DE69636936T2

DE69636936T2 - Faktor-1, induzierbar durch hypoxämie, und verfahren zur anwendung

Info

Publication number: DE69636936T2
Application number: DE69636936T
Authority: DE
Inventors: Gregg L. Towson SEMENZA
Original assignee: Johns Hopkins University; School of Medicine of Johns Hopkins University
Current assignee: Johns Hopkins University; School of Medicine of Johns Hopkins University
Priority date: 1995-06-06
Filing date: 1996-06-06
Publication date: 2007-10-31
Anticipated expiration: 2016-06-07
Also published as: US6020462A; WO1996039426A1; CA2222279C; EP0833840A1; DE69636936D1; EP1806357A1; AU6332696A; IL118581A0; US6222018B1; JP2009077729A; EP0833840A4; EP0833840B1; JPH11507541A; US5882914A; AU704384B2; IL118581A; ATE355299T1; CA2222279A1

Description

Aussage zu föderal unterstützer Forschung
Diese Erfindung wurde zum Teil mit Geldern der Föderalen Regierung durchgeführt, PHS Grant RO1-DK39869. Die Regierung besitzt daher bestimmte Rechte an der Erfindung.
GEBIET DER ERFINDUNG
Diese Erfindung betrifft die Verwendungen von mit Hypoxie verbundenen Proteinen, und spezifisch die Verwendungen von neuen DNA-bindenden Proteinen, die durch Hypoxie induziert werden.
Hintergrund der Erfindung
Säugetiere benötigen molekularen Sauerstoff (O₂) für essentielle Stoffwechselprozesse einschließlich der oxidativen Phosphorylierung, bei der O₂ als ein Elektronenakzeptor während der ATP-Bildung dient. Systemische, lokale und intrazelluläre homöostatische Reaktionen, die durch Hypoxie (der Status, in dem der Bedarf an O₂ den Nachschub übersteigt) hervorgerufen werden, umschließen Erythropoiesie bei Individuen, die anämisch sind oder sich in großer Höhe befinden (Jelkmann (1992) Physiol. Rev. 72: 449-489), Neubildung von Gefäßen in ischämischem Myokard (White et al. (1992) Circ. Res. 71: 1490-1500) und Glykolyse in Zellen, die bei vermindertem O₂-Druck kultiviert werden (Wolfle et al. (1983) Eur. J. Biochem. 135: 405-412). Diese adaptiven Reaktionen erhöhen entweder die O₂-Zuführung oder aktivieren alternative Stoffwechselwege, die keinen O₂ benötigen. Durch Hypoxie induzierbare Genprodukte, die an diesen Reaktionen beteiligt sind, umschließen Erythropoietin (EPO) (im Überblick bei Semenza (1994) Hematol. Oncol. Clinics N. Amer. 8: 863-884), den vaskulären Endothel-Wachstumsfaktor (Shweiki et al. (1992) Nature 359: 843-845; Banai et al. (1994) Cardiovasc. Res. 28: 1176-1179; Goldberg & Schneider (1994) J. Biol. Chem. 269: 4355-4359) und glykolytische Enzyme (Firth et al. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91: 6496-6500; Semenza et al. (1994) J. Biol. Chem. 269: 23757-23763).
Die molekularen Mechanismen, die genetische Reaktionen auf Hypoxie vermitteln, sind für das EPO-Gen, welches einen Wachstumsfaktor codiert, der die Erythropoiesie und auf diese Weise die O₂-Transportkapazität des Blutes reguliert, umfangreich erforscht worden (Jelkmann (1992) vorstehend, Semenza (1994) vorstehend). Cis-agierende DNA-Sequenzen, die für die transkriptionale Aktivierung bei der Reaktion auf Hypoxie erforderlich sind, wurden in der EPO 3'-flankierenden Region identifiziert, und ein trans-agierender Faktor, der an den Enhancer bindet, der durch Hypoxie induzierbare Faktor 1 (HIF-1), erfüllte Kriterien für einen physiologischen Regulator der EPO-Transktiption: Auslöser von EPO-Expression (1% O₂, Kobaltchlorid [CoCl₂] und Desferrioxamin [DFX]) induzierten auch die Bindungsaktivität von HIF-1 an DNA mit ähnlicher Kinetik; Inhibitoren der EPO-Expression (Aktinomycin D, Cycloheximid und 2-Aminopurin) blockierten die Induktion der HIF-1-Aktivität; und Mutationen in der EPO 3'-flankierenden Region, die die HIF-1-Bindung eliminierten, eliminierten auch die Enhancer-Funktion (Semenza (1994), vorstehend). Diese Ergebnisse unterstützen auch die Hypothese, dass die O₂-Spannung durch ein Hämoprotein wahrgenommen wird (Goldberg et al. (1988) Science 242: 1412-1415), und dass ein Stoffwechselweg zur Signalübertragung, der den Fortgang von Transkription, Translation und Proteinphosphorylierung erforderlich macht, an der Induktion der DNA-Bindungsaktivität von HIF-1 und der EPO-Transkription in hypoxischen Zellen beteiligt ist (Semenza (1994) vorstehend).
EPO-Expression ist zelltypspezifisch, die Induktion von HIF-1-Aktivität durch 1% O₂, CoCl₂, oder DFX wurde jedoch in vielen Säugetier-Zelllinien nachgewiesen (Wang & Semenza (1993a) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 4304-4308), und der EPO-Enhancer steuerte die durch Hypoxie induzierbare Transkription von Reporter-Genen, die in Zellen transferiert worden waren, welche EPO nicht produzierten (Wang & Semenza (1993a) vorstehend; Maxwell et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 2423-2427). RNAs, die mehrere glykolytische Enzyme codierten, wurden durch 1% O₂, CoCl₂, oder DFX in EPO produzierenden Hep3B- oder nicht produzierenden HeLa-Zellen induziert, wobei Cycloheximid ihre Induktion blockierte und glykolytische Gensequenzen, die Bindungsstellen für HIF-1 enthielten, vermittelten in Transfektionsversuchen die durch Hypoxie induzierbare Transkription (Firth et al. (1994) vorstehend; Semenza et al. (1994) vorstehend). Diese Experimente unterstützen die Rolle von HIF-1 bei der Aktivierung von homöostatischen Reaktionen auf Hypoxie. Dejgaard et al. (1994, J. Mol. Biol. 236: 33-48) beschreiben Identifizierung, molekulare Clonierung, Expression und Chromosom-Kartierung einer Familie von Transformations-hochgeregelten hnRNP-k-Proteinen, die durch alternatives Spleißen erhalten worden waren, und stellt beispielhaft zwei Spleißvarianten von hnRNP-k-Proteinen vor (Zugangsnummern X72727 und X72726 der EMBL-Datei).
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Die Erfindung zeichnet sich durch die Verwendungen eines an DNA bindenden Proteins, den durch Hypoxie induzierbaren Faktor 1 (HIF-1), aus, welches dadurch gekennzeichnet ist, dass es die Expression eines Strukturgens aktiviert, wenn die Promotorregion des Strukturgens eine Bindungsstelle für HIF-1 enthält. Beispiele für solche Strukturgene umschließen Erythropoietin (EPO), Wachstumshormon für Gefäßendothel (V-EGF) und glykolytische Gene; HIF-1 ist aus zwei Untereinheiten zusammengesetzt, HIF-1α und einer Isoform HIF-1β.
Die Erfindung zeichnet sich durch die Verwendungen eines HIF-1α-Polypeptides und Verwendungen einer Nukleotidsequenz, die HIF-1α codiert, aus.
Besonders zeichnet sich die Erfindung durch Verwendungen einer HIF-1α codierenden Nukleotidsequenz aus, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus

(a) Nukleotidsequenzen, die ein Polypeptid codieren, welches die Aminosäuresequenzen umfassen, die in SEQ ID NO:2 dargestellt sind;
(b) Nukleotidsequenzen, die die Sequenz der codierenden Region umfassen, die in SEQ ID NO:1 dargestellt ist;
(c) Nukleotidsequenzen, die einen Abschnitt des Polypeptides codieren, welches in SEQ ID NO:2 dargestellt ist, wobei jener Abschnitt HIF-1α-Aktivität aufweist;
(d) Nukleotidsequenzen, die in der Lage sind, selektiv an eine der Nukleotidsequenzen aus (a) bis (c) unter stringenten Bedingungen zu hybridisieren, und welche ein HIF-1α-Aktivität aufweisendes HIF-1α-Polypeptid oder einen Abschnitt hiervon codieren; und
(e) Nukleotidsequenzen, die sich auf Grund der Degeneration des genetischen Codes von einer der Nukleotidsequenzen aus (a) bis (d) unterscheiden;

Die Anmeldung offenbart auch Verwendungen der Arzneimittel, die hierin zur Vorbeugung und Behandlung von durch Hypoxie verursachte Funktionsstörungen, einschließlich von Gewebeschädigung die durch Hypoxie und Reperfusion hervorgerufen werden, definiert werden, wobei eine therapeutisch wirksame Menge an HIF-1-Protein zu verabreichen ist. Ebenso in den Rahmen der Erfindung eingeschlossen ist die Verwendung von hierin definierten Arzneimitteln in der Gentherapie, wobei eine Nukleotidsequenz, die HIF-1 codiert, in Zellen eingeführt werden soll. Die Erfindung liefert auch die Verwendungen von den hierin definierten Verbindungen zur Herstellung eines Arzneimittels, welche einen pharmazeutisch verträglichen Träger, vermischt mit einer therapeutisch wirksamen Menge an HIF-1 oder der Nukleotidsequenz, die HIF-1 codiert, umfasst.
Darüberhinaus offenbart die Anmeldung eine neue Variante des HIF-1α-Polypeptides, welches HIF-1 in vivo funktional inaktiviert. Die vorliegende Anmeldung offenbart auch Arzneimittel zur Behandlung einer durch HIF-1 vermittelten Funktionsstörung oder eines durch HIF-1 vermittelten Zustandes durch funktionale Inaktivierung des zur Verabreichung einer wirksamen Menge der offenbarten HIF-1α-Variante verwendeten HIF-1.
KURZE BESCHREIBUNG DER ABBILDUNGEN
1 ist eine Autoradiographie, die die von der Dosis abhängige Induktion der DNA-Bindungsaktivität von HIF-1 durch Behandlung mit CoCl₂ darstellt. Zellkernextrakte, die aus HeLa-Zellen präpariert wurden, welche in Anwesenheit von 0, 5, 10, 25, 50, 75, 100, 250, 500 oder 1000 μM CoCl₂ über 4 h bei 37 °C kultiviert worden waren, wurden mit der W18-Sonde inkubiert und durch Gel-Shift-Untersuchung analysiert. Linien 1-8 und 9-12 stellen Extrakte dar, die in zwei getrennten Experimenten hergestellt worden waren. Pfeile kennzeichnen HIF-1, konstitutive DNA-Bindungsaktivität (C), nicht spezifische Aktivität (NS) und freie Sonde (F).
2 ist eine Autoradiographie, die die Ergebnisse der Methylierungs-Interferenzanalyse mit Zellkernextrakten von HeLa-Zellen zeigt, die mit CoCl₂ behandelt worden waren. W18 wurde auf dem codierenden oder dem nicht codierenden Strang am 5'-Ende markiert, war zum Teil methyliert und wurde mit Zellkernextrakten inkubiert. DNA-Proteinkomplexe, die HIF-1, konstitutiven DNA-Bindungsaktivitäten (C1 und C2) und nicht spezifische Bindungsaktivitäten (NS) entsprachen, wurden aus einer präparativen Gel-Shift-Untersuchung (untere Abbildung) in Ergänzung zur freien Sonde (F) (nicht dargestellt) isoliert. Die DNA wurde gereinigt, mit Piperidin gespalten und auf einem 15% denaturierendem Polyacrylamid-Gel analysiert (obere Abbildung). Die Ergebnisse sind auf der linken Seite für den codierenden Strang und auf der rechten Seite für den nicht codierenden Strang zusammengefasst. Die Guanin-Reste werden nach ihrer Lage auf der W18-Sonde nummeriert. Die HIF-1-Bindungsstelle ist eingerahmt. Vollständige Methylierungsinterferenz mit HIF-1-Bindung ist mit ausgefüllten Kreisen gekennzeichnet; teilweise und vollständige Methylierungsinterferenzen mit konstitutiver DNA-Bindungsaktivität sind durch offene beziehungsweise ausgefüllte Quadrate gekennzeichnet.
3A ist eine Autoradiographie, die die Analyse der Gel-Shift-Untersuchung von Säulenfraktionen für die DNA-Bindungsaktivität von HIF-1 darstellt. Zellkernextrakte wurden durch DEAE-Sepharose-Chromatographie fraktioniert und Fraktionen, die HIF-1-Aktivität enthielten, wurden auf eine W18-DNA-Affinitätssäule aufgetragen. 5 μg Protein wurden mit 0,1 μg Kälberthymus-DNA zur Gel-Shift-Analyse von rohem Zellkernextrakt (roher NE, Bahn 1) und HIF-1-aktiven Fraktionen von DEAE-Sepharose-Säulen (DEAE, Bahn 2) inkubiert. Für Fraktionen von der W18-Säule (Bahnen 3-13) wurden 1 μl-Aliquots mit 5 ng Kälberthymus-DNA inkubiert. Die Positionen der beiden HIF-1-Banden, der konstitutiven Aktivität (C), der nicht spezifischen Aktivität (NS) und der freien Sonde (F) sind gekennzeichnet. FT, Durchfluss, 0,25 M, 0,5 m, 1 M und 2 M sind Fraktionen, die mit angegebener Konzentration an KCl in Pufferlösung Z eluiert worden sind.
3B ist eine Autoradiographie, die sequenzspezifische DNA-Bindung der zum Teil gereinigten Fraktionen, die in der Legende zu 3A beschrieben werden, darstellt. 5 μg der Fraktionen aus der DEAE-Sepharose-Säule wurden mit der W18-Sonde in Anwesenheit von keinem Konkurrenten (Bahn 1), 10-fachem (Bahnen 2 und 5), 50-fachem (Bahnen 3 und 6) oder 250-fachem (Bahnen 4 und 7) molarem Überschuss an nicht markiertem W18- (W, Bahnen 2-4) oder M18- (M, Bahnen 5-7) Oligonukleotid inkubiert.
4A ist eine Autoradiographie, die die Reinigung von HIF-1 aus HeLa S3-Zellen, die mit CoCl₂ behandelt worden waren, darstellt. Die Durchflussfraktion der M18-DNA-Säule (Ladung, Bahn 1) und 0,25 M KCl- und 0,5 M KCl-Fraktionen der zweiten W18-DNA-Affinitätssäule (Bahnen 2 und 3) wurden analysiert. Ein Aliquot aus jeder Fraktion (5 μg der Ladung oder 1 μg der Fraktionen aus den Affinitätssäulen) wurden durch 6% SDS-PAGE wieder gelöst und mit Silber angefärbt. HIF-1-Polypeptide in den Bahnen 2 und 3 sind durch Pfeile auf der rechten Seite der Abbildung gekennzeichnet.
4B ist eine Autoradiographie, die die Reinigung von HIF-1 aus hypoxischen Hep3B-Zellen darstellt. HIF-1-Fraktionen aus der ersten W18-Säule (Ladung, Bahn 1) und 0,25 M KCl- und 0,5 M KCl-Fraktionen aus der zweiten W18-Säule (Bahnen 2 und 3) wurden analysiert. Ein Aliquot aus jeder Fraktion (50 μl) wurde durch 7% SDS-PAGE wieder gelöst und mit Silber angefärbt. Molekulargewichtsmarker sind Myosin (200 kDa), β-Galaktosidase (116 kDa), Phosphorylase (97 kDa), BSA (66 kDa) und Ovalbumin (45 kDa). HIF-1-Polypeptide in Bahnen 2 und 3 sind durch Pfeile auf der rechten Seite der Abbildung gekennzeichnet.
5A ist eine Autoradiographie, die die HIF-1-Polypeptide identifiziert. Ein Aliquot des affinitätsgereinigten HIF-1 wurde auf einem 6% SDS-Polyacrylamid-Gel mit 3,2% Vernetzung mit dem HIF-1-Proteinkomplex, der durch präparative native Gel-Shift-Untersuchung (HIF-1) isoliert worden war, wieder in Lösung gebracht. MW, Molekulargewichtsmarker, deren Größe (kDa) auf der linken Seite der Abbildung angegeben ist; die Zahlen auf der rechten Seite der Abbildung geben die offensichtlichen Molekulargewichte (kDa) der HIF-1-Polypeptide an.
5B ist eine Autoradiographie, die die HIF-1-Bestandteile auf einem 6% SDS-Polyacrylamid-Gel mit 5% Vernetzung darstellt. Ein Aliquot des affinitätsgereinigten HIF-1 wurde auf einem 6% SDS-Polyacrylamid-Gel zusammen mit dem HIF-1-Proteinkomplex, der durch präparative native Gel-Shift-Untersuchung (HIF-1) isoliert worden war, wieder in Lösung gebracht. Das Polypeptid mit 120 kDa, Polypeptide mit 94/93/91 kDa und zwei verunreinigte Proteine (*1 und *2) sind gekennzeichnet.
5C ist eine Autoradiographie, die die Anordnung von HIF-1-Bestandteilen darstellt, die auf zwei Gel-Systemen mit unterschiedlichem Grad an Vernetzung identifiziert worden sind. Gel-Stücke, die aus dem 6% SDS-Polyacrylamid-Gel mit 5% Kreuzbindung isoliert worden sind, welche dem HIF-1-Polypeptid mit 120 kDa (12), dem HIF-1-Polypeptid mit 94/93/91 kDa (94/93/91) und zwei verunreinigten Proteinen (*1 und *2) entsprechen, wurden auf einem 6% SDS-Polyacrylamid-Gel mit 3,2% Vernetzung parallel zueinander mit einem Aliquot (30 μl) an affinitätsgereinigtem HIF-1 wieder in Lösung gebracht (5A).
6 ist eine grafische Darstellung der Absorptionsprofile bei 215 nm von tryptischen Peptiden, die von dem HIF-1-Polypeptid mit 91 kDa (oben), den Polypeptiden mit 93/94 kDa (Mitte) und Trypsin (unten) abstammen.
7 ist eine Autoradiographie, die die UV-Vernetzungsanalyse mit affinitätsgereinigtem HIF-1 und Sonde 18 in Abwesenheit (Bahn 1) oder Anwesenheit von 250-fachem molarem Überschuss an nicht markiertem W18- (Bahn 2) oder M18-(Bahn 3) Oligonukleotid darstellt. Die Bindungsreaktionsgemische wurden mit UV-Licht bestrahlt und auf einem 6% SDS-Polyacrylamid-Gel analysiert. Molekulargewichtsstandards werden auf der linken Seite angezeigt.
8 ist eine Autoradiographie, die die Ergebnisse der Sedimentationsanalyse im Glyzeringradienten darstellt. Zellkernextrakte, die aus Hep3B-Zellen, die 1% O₂ über 4 h ausgesetzt waren, hergestellt worden waren (Ladung), wurden durch einen 10-30% linearen Glyzeringradienten sedimentiert. Aliquots (10 μl) aus jeder Fraktion wurden durch Gel-Shift-Untersuchung analysiert. Pfeile am oberen Rand kennzeichnen die Spitzenwanderung von Ferritin (440 kDa), Katalase (232 kDa), Adolase (158 kDa) und BSA (67 kDa).
9 ist ein Diagramm der HIF-1α codierenden c-DNA-Sequenz. Fette Linien kennzeichnen die Ausdehnung der Clone hbc120, hbc025 und 3.2-3 in Relation zu der RNA-Codierungssequenz in voller Länge, die nachfolgend dargestellt wird. Rahmen, Aminosäure codierende Sequenzen; dünne Linien, nicht translatierte Sequenzen; bHLH, basale Helix-Schleife-Helix-Domäne; A und B, interne Homologie-Einheiten innerhalb der PAS-Domäne.
10 ist die Nukleotid- und abgeleitete Aminosäuresequenz von HIF-1α. Eine zusammengesetzte Sequenz wurde aus den vollständigen Nukleotidsequenzen erhalten, die für die Clone 3.2-3 (Nt 1-3389), hbc025 (Nt 135-3691) und hbc120 (Nt 1739-3720) bestimmt worden waren. Sequenzen von vier tryptischen Peptiden, die aus dem gereinigten HIF-1α-Polypeptid mit 120 kDa erhalten worden waren, sind unterstrichen (zwei Peptide sind benachbart).
11 ist die Analyse von bHLH-Domänen. Die Koordinate des ersten Restes von jeder Sequenz und Aminosäuren-Identität mit HIF-1α oder HIF-1β (ARNT) werden in Klammern an den linken beziehungsweise rechten Rändern angegeben. Ein Bindestrich kennzeichnet eine Lücke, die in die Sequenz eingefügt wurde, um die Anordnung zu maximieren, ausgenommen bei Übereinstimmung, wo er ein Mangel an Übereinstimmung anzeigt. Übereinstimmung kennzeichnet mindestens 3 Proteine mit identischem oder ähnlichem Rest an einer gegebenen Position: 1: F, I, L, M oder V; 2: S oder T; 3: D oder E; 4: K oder R. Invariante Reste werden in Fettdruck dargestellt.
12 ist die Analyse von PAS-Domänen. Anordnungen von PAS A- (oben) und B- (unten) Untereinheiten werden dargestellt. Übereinstimmung kennzeichnet mindestens 4 Proteine mit identischem oder ähnlichem Rest an einer gegebenen Position. GenBank-Zugangsnumern: ARNT, M69238; AHR, L19872; SIM, M19020; MI, Z23066; USF, X55666; L-MYC, X13945; CP-1, M34070; PER, M30114; KinA, M31067.
