DE19725186C2 - Herz- und Skelettmuskel-spezifische Nukleinsäure, ihre Herstellung und Verwendung - Google Patents

Description

Die Erfindung betrifft eine im menschlichen Herz- und Skelettmuskel ex­ primierte Nukleinsäure, ihre Herstellung und Verwendung als Diagnostikum, Arzneimittel und Test zur Identifizierung funktioneller Interaktoren.

Das Herz ist ein muskuläres Hohlorgan mit der Aufgabe, durch wechselnde Kontraktion (Systole) und Erschlaffung (Diastole) von Vorhöfen und Kam­ mern den Blutstrom in den Gefäßen in Bewegung zu halten.

Der Herzmuskel, das Myokard, setzt sich aus spezialisierten quergestreiften Muskelzellen zusammen, zwischen denen Bindegewebe liegt. Jede Zelle besitzt einen zentralen Kern, wird von der Plasmamembran, dem Sarko­ lemm, begrenzt und enthält zahlreiche kontraktile Myofibrillen, die unregel­ mäßig durch Sarkoplasma getrennt sind. Die kontraktile Substanz des Her­ zens bilden lange parallele Myofibrillen. Jede Myofibrille unterteilt sich in mehrere gleiche strukturelle und funktionelle Einheiten, die Sarkomere. Die Sarkomere wiederum setzen sich aus den dünnen Filamenten, die hauptsäch­ lich aus Aktin, Tropomyosin und Troponin bestehen und den dicken Fila­ menten zusammen, die hauptsächlich aus Myosin bestehen.

Der molekulare Mechanismus der Muskelkontraktion beruht auf einer zykli­ schen Anheftung und Ablösung der globulären Myosinköpfe von den F- Aktinfilamenten. Bei elektrischer Stimulation des Herzmuskels wird Ca²⁺ aus dem sarkoplasmatischen Retikulum freigesetzt, welches durch eine allosteri­ sche Reaktion den Troponin-Komplex und Tropomyosin beeinflußt und so den Weg frei macht für einen Kontakt des Aktinfilamentes mit dem Myosin­ kopf. Die Anheftung bewirkt eine Konformationsänderung des Myosins, welches so das Aktinfilament an sich entlang zieht. Um diese Konforma­ tionsänderung rückgängig zu machen und an den Anfang eines Kontraktions­ zyklus zurückzukehren, wird ATP benötigt.

Die Aktivität des Herzmuskels kann durch nervöse und hormonelle Regula­ tionsmaßnahmen kurzfristig an den jeweiligen Perfusionsbedarf, d. h. Durch­ blutungsbedarf, des Körpers angepaßt werden. So können sowohl die Kon­ traktionskraft als auch die Kontraktionsgeschwindigkeit gesteigert werden. Bei langfristiger Überbeanspruchung kommt es zu physiologischen Umbauvor­ gängen im Herzmuskel, die hauptsächlich durch eine Vermehrung der Myofibrillen charakterisiert sind (Myozytenhypertrophie).

Bei Schädigungen des Herzmuskels führen oft die ursprünglich physiologi­ schen Anpassungsmechanismen langfristig zu pathophysiologischen Zuständen, die in chronische Herzinsuffizienz, d. h. Herzschwäche, münden und mei­ stens mit akutem Herzversagen enden. Bei schwerer chronischer Insuffizienz kann das Herz nicht mehr adäquat auf veränderte Leistungsanforderungen reagieren, selbst geringe körperliche Verrichtungen führen zu Erschöpfung und Atemnot.

Schädigungen des Herzmuskels resultieren aus Ischämie, d. h. Blutleere, verursacht durch Koronarerkrankungen, bakteriellen oder viralen Infektionen, Toxinen, metabolischen Abnormalitäten, Autoimmunerkrankungen oder geneti­ schen Defekten. Therapeutische Maßnahmen richten sich zur Zeit auf eine Stärkung der Kontraktionkraft und eine Kontrolle der kompensatorischen neuronalen und hormonellen Kompensationsmechanismen. Trotz dieser Be­ handlung ist die Sterblichkeit dieser Erkrankung nach wie vor hoch (35-50% innerhalb der ersten 5 Jahre nach Diagnose). Herzinsuffizienz ist die Haupt­ todesursache weltweit. Die einzige Kausaltherapie stellt die Herztransplantation dar.

Die molekularen Veränderungen bei chronischer Herzinsuffizienz sind nur ungenügend bekannt. Insbesondere die genetischen Veränderungen, die der Herzinsuffizienz zugrundeliegen, sind weitgehend unbekannt. Auch die Frage, warum sekundäre Schädigungen durch Toxine oder Viren bei manchen Menschen zur Herzinsuffizienz führen, jedoch bei anderen nicht, bleibt unbeantwortet.

Der vorliegenden Erfindung liegt somit die Aufgabe zugrunde, Gene zu identifizieren und zu isolieren, die für genetisch bedingte Herzerkrankungen zumindest mitverantwortlich, wenn nicht sogar ursächlich sind.

Es wurde nun überraschenderweise in einer cDNA-Bank des menschlichen Herzgewebes ein Gen gefunden, das im insuffizienten Herzgewebe stärker exprimiert wird als im gesunden Herzgewebe und somit in einem kausalen Zusammenhang mit einer genetisch bedingten Herzinsuffizienz steht.

Ein Gegenstand der Erfindung ist daher eine Nukleinsäure kodierend für ein Polypeptid mit einer Aminosäuresequenz gemäß Fig. 4 oder eine funktionelle Variante davon, und Teile davon mit mindestens 8 Nukleotiden, vorzugsweise mindestens 10 Nukleotiden, insbesondere mindestens 15 Nukleotiden, vor allem mindestens 20 Nukleotiden (nachfolgend "erfindungsgemäße Nukleinsäure" genannt), die im insuffizienten Herzgewebe stärker exprimiert wird als im gesunden Herzgewebe.

Die erfindungsgemäße Nukleinsäure wurde aus einer cDNA-Bank des menschlichen Herzgewebes isoliert und sequenziert. Hierzu wurde zuerst aus einer gesunden und insuffizienten Hergewebe-Probe Gesamt-RNA nach Standardmethoden isoliert und mit Hilfe eines 3'-Anker-Primergemisches, z. B. eines 5'-T₁₂ACN-3' Primers, bei dem N ein beliebiges Deoxyribonukleo­ tid bedeutet, und reverser Transkriptase in c-DNA umgeschrieben. Die cDNA wurde anschießend in Anlehnung an die sogenannte Differential Display Methode nach Liang und Pardee (Liang, P. & Pardee, A. (1992) Science 257, 967-970) unter speziellen PCR-Bedingungen mit Hilfe eines 3'- Primers, z. B. eines T₁₂ACN-Primers, und eines willkürlich ausgewählten 5'-Dekamer-Primer, z. B. eines 5'-CCTTCTACCC-3'-Dekamer-Primers, am­ plifiziert. Hierbei konnte ein 321 Basenpaar (bp)-langes DNA-Fragment amplifiziert werden, das überraschenderweise nicht in der gesunden Herz­ probe, jedoch deutlich in der insuffizienten Herzprobe vorhanden ist. Dies war deshalb so überraschend, da die gängigen Methoden wie Differential Display Methode oder auch substraktive cDNA-Genbanken mit dem Problem der Redundanz, der Unterrepräsentation und der falsch positiven Klone behaftet sind. Insbesondere die Genprodukte schwach exprimierter Gene können nur unter speziellen Bedingungen identifiziert werden. Daher ist es auch nicht verwunderlich, daß die Trefferquote im allgemeinen sehr gering (10-20%) ist und beispielsweise bei der Differentiellen Display Methode auch von den gewählten PCR-Bedingungen, der Primer-Länge oder beispielsweise bei der Herstellung subtraktiver Banken von der Hybridisierungstemperatur abhängt. Anschließend wurde das gesamte Gen aus einer cDNA-Genbank mit Hilfe des gefundenen DNA-Fragmentes isoliert und sequenziert.

