DE69333984T2

DE69333984T2 - Androgen-regulierung durch dns sequenzen des rattenprobasin-gens

Info

Publication number: DE69333984T2
Application number: DE69333984T
Authority: DE
Inventors: J. Robert Winnipeg MATUSIK
Original assignee: University of Manitoba
Current assignee: University of Manitoba
Priority date: 1992-08-07
Filing date: 1993-08-09
Publication date: 2006-09-14
Anticipated expiration: 2013-08-10
Also published as: GB9216851D0; US5952488A; CA2142181A1; AU4694793A; KR950703056A; KR100211294B1; ATE318306T1; DE69333984D1; JPH07509608A; CA2142181C; EP0656060A1; WO1994003594A1; EP0656060B1; JP3524092B2; US5783681A

Description

GEBIET DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung betrifft ein neues DNA-Molekül und Fragmente davon, welches die Herstellung (1) eines Assays für androgene oder anti-androgene Stoffe, (2) transgener nicht-menschlicher eukaryotischer Tiermodelle für Prostata-Erkrankung, (3) von Zellkulturmodellen für Prostata-Erkrankung und (4) Behandlung von humaner gutartiger Prostata-Hyperplasie und humanem Prostata-Krebs durch Gentherapie gestattet. Diese Erfindung ermöglicht Assays bezüglich Agonisten und Antagonisten des Androgenrezeptors oder Stoffwechselwegen, welche zu Androgen-Wirkung führen, Testmaterialien hinsichtlich Karzinogenität an der Prostata, Testarzneimittel und Gentherapie oder schutzgebendes Potential von Materialien auf Prostatazellen gegen Prostata-Erkrankung.
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Androgen-Aktivität: Eine klinische Notwendigkeit zum Assayen der Funktion des Androgenrezeptors (AR) tritt auf, wenn Defekte im Weg der Androgen-Wirkung erscheinen. Zum Beispiel beeinflussen Mutationen im AR die Bioaktivität des Rezeptors bei Androgen-Insensitivitäts-Syndrom AIS (Kazemi-Esfarjani et al., 1993; Brinkmann et al., 1991; Brinkmann et al., 1992a, Brinkmann et al., 1992b; De Bellis et al., 1992; French et al., 1990; Imperato-McGinley et al., 1990; Lubahn et al., 1989; Quigley et al., 1992; Ris-Stalpers et al., 1990; Ris-Stalpers et al., 1991; Simental et al., 1992) oder testikulär feminisierten Tieren (Yarbrough et al., 1990; He et al., 1991), Kennedy-Syndrom (La Spada et al., 1991), Prostata-Krebs (Newmark et al., 1992, Brinkmann et al., 1991; Veldscholte et al., 1992b; Veldscholte et al., 1992a; Veldscholte et al., 1990) und Brustkrebs (Wooster et al., 1992). Neben Mutationen direkt in dem Rezeptor können Defekte in dem nicht-androgenischen Mechanismus zur Steroidrezeptor-Aktivierung auftreten, wie es für Steroidrezeptoren berichtet worden ist (Power et al., 1991; Shemshedini et al., 1992; Kuiper et al., 1993). Ein Assay, welcher das Ausmaß dieser Defekte messen würde, würde auch ein Werkzeug bereitstellen, um neue Materialien zu testen, welche den defekten Rezeptor aktivieren und die Grundlage einer Therapie bilden können.
Androgenrezeptoren sind Mitglieder einer Überfamilie von Zellkernrezeptoren, welche angenommenermaßen hauptsächlich als Transkriptionsfaktoren wirken, welche Gen-Aktivität durch Binden von spezifischen DNA-Sequenzen an Hormon-Responsiven-Elementen (HRE) und assoziierten Faktoren regulieren (Allan et al., 1991; Smith et al., 1993; Evans, 1988; Beato, 1989). Im Allgemeinen können diese HREs in zwei Kategorien von gegenläufigen Wiederholungs- bzw. "Inverted-Repeat"-Konsensussequenzen gruppiert werden: Das TGACC-Motiv, welches Östrogen-, Retinsäure- und Thyroid-Hormonantworten vermittelt (Klein-Hitpass et al., 1986; Umesono et al., 1988); und die TGTTCT-Sequenz, welche Regulierung durch Glucocorticoide, Progestine und Androgene vermittelt (Scheidereit et al., 1986; Shrahle et al., 1987; Ham et al., 1988). Der Einschluss des Androgenrezeptor-Responsiven-Elementes (ARE) in dieser letzteren Gruppe basiert größtenteils auf der beobachteten Bindung von Androgenrezeptoren an das Glucocorticoid-Responsive-Element (GRE) von Maus-Mammary-Tumorvirus(MMTV)-DNA (Ham et al., 1988; Roche et al., 1992; Darbre et al., 1986; Cato et al., 1987) und des Tyrosin-Aminotransferase(TAT)-Gens (Denison et al., 1989).
Die Androgenregulierung des C3(1)-Gens, welches eine Polypeptidkomponente von Prostata-Steroidbindungsprotein codiert, ist untersucht worden (Heyns et al., 1978; Hurst et al., 1983; Parker et al., 1988; Parker et al., 1980). Obwohl Sequenzen sowohl innerhalb der Promotorregion als auch dem ersten Intron des C3(1)-Gens eine Hochaffinitätsbindung für Androgenrezeptoren aufweisen (Perry et al., 1985; Claessens et al., 1993; De Vos et al., 1991; Rushmere et al., 1990), sind Versuche, diese Sequenzen zum Vermitteln von Androgenregulierung auf ein homologes oder heterologes Promotor-Reporter-System zu verwenden, von begrenztem Erfolg gewesen (Parker et al., 1985; Parker et al., 1988); wobei eine nur schwache Androgen-Induktion mit diesen genomischen Fragmenten beobachtet wurde (Claessens et al., 1993; Tan et al., 1992; De Vos et al., 1991; Rushmere et al., 1990; Claessens et al., 1990b, Claessens et al., 1990a; Claessens et al., 1989b; Claessens et al., 1989a). Kürzlich haben DNAase I-Footprinting-Experimente gezeigt, dass die DNA-Bindungs-Domäne des Androgenrezeptors an ein Glucocorticoid-Responsive-Element (GRE) bindet, welches in diesem intronischen Fragment vorhanden ist (De Vos et al., 1991; Claessens et al., 1993). Das Vorkommen eines vollständigen GRE in diesem Gen ist konsistent mit den beobachteten Effekten von Glucocorticoiden auf die Expression der C1-Komponente von Prostata-Bindungsprotein (Rennie et al., 1989). Das humane Prostata-spezifische Antigen(PSA)-Gen ist in humanen Prostata-Tumoren und in Zellkultur Androgen-reguliert (Riegman et al., 1991; Montgomery et al., 1992; Young et al., 1992; Murphy et al., 1992; Armbruster, 1993). Der Aufbau des PSA-DNA-Promotors enthüllt eine GRE-ähnliche Sequenz, welche auf Androgene anspricht (Riegman et al., 1991). Das Slp-Gen zeigt eine spezifische Androgen-Regulierung über GRE-ähnliche Sequenzen (Adler et al., 1992; Adler et al., 1991). Andere Androgen-regulierte Gene aus der Prostata sind kloniert worden, wie das SVS II (Dodd et al., 1983; Dodd et al., 1986; Harris et al., 1990), 20-kDa-Protein (Ho et al., 1989), und DP1 (Ho et al., 1992), aber die Androgen-Regulatorsequenzen sind nicht identifiziert worden.
Transgene Tiere: Die Einführung eines Gens in die Keimbahn beim Ein-Zell- oder einem frühen Embryo-Stadium erzeugt ein transgenes Tier, welches das Gen enthalten und an seine Nachkommenschaft weitergeben wird. Eine gewebespezifische Expression eines Gens kann durch gewebespezifische Elemente bei der DNA restringiert sein. Der Erfolg mit prostataspezifischer Expression von Transgenen ist begrenzt gewesen und häufig nicht auf die Prostata beschränkt gewesen. Zum Beispiel wird das vollständige Ratten-C3(1)-Gen einschließlich 4,3 kb 5'-flankierender Sequenz und 2,2 kb an 3'-flankierender Sequenz eine prostataspezifische Expression in transgenen Mäusen ergeben (Allison et al., 1989), aber die Verwendung von nur den 6 kb an 5'-flankierendem C3(1) führte zu transgenen Linien, welche auf die Prostata, Samenbläschen und Hoden zielten (Buttyan et al., 1993). MMTV, welches an int-2 gekoppelt war, erzeugte eine transgene Mauslinie, welche Prostata-Epithelzell-Hyperplasie entwickelte, die Androgen-reguliert war, aber die Männchen sind steril (Muller et al., 1990; Leder, 1990; Tutrone et al., 1993). Verschiedene Männchen in unterschiedlichen Linien exprimierten, zusätzlich zum Exprimieren des Transgens in der Prostata, das int-2-Gen auch in den Samenbläschen, dem Vas deferens und der Speicheldrüse, wohingegen die Weibchen das Gen in der Brustdrüse exprimierten und Brustdrüsenhyperplasie entwickelten (Leder, 1990). Allerdings kann ein Targeting mit MMTV zu Expression in den Hoden führen, was zu Sterilität führt (Lucchini et al., 1992). Unter Verwendung des Promotors des gp91-phox-Gens (ein Gen, das normalerweise nicht in der Prostata exprimiert wird), der an die "Early"-Region von SV-40-Virus verknüpft ist, wurden Schädigungen in der Prostata, welche als Neuroplastone definiert sind, erzeugt (Skalnik et al., 1991).
