DE69636055T2

DE69636055T2 - Adenovirale vektoren, die nicht von gruppe c adenovirus typen abgeleitet sind

Info

Publication number: DE69636055T2
Application number: DE69636055T
Authority: DE
Inventors: S. Erik Dobbs Ferry FALCK-PEDERSEN; G. Ronald Potomac CRYSTAL; Andrea New York MASTRANGELI; Karil Abrahamsen
Original assignee: Cornell Research Foundation Inc
Current assignee: Cornell Research Foundation Inc
Priority date: 1995-10-02
Filing date: 1996-09-24
Publication date: 2007-04-12
Anticipated expiration: 2016-09-25
Also published as: US5837511A; ATE323773T1; EP0866873B1; EP0866873A2; JPH11514866A; DE69636055D1; WO1997012986A3; WO1997012986A2; JP2009028040A

Description

Technischer Bereich der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft adenovirale Gentransfervektoren, welche ein in Nicht-Gruppe-C-Adenoviren vorkommendes DNA-Segment, typisch ein Fremdgen zur Expression innerhalb einer Zelle, umfassen. Die vorliegende Erfindung betrifft ferner die therapeutische und diagnostische Verwendung derartiger Vektoren.
Hintergrund der Erfindung
Während des Winters und Frühjahrs 1952/1953 erhielten Rowe und Mitarbeiter am National Institutes of Health (NIH) Adenoiden, die Kleinkindern aus der Gegend von Washington DC chirurgisch entfernt worden waren, und brachten sie in Gewebekultur (Rowe et al., Proc. Soc. Exp. Biol. Med., 84, 570–573 (1953)). Nach Zeiträumen von mehreren Wochen begannen viele der Kulturen progressive Degeneration zu zeigen, charakterisiert durch die Zerstörung epithelialer Zellen. Dieser cytopathische Effekt konnte durch filtrierte Kulturfluide seriell auf etablierte Gewebekulturen humaner Zelllinien übertragen werden. Das cytopathische Agens wurde "Adenoid-degenerierendes" (Ad-)Agens genannt. Schließlich wurde der Name "Adenovirus" für dieses Agens allgemein gebräuchlich. Auf diese anfänglichen Entdeckungen folgte die Entdeckung vieler Prototyp-Stämme von Adenovirus, von denen einige respiratorische Krank heiten verursachten (Rowe et al., supra; Dingle et al., Am. Rev. Respir. Dis., 97, 1–65 (1968); Horwitz "Adenoviridae and Their Replication", in: Fundamental Virology (Fields et al., eds., Raven Press Ltd., New York, NY, 2nd ed., 1991), pp. 771–813).
Alle Adenoviren sind morphologisch und strukturell ähnlich. Diese Viren sind nicht-umhüllte regelmäßige Ikosaeder mit einem Durchmesser von ca. 65 bis 80 nm, bestehend aus einem äußeren Capsid und einem inneren Core. Das Capsid setzt sich zusammen aus 20 Dreiecksflächen oder Facetten mit 12 Scheitelpunkten (Horne et al., J. Mol. Biol., 1, 84–86 (1959)). Die Facetten werden von Hexonen gebildet und die Scheitelpunkte von Pentonen. Von jedem der Scheitelpunkte ragt eine Fiber hervor. Neben den Hexonen, Pentonen und Fibern gibt es acht kleinere Strukturpolypeptide, deren exakte Positionen größtenteils unklar sind.
Das virale Core enthält ein lineares doppelsträngiges DNA-Molekül mit invertierten terminalen Repeats (ITRs), von denen festgestellt wurde, dass ihre Länge von 103 bp bis 163 bp zwischen verschiedenen Isolaten variiert (Garon et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 69, 2391–2394 (1972); Wolfson et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 69, 3054–3057 (1972); Arrand et al., J. Mol. Biol., 128, 577–594 (1973); Steenberg et al., Nucleic Acids Res., 4, 4371–4389 (1977); Tooze, DNA Tumor Viruses (2nd ed., Cold Spring Harbor, New York: Cold Spring Harbor Laboratory, 1981), pp. 943–1054). Die ITRs beherbergen DNA-Replikationsursprünge (Garon et al., supra; Wolfson et al., supra; Arrand et al., supra; Steenberg et al., supra).
Die virale DNA ist mit vier Polypeptiden assoziiert, nämlich Polypeptid V, VII, μ und terminates Polypeptid (TP). Das 55-kD-TP ist über ein dCMP kovalent mit den 5'-Enden der DNA verknüpft (Rekosh et al., Cell, 11, 283–295 (1977); Robinson et al., Virology, 56, 54–69 (1973)). Die anderen drei Polypeptide sind nicht-kovalent an die DNA gebunden und falten diese auf solche Weise, dass sie in das kleine Volumen des Capsids passt. Die DNA scheint in eine zellulären Nucleosomen ähnliche Struktur verpackt zu sein, wie aus Nucleaseverdauungsmustern zu sehen (Corden et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 73, 401–404 (1976); Tate et al., Nucleic Acids Res., 6, 2769–2785 (1979); Mirza et al., Biochim. Biophys. Acta, 696, 76–86 (1982)).
Über die verschiedenen, für die Adenoviren charakteristischen physikalischen Ähnlichkeiten hinaus hat man diese Viren nach gewissen Kriterien untergliedert, welche immunologische Reaktivitäten, Onkogenität und GC-Gehalt des Genoms eines gegebenen Stamms umfassen. Siehe Horwitz, supra S. 777. Beispielsweise hat man über 40 Serotypen und vier Hämagglutinationsgruppen unter humanen Adenovirus-Isolaten identifiziert. Die folgende Tabelle fasst die Klassifikation der humanen Adenoviren zusammen, siehe Horwitzs Übersicht, supra S. 777:
Mindestens was die bis heute am besten untersuchten adenoviralen Serotypen anlangt, nämlich Ad2 und Ad5, die bereits vollständig sequenziert worden sind, ist die Gesamtorganisation des adenoviralen Genoms zwischen Serotypen konserviert, so dass spezifische Funktionen ähnlich positioniert sind. Es sind bereits Teile von anderen Serotypen sequenziert worden, deren Ergebnisse konsistent sind mit der Hypothese einer konservierten genetischen Organisation zwischen den Adenoviren. Dennoch, wie durch die Tabelle widergespiegelt wird, zeigen die Adenoviren eine beträchtliche Diversität auf genetischer Ebene. So zeigen beispielsweise virale Isolate aus den verschiedenen Gruppen von Adenoviren variierende GC-Gehalte in ihren jeweiligen Genomen. Ferner zeigen DNA-DNA-Hybridisierungsstudien, dass weniger als 20% Homologie zwischen der DNA von verschiedenen Gruppen besteht, obgleich verfeinertere Analysen zeigen, dass konservierte Sequenzen in Vergleichen von subgenomischen Segmenten detektiert werden können. So wurde beispielsweise in Untersuchungen von bis zu 30 Karteneinheiten DNA-Länge festgestellt, dass mindestens 20–50% der DNA-Sequenz zwischen Gruppen variieren (Horwitz, supra S. 777). In einer weiteren Studie wurde festgestellt, dass Sequenzen des Replikationsursprungs von Subtypen, die mit jeder der sechs Adenovirusgruppen assoziiert sind, zwar verwandt, aber verschieden sind.
Wichtig, obgleich bisher ungeklärt ist, dass Adenoviren verschiedener Gruppen nicht rekombinieren, wenn eine Co-Infektion des gleichen Wirtes auftritt. Demgegenüber rekombinieren die Adenoviren innerhalb einer Gruppe effizient (Sambrook et al., J. Mol. Biol., 97, 369–390 (1975)). Das Ausbleiben einer Rekombination zwischen Gruppen betont die genetische Varianz der adenoviralen Gruppen.
Die grundlegende Physiologie der adenoviralen Infektion ist überwiegend in Bezug auf Ad2 und Ad5 untersucht worden. Nach diesen Studien beginnt der Prozess der Infektion einer Zelle durch Adenovirus mit Anheftung der Fiber an einen spezifischen Rezeptor auf der Zellmembran (Londberg-Holm et al., J. Virol., 4, 323–338 (1969); Morgan et al., J. Virol., 4, 777–796 (1969); Pastan et al., "Adenovirus entry into cells: some new observations on an old problem", in: Concepts in Viral Pathogenesis, Notkins et al., eds., Springer- Verlag, New York, NY, pp. 141–146 (1987)). Sodann bindet die Pentonbasis an einen zellulären Integrin-Rezeptor. Das rezeptorgebundene Virus wandert dann aus der Plasmamembran zu "Clathrin-Coated-Pits", die endocytische Vesikel oder Rezeptosome bilden, wo der pH-Wert auf 5,5 sinkt. Man glaubt, dass die Absenkung des pH-Wertes die Oberflächenkonfiguration des Virus verändert, resultierend in einer Rezeptosomenruptur und Virusfreisetzung in das Cytoplasma der Zelle.
Wenn das Virus die Kernporen erreicht, tritt die virale DNA in den Kern ein, wobei der größte Teil des restlichen Proteins im Cytoplasma zurückbleibt (Philipson et al., J. Virol., 2, 1064–1075 (1968)). Die virale DNA ist jedoch nicht vollständig proteinfrei, insofern als mindestens ein Teil der viralen DNA mit mindestens vier viralen Polypeptiden assoziiert ist, nämlich V, VII, TP und μ, und wird in einen Komplex von viraler DNA und zellulärem Histon umgewandelt (Tate et al., Nucleic Acids Res., 6, 2769–2785 (1979)).
Der Zyklus von der Zellinfektion bis zur Produktion von viralen Partikeln dauert ein bis zwei Tage und resultiert in der Produktion von bis zu ca. 10 000 infektiösen Partikeln pro Zelle (Green et al., Virology, 13, 169–176 (1961)). Der Infektionsprozess von Adenovirus ist in eine frühe (E) und eine späte (L) Phase unterteilt, die durch eine virale DNA-Replikation getrennt sind, obschon einige Ereignisse, die während der frühen Phase stattfinden, auch während der späten Phase stattfinden und umgekehrt. Weitere Unterteilungen der adenoviralen genetischen Regionen sind vorgenommen worden, um die zeitliche Expression von viralen Genen vollständig zu beschreiben.
