DE69534733T2 - NEUARTIGE AUF p53 ANSPRECHENDE GENE - Google Patents

NEUARTIGE AUF p53 ANSPRECHENDE GENE Download PDF

Info

Publication number
DE69534733T2
DE69534733T2 DE69534733T DE69534733T DE69534733T2 DE 69534733 T2 DE69534733 T2 DE 69534733T2 DE 69534733 T DE69534733 T DE 69534733T DE 69534733 T DE69534733 T DE 69534733T DE 69534733 T2 DE69534733 T2 DE 69534733T2
Authority
DE
Germany
Prior art keywords
sequence
dna
pigi
nucleic acid
expression
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Expired - Lifetime
Application number
DE69534733T
Other languages
English (en)
Other versions
DE69534733D1 (de
Inventor
Leonard Doylestown BUCKBINDER
Randy Freehold TALBOTT
Bernd R. Stockton SEIZINGER
Nikolai Princeton Junction KLEY
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Bristol Myers Squibb Co
Original Assignee
Bristol Myers Squibb Co
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Bristol Myers Squibb Co filed Critical Bristol Myers Squibb Co
Application granted granted Critical
Publication of DE69534733D1 publication Critical patent/DE69534733D1/de
Publication of DE69534733T2 publication Critical patent/DE69534733T2/de
Anticipated expiration legal-status Critical
Expired - Lifetime legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • C07K14/4701—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals not used
    • C07K14/4746—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals not used p53
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • C07K14/4701—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals not used
    • C07K14/4702—Regulators; Modulating activity
    • C07K14/4703—Inhibitors; Suppressors
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Saccharide Compounds (AREA)

