon- und Pdx1-Expression im Pankreas neugeborener Mäuse, die sowohl für Pax6 als auch Pax4 homozygot sind. In Mäusen, denen sowohl Pax4 als auch Pax6 fehlte, wurden nur wenige β-Galactosidase-positive Zellen beobachtet (a, b). Diese Zellen exprimierten weder Insulin (a) noch Glucagon (b). Pdx1-positive Zellen konnten jedoch in dem Pankreas nachgewiesen werden. Vergrößerung in den Spuren a, b ist 200 ×; c, d ist 400 ×.
  • 9. Vorgeschlagenes Modell für die Rolle von Pax4 und Pax6 bei der Differenzierung von α- und β-Zellen während der Entwicklung des Pankreas.
  • Am Tag 8,5 p.c. bestimmt die Pdx1-Expression den Bereich des Endoderms, aus dem die exokrinen und endokrinen Vorläuferzellen entstehen. Der Beginn der Pax-Gen-Expression in den endokrinen Vorläufern am Tag 9,0 p.c. legt diese Zellen auf 2 Typen von Vorläufern fest. Die Vorläufer, die sowohl Pax4 als auch Pax6 exprimieren, werden sich in reife Insulin-produzierende β-Zellen entwickeln, während die Vorläufer, die ausschließlich Pax6 exprimieren, in Glucagon-produzierende α-Zellen differenzieren. Die Deletion von Pax4 leitet die β-Zelllinie in die α-Zelllinie um. Die Abwesenheit von Pax6 eliminiert die Linie für α-Zellen.
  • 10. Analyse von β-Galactosidase-, Somatostatin- und PP-Expression im Pankreas von neugeborenen heterozygoten (+/–) und homozygoten (–/–) Pax6-mutierten Mäusen. Blau gefärbte Zellen exprimieren entweder Somatostatin oder PP. Beide Zelltypen werden in +/– -Mäusen an der Peripherie der Langerhans'schen Inseln lokalisiert (markiert durch Pfeilspitze). In –/– -Mäusen waren noch Somatostatin- und PP-Zellen anwesend, diese konnten sich aber nicht mehr in inselähnliche Strukturen organisieren. Vergrößerung, 200 ×.
  • 11. Hormonelle Konzentrationen im Pankreas von Wildtyp, heterozygoten und homozygoten Pax6-mutierten neugeborenen Mäusen.
  • Zwischen Wildtyp- und heterozygoten Tieren wurden geringe oder keine Unterschiede in der Insulin- oder Glucagon-Konzentration beobachtet. Homozygote Tiere zeigten eine Reduktion der Insulin-Konzentration um 70% und eine Reduktion von Glucagon um 100%.
  • 12. Northern Blot-Analyse von Pankreas-Tumorzelllinien.
  • Eine hohe Expression von Pax6 korrelierte mit einer hohen Expression von Insulin und manchmal Glucagon.
  • Ein besseres Verständnis der vorliegenden Erfindung und ihrer zahlreichen Vorteile wird man anhand der nachfolgenden Beispiele erhalten, die zum Zwecke der Veranschaulichung bereitgestellt werden.
  • BEISPIELE
  • Antikörper, die gegen Insulin, Glucagon und Amylase verwendet werden, sind von verschiedenen Firmen kommerziell erhältlich. Die Antikörper, die in den Experimenten des Anmelders verwendet werden, wurden von Boehringer Mannheim gekauft. Der Pdx1-Antikörper war ein großzügiges Geschenk von Prof. Thomas Edlund (Department of Microbiology, University of Umea, 5–901 87 Umea, Schweden). Antikörper mit der gleichen Spezifität, d. h. die das Pdx1-Protein spezifisch erkennen, können unter Verwendung des Pdx1-Protein als ein Antigen in Anlehnung an herkömmliche Verfahren hergestellt werden.