Jedwedes Gen, welches auf die Prostata in transgenen Tieren zielgerichtet ist, kann Prostata-Wachstum und -Funktion verändern. Onkogene und Tumorsupressor-Gene (Fleming et al., 1986; Matusik et al., 1987; Dodd et al., 1990; Hockenbery, 1992; Buttyan et al., 1993; Carter et al., 1990a; Carter et al., 1990b; Tutrone et al., 1993; Bookstein et al., 1993; Thompson et al., 1993; Peehl, 1993; Dodd et al., 1993; McNicol et al., 1991; McNicol et al., 1990a; McNicol et al., 1990b) sowie Wachstumsfaktoren (Morris et al., 1990; Ichikawa et al., 1992; Isaacs et al., 1991a; Isaacs et al., 1991b; Carter et al., 1990a; Pienta et al., 1991; Morton et al., 1990), welche mit der Entwicklung von Prostatahyperplasie oder -krebs in Verbindung gebracht wurden, sind wahrscheinliche Ausgangspunkte. Darüber hinaus sind Gene, wie das große T-Antigen, welches erfolgreich Krebs in endokrinen Drüsen induziert, wenn es in transgenen Tieren zielgerichtet wird, geeignete Kandidaten (Anonym, 1991: Stefaneanu et al., 1992; Hanahan, 1986; Rindi et al., 1991; Hamaguchi et al., 1990).
Transgene Tiere, welche das Transgen in einer gewebe- oder nicht-gewebespezifischen Weise exprimieren, können zu neuen Modellen führen. Zum Beispiel kann nicht-gewebespezifische Expression zu Krankheitszuständen in einer Anzahl von Geweben führen, wohingegen gewebespezifische Expression von zielgerichteten Genen zu Krankheitszuständen in angezielten Organen wie folgend führen kann: Krebsmodelle (Burck et al., 1988; Yamamura, 1989; Folkman et al., 1989; Reynolds et al., 1988; Anonym, 1992; Bautch, 1989; Hanahan, 1986; Lucchini et al., 1992; Anonym, 1988); Brustdrüsen-Adenokarzinom (Muller et al., 1988; Muller, 1991; Pawson, 1987; Callahan et al., 1989; Muller, 1991; Strange et al., 1990); Hyperplasie und Dysplasie (Mayo et al., 1988; Borrelli et al., 1992; Eva et al., 1991; Lin et al., 1992; Matsui et al., 1990); Neuroblastome (Dalemans et al., 1990); Leberkrebs (Butel et al., 1990; Dubois et al., 1991; Sandgren et al., 1993; Sandgren et al., 1989); gonadale Tumoren (Schechter et al., 1992; Matzuk et al., 1992); Thymus-Mesenchymtumoren (Sinkovics, 1991); und Leukämie (Knight et al., 1988; Adams et al., 1985). Ferner können zielgelenkte Gene wirken, um die Tumorbildung durch Vermittlung von Empfindlichkeit gegenüber Transformation durch Faktoren oder Karzinogene zu beschleunigen (Langdon et al., 1989; Breuer et al., 1989; Mougneau et al., 1989). Promotoren, wie Metallothionein (MT), führen oft zu genereller Expression in vielen Organen (Dyer et al., 1989; Iwamoto et al., 1991), wohingegen der MMTV-Promotor wegen seines HRE die Expression auf endokrine Zielgewebe begrenzt (Ham et al., 1988; Roche et al., 1992; Darbre et al., 1986; Cato et al., 1987). Sogar die Verwendung eines generellen Promotors kann zu spezifischen Effekten führen, wenn der exprimierte Faktor auf ein spezifisches Gewebe abzielt, d. h. MT-Wachstumshormon-Releasing-Faktor (Mayo et al., 1988) oder ektopischer Nervenwachstumsfaktor (Borrelli et al., 1992) führen zu Hypophysenhyperplasie in transgenen Mäusen.
Gentherapie: Die Behandlung von menschlicher Krankheit oder Krankheit in nicht-menschlichen eukaryotischen Tieren durch Gentherapie begann mit dem Ziel, Einzelgen-vererbte Defekte zu korrigieren. Fortschritte haben dieses Ziel erweitert, wodurch die Behandlung von erworbenen Krankheiten, wie Krebsarten (Davies, 1993; Anderson, 1992; Mulligan, 1993; Culotta, 1993; Felgner, 1993; Tolstoshev et al., 1993), beinhaltet wird. Anerkannte klinische Versuche zeigen ermutigende Ergebnisse. Das praktische Problem bestand in der Entwicklung von effizienten und spezifischen Herangehensweisen, welche ein Gen in den korrekten Zelltyp überführen und darin exprimieren werden. Die Herangehensweisen können als virale und nicht-virale Verfahren zum Transferieren von Genen klassifiziert werden. Einige der therapeutischen Herangehensweisen transferieren die Gen(e) in Patientenzellen, welche kultiviert worden sind, und danach in das gleiche Individuum zurückgeführt werden (Fenjves et al., 1989). Von anderer Seite wurde ein direkter Transfer des Gens in das menschliche Gewebe versucht. Beispielsweise kann ein DNA-Komplex mit Liposomen an die Atemwege zugeführt werden und den zystischen Fibrose-Defekt in transgenen Mäusen korrigieren (Hyde et al., 1993). Der direkte Gen-Transfer durch DNA:kationische-Liposomen in adulte Mäuse hinein demonstriert einen effizienten Transfer, und Expression tritt in den meisten Organen auf (Zhu et al., 1993). Wenn das Gen stabil integriert wird, dann kann der Defekt korrigiert werden, wohingegen, wenn das Gen vorübergehend exprimiert wurde, eine Linderung der Krankheit dann wahrscheinlich vorübergehend sein wird. In Fällen, wie Krebs, jedoch, worin das Ziel darin besteht, die kanzeröse Zelle zu töten, wird eine vorübergehende Expression ausreichend sein, wenn das exprimierte Gen toxisch ist (Short et al., 1990; Culver et al., 1992). Herangehensweisen können das Exprimieren von Tumorsuppressorgenen (Friedmann, 1992) oder Genen zum Inhibieren von exprimierten Onkogenen (Mukhopadhyay et al., 1991) beinhalten.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
In einem Aspekt sieht die vorliegende Erfindung ein isoliertes DNA-Molekül vor, welches eine 5'-flankierende Region des Ratten-Probasin-Gens umfasst und mindestens ein Androgen-Responsive-Element, vorzugsweise zwei derartige Elemente, enthält. Das DNA-Molekül besteht aus einer Sequenz, welche die DNA-Sequenz ist, welche in der 1 gezeigt wird (SEQ ID NR: 1), oder darin enthalten ist. SEQ ID NR: 2 zeigt die abgeleiteten Aminosäuren für den Aminosäure-codierenden Bereich dieses DNA-Moleküls.
In einem anderen Aspekt der Erfindung wird ein isoliertes DNA-Molekül, das die Prostata-spezifische heterologe Gen-Expression steuern kann, bereitgestellt, das wenigstens ein Androgen-Responsive-Element enthält und unter stringenten Bedingungen mit einem DNA-Molekül mit der in 1 (SEQ ID NR: 1) gezeigten Sequenz hybridisiert. Vorzugsweise umfasst die DNA-Sequenz die Nukleotide –241 bis –233 und/oder die Nukleotide –140 bis –117, wie in der 1 ersichtlich, oder eine Mutation davon, welche Androgen-Aktivität beibehält. In einer Ausführungsform werden die Nukleotide –130 bis –127 durch die Nukleotide TACT (SEQ ID NR: 3) und GTCT (SEQ ID NR: 4) ersetzt.