Description

  • Gebiet der Erfindung
  • Die vorliegende Erfindung betrifft neuartige, auf p53 ansprechende Gene, diese Gene umfassende Expressionsvektoren, die Expressionsvektoren umfassende Wirtszellen, durch die Gene hergestellte Proteine, Verfahren zur Herstellung der Proteine und Verfahren zur Verwendung der Gene und Protein.
  • Hintergrund der Erfindung
  • Die Inaktivierung oder der Verlust von p53 stellt ein häufiges Ereignis dar, das mit der Entwicklung von Krebs beim Menschen in Zusammenhang steht. Eine funktionale Inaktivierung kann als Folge genetischer Abweichungen innerhalb des p53-Gens auftreten, wobei Missense-Mutationen am häufigsten sind, oder durch Wechselwirkung mit viralen und zellulären Onkogenen [Übersichtsartikel hierzu: Levine, A. J. et al., Nature 351, 453–455 (1991), Vogelstein, B. und Kinzler, K. W., Cell 70, 523–526 (1992), Zambetti, G. und Levine, A. J. FASEB J. 7, 855–865 (1993), Harris, C. C., Science 262, 1980–1981 (1993)]. Der Verlust der Wildtyp (wt)-Funktionen von p53 führt zu einem unkontrollierten Zellzyklus und unkontrollierter Zellreplikation, ineffizienter DNA-Reparatur, einem selektiven Wachstumsvorteil und folglich zur Tumorbildung [Levine, A. J. et al., Nature 351, 453–455 (1991), Vogelstein, B. und Kinzler, K. W., Cell 70, 523–526 (1992), Zambetti, G. und Levine, A. J. FASEB J. 7, 855–865 (1993), Harris, C. C., Science 262, 1980–1981 (1993); Lane, D. P. Nature 358, 15–16 (1992), Livingstone, L. R. et al., Cell 70, 923–935 (1992)]. Durch den Erwerb neuer Funktionen, die mit vielen mutierten Formen von p53 einhergehen, kann die Tumorgenese sogar weiter verstärkt werden [Chen, P. -L. et al., Science 250, 1576–1580 (1990); Dittmer, D. et al., Nature Genetics 4, 4142–4145 (1993); Sun, Y. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, 2827–2831 (1993)], wodurch eine mögliche Grundlage für deren starke Selektion in menschlichen Tumoren gegeben ist.
  • Der Mechanismus (die Mechanismen), der (die) der durch p53 vermittelten Wachstumsunterdrückung zu Grunde liegen, ist (sind) noch unzureichend definiert. Von besonderem Interesse ist jedoch die Fähigkeit von p53, als Transkriptionsfaktor zu wirken, eine Funktion, die stark mit dessen Fähigkeit korreliert, als Tumorsupressor zu wirken. Es wurde gezeigt, dass p53 eine Vielzahl von Promotoren unterdrückt, die TATA-Elemente enthalten [z.B. Ginsberg, D. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88, 9979–9983 (1993), Santhanam, U. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88, 7605–7609 (1993), Kley, N. et al., Nucleic Acids Res. 20, 4083–4087 (1992), Mack, D. H. et al., Nature 363, 281–283 (1993)]. Diese Unterdrückung ist sequenzunabhängig und kann die Bindung von p53 an Bestandteile der grundlegenden Transkriptionsmaschinerie, beispielsweise das TATA-Bindungsprotein, beinhalten [z.B. Seto, E. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89, 12028–12032 (1992), Truant, R. et al., J. Biol. Chem. 268, 2284–2287 (1993), Liu, X. et al., Mol. Cell. Biol. 13, 3291–3300 (1993)]. Im Gegensatz dazu ist die Transaktivierung durch p53 sequenzabhängig und korreliert mit dessen Bindung an spezifische DNA-Sequenzen wie beispielsweise die Consensus-Bindungsstelle, über die kürzlich berichtet wurde [EI-Deiry, W. S. et al., Nature Genetics 1, 45–49 (1992), Funk, W. D. et al., Mol. Cell. Biol. 12, 2866–2871 (1992)]. p53 kann effizient sowohl in vivo als auch in vitro die Transkription von Promotoren aktivieren, die solche Stellen aufweisen [z.B. Kley, N. et al., Nucleic Acids Res. 20, 4083–4087 (1992), Seto E. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89, 12028–12032 (1992), Weintraub H. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88, 4570–4574 (1991), Kern S. E. et al., Science 256, 827–830 (1992), Farmer G. et al., Nature 358, 83–86 (1992), Zambetti, G. P. et al., Genes & Development 6, 1143–1152 (1992)]. Die meisten onkogenen Mutanten von p53 haben sowohl die Eigenschaften der Transkriptionsunterdrückung als auch die der sequenzspezifischen Transaktivierung verloren, die beim Wildtyp-p53 vorliegen.
  • Die starke Korrelation zwischen der Fähigkeit von p53 zur Aktivierung der Transkription in sequenzspezifischer Weise und dessen Fähigkeit zur Unterdrückung des Zellwachstums oder zur Induzierung von Apoptose [Vogelstein, B. und Kinzler, K. W. Cell 70, 523–526 (1992), Yonish-Rouach, E. et al., Nature 352, 345–347 (1991), Lowe, S. W. et al., Nature 362, 847–849 (1993), Clark, A. R. et al., Nature 362, 849–852 (1993), Shaw, P. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89, 4495–4499 (1992)] legt nahe, dass durch p53 induzierte Gene eine wichtige Rolle bei der Vermittlung der Funktion von p53 als Tumorsupressor spielen können. Einige wenige endogene Gene wurden als durch p53 induziert charakterisiert. Diese umfassen das mdm-2-Gen und dessen menschliches Homologes, das hdm-2-Gen [Wu, X. et al., Genes & Development 7, 1126–1132 (1993)], GADD45 [Kastan, M. B. et al., Cell 71, 587–597 (1992)], und die WAF1/CIP1/p21-Gene [EI-Deiry, W. S., et al., Cell 75, 817–825 (1993)]. Es wurde vorschlagen, dass hdm-2 als ein negativer Rückkopplungsregulator von p53 wirkt und in dieser Hinsicht als Onkogen fungieren würde [Wu, X. et al., Genes & Development 7, 1126–1132 (1993), Zambetti, G. und Levine, A. J., FASEB J. 7, 855–865 (1993)]. Dies passt zu dem Befund, dass die Amplizifierung des hdm-2-Gens mit Krebs beim Menschen einhergeht [Oliner, J. d. et al., Nature 358, 80–83 (1992)]. Bisher wurde sowohl von WAF1/CIP1/p21, einem Inhibitor Cyclin-abhängiger Kinasen [Harper, J. W. et al., Cell 75, 805–816 (1993), Xiong, Y. et al., Nature 366, 701–704 (1993)], als auch von gadd45 [Zhan, Q. et al., Mol. Biol. 14, 2361–2371 (1994)] gezeigt, dass sie das Wachstum von Tumorzellen in Kultur inhibieren [EI Deir, W. S. et al., Cell 75, 817–825 (1993)].
  • Partanen et al. (EMBO Journal, Bd. 10 Nr. 6 ff, 134, 1347–1354, 1991) beschreiben die abgeleitete Aminosäuresequenz von FGFR-4, einem Rezeptor für sauren Fibroblasten-Wachstumsfaktor (GenBank-Zugangs-Nr. X57205). Die WO 93/10230 beschreibt ein Verfahren zur Herstellung einer komplementären DNA (cDNA)-Bibliothek, die angereichert ist für Liganden-induzierbare Gene einer Zelle. Mit RNA, die von menschlichen IL-2R-positiven T- Zell-Blasts isoliert worden war, die mit entweder nur Cyclohexamid oder IL-2 oder mit einer Kombination der beiden Wirkstoffen stimuliert worden waren, wurde eine Northern Blot-Analyse durchgeführt. Auf der Grundlage der Induktionsmuster und der ungefähren Größen der RNA-Transkripte wurden 8 durch IL-2 induzierte Gene unterschieden. Einer dieser Klone mit der Bezeichnung 1A8 weist die als SEQ ID NO: 1 gezeigte Nukleotidsequenz auf Hong et al. (Journal of Immunology, Bd. 150, Seiten 3895–3904, 1993) beschreiben die Isolierung einer Reihe von cDNA-Klonen, die zwischen B- und T-Lymphozyten differenziell exprimiert werden. Eine der cDNAs wurde als BL34 bezeichnet. Northern-Blot-Analyse mit der BL34-cNDA zeigte ein 1,6 kb mRNA-Transkript, das in niedrigen Mengen in RNA vorhanden war, die aus ruhenden B-Lymphozyten extrahiert worden war, aber dessen Expression deutlich gesteigert war in RNA, die aus mitogen-aktivierten B-Zellen hergestellt worden war. Zwei BL34-cDNAs mit voller Länge wurden sequenziert und ein offener Leserahmen mit 588 bp identifiziert, der vorhersagegemäß ein Protein mit 196 Aminosäuren kodiert.
  • Zusammenfassung der Erfindung
  • Die vorliegende Erfindung beinhaltet die Isolierung eines durch p53 hochregulierten Gens.
  • Die vorliegende Erfindung betrifft ein isoliertes Polypeptidmolekül, umfassend
    • i) die in 7 [SEQ ID NO: 2] gezeigte Aminosäuresequenz des auf p53 ansprechenden Protein PIGI-1 (durch p53 induzierter Wachstumsinhibitor 1), oder
    • ii) eine Allelvariante der Sequenz, worin eine oder mehrere Aminosäuren deletiert, substituiert, Invertiert, invertiert oder hinzugefügt sind,
    wobei das die Allelvariante der Sequenz umfassende Polypeptid die wachstumshemmende Eigenschaft des auf p53 ansprechenden Proteins PIGI-1 hat.
  • Die vorliegende Erfindung betrifft weiterhin ein isoliertes Polypeptidmolekül, das die Sequenz der Aminosäuren 142–202 der in 7 gezeigten Aminosäurensequenz des auf p53 ansprechenden Proteins PIGI-1 umfasst.
  • Die vorliegende Erfindung betrifft weiterhin ein isoliertes Polypeptidmolekül, das erhältlich ist durch Expression einer Nukleinsäuresequenz, die ein erfindungsgemäßes Polypeptidmolekül kodiert.
  • Die vorliegende Erfindung betrifft weiterhin ein isoliertes Nukleinsäuremolekül, das ein erfindungsgemäßes Polypeptidmolekül kodiert. Das Nukleinsäuremolekül ist bevorzugt ein DNA (Desoxyribonukleinsäure)-Molekül, und die Nukleinsäuresequenz ist eine DNA-Sequenz.
  • Weiterhin bevorzugt ist eine DNA-Sequenz mit der in 6 [SEQ ID NO: 1] gezeigten Nukleotidsequenz oder der in 6 [SEQ ID NO: 1] gezeigten Sequenz der Nukleotide 416–2383.
  • Die vorliegende Erfindung betrifft weiterhin ein isoliertes Nukleinsäuremolekül, insbesondere ein DNA-Molekül, mit einer Nukleinsäuresequenz, die mit einer Nukleinsäuresequenz hybridisiert, die ein erfindungsgemäßes Polypeptidmolekül kodiert, wobei der Hybridisierungs-Waschpuffer 0,2 × SSPE, 0,1% SDS ist und die Hybridisierungstemperatur 65°C beträgt.
  • Die vorliegende Erfindung betrifft weiterhin ein Nukleinsäuremolekül mit einer Sequenz, die zu den oben genannten Nukleinsäuresequenzen komplementär ist.
  • Die vorliegende Erfindung betrifft weiterhin Expressionsvektoren, die eine DNA-Sequenz umfassen, welche ein Polypeptidmolekül wie oben angegeben kodiert. Gemäß einer Ausführungsform hat die das Polypeptid kodierende DNA-Sequenz die in 6 (SEQ ID NO: 1] gezeigte Nukleotidsequenz.
  • Gemäß einer weiteren Ausführungsform hat die DNA-Sequenz die in 6 [SEQ ID NO: 1] gezeigte Sequenz der Nukleotide 416–2383.
  • Die vorliegende Erfindung betrifft weiterhin prokaryotische oder eukaryotische Wirtszellen, die den Expressionsvektor wie oben angegeben umfassen.
  • Die vorliegende Erfindung betrifft weiterhin ein Verfahren zur Herstellung eines erfindungsgemäßen Polypeptidmoleküls, wobei man eine Wirtszelle wie oben angegeben unter Bedingungen kultiviert, welche eine Expression des Polypeptidmoleküls zulassen.
  • Die vorliegende Erfindung betrifft weiterhin eine pharmazeutische Zusammensetzung, die eine pharmazeutisch wirksame Menge eines erfindungsgemäßen Polypeptidmoleküls oder eines erfindungsgemäßen Nukleinsäuremoleküls oder eines erfindungsgemäßen Expressionsvektors umfasst, und die Verwendung eines erfindungsgemäßen Polypeptidmoleküls oder eines erfindungsgemäßen Nukleinsäuremoleküls oder eines erfindungsgemäßen Expressionsvektors zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung zur Behandlung von Tumoren und von Krebs. Weiterhin werden Verfahren zum Nachweis von Nukleinsäuresequenzen, die einen Teil oder das gesamte neuartige, auf p53 ansprechende Protein kodieren, das die in 7 [SEQ ID NO: 2] gezeigte Aminosäuresequenz aufweist, oder verwandter Nukleinsäuresequenzen beschrieben.
  • Kurze Beschreibung der Zeichnungen
  • 1
    • A. Für die tet-regulierte p53-Expression verwendete Plasmidkonstrukte. Das tet-Aktivator-Plasmid (pUHD 15-1 Neo) exprimiert konstitutiv tTa (siehe Text). Die p53-Mutanten V143A und N247I wurden in den auf tet ansprechenden Expressionsvektor pUHG10-3 kloniert, wodurch pTE9.5 bzw. pTE3.1 erzeugt wurden. Die Expression der klonierten p53-Gene wird durch tTa reguliert, welches bei Fehlen von Tetracyclinen an tOp bindet, und durch Zugabe von Tetracyclin unterdrückt.
    • B. Westernblot-Analyse der p53-Expression in Saos-2-A3- und -D4-Zellen. Saos-2-, Saos-2-D4- und -A3-Ausgangszellen wurden wie angegeben über Nacht mit (1 μg/ml) oder ohne Tetracyclin kultiviert. Am nächsten Tag wurden Kernextrakte hergestellt, 80 μg Protein auf einem SDS-Polyacrylamidgel (12%) aufgetrennt und p53 über Westernblot-Analyse unter Verwendung des monoklonalen Antikörpers DO1 (Oncogene Science, Uniondale, NY) nachgewiesen. Die Position des p53-Proteins mit voller Länge ist durch eine Pfeilspitze markiert. Die Position der Molekulargewichtsstandards ist rechts angegeben (in Kilodalton).
  • 2
    • A. Induktion von Luciferase durch Temperatur-revertierte mutierte p53-Proteine. Sao-2-A3B- und -D4H-Zellen, die in Tetracyclin enthaltenden Medien wuchsen, wurden 4× mit DMEM gewaschen und in Antibiotika-freien (• beziehungsweise Δ) oder Tetracyclin-enthaltenden Medien (o beziehungsweise Δ, 1 μg/ml) inkubiert. Nach 16 Stunden bei 37°C wurden die Zellen 30°C ausgesetzt (0 h Zeitpunkt). Zu den angegebenen Zeitpunkten (in Stunden) wurden Zellextrakte hergestellt und die Luciferase-Aktivität unter Verwendung gleicher Mengen von Zellextrakten bestimmt.
    • B. Induzierung der hdm-2-Genexpression in Saos-2-D4H-Zellen. Saos-2-D4H-Zellen wurden über Nacht mit (1 μg/ml) oder ohne Tetracyclin inkubiert und anschließend für den angegebenen Zeitraum (in Stunden) bei 30°C inkubiert, bevor sie geerntet wurden. Gesamt-RNA (10 μg) wurde über Northern Blots analysiert. Blot-Duplikate wurden mit einer 32P-markierten cDNA-Sonde für entweder hdm-2 oder β-Actin hybridisiert, und die Autoradiogramme der hydrisierten Blots sind gezeigt. Die Position der RNA-Molekulargewichtsmarker ist links angegeben.
  • 3
  • Angereichertes cDNA-Fragment W4.5 identifiziert ein p53-reguliertes Transkript.
  • Saos-2-D4H-Zellen wurden bei Fehlen oder in Gegenwart von Tetracylin (1 μg/ml) wie in 2B bei 30°C inkubiert. Ein Northern Blot (10 μg Gesamt-RNA/Spur) wurde mit einer 32P-markierten cDNA-Sonde hybridisiert, die dem Klon W4.5 entsprach. Ein Autoradiogramm des hybridisierten Blots ist gezeigt, wobei die Position des Molekulargewichtsmarkers links angegeben ist.
  • 4
  • Die Klone A28 und A26 identifizieren Transkripte, die durch die ts-Mutante p53V143A in Saos 2-D4H-Zellen reguliert ist.
  • Saos 2-D4H-Zellen wurden bei Fehlen von Tetracyclin bei 37°C kultiviert. Die Zellen wurden mit Vehikel (Wasser) oder Cycloheximid (10 μg/ml) 30 Minuten behandelt und anschließend weitere 7 Stunden bei 37 oder 30°C wie angegeben inkubiert. Unter Verwendung gleicher Mengen polyadenylierter RNA wurden Northern Blots hergestellt und nacheinander mit einer 32P-markierten cDNA-Sonde für A28 und A26 hybridisiert. Gezeigt sind Autoradiogramme, wobei die Position des RNA-Molekulargewichtsmarkers links angegeben ist.
  • 5
  • A28- und A26-Transkripte werden durch Wildtyp-p53 in EB1-Coloncarzinomzellen induziert.
  • Ausgangs-EB-Zellen und klonale EB1-Zellen (die das Wildtyp-p53 unter Kontrolle des Metallothioneinpromotors enthalten) wurden mit Vehikel (Wasser) oder CdCl2 (6 μM) 10 Stunden wie angegeben behandelt. Polyadenylierte RNA wurde isoliert und Northern Blots wurden in vierfacher Ausfertigung hergestellt. Die Blots wurden mit Sonden für die Klone A28, A26, W4.5 oder β-Actin hybridisiert. Gezeigt sind Autoradiogramme, wobei die Position der Molekulargewichtsmarker links angegeben ist.
  • 6
  • Nukleotidsequenz der cDNA, die auf p53 ansprechendes Protein PIGI-1 kodiert.
  • 7
  • Vorhergesagte Aminosäuresequenz des auf p53 ansprechenden Protein PIGI-1.
  • 8
  • Northern Blot-Analyse der Expression des auf p53 ansprechenden Proteins PIGI-1 in verschiedenen menschlichen Geweben.
  • Zur Herstellung von Northern Blots wurden 2,5 μg polyadenylierter RNA der angegebenen Gewebe erwachsener Menschen verwendet (Clonetech, Palo Alto, CA). Die Blots wurden mit einer 32P-markierten cDNA-Sonde hybridisiert, die dem cDNA-Fragment A28 entsprach, und durch Autoradiographie sichtbar gemacht. Die Position der RNA-Standards ist rechts in kb angegeben. Ein Transkript von etwa 2,5 kb wurde in allen Geweben nachgewiesen, wobei periphere Blutleukozyten (Spur 9) eine mögliche Ausnahme darstellen. Bei längerem Kontakt des Blots mit dem Film war eine Expression in Hoden erkennbar.
  • 9
  • Schematische Darstellung der Klonierungs- und Sequenzierungsstrategie für die A28-cDNA, welche auf p53 ansprechendes Protein PIGI-1 kodiert.
  • Menschliche Lungen- und Gehirn-cDNA-Bibliotheken wurden mit dem A28-cDNA-Fragment gescreent, das durch die Bibliothek-Substraktionsmethode identifiziert wurde. Der längste hybridisierende cDNA-Klon, der identifiziert wurde, A28-15B, hatte eine Länge von 1968 bp und stellte einen partiellen cDNA-Klon dar. Das 5'-Ende der cDNA wurde durch 5' RACE erhalten. Der Klon voller Länge (oder nahezu voller Länge) wurde unter Verwendung der einmal vorkommenden BglII-Schnittstelle bei nt-Position 416 zusammengebaut. Die cDNA wurde in beiden Richtungen unter Verwendung der angegebenen genspezifischen Oligonukleotide und eines automatisierten Farbstoff-Deoxynukleotid-Sequenzierverfahrens (ABI, Foster City, CA) sequenziert.
  • 10
  • In vitro-Translation von PIGI-1-Protein.
  • Detaillierte Beschreibung der Erfindung
  • Verwendung und Brauchbarkeit
  • Die erfindungsgemäßen Nukleinsäuren können erfindungsgemäß auf vielfältige Weise verwendet werden. Beispielsweise können sie als DNA-Sonden verwendet werden, um andere cDNA- und genomische DNA-Bibliotheken zu screenen, um über Hybridisierung weitere DNA-Sequenzen zu selektieren, die Proteine kodieren, welche verwandt sind mit auf p53 ansprechendem Protein PIGI-1. Weiterhin können die erfindungsgemäßen Nukleinsäuren, die für das gesamte, auf p53 ansprechende Protein PIGI-1 oder einen Teil davon kodieren, als DNA-Sonden verwendet werden, um weitere cDNA- und genomische DNA-Bibliotheken zu screenen, um über Hybridisierung DNA-Sequenzen zu selektieren, die auf p53 ansprechendes Protein PIGI-1 anderer Organismen kodieren. Die Nukleinsäure-Sonde könnte mit radioaktiven Nukleotiden oder über nicht-radioaktive Verfahren (d.h. Biotin) markiert sein. Das Screenen kann mit unterschiedlicher Stringenz (über Manipulation der Hypridisierungs-Tm, normalerweise unter Verwendung einer Kombination von Ionenstärke, Temperatur und/oder Gegenwart von Formamid) durchgeführt werden, um nah oder entfernt verwandte Homologe zu isolieren. Die Nukleinsäuren können auch zur Erzeugung von Primern verwendet werden, um cDNA oder genomische DNA über Polymerase-Kettenreaktionstechniken (PCR-Techniken) zu amplifizieren. Die erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenzen können weiterhin für die Identifizierung benachbarter Sequenzen in der cDNA oder im Genom, beispielsweise flankierender Sequenzen und regulatorischer Elemente, verwendet werden.
  • Die erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenzen können weiterhin für den diagnostischen Nachweis von Nukleinsäuresequenzen verwendet werden, die funktional geschädigtes, auf p53 ansprechendes Protein PIGI-1 in menschlichen Tumoren kodieren. Dies würde sich in Mutationen, Deletionen oder Punktmutationen zeigen, die für die Diagnose von Krebs brauchbar sein können. Der Nachweis solcher Mutationen könnte über gewöhnliche Techniken der DNA-Analyse erfolgen, einschließlich genomischer und/oder cDNA-Sequenzierung, SSCP und Southern Blot. Weiterhin kann funktional geschädigtes, auf p53 ansprechendes Protein PIGI-1 selbst unter Verwendung von ELISA-, Immunpräzipitations-, Immunhistochemie- oder Western Blot-Analyse durch monoklonale und polykolonale Antikörper nachgewiesen werden, die so erzeugt werden können, dass sie für normale und mutierte Proteine selektiv sind.