Während der frühen Phase wird virale Messenger-RNA ("mRNA"), die einen kleineren Anteil der in der Zelle vorliegenden Gesamt-RNA ausmacht, von beiden Strängen der in dem Zellkern vorliegenden adenoviralen DNA synthetisiert. Mindestens fünf Regionen, mit der Bezeichnung E1, E2, E3, E4 und MLP-L1, werden transkribiert (Lewis et al., Cell, 7, 141–151 (1976); Sharp et al., Virology, 75, 442–456 (1976); Sharp "Adenovirus transcription", in: The Adenoviruses, Ginsberg, ed., Plenum Press, New York, NY, pp. 173–204 (1984)). Jede Region hat mindestens einen distinkten Promotor und wird prozessiert, um multiple mRNA-Species herzustellen.
Die Produkte der frühen (E-)Regionen dienen (1) regulatorischen Funktionen für die Expression anderer viraler Komponenten, sind (2) in der generellen Abschaltung der zellulären DNA-Replikation und Protein-Synthese involviert und werden (3) für die virale DNA-Replikation benötigt. Die komplizierte Serie von Ereignissen, welche die frühe mRNA-Transkription regulieren, beginnt mit der Expression gewisser "Immediate-Early"-Regionen, zu denen E1A, L1 und das 13,5-kD-Gen zählen (Übersicht in Sharp (1984), supra; Horwitz , supra). Die Expression der "Delayed-Early"-Regionen E1B, E2A, E2B, E3 und E4 ist von den Produkten der E1A-Gene abhängig. Drei Promotoren, der E2-Promotor bei Karteneinheit ("mu") 72, der Protein-IX-Promotor und der IVa-Promotor, werden durch das Einsetzen der DNA-Replikation verstärkt, sind aber nicht von ihr abhängig (Wilson et al., Virology, 94, 175–184 (1979)). Ihre Expression charakterisiert eine Zwischenphase der viralen Genexpression. Das Resultat der Expressionskaskade der frühen Gene ist der Start der viralen DNA-Replikation.
Die adenovirale DNA-Replikation verdrängt einen parentalen Einzelstrang durch kontinuierliche Synthese in 5'-nach-3'-Richtung ausgehend von Replikationsursprüngen an beiden Enden des Genoms (Übersicht in Kelly et al., "Initiation of viral DNA replication", in Advances in Virus Research, Maramorosch et al., eds., Academic Press, Inc., San Diego, CA, 34, 1–42 (1988); Horwitz et al., in Virology, Raven Press, New York, 2, 1679–1721 (1990); van der Vliet, "Adenovirus DNA replication in vitro", in The Eukaryotic Nucleus, Strauss et al., eds., Telford Press, Cadwell, NJ, 1, 1–29 (1990)). Drei virale Proteine, die von E2 codiert werden, sind essentiell für die adenovirale DNA-Synthese: (1) das einsträngige DNA-Bindeprotein (DBP), (2) die adenovirale DNA-Polymerase (Ad pol) und (3) das präterminale Protein (pTP). Zusätzlich zu diesen essentiellen Proteinen haben in vitro-Experimente zahlreiche Wirtszellenfaktoren identifiziert, die für die DNA-Synthese benötigt werden.
Die DNA-Synthese wird initiiert durch die kovalente Anheftung eines dCMP-Moleküls an einen Serinrest von pTP. Der pTP-dCMP-Komplex fungiert dann als Primer für Ad pol, um die Elongation zu ermöglichen. Der verdrängte parentale Einzelstrang kann eine Pfannenstiel-Struktur bilden durch Basenpaarung der invertierten terminalen Repeats. Diese terminale Duplex-Struktur ist identisch zu den Enden des parentalen Genoms und kann als Origin für die Initiation der Synthese des komplementären Strangs dienen. Die Initiation der viralen DNA-Replikation scheint essentiell für den Eintritt in die späte Phase zu sein. Die späte Phase der viralen Infektion ist charakterisiert durch die Produktion großer Mengen der viralen Strukturpolypeptide und der Nichtstrukturproteine, die in den Zusammenbau ("Assembly") des Capsids involviert sind. Der "Major-Late"-Promotor (MLP) wird voll aktiv und produziert Transkripte, die bei 16,5 mu beginnen und in der Nähe des Endes des Genoms enden. Die posttranskriptionale Prozessierung dieses langen Transkripts verursacht die Entstehung von fünf späten mRNA-Familien mit der Bezeichnung L1 bis L5 (Shaw et al., Cell, 22, 905–916 (1980)). Die Mechanismen, die die Umschaltung von der frühen zur späten Phase kontrollieren und in einer derartigen dramatischen Umschaltung in der transkriptionalen Nutzung resultieren, sind unklar. Für die DNA-Replikation kann eine cis-Eigenschaft des DNA-Template nötig sein, weil späte Transkription aus einem superinfizierenden Virus nicht zu einer Zeit auftritt, in der die späte Transkription des ersten infizierenden Virus aktiv ist (Thomas et al., Cell, 22, 523–533 (1980)).
Der Zusammenbau des Virions ist ein komplizierter Vorgang beginnend mit dem ersten Schritt des Zusammenbaus größerer Struktureinheiten von einzelnen Polypeptidketten (Übersicht in Philipson, "Adenovirus Assembly", in: The Adenoviruses, Ginsberg, ed., Plenum Press, New York, NY (1984), pp. 309–337; Horwitz, supra). Hexon, Pentonbasis und Fiber fügen sich nach der Synthese im Cytoplasma zu trimeren homopolymeren Formen zusammen. Das 100 kD-Protein scheint als "Scaffolding"-Protein für die Hexon-Trimerisierung zu fungieren, und das resultierende Hexon-Trimer erhält die Bezeichnung Hexon-Capsomer. Die Hexon-Capsomere können sich in einem als "Self-Assembly" bezeichneten Prozess zusammenfügen, um die Schale eines leeren Capsids zu bilden, und das Pentonbasis- und Fibertrimer können kombinieren, um das Penton zu bilden, wenn die Komponenten im Inneren des Kerns sind. Die Facette des Ikosaeders besteht aus drei Hexon-Capsomeren, was durch Dissoziation des Capsids zu ersehen ist; der Zwischenschritt der Bildung einer Hexon-Neunergruppe ist jedoch noch nicht beobachtet worden. Verschiedene "Assembly"-Intermediate haben sich aus Experimenten mit temperatursensiblen Mutanten ergeben. Der Fortschritt des Capsid-Zusammenbaus scheint abhängig von "Scaffolding"-Proteinen, 50 kD und 30 kD. Die nackte DNA gelangt höchstwahrscheinlich durch eine Öffnung an einem der Scheitelpunkte in das Innere des nahezu komplettierten Capsids. Der letzte Schritt des Vorgangs beinhaltet das proteolytische Trimmen der Vorläufer-Polypeptide pVI, pVII, pVIII und pTP, was die Capsid-Struktur stabilisiert, die DNA unempfindlich gegen Nuclease-Behandlung macht und ein reifes Virion liefert.
Gewisse rekombinante adenovirale Vektoren haben in der Gentherapie Verwendung gefunden, nämlich Ad2 und Ad5, die beide der Gruppe C zugeordnet sind. Die Verwendung eines rekombinanten adenoviralen Vektors zum Transfer eines oder mehrerer rekombinanter Gene ermöglicht das zielgesteuerte Delivery des Gens oder der Gene in ein Organ, Gewebe oder Zellen, die der Behandlung bedürfen, um so das bei den meisten Formen der somatischen Gentherapie anzutreffende Delivery-Problem zu überwinden. Ferner verlangen rekombinante adenovirale Vektoren keine Wirtszellenproliferation für die Expression von adenoviralen Proteinen (Horwitz et al., supra; Berkner, BioTechniques, 6, 616 (1988)). Überdies, wenn es sich bei dem erkrankten, behandlungsbedürftigen Organ um die Lunge handelt, bietet die Verwendung von Adenovirus als Vektor genetischer Information den zusätzlichen Vorteil, dass Adenovirus einen normalen Tropismus für das respiratorische Epithel besitzt (Straus, in: Adenoviruses, Plenum Press, New York, pp. 451–496 (1984)).
Weitere Vorteile von Adenoviren als Vektoren für die humane Gentherapie umfassen: (i) Rekombination ist selten; (ii) es gibt keine bekannten Assoziationen von malignen Erkrankungen beim Menschen mit adenoviralen Infektionen, trotz dem adenovirale Infektionen beim Menschen weit verbreitet sind; (iii) das adenovirale Genom (bei dem es sich um lineare doppelsträngige DNA handelt) kann allgemein so manipuliert werden, dass es Fremdgene bis zu einer Größe von 7,0 bis 7,5 kb Länge aufnehmen kann; (iv) ein adenoviraler Vektor inseriert seine DNA nicht in das Chromosom einer Zelle, so dass seine Wirkung nicht permanent ist und es unwahrscheinlich ist, dass er mit der normalen Funktion der Zelle interferiert; (v) das Adenovirus kann nicht-teilende oder terminal differenzierte Zellen infizieren, z.B. Zellen des Gehirns und der Lunge; und (vi) lebendes Adenovirus, das als essentielle Charakteristik die Fähigkeit zur Replikation aufweist, wird als Humanvakzin bereits sicher verwendet (Horwitz et al., supra; Berkner et al., J. Virol., 61, 1213–1220 (1987); Straus supra; Chanock et al., JAMA, 195, 151 (1966); Haj-Ahmad et al., J. Virol., 57, 267 (1986); Ballay et al., EMBO, 4, 3861 (1985)).