Die vorliegende Erfindung schließt nicht nur die isolierten und gereinigten PB-Nukleotidsequenzen ein, sondern schließt des Weiteren (1) Verfahren und Reagenzien zur Verwendung in Bioassays hinsichtlich androgener oder anti-androgener Stoffe, und (2) Zellkulturmodelle für Prostata-Krankheit ein. Die vorliegende Erfindung ermöglicht Assays an Agonist und Antagonist des Androgenrezeptors oder Wege, welche zu Androgen-Wirkung führen, Testmaterialien für Karzinogenität an der Prostata, Testarzneistoffe und Gentherapie sowie Schutzpotenzial von Materialien für Prostatazellen gegen Prostata-Krankheit.
Zuerst werden die Figuren und Tabellen beschrieben. Es sei denn, es ist anders lautend angegeben, werden alle Bioassays von PB-Konstrukten in PC-3-Zellen mit der Cotransfektion des passenden Steroidrezeptor-Expressionsvektors durchgeführt (Rennie et al., 1993; Kazemi-Esfarjani et al., 1993).
KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
Die 1 zeigt die PB-Rattengenom-Sequenz von –426 bis +28 bp (SEQ ID NR: 1). Der Transkriptions-Start ist als ν gezeigt, wobei die Nummer unmittelbar danach als +1 beginnt. Sämtliche negative Nummerierung bezieht sich auf die Startstelle der Transkription. Sequenzen jenseits von +28 definieren zusätzliche Leader-Sequenzen und Aminosäuresequenz des ersten Exons für PB. Per Sequenzhomologie sind die GRE-ähnliche Sequenz (ARE-1), CAAT-Box (SEQ ID NR: 5) und TATAA-Box (SEQ ID NR: 6) unterstrichen.
Die 2 zeigt die Deletionskartierung von 5'-flankierenden Sequenzen von PB (–426, –346, –307, –286, –244, –235, –157 bp) in PB-CAT, co-transfiziert in PC-3-Zellen mit rAR- oder rGR-Expressionsvektoren jeweils plus DHT (ausgefüllte Kreise) oder DEX ausgefüllte Dreiecke). Die Aktivität von CAT mit dem rAR- (leere Kreise) oder rGR-Expressionsvektor (leere Dreiecke) ohne Hormonzugabe diente als die Basislinie (untere Tafel).
Die 3 zeigt die CAT-Aktivität von Wildtyp(wt)-AREs (Ovale) im –244-PB-CAT, verglichen zu Einzelbasen-Mutation (schraffierte Ovale) entweder in ARE-1 (mut 1) oder ARE-2 (mut 2). Die Aktivitäten sind als Vielfaches der Induktion von der Basislinie für DHT und DEX mit ihrem jeweiligen Steroidrezeptor in PC-3-Zellen gezeigt.
Die 4 zeigt den Bioassay von humanem Wildtyp-AR im Vergleich dazu, wenn Valin-865 durch Methionin (V865M) oder Leucin (V865L) substituiert wird, was jeweils zu vollständigem oder teilweisem AIS führt.
KURZE BESCHREIBUNG DER TABELLEN
Die Tabelle I zeigt die hormonale Induktion von PB-CAT in HeLa- und PC-3-Zellen mit DHT, DEX und Progestin.
Die Tabelle II zeigt, dass die spezifische/feste AR-Bindung sowohl von ARE-Stellen als auch benachbarten DNA-Sequenzen abhängig ist.
Die Tabelle III zeigt, dass die Bioaktivität und Spezifität für AR sowohl von AREs als auch benachbarten DNA-Sequenzen abhängig ist.
Die Tabelle IV zeigt die Bioaktivität von –286-PB-ARE2*CAT, verglichen für Wildtyp –286-PB-CAT für Wildtyp-AR und wenn Valin-865 durch Methionin oder Leucin bei AIS substituiert ist.
Die Tabelle V zeigt den Bioassay-Effekt auf Androgen-Induktion, wenn die Wiederholungen –244 bis –96 benachbart zu TK-Luc sind.
Die Tabelle VI zeigt die Empfindlichkeitserhöhung gegenüber sehr niedrigen Spiegeln an Androgen im Vergleich zu dem Glucocorticoid DEX, wenn die Wiederholungen bei n = 3 vorliegen.
Die Tabelle VII zeigt die Empfindlichkeitserhöhung von Wiederholungen bei n = 3, um Unterschiede in dem humanen Wildtyp-AR zu AIS-Proben nachzuweisen.
Die Tabelle VIII zeigt die hohe PB-CAT-Aktivität in den Prostata-Lappen der transgenischen Linie #4248.
Die Tabelle IX zeigt die PB-CAT-transgenische Linie #4248-Expression in der Maus, verglichen zum endogenen Ratten-PB-Gen. Die Expression im seitlichen Lappen wird als 100% angenommen, und sämtliche andere Expression wird relativ zu diesem Wert verglichen.
Die Tabelle X zeigt die PB-CAT-transgenische Linie #4248-Expression nach Kastration und Androgen- oder Glucocorticoid-Ersetzung.
BESCHREIBUNG DER BEVORZUGTEN AUSFÜHRUNGSFORMEN
1) Assay hinsichtlich androgener oder anti-androgener Materialien.
Der Erfinder hat die 5'-flankierende DNA des Ratten-Probasin(PB)-Gens isoliert und sequenziert (1), welches spezifisch in den Prostata-Lappen exprimiert wird und in den Samenbläschen nachweisbar ist (Matusik et al., 1986). Das Probasin-Gen codiert ein sezerniertes und nukleäres Protein (Spence et al., 1989), welches in vivo und in vitro Androgen-reguliert ist (Dodd et al., 1983; Rennie et al., 1993).
Isolierung des genomischen Probasin-Klons
Um die 5'-flankierende DNA des PB-Gens zu isolieren, wurde pM-40 (Dodd et al., 1983), ein cDNA-Klon, welcher die vollständige codierende Region für PB enthält (Spence et al., 1989), verwendet, um eine genomische Ratten-Bibliothek zu screenen. Vier positive Klone wurden anfänglich isoliert und von ihnen wurde nach Restriktions- und Hybridisierungs-Analyse festgestellt, identisch zu sein. Nach Subklonierung in pUC119 wurden die genomischen Klone bidirektional sequenziert. Die Sequenz der 5'-flankierenden DNA von PB zwischen Basenpaar (bp) –426 bis +28 ist in der 1 gezeigt. Die 5'-Grenze von Exon 1 wurde sowohl durch Primer-Verlängerung als auch S1-Nuklease-Kartierung definiert (Spence et al., 1989). Auf eine Haupt-Transkriptionsstartstelle (Position 0) folgt, vier bp stromabwärts, eine Nebenstartstelle. Die kanonischen CAAT- und TATAA-Boxen sind in der 1 unterstrichen und bei –48 bzw. –27 gelegen. Vier ähnliche CAAT-Boxen werden bei –101, –95, –82 und –75 gefunden.
DNase I-Footprinting-Analyse
Das DNase I-Footprinting wurde im Wesentlichen durchgeführt, wie beschrieben (Von der Ahe et al., 1993; Rennie et al., 1993). Proteine (10 ng bis 18 μg) wurden mit 20000 cpm der markierten DNA in 100 μl DNA-Bindungs-Puffer während 30 Minuten bei 20°C inkubiert. Nach Einstellen der Proben auf 4 mM MgCl₂ und 2,5 mM CaCl₂ wurden 5 ng DNase I zugesetzt und die DNA während 2 Minuten bei 20°C verdauen gelassen. Die Reaktion wurde gestoppt durch Zugeben von 100 μl Stop-Puffer (0,25% SDS, 0,3 M EGTA und 500 μg/ml Proteinase K) und während einer Stunde bei 37°C inkubiert. Die Proben wurden mit Phenol-Chloroform extrahiert; mit 0,2 M Natriumacetat, 85 μg/ml Träger-tRNA und 2 Volumen an Ethanol präzipitiert; in 3 μl Formamid-Farbstoff-Lösung erneut gelöst. Nach Erwärmen bei 70°C während 10 Minuten und raschem Abkühlen auf Eis wurden die Proben, zusammen mit einer A + G-Maxam-Gilbert-Sequenzierungsreaktion zum Erhalt einer Purin-Leiter, auf 7%ige Polyacrylamid/Harnstoff-Gele (Acrylamid:Bis 30:1) aufgetragen und laufen gelassen (Rennie et al., 1993). Die Gele wurden getrocknet und für eine Autoradiographie hergerichtet.