In jedem Fall ist es notwendig, durch weitere Methoden aufzuklären, ob die gefundene cDNA einem aktiven und/oder gewebespezifischen Gen zugeordnet werden kann. Daher wurden mRNAs aus verschiedenen menschlichen Gewe­ ben mit dem gefundenen DNA-Fragment in einem sogenannten Northern-Blot hybridisiert und die Menge an gebundener m-RNA beispielsweise über die radioaktive Markierung des DNA-Fragments bestimmt. Dieses Experiment führte zu einem Nachweis der korrespondierenden RNA vor allem in quer­ gestreifter Muskulatur, also Herzmuskel- und Skelettmuskelgewebe sowie sehr schwach in Prostatagewebe. In einem weiteren Vergleichsexperiment zwischen gesundem und insuffizientem Herzgewebe wurde eine erhöhte Expression, beispielsweise eine um ca. 35% erhöhte Expression der RNAs in insuffizien­ tem Gewebe im Vergleich zum gesunden Gewebe nachgewiesen. Insbesonde­ re konnte nachgewiesen werden, daß eine kleinere RNA-Spezies bevorzugt in insuffizientem Gewebe im Vergleich zum gesunden Gewebe eine erhöhte Expression aufweist. Die erhöhte Expression der kleineren RNA-Spezies ist beispielsweise im Northern-Blot in Form einer Doppelbande leicht zu erken­ nen (siehe Fig. 5b).

Ein Vergleich der abgeleiteten Polypeptidsequenz mit einer Proteindatenbank ergab zudem eine gewisse Verwandtschaft (Homologie) mit dem Protein Tropomodulin (siehe Fig. 4). Tropomodulin ist als ein Polypeptid bekannt, das in Hühnchen-Kardiomyozyten Einfluß auf die Ausbildung der Myofibril­ len und die Kontraktionsfähigkeit der Zellen hat (Gregorio et al. (1995) Nature 377, 83-86). Dieses Protein bindet zum einen an Tropomyosin und zum anderen an die Actin-Filamente, wird aber selbst nicht in seiner Aktivi­ tät reguliert. Das abgeleitete erfindungsgemäße Polypeptid weist ebenso einige Strukturmerkmale des Tropomodulins auf, wie z. B. eine Tropomyo­ sin-Bindedomäne. Im Gegensatz zu Tropomodulin besitzt das erfindungs­ gemäße Polypeptid zusätzliche Strukturmerkmale, die auf eine Regulation der Aktivität des Polypeptids durch sogenannte Tyrosinkinasen hinweisen (siehe Fig. 4).

Unter dem Begriff "funktionelle Variante" im Sinne der vorliegenden Erfin­ dung versteht man daher Polypeptide, die funktionell mit dem erfindungs­ gemäßen Polypeptid verwandt sind, d. h. ebenso als ein regulierbarer Modulator der Kontraktionsfähigkeit von Herzmuskelzellen bezeichnet werden können, in quergestreifter Muskulatur, vorzugsweise in Herzmuskel-, Skelett­ muskel- und/oder Prostatagewebe, vor allem in Herzmuskel- und/oder Ske­ lettmuskel und insbesondere in Herzmuskelzellen exprimiert werden, Struktur­ merkmale des Tropomodulins aufweisen, wie z. B. eine oder mehrere Tropomyosin-Bindedomänen, und/oder deren Aktivität durch Tyrosinkinasen reguliert werden können. Beispiele funktioneller Varianten sind die entspre­ chenden Polypeptide, die aus anderen Organismen als dem Menschen, vorzugsweise aus nicht-menschlichen Säugetieren, wie z. B. Affen, stammen.

Im weiteren Sinne versteht man darunter auch Polypeptide, die eine Se­ quenzhomologie, insbesondere eine Sequenzidentität, von ca. 70%, vorzugs­ weise ca. 80%, insbesondere ca. 90%, vor allem ca. 95% zu dem Polypep­ tid mit der Aminosäuresequenz gemäß Fig. 4 haben. Darunter zählen bei­ spielsweise Polypeptide, die von einer Nukleinsäure kodiert werden, die aus nicht-herzspezifischem Gewebe, z. B. Skelettmuskelgewebe, isoliert wird, jedoch nach Expression in einer herzspezifischen Zelle die bezeichnete Funktion(en) besitzt. Ferner zählen hierzu auch Deletionen des Polypeptids im Bereich von ca. 1-60, vorzugsweise von ca. 1-30, insbesondere von ca. 1-15, vor allem von ca. 1-5 Aminosäuren. Beispielsweise kann die erste Aminosäure Methionin fehlen, ohne daß die Funktion des Polypeptids we­ sentlich verändert wird. Daneben zählen hierzu auch Fusionsproteine, die die oben beschriebenen erfindungsgemäßen Polypeptide enthalten, wobei die Fusionsproteine selbst bereits die Funktion eines regulierbaren Modulators der Kontraktionsfähigkeit von Herzmuskelzellen haben oder erst nach Ab­ spaltung des Fusionsanteils die spezifische Funktion bekommen können. Vor allem zählen hierzu Fusionsproteine mit einem Anteil von insbesondere nicht- herzspezifischen Sequenzen von ca. 1-200, vorzugsweise ca. 1-150, ins­ besondere ca. 1-100, vor allem ca. 1-50 Aminosäuren. Beispiele von nicht- herzspezifischen Peptidsequenzen sind prokaryotische Peptidsequenzen, die z. B. aus der Galactosidase von E. coli abgeleitet sein können.

Die erfindungsgemäße Nukleinsäure ist im allgemeinen eine DNA oder RNA, vorzugsweise eine DNA. Für die Expression des betreffenden Gens ist im allgemeinen eine doppelsträngige DNA bevorzugt und für die Ver­ wendung als Sonde eine einzelsträngige DNA. Besonders bevorzugt ist eine doppel- oder einzelsträngige DNA mit einer Nukleinsäuresequenz gemäß Fig. 1, 2 oder 3 und die oben bereits näher beschriebenen Teile davon, wobei der für das Polypeptid kodierende DNA-Bereich besonders bevorzugt ist. Dieser Bereich beginnt mit den Nukleinsäuren "ATG" kodierend für Methio­ nin an der Position 89 bis "TAG" kodierend für "Amber" (Stop) an der Position 1747.

Die erfindungsgemäße Nukleinsäure kann beispielsweise chemisch anhand der in Fig. 1-3 offenbarten Sequenzen oder anhand der in Fig. 4 offenbarten Polypeptidsequenz unter Heranziehen des genetischen Codes z. B. nach der Phosphotriester-Methode synthetisiert werden (siehe z. B. Uhlmann, E. & Peyman, A. (1990) Chemical Reviews, 90, 543-584, No. 4). Eine weitere Möglichkeit, die erfindungsgemäße Nukleinsäure in die Hand zu bekommen, ist die Isolierung aus einer geeigneten Genbank, beispielsweise aus einer herzspezifischen Genbank, anhand einer geeigneten Sonde (siehe z. B. J. Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning. A Laboratory Manual 2nd edn., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY). Als Sonde eignen sich beispielsweise einzelsträngige DNA-Fragmente mit einer Länge von ca. 100-1000 Nukleotiden, vorzugsweise mit einer Länge von ca. 200-­ 500 Nukleotiden, insbesondere mit einer Länge von ca. 300-400 Nukleotiden deren Sequenz aus den Nukleinsäuresequenzen gemäß Fig. 1-3 abgeleitet werden kann. Ein Beispiel einer Sonde ist das 321 bp große DNA-Fragment gemäß Beispiel 1, das dem unterstrichenen Bereich in Fig. 1 entspricht, mit dem bereits erfolgreich die erfindungsgemäße Nukleinsäure aus humanem Herzgewebe isoliert wurde (siehe Beispiel 2).