Fremdgene sind in zwei Hauptregionen des Gruppe-C-Adenovirusgenoms zur Verwendung als Expressionsvektoren inseriert worden, nämlich in die Regionen E1 und E3, um so ein einfach defizientes Adenovirus und hiervon abgeleitete Vektoren bereitzustellen. Insertion in die E1-Region resultiert in defektiver Nachkommenschaft, die entweder ein Wachstum in komplementären Zellen oder die Gegenwart eines intakten Helfervirus benötigt; beides dient dazu, die Funktion der beeinträchtigten oder fehlenden E1-Region zu ersetzen (Berkner et al., supra; Davidson et al., J. Virol., 61, 1226–1239 (1987); Mansour et al., Mol. Cell. Biol., 6, 2684–2694 (1986)). Allgemein gibt es nur ein paar existierende Zelllinien, die essentielle Funktionen, welche einem einfach defizienten Adenovirus fehlen, komplementieren. Beispiele für solche Zelllinien umfassen die als HEK-293 bekannten menschlichen embryonalen Nierenzellen (Graham et al., Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol., 39, 637–650 (1975)), W162 (Weinberg et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 80, 5383–5386 (1983)) und gMDBP (Klessig et al., Mol. Cell. Biol., 4, 1354–1362 (1984); Brough et al., Virology, 190, 624–634 (1992)).
Die E1-Region des Genoms ist bisher am häufigsten für die Expression von Fremdnucleinsäure verwendet worden. In die E1-Region inserierte Gene hat man unter die Kontrolle von verschiedenen Promotoren gestellt, und die meisten produzieren große Mengen des Fremdgenprodukts in Abhängigkeit von der Expressionskassette.
Die E3-Region, d.h. die andere, typischerweise für die Insertion von Fremdnucleinsäure verwendete Region, wie vorstehend angegeben, ist nicht-essentiell für das Viruswachstum in Gewebekultur, und der Ersatz dieser Region durch eine Fremdnucleinsäure-Expressionskassette führt zu einem Virus, das in einer nicht-komplementierenden Zelllinie produktiv wachsen kann. Bei spielsweise ist die Insertion und Expression des Hepatitis-B-Oberflächenantigens in der E3-Region des Adenovirus vom Serotyp 5 mit anschließender Inokulation und Bildung von Antikörpern im Hamster berichtet worden (Morin et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84, 4626–4630 (1987)). Über analoge E3-Defizienzen, die in Ad4 und Ad7-Serotypen erzeugt worden sind, ist ebenfalls berichtet worden (hinsichtlich Ad4: Chengalvala et al., Vaccine, 9, 485–490 (1991); hinsichtlich Ad7: Lindley et al., Gene, 138, 165–170 (1994) und Chegalvala et al., J. Gen. Virol., 75, 125–131 (1994)).
Auf dem Gebiet der adenoviralen Gentherapie sind in klinischen Studien bisher nur die zwei vorstehend erwähnten Gruppe-C-Serotypen, nämlich Ad2 und Ad5, zur Verwendung gekommen. Als Beispiele für derartige Studien siehe Davidson et al., Nature, 3, 219 (1993) und Mastrangeli et al., J. Clin. Invest., 91, 225–234 (1993). Dass sich das Augenmerk der aktuellen Studien auf die Gruppe-C-Serotypen richtet, ist verständlich angesichts der Tatsache, dass die überwältigende Mehrzahl der grundlegenden Forschungsstudien über die Charakterisierung der Adenoviren auf Ad2 und Ad5 gerichtet sind. Siehe Fields, supra; siehe auch The Adenoviruses (Ginsberg, ed., Plenum Press, New York, NY, 1984). Diese Studien haben gezeigt, dass die Gruppe-C-Adenoviren außerordentliche effektiv sind als Delivery-Vehikel für eine Vielfalt von Zielgeweben, einschließlich des respiratorischen Epithels. Siehe z.B. Bajocchi et al., Nature Genetics, 3, 229–234 (1993).
Es gibt jedoch Limitationen bei der Verwendung von Gruppe-C-Adenovirus-Gentherapievektoren. Ein Wirt kann eine Immunantwort auf den besonderen, für die Gentherapie verwendeten adenoviralen Vektor entwickeln als eine Folge einer natürlichen Exposition des Wirts gegenüber dem gleichen Adenovirus-Typ vor Beginn der Gentherapie oder als eine Folge der Exposition des Wirts gegenüber dem adenoviralen Vektor im Verlaufe der Gentherapie selbst. Eine zelluläre Immunantwort kann die Lebensdauer von mit dem adenoviralen Vektor infizierten Zellen und dadurch die Expression der Fremdnucleinsäure vermindern, wodurch die Gesamteffektivität der Gentherapie gemindert wird. In der Tat ist empirisch festgestellt worden, dass eine Hauptlimitierung der allgemein verwendeten Gentherapiesysteme auf Basis von Gruppe-C-Adeno vixen die damit erhaltene kurze Dauer der Genexpression ist. Siehe z.B. Crystal et al., Nature Genetics, 8, 42–51 (1994). Ferner kann eine humorale Immunantwort, die zur Produktion von Antikörpern führt, die Effektivität der Gentherapie mit einem bestimmten adenoviralen Vektor wesentlich vermindern.
Es besteht also ein Bedarf an zusätzlichen replikationsdefizienten adenoviralen Vektoren, welche von adenoviralen Vektoren der Gruppe C verschieden sind. Insbesondere besteht ein Bedarf an zusätzlichen replikationsdefizienten adenoviralen Vektoren, die die Inkorporation und Expression von Fremdnucleinsäure erlauben und Infektionsphysiologien aufweisen, die von adenoviralen Vektoren der Gruppe C verschieden sind. Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist die Bereitstellung derartiger Vektoren sowie Verfahren zur Verwendung derartiger Vektoren. Diese und andere Aufgaben und Vorteile der vorliegenden Erfindung sowie weitere erfindungsgemäße Merkmale ergeben sich aus der nachfolgenden Beschreibung der vorliegenden Erfindung.
Kurze Zusammenfassung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft einen Vektor-Stock eines replikationsdefizienten adenoviralen Gentransfervektors, umfassend: ein adenovirales DNA-Segment, wobei das adenovirale DNA-Segment aus einem Adenovirus isoliert ist oder unter stringenten Bedingungen an ein in einem Adenovirus enthaltenen DNA-Segment hybridisiert, wobei das Adenovirus als ein Adenovirus der Gruppe A, B, D, E oder F klassifiziert ist, wobei der replikationsdefiziente Gentransfervektor ein Nicht-Gruppe-C-Adenovirusvektor ist, wie serotypisch definiert, und wobei der Vektor-Stock kein replikationskompetentes Adenovirus enthält. Die vorliegende Erfindung stellt ferner Verfahren bereit zur Verwendung derartiger Vektoren wie in den Ansprüchen 15 und 16 definiert.
Kurzbeschreibung der Figuren
1A ist eine physikalische Karte des Ad7a-Genoms, in der die Orte der AatII-Restriktionsendonuclease-Stellen angegeben sind. 1B ist eine Fotografie des gefärbten Gels eines Gelelektrophorese-Assay der Fraktionen eines Saccharosegradienten, der zum Separieren der AatII-Restriktionsfrag mente von Ad7a-DNA verwendet wurde. 1C ist eine zweite Fotografie des gefärbten Gels eines Gelelektrophorese-Assay der gepoolten und konzentrierten Fraktionen der gleichen saccharosegradientenseparierten Restriktionsfragmente.
2 ist eine schematische Darstellung des pAd7aCMV-CATgD-Plasmids.
3 ist eine Fotografie eines Chloramphenicolacetyltransferaseaktivität-Assay in Aliquoten der Lysate von HEK-293-Zellen nach Transfektion, durchgeführt unter Verwendung verschiedener Kombinationen von viralen großen Fragmenten und Plasmid-DNA.
4A ist eine Fotografie eines Chloramphenicolacetyltransferaseaktivität-Assay in Aliquoten der Sekundärviruslysate von HEK-293-Zellen nach Infektion. 4B ist eine Fotografie von gelseparierten und gefärbten AatII-Restriktionsendonuclease-Fragmenten der DNA aus denselben Lysaten.
Detailbeschreibung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung basiert mindestens teilweise auf der Entdeckung, dass Nicht-Gruppe-C-Adenoviren verwendet werden können, um replikationsdefiziente adenovirale Gentransfervektoren herzustellen, und dass solche Vektoren in komplementierenden Zelllinien propagiert werden können, die für replikationsdefiziente Gruppe-C-Adenovirusvektoren entworfen sind. Diese Entdeckung war unerwartet in Anbetracht der wesentlichen Unterschiede zwischen Nicht-Gruppe-C-Adenoviren und Gruppe-C-Adenoviren, wie exemplarisch aus dem relativ geringen Ähnlichkeitsgrad zwischen E1A- und E1B-Genprodukten von Nicht-Gruppe-C-Adenoviren und Gruppe-C-Adenoviren deutlich wird.
Die vorliegende Erfindung stellt einen adenoviralen Gentransfervektor bereit, umfassend ein adenovirales Nucleinsäuresegment, wobei das adenovirale Nucleinsäuresegment aus einem Adenovirus isoliert ist oder im Wesentlichen homolog zu einem in einem Adenovirus enthaltenen Nucleinsäuresegment ist und wobei das Adenovirus ein Nicht-Gruppe-C-Adenovirus ist, z.B. ein Adenovirus der Gruppe A, B, D, E oder F. Ferner ist der adenovirale Gentransfer vektor gemäß vorliegender Erfindung replikationsdefizient, d.h. defizient in mindestens einer Region, die für die virale Replikation benötigt wird. Typisch umfasst der adenovirale Vektor gemäß vorliegender Erfindung ferner – im Allgemeinen an Stelle von mindestens einer der deletierten, für die virale Replikation benötigten Regionen – eine Fremdnucleinsäure, die ein Produkt codiert, welches therapeutisch und/oder prophylaktisch nutzbar ist.