Die Androgen-Responsiven-Elemente (ARE) sind bei –241 bis –223 (ARE-1) und –140 bis –117 (ARE-2) lokalisiert. Die Sequenz von ARE-1 und ARE-2 in der 5'-flankierenden PB-DNA wurde unter Anwendung von DNase I-Footprint-Assays mit Peptiden, welche die DNA-Bindungsdomäne des Androgen-Rezeptors enthielten, und späterem Bioassay der funktionellen Domänen ermittelt. Die DNA- und Steroid-bindenden Domänen des Ratten-Androgenrezeptors (GST-AR1) und die DNA-Bindungsdomäne- und Gelenk-Region allein (GST-AR2) wurden in E. coli als Fusionsproteine mit Glutathion-S-Transferase exprimiert und unter Anwendung von Glutathion-Affinitätschromatographie gereinigt (Rennie et al., 1993). Sowohl GST-AR1 als auch GST-AR2 ergaben qualitativ ähnliche DNase I-Footprinting-Muster, welche zwei Bindungsstellen enthüllten: eine zwischen den Positionen –236 und –223 (mittels 5'-Deletions-Kartierung wurde festgestellt, dass die DNA-Basen, welche bis zu –244 reichen, für eine Bioaktivität notwendig sind); und die andere zwischen –140 und –117 (ARE-2). Beide Androgenrezeptor-Bindungsstellen sind ähnlich zu Glucocorticoid-Responsiven-Elementen (GRE) mit einem konservierten 5'-GTTCT. Synthetische ARE-Oligomere waren viel effizientere Kompetitoren in einem Banden-'Shift' hinsichtlich Bindung an Probasin-DNA als diejenigen, welche den Glucocorticoid- (GRE; schwacher Kompetitor) oder Östrogen- (ERE; inaktiver Kompetitor) -Responsiven-Elementen entsprachen (Rennie et al., 1993). Durch Homologie zu dem GRE wurde das PB-ARE-1 fernerhin definiert als –241 bis –223 (ATAGCATCTTGTTCTTAGT – SEQ ID NR: 7), wohingegen ARE-2 GRE-ähnliche Sequenzen in –140 bis –117 (GTAAAGTACTCCAAGAACCTATTT – SEQ ID NR: 8) umfasst.
Konstruktion von chimärem CAT-Gen
Das Plasmid pPH 1.4, welches die 5'-flankierende Sequenz von PB, beginnend an der Hind III-Stelle (–426 bp), Exon 1 und einen Teil von Intron A, endend an der Pst I-Stelle, enthielt (Rennie et al., 1993), wurde mit Sac I verdaut, um die codierende Region von Exon 1 und Intron A zu entfernen. Die Sac I-Stelle wurde mit Klenow-DNA-Polymerase stumpfendig gemacht und an einen BamHI-Linker ligiert. Nach Transformation in E. coli und Screening hinsichtlich geeigneten Klonen, wurde das Plasmid pBH 500 in dem Vektor pU119 erhalten. Das PB-CAT-Chimären-Gen wurde durch Inserieren des bakteriellen Chloramphenicol-Acetyl-Transferase(CAT)-Gens, welches aus einem Bam HI/Bgl II-Verdau von p-109TK hergestellt worden war (Cattini et al., 1986) in die Bam HI-Stelle von pBH500 konstruiert, wobei die –426 bis +28-PB-Sequenzen benachbart zu CAT erstellt wurden. Dieses Konstrukt enthält ebenfalls die SV40-Sequenz, welche ein 3'-Intron und Polyadenylierungs- und Spaltungssignale bereitstellen. Nach Transformation in E. coli und Screening wurden geeignete Klone, welche das Plasmid enthielten, welches als –426-PB-CAT bezeichnet wurde, isoliert. Deletionen von –426-PB-CAT wurden aus einem Hind III-Verdau, gefolgt von einer Zeitverlauf-Behandlung mit der Exonuklease Bal 31 (15, 30, 45, 60 und 75 Sekunden), hergestellt. Die Hind III-Stelle wurde durch Ligation an Hind III-Linker rekonstituiert. Nach Transformation in E. coli wurden Klone, welche Deletionsmutanten enthielten, gescreent, und ihre Plasmid-DNAs wurden mit Hind III und EcoR I verdaut, um Fragmentgrößen durch Elektrophorese in 1,5%igen Agarosegelen zu bestimmen. Eine Auswahl an Deletionsmutanten wurde als Ergebnis dieses Enzymverdau-Größenscreenings ausgewählt. Die Ursprungsklone wurden dann mit Hind III und Bam HI doppelverdaut, und das Insert wurde nach Elektrophorese in Gelen aus Agarose mit niedrigem Schmelzpunkt isoliert. Anschließend wurden die Hind III/Bam HI-Fragmente in die Hind III- und Bam HI-Stellen eines undeletierten pUC119-Plasmidvektors subkloniert. Der Umfang an PB-bp in jedem Konstrukt (2) ist mit einer negativen und/oder positiven Nummer von der in 1 abgebildeten Sequenz markiert. Die Nukleotidsequenzen des Konstruktes wurden durch Didesoxy-Sequenzierung bestätigt.
Weitere PB-CAT-Chimären-Konstrukte wurden durch Ersetzen des endogenen PB-Promotors mit dem TK-Gen-Promotor hergestellt. Die PB-Fragmente wurden durch den passenden Restriktionsenzym-Verdau erhalten. Ein Konstrukt wurde hergestellt durch PCR-Amplifizieren der Region von –244 bis –96 unter Verwendung eines Primers, welcher eine Hind III- Stelle am 5'-Ende enthielt, und des anderen Primers, welcher eine Xba I-Stelle am 3'-Ende enthielt (Rennie et al., 1993). Dieses mittels Polymerasekettenreaktion (PCR) amplifizierte Fragment wurde zwangsmäßig Orientierungs-subkloniert in Hind III/Xba I-TKCAT, wodurch das chimäre Plasmid –243/–96PB-TKCAT erzeugt wurde. Mutationen wurden unter Anwendung des Muta-Gene-Phagmid-in vitro-Mutagenese-Kit (Bio-Rad, Mississauga, Ontario, Canada) erzeugt. Die Nukleotidsequenzen von allen Konstrukten wurden durch Didesoxy-Sequenzierung bestätigt.
Zellkultur und Transfektionen
HeLa-Zellen wurden bei einer anfänglichen Dichte von 2 × 10⁶/100-mm-Schale in Dulbecco's modifiziertem Eagle-Medium (DMEM), welches mit 10% fötalem Kälberserum (FCS) oder 5% FCS und 5% Kälberserum ergänzt war, ausplatiert. Die PC-3-Zellen wurden bei einer anfänglichen Dichte von 8 × 10⁵/100-mm-Schale in Minimal-Essentiellem-Medium (MEM), welches mit 10% FCS ergänzt war, ausplatiert. Eine transiente Transfektion der HeLa-Zellen mit Plasmid-DNA wurde unter Anwendung eines Calciumphosphat-DNA-Präzipitationsverfahrens ausgeführt (Cattini et al., 1986). Die Zellen wurden 2 Minuten lang mit 20% Glycerol/DMEM bei 6 Stunden nach der Transfektion behandelt und wurden anschließend in DMEM plus 1% Aktivkohle-gestripptem FCS (STR-FCS) mit oder ohne Dihydrotestosteron (DHT) oder Dexamethason (DEX) während 24 oder 40 Stunden wachsen gelassen, bevor die Zellen geerntet wurden. Die transiente Transfektion von PC-3 wurde durchgeführt, wie für HeLa-Zellen umrissen, mit der Ausnahme, dass die PC-3-Zellen in MEM plus 5% STR-FCS wachsen gelassen wurden.
CAT-Assays
Zellen, welche eine transiente Transfektion durchlaufen hatten, wurden in phosphatgepufferter Kochsalzlösung, welche 1 mM EDTA enthielt, geerntet. Nach 4 Minuten langer Zentrifugation bei 2000 × g bei Raumtemperatur wurden die Zellen in 0,1 M Tris-HCl/0,1% Triton X-100, pH 7,8, 15 Minuten lang auf Eis lysiert. Unlösliches Material wurde durch 15 Minuten lange Zentrifugation bei 14500 × g bei 4°C entfernt. Die CAT-Aktivität im Zellextrakt wurde durch einen zweiphasigen Fluor-Diffusions-Assay (Nachtigal et al., 1989) bestimmt. Des Weiteren wurde die DNA aus dem unlöslichen Material isoliert, und 2-μg-Proben wurden mittels einer Slot-Blot-Vorrichtung in zweifacher Ausfertigung auf Nitrozellulosemembran platziert und mit ³²P-markierter CAT-Insert-DNA sondiert. Autoradiogramme wurden durch Densitometrie analysiert, und sämtliche CAT-Aktivitätsdaten wurden hinsichtlich der Transfektionseffizienz normiert. Für transgene Mäuse wurde ein Gesamtzellextrakt von jedem Gewebe hinsichtlich CAT-Aktivität getestet.