Üblicherweise ist die erfindungsgemäße Nukleinsäure in einem Vektor, vorzugsweise in einem Expressionsvektor oder gentherapeutisch wirksamen Vektor enthalten. Vorzugsweise enthält der gentherapeutisch wirksame Vektor herzspezifische regulatorische Sequenzen, wie z. B. den Troponin C (cTNC) Promotor (siehe z. B. Parmacek, M. S. et al. (1990) J. Biol. Chem. 265 (26) 15970-15976 und Parmacek, M. S. et al. (1992) Mol. Cell Biol. 12(5), 1967-1976), der funktionell mit der erfindungsgemäßen Nukleinsäure ver­ bunden ist.

Die Expressionsvektoren können prokaryotische oder eukaryotische Expres­ sionsvektoren sein. Beispiele für prokaryotische Expressionsvektoren sind für die Expression in E. coli z. B. die Vektoren pGEM oder pUC-Derivate und für eukaryotische Expressionsvektoren für die Expression in Saccharomyces cerevisiae z. B. die Vektoren p426Met25 oder p426GAL1 (Mumberg et al. (1994) Nucl. Acids Res., 22, 5767-5768), für die Expression in Insektenzel­ len z. B. Baculovirus-Vektoren wie in EP-B1-0 127 839 oder EP-B1-0 549 721 offenbart, und für die Expression in Säugerzellen z. B. die Vektoren Rc/CMV und Rc/RSV oder SV40-Vektoren, welche alle allgemein erhältlich sind.

Im allgemeinen enthalten die Expressionsvektoren auch für die jeweilige Wirtszelle geeignete Promotoren, wie z. B. den trp-Promotor für die Ex­ pression in E. coli (siehe z. B. EP-B1-0 154 133), den ADH2-Promotor für die Expression in Hefen (Russel et al. (1983), J. Biol. Chem. 258, 2674- 2682), den Baculovirus-Polyhedrin-Promotor für die Expression in Insekten­ zellen (siehe z. B. EP-B1-0 127 839) oder den frühen SV40 Promotor oder LTR-Promotoren z. B. von MMTV (mouse mammary tumour virus; Lee et al. (1981) Nature 214, 228-232).

Beispiele von gentherapeutisch wirksamen Vektoren sind Virusvektoren, vorzugsweise Adenovirusvektoren, insbesondere replikationsdefiziente Adenovi­ rusvektoren, oder Adenoassoziierte Virusvektoren, z. B. ein Adenoassoziierter Virusvektor, der ausschließlich aus zwei invertierten terminalen Wiederho­ lungssequenzen (ITR) besteht.

Ein Adenovirusvektor und insbesondere ein replikationsdefizienter Adenovirusvektor sind aus den folgenden Gründen besonders bevorzugt.

Das humane Adenovirus gehört zu der Klasse der doppelsträngigen DNA- Viren mit einem Genom von ca. 36 Kilobasenpaaren (Kb). Die virale DNA kodiert für etwa 2700 verschiedene Genprodukte, wobei man frühe ("early genes ") und späte ("late genes") unterscheidet. Die "early genes " werden in vier transkriptionellen Einheiten, E1 bis E4, unterteilt. Die späten Gen­ produkte kodieren für die Kapsidproteine. Immunologisch können mindestens 42 verschiedene Adenoviren und die Untergruppen A bis F unterschieden werden, die alle für die vorliegende Erfindung geeignet sind. Die Trans­ kription der viralen Gene setzt die Expression der E1-Region voraus, welche für einen Transaktivator der adenoviralen Genexpression kodiert. Diese Abhängigkeit der Expression aller nachfolgenden viralen Gene von dem E1- Transaktivator kann für die Konstruktion der nicht replikationsfähigen adeno­ viralen Vektoren genutzt werden (siehe z. B. McGrory, W. J. et al. (1988) Virol. 163, 614-617 und Gluzman, Y. et al. (1982) in "Eukaryotic Viral Vectors" (Gluzman, Y. ed.) 187. 192, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, New York). In adenoviralen Vektoren, insbesondere vom Typ 5 (Sequenz siehe Chroboczek, J. et al. (1992) Virol. 186, 280-285) und vor allem von der Untergruppe C, wird im allgemeinen die E1-Genre­ gion durch ein Fremdgen mit eigenem Promotor bzw. durch das erfindungs­ gemäße Nukleinsäurekonstrukt ersetzt. Durch den Austausch der E1-Genre­ gion, welche für die Expression der nachgeschalteten adenoviralen Gene Voraussetzung ist, entsteht ein nicht replikationsfähiges Adenovirus. Diese Viren können sich dann nur in einer Zellinie vermehren, welche die fehlen­ den E1-Gene ersetzt.

Replikationsdefiziente Adenoviren werden daher im allgemeinen durch homo­ loge Rekombination in der sogenannten 293-Zellinie (humane embryonale Nierenzellinie), die eine Kopie der E1-Region stabil im Genom integriert hat, gebildet. Hierzu werden unter Kontrolle eines eigenen Promotors, z. B. des bereits oben genannten Troponin C Promotors, die erfindungsgemäße Nukleinsäure in rekombinante adenovirale Plasmide kloniert. Anschließend erfolgt die homologe Rekombination mit einem E1-defizienten adenoviralen Genom, wie z. B. d1327 oder del1324 (Adenovirus 5), in der Helferzellinie 293. Bei erfolgreicher Rekombination werden virale Plaques geerntet. Die so erzeugten replikationsdefizienten Viren werden in hohen Titern (beispielsweise 10⁹ bis 10¹¹ "plaque forming units" oder plaquebildenden Einheiten) zur Infektion der Zellkultur oder für die somatische Gentherapie eingesetzt.

Im allgemeinen ist die genaue Insertionsstelle der erfindungsgemäßen Nu­ kleinsäure in das adenovirale Genom nicht kritisch. Es ist z. B. auch mög­ lich, die erfindungsgemäße Nukleinsäure an die Stelle des deletierten E3- Gens zu klonieren (Karlsson, S. et al. EMBO J. 5. 1986, 2377-2385). Vorzugsweise wird jedoch die E1-Region oder Teile davon, z. B. die E1A- oder E1B-Region (siehe z. B. WO 95/00655) durch die erfindungsgemäße Nukleinsäure ersetzt, vor allem, wenn auch die E3-Region deletiert ist.

Die vorliegende Erfindung ist jedoch nicht auf das adenovirale Vektorsystem beschränkt, sondern auch Adeno-assoziierte Virusvektoren eignen sich in Kombination mit der erfindungsgemäßen Nukleinsäure aus folgenden Gründen in besonderer Weise.

