WO1997017937A2 - Gentherapeutisches nukleinsäurekonstrukt, seine herstellung und verwendung zur behandlung von herzerkrankungen - Google Patents

Gentherapeutisches nukleinsäurekonstrukt, seine herstellung und verwendung zur behandlung von herzerkrankungen Download PDF

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Definitions

  • the present invention relates to a gene therapeutic nucleic acid construct containing a regulatory nucleic acid sequence from the 5 'end of the myosin light chain 2 gene (MLC-2) of the heart, which is functionally linked to a nucleic acid that is necessary for a therapeutically active gene product antisense nucleic acid or encoded for a ribozyme, as well as a method for its production and the use for gene therapy treatment of heart diseases.
  • MLC-2 myosin light chain 2 gene
  • the clinical picture of cardiomyopathy encompasses a group of cardiac muscle diseases which show up both in contractile and in electrophysiological disorders and ultimately lead to severe heart failure and / or sudden, electrophysiological cardiac death.
  • the search for monogenetic causes in familial forms of dilated and hypertrophic cardiomyopathy is currently the subject of numerous scientific studies. In this way, genetic causes of heart muscle diseases have recently been elucidated at the molecular level. For example, the so-called Duchenne muscular dystrophy (DMD) also causes cardiomyopathy.
  • DMD is an inherited disorder caused by mutations and deletions in the dystrophin gene.
  • the dystrophin gene is on the X chromosome localized and is expressed in healthy people in cardiac muscle cells. It was also found that with chronic congestive heart failure (CHF) the myocardium contains 50% less ß-adrenergic receptor than healthy myocardium.
  • CHF chronic congestive heart failure
  • somatic gene transfer is a promising method for treating genetically caused heart muscle diseases.
  • somatic gene transfer e.g. B. the gene transfer by injection of DNA, the liposome-assisted gene transfer or the gene transfer by means of retroviral, adenoviral or adeno-associated vectors.
  • Essential prerequisites for successful gene therapy are a high transmission rate, stable gene expression and, above all, tissue specificity.
  • WO94 / 11506 shows the successful gene transfer and the successful expression of a gene coding for the ⁇ -galactosidase under the control of the CMV promoter both in smooth muscle cells of the coronary vessels and in cardiac muscle cells.
  • cardiac muscle-specific expression could not be achieved.
  • the description generally refers to the cardiac muscle-specific troponin C (cTNC) promoter, it does not, however, show cardiac-specific in vivo expression.
  • the object of the present invention was therefore to find a nucleic acid construct which has a high transmission rate, a stable gene expression and above all a specificity for cardiac muscle cells for the gene therapy of heart diseases.
  • the present invention therefore relates to a gene-therapeutic nucleic acid construct containing a regulatory nucleic acid sequence from the 5 'end of the myosin light chain 2 gene (MLC-2) of the heart, preferably the heart of a mammal, in particular of humans or of a rodent, especially from the rat, which is functionally linked to a nucleic acid that codes for a therapeutically effective gene product, for an antisense nucleic acid or for a ribozyme.
  • MLC-2 myosin light chain 2 gene
  • a regulatory nucleic acid sequence in the sense of the present invention is generally understood to be the nucleic acid sequence located upstream from the transcription start point (+1) of the MLC-2 gene, which is the transcription of a downstream nucleic acid sequence connected to this sequence at the 3 'end, in particular with regard to the correct transcription start which controls the transcription rate and / or the myocardial tissue specificity, ie the regulatory nucleic acid sequence is functionally linked to the downstream nucleic acid sequence.
  • the sequence from about +18 to -19 to about -800 based on the start of transcription of the MLC-2 gene of the heart is particularly preferred (see Fig.
  • Another preferred embodiment is also a sequence from about +18 to -19 to about -1600 and in particular from about +18 to -19 to about -1800, especially from about +18 to -19 to about -2100 or from about + 18 to -19 to approximately -2700 based on the transcription start point of the MLC-2 gene of the heart (see Fig. 10).
  • the regulatory nucleic acid sequence mainly contains one or more regulatory elements selected from TATA-Box, HF-la, HF-lb, HF-2, HF-3, E-Box, MLE1 and / or CSS sequence, especially selected from TATA-Box, HF-la, HF-lb, HF-2, HF-3, E-Box and / or MLE1.
  • the TATA box is approximately between -198 and -19, the HF-1 element, a conserved 28 base long sequence, approximately between -72 and -45 and in particular the HF-la element approximately between - 57 and -65 and the HF-lb element approximately between -45 and -56, the HF-2 element approximately between -123 and -134, the HF-3 element approximately between -186 and -198, the E-Box element approximately between -72 and -77, the MLE1 element approximately between -165 and -176 and the CSS-like element approximately between -1723 and -1686 related to the transcription start point of the MLC-2 gene (see Fig. 10).
  • the regulatory sequences TATA box, HF-lb element, HF-la element, E-box element, HF-2 element, MLE1 element and HF-3 element are in this order within the first 200 Bases upstream from the gene's transcription start point (see Fig. 10).
  • the nucleic acid construct according to the invention contains the HF-la element, the HF-lb element, the MLE1 element and the HF-3 element, preferably together with the E-Box element, in particular together with the E-Box Element and / or HF-2 element. In any case, it is also preferred if the nucleic acid construct according to the invention additionally contains the heart-specific sequence CSS.
  • a gene therapeutic nucleic acid construct in the sense of this invention is understood to mean a nucleic acid construct with a nucleic acid sequence, which is in particular a DNA or RNA sequence, preferably a single-stranded or double-stranded, especially a double-stranded DNA sequence, the nucleic acid construct being a medicament for gene therapy treatment of heart diseases, in particular for the treatment of heart failure, dilated or hypertrophic cardiomyopathy, dystrophinopathy, vascular diseases, hypertension, arteriosclerosis, stenosis or restenosis of the blood vessels can advantageously be used.
  • the nucleic acid construct according to the invention is preferably combined with a virus vector and / or with liposomes, preferably with an adenovirus vector, especially with a replication-deficient adenovirus vector, or with an adeno-associated virus vector, especially with an adeno-associated virus vector, which consists exclusively of two inverted terminal Repeat sequences (ITR) exist, ligated.
  • a particularly preferred embodiment of the present invention is the genetic engineering connection of the nucleic acid construct according to the invention with an adenovirus vector, especially with a replication-deficient adenovirus vector.
  • An adenovirus vector and particularly a replication-deficient adenovirus vector are particularly preferred for the following reasons:
  • the human adenovirus belongs to the class of double-stranded DNA viruses with a genome of approximately 36 kilobase pairs (Kb).
  • the viral DNA codes for about 2700 different gene products, a distinction being made between early ("late genes”) and late (“late genes”) gene products with regard to the adenoviral replication cycle.
  • the "early genes” are divided into four transcriptional units, E1 to E4.
  • the late gene products code for the capsid proteins.
  • At least 42 different adenoviruses and the AF subgroups can be differentiated immunologically, all of which are suitable for the present invention.
  • the transcription of the viral genes presupposes the expression of the El region, which codes for a transactivator of the adenoviral gene expression.
  • the El gene region is generally replaced by a foreign gene with its own promoter or replaced by the nucleic acid construct according to the invention.
  • the exchange of the El gene region which is a prerequisite for the expression of the downstream adenoviral genes, results in an adenovirus that is not capable of replication. These viruses can then only multiply in a cell line that replaces the missing El genes.
  • Replication-deficient adenoviruses are therefore generally formed by homologous recombination in the so-called 293 cell line (human embryonic kidney cell line), which has a copy of the El region stably integrated in the genome.
  • 293 cell line human embryonic kidney cell line
  • a nucleic acid sequence for example that for a therapeutically active gene product according to the present invention or for a marker, for example ⁇ -galactosidase / ⁇ -Gal
  • the homologous recombination then takes place, for example, between the plasmids pAd.mlc-2 / ß-Gal and an El-deficient adenoviral genome such as, for.
  • viral plaques are harvested.
  • the replication-deficient viruses generated in this way are then used in high titers (for example IO 9 to 10 11 "plaque forming units” or plaque forming units) for infection of the cell culture or for somatic gene therapy.
  • the precise location of insertion of the foreign DNA into the adenoviral genome is not critical. It is Z. B. also possible to clone the foreign DNA in the place of the deleted E3 gene (Karlsson, S. et al. EMBO J. 1986, 5, 2377-2385). However, the El region or parts is preferred of which, e.g. B. the E1A or ElB region (see e.g. WO95 / 00655) replaced by the foreign DNA, especially if the E3 region is also deleted.
  • the present invention is not limited to the adenoviral vector system, but adeno-associated virus vectors are also particularly suitable in combination with the nucleic acid construct according to the invention for the following reasons:
  • the AAV virus belongs to the parvovirus family. These are characterized by an icosahedral, non-encapsulated capsid with a diameter of 18-30 nm, which contains a linear, single-stranded DNA of about 5 kb. A co-infection of the host cell with helper viruses is required for an efficient multiplication of AAV. Suitable aids are, for example, adenoviruses (Ad5 or Ad2), herpes viruses and vaccinia viruses (Muzyczka, N. (1992) Curr. Top. Microbiol. Immunol. 158, 97-129).
  • AAV In the absence of a helper virus, AAV goes into a latency state, whereby the virus genome is able to integrate stably into the host cell genome.
  • the ability of AAV to integrate into the host genome makes it particularly interesting as a transduction vector for mammalian cells.
  • the two approximately 145 bp long inverted terminal repetition sequences (ITR: inverted terminal repeats; generally see W095 / 23867) are sufficient for the vector functions. They carry the signals necessary for replication, packaging and integration into the host cell genome.
  • ITR inverted terminal repeats
  • a cell-free lysate which contains adenoviruses in addition to the recombinant AAV particles.
  • the adenoviruses can advantageously be removed by heating to 56 ° C. or by banding in a cesium chloride gradient. With this cotransfection method, rAAV titers are 10 5 -10 6 IE / ml achievable. Contamination by wild-type viruses is below the detection limit if the packaging plasmid and the vector plasmid have no overlapping sequences (Samulski, RJ (1989) J. Virol. 63, 3822-3828).
  • the transfer of foreign genes into somatic body cells can be carried out by AAV in resting, differentiated cells, which is particularly advantageous for the gene therapy of the heart. Long-term gene expression in vivo can also be ensured by the integration capability mentioned, which in turn is particularly advantageous. Another advantage of AAV is that the virus is not pathogenic to humans and is relatively stable in vivo.
  • the nucleic acid construct according to the invention is cloned into the AAV vector or parts thereof according to methods known to the person skilled in the art, such as, for. B. in W095 / 23867, by Chiorini, J.A. et al. (1995) Human Gene Therapy 6, 1531-1541 or Kotin, R.M. (1994) Human Gene Therapy 5, 793-801.
  • a further advantageous combination in the sense of the present invention is the complexation of the nucleic acid constructs according to the invention with liposomes, since this enables a very high transfection efficiency, in particular of cardiac muscle cells, to be achieved (Feigner, PL et al. (1987) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 84 , 7413-7417).
  • lipofection small unilamellar vesicles are made from cationic lipids by ultrasound treatment of the liposome suspension.
  • the DNA is bound ionically on the surface of the liposomes in such a ratio that a positive net charge remains and the plasmid DNA is 100% complexed by the liposomes.
  • lipid mixtures DOTMA (1,2-dioleyloxypropyl-3-trimethylammonium bromide) and DOPE (dioleoylphosphatidylethanolamine) have meanwhile been synthesized and numerous new lipid formulations have been synthesized and tested for their efficiency in transfecting different cell lines (Behr, JP et al. (1989 ) Proc. Natl. Acad. Sei USA 86, 6982-6986; Feigner, JH et 97/17937 PC17DE96 / 02181
  • Suitable therapeutic gene products are, for example, dystrophin, the ⁇ -adrenergic receptor, nitrogen monoxide synthase or any other gene product that e.g. complements a monogenetic error, prevents or reduces electrophysiological disorders or can mitigate or cure other heart-specific diseases.
  • the gene coding for the therapeutic gene product contains one or more non-coding sequences, including intron sequences, preferably between the promoter and the start codon of the transgene, and / or a polyA sequence, especially on the 3 ' -End of the transgene, for example the endogenous polyA sequence of the respective gene, preferably an SV40 virus polyA sequence, since this can stabilize the mRNA in the heart muscle cell (Jackson, RJ (1993) Cell 74, 9-14 and Palmiter , RD et al. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88, 478-482).
  • the nucleic acid functionally linked to the regulatory nucleic acid of the MLC-2 gene can be not only a nucleic acid which codes for a therapeutically active gene product, but also a nucleic acid which is responsible for an "antisense” nucleic acid, preferably an “antisense” oligonucleotide, in particular an “antisense” DNA oligonucleotide or encoded for a ribozyme.
  • an antisense oligonucleotides and by ribozymes, the expression of genes in the heart can be specifically reduced or can be prevented, whereby a variety of Herz ⁇ specific diseases, such as. B.
  • Another object of the present invention is also a method for producing the nucleic acid construct according to the invention, wherein the regulatory nucleic acid sequence described in more detail above is functionally linked to a nucleic acid which codes for a therapeutically active gene product, for an antisense nucleic acid or for a ribozyme.