Charakterisierung des Mechanismus von Androgen-Wirkung
Die PB-DNA-Sequenz, welche die Nukleotide –426 bis +28 umfasst (1), enthält die notwendige Information, um Androgen-Regulierung, wie nachstehend definiert, zu erhalten. Die PB-CAT-Konstrukte, Deletionen und Mutationen darin, wurden verwendet, um die funktionelle Bedeutung von ARE-1 und ARE-2 zu bestimmen.
Aufgrund des Fehlens von passenden Zelllinien, welche entweder Androgenrezeptoren enthalten und/oder von Prostata-Ursprung sind, wurde eine Auswahl an Zelllinien getestet. Die humanen Prostata-Zellen LNCaP würden PB-CAT exprimieren und Androgen-regulieren, wohingegen HeLa-, prostatische DU-145- und PC-3-Zellen eine Cotransfektion eines Androgenrezeptor-Expressionsvektors für eine Androgen-Regulierung erforderten. Die humane PC-3-Prostata-Karzinom-Linie, welche transient mit dem Hybrid PB-CAT transfiziert worden war, wobei mit dem Ratten-Androgenrezeptor-Expressionsvektor cotransfiziert wurde, war der Standard-Assay unter Verwendung von Dihydrotestosteron (DHT) oder R1881 (einem synthetischen Androgen). Dexamethason (DEX), ein synthetisches Glucocorticoid, wurde durch Cotransfizieren von PC-3-Zellen mit einem Expressionsvektor für Glucocorticoid-Rezeptor (GR) untersucht.
Eine Serie von 5'-Deletionen von PB-CAT-DNA wurde konstruiert und in PC-3-Zellen transfiziert. Die Deletion der 5'-flankierenden DNA von PB zwischen –426 und –286 führte zu einem Netto-Zuwachs der Androgen-induzierbaren CAT-Aktivität (2). Eine ähnliche Beobachtung wurde mit Zellen gemacht, die mit GR-Expressionsvektor transfiziert und mit DEX behandelt wurden (2). Die erhöhte Aktivität aufgrund der Deletion bis zu –286 impliziert, dass es stromaufwärts einen cis-wirkenden Silencer gab. Bei –286 PB-CAT war der absolute Nettospiegel an Androgen-induzierter CAT-Aktivität (4605 dpm/min/mg Protein), sowie eine 42-fache Erhöhung von der Grundlinie aus, höher als die Nettoaktivität (496 dpm/min/mg Protein) sowie die 29-fache Induktion, welche mit DEX beobachtet wurden. Bei einer weiteren Deletion bis zur Position –244 wurde die Steroid-Induktion von CAT-Aktivität verringert. Die Progesteron-Behandlung mit Cotransfektion der Huhn-Progesteron-Expressionsvektoren zeigt eine geringe Aktivität auf –286PB-CAT. Die PB-AREs antworten präferentiell auf Androgene im Vergleich zu Glucocorticoiden, und kaum auf Progestine, sowohl in PC-3- als auch HeLa-Zellen (Tabelle I), was darauf hinweist, dass die PB-AREs eher als ein verschiedenes Androgen-Responsive-Element denn als ein GRE, welches hinsichtlich Androgenrezeptor permissiv ist, funktionieren.
Eine weitere Analyse der 5'- und 3'-flankierenden Regionen von PB demonstriert, dass die zwei cis-wirkenden DNA-Elemente, welche den Androgenrezeptor binden, ARE-1 und ARE-2, beide für die Androgen-induzierte CAT-Aktivität erfordert werden (Rennie et al., 1993). Dies wurde verdeutlicht durch Vornehmen einer Mutation in ARE-1 an Base –231 (G), welche zu A verändert wurde (Mut 1), oder innerhalb von ARE-2 an Base –123 (C), welche zu einem A geändert wurde (Mut 2) (3). Unsere Daten zeigen ebenfalls, dass die präferenzielle Androgen-Wirkung nicht nur eine spezifische/feste AR-Bindung an die zwei Stellen erfordert, sondern auch Interaktionen mit benachbarten DNA-Sequenzen und Proteinen. Dies vermittelt weiterhin eine Kooperativität zwischen der AR-Bindung und führt zu präferenzieller Induktion durch AR. Die zwei ARE-Stellen wirken in einer kooperativen Weise für die Bindung von AR (Tabelle II). AR bindet bei hoher Affinität, wenn sowohl ARE-1 als auch ARE-2 mit dem endogenen PB-Promotor (–286 bis +28 bp) vorhanden sind, wie durch den Footprint verdeutlicht wird, welcher bei 60 ng synthetischem GSTR-AR2 auftritt. Die Entfernung von entweder ARE-1 (–157 bis +28 bp) oder ARE-2 (–426 bis –134 bp) verringert die Bindung von GST-AR2 an die verbleibende Stelle (Tabelle II). Einzelbasenmutationen in ARE-1 (Mut 1) oder ARE-2 (Mut-2) verringern steroidinduzierte CAT-Bioaktivität um > 95% (3) und verringern die Bindung des GST-AR2 an beide AREs (Tabelle II). Diese zwei Stellen erfordern flankierende DNA-Sequenzen, um eine präferenzielle Androgen-Regulierung zu vermitteln, da das Entfernen des endogenen PB-Promotors (unter Ersetzung desselben mit Thymidinkinase-Promotor, TK) zu Konstrukten führt, welche AR nur bei höheren Konzentrationen binden (Tabelle II) und nun gleichwertig durch das synthetische Glucocorticoid DEX induzierbar sind (Tabelle III). Durch Entfernen der DNA-Sequenz zwischen ARE-1 und ARE-2 (Konstrukt enthält ARE-1, welches angrenzend an die PB-Position –158 bp platziert wird, welche den endogenen PB-Promotor enthält) sehen wir ebenfalls, dass DEX ein potenter Stimulus zum Induzieren von CAT-Aktivität um das 21-Fache wird, was ähnlich zu DHT-Induktion um das 16-Fache ist (Tabelle III).
Wir haben die Nützlichkeit der AREs in dem –286PB-CAT-Gen als ein Bio-Assay hinsichtlich defektem Androgenrezeptor, welcher bei Androgen-Insensitivität-Syndrom beobachtet wird, demonstriert (4) (Kazemi-Esfarjani et al., 1993). Unterschiede zwischen dem Wildtyp-AR und AIS-ARs werden am besten bei niedrigeren Konzentrationen an Androgenen (1 nM oder weniger) aufgezeichnet, während bei hohen Konzentrationen (10 nM) der Wildtyp-AR und V865L eine ähnliche Antwort zeigen. Unser Assay wird auch die Wirksamkeit eines Anti-Androgen-Materials messen, wenn es zugegeben wird, um mit jedweder androgenen Aktivität zu kompetieren. Um die Empfindlichkeit und Spezifität des Bioassays zu erhöhen, sind zwei zusätzliche Verbesserungen vorgenommen worden.

1) –286 PB-ARE2*CAT: Die Sequenz innerhalb von ARE-2 wurde durch Substitution von vier Basen an –130 bis –127 von CCAA mit –130 bis –127 TACT oder GTCT verändert, was zu ARE2* führt (siehe 1). Diese Konstrukte zeigen eine erhöhte Antwort auf Androgene, so dass die Änderung eine 100-fache Induktion ergab, im Vergleich zu Wildtyp –286PB-CAT, welches eine 36-fache Induktion ergab. Ferner zeigte dieses ARE-2* eine erhöhte Antwort für DEX von dem 19-Fachen, verglichen zu Wildtyp –286PB-CAT, welches das 9,6-Fache ergab. Das –286 PB-ARE2*CAT demonstrierte auch, dass Androgen-Spezifität weiter von dem Glucocorticoid-induzierbaren Effekt abgetrennt werden kann, was zu einer gesteigerten Bioaktivität und erhöhten Empfindlichkeit führt. Zum Beispiel zeigen Androgene plus Androgenrezeptor oder plus defektem Androgenrezeptor, wie er bei AIS gefunden wird, einen größeren Unterschied mit ARE2*-Konstrukten, wenn mit dem Wildtyp –286 PB-CAT verglichen wird (Tabelle IV).