Das AAV-Virus gehört zur Familie der Parvoviren. Diese zeichnen sich durch ein ikosaedrisches, unbehülltes Kapsid mit einem Durchmesser von 18 bis 30 nm aus, welches eine lineare, einzelsträngige DNA von ca. 5 kb enthält. Für eine effiziente Vermehrung von AAV ist eine Koinfektion der Wirtszelle mit Helferviren erforderlich. Als Helfer eignen sich beispielsweise Adenoviren (Ad5 oder Ad2), Herpesviren und Vacciniaviren (Muzyczka, N. (1992) Curr. Top. Microbiol. Immunol. 158, 97-129). In Abwesenheit eines Helfervirus geht AAV in einen Latenzzustand über, wobei das Virus­ genom in der Lage ist, stabil in das Wirtszellgenom zu integrieren. Die Eigenschaft von AAV, in das Wirtsgenom zu integrieren, macht es als Transduktionsvektor für Säugetierzellen besonders interessant. Für die Vektor­ funktionen genügen im allgemeinen die beiden ca. 145 bp langen invertierten terminalen Wiederholungssequenzen (ITR: inverted terminal repeats; siehe z. B. WO 95/23867). Sie tragen die in "cis" notwendigen Signale für Repli­ kation, Verpackung und Integration in das Wirtszellgenom. Zur Verpackung in rekombinante Vektorpartikel wird ein Vektorplasmid, welches die Gene für nicht-strukturelle Proteine (rep-Proteine) und für strukturelle Proteine (cap-Proteine) trägt, in Adenovirus-infizierte Zellen transfiziert. Nach einigen Tagen wird ein zellfreies Lysat hergestellt, welches neben den rekombinanten AAV-Partikeln auch Adenoviren enthält. Die Adenoviren kön­ nen vorteilhafterweise durch Erhitzen auf 56°C oder durch Bandieren im Cäsiumchlorid-Gradienten entfernt werden. Mit dieser Cotransfektionsmethode sind rAAV-Titer von 10⁵ bis 10⁶ IE/ml erzielbar. Die Kontamination durch Wildtypviren liegt unterhalb der Nachweisgrenze, wenn das Verpackungs­ plasmid und das Vektorplasmid keine überlappenden Sequenzen besitzen (Samulski, R. J. (1989) J. Virol. 63, 3822-3828).

Der Transfer der erfindungsgemäßen Nukleinsäure in somatische Körperzellen kann durch AAV in ruhende, differenzierte Zellen erfolgen, was für die Gentherapie des Herzens besonders vorteilhaft ist. Durch die erwähnte Integrationsfähigkeit kann auch eine lang anhaltende Genexpression in vivo gewährleistet werden, was wiederum besonders vorteilhaft ist. Ein weiterer Vorteil von AAV ist, daß das Virus nicht pathogen für den Menschen und relativ stabil in vivo ist. Die Klonierung der erfindungsgemäßen Nukleinsäure in den AAV-Vektor oder Teilen davon erfolgt nach dem Fachmann bekann­ ten Methoden, wie sie z. B. in der WO 95/23867, bei Chiorini, J. A. et al. (1995), Human Gene Therapy 6, 1531-1541 oder Kotin, R. M. (1994), Human Gene Therapy 5, 793-801 beschrieben sind.

Gentherapeutisch wirksame Vektoren lassen sich auch dadurch erhalten, daß man die erfindungsgemäße Nukleinsäure mit Liposomen komplexiert, da damit eine sehr hohe Transfektionseffizienz, insbesondere von Herzmuskelzellen, erreicht werden kann (Felgner, P. L. et al. (1987), Proc. Natl. Acad. Sci USA 84, 7413-7417). Bei der Lipofektion werden kleine unilamellare Vesikel aus kationischen Lipiden durch Ultraschallbehandlung der Liposomensuspension hergestellt. Die DNA wird ionisch auf der Ober­ fläche der Liposomen gebunden, und zwar in einem solchen Verhältnis, daß eine positive Nettoladung verbleibt und die Plasmid-DNA zu 100% von den Liposomen komplexiert wird. Neben den von Felgner et al. (1987, supra) eingesetzten Lipidmischungen DOTMA (1,2-Dioleyloxypropyl-3-trimethyl­ ammoniumbromid) und DOPE (Dioleoylphosphatidylethanolamin) wurden inzwischen zahlreiche neue Lipidformulierungen synthetisiert und auf ihre Effizienz der Transfektion verschiedener Zellinien getestet (Behr, J. P. et al. (1989), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86, 6982-6986; Felgner, J. H. et al. (1994) J. Biol. Chem. 269, 2550-2561; Gao, X. & Huang, L. (1991), Biochim. Biophys. Acta 1189, 195-203). Beispiele der neuen Lipidformu­ lierungen sind DOTAP N-[1-(2,3-Dioleoyloxy)propyl]-N,N,N- trimethylammoniumethylsulfat oder DOGS (TRANSFECTAM; Dioc­ tadecylamidoglycylspermin). Ein Beispiel für die Herstellung von DNA- Liposomenkomplexen und deren erfolgreiche Anwendung in der Herz­ spezifischen Transfektion ist in der DE 44 11 402 beschrieben.

Für die gentherapeutische Anwendung der erfindungsgemäßen Nukleinsäure ist es auch von Vorteil, wenn der Teil der Nukleinsäure, der für das Polypeptid kodiert, ein oder mehrere nicht-kodierende Sequenzen einschließlich Intronsequenzen, vorzugsweise zwischen Promotor und dem Startcodon des Polypeptids, und/oder eine polyA-Sequenz, insbesondere die natürlich vorkommende polyA-Sequenz oder eine SV40 Virus polyA-Sequenz, vor allem am 3'-Ende des Gens enthält, da hierdurch eine Stabilisierung der mRNA in der Herzmuskelzelle erreicht werden kann (Jackson, R. J. (1993) Cell 74, 9-14 und Palmiter, R. D. et al. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88, 478-482).

Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist auch das Polypeptid selbst mit einer Aminosäuresequenz gemäß Fig. 4 oder eine funktionelle Variante davon, und Teile davon mit mindestens 6 Aminosäuren, vorzugsweise mit mindestens 12 Aminosäuren, insbesondere mit mindestens 15 Aminosäuren und vor allem mit mindestens 164 Aminosäuren (nachfolgend erfindungsgemäßes Polypeptid genannt), dessen für das Polypeptid kodierende Nukleinsäure im insuffizienten Herzgewebe stärker exprimiert wird als im gesunden Herzgewebe.

Das Polypeptid wird beispielsweise durch Expression der erfindungsgemäßen Nukleinsäure in einem geeigneten Expressionssystem, wie oben bereits beschrieben, nach dem Fachmann allgemein bekannten Methoden hergestellt. Als Wirtszellen eignen sich beispielsweise die E. coli Stämme DH5, HB101 oder BL21, der Hefestamm Saccharomyces cerevisiae, die Insektenzellinie Lepidopteran, z. B. von Spodoptera frugiperda, oder die tierischen Zellen COS, Vero, 293 und HeLa, die alle allgemein erhältlich sind.

Die genannten Teile des Polypeptids können auch mit Hilfe der klassischen Synthese (Merrifield-Technik) synthetisiert werden. Sie eignen sich insbeson­ dere zur Gewinnung von Antiseren, mit deren Hilfe geeignete Genexpres­ sionsbanken durchsucht werden können, um so zu weiteren funktionellen Varianten des erfindungsgemäßen Polypeptids zu gelangen.

Ein anderer Gegenstand der vorliegenden Erfindung bezieht sich daher auch auf Antikörper, die mit dem erfindungsgemäßen Polypeptid spezifisch reagie­ ren, wobei die oben genannten Teile des Polypeptids entweder selbst immu­ nogen sind oder durch Kopplung an geeignete Träger, wie z. B. bovines Serumalbumin, immunogen gemacht bzw. in ihrer Immunogenität gesteigert werden können.