  • Die erfindungsgmäßen Polypeptide sind brauchbar für die Untersuchung der Eigenschaften von auf p53 ansprechendem Protein PIGI-1; beispielsweise dessen Struktur, Wirkungsmechanismus und Rolle bei der Onkogenese. Beispielsweise kann das PIGI-1-Protein untersucht werden, um dessen funktionale Domänen weiter zu beschreiben, und kann somit verwendet werden, um Verbindungen mit ähnlicher Aktivität zu entwerfen. PIGI-1-Protein kann weiterhin dafür verwendet werden, um zu bestimmen, ob es mit sich selbst, anderen verwandten Homologen oder anderen Proteinen interagiert, wobei Co-Immunpräzipitation aus markierten Zellextrakten, Western Blots, das Screenen von Expressionsbibliotheken mit markiertem PIGI-1-Protein und/oder andere übliche Vorgehensweisen zur Anwendung kommen. Das PIGI-1-Protein kann weiterhin zur Bestimmung von dessen Fähigkeit zur Bindung an DNA verwendet werden und zur Identifizierung von dessen Bindungsstellen durch Screenen genomischer Sequenzfragmente oder synthetischer Oligonukleotidfragmente unter Verwendung einer Technologie der Anreicherung und Amplifizierung ausgewählter DNA-Elemente auf der Grundlage von PCR, die ihrerseits Zielsubstanzen im Rahmen der Suche nach Wirkstoffen sein können. Das PIGI-1-Protein kann weiterhin in in vivo-Assays auf der Grundlage von Zellen und in zellfreien in vitro-Assays für das Screenen natürlicher Produkte und synthetischer Verbindungen verwendet werden, welche die Funktion des PIGI-1-Proteins nachahmen, regulieren oder anregen. Die Expression von PIGI-1 (entweder RNA oder das Proteinprodukt) kann verwendet werden, um das Vorliegen von Wildtyp-p53-Aktivität zu überwachen, beispielsweise beim Screenen auf Verbindungen, welche die Funktion von mutiertem p53 nachahmen oder wiederherstellen.
  • Wie nachfolgend hier gezeigt, besitzt das PIGI-1-Protein wachstumshemmende Eigenschaften und kann in menschlichen Tumoren funktional geschädigt sein. Dementsprechend können verschiedene, auf das PIGI-1-Protein gerichtete Therapien bei der Behandlung von Tumoren und Krebs verwendet werden. Beispielsweise können Gentherapietechniken unter Verwendung der gesamten oder eines Teils der PIGI-1-Protein kodierenden Nukleinsäuresequenzen, Techniken unter Verabreichung von PIGI-1-Protein oder biologisch aktiver Fragmente davon, Techniken unter Verwendung Antigen-spezifischer Antikörper, die mit PIGI-1-Protein oder biologisch aktiven Fragmenten davon fusioniert sind, oder Techniken unter Verwendung kleiner Moleküle oder Verbindungen, die entworfen wurden, um PIGI-1 nachzuahmen, oder für die eine Nachahmung von PIGI-1 gefunden wurde, für die Behandlung von Tumoren und Krebs verwendet werden.
  • Verschiedene weitere Verfahren der Verwendung erfindungsgemäßer Nukleinsäuren, Polypeptide, Expressionsvektoren und Wirtszellen sind nachfolgend ausführlich beschrieben.
  • Nukleinsäuren
  • Die vorliegende Erfindung betrifft ein isoliertes Nukleinsäuremolekül, das eine Nukleinsäuresequenz umfasst, die für das gesamte oder ein Teil des auf p53 ansprechenden Proteins PIGI-1 gemäß obiger Definition kodiert. Vorzugsweise ist das Nukleinsäuremolekül ein DNA-Molekül und die Nukleinsäuresequenz ist eine DNA-Sequenz. Weiterhin bevorzugt ist eine DNA-Sequenz mit der in 6 [SEQ ID NO: 1] gezeigten Nukleotidsequenz. Weiterhin bevorzugt sind Nukleinsäuresequenzen, die zu einer dieser Nukleinsäuresequenzen komplementär sind. Zusätzlich bevorzugt sind Nukleinsäuresequenzen, die mit einer dieser Nukleinsäuresequenzen hybridisieren. Im Falle einer Nukleotidsequenz (z.B. einer DNA-Sequenz), die einen Teil des auf p53 ansprechenden Proteins PIGI-1 kodiert, ist bevorzugt, dass die Nukleotidsequenz wenigstens etwa eine Länge von etwa 15 aufeinanderfolgenden Nukleotiden besitzt, bevorzugt wenigstens eine Länge von etwa 20 bis 30 aufeinanderfolgenden Nukleotiden.
  • Die erfindungsgemäßen Nukleinsäuren können aus einer Vielzahl von Quellen isoliert werden, obwohl die gegenwärtig bevorzugten Sequenzen aus menschlichen cDNA-Bibliotheken isoliert wurden. Die genaue Aminosäuresequenz des hergestellten Polypeptidmoleküls variiert in Abhängigkeit von der anfänglichen DNA-Sequenz.
  • Die erfindungsgemäßen Nukleinsäuren können unter Verwendung verschiedener Verfahren erhalten werden, die dem Durchschnittsfachmann allgemein bekannt sind. Es können wenigstens drei alternative grundlegende Verfahren verwendet werden:
    • (1) die Isolierung einer doppelsträngigen DNA-Sequenz aus genomischer DNA oder komplementärer DNA (cDNA), welche die Sequenz enthält;
    • (2) die chemische Synthese der DNA-Sequenz; und
    • (3) die Synthese der DNA-Sequenz über Polymerase-Kettenreaktion (PCR).
  • Beim ersten Verfahren kann eine genomische oder cDNA-Bibliothek gescreent werden, um eine DNA-Sequenz zu identifizieren, die das gesamte oder einen Teil des auf p53 ansprechenden Proteins PIGI-1 kodiert. Beispielsweise können menschliche cDNA-Bibliotheken gescreent werden, um eine DNA-Sequenz zu identifizieren, die das gesamte oder einen Teil des auf p53 ansprechenden Proteins PIGI-1 kodiert. Es können verschiedene cDNA-Bibliotheken, beispielsweise cDNA-Bibliotheken der Lunge des erwachsenen Menschen und cDNA-Bibliotheken des Gehirns (striata) des erwachsenen Menschen verwendet werden (Stratagene, La Jolla, CA).
  • Für das Screenen genomischer DNA- oder cDNA-Bibliotheken auf Sequenzen, die neues, auf p53 ansprechendes Protein PIGI-1 kodieren, können verschiedene Techniken verwendet werden. Die Technik kann beispielsweise eine markierte, einzelsträngige DNA-Sonde mit einer Sequenz verwenden, die komplementär zu einer Sequenz ist, die auf p53 ansprechendes Protein PIGI-1 kodiert. Beispielsweise können DNA/DNA-Hybridisierungsverfahren verwendet werden, um die Sequenz in klonierten Kopien genomischer DNA oder cDNA zu identifizieren, welche in eine einzelsträngige Form denaturiert wurden. Geeignete Sonden umfassen cDNA für auf p53 ansprechendes Protein PIGI-1, die von der gleichen oder einer verwandten Art gewonnen wurde, synthetische Oligonukleotide und dergleichen.
  • Unter Verwendung von Immunblot-Techniken kann eine genomische DNA- oder cDNA-Bibliothek weiterhin gescreent werden auf eine genomische DNA oder cDNA, die das gesamte oder einen Teil des auf p53 ansprechenden Proteins PIGI-1 kodiert, und auf Sequenzen, die solche kodierenden Sequenzen flankieren.
  • Bei einem typischen, für die Hybridisierungstechniken geeigneten Screeningverfahren wird zunächst eine genomische DNA- oder cDNA-Bibliothek auf Agarplatten ausplattiert, und die Klone werden dann auf Filtermembranen, beispielsweise Nitrozellulosemembranen übertragen. Die genomische DNA ist normalerweise in einem Vektor wie beispielsweise EMBL 3 oder EMBL 4 oder Derivaten davon (z.B. lambda DASHTM) oder in Cosmid-Bibliotheken, P1 Phagen-Bibliotheken oder YAC-Bibliotheken enthalten. Die cDNA-Bibliothek ist normalerweise in einem Vektor wie Igt10, Igt11 oder lambda ZAP enthalten. Eine DNA-Sonde kann dann mit den Klonen hybridisiert werden, um solche Klone zu identifizieren, die genomische oder cDNA enthalten, welche das gesamte oder einen Teil des auf p53 ansprechenden Proteins PIGI-1 kodiert. Alternativ können geeignete E. coli-Stämme, die Vektoren wie beispielsweise Igt1 oder lambda ZAP enthalten, für die Synthese von Fusionsproteinen induziert werden, die Fragmente von Proteinen enthalten, welche dem cDNA-Insert im Vektor entsprechen. Die Fusionsproteine können auf Filtermembranen übertragen werden, beispielsweise auf Nitrozellulose. Anschließend kann ein Antikörper an das Fusionsprotein gebunden werden, um das gesamte oder einen Teil des auf p53 ansprechenden Protein PIGI-1 zu identifizieren.
  • Beim zweiten Verfahren kann die erfindungsgemäße Nukleinsäure, die das gesamte oder einen Teil des auf p53 ansprechenden Proteins PIGI-1 kodiert, chemisch synthetisiert werden. Kürzere Oligonukleotide, beispielsweise mit 15 bis 50 Nukleotiden, können direkt synthetisiert werden. Bei längeren Oligonukleotiden kann die DNA-Sequenz, die auf p53 ansprechendes Protein PIGI-1 kodiert, als eine Reihe von Oligonukleotiden mit 50 – 100 Basen synthetisiert werden, die dann sequenziell ligiert werden (über geeignete endständige Restriktionsschnittstellen), so dass die korrekte lineare Nukleotidsequenz gebildet wird.
  • Beim dritten Verfahren können die erfindungsgemäßen Nukleinsäuren, die das gesamte oder einen Teil des auf p53 ansprechenden Proteins PIGI-1 kodieren, über PCR synthetisiert werden. Kurz zusammengefasst werden Paare synthetischer, im Allgemeinen eine Länge von wenigstens 15 Basen aufweisender DNA-Oligonukleotide (PCR-Primer), welche mit entgegengesetzten Strängen der Ziel-DNA-Sequenz hybridisieren, für die enzymatische Amplifizierung des dazwischenliegenden DNA-Bereichs auf der Ziel-Sequenz verwendet. Wiederholte Zyklen der Hitzedenaturierung des Templates, der Anlagerung der Primer und der Verlängerung der 3'-Enden der angelagerten Primer über eine DNA-Polymerase führt zu der Amplizifierung des durch die PCR-Primer definierten Segments. Siehe White, T. J. et al., Trends Genet. 5, 185–9 (1989).
  • Die erfindungsgemäßen Nukleinsäuren, die das gesamte oder einen Teil des auf p53 ansprechenden Proteins PIGI-1 kodieren, können weiterhin für die Erzeugung verschiedener Mutationen modifiziert (d.h. mutiert) werden. Solche Mutationen können die vom mutierten Codon kodierten Aminosäuresequenzen ändern, oder sie können still sein und die Aminosäuresequenz nicht verändern. Diese modifizierten Nukleinsäuren können beispielsweise durch Mutation der Nukleinsäure erzeugt werden, die auf p53 ansprechendes Protein PIGI-1 kodiert, so dass die Mutation zur Deletion, Substitution, Insertion, Inversion oder Hinzufügung einer oder mehrerer Aminosäuren in dem kodierten Polypeptid führt, wobei verschiedene dem Fachmann bekannte Verfahren verwendet werden. Beispielsweise können die Verfahren der ortsgerichteten Mutagenese verwendet werden, die beschrieben sind in Taylor J. W. et al., Nucl. Acid. Res. 13, 8749–64 (1985) und Kunkel, J. A.. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82, 482–92 (1985). Darüberhinaus können von verschiedenen kommerziellen Bezugsquellen Kits für ortsgerichtete Mutagenese bezogen werden. Beispielsweise kann ein Kit zur Durchführung ortsgerichteter Mutagenese von der Amersham Corp. (Arlington Heights, IL) bezogen werden. Weiterhin können Hinzufügungs-, Unterbrechungs-, Deletions- und Verkürzungsverfahren wie in Sayers et al., Nucl. Acids Res. 16, 791–800 (1988) beschrieben, ebenfalls verwendet werden. Mutationen können bei der Herstellung oder Verwendung der erfindungsgemäßen Polypeptide vorteilhaft sein. Beispielsweise können diese Mutationen die Funktion des Proteins modifzieren (z.B. zu höherer oder niedrigerer Aktivität führen), höhere Grade der Proteinherstellung oder leichtere Aufreinigung des Proteins ermöglichen, oder zusätzliche Erkennungsstellen für Restriktionsendonukleasen in der Nukleinsäure bereitstellen. Alle diese modifizierten Nukleinsäuren und Polypeptidmoleküle fallen unter den Schutzumfang der vorliegenden Erfindung.
  • Sofern nicht für bestimmte Fälle eine Beschränkung vorgenommen wird, bedeutet hier der Begriff „modifiziert" bei Bezugnahme auf eine Nukleotid- oder Polypeptidsequenz eine Nukleotid- oder Polypeptidsequenz, die sich von der in der Natur vorkommenden Wildtypsequenz unterscheidet.
  • Expressionsvektoren
  • Die vorliegende Erfindung betrifft weiterhin Expressionsvektoren, die eine DNA-Sequenz umfassen, welche das gesamte oder einen Teil des auf p53 ansprechenden Proteins PIGI-1 wie oben angegeben kodiert. Die Expressionsvektoren enthalten vorzugsweise die DNA-Sequenz mit der in 6 [SEQ ID NO: 1] gezeigten Nukleotidsequenz. Weiterhin bevorzugt sind Expressionsvektoren, die eine oder mehrere regulatorische DNA-Sequenzen umfassen, welche operativ verknüpft sind mit der DNA-Sequenz, die das gesamte oder einen Teil des auf p53 ansprechenden Proteins PIGI-1 kodiert. In diesem Zusammenhang bedeutet der Begriff „operativ verknüpft", dass die regulatorischen DNA-Sequenzen die Replikation und/oder die Expression der DNA-Sequenz, die das gesamte oder einen Teil des auf p53 ansprechenden Protein PIGI-1 kodiert, zu steuern vermögen.
  • Erfindungsgemäß brauchbare Expressionsvektoren liegen oft in Form von „Plasmiden" vor, womit auf ringförmige, doppelsträngige DNA-Schleifen Bezug genommen wird, die in ihrer Vektorform nicht mit dem Chromosom verbunden sind. Die Erfindung soll jedoch solche weiteren Formen von Expressionsvektoren umfassen, die äquivalenten Funktionen dienen und dem Fachmann später bekannt werden. Die erfindungsgemäßen Expressionsvektoren können weiterhin zur stabilen Integration der DNA-Sequenz, die ein auf p53 ansprechendes Protein PIGI-1 kodiert, in das Chromosom einer geeigneten Wirtszelle (z.B. COS-, HepG2-, Saos2- und EB-Zellen) verwendet werden.
  • Die erfindungsgemäß brauchbaren Expressionsvektoren umfassen typischerweise einen Replikationsursprung, einen Promotor, der 5' von (d.h. stromaufwärts von) und gefolgt von der DNA-Sequenz, die das gesamte oder einen Teil des auf p53 ansprechenden Proteins PIGI-1 kodiert, lokalisiert ist, Transkriptionsterminationssequenzen und den restlichen Vektor. Weiterhin können die Expressionsvektoren weitere dem Fachmann bekannte DNA-Sequenzen umfassen, beispielsweise Stabilitäts-Leadersequenzen, welche für die Stabilität des Expressionsprodukts sorgen, sekretorische Leadersequenzen, welche für die Sekretion des Expressionsprodukts sorgen, Sequenzen, die eine Modulation der Expression des Strukturgens ermöglichen (z.B. durch die Gegenwart oder das Fehlen von Nährstoffen oder anderen induzierenden Faktoren im Wachstumsmedium), markierenden Sequenzen, welche eine phänotypische Selektion in den transformierten Wirtszellen ermöglichen, Sequenzen, die Schnittstellen für die Spaltung durch Restriktionsendonukleasen bereitstellen, und Sequenzen, die eine Expression in verschiedenen Arten von Wirten ermöglichen, einschließlich und ohne darauf beschränkt zu sein, Prokaryoten, Hefen, Pilzen, Pflanzen und höheren Eukaryoten. Die Eigenschaften des tatsächlichen Expressionsvektors müssen mit der zu verwendenden Wirtszelle vereinbar sein. Wenn beispielsweise DNA-Sequenzen in einem Säugetierzellsystem exprimiert werden, sollte der Expressionsvektor aus dem Genom von Säugetierzellen isolierte Promotoren (z.B. den Metallothionein-Promotor der Maus) oder aus in diesen Zellen wachsenden Viren isolierte Promotoren (z.B. den 7.5K-Promotor des Vaccinia-Virus) enthalten. Ein Expressionsvektor im Sinne der vorliegenden Erfindung vermag wenigstens die Replikation und vorzugsweise die Expression der erfindungsgemäßen Nukleinsäuren zu steuern. Zu geeigneten Replikationsursprüngen gehören beispielsweise der Col E1-, der virale SV40- und der M13-Replikationsursprung. Zu geeigneten Promotoren gehören beispielsweise der Cytomegalovirus-Promotor, der lac Z-Promotor, der gal 10-Promotor und der polyhydrale Promotor des multiplen nuklearen Polyhydrosis-Virus (AcMNPV) von Autographia california. Zu geeigneten Terminationssequenzen gehören beispielsweise die Rinderwachstumshormon-, SV40-, lac Z- und AcMNPV-polyhydralen Polyadenylierungssignale. Zu Beispielen für selektierbare Marker gehören Neomycin-, Ampicillin- und Hygromycin-Resistenz und dergleichen. Alle dieser Materialien sind dem Fachmann bekannt und kommerziell erhältlich.
  • Zu geeigneten kommerziell erhältlichen Expressionsvektoren, in welche die erfindungsgemäßen DNA-Sequenzen insertiert werden können, gehören die Säugetierexpressionsvektoren pcDNA3 oder pcDNA/Neo, die Baculovirus-Expressionsvektoren pBlueBac und pBlueBacHis, der prokaryotische Expressionsvektor pcDNAII und der Hefeexpressionsvektor pYes2, die alle von der Invitrogen Corp, San Diego, CA, bezogen werden können.
  • Geeignete Expressionsvektoren, welche die gewünschten kodierenden und Kontrollregionen enthalten, können unter Verwendung von dem Fachmann bekannten üblichen Standardtechniken für rekombinante DNA konstruiert werden, von denen viele in Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Zweite Ausgabe, Cold Spring Harbour Laboratory, Cold Spring Harbour, NY (1989), beschrieben sind.
  • Sofern nicht für spezielle Fälle anderweitig eingeschränkt, bezieht sich hier der Auszug „Kontrollregionen" auf Nukleotidsequenzen, welche die Expression des auf p53 ansprechenden Proteins PIGI-1 regulieren, einschließlich und ohne darauf beschränkt zu sein jedes beliebigen Promotors, Silencers, Enhancer-Elements, jeder beliebigen Spleißstellen, jeder beliebigen Transkriptionsinitiierungselemente, Transkriptionsterminierungselemente, Polyadenylierungssignale, Translationskontrollelemente, Translationsstartstellen, Translationsterminierungsstellen und Botenstabilisierungselementen. Solche Kontrollregionen können in Sequenzen 5' oder 3' von der kodierenden Region oder in die kodierenden Region unterbrechenden Introns lokalisiert sein.
  • Wirtszellen
  • Die vorliegende Erfindung betrifft weiterhin Wirtszellen, die einen Expressionsvektor enthalten, der eine DNA-Sequenz umfasst, die das gesamte oder einen Teil des auf p53 ansprechenden Proteins PIGI-1 gemäß obiger Definition kodiert. Es wird beispielsweise auf die Wirtszellen des nachfolgenden Beispiels 2 verwiesen, die eine bevorzugte Ausführungsform darstellen. Die Wirtszellen enthalten vorzugsweise einen Expressionsvektor, der eine DNA-Sequenz umfasst, welche im Wesentlichen die in 6 gezeigte Nukleotidsequenz aufweist. Es wird beispielsweise auf den nachfolgend in Beispiel 2 vorkommenden Expressionsvektor verwiesen, der eine bevorzugte Ausführungsform darstellt. Weiterhin bevorzugt sind Wirtszellen, die einen Expressionsvektor enthalten, der eine oder mehrere regulatorische DNA-Sequenzen umfasst, welche die Replikation und/oder die Expression einer das gesamte oder einen Teil des auf p53 ansprechenden Proteins PIGI-1 kodierenden Sequenz steuern und mit dieser operativ verknüpft sind. Zu geeigneten Wirtszellen gehören sowohl prokaryotische als auch eukaryotische Zellen. Zu geeigneten prokaryotischen Wirtszellen gehören beispielsweise die E. coli-Stämme HB101, DH5a, XL1 Blue, Y1090 und JM101. Zu geeigneten eukaryotischen Wirtszellen gehören beispielsweise Spodoptera frugiperda-Insektenzellen, COS-7-Zellen, Saos-2-Zellen, HeLa-Zellen, menschliche Hautfibroblasten und Sacharomyces cerevisiae-Zellen.
  • Expressionsvektoren können über verschiedene dem Fachmann bekannte Verfahren in Wirtszellen eingeführt werden. Beispielsweise kann die Transfektion von Wirtszellen mit Expressionsvektoren über das Calciumphosphat-Fällungsverfahren erfolgen. Es können jedoch weitere Verfahren für die Einführung von Expressionsvektoren in Wirtszellen verwendet werden, beispielsweise Elektroporation, liposomale Fusion, Kerninjektion und virale oder Phageninfektion.
  • Sobald ein Expressionsvektor in eine geeignete Wirtszelle eingeführt wurde, kann die Wirtszelle unter Bedingungen kultiviert werden, die eine Expression großer Mengen des gewünschten Polypeptids, in diesem Fall eines Polypeptidmoleküls, welches das gesamte oder einen Teil des auf p53 ansprechenden Proteins PIGI-1 umfasst, zulassen.
  • Wirtszellen, die einen Expressionsvektor enthalten, der eine das gesamte oder einen Teil des auf p53 ansprechenden Proteins PIGI-1 kodierende DNA-Sequenz enthält, können über einen oder mehrere der folgenden sechs allgemeinen Ansätze identifiziert werden: (a) DNA-DNA-Hybridisierung; (b) das Vorliegen oder Fehlen von Markergenfunktionen; (c) die Bestimmung des Transkriptionsgrads, gemessen durch die Erzeugung von mRNA-Transkripten, die das auf p53 ansprechende Protein PIGI-1 in der Wirtszelle kodieren; (d) den immunologischen Nachweis des Genprodukts; (e) biologische Aktivität; und (f) PCR.
  • Beim ersten Ansatz kann das Vorliegen einer DNA-Sequenz, die das gesamte oder einen Teil des auf p53 ansprechenden Proteins PIGI-1 kodiert, durch DNA-DNA- oder RNA-DNA-Hybridisierung unter Verwendung von Sonden nachgewiesen werden, die zu der DNA-Sequenz komplementär sind.