2) (–244/–96)nPB-TK. Obwohl DHT und DEX gleich gut funktionieren und Androgenspezifität mit dem Ersetzen der PB-Promotor-Region (–96/+28) durch TK (entweder –109 bp oder –81 bp TK) verloren geht, ist der Vorteil in dem Bioassay gewesen, dass der TK-Promotor in allen getesteten Zellen funktioniert. Um wieder Androgenspezifität zu erlangen, während der TK-Promotor beibehalten wird, ist die –244/–96 von 5' nach 3' in Form von Wiederholungen, benachbart zu –109 oder –81 TK, angeordnet worden, wobei beide TK-Promotoren gleich gut für die Induktion mittels Steroiden funktionieren, aber der –81-TK mit einer sehr niedrigen basalen Aktivität beginnt. Wenn das CAT-Gen durch den Luciferase(Luc)-Reporter ersetzt wird, steigt die Empfindlichkeit des Assays (De Wet et al., 1987). Die Konstrukte sind (–244/–96)nPB-81TKLuc, wobei n gleich der Anzahl von Wiederholungen ist. Wenn n = 2 oder n = 3, wird eine potente Androgen-Antwort mit einer nur geringen Erhöhung erhalten, wenn n weiter steigt, als 5 μg DNA-Konstrukt transfiziert wurden (Tabelle V). Diese Konstrukte zeigen eine erhöhte Empfindlichkeit in Bezug auf die Messung der Aktivität des Androgenrezeptors, von Androgenen bei sehr niedrigen Konzentrationen (Tabelle VI) und von Defekten im AR, wie sie bei AIS beobachtet werden (Tabelle VII).

Routinemäßig ergeben drei Wiederholungen (–244/–96 PB) eine > 300-fache Induktion der Antwort auf Androgene (Tabelle VI und VII) und zeigen Spezifität für Androgene gegenüber DEX bei sehr niedrigen Konzentrationen an Steroiden, wohingegen bei hohen Konzentrationen an Steroiden sowohl DHT als auch DEX gleiche Aktivität aufzeigen (Tabelle VI). Dies weist darauf hin, dass der Assay nicht auf Androgene beschränkt ist, sondern auch andere Steroidaktivitäten bei höheren Konzentrationen dieser Steroide (> 1 nM) messen kann. Eine Kombination von einem der beiden Vier-Basen-Austausche, welche für ARE2* beschrieben wurden, in jeder Wiederholung von –244/–96 PB wird die Empfindlichkeit gegenüber Steroiden weiter erhöhen.
2) Transgene nicht-humane eukaryotische Tiermodelle für Prostata-Krankheit
Um neue Tiermodelle für Prostata-Karzinogenese und gutartige Prostatahyperplasie zu schaffen, kann die PB-Sequenz (1) verwendet werden, um jedwedes Gen zielgerichtet auf die Prostata zu lenken. Wir haben bewiesen, dass die 5'-flankierende Region von PB die notwendigen Sequenzen für Prostata-Targeting in transgenen Mäusen enthält, indem aufgezeigt wurde, dass PB die Prostata-spezifische Expression des bakteriellen CAT-Gens steuert (Greenberg et al., 1992a; Greenberg et al., 1992b; Greenberg et al., 1993; Greenberg et al., 1993). Es wird Prostata-spezifische Expression und Androgen-Regulierung von dem PB-zielgelenkten Gen in transgenen Tieren beschrieben.
In vivo-Untersuchungen haben gezeigt, dass der PB-Promotor Prostata-spezifische Expression in transgenen Mäusen ziellenkt. Unter Verwendung des Konstruktes –426/+28 PB-CAT als das Transgen wurde bei 5 von 21 im Anschluss an Mikroinjektion Neugeborene mittels PCR festgestellt, dass sie das PB-CAT-Transgen trugen (4 Männchen, 1 Weibchen). Mit der transgenen Gründer-Maus wurden Linien eingerichtet, und von ihnen wurde gezeigt, das gleiche Muster der PB-CAT-Expression auf die Prostata von nachfolgenden Generationen weiterzugeben. Drei der männlichen transgenen Linien zeigten Prostata-spezifische CAT-Expression, wohingegen keine CAT-Aktivität in einem beliebigen Gewebe von einem Männchen und dem Weibchen detektiert wurde. Die transgene Linie #4248 (Tabelle VIII) zeigt einen hohen Spiegel an CAT-Aktivität in der Prostata, wohingegen die Linie #4217 den niedrigsten Spiegel, aber dieselbe Prostata-spezifische Expression von CAT-Aktivität zeigt. Das dritte Männchen wies intermediäre CAT-Spiegel auf. Die Variabilität hinsichtlich des Spiegels an transgenischer CAT-Expression unter den Linien, einschließlich des Fehlens von Expression in einem männlichen Gründer, kann aufgrund der Stelle der Transgen-Integration zustande kommen. Eine weitere Charakterisierung der transgenen Hochexpressions-Linie (#4248) verdeutlicht eine äußerst hohe CAT-Aktivität in dem seitlichen Lappen (die Verwendung von lediglich 5 μg Gewebeextrakt führt dazu, dass 21% des Substrates acetyliert werden, wohingegen bei den üblichen 25 μg Extrakt 89% des Substrates acetyliert werden). Die Tatsache, dass der Promotor des PB-Gens so gut funktioniert, steht in Übereinstimmung mit dem hohen Spiegel an Expression des endogenen PB-Gens in der lateralen Prostata (8% der Gesamt-mRNA). Die männliche untergeordnete Organ-Verbreitung von CAT-Aktivität in der transgenen Maus (zutreffend für alle drei Linien, Linie #4248 in der Tabelle IX) ist in enger Weise parallel zu den berichteten endogenen Ratten-PB-mRNA-Spiegeln (Matusik et al., 1986). Ferner zeigen die in situ-Hybridisierung und Immunhistochemie von CAT, dass das PBCAT-Gen in denselben epithelialen Zellen exprimiert wird, welche für PB-mRNA und -Protein berichtet wurden (Spence et al., 1989; Sweetland et al., 1988).
Ferner zeigt das PBCAT-Gen eine entwicklungsmäßige und Androgen-Regulierung der Expression. Mit einem Alter von 7 Wochen wurde in 3 Männchen von 5 Gründermäusen (4 Männchen, 1 Weibchen) das CAT-Gen präferenziell in der lateralen, dorsalen und vertralen Prostata exprimiert. Wiederum wurden bei der Alterung der Tiere (bis 23 Wochen alt) lediglich niedrige Spiegel in der anterioren Prostata und den Samenbläschen nachgewiesen, und keine CAT-Aktivität wurde in Gehirn, Niere, Milz, Lunge, Herz, Thymus, Leber oder Hoden von irgendeiner Linie nachgewiesen. Als jedoch die Tiere in der Linie #4248 alterten, stieg die Expression von PB-CAT in der ventralen Prostata bis zum letzten überprüften Zeitpunkt (23 Wochen) an, sank im lateralen Lappen, wobei sie eine geringe Veränderung im dorsalen Lappen zeigte. Die CAT-Aktivität in der Prostata schwankte über mehrere logarithmische Einheiten zwischen den am niedrigsten und höchsten exprimierenden Mauslinien, wahrscheinlich wegen der Stelle der Transgen-Integration. Dieses Expressionsmuster ist über 4 Generationen hinweg weitergegeben worden. Die von einem hochexprimierenden Männchen gegründete Linie #4248 zeigte eine 70-fach erhöhte Prostata-CAT-Aktivität zwischen 3 bis 7 Wochen Alter, einer Zeit, welche der sexuellen Reifung entspricht. 7 Tage nach Androgen-Entfernung (Kastration von reifen Männchen, Linie #4248) nahm die prostatische CAT-Aktivität ab (Tabelle X) und konnte durch Androgen-Ersetzung aber nicht mit DEX induziert werden (Tabelle X). In anschließenden Untersuchungen wurde PB-CAT mit der Matrix-Anheftungs-Region des Hühnerlysozymgens, MAR (McKnight et al., 1992) co-injiziert, und die Co-Integration des MAR und PB-CAT führte zu einer dorsolateralen Prostata-spezifischen CAT-Expression in allen drei untersuchten Linien. Bei der Zugabe von MAR wurde keine ventrale Expression in transgenen Mäusen nachgewiesen.