Die Antikörper sind entweder polyklonal oder monoklonal. Die Herstellung, die auch einen Gegenstand der vorliegenden Erfindung darstellt, erfolgt bei­ spielsweise nach allgemein bekannten Methoden durch Immunisieren eines Säugetiers, beispielsweise eines Kaninchens, mit dem erfindungsgemäßen Polypeptid oder den genannten Teilen davon gegebenenfalls in Anwesenheit von z. B. Freunds Adjuvant und/oder Aluminumhydroxidgelen (siehe z. B. Diamond, B. A. et al. (1981) The New England Journal of Medicine, 1344-­ 1349). Die im Tier aufgrund einer immunologischen Reaktion entstandenen polyklonalen Antikörper lassen sich anschließend nach allgemein bekannten Methoden leicht aus dem Blut isolieren und z. B. über Säulenchromatogra­ phie reinigen. So konnte beispielsweise gegen ein Polypeptid mit den erfin­ dungsgemäßen Aminosäuren 1-90 gemäß Fig. 4, das als Fusionsprotein in Bakterien exprimiert und über eine Affinitätschromatographie gereinigt wurde, ein polyklonales Antiserum im Kaninchen erzeugt werden. Die erfindungs­ gemäßen Antikörper erkannten in Extrakten aus humanem Herzgewebe spezifisch das entsprechende Protein von ca. 80 kD.

Monoklonale Antikörper können beispielsweise nach der bekannten Methode von Winter & Milstein (Winter, G. & Milstein, C. (1991) Nature, 349, 293-299) hergestellt werden.

Ein Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist auch ein Arzneimittel, das eine erfindungsgemäße Nukleinsäure oder ein erfindungsgemäßes Polypeptid und gegebenenfalls geeignete Zusatz- oder Hilfsstoffe enthält und ein Ver­ fahren zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung von Herzerkran­ kungen, insbesondere von Herzinsuffizienz, bei dem eine erfindungsgemäße Nukleinsäure oder ein erfindungsgemäßes Polypeptid mit einem pharmazeu­ tisch annehmbaren Träger formuliert wird.

Für die gentherapeutische Anwendung beim Menschen ist vor allem ein Arzneimittel geeignet, das die erfindungsgemäße Nukleinsäure in nackter Form oder in Form eines der oben beschriebenen gentherapeutisch wirk­ samen Vektoren oder in mit Liposomen komplexierter Form enthält. Der pharmazeutische Träger ist beispielsweise eine physiologische Pufferlösung, vorzugsweise mit einem pH von ca. 6,0-8,0, vorzugsweise von ca. 6,8-7,8, insbesondere von ca. 7,4 und/oder einer Osmolarität von ca. 200-400 milliosmol/Liter, vorzugsweise von ca. 290-310 milliosmol/Liter. Zusätzlich kann der pharmazeutische Träger geeignete Stabilisatoren, wie z. B. Nukle­ aseinhibitoren, vorzugsweise Komplexbildner wie EDTA und/oder andere dem Fachmann bekannte Hilfsstoffe enthalten.

Die Verabreichung der erfindungsgemäßen Nukleinsäure gegebenenfalls in Form der oben näher beschriebenen Virusvektoren oder als Liposomenkom­ plexe erfolgt üblicherweise intravenös, z. B. mit Hilfe eines Katheters. Vorteilhaft ist beispielsweise die direkte Infusion der erfindungsgemäßen Nukleinsäure in die Koronararterien des Patienten (sog. "Percutaneous Coronary Gene Transfer", PCGT), insbesondere in Form von rekombinanten Adenovirusvektoren oder Adenoassoziierten Virusvektoren. Besonders bevor­ zugt ist die Verabreichung mit Hilfe eines Ballonkatheters, da hierdurch die Transfektion nicht nur auf das Herz, sondern auch innerhalb des Herzens auf die Injektionsstelle begrenzt werden kann (siehe z. B. Feldman, L. J. et al. (1994) JACC 235A, 906-934).

Es ist auch möglich, das Polypeptid selbst intravenös oder mit Hilfe eines Katheters oder Ballonkatheters gegebenenfalls mit geeigneten Zusatz- oder Hilfsstoffen, wie z. B. physiologische Kochsalzlösung, Stabilisatoren, Protei­ naseinhibitoren etc., zu verabreichen, um die Funktion des Herzens sofort und unmittelbar zu beeinflussen.

Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist auch ein Diagnosti­ kum enthaltend eine erfindungsgemäße Nukleinsäure, ein erfindungsgemäßes Polypeptid oder erfindungsgemäße Antikörper und gegebenenfalls geeignete Zusatz- oder Hilfsstoffe und ein Verfahren zur Herstellung eines Diagnosti­ kums zur Diagnose von Herzerkrankungen, insbesondere Herzinsuffizienz, bei dem eine erfindungsgemäße Nukleinsäure, ein erfindungsgemäßes Polypeptid oder erfindungsgemäße Antikörper mit geeigneten Zusatz- oder Hilfsstoffe versetzt wird.

Beispielsweise können gemäß der vorliegenden Erfindung anhand der erfin­ dungsgemäßen Nukleinsäure ein Diagnostikum auf der Basis der Polymerase­ kettenreaktion (PCR-Diagnostik, z. B. gemäß EP-0 200 362) oder eines Northern-Blots, wie in Beispiel 3 unter Verwendung des erfindungsgemäßen 321 bp DNA-Fragmentes als Sonde näher dargestellt, hergestellt werden. Diese Tests beruhen auf der spezifischen Hybridisierung der erfindungs­ gemäßen Nukleinsäuren mit dem komplementären Gegenstrang üblicherweise der entsprechenden mRNA. Die erfindungsgemäße Nukleinsäure kann hierbei auch modifiziert sein, wie z. B. in EP 0 063 879 beschrieben. Vorzugs­ weise wird ein erfindungsgemäßes DNA-Fragment, insbesondere das in Beispiel 1 beschriebene DNA-Fragment mittels geeigneter Reagenzien, z. B. radioaktiv mit α-P³²-dCTP oder nicht-radioaktiv mit Biotin, nach allgemein bekannten Methoden markiert und mit isolierter RNA, die vorzugsweise vorher an geeignete Membranen aus z. B. Cellulose oder Nylon gebunden wurde, inkubiert. Zudem ist es vorteilhaft die isolierte RNA vor der Hybri­ disierung und Bindung an eine Membran der Größe nach, z. B. mittels Agarose-Gelelektrophorese, aufzutrennen. Bei gleicher Menge an untersuchter RNA aus jeder Gewebeprobe kann somit die Menge an mRNA bestimmt werden, die spezifisch durch die Sonde markiert wurde.

Mit Hilfe des erfindungsgemäßen Diagnostikums kann somit auch eine Gewebeprobe des Herzens in vitro auf die Expressionsstärke des korrespon­ dierenden Gens spezifisch gemessen werden, um eine mögliche Herzinsuffi­ zienz sicher diagnostizieren zu können (siehe Beispiel 1). Insbesondere eignet sich eine cDNA mit einer Sequenz gemäß Fig. 1 für die Diagnose einer möglichen Herzinsuffizienz (siehe Beispiel 2).

Ein weiteres Diagnostikum enthält das erfindungsgemäße Polypeptid bzw. die oben näher beschriebenen immunogenen Teile davon. Das Polypeptid bzw. die Teile davon, die vorzugsweise an eine Festphase, z. B. aus Nitrocellulo­ se oder Nylon, gebunden sind, können beispielsweise mit der zu unter­ suchenden Körperflüssigkeit, z. B. Blut, in vitro in Berührung gebracht werden, um so beispielsweise mit Autoimmunantikörper reagieren zu können. Der Antikörper-Peptid-Komplex kann anschließend beispielsweise anhand markierter Antihuman-IgG- oder Antihuman-IgM-Antikörper nachgewiesen werden. Bei der Markierung handelt es sich beispielsweise um ein Enzym, wie Peroxidase, das eine Farbreaktion katalysiert. Die Anwesenheit und die Menge an anwesenden Autoimmunantikörper kann somit über die Farbreak­ tion leicht und schnell nachgewiesen werden.

