DE69734143T2

DE69734143T2 - Neue methoden zur charakterisierung von verbindungen, welche die stf-1 expression in inselzellen der bauchspeicheldrüse stimuliert

Info

Publication number: DE69734143T2
Application number: DE69734143T
Authority: DE
Inventors: R. Marc MONTMINY; Seema Sharma
Original assignee: Research Development Foundation
Current assignee: Research Development Foundation
Priority date: 1996-01-22
Filing date: 1997-01-22
Publication date: 2006-07-13
Anticipated expiration: 2017-01-23
Also published as: WO1997026360A1; KR100454621B1; IL125153A; AU726356C; IL125153A0; EP0876492A4; CN1209843A; JP2000503211A; EP0876492B1; AU726356B2; CN1154738C; ZA97476B; ATE304055T1; CA2244176C; DE69734143D1; JP4472025B2; RU2183465C2; NZ330866A; EP0876492A1; KR19990081853A

Description

HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Gebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung bezieht sich allgemein auf die Gebiete der biochemischen Endokrinologie, Molekularbiologie und Proteinchemie. Insbesondere bezieht sich die vorliegende Erfindung auf neuartige Verfahren zur Charakterisierung von Verbindungen, die die STF-1-Expression in Pankreasinselzellen stimulieren.
Beschreibung des Standes der Technik
Die Glucosehomöostase erfordert das Zusammenspiel zahlreicher neuroendokriner Systeme. Die Pankreasinseln gelten als primärer „Glucosesensor" bei Säugetieren. Pankreasinseln enthalten vier Zellpopulationen, die hauptsächlich als Insulin, Glucagon, Somatostatin und Pankreaspolypeptide erzeugende Zellen charakterisiert sind. Darunter sind die insulinerzeugenden β-Zellen vorherrschend. Insulinsezernierung und -erzeugung werden durch einen Anstieg der Serumglucose stimuliert, der für die nachfolgende Glucoseaufnahme in bestimmten Geweben unerlässlich ist. Daher führt eine Fehlfunktion bzw. Zerstörung der β-Zellen zu einem erhöhten Serumglucosespiegel und resultiert letztlich in der Entwicklung eines Diabetes mellitus.
Die Analyse der genetischen Verknüpfung deutet darauf hin, dass erbliche Faktoren die Anfälligkeit für den Erwerb des diabetischen Status stark beeinflussen. Beispielsweise weisen mindestens 18 Genorte einen gewissen Verknüpfungsgrad mit insulinabhängigem Diabetes mellitus (IDDM) auf. Ein als IDDM2 bezeichneter Genort für Krankheitsanfälligkeit umfasst das humane Insulingen und steht mit einer veränderten Transskriptionsregulierung der Insulinpromotorfunktion in Zusammenhang. Daher kann der Abbruch der die Insulingenexpression regulierenden Prozesse teilweise ursächlich für die Diabetogenese sein. In Übereinstimmung mit dieser Hypothese tritt eine Funktionsstörung der β-Zellen bei Diabetes sehr häufig auf.
Man geht davon aus, dass nicht-insulinabhängiger Diabetes mellitus (NIDDM) Folge sowohl externer als auch komplexer genetischer Einflüsse ist. Interessanterweise wurden Allelvarianten am Insulingenort selbst mit der Krankheit in Verbindung gebracht. Diese Varianten scheinen ein normales Insulingen zu enthalten, weisen aber hinsichtlich der Transskriptionsregulierung veränderte Eigenschaften auf.
Schätzungen deuten darauf hin, dass bis zu 20 Millionen Amerikaner an nicht-insulinabhängigem Diabetes mellitus (Diabetes mellitus Typ II) leiden. Die Progredienz der Erkrankung scheint sowohl auf Umfeldfaktoren als auch bestimmten, bislang weitestgehend nicht identifizierten Diabetesanfälligkeitsgenen zu beruhen, die zur peripheren Insulinresistenz des Typ II-Diabetes beitragen, bei der das Gewebe die Glucose als Reaktion auf das Insulinsignal nicht mehr richtig nutzen kann. Alternativ können auch genetische Faktoren zu der reduzierten Glucoseempfindlichkeit der insulinerzeugenden β-Zellen des Pankreas bei diesen Personen führen. Das Endergebnis dieser beiden physiologischen Zustände ist eine ausgeprägte Hyperglykämie, das Hauptmerkmal des Diabetes.
Die Transskriptionssteuerung des Insulingens erfolgt mittels einer kurzen Flanken-DNA-Region, die mit zellspezifischen und glucoseempfindlichen Signalmolekülen interagiert. Wie diese regulatorische Organisation funktioniert, versteht man nach wie vor nicht genau, auch wenn allgemein anerkannt ist, dass basische Helix-Schleife-Helix (bHLH) und Homöodomänen enthaltende Faktoren wichtige Komponenten der Transskriptionsmaschinerie sind, die die β-zell-spezifische Insulinexpression steuert. Ein inselspezifischer basischer Helix-Schleife-Helix-Komplex steht mit einer proximalen E-Box in Wechselwirkung, die Nir, IEB1 oder ICE heißt; dieses Element kommt im Insulin-I-Gen von Ratten zweimal vor, im Insulin-II-Gen der Ratte und dem menschlichen Insulingen jedoch nur einmal.
Kurztests mit insulinerzeugenden Zelllinien weisen darauf hin, dass E-Box-Bindungsfaktoren mit β-zell-spezifischen Proteinen, die sich an eine benachbarte AT-reiche Sequenz (FLAT) binden, die die Merkmale einer Homöodomänenerkennungssequenz aufweist, synergistisch interagieren. Es hat sich gezeigt, das sich verschiedene charakterisierte Homöodomänenproteine an das FLAT-Element binden, z.B. Isl-1, 1mx-1, cdx-3 und STF-1. Darüber hinaus entspricht letzteres Protein der Hauptbindungsaktivität einer evolutionär erhalten gebliebenen AT-reichen Sequenz, dem sogenannten P-Element. Isl-1 geht mit dem FLAT-Element eine schwache Bindung ein und scheint in den mittels Extrakten insulinerzeugender Zellen nachgewiesenen FLAT-Bindungskomplexen nicht vorzuliegen. Neueste Hinweise deuten darauf, dass Isl-1 bei der neuralen Entwicklung eine wichtigere Rolle spielt. Die Homöodomänenfaktoren lmx-1 und cdx-3 verfügen hinsichtlich der Insulinpromotorfunktion in heterologen Zellen über interessante Transaktivierungseigenschaften, doch ihre Zellverteilung und FLAT-Bindungsfähigkeit innerhalb der β-Zelle sind nach wie vor ungeklärt. Darüber hinaus liegen kaum Daten zur Funktion dieser Faktoren in β-Zelllinien vor.
Innerhalb der Gruppe von Faktoren mit Insulinpromotor-Bindungsaktivität ist STF-1 vielleicht der vielversprechendste Kandidat für einen Bona-fide-Regulator der Insulinpromotorfunktion. Bei Mäuseembryos wird STF-1 erstmals am Tag 8,5 in den Zellkernen von Urzellen, aus denen der Pankreas entsteht, nachgewiesen, kurz vor der frühesten erfassten Insulinexpression in dieser Region. Während der gesamten nachfolgenden Entwicklung des endokrinen Pankreas werden STF-1 und Insulin weitestgehend gleichzeitig exprimiert. Darüber hinaus scheint STF-1 in Extrakten insulinerzeugender Zelllinien eine Komponente der endogenen DNA-Bindungsaktivität des FLAT- und P-Elementes in dem Insulinpromotor zu sein. STF-1 interagiert außerdem mit dem E-Box-Bindungsfaktor Pan-1 stark synergistisch, wie es von einem FLAT-Bindungsfaktor zu erwarten ist. DNA-Bindungstests zeigen jedoch, dass andere unbekannte Faktoren der β-Zellextrakte ebenfalls einen großen Beitrag zu der nachgewiesenen FLAT-Bindungsaktivität leisten. Es ist nach wie vor unklar, ob eine FLAT-vermittelte Insulinpromotoraktivität die Gesamtheit oder nur einen Teil dieser erfassten Spezies benötigt.
Zwar wird STF-1 anfangs sowohl in exokrinen als auch in endokrinen Zellen des sich entwickelnden Pankreas exprimiert, doch die Erzeugung von STF-1 wird zunehmend auf die Insulin und Somatostatin erzeugenden Inselzellen beschränkt. In diesen Zellen scheint die STF-1-Wirkung für die Aufrechterhaltung der starken Expression der Somatostatin- und Insulingene wichtig zu sein.
STF-1 erkennt zwei genau definierte inselspezifische Elemente auf dem Insulinpromotor, nämlich FLAT und P. Bei der Bindung daran stimuliert STF-1 die Insulintransskription zusammen mit E47, einem Helix-Schleife-Helix-Protein, das zwei E-Box-Elemente (Far und Nir) erkennt. In ähnlicher Weise reguliert STF-1 die Somatostatinexpression in Inselzellen mittels zweier inselspezifischer Elemente (TSEI und TSEII).
Es hat sich herausgestellt, dass Homöodomänenproteine wie STF-1 eine wichtige Rolle bei der Entwicklung spielen, indem sie eine Zell- bzw. Segmentidentität erzeugen. Im Gegensatz zu ihren spezifischen und eindeutigen Wirkungen in vivo weisen die meisten Homöodomänenproteine in vitro eine geringe und überlappende DNA-Bindungsspezifität auf. Neueste Studien haben jedoch bestimmte Protein-Kofaktoren als Determinanten der Homöodomänen-DNA-Bindungsspezifität in vivo impliziert. Es wurde beispielsweise gezeigt, dass das Extradentikel (exd) der Drosophila die Aktivität homöotischer Proteine moduliert, ohne ihr Expressionsmuster zu verändern. Das Extradentikel scheint vielmehr die Zielgenselektion durch Verbesserung der DNA-Bindungsspezifität bestimmter Homöodomänenproteine zu fördern. Das Extradentikel ist de facto bei Wirbeltieren in hohem Maße erhalten geblieben und weist eine ausgeprägte Sequenzähnlichkeit (71%) mit dem menschlichen Proto-Onkogen Pbx1 auf.
Die Verknüpfung der Zellen mit einer spezifischen Abstammung während der Entwicklung wird größtenteils durch die relative Expression verschiedener Homöodomänen(HOX)-Selektorproteine bestimmt, die die Aktivierung bestimmter genetischer Programme vermitteln. Die Mechanismen, nach denen einzelne HOX-Gene selbst zum Ziel für die Expression in unterschiedlichen Zelltypen werden, ist jedoch nach wie vor weitgehend unklar.
Der Wirbeltierpankreas besteht aus endokrinen und exokrinen Komponenten, die aus einer gemeinsamen Vorläuferzelle in der Duodenumanlage entstehen (1). In der endokrinen Komponente des Pankreas wird eine pluripotente Vorläuferzelle, die anfänglich verschiedene Inselhormone exprimiert, zunehmend auf die Bildung der vier, die adulten Langerhans'schen Inseln enthaltenden Zellunterpopulationen – Insulin, Somatostatin, Glucagon und Pankreaspolypeptide erzeugende Zellen – beschränkt (2, 3). Der Mechanismus, nach dem diese Entwicklungswege aktiviert werden, ist unklar, doch neueste Hinweise deuten auf den Homöobox-Faktor STF-1 (IPF-1/IDX-1) als wichtige Determinante in diesem Prozess. Die Tatsache, dass STF-1 in der Tat für die Entwicklung notwendig ist, wird durch homologe Rekombinationsstudien gestützt, in denen die gezielte Zerstörung des SRF-1/IPF-1-Gens zu einem angeborenen Fehlen des Pankreas führt (4).