  • Beispiel 1: Herstellung eines Konstrukts zur homologen Rekombination und Erzeugung von Pax6-defizienten Mäusen
  • Pax6-defiziente Mäuse wurden durch homologe Rekombination in embryonalen Stamm (ES)-Zellen erzeugt, wobei gut etablierte Verfahren verwendet wurden; zum Beispiel, A. L. Joyner, Herausgeber, "Gene targeting: a practical approach", Oxford University Press, Oxford, 1993. Kurz, ein 11,5 kb genomisches DNA-Fragment wurde aus einer 129Sv-Maus-genomischen Bibliothek durch Durchmustern nach Homologen isoliert, wobei als Sonde ein Fragment der Pax6-cDNA verwendet wurde, das von Walter and Gruss, Development 113 (1993), 1435–1449, beschrieben wurde. Die Herstellung der genomischen Bibliothek, das Durchmustern nach Homologen und alle Clonierungsschritte wurden unter Verwendung von Techniken durchgeführt, die im Stand der Technik gut bekannt sind; siehe zum Beispiel Sambrook et al., "Molecular Cloning, A Laboratory Manual" 2. Ausgabe, CSH Press, Cold Spring Harbor, 1989; "Nucleic Acid Hybridisation, A Practical Approach", Hames and Higgins Hrsg., IRL Press, Oxford, 1985. Das Pax6-Initiationscodon und die gesamte Paired-Domäne wurde durch Inserierung einer β-Galactosidase-Neomycin-Kassette in die Bam HI-Kpn I-Restriktionsschnittstelle der genomischen DNA ersetzt, wobei eine Mutation erzeugt wurde, die jedes funktionelle Pax6-Protein eliminiert (1). Das Targetierungs-Konstrukt wurde dann in die embryonale Stammzelllinie R1 (Nagy, A., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90 (1993), 8424–8428) eingebracht. Ungefähr 107 ES-Zellen wurden in einer Tris-Phosphat-Pufferlösung, die 30 μg linearisiertes Targetierungs-Konstrukt enthielt, durch Elektroporation unter Verwendung eines einzelnen Pulses von 500 μF/250 Volt bei Raumtemperatur behandelt. Die Zellen wurden dann ausplattiert und 2 Wochen lang gegen das Antibiotikum G418 selektioniert. Resistente Clone wurden vereinzelt isoliert und deren DNA wurde mit den Restriktionsenzymen Spe I-Eco RV gespalten und durch Southern Blot analysiert, wobei eine Sonde verwendet wurde, die spezifisch für den Pax6-Locus war. Das mutierte Pax6-Allel generierte ein 8,2 kb-Fragment im Vergleich mit einem 11 kb-Fragment der Wildtyp-Allele. Von 200 analysierten Kolonien wurden 3 herausgefunden, die ein mutiertes Pax6-Allel enthielten. Durch Vereinigung von ES-Zellen eines mutanten Clons mit 8-Zell-Morula-Embryonen von der NMRI-Mauslinie, wurden chimäre Tiere erzeugt. Die chimären Tiere wurden dann für die Keimbahn-Transmission gekreuzt.
  • Beispiel 2: Expression von Pax6 in sich entwickelnden und neugeborenen Tieren
  • β-Galactosidase-Aktivität wurde in heterozygoten Embryonen während der Entwicklung analysiert. In unterschiedlichen Entwicklungsstadien wurden Embryonen isoliert und 30 Minuten in 3% Formaldehyd/0,02% Glutaraldehyd in Phosphat-gepufferter physiologischer Kochsalzlösung (phosphate buffered saline; PBS) fixiert und über Nacht bei 30°C in einer PBS-Lösung, enthaltend 0,1% Xgal, 2 mM MgCl2, 5 mM K3Fe(CN)6, 5 mM K4Fe(CN)6, 0,2% Nonidet P-40 und 2,5 mM Deoxycholinsäure gefärbt. Pax6/β-Galactosidase-Färbung wurde zuerst in der offenen Neuralplatte und der geschlossenen neuralen Falte von Tag 8,0-Embryonen nachgewiesen (2). Einige wenige Stunden später, am Tag 8,5, wurde eine starke β-Galactosidase-Färbung in den Anlagen des Vorderhirns und des Hinterhirns beobachtet und diese progredierte in kaudaler Richtung, sobald die Neuralröhre geschlossen wurde. Es wurde keine Expression in der Anlage der Mittelhirn-Region nachgewiesen. Am Tag 9,5 teilt sich das Vorderhirn in das Telencephalon, das Diencephalon und es bildet sich das optische Vesikel. Eine starke β-Galactosidase-Aktivität wurde auch im Hinterhirn, in der Neuralröhre und in dem sich entwickelnden Pankreas nachgewiesen. Die Expression wurde während der gesamten Entwicklung im Gehirn, im Auge, in der Neuralröhre und dem Pankreas aufrecht erhalten und persistierte in einigen Zellen des adulten Tieres. Die β-Galactosidase-Expression korrespondierte mit dem Pax6-Expressionsmuster, das zuvor anhand von in situ-Analysen beschrieben wurde (Walter and Gruss, Development 113 (1991), 1435–1449). Die Anmelder fanden keinerlei ektopische β-Galactosidase-Expression in mutierten Tieren.