  • Im zweiten Ansatz kann das rekombinante Expressionsvektor-Wirtssystem auf der Grundlage des Vorliegens oder Fehlens bestimmter Markergenfunktionen (z.B. Thymidinkinase-Aktivität, Resistenz gegen Antibiotika usw.) identifiziert und selektiert werden. Ein Markergen kann unter der Regulation desselben oder eines unterschiedlichen Promotors, der für die Regulation der kodierenden Sequenz des auf p53 ansprechenden Proteins PIGI-1 verwendet wird, in das gleiche Plasmid wie die DNA-Sequenz, die das gesamte oder einen Teil des auf p53 ansprechenden Proteins PIGI-1 kodiert, eingesetzt werden. Eine Expression des Markergens zeigt die Expression der DNA-Sequenz an, die das gesamte oder einen Teil des auf p53 ansprechenden Proteins PIGI-1 kodiert.
  • Beim dritten Ansatz kann die Erzeugung von mRNA-Transkripten, die auf p53 ansprechendes Protein PIGI-1 kodieren, durch Hybridisierungsassays bestimmt werden. Beispielsweise kann unter Verwendung einer zu der RNA-Sequenz komplementären Sonde polyadenylierte RNA isoliert und über Northern Blots oder einen Nuclease-Schutz-Assay analysiert werden. Alternativ kann die Gesamt-RNA der Wirtszelle extrahiert und auf Hybridisierung mit solchen Sonden hin untersucht werden.
  • Beim vierten Ansatz kann die Expression des gesamten oder eines Teils des auf p53 ansprechenden Proteins PIGI-1 immunologisch bestimmt werden, beispielsweise durch Immunblots mit einem Antikörper gegen das auf p53 ansprechende Protein PIGI-1 (Western Blotting).
  • Beim fünften Ansatz kann die Expression des auf p53 ansprechenden Proteins PIGI-1 durch Untersuchung der Aktivität des auf p53 ansprechenden Proteins PIGI-1 unter Verwendung bekannter Verfahren gemessen werden.
  • Beim sechsten Ansatz werden Oligonucleotidprimer, die homolog sind zu den in dem Expressionssystem vorliegenden Sequenzen (d.h. Sequenzen des Expressionsvektors oder Sequenzen des auf p53 ansprechenden Proteins PIGI-1), in einer PCR verwendet, wodurch ein DNA-Fragment einer vorhergesagten Länge erzeugt wird, das den Einbau des Expressionssystems in die Wirtszelle anzeigt.
  • Die DNA-Sequenzen erfindungsgemäßer Expressionsvektoren, Plasmide oder DNA-Moleküle können über verschiedene dem Fachmann bekannte Verfahren bestimmt werden. Beispielsweise können die durch Sanger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74, 5463–7 (1977) beschriebene Dideoxykettenabbruchsmethode oder die in Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74, 560–4 (1977) beschriebene Maxam-Gilbert-Methode verwendet werden.
  • Verständlicherweise werden nicht alle Expressionsvektoren und DNA-regulatorischen Sequenzen hinsichtlich der Expression der erfindungsgemäßen DNA-Sequenzen gleichermaßen gut funktionieren. Ebenso wenig werden alle Wirtszellen mit dem gleichen Expressionssystem gleichermaßen gut funktionieren. Jedoch kann der Durchschnittsfachmann auf dem Gebiet anhand der hier gegebenen Anleitung ohne unzumutbaren experimentellen Aufwand und ohne Verlassen des Schutzbereichs der vorliegenden Erfindung eine Auswahl unter Expressionsvektoren, DNA-regulatorischen Sequenzen und Wirtszellen treffen.
  • Polypeptide
  • Die vorliegende Erfindung betrifft weiterhin Polypeptidmoleküle, die das gesamte oder einen Teil des auf p53 ansprechenden, in 7 [SEQ ID NO: 2] gezeigten Proteins PIGI-1 gemäß obiger Definition umfassen. Bei Polypeptidmolekülen, die eine Teil des auf p53 ansprechenden Proteins PIGI-1 umfassen, beträgt die Länge der Polypeptidmoleküle vorzugsweise wenigstens etwa 5 bis 8 aufeinanderfolgende Aminosäuren, besonders bevorzugt wenigstens etwa 15 bis 20 aufeinanderfolgende Aminosäuren.
  • Alle Aminosäuresequenzen werden hier durch Formeln dargestellt, deren Orientierung von links nach rechts der üblichen Richtung von Amino-Terminus zu Carboxy-Terminus entspricht.
  • Die erfindungsgmäßen Polypeptide können über synthetische Mittel, d.h. chemische Synthese des Polypeptids aus den darin enthaltenden Aminosäuren, über Verfahren erhalten werden, die dem Durchschnittsfachmann auf dem Gebiet bekannt sind. Beispielsweise kann das von Houghton et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 82, 5131–5135 (1985) beschriebene Festphasen-Verfahren verwendet werden. Vorzugsweise werden die Polypeptide erhalten durch Herstellung in prokaryotischen oder eukaryotischen Wirtszellen, die eine DNA-Sequenz exprimieren, die das gesamte oder einen Teil des auf p53 ansprechenden Proteins PIGI-1 kodiert, oder durch in vitro-Translation der mRNA, die durch eine DNA-Sequenz kodiert wird, die das gesamte oder einen Teil des auf p53 ansprechenden Proteins PIGI-1 kodiert. Beispielsweise kann die DNA-Sequenz der 6 [SEQ ID NO: 1] unter Verwendung von PCR wie oben beschrieben synthetisiert und in einen geeigneten Expressionsvektor insertiert werden, der wiederum für die Transformation einer geeigneten Wirtszelle verwendet werden kann. Die rekombinante Wirtszelle kann dann kultiviert werden, um auf p53 ansprechendes Protein PIGI-1 herzustellen. Techniken für die Erzeugung von Polypeptiden über diese Mittel sind dem Fachmann bekannt und werden hier beschrieben.
  • Die auf diese Weise hergestellten Polypeptide können dann isoliert und unter Verwendung verschiedener Proteinaufreinigungstechniken bis zu einem gewissen Grad aufgereinigt werden. Beispielsweise können chromatographische Methoden, wie beispielsweise Ionenaustauschchromatographie, Gelfiltrationschromatographie und Immunaffinitätschromatographie verwendet werden.
  • Die erfindungsgemäßen Polypeptide können auf sehr vielfältige Weise verwendet werden. Beispielsweise können die Polypeptide, sogar solche, die biologisch inaktiv sind, auf bekannte Weise zur Erzeugung polyklonaler oder monoklonaler Antikörper verwendet werden, welche die Polypeptide zu binden vermögen. Diese Antikörper können wiederum für den Nachweis der erfindungsgemäßen Polypeptide in einer Probe, beispielsweise einer Zellprobe, unter Verwendung von Immunoassay-Techniken, beispielsweise Radioimmunoassay, Enzymimmunoassay oder Immuncytochemie, verwendet werden. Die Antikörper können weiterhin in der Affinitätschromatographie für die Isolierung oder Aufreinigung der erfindungsgemäßen Polypeptide aus verschiedenen Quellen verwendet werden.
  • Die erfindungsgemäßen Polypeptide wurden über die bestimmte DNA- und abgeleitete Aminosäuresequenzierung definiert. Auf Grund der Degeneriertheit des genetischen Codes können weitere DNA-Sequenzen, welche die gleiche, in 7 [SEQ ID NO: 2] gezeigte Aminosäuresequenz oder einen beliebigen Teil davon kodieren, für die Herstellung der erfindungsgemäßen Polypeptide verwendet werden.
  • Es ist weiterhin ersichtlich, das Allelvarianten dieser DNA- und Aminosäuresequenzen natürlicherweise vorkommen oder unter Verwendung von dem Fachmann bekannten Verfahren absichtlich eingeführt werden können. Diese Varianten können durch einen oder mehrere Aminosäurenaustausche in der Gesamtsequenz gezeigt werden, beispielsweise Deletionen, Substitutionen, Insertionen, Inversionen und Hinzufügungen einer oder mehrerer Aminosäuren in der Sequenz. Solche Veränderungen können für die Herstellung oder Verwendung der erfindungsgemäßen Polypeptide vorteilhaft sein; beispielsweise bei der Isolierung über Affinitätsreinigung des auf p53 ansprechenden Proteins PIGI-1 oder der Polypeptide. Aminosäuresubstitutionen können beispielsweise auf der Grundlage der Ähnlichkeit der Polarität, der Ladung, der Löslichkeit, der Hydrophobizität, der Hydrophilizität und/oder des amphipathischen Charakters der betroffenen Reste erfolgen. Beispielsweise gehören zu negativ geladenen Aminosäuren Asparaginsäure und Glutaminsäure; zu positiv geladenen Aminosäuren gehören Lysin und Arginin; zu Aminosäuren mit ungeladenen, polaren Seitenketten oder unpolaren Seitenketten mit ähnlichen Hydrophilizitätswerten gehören die folgenden Aminosäuren: Leucin, Isoleucin, Valin, Glycin, Alanin, Asparagin, Glutamin, Serin, Threonin, Phenylalanin, Tyrosin. Zu weiteren erfassten Varianten gehören Salze und Ester der zuvor genannten Polypeptide, ebenso Precursor der zuvor genannten Polypeptide, beispielsweise Precursor mit N-terminalen Substituenten wie Methionin, N-Formylmethionin und Leadersequenzen. Alle diese Varianten fallen unter den Schutzumfang der vorliegenden Erfindung.
  • Verfahren zum Nachweis von Nukleinsäuren
  • Ein Verfahren zum Nachweis einer Nukleinsäuresequenz, die das gesamte oder einen Teil des auf p53 ansprechenden Proteins PIGI-1 kodiert, oder einer verwandten Nukleinsäuresequenz umfasst das Inkontaktbringen der Nukleinsäuresequenz mit einem nachweisbaren Marker, der spezifisch an wenigstens einen Teil der Nukleinsäuresequenz bindet, und den Nachweis des derart gebundenen Markers. Das Vorliegen des gebundenen Markers zeigt das Vorliegen der Nukleinsäuresequenz an. Vorzugsweise ist die Nukleinsäuresequenz eine DNA-Sequenz mit im Wesentlichen der in 6 [SEQ ID NO: 1] gezeigten Nukleotidsequenz oder stellt eine dazu komplementäre Sequenz dar.
  • Eine die DNA-Sequenz enthaltende DNA-Probe kann unter Verwendung verschiedener, dem Fachmann geläufiger Verfahren für die DNA-Isolierung isoliert werden. Beispielsweise kann eine genomische DNA-Probe aus Gewebe isoliert werden, indem man das Gewebe, aus dem die DNA isoliert werden soll, schnell einfriert, das Gewebe zerkleinert, um leicht verdaubare Stücke zu erzeugen, das zerkleinerte Gewebe in eine Lösung aus Proteinase K und SDS legt und die erhaltene Lösung inkubiert, bis das meiste des zellulären Proteins abgebaut ist. Die genomische DNA wird dann durch aufeinanderfolgende Phenol- Chloroform/Isoamylalkohol-Extraktionen deproteinisiert, über Ethanolfällung gewonnen, getrocknet und in Buffer resuspendiert.
  • Weiterhin bevorzugt ist ein Verfahren, bei dem die Nukleinsäuresequenz eine RNA-Sequenz ist. Vorzugsweise ist die RNA-Sequenz eine mRNA-Sequenz. Weiterhin bevorzugt ist ein Verfahren, bei dem die RNA-Sequenz sich in den Zellen einer Gewebeprobe befindet. Eine die RNA-Sequenz enthaltende RNA-Probe kann über verschiedene, dem Durchschnittsfachmann auf dem Gebiet allgemein bekannte Verfahren zur RNA-Isolierung isoliert werden. Beispielsweise kann eine RNA-Probe aus kultivierten Zellen isoliert werden, indem man die Zellen mediumfrei wäscht und sie dann lysiert, indem man sie in eine Lösung aus 4 M Guanidinium legt. Die Viskosität der erhaltenen Lösung wird verringert, indem man das Lysat durch eine 20-Gauge-Nadel zieht. Dann wird die RNA über einen Cäsiumchlorid-Stufengradienten pelletiert und die überstehende Flüssigkeit des Gradienten sorgfältig entfernt, um eine vollständige Trennung der sich im Pellet befindlichen RNA von kontaminierender DNA und Protein zu ermöglichen.
  • Der nachweisbare Marker, der für den Nachweis einer das gesamte oder einen Teil des auf p53 ansprechenden Proteins PIGI-1 kodierenden Nukleinsäuresequenz oder einer verwandten Nukleinsäuresequenz brauchbar ist, kann eine markierte DNA-Sequenz sein, einschließlich einer markierten cDNA-Sequenz, die eine Nukleotidsequenz aufweist, die wenigstens zu einem Teil der Nukleotidsequenz komplementär ist, die das gesamte oder einen Teil des auf p53 ansprechenden Proteins PIGI-1 kodiert.
  • Der nachweisbare Marker kann auch eine markierte RNA mit einer Sequenz sein, die komplementär ist zu wenigstens einem Teil der DNA-Sequenz, die das gesamte oder einen Teil des auf p53 ansprechenden Proteins PIGI-1 kodiert.
  • Die nachweisbaren Marker der vorliegenden Erfindung können mit üblicherweise verwendeten radioaktiven Markierungen wie beispielsweise 32P und 35S markiert werden, obwohl andere Markierungen wie beispielsweise Biotin oder Quecksilber verwendet werden können. Für die Markierung der nachweisbaren Marker können verschiedene, dem Durchschnittsfachmann auf dem Gebiet allgemein bekannte Verfahren verwendet werden. Beispielsweise können DNA-Sequenzen und RNA-Sequenzen unter Verwendung des Zufallsprimer-Verfahrens mit 32P oder 35S markiert werden.
  • Nach Erhalt eines geeigneten nachweisbaren Markers können verschiedene, dem Durchschnittsfachmann auf dem Gebiet allgemein bekannte Verfahren verwendet werden, um den nachweisbaren Marker mit der Probe von Interesse in Kontakt zu bringen. Beispielsweise können DNA-DNA-, RNA-RNA- und DNA-RNA-Hybridisierung über fachübliche Standardvorgehensweisen durchgeführt werden. In einer typischen Vorgehensweise für DNA-DNA-Hybridisierung zum Nachweis von DNA-Sequenzen in genomischer DNA, die das gesamte oder einen Teil des auf p53 ansprechende Proteins PIGI-1 kodieren, wird die genomische DNA zunächst über bekannte Verfahren isoliert und dann mit einem oder mehreren Restriktionsenzymen verdaut. Die erhaltenen DNA-Fragmente werden in Agarosegelen aufgetrennt, in situ denaturiert und auf Membranfilter übertragen. Nach Prähybridisierung zur Verringerung unspezifischer Hybridisierung wird eine radiomarkierte Nukleinsäuresonde mit den immobilisierten DNA-Fragmenten hybridisiert. Die Membran wird dann gewaschen, um nicht gebundene oder schwach gebundene Sonden zu entfernen, und dann autoradiographiert, um die DNA-Fragmente zu identifizieren, die mit der Probe hybridisieren.
  • Das Vorliegen gebundener, nachweisbarer Marker kann über verschiedene, dem Durchschnittsfachmann auf dem Gebiet allgemein bekannte Verfahren nachgewiesen werden. Wenn beispielsweise der nachweisbare Marker radioaktiv markiert ist, kann Autoradiographie eingesetzt werden. In Abhängigkeit von der verwendeten Markierung können weitere Nachweisverfahren wie beispielsweise Spektrophotometrie ebenfalls verwendet werden.
  • Es ist ersichtlich, dass unter Verwendung der hier beschriebenen Verfahren auch Nukleinsäuresequenzen nachgewiesen werden können, die mit Nukleinsäuresequenzen verwandt sind, welche das gesamte oder einen Teil des auf p53 ansprechenden Proteins PIGI-1 kodieren. Beispielsweise kann eine DNA-Sonde, die konservierte Regionen des Gens für ein neuartiges, auf p53 ansprechendes Protein aufweist, zum Nachweis und zur Isolierung verwandter DNA-Sequenzen verwendet werden (z.B. einer DNA-Sequenz, die ein auf p53 ansprechendes Protein kodiert, das verwandt ist mit einem auf p53 ansprechenden Protein PIGI-1 der Maus, Ratte, des Hamsters oder von Hunden). cDNA von PIGI-1 kann weiterhin verwendet werden zur Isolierung von flankierenden regulatorischen Regionen, wie beispielsweise Promotoren, und zur Isolierung von neuartigen Genen, die durch ihre Nähe ebenfalls über p53 reguliert sein können. All diese Verfahren fallen unter den Schutzumfang der vorliegenden Erfindung.
  • Sofern nicht für spezielle Fälle anderweitig beschränkt, bedeutet bei Bezugnahme auf eine Nukleotidsequenz der Begriff „verwandt" eine Nukleinsäuresequenz, die unter Hybridisierungsbedingungen, bei denen 0,2 × SSPC, 0,1% SDS-Puffer und eine Hybridisierungstemperatur von 65°C verwendet werden, mit einer Oligonukleotidsonde auf der Grundlage der Nukleotidsequenz, die auf p53 ansprechendes Protein PIGI-1 kodiert, zu hybridisieren vermag.
  • Die nachfolgenden Beispiele dienen der weiteren Veranschaulichung der vorliegenden Erfindung. Diese Beispiele sollen den Schutzumfang der vorliegenden Erfindung nicht beschränken, und können weiter zum Verständnis der Erfindung beitragen.
  • BEISPIEL 1
  • Identifizierung neuartiger, auf p53 ansprechender Gene
  • A. MATERIALIEN UND METHODEN
  • 1. Plasmidkonstruktion:
  • Die Plasmide pUHD15-1 Neo (Tet-Vp16 Fusionsprotein-Expressionskonstrukt), pUHC13-3 (auf Tet-Vp16 ansprechendes Luciferase-Konstrukt, enthält TET-Operatorsequenzen) und pUHG10-3 (auf Tet-Vp16 ansprechender Expressionsvektor) erhielt man von Dr. H. Bujard, Universität Heidelberg, Heidelberg, Deutschland. Man subklonierte die cDNA, die eine p53-Mutante in Codon 143 (Substitution von V durch A) kodierte, aus dem Plasmid pC53-SCX3 [Baker, S. J. et al., Science 249, 912–915 (1990)] in die BamHI-Schnittstelle von pUHG10-3, wodurch man pTE9.5 erhielt. Man konstruierte pTE3.1 durch Subklonieren der cDNA, die eine p53-Mutante in Codon 247 (Substitution von N durch 1) kodierte, aus dem Plasmid Gal4-53 247 [Unger, T. et al., EMBO J. 11, 1383–1390 (1992)] in pUHG10-3. Das auf p53 ansprechende Luciferase-Reporter-Konstrukt erzeugte man durch Ersetzen der TET-Operatorsequenzen von pUHC13-3 durch zwei Kopien eines DNA-Fragments, 5'-TCGAGCTTGCCTGGACTTGCCTGCCAGATCTGTCGACGGAGG-3' [SEQ ID NO: 3], das die RCC p53-Bindungsstelle enthielt [Kern, S. E. et al., Science 252, 1708–1711 (1991)], wodurch man das Plasmid mRE10 erhielt. Alle rekombinanten Konstrukte wurden über Sequenzanalyse unter Verwendung automatisierter DNA-Sequenzierung (Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA) charakterisiert und verifiziert.
  • 2. Entwicklung p53-exprimierender Zelllinien:
  • Man ließ Saos-2-Zellen (American Type Cell Culture, Bethesda, Maryland) bei 37°C 5% CO2 in McCoys-Medium wachsen, das mit 15% fötalem Kälberserum, 2mM L-Glutamin und 10 U Penicillin, 10 μg/ml Streptomycin (Gibco) supplementiert war. Man co-transfektierte durch Elektroporation (Gibco Elektroporator), mit dem tTa-Expressionsplasmid pUDH15-1 Neo (das Resistenz gegen G418 bereitstellte) und entweder pTE9.5 oder pTE3.1 (jeweils in einem Verhältnis von 1:10). Man selektierte die Zellen in G418 (250 μ/ml, Gibco) und Tetracyclin (1 μg/ml, Sigma) enthaltendem Medium. Man klonierte und expandierte G418-resistente Kolonien, wodurch man Saos-2-A3 und Saos-2-D4 erhielt.
  • Anschließend etablierte man das Luciferase-Reporter-Konstrukt mRE10 enthaltende Derivate von Saos-2-A3 und Saos-2-D4 unter Verwendung von pBShygro (exprimiert das bakterielle Hygromycin-Resistenzgen unter Kontrolle des frühen SV40-Promotors, erhalten von Dr. Mark Lynch, Bristol-Myers Squibb) für positive Selektion resistenter Zellen in Hygromycin B enthaltendem Medium (150 U/ml), wodurch man die klonalen Linien Saos-2-A3B beziehungsweise Saos-2-D4H erhielt.
  • Von P. Shaw [Shaw, P. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89, 4495–4499 (1992)] erhaltene EB- und klonale EB1-Zellen hielt man bei 37°C und 9% CO2 in DMEM (Gibco), das mit 10% fötalem Kälberserum und Antibiotika wie oben beschrieben supplementiert war.
  • 3. Luciferase-Assay:
  • Man stellte Zellextrakte in 100 μl 2× Luciferase-Puffer (30 mM Glycyl-glycin pH 7,8, 30 mM MgSO4, 1,0 mM EGTA [Ethylenglycol-bis(B-aminoethylether)N,N,N',N'-tetraessigsäure], 2,0 mM DTT [Dithiothreitol]) her, der 1% Triton X100 enthielt. Man bestimmte die Luciferase-Aktivität durch Auslesen der von 50 μl Extrakt (der auf die Proteinkonzentration hin korrigiert war) erzeugten relativen Lumineszenz in einem Luminometer (Berthold Modell LB 952 T/16 oder Dynatech Modell ML 1000) nach Injektion von 100 μl Assay-Puffer (1 × Luciferase-Puffer mit 2,0 mM ATP [Adenosintriphosphat, pH 7,0] und 5 mM Luciferin).
  • 4. Isolierung von RNA und Northern Blot-Analyse:
  • Man stellte Gesamt-DNA unter Verwendung der sauren Guanidiniumthiocyanat-Isolierungsmethode in einem Schritt her [Chomczynski, P. et al., Anal. Biochem. 162, 156–159 (1987)]. Man stellte polyadenylierte RNA unter Verwendung von Oligotex-dT her (Quiagen). Die Northern Blot-Analyse erfolgte wie früher beschrieben [Buckbinder, L. et al., J. Biol. Chem. 267, 25786–25791 (1992)]. Die Quantifizierung von Northern Blots erfolgte über Laserdensitometry (Molecular Dynamics) der Autoradiogramme oder durch Inkontaktbringen der Blots mit Phosphorimging-Platten und anschließende Analyse auf einem Phosphoimager (Fujji).
  • 5. cNDA-Bibliotheken:
  • Die Vorgehensweise zur Subtraktion von cDNA-Bibliotheken entsprach im Wesentlichen der beschriebenen Vorgehensweise [Wang, Z. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88, 11505–11509 (1991)], sofern es unten stehend nicht anders angegeben ist. Man teilte die cDNA in drei Aliquots, von denen eines mit HaeIII und eines mit RsaI verdaut wurde. Die Zugabe von Linker, die PCR-Amplifizierung, die Herstellung biotinylierter Treiber-DNA, die Hybridisierung und die Entfernung von Hybriden erfolgten wie früher beschrieben [Wang, Z. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88, 11505–11509 (1991); Buckbinder, L. et al., J. Biol. Chem. 267, 25786–25791 (1992)]. Die Klonierung und das Screenen von cDNA begann nach der dritten Subtraktionsrunde. Dann gab man das identifizierte klonierte cDNA-Fragment (W4.5) zum Treiber, um das Fragment zu unterdrücken, so dass verschiedene cDNAs in einem Screening einer vierten Runde angereichert werden konnten.
  • 6. Western Blot-Analyse:
  • Kernproteine (80 μg) wurden über SDS-Polyacrylamidgel-Elektrophorese (12%) aufgetrennt. Man übertrug die Proteine durch Elektroblot auf eine PVDF-Membran (Gibco) und führte eine Immunblot-Analyse wie von Harlow, E. et al., Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press (1988) beschrieben durch. Als primärer Antikörper wurde der p53 monoklonale Antikörper DO1 (mAB-6, Oncogene Science, Uniondale, NY) verwendet. Die Western Blot-Reaktionen wies man über ein Chemilumineszenz-gestützes Photoblot-System nach (Gibco, Grand Island, NY). Die Quantifizierung des Autoradiogramms erfolgte wie oben beschrieben.
  • B. Ergebnisse
  • 1. Entwicklung von Zellllinien, die induzierbare p53-Gene tragen:
  • Aus mehreren Gründen wurden menschliche Saos-2-Osteosarkomzellen als Ausgangszelllinie ausgewählt: 1) sie sind p53-negativ, 2) die Überexpression von exogenem wt p53 in diesen Zellen inhibiert deren Wachstum [Diller L. et al., Mol. Cell. Biol. 10, 5772–5781 (1990)], und 3) in transienten Expressionsassays aktivieren mehrere temperatursensitive (ts) Mutanten von menschlichem p53 bei der zulässigen Temperatur (30°C) ein Reportergen, das stromaufwärts gelegene, auf p53 ansprechende Elemente trägt (Daten nicht gezeigt). Man wählte zwei natürlicherweise auftretende Mutanten von p53 wurden für das Etablieren stabiler Zelllinien aus: p53N247I (Substitution von Asparagin durch Isoleucin bei Codon 247) und p53V143A (Substitution von Valin durch Alanin bei Codon 143). Die Mutante p53N247I zeigte als Gal4-Fusionsprotein bei der Transaktivierung einen ts-Phänotyp [Unger, T., et al., EMBO J. 11, 1383–1390 (1992)]. Die Mutante p53V143A [Baker, S. J. et al., Science 249, 912–915 (1990)] war bis dahin nicht als eine ts-Mutante charakterisiert worden. Jedoch zeigten DNA-Bindungsexperimente mit aufgereinigtem p53V143A aus Baculovirus, dass es bei 30°C effektiv an DNA bindet (Takenaka, Faha und Kley, unveröffentlichtes Ergebniss), und Experimente mit transienter Transfektion zeigten, dass es bei der erlaubten Temperatur ein auf p53 ansprechendes Reportergen aktivierte (Daten nicht gezeigt).
  • 2. Tetracyclin-regulierte p53-Expression
  • Zur Entwicklung stabiler Zelllinien wurde ein von Gossen und Bujard [Gossen, M. und Bujard, H., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89, 5547–5551 (1992)] etabliertes Tetracyclin (tet)-reguliertes Expressionssystem verwendet. Man klonierte die p53-cDNAs stromabwärts von einem Minimal-Promotor, der bakterielle Sequenzen des tet-Operators (tOp) enthielt (siehe 1A). Ein CMV-Promotor steuert die konstitutive Expression eines bakteriellen tet-Repressor-VP16 (tTA)-Aktivator-Fusionsproteins, das bei Fehlen von Tetracyclin an tOp bindet und die Transkription des p53-Expressionskonstrukts aktiviert. Die Zugabe von Tetracyclin inaktiviert die tTA-DNA-Bindung und unterdrückt dadurch die p53-Expression. Das Entfernen von Tetracyclin aus dem Zellkulturmedium führt somit zu einer deutlichen Akkumulierung von p53-Protein. Man selektierte und vemehrte die unterschiedlichen Klone Saos-2-A3 und Saos-2-D4, die eine Tetracyclin-regulierte Expression der beiden mutierten p53-Proteine (p53N247I beziehungsweise p53V143A) zeigen. 1B zeigt die regulierte Expression von p53 in diesen Zellen bei 37°C nach Entfernen von Tetracyclin aus dem Kulturmedium. Die Hintergrundexpression ist in der Zelllinie Saos-2-D4 praktisch nicht nachweisbar. Bei -D4H- Zellen ist die Induktion von p53 > 20-fach und bei Saos-2-A3-Zellen etwa 5-fach (1B), wobei die höchsten induzierten Werte von p53 in beiden Zelllinien vergleichbar sind (1B).
  • 3. Funktionale Aktivität von ts-p53-Mutanten.
  • Anschließend transfizierte man sowohl die Zelllinie Saos-2-A3 als auch die Zelllinie Saos-2-D4 mit einem Luciferase-Reporter-Konstrukt, das zwei Kopien der RGC-p53-Bindungssequenzen enthielt [Kern, S. E. et al., Science 252, 1708–711 (1991)]. Man selektierte auf stabile Klone, die ein integriertes Reporterkonstrukt trugen, Saos-2-A3B und Saos-2-D4H, und charakterisierte die p53-abhängige Luciferase-Induktion. Die Luciferase-Expression wurde nach Ändern der Temperatur hin zur erlaubten Temperatur (30°C) bestimmt. Saos-2-A3B und -DH4-Zellen, die ohne tet kultiviert wurden, zeigten eine starke Induktion bei Inkubation bei 30°C (2A). Die Induktion erfolgt schnell und ergibt bei Saos-2-A3B- bzw. Saos 2-D4H-Zellen eine 6- beziehungsweise 10-fache Steigerung nach 4 Stunden und eine 10- beziehungsweise 200-fache Induktion nach 24-stündiger Inkubation, was zeigt, dass diese menschlichen ts-mutierten p53-Proteine tatsächlich die sequenzspezifischen Transaktivierungsfunktionen von wt p53 nachahmen können. In Gegenwart von Tetracyclin wurde in Saos-2-D4H-Zellen keine Induktion nachgewiesen, und in Saos-2-A3B-Zellen wurde eine schwache Induktion nachgewiesen, die möglicherweise auf einer niedrigen Hintergrundexpression von p53 beruhte (1B).
  • Obwohl diese Experimente zeigten, dass mutierte p53-Proteine bei Rückführung zu einem wt-ähnlichen Phänotyp die Genexpression von einem exogenen, ein auf p53 ansprechendes Element tragenden Promotor in einer künstlichen Situation aktivieren können, war es unklar, ob diese mutierten p53-Proteine tatsächlich endogene Genexpression aktivieren konnten. 2B zeigt, dass die Inkubation von Saos-2-D4H-Zellen (welche die p53-Mutante V143A tragen) bei 30°C mit einer deutlichen Induktion des endogenen hdm-2-Gens in einer p53-abhängigen Weise einhergeht. RNA wurde aus -D4H-Zellen isoliert, die mit oder ohne Tetracyclin gewachsen waren und über verschiedene Zeiträume bei 30°C inkubiert worden waren, und über Northern Blot-Analyse charakterisiert. Die Induktion der hdm-2-mRNA-Mengen war 8 Stunden nach der Temperturveränderung am stärksten (10-fach, 2B). Die anschließende schnelle Abnahme der hdm-2-mRNA-Mengen kann teilweise auf der schnellen, in diesem Zeitraum auftretenden Abnahme der p53-Expression beruhen. Die p53-RNA-Mengen nehmen nach der Temperaturveränderung auf 30°C schnell ab (Daten nicht gezeigt), was ein Ergebnis der Temperaturverringerung und der damit einhergehenden Verringerung der Transkriptionsaktivität sein könnte, und/oder der Effekt eines p53-vermittelten negativen Rückkopplung.
  • 4. Identifizierung neuartiger p53-regulierter Gene:
  • Die oben beschriebenen Experimente legten nahe, dass die Zelllinie Saos-2-D4H ein brauchbares Hilfsmittel für die Isolierung p53-regulierter Gene darstellen würde. Dafür wurde RNA 8 Stunden nach einer Temperaturveränderung aus Zellen gewonnen, die unter 3 verschiedenen Bedingungen gehalten wurden, die bezeichnet werden als: p53 „Null" (inkubiert mit tet bei 30°C), „Wildtyp" (inkubiert ohne tet bei 30°C) und „mutiert" (inkubiert ohne tet und bei 37°C gehalten). Die Vorgehensweise, die für die Anreicherung von Sequenzen verwendet wurde, die durch Wildtyp-ähnliches p53, d.h. Temperatur-revertiertes p53V143A, induziert werden, basierte auf einer durch PCR getriebenen Bibliothek-Substraktionsmethode [Wang, Z. et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA 88, 11505–11509 (1991)] (für Einzelheiten wird auf Materialien und Methoden oben verwiesen). Kurz zusammengefasst stellte man aus den drei RNA-Populationen cDNA her, verdaute mit den Restriktionsenzymen RsaI oder HaeIII und amplifizierte nach Zugabe von Linkern über PCR, wodurch man das Ausgangs-cDNA-Bibliotheksmaterial erhielt. Der Treiber wurde hergestellt, indem man Photobiotin an die „Null"- und „mutierten"-PCR-Fragmente koppelte, die dann bei 20-fachem molarem Überschuss mit „Wildtyp"-Fragmenten (tracer) in einer Hybridisierungsmischung inkubiert wurden. Nach ausgiebiger Inkubation entfernte man die Hybride und führte mit dem verbleibenden nicht-hybridisierten Material einen zweiten Hybridisierungszyklus durch. Nicht-hybridisiertes Material amplifizierte man über PCR, wodurch man das angereicherte Material der ersten Runde herstellte. Dieses reicherte man durch zwei zusätzliche Zyklen des Treibens weiter an. Das hochregulierte Material war ausreichend angereichert, um unter Verwendung der angereicherten Sonde der dritten Runde über Koloniehybridisierung charakterisiert zu werden.
  • 5. Identifizierung von p53-regulierten Transkripten mit mittlerer Häufigkeit.
  • Alle Kolonien, die stark mit der angereicherten Sonde der dritten Runde hybridisierten, bestanden aus einem cDNA-Fragment, das als W4.5 bezeichnet wurde. Northern Blot-Analyse unter Verwendung der markierten W4.5-Sonde zeigte eine stark hybridisierende mRNA mit einer Größe von etwa 2,2 kb, die in „Null"- und „mutiert"-p53-exprimierenden Zellen vorlag, und die nach Überführen der Zellen auf die zulässige Temperatur von 30°C („Wildtyp"-Status) stark induziert wurde. 8 Stunden nach der Temperaturveränderung wurde ein 15-fache Induktion erreicht (3). Ähnlich dem für die Induktion von hdm-2-mRNA beobachteten Profil (siehe 2B) nahmen die mRNA-Mengen danach ab. Bei einer Suche in der Genbank-Datenbank entdeckte man anfänglich keine DNA-Sequenzhomologien zu W4.5. Während die Erfinder jedoch dieses neuartige Gen detailliert charakterisierten, erschien eine Veröffentlichung (EI Deiry, W. S. et al., Cell 75, 817–825 (1993)], welche die Identifizierung eines p53-induzierten Gens beschrieb, das ein neuartiges Transkript von etwa 2,1 kb kodierte und als WAF1 bezeichnet wurde. Ein Sequenzvergleich zeigte, dass die DNA-Sequenz von W4.5 zu der Sequenz eines RsaI-Restriktionsfragments von 466 bp identisch war, das in der 3'-nicht translatierten Region der veröffentlichten cDNA-Sequenz von WAF1 vorlag. Die unabhängigen Klonierungsversuche der Erfinder bestätigen, dass WAF1 ein p53-reguliertes Gen ist, und zeigen, dass es auch durch ein Temperatur-revertiertes menschliches p53V143A-Mutanten-Protein effizient induziert wird. Beurteilt auf der Grundlage der Häufigkeit des W4.5-Fragments in dem ursprünglichen cDNA-Bibliothek-Ausgangsmaterial und der Intensität der hybridisierenden mRNA-Spezies in Northern Blots im Vergleich zur Intensität des β-Actin-mRNA-Transkripts (in großer Häufigkeit vorhanden, etwa 0,5% der Gesamt-mRNA-Population), gehört das W4.5 kodierende Transkript zu einer Klasse von Transkripten, die mit mittlerer Häufigkeit transkribiert werden (0,1–0,05% der mRNA, auf der Grundlage des Vergleichs mit β-Actin).
  • Die Vorgehensweise der Bibliothekssubtraktion auf Grundlage von PCR tendiert zur effizienten Anreicherung der häufigsten und differentiell exprimierten Transkripte. Zur Anreicherung weniger häufiger, aber regulierter cDNA-Sequenzen wurden W4.5-Fragmente aus der angereicherten cDNA-Bibliothek ausgetrieben. Dies führte zur Identifizierung von zwei nicht-überlappenden cDNA-Fragmenten W5.5 und B26. Sowohl W5.5 und als auch B26 hybridisierten auf Northern Blots mit einem regulierten Transkript einer Größe von etwa 6 kb (Daten nicht gezeigt). Eine Sequenzanalyse zeigte, dass W5.5 identisch ist mit einer Sequenz, die in der veröffentlichten hdm-2-cDNA-Sequenz vorkommt. Die Sequenzanalyse von B26 zeigte keine Sequenzhomologie mit der veröffentlichten, partiellen hdm-2-cDNA-Sequenz. Jedoch stellten die Erfinder bei Verwendung einer genomischen DNA von einem menschlichen Tumor, für den zuvor eine Amplifizierung des hdm-2-Gens festgestellt worden war (erhalten von A. J. Levine, Princeton University, Princeton, NJ) über Southern Blot-Analyse das Vorliegen eines amplifizierten genomischen DNA-Fragments fest. Sie schlussfolgerten, dass B26 das zweite idenfizierte Fragment für hdm-2 darstellt und höchstwahrscheinlich durch nicht-translatierte Regionen innerhalb des Gens kodiert wird, die zuvor nicht kloniert worden waren. Ähnlich den mit der W4.5-Sonde erhaltenen Ergebnissen gehört das hdm-2-Transkript zur Klasse der Transkripte in diesen Zellen, die mit mittelerer Häufigkeit vorliegen.
  • 6. Identifizierung von neuen p53-regulierten Transkripten mit geringer Häufigkeit
  • Nach wiederholtem Bibliothek-Screening identifizierte man einzelne Klone für die zwei nicht-überlappenden cDNA-Fragmente, A26 und A28. Nach Hybridisierung mit dem Ausgangsmaterial schienen beide Fragmente kodiert zur sein durch Transkripte, die mit niedriger Häufigkeit vorkamen, aber reguliert waren. Dies wurde über Northern Blot-Analyse bestätigt. Wegen der extrem niedrigen Häufigkeit dieser Transkripte (< 0,005% der Gesamt-mRNA, auf der Grundlage eines Vergleichs mit β-Actin) gewann man polyadenylierte RNA aus -D4H-Zellen, die bei Fehlen von Tetracyclin kultiviert worden waren und 7 Stunden bei 37°C oder 30°C gehalten worden waren.
  • Eine Northern Blot-Analyse unter Verwendung der Sonde A28 zeigte eine hybridisierende mRNA mit etwa 2,5 kb, die durch Temperaturveränderung in einer p53- abhängigen Weise induziert wird (4, Spur 1 im Vergleich mit Spur 2). In Gegenwart von Tetracyclin wurde keine Induktion festgestellt (Daten nicht gezeigt). Die Größe der mRNA unterscheidet sich von anderen charakterisierten, p53-aktivierten Transkripten und scheint durch ein neuartiges reguliertes Gen kodiert zu sein. Bei Suche in der Genbank-Datenbank entdeckte man keine Sequenzhomologien (Daten nicht gezeigt). Dass die A28-Sequenz kodierende Gen scheint ein direkt auf p53 ansprechendes Gen zu sein. Dies wurde in Zellen untersucht, die man wie zuvor behandelte, wobei man jedoch den Proteinsyntheseinhibitor Cycloheximid (chx, 10 μg/ml) 30 Minuten vor der Temperaturveränderung zugab (die Behandlung mit chx führte zu > 95% Inhibition der Proteinsynthese gemäß 35S-Methionin-Markierung der Zellen, Daten nicht gezeigt). Die Behandlung mit chx steigerte die Hintergrundmengen (nicht-induziert) des A28-kodierten Transkripts, verhinderte jedoch nicht die p53-abhängige Induktion dieses Transkripts (12-fache Induktion, 4, Spur 3 im Vergleich mit Spur 4). Durch chx vermittelte RNA-Stabilisierung, die als Superinduktion bezeichnet wird, wurde für eine Reihe von RNA-Spezies beobachtet und besonders gut für die „immediate-early serum response genes" charakterisiert [Lau, F. L. und Nathans, D., (1991). Hormonal Control: Regulation of Gene Transcription (Cohen, P. und Faulks, J. G. Hrsg.), S. 757–793, Elsevier Sciences Publishers, London]. Wie zuvor vorgeschlagen könnten das Fehlen einer Rückkopplungsinhibition oder der Umsatz labiler Inhibitoren für diese Stabilisierung sorgen.
  • Die Sonde A26 wies in der Northern Blot-Analyse zwei RNA-Spezies mit einer Größe von etwa 3 und 4 kb nach. Beide RNA-Spezies werden spezifisch in einer p53-abhängigen Weise bei Temperturveränderung von -D4H-Zellen induziert (5-fach, 4, Spur 1 im Vergleich mit Spur 2). In Gegenwart von Tetracyclin stellte man keine Induktion fest (Daten nicht gezeigt). Obwohl es reguliert ist, ist es gegenwärtig jedoch unklar, ob A26 durch ein direkt auf p53 ansprechendes Gen kodiert wird. In chx-behandelten Zellen liegt das basale A26 kodierende Transkript ebenfalls vermehrt vor, jedoch beobachtete man im Gegensatz zu dem A28-kodierten Transkript keine Induktion bei anschließender Temperaturveränderung (4, Spur 3 im Vergleich mit Spur 4). Vorläufige Sequenzinformationen zeigen, dass A26 ebenfalls durch ein neuartiges Gen kodiert wird (Daten nicht gezeigt).
  • 7. Die Induktion neuer p53-regulierter Transkripte korreliert mit p53-induzierter Apoptose.
  • Zur Ergänzung der Untersuchungen der Erfinder über die Regulierung der A28 und A26 kodierenden Transkripte in Saos-2-Zellen, deren Wachstumsrate nach Induktion von Wildtyp-ähnlichem p53 als Konsequenz einer Temperaturveränderung verringert, aber nicht aufgehoben wird (Daten nicht gezeigt), untersuchten die Erfinder die Regulation dieser Transkripte in einer Colorectalkarzinom-Zelllinie (EB), die ein induzierbares Wildtyp-p53-Gen trägt. In diesen EB-Zellen steht die Expression von wt p53 unter der Kontrolle eines Metallothionein-Promotors, der durch Metallionen wie beispielsweise Zink oder Cadmium aktiviert wird [Shaw, P. et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA 89, 4495–4499 (1992)]. Die Expression von p53 in diesen Zellen führt sowohl in Kultur als auch bei in Tieren etablierten Tumoren zu Apoptose [Shaw, P. et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA 89, 4495–4499 (1992)]. Man gewann polyadenylierte RNA aus kultivierten Ausgangs-EB-Zellen und klonalen EB1-Zellen (die das wt p53-Gen tragen), die ohne oder mit Cadmium (6 μM) 10 Stunden inkubiert worden waren. Eine Northern Blot-Analyse zeigte, dass das A28 kodierende Transkript stark und spezifisch in Cadmium-behandelten p53-positiven klonalen EP1-Zellen induziert wird (> 20-fach, 5). In ähnlicher Weise wurden mit der Sonde A26 hybridisierende Transkripte induziert (5-fach, 5). Interessanterweise haben die wesentlichen, durch die A26-Sonde nachgewiesenen RNA-Spezies eine Größe von etwa 2 und 3 kb, im Vergleich mit etwa 3 und 4 kb bei Saos-2-D4H-Zellen. Nach längerem Kontakt ist auch eine RNA-Spezies von etwa 4 kb nachweisbar (Daten nicht gezeigt). Eine mögliche Erklärung für diese Ergebnisse besteht darin, dass das A26 kodierende Gentranskript in verschiedenen Zelltypen alternativ gespleißt wird. Die WAF1/CIP1/p21-mRNA wurde unter diesen Bedingungen 8-fach induziert (5). Actin-mRNA wurde nicht induziert, und in EB1-Zellen, die mit oder ohne Cadmium behandelt worden waren, stellte man ähnliche Mengen fest (5).
  • C. Diskussion
  • Die starke Korrelation zwischen der Fähigkeit von p53 zur Bindung von DNA und der Aktivierung der Transkription in einer sequenzspezifischen Weise und dessen Fähigkeit zur Unterdrückung des Zellwachstums oder der Induktion von Apoptose legt nahe, dass p53-induzierte Gene eine wesentliche Rolle bei der Vermittlung der Funktion von p53 als Tumorsuppressor spielen können. In der vorliegenden Untersuchung strebten die Erfinder die Isolierung und Charakterisierung solcher potentieller Effektoren im p53-Signalweg an. Dies führte zu der Isolierung von früher identfizierten p53-regulierten Genen und ebenso zu der Identifizierung zusätzlicher, neuartiger p53-regulierter Transkripte.