  • the regulatory nucleic acid mentioned and the nucleic acid which codes for a therapeutically active gene product, for an antisense nucleic acid or for a ribozyme are cloned either simultaneously or in succession into one of the virus vectors described in more detail above.
  • the method according to the invention is carried out according to genetic engineering methods which are generally known to the person skilled in the art (see, for example, Maniatis et al. (1982) Molecular cloning, A laboratory manual. Cold Spring Harbor Laboratory New York).
  • the protein or nucleic acid sequences of the therapeutically active gene products are available, for example, from the EMBL gene bank or any other publicly accessible gene bank.
  • the sequence of the rat heart MLC-2 gene is from Henderson, SA et al. (1989), known supra and the regulatory nucleic acid sequence of the MLC-2 gene can be found in Fig. 10. Based on these sequences and that described in Henderson, SA et al.
  • Another object of the present invention relates to a method in which the nucleic acid construct according to the invention with liposomes, such as e.g. described in more detail in DE 44 11 402, is complexed.
  • Another object of the present invention is the use of the nucleic acid construct according to the invention for the gene therapy treatment of a heart disease or for the manufacture of a medicament for the gene therapy treatment of a heart disease, the heart disease preferably being heart failure, dilated or hypertrophic cardiomyopathy, dystrophinopathy, vascular diseases, High blood pressure, arteriosclerosis, stenosis and / or restenosis of the blood vessels. It is particularly advantageous if the nucleic acid construct according to the invention acts essentially in the heart chamber (ventricle).
  • Another object of the present invention is therefore also a medicament containing a nucleic acid construct according to the invention and optionally a pharmaceutical carrier, for example a physiological buffer solution, preferably with a pH of approximately 6.0 to approximately 8.0, especially approximately 6.8 to about 7.8, especially about 7.4 and / or an osmolarity of from about 200 to about 400 milliosmols per liter (mosm / L), preferably from about 290 to about 310 mosm / L.
  • the pharmaceutical carrier can also suitable stabilizers, such as. B. nuclease inhibitors, preferably complexing agents such as EDTA and / or other auxiliaries known to those skilled in the art.
  • the application of the nucleic acid constructs according to the invention optionally in combination with the virus vectors or liposomes described above is generally carried out intravenously (iv), for. B. with the help of a catheter.
  • iv intravenously
  • PCGT Percutaneous Coronary Gene Transfer
  • the application of the nucleic acid constructs according to the invention, especially in the form of recombinant adenoviruses with the aid of a balloon catheter such as. B. Feldman et al. (Feldman, LJ et al. (1994) JACC 235A, 906-34), preferred, since in this way the transfection can be limited not only to the heart but also to the injection site within the heart.
  • the nucleic acid construct according to the invention shows a high transmission rate in the gene therapy treatment of heart diseases, is stable and expressible in the transfected cells and, above all, does not lose its specificity for cardiac muscle cells. This is so surprising because, for. B. the smmhc promoter loses its specificity for neonatal and adult smooth muscle cells (see Example 6 below) and a preferred mlc-2 promoter of the nucleic acid construct according to the invention, which does not contain the heart-specific sequence CSS, retains its specificity, in particular in connection with an adenovirus vector.
  • the mlc-2 promoter-controlled expression in cardiomyocytes, in particular in the ventricle is significantly higher than, for example, the mlc-2 promoter-controlled expression in vascular muscle cells, above all that the difference in Expression is about one to about three, especially about three to about six, especially about three to about four powers of ten.
  • the mlc-2 promoter restricted the expression of the luciferase to the heart much more than the C-mhc promoter (see Example 10 below). It is also particularly advantageous that with the nucleic acid construct according to the invention the heart-specific expression after in vivo application is limited to the heart chamber (ventricle) (see Example 11 below), since it is thereby possible, for example, to increase the contraction force of the ventricle.
  • Fig. 1 shows a schematic representation of the constructed plasmids pAd-Luc, pAd-rsvLuc, pAd-mlcLuc and pAd-smmhcLuc.
  • BamHI, Kpnl and Hindlll denote the restriction enzyme interfaces of the corresponding enzymes.
  • Fig. 2 shows the recombinant adenoviruses obtained by homologous recombination, which are derived from the adenovirus del324, the luciferase gene having been cloned into the former El region.
  • Expression of the luciferase gene is either by the smmhc promoter (Ad-smmhcLuc), which is specific for the smooth vascular muscles, the mlc-2v promoter (Ad-mlcLuc) for the heart muscle-specific expression, by the RSV promoter (Ad- rsvLuc) as a positive control or controlled by no promoter (Ad-Luc) as a negative control.
  • Ad-smmhcLuc the mlc-2v promoter
  • Ad-rsvLuc the RSV promoter
  • Fig. 4A-C show schematic representations of the luciferase activities of Ad-Luc, Ad-rsvLuc and Ad-mlcLuc in various primary cell tissues.
  • the thin line on each column represents the mean standard deviation of the experiments.
  • Fig. 5A-C show the schematic representations of the luciferase activity of Ad-Luc, Ad-rsvLuc and Ad-mlcLuc in different tissues after injection of the recombinant adenoviruses into the ventricle of neonatal rats.
  • the thin line on each column represents the mean standard deviation of the experiments.
  • Fig. 6A and B show the histological detection of the ⁇ -galactosidase activity in the myocardium after intracavitary injection of the recombinant adenovirus AD.RSVßgal.
  • Fig. 6A shows a photograph of a histological section through the apex (injection site).
  • Fig. 6B shows the photograph of a histological section through the left ventricle. The bar corresponds to 100 ⁇ m.
  • Fig. 7A-C show the detection of adenoviral DNA in 12 different tissues after intracavitary injection of the recombinant adenoviruses Ad-Luc, Ad-rsvLuc and Ad-mlcLuc.
  • Fig. 7A shows a photograph of a 2.4% agarose gel with the specific 860 bp PCR product, which was generated by amplification of decreasing amounts of Addel324 DNA.
  • 100 ng of rat genomic DNA mixed with Addel324 DNA were used as the sample: lane 1:10 pg; Lane 2: 1 pg; Lane 3: 100 fg; Lane 4: 10 fg; Lane 5: 1 fg; Lane 6; 0.1 fg; Lane 7: no viral DNA.
  • M corresponds to a DNA marker (100 bp ladder).
  • FIG. 7B shows a photograph of a 2.4% agarose gel with the specific 860 bp PCR product, amplified from 100 ng of genomic DNA which is isolated from the specified tissues after intracavitary injection of Ad-Luc, Ad-rsvLuc and Ad-mlcLuc had been.
  • a PCR approach with 100 ng genomic DNA of the rat mixed with 1 pg Addel324 DNA served as a positive control, a approach without Addel324 DNA as a negative control.
  • Fig. 7C shows a Southern blot of the Ad-mlcLuc infected animal according to Fig. 7B.
  • the ⁇ 2 P-labeled 860 bp PCR product from a control batch was used as the probe.
  • Fig. 8A and B show the luciferase activities of the recombinant adenoviruses Ad-o-mhcLuc (Fig. 8A) and Ad-mlcLuc (Fig. 8B) after intracavitary injection into the left main chamber of neonatal rats in different tissues.
  • Fig. 9A-C show the luciferase activities of the recombinant adenoviruses Ad-rsvLuc, Ad-mlcLuc, Ad-O-mhcLuc and Ad-Luc in the atrium (Fig. 9A) and in the ventricle (Fig. 9B).
  • the relationship between the activities in the atrium and in the ventricle is shown in Fig. 9C.
  • the columns show the median of four experiments, the dots representing the results for the respective test animals and the ratio of the luciferase activity in the ventricle to the atrium.
  • 10A-C show the nucleic acid sequence of a 2216 base pair long promoter of the rat MLC-2v gene upstream from the transcription start point (+1).
  • the cloning sequence for the BamHI restriction endonuclease is at position 158-163 and for Kpnl at position 189-194. From position 189-2405 is the 2216 base pair promoter of the MLC-2v gene.
  • the CSS-like sequence is at position 682-724, the HF-3 element at position 2207-2219, the MLE1 element at position 2229-2241, the HF-2 element at position 2271-2289, the E-Box element at position 2328-2333, the HF-la element at position 2340-2348, the HF-lb element at position 2349-2361 and the transcription start (+1) at position 2406.
  • the luciferase coding sequence begins at position 2461.
  • At position 1660-2406 is the 746 base pair long regulatory sequence of the plasmid pAd-mlcLuc (see Example 1).
  • the plasmids pAD-Luc, pAD-rsvLuc, pAd-mlcLuc, pAd-smmhcLuc (Fig. 1) and pAdctmhcLuc are derivatives of the plasmid pAd.RSVßgal (Stradtford-Perricaudet, LD, J. (1992) Clin. Invest.
  • the HindiII / Kpnl fragment of the plasmid pSVOAL which codes for the luciferase gene, was subcloned 5 'into the HindiII / Kpnl cloning interfaces of the vector pBluescriptSK (Stratagene) and the plasmid pBluescript-Luc was thereby generated (Wet, JR et al. (1987) Mol. Cell. Biol. 7, 725-735).
  • the BamHI / Kpnl luciferase fragment of the subclone pBluescript-Luc was then cloned into the BamHI / Kpnl interfaces of the plasmid pAD.RSV-ßgal, and the plasmid pAd-Luc was thereby generated.
  • the BamHI / HindiII RSV fragment (587 bp) of the plasmid pAD.RSV- ⁇ gal was cloned into the BamHI / VietnameseII interfaces of the subclone pBluescript-Luc and the plasmid pBluescript-RSV-Luc was thereby generated.
  • the BamHI / Kpnl RSV-Luciferase fragment of the plasmid pBluescript-RSV-Luc was then cloned into the BamHI / Kpnl interfaces of pAd.RSV-ßgal and the plasmid pAd-rsvLuc was thereby generated.
  • the BamHI / Kpnl mlc-luciferase fragment (746 base pair long "myosin light chain” -2v promoter according to Fig. 10 and 1.8 kb luciferase gene) from the plasmid pMLCIl ⁇ s' was directly into the BamHI / Kpnl interfaces of the plasmid pAd-RSVßgal cloned (Henderson, SA et al. (1989) J. Biol. Chem. 264, 18142-18148).
  • the mlc-2 / luciferase fusion construct was cut out at the restriction enzyme sites Kpnl, the overhanging ends were filled in a so-called "Klenow reaction” and PvuII linkers were ligated at both ends.
  • the 4.0 kb long mlc-2 / luciferase DNA fragment was then inserted into the PvuII site at the 3 'end of the 1.3 m.u. in analogy to the recombinant plasmid pAd.RSVßgal. Region of the adenovirus type 5 (Ad 5) genome coupled.
  • the 1.2 kb BamHI / Hindlll smmhc fragment (rabbit "smooth muscle myosin heavy chain" promoter / -1225 / -4) from the plasmid pRBSMHC-1225ßgal (Kallmeier, RC et al. (1995) J. Biol. Chem. 270, 30949-30957) and cloned in the BamHI / HindIII opened subclone pBluescript-Luc in front of the luciferase gene and the subclone pl.2smmhcBluescript-Luc was thereby constructed.
  • the BamHI / Kpnl smmhc luciferase fragment of this subclone was then cloned into the BamHI / Kpnl sites of the plasmid pAd-RSVßgal and the plasmid pAd-smmhcLuc was generated.
  • the recombinant adenoviruses were generated by standard methods by homologous recombination between the plasmids pAd-Luc, pAd-rsvLuc, pAd-mlcLuc, pAd-smmhcLuc and pAd-ctmhcLuc and the genomic DNA of adenovirus del324 (Ad5) in 293 cells in vivo (Thimmappaya , B. et al. (1982) Cell 31, 543-551 and Stradtford-Perricaudet, LD et al. (1992), supra and Graham, FL et al. (1977) J. Gen. Virol. 36, 59-74 ).
  • the recombinant adenoviruses have a deletion in the E3 region and the transgenes Luc, RSV-Luc, mlcLuc, pAd-smmhcLuc and pAd-O-mhcLuc replace the El region.
  • the day before the transfection 2 ⁇ 10 6 293 cells were plated out in a small cell culture dish.
  • 5 ⁇ g of the large Clal fragment of the genomic DNA from Addel324 were co-transfected into 293 cells together with 5 ⁇ g of the AatII linearized plasmids pAd-Luc, pAd-RSV-Luc, pAd-mlcLuc, pAd-s ⁇ unhcLuc and pAd- ⁇ mhcLuc according to the calcium phosphate method .
  • the positive viral clones were again subjected to a single plaque cleaning before they were propagated in 293 cells for large-scale processing and were purified by means of two cesium chloride density gradient centrifugation (Stradtford-Perricaudet, LD, 1992, supra). Finally the viruses were treated against TD buffer (137 mM NaCl, 5 mM KCl, 0.7 mM Na 2 HP0 4 , 0.5 mM CaCl 2 , 1 mM MgCl 2 , 10% (v / v) glycerol, 25 mM Tris -HCl, pH 7.4) dialyzed and frozen at -72 ° C.
  • TD buffer 137 mM NaCl, 5 mM KCl, 0.7 mM Na 2 HP0 4 , 0.5 mM CaCl 2 , 1 mM MgCl 2 , 10% (v / v) glycerol, 25 mM Tris -HCl, pH 7.