  • Homozygoten Tieren fehlten Auge und Riechkolben, was in Missbildungen in Schädel und Gesicht resultierte. Sie hatten auch Defekte im Diencephalon und Telencephalon und starben einige Minuten nach der Geburt. Die Phänotypen, die in homozygoten Pax6-LacZ-Mäusen beobachtet wurden, waren ähnlich denjenigen, die in homozygoten Small eye-Mutanten beschrieben wurden (Stoykova, A., et al., Development 122 (1996), 34533465; Grindley, J. C., et al., Development 121 (1995), 1433–1442).
  • Beispiel 3: Expression von Pax6 in endokrinen Zellen des Pankreas
  • Die Pax6-Expression wurde im sich entwickelnden Pankreas durch Studium von β-Galactosidase-Aktivität in heterozygoten Pax6-LacZ-Embryonen studiert. β-Galactosidase-positive Zellen wurden zuerst in einzelnen Zellen der Pankreas-Aufwölbung am Tag 9,0 p.c. nachgewiesen. Die Pax6-Expression wurde in einer Untergruppe von Zellen während der Pankreasentwicklung aufrecht erhalten und war in neugeborenen und adulten Tieren auf die Langerhans'schen Inseln beschränkt (4). In dem exokrinen Gewebe wurde keine Pax6-Expression nachgewiesen.
  • Die hormonale Produktion im embryonalen und Neugeborenen-Pankreas wurde durch indirekte Immunchemie überprüft, wobei ein monoclonaler Antikörper verwendet wurde, der spezifisch für Insulin oder Glucagon ist (5a, b, c). Die Zellen, die Pax6 exprimieren, synthetisierten entweder Glucagon oder Insulin, was bedeutet, dass Pax6 sowohl in α- als auch in β-Zellen exprimiert wird. Die Bauchspeicheldrüsen wurden isoliert und wie vorstehend beschrieben auf β-Galactosidase-Aktivität gefärbt. Nach der Färbung wurden die Gewebe in Paraffin eingebettet und 10 μm-Schnitte wurden angefertigt. Alle immunhistochemischen Analysen mit Paraffinschnitten wurden nach der β-Galactosidase-Färbung entsprechend nach einem Standardverfahren durchgeführt. Kurz, die Schnitte wurden in einer Serie von Alkohol-Verdünnungen rehydriert und in einer Blockierungs-Lösung, die 1 mg/ml Blocking-Reagenz (Boehringer-Mannheim cat. # 1096176), 20% fötales Kälberserum, 100 mM Maleinsäure, 150 mM NaCl enthielt, 30 Minuten bei Raumtemperatur in einer Feuchtekammer prähybridisiert. Die Blocking-Lösung wurde entfernt und die Schnitte wurden dann über Nacht in einer Feuchtekammer bei Raumtemperatur mit einem primären Antikörper gegen Glucagon oder Insulin getestet. Beide primären Antikörper wurden von Sigma erhalten (Cat # G-2654; I-2018) und 1 : 500 in Blocking-Puffer verdünnt. Die Schnitte wurden dann 3 × 10 Minuten in einem TBST-Puffer gewaschen, der 10 mM Tris-Cl pH 8,0, 150 mM NaCl, 0,05% Tween-20 enthielt und über Nacht mit einem zweiten Anti-Maus-IgG-Antikörper, gekoppelt an Meerrettich-Peroxidase (Cappel Teknika Corp. Antikörper cat. # 55559) getestet. Die Schnitte wurden wiederum 3 × in TBST-Puffer gewaschen und in einer TBST-Lösung gefärbt, die 0,5 mg/ml Diaminobenzidin, 0,066% H2O2 enthielt.