  • Die Strategie der Erfinder beinhaltete die Etablierung genetisch veränderter menschlicher Saos-2-Osteosarkomzellen (die defizient sind für die endogene p53-Expression), welche induzierbare Gene tragen, die temperatur-sensitive (ts) Mutanten von p53 kodieren. Unter Verwendung eines Tetracyclin-regulierten Expressionssystems, das von Gossen und Bujard entwickelt worden war [Gossen, M. und Bujard, H., Proc. Natl. Acad. Sci. US 89, 5547-5551 (1992)], etablierte man stabile Zelllinien, die ein integriertes p53-Gen enthalten, welches eine der beiden, natürlich auftretenden onkogenen Mutanten von p53, p53N247I und p53V143A, kodieren. p53 wird durch Tetracyclin streng reguliert, und bei Temperaturveränderung (von 37°C auf 30°C) aktivieren beide mutierten Proteine effizient und spezifisch ein integriertes Luciferase-Reporter-Konstrukt, das zwei Kopien des auf p53 ansprechenden Elements RGC enthält [Kern. S. E. et al., Science 252, 1708–1711 (1991)], und das endogene hdm-2-Gen. Es wurde früher gezeigt, dass die p53N2471-Mutante temperatursensitiv für die Transaktivierung als GAL4-Fusionsprotein ist [Unger T. et al., EMBO J. 11, 1383–1390 (1992)]. Die Ergebnisse der Erfinder bestätigen, dass diese Mutante ts-Eigenschaften zeigt, wenn sie auf regulierte Weise als natives Protein exprimiert wird. Weiterhin zeigen die Untersuchungen der Erfinder, dass die p53V143A-Mutante [Baker, S. J. et al., Science, 249, 912–915 (1990)] temperatursensitiv für die Transaktivierung ist und aktiver zu sein scheint als die p53N2471-Mutante in diesen klonalen Saos-2-Zellen. Jedoch wurde die Wildtyp-ähnliche Aktivität nur bei Inkubation der Zellen bei 30°C nachgewiesen, im Gegensatz zu 34°C für die p53N247I-Mutanten-Zellen (Daten nicht gezeigt). Diese Ergebnisse zeigen, dass unterschiedliche p53-Mutanten eine unterschiedliche Sensitivität hinsichtlich ihrer Fähigkeit zur Revertierung zu einem Wildtyp-ähnlichen Phänotyp zeigen können. Untersuchungen unter Verwendung von aufgereinigtem Baculovirus-p53V143A zeigen, dass diese Mutante ts für DNA-Bindung in vitro ist, was anzeigt, dass die Temperatursensitivität eine intrinsische Eigenschaft dieser p53-Mutante ist (Takenaka, Faha und Kley, unveröffentlichte Ergebnisse).
  • Angesichts ihrer Sensitivität für p53-abhängige Transaktivierung wurde die p53V143A-exprimierende Zelllinie Saos-2-D4H verwendet, um neuartige, p53-hochregulierte Transkripte zu isolieren. Die von den Erfindern über eine von Wang und Brown [Wang, Z. und Brown, D. D., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88, 11505–11509 (1992)] beschriebene Selektionsmethode klonierten cDNAs werden durch Transkripte kodiert, die hauptsächlich zu zwei Kategorien gehören, d.h. p53-regulierte Transkripte mittlerer Häufigkeit und geringer Häufigkeit (im Vergleich zu beispielsweise den β-Actin-Transkripten hoher Häufigkeit). Klone, die von den Erfindern als Transkripte mittlerer Häufigkeit isoliert wurden, stellten Sequenzen dar, die von dem kürzlich klonierten WAF1/CIP1/p21-Gen [EI-Deiry, W. S. et al., Cell 75, 817–825 (1993)] kodiert werden, über das während der Charakterisierung der klonierten W4.5-Sonde berichtet wurde, sowie das hdm-2-Gen. Die Erfinder bestätigten somit unabhängig, dass WAF1/CIP1/p21 ein p53-reguliertes Gen ist, und zeigten, dass dessen Aktivierung durch menschliche, temperatur-revertierte mutierte p53-Proteine ausgelöst werden kann. Dies bestätigt weiterhin, dass diese Mutanten-Proteine bei der zulässigen Temperatur wirklich als Wildtyp-ähnliche p53-Proteine fungieren. Von den Erfindern als Transkripte mit niedriger Häufigkeit isolierte Klone (die Expression liegt wenigstens eine Größenordnung geringer als die der WAF1/CIP1/p21- und hdm-2-Transkripte) scheinen durch neuartige p53-regulierte Gene kodiert zu sein. Ein DNA-Fragment, A28, weist eine p53-spezifisch regulierte mRNA von etwa 2,5 kb in Northern Blots nach. Ein weiteres kloniertes cDNA-Fragment, A26, weist zwei p53-spezifisch hochregulierte Transkripte mit einer Größe von etwa 3 kb und 4 kb in Saos-2-D4H-Zellen nach.
  • Obwohl beide Transkripte durch p53 reguliert werden, ist die Induktion hinsichtlich ihrer Sensitivität gegenüber dem Proteininhibitor Cycloheximid unterschiedlich. Definitionsgemäß ist das A28 kodierende Gen ein direkt auf p53 ansprechendes Gen, da für die Induktion keine laufende Proteinsynthese erforderlich ist. Im Gegensatz dazu ist es unklar, ob das A26 kodierende Gen ein direkt ansprechendes Gen ist, da die Induktion durch p53 durch Cycloheximid blockiert wird. Dies kann auf verschiedene Arten interpretiert. werden: 1) das A26 kodierende Gen ist kein direkt ansprechendes Gen, 2) auf Grund der Stabilisierung der A26 kodierenden RNA und der möglichen Aktivierung alternativer Signalwege bei Behandlung mit Cycloheximid kann die direkte Induktion durch p53 verschleiert werden, oder 3) die Kinetik der Induktion des A26 kodierenden Transkripts durch p53 ist vergleichbar mit der anderer direkt ansprechender Gene wie beispielsweise WAF1/CIP1/p21, hdm-2, was nahe legt, dass das A26 kodierende Gen ein direkt ansprechendes Gen sein kann. In diesem Fall würde die direkte Aktivierung durch p53 die Gegenwart eines kurzlebigen Co-Aktivator-Proteins erfordern und würde möglicherweise durch ein DNA-Antwortelement vermittelt, das sich von der p53 20 bp-Consensus-Bindungsstelle unterscheidet [EI-Deiry, W. S. et al., Nature Genetics 1, 45–49 (1992)], wie durch den möglichen Co-Aktivator vorgegeben wird. Die Klonierung und Charakterisierung des Promotors würde dieses Problem angehen.
  • Die vorliegende Untersuchung zeigt, dass p53 mehrere Zielgene in Saos-2-Zellen aktiviert. Es bleibt zu ermitteln, ob die durch Transkripte niedriger Häufigkeit kodierten Proteine besonders starke Wachstumsinhibitoren sein könnten. Tatsächlich verringern Saos-2-D4H-Zellen ihre Wachstumsrate nach Induktion von p53 bei der zulässigen Temperatur nur mäßig (Daten nicht gezeigt). Der Grund dafür ist unklar, kann aber damit zusammenhängen, dass diese Zellen auch negativ sind hinsichtlich der endogenen Expression von RB. Die Erfinder dehnten daher ihre Untersuchungen auf eine unterschiedliche Zellart aus, eine Colorectalkarzinom-Zelllinie (EB-Zellen), für die nach Cadmium-vermittelter Induktion eines integrierten wt p53-Gens sowohl in vitro als auch in vivo als etablierter Tumor Apoptose gezeigt wurde [Shaw, P. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89, 4495–4499 (1992)]. Die Ergebnisse der Erfinder zeigen, dass die WAF1/CIP1/p21-RNA und die A28 und A26 kodierenden Transkripte nach Induktion von wt p53 effizient und spezifisch vermehrt werden. Die Induktion war bei der A28 kodierenden RNA deutlicher als bei den WAF1/CIP1/p21 und A26 kodierenden RNAs. Da die Induktion dieser Transkripte in einer Zellart auftritt, die p53-vermittelte Adoptose vollzieht, ist es möglich, dass die kodierten Proteine nachgeordnete Effektoren des p53-Signalwegs darstellen, die am programmierten Zelltod beteiligt sind. Weitere Analysen sind erforderlich, um diese Möglichkeit zu untersuchen.
  • Zusammengefasst zeigen die Erfinder, dass p53 über dessen Fähigkeit, als Transkriptionsaktivator zu fungieren, mehrere Signalwege aktivieren kann. Die Aktivierung mehrerer Effektoren kann somit bei der Vermittlung der Funktionen von p53 als Tumorsupressor beteiligt sein.
  • BEISPIEL II
  • Klonierung und Analyse von cDNA voller Länge, die dem A28-cDNA-Fragment entspricht
  • Von einem spezifischen cDNA-Fragment, das als A28 bezeichnet wurde (siehe Beispiel I), wurde gezeigt, dass es ein p53-reguliertes Transkript von etwa 2,5 kb erkennt. Diese Sonde wurde für die Klonierung der entsprechenden cDNA voller Länge verwendet. Die cDNA wurde sequenziert und das vorhergesagte kodierte Protein identifiziert.
  • A. Klonierung von cDNA, die dem A28-cDNA-Fragment entspricht.
  • Man hybridiserte polyadenylierte RNA mehrerer menschlicher Gewebe enthaltende Northern Blots (bezogen von Clonetech, Palo Alto, CA) mit dem A28-cDNA-Fragment (Northern Blot-Analyse wie oben in Beispiel I beschrieben). Diese Analyse zeigte, dass alle Gewebe, möglicherweise mit Ausnahme von Leukozyten des peripheren Bluts, unterschiedliche Mengen eines Transkripts exprimierten, das A28 entsprach und eine Größe von etwa 2,5 kb aufwies (8). Eine starke Expression wurde im Gehirn nachgewiesen.
  • Eine cDNA-Bibliothek des menschlichen Gehirns wurde von Stratagene bezogen (La Jolla, CA). Man screente 1 × 106 Phagen unter Verwendung einer 32P-markierten A28-Sonde (1 × 106 cpm/ml) unter den vom Hersteller (Stratagene) der Bibliothek beschriebenen Bedingungen mit den folgenden Modifizierungen. Die Hybridisierungslösung war: 50% Formamid, 5 × SSPE (1 × SSPE = 0,15 M NaCl, 0,01 M NaH2PO4, 1,25 mM EDTA, pH 7,4), 5× Denhardt's Lösung [Hrsg. Ausubel et al., In Current Protocols In Molecular Biology, John Wiley and Sons Publishers, New York, NY (1998)], und 50 μg/ml denaturierte Heringssperma-DNA. Man führte die Hybridisierung durch, indem man bei 42°C über Nacht inkubierte. Man wusch die Blots 3 mal 15 Minuten mit einem Überschuss an Waschpuffer (2 × SSPE, 1% SDS) bei Raumtemperatur und anschließend 15 Minuten in 0,2 × SSPE, 0,1% SDS bei 65°C.
  • Man reinigte die hybridisierenden Plaques über eine zweite Screening-Runde. Drei Klone, die cDNAs von 1,5 bis 2,0 kb enthielten, wurden weiter analysiert. Den längsten Klon, A28-15B gewann man als ein pBluescript-Plasmid (in den von Stratagene bereitgestellten Methoden beschrieben). Man sequenzierte A28-15B unter Verwendung vektorspezifischer Primer (T3, T7, KS, SK, siehe Bluescript, Stratagene) und genspezifischen Primer (9). A28-15B entsprach 1969 Nukleotiden (415–2383 der in 6 [SEQ ID NO: 1] gezeigten Sequenz. Auf Grund des Größenunterschieds zu Northern Blots und der Tatsache, dass die Sequenz mitten in dem möglichen offenen Leserahmen begann, schien bei A28-15B kein Fragment voller Länge vorzuliegen.
  • B. 5' RACE von A28-Sequenzen
  • Um die fehlende 5'-Sequenz zu erhalten, führte man unter Verwendung eines von Clonetech bezogenen Kits eine Technik durch, die auf einer Kombination von revers transkribierter RNA, Primer-Ligation mit einzelsträngigem Anker und PCR mit vernetzten Primern beruhte (kollektiv als 5' RACE bezeichnet). Das Protokoll gemäß den Anweisungen des Herstellers wurde eingehalten und ist nachfolgend kurz beschrieben. Man führte mit polyadenylierter RNA von EP1-Zellen (in Beispiel I oben beschrieben) eine reverse Transkription unter Verwendung von LB57-Primer durch (9). Man ligierte den Anker mit der Erststrang-cDNA. Eine sequenzielle PCR führte man dann mit dem Anker-Primer und LB57, und dann mit dem Anker-Primer und LB44 durch (9). Man erhielt ein Produkt von etwa 1000 Basenpaaren und sequenzierte mit dem Anker und LB50 wie oben beschrieben. Die mit A28-B15 überlappende Sequenz war identisch, erstreckte sich aber auch etwa 415 Basen weiter in Richtung 5' (6 und 9). Man sequenzierte dieses Produkt, und die erhaltene Information sagte voraus, dass es die Stelle des Translationsstarts und die fehlende kodierende Region des Proteins enthielt (siehe unten). Darüber hinaus legte bei Vergleich des 5' RACE-Produkts mit der Sequenz von A28-15B dessen Größe nahe, dass es nahe am Produkt voller Länge lag.
  • C. Konstruktion eines A28-Klons voller Länge
  • Der Teil-cDNA-Klon von A28-15B enthält eine einzige BglII-Restriktionsschnittstelle, die sich 16 Nukleotide von dessen 5'-Ende befindet. Daher verdaute man A28-15B mit BglII und SmaI, die nur in dem Polylinker vorlagen (alle Restriktionsenzyme bezog man von Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN, und verwendete sie gemäß den Angaben des Herstellers). Man verdaute das PCR-5' cDNA-Fragment mit BglII und klonierte in das verdaute A28-15B, wodurch man pBS-A28 erhielt. Die korrekte Insertion verifizierte man durch Sequenzierung. Die Sequenz des konstruierten Klons voller Länge ist in 6 dargestellt [SEQ ID NO: 1]. Alle über PCR erzeugten Sequenzen verifizierte man auch über Sequenzierung der entsprechenden genomischen Sequenz, die von einem Cosmid-Klon abgeleitet wurde, für den das ursprüngliche A28-cDNA-Fragment nachgewiesen wurde. Das Plasmid pBS-A28.7 in einer Escherichia coli-Wirtszelle (Stamm D45a) wurde am 29. Juni 1994 gemäß dem Budapester Vertrag bei der American Type Culture Collection, Rockville, Maryland, hinterlegt und dem Stamm die ATCC-Zugangs-Nr. 69649 zugewiesen. Bei Erteilung eines Patents der Vereinigten Staaten werden alle Beschränkungen hinsichtlich der Verfügbarkeit der hinterlegten Zelllinie für die Öffentlichkeit unwiderruflich aufgehoben. Die Hinterlegung wird ersetzt, wenn von der Verwahrungsstelle keine lebensfähigen Proben ausgegeben werden können.
  • D. Analyse der A28-cDNA voller Länge
  • Das von der A28-cDNA als kodiert vorhergesagte Protein weist 202 Aminosäuren auf (7 [SEQ ID NO: 2]) und wird hiermit als PIGI-1-Protein geführt. Das abgeleitete Protein beginnt mit dem initiierenden Methionin (ATG) bei Nukleotid 93 und setzt sich bis zu dem Stopcodon (TGA) bei Nukleotid 740 fort. Dem ATG gehen Sequenzen voraus, die mit Translationsstartstellen in Zusammenhang stehen [Kosak, M., Nucl. Acids Res. 20, 8125–8132 (1987)]. Das abgeleitete Protein weist eine starke Aminosäurehomologie mit zwei abgeleiteten Proteinen ähnlicher Größe, aber unbekannter Funktion auf, die in GenBank vorliegen (HUMGOS8PPC, 44,3% Identität über 185 Aminosäuren, und Hslr20rna, 48,3% über 147 Aminosäuren).
  • E. Expression von PIGI-1-Sense- und -Antisense in vitro und in vivo.
  • Man klonierte PIGI-1-cDNA voller Länge in einen eukaryotischen/prokaryotischen Expressionsvektor, pCDNA3 (Invitrogen, San Diego, CA). Dies erreichte man durch Subklonieren der von EcoRI flankierten cDNAs von pBS-A28 (die 3'-EcoRI-Stelle war die ursprüngliche Klonierungsstelle für die cDNA-Bibliothek und die 5'-EcoRI-Stelle wurde durch den Anker-Primer bei der 5' RACE erzeugt) in pCDNA3 (Invitrogen, San Diego, CA). Kurz zusammengefasst trennte man das 2,4 EcoRI-Fragment in einem 0,8%-Agarosegel vom Vektor und reinigte die ausgeschnittene DNA-Bande über Gene Clean (Bio101, La Jolla, CA). Man bereitete den pCDNA3-Vektor durch Verdau mit EcoRI und anschließende Behandlung mit intestinaler Phosphatase des Kalbes (Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN) und Aufreinigung über Gene Clean vor. Man mischte das Insert mit Phosphatasebehandeltem Vektor in einem molaren Verhältnis von 5:1 und ligierte 1 Stunde bei 14°C mit T4 DNA-Ligase (Boehringer Mannheim). Zur Transformation kompetenter E. coli Stamm verwendete man 10 ng ligierte DNA DH5a gemäß den Anleitungen des Herstellers (GibcoBRL Life Technologies, Grand Island, NY). Man selektierte die Rekombinanten auf LB-Ampillicin-Platten [Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, NY (1982)]. Die Rekombinanten wurden analysiert, indem man unter Verwendung von Quiagen Plasmidaufreinigungssäulen (Quiagen, Chatsworth, CA) in Flüssigkulturen hergestellte Plasmide herstellte und entweder mit ApaI oder BamHI verdaute, um diagnostisch die Orientierung festzustellen (beide Enzyme schneiden den Vektor und das Insert jeweils einmal), wodurch man pCDNA3-PIGI-1 und pCDNA3-PIGI1-AS (Antisense) erhielt.
  • Man verwendete diese Plasmide als Template für die Erzeugung von RNA und anschließend Protein, indem man eingekoppeltes in vitro-Transkriptions-/Translationssystem gemäß den Anleitungen des Herstellers verwendete (TNT, Promega, Madison, WI). Man verwendete (gemäß den Herstellerangaben, Promega) 35S-Methionin (Amersham, Arlington Heights, IL) für die Markierung der in vitro-Translationsprodukte, die man auf einem SDS- Polyacrylamidgel (Novex, San Diego, CA) auftrennte und nach Kontakt mit Phosphorimaging-Platten (Fuji, Stamford, CT) sichtbar machte. Bei Extrakt nach Zugabe von pCDNA-PIGI-1 wies man ein Produkt von etwa 23 kd nach (10). Dies liegt nahe an der vorhergesagten Größe von 22,7 kd. Das Extrakt nach Zugabe von Antisense zeigte kein spezifisches Proteinprodukt. Mit dem PIGI-1-Antisense-Expressionsvektor (pCDNA3-PIGI-1AS) stellte man kein Translationsprodukt fest.
  • Bei Translationsreaktionen nach Zugabe der verkürzten Form A28-15B wies man ein Produkt von etwa 8 kd nach. A28-15B beginnt bei Nukleotidposition 416 von PIGI-1 voller Länge, und es liegt ein ATG bei Nukleotid 493 vor, das den Initiationsregeln von Kozak entsprechen zu scheint; jedoch würde dies nur ein Peptid von 5 Aminosäuren kodieren, bevor ein Stopcodon erreicht wird, und ist somit nicht für das beobachtete Produkt verantwortlich. Das nächste mögliche initiierende Methionin (ATG) befindet sich bei Position 517, entspricht den Regeln von Kozak, liegt im Leserahmen des vorhergesagten PIGI-1-Proteins und kodiert abgeleitet die 61 C-terminalen Aminosäuren. Die Größe dieses Produkts würde 7,4 kd betragen und stimmt mit der Größe des beobachteten in vitro-Translationsprodukts überein, das durch nach Zugabe von pCDNA3-A2815B hergestellt wird.
  • F. PIGI-1-Protein unterdrückt das Wachstum von Tumorzellen.
  • Es wurde gezeigt, dass PIGI-1-Protein direkt durch p53 induziert wird. Da p53 ein bekannter Tumorsupressor ist, der erwiesenermaßen wenigstens zwei Gene, WAF1/p21 und Gadd45 reguliert, die ihrerseits wachstumshemmende Eigenschaften aufweisen, untersuchte man die Wirkungen von PIGI-1 auf das Wachstum von menschlichen Tumorzellen. Man transfizierte die eukaryotischen Expressionsvektoren pCDNA3-PIGI-1, pCDNA3-PIGI-1AS, Wildtyp-p53 oder den Vektor pCDNA3 unter Verwendung kationischen Lipids (Lipofectamine, Gibco, Grand Island, NY) in EB-Colonkarzinomzellen (erhalten von Dr. Phillip H. Shaw, Institut de Pathologie, Lausanne, Switzerland), HeLa Cervixcarzinom- oder Saos-2-Osteosarkom-Zelllinien (beide bezogen von ATCC, Rockville, MD). Man kultivierte die Zellen in Gegenwart von G418 und beurteilte die Kolonien nach etwa zweiwöchiger Selektion. Die Ergebnisse mit A28-15B legen nahe, dass die 61 carboxyterminalen Aminosäuren des PIGI-1-Proteins ebenfalls eine Unterdrückung von Tumorzellwachstum zu vermitteln vermögen (Daten nicht gezeigt)
  • Übereinstimmend mit dessen Tumorsupressor-Funktion beobachtete man eine starke Verringerung des Wachstums aller mit p53 transfizierten Zelllinien, die von 88–100% Verringerung bei der Koloniebildung im Vergleich mit dem Kontrollplasmid pCDNA3 reichte (Tabelle 1). Die Expression der PIGI-1-RNA führt ebenfalls zu einer Verringerung des Wachstums von Tumorzellen des Menschen, Saos-2 und EB (97 bzw. 82%), wie auch von Tumorzellen anderer Säugetierarten, COS7-Zellen des Affen und NIH 3T3-Zellen der Maus (61 bzw. 90% Wachstumshemmung durch PIGI-1). Die Expression von Antisense-PIGI-1 (PIGI-1-AS) hatte keinen nennenswerten Effekt auf das Wachstum von COS7-Zellen (110% des Vektors), schien aber in den menschlichen Linien Saos-2 und EP tatsächlich einen leichten Wachstumsvorteil zu verschaffen (200% bzw. 179%). Dies kann anzeigen, dass Antisense-PIGI-1 endogene PIGI-1-mRNA inhibiert (Stabilität oder Expression), womit weiter angezeigt wird, dass endogenes PIGI-1 an zellulären Wachstumsfunktionen beteiligt ist.
  • In Übereinstimmung mit der Rolle von p53 bei der Antwort auf DNA-Schäden fand man, dass, vergleichbar mit WAF1 [EI-Deiry et al., Cancer Res. 54, 1169–1174 (1994)), PIGI-1 durch DNA-schädigende Mittel wie beispielsweise Adriamycin oder Ultraviolett-Bestrahlung induziert wird (Daten nicht gezeigt), und dass diese Induktion mit dem p53-Status der Zelle korreliert. Die Aktivierung von PIGI-1 könnte daher einen wichtigen Schritt bei der zellulären wachstumshemmenden und/oder apoptotischen Antwort auf DNA-Schäden darstellen. Weiterhin können neuartige Chemotherapeutika, die auf PIGI-1 gerichtet sind, herkömmliche chemotherapeutische Wirkstoffe ersetzen, die direkt oder indirekt auf p53 gerichtet sind. Diese neuartigen Chemotherapeutika sollten selbst in Tumorzellen wirksam sein, denen die Expression von normalem p53 fehlt.
  • Figure 00340001
  • Man transfizierte Zellen in Gewebekultur (3 × 105 pro Well) mit dem angegebenen Plasmidkonstrukt (2 μg) und selektierte etwa 2 Wochen in G418 enthaltendem Medium (500 U/ml, wobei jedoch bei EB-Zellen 800 U/ml verwendet wurden). Man wusch die Zellen und färbte sie mit Formalin-Kristallviolett. Die Nummern stellen die durchschnittliche Fraktion überlebender Kolonien im Vergleich mit Zellen dar, die mit dem Kontrollplasmid pCDNA3 transfiziert waren (die Transfektionen wurden 3 mal in zweifachen Wells wiederholt, wobei unterschiedliche DNA-Präparationen verwendet wurden, wobei jedoch Antisense zweifache Transfektionen darstellt). Der Bereich der Fraktion überlebender Kolonien ist in Klammern angegeben. ND bezeichnet „nicht durchgeführt".
  • SEQUENZPROTOKOLL
    Figure 00350001
  • Figure 00360001
  • Figure 00370001
  • Figure 00380001