  • the "plaque assay” was carried out using 293 cells. All recombinant adenoviruses had a titer of approximately 10 11 "plaque forming units" (pfu) / ml.
  • the DNA of the viral stock solutions was isolated and examined for the correct integration of the inserts by analysis using restriction endonucleases and PCR. Furthermore, the viral stock solutions were examined by means of PCR on the wild type Ad-5, whereby no contamination was detectable in 50 ng of the adenoviral DNA (Zang, WW et al. (1995) BioTechniques 18, 444-447).
  • the cells were harvested 48 hours after infection.
  • the luciferase activity in protein extracts was then determined according to established protocols using the Lumat LB 9501 transilluminometer (Bertold, Wildbad) (Ausubel, F.M. et al. (1989) Current Protocols in Molecular Biology. Greene and Wiley, New York).
  • the protein concentration of the lysates was determined according to Bradford (1976) (BioRad, Kunststoff). Luciferase activity was converted to pg luciferase per ⁇ g protein (Krougliak, V. & Graham, FL (1995) Hum. Gene Ther. 6, 1575-1586 and Franz, WM et al. (1993) Circ. Res. 73, 629- 638).
  • the rats were decapitated 5 days after injection. Twelve different tissues (intercostal muscle, heart, thymus, lungs, diaphragm, abdominal muscle, liver, stomach, spleen, kidneys, quadriceps femoris, brain) were removed and immediately frozen in liquid nitrogen. The tissue samples were then weighed in 200 ⁇ l lysis buffer (1% (v / v) Triton X-100, 1 mM DTT, 100 mM potassium phosphate pH 7.8) was taken up, digested in a glass homogenizer and centrifuged for 15 minutes at 4 ° C. in a refrigerated centrifuge.
  • lysis buffer 1% (v / v) Triton X-100, 1 mM DTT, 100 mM potassium phosphate pH 7.8
  • luciferase The supernatant was used for the determination of luciferase (Acsadi, G. et al. (1994) Hum. Mol. Gen. 3, 579-584 and Ausubel, FM (1989), supra).
  • the substrates luciferin and ATP were added and the light emission, which is proportional to the luciferase activity, was measured photometrically at 560 nm in a transilluminometer. Luciferase activity was reported in "relative light units" (RLU) / mg wet tissue weight after subtracting the background activity determined for the various tissues in uninfected animals.
  • RLU relative light units
  • the hearts of neonatal rats were frozen in nitrogen-cooled isopentane and stored at -70 ° C.
  • the heart tissue was embedded in 0. CT (Tissue Tek, Miles, USA) freezing medium and 10 ⁇ m tissue sections were made with a cryostat (Frigocut 2800 E, Leica).
  • the genomic DNA was extracted from the sediments of the tissue homogenates of the neonatal rats infected with adenoviruses using the QIAamp tissue kit (from Quiagen, Hilden) according to the manufacturer's instructions. Two of the animals infected with Ad-Luc, Ad-RSV-Luc and Ad-mlcLuc were examined for the tissue distribution of the injected viruses by PCR (polymerase chain reaction) to detect the adenoviral DNA (Zhang, WW (1995) BioTechniques 18, 444- 447).
  • genomic DNA 100 ng was used as a sample together with 40 ng of the oligonucleotides E2B-1 and E2B-2 and 1.25 U Taq polymerase from Promega in a reaction volume of 25 ⁇ l. Gel electrophoresis of the specific PCR product gave an 860 bp band.
  • the sensitivity of the PCR was determined in preliminary tests. For this purpose, 100 ng of genomic DNA from an uninfected rat were mixed with decreasing amounts of Addel324 DNA and used as a sample in a PCR reaction. In order to increase the sensitivity of the detection of the PCR, the PCR products were transferred to a GeneScreenPlus nylon membrane (NEN, Boston, Massachusetts) by capillary blot and then detected by Southern blot hybridization (Ausubel, FM et al. (1989), supra). The adenoviral 860 bp DNA fragment of the positive control amplified by PCR was used as the probe.
  • the PCR product was purified from the gel and radioactively labeled with ⁇ 2 p by "random hexanucleotide prime" and used as a sample for the hybridization. In this way, the sensitivity of the PCR detection could be improved by a factor of 10 to 100.
  • A10- (rat smooth muscle cell line), H9c2- ((rat myoblast cell line) and HeLa- (human Cervical carcinoma cell line) Cells were complemented in "Dulbecco's modified Eagle's medium” (DMEM), 293 cells in MEM, with 10% fetal calf serum (FCS), 100 U / ml penicillin, 0.1 ⁇ g / ml streptomycin and 2 mM L - Cultivated glutamine.
  • DMEM Dulbecco's modified Eagle's medium
  • FCS fetal calf serum
  • lxlO 5 cells from the established cell lines H9c2, AlO and HeLa were plated in triplicate on "12 well" culture dishes.
  • the cells were incubated in 0.2 ml of the respective serum-free medium which contained the recombinant adenoviruses Ad-Luc, Ad-RSVLuc, Ad-mlcLuc and Ad-smmhcLuc in a "multiplicity of infection" (moi) of 10 (10 viruses / Cell). After 1 hour of incubation at 37 ° C. with slight oscillation, 2 ml of the respective completed medium were added every 15 minutes. All infection experiments were repeated 4 times. Three days after the infections, the luciferase activities were measured as described above.
  • moi multiplicity of infection
  • Fig. 3 The results of the experiments are shown schematically in Fig. 3. It can be seen that the luciferase activity of the adenovirus Ad-mlcLuc is lower than the negative control with the promoterless adenovirus Ad-Luc in all cell lines examined.
  • Ad-smmhcLuc shows increased activity in the HeLa cell line and Ad-rsvLuc shows the highest luciferase activity as a positive control in all cell lines examined.
  • Fig. 4 The results of the experiments are shown schematically in Fig. 4. It can be seen that only in neonatal cardiomyocytes is the luciferase activity of the recombinant adenovirus Ad-mlcLuc higher than the negative control with the adenovirus Ad-Luc, but less than the positive control with the adenovirus Ad-rsvLuc, but 300-900 times higher than in smooth ones Vascular muscle cells. It can also be seen that the luciferase activity of Ad-mlcLuc is 129 times higher than that of Ad-smmhcLuc. It follows that the mlc-2 promoter is active in neonatal cardiomyocytes, while the expected activity of the smmhc promoter was absent in neonatal and adult smooth muscle cells.
  • luciferase activity was determined in twelve different tissues (intercostal muscle, heart, thymus, lungs, diaphragm, abdominal muscle, liver, stomach, spleen, kidney, brain and quadriceps femoris).
  • the determined luciferase activity in RLU / mg tissue is summarized in Fig. 5.
  • Adenovirus AD-mlcLuc which carries the myocardium-specific mlc-2v promoter, showed luciferase activity that was restricted to the myocardium (Fig. 5c).
  • Ad-rsvLuc The injection of the positive control Ad-rsvLuc showed the highest luciferase activity in the intercostal muscle, in the heart and a strong luciferase activity in the lungs, thymus and diaphragm (Fig. 5b).
  • Ad-Luc low luciferase activity was measured in the intercostal muscle, heart, thymus and diaphragm (Fig. 5a).
  • the ad-mlcLuc-induced luciferase activity was 17 times higher than that of Ad-Luc, while in all other tissues the luciferase activity of Ad-Luc and Ad-mlcLuc was comparable. This showed that Ad-mlcLuc is specifically active in the heart.
  • the distribution of infected cardiac muscle cells after injection of adenoviruses into the ventricle of neonatal rats was additionally checked in experiments using the injection of the recombinant adenovirus Ad-rsvßgal.
  • the recombinant adenovirus Ad-rsvßgal expresses the ⁇ -galactosidase as a reporter gene under the control of the "Rous Sarcoma Virus" (rsv) promoter.
  • the animal was sectioned five days after the injection and the expression of the ⁇ -galactosidase was determined after staining of the transgene. In the histological sections, infected cells can be recognized by the nucleus turning blue.
  • Ad-mlcLuc The luciferase activity achieved by Ad-mlcLuc was 0.05% of the luciferase activity of Ad-rsvLuc.
  • the genomic DNA from 12 tissues (intercostal muscle, heart, thymus, lung, diaphragm, abdominal muscle, liver, stomach, spleen, kidney, brain, Quadriceps femoris) and the presence of the adenoviral DNA in these tissues was determined by the PCR.
  • adenoviral DNA The sensitivity of the detection of adenoviral DNA was determined in preliminary experiments by mixing 100 ng of genomic DNA from uninfected rats with decreasing amounts of adenoviral DNA Addel324 (from 10 pg to 0.1 fg) and then analyzing them by means of PCR. It was found that 10 fg of the adenoviral DNA Addel324 could still be detected in 100 ng of genomic DNA from uninfected animals. This corresponds to 0.017 adenoviral genomes per cell (Fig. 7A). In animals infected with adenovirus, the viral DNA was regularly detected in the intercostal muscle, heart, thymus, lungs, diaphragm and liver (Fig. 4B).
  • FIG. 4C shows a representative Southern blot for an Ad mlcLuc injected animal.
  • the experiments described show that the gene expression of the recombinant adenovirus Ad-mlcLuc is due to the hermus-specific mlc-2v promoter and not to a locally increased virus concentration.
  • the recombinant adenovirus Ad-mhcLuc is more active in the kidney, spleen, liver, diaphragm, lung and intercostal muscle than Ad-mlcLuc. It follows that the mlc-2 promoter in the adenoviral vector system limits the expression of luciferase to the heart much more than the o-mhc promoter and in addition the mlc-2 promoter is 3-4 times more active in the heart than the otmhc promoter.

Abstract

Bei der Erfindung handelt es sich um ein gentherapeutisches Nukleinsäurekonstrukt enthaltend eine regulatorische Nukleinsäuresequenz vom 5'-Ende des Myosin-Leichte-Ketten-2 Gens (MLC-2) des Herzens, die funktionell mit einer Nukleinsäure verbunden ist, die für ein therapeutisch wirksames Genprodukt, für eine antisense Nukleinsäure oder für ein Ribozym kodiert, sowie um ein Verfahren zu dessen Herstellung und die Verwendung zur gentherapeutischen Behandlung von Herzerkrankungen.

Description

Gentherapeutisches Nukleinsäurekonstrukt, seine Herstellung und Verwendung zur Behandlung von Herzerkrankungen
Die vorliegende Erfindung betrifft ein gentherapeutisches Nukleinsäurekonstrukt enthaltend eine regulatorische Nukleinsauresequenz vom 5'-Ende des Myosin-Leichte-Ketten-2 Gens (MLC-2) des Herzens, die funktionell mit einer Nukleinsäure verbunden ist, die für ein therapeutisch wirksames Genprodukt, für eine antisense Nukleinsäure oder für ein Ribozym kodiert, sowie ein Verfahren zu dessen Herstellung und die Verwendung zur gentherapeutischen Behandlung von Herzerkrankungen.
Das Krankheitsbild der Kardiomyopathie umfaßt eine Gruppe von Herzmuskelerkrankungen, welche sich sowohl in kontraktilen als auch in elektrophysiologischen Störungen zeigen und letztlich zur schweren Herzinsuffizienz und/oder zum plötzlichen, elektrophysiologischen Herztod führen. Die Suche nach monogenetischen Ursachen bei familiären Formen der dilatativen und hypertrophen Kardiomyopathie ist derzeit Gegenstand zahlreicher wissenschaftlicher Untersuchungen. So konnten gerade in jüngster Zeit genetische Ursachen für Herzmuskelerkrankungen auf molekularer Ebene aufgeklärt werden. Beispielsweise verursacht die sogenannte Duchenne Muskeldystrophie (DMD) auch eine Kardiomyopathie. DMD ist eine Erbkrankheit, die durch Mutationen und Deletionen im Dystrophingen verursacht wird. Das Dystrophingen ist auf dem X-Chromosom lokalisiert und wird beim gesunden Menschen u. a. in Herzmuskelzellen exprimiert. Ferner wurde gefunden, daß bei dem chronisch congestiven Herzfehler (CHF) das Myokard 50% weniger an ß-adrenergischem Rezeptor enthält als gesundes Myokard.
Nach der Identifizierung genetischer Defekte oder dem Nachweis einer veränderten Genexpression in erkrankten Herzmuskelgeweben ergibt sich daher die Möglichkeit, die Krankheiten mittels molekularbiologischer Methoden zu heilen. So stellt beispielsweise der somatische Gentransfer eine vielversprechende Methode dar, genetisch bedingte Herzmuskelerkrankungen zu behandeln.
Für den somatischen Gentransfer eignen sich verschiedene Methoden, wie z. B. der Gentransfer durch Injektion von DNA, der Liposomen-unterstützte Gentransfer oder der Gentransfer mittels retroviraler, adenoviraler oder adeno-assoziierter Vektoren. Wesentliche Voraussetzungen für eine erfolgreiche Gentherapie sind eine hohe Übertragungsrate, eine stabile Genexpression und vor allem die Gewebespezifität.
In der WO94/11506 wird der erfolgreiche Gentransfer und die erfolgreiche Expression eines Gens kodierend für die ß- Galaktosidase unter der Kontrolle des CMV-Promotors sowohl in glatten Muskelzellen der Koronargefäße als auch in Herzmuskelzellen gezeigt. Eine Herzmuskel-spezifische Expression konnte jedoch nicht erreicht werden. In der Beschreibung wird zwar allgemein auf den Herzmuskel¬ spezifischen Troponin C (cTNC) Promotor hingewiesen, ohne jedoch eine herzspezifische in vivo Expression zu zeigen.