Die Expression von STF-1 (auch als Pdx1 bezeichnet) ist im Embryonalstadium erstmals an Tag 8,5 in Zellen der Pankreasanlage sowie in pluripotenten Vorläuferzellen nachweisbar. Nach vorübergehender Expression in endokrinen und exokrinen Komponenten des sich entwickelnden Pankreas wird die STF-1-Erzeugung zunehmend auf die Insulin und Somatostatin erzeugenden Inselzellen beschränkt (5, 6). In diesen Zellen scheint STF-1 die Insulin- und Somatostatingene durch Bindung an funktionale Elemente in dem Promotor zu regulieren (5, 7–16).
Dem Stand der Technik fehlt ein wirksames Mittel zur Regulierung der Expression des Homöodomänenproteins STF-1 in Pankreaszellen. Die vorliegende Erfindung erfüllt diesen im Stand der Technik seit langem bestehenden Bedarf und Wunsch.
Zusammenfassung der Erfindung
Zwar ist STF-1 ein wichtiger Regulator der Pankreasgene, doch der Mechanismus, nach dem die STF-1-Expression selbst auf Pankreaszellen ausgerichtet wird, ist nach wie vor unklar. Die vorliegende Erfindung belegt, dass ein 6,5 kb-Fragment des STF-1-Promotors ausreicht, die inselspezifische Expression eines β-Galactosidase-Reportergens in transgenen Mäusen und gezüchteten Duodenumzellen zu dirigieren. Innerhalb dieses 6,5 kb-Fragmentes ist ein E-Box-Element bei –104 relativ zu der Haupttransskriptionsinitiationsstelle für die STF-1-Promotoraktivität besonders wichtig.
Dieses Element wird von einem vorgeschalteten Aktivator erkannt, der für die Inselexpression von STF-1 ausschlaggebend ist. In der Tat verstärkt dieser STF-1-Promotor die gezielte Expression von STF-1 in Inselzellen um das 20- bis 100-fache. Die Deletion der proximalen E-Box-Sequenz bei –104 brachte die STF-1-Expression in HIT-Zellen vollständig zum Erliegen. Weiterhin hemmte ein Anti-USF-Antiserum (USF = vorgeschalteter Faktor) die Bildung von C1, C2 und C3, was darauf deutet, dass diese Proteine durch das USF-Protein gebildet werden.
Weiterhin hat man ein STF-1-Verstärkerelement in einer 530 bp-Region gefunden, das sich 600 bp oberhalb der Transskriptionsinitiationsstelle erstreckt. Promotorkonstrukte, die dieses 530 bp-Fragment enthielten, wurden mittels Dexamethasonbehandlung vollständig unterdrückt, nicht jedoch ein minimales STF-1-Promotorkonstrukt, das die allgegenwärtige USF-1-Erkennungsstelle enthielt. Die 530 bp-Region war in HIT-T15-Zellen 5–10 Mal so aktiv wie in COS-7-Zellen, was belegt, dass dieses Fragment eine inselzell-spezifische Aktivität enthält. Daher wird das STF-1-lacZ-Fusionsgen in der vorliegenden Erfindung für die Untersuchung von Verbindungen eingesetzt, die die STF-1-Expression in Pankreasinselzellen verstärken. Verbindungen, die die STF-1-Produktion stimulieren, verstärken die Funktion der Pankreasinsel-B-Zellen, d.h. die Produktion von Insulin. Daher eignen sich mit Hilfe des erfindungsgemäßen Verfahrens identifizierte Verbindungen besonders für Patienten mit Diabetes mellitus Typ II und einer Glucoseintoleranz infolge einer grenzwertigen Inselzellfunktion.
In einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren zum Testen von Verbindungen, die die STF-1-Transskription induzieren, bereitgestellt.
Pankreasinselzelllinien, die das STF-1/lacZ-Fusionsgen exprimieren, werden durch gleichzeitiges Ausfällen von Calciumphosphat isoliert. Um die Wirkung verschiedener Verbindungen auf die STF-1-Expression zu untersuchen, wird die jeweilige Verbindung STF-1/lacZ exprimierenden Zellen zugegeben. Dann wird die lacZ-Aktivität in Kontrollzellen und behandelten Zellen mittels eines Kolorimetrietests quantifiziert. Mit Hilfe dieses Verfahrens können eine große Anzahl von Verbindungen untersucht und STF-1 induzierende Verbindungen leicht identifiziert werden.
In einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren zur Verwendung des STF-1-Promotors zur Markierung insulinerzeugender Pankreasinselzellen in vivo bereitgestellt. Diesbezüglich diente das grün fluoreszierende Protein (GFP) als wichtiger Indikator. Die Expression des grün fluoreszierenden Proteins kann, wie von Ogawa et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 1995, 92: 11899–11903 beschrieben, zerstörungsfrei nachgewiesen werden. Um die Rückgewinnung der β-Zellen aus dem Pankreas eines Tieres zu erleichtern, wurde der STF-1-Promotor mit dem GFP codierenden Gen fusioniert. Das Einbringen des STF-I-GFP-Transgens in Schweine ermöglicht die effiziente und rasche Rückgewinnung insulinproduzierender Zellen aus dem Pankreas. Kurz gesagt wird der Pankreas aus Schweinen rückgewonnen und mit Collagenase behandelt, um die Zellen zu dispergieren. Insulinerzeugende Inselzellen lassen sich durch fluoreszenzaktivierte Zelltrennung (FACS) auf der Basis der Expression des STF-1-GFP-Transgens effizient rückgewonnen. Die gereinigte β-Zellpopulation kann nun bei der Zelltherapie von Diabetespatienten zum Einsatz kommen.
In einem Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren zur Bestimmung der Fähigkeit einer Prüfverbindung, die Pankreasinselzellen zur Induzierung der STF-1-Transskription zu stimulieren, bereitgestellt, das folgende Schritte umfasst: Bereitstellen eines Transportsystems, das einen STF-1-Verstärker mit einer Sequenz, die aus der Gruppe SEQ ID-Nr. 1 oder SEQ ID-Nr. 2 oder Fragmenten davon ausgewählt ist, sowie einen Promotor und ein Reportergen, das unter der Transskriptionssteuerung sowohl des STF-1-Verstärkers als auch des Promotors steht, enthält, wobei das Reportergen in der Lage ist, ein erfassbares Signal auf die Wirtszelle zu übertragen; Transferieren des Transportsystems in die Wirtszelle; Anlegen einer Kultur der Wirtszelle im Beisein einer Prüfverbindung zur Bestimmung der Fähigkeit der Prüfsubstanz, die Wirtszelle zur Erzeugung des Signals zu stimulieren; und Überprüfen des Signals zur Bestimmung der Fähigkeit der Prüfverbindung, die Wirtszelle zum Erzeugen des erfassbaren Signals zu stimulieren, wobei ein Vorhandensein des Signals anzeigt, dass die Prüfverbindung Pankreasinselzellen zur Induzierung der STF-1-Transskription stimuliert, und ein Nichtvorhandensein des Signals anzeigt, dass die Prüfverbindung Pankreasinselzellen nicht zur Induzierung der STF-1-Transskription stimuliert.
In einer bevorzugten Ausführungsform dieser Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist das verwendete Reportergen ein Enzym. In einer noch bevorzugteren Ausführungsform ist das Enzym aus der Gruppe von Luciferase und β-Galactosidase ausgewählt.
In einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung erfolgt der Übertragungsschritt durch Einbringen eines Transgens in Tiere mittels Transfektion oder Mikroinjektion.
In einer anderen Aufgabe der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren zur Markierung insulinproduzierender Pankreasinselzellen in vivo bereitgestellt, das folgende Schritte umfasst:
Bereitstellen eines Transportsystems, das einen STF-1-Promotor umfasst, der operativ mit einem Reportergen verbunden ist, wobei die Expression des Reportergens ein erfassbares Signal auf eine Pankreasinselzelle überträgt;
Einbringen des Transportsystems als Transgen in einen Schweine- oder Mäuseembryo; Heranwachsenlassen des Embryos zu einem Schwein oder einer Maus mit Pankreasinselzellen; und
Überprüfen des erfassbaren Signals, um zu bestimmen, ob irgendwelche der Pankreasinselzellen des Schweins oder der Maus das Reportergen exprimieren, wobei ein Vorhandensein des erfassbaren Signals das Vorhandensein insulinproduzierender Pankreasinselzellen anzeigt und das Nichtvorhandensein des erfassbaren Signals ein Nichtvorhandensein insulinproduzierender Pankreasinselzellen anzeigt.
In einer bevorzugten Ausführungsform dieser Aufgabe der vorliegenden Erfindung erzeugt das Reportergen ein fluoreszierendes Protein; das Verfahren schließt weiterhin den Schritt des Trennens insulinproduzierender Pankreasinselzellen von nicht-insulinproduzierenden Pankreasinselzellen mittels fluoreszenzaktivierter Zelltrennung (FACS) ein.
Andere und weitere Aspekte, Merkmale und Vorteile der vorliegenden Erfindung gehen aus der nachfolgenden Beschreibung der bevorzugten Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung hervor.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
Damit der Gegenstand mit den oben genannten erfindungsgemäßen Merkmalen, Vorteilen und Aufgaben im Detail verständlich ist, ist durch Bezugnahme auf bestimmte Ausführungsformen, die in den beigefügten Zeichnungen dargestellt sind, eine genauere Beschreibung der zuvor kurz zusammengefassten Erfindung möglich. Diese Zeichnungen sind Teil der Beschreibung. Es ist jedoch zu beachten, dass die beigefügten Zeichnungen bevorzugte Ausführungsformen der Erfindung darstellen und daher nicht als deren Umfang beschränkend gelten sollen.
1 stellt den Chomosomenort des STF-1-Gens dar. 1A stellt in einem schematischen Diagramm, das die Position von STF-1- (als Pdx1 bezeichnet) in Relation zu anderen Markern auf dem Mäusechromosom 5 zeigt, dar, dass das STF-1-Gen durch ein in der distalen Region des Mäusechromosoms 5 befindliches Orphan-Homöobox-Gen codiert wird. Rechts befindet sich eine centiMorgan-Skala. 1B ist eine Tabelle, die die Rekombinationshäufigkeit von STF-1 und verschiedenen Markern auf Chromosom 5 darstellt. Die linke Spalte zeigt Marker für die Chromosomenzuordnung. STF-1- wird hier als Pdx1 bezeichnet.
2 zeigt, dass der STF-1-Promotor keine TATA enthält und verschiedene Transskriptionsinitiationsstellen nutzt. 2A zeigt schematisch den 15 kb-Genomklon von STF-1 mit der darüber befindlichen kb-Skala. Dargestellt sind die 6,5 kb-5'-Flanke, das 4 kb-Intron und die 3 kb-3'-Flanke. IVS bezieht sich auf das 4 kb-Intron, das Exon I (schattiert, I) und Exon II (schattiert, II) unterbricht. 2B stellt die Nukleotidsequenz der 5'-Flankenregion des STF-1-Gens dar. Die mittels RNase-Schutz (dunkle Pfeile) und Primerextension (leere Pfeile) lokalisierten Transskriptionsstartstellen werden als S1 (Hauptinitiationsstelle, fett), S2 und S3 bezeichnet. Potentielle Bindungsstellen vorgeschalteter Faktoren für bHLH/bHLH-ZIP-Proteine (E-Box), CTF/NF-1 (CAAT) und C/EBP sind unterstrichen und ihre Position in Relation zur Hauptstartstelle markiert. 2C stellt einen RNase-Schutztest von Tu6-RNA (Tu6, Bahn 2) bzw. Kontrollhefe-tRNA (Hefe, Bahn 3) mittels einer Antisense-STF-1-RNA-Sonde dar. Links (Bahn 1) ist eine unverdaute Sonde dargestellt. 2D zeigt die Ergebnisse der Primerextensionsanalyse von Hefe (Bahn 4), Tu6-mRNA (Bahn 5) bzw. RIN-mRNA (Bahn 6) mittels eines Antisense-STF-1-Primers. Ganz rechts ist eine Sequenzierleiter dargestellt (GATC, Bahnen 7–10). Die Verbindung zwischen RNasegeschützen Produkten und Primerextensionsprodukten ist markiert; dargestellt sind die ersten drei Startstellen S1, S2 und S3 (siehe auch 2B unten).