Claims (17)

  1. Isoliertes Polypeptidmolekül, umfassend i) die in 7 [SEQ ID NO: 2) gezeigte Aminosäuresequenz des auf p53 ansprechenden Proteins PIGI-1, oder ii) eine Allelvariante der Sequenz, worin eine oder mehrere Aminosäuren deletiert, substituiert, insertiert, invertiert oder hinzugefügt sind, wobei das die Allelvariante der Sequenz umfassende Polypeptid die wachstumshemmende Eigenschaft des auf p53 ansprechenden Proteins PIGI-1 hat.
  2. Isoliertes Polypeptidmolekül, umfassend die Sequenz der Aminosäuren 142–202 der in 7 gezeigten Aminosäuresequenz des auf p53 ansprechenden Proteins PIGI-1.
  3. Isoliertes Polypeptidmolekül, erhältlich durch Expression einer Nukleinsäuresequenz, die ein Polypeptidmolekül nach Anspruch 1 oder 2 kodiert.
  4. Isoliertes Nukleinsäuremolekül, das ein Polypeptidmolekül nach einem der Ansprüche 1 bis 3 kodiert.
  5. Nukleinsäuremolekül nach Anspruch 4, nämlich ein DNA-Molekül.
  6. DNA-Molekül nach Anspruch 5 mit der in 6 [SEQ ID NO: 1] gezeigten Nukleotidsequenz.
  7. DNA-Molekül nach Anspruch 5 mit der Sequenz der in 6 [SEQ ID NO: 1) gezeigten Nukleotide 416–2383.
  8. Nukleinsäuremolekül mit einer Nukleinsäuresequenz, die mit einer Nukleinsäuresequenz hybridisiert, welche ein Polypeptidmolekül nach einem der Ansprüche 1 bis 3 kodiert, wobei der Hybridisierungswaschpuffer 0,2 × SSPE, 0,1% SDS ist und die Hybridisierungstemperatur 65°C beträgt.
  9. Nukleinsäuremolekül nach Anspruch 8, nämlich ein DNA-Molekül.
  10. DNA-Molekül mit einer DNA-Sequenz, die zu der DNA-Sequenz nach einem der Ansprüche 5, 6 oder 7 komplementär ist.
  11. Expressionsvektor, umfassend eine DNA-Sequenz, die ein Polypeptidmolekül nach einem der Ansprüche 1 bis 3 kodiert.
  12. Expressionsvektor nach Anspruch 11, worin die DNA-Sequenz die in 6 [SEQ ID NO: 1] gezeigte Nukleotidsequenz hat.
  13. Expressionsvektor nach Anspruch 11, worin die DNA-Sequenz die Sequenz der in 6 [SEQ ID NO: 1] gezeigten Nukleotide 416–2383 hat.
  14. Prokaryotische oder eukaryotische Wirtszelle, die den Expressionsvektor nach einem der Ansprüche 11, 12 oder 13 umfasst.
  15. Verfahren zur Herstellung eines Polypeptidmoleküls nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei man eine Wirtszelle nach Anspruch 14 unter Bedingungen kultiviert, welche die Expression des Polypeptidmoleküls zulassen.
  16. Pharmazeutische Zusammensetzung, umfassend eine pharmazeutisch wirksame Menge eines Polypeptidmoleküls nach einem der Ansprüche 1 bis 3 oder eines Nukleinsäuremoleküls nach einem der Ansprüche 4 bis 10 oder eines Expressionsvektors nach einem der Ansprüche 11 bis 13.
  17. Verwendung eines Polypeptidmoleküls nach einem der Ansprüche 1 bis 3 oder eines Nukleinsäuremoleküls nach einem der Ansprüche 4 bis 10 oder eines Expressionsvektors nach einem der Ansprüche 11 bis 13 zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung zur Behandlung von Tumoren und Krebs.
DE69534733T 1994-07-12 1995-07-10 NEUARTIGE AUF p53 ANSPRECHENDE GENE Expired - Lifetime DE69534733T2 (de)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US08/274,318 US5667987A (en) 1994-07-12 1994-07-12 P53 response genes
US274318 1994-07-12
PCT/US1995/008597 WO1996001907A1 (en) 1994-07-12 1995-07-10 NOVEL p53 RESPONSE GENES