13A ist eine Autoradiographie, die RNA-Expression von HIF-1α und HIF-1β darstellt, nachdem Hep3B-Zellen 1% O₂ über 0, 1, 2, 4, 8 und 16 h ausgesetzt worden waren.
13B ist eine Autoradiographie, die RNA-Expression von HIF-1α und HIF-1β darstellt, nachdem Hep3B-Zellen 75 μM CoCl₂ über 0, 1, 2, 4, 8 und 16 h ausgesetzt worden waren.
13C ist eine Autoradiographie, die RNA-Expression von HIF-1α und HIF-1β darstellt, nachdem Hep3B-Zellen 130 μM Desferrioxamin (DFX) über 0, 1, 2, 4, 8 und 16 h ausgesetzt worden waren.
13D ist eine Autoradiographie, die RNA-Expression von HIF-1α und HIF-1β darstellt, nachdem Hep3B-Zellen 1% O₂ über 4 h ausgesetzt worden waren, dann erhielten die Zellen wieder 20% O₂ über 0, 5, 15, 30 oder 60 min vor Isolierung der RNA.
13E ist eine Tabelle der AUUUA enthaltenden Elemente der 3'-UTR von HIF-1α. Das erste Nukleotid ist entsprechend der zusammengesetzten c-DNA-Sequenz nummeriert.
14A ist eine Autoradiographie von Zellkernextrakten von hypoxischen Hep3B-Zellen, die mit der Oligonukleotidsonde W18 über 10 min auf Eis inkubiert worden waren, Immunseren wurden zugegeben (Bahnen, 2 und 5) und über 20 min auf Eis inkubiert, anschließend erfolgte eine Polyacrylamid-Gel-Elektrophorese. Präimmunseren (Bahnen 3 und 5) und Antiseren (Bahnen 2 und 4) wurden aus Kaninchen vor beziehungsweise nach Immunisierung mit GST/HIF-1α (Bahnen 2 und 3) oder GST/HIF-1β (Bahnen 4 und 5) gewonnen. HIF-1-, konstitutive (C) und nicht spezifische (NS) DNA-Bindungsaktivitäten, freie Sonde (F) und überlagerter HIF-1/DNA/Antikörper-Komplex (S) sind gekennzeichnet.
14B ist ein Immunblot, der die Erkennung von Antiseren durch HIF-1-Untereinheiten darstellt, welche in gereinigten Proteinpräparaten und Rohproteinextrakten dargeboten worden sind. Zellkernextrakte aus Hep3B-Zellen, die unbehandelt (Bahn 1) oder 1% O₂ über 4 h ausgesetzt (Bahn 4) worden waren, und aus HeLa-Zellen, die unbehandelt (Bahn 6) oder 75 μM CoCl₂ über 4 h (Bahn 7) ausgesetzt worden waren, wurden auf einem 6% SDS-Polyacrylamid-Gel parallel zu 1, 2 und 5 μl affinitätsgereinigtem HIF-1 aus mit CoCl₂ behandelten HeLa-Zellen (Bahnen 3–5) fraktioniert. Protein wurde auf eine Nitrozellulose-Membran übertragen und mit Antiseren gegen HIF-1α (oben) oder HIF-1β (unten) inkubiert.
14C ist ein Immunblot, der die Induktionskinetik von HIF-1β- und HIF-1β-Protein in hypoxischen Zellen darstellt. Hep3B-Zellen wurden 1% O₂ über 0 bis 16 h vor der Präparation der Zellkern- (N.E.) und Zytoplasma- (C.E.) Extrakte ausgesetzt, und die Immunblot-Analyse wurde mit Antiseren gegen HIF-1α (oben) oder HIF-1β (unten) durchgeführt.
14D ist ein Immunblot, der die Abbaukinetik von HIF-1α- und HIF-1β-Polypeptiden in post-hypoxischen Zellen darstellt. Hep3B-Zellen wurden 1% O₂ über 4 h ausgesetzt und vor der Präparation von Extrakten und der Immunblot-Analyse für 0 bis 60 min in 20% O₂ zurück gesetzt. Pfeilspitzen trennen HIF-1-Untereinheiten von kreuzreagierenden Proteinen unbekannter Identität.
15A ist ein Diagramm der Struktur der Reportergen-Konstruktionen, die zur funktionalen Analyse von HIF-1-Bindungsstellen in Genen für menschliche Adolase A (hALDA), menschliche Phosphoglycerat-Kinase 1 (hPGK1) und mausstämmige Phosphofruktokinase L (mPFKL) verwendet worden sind. Pfeil: Stelle für den Transkriptionsbeginn; Rahmen: hEPO 3'-FS- (kreuz-schraffiert), hPGK1 5'-FS-(gerastert) oder mPFKL IVS1- (gestreift) Oligonukleotid (Sequenzen wie in Tabelle 2 dargestellt). Die DNA-Fragmente vom 5'-Ende des hALDA-Gens in pNMHcat und pHcat haben eine Größe von 3,5 beziehungsweise 0,76 kB und sind ko-linear zum 3'-Ende, an dem sie direkt an die CAT codierenden Sequenzen fusioniert sind.
15B ist ein Balkendiagramm, welches die Expression von CAT/β-Galaktosidase (relative CAT-Aktivität) in transferierten Zellen darstellt, die 20% O₂ (weißer Balken) oder 1% O₂ (schraffierter Balken) ausgesetzt worden waren. Die Daten wurden unter Verwendung der unteren Skala für alle Ergebnisse gedruckt, mit Ausnahme jener für pHcat, die nach der oberen Skala gedruckt wurden. Die Induktion, die die relative CAT-Aktivität bei 1% O₂/20% O₂ darstellt, wurde für jedes Experiment berechnet; Mittelwert und Standardabweichung vom Mittelwert (SEM) wurden für die Ergebnisse von n unabhängigen Experimenten bestimmt.
16 ist die Amino-terminale (oben) und Carboxy-terminale (unten) Aminosäuresequenz des Wildtyps und der negativ-dominant varianten Formen von HIF-1α.
GENAUE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Die Erfindung liefert Verwendungen eines durch Hypoxie induzierbaren Faktors 1 (HIF-1), der als ein DNA-Bindungsprotein gekennzeichnet ist, welches an eine Region in der Regulator-, bevorzugt in der Enhancer-Region, eines Strukturgens bindet, das das HIF-1-Bindungsmotiv besitzt. Von den Strukturgenen, die durch HIF-1 aktiviert werden können, sind Erythropoietin (EPO), Gefäßendothel-Wachstumsfaktor (VEGF) und glykolytische Gentranskription in Zellen, die Hypoxie unterworfen sind, eingeschlossen. Die Analyse von gereinigtem HIF-1 zeigt, dass er aus den Untereinheiten HIF-1α und der Isoform HIF-1β zusammengesetzt ist. Zusätzlich zum Besitz von Domänen, welche ihre gemeinsame Zusammenlagerung zur Bildung von HIF-1 ermöglichen, enthalten sowohl die α- als auch die β- Untereinheiten von HIF-1 DNA-Bindungsdomänen. Die Alpha-Untereinheit kommt nur in HIF-1 vor, während die β-Untereinheit (ARNT) ein Bestandteil von mindestens zwei weiteren Transkriptionsfaktoren ist.
Die Erfindung liefert Verwendungen eines durch Hypoxie induzierbaren Faktor 1α-(HIF-1α-) Polypeptids, das dadurch gekennzeichnet ist, dass es ein Molekulargewicht von 120 kDa aufweist, wie durch SDS-PAGE-Analyse bestimmt wurde, und dass es im Wesentlichen die Aminosäuresequenz der SEQ ID NO:2 (10) aufweist und mit HIF-1β dimerisiert, um HIF-1 zu bilden. Das hierin verwendete HIF-1α-Polypeptid ist im Wesentlichen frei von anderen Proteinen, Lipiden, Kohlenhydraten oder anderen Materialien, mit denen es natürlicherweise verbunden ist. Fachleute auf dem Gebiet können HIF-1α unter Verwendung von Standardverfahren zur Proteinreinigung reinigen. Das hierin verwendete Polypeptid wird eine einzelne Bande auf einem nicht reduzierenden Polyacrylamid-Gel ergeben. Die Reinheit des HIF-1α-Polypeptides kann auch durch aminoterminale Analyse der Aminosäuresequenz bestimmt werden. Das HIF-1α-Protein umschließt funktionale Fragmente des Polypeptides, solange die Aktivität von HIF-1α, wie etwa die Fähigkeit, an HIF-1β zu binden, erhalten bleibt. Kleinere Peptide, die die biologische Aktivität von HIF-1α umfassen, werden in der Erfindung verwendet.
Die Erfindung liefert Verwendungen von Nukleotidsequenzen, die das HIF-1α-Polypeptid codieren (SEQ ID NO:1) (10). Diese Nukleotide umschließen DNA-, cDNA- und RNA-Sequenzen, die HIF-1α codieren. Es wird ebenfalls deutlich, dass Verwendungen von allen Nukleotidsequenzen, die den vollständigen HIF-1α oder einen Teil hiervon codieren, ebenfalls hierin eingeschlossen sind, solange sie ein Polypeptid mit HIF-1α-Aktivität codieren. Solche Nukleotidsequenzen umschließen natürlich vorkommende, synthetische und willentlich veränderte Nukleotidsequenzen. Zum Beispiel können HIF-1α-Nukleotidsequenzen der stellengerichteten Mutagenese unterworfen werden. Die in der Erfindung eingesetzten Nukleotidsequenzen umschließen Antisense-Sequenzen. Die Nukleotidsequenzen, die in der Erfindung verwendet werden, umschließen Sequenzen, die als ein Ergebnis des genetischen Codes degeneriert sind. Alle degenerierten Nukleotidsequenzen sind in die Verwendungen der Erfindung eingeschlossen, solange die Aminosäuresequenz des HIF-1α-Polypeptides, das durch die Nukleotidsequenz codiert wird, funktionell unverändert ist.
Spezifisch hierin offenbart werden die Verwendungen einer DNA-Sequenz, die das HIF-1α-Gen des Menschen codiert. Die Sequenz enthält einen offenen Leserahmen, welcher ein Polypeptid mit einer Länge von 826 Aminosäuren codiert. Das Methionin-Codon zur Initation des menschlichen HIF-1α, das in 10 an Nukleotid-Position 29-31 dargestellt ist, ist das erste ATG-Codon, das dem Stop-Codon im Rahmen der Nukleotide 2-4 folgt. Bevorzugt ist die Aminosäuresequenz für HIF-1α des Menschen die SEQ ID NO:2.
Die HIF-1α codierende Nukleotidsequenz umschließt sowohl SEQ ID NO:1 als auch Nukleinsäuresequenzen, die zu SEQ ID NO:1 komplementär sind. Eine komplementäre Sequenz kann ein Antisense-Nukleotid einschließen. Wenn die Sequenz RNA ist, sind die Desoxynukleotide A, G, C und T der SEQ ID NO:2 durch die Ribonukleotide A, G, C beziehungsweise U ersetzt. Ebenfalls in die Erfindung eingeschlossen sind die Verwendungen von Fragmenten der vorstehend identifizierten Nukleinsäuresequenzen, die mindestens eine Länge von 15 Basen aufweisen, welche ausreicht, dem Fragment zu ermöglichen, selektiv an DNA oder RNA zu hybridisieren, die das Polypeptid der SEQ ID NO:2 unter physiologischen Bedingungen codiert. Die Fragmente sollten spezifisch unter stringenten Bedingungen an DNA oder RNA, die das HIF-1α-Protein codiert, hybridisieren.
Kleinere Veränderungen der primären Aminosäuresequenz von HIF-1α können zu Proteinen führen, die im Vergleich zu dem hierin beschriebenen HIF-1α-Polypeptid im Wesentlichen äquivalente Aktivität besitzen. Solche Proteine umschließen jene, die durch den Ausdruck „besitzen im Wesentlichen die Aminosäuresequenz der SEQ ID NO:2" definiert sind. Solche Veränderungen können beabsichtigt sein, wie etwa durch stellengerichtete Mutagenese, oder sie sind spontan. Die Verwendungen all der Polypeptide, die durch diese Veränderungen hergestellt worden sind, sind in die Erfindung eingeschlossen, solange die biologische Aktivität von HIF-1α noch besteht. Darüber hinaus können Deletionen von einer oder mehreren Aminosäuren ebenfalls zu einer Veränderung der Struktur des entstehenden Moleküls führen, ohne dass seine biologische Funktion signifikant verändert wird. Dies kann zur Entwicklung eines kleineren aktiven Moleküls führen, welches einen breiteren Anwendungsbereich hätte. Zum Beispiel kann man Amino- oder Carboxy-terminale Aminosäuren, die für die biologische Aktivität von HIF-1α nicht erforderlich sind, entfernen.
Das HIF-1α-Polypeptid, wie es in der Erfindung verwendet wird, codiert durch die Nukleotidsequenz, wie sie in der Erfindung verwendet wird, umschließt die offenbarte Sequenz (SEQ ID NO:2) und konservative Variationen hiervon. Der hierin verwendete Ausdruck „konservative Variation" bezeichnet den Austausch eines Aminosäurerestes durch einen anderen, biologisch ähnlichen Rest. Beispiele für konservative Variationen umschließen die Substitution eines hydrophoben Restes wie etwa Isoleucin, Valin, Leucin oder Methionin durch einen anderen, oder die Substitution eines polaren Restes durch einen anderen, wie etwa die Substitution von Arginin für Lysin, Glutaminsäure für Asparaginsäure oder Glutamin für Asparagin und dergleichen. Der Ausdruck „konservative Variation" umschließt auch die Verwendung einer substituierten Aminosäure an Stelle einer nicht substituierten Ausgangs-Aminosäure, vorausgesetzt, dass die Antikörper, die gegen das substituierte Polypeptid gebildet worden sind, auch mit dem nicht substituierten Polypeptid eine Immunreaktion eingehen.
Die DNA-Sequenzen, die in der Erfindung verwendet werden, können durch verschiedene Verfahren erhalten werden. Zum Beispiel kann die DNA unter Verwendung von Hybridisierungstechniken, die auf dem Fachgebiet gut bekannt sind, isoliert werden. Diese umschließen, sind aber nicht hierauf begrenzt: 1) Hybridisierung von genomischen oder cDNA-Banken mit Sonden, um homologe Nukleotidsequenzen aufzudecken, 2) Anwendung der Polymerase-Kettenreaktion (PCR) auf genomische DNA oder cDNA unter Verwendung von Primern, die in der Lage sind, sich an die DNA-Sequenz von Interesse anzulagern und 3) Durchmusterung von Expressionsbibliotheken mit Hilfe von Antikörpern, um clonierte DNA-Fragmente mit übereinstimmenden Struktureigenschaften aufzudecken.
Bevorzugt stammt die Nukleotidsequenz für HIF-1α, die in der Erfindung verwendet wird, von Organismen aus der Klasse der Säugetiere, und am meisten bevorzugt vom Menschen. Verfahren zur Durchmusterung, die auf der Hybridisierung von Nukleinsäuren beruhen, ermöglichen es, jede beliebige Gensequenz aus jedem beliebigen Organismus zu isolieren, vorausgesetzt, dass die geeignete Sonde zur Verfügung steht. Oligonukleotid-Sonden, welche einem Teil der Sequenz entsprechen, die das in Frage stehende Protein codiert, können chemisch synthetisiert werden. Dies erfordert, dass kurze Oligopeptid-Abschnitte aus den Aminosäuresequenzen bekannt sein müssen. Die DNA-Sequenz, die das Protein codiert, kann aus dem genetischen Code abgeleitet werden, jedoch muss die Degeneriertheit des Codes berücksichtigt werden. Es ist möglich, eine gemischte Additionsreaktion durchzuführen, wenn die Sequenz degeneriert ist. Diese umschließt ein heterogenes Gemisch aus denaturierter doppelsträngiger DNA. Für das Durchmustern wird die Hybridisierung entweder mit einzelsträngiger DNA oder denaturierter doppelsträngiger DNA durchgeführt. Hybridisierung ist besonders beim Nachweis von cDNA-Clonen nützlich, die aus Quellen stammen, bei denen eine außerordentlich geringe Menge an mRNA-Sequenzen, die dem interessierenden Polypeptid entsprechen, vorhanden ist. In anderen Worten, durch Verwendung von stringenten Hybridisierungsbedingungen zur Vermeidung von nicht spezifischen Bindungen, ist es möglich, zum Beispiel die autoradiographische Sichtbarmachung eines spezifischen cDNA-Clons durch die Hybridisierung der Ziel-DNA an diese eine Sonde in dem Gemisch, die ihr vollständig komplementär ist, zu erlauben (Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. Aufl.; Cold Spring Harbor Laboratory Press, Plainview, NY).
Die Entwicklung von spezifischen DNA-Sequenzen, die HIF-1α codieren, kann auch erhalten werden durch: 1) Isolierung von doppelsträngigen DNA-Sequenzen aus der genomischen DNA; 2) chemische Herstellung einer DNA-Sequenz, um die benötigten Codons für das interessierende Polypeptid bereitzustellen; und 3) in vitro-Synthese einer doppelsträngigen DNA-Sequenz durch reverse Transkription von mRNA, die aus einer eukaryontischen Spenderzelle isoliert wurde. Im letzten Fall wird schließlich eine zu der mRNA komplementäre doppelsträngige DNA gebildet, die allgemein als cDNA bezeichnet wird. Unter den drei vorstehend genannten Verfahren zur Entwicklung von spezifischen DNA-Sequenzen zur Verwendung in rekombinanten Verfahren ist die Isolierung von genomischen DNA-Isolaten die am wenigsten gebräuchliche. Dies gilt besonders, wenn es wünschenswert ist, die mikrobielle Expression von Säugetier-Polypeptiden auf Grund der Anwesenheit von Introns zu erreichen.
Die Synthese von DNA-Sequenzen ist häufig das Verfahren der Wahl. Wenn die vollständige Sequenz der Aminosäurereste des gewünschten Polypeptides nicht bekannt ist, ist die direkte Synthese von DNA-Sequenzen nicht möglich, und das Verfahren der Wahl ist die Synthese von cDNA-Sequenzen. Zu den Standardverfahren zur Isolierung der cDNA-Sequenzen von Interesse gehört die Bildung von Plasmid- oder Phagen-tragenden cDNA-Banken, die von reverser Transkription von mRNA stammen, welche in Spenderzellen, die das Gen von Interesse in hohem Maße exprimieren, in großer Menge vorkommt. Zusammen mit der Verwendung der Technik der Polymerase-Kettenreaktion können selbst seltene Expressionsprodukte cloniert werden. In diesen Fällen, in denen signifikante Abschnitte der Aminosäuresequenz des Polypeptides bekannt sind, kann die Produktion von Sequenzen von markierten einzel- oder doppelsträngigen DNA- oder RNA-Sonden, die eine Sequenz duplizieren, die vermutlich in der Ziel-DNA vorkommt, in den DNA/DNA-Hybridisierungsverfahren verwendet werden, die an clonierten Kopien der cDNA, welche in eine einzelsträngige Form denaturiert worden sind, durchgeführt werden (Jay et al. (1983), Nucl. Acid Res., 11:2325).
Eine cDNA-Expressionsbibliothek, wie etwa lambda gt11, kann indirekt auf HIF-1α-Peptide, die mindestens ein Epitop aufweisen, durchmustert werden, indem für HIF-1α spezifische Antikörper verwendet werden. Solche Antikörper können sowohl polyclonalen als auch monoclonalen Ursprungs sein und können verwendet werden, um ein Expressionsprodukt nachzuweisen, welches die Anwesenheit von cDNA für HIF-1α anzeigt.
DNA-Sequenzen, die HIF-1α codieren, können in vitro durch DNA-Transfer in eine geeignete Wirtszelle exprimiert werden. „Wirtszellen" sind Zellen, in die ein Vektor eingeführt und seine DNA exprimiert werden kann. Der Ausdruck umschließt auch jede Art der Vermehrung der betreffenden Wirtszelle. Es ist klar, dass nicht alle Nachkommen mit der Elternzelle identisch sein müssen, da es Mutationen geben kann, die während der Replikation auftreten. Solche Nachkommen sind jedoch eingeschlossen, wenn der Ausdruck „Wirtszelle" verwendet wird. Verfahren für stabile Transfers, das bedeutet, dass die fremde DNA fortlaufend in der Wirtszelle behalten wird, sind auf dem Fachgebiet bekannt.
Um in den Verwendungen der vorliegenden Erfindung eingesetzt werden zu können, können die Nukleotidsequenzen für HIF-1α in einen rekombinanten Expressionsvektor inseriert werden. Der Ausdruck „rekombinanter Expressionsvektor" bezeichnet ein auf dem Fachgebiet bekanntes Plasmid, Virus oder einen anderen Träger, der durch Insertion oder Inkorporation der genetischen Sequenzen für HIF-1α verändert worden ist. Solche Expressionsvektoren enthalten eine Promotor-Sequenz, die die wirksame Transkription der inserierten genetischen Sequenz in der Wirtszelle erleichtert. Der Expressionsvektor enthält typischerweise sowohl einen Replikationsursprung, einen Promotor als auch spezifische Gene, die phänotypische Selektion der transformierten Zellen zulassen. Vektoren, die für die Verwendung in der vorliegenden Erfindung geeignet sind, umschließen, sind aber nicht hierauf begrenzt, den auf T7 basierenden Expressionsvektor zur Expression in Bakterien (Rosenberg et al. (1987), Gene 56:125), den pMSXND-Expressionsvektor zur Expression in Säugetierzellen (Lee und Nathans (1988), J. Biol. Chem. 263:3521) und von Baculoviren stammende Vektoren zur Expression in Insektenzellen. Das DNA-Segment kann in dem Vektor operativ verbunden mit regulatorischen Elementen, wie etwa einem Promotor (z.B. T7, Metallothionein I oder Polyhedron-Promotoren) vorliegen.