Ein anderes Diagnostikum enthält die erfindungsgemäßen Antikörper selbst. Mit Hilfe dieser Antikörper kann beispielsweise eine Gewebeprobe des Herzens leicht und schnell dahingehend untersucht werden, ob das betreffen­ de Polypeptid in einer erhöhten Menge vorhanden ist, um dadurch einen Hinweis auf eine mögliche Herzinsuffizienz zu erhalten. In diesem Fall sind die erfindungsgemäßen Antikörper beispielsweise mit einem Enzym, wie oben bereits beschrieben, markiert. Der spezifische Antikörper-Peptid-Komplex kann dadurch leicht und ebenso schnell über eine enzymatische Farbreaktion nachgewiesen werden.

Ein anderer Gegenstand der vorliegenden Erfindung betrifft einen Test zur Identifizierung funktioneller Interaktoren enthaltend eine erfindungsgemäße Nukleinsäure, ein erfindungsgemäßes Polypeptid oder die erfindungsgemäßen Antikörper und gegebenenfalls geeignete Zusatz- oder Hilfsstoffe.

Ein geeigneter Test zur Identifizierung funktioneller Interaktoren ist z. B. das sogenannte "Two-Hybrid System" (Fields, S. & Sternglanz, R. (1994) Trends in Genetics, 10, 286-292).

Bei diesem Test wird eine Zelle, beispielsweise eine Hefezelle, mit einem oder mehreren Expressionsvektoren transformiert oder transfiziert, die ein Fusionsprotein exprimieren, das das erfindungsgemäßen Polypeptid und eine DNA-Bindedomäne eines bekannten Proteins, beispielsweise von Gal4 oder LexA aus E. coli, enthält, und/oder ein Fusionsprotein exprimiert, das ein unbekanntes Polypeptid und eine Transkriptions-Aktivierungsdomäne, beispiels­ weise von Gal4, Herpes Virus VP16 oder B42, enthält. Zudem enthält die Zelle ein Reportergen, beispielsweise das lacZ-Gen aus E. coli, "green fluorescence protein" oder die Aminosäure-Biosynthesegene der Hefe His3 oder Leu2, das durch regulatorische Sequenzen, wie z. B. den lexA-Promo­ tor/Operator oder durch eine sogenannte "upstream activation sequence" (UAS) der Hefe, kontrolliert wird. Das unbekannte Polypeptid wird bei­ spielsweise durch ein DNA-Fragment kodiert, das aus einer Genbank, beispielsweise aus einer Herzgewebe-spezifischen Genbank des Menschen, stammt. Üblicherweise wird gleich eine c-DNA-Genbank mit Hilfe der beschriebenen Expressionsvektoren in Hefe hergestellt, so daß der Test unmittelbar danach durchgeführt werden kann.

Beispielsweise wird in einen Hefe-Expressionsvektor die erfindungsgemäße Nukleinsäure in funktioneller Einheit an die Nukleinsäure kodierend für die LexA-DNA-Bindedomäne kloniert, so daß ein Fusionsprotein aus dem erfin­ dungsgemäßen Polypeptid und der LexA-DNA-Bindedomäne in der trans­ formierten Hefe exprimiert wird. In einem anderen Hefe-Expressionsvektor werden c-DNA-Fragmente aus einer c-DNA-Genbank in funktioneller Einheit an die Nukleinsäure kodierend für die Gal4-Transkriptions-Aktivierungsdomä­ ne kloniert, so daß ein Fusionsprotein aus einem unbekannten Polypeptid und der Gal4-Transkriptions-Aktivierungsdomäne in der transformierten Hefe exprimiert wird. Die mit beiden Expressionsvektoren transformierte Hefe, die beispielsweise Leu2^- ist, enthält zusätzlich eine Nukleinsäure, die für Leu2 kodiert, und durch den LexA-Promotor/Operator kontrolliert wird. Im Falle einer funktionellen Interaktion zwischen dem erfindungsgemäßen Polypeptid und dem unbekannten Polypeptid bindet die Gal4-Transkriptions-Aktivierungs­ domäne über die LexA-DNA-Bindedomäne an den LexA-Promotor/Operator, wodurch dieser aktiviert und das Leu2-Gen exprimiert wird. Dies hat zur Folge, daß die Leu2^- Hefe auf Minimalmedium, das kein Leucin enthält, wachsen kann.

Bei Verwendung des lacZ-bzw. "green fluorescense protein"-Reportergens anstelle eines Aminosäure-Biosynthesegens kann die Aktivierung der Trans­ kription dadurch nachgewiesen werden, daß sich blaue bzw. grün-fluoreszie­ rende Kolonien bilden. Die Blau- bzw. Fluoreszenzfärbung läßt sich auch leicht im Spektrophotometer z. B. bei 585 nm im Falle einer Blaufärbung quantifizieren.

Auf diese Weise können Expressionsgenbanken leicht und schnell auf Poly­ peptide durchsucht werden, die mit dem erfindungsgemäßen Polypeptid inter­ agieren. Anschließend können die gefundenen neuen Polypeptide isoliert und weiter charakterisiert werden.

Eine weitere Anwendungsmöglichkeit des "Two-Hybrid Systems" ist die Beeinflussung der Interaktion zwischen dem erfindungsgemäßen Polypeptid und einem bekannten oder unbekannten Polypeptid durch weitere Substanzen, wie z. B. chemische Verbindungen. Auf diese Weise lassen sich auch leicht neue und wertvolle, chemisch synthetisierbare Wirkstoffe auffinden, die als Therapeutikum zur Behandlung einer Herzerkrankung eingesetzt werden können. Die vorliegende Erfindung ist daher nicht nur auf ein Verfahren zum Auffinden von Polypeptid-artigen Interaktoren beschränkt, sondern er­ streckt sich auch auf ein Verfahren zum Auffinden von Substanzen, die mit dem oben beschriebenen Protein-Protein-Komplex interagieren können. Der­ artige Polypeptid-artige, wie auch chemische Interaktoren werden daher im Sinne der vorliegenden Erfindung als funktionelle Interaktoren bezeichnet.

Der überraschende Vorteil der vorliegenden Erfindung ist somit, daß mit Hilfe der erfindungsgemäßen Gegenstände Herzerkrankungen, insbesondere die Herzinsuffizienz, spezifisch und sicher diagnostiziert und therapiert werden können. Es ergeben sich jedoch auch weitere wertvolle therapeutische und diagnostische Möglichkeiten. Beispielsweise sind die mit den beschriebe­ nen Testverfahren leicht aufzuspürenden funktionelle Interaktoren deshalb so vorteilhaft, weil mit deren Hilfe in Form von geeigneten Arzneimitteln die Aktivität des erfindungsgemäßen Polypeptids in seiner natürlichen Umgebung im Herzmuskel und somit auch die Kontraktionsfähigkeit der Herzmuskelzel­ len gezielt beeinflußt werden kann, insbesondere da die Aktivität dieses Polypeptids, wie oben bereits näher beschrieben, reguliert werden kann.

Die nachfolgenden Abbildungen und Beispiele sollen die Erfindung näher erläutern ohne sie zu beschränken.

Beschreibung der Abbildungen

Fig. 1 zeigt eine 1936 Nukleotide-lange herzspezifische DNA-Sequenz. Der Bereich, der für das entsprechende Polypeptid kodiert, ist in Fettdruck dargestellt. Das DNA-Fragment aus Beispiel 1 ist unterstrichen.

Fig. 2 zeigt eine 2080 Nukleotide-lange herzspezifische DNA-Sequenz, die eine Verlängerung am 5'-Ende der DNA-Sequenz aus Fig. 1 aufweist. Der Bereich, der für das entsprechende Polypeptid kodiert, ist wiederum in Fettdruck dargestellt.