Die adenovirale Klassifikation, die im Kontext der vorliegenden Erfindung verwendet wird, ist die im Vorstehenden und von Horwitz, supra, beschriebene. Als solcher basiert ein "Nicht-Gruppe-C-Adenovirusvektor" auf der serotypischen Definition, z.B. stammen vorzugsweise alle Capsidproteine für einen solchen adenoviralen Vektor aus einem Nicht-Gruppe-C-Adenovirus. Somit umfasst der Ausdruck "Nicht-Gruppe-C-Adenoviren" Adenoviren der Gruppe A, B, D, E und F. Bevorzugte Adenoviren, welche für die Konstruktion von Nicht-Gruppe-C-Adenovirus-Gentransfervektoren gemäß vorliegender Erfindung zur Verwendung kommen, umfassen Ad12 (Gruppe A), Ad7 (Gruppe B), Ad30 und Ad36 (Gruppe D), Ad4 (Gruppe E) und Ad41 (Gruppe F). Mehr bevorzugte Adenoviren, welche für die Konstruktion der Nicht-Gruppe-C-Adenovirus-Gentransfervektoren gemäß vorliegender Erfindung zur Verwendung kommen, umfassen diejenigen der Gruppe B, insbesondere Ad7.
Es kann ein beliebiger Subtyp, Mischung von Subtypen oder chimäres Adenovirus als Quelle der Nucleinsäure für die Herstellung der adenoviralen Vektoren gemäß vorliegender Erfindung Verwendung finden, wobei jedoch mindestens eines der verwendeten Adenoviren ein Nicht-Gruppe-C-Adenovirus sein muss und wobei der adenovirale Vektor ein Nicht-Gruppe-C-Adenovirusvektor bleiben muss wie serotypisch definiert, z.B. derart, dass alle Capsidproteine für einen derartigen Vektor aus einem Nicht-Gruppe-C-Adenovirus stammen. So kann z.B. eine Region eines bestimmten Nicht-Gruppe-C-Adenovirus, z.B. die E4-Region von Ad7, durch eine Region eines Wildtyp-Gruppe-C-Adenovirus, z.B. durch die E4-Region von Ad2 oder Ad5, ersetzt sein. Derartige Kombinationen sind beabsichtigt, um eine Reihe von rekombinanten Adenoviren bereitzustellen, die immunologisch unsichtbar sind, sowohl in Bezug auf Wildtyp-Adenoviren und allgemein verwendete adenovirale Vektoren als auch in Bezug auf die im Kontext der vorliegenden Erfindung hergestellten. Dementsprechend kann ein Wirt, der fortlaufender Gentherapie bedarf, unter Verwendung einer Aufeinanderfolge von verschiedenen adenoviralen Gentherapievektoren behandelt werden, die nicht durch in dem Wirt als Antwort auf frühere natürliche Adenovirusinfektionen und/oder frühere Gentherapiebehandlungen mit anderen Vektoren induzierte Antikörper neutralisiert werden.
Während das adenovirale Nucleinsäuresegment, welches Teil des vorliegenden erfindungsgemäßen adenoviralen Vektors bildet, vorzugsweise aus einem Adenovirus isoliert wird, kann das adenovirale Nucleinsäuresegment jedoch auch im Wesentlichen homolog zu einem in einem solchen Adenovirus enthaltenen Nucleinsäuresegment sein. Der Ausdruck "Nucleinsäuresegment" bezieht sich auf ein DNA- oder RNA-Polymer, z.B. ein Polynucleotid, welches ein- oder doppelsträngig sein kann und optional synthetische, nichtnatürliche oder veränderte Nucleotide enthalten kann. Eine beliebige Kombination derartiger Nucleotide kann in DNA- oder RNA-Polymere inkorporiert sein.
Der Ausdruck "im Wesentlichen homolog", wie er hierin verwendet wird, bezieht sich auf die Fähigkeit von zwei Nucleinsäuren, unter mindestens moderat stringenten Hybridisierungsbedingungen zu hybridisieren. Die Stringenz der Hybridisierung ist ein Fachausdruck, der sich auf die für eine Hybridisierungsreaktion verwendeten Bedingungen bezieht, wodurch komplementäre Nucleinsäureeinzelstränge sich miteinander verbinden, um eine doppelsträngige Nucleinsäure mit einem gewissen Grad der Basenfehlpaarung zu bilden, wobei der Grad eine Funktion der verwendeten Stringenz ist. Im Besonderen ist die Stringenz abhängig von der Größe und Zusammensetzung der Nucleinsäurestränge, die zur Reaktion gebracht werden, dem erlaubten Grad der Basenfehlpaarung, der gewünschten Kreuzreaktivität und dergleichen. Der Grad der Stringenz kann u.a. beeinflusst werden durch die verwendeten ionischen Bedingungen und die Temperatur, wie auf dem Fachgebiet wohlbekannt (Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2d ed., 1989)).
Im Kontext der vorliegenden Erfindung definiert die spezifizierte Hybridisierungsstringenz zum Teil die erfindungsgemäße Nucleinsäure. Die Hybridisierungsbedingungen werden also geeignet entworfen, so dass sie mindestens moderat stringent oder stringent sind. Im erstgenannten Fall werden geeignete Bedingungen hinsichtlich Salze, Temperatur, Reaktionsmischung und Größe der Nucleinsäurereaktanten in Einklang mit konventionellem Wissen so eingestellt, dass ca. 45% bis ca. 80% Basenfehlpaarungen der Sequenz von Nucleotiden der Nucleinsäure bereitgestellt werden. Vorzugsweise werden moderat stringente Hybridisierungsbedingungen so eingestellt, dass ca. 55% bis ca. 75% Basenfehlpaarungen bereitgestellt werden; mehr bevorzugt werden derartige Bedingungen so einstellt, dass ca. 60% bis ca. 70% Basenfehlpaarungen bereitgestellt werden. Im letztgenannten Falle werden geeignete Bedingungen für die Hybridisierung in Einklang mit konventionellem Wissen so eingestellt, dass ca. 10% bis ca. 40% Basenfehlpaarungen bereitgestellt werden. Vorzugsweise werden stringente Hybridisierungsbedingungen so eingestellt, dass ca. 20% bis ca. 40% Basenfehlpaarungen bereitgestellt werden; mehr bevorzugt werden derartige Bedingungen so eingestellt, dass ca. 30% bis ca. 40% Basenfehlpaarungen bereitgestellt werden. Mit "Basenfehlpaarung" ist der Grad gemeint, in dem sich nichtkomplementäre Basenpaare in einer ansonsten doppelsträngigen Nucleinsäure gegenüberliegen, wodurch Blasenstrukturen gebildet werden und die Schmelztemperatur der Duplex erniedrigt wird verglichen mit einer 100% perfekt basengepaarten Duplex gleicher Länge und Basenzusammensetzung.
Vorzugsweise umfasst der vorliegende erfindungsgemäße adenovirale Vektor ferner eine Fremdnucleinsäure, die typischerweise ein therapeutisch und/oder prophylaktisch nutzbares Produkt codiert und in einer Wirtszelle exprimiert. Der Ausdruck "Fremdnucleinsäure" wie hierin verwendet bezieht sich auf eine beliebige, in einen Vektor gemäß vorliegender Erfindung inserierte Sequenz von DNA oder RNA, insbesondere DNA, die dem adenoviralen Genom fremd ist. Eine derartige Fremdnucleinsäure kann ein Gen, Teil eines Gens oder eine beliebige andere Nucleinsäuresequenz umfassen, einschließlich, jedoch nicht beschränkt auf eine Sequenz, die RNA, Antisense-RNA, ein synthetisches Oligonucleotid und/oder ein Polypeptid codiert. Therapeutisch nutzbare Fremdnucleinsäuren umfassen Gene, welche eine fehlende oder beeinträchtigte Genfunktion codieren, z.B. das mit der cystischen Fibrose (CF) assoziierte Cystische-Fibrose-Transmembran-Regulator-(CFTR-)Gen. Prophylaktisch nutz bare Fremdnucleinsäuren umfassen Gene, welche ein Genprodukt codieren, das eine Fähigkeit zur direkten oder indirekten Verhinderung einer Krankheit aufweist, z.B. durch Bereitstellung einer Quelle für ein Polypeptid oder ein anderes Antigen, um eine Immunantwort hierauf bereitzustellen.
Ein Adenovirus enthält zahlreiche Regionen. Eine Region des adenoviralen Genoms umfasst ein oder mehrere Gene (Horwitz, supra). Derartige Gene codieren Genprodukte, die die verschiedenen Komponenten oder Aktivitäten des Adenovirus vermitteln, erleichtern, verursachen oder darstellen, z.B. Anheftung, Penetration, "Uncoating", Replikation, Core-Protein, Hexon, Fiber, Hexon-assoziiertes Protein und dergleichen. Ein Effekt einer defizienten Region kann eine Unfähigkeit des Adenovirus z.B. zur Propagation sein, die eine beliebige oder alle der vorstehend erwähnten Komponenten oder Aktivitäten involvieren kann. Die vorstehend erwähnten Komponenten oder Aktivitäten werden hierin als Genfunktionen bezeichnet. Eine Defizienz in einem Gen oder einer Genfunktion, d.h. ein defizientes Gen, Genregion oder Region, wie hierin verwendet, ist definiert als eine Deletion von genetischem Material des viralen Genoms, die dazu dient, die Funktion des Gens, dessen Nucleinsäuresequenz ganz oder teilweise deletiert worden ist, zu beeinträchtigen oder auszulöschen und in dem viralen Genom Platz oder Kapazität zu schaffen für die Insertion einer Fremdnucleinsäure. Derartige Defizienzen können in Genen liegen, die für die Propagation des adenoviralen Vektors in Gewebekultur in einem nicht-komplementierenden zellulären Wirt essentiell oder nicht-essentiell sind.