  • Beispiel 4: Analyse von Insulin und Glucagon in Mäusen, denen das Pax6-Gen fehlt
  • β-Galactosidase-positive Zellen wurden in dem Pankreas von neugeborenen Tieren mit homozygoten Pax6-Mutanten noch nachgewiesen. Sie waren jedoch nicht in der Lage, Inseln auszubilden und blieben über das gesamte exokrine Gewebe verstreut (5d, e, f). Darüber hinaus produzierten β-Galactosidase-positive Zellen ausschließlich Insulin. Glucagon-produzierende Zellen wurden nie nachgewiesen, was bedeutet, dass die α-Zellen-Population im Pankreas von homozygoten Mutanten fehlte. Ähnliche Ergebnisse wurden mit der natürlichen Maus-Mutante Small eye erhalten (6), die ebenfalls ein mutiertes Pax6-Allel enthält (Van de Meer-Jong, R., et al., Genomics 7 (1990), 270–275).
  • Darüber hinaus bildete die β-Zell-Population von Mäusen mit homozygot mutiertem Pax6 keine Langerhans'schen Inseln aus, obwohl sie noch Insulin produzierte. Im normalen Pankreas ist die Bildung von Inseln in Bezug auf ihren Ursprung nicht clonal (Deltour, L., et al., Development 112 (1991), 1115-1121), man geht aber davon aus, dass sie das Ergebnis von Zellmigration und -aggregation darstellt, die spät in der Entwicklung auftritt (Herrera, P. L., et al., Development 113 (1991), 1257–1265). Es ist möglich, dass Pax6 bei der Organisation der endokrinen Zellen in Inseln beteiligt ist. Kürzliche Studien schlagen vor, dass Zell-Adhäsionsmoleküle bei der Ausbildung der Inseln eine wichtige Rolle spielen (Dahl, U., et al., Development 122 (1996), 2895–2902; Moller, C. J., et al., Mol. Endocrinol. 6 (1992), 1332–1342; Rouiller, D. G., et al., Dev. Biol. 148 (1991), 233–242) und es ist gezeigt worden, dass Pax6 an den Promotor von mindestens einem Zell-Adhäsionsmolekül binden kann (Chalepakis, G., et al., DNA Cell Biol. 13 (1994), 891–900). Schließlich wurde das exokrine Gewebe des Pankreas von Homozygoten mit dem Pankreas von Heterozygoten hinsichtlich der Amylase-Produktion verglichen (Sigma-Antikörper Cat. # A-8273). Es wurde kein Unterschied zwischen Homozygoten und Heterozygoten beobachtet, was bedeutet, dass das exokrine Gewebe in Abwesenheit von Pax6 nicht beeinflusst wurde (7).
  • Beispiel 5: Sowohl Pax4 als auch Pax6 sind für die Differenzierung der Endokrinen erforderlich
  • Das Pax4-Gen ist für die Differenzierung der β-Zellen erforderlich, weil mutante Mäuse keine Insulin-sekretierenden Zellen entwickeln. Das Schicksal von endokrinen Zellen im Pankreas von neugeborenen Tieren, denen sowohl Pax6 als auch Pax4 fehlte, wurde analysiert. In dem exokrinen Gewebe wurde noch eine kleine Population von β-Galactosidase-positiven Zellen beobachtet. Während die Zellen keinerlei Insulin oder Glucagon produzierten, konnte die Expression des Homeobox-Gens Pdx1 nachgewiesen werden (8). Da Pdx1 ausschließlich in Vorläufer-Zellen und reifen β-Zellen exprimiert wird (Guz, Y., et al., Development 121 (1995), 11–18) und homozygote Pax4-Mäuse, denen β-Zellen fehlen, Pdx1 nicht exprimieren, bedeuten die Ergebnisse der Anmelder, dass die endokrinen Vorläufer-Zellen im Pankreas von Pax4/Pax6-homozygoten neugeborenen Mäusen weiterhin vorhanden waren, jedoch nicht in der Lage waren in reife endokrine Zellen zu differenzieren.