Nukleotidsequenzen, die HIF-1α codieren, können sowohl in Prokaryonten als auch in Eukaryonten exprimiert werden. Wirtszellen können mikrobielle, Hefe-, Insekten- und Säugetier-Organismen umschließen. Verfahren zur Expression von DNA-Sequenzen mit eukaryontischen oder viralen Sequenzen in Prokaryonten sind auf dem Fachgebiet gut bekannt. Biologisch funktionale virale und Plasmid-DNA-Vektoren, die zur Expression und Replikation in einer Wirtszelle in der Lage sind, sind auf dem Fachgebiet bekannt. Solche Vektoren werden verwendet, um DNA-Sequenzen, wie sie in der Erfindung verwendet werden, zu inkorporieren.
Transformation einer Wirtszelle mit rekombinanter DNA kann mit herkömmlichen Techniken, die Fachleuten auf dem Gebiet gut bekannt sind, durchgeführt werden. Wenn die Wirtszelle prokaryontisch ist, wie etwa E. coli, können kompetente Zellen, die zu DNA-Aufnahme in der Lage sind, aus Zellen gewonnen werden, die nach der exponentiellen Wachstumsphase geerntet worden und anschließend mit dem CaCl₂-Verfahren unter Verwendung von Prozessen, die auf dem Fachgebiet gut bekannt sind, behandelt werden. Alternativ können MgCl₂ oder RbCl verwendet werden. Falls gewünscht, kann die Transformation auch nach Bildung eines Protoplasten der Wirtszelle durchgeführt werden.
Wenn die Wirtszelle ein Eukaryont ist, können solche Verfahren zur Transfizierung von DNA wie Co-Fällungen, mit Calciumphosphat herkömmliche mechanische Vorgehensweisen wie etwa Mikroinjektion, Elektroporation, Insertion eines Plasmids, das in Liposomen eingeschlossen ist, oder virale Vektoren verwendet werden. Eukaryontische Zellen können auch mit DNA-Sequenzen, die den HIF-1α codieren, und einem zweiten fremden DNA-Molekül, welches einen selektierbaren Phänotyp codiert, wie etwa dem Thymidinkinase-Gen von Herpes simplex, co-transformiert werden, was in der Erfindung Anwendung findet. Ein anderes Verfahren besteht darin, einen eukaryontischen viralen Vektor zu verwenden, wie etwa das Affenvirus 40 (SV40) oder das Papillomavirus des Rindes, um eukaryontische Zellen vorübergehend zu infizieren oder zu transformieren und das Protein zu exprimieren (vgl. zum Beispiel Eukaryotic Viral Vectors, Cold Spring Harbor Laboratory, Gluzman, Hrsg., 1982).
Isolierung und Reinigung von mikrobiell exprimiertem Polypeptid oder Fragmenten hiervon, die in der Erfindung durchgeführt werden, können unter Verwendung herkömmlicher Mittel, einschließlich der präparativen Chromatographie und immunologischer Trennverfahren unter Verwendung von monoclonalen oder polyclonalen Antikörpern, durchgeführt werden.
Die hierin beschriebenen HIF-1α-Polypeptide können auch verwendet werden, um Antikörper herzustellen, die immunreaktiv sind oder Epitope der HIF-1α-Polypeptide binden. Solche Antikörper können zum Beispiel in. Standardtechniken der Affinitätsreinigung verwendet werden, um HIF-1α oder HIF-1 zu isolieren. Sowohl Antikörper, die im Wesentlichen einen Pool aus monoclonalen Antikörpern mit unterschiedlichen Epitop-Spezifitäten umfassen, als auch Präparate von verschiedenen monoclonalen Antikörpern können verwendet werden. Monoclonale Antikörper können aus Antigen enthaltenden Fragmenten des Proteins unter Verwendung von Verfahren, die auf dem Fachgebiet gut bekannt sind, hergestellt werden (Kohler et al. (1975), Nature 256:495; Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel et al., Hrsg., 1989).
Ein Antikörper oder eine Nukleinsäure-Sonde, die für HIF-1α spezifisch sind, können verwendet werden, um das HIF-1α-Polypeptid (Verwendung des Antikörpers) oder Nukleotid-Sequenzen (Verwendung der Nukleinsäure-Sonde) in biologischen Flüssigkeiten oder Geweben nachzuweisen. Ein Antikörper, der mit HIF-1α eine Reaktion eingeht, oder die Nukleinsäure-Sonde können mit einer Verbindung markiert werden, die den Nachweis der Bindung an HIF-1α gestattet. Jede beliebige Probe, die eine nachweisbare Menge an Antigen oder Polynukleotid enthält, kann verwendet werden. Verschiedene nachweisbare Markierungen und Testausführungen sind Fachleuten auf dem Gebiet gut bekannt und können ohne die Notwendigkeit übermäßigen Experimentierens eingesetzt werden.
Wenn der Zellbestandteil eine Nukleinsäure ist, kann es notwendig sein, die Nukleinsäure vor der Bindung mit einer für HIF-1α spezifischen Sonde zu amplifizieren. Bevorzugt wird die Polymerase-Kettenreaktion (PCR) verwendet, jedoch können auch andere Verfahren zur Amplifizierung von Nukleinsäure, wie etwa Ligase-Kettenreaktion (LCR), ligierte aktivierte Transkription (LAT) und auf der Nukleinsäuresequenz basierende Amplifizierung (NASBA), verwendet werden.
Die vorliegende Erfindung offenbart ein variantes HIF-1α-Polypeptid, das dadurch gekennzeichnet ist, das es mit HIF-1β dimerisiert, um einen funktionell inaktiven HIF-1-Komplex zu bilden, das heißt, dass der Komplex nicht in der Lage ist, das HIF-1-Bindungsmotiv in der Regulatorregion in ausreichendem Maße zu binden, um wirksame Expression des Strukturgens unter Kontrolle der Regulatorregion zu ermöglichen. Die Anmeldung offenbart darüber hinaus Nukleotidsequenzen, die HIF-1α-Varianten codieren. Besonders die Polynukleotid codierende HIF-1α-Variante kann die Aminosäuresequenz der SEQ ID NO:3 codieren. Das HIF-1α-variante Polypeptid der SEQ ID NO:4 wird durch Substitution der Aminosäuren des Wildtyps durch andere Aminosäuren und durch Deletion eines Abschnittes der Sequenz des Wildtyps erzeugt. Veränderungen der HIF-1α-varianten Aminosäuresequenz werden ebenso hierin offenbart, solange das entstehende Polypeptid an HIF-1β dimerisiert, um einen funktional inaktiven HIF-1-Komplex in dem Sinne zu bilden, dass der HIF-1-Komplex oder das Dimer nicht länger DNA ausreichend bindet.
Besonders werden spezifische HIF-1α-Varianten offenbart, bei denen eine oder mehrere der Aminosäuren, die an der Bindung von HIF-1 an DNA beteiligt sind, unter Verwendung von gentechnischen Verfahren ersetzt werden.
Es wird offenbart, dass HIF-1αΔNB und HIF-1αΔNBΔAB die spezifischen, negativ dominanten varianten Formen von HIF-1α sind (vgl. Referenzbeispiel 10). Diese beiden Formen haben eine Deletion der Aminosäuren gemein, die die basische Domäne umfassen, die für die Bindung an DNA erforderlich sind (Aminosäurereste 17-30 von HIF-1α; 10) Jede variante Form von HIF-1α, in der eine Veränderung der basischen Domäne die DNA-Bindungsaktivität eliminiert, während die Fähigkeit von HIF-1α, mit HIF-1β zu dimerisieren, erhalten bleibt, sollte als eine negativ dominante Variante wirken. Solche Veränderungen der Nukleotidsequenz, die die basische Domäne codiert, umschließen Deletionen oder Substitutionen von kritischen basischen Aminosäureresten innerhalb der Domäne, die für die DNA-Bindung erforderlich sind. Zusätzliche Veränderungen des Proteins können die negativ dominante Wirkung in vivo verstärken. Zum Beispiel enthält die Variante HIF-1αΔNBΔAB die gleiche Mutation in der basische Domäne wie HIF-1αΔNB (16), aber zusätzlich ist HIF-1αΔNBΔAB auch am Carboxylende verzweigt, um seine Proteinstabilität in vivo zu verbessern.
Die Nukleotidsequenzen, die die hierin beschriebenen varianten HIF-1α-Moleküle codieren, können in einen geeigneten Expressionsvektor inseriert und in Zellen exprimiert werden. Veränderte Varianten der spezifischen HIF-1α-Variante mit der SEQ ID NO:4 können hergestellt werden, um Stabilität, Produktion, Reinigung oder Ertrag des exprimierten Produktes zu verbessern. Zum Beispiel kann die Expression eines Fusionsproteins oder eines spaltbaren Fusionsproteins hergestellt werden, welches die HIF-1α-Variante und ein heterologes Protein umfasst. Ein solches Fusionsprotein kann leicht durch Affinitätschromatographie isoliert werden, z.B. durch Immobilisierung auf einer für das heterologe Protein spezifischen Säule. Wo eine Stelle zur Spaltung zwischen der HIF-1α-Einheit und dem heterologen Protein eingefügt worden ist, kann das HIF-1α-Polypeptid durch Behandlung mit einem geeigneten Enzym oder Agens, welches die Spaltstelle spaltet, von der chromatographischen Säule freigesetzt werden (Booth et al. (1988), Immunol. Lett. 19: 65-708; Gardella et al. (1990), J. Biol. Chem. 265: 15854-15859).
Die Erfindung liefert Verwendungen der hierin definierten Verbindungen für die Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung von durch Hypoxie vermittelte Gewebeschädigung, welche durch Modulation der Expression oder Aktivität des HIF-1-Gens verbessert oder gemildert wird. Der Ausdruck „Modulation" umfasst die Hemmung der Expression von HIF-1, wenn gewünscht, oder die Verstärkung der Expression von HIF-1, wenn geeignet. Wo die Expression oder die Verstärkung der Expression von HIF-1 gewünscht wird, umschließt die Behandlung, für die das Arzneimittel hergestellt worden ist, direkte (Protein) oder indirekte (Nukleotid) Verabreichung von HIF-1.
Im Einklang mit der Verwendung der Erfindung wird ein Arzneimittel, das HIF-1 oder die Nukleotidsequenz, die HIF-1 codiert, umfasst, einem menschlichen Patienten zur Behandlung von durch Hypoxie verursachter Gewebeschädigung verabreicht. Der geeignete menschliche Patient ist jemand, der unter einer durch Hypoxie verursachten Fehlfunktion leidet, wie etwa einer atherosklerotischen Koronar- oder Zerebralarterienerkrankung. Wenn ein Patient mit einem hierin verwendeten Arzneimittel, der ein Nukleotid umfasst, behandelt wird, kann das Nukleotid eine HIF-1α codierende Sequenz, oder eine HIF-1α codierende Nukleotidsequenz und eine HIF-1β codierende Nukleotidsequenz sein (vgl. zum Beispiel Rayes et al., Science 256: 1193-1195, 1992; und Hoffman et al., Science 252: 954-958, 1991).
Wo Hemmung der Expression von HIF-1α gewünscht wird, wie etwa die Hemmung von Tumor-Proliferation, vermittelt durch VEGF-induzierte Angiogenese, können hemmende Nukleinsäuresequenzen verwendet werden, die mit der Expression von HIF-1 auf der transkriptionalen Ebene in Wechselwirkung treten. Dieser Ansatz verwendet zum Beispiel Antisense-Nukleinsäure, Ribozyme oder Dreifach-Agenzien, um Transkription oder Translation einer spezifischen HIF-1α-mRNA oder DNA zu blockieren, entweder, indem diese mRNA mit einer Antisense-Nukleinsäure oder DNA mit einem Dreifach-Agens maskiert wird, oder durch Spaltung der Nukleotidsequenz mit Hilfe eines Ribozyms.
Antisense-Nukleinsäuren sind DNA- oder RNA-Moleküle, die wenigstens zu einem Teil komlementär zu einem spezifischen mRNA-Molekül sind (Weintraub (1990), Scientific American 262:40). In der Zelle hybridisieren die Antisense-Nukleinsäuren mit der entsprechenden mRNA, ein doppelsträngiges Molekül bildend. Die Antisense-Nukleinsäuren beeinträchtigen die Translation der mRNA, da die Zelle eine mRNA, die doppelsträngig ist, nicht translatieren wird. Antisense-Oligomere mit etwa 15 Nukleotiden sind bevorzugt, da sie sich leicht synthetisieren lassen und weniger Probleme verursachen als größere Moleküle, wenn sie in die HIF-1α produzierende Zelle eingeführt werden.
Die Verwendung eines Oligonukleotids zum Stoppen der Transkription ist als eine Dreifach-Strategie bekannt, da sich das Oligomer um die Doppelhelix der DNA windet, eine dreisträngige Helix bildend. Daher können diese Dreifach-Verbindungen so entworfen werden, dass sie eine bestimmte Stelle auf einem ausgewählten Gen erkennen (Maher et al. (1991), Antisense Res. and Dev. 1:227; Helene (1991), Anticancer Drug Design, 6:569).
Ribozyme sind RNA-Moleküle, die die Fähigkeit besitzen, andere einsträngige RNA spezifisch in einer den DNA-Restriktionsendonukleasen analogen Weise zu spalten. Durch die Veränderung der Nukleotidsequenzen, die diese RNAs codieren, ist es möglich, Moleküle zu erzeugen, die Nukleotidsequenzen in einem RNA-Molekül spezifisch erkennen und es spalten (Cech (1988), J. Amer. Med. Assn. 260:3030). Ein größerer Vorteil dieses Ansatzes ist, dass nur mRNAs mit bestimmten Sequenzen inaktiviert werden, weil sie sequenzspezifisch sind.
Es gibt zwei Grunddtypen von Ribozymen, nämlich den Tetrahymena-Typ (Hasselhoff (1988) Nature 334:585) und den „Hammerkopf"-Typ. Ribozyme des Tetrahymena-Typs erkennen Sequenzen, die eine Länge von vier Basen haben, während Ribozyme des „Hammerkopf"-Typs Basensequenzen mit einer Länge von 11-18 Basen erkennen. Je länger die Erkennungssequenz ist, desto größer ist die Wahrscheinlichkeit, dass die Sequenz ausschließlich in dem Typ der Ziel-mRNA vorkommt. Folglich sind Ribozyme des „Hammerkopf"-Typs den Ribosomen des Tetrahymena-Typs zur Inaktivierung einer spezifischen mRNA-Art vorzuziehen, und Erkennungssequenzen mit 18 Basen sind kürzeren Erkennungssequenzen vorzuziehen.
Suppression der HIF-1-Funktion kann auch durch Verabreichung eines varianten HIF-1-Polypeptides (negativ dominante Variantenform) oder durch eine Nukleotidsequenz, die ein variantes HIF-1-Polypeptid codiert, erreicht werden. Zum Beispiel wäre es im Fall von Erkrankungen, die durch die Expression von HIF-1α verstärkt werden, wie etwa sekundäre Tumor-Proliferation durch VEGF-vermittelte Angiogenese, wünschenswert, den Tumor „auszuhungern", indem Gefäßneubildung, die zur ausreichenden Versorgung des Tumors mit Nährstoffen notwendig ist, verhindert wird. Durch Verabreichung einer HIF-1α-Polypeptidvariante oder einer Nukleotidsequenz, die ein solches Polypeptid codiert, wird die Variante mit dem HIF-1α des Wildtyps um eine Bindung an HIF-1β zur Bildung des HIF-1-Dimers konkurrieren, wodurch die Konzentration des HIF-1-Dimers, das wirksam das HIF-1-Bindungsmotiv der DNA binden kann, in der Zelle verringert wird.
Die vorliegende Erfindung umschließt auch, dass die hierin definierten Arzneimittel in der Gentherapie eingesetzt werden können, um durch Hypoxie verursachte Erkrankungen, die durch das HIF-1-Polypeptid gebessert oder gemildert werden können, zu behandeln. Eine solche Therapie würde ihre therapeutische Wirkung durch die Einführung des HIF-1α-Nukleotides allein oder in Kombination mit dem HIF-1β-Nukleotid in Zellen, die hypoxischen Zuständen ausgesetzt sind, erreichen. Die Zuführung des HIF-1α-Nukleotides allein oder in Kombination mit dem HIF-1β-Nukleotid kann erreicht werden, indem ein rekombinanter Expressionsvektor, wie etwa ein chimäres Virus oder ein kolloidales Dispersionssystem verwendet werden. Besonders bevorzugt für die therapeutische Zuführung von Sequenzen ist die Verwendung von zielgerichteten Liposomen.
Die zahlreichen virale Vektoren, die für die hierin unterrichtete Gentherapie verwendet werden können, umschließen Adenovirus, adeno-assoziierten Virus, Herpesvirus, Vaccinia oder bevorzugt ein RNA-Virus, wie etwa ein Retrovirus. Bevorzugt ist der retrovirale Vektor ein Derivat eines Retrovirus von Maus oder Vogel. Beispiele für retrovirale Vektoren, in die ein einzelnes fremdes Gen inseriert werden kann, umschließen, sind aber nicht hierauf begrenzt: murines Moloney Leukämievirus (MoMuLV), murines Harvey Sarkomvirus (HaMuSV), murines Brusttumorvirus (MuMTV) und Rous-Sarkomvirus (RSV). Wenn der Patient ein Mensch ist, wird bevorzugt ein Vektor wie das Leukämievirus von Gibbonaffen (GaLV) verwendet. Eine Reihe von zusätzlichen retroviralen Vektoren kann mehrere Gene aufnehmen. Alle diese Vektoren können ein Gen für eine selektierbare Markierung transferieren oder aufnehmen, so dass transduzierte Zellen erkannt und erzeugt werden können. Indem eine interessierende HIF-1α-Sequenz zusammen mit einem anderen Gen, welches zum Beispiel den Liganden für einen Rezeptor auf einer spezifischen Zielzelle codiert, in den viralen Vektor inseriert wird, ist der Vektor nun zielspezifisch. Retrovirale Vektoren können zielspezifisch gemacht werden, indem zum Beispiel ein Zucker, ein Glykolipid oder ein Protein angehängt werden. Bevorzugt wird Ausrichtung auf ein Ziel erreicht, indem ein Antikörper zur Ausrichtung des retroviralen Vektors auf ein Ziel verwendet wird. Fachleute auf dem Gebiet werden wissen oder können leicht ohne umfangreiches Experimentieren nachvollziehen, dass spezifische Polynukleotidsequenzen, die in das retrovirale Genom inseriert oder an die virale Hülle angeheftet werden können, um zielgerichtete Zuführen des retroviralen Vektors, der die HIF-1α-Nukleotidseugenz enthält, zu ermöglichen.
Da rekombinante Retroviren defekt sind, benötigen sie Unterstützung, um infektiöse Vektorpartikel herzustellen. Diese Unterstützung kann zum Beispiel durch Verwendung von Helfer-Zelllinien geliefert werden, die Plasmide enthalten, welche alle Strukturgene des Retrovirus unter der Kontrolle von Regulatorsequenzen innerhalb des LTR codieren. Diesen Plasmiden fehlt eine Nukleotidsequenz, welche den Verpackungsmechanismus in die Lage versetzt, eine RNA-Transkription zur Verkapselung zu erkennen. Helfer-Zelllinien, die Deletionen des Verpackungssignals aufweisen, umschließen zum Beispiel, sind aber nicht hierauf begrenzt, Ψ2, PA317 und PA12. Diese Zelllinien produzieren leere Virione, da kein Genom verpackt ist. Wenn ein retroviraler Vektor in solche Zellen eingeführt wird, in denen das Verpackungssignal intakt ist, die Strukturgene aber durch andere interessierende Gene ersetzt werden, kann der Vektor verpackt und ein Vektor-Virion erzeugt werden.
Alternativ können NIH 3T3 oder andere Gewebekulturzellen direkt mit Plasmiden, die die retroviralen Strukturgene gag, pol und env codieren, unter Verwendung der herkömmlichen Calciumphosphat-Transfektion transfiziert werden. Diese Zellen werden dann mit dem Vektor-Plasmid transfiziert, das die interessierenden Gene enthält. Die entstehenden Zellen entlassen den retroviralen Vektor in das Kulturmedium.