3 zeigt, dass ein 6,5 kb-Fragment des STF-1-Promotors die Expression eines β-Galactosidase-Reportergens auf Pankreasinselzellen transgener Mäuse richtet. Repräsentative Kryoschnitte eines adulten Pankreas transgener Tiere (oben) und Kontrolltiere (unten) wurden unter Verwendung von XgaI als chromogenem Substrat bezüglich ihrer lacZ-Aktivität bewertet. Die Pfeile deuten auf die Pankreasinselzellen.
4 zeigt, dass die distalen und proximalen Elemente in dem STF-1-Promotor die STF-1-Expression auf Pankreasinselzellen dirigieren. 4A stellt die Aktivität eines (–6500)-STF-1-Luciferase-Reporterplasmids nach Transfektion in Pankreasinselzelllinien (βTC 3, HIT) versus Nicht-Inselzelllinien (PC12, COS, HeLa) dar. Ein repräsentativer Test zeigt die STF-1-Promotoraktivität in HIT-Zellen (100%) in Relation zu anderen Zelllinien nach Normalisierung mit gleichzeitig transfiziertem RSV-CAT-Kontrollplasmid. Die Tests wurden mindestens dreimal wiederholt. 4B zeigt einen repräsentativen Test der STF-1-Luciferase-Promotorkonstrukte (STF luc) nach Transfektion in HIT-Zellen. Die Konstrukte wurden nach der 5'-Promotorgrenze in Relation zur Haupttransskriptionsstartstelle benannt (S1, siehe 2A und 2B). Schematische Diagramme stellen die Position potentieller Bindungsstellen für Kernfaktoren dar; die Haupttransskriptionsstartstelle ist durch den dunklen Pfeil dargestellt. Das Sternchen bezeichnet eine nicht charakterisierte Bindungsaktivität in den distalen 3 kb. Bei jedem Konstrukt wurde die Aktivität in Relation zu (–6500)-STF-Luc (100%) nach Normalisierung zur Transfektionseffizienz mittels RSV-CAT als interner Kontrolle berechnet. Die Tests wurden mindestens viermal wiederholt.
5 zeigt, dass sich ein proximales E-Box-Element in dem STF-1-Promotor an den vorgeschalteten Faktor USF bindet. 5A stellt die Ergebnisse eines DNase I-Schutztests mit einem sich von –182 bis –37 (145 Basenpaare) erstreckenden und mit ³²p markierten STF-1-Promotorfragment dar. Das Autoradiogramm zeigt das Verdauungsmuster ohne Extrakt (Bahnen 1 und 4), mit Kernextrakten aus HIT- oder HeLa-Zellen (Bahnen 2 bzw. 3) und mit rekombinantem USF-1 (Bahn 5).
5B stellt einen elektrophoretischen Mobilitätsverschiebungstest eines mit einem ³²p markierten, die STF-1-E-Box (–118/–95) enthaltenden Doppelstrang-Oligonukleotid inkubierten HIT-Kernextraktes dar (Bahn 1). Unmarkierte Konkurrenz-Oligonukleotide (50-facher molarer Überschuss) wurden den Bindungsreaktionen wie folgt zugesetzt (Bahnen 2–5): STF-E ist das Wildtyp-STF-1-E-Box-Oligonukleotid, STF-E-MUT ist das Substitutionen im E-Box-Motiv bei –106 (C/A) und –102 (T/G) enthaltende Mutanten-STF-E-Oligonukleotid, Ins-1 (P) ist das P-Element des Insulin I-Promotors und Gal4 ist die GAL4-Erkennungsstelle.
5C links stellt die Ergebnisse eines Gelverschiebungstests der HIT-Kernextrakte unter Verwendung der STF-E-Box als Sonde dar (Bahn 1). Die Zugabe von USF oder TFE-3-Antikörpern zu den Reaktionen erfolgte wie angegeben (Bahnen 2 und 3). Komplexe C1, C2 und C3 wie angegeben. 5C rechts zeigt die Ergebnisse eines Gelverschiebungstests der HIT-Extrakte (Bahnen 1–3) unter Verwendung der STF-E-Sonde. Dargestellt ist die Zugabe der USF-1- und USF-2-spezifischen Antiseren zu den Bindungsreaktionen.
6 stellt dar, dass die Bindung von USF an die E-Box bei –104 für die STF-1-Promotoraktivität wichtig ist. 6A zeigt die Wirkung von E-Box-Mutationen auf die USF-Bindungsaktivität. Nachfolgend sind die Ergebnisse eines Gelverschiebungstests mit HIT-Kernextrakt unter Verwendung von Wildtyp-(E-WT) oder Mutanten-(E-MUT)STF-1-E-Box-Sonden von –106 bis –102 dargestellt. C1–3 = Komplexe C1, C2 und C3. 6B zeigt die Wirkung von E-Box-Mutationen auf die STF-1-Promotoraktivität in HIT-Zellen. Dargestellt ist ein repräsentativer Test mit Wildtyp-, Mutanten- oder deletierten (–118/–95) STF-1-E-Box-Motiven transfizierter HIT-Zellen im Zusammenhang mit 6500 Basenpaaren bzw. 190 Basenpaaren des STF-1-Promotors. Die Reporteraktivitäten sind in Relation zu dem Wildtyp-(–6500)-STF-1-Luc-Konstrukt (100%) nach Normalisierung für die Transfektionseffizienz mit einem gleichzeitig transfizierten RSV-CAT-Kontrollplasmid dargestellt. Die Tests wurden mindestens dreimal wiederholt.
7 zeigt, dass Glucocorticoide die STF-1-Expression über einen inselspezifischen Verstärker in der 5'-Flankenregion des STF-1-Gens unterdrücken.
7A zeigt die Aktivität von STF-1-Promotorkonstrukten nach Behandlung von HIT-T15-Zellen mit Dexamethason (10^–7 M) oder einem Kontrollethanoltransportsystem über 18–24 Stunden. Die Aktivität des –6,2/–5,67-STF-Luc-Reporters ist auf 100% festgelegt. Sämtliche Konstrukte wurden im Zusammenhang mit einem STF-1-Luciferase-Transportsystem (STF-1-Luc) bewertet, das 120 Basen der 5'-proximalen Flankenregion enthält. Die in den STF-1-Luc-Reporter eingesetzten STF-1-Sequenzen sind mit Nukleotidzahlen gekennzeichnet. –6,5/–6,2-STF-Luc enthält z.B. STF-1-Sequenzen von –6500 bis –6200, die mit den proximalen 120 Basen der STF-1-5'-Flankenregion fusioniert sind. Distale Regionen, die Aktivierungselemente enthalten, sind durch ein Oval und ein Quadrat gekennzeichnet, der minimale STF-1-Promotor durch ein Rechteck. Es sind Standardfehlerbalken dargestellt. Die Tests wurden mindestens dreimal wiederholt. Die STF-1-Reporteraktivität wurde durchgehend unter Verwendung eines gleichzeitig transfizierten CMV-βgal-Kontrollplasmids zur Transfektionseffizienz normalisiert.
7B (oben) stellt die Ergebnisse eines Kurztransfektionstests von STF-1-Reporterkonstrukten in HIT-T15-Zellen dar. Die Aktivität von (–6500)-STF-Luc, das 6500 Basen der 5'-Flankensequenz enthält, ist auf 100% festgelegt. Sämtliche Tests wurden mindestens viermal doppelt wiederholt. Standardfehler wie angegeben (unten). Dargestellt ist die Aktivität der STF-1-Luciferase-Reporterplasmide nach vorübergehender Transfektion in COS-7-Zellen. Die Promotoraktivität ist auf CMV-βgal-Kontrollaktivität normalisiert und ermöglicht so den direkten Vergleich mit der STF-Reporteraktivität in HIT-Zellen.
7C zeigt die Nukleotidsequenz des minimalen inselspezifischen Verstärkers in dem STF-1-Gen, die sich von –6,2 bis –5,67 kb erstreckt. HNF-3- und E-Box-Bindungsmotive sind fett und unterstrichen dargestellt.
8 zeigt, dass der pankreasinsel-spezifische Verstärker in dem STF-1-Gen Bindungsstellen für HNF-3β und BETA-2 enthält.
8A stellt die Ergebnisse von DNAse I-Schutztests roher Kernextrakte von HIT-T15-Inselzellen, HeLa- oder COS-7-Zellen mittels einer sich von –5870 bis –6100 des Ratten-STF-1-Promotors erstreckenden ³²p-markierten STF-1-Sonde dar. KEINE = Kontrollreaktion ohne zugesetzten Extrakt, HNF-3α = Reaktion mittels rekombinantem Protein.
8B stellt die Ergebnisse eines Gelmobilitätsverschiebungstests von rohen Kernextrakten aus HeLa, HepG2, Glucagon erzeugenden αTC- oder Insulin erzeugenden HIT- und RIN-Zelllinien dar (Bezeichnung über der jeweiligen Bahn). Die Tests wurden mit einer ³²p-markierten, das H-Element enthaltenden STF-1-Oligonukleotidsonde durchgeführt. Nachfolgend sind die Wildtyp(WT)-Nukleotidsequenz und Mutanten(MT)-H-Elemente dargestellt. Die Zugabe des 100-fachen Überschusses nicht markierter Wildtyp- oder Mutantenkonkurrenz-DNA erfolgte wie über den Bahnen angegeben.
8C zeigt die Ergebnisse eines Gelmobilitätsverschiebungstests von rohem Kernextrakt aus HIT-Insulinom-(HIT NE) und primären kultivierten adulten Ratten-Inselzellen(ISLET NE) mittels einer sich von –5907 bis –5927 erstreckenden ³²p-markierten STF-1-H-Element-Sonde. Die Zugabe von HNF3α, β- oder γ-Antiseren zu Reaktionen erfolgte wie über den Bahnen angegeben. – = kein Antiserum zugegeben; I und II = Protein-DNA bzw. Antikörper-Supershift-Komplexe.
8D stellt die Ergebnisse eines Gelmobilitätsverschiebungstests von rohem Kernextrakt aus HIT-T15-Zellen mittels einer sich von –5963 bis –5981 des STF-1-Promotors erstreckenden ³²p-markierten B-Element-Sonde dar. Die Zugabe von BETA-2-E2A- oder STF-1-Antiserum zu Bindungsreaktionen ist über den einzelnen Bahnen angegeben. Die Zugabe eines 100-fachen Überschusses von nicht markierter Wildtyp (WT: 5'-TCAGTGACAGATGGAGTCCT-3')- oder Mutanten (MT: 5'-TCAGTGAAAGACGGAGTCCT-3')-Konkurrenz-DNA erfolgte wie angegeben. Die Bindungsaktivität, die von dem mit BETA-2- und E47-cDNA programmierten Retikulozytenlysat stammt, ist in Bahn 7 dargestellt. Die oberste Bande in Bahn 7 gehört zu dem Retikulozytenlysat.