Aus Franz, W.-M. et al. (1994) Cardioscience, 5, 235-243, No. 4 ist bekannt, daß die Mikroinjektion einer nackten DNA eines Myosin-Leichte-Ketten-2(MLC-2)-Promotor-Luciferase- Fusionsgens in den männlichen Pronukleus von fertilisierten Mausoozyten eine transgene Maus erzeugt, die eine Herzmuskel¬ spezifische Expression des Luciferasegens besitzt. Myosin, eine Hauptkomponente des Herzmuskels und anderer gestreifter Muskeln, besteht aus zwei schweren Ketten (MHC) und zwei Paaren von Myosin-Leichte-Ketten (MLC) . Die MLC teilen sich wiederum in eine nicht-phosphorylierbare (MLC-1) und eine phosphorylierbare (MLC-2) Form. Es wurde nun gefunden, daß die regulatorische Nukleinsauresequenz (Promotor) am 5'-Ende der MLC-2 Gene der Skelettmuskel und der Herzmuskel der Ratte unterschiedlich sind, jedoch der MLC-2 Gene der Herzmuskel der Ratte und des Huhns konserviert sind, obwohl die Ratte und das Huhn evolutionär weit getrennt sind (Henderson, S. A. et al. (1989) J. Biol. Chem., 264, 18142-18148). Lee et al. (Lee, K. J. et al. (1994) Mol. Cell. Biol., 14, 1220-1229, No. 2) fanden nun anhand von transgenen Mäusen, daß eine Kombination von positiven (HF-la und HF-lb) und negativen (E-Box und HF-3) regulatorischen Elementen, die innerhalb von 250 Basenpaaren stromaufwärts vom Transkriptionsstartpunkt liegen, eine Ventrikelkammer- spezifische Expression verursacht, obwohl ein Erhalt der Spezifität bei einer gentherapeutischen in vivo Applikation bis heute nicht gezeigt werden konnte. Franz, W.-M. et al. (1994), supra fanden jedoch ebenso anhand von transgenen Mäusen, daß für die Herzmuskel-spezifische Expression eine weitere regulatorische Sequenz, die sogenannte herzspezifische Sequenz (CSS), ein ca. 1700 Basenpaare stromaufwärts vom Transkriptionsstartpunkt liegendes Repressorelement, notwendig ist. Aus diesen Ergebnissen erkennt man, daß der Mechanismus zur Herz-spezifischen Expression von Genen noch nicht geklärt ist und eine Herz¬ spezifische Expression eines Gens nach in vivo Applikation des Gens noch nicht gefunden wurde.
Aufgabe der vorliegenden Erfindung war daher, ein Nukleinsäurekonstrukt zu finden, das für die Gentherapie von Herzerkrankungen eine hohe Übertragungsrate, eine stabile Genexpression und vor allem eine Spezifität für Herzmuskelzellen besitzt. Ein Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist daher ein gentherapeutisches Nukleinsäurekonstrukt enthaltend eine regulatorische Nukleinsauresequenz vom 5'-Ende des Myosin- Leichte-Ketten-2 Gens (MLC-2) des Herzens, vorzugsweise des Herzens eines Säugetiers, insbesondere vom Menschen oder von einem Nager, vor allem von der Ratte, die funktionell mit einer Nukleinsäure verbunden ist, die für ein therapeutisch wirksames Genprodukt, für eine antisense Nukleinsäure oder für ein Ribozym kodiert.
Als regulatorische Nukleinsauresequenz im Sinne der vorliegenden Erfindung versteht man im allgemeinen die stromaufwärts vom Transkriptionsstartpunkt (+1) des MLC-2 Gens gelegene Nukleinsauresequenz, die die Transkription einer mit dieser Sequenz am 3'-Ende verbundenen, stromabwärts liegenden Nukleinsauresequenz insbesondere bezüglich des korrekten Transkriptionsstartes, der Transkriptionsrate und/oder der Herzmuskel-Gewebespezifität kontrolliert, d.h. die regulatorische Nukleinsauresequenz ist mit der stromabwärts liegenden Nukleinsauresequenz funktionell verbunden. Die Sequenz von ungefähr +18 bis -19 bis ungefähr -800 bezogen auf den Transkriptionsstartpunkt des MLC-2 Gens des Herzens ist besonders bevorzugt (siehe Abb. 10), da es besonders überraschend war, daß ungefähr 800 Basenpaare stromaufwärts vom Transkriptionsstartpunkt ausreichend sind, um bei einer in vivo Applikation eine Herz-spezifische und insbesondere eine Herzkammer-spezifische Expression zu bewirken, obwohl diese Sequenz die sogenannte herzspezifische Sequenz CSS nicht enthält. Eine weitere bevorzugte Ausführungsform ist auch eine Sequenz von ungefähr +18 bis -19 bis ungefähr -1600 und insbesondere von ungefähr +18 bis -19 bis ungefähr -1800, vor allem von ungefähr +18 bis -19 bis ungefähr -2100 oder von ungefähr +18 bis -19 bis ungefähr -2700 bezogen auf den Transkriptionsstartpunkt des MLC-2 Gens des Herzens (siehe Abb. 10). Die regulatorische Nukleinsauresequenz enthält vor allem ein oder mehrere regulatorische Elemente ausgewählt aus TATA-Box, HF-la, HF- lb, HF-2, HF-3, E-Box, MLE1 und/oder CSS-Sequenz, insbesondere ausgewählt aus TATA-Box, HF-la, HF-lb, HF-2, HF- 3, E-Box und/oder MLE1. Beispielsweise liegt bei einer regulatorischen Nukleinsauresequenz der Ratte die TATA-Box ungefähr zwischen -198 und -19, das HF-1 Element, eine konservierte 28 Basen lange Sequenz, ungefähr zwischen -72 und -45 und insbesondere das HF-la Element ungefähr zwischen -57 und -65 und das HF-lb Element ungefähr zwischen -45 und -56, das HF-2 Element ungefähr zwischen -123 und -134, das HF-3 Element ungefähr zwischen -186 und -198, das E-Box Element ungefähr zwischen -72 und -77, das MLE1 Element ungefähr zwischen -165 und -176 und das CSS-ähnliche Element ungefähr zwischen -1723 und -1686 bezogen auf den Transkriptionsstartpunkt des MLC-2 Gens (siehe Abb. 10). Bei dem MLC-2 Gen der Ratte liegen die regulatorischen Sequenzen TATA-Box, HF-lb Element, HF-la Element, E-Box Element, HF-2 Element, MLE1 Element und HF-3 Element in dieser Reihenfolge innerhalb der ersten 200 Basen stromaufwärts vom Transkriptionsstartpunkt des Gens (siehe Abb. 10).
Für die herzspezifische Expression ist es bevorzugt, wenn das erfindungsgemäße Nukleinsäurekonstrukt das HF-la Element, das HF-lb Element, das MLE1 Element und das HF-3 Element, vorzugsweise zusammen mit dem E-Box Element, insbesondere zusammen mit dem E-Box Element und/oder HF-2 Element, enthält. In jedem Fall ist es ebenso bevorzugt, wenn das erfindungsgemäße Nukleinsäurekonstrukt zusätzlich die herzspezifische Sequenz CSS enthält.
Unter einem gentherapeutischen Nukleinsäurekonstrukt im Sinne dieser Erfindung versteht man ein Nukleinsäurekonstrukt mit einer Nukleinsauresequenz, die insbesondere eine DNA- oder RNA-Sequenz, vorzugsweise eine einzelstängige oder doppelsträngige, vor allem eine doppelsträngige DNA-Sequenz ist, wobei das Nukleinsäurekonstrukt als Arzneimittel für die gentherapeutische Behandlung von Herzerkrankungen, insbesondere zur Behandlung von Herzinsuffizienz, dilatative oder hypertrophe Kardiomyopathie, Dystrophinopathie, Gefäßerkrankungen, Bluthochdruck, Arteriosklerose, Stenose oder Restenose der Blutgefäße in vorteilhafterweise verwendet werden kann.
Das erfindungsgemäße Nukleinsäurekonstrukt wird vorzugsweise mit einem Virusvektor und/oder mit Liposomen kombiniert, vorzugsweise mit einem Adenovirusvektor, vor allem mit einem replikationsdefizienten Adenovirusvektor, oder mit einem Adeno-assoziierten Virusvektor, vor allem mit einem Adeno- assoziierten Virusvektor, der ausschließlich aus zwei invertierten terminalen Wiederholungssequenzen (ITR) besteht, ligiert. Eine besonders bevorzugte Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist die gentechnische Verbindung des erfindungsgemäßen Nukleinsäurekonstruktes mit einem Adenovirusvektor, vor allem mit einem replikationsdefizienten Adenovirusvektor.
Ein Adenovirusvektor und insbesondere ein replikationsdefizienter Adenovirusvektor sind aus den folgenden Gründen besonders bevorzugt:
Das humane Adenovirus gehört zu der Klasse der doppelsträngigen DNA-Viren mit einem Genom von ca. 36 Kilobasenpaaren (Kb) . Die virale DNA kodiert für etwa 2700 verschiedene Genprodukte, wobei man frühe ("early genes") und späte ("late genes") Genprodukte in bezug auf den adenoviralen Replikationszyklus unterscheidet. Die "early genes" werden in vier transkriptioneile Einheiten, El bis E4, unterteilt. Die späten Genprodukte kodieren für die Kapsidproteine. Immunologisch können mindestens 42 verschiedene Adenoviren und die Untergruppen A-F unterschieden werden, die alle für die vorliegende Erfindung geeignet sind. Die Transkription der viralen Gene setzt die Expression der El Region voraus, welche für einen Transaktivator der adenoviralen Genexpression kodiert. Diese Abhängigkeit der Expression aller nachfolgenden viralen Gene von dem El-Transaktivator kann für die Konstruktion der nicht replikationsfähigen adenoviralen Vektoren genutzt werden (siehe z. B. McGrory, W. J. et al. (1988) Virol. 163, 614- 617 und Gluzman, Y. et al. (1982) in "Eukaryotic Viral Vectors (Gluzman, Y. ed) 187-192, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, New York). In adenoviralen Vektoren, insbesondere vom Typ 5 (Sequenz siehe Chroboczek, J. et al. (1992) Virol. 186, 280-285) und vor allem von der Untergruppe C, wird im allgemeinen die El-Genregion durch ein Fremdgen mit eigenem Promotor bzw. durch das erfindungsgemäße Nukleinsäurekonstrukt ersetzt. Durch den Austausch der El- Genregion, welche für die Expression der nachgeschalteten adenoviralen Gene Voraussetzung ist, entsteht ein nicht replikationsfähiges Adenovirus. Diese Viren können sich dann nur in einer Zellinie vermehren, welche die fehlenden El Gene ersetzt.
Replikationsdefiziente Adenoviren werden daher im allgemeinen durch homologe Rekombination in der sogenannten 293 Zellinie (humane embryonale Nierenzellinie), die eine Kopie der El Region stabil im Genom integriert hat, gebildet. Hierzu werden unter Kontrolle eines eigenen Promotors (z.B. des mlc- 2 Promotors gemäß der vorliegenden Erfindung) eine Nukleinsauresequenz (z.B. die für ein therapeutisch wirksames Genprodukt gemäß der vorliegenden Erfindung oder für einen Marker, z. B. ß-Galaktosidase/ß-Gal) in rekombinante adenovirale Plasmide kloniert. Anschließend erfolgt die homologe Rekombination beispielsweise zwischen den Plasmiden pAd.mlc-2/ß-Gal und einem El-defizienten adenoviralen Genom wie z. B. dl327 oder del324 (Adenovirus 5) in der Helferzellinie 293. Bei erfolgreicher Rekombination werden virale Plaques geerntet. Die so erzeugten replikationsdefizienten Viren werden dann in hohen Titern (beispielsweise IO9 bis 1011 "plaque forming units" oder Plaque bildende Einheiten) zur Infektion der Zellkultur oder für die somatische Gentherapie eingesetzt.
Im allgemeinen ist die genaue Insertionsstelle der Fremd-DNA in das adenovirale Genom nicht kritisch. Es ist z. B. auch möglich die Fremd-DNA an die Stelle des deletierten E3 Gens zu klonieren (Karlsson, S. et al. EMBO J. 1986, 5, 2377- 2385). Vorzugsweise wird jedoch die El Region oder Teile davon, z. B. die E1A oder ElB Region (siehe z. B. WO95/00655) durch die Fremd-DNA ersetzt, vor allem wenn auch die E3 Region deletiert ist.