Ein anderes zielgerichtetes Zuführungssystem für HIF-1α-Nukleotide ist ein kolloidales Dispersionssystem. Kolloidale Dispersionssysteme umschließen Makromolekülkomplexe, Nanokapseln, Mikrokügelchen, Perlen und auf Lipid basierende Systeme, einschließlich Öl-in-Wasser-Emulsionen, Mizellen, gemischter Mizellen und Liposomen. Das bevorzugte kolloidale System ist ein Liposom. Liposomen sind künstliche Membranvesikel, die als Zuführungsvehikel in vitro und in vivo nützlich sind. Es ist gezeigt worden, dass große, unilamellare Vesikel (LW), deren Größe von 0,2-4,0 μm reicht, einen hohen Prozentsatz an wässriger Pufferlösung, die große Makromoleküle enthält, einschließen kann. RNA, DNA und intakte Virionen können innerhalb des wässrigen Inhaltes eingeschlossen werden und in biologisch aktiver Form den Zellen zugeführt werden (Fraley et al. (1981), Trends Biochem. Sci. 6:77). Zusätzlich zu Säugetierzellen sind Liposomen zur Zuführung von Polynukleotiden in Pflanzen-, Hefe- und Bakterienzellen verwendet worden. Um ein Liposom zu einem wirksamen Gentransfer-Vehikel zu machen, sollten die nachstehenden Eigenschaften vorhanden sein: (1) Einschluss der interessierenden Gene mit hoher Wirksamkeit, ohne ihre biologische Aktivität zu beeinträchtigen; (2) bevorzugte und wesentliche Bindung an eine Zielzelle im Vergleich zu Nicht-Zielzellen; (3) Zuführung des wässrigen Inhalts des Vesikels in das Zytoplasma der Zielzelle mit hoher Wirksamkeit; und (4) genaue und wirksame Expression von genetischer Information (Mannino et al. (1988), Biotechniques 6:682).
Die Zusammensetzung der Liposomen ist gewöhnlich eine Kombination aus Phospholipiden, besonders Phospholipiden mit hoher Phasen-Übergangstemperatur, gewöhnlich in Kombination mit Sterinen, besonders Cholesterin. Andere Phospholipide oder andere Lipide können ebenfalls verwendet werden. Die physikalischen Eigenschaften von Liposomen sind abhängig von pH-Wert, Ionenstärke und dem Vorhandensein von divalenten Kationen.
Beispiele für Lipide, die bei der Herstellung von Liposomen nützlich sind, umschließen Phosphatidyl-Verbindungen, wie etwa Phosphatidylglycerin, Phosphatidylcholin, Phosphatidylserin, Phosphatidylethanolamin, Sphingolipide, Cerebroside und Ganglioside. Besonders nützlich sind Diacylphosphatidylglycerine, bei denen die Lipid-Einheit zwischen 14-18 Kohlenstoffatome, besonders zwischen 16-18 Kohlenstoffatome, umfasst und gesättigt ist. Beispielhafte Phospholipide umschließen Phosphatidylcholin aus dem Ei, Dipalmitoylphosphatidylcholin und Distearoylphosphatidylcholin.
Die Zielrichtung von Liposomen kann anhand von anatomischen und mechanischen Faktoren klassifiziert werden. Die anatomische Klassifizierung beruht auf dem Grad der Selektivität, zum Beispiel organspezifisch, zellspezifisch und organellen-spezifisch. Mechanische Zielrichtung kann, basierend darauf, ob sie aktiv oder passiv erfolgt, unterschieden werden. Passive Zielrichtung nutzt die natürliche Tendenz von Liposomen, sich an Zellen des retikulo-endothelialen Systems (RES) in Organen zu verteilen, die sinusoidale Kapillaren enthalten. Aktive Zielrichtung dagegen beinhaltet Veränderung des Liposoms durch Binden des Liposoms an einen spezifischen Liganden, wie etwa einen monoclonalen Antikörper, Zucker, ein Glycolipid oder Protein, oder durch Änderung der Zusammensetzung oder der Größe des Liposoms, um die Zielrichtung auf Organe und Zelltypen zu erreichen, die sich von den natürlich auftretenden Anlagerungsstellen unterscheiden.
Die Oberfläche des zielgerichteten Zuführungssystems kann durch eine Reihe von Vorgehensweisen verändert werden. Im Fall des liposomalen zielgerichteten Zuführungssystems können Lipidgruppen in die Lipiddoppelschicht des Liposoms eingelagert werden, um den zielgerichteten Liganden in stabiler Verbindung mit der liposomalen Doppelschicht zu halten. Verschiedene Bindungsgruppen können verwendet werden, um die Lipidketten mit dem zielgerichteten Liganden zu verbinden.
Auf Grund der biologischen Aktivität von HIF-1 in verstärkender Synthese mit VEGF, EPO und glycolytischen Enzymen ergibt sich eine Veilzahl von Anwendungen unter Verwendung des Polypeptides oder Nukleotides, die in der Erfindung verwendet werden. Solche Anwendungen umschließen die Herstellung von Arzneimitteln zur Behandlung von mit Hypoxie verbundener Gewebeschädigung und durch HIF-1 vermittelten Erkrankungen. Zusätzlich kann HIF-1 in verschiedenen Gentherapieverfahren hilfreich sein. HIF-1 kann verwendet werden, um durch Hypoxie vermittelte Gewebeschädigung zu verhindern oder zu beheben. Wichtige Anwendungen umschließen die Herstellung von Arzneimitteln zur Behandlung von Erkrankungen zerebraler und koronarer Arterien.
Umgekehrt kann das Blockieren der HIF-1-Wirkung, entweder mit anti-HIF-1-Antikörpern, anti-HIF-1α-Antikörpern oder mit einem HIF-1α-antisense-Nukleotid, Erkrankungen, die von der HIF-1-Wirkung abhängen, z.B. V-EGF-unterstützte Tumor-Gefäßbildung, verlangsamen oder abmildern. Die vorstehend beschriebenen Systeme zur Zuführung eines HIF-1α-Nukleotides sind vollständig anwendbar, um einen HIF-1-Antagonisten zur spezifischen Blockierung von HIF-1-Expression und/oder Aktivität zuzuführen, wenn gewünscht. Ein HIF-1-Antagonist kann ein HIF-1-Antikörper, ein HIF-1α-Antikörper, eine HIF-1α-antisense-Nukleotidsequenz oder das Polypeptid oder Nukleotid einer HIF-1α-Variante sein.
Besonders liefert die vorliegende Erfindung die Verwendungen einer Nukleotidsequenz, die HIF-1α codiert, ausgewählt aus einer Gruppe, bestehend aus:

(a) Nukleotidsequenzen, die ein Polypeptid codieren, welches die in SEQ ID NO:2 dargestellten Aminosäuresequenzen umfasst;
(b) Nukleotidsequenzen, die die in SEQ ID NO:1 dargestellte Sequenz der Codierungsregion umfasst;
(c) Nukleotidsequenzen, die einen Abschnitt des in SEQ ID NO:2 dargestellten Polypeptides codieren, wobei dieser Abschnitt HIF-1α-Aktivität aufweist;
(d) Nukleotidsequenzen, die in der Lage sind, selektiv an eine der unter (a) bis (c) beschriebenen Nukleotidsequenzen unter stringenten Bedingungen zu hybridisieren, und die ein HIF-1α-Polypeptid oder einen Abschnitt hiervon codieren, welcher HIF-1α-Aktivität aufweist; und
(e) Nukleotidsequenzen, die sich von den unter (a) bis (d) beschriebenen Nukleotidsequenzen auf Grund der genetischen Degeneriertheit unterscheiden;

Die HIF-1α codierende Nukleotidsequenz, die in den hierin genannten Anwendungen verwendet werden soll, kann aus einer Säugetierzelle stammen. Es ist besonders vorgesehen, dass die Säugetierzelle, die in den Anwendungen der vorliegenden Erfindung verwendet werden soll, eine menschliche Zelle ist. Darüber hinaus ist es vorgesehen, dass die Nukleotidsequenz, die HIF-1α codiert, die Nukleotide 1 bis 3736 umfasst, wie in der SEQ ID NO:1 dargestellt ist. Die Vektoren, die in der vorliegenden Erfindung verwendet werden, können Plasmide oder Viren sein. Die in der vorliegenden Erfindung verwendeten Wirtszellen können prokaryontisch oder eukaryontisch sein.
Die Isolierung und Reinigung von HIF-1 aus EPO produzierenden Hep3B-Zellen und nicht EPO produzierenden HeLa S3-Zellen wird in den Beispielen 1-3 beschrieben. HIF-1-Protein wurde 11.250-fach durch DEAE-Ionenaustausch- und DNA-Affinitätschromatographie aufgereinigt. Die Analyse von HIF-1 ergab 4 Polypeptide mit Molekulargewichten von 91, 93, 94 (HIF-1β) und 120 kDa (HIF-1α). Die Glyceringradient-Sedimentationsanalyse zeigt an, dass HIF-1 überwiegend als ein Heterodimer und in geringerem Ausmaß als ein Heterotetramer vorliegt.
Das HIF-1α-Polypeptid wurde isoliert und sequenziert. Seine cDNA wurde durch PCR erzeugt, und seine Sequenz bestimmt. Das HIF-1α-Polypeptid wird als ein basisches Helix-Schleifen-Helix (bHLH) -Polypeptid beschrieben, das eine PAS-Domäne enthält, dessen Expression durch den zellulären O₂-Druck reguliert wird (Beispiele 4-7).
Die Induktion der Transkription von Genen, die die glykolytischen Enzyme codieren, durch HIF-1 wurde untersucht (Beispiel 9). Die Studien ergaben, dass die glykolytischen Enzyme Aldolase A (ALDA), Phosphoglycerat-Kinase 1 (PGK1) und Pyruvat-Kinase M (PKM) induziert werden, wenn die Zellen HIF-1 induzierenden Agenzien (1% O₂, CoCl₂, DFX) ausgesetzt werden. Diese Gene besitzen HIF-1-Bindungsstellen, von denen gezeigt wurde, dass sie spezifisch HIF-1 binden. Diese Ergebnisse unterstützen die Rolle von HIF-1 als Vermittler von adaptiven Antworten auf Hypoxie, die zellulärer und systemischer Sauerstoff-Homöostase unterliegen.
Eine dominant negative Variante von HIF-1α wurde erzeugt, der die basische Domäne (Aminosäuren 17-3O) des Proteins fehlte, die für die Bindung von HIF-1 an DNA notwendig ist (Referenzbeispiel 10). Die variante HIF-1α-Untereinheit kann mit HIF-1β dimerisieren, aber das entstehende Heterodimer kann DNA nicht binden. In Zellen, die die variante HIF-1α-Untereinheit überexprimieren, war die Mehrheit der HIF-1β-Untereinheiten in nicht-funktionalen Heterodimeren gebunden, was eine funktionale Inaktivierung von HIF-1 zur Folge hatte. Diese Ergebnisse zeigen, dass die HIF-1α-Variante in vivo nützlich ist, um HIF-1-Aktivität zu blockieren.
Die nachstehenden Beispiele sollen die Erfindung erläutern, aber nicht begrenzen. Die Vorgehensweisen sind jene, die typischerweise verwendet werden können, andere, die Fachleuten auf dem Gebiet bekannt sind, können jedoch alternativ verwendet werden.
Beispiel 1 Experimentelle Verfahren.
Menschlicher HIF-1 wurde gereinigt, und seine DNA-Bindungsaktivität wurde wie nachstehend bestimmt.
Herstellung von Zellkultur und Zellkernextrakt. Menschliche Hep3B- und HeLa-Zellen wurden in Kultur gehalten und mit 1% O₂ und CoCl₂ behandelt (Wang & Semenza (1993a) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 4304-4308), und Zellkernextrakte wurden wie vorstehend beschrieben hergestellt (Semenza & Wang (1992) Mol. Cell. Biol. 12: 5447-5454; Dignam et al. (1983), Nucleic Acids Res. 11: 1474-1489). HeLa S3-Zellen, erhalten von der American Type Culture Collection, wurden an Suspensionswachstum in Spinner's essentiellem Minimum-Kulturmedium, das mit 5% (v/v) Pferdeserum (Quality Bioiogical, Gaithersburg, MD) angereichert war, gewöhnt. Die Zellen wurden in einer Dichte von 8 × 10⁵ Zellen/ml gezüchtet und in Kultur gehalten, indem alle 2 Tage mit frischem vollständigem Kulturmedium auf 2 × 10⁵ Zellen/ml verdünnt wurde. Zur Induktion der DNA-Bindungsaktivität von HIF-1, wurden HeLa-S3-Zellen mit 125 μM CoCl₂ über 4 h bei 37 °C behandelt, bevor sie durch Zentrifugieren über 10 min mit 2.500 × g geerntet wurden. Der Zellniederschlag wurde zweimal mit eisgekühlter Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung gewaschen und in 5 gepressten Zellvolumen an Pufferlösung A (10 mM Tris-HCl (pH-Wert 7,6), 1,5 mM MgCl₂, 10 mM KCl), ergänzt mit 2 mM Dithiothreitol (DTT), 0,4 mM Phenylmethylsulfonylfluorid und 1 mM Na₃VO₄, resuspendiert. Nach Inkubation auf Eis über 10 min wurden die Zellen mit 2.500 × g über 5 min niedergeschlagen, in 2 gepressten Zellvolumen an Pufferlösung A resuspendiert, und durch 20 Stöße in einem gläsernen Dounce-Homogenisator mit einem Stößel des Typs B lysiert. Die Zellkerne wurden mit 10.000 × g über 10 min niedergeschlagen und in 3,5 gepresstem Zellkernvolumen an Pufferlösung C (0,42 M KCl, 20 mM Tris-HCl (pH-Wert 7,6), 20% Glycerin, 1,5 mM MgCl₂) ergänzt mit 2 mM DTT, 0,4 mM Phenylmethylsulfonylfluorid und 1 mM Na₃VO₄, resuspendiert. Zellkern-Proteine wurden durch Rühren bei 4 °C über 30 min extrahiert. Nach Zentrifugation mit 15.000 × g über 30 min wurde der Überstand gegen Pufferlösung Z-100 (25 mM Tris-HCl (pH-Wert 7,6), 0,2 mM EDTA, 20% Glycerin, 2 mM DTT, 0,4 mM Phenylmethylsulfonylfluorid, 1 mM Na₃VO₄ und 100 mM KCl) bei 4 °C dialysiert. Das Dialysat wurde durch Ultrazentrifugation mit 100.000 × g über 60 min bei 4 °C geklärt und als Zellkern-Rohextrakt bezeichnet. Die Zellkernextrakte wurden in Aliquots aufgeteilt in flüssigem N₂ tiefgefroren und bei -80 °C gelagert. Die Proteinkonzentration wurde durch das Verfahren von Bradford (1976), Anal. Biochem. 72: 248-254, mit Hilfe eines käuflich zu erwerbenden Kits (Bio-Rad) unter Verwendung von Rinderserumalbumin (BSA) als einem Standard bestimmt.
Gel-Shift-Untersuchungen. Gel-Shift-Untersuchungen wurden wie beschrieben durchgeführt (Semenza & Wang (1992) Mol. Cell. Biol. 12: 5447-5454), mit der Änderung, dass die Bindungsreaktion in Pufferlösung Z-100 stattfand. Für Gel-Shift-Untersuchungen mit teilgereinigten und affinitätsgereinigten HIF-1-Präparaten wurden 0,25 mg/ml BSA und 0,05% Nonidet P-40 in die Bindungsreaktion eingeschlossen. Nicht spezifische Kälberthymus-DNA (Sigma) als Konkurrent wurde in reduzierten Mengen für teilgereinigte Fraktionen verwendet, für affinitätsgereinigte HIF-1-Fraktionen wurde keine Kälberthymus-DNA verwendet. Für Vergleichsexperimente wurde nicht markierte Oligonukleotid-DNA mit Fraktionen aus der DEAE-Sepharose-Säule über 5 min auf Eis inkubiert, bevor Sonden-DNA zugegeben wurde.
Aus HeLa-Zellen hergestellte Zellkernextrakte, die in Anwesenheit von 0, 5, 10, 25, 50, 75, 100, 250, 500 oder 1000 μM CoCl₂ über 4 h bei 37 °C kultiviert worden waren, wurden mit der W18-Sonde inkubiert.
Methylierungsinterferenz-Analyse. Die Methylierungsinterferenz-Analyse wurde wie beschrieben durchgeführt (Wang & Semenza (1993b) J. Biol. Chem. 268: 21513-21518) mit der Änderung, dass 100 μg des Zellkernextraktes, der aus mit CoCl₂ behandelten HeLa-Zellen hergestellt worden war, in den Bindungsreaktionen verwendet wurden.
Ergebnisse. Um die optimale Konzentration an CoCl₂ für die Induktion der DNA-Bindungsaktivität von HIF-1 zu bestimmen, wurden HeLa-Zellen mit CoCl₂ behandelt. Zellkernextrakte wurden hergestellt und durch Gel-Shift-Untersuchung mit dem Oligonukleotid W18 als Sonde analysiert (Beispiel 2). Ergebnisse werden in 1 dargestellt. Die Induktion der DNA-Bindungsaktivität von HIF-1 durch CoCl₂ war von der Dosis abhängig. HIF-1-Aktivität in Zellkernextrakten wurde bei 25 μM CoCl₂ nachgewiesen und erreichte eine maximale Aktivität bei 250 μM. Bei CoCl₂-Konzentrationen über 250 μM wurde jedoch signifikanter Zelltod beobachtet, der zu vermindertem Ertrag an Zellkern-Proteinen führte. Aus diesem Grund wurden 125 μM CoCl₂ für die anschließende Herstellung von Zellkernextrakt in großem Umfang ausgewählt. Konstitutive DNA-Bindungsaktivitäten, die auch die Sequenz der W18-Sonde spezifisch binden, blieben in Zellen, die mit 0-100 μM CoCl₂ behandelt wurden, relativ unverändert und sanken bei einer CoCl₂-Konzentration von mehr als 250 μM, was eine gegenläufige Wirkung von hohen CoCl₂-Konzentrationen auf die Zellen nahelegt. Nicht spezifische DNA-Bindungsaktivitäten waren in dieser speziellen Gel-Shift-Untersuchung kaum nachweisbar und variieren mit dem Zelltyp und dem relativen Anteil der verwendeten nicht spezifischen Konkurrenz-DNA.
Die Methylierungsinterferenz-Analyse wurde durchgeführt, um zu bestimmen, ob HIF-1 aus hypoxischen Hep3B-Zellen und mit CoCl₂ behandelten HeLa-Zellen die gleichen DNA-Bindungseigenschaften haben. Wie in 2 dargestellt, eliminierte die Methylierung von G₈ beziehungsweise G₁₀ auf dem Codierungsstrang die HIF-Bindung oder reduzierte sie stark (2, links, Linie 2). Die Methylierung von G₁₀ beeinflusste nur zum Teil die Bindung von konstitutiven Faktoren (2, links, Linien 3 und 4). Auf dem nicht codierenden Strang blockierte die Methylierung von G₇ oder G₁₁ die Bindung von HIF-1 an die Sonde (2B, rechts, Linie 2). Nur die Methylierung von G7 beeinflusste die Bindung von konstitutiven Faktoren (2B, rechts, Linien 3 und 4). Die nicht spezifische Bindungsaktivität blieb durch DNA-Methylierung auf beiden Strängen unbeeinflusst (2A, links, Linie 5 und 2B, rechts, Linie 5). Die Ergebnisse zeigen an, dass (i) HIF-1 durch die größere Windung der DNA-Helix einen engen Kontakt zu G₈ und G₁₀ auf dem codierenden Strang und G₇ und G₁₁ auf dem nicht codierenden Strang hat, und (ii) HIF-1 und die konstitutiven DNA-Bindungsfaktoren anhand der Kontakte zu ihrer DNA-Bindungsstelle unterschieden werden können.
Beispiel 2 Biochemische Reinigung von HIF-1.
Herstellung von DNA-Affinitätssäulen. DNA-Affinitätssäulen wurden durch Koppelung von multimerisierten doppelsträngigen Oligonukleotiden an CNBr-aktivierte Sepharose hergestellt (Kadonaga & Tijan (1986), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83: 5889-5893). Die Säule des Wildtyps und der Mutanten enthielt multimerisiertes Oligonukleotid W18 (SEQ ID NO:5)
beziehungsweise M18 (SEQ ID NO:6) (Mutation unterstrichen).
Gleiche Mengen an komplementären Oligonukleotiden wurden angeheftet, phosphoryliert und ligiert. Ligierte Oligonukleotide (60-500 Bp) wurden mit Phenol/Chloroform extrahiert, mit Ethanol ausgefällt, in deionisiertem Wasser resuspensiert und nach Angaben des Herstellers (Pharmacia Biotech Inc.) an CNBr-aktivierte Sepharose 4B gebunden. Etwa 50 μg der ligierten doppelsträngigen Oligonukleotide wurden pro ml Sepharose gebunden.
Reinigung von HIF-1. Zellkern-Rohextrakte aus 120 Litern HeLa S3-Zellen, die mit CoCl₂ behandelt worden waren (435 ml, 3,040 mg), wurden auf Eis aufgetaut und durch Zentrifugation mit 15.000 × g über 10 min geklärt. Die Extrakte wurden als drei Einheiten auf eine DEAE-Sepharose CL-6B-Säule mit 36 ml Größe (Pharmacia) in Pufferlösung Z100 mit einem steilen Gradienten an ansteigender KCl-Konzentration gegeben. Fraktionen, die eine schwache maximale Aktivität enthielten, wurden zusammengegeben und gegen Pufferlösung Z-100 dialysiert. Das Dialysat aus den DEAE-Sepharose-Säulen wurde mit Kälberthymus-DNA (Sigma) in einer Konzentration von 4,4 μg/ml über 15 min auf Eis inkubiert. Nach Zentrifugation mit 15.000 × g über 10 min wurde der Überstand (240 ml; 2,3 mg/ml) auf eine DNA-Affinitätssäule mit 6 ml Größe aufgetragen, die mit verknüpftem W18-Oligonukleotid hergestellt worden war. Die Fraktionen, die HIF-1-Aktivität enthielten, wurden zusammengegeben und gegen Pufferlösung Z-100 dialysiert. Das Dialysat aus der ersten DNA-Affinitätssäule wurde mit Kälberthymus-DNA in einer Konzentration von 2,5 μg/ml vermischt und auf Eis über 15 min inkubiert. Nach Zentrifugation (wie vorstehend beschrieben), wurde der Überstand auf eine M18-DNA-Sepharose-Säule mit 1,5 ml Größe aufgetragen. Der Durchfluss aus der M18-Säule wurde gesammelt und wiederum auf eine zweite W18-Säule mit 2 ml Größe aufgetragen. Alle für die DNA-Aftinitätschromatographie verwendeten Pufferlösungen waren mit 0,05% Nonidet P-40 und 5 mM DTT ergänzt. Die Proteinmenge in den Fraktionen der Affinitätssäulen wurde durch Silberfärbung von SDS-Polyacrylamid-Gelen oder durch Amido-Black (Sigma) -Färbung von Nitrozellulosemembranen (Schleicher & Schuell), auf die Proteinproben aufgetragen worden waren, quantifiziert und mit bekannten Mengen an Standardproteinen (BioRad) verglichen.