Fig. 3 zeigt eine 2268 Nukleotide-lange herzspezifische DNA-Sequenz, die eine Verlängerung am 5'-Ende der DNA-Sequenz aus Fig. 1 bzw. Fig. 2 aufweist. Der Bereich, der für das entsprechende Polypeptid kodiert, ist ebenso in Fettdruck dargestellt.

Fig. 4 zeigt eine 552 Aminosäuren-lange Polypeptid-Sequenz, die von einer der DNA-Sequenzen gemäß Fig. 1-3 kodiert wird. Die zu humanem Tropo­ modulin homologen Bereiche sind in Fettdruck dargestellt. Die Sequenzmoti­ fe, die auf eine Regulation des Polypeptides durch Tyrosinkinase-Signaltrans­ duktionswege hinweisen, sind unterstrichen.

Fig. 5a und 5b zeigen Northern-Blots von mRNAs, die zu den Nukleinsäu­ resequenzen gemäß Fig. 1-3 korrespondieren, zum Nachweis der Expression in verschiedenen menschlichen Geweben (Fig. 5a) und zum Nachweis der Expression in gesundem und insuffizientem menschlichen Herzgewebe (Fig. 5b).

Beispiele 1. Isolierung eines DNA-Fragments aus humanem insuffizientem Herzgewebe

Aus einer gesunden und einer insuffizienten Herzgewebe-Probe wurde zu­ nächst durch Standardmethoden (Chomczynski & Sacchi (1987), Anal. Biochem, 162 (1), 156-159) Gesamt-RNA isoliert. Die RNA wurde dann mit DNAse behandelt, um DNA-Kontaminationen zu entfernen. Ein Aliquot dieser RNA (0,2 µg) wurde dann in einem 20 µl-Reaktionsmix mit 1 × RT- Puffer (Gibco Y00121), 10 mM DTT, 20 µM dNTP-Mix, 1 U/µl RNAsin (Promega N2511), 1 µM 3'-Anker-Primergemisch vom Typ 5'-T₁₂ACN-3' wobei N ein beliebiges desoxy-Nukleotid sein kann und 10 U/µl SuperScript RNAse H^- reverser Transkriptase 60 min bei 37°C inkubiert und somit in cDNA umgeschrieben. Ein cDNA-Aliquot wurde anschließend einer 20 µl- PCR-Reaktion in 1x PCR-Puffer (Perkin-Elmer) unterworfen, die neben 1 µM 3'-Primer T₁₂AC und 1 µM 5'-Dekamer-Primer (5'-CCTTCTACCC-3'), 10 µCi α-P³³-dCTP, 2 µM dNTP-Mix und 1 U AmpliTaq (Perkin Elmer) enthält. Das Gemisch wurde zunächst 1 min bei 94°C, dann 40 Zyklen mit jeweils 30 s 94°C, 2 min 40°C und 30 s 72°C und abschließend 10 min bei 72°C inkubiert. Das entstehende DNA-Fragment-Gemisch wurde dann auf einem 6%igen Polyacrylamid-Gel aufgetrennt und autoradiographiert. Es wird so ein 321 bp großes DNA-Fragment dargestellt, welches nicht in der Gesundherzprobe, jedoch deutlich in der insuffizienten Herzprobe vorhanden ist. Dieses Fragment wurde dann anhand des Röntgenfilmes aus dem Gel ausgeschnitten und mittels PCR unter den bereits beschriebenen Bedingungen reamplifiziert. Das erhaltene Fragment wurde dann in einen entsprechenden Vektor kloniert, und die DNA-Sequenz wurde bestimmt. Ein derartig darge­ stelltes Fragment enthält die Nukleotide 1627-1936 der Sequenz gemäß Anspruch 1 und die 12 Thymin-Nukleotide aus dem 3'-Anker-Primer.

2. Isolierung von herzspezifischen Nukleinsäuren

Mit Hilfe eines α-P³²-dCTP markierten DNA-Fragmentes aus Beispiel 1, das die Nukleotide von Position 1627-1936 nach Fig. 1 umfaßt, wurde eine Plaquehybridisierung mit einer cDNA-Genbank aus Herzgewebe nach Stan­ dardbedingungen durchgeführt (siehe Sambrook, J., Frisch, E. F. & Mania­ tis, T. (1989) Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Kap. 8-10). An­ schließend wurden die gefundenen cDNAs isoliert und sequenziert. Die Sequenzen sind in Fig. 1-3 dargestellt. Hierbei zeigte sich, daß sich die cDNA mit der Sequenz gemäß Fig. 1 mit größerer Wahrscheinlichkeit aus insuffizientem Herzgewebe isolieren ließ als die cDNA mit der Sequenz gemäß Fig. 2 oder 3, welche sich mit größerer Wahrscheinlichkeit aus gesundem Herzgewebe isolieren ließ.

3. Nachweis der Expressionsstärke des herzspezifischen Gens in verschiedenen menschlichen Geweben anhand von Northern Blots.

Das bereits in den Beispielen 1 und 2 und Fig. 1 beschriebene 321 bp große DNA-Fragment wurde zunächst mit α-P³²-dCTP mittels der "random primer labeling"-Methode (Feinberg, A. P. & Vogelstein, B. (1983) Anal. Biochem., 132, 6) radioaktiv markiert. Hierzu wurde das RTS RadPrime DNA Labeling System (GibcoBRL 10387-017) verwendet. Die Hybridisierung von Blots mit poly A⁺-RNA aus menschlichen Geweben (siehe Fig. 5a und 5b) fand nach Herstellerangaben (Multiple Tissue Northern Blots I & II, Clontech Laboratories GmbH, Heidelberg, #7760-1, #7759-1) in ExpressHyb Hybridisierungslösung (Clontech #8015-1) 1 Stunde bei 68°C statt. Die Blots wurden anschließend 30 Minuten mit 2 × SSC und 0,05% SDS und danach 1 Stunde mit 0,1 × SSC und 0,1% SDS gewaschen und autoradio­ graphiert. Es zeigte sich, daß die 321 bp große Sonde mit einer polyA⁺- RNA von ca. 2400 bp stark in Herzgewebe und Skelettmuskel, sehr schwach in Prostatagewebe und nicht in Leukozyten, Dickdarm-, Dünndarm-, Eierstock-, Hoden-, Thymus-, Milz-, Niere-, Leber-, Lunge-, Plazenta- und Gehirngewebe hybridisiert (Fig. 5a).