  • Basierend auf ihren Beobachtungen schlagen die Anmelder vor, dass Pax4 und Pax6 das zelluläre Schicksal der endokrinen Vorläufer während der Entwicklung bestimmen (9). In einem ersten Schritt definiert das Pdx1-Gen den Bereich des Endoderms, aus welchem pankreatische exokrine und endokrine Vorläufer entstehen, da dessen Expression vor der Expression von Pax-Genen auftritt (Serup, P.- et al., Biochem. J. 310 (1995), 997–1003; Guz, Y., et al., Development 121 (1995), 11-18) und Mäuse, denen Pdx1 fehlt, bilden keinen Pankreas aus (Jonsson, J., et al., Nature 371 (1994), 606–609). Das Einschalten von Pax-Expression in dem Pankreas unterteilt die endokrinen Vorläufer in zwei Populationen: Zellen, die sowohl Pax4 als auch Pax6 exprimieren, differenzieren in reife β-Zellen, während Zellen, die ausschließlich Pax6 exprimieren, in α-Zellen differenzieren. Die Abwesenheit von Pax4 leitet alle Vorläufer in die α-Zelllinie um, da Pax6 in diesen Zellen weiterhin vorliegt. Dies wird durch die Beobachtung unterstützt, dass homozygote Pax4-mutante Mäuse eine größer als normale α-Zell-Population besitzen, während ihnen β-Zellen fehlen. Die Deletion von Pax6 eliminiert die Linie der α-Zellen in ihrer Gesamtheit oder kann die Vorläufer in die Linie der β-Zellen umleiten. Wenn sowohl Pax4 als auch Pax6 fehlen, sind die Vorläufer nicht in der Lage sich in reife endokrine Zellen zu entwickeln. Somit sind beide Pax-Gene für die endokrine Zelldifferenzierung während der Pankreasentwicklung erforderlich.
  • Beispiel 6: Expression von Pax6 in pankreatischen δ- und PP-Zellen
  • Die Pax6-Expression in Somatostatin-produzierenden δ-Zellen und in PP-Zellen wurde durch Studium der β-Galactosidase-Aktivität in heterozygoten und homozygoten Pax6-LacZ-neugeborenen Mäusen analysiert (10). Die hormonelle Produktion im Pankreas von Neugeborenen wurde durch indirekte Immunchemie überprüft, wobei ein monoclonaler Antikörper verwendet wurde, der spezifisch für Somatostatin oder pankreatisches Polypeptid (PP) ist. Zellen, die sowohl Somatostatin als auch PP produzierten, exprimierten Pax6, was bedeutet, dass Pax6 auch in δ-Zellen und PP-Zellen exprimiert wird. Beide Zelltypen wurden in der Peripherie der Langerhans'schen Inseln gefunden. Diese Zellen lagen auch noch in homozygoten Tieren vor, waren aber nicht in Inseln organisiert. Die Bauchspeicheldrüsen von Neugeborenen wurden isoliert und wie in Beispiel 2 beschrieben auf β-Galactosidase-Aktivität gefärbt, während die indirekte Immunchemie wie in Beispiel 3 beschrieben durchgeführt wurde. Die monoclonalen Antikörper gegen Somatostatin und PP wurden von Dacko (Cat # AO566, AO619) erhalten.
  • Beispiel 7: Insulin- und Glucagon-Konzentrationen in Bauchspeicheldrüsen von heterozygoten und homozygoten Pax6-mutanten neugeborenen Mäusen
  • Insulin- und Glucagon-Produktion in vollständigen Bauchspeicheldrüsen von heterozygoten oder homozygoten neugeborenen Pax6-LacZ-Mäusen wurde durch einen Radioimmuntest (radioimmunoassay; RIA) quantifiziert. Zwischen Wildtyp- und heterozygoten Tieren wurden keine signifikanten Unterschiede in den Insulin- oder Glucagon-Konzentrationen beobachtet (11). In homozygoten Tieren wurde jedoch eine dreifache Abnahme der Insulin-Konzentration und ein vollständiges Fehlen der Glucagon-Produktion beobachtet. Diese Ergebnisse sind in Übereinstimmung mit denjenigen, die anhand der Immunhistochemie erhalten wurden (Beispiel 4) und schlagen vor, dass Pax6 für die Ausbildung von α-Zellen während der Pankreas-Entwicklung erforderlich ist und an der Regulation des Insulin-Gens in β-Zellen beteiligt ist. Kürzlich wurde auch gezeigt, dass das Pax6-Protein den Insulin-Promotor binden und aktivieren kann (Sander et al., Genes Dev. 11 (1997), 1662-1673).