Zur Reinigung von HIF-1 aus mit Hypoxie behandelten Hep3B-Zellen wurden Zellkernextrakte (95 mg) mit Hilfe der Verwendung einer DEAE-Sepharose-CL-6B-Säule mit 4 ml Größe wie vorstehend beschrieben fraktioniert. Fraktionen des 0,25 M KCl-Eluats wurden gegen Pufferlösung Z100 dialysiert und auf eine Sephacryl S-300-Gelfiltrationssäule (50 ml, 1,5 × 30 cm) aufgetragen. Die Fraktionen, die HIF-1-Aktivität enthielten, wurden zusammengegeben und auf eine Kälberthymus-DNA-Säule mit 2 ml Größe aufgetragen (0,8 mg Kälberthymus-DNA/ml Sepharose), die hergestellt worden war, indem einsträngige Kälberthymus-DNA an CNBr-aktivierte Sepharose-4B gebunden wurde. Der Durchfluss wurde gesammelt und nach Inkubation mit Kälberthymus DNA (2,2 μg/ml) über 10 min wie vorstehend beschrieben auf eine W18-Säule mit 0,4 ml Größe aufgetragen, gefolgt von einer weiteren W18-Säule nach Dialyse gegen Pufferlösung Z-100.
SDS-PAGE und Silberfärbung. SDS-PAGE wurde wie von Laemmli (1970), Nature 227: 680-685, beschrieben durchgeführt. Die Gele wurden mit Molekulargewichtsstandards für hohe Bereiche oder zuvor angefärbten Molekulargewichtsmarkierungen (Bio-Rad) kalibriert. Die Elektrophorese wurde bei 30 mA durchgeführt. Die Silberfärbung wurde mit Silbernitrat wie beschrieben (Switzer et al. (1979) Anal. Biochem. 98: 231-237) durchgeführt. Die Molekulargewichtsbestimmung für HIF-1-Polypeptide basierte auf SDS-Polyacrylamid-Gelen mit 3,2% Kreuzbindung (Verhältnis Acrylamid/Bisacrylamid von 30:1).
Ergebnisse. Da die DNA-Bindungsaktivität von HIF-1 aus hypoxischen Hep3B-Zellen und aus mit CoCl₂ behandelten HeLa-Zellen nicht zu unterscheiden ist (Beispiel 1), wurden HeLa-S3-Zellen, die mit 125 μM CoCl₂ behandelt worden waren, als Startmaterial für die Reinigung von HIF-1 in großem Maßstab verwendet. Um HIF-1 durch DNA-Affinitätschromatographie zu reinigen, musste zunächst die konstitutive DNA-Bindungsaktivität von HIF-1 getrennt werden, da beide spezifisch die W18-DNA-Sequenz binden. Zahlreiche Ionenaustausch-Harze und Gelfiltrationsmatrizen wurden untersucht. HIF-1 wurde auf DEAE-Anionenaustausch-Harzen in Pufferlösung Z-100 zurückgehalten, während die konstitutive DNA-Bindungsaktivität im Durchfluss gefunden wurde. DNA-Bindungsaktivität von HIF-1 wurde mit 250 mM KCl in Pufferlösung Z eluiert. DEAE-Sepharose-Chromatographie entfernte konstitutive DNA-Bindungsaktivität wirksam und führte zu einer 4-fachen Aufreinigung von HIF-1 (3A, Linien 1 und 2). Dieser Schritt schien jedoch den HIF-1-Proteinkomplex zu destabilisieren und führte zu einer schneller wandernden Form von HIF-1 (3A, Linie 2, zweiter Pfeil), was ebenfalls gelegentlich in Präparationen von Zellkern-Rohextrakten beobachtet wurde. Diese schneller wandernde Form konnte mit höheren Salzkonzentrationen in die langsamer wandernde Bande umgewandelt werden, und nach der ersten Runde der DNA-Affinitäts-Säulenchromatographie erschien HIF-1 wiederum überwiegend in der langsamer wandernden Form (3A, Linien 10-12), was nahelegt, dass kein HIF-1-Bestandteil während des Schrittes der DEAE-Sepharose-Chromatographie verloren gegangen ist. Die Bindung von Sonden an beide HIF-1-Formen konnte durch nicht markierte W18- (3B, Linien 2-4), nicht aber durch M18-Oligonukleotide (3B, Linien 5-7) erreicht werden, welche eine dreifache Basenpaar-Substitution enthielt, die die Fähigkeit des EPO-Enhancers, durch Hypoxie induzierbare Transkription zu vermitteln, zerstörte.
Teilgereinigte HIF-1-Fraktionen wurden dann mit nicht spezifischer Kälberthymus-DNA als Konkurrent in Konzentrationen inkubiert, die optimalen Nachweis der DNA-Bindungsaktivität von HIF-1 durch Gel-Shift-Untersuchungen gestatteten, und auf eine W18-DNA-Affinitätssäule aufgetragen. Eluierte Fraktionen, die HIF-1 enthielten (0,5 M KCl, 3A, Linie 10; 1 M KCl, 3A, Linie 11), wurden zusammengegeben und gegen Pufferlösung Z-100 dialysiert. Um nicht spezifische DNA-Bindungsproteine, die nicht durch den Kälberthymus-DNA-Konkurrenten entfernt worden waren, zu eliminieren, wurde das Dialysat auf eine M18-DNA-Säule aufgetragen. Die DNA-Bindungsaktivität von HIF-1 wurde im Durchfluss nachgewiesen, welcher dann direkt auf eine zweite W18-Säule aufgetragen wurde. HIF-1-Aktivität wurde ausschließlich in den 0,5 M KCl-Fraktionen nachgewiesen. Zwei Runden einer W18- und eine Runde einer M18-Säulenchromatographie führten zu einer etwa 2.800-fachen Aufreinigung.
Die Ergebnisse der letzten Aufreinigung in großem Maßstab werden in Tabelle 1 zusammengefasst. Aus 120 Litern HeLa-Zellen wurden etwa 60 μg an hoch gereinigtem HIF-1 gewonnen. Die gesamte Aufreinigung betrug das 11.250-Fache und enthielt etwa 22% der anfänglichen DNA-Bindungsaktivität von HIF-1. Unser Ziel war bestand darin, HIF-1-Untereinheiten zu identifizieren und HIF-1-Bestandteile zum Zweck der Peptidkartierung und Protein-Mikrosequenz-Analyse zu isolieren. Da zusätzliche Reinigungsschritte zu einem deutlich geringeren Ertrag führten, reinigten wir HIF-1 nicht weiter bis zur Homogenität. Sowohl Aliquots vom Durchfluss der M18-Säule (4A, Ladung) als auch des Waschschrittes mit 0,25 M KCl und der 0,5 M KCl-Eluatfraktionen der zweiten W18-Säule wurden mit Hilfe der 6%-SDS-PAGE-Analyse und Silberfärbung analysiert. Vier Polypeptide mit 90-120 kDa wurden in der 0,5 M KCl-Fraktion hoch angereichert, welche im Vergleich mit der 0,25 M KCl-Fraktion, die sehr geringe HIF-1-Bindungsaktivität aufwies, eine hohe DNA-Bindungsaktivität von HIF-1 besaß. Die 0,5 M KCl-Fraktion wies jedoch immer noch viele verunreinigenden Proteine auf, die in der 0,25 M KCl-Fraktion gefunden worden waren.
In einer zusätzlichen Pilot-Reinigung von HIF-1 aus durch Hypoxie induzierten Hep3B-Zellen wurde ein abweichendes Reinigungsprotokoll verwendet. Es stellte sich heraus, dass Gelfiltration über eine Sephacryl S 300-Säule ebenfalls wirksam HIF-1- von konstitutiver DNA-Bindungsaktivität trennt. Zusätzlich wurde eine Kälberthymus-DNA-Säule verwendet, um nicht spezifische DNA-Bindungsproteine vor den zwei Runden der W18-DNA-Affinitätschromatographie zu entfernen. HIF-1-Aktivität wurde in den 0,5 M KCl-Fraktionen aus beiden DNA-Säulen nachgewiesen. Sowohl ein Aliquot aus der 0,5 M KCl-Eluatfraktion der ersten W18-Säule (4B, Ladung) als auch aus dem 0,25 M KCl-Waschschritt und den 0,5 M KCl-Eluatfraktionen aus der zweiten W18-Säule wurden mit Hilfe der 7% SDS-PAGE-Analyse und Silberfärbung analysiert. Vier Polypeptide mit ähnlicher Molekülmasse wie jene, die zusammen mit der DNA-Bindungsaktivität von HIF-1 in den mit CoCl₂ behandelten HeLa-Zellen gereinigt worden waren, befanden sich in dem affinitätsgereinigten Präparat aus hypoxischen Hep3B-Zellen (4B, Linie 3, Pfeile), was darauf hinweist, dass HIF-1 aus den beiden unterschiedlichen Zelltypen aus den selben Polypeptid-Untereinheiten zusammengesetzt ist. Affinitätsgereinigter HIF-1 sowohl aus mit CoCl2 behandelten HeLa-Zellen als auch aus hypoxischen Hep3B-Zellen band in Gel-Shift-Untersuchungen spezifisch an die W18-Sonde.
Beispiel 3. Analyse der HIF-1-Untereinheiten
Die nachstehenden Experimente wurden durchgeführt, um Polypeptide zu identifizieren, die Teil des DNA-Bindungskomplexes von HIF-1 sind.
Präparative Gel-Shift-Untersuchungen wurden mit 30 μl affinitätsgereinigtem HIF-1 und Sonde W18 durchgeführt. Gel-Scheiben, die HIF-1 enthielten, und umgebende Gebiete wurden nach Autoradiographie mit nassem Gel isoliert. Gel-Scheiben wurden auf dem geschichteten Gel aus einem 6% SDS-Polyacrylamid-Gel platziert und mit Leämmli-Pufferlösung in situ über 15 min inkubiert, und parallel dazu wurde eine Elektrophorese mit 30 μl affinitätsgereinigtem HIF-1 und Molekulargewichtsmarkierungen durchgeführt. Für die zweidimensionale denaturierende Gel-Elektrophorese wurden zwei Aliquots an affinitätsgereinigtem HIF-1 auf einem 6% SDS-Polyacrylamid-Gel mit 5% Kreuzbindung (Acrylamid/Biacrylamid im Verhältnis von 19:1) gelöst. Eine der Linien wurde mit Silbernitrat angefärbt. Die Gel-Scheiben, die interessierenden Regionen entsprachen, wurden aus der nicht angefärbten Linie isoliert. Die isolierten Gel-Scheiben wurden direkt auf den auf dem geschichteten Gel der zweiten Dimension des 6% SDS-Polyacrylamid-Gels mit 3,2% Kreuzbindung platziert, und parallel wurde eine Elektrophorese mit 30 μl Affinitätsgereinigtem HIF-1 durchgeführt.
Peptidkartierung von HIF-1-Untereinheiten.
2 ml affinitätsgereinigter HIF-1 wurden gegen 10 mM Ammoniumbicarbonat, 0,05% SDS dialysiert und lyophilisiert. Nach Resuspendierung in einer solubilisierenden Lösung (100 mM Saccharose, 3% SDS, 21,25 mM Tris-HCl (pH-Wert 6,9), 1 mM EDTA, 5% β-Mercaptoethanol, 0,005% Bromphenol-Blau) wurden die Proteinproben auf 37 °C über 15 min erhitzt und auf einem 6% Polyacrylamid-Gel, das 0,2% SDS enthielt, gelöst. Die Polypeptide wurden elektrophoretisch bei 4 °C auf eine Polyvinylidendifluorid-Membran (Bio-Rad) in 0,5 × Towbin-Pufferlösung (Towbin et al. 1979), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76: 4350-5354) (96 mM Glycin, 12,5 mM Tris-HCl (pH-Wert 8,3)) mit 10% Essigsäure übertragen, mit 5% Essigsäure entfärbt und mit Milli-Q-Wasser gespült. Die Membranscheiben, die die HIF-1 Polypeptide von 120, 94/93, und 91 kDa enthielten, wurden ausgeschnitten und der Peptidkartierung unterworfen (Best et al. (1994) in Techniques in Protein Chemistry V (Crabb, J.W., Hrsg.), S. 205-213, Academic Press, San Diego, CA). Trypsin-Spaltung in situ und Reversphasen-HPLC wurden vom Wistar Protein Microchemistry Laboratory durchgeführt.
UV-Vernetzungsanalyse. UV-Vernetzung wurde wie beschrieben durchgeführt (Wang & Semenza (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 4304-4308), mit der Änderung, dass 30 μl affinitätsgereinigter HIF-1 in der Bindungsreaktion verwendet wurden. Affinitätsgereinigter HIF-1 wurde mit der W18-Sonde in Abwesenheit oder in Anwesenheit von nicht markiertem W18- oder M18-Oligonukleotid inkubiert. Nach der Inkubation über 15 min bei 4 °C wurden die Reaktionsgemische über 30 min mit UV-Licht (312 nm; Fisher Scientific) bestrahlt und durch 6% SDS-PAGE-Analyse mit zuvor angefärbten Molekulargewichtsmarkierungen gelöst und durch Autoradiographie sichtbar gemacht.
Glyceringradient-Sedimentation. Lineare Gradienten von 12 ml 10-30% Glycerin in einer Pufferlösung, die 100 mM KCl, 25 mM Tris-HCl (pH-Wert 7,6), 0,2 mM EDTA, 5 mM DTT und 0,4 mM Phenylmethylsulfonylfluorid enthielt, wurden für die Zentrifugation in einem Beckman-SW40-Rotor über 48 h bei 4 °C hergestellt. Zellkernextrakt, der aus hypoxischen Hep3B-Zellen hergestellt worden war, (100 μl, 5 mg/ml), wurde mit einem gleichen Volumen an Glyceringradient-Pufferlösung, die 10% Glycerin enthielt, vermischt und über den Gradienten geschichtet. Ein Markierungsgradient wurde parallel dazu sedimentiert und enthielt jeweils 50 μg Thyroglobulin (660 kDa), Ferritin (440 kDa), Katalase (232 kDa), Aldolase (158 kDa), und BSA (67 kDa) (Pharmacia). Die Markierungen wurden auf gleiches Volumen und gleiche Glycerinkonzentration wie die Probe eingestellt. Fraktionen (0,5 ml) wurden aus dem oberen Abschnitt der Röhrchen gesammelt, und die DNA-Bindungsaktivität wurde durch die Gel-Shift-Untersuchung gemessen. Die Markierungen wurden durch SDS-PAGE-Analyse und Silberfärbung untersucht.
Ergebnisse. Um Polypeptide zu identifizieren, die Teil des DNA-Bindungskomplexes von HIF-1 sind, wurden präparative Gel-Shift-Untersuchungen mit affinitätsgereinigtem HIF-1 und W18-Sonde durchgeführt. Gel-Scheiben, die den HIF-1-DNA-Komplex enthielten, wurden isoliert, direkt in die Vertiefungen eines SDS-Polyacrylamid-Gels inseriert und durch Elektrophorese parallel mit einem Aliquot an affinitätsgereinigtem HIF-1 analysiert (5A). Vier Polypeptide, die in dem HIF-1-Komplex vorkommen, wanderten mit einem offensichtlichen Molekulargewicht von 120, 94, 93 beziehungsweise 91 kDa (5A, HIF-1). Keines dieser Peptide wurden in Gel-Scheiben nachgewiesen, die aus anderen Regionen der selben Linie isoliert wurden. Diese vier Polypeptide wanderten an den gleichen Positionen wie die Polypeptide, die zusammen mit der DNA-Bindungsaktivität von HIF-1 durch DNA-Affinitätschromatographie gereinigt worden waren (5A, Linie A). Das Polypeptid mit 120 kDa und die Polypeptide mit 91-94 kDa scheinen in einem äquimolaren Verhältnis vorzuliegen, was nahelegt, dass das Polypeptid mit 120 kDa Komplexe mit einem der 91-, 93- und 94 kDa großen Polypeptide bildet.
Auf einem der 6% SDS-Polyacrylamid-Gele mit 3,2% Kreuzbindung wanderte das HIF-1-Polypeptid mit 120 kDa sehr dicht zusammen mit einem verunreinigenden Polypeptid mit einem etwas größeren offenbaren Molekulargewicht (5A, Linie A), was die Isolierung des 120 kDa großen Polypeptids erschwerte. Dieses Problem wurde gelöst, indem die HIF-1-Polypeptide auf einem 6% SDS-Polyacrylamid-Gel mit 5% Kreuzbindung aufgetrennt wurden. Das Polypeptid mit 120 kDa wanderte auf dem höher vernetzten Gel im Vergleich zur Wanderung der Molekularmassenmarkierung mit 116 kDa viel schneller, wohingegen die Wanderung der Bande der Verunreinigung (*1) unverändert blieb (5B, Linie A). Unter diesen Bedingungen lief jedoch das Polypeptid mit 91 kDa sehr dicht zusammen mit einer anderen Bande einer Verunreinigung (*2) unter sich. Zwei Systeme von Polyacrylamid-Gelen mit verschiedenen Graden an Kreuzbindungen waren daher für die Isolierung der HIF-1-Polypeptide mit 91-94 kDa beziehungsweise 120 kDa erforderlich.
Um zu bestätigen, das die HIF-1-Polypeptide, die durch die beiden Gel-Systeme identifiziert wurden, identisch sind, wurde eine zweidimensionale denaturierende Gel- Elektrophorese durchgeführt. Affinitätsgereinigter HIF-1 wurde zunächst auf einem 6% SDS-Polyacrylamid-Gel mit 5% Kreuzbindung gelöst (wie in 5B, Linie A). Sowohl Regionen des Gels, die die HIF-1-Polypeptide mit 120 kDa, mit 94/93/91 kDa enthielten, als auch die beiden kontaminierenden Banden wurden isoliert und durch Elektrophorese auf einem 6% SDS-Polyacrylamid-Gel mit 3,2% Kreuzbindung parallel zu einem Aliquot des affinitätsgereinigten HIF-1 analysiert. Wie in 5C gezeigt wird, wandern der isolierte HIF-1 und verunreinigte Polypeptide zusammen mit den entsprechenden Banden in den Kontrollproben, was darauf hinweist, dass die Unterschiede in ihrem Wanderungsverhalten auf unterschiedliche Vernetzungsgrade der Polyacrylamid-Gele zurückzuführen sind.
Um zu bestimmen, ob die vier Polypeptide aus dem HIF-1-Komplex eigene Proteinarten darstellen, wurde eine tryptische Peptidkartierung durchgeführt. Die Bande mit 91 kDa wurde individuell isoliert, während die Banden mit 93 und 94 kDa nach elektrophoretischer Trennung und Übertragung auf eine Polyvinylidendifluorid-Membran zusammen ausgeschnitten wurden. Die Proteine wurden mit Trypsin in situ gespalten, und die tryptischen Peptide wurden durch Reversphasen-HPLC (6) getrennt. Die Elutionsprofile der tryptischen Peptide, die von dem Protein mit 91 kDa und den Proteinen mit 93/94 kDa stammten, waren nahezu deckungsgleich (6), was nahelegt, dass sie von ähnlichen Polypeptiden stammten. Ein weiteres Aliquot an HIF-1 wurde auf einem 6% Polyacrylamid-Gel mit 5% Kreuzbindung zur Isolierung des HIF-1-Polypeptides mit 120 kDa gelöst. Das Elutionsprofil für das tryptische Peptid, das von dem Polypeptid mit 120 kDa stammte, unterschied sich von jenen der Polypeptide mit 91-94 kDa. Diese Ergebnisse legen nahe, dass HIF-1 aus zwei verschiedenen Untereinheiten zusammengesetzt ist, HIF-1α mit 120 kDa und HIF-1β mit 91/93/94 kDa.