Dies zeigt die Spezifität und Androgenregulierung der 5'-flankierenden Sequenzen von PB mit dem CAT-Reporter-Transgen in nicht-humanen eukaryotischen transgenen Tieren. Um die Androgenregulierung zu verstärken, können die ARE2*-Wiederholungen von –244/–96 PB und/oder ARE2*, platziert in die Wiederholungen von –244/–96, dem –426/+28-PB-Promotor hinzugefügt werden. Um den Promotor responsiv gegenüber Metallionen, wie Zn und Cd, zu machen, können MT-induzierbares Elemente, wie verwendet in transgenen Tieren (Dyer et al., 1989; Iwamoto et al., 1992; Li et al., 1989; Russo et al., 1988; Mayo et al., 1988; Iwamoto et al., 1991) hinzugefügt werden, oder, um ihn responsiv gegenüber Glucocorticoiden zu machen, können die GRE-Sequenzen, wie beobachtet im MMTV-Promotor (Stamp et al., 1992; Lin et al., 1992; Lucchini et al., 1992; Bouchard et al., 1989; Muller et al., 1988; Leder et al., 1986), hinzugefügt werden. Die 5'-flankierende Sequenz von PB kann verwendet werden, um jedwedes Gen auf die Prostata zielzurichten, welches Prostata-Funktion, -Wachstum verändern oder Tumorbildung verursachen kann. Die zielgerichteten Gene schließen "großes T", TRPM-2, bcl-2, mutiertes p53, myc, ras, bFGF, TGF-β1, Activin, Activinrezeptor, AR, RXR, c-fos, IGFs, IGFBPs, PSA und int-2 ein. Ferner können transgene Linien, welche verschiedene PB-Ziellenk-Gene tragen, gekreuzt werden, um neue Linien zu entwickeln, welche eine(n) unterschiedliche(n) Häufigkeit oder Typ an Tumorentwicklung aufzeigen. In dieser Weise können für Prostata-Tumorwachstum bedeutsame Gene identifiziert werden. Darüber hinaus können PB-zielgelenkte Gene in Kombination mit anderen endogenen Genen oder neu aktivierten Genen wirken, um Tumorwachstum zu induzieren. Das PB-transgenische Modell gestattet die Identifikation dieser Gene.
3) Zellkulturmodelle für Prostata-Krankheit.
Die entwickelten transgenischen Mausmodelle werden Forscher in die Lage versetzen, den mehrstufigen Prozess der Tumorigenese, wie er in vivo auftritt, zu untersuchen und zu analysieren. Diese Untersuchungen werden relevante histologische und pathologische Korrelate mit dem bekannten transgenischen Phänotyp im Kontext des gesamten Tieres ergeben. Allerdings sind Ganztier-Untersuchungen nicht immer anpassbar, um die verschiedenen Wechselwirkungen von Materialien, wie Hormonen, Wachstumsfaktoren, Anheftungsfaktoren und Cytokinen, welche Wachstumsrate, Differenzierung, metastatisches Potenzial und phänotypische Expression beeinflussen, zu schildern. Um diese Parameter anzugehen, kann ein schnelles in vitro-Modell für Assays eingerichtet werden. Transgene Tierlinien, welche mit den PB-Ziellenk-Genen hergestellt wurden, welche dann prostatisches Über-Wachstum oder Tumorbildung aufzeigen, werden als eine Quelle von Gewebe verwendet, um Zellen für die Einrichtung von replikativen Zellkulturen (Zelllinien) zu isolieren. Aus transgenen Tieren entnommene immortalisierte Zellen sind erfolgreich verwendet worden, um Zellkulturlinien einzurichten (Larue et al., 1993; Hammang et al., 1990; Martinez de la Escalera et al., 1992; Mellon et al., 1992; von Deimling et al., 1990; Windle et al., 1990; Dalemans et al., 1990; Galiana et al., 1990; Vaux et al., 1988; Efrat et al., 1988; Anonym, 1991; Tal et al., 1992).
4) Behandlung von humaner gutartiger Prostatahyperplasie und humanem Prostata-Krebs
Die Behandlung von humaner Erkrankung mittels Gentherapie kann auf humane gutartige Prostatahyperplasie (hBPH), Prostata-Krebs (CaP) und jedweden Krankheitszustand der Prostata angewandt werden durch Einsetzen der Fähigkeit von Probasin, eine Ziellenkung eines Toxins auf Prostata-Zellen zu bewirken. Unsere Untersuchungen, welche in diesem Patent beschrieben werden, verdeutlichen, dass PB die Expression auf die Prostata des transgenen Tiers zielrichtet und PB die Expression in humanen Prostata-Krebszelllinien steuert. Da an den Probasin-Promotor gekoppelte Transgene hinsichtlich der Expression spezifisch auf die prostatischen Zellen zielgerichtet werden, werden Nebenwirkungen der Therapie auf andere Zelltypen eingeschränkt. Bei CaP wird eine stabile Integration des PB-zielgelenkten Transgens in die chromosomale DNA des Patienten nicht erfordert, da das Ziel darin besteht, die Krebszellen zu töten. Eine Therapie für hBPH kann ausgelegt sein, um die hyperplastischen Zellen zu töten oder das PB-zielgelenkte Transgen zu integrieren, um das hyperplastische Wachstum zu korrigieren oder zu verringern.
ZUSAMMENFASSUNG DER OFFENBARUNG
In der Zusammenfassung dieser Offenbarung sieht die vorliegende Erfindung eine neue DNA-Sequenz vor, welche die Einführung eines Assays bezüglich androgener und anti-androgener Stoffe, von transgenen Tieren und Gentherapie für die Behandlung der Prostata gestattet.
Merkmale, welche hierin beschrieben und hierdurch bereitgestellt werden, schließen die folgenden ein:

1. Durch transient transfizierte oder stabil integrierte PB-Sequenzen, welche an ein Reportergen gekoppelt sind, kann ein Bioassay hinsichtlich androgener Materialien in Zellkultur durchgeführt werden. Das androgene Material ist nicht auf Liganden für den Androgenrezeptor beschränkt, sondern kann Nicht-Steroid-Wege, welche zu Androgen-Wirkung führen, Proteine, DNA- und RNA-Sequenzen, die für Androgen-Wirkung bedeutsam sind, einschließen.
2. Die transfizierten Zellen von Merkmal 1 können angewandt werden, um einen Bioassay hinsichtlich jedweden anti-androgenen Materials mittels Kompetitions-Untersuchungen mit androgenem Material vorzunehmen. Das anti-androgene Material beinhaltet Rezeptor-Liganden, Proteine, DNA- und RNA-Sequenzen, sowie Materialien, welche den Phosphorylierungszustand verändern und den Weg der Androgen-Wirkung verändern können. Das Anti-Androgen-Material kann in den Androgen-Wirkungsweg durch direkte Bindung des Liganden an den Steroidrezeptor eingreifen, es kann direkt an den Steroidrezeptor oder PB-DNA-Sequenzen binden, wodurch die Rezeptorbindung an DNA-, RNA- und/oder Proteine gestört wird, oder es kann eine Modifikation von Material im Ablaufweg der Androgen-Wirkung beeinflussen.
3. Androgene und anti-androgene Stoffe können geassayt werden durch Bestimmen ihrer Wirkung auf die Bindung von Androgenrezeptor an PB-DNA-Sequenzen oder an Protein-Komplexe, welche mit dem Androgenrezeptor an PB-DNA-Sequenzen gebunden werden.
4. In transgenen nicht-humanen eukaryotischen Tieren nehmen die PB-Sequenzen eine Ziellenkung von Genen auf den männlichen Urogenital-Trakt vor, wobei der höchste Expressionsspiegel in Prostata-Zellen vorliegt. Gen(e) werden in das Chromosom des Tieres durch Einbringung im Embryostadium integriert werden.
5. In nicht-humanen eurkaryotischen Tieren können die PB-Sequenzen eine Ziellenkung von Genen auf den männlichen Urogenitaltrakt vornehmen, nachdem DNA vermittels viraler oder nicht-viraler Verfahren injiziert wurde, was zum höchsten Expressionsspiegel in Prostatazellen führt.
6. In Tieren von Merkmal 4 oder 5 reguliert der PB-Promotor die Expression von Gen(en). Eine Transkription vermittels des PB-Promotors kann ferner durch das Hinzufügen von Enhancer-, induzierbaren oder Repressor-DNA-Elementen reguliert werden.
7. In Tieren von Merkmal 4 oder 5 können zielgelenkte Gene Prostata-Erkrankung induzieren, einschließlich Prostatitis, Hyperplasie, Harnröhren-Obstruktion und Prostata-Krebs, um als Modelle zu dienen.
8. Aus Tieren von Merkmal 7 können Zellen aus Prostatagewebe isoliert werden, um Zelllinien einzurichten.
9. In Tieren von Merkmal 4 oder 5 oder Zelllinien von Merkmal 8 können Therapien getestet werden, um neue Arzneimittel zu entwickeln, einschließlich neuer Herangehensweisen für Gentherapie.