Publications (2)

Publication Number Publication Date
DE69534733D1 DE69534733D1 (de) 2006-03-30
DE69534733T2 true DE69534733T2 (de) 2006-09-14

Family

ID=23047698

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
DE69534733T Expired - Lifetime DE69534733T2 (de) 1994-07-12 1995-07-10 NEUARTIGE AUF p53 ANSPRECHENDE GENE

Country Status (6)

Country Link
US (2) US5667987A (de)
EP (1) EP0804609B1 (de)
AT (1) ATE315087T1 (de)
DE (1) DE69534733T2 (de)
ES (1) ES2256847T3 (de)
WO (1) WO1996001907A1 (de)

Families Citing this family (28)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6020155A (en) * 1991-11-20 2000-02-01 Trustees Of Dartmouth College Nucleic acids encoding CR1 fusion protein, vector, transfected cell and expression
US5670325A (en) * 1996-08-14 1997-09-23 Exact Laboratories, Inc. Method for the detection of clonal populations of transformed cells in a genomically heterogeneous cellular sample
US5741650A (en) * 1996-01-30 1998-04-21 Exact Laboratories, Inc. Methods for detecting colon cancer from stool samples
CA2256498A1 (en) * 1996-05-29 1997-12-04 Genzyme Corporation Cell growth regulatory genes
US6020137A (en) * 1996-08-14 2000-02-01 Exact Laboratories, Inc. Methods for the detection of loss of heterozygosity
US6146828A (en) * 1996-08-14 2000-11-14 Exact Laboratories, Inc. Methods for detecting differences in RNA expression levels and uses therefor
US6203993B1 (en) 1996-08-14 2001-03-20 Exact Science Corp. Methods for the detection of nucleic acids
US6100029A (en) * 1996-08-14 2000-08-08 Exact Laboratories, Inc. Methods for the detection of chromosomal aberrations
US5952178A (en) 1996-08-14 1999-09-14 Exact Laboratories Methods for disease diagnosis from stool samples
US6300077B1 (en) 1996-08-14 2001-10-09 Exact Sciences Corporation Methods for the detection of nucleic acids
US5928870A (en) * 1997-06-16 1999-07-27 Exact Laboratories, Inc. Methods for the detection of loss of heterozygosity
JP3930074B2 (ja) * 1996-09-30 2007-06-13 株式会社ルネサステクノロジ 半導体集積回路及びデータ処理システム
US6134148A (en) * 1997-09-30 2000-10-17 Hitachi, Ltd. Semiconductor integrated circuit and data processing system
US5846780A (en) * 1996-10-04 1998-12-08 Millennium Pharmaceuticals, Inc. Murine RATH gene
US6020142A (en) * 1996-10-04 2000-02-01 Millennium Pharmaceuticals, Inc. Rath genes and polypeptides and methods for the treatment and diagnosis of immune disorders
US6048693A (en) * 1996-10-16 2000-04-11 Bittech, Inc. Phenotypic assays of cyclin/cyclin-dependent kinase function
AU4903897A (en) * 1996-10-16 1998-05-11 Bittech, Inc. Phenotypic assays of cyclin/cyclin-dependent kinase function
KR100497800B1 (ko) * 1996-11-06 2005-11-24 미쯔이가가꾸가부시끼가이샤 α-올레핀 중합반응을 위한 공정, 이에 의해 제조한 폴리-α-올레핀, 및 이 공정을 위한 촉매 성분으로서 유용한 아미노실란화합물
US5858715A (en) * 1997-01-29 1999-01-12 Incyte Pharmaceuticals, Inc. Human apoptosis-associated protein
DE19736691A1 (de) * 1997-08-22 1999-02-25 Michael Prof Dr Med Giesing Verfahren zur Charakterisierung und Identifizierung disseminierter und metastasierter Krebszellen
AU1455599A (en) * 1997-11-17 1999-06-07 Warner-Lambert Company P53cp, a protein that specifically binds to consensus p53 dna binding sites
US6020135A (en) * 1998-03-27 2000-02-01 Affymetrix, Inc. P53-regulated genes
US7691370B2 (en) * 1998-10-15 2010-04-06 Canji, Inc. Selectivity replicating viral vector
US6280947B1 (en) 1999-08-11 2001-08-28 Exact Sciences Corporation Methods for detecting nucleotide insertion or deletion using primer extension
US6864355B1 (en) 2000-05-02 2005-03-08 Yale University Inhibition of NF-κB activation by blockade of IKKβ-NEMO interactions at the NEMO binding domain
US7229096B2 (en) * 2004-05-06 2007-06-12 Delphi Technologies, Inc. Adaptive energy absorbing system using pin pullers
US9109256B2 (en) 2004-10-27 2015-08-18 Esoterix Genetic Laboratories, Llc Method for monitoring disease progression or recurrence
US9777314B2 (en) 2005-04-21 2017-10-03 Esoterix Genetic Laboratories, Llc Analysis of heterogeneous nucleic acid samples

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5314995A (en) * 1990-01-22 1994-05-24 Oncogen Therapeutic interleukin-2-antibody based fusion proteins
WO1993010230A1 (en) * 1991-11-20 1993-05-27 Trustees Of Dartmouth College Ligand-stimulated gene expression

Also Published As

Publication number Publication date
ATE315087T1 (de) 2006-02-15
US5667987A (en) 1997-09-16
US5886149A (en) 1999-03-23
DE69534733D1 (de) 2006-03-30
EP0804609B1 (de) 2006-01-04
WO1996001907A1 (en) 1996-01-25
ES2256847T3 (es) 2006-07-16
EP0804609A4 (de) 1998-01-21
EP0804609A1 (de) 1997-11-05

Similar Documents

Publication Publication Date Title
DE69534733T2 (de) NEUARTIGE AUF p53 ANSPRECHENDE GENE
DE69838905T2 (de) Transkriptionsfaktor islet-brain 1 (ib1)
DE69636936T2 (de) Faktor-1, induzierbar durch hypoxämie, und verfahren zur anwendung
DE69738370T2 (de) Modulatoren des tnf-rezeptor-assoziierten faktors, deren herstellung und verwendungen
DE69926764T2 (de) Methoden zur bestimmung von komponenten zur modulation des körpergewichts
DE69837085T2 (de) Crsp-proteine (cystein-reiche, sekretierte proteine), die dafür kodierenden nukleinsäuren und ihre verwendungen
DE4425481A1 (de) Melanom-inhibierendes Protein
DE69738322T2 (de) Apoptose assoziertes protein bbk
EP0926236A1 (de) Bindungspartner für Inhibitoren von cyclinabhängigen Kinasen und ihre Verwendung zur Suche nach Inhibitoren, zur Diagnose oder zur Therapie
WO2002040668A2 (de) Proteine und den proteinen zugrundeliegende dna-sequenzen mit funktion bei entzündungsereignissen
DE69233155T2 (de) Insulinartigen wachstumsfaktor bindendes protein
DE60125148T2 (de) Fctrx genannte proteine und dafür kodierende nuklein säure
DE69734143T2 (de) Neue methoden zur charakterisierung von verbindungen, welche die stf-1 expression in inselzellen der bauchspeicheldrüse stimuliert
US5876972A (en) Nucleic acid molecules coding for tumor suppressor proteins and methods for their isolation
DE69838565T2 (de) Nukleinsäuren von CIITA Genen
EP1237910B1 (de) Mit trp-proteinen verwandtes protein mtr1 und dieses codierende dna-sequenz
DE60217711T2 (de) Ptp10d nukleinsäuren und peptide in der regulation von energie-homeostase
DE60217081T2 (de) Gen beteiligt an v(d)j rekombination und/oder dna reparatur
DE60122684T2 (de) Akuter neuronal-induzierter liganden des calcium-bindenden protein-1
WO2001040461A2 (de) cDNA-SEQUENZEN VON ZWEI INTERAKTOREN FANCIP4 UND FANCIP5 DER FANCONI-ANÄMIE-PROTEINE DER KOMPLEMENTATIONSGRUPPEN A UND C
WO1999050288A2 (en) Mammalian blood loss-induced gene, kd312
WO2000046244A1 (de) cDNA-SEQUENZ EINES INTERAKTORS FANCIP1 DES FANCONI-ANÄMIE-PROTEINS DER KOMPLEMENTATIONSGRUPPE A
EP1297126A1 (de) Nukleotid- und aminosauresequenzen eines zellularen repressors der dna replikation des herpes-virus epstein-bar
WO2003093310A1 (de) Neue nukleinsäuresequenzen und proteine von tumoren und neoplasien der schilddrüse
Tchernev Characterization of the Chediak-Higashi syndrome gene in human and mouse

Legal Events

Date Code Title Description
8364 No opposition during term of opposition