  • RIAS für Insulin wurden unter Verwendung eines kommerziell erhältlichen Kits von Lonco Research (Cat#: RI-13K) durchgeführt und dies erfolgte gemäß den Anleitungen der Hersteller. Die Bauchspeicheldrüsen von Wildtyp- und mutanten Mäusen wurden unmittelbar vor der Geburt an e19 der Schwangerschaft durch Kaiserschnitt isoliert. Einzelne Bauchspeicheldrüsen wurden in 40 μl Säure-Extraktionspuffer (80 ml Ethanol, 17,9 ml destilliertes Wasser, 2,1 ml konzentrierte HCl) gegeben und auf Eis einer Ultraschall-Behandlung unterzogen, um ihren Protein-Inhalt zu extrahieren. Nach einer Inkubation über Nacht bei 4°C wurden die Proben 15 Minuten bei 13.000 UpM zentrifugiert. Die Überstände wurden dann in ein neues Gefäß übertragen und der RIA wurde mit einer 1 : 1.000 bis 1 : 10.000-Verdünnung mit jeder Protein-Extraktion durchgeführt. Kurz, 100 μl jedes verdünnten Extraktes wurden 18 Stunden bei 4°C mit 100 μl Ratten-Insulin-Antikörper und 100 μl 125I-Insulin-Markierung inkubiert. Die Proben wurden dann in 1 ml Präzipitations-Reagenz 20 Minuten bei 4°C gefällt und 15 Minuten bei 2.000 UpM zentrifugiert. Die Überstände wurden dekantiert und die Rückstände in einem Scintillationszähler gezählt. Der RIA für Glucagon wurde unter Verwendung eines kommerziell erhältlichen Kits von Linco Research (Cat#: GL-32K) entsprechend den Anleitungen des Herstellers durchgeführt. Proteine von neugeborenen Wildtyp- und Mutanten-Bauchspeicheldrüsen wurden wie vorstehend beschrieben isoliert und 100 μl von jeder verdünnten Probe wurden 18 Stunden bei 4°C mit 100 μl Ratten-Glucagon-Antikörper inkubiert, gefolgt von einer 24-Stunden Inkubation bei 4°C mit 100 μl 125I-Glucagon-Markierung. Die Proben wurden dann in 1 ml Präzipitations-Reagenz 20 Minuten bei 4°C ausgefällt und 15 Minuten bei 2.000 UpM zentrifugiert. Die Überstände wurden dekantiert und die Rückstände in einem Scintillaitonszähler gezählt.
  • Beispiel 8: Expression von Pax6 in pankreatischen Tumorzelllinien
  • Die Pax6-Expressionsspiegel wurden in verschiedenen Insulinom-(RIN 5F, βTC1), Glucagonom- (αTC1-9), Somatostatinom-(RIN 14β), Insel-Tumor-(HC 13, HC 13T, RINm) und duktalen Adenokarzinom-(mPAC)-Zelllinien analysiert (12). In βTC1 und HC 13-Zelllinien wurde eine sehr hohe Pax6-Expression nachgewiesen, während in den Linien RINm, RIN 5F und RIN 14β mäßige Spiegel beobachtet wurden. Wenig oder gar keine Expression wurde in mPAC, αTC1-9 und HC 13T-Zelllinien nachgewiesen. Pankreatische endokrine Tumoren sind häufig mit einer hohen hormonellen Sekretion assoziiert. In Tumor-Zelllinien, die hohe Spiegel an Pax6 exprimieren, wurden hohe Spiegel an Insulin- und Glucagon-Expression beobachtet, was bedeutet, dass eine Beziehung bestehen kann zwischen abnormaler Pax6-Expression und aberranter hormoneller Produktion in endokrinen Tumoren. Darüber hinaus wurde die Insulin- und Glucagon-Expression verhindert, nachdem die Insel-Tumorzelllinie HC 13 in die Fibroblasten-Zelllinie HC 13T entdifferenziert wurde. Die Expressionsspiegel in den unterschiedlichen Zelllinien wurden mit Hilfe herkömmlicher Northern Blot-Analysen ausgewertet, wie beschrieben, z. B. bei Sambrook et al., "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", CSH Press, Cold Spring Harbor, 1989. Kurz, die Zellen wurden trypsiniert und in ein Gefäß übertragen, das 1 ml Homogenisierungspuffer enthielt (3 M LiCl, 6 M Harnstoff, 0,1% SDS) und 3–4 × 20 Sekunden auf Eis einer Ultraschall-Behandlung unterzogen. Nach Inkubation über Nacht bei 4°C wurden die Lysate 30 Minuten bei 18.600 UpM zentrifugiert. Die RNA-Rückstände wurden 2 × in 1 ml 3 M LiCl gewaschen, in 500 μl Lösungspuffer aufgelöst (10 mM Tirs-Cl pH 7,5, 0,5% SDS) und durch Phenol-Chloroform-Extraktion gereinigt, gefolgt von einer Ethanol-Fällung. 20 μg RNA wurden in einem Agarosegel aufgetrennt und auf eine Nylon-Membran übertragen, wobei standardisierte Northern Blot-Protokolle verwendet wurden. Die Membranen wurden dann entweder mit einer Maus-Pax6-cDNA-Sonde (EMBL Registriernummer # X63963), einer Maus-Glucagon-cDNA-Sonde (EMBL Registriernr. # Z46845) oder einer Ratten-Insulin-cDNA-Sonde (EMBL Registriernr. # J04807) hybridisiert. Die Zelllinien RINm (cat # CRL-2057), RIM 5F (cat # CRL-2058) und RIN 14β (cat # CRL-2059) wurden von der American Tissue Culture Collection erhalten. Die Zelllinien βTC1, αTC1-9, HC 13, HC 13T und mPac können von Rip1Tag2-trangenen Mäusen isoliert werden (Hanahan, D., Nature 315 (1985), 115–122), wobei herkömmliche Gewebekultur-Verfahren verwendet werden.