Um die Untereinheit(en) für die DNA-Bindung zu identifizieren, wurde affinitätsgereinigter HIF-1 mit der W18-Sonde inkubiert. Nach UV-Bestrahlung, um die DNA-Bindungsproteine über Kreuzbindungen an Nukleotidreste an der Bindungsstelle zu verbinden, wurden die Reaktionsgemische in Laemmli-Pufferlösung gekocht und durch SDS-PAGE gelöst, und über Kreuzbindung gebundene Proteine wurden durch Autoradiographie sichtbar gemacht. Zwei DNA-Bindungsproteine wurden nachgewiesen (7, Bahn 1). Ihre Molekularmassen wurden (nachdem die Molekularmasse von 16 kDa, die auf Sonden-DNA zurückzuführen war, abgezogen worden war) auf etwa 120 und 92 kDa bestimmt, ähnlich wie jene von HIF-1α und HIF-1β. Die Bindung von beiden Proteinen an die Sonde war sequenzspezifisch, da sie mit nicht markiertem W18-Oligonukleotid des Wildtyps konkurrieren konnte (7, Bahn 2), nicht aber mit mutiertem M18-Oligonukleotid (7, Bahn 3). Diese Ergebnisse legen nahe, dass sowohl HIF-1α als auch HIF-1β direkt mit DNA in Kontakt treten. HIF-1α war wesentlich stärker durch Kreuzbindungen an DNA gebunden als HIF-1β (7, Bahnen 1 und 3). Diese Tatsache liefert einen weiteren Hinweis darauf, dass die vier Polypeptide, die durch DNA-Affinitätschromatographie gereinigt worden waren, echte Bestandteile der DNA-Bindungsaktivität von HIF-1 sind.
Um die ursprüngliche Größe von HIF-1 zu bestimmen, wurde die Glyceringradient-Sedimentationsanalyse mit Zellkern-Rohextrakt durchgeführt, der aus hypoxischen Hep3B-Zellen hergestellt worden war.
HIF-1 und die konstitutive DNA-Bindungsaktivität wurden durch Gel-Shift-Untersuchungen beobachtet. In hypoxischen Hep3B-Zellkernextrakten kommen HIF-1-DNA-Komplexe in zwei Formen vor, während in mit CoCl₂ behandelten HeLa-Extrakten die schneller wandernde Form überwiegt. Die Ergebnisse, in 8 dargestellt, zeigen, dass die zwei HIF-1-Doppelbanden durch Sedimentation trennbar sind. Für die schneller wandernde Form wurde eine Molekularmasse von etwa 200-220 kDa bestimmt. Längere Exposition der Autoradiographie ergab, dass die langsamer wandernde Bande zusammen mit Ferritin wanderte, welches eine Molekularmasse von 440 kDa aufweist. Nimmt man eine kugelförmige Konformation für beide Proteinkomplexe an, stimmen diese Ergebnisse mit der Hypothese überein, dass die schneller wandernde Form einen heterodimeren Komplex darstellt, der aus einer HIF-1α-Untereinheit mit 120 kDa und einer HIF-1β-Untereinheit mit 91-94 kDa darstellt, während die langsamer wandernde Form ein Heterotetramer darstellen kann. Die genaue Natur und Stöchiometrie dieser HIF-1-Komplexe bleibt jedoch noch zu bestimmen. Die konstitutive DNA-Bindungsaktivität weist eine Molekularmasse auf, die geringer als das BSA-Protein mit 67 kDa ist. Da die UV-Analyse der Vernetzung anzeigte, dass der konstitutive Faktor eine DNA-Bindungs-Untereinheit mit etwa 40-50 kDa aufweist, ist es höchst wahrscheinlich, dass der konstitutive Faktor DNA als ein Monomer bindet. Übereinstimmend mit den Ergebnissen aus der Glyceringradient-Sedimentationsanalyse eluierte HIF-1 aus einer Sephacryl S-300 Gel-Filtrationssäule vor der konstitutiven Bindungsaktivität, und die langsamer wandernde HIF-1-Gel-Shift-Aktivität eluierte vor der schneller wandernden Form. Diese Ergebnisse legen nahe, dass HIF-1 in Lösung überwiegend als ein Heterodimer und in geringerem Ausmaß als ein Komplex höherer Ordnung vorliegt, und dass diese Komplexe mindestens eine HIF-1α- und eine HIF-1β-Untereinheit umfassen.
Beispiel 4. Isolierung und Charakterisierung von cDNA-Sequenzen von HIF-1α.
Protein-Mikroseguenzanalyse. Gereinigte HIF-1-Untereinheiten wurden durch SDS-Polyacrylamid-Gel-Elektrophorese fraktioniert und die Polypeptide mit 120 und 94 kDa wurden auf Polyvinyliden-Difluorid-Membranen übertragen, individuell mit Trypsin in situ gespalten, und die Peptide wurden durch Reversphasen-Hochdruck-Flüssigkeitschromatographie fraktioniert (Wang & Semenza (1995), J. Biol. Chem. 270: 1230-1237). Die Protein-Mikrosequenzanalyse wurde im Wistar Protein Microchemistry Laboratory, Philadelphia (Best et al. (1994) vorstehend) durchgeführt.
Herstellung und Durchmusterung der cDNA-Bank. Poly(A)+ RNA wurde aus Hep3B-Zellen isoliert, die über 16 h bei 37 °C in einer mit 1% O₂/5% CO₂/Balance-N₂ durchströmten Kammer kultiviert worden waren. cDNA wurde unter Verwendung von Oligo(dT) und zufälligen Hexamer-Primern synthetisiert, und Bakteriophagen-Bibliotheken wurden in λgt11 und Uni-ZAP XR konstruiert (Stratagene, La Jolla, CA). cDNA-Bibliotheken wurden mit Hilfe von ³²P-markierten cDNA-Fragmenten durch Plaque-Hybridisierung durchmustert, wie beschrieben Sambrook et al. (1989), Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. Aufl.; Cold Spring Harbor Laboratory Press, Plainview, NY).
PCR. Degenerierte Oligonukleotid-Primer wurden unter Verwendung der Codon-Präferenzregeln (Lathe (1985), J. Mol. Biol. 183: 1-12) entworfen. αF1
(5'-ATCGGATCCATCACIGA(A/G)CT(C/G)-ATGGGITATA-3')(SEQ ID NO:7)
basierte auf dem Amino-Ende des HIF-1α-Peptides 87-1 und wurde als ein vorwärts gerichteter Primer verwendet. Zwei ineinander geschachtelte Revers-Primer, αR1
(5'-ATTAAGCmTGGT-(G/C)AGGTGGTCI(GIC)A/T)GTC-3') (SEQ ID NO:8)
und αR2
(5'-ATTAAGCTTGCATGGTAGTA(T/C)TCATAGAT-3')(SEQ ID NO:9)
basierten auf dem Carboxyl-Ende von Peptid 91-1. PCR wurde durchgeführt mit: Denaturierung von 108 Phage oder 10 ng Phagen-DNA bei 95 °C über 10 min; Zugabe von AmpliTaq (Perkin-Elmer) bei 80 °C; und Amplifizierung über 3 Zyklen bei 95 °C, 37 °C und 72 °C (jeweils 30 sek), gefolgt von 35 Zyklen bei 95 °C, 50 °C, und 72 ° C (jeweils 30 sek). Verschachtelte PCR mit αF1/αR1 und dann αF1/αR2 erzeugte ein Fragment mit 86 Bp, welches in pGEM4 (Promega) cloniert wurde. Für HIF-1β (ARNT) wurde die PCR durchgeführt, wie vorstehend beschrieben, wobei nachstehende Primer verwendet wurden:
5'-ATAAAGCTTGT(C/G)TA(C/T)GT-(C/G)TCIGA(C/T)TCIG-3' (SEQ ID NQ:10)
und
5'ATCGAATTC(C/T)TCI-GACTGIGGCTGGTT-3' (SEQ ID NQ:11)
was zu dem vorhergesagten Produkt mit 69 Bp führte. Zur Analyse des 5'-Endes von HIF-1β (ARNT) wurde Hep3B-poly(A) + RNA unter Verwendung von Reagenzien aus einem 5'-RACE-Kit (Clontech) revers transkribiert. Die cDNA wurde als Matrize verwendet, um Nt 54-425 der ARNT-cDNA zu amplifizieren (Hoffman et al. (1991), vorstehend), wobei
5'-TACGGATCCGCCATGGCGGCGACT-ACTGA-3' (SEQ ID N:12)
(vorwärts gerichteter Primer) und die ineinander verschlungenen reversen Primer
5'-AGCCAGGGCACTACAGGTGGGTACC-3' (SEQ ID NO:13)
und
5'GTTCCCCGCAAGGACTTCATGTGAG-3' (SEQ ID NO:14)
über 35 Zyklen bei 95 °C, 60 °C und 72 °C (jeweils 30 sek) verwendet wurden. Die PCR-Produkte wurden zur Nukleotidsequenz-Analyse in pGEM4 cloniert.
Ergebnisse. Das gereinigte HIF-1α-Polypeptid mit 120 kDa wurde mit Trypsin gespalten, die Peptide wurden durch Reversphasen-Hochdruck- Flüssigkeitschromatographie fraktioniert, und die Fraktionen 87 und 92 wurden der Mikrosequenzierung unterworfen. Jede Fraktion enthielt zwei tryptische Peptide, für die nahezu vollständige Aminosäuresequenzen erhalten wurden:
ITELMGYEPEELLGR (SEQ ID NO:15) (87-1), XIILIPSDLAXR (SEQ ID NO:16) (87-2), SIYEYYHALDSDHLTK (SEQ ID NO:17) (91-1),
und SFFLR (SEQ ID NO:18) (91-2).
Wenn 87-1 und 91-1 als aufeinander folgende Sequenzen eingegeben wurden, identifizierte die Datensuche Ähnlichkeiten mit den Proteinen period (PER) und single-minded (SIM) von Drosophila, und mit den Proteinen Aryl-Hydrocarbon-Rezeptor (AHR) und Aryl-Hydrocarbon-Rezeptor-Kern-Translokator (ARNT) der Säugetiere, welche alle Sequenzen von 200-350 Aminosäuren umfassen, die die PAS (PER-ARNT-AHR-SIM)-Domäne bilden. (Hoffman et al. (1991), Science 252: 954-958; Citri et al. (1987), Nature 326: 42-47; Burbach et al. (1992), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 8185-8189; Crews et al. (1988), Cell 52: 143-151; Nambu et al. (1991), Cell 67: 1157-1167). Degenerierte Oligonukleotide wurden auf den Sequenzen von 87-1 und 91-1 basierend synthetisiert und für die PCR mit cDNA, die aus hypoxischen HEP3B-Zellen präpariert worden war, verwendet. Die Nukelotidsequenz-Analyse ergab, dass das clonierte PCR-Produkt die vorhergesagten Aminosäuren codierte, was zeigt, dass 87-1 und 91-1 aufeinander folgende Peptide waren.
Beispiel 5. Nukleotidsequenz und Datenbank-Analyse
Vollständige, eindeutig doppelsträngige Nukleotidsequenzen wurden durch Inkorporation von fluoreszenzmarkierten Didesoxy-Nukleotiden in die Sequenzierungsreaktionen des Thermalzyklus unter Verwendung von T3, T7 und auf herkömmliche Weise synthetisierten Primern erhalten. Die Reaktionen wurden unter Verwendung des DNA-Sytheseapparates 394 von Applied Biosystems und des Automatisierten DNA-Sequenziergerätes 373a der Genetics Core Resources Facility der Johns Hopkins University durchgeführt. Datenbank-Recherchen für Proteine und Nukleinsäuren wurden am National Center for Biotechnology Information unter Verwendung der Programme BLASTP und TBLASTN (Altschul et al. (1990) J. Mol. Biol. 215: 403-410) durchgeführt. Die cDNA-Nukleotidsequenz von HIF-1α und die abgeleitete Aminosäuresequenz sind in der GenBank hinterlegt worden. Die Zugangsnummer ist U22431.
Ergebnisse. Die Datenbank-Analyse identifizierte gleichfalls ein taq für exprimierte Sequenz (EST), dessen abgeleitete Aminosäuresequenz Ähnlichkeit mit den bHLH-PAS-Proteinen aufwies. Wir gewannen die 3,6 kB große cDNA, hbc025, von der die EST abstammte (Takeda et al. (1993), Hum. Mol. Genet. 2: 1793-1798). Analyse der vollständigen Nukleotidsequenz ergab, dass sie alle vier tryptischen Peptide codierte. Eine weitere EST wurde identifiziert, welche Identität mit hbc025 teilte und durch eine 2 kB große cDNA codiert wurde, hbc120 (Takeda et al. (1993), vorstehend. Sequenzanalyse von hbc120 ergab, dass sie ko-linear mit dem 3'-Ende von hbc025 war (9), sie unterschied sich nur durch die Länge des Poly(A)-Schwanzes. Das 5'-Ende von hbc025 wurde verwendet, um eine Bibliothek der cDNA von Hep3B-Zellen zu durchmustern, was zu der Isolierung einer überlappenden 3,4 kB großen cDNA, 3,2-3, führte, die sich bis zu einem Initiator-Codon erstreckte. Die zusammengesetzte cDNA mit 3720 Bp codierte einen 2478 Bp großen offenen Leserahmen, welcher ein Translations-Startcodon, eine 25 Bp große 5'-nicht translatierte Region (5'-UTR), die ein innerhalb des Rahmes liegendes Terminationscodon umfasste, und eine 1211 Bp große 3'-UTR, die mit einem kanonischen Polyadenylierungssignal endete, welches nach 12 Bp durch 43 Adenosinreste folgte. Im Vergleich zu der übereinstimmenden Sequenz zur Translationsinitation
GCC(A/G)CCATGG (SEQ ID NO:19)
(Kozak (1987), Nucleic Acids Res. 15: 8125-8132) ist die cDNA-Sequenz von HIF-1α
TTCACCATGG (SEQ ID NO:20).
Der offenen Leserahmen der cDNA von HIF-1α sagte ein neues Polypeptid mit 826 Aminosäuren (10) mit einer Molekularmasse von 93 kDa voraus, das eine bHLH-PAS-Domäne an seinem Amino-Ende umfasste.
Die Analyse von zwei tryptischen Peptiden, die aus dem HIF-1β-Polypeptid mit 94 kDa isoliert worden waren (Wang & Semenza (1995), vorstehend), ergaben die Teil-Aminosäuresequenzen
WYVSDSVTPVLNQPQSE (SEQ ID NO:21)
und
TSQFGVGSFQTPSSFSSMXLPGAPTASPGAAAY (SEQ ID NO:22).
Unter Verwendung von degenerierten Oligonukleotiden, die auf der zweiten Peptidsequenz beruhten, wurde ein PCR-Produkt mit der vorausgesagten Größe aus cDNA von Hep3B-Zellen amplifiziert. Datenbank-Recherchen identifizierten beide Peptide innerhalb der Sequenz von ARNT, ein bHLH-PAS-Protein, von dem zuvor gezeigt worden war, dass es mit AHR ein Heterodimer bildet, um den funktionalen Dioxin-Rezeptor zu bilden (Reyes et al. (1992), Science 256: 1193-1195). Zwei Isoformen von ARNT sind identifiziert worden, die sich durch die Anwesenheit oder das Fehlen einer 15 Aminosäuren großen Sequenz, die durch ein alternatives, 45 Bp großes Exon codiert wird, unterscheiden (Hoffman et al. (1991), vorstehend). Analyse der RNA von Hep3B-Zellen durch PCR mit reverser Transkriptase ergab sowohl die Anwesenheit beider Sequenzen als auch zusätzlicher Isoformen. Auf diese Unterschiede in der Primärsequenz kann die Reinigung von drei (91, 93 und 94 kDa) HIF-1β-Polypeptiden zurückzuführen sein (Wang & Semenza (1995), vorstehend). Die offensichtliche Molekularmasse sowohl für HIF-1α als auch für HIF-1β auf denaturierenden Gelen war größer als die Masse, die auf Grund der cDNA-Sequenz vorausgesagt worden war. Für HIF-1α betrug die offensichtliche Masse 120 kDa im Vergleich zu einer berechneten Masse von 93 kDa; für die HIF-1β-Untereinheiten betrugen die offensichtlichen Massen 91-94 kDa, im Vergleich zu berechneten Massen von 85 und 87 kDa für die Isoformen von ARNT mit 774 beziehungsweise 789 Aminosäuren. Die Sequenzen von HIF-1α und ARNT enthalten viele übereinstimmende Stellen zur Protein-Phosphorylierung, und es ist gezeigt worden, dass zur DNA-Bindung von HIF-1 Phosphorylierung erforderlich ist (Wang & Semenza (1993b), vorstehend).
HIF-1α und HIF-1β (ARNT) gehören zu unterschiedlichen Klassen von bHLH-Domänen, die aus übereinstimmenden DNA-Bindungs- (b) und Dimerisations (HLH) -Motiven. Die bHLH-Domäne von HIF-1α ist den anderen bHLHPAS-Proteinen SIM und AHR sehr ähnlich (11). HIF-1β (ARNT) weist die größte Ähnlichkeit mit den bHLH-Domänen, die in einer Reihe von Säugetier- (MI, USF, L-MYC) und Hefe (CP-1) -Proteinen gefunden werden, die an
5'-CACGTG-3' (SEQ ID NO:23)
binden (Dang et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 599-603), eine Sequenz, die den Bindungsstellen für HIF-1
[5'(G/Y)ACGTGC(G/T)-3' (SEQ ID NO:24)
(Semenza et al. (1994), vorstehend)] und dem Dioxin-Rezeptor
[5'-(TIG)NGCGTG(A/C)-(G/C)-3' (SEQ ID NO:25)
(Lusska et al. (1993), J. Biol. Chem. 268: 6575-6580)] ähnelt. Diese Transkriptionsfaktoren haben bHLH-Domänen mit verwandter Sequenz gemeinsam, welche in unterschiedlichen Dimerisationskontexten auftritt: MI, L-MYC und USF sind bHLH-Leucin-Reißverschluss-Proteine, ARNT ist ein bHLH-PAS-Protein, und CP-1 umfasst lediglich eine bHLH-Domäne.
Analyse der PAS-Domänen, die sowohl an der Ligand-Bindung als auch der Protein-Dimerisierung beteiligt sind, (Huang et al. (1993), Nature 364: 259-262; Dolwick et al. (1993), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 8566-8570; Reisz-Porszasz et al. (1994), Mol. Cell. Biol. 14: 6075-6086), ergaben, dass HIF-1α größte Ähnlichkeit mit SIM aufweist. Unsere Anordnung ergab übereinstimmende Sequenzen, die ein zuvor nicht beschriebenes Motiv, HXXD, einschloss, welches in den A- und B-Wiederholungen von allen PAS-Proteinen vorkommt (12). Wir fanden auch heraus, dass KinA von Bacillus subtilis (Perego et al. (1989), J. Bacteriol. 171: 6187-61 96) eine PAS-Domäne an seinem Amino-Ende enthält und daher das erste prokaryontische Mitglied dieser Proteinfamilie ist, was auf einen bemerkenswerten Grad an evolutionärer Beständigkeit hinweist. KinA besitzt, wie PER, ein PAS, aber keine bHLH-Domäne und ist daher nicht in der Lage, DNA zu binden. B. subtilis geht zu Sporenbildung als Antwort auf ungünstige Umweltbedingungen über, und KinA dient als ein Sensor, der Signale über eine carboxy-terminale Kinase-Domäne überträgt (Burbulys et al. (1991), Cell 64, 545-552).
Beispiel 6. RNA-Blot-Hybridisierung.
Die Expression von HIF-1-RNAs als Antwort auf induzierende Substanzen der DNA-Bindungsaktivität von HIF-1 wurde wie folgt analysiert.
Gesamt-RNA (15 μg) wurde durch 2,2 M Formaldehyd/1,4% Agarose-Gel-Elektrophorese fraktioniert, auf Nitrozellulose-Membranen übertragen und bei 68 °C in Quik-Hyb (Stratagene) an mit ³²P markierten HIF-1α oder ARNT-cDNA hybridisiert. Die Gele wurden mit Ethidiumbromid angefärbt, und die RNA wurde durch Ultraviolett-Bestrahlung vor und nach der Übertragung sichtbar gemacht, um gleiche Ladung beziehungsweise Übertragung für jede Linie sicherzustellen. Basierend auf der Wanderung der Markierungen in RNA-Größe (BRL-GIBCO) auf den selben Gelen wurde die Größe der RNA von HIF-1α auf 3,7 t 0,1 kB bestimmt. Zwei RNA-Arten von ARNT wurden als bereits zuvor beschrieben erkannt (Hoffman et al. (1991), vorstehend).
Ergebnisse. Wenn Hep3B-Zellen 1% O₂ ausgesetzt wurden, erreichte HIF-1α- und HIF-1β (ARNT)-RNA Spiegel, die nach 1-2 h einen Höhepunkt erreichten, nach 8 h auf einen Wert nahe der Grundlinie absanken, und nach 16 h fortgesetzter Hypoxie einen zweiten Anstieg zeigten (13A). Als Antwort auf 75 μM CoCl₂ erreichten HIF-1-RNAs nach 4 h einen Gipfel, sanken nach 8 h und stiegen nach 16 h wieder an (13B). In Zellen, die mit 130 μM Desferrioxamin behandelt wurden, wurde ein einzelner Gipfel nach 1-2 h beobachtet (13C). Wenn Zellen bei 1% O₂ über 4 h inkubiert wurden, und man sie dann zu 20% O₂ zurückkehren ließ, sanken sowohl HIF-1α- als auch HIF-1β-RNA innerhalb von 5 min, dem frühesten Untersuchungszeitpunkt, unter ihre Grundlinien (13D). Diese Ergebnisse zeigen, dass, wie in dem Fall der DNA-Bindungsaktivität von HIF-1 (Wang & Semenza (1993b) vorstehend), die Spiegel von HIF-1-RNA streng durch die zelluläre O₂-Spannung reguliert werden. An der ausgesprochenen Instabilität von HIF-1α-RNA in posthypoxischen Zellen kann die 3'-nicht translatierte Region (3'-UTR) beteiligt sein, die acht AUUUA-Sequenzen enthält (13E), welche in RNAs mit kurzen Halbwertszeiten identifiziert worden sind, und für die gezeigt worden ist, dass sie eine destabilisierende Wirkung haben, wenn sie in heterologe RNAs (Shaw & Kamen (1986) Cell 46: 659-667) eingeführt werden. Sieben der AUUUA-Sequenzen von HIF-1α stimmen mit den in einem stringenteren Sinne für RNA destabilisierenden Elementen,
5'-UUAUUUA(U/A)(U/A)-3' (SEQ ID NO:26)
überein (Lagnado et el. (1994), Mol. Cell. Biol. 14: 7984-7995).