9 belegt, dass Glucocorticoide die STF-1-Expression durch Blockieren der HNF-3-Aktivität auf dem inselspezifischen Verstärker hemmen.
9A zeigt die Ergebnisse eines Kurztransfektionstests von STF-1-Reporterplasmiden in HIT-T15-Insulinomzellen. Die Aktivität des –6,2/–5.7-STF-Luc-Konstrukts, das den minimalen inselspezifischen Verstärker (–6200 bis –5700) enthält, ist auf 100% festgesetzt. Konstrukte, die Punktmutationen in H- und B-Elementen enthalten, die die Bindung von HNF-3β und BETA-2/E2A zerstören, sind mit einem X in einem Oval oder Quadrat gekennzeichnet. Die Punktmutationen entsprechen bei Gelmobilitätsverschiebungstests eingesetzten E-Box- und H-Elementmutationen (siehe 8).
9B belegt die Wirkung der HNF-3β-Überexpression auf die STF-1-Reporteraktivität (Wildtyp- = dunkle Balken, H-Element-Mutanten = helle Balken) bei Kontroll- (–) und mit Dexamethason (+) behandelten HIT-T15-Zellen. Die Aktivität des Wildtyp-(–6,2/–5,7)-STF-Luc-Konstrukts, das den minimalen inselspezifischen Verstärker (–6200 bis –5700) in Kontrollzellen enthält, ist auf 100% festgesetzt. Standardfehlerbalken dargestellt. Die Experimente wurden mindestens viermal wiederholt.
9C zeigt die Wirkung eines steigenden HNF-3β-Effektorplasmid-Spiegels auf die Wildtyp-STF-1-Reporteraktivität (–6500 STF-1-LUC) in HIT-T15-Zellen. Die Menge des HNF-3β-Effektorplasmids (in μg) ist unter dem jeweiligen Balken angegeben. Die Gesamtmenge des Effektorplasmids in den einzelnen Tests wurde durch Austarieren mit einem leerem CMV-Expressionstransportsystem konstant gehalten. Kontroll-(ETOH) und mit Dexamethason (DEX) behandelte Zellen wie angegeben.
In der vorliegenden Erfindung wurde gezeigt, dass STF-1, ein Homöodomänenprotein, das an der Pankreasmorphogenese und Glucosehomöostase beteiligt ist, von einem „Orphan"-Homöoboxgen auf dem Mäusechromosom 5 codiert wird. Bei der Fusionierung mit einem β-Galactosidase-Reportergen zeigte ein 6,5 kb-Genomfragment der 5'-Flankensequenz des STF-1-Gens eine pankreasinsel-spezifische Aktivität bei transgenen Mäusen. Zwei eindeutige Elemente in dem STF-1-Promotor sind für die auf die Inseln beschränkte Expression notwendig – eine distale Verstärkersequenz zwischen –3 und –6,5 kb und eine proximale E-Box-Sequenz bei –104, die hauptsächlich von dem Helix-Schleife-Helix(bHLH)/Leucinzipper(ZIP)-Kernfaktor USF erkannt wird. Da Punktmutationen in der E-Box bei –104, die die USF-Bindung zerstören, dementsprechend auch die STF-1-Promotoraktivität behindern, zeigt die vorliegende Erfindung, dass USF eine wichtige Komponente des Regulationsapparates ist, der die STF-1-Expression auf Pankreasinselzellen richtet. Weiterhin stellte man fest, dass Glucocorticoide die Expression des STF-1-Gens durch Blockierung der Aktivität eines distalen inselspezifischen Verstärkers, der zwei endodermale Faktoren, nämlich HNF-3β und BETA-2/E47 erkennt, stark unterdrückt. Mutationen im STF-1-Verstärker, die die Bindung von HNF-3β und BETA-2/E47 blockieren, zerstörten dementsprechend auch die STF-1-Promotoraktivität. Die Fähigkeit eines HNF-3β-Expressionstransportsystems zur Rettung der STF-1-Verstärkeraktivität in glucocorticoid-behandelten Zellen zeigt, dass HNF-3β in der Tat ein wichtiger Regulator der STF-1-Expression ist.
Eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist die Bereitstellung eines Verfahrens zur Prüfung von Verbindungen, die eine STF-1-Transskription induzieren. Pankreasinselzelllinien, die das STF-1/lacZ-Fusionsgen exprimieren, werden durch gleichzeitiges Ausfällen von Calciumphosphat isoliert. Um die Wirkung verschiedener Verbindungen auf die STF-1-Expression zu untersuchen, wird die jeweilige Verbindung STF-1/lacZ exprimierenden Zellen zugegeben. Dann wird die lacZ-Aktivität in Kontrollzellen und behandelten Zellen mittels eines Kolorimetrietests quantifiziert. Mit Hilfe dieses Verfahrens können eine große Anzahl von Verbindungen untersucht und STF-1 induzierende Verbindungen leicht identifiziert werden.
In einer weiteren Aufgabe der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren zum Einsatz des STF-1-Promotors zur Markierung insulinerzeugender Pankreasinselzellen in vivo bereitgestellt. Diesbezüglich diente das grün fluoreszierende Protein (GFP) als wichtiger Indikator. Die Expression des grün fluoreszierenden Proteins kann, wie von Ogawa et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 1995, 92: 11899–11903 beschrieben, ohne Zerstörung der Zellen nachgewiesen werden. Um die Rückgewinnung der β-Zellen aus dem Pankreas eines Tieres zu erleichtern, wurde der STF-1-Promotor mit dem GFP codierenden Gen fusioniert. Das Einbringen des STF-I-GFP-Transgens in Schweine ermöglicht die effiziente und rasche Rückgewinnung von insulinproduzierenden Zellen aus dem Pankreas. Kurz gesagt wird der Pankreas aus Schweinen rückgewonnen und mit Collagenase behandelt, um die Zellen zu dispergieren. Insulinerzeugende Inselzellen lassen sich durch fluoreszenzaktivierte Zelltrennung (FACS) auf der Basis der Expression des STF-I-GFP-Transgens rückgewinnen. Die gereinigte β-Zellpopulation kann nun bei der Zelltherapie von Diabetespatienten zum Einsatz kommen.
In einem Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren zur Bestimmung der Fähigkeit einer Prüfverbindung, Pankreasinselzellen zur Induzierung der STF-1-Transskription zu stimulieren, bereitgestellt, das folgende Schritte umfasst: Bereitstellen eines Transportsystems, das einen STF-1-Verstärker mit einer Sequenz, die aus der Gruppe SEQ ID-Nr. 1 oder SEQ ID-Nr. 2 oder Fragmenten davon ausgewählt ist, sowie einen Promotor und ein Reportergen, das unter der Transskriptionssteuerung sowohl des STF-1-Verstärkers als auch des Promotors steht, enthält, wobei das Reportergen in der Lage ist, ein erfassbares Signal auf die Wirtszelle zu übertragen; Transferieren des Transportsystems in die Wirtszelle; Anlegen einer Kultur der Wirtszelle im Beisein einer Prüfverbindung zur Bestimmung der Fähigkeit der Prüfsubstanz, die Wirtszelle zur Erzeugung des Signals zu stimulieren; und Überprüfen des Signals zur Bestimmung der Fähigkeit der Prüfverbindung, die Wirtszelle zum Erzeugen des erfassbaren Signals zu stimulieren, wobei ein Vorhandensein des Signals anzeigt, dass die Prüfverbindung Pankreasinselzellen zur Induzierung der STF-1-Transskription stimuliert, und ein Nichtvorhandensein des Signals anzeigt, dass die Prüfverbindung Pankreasinselzellen nicht zur Induzierung der STF-1-Transskription stimuliert.
In einer bevorzugten Ausführungsform dieser Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist das verwendete Reportergen ein Enzym. In einer noch bevorzugteren Ausführungsform ist das Enzym aus der Gruppe Luciferase und β-Galactosidase ausgewählt.
In einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung erfolgt der Übertragungsschritt durch Einbringen eines Transgens in Tiere mittels Transfektion oder Mikroinjektion.
In einer anderen Aufgabe der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren zur Markierung insulinproduzierender Pankreasinselzellen in vivo bereitgestellt, das folgende Schritte umfasst:
Bereitstellen eines Transportsystems, das einen STF-1-Promotor umfasst, der operativ mit einem Reportergen verbunden ist, wobei die Expression des Reportergens ein erfassbares Signal auf eine Pankreasinselzelle überträgt;
Einbringen des Transportsystems als Transgen in einen Schweine- oder Mäuseembryo; Heranwachsenlassen des Embryos zu einem Schwein oder einer Maus mit Pankreasinselzellen; und
Überprüfen des erfassbaren Signals, um zu bestimmen, ob irgendwelche der Pankreasinselzellen des Schweins oder der Maus das Reportergen exprimieren, wobei ein Vorhandensein des erfassbaren Signals das Vorhandensein insulinproduzierender Pankreasinselzellen anzeigt und das Nichtvorhandenseins des erfassbaren Signals ein Nichtvorhandensein insulinproduzierender Pankreasinselzellen anzeigt.
In einer bevorzugten Ausführungsform dieser Aufgabe der vorliegenden Erfindung erzeugt das Reportergen ein fluoreszierendes Protein; das Verfahren schließt weiterhin den Schritt des Trennens insulinproduzierender Pankreasinselzellen von nicht-insulinproduzierenden Pankreasinselzellen mittels fluoreszenzaktivierter Zelltrennung (FACS) ein.
Das menschliche Genom enthält vier Gencluster (HOX oder homöotische Selektorgene), die kritische Determinanten der Axialkörpermusterbildung während der Embryogenese darstellen (Krumauf, 1994, Cell, 78: 191–201). Die vier Cluster enthalten jeweils bis zu 13 Gene; eines der Gene eines Clusters weist für gewöhnlich eine besonders starke Homologie mit einem Mitglied der anderen drei Familien auf. Solche verwandten Gene werden als Paraloge bezeichnet; HoxA1, HoxB1, HoxC1 und HoxD1 sind also allesamt eng verwandte Paraloge, die sich in verschiedenen HOX-Clustern auf unterschiedlichen Chromosomen befinden. Der HoxB-Komplex befindet sich auf dem langen Arm des Chromosoms 17; HoxB1 bis HoxB9 beispielsweise wurden bereits identifiziert.
Die glucoseabhängige Regulation des Insulingens scheint zusammen mit einem glucosevermittelten Anstieg der Insulinsezernierung zu erfolgen. Dies kann teilweise Folge eines intrazellulären Calciumanstiegs sein. Darüber hinaus kann eine glucose-responsive Insulinpromotorfunktion zumindest teilweise durch Modulation der Aktivität der FLAT-Bindungsproteine erfolgen. HoxB13 bindet sich mit hoher Affinität an das funktionell wichtige FLAT-Element des Insulinpromotors. Weiterhin aktivieren HoxB13 und der Insulin-ICE/Nir-Element-Bindungsfaktor Pan-1 bei kombinierter Zugabe den Insulinpromotor stark. Dies stimmt mit der Beobachtung überein, dass die FLAT- und Nir-Elemente in insulinerzeugenden Zellen synergistisch funktionieren. Zusammengenommen weisen diese Daten darauf hin, dass calciumabhängige Signalwege die Funktion von HoxB13 regulieren könnten.