Der vorliegende erfindungsgemäße replikationsdefiziente adenovirale Vektor kann in einer oder mehreren beliebigen Regionen defizient sein, z.B. in einer oder mehreren beliebigen Regionen der frühen oder späten Regionen, die für die virale Replikation benötigt werden. Vorzugsweise ist der adenovirale Vektor gemäß vorliegender Erfindung defizient in mindestens einer Region der frühen Regionen, welche für die virale Replikation benötigt werden, insbesondere in der E1-Region, speziell in der E1A-Region allein oder sowohl in der E1A als auch in der E1B-Region. Mehr bevorzugt ist der adenovirale Vektor defizient in mindestens einer Region zusätzlich zu der Defizienz in einer für die virale Replikation benötigten Region, z.B. in einer früheren Region, wie die E1A- Region, in Kombination mit einer Defizienz in einer weiteren frühen Region, z.B. die frühe Region 1 (E1), einschließlich der frühen Region 1A (E1A) und/oder der frühen Region 1B (E1B), die frühe Region 2 (E2), einschließlich der frühen Region 2A (E2A) und/oder der frühen Region 2B (E2B), die frühe Region 3 (E3) und die frühe Region 4 (E4), oder auch in einer späten Region des adenoviralen Genoms. Während die Defizienz einer zusätzlichen Region in einer Region liegen kann, die für die virale Replikation nicht benötigt wird, z.B. die E3-Region, kann die Defizienz einer zusätzlichen Region wünschenswerterweise in einer weiteren für die virale Replikation benötigten Region liegen, obschon eine derartige zusätzliche Defizienz in Verbindung mit noch weiteren Defizienzen in einer oder mehreren Regionen, die für die virale Replikation erforderlich sind oder auch nicht, liegen kann. Von besonderem Interesse sind diejenigen adenoviralen Vektoren gemäß vorliegender Erfindung, welche in der HEK-293-Zelllinie propagieren können, die bereits verwendet worden ist, um die replikationsessentielle E1-Region zu liefern, um die Propagation von E1-defizienten Gruppe-C-Adenovirusvektoren zu ermöglichen.
Eine beliebige der deletierten Regionen kann durch eine Fremdnucleinsäure wie z.B. eine promotorvariable Expressionskassette ersetzt sein, um ein Fremdgenprodukt zu produzieren, d.h. ein Genprodukt, welches in Bezug auf das Adenovirus fremd ist. Die Insertion einer Fremdnucleinsäure in die E2A-Region z.B. kann durch die Einführung einer singulären Restriktionsstelle erleichtert werden, so dass das Fremdnucleinsäureprodukt von dem E2A-Promotor exprimiert werden kann.
Die vorliegende Erfindung ist nicht auf adenovirale Vektoren begrenzt, welche in Genfunktionen nur in der frühen Region des Genoms defizient sind. Die vorliegende Erfindung umfasst ferner diejenigen replikationsdefizienten adenoviralen Vektoren, welche in der späten Region des Genoms defizient sind, adenovirale Vektoren, welche in der frühen und späten Region des Genoms defizient sind, sowie Vektoren, bei denen im Wesentlichen das gesamte Genom entfernt worden ist, in welchem Fall es bevorzugt ist, wenn mindestens die viralen invertierten terminalen Repeats und ein Verpackungssignal intakt bleiben. Für den Durchschnittsfachmann wird erkennbar sein, dass je größer die Region des adenoviralen Genoms, die entfernt wird, umso größer das Stück exogener DNA, das in das Genom inseriert werden kann. Nehmen wir das Beispiel einer Länge des adenoviralen Genoms von 36 kb: lässt man die viralen invertierten terminalen Repeats und einige der Promotoren intakt, beträgt die Kapazität des Adenovirus ca. 35 kb. Alternativ könnte man einen adenoviralen Vektor herstellen, der nur das ITR und ein Verpackungssignal enthält. Dies würde dann effektiv die Expression von 37–38 kb Fremdnucleinsäure von dem Vektor erlauben.
Generell stützt sich die Virusvektorkonstruktion auf einen hohen Rekombinationslevel zwischen Fragmenten von adenoviraler DNA in der Zelle. Zwei oder drei Fragmente von adenoviraler DNA, welche Regionen enthalten, die Ähnlichkeit (oder Überlappung) zwischen Fragmenten aufweisen und die gesamte Länge des Genoms bilden, werden in eine Zelle transfiziert. Die Rekombinationsmaschinerie der Wirtszelle konstruiert ein virales Vektorgenom durch Rekombination der im Vorstehenden erwähnten Fragmente. Andere geeignete Verfahren zur Konstruktion von Viren, welche Veränderungen in verschiedenen einzelnen Regionen enthalten, sind bereits beschrieben worden (Berkner et al., Nucleic Acids Res., 12, 925–941 (1984); Berkner et al., Nucleic Acids Res., 11, 6003–6020 (1983); Brough et al., Virol., 190, 624–634 (1992)) und können eingesetzt werden, um mehrfach defiziente Viren zu konstruieren; weitere geeignete Verfahren umfassen z.B. in vitro-Rekombination und -Ligation.
Der erste Schritt bei der Virusvektorkonstruktion besteht in der Konstruktion einer Deletion oder Modifikation einer bestimmten Region des adenoviralen Genoms in einer Plasmidkassette mit molekularbiologischen Standardtechniken. Diese veränderte DNA (welche die Deletion oder Modifikation enthält) wird dann in ein viel größeres Plasmid überführt, welches bis zu einer Hälfte des adenoviralen Genoms enthält. Der nächste Schritt besteht darin, die Plasmid-DNA (welche die Deletion oder Modifikation enthält) und ein großes Stück des Adenovirusgenoms in eine Empfängerzelle zu transfizieren. Zusammengenommen umfassen diese beiden DNA-Stücke das gesamte Adenovirusgenom plus eine Ähnlichkeitsregion. Innerhalb dieser Ähnlichkeitsregion wird ein Rekombinationsereignis stattfinden, um ein rekombiniertes virales Genom herzu stellen, welches die Deletion oder Modifikation umfasst. Im Falle eines replikationsdefizienten Vektors stellt die Empfängerzelle nicht nur die Rekombinationsfunktionen bereit, sondern auch alle fehlenden viralen Funktionen, die nicht in dem transfizierten viralen Genom enthalten sind, um so jegliche Defizienzen des rekombinierten viralen Genoms zu komplementieren und die Propagation des replikationsdefizienten Vektors zu erlauben.
Vorzugsweise komplementiert die komplementierende Zelllinie, welche die Propagation eines replikationsdefizienten adenoviralen Vektors gemäß vorliegender Erfindung erlaubt, spezifisch diejenigen Funktionen, die dem replikationsdefizienten adenoviralen Vektor von Interesse fehlen. Ferner ist es bevorzugt, wenn eine derartige Zelllinie das/die komplementierende/n Gen/e in nicht-überlappender Weise enthält, so dass die Möglichkeit der Vektorrekombination und Entstehung eines replikationskompetenten adenoviralen Vektors minimiert, wenn nicht sogar ausgeschlossen ist.
Die komplementierende Zelllinie sollte eine Zelllinie sein, die dazu in der Lage ist, die Produkte der defizienten adenoviralen Genfunktionen, welche für die Replikation benötigt werden, auf dem geeigneten Level für diese Produkte zu exprimieren, damit ein Hochtiter-Stock des rekombinanten adenoviralen Vektors hergestellt wird. Beispielsweise ist es für die adenovirale DNA-Replikation notwendig, das E2A-Produkt, DBP, auf stöchiometrischen Levels, d.h. relativ hohen Levels, zu exprimieren, wohingegen das E2B-Produkt, Ad pol, nur auf katalytischen Levels, d.h. relativ niedrigen Levels, für die adenovirale DNA-Replikation benötigt wird. Nicht nur muss der Produktlevel geeignet sein, auch die zeitliche Expression des Produktes muss konsistent sein mit der, die bei einer normalen Virusinfektion einer Zelle gefunden wird, um einen Hochtiter-Stock des rekombinanten adenoviralen Vektors zu gewährleisten. So müssen beispielsweise die für die virale DNA-Replikation benötigten Komponenten vor jenen exprimiert werden, die zum Virionen-Zusammenbau notwendig sind. Um Zelltoxizität zu vermeiden, die häufig mit hohen Expressionslevels der viralen Produkte einhergeht, und um die zeitliche Expression der Produkte zu regulieren, werden induzierbare Promotor-Systeme verwendet. So kann z.B. das induzierbare Schaf-Metallothionin-Promotor-System verwendet werden, um die komplette E4-Region, den offenen Leserahmen 6 der E4-Region und die E2A-Region zu exprimieren. Weitere Beispiele für geeignete induzierbare Promotor-Systeme umfassen, ohne jedoch hierauf begrenzt zu sein, das bakterielle lac-Operon, das Tetracyclin-Operon, das T7-Polymerase-System und Kombinationen und chimäre Konstrukte von eukaryotischen und prokaryotischen Transkriptionsfaktoren, Repressoren und anderen Komponenten. Wenn das zu exprimierende virale Produkt hochtoxisch ist, ist es wünschenswert, ein zweiteiliges induzierbares System zu verwenden, wobei der Induktor in einem viralen Vektor getragen wird und das induzierbare Produkt innerhalb des Chromatins der komplementierenden Zelllinie getragen wird. Ferner können reprimierbare/induzierbare Expressionssysteme wie das Tetracyclin-Expressionssystem und das lac-Expressionssystem verwendet werden.
DNA, die in einen kleinen Teil von transfizierten Zellen eintritt, kann in einigen dieser Zellen stabil aufrechterhalten werden. Die Isolierung einer Zelllinie, die ein oder mehrere transfizierte Gene exprimiert, wird erzielt, indem in dieselbe Zelle ein zweites Gen (Markergen) eingeführt wird, welches z.B. Resistenz gegen ein Antibiotikum, einen Wirkstoff oder eine andere Verbindung verleiht. Diese Selektion basiert auf der Tatsache, dass in der Gegenwart des Antibiotikums, Wirkstoffs oder der anderen Verbindung die Zelle ohne das transferierte Gen stirbt, während die Zelle, die das transferierte Gen enthält, überlebt. Die überlebenden Zellen werden dann klonal isoliert und als individuelle Zelllinien expandiert. In den Bereich dieser Zelllinien fallen diejenigen, welche sowohl das Markergen als auch das Gen oder die Gene von Interesse exprimieren. Die Propagation der Zellen ist von der parentalen Zelllinie und dem Selektionsverfahren abhängig. Die Transfektion der Zelle ist ferner vom Zelltyp abhängig. Die meistgebräuchlichen Techniken, die für die Transfektion zur Verwendung kommen, sind Calciumphosphatpräzipitation, Liposomen- oder DEAE-Dextran-vermittelter DNA-Transfer.