Beispiel 7. Herstellung von Antikörpern.
Um die Proteinexpression von HIF-1 zu analysieren, wurden polyclonale Antiseren wie folgt gegen HIF-1α und HIF-1β gezüchtet.
Kaninchen wurden mit rekombinanten Proteinen immunisiert, in denen Glutathion-S-Transferase (GST) an die Aminosäuren 329-531 von HIF-1α oder an 496-789 von ARNT fusioniert worden war. Um Antikörper gegen HIF-1α zu erzeugen, wurde ein 0,6 kB großes EcoRI-Fragment von hbc025 in pGEX-3X (Pharmacia) cloniert und in E. coli-DH5cx-Zellen (GIBCO-BRL) transformiert. Das GST/HIF-1α-Fusionsprotein wurde isoliert, indem die Bakterien (OD₆₀₀ = 0,8)0,1 mM IPTG bei Zimmertemperatur über 1 h ausgesetzt wurden; Ultraschallbehandlung in 50 mM Tris-HCl (pH-Wert 7,4), 1 mM EDTA, 1 mM EGTA, 1 mM Phenylmethylsulfonylfluorid; Zentrifugation mit 10.000 × g über 10 min; Inkubieren des Überstandes mit Glutathion-Agarose (Pharmacia) in Anwesenheit von 1% NP-40 über 1 h bei 4 °C; und Elution mit 5 mM reduziertem Glutathion, 50 mM Tris-HCl (pH-Wert 8,0), 150 mM NaCl. Um Antikörper gegen HIF-1β zu erzeugen, wurden die Nt 1542-2428 von ARNT aus cDNA von Hep3B-Zellen mit Hilfe der PCR mit Taq-Polymerase unter Verwendung des vorwärts gerichteten Primers
5'-ATAGGATCCTCAGGTCAGCTGGCACCCAG-3' (SEQ ID NO:27)
und des reversen Primers
5'-CCAAAGCTTCTATTCTGAAAAGGGGGG-3' (SEQ ID NQ:28)
amplifiziert. Das Produkt wurde mit BamHI und EcoRI gespalten, um ein Fragment zu erzeugen, das den Nt 1542-2387 von ARNT entspricht, und in pGEX-2T (Pharmacia) cloniert. Die Isolierung des Fusionsproteins erfolgte wie vorstehend beschrieben, mit der Änderung, dass die Induktion mit 1 mM IPTG über 2 h erfolgte, und die Bindung an Glutathion-Agarose fand in Anwesenheit von 1% Triton X-100 anstatt NP-40 statt. Die Fusionsproteine wurden aus den 10% SDS/Polyacrylamid-Gelen ausgeschnitten und verwendet, um weiße Neuseeland-Kaninchen (HRP Inc., Denver PA) nach einem im Institut bewährten Protokoll zu immunisieren. Die gegen HIF-1α erhobenen Antikörper wurden durch Bindung an GST/HIF-1α, gekoppelt an CNBr-aktivierte Sepharose 4B (Pharmacia), affinitätsgereinigt.
Ergebnisse. Antiseren wurden verwendet, um zu zeigen, dass die Proteine, die durch die clonierte cDNA für HIF-1α und ARNT codiert werden, Bestandteile der DNA-Bindungsaktivität von HIF-1 sind (14A). Wenn Zellkern-Rohextrakte von hypoxischen Zellen mit Sonden-DNA, und einem der Antiseren inkubiert wurden, wurde der HIF-1/DNA-Komplex, der beim Fehlen von Antiseren beobachtet worden war, durch einen langsamer wandernden HIF-1/DNA/AantiKörper-Komplex ersetzt, die Zugabe von Präimmunseren, hingegen, hatte keine Wirkung auf den HIF-1/DNA-Komplex.
Beispiel 8. Immunblot-Analyse.
15 μg an Aliquots von Proteinextrakten aus dem Zellkern wurden auf 6% SDS/Polyacrylamid-Gelen gelöst und auf Nitrozellulose-Membranen in 20 mM Tris-HCl (pH-Wert 8,0), 150 mM Glycin, 20% Methanol übertragen. Die Membranen wurden mit 5% Milch/TBS-T [20 mM Tris-HCl (pH-Wert 7,6), 137 mM NaCl, 0,1% Tween-20] blockiert, mit affinitätsgereinigten HIF-1α-Antikörpern oder HIF-1β-Antiserum, 1:400 beziehungsweise 1:5000 verdünnt, inkubiert, gewaschen, mit anti-Immunglobulin-Konjugat von Meerrettich-Peroxidase, 1:5000 verdünnt, inkubiert, gewaschen und mit ECL-Reagenz (Amersham) entwickelt und der Autoradiographie unterworfen. Die Inkubationen erfolgten über 1 h in 5% Milch/TBS-T und die Waschschritte erfolgten insgesamt über 30 min in TBS-T bei Zimmertemperatur.
Ergebnisse. Die Immunblot-Analyse ergab, dass die Antiseren Polypeptide in Zellkern-Rohextrakten von hypoxischen Hep3B- oder mit CoCl₂ behandelten HeLa-Zellen nachwiesen, die zusammen mit Polypeptiden wanderten, die in gereinigten HIF-1-Protein-Präparaten anwesend waren (14B). Die Analyse von Zellkern- und zytoplasmatischen Extrakten, die aus Hep3B-Zellen, die 1% O₂ ausgesetzt waren, hergestellt worden waren (14C), ergab, dass höchste Spiegel an HIF-1α und HIF-1β in Zellkernextrakten nach 4-8 h fortgesetzter Hypoxie vorlagen, ähnlich wie bei der Induktionskinetik der DNA-Bindungsaktivität von HIF-1 (Wang & Semenza (1993) J. Biol. Chem. 268: 21513-21518). Bei HIF-1α wanderte die vorherrschende Proteinart, die zu späteren Zeitpunkten akkumulierte, zu einer höheren Position im Gel als Protein, das zu früheren Zeitpunkten vorlag, was nahelegt, dass posttranslationale Modifikationen von HIF-1α vorkommen können. Bei HIF-1β wurden die Arten mit 94 und 93 kDa von der Form mit 91 kDa gelöst, jedoch nicht voneinander, und es wurden keine Änderungen der Wanderung beobachtet. Der post-hypoxische Abbau von HIF-1-Proteinen erfolgte ebenfalls bemerkenswert schnell (14D), was darauf hinweist, dass diese Proteine, wie im Fall der RNAs, in post-hypoxischen Zellen instabil sind. Sowohl bei HIF-1α als auch bei ARNT sind 31% aller Aminosäuren Prolin-, Glutaminsäure-, Serin- oder Threonin (PEST)-Reste, die mit der Protein-Instabilität in Verbindung gebracht werden (Rogers et al. (1986), Science 234: 364-368). Bei HIF-1α enthalten zwei Sequenzen aus 20 Aminosäuren (499-518 und 581-600; 10) jeweils 15 PEST-Reste. Bei HIF-1β (ARNT) schien auch die Neuverteilung zwischen Zellkern- und zytoplasmatischen Abschnitten sowohl bei der Induktion als auch beim Abbau von Zellkern-Proteinspiegeln eine Rolle zu spielen.
Zusammen mit unseren vorausgehenden Studien an HIF-1 weisen die hier dargelegten Ergebnisse darauf hin, dass HIF-1 ein heterodimerer bHLH-PAS-Transkriptionsfaktor ist, der einen Komplex aus einer 120 kDa großen HIF-1α-Untereinheit mit einer 91-94 kDa großen HIF-1β (ARNT)-Isoform darstellt. Daher codiert ARNT eine Reihe von allgemeinen Untereinheiten, die sowohl von HIF-1 als auch vom Dioxin-Rezeptor genutzt werden, analog zu der Heterodimerisierung von E2A-Genprodukten mit verschiedenen bHLH-Proteinen (Murre et al. (1989), Cell 58: 537-544). Basierend auf diesen Ergebnissen und der Ähnlichkeit von HIF-1α und SIM innerhalb der bHLH-Pas-Domäne, kann ARNT auch mit SIM ein Heterodimer bilden. Bei Drosophila sind mehrere SIM-regulierte Gene durch Enhancer-Elemente charakterisiert, welche 1-5 Kopien der Sequenz
5'-(G/A)(T/A)ACGTG-3' (SEQ ID NO:29)
(Wharton et al. (1994), Development 120: 3563-3569) einschließen. Die Beobachtung, dass die HIF-1-, Dioxin-Rezeptor- und SIM-Bindungsstellen alle die Sequenz 5-CGTG-3' aufweisen, unterstützt die Hypothese, dass ARNT zu kombinatorischer Assoziation mit HIF-1α, AHR, und SIM in der Lage ist, da diese Halb-Stelle auch von den Transkriptionsfaktoren erkannt wird, mit denen ARNT in der bHLH-Domäne größte Ähnlichkeit aufweist.
Beispiel 9. Transkriptionsregulation von Genen, die glykolytische Enzyme codieren, durch HIF-1.
Die Beteiligung von HIF-1 an transkriptionaler Regulierung von Genen, die glykolytische Enzyme in hypoxischen Zellen codieren, wurde wie folgt erforscht.
RNA-Analyse. Gesamt-RNA wurde aus Hep3B- und HeLa-Zellen isoliert (Chomczynski & Sacchi (1987), Anal. Biochem. 162: 156-159). RNA-Konzentrationen wurden durch Messung der Absorption bei 260 nm bestimmt. Agarose-Gel-Elektrophorese gefolgt von Anfärbung mit Ethidiumbromid und Sichtbarmachung der 28- und 18-S-rRNA unter UV-Licht bestätigte, dass Aliquots aus verschiedenen Präparaten gleiche Mengen an intakter Gesamt-RNA enthielten. Die Plasmide N-KS⁺ und H-KS⁺, von P. Maire (Institut Cochin de Genetique Moleculaire, Paris) zur Verfügung gestellt, wurden durch Spaltung mit HindIII linearisiert. Antisense-RNA wurde unter Verwendung von RNA-Polymerase von T3 in Anwesenheit von [α-³²P]ATP synthetisiert. 10 μg zellulärer Gesamt-RNA wurden an H- oder N-Ribosonde (3 × 105 cpm) über 3 h bei 66 °C hybridisiert und mit RNasen A und T₁ gespalten; geschützte Fragmente wurden durch 8 M Harnstoff, 8% Polyacrylamid-Gel-Elektrophorese analysiert (Semenza et al. (1990), Mol. Cell. Biol. 10: 930-938). Menschliche Phosphoglycerat-Kinase 1 (PGKI)-cDNA aus Plasmid pHPGK-7e (Michelson et al. (1985), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82: 6965-6969), erhalten aus der American Type Culture Collection, und PKM-cDNA der Ratte aus Plasmid pM2PK33 (Noguchi et al. (1986) J. Biol. Chem. 261: 13807-13812), zur Verfügung gestellt von T. Noguchi (Osaka University Medical School Osaka, Japan), wurden als zufallsmarkierte Sonden für Blot-Hybridisierungen verwendet, die in QuikHyb (Stratagene) über 1 h bei 68 °C durchgeführt wurden, gefolgt von einem Waschschritt in 15 mM Natriumchlorid, 1,5 mM Natriumcitrat, 0,1% SDS bei 50 °C. Die densitometrische Analyse von Autoradiogrammen wurde mit einem LKM-Ultroscan- XL-Laser-Densitometer unter Verwendung Computer-basierender Gipfel-Integration durchgeführt.
Elektrophoretische Mobilitäts-Shift-Untersuchung (EMSA). Präparate von Zellkern-Rohextrakten, Bedingungen bei der Herstellung von Sonden, Bindungsreaktionen und Gel-Analyse wurden alle bereits vorstehend beschrieben. Doppelsträngige Oligonukleotide wurden nach den in Tabelle 2 dargestellten Sequenzen synthetisiert, mit der Änderung, dass jedes Oligonukleotid an seinem 5'-Ende die Sequenz 5'-GATC-3' enthielt, welche einen einsträngigen Überhang bildete, wenn komplementäre Oligonukleotide angeheftet wurden. Die Sequenz des vorwärts gerichteten (Sense-)Stranges der Oligonukleotide W18 und M18 lautete wie vorstehend angegeben. HIF-1 wurde aus 50 Litern HeLa-Zellen, die mit CoCl₂ behandelt worden waren, durch Herstellung von Zellkern-Rohextrakt, DEAE-Sepharose-Chromatographie, MonoQ-Schnellprotein-Flüssigkeitschromatographie und DNA-Affinitätschromatographie teilgereinigt. Inkubationen mit Zellkern-Rohextrakten und teilgereinigtem HIF-1 enthielten 100 beziehungsweise 1 ng denaturierter Kälberthymus-DNA. Vergleichsexperimente wurden mit 5 ng nicht markiertem W18-oder M18-Oligonukleotid durchgeführt.
Gewebekultur. Hep3B- und HeLa-Zellen wurden in Kultur gehalten und mit 1% O₂, CoCl₂, DFX und Cycloheximid (CHX), wie vorstehend beschrieben, behandelt.
Untersuchung zu vorübergehender Expression. Das psvcat-Reporter-Plasmid (pCAT Promoter, Promega) umfasste den frühen SV40-Region-Promotor, Codierungssequenzen für bakterielle Chloramphenicol-Acetyltransferase (CAT), Spleiß- und Polyadenylierungssignale von SV40. Die Oligonukleotide wurden in die BgIII- und BamHI-Stellen cloniert, die 5'- beziehungsweise 3'-wärts der Transkriptionseinheit liegen. Die Plasmide pNMHcat und pHcat (Concordet et al. (1991), Nucleic Acids Res. 19: 4173-4180), die Gensequenzen für menschliche Aldolase A direkt an die CAT-codierenden Sequenzen fusioniert enthalten, wurden von P. Maire zur Verfügung gestellt. pSVβgal (Promega) enthielt Codierungssequenzen für bakteriellen IacZ, gesteuert vom frühern SV40-Region-Promotor und Enhancer. Die Plasmide wurden durch alkaline Lyse und zwei Runden Cäsiumchlorid-Dichtegradient-Zentrifugation gereinigt. Hep3B-Zellen wurden durch Elektroporation mit einem Gene-Pulser (Bio-Rad) bei 260 V und 960 Mikrofarad transfiziert. Zweifache Elektroporationen wurden zusammengegeben und auf zwei Gewebekulturschalen mit 10 cm Größe (Corning) aufgeteilt, die 8 ml Kulturmedium enthielten. Man ließ sich die Zellen über 24 h in einem 5% CO₂, 95% Luft-Inkubator bei 37 °C erholen, das Kulturmedium wurde ersetzt, und ein Satz der doppelten Schalen wurde in eine modulare Inkubatorkammer gestellt, die mit 1% O₂, 5% CO₂, N₂ zur Balance gefüllt war, versiegelt und auf 37 °C gehalten. Die Zellen wurden 72 h nach der Transfizierung geerntet, und Extrakte für CAT- und β-Galactosidase-Aktivität wurden hergestellt.
Ergebnisse. Das menschliche Gen für Aldolase A (hALDA) enthält vier nicht codierende Exons, N1, N2, M, und H (Maire et al. (1987), J. Mol. Biol. 197: 425-438). Die Transkription wird in den meisten Geweben, die nicht Muskelgewebe sind, an den Exons N1 und H initiiert. Untersuchungen zum Ribonuklease-Schutz von RNA, die aus Zellen isoliert wurde, die 20 oder 1% O₂ über 16 h ausgesetzt worden waren, ergab in Hep3B- und HeLa-Zellen, die 1% O₂ ausgesetzt waren, 3,0- und 2,9-fach höhere Spiegel an ALDA-RNA, initiiert von Exon H, wohingegen RNA, die von Exon N1 initiiert wurde, nur um das 1,7- beziehungsweise 1,1-Fache in hypoxischen Hep3B- und HeLa-Zellen anstieg, was eine Promotor-spezifische Antwort auf Hypoxie vermuten lässt.
Als nächstes verglichen wir die Expression von RNA für ALDA und Phosphoglycerat-Kinase 1 (PGK1) in Hep3B-Zellen, die 1% O₂ über 0-16 h ausgesetzt waren. Maximale Induktion von RNA sowohl für ALDA als auch für PGK1 zeigte verzögerte Kinetiken, was die Erfordernis zur Proteinsynthese während der Induktion nahelegt, dies wurde dadurch bestätigt, dass gezeigt wurde, dass Behandlung von Hep3B-Zellen mit 100 μM CHX die Induktion von RNA für ALDA und PGK1 in hypoxischen Zellen vom 6,1- beziehungsweise 8,2-Fachen auf das 1,6- beziehungsweise 1,4-Fache senkte.
Behandlung von Hep3B-Zellen mit 75 μM CoCl₂ oder 130 μM DFX über 16 h induzierte sowohl RNA für ALDA als auch für PGK1, wobei ALDA-Transkriptionen bevorzugt von Exon H inititert wurden. Die Analyse der selben RNA-Proben mit einer Sonde für PKM ergab, dass die RNA für PKM ebenfalls durch die Exposition von Hep3B-Zellen gegenüber 1% O₂, CoCl₂ oder DFX ebenfalls induziert wurde. RNAs für ALDA, PGK1 und PKM wurden auch durch Behandlung von HeLa-Zellen mit 1% O₂, CoCl₂, oder DFX induziert. RNA für PFKL wurde in Hep3B- oder HeLa-Zellen nicht in nachweisbaren Mengen exprimiert. Diese RNA-Analysen zeigen, dass Agenzien, die RNA für EPO und HIF-1-Aktivität induzieren, auch RNA für ALDA, PGK1 und PKM sowohl in EPO produzierenden Hep3B- als auch in nicht produzierenden HeLa-Zellen induzieren, mit der Notwendigkeit für eine de novo Proteinsynthese, wie zuvor für die Induktion von RNA für EPO und HIF-1-Aktivität gezeigt worden ist (Semenza & Wang (1992), Mol. Cell. Biol. 12: 5447-5454). Nukleotidsequenzen von Genen, die in Genbanken vorliegende glykolytische Enzyme codieren, wurden auf mögliche HIF-1-Bindungsstellen durchsucht, indem die fragliche Sequenz 5'-ACGTGC-3' verwendet wurde, die die 4 Guanin-Reste enthält, die mit HIF-1 in der Hauptwindung der DNA in Kontakt treten (Wang & Semenza (1993b), vorstehend. Es wurden doppelsträngige Oligonukleotide synthetisiert, die den 5'-flankierenden Sequenzen (5'-FS) der Gene für menschliches PGK1 (hPGKI), menschliche Enolase 1 (hENO1) und LDHA der Maus (mLDHA); den 5'-nicht translatierten Sequenzen (5'-UT) von hPGKI; und unterbrechenden Sequenzen (IVS) der Gene für hALDA und mPFKL entsprachen. Diese Oligonukleotide enthielten als mögliche HIF-1-Stellen,
5'-TACGTGCT-3' (SEQ ID NO:30),
5'-GACGTGCG-3' (SEQ ID NO:31)
(die auch in hEPO 5-FS gefunden wurde), und
5'-CACGTGCG-3' (SEQ ID NO:32).
Die erste Sequenz ist mit der zuvor identifizierten HIF-1-Bindungsstelle im EPO-Enhancer identisch (Semenza & Wang (1992), vorstehend, wohingegen die letzteren beiden Sequenzen sich an den ersten und letzten Nukleotiden unterscheiden. Die Fähigkeit dieser Oligonukleotide, HIF-1- zu binden, wurde durch EMSA untersucht.
Bei Inkubation mit Zellkernextrakt, der aus Hep3B-Zellen, die 1% O₂ über 4 h ausgesetzt waren, gewonnen worden war, erzeugte jede Sonde einen DNA-Protein-Komplex mit ähnlicher Mobilität und Intensität wie der HIF-1-Komplex, der mit Sonde W18 gebildet wurde, die den Nukleotiden 1-18 der hEPO 3'-FS entsprach. Im Gegensatz dazu wies keine dieser Sonden einen HIF-1-Komplex in Zellkernextrakten von Zellen nach, die bei 20% O₂ gehalten worden waren, obgleich die EMSA-Muster ansonsten denjenigen ähnelten, die von Zellkernextrakten aus hypoxischen Zellen gewonnen worden waren. Der DNA-Protein-Komplex, der unterhalb des HIF-1-Komplexes wanderte, war weniger intensiv, wenn hypoxische (im Vergleich zu nicht hypoxischen) Zellkernextrakte untersucht wurden. Wir zeigten zuvor, dass dieser Komplex einen konstitutiv exprimierten Faktor enthält, welcher dieselbe DNA-Sequenz wie HIF-1-erkennt (Wang & Semenza (1993b), vorstehend). Die verminderte Bindung des konstitutiven Faktors in hypoxischen Extrakten kann daher auf den Wettbewerb mit HIF-1 um die Bindung zurückzuführen sein.