Erfindungsgemäß verfügt der Stand der Technik über angewandte herkömmliche molekularbiologische, mikrobiologische und rekombinante DNA-Techniken. Solche Techniken werden in der Literatur ausführlich erläutert (siehe z.B. Maniatis, Fritsch & Sambrook, „Molecular Cloning: A Laboratory Manual" (1982); „DNA Cloning: A Practical Approach", Band I und II (Hrsg. D. N. Glover, 1985); „Oligonucleotide Synthesis" (Hrsg. M. J. Gait, 1984); „Nucleic Acid Hybridization" (Hrsg. B. D. Hames & S. J. Higgins, 1985); „Transscription and Translation" (Hrsg. B. D. Hames & S. J. Higgins, 1984); „Animal Cell Culture" (Hrsg. R. I. Freshney, 1986); „Immobilized Cells And Enzymes" (IRL Press, 1986); B. Perbal, „A Practical Guide To Molecular Cloning" (1984).
Daher sind die unten stehenden Begriffe – sofern sie hierin erscheinen – wie nachfolgend definiert.
Ein „Transportsystem" ist ein Replikon wie z.B. ein Plasmid, ein Phage oder ein Cosmid, an das ein anderes DNA-Segment angefügt werden kann, um die Replikation des angefügten Segmentes hervorzurufen.
Ein „DNA-Molekül" bezieht sich auf die Polymerform der Desoxyribonukleotide (Adenin, Guanin, Thymin und Cytosin) als Einzelstrang oder Doppelstranghelix. Dieser Begriff bezieht sich ausschließlich auf die primäre und sekundäre Struktur des Moleküls ohne Beschränkung auf eine bestimmte tertiäre Form. Daher schließt dieser Begriff unter anderem in linearen DNA-Molekülen gefundene Doppelstrang-DNA (z.B. Restriktionsfragmente), Viren, Plasmide und Chromosomen ein. Die Struktur wird nach dem üblichen Schema der ausschließlichen Angabe der Sequenz in 5'-3'-Richtung entlang des nicht transskribierten DNA-Strangs (d.h. des Strangs mit einer zur mRNA homologen Sequenz) diskutiert.
Ein „Replikationsursprung" bezieht sich auf diejenigen DNA-Sequenzen, die an der DNA-Synthese teilnehmen.
Eine DNA-„Codiersequenz" ist eine Doppelstrang-DNA-Sequenz, die bei Steuerung durch geeignete Regulationssequenzen in vivo in ein Polypeptid transskribiert und translatiert wird. Die Grenzen der Codiersequenz werden durch ein Startcodon am 5'-Ende (Aminoende) und ein Translationsstopcodon am 3'-Ende (Carboxylende) bestimmt. Eine Codiersequenz umfasst z.B. jedoch nicht ausschließlich prokaryontische Sequenzen, cDNA eukaryontischer mRNA, Genom-DNA-Sequenzen eukaryontischer DNA (z.B. Säugetier-DNA) und sogar synthetische DNA-Sequenzen. Ein Polyadenylierungssignal und eine Transskriptionsterminationssequenz befinden sich für gewöhnlich am 3'-Ende der Codiersequenz.
Sequenzen zur Steuerung von Transskription und Translation sind DNA-Regulationssequenzen wie Promotoren, Verstärker, Polyadenylierungssignale, Terminatoren und dergleichen, die die Expression einer Codiersequenz in einer Wirtszelle hervorrufen.
Eine „Promotorsequenz" ist eine DNA-Regulierungsregion, die sich an RNA-Polymerase in einer Zelle binden und die Transskription einer nachgeschalteten (3'-Richtung) Codiersequenz initiieren kann. Zum Zweck der Definition der vorliegenden Erfindung ist die Promotorsequenz an ihrem 3'-Ende durch die Transskriptionsinitiationsstelle gebunden und erstreckt sich aufwärts (in 5'-Richtung), um die minimale Anzahl Basen oder Elemente einzuschließen, die für die Initiierung der Transskription auf einem vor dem Hintergrundrauschen nachweisbaren Level notwendig sind. Innerhalb der Promotorsequenz finden sich eine Transskriptionsinitiationsstelle (zweckmäßigerweise durch Mapping mit Nuklease S1 definiert) sowie Proteinbindungsdomänen (Konsenssequenzen), die für die Bindung der RNA-Polymerase verantwortlich sind. Eukaryontische Promotoren enthalten häufig, aber nicht immer „TATA"-Boxen und „CAT"-Boxen. Prokaryontische Promotoren enthalten zusätzlich zu den –10- und –35-Konsenssequenzen Shine-Dalgarno-Sequenzen.
Eine „Expressionssteuersequenz" ist eine DNA-Sequenz, die die Transskription und Translation einer anderen DNA-Sequenz steuert und reguliert. Eine Codiersequenz befindet sich „unter der Steuerung" der Transskriptions- und Translationssteuersequenzen in einer Zelle, wenn die RNA-Polymerase die Codiersequenz in mRNA transskribiert, die dann in das von der Codiersequenz codierte Protein translatiert wird.
Eine „Signalsequenz" kann sich vor der Codiersequenz befinden. Diese Sequenz codiert ein Signalpeptid am N-Ende des Polypeptids, das mit der Wirtszelle kommuniziert, um das Polypeptid an die Zelloberfläche zu dirigieren oder das Polypeptid in die Medien zu sezernieren; dieses Signalpeptid wird vor dem Austritt des Proteins aus der Zelle von der Wirtszelle abgeschnitten. Signalsequenzen können zusammen mit einer Vielzahl von Proteinen aus Prokaryonten und Eukaryonten auftreten.
Der Begriff „Oligonukleotid", wie er hierin mit Bezug auf die erfindungsgemäße Sonde verwendet wird, ist definitionsgemäß ein Molekül, das aus zwei oder mehr, vorzugsweise mehr als acht Ribonukleotiden besteht. Seine exakte Größe hängt von vielen Faktoren ab, die wiederum von der letztendlichen Funktion und Verwendung des Oligonukleotids abhängen.
Der Begriff „Primer", wie er hierin verwendet wird, bezieht sich auf ein Oligonukleotid – sei es natürlich vorkommend wie in einem gereinigten Restriktionsdigest oder synthetisch hergestellt – das unter Bedingungen, bei denen die Synthese eines zu einem Nukleinsäurestrang komplementären Primerextensionsproduktes induziert wird, d.h. im Beisein von Nukleotiden und einem Induktionsmittel wie z.B. einer DNA-Polymerase und bei geeigneter Temperatur und geeignetem pH, als Syntheseinitiationspunkt dienen kann. Der Primer kann entweder aus einem Einzel- oder einem Doppelstrang bestehen und muss ausreichend lang sein, um die Synthese des gewünschten Extensionsproduktes im Beisein des Induktionsmittels zu starten. Die genaue Länge des Primers hängt von vielen Faktoren wie z.B. Temperatur, Primerquelle und Anwendungszweck ab. Für diagnostische Anwendungszwecke beispielsweise enthält der Oligonukleotid-Primer je nach Komplexität der Zielsequenz typischerweise 15–25 oder mehr Nukleotide, kann aber auch weniger Nukleotide enthalten.
Die Primer werden hierin so ausgewählt, dass sie „im Wesentlichen" komplementär zu verschiedenen Strängen einer bestimmten Ziel-DNA-Sequenz sind. Das heißt, dass die Primer ausreichend komplementär sein müssen, um mit ihren jeweiligen Strängen zu hybridisieren. Daher muss die Primersequenz nicht die genaue Sequenz der Schablone widerspiegeln. Ein nicht-komplementäres Nukleotidfragment z.B. kann am 5'-Endes des Primers befestigt sein, während der Rest der Primersequenz zum Strang komplementär ist. Alternativ können nicht-komplementäre Basen oder längere Sequenzen in dem Primer verteilt sein, vorausgesetzt dass die Primersequenz zu der Sequenz ausreichend komplementär ist oder mit ihr hybridisiert und so die Schablone für die Synthese des Extensionsproduktes bildet.
Die Begriffe „Restriktionsendonukleasen" und „Restriktionsenzyme", wie sie hierin verwendet werden, beziehen sich auf bakterielle Enzyme, die Doppelstrang-DNA an oder in der Nähe einer spezifischen Nukleotidsequenz zerschneiden.
Eine Zelle wurde durch exogene oder heterologe DNA „transformiert", wenn eine solche DNA in die Zelle eingebracht wurde. Die Transformations-DNA kann in das Genom der Zelle eingebaut (kovalent gebunden) werden. Bei Prokaryonten, Hefe und Säugetierzellen z.B. kann die Transformations-DNA auf einem episomalen Element, z.B. einem Plasmid gehalten werden. Bei eukaryontischen Zellen ist eine stabil transformierte Zelle eine Zelle, bei der die Transformations-DNA in ein Chromosom eingebaut wurde, so dass sie durch Tochterzellen mittels Chromosomenreplikation vererbt wird. Diese Stabilität wird durch die Fähigkeit eukaryontischer Zellen zur Bildung von Zelllinien oder Klonen aus einer Population Transformations-DNA enthaltender Tochterzellen belegt. Ein „Klon" ist eine von einer einzelnen Zelle oder einem gemeinsamen Vorfahren mittels Mitose abgeleitete Zellpopulation. Eine „Zelllinie" ist ein Klon einer Primärzelle, der über viele Generationen in vitro stabil wachsen kann.
Zwei DNA-Sequenzen sind „im Wesentlichen homolog", wenn mindestens etwa 75% (vorzugsweise mindestens etwa 80% und am bevorzugtesten mindestens etwa 90 oder 95%) der Nukleotide über die definierte Länge der DNA-Sequenzen übereinstimmen. Sequenzen, die im Wesentlichen homolog sind, lassen sich durch Sequenzvergleich mittels Standardsoftware (erhältlich in Sequenzdatenbanken) oder in einem Southern-Hybridisierungsexperiment unter z.B. stringenten Bedingungen, wie sie für dieses spezielle System definiert sind, identifizieren. Die Definition geeigneter Hybridisierungsbedingungen ist im Stand der Technik möglich (siehe z.B. Maniatis et al., supra; DNA Cloning, Band I & II, supra; Nucleic Acid Hybridization, supra).
Eine „heterologe" Region des DNA-Konstrukts ist ein identifizierbares DNA-Segment innerhalb eines größeren DNA-Moleküls, das in der Natur nicht zusammen mit dem größeren Molekül vorkommt. Codiert also die heterologe Region ein Säuretiergen, ist das Gen für gewöhnlich von DNA flankiert, die die Säuretier-Genom-DNA im Genom des Quellorganismus nicht flankiert. In einem anderen Beispiel ist die Codiersequenz ein Konstrukt, bei dem die Codiersequenz selbst in der Natur nicht vorkommt (z.B. eine cDNA, bei der die Genomcodiersequenz Introns enthält, oder synthetische Sequenzen mit anderen Codons als das native Gen). Allelvariationen oder natürlich vorkommende Mutationsereignisse führen nicht zu einer heterologen DNA-Region, wie sie hierin definiert ist.
Die bei diesen Studien am häufigsten angewandten Marker sind radioaktive Elemente, Enzyme, chemische Substanzen, die bei Einwirkung von ultraviolettem Licht fluoreszieren, und sonstige. Eine Reihe fluoreszierender Materialien ist bekannt und kann als Marken eingesetzt werden. Dazu gehören zum Beispiel Fluorescein, Rhodamin, Auramin, Texas-Rot, AMCA-Blau und Lucifer-Gelb. Ein Material mit besonderer Nachweiskraft sind in Ziegen erzeugte und mittels eines Isothiocyanats mit Fluorescein konjugierte Anti-Kaninchen-Antikörper.