Die vorliegende Erfindung ist jedoch nicht auf das adenovirale Vektorsystem beschränkt, sondern auch Adeno- assoziierte Virusvektoren eignen sich in Kombination mit dem erfindungsgemäßen Nukleinsäurekonstrukt aus folgenden Gründen in besonderer Weise:
Das AAV Virus gehört zur Familie der Parvoviren. Diese zeichnen sich durch ein ikosaedrisches, unbehülltes Kapsid mit einem Durchmesser von 18-30 nm aus, welches eine lineare, einzelsträngige DNA von ca. 5 kb enthält. Für eine effiziente Vermehrung von AAV ist eine Koinfektion der Wirtszelle mit Helferviren erforderlich. Als Helfer eignen sich beispielsweise Adenoviren (Ad5 oder Ad2), Herpesviren und Vacciniaviren (Muzyczka, N. (1992) Curr. Top. Microbiol. Immunol. 158, 97-129). In Abwesenheit eines Helfervirus geht AAV in einen Latenzzustand über, wobei das Virusgenom in der Lage ist, stabil in das Wirtszellgenom zu integrieren. Die Eigenschaft von AAV in das Wirtsgenom zu integrieren macht es als Transduktionsvektor für Säugertierzellen besonders interessant. Für die Vektorfunktionen genügen im allgemeinen die beiden ca. 145 bp langen invertierten terminalen Wiederholungsequenzen (ITR: inverted terminal repeats; siehe z. B. W095/23867). Sie tragen die in "eis" notwendigen Signale für Replikation, Verpackung und Integration in das Wirtszellgenom. Zur Verpackung in rekombinante Vektorpartikel wird ein Vektorplasmid, welches die Gene für nicht¬ strukturelle Proteine (rep-Proteine) und für strukturelle Proteine (cap-Proteine) trägt, in Adenovirus-infizierte Zellen transfiziert. Nach einigen Tagen wird ein zellfreies Lysat hergestellt, welches neben den rekombinanten AAV Partikeln auch Adenoviren enthält. Die Adenoviren können vorteilhafterweise durch Erhitzen auf 56°C oder durch Bandieren im Cäsiumchlorid-Gradienten entfernt werden. Mit dieser Cotransfektionsmethode sind rAAV Titer von 105-106 IE/ml erzielbar. Die Kontamination durch Wildtyp Viren liegt unterhalb der Nachweisgrenze, wenn das Verpackungsplasmid und das Vektorplasmid keine überlappenden Sequenzen besitzen (Samulski, R. J. (1989) J. Virol. 63, 3822-3828).
Der Transfer von Fremdgenen in somatische Körperzellen kann durch AAV in ruhende, differenzierte Zellen erfolgen, was für die Gentherapie des Herzens besonders vorteilhaft ist. Durch die erwähnte Integrationsfähigkeit kann auch eine lang anhaltende Genexpression in vivo gewährleistet werden, was wiederum besonders vorteilhaft ist. Ein weiterer Vorteil von AAV ist, daß das Virus nicht pathogen für den Menschen und relativ stabil in vivo ist. Die Klonierung des erfindungsgemäßen Nukleinsäurekonstruktes in den AAV-Vektor oder Teilen davon erfolgt nach dem Fachmann bekannten Methoden, wie sie z. B. in der W095/23867, bei Chiorini, J. A. et al. (1995) Human Gene Therapy 6, 1531-1541 oder Kotin, R. M. (1994) Human Gene Therapy 5, 793-801 beschrieben sind.
Eine weitere vorteilhafte Kombination im Sinne der vorliegenden Erfindung ist die Komplexierung der erfindungsgemäßen Nukleinsäurekonstrukte mit Liposomen, da damit eine sehr hohe Transfektionseffizienz insbesondere von Herzmuskelzellen erreicht werden kann (Feigner, P. L. et al. (1987) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 84, 7413-7417). Bei der Lipofektion werden kleine unilamellare Vesikel aus kationischen Lipiden durch Ultraschallbehandlung der Liposomensuspension hergestellt. Die DNA wird ionisch auf der Oberfläche der Liposomen gebunden und zwar in einem solchen Verhältnis, daß eine positive Nettoladung verbleibt und die Plasmid-DNA zu 100% von den Liposomen komplexiert wird. Neben den von Feigner et al. (1987, supra) eingesetzten Lipidmischungen DOTMA (l,2-Dioleyloxypropyl-3-trimethyl- ammoniumbromid) und DOPE (Dioleoylphosphatidylethanolamin) wurden inzwischen zahlreiche neue Lipidformulierungen synthetisiert und auf ihre Effizienz der Transfektion verschiedener Zellinien getestet (Behr, J. P. et al. (1989) Proc. Natl. Acad. Sei USA 86, 6982-6986; Feigner, J. H. et 97/17937 PC17DE96/02181
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al. (1994) J. Biol. Chem. 269, 2550-2561; Gao, X. & Huang, L. (1991) Biochem. Biophys. Res. Commun. 179, 280-285; Zhou, X. & Huang, L. (1994) Biochim. Biophys. Acta 1189, 195-203). Beispiele der neuen Lipidformulierungen sind DOTAP N-[l-(2,3- Dioleoyloxy)propyl]-N,N,N-trimethylammoniummethyIsulfat oder DOGS (TRANSFECTAM; Dioctadecylamidoglycylspermin) . Ein Beispiel für die Herstellung von DNA-Liposomenkomplexen und deren erfolgreiche Anwendung in der Herz-spezifischen Transfektion ist in der DE 44 11 402 beschrieben.
Als therapeutisches Genprodukt eignen sich beispielsweise Dystrophin, der ß-adrenergische Rezeptor, die Stickstoffmonoxid-Synthase oder jedes andere Genprodukt, das z.B. einen monogenetischen Fehler komplementiert, elektrophysiologische Störungen verhindert bzw. verringert oder andere herzspezifische Krankheiten mildern bzw. heilen kann. Insbesondere ist es von Vorteil, wenn das Gen, das für das therapeutische Genprodukt kodiert (Transgen), ein oder mehrere nicht-kodierende Sequenzen einschließlich Intronsequenzen, vorzugsweise zwischen Promotor und dem Startcodon des Transgens, und/oder eine polyA Sequenz vor allem am 3'-Ende des Transgens, beispielsweise die endogene polyA Sequenz des jeweiligen Gens, vorzugsweise eine SV40 Virus polyA Sequenz, enthält, da hierdurch eine Stabilisierung der mRNA in der Herzmuskelzelle erreicht werden kann (Jackson, R. J. (1993) Cell 74, 9-14 und Palmiter, R. D. et al. (1991) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 88, 478-482) .
Die mit der regulatorischen Nukleinsäure des MLC-2 Gens funktionell verbundene Nukleinsäure kann jedoch nicht nur eine Nukleinsäure, die für ein therapeutisch wirksames Genprodukt kodiert, sein, sondern auch eine Nukleinsäure, die für eine "antisense" Nukleinsäure, vorzugsweise ein "antisense" Oligonukleotid, insbesondere ein "antisense" DNA- Oligonukleotid oder für ein Ribozym kodiert. Sowohl durch "antisense" Oligonukleotide als auch durch Ribozyme kann die Expression von Genen im Herzen spezifisch verringert bzw. verhindert werden, wodurch eine Vielzahl von Herz¬ spezifischen Erkrankungen, wie z. B. die Arteriosklerose oder die Restenose, aber auch Autoimmun- oder Krebserkrankungen behandelt werden können (siehe z. B. Barr, E. & Leiden, J. M. (1994) Trends Cardiovasc. Med. 4, 57-63, No. 2 und Bertrand, E. et al. (1994) Nucleic Acids Res. 22, 293-300).
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist auch ein Verfahren zur Herstellung des erfindungsgemäßen Nukleinsäurekonstruktes, wobei die oben näher beschriebene regulatorische Nukleinsauresequenz funktionell mit einer Nukleinsäure verbunden wird, die für ein therapeutisch wirksames Genprodukt, für eine antisense Nukleinsäure oder für ein Ribozym kodiert. In einer bevorzugten Ausführungsform wird die genannte regulatorische Nukleinsäure und die Nukleinsäure, die für ein therapeutisch wirksames Genprodukt, für eine antisense Nukleinsäure oder für ein Ribozym kodiert, entweder gleichzeitig oder hintereinander in einen der oben näher beschriebenen Virusvektoren kloniert.
Das erfindungsgemäße Verfahren erfolgt nach dem Fachmann allgemein bekannten gentechnischen Methoden (siehe z. B. Maniatis et al. (1982) Molecular cloning, A laboratory manual. Cold Spring Harbor Laboratory New York). Die Protein¬ bzw. Nukleinsäuresequenzen der therapeutisch wirksamen Genprodukte sind beispielsweise über die EMBL Genbank oder jede andere öffentlich zugängliche Genbank erhältlich. Die Sequenz des MLC-2 Gens des Herzens der Ratte ist aus Henderson, S. A. et al. (1989), supra bekannt und die regulatorische Nukleinsauresequenz des MLC-2 Gens kann der Abb. 10 entnommen werden. Ausgehend von diesen Sequenzen und der bei Henderson, S. A. et al. (1989), supra beschriebenen Methode zur Isolierung des MLC-2 Gens einschließlich der regulatorischen Sequenzen aus einer genomischen Genbank lassen sich ohne weiteres auch zu dem Rattengen homologe Sequenzen aus anderen Tieren oder dem Menschen finden. Insbesondere ist es möglich weitere regulatorische Sequenzen des MLC-2 Gens des Herzens in genomischen Genbanken anderer Tiere oder des Menschen ohne unzumutbaren Aufwand zu isolieren, da, wie oben bereits erwähnt, die am 5'-Ende gelegenen regulatorischen Nukleinsäuresequenzen des MLC-2 Gens des Herzens sogar zwischen evolutionär weit entfernter Tierarten, wie z. B. der Ratte und dem Huhn, im wesentlichen konserviert sind (Henderson, S. A. et al. (1989), supra).
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren, bei dem das erfindungsgemäße Nukleinsäurekonstrukt mit Liposomen, wie z.B. in DE 44 11 402 näher beschrieben, komplexiert wird.
Ein anderer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist auch die Verwendung des erfindungsgemäßen Nukleinsäurekonstruktes zur gentherapeutischen Behandlung einer Herzerkrankung bzw. zur Herstellung eines Arzneimittels zur gentherapeutischen Behandlung einer Herzerkrankung, wobei es sich bei der Herzerkrankung vorzugsweise um die Herzinsuffizienz, dilatative oder hypertrophe Kardiomyopathie, Dystrophinopathie, Gefäßerkrankungen, Bluthochdruck, Arteriosklerose, Stenose und/oder Restenose der Blutgefäße handelt. Insbesondere ist es vorteilhaft, wenn das erfindungsgemäße Nukleinsäurekonstrukt im wesentlichen in der Herzkammer (Ventrikel) wirkt.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist daher auch ein Arzneimittel enthaltend ein erfindungsgemäßes Nukleinsäurekonstrukt und gegebenenfalls einen pharmazeutischen Träger, der beispielsweise eine physiologische Pufferlösung, vorzugsweise mit einem pH von ungefähr 6,0 bis ungefähr 8,0, vor allem von ungefähr 6,8 bis ungefähr 7,8, insbesondere ungefähr 7,4 und/oder einer Osmolarität von ungefähr 200 bis ungefähr 400 milliosmols pro Liter (mosm/L), vorzugsweise von ungefähr 290 bis ungefähr 310 mosm/L enhält. Daneben kann der pharmazeutische Träger auch noch geeignete Stabilisatoren, wie z. B. Nukleaseinhibitoren, vorzugsweise Komplexbildner wie EDTA und/oder andere dem Fachmann bekannte Hilfsstoffe enthalten. Die Applikation der erfindungsgemäßen Nukleinsäurekonstrukte gegebenenfalls in Kombination mit den oben beschriebenen Virusvektoren oder Liposomen erfolgt im allgemeinen intravenös (i. v.), z. B. mit Hilfe eines Katheters. Vorteilhaft ist beispielsweise die direkte Infusion des erfindungsgemäßen Nukleinsäurekonstruktes, vor allem in Form rekombinanter Adenoviren, in die Koronararterien des Patienten ("Percutaneous Coronary Gene Transfer", PCGT) . Insbesondere ist die Applikation der erfindungsgemäßen Nukleinsäurekonstrukte, vor allem in Form rekombinanter Adenoviren mit Hilfe eines Ballonkatheters, wie z. B. bei Feldman et al. ( Feldman, L. J. et al. (1994) JACC 235A, 906- 34) beschrieben, bevorzugt, da hierdurch die Transfektion nicht nur auf das Herz, sondern auch innerhalb des Herzens auf die Injektionsstelle begrenzt werden kann.
Die unerwarteten Vorteile der vorliegenden Erfindung liegen darin, daß das erfindungsgemäße Nukleinsäurekonstrukt bei der gentherapeutischen Behandlung von Herzerkrankungen eine hohe Übertragungsrate zeigt, in den transfizierten Zellen stabil und exprimierbar ist und vor allem seine Spezifität für Herzmuskelzellen nicht verliert. Dies ist deshalb so überraschend, weil z. B. der smmhc-Promotor seine Spezifität für neonatale und adulte glatte Muskelzellen verliert (siehe Beispiel 6 unten) und ein bevorzugter mlc-2 Promotor des erfindungsgemäßen Nukleinsäurekonstruktes, der die herzspezifische Sequenz CSS nicht enthält, seine Spezifität insbesondere in Verbindung mit einem Adenovirusvektor behält. Unter Spezifität im Sinne der vorliegenden Erfindung versteht man daher, daß die mlc-2 Promotor-kontrollierte Expression in Kardiomyozyten, insbesondere im Ventrikel, deutlich höher ist als beispielsweise die mlc-2 Promotor-kontrollierte Expression in Gefäßmuskelzellen, vor allem daß der Unterschied in der Expression ungefähr ein bis ungefähr drei, insbesondere ungefähr drei bis ungefähr sechs, vor allem ungefähr drei bis ungefähr vier Zehnerpotenzen beträgt. O 97/17937 PC17DE96/02181
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Es war auch überraschend, daß der mlc-2 Promotor die Expression der Luciferase wesentlich stärker auf das Herz beschränkt als der C-mhc-Promotor (siehe Beispiel 10 unten) . Von besonderem Vorteil ist auch, daß mit dem erfindungsgemäßen Nukleinsäurekonstrukt die herzspezifische Expression nach in vivo Applikation auf die Herzkammer (Ventrikel) beschränkt ist (siehe Beispiel 11 unten), da es hierdurch beispielsweise möglich ist, die Kontraktionskraft des Ventrikels zu steigern.