Die vorliegenden beispielhaften DNA-Sequenzen und Plasmide können vielfältig modifiziert und variiert werden. Beispielsweise erlaubt die Degeneration des genetischen Codes die Substitution von Nucleotiden über Polypeptid-Codierungsregionen hinweg sowie im Translationsstopsignal ohne Änderung der codierten Polypeptid-Codierungssequenz. Derartige substituierbare Sequenzen können von der bekannten Aminosäure oder DNA-Sequenz eines gegebenen Gens abgeleitet und nach konventionellen synthetischen oder ortsspezifischen Mutageneseverfahren konstruiert werden. Synthetische DNA-Methoden können im Wesentlichen in Einklang mit den Verfahren nach Itakura et al., Science, 198, 1056 (1977), und Crea et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA; 75, 5765 (1978), durchgeführt werden. Ortsspezifische Mutageneseverfahren sind bei Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, NY (2d ed. 1989) beschrieben. Die vorliegende Erfindung ist daher in keiner Weise auf die spezifisch und beispielhaft hierin angeführten DNA-Sequenzen und Plasmide begrenzt. Beispielhafte Vektoren sind für die Markergen-Chloramphenicolacetyltransferase (CAT) und für die Gentherapie von cystischer Fibrose; die hierin beschriebenen besonderen Vektoren enthalten und exprimieren daher das CAT-Gen und das Cystische-Fibrose-Transmembran-Regulator-(CFTR-)Gen. Jedoch können die hierin beschriebenen Vektoren leicht umgewandelt werden, um andere Erkrankungen zu behandeln, einschließlich, jedoch nicht beschränkt auf andere chronische Lungenkrankheiten, wie Emphysem, Asthma, Atemnotsyndrom des Erwachsenen und chronische Bronchitis, sowie Krebs, koronare Herzerkrankungen und andere Leiden, welche durch Gentherapie, Vakzinierung und dergleichen geeignet behandelt oder verhindert werden. Dementsprechend kann ein beliebiges Gen oder DNA-Sequenz in einen Nicht-Gruppe-C-Adenovirus-Gentransfervektor inseriert werden. Die Wahl des Gens oder der DNA-Sequenz wird so getroffen, dass ein therapeutischer und/oder prophylaktischer Effekt, z.B. im Kontext der Gentherapie, Vakzinierung und dergleichen, erzielt wird.
Für den Fachmann wird erkennbar sein, dass geeignete Verfahren zur Verabreichung eines adenoviralen Vektors gemäß vorliegender Erfindung an ein Tier zu therapeutischen oder prophylaktischen Zwecken, z.B. Gentherapie, Vakzinierung und dergleichen (s. z.B. Rosenfeld et al., Science, 252, 431–434 (1991), Jaffe et al., Clin. Res., 39 2 , 302A (1991), Rosenfeld et al., Clin. Res., 39 2 , 311A (1991), Berkner, BioTechniques, 6, 616–629 (1988)), zur Verfügung stehen und dass man zwar mehr als eine Route verwenden kann, um den Vektor zu verabreichen, die eine Route aber möglicherweise eine unmittelbarere und effektivere Reaktion bereitstellt als die andere. Pharmazeutisch zulässige Träger sind dem Fachmann ebenfalls wohlbekannt und problemlos verfügbar. Die Wahl des Trägers wird zum Teil bestimmt durch das jeweilige Verfahren, welches zur Verabreichung der Zusammensetzung verwendet wird. Dementsprechend gibt es eine breite Vielfalt an geeigneten Formulierungen der pharmazeutischen Zusammensetzung gemäß vorliegender Erfindung. Die folgenden Formulierungen und Verfahren sind rein exemplarisch und in keiner Weise limitierend, jedoch sind orale, injizierbare und Aerosol-Formulierungen bevorzugt.
Zur oralen Verabreichung geeignete Formulierungen können bestehen aus:

(a) flüssigen Lösungen, z.B. aus einer wirksamen Menge der Verbindung, gelöst in Verdünnungsmitteln wie Wasser, Salzlösung oder Orangensaft;
(b) Kapseln, Sachets oder Tabletten, die jeweils eine vorgegebene Menge der Aktivsubstanz als Feststoffe oder Granulen enthalten; (c) Suspensionen in einer geeigneten Flüssigkeit; und (d) geeignete Emulsionen. Tablettenformen können eine oder mehrere der folgenden Komponenten umfassen: Lactose, Mannitol, Maisstärke, Kartoffelstärke, mikrokristalline Cellulose, Acacia, Gelatine, kolloidales Siliciumdioxid, Croscarmellose-Natrium, Talkum, Magnesiumstearat, Stearinsäure und andere Träger, Farbmittel, Verdünnungsmittel, Puffer, Feuchthaltemittel, Konservierungsmittel, Geschmackstoffe und pharmakologisch kompatible Träger. Pastillenformen können die Aktivsubstanz in einem Geschmackstoff umfassen, üblicherweise Saccharose und Acacia oder Tragant, sowie Pastillen, welche die Aktivsubstanz in einer inerten Grundlage, z.B. Gelatine und Glycerin oder Saccharose und Acacia, Emulsionen, Gelen und dergleichen umfassen, die neben der Aktivsubstanz solche Träger enthalten, wie sie auf dem Fachgebiet bekannt sind.

Die Vektoren gemäß vorliegender Erfindung – für sich allein oder in Kombination mit anderen geeigneten Komponenten – können zu Aerosol-Formulierungen verarbeitet werden, welche durch Inhalation zu verabreichen sind. Diese Aerosol-Formulierungen können in zulässige Drucktreibmittel eingebracht werden, z.B. Dichlordifluormethan, Propan, Stickstoff und dergleichen. Sie können ferner als Arzneimittel für drucklose Zubereitungen, z.B. in Nebulisatoren oder Zerstäubern, formuliert werden.
Zur parenteralen Verabreichung geeignete Formulierungen umfassen wässrige und nicht-wässrige isotonische, sterile Injektionslösungen, welche Antioxidantien, Puffer, Bakteriostatika und gelöste Substanzen, welche die Formulierung auf Isotonie mit dem Blut des vorgesehenen Empfängers einstellen, enthalten können, sowie wässrige und nicht-wässrige sterile Suspensionen, welche Suspensionsmittel, Lösungsvermittler, Verdickungsmittel, Stabilisatoren und Konservierungsmittel umfassen können. Die Formulierungen können in versiegelten Einzeldosis- oder Mehrdosenbehältnissen, z.B. Ampullen und Vials, dargeboten werden und können in gefriergetrocknetem (lyophilisiertem) Zustand gelagert werden, wobei nur die Zugabe des sterilen flüssigen Trägers, z.B. Wasser für Injektionszwecke, unmittelbar vor Gebrauch erforderlich ist. Extemporane Injektionslösungen und Suspensionen können aus sterilen Pulvern, Granulen und Tabletten der zuvor beschriebenen Art hergestellt werden.
Ferner können die für die vorliegende Erfindung verwendeten Vektoren zu Suppositorien verarbeitet werden durch Mischen mit einer Vielfalt von Grundlagen, z.B. mit emulgierenden Grundlagen oder wasserlöslichen Grundlagen. Zur vaginalen Verabreichung geeignete Formulierungen können als Pessare, Tampons, Cremes, Gele, Pasten, Schaumpräparate oder Sprayformulierungen dargeboten werden, welche neben der Aktivsubstanz solche Träger enthalten, wie sie auf dem Fachgebiet als geeignet bekannt sind.
Die einem Tier, insbesondere einem Menschen, verabreichte Dosis im Kontext der vorliegenden Erfindung variiert je nach dem Gen oder der anderen Sequenz von Interesse, der verwendeten Zusammensetzung, der Verabreichungsmethode und dem jeweils behandelten Ort und Organismus. Die Dosis sollte ausreichend sein, um eine wünschenswerte Antwort, z.B. eine therapeutische oder prophylaktische Antwort, innerhalb eines wünschenswerten Zeitrahmens zu bewirken.
Die Nicht-Gruppe-C-Adenovirus-Gentransfervektoren gemäß vorliegender Erfindung können ferner in vitro genutzt werden. Beispielsweise können sie ver wendet werden, um die adenovirale Genfunktion und den Zusammenbau in Bezug auf die Adenoviren der verschiedenen Gruppen zu studieren. Alternativ kann man die Expression von Fremdnucleinsäure in einer geeigneten Zielzelle mittels der Vektoren gemäß vorliegender Erfindung studieren. Der Durchschnittsfachmann kann eine geeignete Zielzelle identifizieren durch Selektion einer Zielzelle, die durch den erfindungsgemäßen adenoviralen Vektor transfiziert und/oder durch adenovirale Partikel infiziert werden kann, resultierend in der Expression des dadurch inserierten adenoviralen DNA-Komplements. Bevorzugt wird eine geeignete Zielzelle selektiert, die Rezeptoren zur Anheftung und Penetration von Adenovirus in eine Zelle aufweist. Derartige Zellen umfassen – ohne jedoch hierauf begrenzt zu sein – diejenigen, welche von einem beliebigen Säugetier original isoliert worden sind. Nach erfolgter Selektion der geeigneten Zielzelle wird die Zielzelle mit einem eine Fremdnucleinsäure enthaltenden rekombinanten adenoviralen Vektor oder adenoviralen Partikel gemäß vorliegender Erfindung in Kontakt gebracht, wodurch Transfektion bzw. Infektion bewirkt wird. Expression, Toxizität und andere Parameter betreffend die Insertion und Aktivität der Fremdnucleinsäure in der Zielzelle werden dann nach konventionellen, auf dem Fachgebiet wohlbekannten Methoden gemessen. Hierbei können Forscher die Phänomenologie betreffend die adenovirale Infektion sowie die Effizienz und Wirkung der Expression verschiedener Fremdnucleinsäuresequenzen, die durch den erfindungsgemäßen Vektor in verschiedene Zelltypen eingeführt werden, welche von verschiedenen Organismen explantiert und in Gewebekultur untersucht werden, studieren und aufklären.