Enzymmarker sind ebenfalls nützlich und können mittels einer der derzeit zur Anwendung kommenden kolorimetrischen, spektrophotometrischen, fluorspektrophotometrischen, amperometrischen oder gasometrischen Techniken nachgewiesen werden. Das Enzym wird mit dem ausgewählten Teilchen durch Umsetzen mit Brückenmolekülen wie z.B. Carbodiimiden, Diisocyanaten, Glutaraldehyd und dergleichen konjugiert. Viele Enzyme, die bei diesen Verfahren eingesetzt werden können, sind bekannt und können verwendet werden. Bevorzugt sind Peroxidase, β-Glucuronidase, β-D-Glucosidase, β-D-Galactosidase, Urease, Glucoseoxidase plus Peroxidase und alkalische Phosphatase (bezüglich der Offenbarung alternativer Markermaterialien und -verfahren wird beispielsweise Bezug auf die US-Patente Nr. 3,654,090, 3,850,752 und 4,016,043 genommen).
Die folgenden Beispiele sollen verschiedene Ausführungsformen der Erfindung veranschaulichen, die vorliegende Erfindung jedoch in keiner Weise einschränken.
Es erfolgte ein Chromosomen-Mapping des STF-1-Gens mittels eines (B6 × SPRET) F1 × SPRET-Backcross-DNA-Panels des Jackson Laboratory Backcross DNA Panel Map Service, wobei ein ³²p-markiertes STF-1-cDNA-Fragment als Sonde diente.
Beispiel 2
Ein 6500 Basenpaare einer vorgeschalteten STF-1-Sequenz vor dem β-Galactosidase-Reportergen enthaltendes Fusionsgen wurde mittels Standardkloniertechniken konstruiert und in männliche Pronuclei befruchteter Oozyten injiziert. Gründermäuse wurde mittels Southern Blotting und PCR-Amplifikationstechniken identifiziert. Die Expression des STF-1/β-Galactosidase-Gens in transgenen Geweben wurde auf 20 μm dicken, auf Paraformaldehyd fixierten Gewebeschnitten mittels X-gal als chromogenem Substrat bewertet.
Beispiel 3
In Supershift-Experimenten verwendete, nicht unterscheidende USF-1,2-Antikörper wurden von Santa Cruz Biotechnology bezogen. TFE-3-Antikörper wurden von K. Jones bezogen. Antikörper, die speziell USF-1 oder USF-2 erkennen, wurden von M. Sawadogo (17, 18) bezogen.
Beispiel 4
Das STF-1-Gen wurde mittels eines ³²p-markierten STF-1-cDNA-Fragmentes als Hybridisierungssonde aus einer EMBL-3-Rattengenombibliothek isoliert. STF-1-positive Genomfragmente wurden in die EcoRI-Stellen des SK-II-Plasmids (Stratagene) subkloniert.
Beispiel 5
Poly-A⁺-RNA wurde mittels eines Oligotex(dT)-30-Systems (Quiagen) hergestellt. Oligonukleotid-Primer zur Primerextensionsanalyse wurden am 5'-Ende mit γ-³²p-ATP und T4-Polynukleotidkinase markiert. 5 μg PolyA⁺-RNA wurden mit am Ende markiertem Antisense-Primer 5 Minuten lang bei 80°C und anschließend 16 Stunden lang bei 42°C inkubiert. Die Primerextensionsreaktionen erfolgten mittels AMV-Reverser Transkriptase bei 37°C über eine Stunde; die Produkte wurden auf 5% denaturierendem Polyacrylamid analysiert. Die Analyse des RNase-Schutzes erfolgte mittels 25 μg der gesamten, aus Tu6-Zellen extrahierten RNA (19). Eine Antisense-STF-1-RNA-Sonde wurde mittels eines sich von –185 bis +93 in Relation zu der Translationsstartstelle erstreckenden STF-1-Genomfragmentes erzeugt. Die ³²p-markierte Antisense-STF-1-RNA wurde in vitro mittels T7-RNA-Polymerase und ³²p-UTP synthetisiert. Die STF-1-Antisense-RNA-Sonde und mRNA wurden bei 80°C 5 Minuten lang geglüht und anschließend 16 Stunden lang bei 65°C inkubiert. Die Glühreaktionen wurden anschließend mit 40 μg/ml RNase bei Raumtemperatur eine Stunde lang behandelt und die Verdauungsprodukte wurden mittels Elektrophorese auf 5% denaturierendem Polyacrylamid analysiert.
Beispiel 6
Sämtliche Promotorfragmente wurden mittels Standardklonierverfahren in das p(A)₃- Luciferasegerüst von D. Helinski (20) kloniert. 5'-Flankensequenzen des STF-1-Promotors wurden mit dem Luciferasegen bei +68 (–6500 STF Luc, –3500 STF Luc, –540 STF Luc, –410 STF Luc, –225 STF Luc, –140 STF Luc) oder bei +78 (–190 STF Luc, –130 STF Luc, –120 STF Luc, –95 STF Luc, –35 STF Luc) in Relation zur Haupttransskriptionsinitiationsstelle fusioniert. Die Plasmide wurden durch Calciumphosphatausfällung in HIT-T15-Zellen (ATCC), βTC3- (bereitgestellt von D. Hanahan (21)), PC12-, COS- und HeLa-Zellen transfiziert. Die Luciferasewerte wurden auf einem Monolight-Luminometer quantifiziert und auf die CAT-Aktivität eines gleichzeitig transfizierten internen RSV-CAT-Kontrollplasmids normalisiert.
Beispiel 7
Für elektrophoretische Mobilitätsverschiebungstests wurden Oligonukleotidsonden mit α³²p-dCTP durch Einfüllreaktion mittels eines Klenow-Fragmentes markiert. 4 μg des Kernextraktes wurden mit 0,5 ng des ³²p-markierten Doppelstrang-Oligonukleotids inkubiert und, wie zuvor beschrieben, einer nicht denaturierenden Polyacrylamid-Elektrophorese unterzogen (9). Für die Supershift-Analyse wurden die Proteine vorab mit dem Antikörper und anschließend mit einem radioaktiven Doppelstrang-Oligonukleotid inkubiert und einer Elektrophorese unterzogen. Die DNase-Schutztests wurden wie zuvor beschrieben durchgeführt (22).
Die Figuren für die DNA-Bindungstests wurden mit Hilfe eines HP ScanJet 3C von Originalphotos eingescannt und mit Canvas-Software auf einem Macintosh zusammengesetzt. Die gescannten Bilder wurde auf einem Tektronix Phaser II SDX reproduziert.
Beispiel 8
Mit Hilfe der STF-1-cDNA als Hybridisierungssonde auf einem Backcross-DNA-Panel von Jackson Laboratories wurde das Einkopie-STF-1-Gen einem Mapping bezüglich der distalen Region des Mäusechromosoms 5 unterzogen (1A). An den distalen Markern Pmv12 und Iapls3–9 wurden keine Rekombinanten gefunden, am distaleren Actb-Locus dagegen sechs (1B). Diese Ergebnisse sagen voraus, dass das STF-1-Gen dementsprechend auf dem Rattenchromosom 14 und dem menschlichen Chromosom 7q zu finden ist, Genorten, die keinem der vier homöotischen HOX-Cluster entsprechen. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass STF-1 als „Orphan"-Homöobox-Gen klassifiziert werden sollte.
Um das STF-1 codierende Gen zu isolieren, wurden 106 Bakteriophagenklone aus einer Ratten-EMBL-3-Genombobliothek mit einer ³²p-markierten STF-1-cDNA-Sonde untersucht; man erhielt zwei positive Klone, die jeweils ein Genominsert von 15 kb enthielten. Zusätzlich zu den 6,5 kb der -5'-Flankensequenz und den 3,5 kb der 3'-Flankensequenz enthielt das 15 kb-STF-1-Genomfragment die gesamte STF-1-Codierregion, die von einem unmittelbar oberhalb (Ala 135) der Homöobox-Codiersequenz (Aminosäure 140–215) eingefügten einzelnen 4 kb-Intron unterbrochen wurde (2A).
Eine Konsens-TATA-Box und Initiatorsequenzen in der 5'-Flankenregion des STF-1-Genomklons (2B) waren nicht vorhanden. Als Nächstes wurden die Transskriptionsinitiationsstellen bei diesem Gen einem Mapping unterzogen. Mit Hilfe des RNase-Schutzes und der Primerextensionsanalyse von mRNA aus den insulinerzeugenden Zelllinien RIN und Tu6 (2C und 2D) wurden drei Hauptinitiationsstellen namens S1, S2 und S3 identifiziert, die sich 91, 107 bzw. 120/125 Nukleotide oberhalb der Translationsstartstelle befanden. Eine vierte kleine Transskriptionsinitiationsstelle 137 Nukleotide oberhalb der Translationsstartstelle wurde ebenfalls beobachtet. Wie andere Promotoren ohne TATA enthält der STF-1-Promotor G/A- und G/C-reiche Sequenzen 30 Basenpaare oberhalb der S1- und S2-Startstellen (23–25).
Beispiel 9
STF-1-Promotoraktivität in Pankreasinselzellen
Um zu bestimmen, ob die Sequenzen in der 5'-Flankenregion des STF-1-Gens ausreichen, um die Expression von STF-1 auf Pankreasinselzellen zu richten, wurden 6500 Basenpaare der 5'-Flanken-STF-1-Sequenz mit dem β-Galactosidasegen fusioniert und die Expression dieses STF-1-lacZ-Reporters in transgenen Mäusen untersucht. Mit Hilfe von X-gal als chromogenem Substrat wurde die β-Galactosidaseaktivität in Pankreasinseln der transgenen Mäuse, nicht aber der Kontrollmäuse aus drei unabhängigen Gründerlinien nachgewiesen (3A).
Bei Beibehaltung des zuvor beschriebenen Expressionsmusters für das endogene STF-1-Protein wurde keine signifikante β-Galactosidaseaktivität in exokrinen azinösen Zellen (3B) oder Nicht-Pankreasgeweben wie Leber und Milz transgener Mäuse nachgewiesen (nicht dargestellt). Bei Beibehaltung der berichteten Expression des endogenen STF-1-Gens im Duodenum (8, 13) zeigten in situ-Hybridisierungsstudien mit einer Antisense-β-Galactosidase-RNA-Sonde ebenfalls eine transgene Expression in Epithelzellen des Duodenums transgenen Tiere (nicht dargestellt). Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass 6500 Basenpaare des STF-1-Promotors in der Tat ausreichen, um die Expression von STF-1 auf Pankreasinselzellen und Duodenumzellen zu richten.
Zur Definition funktioneller Elemente, die die STF-1-Expression auf Pankreasinselzellen richten, wurde die Aktivität des (–6500)-STF-Luc-Reporters in zwei bestimmten Pankreasinselzelllinien (βTC3, HIT) untersucht. Wie von den Ergebnissen bei transgenen Mäusen vorausgesagt, wies der STF-1-Reporter im Vergleich zu Nicht-Inselzelllinien wie HeLa, PC12 und COS eine um das 20- bis 100-fach stärkere Aktivität in diesen Inselzellen auf (4A). Im Gegensatz dazu wiesen das 4 kb-Intron und die 3 kb-3'-Flankenregion des STF-1-Gens beim Einsetzen in ein minimales SV40-CAT-Promotorplasmid (nicht dargestellt) keine solche Aktivität auf, was darauf schließen lässt, dass das 6,5 kb-STF-1-Promotorfragment speziell für die gezielte Expression von STF-1 in Inselzellen verantwortlich ist.