Die folgenden Abbildungen und Beispiele sollen die Erfindung näher erläutern ohne sie darauf zu beschränken.
Beschreibung der Abbildungen
Abb. 1 zeigt eine schematische Darstellung der konstruierten Plasmide pAd-Luc, pAd-rsvLuc, pAd-mlcLuc und pAd-smmhcLuc. BamHI, Kpnl und Hindlll bezeichnen die Restriktionsenzym¬ schnittstellen der entsprechenden Enzyme. ITR bedeutet "Inverted Terminal Repeat", Ψ die Verpackungssequenz, mlc-2 der "myosin light chain"-2v-Promotor, Luciferase die Luciferase-kodierende Sequenz, Ad 9.4-18 m.u. die adenovirale Sequenz von 9.4 bis 18 "map units" (1 m. u. = 360 bp) von Adenovirus Typ 5 und ori/ampR den "origin of replication" und das Ampicillin-Resistenzgen.
Abb. 2 zeigt die durch homologe Rekombination erhaltenen rekombinanten Adenoviren, die vom Adenovirus del324 abstammen, wobei das Luciferasegen in die ehemalige El Region kloniert wurde. Die Expression des Luciferasegens wird entweder durch den smmhc-Promotor (Ad-smmhcLuc) , der für die glatte Gefäßmuskulatur spezifisch ist, den mlc-2v-Promotor (Ad-mlcLuc) für die Herzmuskel-spezifische Expression, durch den RSV Promotor (Ad-rsvLuc) als Positivkontrolle oder durch keinen Promotor (Ad-Luc) als Negativkontrolle kontrolliert. Die Abkürzungen sind analog Abb. 1. Abb. 3A-C zeigen schematische Darstellungen der Luciferaseaktivitäten von Ad-Luc, Ad-rsvLuc Ad-mlcLuc und Ad- smmhcLuc in verschiedenen Zellinien. Der dünne Strich auf jeder Säule stellt die mittlere Standardabweichung dar.
Abb. 4A-C zeigen schematische Darstellungen der Luciferaseaktivitäten von Ad-Luc, Ad-rsvLuc und Ad-mlcLuc in verschiedenen primären Zellgeweben. Der dünne Strich auf jeder Säule stellt die mittlere Standardabweichung der Experimente dar.
Abb. 5A-C zeigen die schematische Darstellungen der Luciferaseaktivität von Ad-Luc, Ad-rsvLuc und Ad-mlcLuc in verschiedenen Geweben nach Injektion der rekombinanten Adenoviren in die Herzkammer neonataler Ratten. Der dünne Strich auf jeder Säule stellt die mittlere Standardabweichung der Experimente dar.
Abb. 6A und B zeigen den histologischen Nachweis der ß- Galaktosidaseaktivität im Myokard nach intrakavitärer Injektion des rekombinanten Adenovirus AD.RSVßgal. Abb. 6A stellt eine Fotographie eines histologischen Schnittes durch den Apex (Injektionsstelle) dar. Abb. 6B stellt die Fotographie eines histologischen Schnittes durch den linken Ventrikel dar. Der Balken entspricht 100 μm.
Abb. 7A-C zeigen den Nachweis adenoviraler DNA in 12 verschiedenen Geweben nach intrakavitärer Injektion der rekombinanten Adenoviren Ad-Luc, Ad-rsvLuc und Ad-mlcLuc.
Abb. 7A zeigt eine Photographie eines 2,4%igen Agarosegels mit dem spezifischen 860 bp PCR Produkt, das durch Amplifikation von abnehmenden Mengen Addel324 DNA erzeugt wurde. Als Probe wurden 100 ng genomische DNA der Ratte gemicht mit Addel324 DNA eingesetzt: Spur 1: 10 pg; Spur 2: 1 pg; Spur 3: 100 fg; Spur 4: 10 fg; Spur 5: 1 fg; Spur 6; 0,1 fg; Spur 7: keine virale DNA. M entspricht einem DNA-Marker (100 bp Leiter) . Abb. 7B zeigt eine Photographie eines 2,4%igen Agarosegels mit dem spezifischen 860 bp PCR-Produkt, amplifiziert aus 100 ng genomischer DNA, welche aus den angegebenen Geweben nach intrakavitärer Injektion von Ad-Luc, Ad-rsvLuc und Ad-mlcLuc isoliert worden war. Ein PCR Ansatz mit 100 ng genomischer DNA der Ratte gemischt mit 1 pg Addel324 DNA diente als Positivkontrolle, ein Ansatz ohne Addel324 DNA als Negativkontrolle.
Abb. 7C zeigt einen Southern-Blot des Ad-mlcLuc infizierten Tieres gemäß Abb. 7B. Als Sonde wurde das ^2P-markierte 860 bp PCR Produkt aus einem Kontrollansatz verwendet.
Abb. 8A und B zeigen die Luciferaseaktivitäten der rekombinanten Adenoviren Ad-o-mhcLuc (Abb. 8A) und Ad-mlcLuc (Abb. 8B) nach intrakavitärer Injektion in die linke Hauptkammer neonataler Ratten in verschiedenen Geweben.
Abb. 9A-C zeigen die Luciferaseaktivitäten der rekombinanten Adenoviren Ad-rsvLuc, Ad-mlcLuc, Ad-O-mhcLuc und Ad-Luc im Atrium (Abb. 9A) und im Ventrikel (Abb. 9B) . Das Verhältnis der Aktivitäten im Atrium und im Ventrikel zeigt Abb. 9C. Die Säulen zeigen den Mediän von vier Experimenten, wobei die Punkte die Ergebnisse für die jeweiligen Versuchstiere bzw. das Verhältnis der Luciferaseaktivität im Ventrikel zum Vorhof repräsentieren.
Abb. 10A-C zeigen die Nukleinsauresequenz eines 2216 Basenpaar-langen stromaufwärts vom Transkriptionsstartpunkt (+1) gelegenen Promotors des MLC-2v Gens der Ratte. Die Nukleinsäuren von Position 1-156 kodieren für die Verpackungssequenz ψ des Adenovirus Ad5 (Position 300-456). Die Klonierungssequenz für die Restriktionsendonuklease BamHI befindet sich an Position 158-163 und für Kpnl an der Position 189-194. Von Position 189-2405 befindet sich der 2216 Basenpaar-lange Promotor des MLC-2v Gens. Die CSS- ähnliche Sequenz befindet sich an der Position 682-724, das HF-3 Element an der Position 2207-2219, das MLE1 Element an der Position 2229-2241, das HF-2 Element an der Position 2271-2289, das E-Box Element an der Position 2328-2333, das HF-la Element an der Position 2340-2348, das HF-lb Element an der Position 2349-2361 und der Transkriptionsstart (+1) an der Position 2406. Die Luciferase-kodierende Sequenz beginnt bei Position 2461. An der Position 1660-2406 liegt die 746 Basenpaar-lange regulatorische Sequenz des Plasmids pAd- mlcLuc (siehe Beispiel 1).
Beispiele
1. Herstellung der rekombinanten Plasmide pAD-Luc, pAd-rsvLuc, pAd-mlcLuc, pAd-smmhcLuc und pAdc-mhcLuc
Dis Plasmide pAD-Luc, pAD-rsvLuc, pAd-mlcLuc, pAd-smmhcLuc (Abb. 1) und pAdctmhcLuc sind Derivate des Plasmids pAd.RSVßgal (Stradtford-Perricaudet, L. D., J. (1992) Clin. Invest. 90, 626-630), in dem die BamHI-Kpnl RSV-ßgal-Kassette ("Rous Sarcoma Virus"-Promotor und ß-Galaktosidase- Reportergen) gegen die Luciferase cDNA mit ihrem endogenen Polyadenylierungssignal entweder ohne Promotor (pAD-Luc), mit dem RSV-Promotor (pAD-RSV-Luc) , dem mlc-2v-Promotor (pAD- mlcLuc), dem "smooth muscle myosin heavy chain"-Promotor (pAD-smmhcLuc) oder dem "α-myosin heavy chain"-Promotor (pAD- αmhcLuc) ausgetauscht ist. Hierfür wurde das HindiII/Kpnl Fragment des Plasmids pSVOAL, welches für das Luciferasegen kodiert, 5' in die HindiII/Kpnl Klonierungsschnittstellen des Vektors pBluescriptSK (Stratagene) subkloniert und dadurch das Plasmid pBluescript-Luc erzeugt (Wet, J. R. et al. (1987) Mol. Cell. Biol. 7, 725-735). Das BamHI/Kpnl Luciferasefragment des Subklons pBluescript-Luc wurde anschließend in die BamHI/Kpnl Schnittstellen des Plasmids pAD.RSV-ßgal kloniert und dadurch das Plasmid pAd-Luc erzeugt. Für die Klonierung des Plasmids pAD-rsvLuc wurde das BamHI/HindiII RSV-Fragment (587 bp) des Plasmids pAD.RSV-ßgal in die BamHI/HindiII Schnittstellen des Subklons pBluescript- Luc kloniert und dadurch das Plasmid pBluescript-RSV-Luc erzeugt. Anschließend wurde das BamHI/Kpnl RSV-Luciferase- Fragment des Plasmids pBluescript-RSV-Luc in die BamHI/Kpnl Schnittstellen von pAd.RSV-ßgal kloniert und dadurch das Plasmid pAd-rsvLuc erzeugt.
Zur Herstellung des Plasmids pAD-mlcLuc wurde das BamHI/Kpnl mlc-Luciferasefragment (746 Basenpaar-langer "myosin light chain"-2v-Promotor gemäß Abb. 10 und 1.8 kb Luciferasegen) aus dem Plasmid pMLCIlΛs' direkt in die BamHI/Kpnl Schnittstellen des Plasmids pAd-RSVßgal kloniert (Henderson, S. A. et al. (1989) J. Biol. Chem. 264, 18142-18148). Hierzu wurde das mlc-2/Luciferase Fusionskontrukt an den Restriktionsenzymschnittstellen Kpnl herausgeschnitten, die überhängenden Enden in einer sogenannten "Klenow-Reaktion" aufgefüllt und an beiden Enden PvuII-Linker ligiert. Anschließend wurde das 4,0 kb lange mlc-2/Luciferase-DNA Fragment in Analogie zu dem rekombinanten Plasmid pAd.RSVßgal in die PvuII-Schnittstelle am 3'-Ende der 1,3 m.u. Region des Adenovirus Typ 5 (Ad 5) Genoms gekoppelt.
Zur Herstellung des Plasmids pAd-smmhcLuc wurde das 1,2 kb große BamHI/Hindlll smmhc-Fragment (Kaninchen "smooth muscle myosin heavy chain" Promotor/-1225/-4) aus dem Plasmid pRBSMHC-1225ßgal (Kallmeier, R.C. et al. (1995) J. Biol. Chem. 270, 30949-30957) isoliert und in den BamHI/Hindlll geöffneten Subklon pBluescript-Luc vor das Luciferasegen kloniert und dadurch der Subklon pl.2smmhcBluescript-Luc konstruiert. Das BamHI/Kpnl smmhc-Luciferase-Fragment dieses Subklons wurde anschließend in die BamHI/Kpnl Schnittstellen des Plasmids pAd-RSVßgal kloniert und das Plasmid pAd- smmhcLuc erzeugt.
Die Herstellung des Plasmids pAd-αmhcLuc, das den "ct-myosin heavy chain"-Promotor enthält (Subramaniam, A. et al. (1991) J. Biol. Chem., 266, 24613-24620), wurde ein 1064 bp großes BamHI/Hindlll Fragment in die BamHI/Hindlll Schnittstellen des Plasmids pBluescript-Luc kloniert. Anschließend wurde daraus ein BamHI/Kpnl mhc-Luciferase Fragment in die BamHI/Kpnl Schnittstellen des Plasmids pAd.RSV-ßgal kloniert und dadurch das Plasmid pAD-o-mhcLuc erhalten.