Ferner werden Zellen, die von einem Patienten explantiert oder entnommen werden, der eine Erkrankung aufweist, die durch Gentherapie im Kontext der vorliegenden Erfindung geeignet behandelt wird, nutzbringend in vitro manipuliert. Beispielsweise werden in vitro kultivierte Zellen von einem solchen Individuum unter geeigneten, Transfektion bewirkenden Bedingungen, die von einem Durchschnittsfachmann leicht bestimmt werden können, mit einem adenoviralen Vektor gemäß vorliegender Erfindung in Kontakt gebracht, wobei der Vektor eine geeignete Fremdnucleinsäure umfasst. Ein derartiger Kontakt resultiert geeignet in der Transfektion des Vektors in die kultivierten Zellen, wo auf die transfizierten Zellen unter Verwendung eines geeigneten Markers und selektiven Kulturbedingungen selektiert wird. Hierbei werden – unter Anwendung von Standardverfahren zum Testen auf Vitalität der Zellen und damit Messen der Toxizität und zum Testen auf die Gegenwart von Genprodukten der Fremdnucleinsäure des Vektors von Interesse und damit Messen der Expression – die Zellen des Individuums auf Kompatibilität mit dem die Fremdnucleinsäure enthaltenden Vektor von Interesse, Expression in demselben und Toxizität desselben getestet, um dadurch Informationen bezüglich Eignung und Effizienz der Behandlung des Individuums mit dem so getesteten Vektor/Fremdnucleinsäure-System bereitzustellen. Derartige explantierte und transfizierte Zellen können neben ihrer Funktion, die potentielle Effizienz/Toxizität eines gegebenen Gentherapieregimes zu testen, ferner in eine in vivo-Position innerhalb des Körpers des Individuums zurückgebracht werden. Derartige, dem Individuum so zurückgebrachte Zellen können bis auf ihre in vitro-Transfektion unverändert und schmucklos zurückgebracht werden, oder sie können in eine Matrix eingehüllt oder eingebettet sein, die sie von anderen Geweben und Zellen des Körpers des Individuums getrennt hält. Eine derartige Matrix kann ein beliebiges geeignetes biokompatibles Material sein, inklusive Collagen, Cellulose und dergleichen. Es versteht sich, dass alternativ oder zusätzlich, bevorzugt nach Beobachtung einer positiven Antwort auf den in vitro-Test, die Transfektion in situ implementiert werden kann durch Verabreichungsmittel wie im Vorstehenden detailliert.
Die folgenden Beispiele sollen die vorliegende Erfindung noch näher erläutern, wobei diese selbstverständlich nicht so verstanden werden sollen, dass sie den Bereich der Erfindung in irgendeiner Weise begrenzen. In den Beispielen angeführte Enzyme sind, wenn nichts anderes angegeben ist, von Bethesda Research Laboratories (BRL), Gaithersburg, MD 20877, New England Biolabs Inc. (NEB), Beverly, MA 01915, oder Boehringer Mannheim Biochemicals (BMB), 7941 Castleway Drive, Indianapolis, IN 46250, erhältlich und werden im Wesentlichen in Einklang mit den Empfehlungen des Herstellers verwendet. Viele der hierin verwendeten Techniken sind dem Fachmann wohlbekannt. Molekularbiologische Techniken sind detailliert in geeigneten Laborhandbüchern beschrieben, z.B. Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, NY (2d ed. 1989) und Current Protocols in Molecular Bioloay (Ausubel et al., eds. (1987)). Für den Durchschnittsfachmann wird erkennbar sein, dass verschiedene der im Folgenden vorgestellten Verfahren durch alternative Verfahren ersetzt werden können.
Beispiel 1
Dieses Beispiel illustriert die Deletion der E1A-Region aus der adenoviralen DNA eines Ad7a-Virus der Gruppe B, wobei virale große Fragmente erzeugt werden.
Ad7a-Virus wurde verwendet, um HEK-293-Zellen in Modified Eagles Medium mit 5% Pferdeserum mit einer Infektionsmultiplizität von 100 zu inokulieren, und die DNA wurde aus geerntetem Ad7a-Virus isoliert, wobei die von Falck-Pedersen in Cell Biology: A Laboratory Manual (Spector et al., eds., Cold Spring Harbor Laboratory, New York, 1994) beschriebenen Verfahren verwendet wurden. Ad7a-DNA wurde dann einer Restriktionsendonucleasespaltung mit Aat II nach Dijkema et al., Gene, 12, 287 (1980) unterworfen, wobei ein kleines Fragment von 1,483 kb, linksliegend (Fragment 1 in 1A), ein großes Fragment von ca. 30 kb, in der Mitte des Genoms lokalisiert (Fragment 2 in 1A), und ein zweites großes Fragment von 5 kb, rechtsliegend (Fragment 3 in 1A) erzeugt wurden. Das kleine Fragment enthält den Replikationsursprung und Verpackungssequenzen sowie die frühe Region E1A, die für die DNA-Replikation benötigt wird. Die großen Fragmente enthalten die anderen frühen Gene sowie die späten Gene, die für die Produktion neuer Virionen erforderlich sind.
Die großen Fragmente 2 und 3 wurden cogereinigt und separat durch Saccharose-Dichtegradientenzentrifugation aus dem kleinen Fragment isoliert. Ein kontinuierlicher Saccharosegradient von 10–20% mit einem 40%igen Saccharosekissen wurde mit Aat II-verdauter Ad7a-DNA überschichtet. Nach der Zentrifugation wurde der Gradient fraktioniert. Gereinigte große Fragmente enthaltende Fraktionen wurden durch Agarosegelelektrophorese bestimmt; eine Fotografie des Ethidiumbromid-gefärbten Gels erscheint in
1B. Die Fraktionen 1–10 weisen keine detektierbaren kleinen Fragmente auf.
Die Fraktionen 1–5, 6–10 und 11–19 wurden gepoolt und konzentriert durch Präzipitation und nachfolgende Rekonstitution in einem kleineren Volumen. Wieder wurde Gelelektrophorese verwendet, um die Größe der DNA-Fragmente in jeder der gepoolten Fraktionen zu analysieren; die entsprechenden Resultate sind in 1C gezeigt. Wegen der Anwesenheit der großen Fragmente (2 und 3) und der Abwesenheit des kleinen Fragments (1), welches bekanntermaßen die Region E1A umfasste, wurde Pool 2 (Fraktionen 6–10) in nachfolgenden Schritten der Herstellung des replikationsdefizienten Ad7a-Virus verwendet.
Beispiel 2
Dieses Beispiel beschreibt die Herstellung des Plasmids pAd7aCMV-CATgD, welches in 2 wiedergegeben ist. Das Plasmid pAd7aCMV-CATgD wurde hergestellt durch gerichtetes Klonieren in drei sequentiellen Schritten.
Erstens wurden – unter Verwendung von Oligonucleotid-Primern und der Polymerasekettenreaktion (PCR) – bis zu 475 Basenpaare des linken Endes des Ad7a-Genoms (lokalisiert zwischen den Karteneinheiten (mu) 0 und 1,3 auf dem Ad7a-Genom) amplifiziert und isoliert. Hierfür wurden folgende Primer verwendet:
Die amplifizierte DNA enthielt den essentiellen Origin (ori) und Verpackungssequenzen (pkg). Die frühen Regionen E1A und ein Teil von E1B, lokalisiert in dem Bereich von 1,3 bis 7,7 mu, wurden dadurch deletiert. Der pBS-Vektor (Stratagene Cloning Systems, La Jolla, CA) wurde dann mit SacI-NotI geöffnet und das PCR-Fragment SacI-ori/pgk-NotI inseriert.
Zweitens wurde – unter Verwendung von Standardverfahren – der pBS-Vektor mit NotI-SalI geöffnet, und der Cytomegalovirus-Promotor (CMV) wurde an die Elemente ori und pkg ligiert, gefolgt von der bakteriellen Chloramphenicolacetyltransferasesequenz (CAT) und der Maus-B-maj-Globin-Poly(A)-Stelle.
Drittens wurde eine Region von 2,8 bis 4,0 kb für eine Überlappungsrekombination mit dem Ad7a-Genom durch PCR mittels der folgenden Primer hergestellt:
Dieses Überlappungsrekombinationsfragment ist in dem Bereich von 7,7 bis 11,1 mu auf dem Ad7a-Genom lokalisiert. Der pBS-Vektor wurde dann mit SalI-KpnI geöffnet und das PCR-Fragment SalI-Ad7-Überlappungs-DNA-2,8–4,0 kb-KpnI darin inseriert, d.h. an das zuvor erwähnte DNA-Konstrukt nach der poly(A)-Stelle ligiert, resultierend in der Herstellung des pAd7aCMV-CATgD-Plasmids.
Beispiel 3
Dieses Beispiel beschreibt die Herstellung eines rekombinanten Ad7a-Adenovirus und demonstriert die Fähigkeit des rekombinanten Ad7a-Adenovirus, in HEK-293-Zellen zu replizieren und mit denselben komplementiert zu werden. Virale große Fragmente, hergestellt wie in Beispiel 1 beschrieben, und Plasmid pAd7aCMV-CATgD, hergestellt gemäß Beispiel 2, wurden in verschiedenen Mikrogrammanteilen auf Monolayer von HEK-293-Zellen (106 Zellen pro 60 mm-Schale) durch Calciumphosphatpräzipitation transfiziert. Nach einer Woche wurden die Zellen geerntet und es wurde ein Viruslysat durch wiederholte Gefrier-Tau-Zyklen hergestellt. Ein 10%-Teil des resultierenden Lysats (0,5 ml) wurde verwendet, um einen frischen Monolayer von HEK-293-Zellen zu infizieren. Nach 24 Stunden wurden diese Zellen geerntet und Lysate hergestellt. Die Lysate wurden auf Reportergenaktivität getestet, d.h. Chloramphenicolacetyltransferase-(CAT-)Aktivität, wobei das von Gorman et al., Mol. Cell. Biol., 2, 1044–1051 (1982), und Gorman et al., PNAS, 79, 6777–6781 (1982), offenbarte Verfahren verwendet wurde.