Um Sequenzen in dem STF-1-Promotor zu entwerfen, die eine Inselzellexpression bewirken, wurde eine Reihe von 5'-Deletionskonstrukten erzeugt; diese Reporter wurden durch Transfektion in HIT-Zellen analysiert (4B). Die Deletion der Sequenzen von –6500 bis –3500 bp des (–6500)-STF-Reporterkonstruktes reduzierte die STF-1-Reporteraktivität um das 4-fache, was für die Gegenwart einer distalen Aktivierungssequenz in dieser Region spricht. Eine weitere Reduktion des STF-1-Promotors von –3500 bp bis –190 bp beeinträchtigte die Reporteraktivität in HIT-Zellen nicht signifikant (4B). Die Deletion der STF-1-Promotorsequenzen von –190 bis –95 bp schwächte die Reporteraktivität in HIT-Zellen stark, was darauf deutet, dass ein proximales Element für die STF-1-Promotorfunktion ebenfalls notwendig ist. Die Untersuchung der Sequenz in der Region –190 bis –95 des STF-1-Promotors zeigte drei Konsens-E-Boxmotive (2A). Zwar reduzierte die Entfernung von zwei Tandem-E-Boxen bei –177 die Promotoraktivität nicht, doch die Deletion der proximalen E-Box-Sequenz bei –104 (–95 STF luc) brachte die STF-1-Expression in HIT-Zellen vollständig zum Erliegen.
Beispiel 10
Eine proximale E-Box im STF-1-Promotor erkennt einen USF-haltigen Komplex
Zur Charakterisierung vorgeschalteter Faktoren, die sich an funktionelle Elemente in dem STF-1-Promotor binden, wurden DNase I-Schutztests unter Verwendung von Kernextrakten aus HIT- und HeLa-Zellen durchgeführt (5A). In beiden Extrakten wurde eine vorherrschende Footprint-Aktivität beobachtet, deren Grenzen mit dem funktionell wichtigen proximalen E-Box-Motiv übereinstimmten (–188/–95). Zur weiteren Charakterisierung der Proteine, die sich an das wichtige E-Boxmotiv bei –104 in HIT-versus HeLa-Extrakten binden, wurden Gelmobilititätsverschiebungstests durchgeführt. Mit Hilfe eines sich von –118 bis –95 erstreckenden Doppelstrang-STF-1-Oligonukleotids wurden bei beiden Kernextrakten drei Komplexe (C1, C2 und C3) beobachtet (5B, rechte Tafel, Bahnen 1 und 4). Die Bildung von C1-, C2- und C3-Komplexen wurde durch einen 50-fachen Überschuss an nicht markiertem STF-1-E-Box-Konkurrenz-Oligonukleotid in Bindungsreaktionen gehemmt. Mutanten-E-Box-Oligonukleotid bzw. nicht-spezifische Konkurrenz-DNA hatten keine Wirkung auf diese Bindungsaktivitäten, zeigten aber, dass C1, C2 und C3 in der Tat für die STF-1-E-Box-Sequenz spezifisch sind (5B). Es wurde kein qualitativer Unterschied bezüglich des Musters dieser Komplexe zwischen HeLa- und HIT-Extrakten nachgewiesen (nicht dargestellt), was darauf hinweist, dass das E-Boxmotiv bei –140 Faktoren, die in beiden Zelltypen vergleichbar exprimiert werden, erkennen könnte.
Frühere Berichte zeigten, dass sich E-Boxen wie das (–118/–95)-STF-1-Motiv (CACGTG) vorzugsweise an bHLH-ZIP-Proteine wie myc, max, TFE-3, TFE-B und USF binden. Es wurde bestimmt, ob eines dieser Kandidatenproteine in den C1-, C2- oder C3-Komplexen (26, 27) enthalten war. Die Fähigkeit des (–118/–95)-E-Box-Bindungsproteins, der Wärmedenaturierung zu widerstehen (nicht dargestellt), führte zur Untersuchung dessen, ob USF, ein wärmestabiler vorgeschalteter Faktor, eine Komponente von C1, C2 oder C3 ist (28). Bemerkenswerterweise hemmte die Zugabe eines Anti-USF-Antiserums zu den Gelmobilitätsverschiebungsreaktionen die Bildung aller drei Komplexe (5C). Das Anti-TFE-3-Antiserum hatte jedoch keine Wirkung auf die Komplexe C1, C2 oder C3, was darauf deutet, dass diese Komplexe höchstwahrscheinlich durch USF-Proteine gebildet werden. Bei Gelverschiebungstests erzeugte rekombinanter USF-1 einen Protein-DNA-Komplex, der an dieselbe relative Position wie Komplex C2 wanderte (nicht dargestellt). In DNase I-Schutzstudien stimmte die Footprint-Aktivität des rekombinanten USF-1 mit der bei HIT-Extrakten beobachteten überein (5A).
Zwei Formen des USF (USF-1 und USF-2) scheinen in den meisten Zelltypen exprimiert zu werden (18). Um zu unterscheiden, welches dieser USF-Proteine in den C1-, C2- und C3-Komplexen enthalten war, wurde ein HIT- bzw. HeLa-Extrakt mit entweder Anti-USF-1-spezifischem oder Anti-USF-2-spezifischem Antiserum inkubiert (5D). Zwar führte das USF-1-Antiserum zu einem „Supershift" aller drei Komplexe, doch das USF-2-spezifische Antiserum hemmte nur die Bildung der C1- und C3-Komplexe. Diese Ergebnisse lassen den Schluss zu, dass die Komplexe C1 und C3 den USF-1/USF-2-Heterodimeren entsprechen, wohingegen C2 ein USF-1-Homodimer enthalten könnte.
Um zu verifizieren, ob die CACGTG-E-Box-Sequenz für die STF-1-Promotoraktivität wichtig ist, wurde ein Mutanten-STF-1-Oligonukleotid konstruiert, bei dem zwei Basenpaare der E-Box substituiert sind (–118/–95). Bei Gelmobilitätsverschiebungstests mit HIT-Kernextrakten konnte dieses Mutanten-E-Boxmotiv (AACGTG) keine C1-, C2- und C3-Komplexe bilden und nicht mit dem Wildtyp-E-Box-Oligonukleotid um die Bindung an USF-1 konkurrieren. Dementsprechend waren die das Mutanten-STF-E-Motiv enthaltenden Reporterplasmide (Volllänge: 6,5 kb-STF-1; reduziert: (–190)-STF) in Pankreasinselzellen um fast das 10-fache aktiver als der Wildtyp (6B). Diese Ergebnisse belegen, dass die proximale E-Box, die sich an USF bindet, in der Tat für die STF-1-Promotoraktivität ausschlaggebend ist.
Daher scheinen zwei Elemente in den ersten 6500 Basenpaaren der STF-1-5'-Sequenz für die inselspezifische Expression wichtig zu sein: ein distales Elemente zwischen –6500 und –3500 und ein proximales Element bei –104. Das proximale –104-Element besteht aus einem Konsens-E-Box-Motiv, das den vorgeschalteten Aktivator USF erkennt. Verschiedene Beweislinien deuten darauf hin, dass USF für die STF-1-Promotoraktivität wichtig ist. Erstens erkennen sowohl USF-1/2 nicht unterscheidende Antikörper als auch USF-1- und USF-2-spezifische Antikörper die für die STF-1-E-Box spezifischen Komplexe. Zweitens erinnern manche Eigenschaften der STF-1-E-Box-Bindungsaktivität in HIT-Kernextrakten an USF: die Komplexe sind wärmestabil und weisen eine ähnliche Halbwertszeit wie rekombinanter USF-1 auf. Schließlich schwächen Punktmutationen, die die Bildung von USF-Komplexen auf der STF-E-Box hemmen, die STF-1-Reporteraktivität dementsprechend. Diese Ergebnisse lassen den Schluss zu, dass USF-Komplexe in der Tat für die STF-1-Promoteraktivität und folglich die Pankreasorganogenese wichtig sind.
Andere Kernfaktoren zusätzlich zu USF, vor allem myc und max, können sich ebenfalls mit hoher Affinität an das STF-1-E-Boxmotiv (CACGTG) binden. Es hat sich gezeigt, dass myc die Zielgentransskription durch Bindung an E-Box-Motive als Heterodimer mit max stimuliert (32, 33). Da die myc-Genexpression typischerweise in postmitotischen Zellen wie denen in Pankreasinseln nicht nachweisbar ist, können myc-max-Komplexe hier nicht an der STF-1-Promotorregulierung beteiligt sein. Während der Entwicklung scheint die STF-1-Expression jedoch auf die Proliferation duktaler Zellen konzentriert zu sein (6); myc kann demzufolge die STF-1-Expression unter solchen Bedingungen stimulieren. Diesbezüglich spiegeln die tiefgreifenden Veränderungen der STF-1-Expression, die während der Entwicklung des Pankreas beobachtet werden, unter Umständen teilweise Veränderungen der E-Box-Bindungsaktivitäten wider, die letztlich die STF-1-Produktion auf Pankreasinselzellen beschränken.
Beispiel 11
Gelverschiebungstests und DNase I-Schutztests
Für elektrophoretische Mobilitätsverschiebungstests wurden Doppelstrang-Oligonukleotide mit Hilfe einer ³²PdCTP-Einfüllreaktion mit Klenow-Fragment markiert. 5 Mikrogramm des Kernextrakts wurden mit 0,5 ng des markierten Oligonukleotids und 1 μg der nicht-spezifischen Konkurrenz-DNA 30 Minuten lang auf Eis inkubiert und einer nicht-denaturierenden Polyacrylamid-Elektrophorese unterzogen. Für Supershift-Tests wurden Kernextrakte vorab mit Antiserum 30 Minuten bis eine Stunde lang auf Eis inkubiert und anschließend mit der markierten Sonde versetzt. Die Anti-HNF-3α-, HNF-3β- und HNF-3γ-Antikörper wurden freundlicherweise von S. Duncan und J. Darnell bereitgestellt. Der Anti-BETA-2-Antikörper war ein großzügiges Geschenk von M. J. Tsai. Der Anti-E2A-Antikörper wurde von Santa Cruz Biochemicals bezogen. Die DNase I-Schutztests wurden wie zuvor beschrieben durchgeführt (37). Das rekombinante HNF-3α war ein Geschenk von K. Zaret.
Beispiel 12
Northern Blotting
Somatostatinom/Insulinom-Tu6-Zellen wurden unterschiedlich lang in Ethanol bzw. 10^–7 Dexamethason gezüchtet. Die Gesamt-RNA wurde nach einem Guanidinium-Phenol-Verfahren extrahiert. 15 Mikrogramm der Gesamt-RNA ließ man auf Formaldehyd enthaltenden Agarosegelen laufen und übertrug sie auf eine Zeta-Sonde. Mit Hilfe des Random-Priming-Kits von Amersham wurde nach dem Zufallsprinzip geprimte STF-1- und Tubulin-cDNA erzeugt.
Beispiel 13
Die endodermalen Faktoren HNF-3β und BETA-2 regulieren die STF-1-Expression mittels eines inselspezifischen Verstärkers
Sich von –6200 bis –5670 des STF-1-Gens erstreckende, ein 530 bp-Fragment enthaltende Promotorkonstrukte wurden durch Dexamethasonbehandlung vollständig unterdrückt, doch bei einem die allgegenwärtige USF-1-Erkennungsstelle enthaltenden minimalen STF-1-Promotoxkonstrukt war dies nicht der Fall (7a). Dieselbe 530 bp-Region des STF-1-Gens war in HIT-T15-Zellen etwa 5- bis 10-fach so aktiv wie in COS-7-Zellen, was belegt, dass dieses Fragment eine inselzell-spezifische Aktivität enthält (7b). Die Untersuchung der Nukleotidsequenz in dem zellspezifischen STF-1-Verstärker zeigte Konsensmotive für E-Box-Bindungsproteine (–5,98 bis –5,963) und HNF-3 (–5,927 bis –5,907) (7c). Die Sequenzen des E-Box-Motivs, des sogenannten B-Elements, sind mit denen der NIR- und FAR-Elemente in den Insulin I- und II-Promotoren von Ratten identisch (34). Die HNF-3-Stelle, das sogenannte H-Element, stimmt mit der HNF-3-Konsensbindungsstelle an 9 von 12 Positionen überein.