  • Während wir hiermit bevorzugte Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung beschrieben haben, ist dies so zu verstehen, dass die Erfindung, die durch die anhängigen Ansprüche definiert ist, durch die besonderen Einzelheiten, die in der vorstehenden Beschreibung dargestellt sind, nicht eingeschränkt ist, da zahlreiche offensichtliche Variationsmöglichkeiten davon möglich sind, ohne sich von ihrem Schutzumfang zu entfernen.
  • SEQUENZPROTOKOLL
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Claims (27)

  1. In vitro-Verfahren zur Prüfung des Differenzierungsstatus von Pankreaszellen eines Säugers, umfassend: (a) Bestimmen des Anteils oder Status von Pax6-mRNA in Pankreaszellen des Säugers; und/oder (b) Bestimmen des Anteils oder Status von Pax6-Protein in Pankreaszellen des Säugers; und (c) Vergleichen des Anteils oder Status von Pax6-mRNA und/oder Pax6-Protein mit dem entsprechenden Anteil in normalen Pankreaszellen.
  2. Verfahren nach Anspruch 1 darüber hinaus umfassend (d) Bestimmen des Anteils oder Status von Pax4-mRNA in Pankreaszellen des Säugers; und/oder (e) Bestimmen des Anteils oder Status von Pax4-Protein in Pankreaszellen des Säugers; und (f) Vergleichen des Anteils oder Status von Pax4-mRNA und/oder Pax4-Protein mit dem entsprechenden Anteil in normalen Pankreaszellen.
  3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei der Säuger in der (i) Embryonal-; (ii) Neugeborenen-; oder (iii) Erwachsenen-Phase ist.
  4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei der Säuger eine Maus oder wobei der Säuger ein Mensch ist.
  5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei das Bestimmen in Schritt (a) und, gegebenenfalls, in Schritt (d) ausgeführt wird durch Verwendung (i) einer Nucleinsäuresequenz, die zumindest in einem Teil dem Pax6-Gen entspricht und, vorzugsweise, zumindest einen Teil des Pax6-Proteins codiert und, gegebenenfalls, einer zweiten Nucleinsäuresequenz, die zumindest in einem Teil dem Pax4-Gen entspricht und, vorzugsweise, zumindest einen Teil des Pax4-Proteins codiert; (ii) einer Nucleinsäuresequenz, die komplementär zu der/den Nucleinsäuresequenz(en) aus (i) ist/sind; oder (iii) eines Primers oder eines Primerpaars, das mit der/den Nucleinsäuresequenz(en) von (i) oder (ii) hybridisiert.
  6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei die Bestimmung in Schritt (b) und/oder, gegebenenfalls, in Schritt (e) ausgeführt wird durch Verwendung eines Antikörpers oder eines Fragmentes davon, der spezifisch das Pax6-Protein bindet und, gegebenenfalls, durch Verwendung eines zweiten Antikörpers oder eines Fragmentes davon, welcher spezifisch das Pax4-Protein bindet.
  7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, wobei die Pankreaszellen α-Zellen oder β-Zellen sind.
  8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, wobei der Differenzierungsstatus kennzeichnend ist für eine Bösartigkeit oder ein bösartiges Potenzial der Pankreaszelle.
  9. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, wobei der Differenzierungsstatus in den α-Zellen oder β-Zellen kennzeichnend ist für Hypoglykämie und/oder neuronale Leiden, z. B. eine geistige Störung.