Die Resultate der Transfektionen mit zirkulärem und linearisiertem Plasmid sind in 3 wiedergegeben, die ein Dotblot darstellt, in dem die erzeugte Farbe in Gegenwart von höheren CAT-Konzentrationen intensiver ist. Die Kombination von 2,4–4,8 μg eines großen viralen Fragments und 5,0 μg eines zirkulären Plasmids erzeugte die höchste CAT-Aktivität in resultierenden Lysaten (siehe Spuren 2 und 3). Bezüglich des linearisierten Plasmids erzeugte die Kombination von 2,4 μg eines großen Fragments und 2,5 μg eines Plasmids (Spur 7) das beste Ergebnis. Positive und negative Kontrollen sind in Spur 10 bzw. 11 lokalisiert.
Beispiel 4
Dieses Beispiel ist eine weitere Bestätigung der Herstellung des rekombinanten Ad7a-Adenovirus und der Fähigkeit des rekombinanten Ad7a-Adenovirus, in HEK-293-Zellen zu replizieren und mit denselben komplementiert zu werden. Im Besonderen beschreibt dieses Beispiel den Test eines Sekundärviruslysats auf CAT-Genexpression.
Ein 1,0-ml-Aliquot des gemäß Beispiel 3 erzeugten Primärlysats wurde verwendet, um eine 60 mm-Schale von HEK-293-Zellen zu infizieren. Nach Inkubation für eine Woche wurden die Zellen geerntet und es wurden Lysate hergestellt wie im Beispiel 3. Ein 10%-Teil jedes resultierenden Lysats wurde dann verwendet, um einen frischen Monolayer von HEK-293-Zellen zu infizieren, und das resultierende Lysat hiervon wurde auf CAT-Aktivität getestet.
Die Resultate sind in 4A wiedergegeben. Die Lysatnummer gibt die Transfektionsparameter an, die die gleichen waren wie die für die korrespondierenden Nummern in 3. Die Resultate zeigen, dass die Transfektionsparameter von 4,8 μg eines großen Fragments kombiniert mit fast der gleichen Masse an zirkulärem Plasmid (d.h. 5 μg) in einer starken CAT-Aktivität in einem Sekundärlysat resultiert, die das Resultat der viralen Aktivität der Nachkommenschaft der anfänglich geernteten rekombinanten Viruspartikel ist.
Selektierte Zelllysate (2 und 3) wurden weiter charakterisiert durch Infizieren von HEK-293-Zellen und Ernten der viralen DNA nach einem modifizierten Hirt-Verfahren (Falck-Pedersen, supra). Auf diese Weise gereinigte virale DNA wurde mit der Restriktionsendonuclease AatII verdaut, um die Natur der rekombinanten DNA zu charakterisieren, wie in 4B wiedergegeben. Kontroll-DNA wurde aus Wildtyp-Ad7a- und Wildtyp-Ad5-Adenoviren entnommen. Diagnostische Banden sind durch Pfeile hervorgehoben. Die Spuren 2 und 3 zeigen jeweils das gleiche kleinere DNA-AatII-Restriktionsfragment, verglichen mit den angegebenen AatII-Restriktionsfragmenten der Kontroll-Ad7- und -Ad5-Spuren. Die CAT-Aktivität der mit rekombinantem Ad7a behandelten Lysate korreliert also erwartungsgemäß zu einer genetischen Veränderung.
Beispiel 5
Dieses Beispiel evaluiert die Ähnlichkeiten zwischen Nicht-Gruppe-C-Adenoviren bezüglich Gruppe-C-Adenoviren.
Die Ähnlichkeiten und Unterschiede zwischen verschiedenen Adenovirusgruppen wurden untersucht durch Vergleich der Aminosäureähnlichkeit und -identität zwischen den E1A- und E1B-Genprodukten von Adenovirus Ad2 (Gruppe C), Ad5 (Gruppe C), Ad7 (Gruppe B), Ad12 (Gruppe A) und Ad40 (Gruppe F). Hinsichtlich Viren innerhalb der gleichen Gruppe, spezifisch zwischen Ad2 und Ad5 innerhalb der Gruppe C, ergaben sich eine Ähnlichkeit von 99% und eine Identität von 98% zwischen den E1A- und E1B-Genprodukten von Ad2 und Ad5. Demgegenüber zeigten Vergleiche zwischen den Viren der verschiedenen Gruppen eine stark verminderte Ähnlichkeit und weniger Identität. Beispielsweise ergaben sich 63–75% Ähnlichkeit und 40–53% Identität zwischen den E1A- und E1B-Genprodukten von Ad7, Ad12 und Ad40 im Vergleich mit den E1A- und E1B-Genprodukten von Ad2 und Ad5.
Signifikanterweise wurde jedoch gefunden, dass bestimmte Domänen zwischen den Viren der verschiedenen Gruppen konserviert sind, z.B. zwischen den E1A- und E1B-Genprodukten der Nicht-Gruppe-C- und der Gruppe-C-Adenoviren. Es wurde also gefunden, dass die Unterschiede zwischen bestimmten Nicht-Gruppe-C-Viren verglichen mit Gruppe-C-Viren ähnlich sind, derart, dass z.B. die Demonstration einer Fähigkeit der Gruppe-B-Adenoviren indikativ dafür ist, dass andere Nicht-Gruppe-C-Adenoviren die gleiche Fähigkeit besitzen. Insbesondere liefert die Demonstration der Fähigkeit eines E1-defizienten Gruppe-B-Adenovirus, z.B. Ad7, mit HEK-293-Zellen komplementiert zu werden (wie im Beispiel 3 demonstriert), den Nachweis dafür, dass andere Nicht-Gruppe-C-Adenoviren mit HEK-293-Zellen komplementiert werden können. SEQUENZLISTE

Claims

Vektor-Stock eines replikationsdefizienten adenoviralen Gentransfervektors, umfassend: (i) ein adenovirales DNA-Segment, isoliert aus einem Adenovirus der Gruppe A, B, D, E oder F, oder (ii) ein DNA-Segment, welches unter stringenten Bedingungen an ein DNA-Segment hybridisiert, das in einem Adenovirus der Gruppe A, B, D, E oder F enthalten ist, wobei der replikationsdefiziente Gentransfervektor ein Nicht-Gruppe-C-Adenovirusvektor ist, wie serotypisch definiert, und wobei der Vektor-Stock kein replikationskompetentes Adenovirus enthält.
Vektor-Stock nach Anspruch 1, wobei der Vektor in mindestens der E1A-Region des adenoviralen Genoms defizient ist.
Vektor-Stock nach Anspruch 2, wobei der Vektor ferner in mindestens einer weiteren, zur Virusreplikation erforderlichen Region des adenoviralen Genoms defizient ist.
Vektor-Stock nach Anspruch 3, wobei der Vektor in einer Region defizient ist, die ausgewählt ist aus der Gruppe, welche aus den Regionen E1B, E2A, E3 und E4 des adenoviralen Genoms besteht.
Vektor-Stock nach einem der Ansprüche 2 bis 4, wobei der Vektor ferner in einer Region defizient ist, die ausgewählt ist aus der Gruppe, welche aus den späten Regionen des adenoviralen Genoms besteht.
Vektor-Stock nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei das Adenovirus ein Gruppe-B-Adenovirus ist.
Vektor-Stock nach Anspruch 6, wobei das Adenovirus ein Ad7-Adenovirus ist.
Vektor-Stock nach einem der Ansprüche 1 bis 7, wobei der Vektor in der HEK-293-Zelllinie replizieren kann.
Vektor-Stock nach einem der Ansprüche 1 bis 8, wobei der Stock in einer Zelllinie propagiert wird, die fähig ist, ein Gruppe-C-Adenovirus, welches in der E1A-Region des adenoviralen Genoms defizient ist, in trans zu komplementieren.
Vektor-Stock nach Anspruch 9, wobei die Zelllinie eine HEK-293-Zelllinie ist.
Vektor-Stock nach einem der Ansprüche 1 bis 10, wobei der Vektor ferner eine Fremdnucleinsäure umfasst, die ein therapeutisches oder prophylaktisches Agens in einem Säugetier exprimieren kann.
Verwendung des Vektor-Stock nach Anspruch 11 in der Herstellung eines Medikamentes für die Gentherapie am Menschen.
Vektor-Stock nach Anspruch 11 zur Verwendung als Medikament für die Gentherapie am Säugetier.
Vektor-Stock nach Anspruch 11 zur Verwendung als Medikament für die Impfung am Säugetier.
Verfahren zum Testen der Expression oder Toxizität des Fremdnucleinsäure-enthaltenden Vektors des Stock nach einem der Ansprüche 1 bis 11 in den Zellen eines gentherapiebedürftigen Menschen, wobei das Verfahren umfasst: (a) In-Kultur-Bringen eines Aliquotes von aus dem Menschen entfernten Zielzellen, (b) Inkontaktbringen der Zellen mit dem Vektor-Stock und (c) Bestimmen der Expression der Fremdnucleinsäure und der Vitalität der kultivierten Zielzellen.
Verfahren zum Wachsenlassen und Propagieren eines isolierten Nicht-Gruppe-C-Adenovirusvektor-Stock in Abwesenheit eines Helfervirus, wobei das Verfahren umfasst: Inkontaktbringen einer Zelle einer Zelllinie, welche fähig ist, die Replikation eines Gruppe-C-Adenovirus, das in mindestens der E1A-Region des adenoviralen Genoms defizient ist, zu komplementieren, mit einem Nicht-Gruppe-C-Adenovirus, das in mindestens der E1A-Region des adenoviralen Genoms defizient ist.
Verfahren nach Anspruch 16, wobei die Zelllinie eine HEK-293-Zelllinie ist.
Verfahren nach Anspruch 16 oder 17, wobei der Vektor ferner in einer weiteren Region des adenoviralen Genoms defizient ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 16 bis 18, wobei der Nicht-Gruppe-C-Vektor ein Gruppe-B-Vektor ist.
Verfahren nach Anspruch 19, wobei der Gruppe-B-Vektor ein Ad7-Adenovirus ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 17 bis 20, wobei die Zelllinie den offenen Leserahmen 6 der E4-Region eines Gruppe-C-Adenovirus umfasst.