Um zu bestimmen, ob die B- und H-Elemente tatsächlich durch inselspezifische Kernproteine erkannt werden, führten wir DNase I-Schutztests unter Verwendung eines sich von –5870 bis –6100 erstreckenden ³²p-markierten STF-1-Verstärkerfragments durch. Es stellte sich heraus, dass aus HIT-T15-Zellen hergestellte Kernextrakte DNA-Bindungsaktivitäten über der B-Stelle (E-Box-Motiv) und der H-Stelle (HNF-3-Motiv) enthalten (8a, vergleiche Bahnen 1 und 2). Das B-Element wurde in den DNase I-Schutztests mit Kernextrakten aus HIT-, HeLa- und COS-7-Zellen vergleichsweise geschützt, wohingegen der Schutz des H-Elementes nur bei Extrakten aus HIT-Zellen beobachtet wurde (8a, vergleiche Bahnen 2 und 4). Eine herausragende hypersensible Stelle, die den H-Element-Footprint unterbrach, wurde bei gereinigtes rekombinantes HNF-3α-Protein enthaltenden Reaktionen ebenfalls bemerkt, was uns zu der Vermutung bewog, dass sich ein Mitglied der HNF-3-Regulatorfamilie an das STF-1-H-Element in HIT-T15-Zellen bindet (8a, vergleiche Bahnen 2 und 5).
Zur weiteren Charakterisierung der Kernfaktoren, die das H-Element auf dem STF-1-Verstärker erkennen, führten wird Gelmobilitätsverschiebungstests mit Hilfe einer ³²p-markierten STF-1-H-Element-Sonde durch. Einer der Hauptkomplexe geringer Mobilität wurde bei Reaktionen beobachtet, die HIT- oder RIN-Kernextrakte enthielten; die Bildung dieses Komplexes wurde durch Zugabe des 100-fachen molaren Überschusses des nicht markierten Wildtyps, nicht aber der Mutanten-H-Element-Konkurrenz-DNA speziell gehemmt (8b, vergleiche Bahnen 4–5, 9–10, 14–15). In Reaktionen, die HeLa-Kernextrakte enthielten, wurden keine spezifischen Protein-DNA-Komplexe beobachtet, was darauf deutet, dass das H-Element Kernfaktoren mit eingeschränktem Expressionsmuster erkennen könnte (8b, vergleiche Bahnen 1, 6). Die Gegenwart eines H-Element-spezifischen Komplexes in HepG2-Hepatomextrakten derselben Mobilität wie der RIN/HIT-T15-Komplex deutete jedoch darauf hin, dass das H-Element-Bindungsprotein wohl im Allgemeinen in Zellen endodermalen Ursprungs exprimiert wird (8b, vergleiche Bahnen 3–5).
Die HNF-3-Familie der Kernaktivatoren besteht aus drei Genen (α, β und γ), die sich mittels einer stark erhalten gebliebenen „winged helix"-Domäne an DNA binden. Um zu bestimmen, ob die H-Element-Bindungsaktivität in HIT-Extrakten der eines Mitglieds der HNF-3-Familie entspricht, führten wir Gelmobilitätsverschiebungsstudien mit spezifischen Antiseren gegen die einzelnen HNF-3-Mitglieder durch. Zwar wurden alle drei HNF-3-Proteine in Kernextrakten von HIT-T15-Insulinomzellen durch Western Blotting-Analyse nachgewiesen (nicht dargestellt), doch es stellte sich heraus, dass bei Verwendung desselben Extrakts mit einer H-Element-Sonde nur das HNF-3β-Antiserum die Bildung des Hauptprotein-DNA-Komplexes blockiert (8c, Bahnen 1–4). Identische Ergebnisse wurden bei Gelverschiebungstests von Kernextrakten erzielt, die aus Primärkulturen adulter Ratteninselzellen hergestellt worden waren (8c, Bahnen 5–8).
Das B-Element in dem STF-1-Verstärker enthält ein Konsens-E-Box-Motiv, das mit den E-Box-Elementen in dem Insulinpromotor identisch ist. Frühere Arbeiten, die belegen, dass der inselspezifische Faktor BETA-2 die Insulinpromotoraktivität durch Bindung an diese Insulinpromotorelemente als Heterodimer mit dem allgegenwärtigen Faktor E47 aktiviert, führten dazu, dass wir die BETA-2/E47-Heterodimerbildung auf dem STF-1-B-Element überprüften. Bei Gelmobilitätsverschiebungstests von HIT-Kernextrakten wurde beobachtet, dass eine ³²p-markierte B-Element-Sonde vier spezifische DNA-Proteinkomplexe bildet, die bei Zugabe des nicht markierten Wildtyps, nicht aber von Mutanten-B-Element-Oligonukleotiden miteinander in Konkurrenz treten können (8d, vergleiche Bahnen 1, 5, 6). Der langsamste Komplex wanderte an dieselbe Position wie der rekombinante E2A/BETA-2-Heterodimerkomplex (8d, vergleiche Bahnen 1 und 7). Zwar hatte ein nicht verwandtes Antiserum keine Wirkung auf die B-Element-Bindungsaktivitäten (8d, Bahn 4), doch BETA-2- bzw. E2A-Antiseren hemmten speziell die Bildung des langsamsten Komplexes (8d, Bahnen 2 und 3), was zeigt, dass das BETA-2/E47-Heterodimer das B-Element in HIT-Kernextrakten tatsächlich erkennt.
Um die Bedeutung der HNF-3β- und E2A/BETA-2-Erkennungsstellen bei der Vermittlung der STF-1-Verstärkeraktivität zu bewerten, erzeugten wir in den B- und H-Elementen Punktmutationen, die die Bindung dieser Erkennungsfaktoren in vitro zerstören. Bei Tests im Zusammenhang mit dem 530 bp-Verstärker waren die Mutationen im B- oder H-Element enthaltenden STF-1-Reporterplasmide in HIT-T15-Zellen im Vergleich zu dem Wildtypkonstrukt wesentlich weniger aktiv (9a). Im Gegensatz dazu waren die Mutanten-B- und H-Elementkonstrukte in COS-7-Zellen genauso aktiv wie der Wildtyp (–6500)-STF-1-Reporter; allerdings zeigt dies, dass solche Mutationen speziell mit Inselzellen in Zusammenhang stehende Transskriptionsaktivitäten unterbrechen. Dementsprechend reagierten B- und H-Element-Mutanten-STF-1-Reporterplasmide auch nicht auf eine Dexamethasoninduktion von HIT-T15-Zellen, was zeigt, dass dieses Hormon E2A/BETA-2- bzw. HNF-3β-Aktivitäten speziell stören kann (9b).
Um zu bewerten, ob Dexamethason die STF-1-Expression durch Unterbrechung der HNF-3β- bzw. BETA-2/E47-Aktivität auf dem distalen Verstärker hemmt, wurden Kurztransfektionstests mit HNF-3β- bzw. BETA-2- und E47-Effektorplasmiden durchgeführt. Eine Überexpression von HNF-3β (9b) oder BETA-2/E47 (nicht dargestellt) hatte nur eine minimale Wirkung auf die STF-1-Reporterexpression in nicht stimulierten HIT-T15-Zellen (9c, vergleiche Balken 1 und 5). Es stellte sich heraus, dass HNF-3β die hemmende Wirkung von Dexamethason auf die Wildtyp-STF-1-Reporteraktivität unterdrückt (9b, vergleiche Balken 1, 3, 7), Aktivatoren wie BETA-2/E47, STF-1 und HNF-4 die STF-1-Promotoraktivität in mit Dexamethason behandelten Zellen jedoch nicht retteten (nicht dargestellt). In Titrationsexperimenten mit steigenden Effektorplasmidmengen stellte sich heraus, dass HNF-3β die (–6500)-STF-1-Luc-Reporteraktivität dosisabhängig rettet (9c). HNF-3β potenzierte die Aktivität des eine Mutation im H-Element enthaltenden Mutanten-STF-1-Reporterplasmids jedoch nicht, was den Schluss zulässt, dass die suppressive Wirkung dieses Aktivators aufgrund seiner Erkennungsstelle in dem STF-1-Verstärkers auftritt (9b, vergleiche Balken 2, 4, G, 8).
Die folgenden Literaturstellen wurden hierin zitiert.

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SEQUENZLISTE

Claims

Verfahren zur Bestimmung der Fähigkeit einer Prüfverbindung, Pankreasinselzellen zum Induzieren von STF-1-Transkription zu stimulieren, das folgende Schritte umfasst: Bereitstellen eines Transportsystems, das einen STF-1-Verstärker mit einer Sequenz enthält, die aus der Gruppe SEQ ID Nr. 1 oder SEQ ID Nr. 2 oder Fragmenten davon ausgewählt ist, einen Promotor, und ein Reporter-Gen, das unter der Transkriptionssteuerung sowohl des STF-1-Verstärkers als auch des Promotors steht, wobei das Reporter-Gen in der Lage ist, ein erfassbares Signal auf die Wirtszelle zu übertragen; das Transportsystem in die Wirtszelle zu transferieren; eine Kultur der Wirtszelle im Beisein einer Prüfverbindung anzulegen, um eine Fähigkeit der Prüfsubstanz zu bestimmen, die Wirtszelle dazu zu stimulieren, das Signal zu erzeugen; und das Signal zu überprüfen, um die Fähigkeit der Prüfverbindung, die Wirtszelle zum Erzeugen des erfassbaren Signals zu stimulieren, zu bestimmen, wobei ein Vorhandensein des Signals anzeigt, dass die Prüfverbindung Pankreasinselzellen dazu stimuliert, STF-1-Transkription zu induzieren, und wobei ein Nichtvorhandensein des Signals anzeigt, dass die Prüfverbindung Pankreasinselzellen nicht dazu stimuliert, STF-1-Transkription zu induzieren.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Reporter-Gen ein Enzym ist.
Verfahren nach Anspruch 2, wobei das Enzym aus der Gruppe Luciferase und β-Galactosidase ausgewählt ist.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei der Schritt des Transferierens durch Transfektion erfolgt.
Verfahren nach Anspruch 4, wobei die Pankreasinselzellen HIT-Zellen sind.
Verfahren zum Markieren insulinproduzierender Pankreasinselzellen in vivo, das folgende Schritte umfasst: Bereitstellen eines Transportsystems, das einen STF-1-Promotor umfasst, der operativ mit einem Reporter-Gen verbunden ist, wobei die Expression des Reporter-Gens auf eine Pankreasinselzelle ein erfassbares Signal überträgt; Einbringen des Transportsystem als Transgen in einen Schweine- oder Mäuseembryo; Heranwachsenlassen des Embryos zu einem Schwein oder einer Maus mit Pankreasinselzellen; und Überprüfen des erfassbaren Signals, um zu bestimmen, ob irgendwelche der Pankreasinselzellen des Schweins oder der Maus das Reporter-Gen exprimieren, wobei ein Vorhandensein des erfassbaren Signals das Vorhandensein insulinproduzierender Pankreasinselzellen anzeigt, und wobei das Nichtvorhandensein des erfassbaren Signals ein Nichtvorhandensein insulinproduzierender Pankreasinselzellen anzeigt.
Verfahren nach Anspruch 6, wobei das Reporter-Gen ein fluoreszierendes Protein erzeugt.
Verfahren nach Anspruch 7, wobei das Verfahren darüber hinaus einen Schritt des Trennens insulinproduzierender Pankreasinselzellen von nicht insulinproduzierenden Pankreasinselzellen durch fluoreszenzaktivierte Zelltrennung (FACS – fluorescence activated cell sorting) umfasst.