Weiterhin wurde die Expression der entsprechenden RNAs in gesundem und insuffizientem Herzgewebe untersucht. Hierzu wurde aus verschiedenen menschlichen Herzgewebeproben Gesamt-RNA isoliert (Chomczynski & Sacchi (1987), Anal. Biochem. 162, 156-159). Anschließend wurden jeweils 10 µg RNA mittels eines 1%igen Formaldehyd-Agarose Gels aufgetrennt und im Kapillarverfahren auf eine geladene Nylon-Membran transferiert (Zeta- Probe GT BioRad #162-0197). Die Membran wurde kurz mit 2 × SSC gewaschen und dann bei 80°C 30 Minuten gebacken. Die Membranen wurden mindestens 1 Stunde mit Prähybridisierlösung (0,5 M Na₂HPO₄, pH 7,2; 7% SDS) bei 65°C inkubiert. Anschließend wurde die Lösung gegen eine frische Lösung ausgetauscht und die radioaktive, hitzedenaturierte Sonde hinzugegeben. Die Hybridisierung wurde 15 Stunden bei 65°C durchgeführt. Anschließend wurden die Membranen zunächst 15 Stunden bei 65°C mit 40 mM Na₂HPO₄, pH 7,2; 5% SDS, dann 2 × 30 Minuten bei 65°C mit 40 mM Na₂HPO₄, pH 7,2; 1% SDS gewaschen und anschließend autoradiogra­ phiert. Es zeigte sich, daß in 1%igen Agarose-Gelen verschiedene RNA- Spezien aufgetrennt wurden, die eine Größe von ca. 2200 bis ca. 2400 bp aufwiesen. Diese unterschiedlichen Spezien korrespondieren gut mit den Größen der drei gefundenen cDNAs inklusive eines durchschnittlichen polyA- Schwanzes von 150 bp Länge (siehe Fig. 1-3). Insbesondere die kleinste RNA-Spezie war im erkrankten Gewebe deutlicher nachzuweisen als im gesunden Gewebe. Die Quantifizierung der Blots mittels Phosphoimagers und der ImageQuant Software (Molecular Dynamics GmbH, Krefeld) unter Berücksichtigung einer Kontrollhybridisierung mit ß4-Thymosin und Aktin ergab eine um ungefähr 35% erhöhte Expression der nachgewiesenen RNAs in insuffizientem Herzgewebe im Vergleich zum gesunden Gewebe.

Claims (18)

1. Nukleinsäure kodierend für ein Polypeptid mit einer Aminosäuresequenz gemäß Fig. 4 oder eine funktionelle Variante davon, und Teile davon mit mindestens 8 Nukleotiden, wobei Fig. 4 Bestandteil dieses Anspruchs ist, dadurch gekennzeichnet, daß die Nukleinsäure im insuffizienten Herzgewe­ be stärker exprimiert wird als im gesunden Herzgewebe, ausgenommen ei­ ne Nukleinsäure mit der Sequenz:

2. Nukleinsäure nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Nu­ kleinsäure eine DNA oder RNA, insbesondere eine doppelsträngige DNA ist.

3. Nukleinsäure nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Nukleinsäure eine DNA mit einer Nukleinsäuresequenz gemäß Fig. 1, 2 oder 3 enthält, wobei Fig. 1, 2 und 3 Bestandteil dieses Anspruchs sind.

4. Nukleinsäure nach einem der Ansprüche 1-3, dadurch gekennzeichnet, daß die Nukleinsäure in einem Vektor, vorzugsweise in einem Expres­ sionsvektor oder gentherapeutisch wirksamen Vektor, enthalten ist.

5. Nukleinsäure nach einem der Ansprüche 1-4, dadurch gekennzeichnet, daß der Teil der Nukleinsäure, der für das Polypeptid kodiert, eine oder mehre­ re nicht-kodierende Sequenzen und/oder eine polyA-Sequenz enthält.

6. Verfahren zur Herstellung einer Nukleinsäure nach einem der Ansprüche 1- 5, dadurch gekennzeichnet, daß die Nukleinsäure chemisch synthetisiert oder anhand einer Sonde aus einer Genbank isoliert wird.

7. Polypeptid mit einer Aminosäuresequenz gemäß Fig. 4 oder eine funktio­ nelle Variante davon, und Teile davon mit mindestens 6 Aminosäuren, wo­ bei Fig. 4 Bestandteil dieses Anspruchs ist, dadurch gekennzeichnet, daß die für das Polypeptid kodierende Nukleinsäure im insuffizienten Herzge­ webe stärker exprimiert wird als im gesunden Herzgewebe, ausgenommen ein Polypeptid mit der Sequenz:

8. Verfahren zur Herstellung eines Polypeptids gemäß Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß eine Nukleinsäure gemäß einem der Ansprüche 1-3 in einer geeigneten Wirtszelle exprimiert wird.

9. Antikörper gegen ein Polypeptid mit einer Aminosäuresequenz gemäß Fig. 4 oder eine funktionelle Variante davon, und Teile davon mit mindestens 6 Aminosäuren, wobei Fig. 4 Bestandteil dieses Anspruchs ist.

10. Verfahren zur Herstellung eines Antikörpers gemäß Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß ein Säugetier mit einem Polypeptid mit einer Ami­ nosäuresequenz gemäß Fig. 4 oder eine funktionelle Variante davon, und Teile davon mit mindestens 6 Aminosäuren immunisiert und die entstande­ nen Antikörper isoliert werden, wobei Fig. 4 Bestandteil dieses Anspruchs ist.

11. Arzneimittel enthaltend eine Nukleinsäure kodierend für ein Polypeptid mit einer Aminosäuresequenz gemäß Fig. 4 oder eine funktionelle Variante da­ von, und Teile davon mit mindestens 8 Nukleotiden, oder ein Polypeptid mit einer Aminosäuresequenz gemäß Fig. 4 oder eine funktionelle Variante davon, und Teile davon mit mindestens 6 Aminosäuren, wobei Fig. 4 Be­ standteil dieses Anspruchs ist.

12. Arzneimittel nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß es einen pharmazeutisch annehmbaren Träger aufweist.

13. Verfahren zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung von Herzer­ krankungen, dadurch gekennzeichnet, daß eine Nukleinsäure kodierend für ein Polypeptid mit einer Aminosäuresequenz gemäß Fig. 4 oder eine funk­ tionelle Variante davon, und Teile davon mit mindestens 8 Nukleotiden, oder ein Polypeptid mit einer Aminosäuresequenz gemäß Fig. 4 oder eine funktionelle Variante davon, und Teile davon mit mindestens 6 Aminosäu­ ren mit einem pharmazeutisch annehmbaren Träger formuliert wird, wobei Fig. 4 Bestandteil dieses Anspruchs ist.

14. Diagnostikum enthaltend eine Nukleinsäure kodierend für ein Polypeptid mit einer Aminosäuresequenz gemäß Fig. 4 oder eine funktionelle Variante davon, und Teile davon mit mindestens 8 Nukleotiden, ein Polypeptid mit einer Aminosäuresequenz gemäß Fig. 4 oder eine funktionelle Variante da­ von, und Teile davon mit mindestens 6 Aminosäuren, oder Antikörper ge­ mäß Anspruch 9, wobei Fig. 4 Bestandteil dieses Anspruchs ist.

15. Diagnostikum nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, daß es geeignete Zusatz- oder Hilfsstoffe aufweist.

16. Verfahren zur Herstellung eines Diagnostikums zur Diagnose von Herz­ erkrankungen, dadurch gekennzeichnet, daß eine Nukleinsäure kodierend für ein Polypeptid mit einer Aminosäuresequenz gemäß Fig. 4 oder eine funktionelle Variante davon, und Teile davon mit mindestens 8 Nukleoti­ den, ein Polypeptid mit einer Aminosäuresequenz gemäß Fig. 4 oder eine funktionelle Variante davon, und Teile davon mit mindestens 6 Aminosäu­ ren, oder Antikörper gemäß Anspruch 9 mit einem pharmazeutisch an­ nehmbaren Träger versetzt wird, wobei Fig. 4 Bestandteil dieses An­ spruchs ist.

17. Test zur Identifizierung funktioneller Interaktoren enthaltend eine Nu­ kleinsäure kodierend für ein Polypeptid mit einer Aminosäuresequenz ge­ mäß Fig. 4 oder eine funktionelle Variante davon, und Teile davon mit mindestens 8 Nukleotiden, oder ein Polypeptid mit einer Aminosäurese­ quenz gemäß Fig. 4 oder eine funktionelle Variante davon, und Teile davon mit mindestens 6 Aminosäuren, wobei Fig. 4 Bestandteil dieses Anspruchs ist.

18. Test zur Identifizierung funktioneller Interaktoren nach Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet, daß er geeignete Zusatz- oder Hilfsstoffe aufweist.