EMSA wurde ebenfalls mit einem Präparat von HIF-1 aus mit CoCl₂ behandelten HeLa-Zellen durchgeführt, welches durch DEAE-Zellulose, MonoQ und DNA-Affinitätschromatographie etwa 600-fach aufgereinigt worden war. Jede Sonde band an HIF-1 in einer Weise, die qualitativ und quantitativ dem Komplex ähnelte, der mit W18 gebildet wurde. Die Bindung von HIF-1 an diese Sonden war sequenzspezifisch, da sie durch einen Überschuss an nicht markiertem W18 verdrängt werden konnte, nicht aber durch das mutierte Oligonukleotid M18, welches eine Substitution von 3 Nukleotiden enthielt, von der zuvor gezeigt worden war, dass sie HIF-1-Bindung und die durch Hypoxie induzierbare Enhancer-Funktion ausschließt. Ähnliche Ergebnisse wurden erhalten, wenn Experimente zur Konkurrenz von W18 und M18 mit Zellkern-Rohextrakt aus hypoxischen Heb3B-Zellen durchgeführt wurden. Diese Ergebnisse identifizieren neue HIF-1-Bindungsstellen sowohl in Genen, die ALDA, ENO1, PFKL und PGKI codieren, als auch in den hEPO 5'-FS. Die 8 Oligonukleotide, von denen gezeigt wurde, dass sie spezifisch HIF-1 binden (Tabelle 2), enthalten 3 unterschiedliche Bindungsstellen-Sequenzen, die durch die gemeinsame Sequenz
5'-(C/G/T)ACGTGC(G/T)-3' (SEQ ID NO:33).
repräsentiert werden. Unter Einbeziehung des Messfehlers ist es möglich, dass HIF-1 andere Sequenzen, die nicht durch diese gemeinsame Sequenz repräsentiert werden, erkennen kann. Zusätzlich zu den 6 HIF-Stellen aus glykolytischen Genen lag die Sequenz
5'-CACGTGCT-3' (SEQ ID NO:34)
auch in der hENO1 5'-FS zwischen -786 bis -793 vor (Gialongo et al. (1990), Eur. J. Biochem. 190: 567-573), wurde aber nicht auf HIF-1-Bindung untersucht. Auf diese Weise wurden insgesamt 7 mögliche HIF-1-Stellen in 20,7 kB Nukleotidsequenz, die in der GenBank für diese 5 glykolytischen Gene vorliegen, identifiziert. Im Gegensatz dazu wurden auf keinem DNA-Strang unter insgesamt 43,5 kB, die die Nukleotidsequenzen von 5 zufällig ausgewählten Genen, AFP, BUP4, CREB, DHFR und EPOR umfassten, keine Sequenzen gefunden, die zu der übereinstimmenden HIF-1-Stelle passten (Gibbs et al. (1987), Biochemistry 26: 1332-1343; Kurihara et al. (1993), Biochem. Biophys. Res. Commun. 192: 1049-1056; Meyer et al. (1993), Endocrinology 132: 770-78O; Mitchell et al. (1986), Mol. Cell. Biol. 6: 425-440; Noguchi et al. (1991), Blood 78: 2548-2556).
Um zu bestimmen, ob diese HIF-1-Bindungsstellen von funktionaler Bedeutung waren, wurden unter Verwendung der vorstehend beschriebenen Reporter-Gene Untersuchungen zu vorübergehender Expression durchgeführt. Reporter-Plasmide wurden zusammen mit pSVβgal, welches als eine Kontrolle der Variation der Wirksamkeit der Transfizierung eingeschlossen wurde, in Hep3B-Zellen transfiziert. Transfizierte Zellen wurden unter doppelten Platten aufgeteilt, welche in 1 oder 20% O₂ über 48 h kultiviert wurden, CAT- beziehungsweise β-Galaktosidase-Proteine, das nach der Transkription von Reporter- beziehungsweise Kontrollplasmiden synthetisiert wurde, wurden aus zellulären Extrakten quantifiziert. Der basale Reporter psvcat, in dem die Transkription der CAT-Codierungssequenz durch den frühen SV40-Region-Promotor gesteuert wurde, erzeugte in Zellen, die bei 1 und 20% O₂ kultiviert worden waren, ähnliche Werte für CAT/β-Galaktosidase. Wenn eine (psvcatEPO1) oder zwei (psvcatEPO2) Kopien des 33 Basenpaare großen hEPO 3'-FS-Enhancer 3'-wärts in die Transkriptionseinheit cloniert werden, wurde die Expression von CAT/β-Galaktosidase 4,9- beziehungsweise 17-fach in Zellen induziert, die bei 1% O2 kultiviert worden waren, was mit zuvor berichteten Ergebnissen übereinstimmt (Semenza & Wang (1992), vorstehend).
Die Sequenzen von HIF-1-Bindungsstellen in glykolytischen Genen wurden in der gleichen Untersuchung analysiert. Die Oligonukleotide mPFKL IVS-1 und hPFK1 5'-FS wurden ausgewählt, das sie Sequenzen repräsentierten, die identisch oder verschieden von der HIF-1-Stelle in der hEPO 3'-FS waren und 3'- beziehungsweise 5'-wärts der Stelle der Transkriptions-Initiation lagen. Zwei Kopien des 24 Basenpaare großen hPGK1 5'-FS-Oligonukleotides wurden 5'-wärts von der psvcat-Transkriptionseinheit cloniert (15A), analog zu seiner Lage in hPGK1. Die Expression von pPGK2svcat wurde in hypoxischen Zellen 5,6-fach induziert (15B). Drei Kopien des 26 Basenpaare großen mPFK1 IVS-1-Oligonukleotides wurden ebenfalls 5'-wärts von der psvcat-Transkriptionseinheit cloniert, und pPFKL3svcat vermittelte eine 47-fache Induktion in hypoxischen Zellen (15B).
Wir führten auch Experimente mit hALDA-Gensequenzen durch, um die ursprüngliche Funktion des Promotors zu analysieren und die Sequenz-Erfordernisse zur Induktion der Transfizierungsuntersuchung mit endogenen RNA-Expressionsdaten zu vergleichen. Das Plasmid pNMHcat (Concordet et al. (1991), vorstehend) in dem 3,5 kB vom 5'-Ende von hALDA (Maire et al. (1987), vorstehend) an die CAT codierenden Sequenzen fusioniert worden waren (15A), vermittelte eine 5,5-fache Induktion in hypoxischen Zellen (15B). Das Plasmid pHcat enthielt 0,76 kB von hALDA-Sequenzen, die mit dem 3'-Ende von pNMcat ko-linear sind und innerhalb von IVS-4 beginnen und sich 5'-wärts zum Exon H ausdehnen (15A). Deletion der Exons N1, N2 und M und ihrer flankierenden Sequenzen führte zu 20-fach erhöhten Spiegeln der CAT-Expression, hatte aber keine signifikante Auswirkung auf die relative Expression bei 1% O₂, da pHcat 5,4-fach in hypoxischen Hep3B-Zellen induziert war (15B). Diese Ergebnisse stimmen mit der Beobachtung von (i) spezifischer Induktion von hALDA-Transkriptionen, die vom Exon H initiiert sind, und (ii) der Anwesenheit von einer HIF-1-Bindungsstelle am 5'-Ende von IVS-4, welche sowohl in pNMHcat als auch in pHcat enthalten ist, überein. Daher vermitteln Sequenzen, die HIF-1-Stellen aus den Genen mPFKL, hPGK1 und hALDA enthalten, durch Hypoxie induzierbare Transkription in Verbindung mit entweder einem natürlichen oder einem heterologen Promotor.
Referenzbeispiel 10. Konstruktion einer dominant negativen Variante von HIF-1α
Eine HIF-1α-Variante wurde konstruiert, um funktionale Inaktivierung von HIF-1 zu untersuchen.
Die Ausgangskonstruktion war die cDNA 3,2-3 von HIF-1α, die in das Plasmid pBluescript-SK cloniert wurde. Das Plasmid wurde mit den Restriktionsendonukleasen NcoI und BgIII gespalten, um Sequenzen zu deletieren, die die Aminosäuren 2-28 codierten. Ein doppelsträngiges Oligonukleotid wurde inseriert, das NcoI- und BgIII-Enden enthielt, um die erneute Ringbildung des Plasmids in Anwesenheit von T4-DNA-Ligase zu ermöglichen. Die erhaltene Konstruktion codiert die Aminosäuren 1-3, gefolgt von drei Aminosäuren, die in der entsprechenden Position des Wildtyps von HIF-1α nicht vorhanden sind (Isoleucin, Alanin und Glycin), gefolgt von den Aminosäuren 28-826 von HIF-1α. Diese Konstruktion (pBluescript/HIF-1α3,2T7ΔNB) erlaubt die in vitro-Transkription (unter Verwendung von T7-RNA-Polymerase) und Translation der Varinantenform von HIF-1α(HIF-1α-ΔNB) (SEQ ID NO:35)
Um eine dominant negative Form von HIF-1α zur Expression in Gewebekulturzellen von Säugetieren zu erzeugen, wurde ein Kpn I-Not-I-Fragment, welches die variante cDNA codierte, aus dem pBluescript-Vektor ausgeschnitten und in den säugerstämmigen Expressionsvektor pCEP4 cloniert. Das Plasmid wurde mit AfII und BamHI gespalten, mit der Kleenow-Form der DNA-Polymerase behandelt, um geglättete Enden zu erzeugen, und mit T4-DNA-Ligase erneut zum Ring geschlossen. Das resultierende Plasmid (pCEP4/HIF-1αΔNBΔAB) (SEQ ID NO:3) codiert die Aminosäuren 1-3, gefolgt von drei Aminosäuren, die in der entsprechenden Position des Wildtyps von HIF-1α nicht vorhanden sind (Isoleucin, Alanin und Glycin), gefolgt von den Aminosäuren 28-391 von HIF-1α, gefolgt von drei Aminosäuren, die in der entsprechenden Position des Wildtyps von HIF-1α nicht vorhanden sind (Isoleucin, Glutamin und Threonin). Die Aminosäuren 392-826 wurden deletiert, um die Stabilität des varianten Proteins (HIF-1αΔNBΔAB), das in Zellen exprimiert wurde, zu erhöhen (16).
Ergebnisse. Hep3B-Zellen wurden vorübergehend mit 25 μg des Reportergens psvcat EPO2 transfiziert, welches zwei Kopien der 33 Bp großen Enhancer-Sequenz des menschlichen Erythropoietin-Gens enthielt, wie vorstehend beschrieben. Dieses Plasmid exprimierte im Vergleich zu 20% O2 einen 9-fach höheren Spiegel an CAT-Protein, wenn die Zellen bei 1% O₂ kultiviert wurden. Wenn die Zellen mit psvcatEPO2 und pCEP4/HIF-1α-ΔNBΔAB transfiziert wurden, gab es eine von der Dosis abhängige Inhibition der CAT-Expression bei 1% O₂. Tabelle 3 zeigt die relative Induktion (Expression bei 1% O₂ geteilt durch Expression bei 20% O₂) als eine Funktion der Menge an pCEP4/HIF-1α-ΔNBΔAB (μg), die in die Zellen transfiziert worden waren. Die Ergebnisse sind die Mittelwerte aus drei Experimenten.
Die Expression von variantem HIF-1α beeinträchtigte die Aktivierung der Expression des Reporter-Gens durch endogenen HIF-1, der von hypoxischen Zellen produziert wurde. Die Restaktivierung, die mit der Transfizierung von 40 μg der Variante beobachtet wurde, repräsentiert möglicherweise Zellen, die zwar psvcatEPO2 aufgenommen hatten, nicht aber pCEP4/HIF-1α-ΔNBΔAB. Die Ergebnisse zeigen, dass die negativ-dominante Variante die HIF-1-Funktion in vivo beeinträchtigen kann.
Das variante Protein wurde in einer elektrophoretischen Mobilitäts-Shift-Untersuchung der Bindung an eine doppelsträngige Oligonukleotidsonde, die die HIF-1-Bindungsstelle vom EPO-Enhancer enthielt, verwendet. pBluescript/HIF-1α3,2T7ΔNB wurde als eine Matrize für in vitro-Transkription und -Translation verwendet. Wenn ansteigende Mengen an pBluescript/HIF-1α3,2T7ΔNB zu den Reaktionsgemischen, die eine konstante Menge an Matrizen für HIF-1α und HIF-1β des Wildtyps enthielten, zugegeben wurden, gab es eine von der Dosis abhängige Inhibition der DNA-Bindung, in der Weise, dass HIF-1-DNA-Bindung eliminiert wurde, wenn pBluescript/HIF-1α3,2T7ΔNB in einem 16-fachen Überschuss gegenüber der Matrize des Wildtyps, pBluescript/HIF-1α3,2T7, vorlag.
Diese in vitro- und in vivo-Experimente zeigen, dass Deletion der Basisdomäne von HIF-1α zu einem Protein führt, welches die HIF-1-Aktivität durch Inhibition der DNA-Bindung blockieren kann.
TABELLE 2: OLIGONUKLEOTIDSEQUENZEN AUS DEN GENEN VON EPO UND GLYKOLYTISCHEN ENZYMEN
TABELLE 3: RELATIVE INDUKTION DES REPORTER-GENS IN ANWESENHEIT DER HIF-1α-VARIANTE
SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Verwendung einer Nucleotidsequenz, die den Hypoxie-induzierbaren Faktor 1α (HIF-1α) codiert, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus (a) Nucleotidsequenzen, die ein Polypeptid codieren, das die Aminosäuresequenzen wie dargestellt in SEQ ID NO:2 umfasst; (b) Nucleotidsequenzen, die die Sequenz der codierenden Region wie dargestellt in SEQ ID NO:1 umfassen; (c) Nucleotidsequenzen, die einen Teil des Polypeptids wie dargestellt in SEQ ID NO:2 codieren, wobei der Teil HIF-1α-Aktivität hat; (d) Nucleotidsequenzen, die fähig sind, unter stringenten Bedingungen selektiv an eine Nucleotidsequenz gemäß einem von (a) bis (c) zu hybridisieren und die ein HIF-1α-Polypeptid oder einen Teil davon mit HIF-1α-Aktivität codieren; und (e) Nucleotidsequenzen, die sich aufgrund der Degeneriertheit des genetischen Codes von den Nucleotidsequenzen gemäß einem von (a) bis (d) unterscheiden; oder des komplementären Strangs einer solchen Nucleotidsequenz, eines HIF-1α-Polypeptids, das von einer solchen Nucleotidsequenz codiert wird, oder eines Expressionsvektors, der eine solche Nucleotidsequenz umfasst, oder einer Wirtszelle, die stabil mit einer solchen Nucleotidsequenz oder einem solchen Vektor transformiert ist, für die Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung von Hypoxie-bezogenem Gewebeschaden in ischemischem Myokard.
Verwendung einer Nucleotidsequenz, die den Hypoxie-induzierbaren Faktor 1α (HIF-1α) codiert, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus (a) Nucleotidsequenzen, die ein Polypeptid codieren, das die Aminosäuresequenzen wie dargestellt in SEQ ID NO:2 umfasst; (b) Nucleotidsequenzen, die die Sequenz der codierenden Region wie dargestellt in SEQ ID NO:1 umfassen; (c) Nucleotidsequenzen, die einen Teil des Polypeptids wie dargestellt in SEQ ID NO:2 codieren, wobei der Teil HIF-1α-Aktivität hat; (d) Nucleotidsequenzen, die fähig sind, unter stringenten Bedingungen selektiv an eine Nucleotidsequenz gemäß einem von (a) bis (c) zu hybridisieren und die ein HIF-1α-Polypeptid oder einen Teil davon mit HIF-1α-Aktivität codieren; und (e) Nucleotidsequenzen, die sich aufgrund der Degeneriertheit des genetischen Codes von den Nucleotidsequenzen gemäß einem von (a) bis (d) unterscheiden; oder des komplementären Strangs einer solchen Nucleotidsequenz, eines HIF-1α-Polypeptids, das von einer solchen Nucleotidsequenz codiert wird, oder eines Expressionsvektors, der eine solche Nucleotidsequenz umfasst, oder einer Wirtszelle, die stabil mit einer solchen Nucleotidsequenz oder einem solchen Vektor transformiert ist, für die Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung von Hypoxie-bezogenem Gewebeschaden aufgrund von Reperfusion.
Verwendung einer Nucleotidsequenz, die den Hypoxie-induzierbaren Faktor 1α (HIF-1α) codiert, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus (a) Nucleotidsequenzen, die ein Polypeptid codieren, das die Aminosäuresequenzen wie dargestellt in SEQ ID NO:2 umfasst; (b) Nucleotidsequenzen, die die Sequenz der codierenden Region wie dargestellt in SEQ ID NO:1 umfassen; (c) Nucleotidsequenzen, die einen Teil des Polypeptids wie dargestellt in SEQ ID NO:2 codieren, wobei der Teil HIF-1α-Aktivität hat; (d) Nucleotidsequenzen, die fähig sind, unter stringenten Bedingungen selektiv an eine Nucleotidsequenz gemäß einem von (a) bis (c) zu hybridisieren und die ein HIF-1α-Polypeptid oder einen Teil davon mit HIF-1α-Aktivität codieren; und (e) Nucleotidsequenzen, die sich aufgrund der Degeneriertheit des genetischen Codes von den Nucleotidsequenzen gemäß einem von (a) bis (d) unterscheiden; oder des komplementären Strangs einer solchen Nucleotidsequenz, eines HIF-1α-Polypeptids, das von einer solchen Nucleotidsequenz codiert wird, oder eines Expressionsvektors, der eine solche Nucleotidsequenz umfasst, oder einer Wirtszelle, die stabil mit einer solchen Nucleotidsequenz oder einem solchen Vektor transformiert ist, für die Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung von Hypoxie-bezogenem Gewebeschaden aufgrund atherosklerotischer Krankheit.
Verwendung einer Nucleotidsequenz, die den Hypoxie-induzierbaren Faktor 1α (HIF-1α) codiert, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus (a) Nucleotidsequenzen, die ein Polypeptid codieren, das die Aminosäuresequenzen wie dargestellt in SEQ ID NO:2 umfasst; (b) Nucleotidsequenzen, die die Sequenz der codierenden Region wie dargestellt in SEQ ID NO:1 umfassen; (c) Nucleotidsequenzen, die einen Teil des Polypeptids wie dargestellt in SEQ ID NO:2 codieren, wobei der Teil HIF-1α-Aktivität hat; (d) Nucleotidsequenzen, die fähig sind, unter stringenten Bedingungen selektiv an eine Nucleotidsequenz gemäß einem von (a) bis (c) zu hybridisieren und die ein HIF-1α-Polypeptid oder einen Teil davon mit HIF-1α-Aktivität codieren; und (e) Nucleotidsequenzen, die sich aufgrund der Degeneriertheit des genetischen Codes von den Nucleotidsequenzen gemäß einem von (a) bis (d) unterscheiden; oder des komplementären Strangs einer solchen Nucleotidsequenz, eines HIF-1α-Polypeptids, das von einer solchen Nucleotidsequenz codiert wird, oder eines Expressionsvektors, der eine solche Nucleotidsequenz umfasst, oder einer Wirtszelle, die stabil mit einer solchen Nucleotidsequenz oder einem solchen Vektor transformiert ist, für die Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung von Hypoxie-bezogenem Gewebeschaden aufgrund koronarer Herzerkrankung.
Verwendung einer Nucleotidsequenz, die den Hypoxie-induzierbaren Faktor 1α (HIF-1α) codiert, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus (a) Nucleotidsequenzen, die ein Polypeptid codieren, das die Aminosäuresequenzen wie dargestellt in SEQ ID NO:2 umfasst; (b) Nucleotidsequenzen, die die Sequenz der codierenden Region wie dargestellt in SEQ ID NO:1 umfassen; (c) Nucleotidsequenzen, die einen Teil des Polypeptids wie dargestellt in SEQ ID NO:2 codieren, wobei der Teil HIF-1α-Aktivität hat; (d) Nucleotidsequenzen, die fähig sind, unter stringenten Bedingungen selektiv an eine Nucleotidsequenz gemäß einem von (a) bis (c) zu hybridisieren und die ein HIF-1α-Polypeptid oder einen Teil davon mit HIF-1α-Aktivität codieren; und (e) Nucleotidsequenzen, die sich aufgrund der Degeneriertheit des genetischen Codes von den Nucleotidsequenzen gemäß einem von (a) bis (d) unterscheiden; oder des komplementären Strangs einer solchen Nucleotidsequenz, eines HIF-1α-Polypeptids, das von einer solchen Nucleotidsequenz codiert wird, oder eines Expressionsvektors, der eine solche Nucleotidsequenz umfasst, oder einer Wirtszelle, die stabil mit einer solchen Nucleotidsequenz oder einem solchen Vektor transformiert ist, für die Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung von Hypoxie-bezogenem Gewebeschaden aufgrund einer Hirnarterien-Erkrankung.
Verwendung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei die Nucleotidsequenz aus einer Säugerzelle stammt.
Verwendung gemäß Anspruch 6, wobei die Säugerzelle eine menschliche Zelle ist.
Verwendung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei die Nucleotidsequenz die Nucleotide 1 bis 3736 wie dargestellt in SEQ ID NO:1 umfasst.
Verwendung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 8, wobei der Vektor ein Plasmid ist.
Verwendung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 8, wobei der Vektor ein Virus ist.
Verwendung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 10, wobei die Wirtszelle prokaryontisch ist.
Verwendung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 10, wobei die Wirtszelle eukaryontisch ist.