10. Die Prädisposition von Tieren von Merkmal 4 oder 5 oder Zelllinien von Merkmal 8 für Prostata-Krankheit kann angewandt werden, um Materialien zu testen, welche einen Schutzgebungs-Nutzen gegen die Entwicklung oder das Fortschreiten von Prostata-Krankheit aufweisen. Ein geringeres Auftreten von Prostata-Tumorentwicklung wird einen Schutzgebungs-Nutzen eines Mittels demonstrieren.
11. Die Prädisposition von Tieren von Merkmal 4 oder 5 oder Zelllinien von Merkmal 8 für Prostata-Krankheit erhöht die Empfindlichkeit, um Materialien hinsichtlich Karzinogenität zu messen. Transgene Tiere, Linien oder Zellkulturlinien können gewählt werden, welche eine niedrige Anfälligkeit zur Entwicklung von Prostata-Tumoren aufweisen und mit einem potenziellen Karzinogen über einen Bereich von Dosierungen hinweg behandelt werden. Ferner werden Linien, welche rasch Tumoren entwickeln, die Empfindlichkeit des Tests gegenüber schwachen Karzinogenen erhöhen. Ein Karzinogen sollte eine Erhöhung der Tumorentwicklung und/oder -Progression gegenüber Kontrollen aufzeigen.
12. In Tieren (transgene sowie nicht-transgene) können die PB-Sequenzen als ein Modell verwendet werden, um Verfahren für neue Gentherapien durch die Zuführung von Genen zu entwickeln, welche Toxine exprimieren, oder Arzneistoffe zu toxischen Substanzen in normalen prostatischen, hyperplastischen und kanzerösen Zellen umwandeln.
13. In Menschen können die PB-Sequenzen in der Gentherapie verwendet werden, um eine Ziellenkung von Genen auf den männlichen Urogenitaltrakt, gutartige Prostatahyperplasie und auf Prostata-Krebs hin vorzunehmen. Zielgelenkte Gene können Toxine exprimieren oder Arzneistoffe in toxische Substanzen umwandeln, wodurch das Wachstum von Prostatazellen gehemmt oder selbige abgetötet werden.

Modifikationen innerhalb des Umfangs dieser Erfindung sind möglich.
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TABELLE I
TABELLE II
Mut 1 enthält eine Mutation in ARE-1, die DHT-induzierte CAT-Bioaktivität um > 95% senkt.
Mut 2 enthält eine Mutation in ARE-2, die DHT-induzierte CAT-Bioaktivität um > 95% senkt.

* Suggestiv gibt an, dass ein schwacher Footprint bei > 400 ng GST-AR2 auftritt, aber bei ihm stets das vollständige "Ausweißungs"-Aussehen fehlt, das in allen anderen AR-Footprints zu beobachten war.

TABELLE III
TABELLE IV
TABELLE V
TABELLE VI
TABELLE VII
TABELLE VIII
TABELLE IX
TABELLE X
SEQUENZAUFLISTUNG

Claims

Isoliertes DNA-Molekül, umfassend eine 5'-flankierende Region des Ratten-Probasin-Gens, die wenigstens ein Androgen-Responsive-Element enthält, wobei das Molekül aus einer Sequenz besteht, welche die in 1 (SEQ ID NR: 1) gezeigte DNA-Sequenz ist oder in dieser enthalten ist.
Isoliertes DNA-Molekül, das die Prostata-spezifische heterologe Genexpression steuern kann, das wenigstens ein Androgen Responsive Element enthält und unter stringenten Bedingungen mit einem DNA-Molekül mit der in 1 (SEQ ID NR: 1) gezeigten Sequenz hybridisiert.
DNA-Molekül nach Anspruch 1 oder Anspruch 2, gekennzeichnet durch die Sequenz von der Base –426 bis zur Base +28 der 1.
DNA-Molekül nach Anspruch 1 oder Anspruch 2, gekennzeichnet durch die Sequenz von der Base –426 bis zur Base +1 der 1.
DNA-Molekül nach Anspruch 1 oder Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass wenigstens ein Androgen-Responsive-Element die Sequenz ATAGCATCTTGTTCTTAGT (ARE1) (SEQ ID NR: 7) aufweist.
DNA-Molekül nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass das wenigstens eine Androgen-Responsive-Element die Sequenz GTAAAGTACTCCAAGAACCTATTT (ARE2) (SEQ ID NR: 8) aufweist.
DNA-Molekül nach einem der Ansprüche 1, 2, 3 oder 6, gekennzeichnet durch zwei Androgen-Responsive-Elemente.
DNA-Molekül nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass beide Androgen-Responsive-Elemente die konservierte Sequenz 5'-GTTCT (SEQ ID NR: 9) enthalten.
DNA-Molekül nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass ein Androgen-Responsive-Element die Sequenz ATAGCATCTTGTTCTTAGT (ARE1) (SEQ ID NR: 7) aufweist und das andere Androgen-Responsive-Element die Sequenz GTAAAGTACTCCAAGAACCTATTT (ARE2) (SEQ ID NR: 8) aufweist.
DNA-Molekül nach einem der Ansprüche 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, dass die Probasin-Promotorregion (Basen –95 bis +28 der 1) durch einen TK-Promotor ersetzt ist.
DNA-Molekül nach Anspruch 10, gekennzeichnet durch eine mit dem TK-Promotor verbundene wiederholte (–244 bis –96) Region der 5'-flankierenden Region.
DNA-Molekül nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass das DNA-Molekül eine wie in 1 gezeigte Mutation der Nukleotide –241 bis –223 (ARE1) und/oder der in 1 gezeigten Nukleotide –140 bis –177 (ARE2) umfasst.
DNA-Molekül nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, dass das DNA-Molekül die in 1 gezeigten Nukleotide –140 bis –117 (ARE2) umfasst, in denen die Nukleotide –130 bis –127 durch die Nukleotide TACT (SEQ ID NR: 3) oder GTCT (SEQ ID NR: 4) ersetzt sind.
Zelllinie, umfassend kultiviertes Prostatagewebe aus einem nicht menschlichen, eurkaryotischen Tier, das eine genomische Integration eines DNA-Moleküls nach einem der Ansprüche 1 bis 13 und eine heterologe Gen-codierende Sequenz aufweist, wodurch eine Prostata-spezifische heterologe Genexpression unter Androgen-Kontrolle ermöglicht wird.
Zelllinie nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, dass die Transkription mittels des Probasin-Promotors weiter durch die Gegenwart von Enhancer-, induzierbaren und/oder Repressor-DNA-Elementen reguliert ist.
Zelllinie nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, dass die DNA-Elemente eine genomische Integration von mit den Probasin-Sequenzen verbundenen MT- und/oder GRE-induzierbaren Elementen umfassen.
Reagens zur Verwendung in einem Bioassay für androgene und anti-androgene Stoffe, das ein DNA-Molekül nach einem der Ansprüche 1 bis 13, welches an ein Reporter-Gen gekoppelt ist, umfasst.
Reagens nach Anspruch 17, wobei das DNA-Molekül mehrere Wiederholungen der –244 bis –96 bp-Region der in 1 gezeigten DNA-Sequenz (SEQ ID NR: 1) umfasst.
Reagens nach Anspruch 18, wobei die Anzahl der mehreren Wiederholungen 2 oder 3 beträgt.
Reagens nach Anspruch 18 oder Anspruch 19, wobei die mehreren Wiederholungen mit einem TK-Promotor verbunden sind.
Bioassay-Verfahren, das ein Reagens nach einem der Ansprüche 17 bis 20 verwendet, dadurch gekennzeichnet, dass potentiell androgene und anti-androgene Stoffe auf Zellen, die transient mit dem DNA-Molekül transfiziert sind, getestet werden.
Bioassay-Verfahren, das ein Reagens nach einem der Ansprüche 17 bis 20 verwendet, dadurch gekennzeichnet, dass potentiell androgene und anti-androgene Stoffe auf Zellen, welche das DNA-Molekül stabil integriert in den Zellen aufweisen, getestet werden.
DNA-Molekül, umfassend ein DNA-Molekül nach einem der Ansprüche 1 bis 13, das operativ mit einem heterologen Gen verknüpft ist, um eine Prostata-spezifische heterologe Genexpression unter Androgen-Kontrolle zu ermöglichen.
DNA-Molekül nach Anspruch 23, dadurch gekennzeichnet, dass die Transkription des heterologen Gens mittels des Probasin-Promotors erfolgt und weiter durch die Gegenwart von Enhancer-, induzierbaren und/oder Repressor-DNA-Elemente reguliert ist.
DNA-Molekül nach Anspruch 24, dadurch gekennzeichnet, dass die DNA-Elemente die genomische Integration von mit den Probasin-Sequenzen verbundenen MT- und/oder GRE-induzierbaren Elementen umfassen.