2. Herstellung der rekombinanten Adenoviren
Die rekombinanten Adenoviren wurden nach Standardmethoden durch homologe Rekombination zwischen den Plasmiden pAd-Luc, pAd-rsvLuc, pAd-mlcLuc, pAd-smmhcLuc und pAd-ctmhcLuc und der genomischen DNA von Adenovirus del324 (Ad5) in 293-Zellen in vivo erzeugt (Thimmappaya, B. et al. (1982) Cell 31, 543-551 und Stradtford-Perricaudet, L. D. et al. (1992), supra und Graham, F. L. et al. (1977) J. Gen. Virol. 36, 59-74). Die rekombinanten Adenoviren besitzen eine Deletion in der E3 Region und die Transgene Luc, RSV-Luc, mlcLuc, pAd-smmhcLuc und pAd-O-mhcLuc substituieren die El Region. Am Tag vor der Transfektion wurden 2xl06 293-Zellen in eine kleine Zellkulturschale ausplattiert. 5 μg des großen Clal-Fragments der genomischen DNA von Addel324 wurden zusammen mit 5 μg der Aatll linearisierten Plasmide pAd-Luc, pAd-RSV-Luc, pAd- mlcLuc, pAd-sπunhcLuc und pAd-αmhcLuc nach der Kalziumphosphatmethode in 293-Zellen kotransfiziert. Nach Überschichten mit Weichagar (1% SeaPlaque Agarose, lxMEM, 2% FCS, 100 U/ml Penicillin, 0,1 μg/ml Streptomycin, 2 mM L- Glutamin) und 8-10 Tagen Inkubation bei 37 °C und 5% C02 wurden virale Plaques ausgestanzt und auf 293-Zellen klonal vermehrt. Aus 2xl06 vollständig infizierten 293-Zellen wurde die virale DNA der rekombinanten Viren isoliert und durch Hydrolyse mit Restriktionsendonukleasen auf die korrekte Integration des Transgens untersucht. Von den positiven viralen Klonen wurde erneut eine Einzelplaquereinigung durchgeführt bevor sie in 293-Zellen für eine Großaufarbeitung vermehrt und durch zweimalige Caesium- Chlorid-Dichtegradientenzentrifugation gereinigt wurden (Stradtford-Perricaudet, L. D., 1992, supra). Schließlich wurden die Viren gegen TD-Puffer (137 mM NaCl, 5 mM KCl, 0,7 mM Na2HP04, 0,5 mM CaCl2, 1 mM MgCl2, 10% (v/v) Glycerin, 25 mM Tris-HCl, pH 7,4) dialysiert und bei -72°C eingefroren. Zur Bestimmung der Titer der rekombinanten Adenoviren wurde der "Plaque Assay" unter Verwendung von 293-Zellen durchgeführt. Alle rekombinanten Adenoviren hatten einen Titer von etwa 1011 "plaque forming units" (p.f.u.)/ml. Die DNA der viralen Stammlösungen wurde isoliert und durch eine Analyse mittels Restriktionsendonukleasen und PCR auf die korrekte Integration der Inserts untersucht. Ferner wurden die viralen Stammlösungen mittels PCR auf dem Wildtyp Ad-5 untersucht, wobei in 50 ng der adenoviralen DNA keine Kontamination nachweisbar war (Zang, W. W. et al. (1995) BioTechniques 18, 444-447).
3. Luciferase-Bestimmung
Für die in vitro Studien wurden die Zellen 48 Stunden nach der Infektion geerntet. Anschließend wurde die Luciferaseaktivität in Proteinextrakten nach etablierten Protokollen mittels Transilluminometer Lumat LB 9501 (Bertold, Wildbad) bestimmt (Ausubel, F. M. et al. (1989) Current Protocols in Molecular Biology. Greene and Wiley, New York) . Die Proteinkonzentration der Lysate wurde nach Bradford (1976) bestimmt (BioRad, München). Die Luciferaseaktivität wurde in pg Luciferase pro μg Protein umgerechnet (Krougliak, V. & Graham, F. L. (1995) Hum. Gene Ther. 6, 1575-1586 und Franz, W. M. et al. (1993) Circ. Res. 73, 629-638).
Für die in vivo Studien wurden die Ratten 5 Tage nach Injektion dekapitiert. Zwölf verschiedene Gewebe (Interkostalmuskel, Herz, Thymus, Lunge, Diaphragma, Bauchmuskel, Leber, Magen, Milz, Nieren, Quadriceps femoris, Gehirn) wurden entnommen und sofort in flüssigem Stickstoff eingefroren. Anschließend wurden die Gewebeproben gewogen, in 200 μl Lysepuffer (1% (v/v) Triton X-100, 1 mM DTT, 100 mM Kaliumphosphat pH 7,8) aufgenommen, in einem Glashomogenisator aufgeschlossen und für 15 Minuten bei 4°C in einer Kühlzentrifuge zentrifügiert. Der Überstand wurde für die Luciferase-Bestimmung eingesetzt (Acsadi, G. et al. (1994) Hum. Mol. Gen. 3, 579-584 und Ausubel, F. M. (1989), supra) . Hierzu wurden die Substrate Luciferin und ATP hinzugegeben und die Lichtemission, die proportional zu der Luciferaseaktivität ist, bei 560 nm photometrisch in einem Transilluminometer gemessen. Die Luciferaseaktivität wurde in "relative light units" (RLU)/mg Gewebe-Naßgewicht nach Abzug der Hintergrundsaktivität, die für die verschiedenen Gewebe in nicht-infizierten Tieren ermittelt wurde, angegeben.
4. ß-Galaktosidase-Bestimmung
Die Herzen neonataler Ratten wurden in Stickstoff-gekühltem Isopentan eingefroren und bei -70 °C gelagert. Das Herzgewebe wurde in 0. C. T. (Tissue Tek, Miles, USA) Einfriermedium eingebettet und 10 μm Gewebeschnitte mit einem Kryostat (Frigocut 2800 E, Leica) angefertigt. Anschließend wurden die Schnitte 10 Minuten in Lösung A fixiert (PBS, 0,2% (v/v) Glutaraldehyd, 5 mM EDTA, 2 mM MgCl2), 3x10 Minuten mit Lösung B gewaschen (PBS, 0,01% (v/v) Natrium-Desoxycholat, 0,02% (v/v) Nonidet P40, 5 mM EDTA, 2 mM MgCl2) und über Nacht bei 37 °C in Lösung C gefärbt (Lösung B + 1 mg/ml X- Gal, 5 mM K3Fe(CN)6, 5 mM K4Fe(CN)6) . Anschließend wurde einmal mit Lösung B und einmal mit destilliertem Wasser für 10 Minuten gewaschen. Eine schwache Gegenfärbung mit Hämatoxylin und Eosin sowie das Dehydrieren und Einbetten der Proben erfolgte nach Standardprotokollen (Gossler, A. & Zachgo, J. (1993) "Gene and enhancer trap screens in ES cell chimeras" in Joyner, A. L. (ed. ) Gene Targeting, Oxford University Press, 181-225). 5. Nachweis adenoviraler DNA mit Hilfe der PCR-Methode
Parallel zu den Luciferase-Bestimmungen gemäß Beispiel 3 wurde die genomische DNA aus den Sedimenten der Gewebehomogenate der mit Adenoviren infizierten neonatalen Ratten unter Verwendung des QIAamp Tissue Kit (Fa. Quiagen, Hilden) nach Herstellerangaben extrahiert. Jeweils zwei der mit Ad-Luc, Ad-RSV-Luc und Ad-mlcLuc infizierten Tiere wurden auf die Gewebeverteilung der injizierten Viren durch die PCR (Polymerasekettenreaktion) zum Nachweis der adenoviralen DNA untersucht (Zhang, W. W. (1995) BioTechniques 18, 444-447). Hierzu wurden 100 ng genomische DNA als Probe zusammen mit 40 ng der Oligonukleotide E2B-1 und E2B-2 und 1,25 U Taq Polymerase von Promega in einem Reaktionsvolumen von 25 μl eingesetzt. Die Gelelektrophorese des spezifischen PCR Produktes ergab eine 860 bp Bande.
Die Sensitivitat der PCR wurde in Vorversuchen bestimmt. Hierzu wurden 100 ng genomische DNA einer nicht infizierten Ratte mit abnehmenden Mengen Addel324 DNA gemischt und in einer PCR-Reaktion als Probe eingesetzt. Um die Sensitivitat des Nachweises der PCR zu erhöhen, wurden die PCR Produkte auf eine GeneScreenPlus Nylonmembran (NEN, Boston, Massachusetts) durch Kapillarblot transferiert und anschließend durch Southernblot-Hybridisierung nachgewiesen (Ausubel, F. M. et al. (1989), supra). Als Sonde wurde das durch PCR amplifizierte adenovirale 860 bp DNA-Fragment der Positivkontrolle eingesetzt. Das PCR-Produkt wurde aus dem Gel gereinigt und durch "random hexanucleotide prime" mit ^2p radioaktiv markiert und als Probe für die Hybridisierung verwendet. Die Sensitivitat des PCR-Nachweises konnte auf diese Weise um den Faktor 10 bis 100 verbessert werden.
6. Infektion von Zellinien (in vitro)
A10- (glatte Muskel-Zellinie der Ratte), H9c2- ( (Herzmyoblasten-Zellinie der Ratte) und HeLa- (menschliche Zervixkarzinom-Zellinie) Zellen wurden in "Dulbecco's modified Eagle's medium" (DMEM), 293-Zellen in MEM komplementiert, mit 10% fötalem Kälberserum (FCS), 100 U/ml Penicillin, 0,1 μg/ml Streptomycin und 2 mM L-Glutamin kultiviert. Einen Tag vor der Infektion wurden lxlO5 Zellen der etablierten Zellinien H9c2, AlO und HeLa in Triplika auf "12 well" Kulturschalen ausplattiert. Die Zellen wurden in 0,2 ml des jeweiligen serumfreien Mediums, das die rekombinanten Adenoviren Ad-Luc, Ad-RSVLuc, Ad-mlcLuc und Ad- smmhcLuc in einer "multiplicity of infection " (m. o. i.) von 10 enthielt inkubiert (10 Viren/Zelle). Nach 1 Stunde Inkubation bei 37 °C mit leichtem Schwänken wurden alle 15 Minuten 2 ml des jeweiligen komplettierten Mediums zugegeben. Alle Infektionsexperimente wurden 4mal wiederholt. Drei Tage nach den Infektionen wurden die Luciferase-Aktivitäten, wie oben beschrieben, gemessen.
Die Ergebnisse der Experimente sind schematisch in der Abb. 3 dargestellt. Man erkennt, daß bei allen untersuchten Zellinien die Luciferaseaktivität des Adenovirus Ad-mlcLuc geringer ist als die negative Kontrolle mit dem promotorlosen Adenovirus Ad-Luc. Ad-smmhcLuc zeigt in der HeLa-Zellinie eine erhöhte Aktivität und Ad-rsvLuc zeigt als positive Kontrolle in allen untersuchten Zellinien die höchste Luciferaseaktivität.
7. Infektion von primären Zellen in Gewebekultur (in vitro)
Primäre neonatale Rattenkardiomyozyten von 2 bis 3 Tage alten Tieren wurden wie von Sen, A. et al. (1988) J. Biol. Chem. 263, 19132-19136 beschrieben, präpariert und kultiviert. Einen Tag vor der Infektion wurden 2x10^ frisch präparierte neonatale Kardiomyozyten in Triplika auf "12 well" Kulturschalen ausplattiert. Die Zellen wurden in 0,2 ml des jeweiligen serumfreien Mediums, das die rekombinanten Adenoviren Ad-Luc, Ad-RSVLuc, Ad-mlcLuc und Ad-smmhcLuc in einer "multiplicity of infection " (m. o. i.) von 10 enthielt O 97/17937 PC17DE96/02181
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inkubiert (10 Viren/Zelle). Nach 1 Stunde Inkubation bei 37 °C unter leichtem Schwänken wurden alle 15 Minuten 2 ml des jeweiligen komplettierten Mediums zugegeben. Alle Infektionsexperimente wurden 4mal wiederholt. In analoger Weise wurden primäre neonatale und adulte glatte Muskelzellen der Ratte infiziert.
Die Ergebnisse der Experimente sind schematisch in der Abb. 4 dargestellt. Man erkennt, daß nur in neonatalen Kardiomyocyten die Luciferaseaktivität des rekombinanten Adenovirus Ad-mlcLuc höher ist als die negative Kontrolle mit dem Adenovirus Ad-Luc, jedoch geringer als die positive Kontrolle mit dem Adenovirus Ad-rsvLuc, aber 300-900mal höher als in glatten Gefäßmuskelzellen. Man erkennt ferner, daß die Luciferaseaktivität von Ad-mlcLuc 129mal höher ist als die von Ad-smmhcLuc. Daraus folgt, daß der mlc-2 Promotor in neonatalen Kardiomyozyten aktiv ist, während die erwartete Aktivität des smmhc-Promotors in neonatalen und adulten glatten Muskelzellen ausblieb.
8. intracavitäre Injektion rekombinanter Adenoviren in die linke Herzhöhle von neonatalen Ratten
Alle Injektionen wurden an spezifisch pathogenfreien 2-3 Tage alten Spraque Dawley Ratten (CRWiga, Sulzfeld) durchgeführt. Vor den Injektionen wurden die neonatalen Ratten durch 3-5 minütiger Inhalation mit Methoxyfluran (Metofane, Jannssen GmbH) narkotisiert. 2xl09 "plaque forming units" (p.f.u.) der rekombinanten Adenoviren Ad-Luc, Ad-rsvLuc und Ad-mlcLuc wurden in einem Volumen von 20 μl mittels einer Tuberkulinspritze (27,5 gauge) injiziert. Die Injektion erfolgte durch direkte Punktion der Herzkammer durch den Brustkorb lateral im 4. Interkostalraum. Durch Aspiration von Herzblut wurde sichergestellt, daß die Nadelspitze intrakavitär positioniert war. Eine langsame Injektion der Viren (20 μi/min) wurde durch einen Aufsatz für Tuberkulinspritzen erreicht. Die Injektion der rekombinanten Adenoviren in Quadriceps femoris wurde entsprechend durchgeführt.