  10. Verfahren nach Anspruch 9, wobei der Differenzierungsstatus in den α-Zellen oder β-Zellen im Embryonen-Status oder im Neugeborenen-Status getestet wird.
  11. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 10, wobei der Differenzierungsstatus das Ergebnis der Wirksamkeit eines Arzneimittels oder eines gentherapeutischen Ansatzes ist.
  12. Verfahren nach Anspruch 11, wobei das Arzneimittel auf die Expressionshöhe des Pax6-Gens wirkt und, gegebenenfalls, auf das Pax4-Gen auf mRNA-Ebene oder Proteinebene wirkt.
  13. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 10, wobei der Differenzierungsstatus in Pax6-Knockout-Mäusen getestet wird, die, gegebenenfalls, gleichzeitig Pax4-Knockout-Mäuse sind.
  14. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 10, darüber hinaus umfassend das Einführen eines funktionalen und exprimierbaren Pax6-Gens und, gegebenenfalls, darüber hinaus umfassend das Einführen eines funktionalen und exprimierbaren Pax4-Gens in Pankreaszellen oder in Epithelzellen des Pankreasgangs.
  15. Nicht-menschlicher, transgener Säuger, umfassend mindestens ein inaktiviertes Pax6-Allel.
  16. Nicht-menschlicher, transgener Säuger nach Anspruch 15, darüber hinaus umfassend mindestens ein inaktiviertes Pax4-Allel.
  17. Nicht-menschlicher, transgener Säuger nach Anspruch 15 oder 16, welcher ein nicht-menschliches Tier ist.
  18. Nicht-menschlicher, transgener Säuger nach Anspruch 17, welcher eine Maus oder eine Ratte ist.
  19. Verwendung einer wirksamen Dosis einer Nucleinsäuresequenzen, die ein funktionales und exprimierbares Pax6-Protein codiert und, gegebenenfalls, einer zweiten Nucleinsäuresequenz, die ein funktionales und exprimierbares Pax4-Protein codiert, für die Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung, Vermeidung und/oder Verzögerung von Hypoglykämie und/oder eines neuronalen Leidens, z. B. einer geistigen Störung, in einem Säuger.
  20. Verwendung nach Anspruch 19, wobei die Nucleinsäuresequenz funktionell verknüpft ist mit regulatorischen Elementen, welche die Expression und/oder Targetierung des Pax6-Proteins und, gegebenenfalls, des Pax4-Proteins in spezifischen Zellen ermöglichen.
  21. Verwendung einer wirksamen Dosis eines funktionalen Pax6-Proteins und, gegebenenfalls, eines funktionalen Pax4-Proteins, zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung, Verhinderung und/oder Verzögerung von Hypoglykämie und/oder eines neuronalen Leidens in einem Säuger.
  22. Verwendung nach einem der Ansprüche 19 bis 21, wobei das Arzneimittel verabreicht wird zur Stimulation der Expression eines Pax6-Gens und, gegebenenfalls, eines Pax4-Gens in Pankreaszellen und/oder zum Einführen eines funktionalen und exprimierbaren Pax6-Gens und, gegebenenfalls, eines funktionalen und exprimierbaren Pax4-Gens in Pankreaszellen eines Säugers.
  23. Verwendung eines funktionalen und exprimierbaren Pax6-Gens und, gegebenenfalls, eines funktionalen und exprimierbaren Pax4-Gens, zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung von Hypoglykämie und/oder eines neuronalen Leidens, z. B. einer geistigen Störung, in einem Säuger.
  24. Verwendung nach Anspruch 23, wobei das Arzneimittel in vitro in eine Zelle des Säugers eingeführt wird.
  25. Verwendung nach Anspruch 24, wobei die Zelle wieder eingeführt wird in den Säuger oder in einen Säuger der gleichen Spezies.
  26. Verwendung nach Anspruch 24 oder 25, wobei die Zelle eine Keimzelle, eine Eizelle, eine embryonale Zelle, oder eine davon gewonnene Zelle ist, mit der Ausnahme von menschlichen embryonalen Zellen.
  27. Verwendung nach einem der Ansprüche 19 bis 26, wobei der Säuger ein Mensch, eine Ratte oder eine Maus ist, mit der Ausnahme von menschlichen embryonalen Zellen.
DE69722035T 1996-12-31 1997-12-30 Neue testmethode, um den differenzierungszustand von bauchspeicheldrüsenzellen eines säugetieres festzustellen. Expired - Fee Related DE69722035T2 (de)

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