Fünf Tage nach der Injektion wurde die Luciferaseaktivtät in zwölf verschiedenen Geweben (Interkostalmuskel, Herz, Thymus, Lunge , Diaphragma, Bauchmuskel, Leber, Magen, Milz, Niere, Gehirn und Quadriceps femoris) bestimmt. Die ermittelte Luciferaseaktivität in RLU/mg Gewebe wird in Abb. 5 zusammengefaßt. Adenovirus AD-mlcLuc, der den Herzmuskel¬ spezifischen mlc-2v Promotor trägt, zeigte eine Luciferaseaktivität, die auf den Herzmuskel beschränkt blieb (Abb. 5c). Die Injektion der Positivkontrolle Ad-rsvLuc zeigte die höchste Luciferaseaktivität im Interkostalmuskel, im Herzen und eine starke Luciferaseaktivität in der Lunge, Thymus und Diaphragma (Abb. 5b). Im Ad-Luc injizierten Tier wurde eine geringe Luciferaseaktivität im Interkostalmuskel, Herz, Thymus und Diaphragma gemessen (Abb. 5a). Im Herzen war die Ad-mlcLuc induzierte Luciferaseaktivität 17 mal höher als die von Ad-Luc, während in allen anderen Geweben die Luciferaseaktivität von Ad-Luc und Ad-mlcLuc vergleichbar stark war. Damit wurde gezeigt, daß Ad-mlcLuc spezifisch im Herzen aktiv ist.
Die Verteilung infizierter Herzmuskelzellen nach Injektion von Adenoviren in die Herzkammer neonataler Ratten wurde in Vorexperimenten durch die Injektion des rekombinanten Adenovirus Ad-rsvßgal zusätzlich überprüft. Das rekombinante Adenovirus Ad-rsvßgal exprimiert die ß-Galaktosidase als Reportergen unter Kontrolle des "Rous Sarcoma Virus" (rsv) Promotors. Fünf Tage nach der Injektion erfolgte die Sektion des Tieres und die Expression der ß-Galaktosidase wurde nach Färbung des Transgens bestimmt. In den histologischen Schnitten sind infizierte Zellen durch Blaufärbung des Kerns zu erkennen. Etwa die Hälfte der myokardialen ß- Galaktoseaktivität zeigte sich im Bereich der Einstichstelle in die Herzkammer. Entlang des Kanals der Injektionsnadel fand sich in fast allen Kardiomyozyten ß- Galaktosidaseaktivität (Abb. 6a), wohingegen im restlichen Myokard die Anzahl der infizierten Kardiomyozyten gering war (Abb. 6b).
9. Injektion rekombinanter Adenoviren in die Oberschenkelmuskulatur neonataler Ratten
Um die Aktivität des mlc-2v Promotors im Skelettmuskel zu untersuchen, wurden 20 μl mit 2xl09 "plaque forming units" (p.f.u.) der drei rekombinanten Adenoviren Ad-Luc, Ad-rsvLuc und Ad-mlcLuc in den rechten Oberschenkelmuskel Quadriceps femoris neonataler Ratten injiziert. Fünf Tage nach der Injektion wurde die Luciferaseaktivität bestimmt. Ad-Luc und Ad-mlcLuc zeigten vergleichbar geringe Luciferaseaktivitäten (RLU/mg Gewebe) im injizierten Muskel, während Ad-rsvLuc sehr stark aktiv war (Tab. 1). Die Luciferaseaktivität, erzielt durch Ad-mlcLuc, betrug 0,05% der Luciferaseaktivität von Ad- rsvLuc. Diese Daten zeigen, daß Ad-mlcLuc im Skelettmuskel nicht aktiv ist und bestätigen die Herzmuskel-spezifische Genexpression durch den rekombinanten Adenovirus Ad-mlcLuc.
Ad-Luc Ad-rsvLuc Ad-mlcLuc
RLUxlO~3/mg 3,4+/-l,2 5670+/-3239 2,8+/-l,8
Tab. 1
10. Nachweis adenoviraler DNA in Geweben nach Injektion rekombinanter Adenoviren in die Herzkammer
Um das Ausmaß der Infektion von Nicht-Herzgewebe nach Injektion der rekombinanten Adenoviren in die Herzkammer zu bestimmen, wurde die genomische DNA aus 12 Geweben (Interkostalmuskel, Herz, Thymus, Lunge, Diaphragma, Bauchmuskel, Leber, Magen, Milz, Niere, Gehirn, Quadriceps femoris) isoliert und die Präsenz der adenoviralen DNA in diesen Geweben durch die PCR bestimmt. Es wurden die Gewebe von jeweils zwei mit Ad-Luc, Ad-rsvLuc und Ad-mlcLuc infizierten Tieren untersucht. In Vorexperimenten wurde die Sensitivitat des Nachweises adenoviraler DNA bestimmt, indem 100 ng genomischer DNA von nicht infizierten Ratten mit abnehmenden Mengen adenoviraler DNA Addel324 (von 10 pg bis 0,1 fg) vermischt und anschließend mittels PCR untersucht wurden. Hierbei zeigte sich, daß 10 fg der adenoviralen DNA Addel324 in 100 ng genomischer DNA nicht infizierter Tiere noch nachgewiesen werden konnten. Dies entspricht 0,017 adenoviralen Genomen pro Zelle (Abb. 7A) . In mit Adenovirus infizierten Tieren wurde die virale DNA regelmäßig im Interkostalmuskel, Herz, Thymus, Lunge, Diaphragma und Leber nachgewiesen (Abb. 4B) . Um die Sensitivitat des Nachweises der adenoviralen DNA zu steigern, wurden die PCR-Produkte auf eine Nylon-Membran überführt und durch Southern-Blot- Hybridisierung nachgewiesen. Dies zeigte, daß die adenovirale DNA in geringeren Mengen auch in den anderen Geweben mit geringen Unterschieden zwischen den einzelnen Tieren nachgewiesen werden kann. In Abb. 4C wird ein repräsentativer Southern-Blot für ein Ad-mlcLuc injiziertes Tier gezeigt.
Die beschriebenen Experimente zeigen, daß die Genexpression des rekombinanten Adenovirus Ad-mlcLuc auf den Hermuskel- spezifischen mlc-2v Promotor und nicht auf eine lokal erhöhte Viruskonzentration zurückzuführen ist.
11. Vergleich der spezifischen Aktivität des mlc-Promotors mit dem αmhc-Promotor
Nach intrakavitärer Injektion von ca. 2xl09 "plaque forming units" der rekombinanten Adenoviren Ad-ctπihcLuc (Abb. 8A) und Ad-mlcLuc (Abb. 8B) in die linke Hauptkammer neonataler Ratten konnte für beide Adenoviren die höchste Luciferaseaktivität im Herzen nachgewiesen werden. Jedoch ist der rekombinante Adenovirus Ad-mlcLuc 3-4 mal aktiver im Herzen als Ad-mhcLuc. Zudem ist der rekombinante Adenovirus Ad-mhcLuc in der Niere, der Milz, der Leber, der Diaphragma, der Lunge und dem Intercostalmuskel aktiver als Ad-mlcLuc. Daraus folgt, daß der mlc-2 Promotor im adenoviralen Vektorsystem die Expression der Luciferase wesentlich stärker auf das Herz beschränkt als der o-mhc-Promotor und zusätzlich ist der mlc-2 Promotor im Herzen 3-4mal aktiver als der otmhc- Promotor.
12. Nachweis der Ventrikel-spezifischen Expression
2xl09 "plaque forming units" der rekombinanten Adenoviren Ad- rsvLuc, Ad-mlcLuc, Ad-mhcLuc und Ad-Luc wurden in einem Volumen von 20-40 μl in den linken Ventrikel neonataler Ratten injiziert. Die Gewebe wurden fünf Tage nach der Injektion analysiert. In vier unabhängigen Experimenten konnte gezeigt werden, daß nur für den rekombinanten Adenovirus Ad-mlcLuc eine auf den Ventrikel beschränkte Genexpression gemessen werden kann (Abb. 9). Das Verhältnis der Luciferaseaktivität von Ad-mlcLuc im Ventrikel zum Atrium betrug ca. 30, während es für alle anderen Viren das l-2fache betrug (Abb. 9C) .

Claims

Patentansprüche
1. Gentherapeutisches Nukleinsäurekonstrukt enthaltend eine regulatorische Nukleinsauresequenz vom 5'-Ende des Myosin-Leichte-Ketten-2 Gens (MLC-2) des Herzens, die funktionell mit einer Nukleinsäure verbunden ist, die für ein therapeutisch wirksames Genprodukt, für eine antisense Nukleinsäure oder für ein Ribozym kodiert.
2. Nukleinsäurekonstrukt nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die genannte regulatorische Nukleinsauresequenz vom Herzen eines Säugetiers, insbesondere vom Menschen oder von einem Nager, vor allem von einer Ratte abstammen.
3. Nukleinsäurekonstrukt nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß die genannte regulatorische Nukleinsauresequenz die Nukleinsäuren von den Positionen von ungefähr +18 bis -19 bis ungefähr -800, vor allem von ungefähr +18 bis -19 bis ungefähr -1600 und insbesondere von ungefähr +18 bis -19 bis ungefähr -1800, vor allem von ungefähr +18 bis -19 bis ungefähr -2100 oder von ungefähr +18 bis -19 bis ungefähr -2700 bezogen auf den Transkriptionsstartpunkt des Myosin- Leichte-Ketten-2 Gens (MLC-2) des Herzens umfassen.
4. Nukleinsäurekonstrukt nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß die genannte regulatorische Nukleinsauresequenz das HF-la Element, das HF-lb Element, das MLE1 Element und das HF-3 Element umfassen.
5. Nukleinsäurekonstrukt nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß die genannte regulatorische Nukleinsauresequenz zusätzlich das E-Box Element und/oder das HF-2 Element umfassen.
6. Nukleinsäurekonstrukt nach Anspruch 4 oder 5, dadurch gekennzeichnet, daß die genannte regulatorische Nukleinsauresequenz zusätzlich die CSS Sequenz umfaßt.
7. Nukleinsäurekonstrukt nach einem der Ansprüche 1-6, dadurch gekennzeichnet, daß die Nukleinsauresequenz eine DNA- oder RNA-Sequenz, vorzugsweise eine DNA- Sequenz ist.
8. Nukleinsäurekonstrukt nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß die genannte DNA- oder RNA-Sequenz in einem Virusvektor enthalten ist.
9. Nukleinsäurekonstrukt nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß die genannte DNA-Sequenz in einem Adenovirusvektor oder Adeno-assoziierten Virusvektor, vorzugsweise in einem Adenovirusvektor enthalten ist.
10. Nukleinsäurekonstrukt nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß der genannte Adenovirusvektor ein replikationsdefizienter Adenovirusvektor ist.
11. Nukleinsäurekonstrukt nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß der genannte Adeno-assoziierte Virusvektor ausschließlich aus zwei invertierten terminalen Wiederholungssequenzen (ITR) besteht.
12. Nukleinsäurekonstrukt nach einem der Ansprüche 1-11, dadurch gekennzeichnet, daß das therapeutische Genprodukt ausgewählt ist aus Dystrophin, ß- adrenergischer Rezeptor oder Stickstoffmonoxid- Synthase.
13. Nukleinsäurekonstrukt nach einem der Ansprüche 1-12, dadurch gekennzeichnet, daß die Nukleinsäure, die für ein therapeutisch wirksames Genprodukt kodiert, eine oder mehrere nicht-kodierende Sequenzen und/oder eine polyA Sequenz enthält.
14. Verfahren zur Herstellung eines Nukleinsäurekonstruktes gemäß einem der Ansprüche 1-13, dadurch gekennzeichnet, daß die genannte regulatorische Nukleinsauresequenz funktionell mit einer Nukleinsäure verbunden wird, die für ein therapeutisch wirksames Genprodukt, für eine antisense Nukleinsäure oder für ein Ribozym kodiert.
15. Verfahren gemäß Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, daß die genannte Nukleinsauresequenz zusätzlich in einen Virusvektor gemäß einem der Ansprüche 8-11 kloniert wird und/oder mit Liposomen komplexiert wird.
16. Verwendung eines Nukleinsäurekontruktes gemäß einem der Ansprüche 1-13 zur Herstellung eines Arzneimittels zur gentherapeutischen Behandlung einer Herzerkrankung.
17. Verwendung nach Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei der Herzerkrankung um die Herzinsuffizienz, dilatative oder hypertrophe Kardiomyopathie, Dystrophinopathie, Gefäßerkrankungen, Bluthochdruck, Arteriosklerose, Stenose und/oder Restenose der Blutgefäße handelt.
18. Verwendung nach einem der Ansprüche 16 oder 17, dadurch gekennzeichnet, daß das genannte Arzneimittel im wesentlichen in der Herzkammer wirkt.
19. Arzneimittel enthaltend ein Nukleinsäurekonstrukt gemäß einem der Ansprüche 1-13 und gegebenenfalls einen pharmazeutisch annehmbaren Träger.
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